JP2000504941A

JP2000504941A - トロンビンによって活性化され得るプラスミノーゲンアクチベーター

Info

Publication number: JP2000504941A
Application number: JP10507530A
Authority: JP
Inventors: コーナート，ウルリヒ; フィッシャー，シュテファン
Original assignee: ロシュダイアグノスティックスゲーエムベーハー
Priority date: 1996-08-02
Filing date: 1997-07-21
Publication date: 2000-04-25
Also published as: KR20000029755A; ZA976876B; AU3769797A; TR199900193T2; BR9711015A; CN1226926A; EP0917567A1; WO1998005762A1; TW450996B; CA2262751A1

Abstract

(57)【要約】プラスミノーゲンアクチベーターは、（ａ）トロンビンによって切断され、そのため二本鎖形態になるような方法で改変され；（ｂ）その酵素原性がｔ−ＰＡのそれの少なくとも１．２倍になるような方法で改変され；そして（ｃ）そのフィブリン結合力はプラスミノーゲンアクチベーターの５０％以上が血液血餅に進入できるほど低下させられている。このプラスミノーゲンアクチベーターは、改良されたフィブリン特異性と低下した副作用を有する。

Description

【発明の詳細な説明】トロンビンによって活性化され得るプラスミノーゲンアクチベーター本発明は、トロンビンで活性化し得るプラスミノーゲンアクチベーター、血栓塞栓疾患（thromboembolic disease）を処置する医薬、そのようなプラスミノーゲンアクチベーターを含有する医薬組成物およびその用途に関する。組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ−ｐＡ）は、プラスミノーゲンのプラスミンへの転換を触媒するいくつかのドメインからなるセリンプロテアーゼであり、フィブリン溶解治療に用いられる。多くのｔ−ＰＡ変種および変異体が公知であり、例えば、T.J.R.Harris（1987 ）およびJ.Krause（1988）による概説文献がある。ｔ−ＰＡの作用の機序に関しては、フィブリン溶解が、ｔ−ＰＡとプラスミノーゲンアクチベーターインヒビター１（ＰＡＩ−１、セルピンファミリー由来のセリンプロテアーゼインヒビター）との相互作用によって部分的に調節されていることが、その他のものの中でも知られている。ＰＡＩ−１は、主にアミノ酸２９６〜３０２を介してｔ−ＰＡに結合する。この領域の変異は、ＰＡＩ−１のｔ −ＰＡに対する阻害効果を低下させる（E.L.Madison et al.(1990)）。ｔ−ＰＡのアミノ酸領域２９６〜３０２とＰＡＩ−１との間の相互作用の機序に関してさらなる調査が行われた（例えば、E.L.Madison，Nature 339（1989）721 -723;R.V.Schohet， Thrombosis and Haemostasis 71(1994) 124-128;C.J.Re fino,Thrombosis and Haemostasis 70（1993）313-319;N.F.Paoni,ProteinEngin eering ６（1993）529-534およびThrombosis and Haemostasis 70（1993）307-3 12；W.F.Bennett，J.Biol.Chem．266（1991）5191-5201;D.Eastman,Biochemistr y 31（1992）419-422を参照されたい)。改変されていないヒトｔ−ｐＡ（以下、ｔ−ＰＡという）は、血漿中で生じる形態では５２７アミノ酸からなり、プラスミンにより２本の鎖に切断され得るが、ジスルフィド架橋によって依然として一緒に保持されている。Ａ鎖（重鎖とも呼ばれる）は、４つの構造ドメインからなる。フィンガードメイン（アミノ酸１〜４９）には、フィブロネクチンのフィンガ一構造とある種の類似性がある。