KR20060055302A

KR20060055302A - 혈액 점도 저하제

Info

Publication number: KR20060055302A
Application number: KR1020050046100A
Authority: KR
Inventors: 마사히토 히토스기; 히로아키 마에다; 가즈노부 오무라
Original assignee: 다이와 야꾸힝 가부시키가이샤; 마사히토 히토스기
Priority date: 2004-11-16
Filing date: 2005-05-31
Publication date: 2006-05-23
Also published as: KR100709300B1; EP1657304B1; JP2006143601A; TWI284537B; US20090202982A1; CA2527154A1; CN1775284B; ATE446360T1; EP1657304A1; CN1775284A; US20060105071A1; DE602005017235D1; HK1088849A1; US7972835B2

Abstract

본 발명은 바실루스 서브틸리즈 낫토로부터 유도되고 아미노 말단기로부터 순차적으로, 알라닌, 트레오닌, 아스파르트산, 글리신, 발린, 글루탐산, 트립토판, 아스파라긴, 발린, 아스파르트산, 글루타민, 아이소루신, 아스파르트산, 알라닌, 프롤린, 리신, 알라닌, 트립토판, 알라닌, 루신, 글리신, 티로신, 아스파르트산, 글리신, 트레오닌, 글리신, 트레오닌, 발린, 발린, 알라닌, 세린, 아이소루신, 아스파르트산, 트레오닌, 글리신, 발린, 글루탐산, 트립토판, 아스파라긴, 히스티딘, 프롤린, 알라닌, 루신, 리신, 글루탐산, 리신, 티로신, 아르기닌, 글리신, 티로신, 아스파라긴, 프롤린, 글루탐산, 아스파라긴, 프롤린, 아스파라긴, 글루탐산, 프롤린, 글루탐산, 아스파라긴, 글루탐산, 메티오닌, 아스파라긴, 트립토판, 티로신, 아스파르트산, 알라닌, 발린, 알라닌, 글리신, 글루탐산, 알라닌, 세린, 프롤린, 티로신, 아스파르트산, 아스파르트산, 루신, 알라닌, 히스티딘, 글리신, 트레오닌, 히스티딘, 발린 및 트레오닌을 갖는 1차 구조 아미노산 서열, 알라닌, 페닐알라닌, 세린, 글루탐산, 아스파르트산, 글리신, 글리신, 트레오닌, 아스파르트산, 알라닌, 아스파르트산, 아이소루신, 루신, 글루탐산, 알라닌, 글리신, 글루탐산, 트립토판, 발린 및 루신을 갖는 2차 구조 아미노산 서열, 아스파르트산, 알라닌, 글루탐산, 글리신, 아스파라긴, 프롤린, 히스티딘, 프롤린, 글루탐산, 메티오닌, 알라닌, 프롤린, 아스파르트산 및 발린을 갖는 3차 구조 아미노산 서열 및 발린, 프롤린, 글리신, 글루타민, 알라닌, 티로신, 글루탐산, 아스파르트산, 글리신, 트립토판 및 아스파르트산을 갖는 4차 구조 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 함유하여 전혈의 점도를 저하시키는 혈액-점도 저하제이다.

혈액-점도 저하제, 바실루스 서브틸리즈 낫토

Description

혈액 점도 저하제{Blood-Viscosity Reducing Agent}

도 1과 2 각각은 혈액 점도의 측정 결과를 나타내는 그래프이다.

본 발명은 전혈의 점도를 저하시키는 혈액 점도 저하제에 관한 것이다.

낫토(Natto)는 1600년대부터 지금까지 오랫동안 섭취되는 전통적인 발효 음식이며 일본일들이 대두(大豆) 단백질을 효과적으로 섭취하게 하는 음식으로 탁월하다. 예를 들어, 낫토는 대두보다 뛰어난 소화력을 가진다. 이는 단백질, 지방, 전분 등과 같은 대두의 주요 성분들이 바실루스 서브틸리즈 낫토(Bacillus subtilis natto)에 의해 아미노산, 지방산 및 글루코스로 분해되고 섭취시에 소화력을 향상시키기 때문이다.

낫토에 함유된 대부분의 비타민 B군은 신체 기능을 원활하게 하고 피로회복을 단축시킨다. 낫토는 다량의 비타민 B₂를 함유하고 안정(眼精)피로를 회복시키는 것으로 예상된다. 낫토에 비타민 K의 함량은 식품들중에서 최고로 높다. 낫토는 예를 들어, 골다공증을 예방하고 혈액 응고력을 향상시키는 혈액 칼슘 대사를 향상시 키는 것으로 예상된다.

최근에, 낫토의 다양한 기능들이 증명되었고, 낫토의 효과는 건강 식품으로서 많은 주목을 받아오고 있다. 낫토의 소비는 증가되고 있는 추세이다. 특히, 낫토카아제라 불리는 낫토-함유 효소는 생산 방법, 물리 화학적 성질 및 생화학적 성질이 일본특허공개공보 제 61-162184호(참조문헌 1), 제 3-168082호(참조문헌 2), 및 제 6-153977호(참조문헌 3)에 기술되어 있는 것과 같이 섬유소용해제 및 혈전용해제로서 효과가 있다.