成長因子ドメイン（アミノ酸５０〜８６）は、ある程度、ネズミおよびヒトの上皮成長因子と相同である。クリングルドメイン（アミノ酸８７〜２６１）は、相当程度、プラスミノーゲンの４番目と５番目のクリングルドメインに相同である。ｔ−ＰＡのフィンガーおよびクリングル２ドメインは、特に、フィブリン結合およびフィブリンによるタンパク質分解活性の刺激に関与する。ｔ−ＰＡのＢ鎖（アミノ酸２７６〜５２７、プロテアーゼドメイン）は、セリンプロテアーゼであり、ウロキナーゼおよびプラスミンのＢ鎖に実質的に相同である（T.J.R.Harr is(1987)およびJ.Krause(1988)）。ｔ−ＰＡの酵素活性（プラスミノーゲンのプラスミンへの触媒的活性化）は、フィブリンまたはフィブリン切断産物の非存在下では低いが、これらの刺激物質の存在下で増加する（１０倍以上）。ｔ−ＰＡのin vivoでの作用の機序は、例えば、Korninger and Collen，Tromb.Haemostasis 46(1981)561-565に記載されている。ｔ−ＰＡは、プラスミノーゲンをプラスミンヘ活性化する。プラスミンはフィブリンを切断して可溶性のフィブリン切断産物を形成する。ｔ−ＰＡは、血中に存在するプロテアーゼ／プラスミンによって、アミノ酸２７５（アルギニン）と２７６（イソロイシン）との間で切断され、それにより活性化される。この過程では、２つの部分鎖はシステイン架橋により結合したままである。フィブリンおよびフィブリン切断産物による活性を刺激する能力は、ｔ−ＰＡの必須の特徴で、それによりｔ−ＰＡは他の公知のプラスミノーゲンアクチベーター、例えば、ウロキナーゼまたはストレプトキナーゼから区別される。刺激の効力は、ｔ−ＰＡのアミノ酸配列を改変することによりさらに改良することができる。刺激の効力の測定は、フィブリン存在下および非存在下での触媒効率の比（ｋ_cat／Ｋ_m）である。ｋ_catは、触媒反応の速度定数で、Ｋ_mはミハエリス定数である。ｔ−ＰＡの刺激の効力はアミノ酸２９２および／または３０５を改変することにより１９倍〜８１倍にまで増加し得る(E.L.Madison et al.,Science 26 2(1993)419-421)。ｔ−ＰＡ誘導体は、米国特許第５，５０１，８５３号から公知であり、それは、アミノ酸２７２〜２８０の領域、特に２７４〜２７７の領域、およびさらにはグリコシル化部位の領域（１１７〜１１９および１８４〜１８６）において改変されている。このようなｔ−ＰＡ誘導体は、改良されたタンパク質分解およびプラスミノーゲン分解活性、阻害に対して低下した感受性、フィブリンに対する改良された親和性および／またはプラスミノーゲン分解活性の改良されたフィブリン依存性を有する。トロンビンで活性化し得るプラスミノーゲンアクチベーターは、Wen-Pin Yang et al.，によりBiochemistry 33（1994）2306-2312に記載されている。このキメラプラスミノーゲンアクチベーター（59D8-scuPA-t）は、抗−フィブリン抗体のＦａｂフラグメント（59D8）と、低分子量の一本鎖ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター（scuPA）から、部位特異的変異誘発によるアミノ酸Phe-157 とLys-158の欠失によって得られるトロンビンで活性化し得る低分子量の一本鎖ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター（scuPA-t）のＣ末端部分から調製された。トロンビンで活性化し得るプラスミノーゲン変異体は、K.N.Dawson et al.，によりJ.Biol.Chem.269（1984）15989-15992に記載されている。これらのプラスミノーゲン誘導体は、切断部位のＰ３、Ｐ２およびＰ１’アミノ酸をトロンビンで切断できる配列によって置換することにより得られた。 N.F.Paoni et alは、Protein Engineering ５（1992）259-266において、ｔ− ＰＡのアミノ酸領域２９６〜２９９における改変を記載している。その結果、改良されたフィブリン特異性が得られている。トロンビンで活性化し得るプラスミノーゲンアクチベーターは、米国特許第５，２００，３４０号に記載され、それは、それらが活性化のためのトロンビン切断部位を含むように改変されている。それはまた、成長因子ドメイン（ＥＧＦドメイン）はそのようなｔ−ＰＡ誘導体中で欠失させることもできるが、フィブリン結合ドメイン（フィンガードメイン）およびクリングル構造は保存されなければいけないとも述べている。ＷＯ９１／０９１１８およびＷＯ９４／１０３１８からは、プラスミノーゲンがトロンビンによって活性化され、トロンビン切断部位の導入によりプラスミンを形成し得ることが知られている。トロンビンは、血餅に含まれているので、この活性化が、主に血餅において起こることが意図されている。しかしながら、そのような方法の不利な点は、改変されたプラスミノーゲンが、このために多量に患者に投与されなければならないということである。本発明の目的は、高い特異性と効果によりin vivoで血餅を溶解し得る改良されたプラスミノーゲンアクチベーターを提供することである。この目的は、プラスミノーゲンアクチベーターによって達成され、それは、ヒト組織プラスミノーゲンアクチベーターを基にして、ａ）プラスミノーゲンアクチベーターがトロンビンによって切断され、そのような切断により二本鎖形態に転換されるよう改変されており、ｂ）酵素原性が、ヒトｔ−ＰＡと比較して、少なくとも１．２倍、好ましくは２倍より高いように改変されており、そしてｃ）そのフィブリン結合が、プラスミノーゲンアクチベーターが５０％以上血餅に浸透し得る程度に低下している、ものである。そのようなプラスミノーゲンアクチベーターは、血餅に特異的に作用し、したがって、公知のプラスミノーゲンアクチベーターよりも副作用が実質的に少ない。出発点は、ヒト組織タイププラスミノーゲンアクチベーターの配列である。したがって、本発明の「ヒト組織タイププラスミノーゲンアクチベーターを基にして」とは、本発明のプラスミノーゲンアクチベーターの配列が、ヒトプラスミノーゲンアクチベーターの配列から誘導されることを意味する。このことは、一方で、ｔ−ＰＡに特徴的な構造的特性（ドメイン）が、少なくとも部分的に構造的に保持されることを意味する。例えば、クリングル２および／またはプロテアーゼドメインの構造がその中で保持されており、さらに、本発明による改変を有しているプラスミノーゲンアクチベーターを、本発明の意味において用いることができることが見出されている。さらなるドメインが保持され、本発明による特性が、アミノ酸の欠失、変異および／または付加によってもたらされることもまた可能である。アミノ酸配列の変更は、当業者に公知の方法、例えば、部位特異的変異誘発またはＰＣＲのような方法によって行うことができる。好ましい実施態様においては、本発明のプラスミノーゲンアクチベーターは、ヒト組織タイププラスミノーゲンアクチベーターと比較して、本発明のプラスミノーゲンアクチベーターがプラスミンによりアミノ酸Ｐ１（２７５）とＰ１’ （２７６）との間で切断される能力が低下しているように改変される。好ましくは、本発明のプラスミノーゲンアクチベーターにおけるプラスミンによる切断能力は、１０％以上、好ましくは２０％以上、そして最も好ましくは５０％以上低下させられている。この関係において、プラスミンによる切断能力は完全に破壊されている必要はない。特に、トロンビン活性化は、本発明のプラスミノーゲンアクチベーターのプラスミンによる切断能力によって改良される。しかしながら、この切断能力が、生理学的に関連した切断がin vivoでもはや起こらない程度まで低下させられていることもまた好ましい。その結果、副作用を劇的に減少させることが可能である。したがって、凝固パラメーターの減成は、in vivoで劇的に低下し、出血時間は公知のプラスミノーゲンの場合のようには著しく増加しない。プラスミンによる切断能力は、in vitro試験で測定することができる。このため、プラスミノーゲンアクチベーターを５分間２５℃でプラスミンの量を増加させながらインキュベーションし、続いて、ＳＤＳ電気泳動を、１２．５〜１５％のアクリルアミドを含有するアクリルアミドゲルで、プラスミノーゲンアクチベーターの大きさに応じて行う（U.Kohnert et al.,Protein Engineering 5(1992) 93-100）。