낫토키나제는 일본특허공개공보 제 1-180834(참조문헌 4) 및 제 8-208512(참조문헌 5)에 기술된 것과 같이, 혈전용해제 또는 혈전발생 억제제로서 주목을 받고 있다. 이런 참조문헌들은 예를 들어, 임상치료 분야에서 혈전증(thrombus)에 현재 사용되는 우로키나제, 스트렙토키나제와 같은 혈전용해제 및 혈소판 응집 억제제 및 조직 플라스미노겐 활성제와 같은 물질을 대체하는 활성 성분으로 낫토키나제를 함유하는 안전하게 쉽게 이용할 수 있는 약물과 관련된 기술들을 개시한다.

일본특허공개공보 제 2001-352929호(참조문헌 6)는 다음 방식으로 생산된 낫토의 가공 식품을 개시한다. 발효된 낫토에 독특한 향이 없는 상태에서, 낫토에 독특한 활성 성분은 대두로부터 정제된 대두 단백질 분말이 바실루스 서브틸리즈 낫토로 배양되는 투석 매질로부터 추출된다.

참조문헌 6의 제안에 따라, 이 가공 식품의 사용을 통해 낫토키나제를 사용하는 혈전용해 효과이외에 혈액 응고 시간을 지연시키고 혈전발생을 억제한다.

상기한대로, 낫토로부터 유도된 생성물은 혈전용해 효과이외에 혈액 응고 시 간의 지연과 혈전발생 억제와 같은 다양한 효과를 가진다. 본 발명의 발명자들은 참조문헌 6에 개시된 낫토의 가공 식품에서 상기한 효과들이외에 새로운 기능을 발견하였다.

본 발명의 목적은 낫토로부터 유도된 생성물을 사용하여 새로운 기능을 갖는 물질을 제공하는 것이다.

본 발명의 상기 목적을 성취하기 위해서, 바실루스 서브틸리즈 낫토로부터 유도되고 아미노 말단기로부터 순차적으로, 알라닌, 트레오닌, 아스파르트산, 글리신, 발린, 글루탐산, 트립토판, 아스파라긴, 발린, 아스파르트산, 글루타민, 아이소루신, 아스파르트산, 알라닌, 프롤린, 리신, 알라닌, 트립토판, 알라닌, 루신, 글리신, 티로신, 아스파르트산, 글리신, 트레오닌, 글리신, 트레오닌, 발린, 발린, 알라닌, 세린, 아이소루신, 아스파르트산, 트레오닌, 글리신, 발린, 글루탐산, 트립토판, 아스파라긴, 히스티딘, 프롤린, 알라닌, 루신, 리신, 글루탐산, 리신, 티로신, 아르기닌, 글리신, 티로신, 아스파라긴, 프롤린, 글루탐산, 아스파라긴, 프롤린, 아스파라긴, 글루탐산, 프롤린, 글루탐산, 아스파라긴, 글루탐산, 메티오닌, 아스파라긴, 트립토판, 트리신, 아스파르트산, 알라닌, 발린, 알라닌, 글리신, 글루탐산, 알라닌, 세린, 프롤린, 티로신, 아스파르트산, 아스파르트산, 루신, 알라닌, 히스티딘, 글리신, 트레오닌, 히스티딘, 발린 및 트레오닌을 갖는 1차 구조 아미노산 서열, 알라닌, 페닐알라닌, 세린, 글루탐산, 아스파르트산, 글리신, 글리 신, 트레오닌, 아스파르트산, 알라닌, 아스파르트산, 아이소루신, 루신, 글루탐산, 알라닌, 글리신, 글루탐산, 트립토판, 발린 및 루신을 갖는 2차 구조 아미노산 서열, 아스파르트산, 알라닌, 글루탐산, 글리신, 아스파라긴, 프롤린, 히스티딘, 프롤린, 글루탐산, 메티오닌, 알라닌, 프롤린, 아스파르트산 및 발린을 갖는 3차 구조 아미노산 서열 및 발린, 프롤린, 글리신, 글루타민, 알라닌, 티로신, 글루탐산, 아스파르트산, 글리신, 트립토판 및 아스파르트산을 갖는 4차 구조 아미노산 서열을 포함하는 단백질로 필수적으로 구성되는 혈액-점도 저하제를 제공하여, 전혈의 점도를 감소시킨다.

실시예

본 발명의 실시예는 첨부된 도면들을 참조하여 기술될 것이다. 본 발명의 발명자들은 바실루스 서브틸리즈 낫토 배양의 대두 액체 배지로부터 섬유소용해 물질을 효과적으로 정제하여 얻은 생성물(이후에는 NKCP로 칭함)인 가공 식품을 개발하였다. 개발하는 동안, 본 발명의 발명자들은 혈전을 용해하는 낫토의 섬유소용해 활성의 연구 과정에서 혈전 용해제로서 혈액 점도 감소 효과를 새로 발견하였다.

상기 NKCP 생산은 아래에 기술될 것이다. 바실루스 서브틸리즈 낫토(다카하시 균주)를 순수한 물에 첨가하고 교반하여 서스펜션을 제조한다. 소량의 서스펜션을 표준 한천 배지를 사용하여 제조한 한천평판배지에 접종시킨다. 한천평판배지상에 바실루스 서브틸리즈의 군체를 얻기 위해 상기 서스펜션을 24시간 동안 37℃에서 배양시킨다.

재료들로 1g의 글루코스 및 4g의 대두 단백질 분말을 함유하는 200ml의 액체 배지를 내부 부피가 500ml인 삼각 플라스크(엘렌메이어 플라스크)에서 제조한다. 내부를 살균하기 위하여 삼각 플라스크를 30분 동안 120℃의 가압 멸균기에 놓는다. 대두 단백질 분말을 대두로부터 정제시킨다. 대두를 갈아서 얻은 대두 분말은 재료로 사용될 수 있다. 대두 단백질은 재료 내에 함유되는 것으로 충분하다.

바실루스 서브틸리즈 낫토는 한천평판배지에 배양된 바실루스 서브틸리즈 낫토의 군체로부터 2mm의 지름을 갖는 접종 루프로 일단 샘플을 만든다. 샘플 바실루스 서브틸리즈 낫토를 삼각 플라스크 속의 액체 배지상에 접종시킨다. 바실루스 서브틸리즈 낫토 배지가 접종된 액체 배지를 함유하는 삼각 플라스크를 40℃로 개방시켜 유지하고 삼각 플라스크 속의 액체 배지를 배양하기 위해 2일 동안 회전시키고 진동시킨다.

100g의 글루코스, 400g의 대두 단백질 분말 및 가용성 전분을 함유하는 20L의 액체 배지를 내부 부피가 30L인 단지 발효기(jar fermenter)에서 제조하여, 액체 배지를 살균시킨다. 또한, 삼각 플라스크에서 배양된 200ml의 바실루스 서브틸리즈 낫토 배지를 단지 발효기 속의 액체 배지에 첨가한다. 얻어진 배지를 2일 동안 42℃에서 끓이고 교반시킨다.

세 개의 다른 동일한 배지를 약 50L의 대두 단백질 액체 배지를 얻기 위해 준비한다.

바실루스 서브틸리즈 낫토 균체와 불순물들을 얻어진 대두 단백질 액체 배지로부터 원심분리로 제거하고, 1mol의 황산 암모늄을 이에 첨가한다. 황산 암모늄의 첨가는 발효 용액에 분산된 다양한 효소들과 같은 고분자 화합물들을 포함하는 단 백질들을 소수성으로 만들어 응고를 용이하게 한다. 황산 암모늄의 첨가는 새로운 불용성 물질들을 생산한다. 이런 물질들은 유리 섬유 필터 종이로 여과시킨다.

1 몰 황산 암모늄 용액으로 평형화된 소수성 크로마토그래피 수지를 여과하여 얻은 대두 단백질 액체 배지에 적신다. 소수성 고분자 화합물들을 수지 위에 응고(결합)시킨다. 수지 위의 화합물들은 수지 위에 결합된 고분자 화합물들을 용리하기 위해 0.1-몰 탄산수소 암모늄에 적시어, 40L의 농축된 액체 배지를 얻는다.

농축 액체 배지를 저분자 물질들을 분리하기 위해 분자량 10,000의 제조 스케일을 갖는 한외여과막을 사용하여 한외여과한다. 농축 액체 배지를 40L부터 10L까지 농축시킨다. 20L의 용액을 얻기 위해 10L의 순수한 물을 한외여과막을 통해 얻어진 농축액에 첨가한다. 얻어진 용액을 다시 한외여과시킨다. 이 용액을 저분자 물질들을 분리시킴으로써 부피가 10L가 될 때까지 반복해서 3회 농축시킨다. 이 3회의 농축으로, 거의 모든 저분자 물질들이 제거되어진 발효된 대두 단백질 액체 배지를 제조할 수 있다.

발효된 낫토에 독특한 향의 주요 성분들은 다이메틸파이라진(분자량: 108.14), 트라이메틸파이라진(분자량: 122.17), 테트라메틸파이라진(분자량: 126.20), 2-메틸 부티레이트(분자량: 102.13), 아이소발레르산(분자량: 102.13) 및 암모니아(분자량:17.03)와 같은 저분자량 화합물들이다. 낫토에 함유된 비타민 K₂는 649의 분자량을 가진 탄화수소 화합물이다. 반면에, 효소(예를 들어, 낫토키나제)와 같은 단백질들은 수 만 이상의 분자량을 갖는 고분자 화합물들이다.