それがもはやプラスミンによってＰ１とＰ１’（Schechter,J and Berger,A., Biochem，Biophys.Res.Commun．27(1967)157-162による名称による）との間で切断されないかその程度が減少するようなプラスミノーゲンアクチベーターの改変は、当業者に公知の方法で行うことができる。プラスミンは、配列Ｒ２７５−１２７６（一文字コードのアミノ酸名）を切断する。例えば、プラスミンによる切断能力は１つまたは両方のアミノ酸を改変することにより破壊されるか少なくとも劇的に低下させることができる。プラスミンによる切断能力はまた、位置Ｐ４−Ｐ３’（アミノ酸２７２−２７８）を改変することによっても低下させることができる。この場合、Ｐ２は、好ましくは小さな、好ましくは疎水性のおよび／または非芳香族のアミノ酸、例えば、Ｐに転換される。その結果、驚くべきことに、プラスミンによる切断能力の低下に加えてトロンビンによる切断能力を達成することも可能なのである。この過程において、以下の一般的な条件の１つまたはそれ以上が好ましくは厳守される：（Ｐ）Ｐ４：任意のアミノ酸（Ｐではない。Ｐ２がＰの場合、好ましくはＬ，Ｉ，Ｖである）（Ｑ）Ｐ３：任意のアミノ酸（Ｆ）Ｐ２：疎水性アミノ酸（Ｆ，Ｈ，Ｇ，Ｖ，Ｌ，Ｉ，Ｔ，ＡまたはＰ）特に好ましくはＰ）（Ｒ）Ｐ１：ＲまたはＫ、好ましくはＲ（Ｉ）Ｐ１’：ＶまたはＩ、好ましくはＩ（Ｋ）Ｐ２’：Ｖ，Ｌ，ＩまたはＫ、好ましくはＶ（Ｇ）Ｐ３’：ＧＰ４は、Ｖに、Ｐ２はＰに、そしてＰ２’はＶに、特に好ましく転換される。これは、特に好ましい切断部位（２７２−２７８）ＶＱＰＲＩＶＧ（SEQ ID NO.1 ）となる。トロンビン切断部位はまた、技術の現状に従っても誘導することができる。しかしながら、適切な変異が好ましくはアミノ酸２６４〜２８８の領域に導入される。トロンビンへの親和性を誘導するためのｔ−ＰＡの改変はまた、ループ４５９〜４７１、自己分解ループ４１７〜４２５、および／またはアミノ酸Ｑ４７５、Ｋ５0５および／またはＥ５0６を改変することによっても達成することができる。酵素のその基質への特異性は、実質的に切断部位の配列（一次配列）に依存している。トロンビンおよびプラスミンのようなセリンプロテアーゼの場合、Ｐ１残基は、重要な特異的な決定基である。折りたたまれたタンパク質基質の特異性もまた、酵素（トロンビンまたはプラスミン）と基質（プラスミノーゲンアクチベーター）との間の特徴ある接触、ならびに切断部位のコンフォメーションおよび可撓性に依存する。プラスミンおよびトロンビンの主な特異性は非常に似ているので（どちらもＰ１位のアルギニンの後を切断する）、プラスミンによる切断（プラスミンの活性化能力）が減少し、トロンビンによる切断（トロンビンの活性化能力）が存在するか、実質的にプラスミンの活性化能力よりも高い（少なくとも２〜１０倍）プラスミノーゲンアクチベーターを得ることは容易にできることではない。しかしながら、驚くべきことに、そのような性質は、酵素と基質との間の第２の結合部位を改変することによって、および活性化ループの構造的および動的（dynamic）性質を改変することによって得ることができるということが、見出された。一方でプラスミンによる切断能力を減少させつつ同時にトロンビン特異的切断部位を導入することは、好ましくは、主たる特異性を、活性化ループのアミノ酸２６４と２８８との間の変異により、変更することにより行われる。この場合、領域２７２〜２７７（Ｐ４〜Ｐ２’）における上記の変異が特に好ましい。トロンビン切断能力は、結合ループの可撓性および／または接近可能性を改変することにより改良することができる。このため、Ｇ２６５（低い可撓性を導く変異）またはＲ２６７（Ｇ２６５とＥ４１０との間の塩架橋の変更または切断を導く変異）を改変することが特に好ましい。領域２６４と２６７との間への挿入もまた好ましい。Ｒ２６７は、特に好ましくはＳに改変される（D.Lamba et al. ,J.Mo1.Bio1.258(1996)117-135）。可撓性を増加させるために用いることができる変異は、好ましくはＰ４のＦへの、Ｐ３のＧへの、Ｐ２のＰへの、およびＰ２’のＶへの変異と組み合わせてＲ２６７をＳに変更することである。トロンビン切断能力および特異性は、第２の特異的結合部位を変更することによりさらに改良することができる。このため、ループ４５９〜４７１を、例えば、完全にまたは部分的に欠失させてもよい。このループは、アミノ酸：ＧＤＴＲＳＧＧＰＱＡＮＬＨ（SEQ ID NO.2）からなる。このループ内の領域ＰＱＡＮＬＨ（SEQ ID NO.3）は、好ましくは、完全にまたは少なくとも部分的に欠失されているか（ここでＨは好ましくは保存される）、そのアミノ酸配列が改変されている。以下の配列：ＧＩＰＲＩＶ（SEQ ID NO.4）ＡＱＰＲＩＫ（SEQ ID NO.5）が、アミノ酸２７２〜２７７の領域に好ましく用いられる。２６５と２７７との間のアミノ酸領域に配列：ＧＬＳＱＡＳＱＧＩＰＲＩＶ（SEQ ID NO.7）を用いることもまた好都合である（ｔ−ｐＡの元の配列：ＧＬＲＱＹＳＱＰＱＦＲＩＫ（SEQ ID NO.6））。配列ＧＬＲＱＹＳＱＡＱＧＩＰＲＩＶ（SEQ ID NO.8）もまたこの領域には好ましい。この領域では、アミノ酸ＧおよびＩが、それを伸長するため、ＱとＰ（元の配列はＱとＦ）との間に挿入されている。そのような挿入は、２６４と２７６との間の領域のいかなる部位においても好ましく行われる。その中で、切断部位（SEQ ID NO.1）が、Ｐ４からＦへの、Ｐ３からＧへの、Ｐ２からＰへのおよびＰ２’からＶへの変異、ならびにＲ２６７からＳへの変異の１以上と、好ましくはすべてと組み合わされている本発明の化合物もまた特に好ましい。本発明の好ましい実施態様においては、プラスミノーゲンアクチベーターは、さらに、一本鎖型の活性は劇的に低下させるが二本鎖型の活性は低下させず、したがって、酵素原性の１．２倍まで、好ましくは２倍以上に改良する変異を含む。酵素原性は、二本鎖型の活性および一本鎖型の活性の比率（quatient）として理解される。活性は、アミド分解により測定される。そのようなプラスミノーゲンアクチベーターは、劇的に低下した副作用を伴って、in vivoで血栓溶解の高い選択性と効果を達成する。一本鎖型の適切で好ましい変異は、例えば、E.L.Ma dison et al.，Science 262(1993)419-421に記載されている。酵素原性（プラスミノーゲンアクチベーターの二本鎖型のアミド分解活性の一本鎖型の活性に対する比）を増加させるため（ヒト組織タイププラスミノーゲンアクチベーターから誘導された全てのプラスミノーゲンアクチベーターについても）、Ｋ４２９をＱに、および／またはＨ４１７をＴに改変するか、および／またはＫ４２９とＨ４１７との間の相互作用を抑制または妨害することが特に好ましい。本発明の特に好ましい化合物は、切断部位（２７２〜２７８）ＶＱＰＲＩＶＧ（SEQ ID NO.1）と、Ｋ４２９のＱへの、および／またはＨ４１７のＴへのさらなる変異を含む。フィブリン結合は、フィブリン結合に特異的なｔ−ＰＡのドメイン（フィブリン結合ドメイン、フィンガードメイン）を欠失させることにより、あるいはフィンガードメインを介するフィブリン結合が起きないかまたはほんのわずかな程度であるような方法（機能的に活性なフィンガードメインがない）でそれに変異を起こすことにより、減少させることができる。フィブリン結合の低下は、プラスミノーゲンが血餅に浸透すること（好ましくは５０％以上の程度）および一様に分散することを可能にする。それはトロンビンによってそこで切断され、活性な二本鎖型でその活性を示す。したがって、そのフィブリン結合がこのようにして低下させられたプラスミノーゲンアクチベーターは、もはやｔ−ＰＡに典型的な高親和性のフィブリン結合を示さない。この作用の特異的な機序はプラスミノーゲンアクチベーターの効力を増加させ、特に、それは劇的に副作用を低下させる。本発明のプラスミノーゲンアクチベーターの血餅への浸透は、in vitroモデルで測定することができる。血餅浸透の程度および血餅内での分布は、視覚的に測定することができる。評価については、米国特許第５，２２３，２５６号に記載されたプラスミノーゲンアクチベーターを、血餅に浸透し一様に分布するため、定義により１００％の値を表す標準物（３μg/mlの濃度で測定したもの）として用いる。