한외여과에 의해 저분자 물질들을 제거함으로써, 발효 낫토에 독특한 "향료" 성분과 같은 거의 모든 저분자 물질들과 비타민 K₂는 발효 대두 단백질 액체 배지로부터 제거될 수 있다. 마지막으로, 희석제로서 2kg의 락토오스를 한외여과로 저분자 물질들을 제거한 발효 대두 단백질 액체 배지에 첨가하고, 약 2.1kg의 대두 단백질 발효 분말(NKCP)을 제조하기 위하여 얻어진 용액을 동결건조하였다.

1990년대부터, 낫토로부터 발생된 섬유소용해 물질로 작용하는 낫토키나제는 서브틸리신(알칼린 프로테아제)으로 보고되었다. 상기대로 제조된 NKCP의 주요 활성 물질을 정제하고, 다양한 장치 분석법들로 검사한다. 분석 결과는 주요 활성 물질은 바실루스 서브틸리즈 낫토에 의해 분비된 효소들의 하나로 작용하는 34,000-달톤 바실로펩티다제 F이고, 종래의 낫토키나제와 다르다는 것을 나타내었다.

NKCP 기능성 식품으로 표준을 정하기 위하여, 스트로마 분해 활성이라고 불리는 통상적인 치환 지수이외에 다음 측정 키트를 제조하여 정량 분석을 수행하였다. 키트를 34,000-달톤 바실로펩티다제 F를 제조하자마자 효소면역흡착분석법(enzyme-linked immunosorbent Assay,ELISA)으로 제조하였다. 이런 분석법들은 일본 식품 연구소에 따른 질량 분석에 적절한 것으로 확인되었다.

기능성 식품으로 NKCP를 개발하기 위해서, 많은 동물 실험과 인간 임상 시험에서 안정성과 효과를 검사하였다. 안정성의 경우, 결과는 보건부, 노동부 및 복지부가 채택한 요구에 따라 특정한 건강 용도를 위한 식품의 수준과 일치하였고 임상적 복용량 내에서 임상적인 문제는 발생되지 않았다. 섬유소용해 활성에 예상되는 효과는 많은 동물 실험과 많은 인간 임상 시험에서 확인하였다. 이런 실험들과 시험들의 과정에서, 종래에 서브틸리신으로 보고된 혈전증을 위한 섬유소용해 활성뿐만 아니라, 혈전용해를 억제하고 혈액 점도를 감소시키는 작용도 NKCP에서 발견되었다.

이런 실시예의 NKCP를 함유하는 항응고인자(anticoagulant)에서 혈액 점도를 감소시키기 위한 작용에 대한 증거는 아래에 기술될 것이다. 사전에 동의를 얻은 비흡연자이고 20세 내지 22세인 지원자들로부터 신혈을 수집하였다. 수집한 직후의 신혈을 진동 점도계를 37℃로 유지 시킨 측정 용기에 부었다. 임상 시험 값들과 혈액의 점도 값들을 400 내지 500 mPaㆍS의 전단 속도로 시간에 걸쳐 측정하였다.

샘플을 생리식염수(normal saline)에 용해시키고 1/100의 샘플을 신혈을 부은 측정 용기에 첨가하였다. 신혈을 점도 측정의 과정에서 샘플과 빠르게 교반하였다. 응고/섬유소용해 시스템을 자극하지 않고 조심스럽게 혈액을 수집하였다. 혈액의 응고가 진동 점도계에서 관찰될 수 있도록 혈액을 처리하였다.

상기 방법에 의해 측정된 인간 혈액의 점도는 마치 혈액이 실제 인체를 흐르는 것과 같은 생리적 변화를 유지하면서 생리적 온도에서 항응고인자 또는 희석제 없이 관찰될 수 있다. 혈액 점도는 혈액을 측정 시스템에 놓은 직후에 균형 상태를 나타낸다. 점도는 혈액 응고 반응을 기초로하여 균형 상태 후 약 30초 동안 지수적으로 증가한다. 상세한 내용들은 참조문헌 7, 8 및 9를 참조하라.

MC-FAN(마이크로 채널 에레이 유동 분석기)과 같은 다른 혈액 점도 측정 장치들에서, 측정은 장치에서의 혈액 응고를 막기 위해 항응고인자로 수행한다. 이것 은 혈액에서 혈액 세포들(대부분 적혈구 세포)의 흡착 및 변형과 관련된 혈액 점도가 측정될 때 만족된다. 그러나, 진동 점도계는 혈액의 응고와 섬유소용해를 포함하는 생체 조건하에서의 측정에서 상기 장치보다 우수하다.

점도의 지수적 증가 시기는 혈액이 0.05mg/ml 또는 그 이상의 양으로 NKCP에 첨가될 때 지연된다. 점도의 증가는 0.05mg/ml 또는 그 이상의 양에서 확인되지 않는다. 균형 점도는 0.25mg/ml의 양으로 약 10% 증가하고 0.5mg/ml의 양으로 약 20% 증가되었다. NKCP에 혈액의 첨가에 의한 응고 및 발현 시기의 징후의 정도는 혈전용해제로 작용하는 조직 플라스미노겐 활성제 또는 항응고인자로 작용하는 헤파린의 첨가와 다르다.

NKCP 주입에 따른 임상 조건에서 혈액 점도를 측정한다. 8명의 성인 피험자에게 사전 동의를 받았다. 6명의 다른 피험자들은 위약-처리 대조군으로 선택한다. 선택한 피험자들에서, 급성 질환 및 만성 질환의 급성 악화를 분명히 격고 있는 사람들은 피험자에서 제외한다.

일일 투여량은 1,250mg의 NKCP와 동일한 10개의 정제이다. 연구 첫 날에, 10개의 정제를 아침에 주먹밥 2덩이와 투여한다. 두 번째 날부터, 10개의 정제를 한 주 동안 저녁식사 후 하루에 한 번 투여한다. 연구 첫 날에, 투여 전 및 투여 105분, 180분 및 240분 후에 혈액 점도를 측정한다.

혈액 점도를 상기한 것과 동일한 방식으로 모든 혈액 샘플을 진동 점도계의 37℃로 유지시킨 측정 용기에서 400 내지 500mPaㆍS의 전단 속도로 측정한다. 혈액 점도의 변화를 점도의 지수 변화 전에 정해진 "균형 점도"를 사용하여 결정한다. 표 1과 도 1에 나타낸대로, 혈액 점도의 감소는 180분과 240분에서 관찰되고, 반면 위약-처리한 군에서는 혈액 점도의 변화가 관찰되지 않는다.

시간에 따른 NKCP 투여 후 변수들의 변화

	투여 전	45분	105분	180분	240분
NKCP(n=8)	3.93±0.283	3.86±0.243	3.80±0.193	3.79±0.244	3.89±0.205
위약(n=6)	4.10±0.444	4.11±0.528	4.00±0.513	4.09±0.298	4.02±0.359

값은 8명의 지원자들의 평균 ±SD이다. 투여전과의 차이, 던칸의 다중범위 검정(Duncan's Multiple Test), *: p < 0.05, **: p < 001.

VIS: 32℃(mPaㆍS)에서의 혈액 점도, Ht: 헤마토크릿(39.8 - 51.8%)

NKCP가 첨가된 혈액, 다른 낫토키나제가 첨가된 혈액 및 다른 첨가제가 없는 혈액의 점도를 진동 점도계를 사용하여 측정한다. 도 2에서 변화를 확인한다. 도 2에서, NKCP가 첨가된 혈액, 다른 낫토키나제가 첨가된 혈액 및 다른 첨가제가 없는 혈액의 측정 결과를 각각 점, 검은 사각형 및 검은 삼각형으로 나타낸다. 점으로 나타낸 NKCP가 첨가된 혈액의 측정 결과는 다른 낫토키나제가 첨가된 혈액보다 적게 증가된다. 따라서, 혈액 점도의 변화는 낫토를 함유하는 효소 및 단백질에서 반드시 발견되지 않는다.

혈액 점도 측정의 경우, 마사히토 히토수키 등., "Rheologic Changes in Venous Blood During Prolonged Sitting", Thrombosis Research 100, pp. 409-412, 2000(참조문헌 7), 마사히토 히토수기 등., "Change in Blood Viscosity by Heparin and Argatroban", Thrombosis Research 104, pp. 371-374, 2001(참조문헌 8), 및 마사히토 하토스기 등., "Change in Blood Viscosity with Synthetic Protease Inhibitors", Jounral of Pharmacological Sciences, Vol. 91, pp. 334-336, 2003(참조문헌 9)을 참조하라.

상기한대로, 이런 실시예의 NKCP를 함유하는 혈액-점도 저하제에 따라, 혈액 점도는 명백히 감소된다. 혈액-점도 저하 작용은 혈전증의 유발체로 작용하는 혈액응고의 예방, 산소와 영양분의 공급의 증가와 관련된 근육과 같은 말초조직에서 활성력의 향상, 말초혈관 저항력의 감소에 따른 고혈압의 향상, 동맥경화증 진행의 예방 및 말초혈관 저항력의 감소에 의해 발생된 심부전 질환의 향상과 같은 인간의 건강과 복지의 향상에 기여할 것으로 예상된다.

혈액-점도 저하제는 혈액 수집 후 샘플 혈액을 사용하는 임상 시험에서 문제를 발생시키는 혈액 점도의 증가와 혈액 응고의 증가를 예방 및 임상 시험의 정확성과 편리성을 향상시키기 위한 특성을 가진다. 혈액-점도 저하제는 또한 점도 상승의 억제 때문에 임상 시험과 치료에 사용되는 도구에 의한 혈액 오염에 세정 효과를 향상시키는 것으로 예상된다. 혈액-점도 저하제는 치료 및 외과 수술을 받은 조직 및 생체로부터 얻은 조직 및 생체로부터 수집한 혈액의 유지 및 저장에 영향을 미칠 수 있다.

상기한 이런 실시예에 따른 혈액-점도 저하제로 작용하는 NKCP의 물리화학적 성질의 연구 결과는 아래에서 기술될 것이다. NKCP를 생산하는 균주로 작용하는 바실루스 서브틸리즈 낫토(다카하시 균주)의 유전자 서열을 "16S 리보소말 DNA의 뉴클레오티드 서열의 방법"에 의해 분석하면 168 바실루스 서브틸리즈 아종인 서브틸리스 균주 및 99.9% 이상의 상동성을 나타낸다.

NKCP의 분자량은 TOF-MS(비행시간형 질량분석계(time-of-flight mass spectrometry)로 측정하여 34,134 달톤이 된다. NKCP의 분자량은 약 34,100 달톤이 되도록 정해진다. 이 측정을 위해서, NKCP 샘플은 수퍼큐-토요필(SuperQ-Toyopeal) 650M, 부틸-토요필(Butyl-Toyopeal) 650M, 또는 토요필 HW-40F과 같은 분자체 담체를 사용하여 중력 크로마토그램으로 반복해서 정제한다. 상기와 동일한 방식으로 정제된 샘플들을 다음 측정에서 사용한다.

NKCP 구조를 아미노 말단기로부터 85개 아미노산 서열을 분석하기 위해 에드만 분해법(Edman degradation method)을 사용하여 자동 아미노산 서열 분석 장치로 분석한다. NKCP는 여러 펩타이드 서열을 얻기 위해 라이실 엔도펩티다제(Lysyl endopeptidase)를 사용하여 제한적으로 분해한다. 이런 펩타이드 절편들은 고압 액체 크로마토그램을 사용하여 정제한다. 정제된 절편들을 TOF-MF를 사용하여 질량 분석하고 에트만 분해법을 사용하여 자동 아미노산 잔기 서열 분석을 한다. 얻어진 NKCP 구조는 다음과 같다.

NKCP는 아미노기 말단로부터, "ATDGVEWNVDQIDAPKAWALGYDGTGTVVASIDTGVEWNHPALKEKYRGYNPENPNEPENEMNWYDAVAGEASPYDDLAHGTHVT" "AFSEDGGTDADILEAGEWVL", "DAEGNPHPEMAPDV" 및 "VPGQAYEDGWD"와 같은 구조 아미노산 서열(펩타이드 절편)을 가진다. 다시 말하면, NKCP는 아미노기 말단으로부터 상기 아미노산 서열을 갖는 바실루스 서브틸리즈 낫토로부터 유래된 단백질이다. 상기 서열에서, A는 알라닌; G는 글리신; M은 메티오닌; S는 세린; C는 시스테인; H는 히스티딘; N은 아스파라긴; T는 트레오닌, D는 아스파라트산; I는 아이소루신; P는 프롤린; V는 발린; E는 글루탐산; K는 라이신; Q는 글루타민, W는 트립토판, F는 페닐알라닌; L은 루신; R은 아르기닌 및 Y는 티로신을 나타낸다.

질량 분석 결과의 대조와 분자 구조의 분자량의 계산값의 대조, 지우-츄, 유 등 "Cloning, Genetic Organization, and Characterization of a Structural Gene Encoding Bacillopeptidase F from Bacillus Substilis*", The Journal of Biological Chemistry Vol. 265, No. 12, pp. 6845-6850, 1990(참조문헌 10)에 나타낸 바실루스 서브틸리즈의 유전자 데이타베이스의 대조, 아미노산 서열의 쉬운 생물학적 절단성의 결정 결과로부터, NKCP는 아래 구조 서열을 갖는 것으로 정해진다.

"ATDGVEWNVDQIDAPKAWALGYDGTGTVVASIDTGVEWNHPALKEKYRGYNPENPNEPENEMNWYDAVAGEASPYDDLAHGTHVTGTMVGSEPDGTNQIGVAPGAKWIAVKAFSEDGGTDADILEAGEWVLAPKDAEGNPHPEMAPDVVNNSWGGGSGLDEWYRDMVNAWRAADIFPEFSAGNTDLFIPGGPGSIANPANYPESFATVATDINKKLADFSLQGPSPYDEIKPEISAPGVNIRSSVPGQAYEDGWDFTSMAGPHVSAVAALLKQANASLSVDEMEDILTSTAEPLTDSTFPDSPNNGYGHGLVNAFDAVSAVTDGLGK".

NKCP는 아르기닌 잔기, 히스티딘 잔기 및 세린 잔기를 포함하는 동형 서열로서 세린 프로테아제의 활성 중심을 갖는 것으로 확인된다. 이것은 알란 슬로마 등., "Cloning and Characterization of the Gene for an Additional Extracellular Serine Protease of Bacillus Subtilis", Journal of Bacteriology, Vol. 173, No. 21, pp. 6889-6895, Vov. 1991(참조문헌 11)에 나타낸 바실루스 서브틸리즈의 세포외 프로테아제로 작용하는 바실로펩티다제 F에 의해 증명된다. 이것이 NKCP가 세린 프로테아제들의 하나라는 것을 확인시킨다.

일본 발효 전통 식품인 낫토의 일반적인 생리활성을 기술할 것이다. 낫토는 대두보다 높은 소화 흡수력을 가진다. 이것은 대두의 주요 성분으로 단백질, 지방 및 전분이 바실루스 서브틸리즈 낫토에 의해 아미노산, 지방산 및 글루코스로 분해되기 때문이다. 낫토는 섭취하자마자 높은 소화 흡수 효과를 가진다. 낫토에 함유된 대부분의 비타민 B 군은 신체 기능을 원활하게 하고 피로를 회복시킨다. 비타민 B₂는 낫토에 다량으로 함유되어 있고 안정피로에 효과가 있다. 낫토 속의 비타민 K₂의 함량은 식품 중에서 가장 높다. 이것이 골다공증 및 혈액 응고의 향상과 같은 혈액에서의 칼슘 대사를 향상시키는 것으로 예상할 수 있다.

바실루스 서브틸리즈 낫토에 의한 대두 단백질의 분해 과정에서, 프로테아제 및 아밀라제와 같은 다양한 효소들이 추출되고 소화를 증진시키고 신진대사를 활성화하는 활성 효소제로 작용한다. 낫토키나제는 혈전을 용해시킬 수 있다.

효소로서 낫토키나제와 NKCP의 차이를 생각해 볼 것이다. 낫토에서 발견되어 강한 섬유소용해 효소로 작용하는 낫토키나제는 바실루스 서브틸리즈 낫토로부터 분비된 일종의 세린 프로테아제이고 20,000 달톤의 분자량을 가진다.

낫토키나제는 혈전 및 플라스민을 위한 합성 색원체 기질 모두의 분해력을 가진다. 상기 효소이외에 27,000 달톤 이상의 분자량을 갖는 일부 섬유소용해 효소들을 낫토로부터 얻을 수 있다.

낫토에서 발견되어진 강한 섬유소용해 활성을 가진 새로운 섬유소용해 효소로 작용하는 낫토키나제는 생리식염수를 사용하여 낫토로부터 쉽게 추출할 수 있다. 낫토키나제는 20,000 달톤의 분자량과 8.6의 등전점(isoelectric point)을 가진다. 낫토키나제는 피브린뿐만 아니라 합성 색원체 플라스민 기질(S-2251)도 분해시킨다. 낫토키나제는 비교적 중성 pH에서 안정하고 60℃로 가열될 때 그 활성을 잃는다.

10배의 생리식염수를 4℃에서 낫토에 첨가하고 혼합물을 교반하고 원심분리 시킨다. 얻어진 상청액에 80%의 에탄올을 첨가하여 겔-여과시킨다. 얻어진 용리액을 농축하고, 미정제 효소 부분을 제조하기 위해 동결건조시킨다. 제조된 미정제 효소 부분은 친-우로키나제 활성제 활성을 갖는 섬유소용해 효소를 가진다. 3개 이상의 활성 피크가 27.000 달톤 이상의 분자량에서 발견된다.

상기한대로, NKCP는 바실루스 서브틸리즈 낫토의 배양 생성물로부터 얻은 섬유소용해 단백질의 미정제 정제 생성물이다. NKCP로부터 얻은 리심-X 결합(Lysim-X bond)에 가수분해 특이성을 갖는 바실루스 서브틸리즈 낫토로부터 유도된 단백질은 소정량의 활성 단백질을 함유하고, 이의 분자량 및 가장 최적의 pH는 각각 약 34,1000 달톤과 9.0이다. 비타민 K 및 발효 낫토의 독특한 향을 발생시키는 바실루스 서브틸리즈 낫토균을 미정제 생성물로부터 제거한다. 이것은 낫토키나제의 분자량과 다른 분자량을 가진다.

NKCP의 혈전증과 섬유소용해 시스템에 대한 작용이 아래에 기술될 것이다. NKCP는 인비트로와 인비보에서 섬유소용해 활성을 가지는 것으로 확인된다. 이 작용은 상업적으로 이용가능한 조직 플라스미노겐 활성제(t-Pa)보다 더욱 적절하다. NKCP 섬유소용해 활성이 증가되는 작용기작은 직접 피브린 분해와 플라스미노겐 활성제 억제 인자 1(PAI-1)의 분해에 의해 발생된다. 진동 점도계를 사용하여 측정함으로써 NKCP 작용기작이 혈액 점도를 감소시키는 것이 발견된다.

조직 배양액에 대한 응고 혈전용해 시스템 및 동물 실험에 대한 조사 결과를 나타낸다. NKCP를 첨가한 플라스미노겐 활성제 억제 인자 1(PAI-1)의 생성물 양을 인비트로와 제자리(in situ)에서 HUVEC 세포와 U87-MG 세포를 사용하여 NKCP를 첨가하지 않은 양과 비교한다. HUVEC 세포에 의해 생산된 전체 PAI-1은 48시간 동안 700ng/mL이고, 유리 PAI-1를 580ng/mL까지 증가시킨다. PAI-1 양에 대한 NKCP의 영향은 0 시간과 24 후에 발견되지 않는다.

U87-MG 세포에 의한 생산량은 고 NKCP 농도(10㎍/mL)의 완전배지(complete medium)에서 전체 배양시간 동안 완전히 억제된다. DMEM 배지의 경우, PAI-1 생산은 완전히 억제된다. NKCP가 첨가된 완전 배지와 DMEM 배지에서 PAI-1의 생성물들과 NKCP를 첨가하지 않은 PAI-1 생성물들을 비교한다. NKCP에 의한 영향은 HUVEC 세포에서는 발견되지 않고, 저분자량 단백질은 U87-MG 세포에서 증가한다. 이것은 NKCP의 섬유소용해 활성은 PAI-I 분해에 의한 플라스노미겐-활성화 기능이라는 것을 나타낸다.

NKCP를 수집 직후에 혈액에 첨가하고 혈액 점도를 진동 점도계를 사용하여 측정할 때, 혈액 점도는 감소된다. 조직 플라스노미겐 활성제(t-PA)의 비첨가, 및 이의 첨가, 및 대조예로 헤파린의 첨가를 사용하여, 300-초 임상 시험이 진동 점도계에 의해 응고를 나타낼 때, 항혈전 활성과 플라스민 활성에 의해 발생되지 않는 섬유소용해 활성은 NKCP의 첨가에 의해 발견된다. 건강한 어른이 7일 동안 250mg 내지 500mg의 NKCP를 섭취할 때, 혈액 점도의 감소가 관찰된다.

상기한대로, 본 발명에 따라, 상기한 아미노산 서열은 바실루스 서브틸리즈 낫토로부터 유도된 단백질로부터 얻기 때문에, 낫토로부터 기원된 생성물로서 바실루스 서브틸리즈 낫토로부터 유도된 단백질을 사용하여 혈액 점도를 감소시키는 새로운 물질을 제공한다.

Claims

바실루스 서브틸리즈 낫토로부터 유도되고 아미노 말단기로부터 순차적으로, 알라닌, 트레오닌, 아스파르트산, 글리신, 발린, 글루탐산, 트립토판, 아스파라긴, 발린, 아스파르트산, 글루타민, 아이소루신, 아스파르트산, 알라닌, 프롤린, 리신, 알라닌, 트립토판, 알라닌, 루신, 글리신, 티로신, 아스파르트산, 글리신, 트레오닌, 글리신, 트레오닌, 발린, 발린, 알라닌, 세린, 아이소루신, 아스파르트산, 트레오닌, 글리신, 발린, 글루탐산, 트립토판, 아스파라긴, 히스티딘, 프롤린, 알라닌, 루신, 리신, 글루탐산, 리신, 티로신, 아르기닌, 글리신, 티로신, 아스파라긴, 프롤린, 글루탐산, 아스파라긴, 프롤린, 아스파라긴, 글루탐산, 프롤린, 글루탐산, 아스파라긴, 글루탐산, 메티오닌, 아스파라긴, 트립토판, 티로신, 아스파르트산, 알라닌, 발린, 알라닌, 글리신, 글루탐산, 알라닌, 세린, 프롤린, 티로신, 아스파르트산, 아스파르트산, 루신, 알라닌, 히스티딘, 글리신, 트레오닌, 히스티딘, 발린 및 트레오닌을 갖는 1차 구조 아미노산 서열,

알라닌, 페닐알라닌, 세린, 글루탐산, 아스파르트산, 글리신, 글리신, 트레오닌, 아스파르트산, 알라닌, 아스파르트산, 아이소루신, 루신, 글루탐산, 알라닌, 글리신, 글루탐산, 트립토판, 발린 및 루신을 갖는 2차 구조 아미노산 서열,

아스파르트산, 알라닌, 글루탐산, 글리신, 아스파라긴, 프롤린, 히스티딘, 프롤린, 글루탐산, 메티오닌, 알라닌, 프롤린, 아스파르트산 및 발린을 갖는 3차 구조 아미노산 서열 및

발린, 프롤린, 글리신, 글루타민, 알라닌, 티로신, 글루탐산, 아스파르트산, 글리신, 트립토판 및 아스파르트산을 갖는 4차 구조 아미노산 서열을 포함하는 단백질로 필수적으로 구성되는 것을 특징으로 하여 전혈의 점도를 저하시키는 혈액-점도 저하제.
제 1 항에 있어서,

바실루스 서브틸리즈 낫토로부터 유도된 단백질이 필수적으로 대두로부터 얻은 대두 단백질을 함유하는 바실루스 서브틸리즈 낫토의 액체 배지로부터 바실루스 서브틸리즈 낫토균 및 바실루스 서브틸리즈 낫토에 의해 생산된 효소들보다 낮은 분자량을 갖는 저분자량 성분들을 제거함으로써 얻은 대두 단백질 발효물로 구성되는 혈액-점도 저하제.
제 2 항에 있어서,

저분자량 성분들이 한외여과로 제거되는 혈액-점도 저하제.