ＥＰ−Ｂ００９３６１９による組換えヒト組織タイププラスミノーゲンアクチベーターを、定義にしたがって、血餅に浸透せず実質的に表面に結合するさらなる標準物として用いる。実施例３ｃに記載された手順を用いて、血餅の浸透を試験した。これらの標準物の比較は、「血餅に浸透なし」とは、プラスミノーゲンアクチベーターのかなりの大部分（８０％以上）が血餅の第１の１／４に存在し、一方「一様な分布」の場合には少なくとも５０％のプラスミノーゲンアクチベーターがさらに血餅に浸透し、したがって残りの３／４に存在することを意味することを明らかにする。血餅溶解の特異性および効果は、さらに、フィブリン結合しないか、あるいは非常に僅かで非特異的なフィブリン結合しかしない本発明のプラスミノーゲンアクチベーターが用いられる場合に、さらに増加する。そのような分子は血餅の内部に浸透し、したがって、プラスミノーゲンが血餅内で効果的にプラスミンに活性化されることを確実にする。そのようなプラスミノーゲンアクチベーターは、例えば、ｔ−ＰＡのプロテアーゼドメイン（ＷＯ９６／１７９２８）、または、実質的にクリングル２ドメインおよびプロテアーゼドメインを含むがｔ−ＰＡドメインのようなフィンガードメインは含まない物質（ＷＯ９０／０９４３７、米国特許第５，２２３，２５６号、ＥＰ−Ｂ０２９７０６６、ＥＰ−Ｂ０９６９２０を基にしている。好ましい実施態様において、本発明のプラスミノーゲンアクチベーターは、それがＰＡＩ−１によって阻害され得ないようにさらに改変される。そのような改変は、好ましくは、アミノ酸２９６〜３０２の変異により達成され(Madison,E.L .et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87(1990)3530-3533）、特に好ましくは、アミノ酸２９６〜２９９（ＫＨＲＲ）をＡＡＡＡによって置換することにより達成される（ＷＯ９６／０１３１２）。本発明の化合物は、血栓溶解性が活性のタンパク質で、好ましくはｔ−ＰＡ（Alteplase）とは対照的に、i.v.ボーラス注射としての投与に適している。それらは低用量で効果があり、Alteplaseの標準的な臨床的注入と実際には同じ血栓溶解活性を有している。特異性の増加および関連する出血副作用の減少により、本発明の化合物は、全ての血栓塞栓性疾患の処置のための非常に価値のある血栓溶解剤になる。心臓梗塞（cardiac infarction）および大動脈塞栓症（massive pulmonary embolism）のような著しく生命を脅かす疾患用にのみこれまで認められていた血栓溶解剤とは対照的に、そのような変種の使用は、急性度の低い生命を脅かす疾患（例えば、深静脈血栓症）用にさえ、本発明の化合物による血栓塞栓の処置の機会を提供する。さらに、本発明の化合物に基づく血栓溶解剤は、今までよりもはるかに広い基盤について用いることができるが、それは、それらの広範な使用を妨げていた主な理由が、出血の併発の危険性であったからである。これとは無関係に、本発明の化合物はまた、心臓梗塞または動脈塞栓症のような急性疾患にも好都合に用いることができる。本発明によって用いられるプラスミノーゲンアクチベーターは、当業者によく知られた方法により真核生物細胞または原核生物細胞内で産生させることができる。本発明の化合物は、好ましくは遺伝子工学により生成される。そのような方法は、例えば、ＷＯ９０／０９４３７、ＥＰ−Ａ０２９７０６６、ＥＰ−Ａ０３０２４５６、ＥＰ−Ａ０２４５１００およびＥＰ−Ａ０４００５４５に記載され、それらはそのような生成方法の開示の主題である。変異は、オリゴヌクレオチド指向性部位特異的変異誘発により、ｔ−ＰＡのｃＤＮＡまたはその誘導体へ導入される。部位特異的変異誘発は、例えば、Zoller and Smith（1984）によって記載され、T.A.Kunkel（1985）およびMorinaga et al．（1984）によって改変されている。例えば、Ausubel et al．（1991）に記載されたＰＣＲ変異誘発方法も適している。この方法で得られた核酸を用いて、それが、用いられる宿主細胞にとって適切な発現ベクター上に存在する場合には、本発明のプラスミノーゲンアクチベーターを発現させる。本発明のタンパク質の核酸配列は、さらに改変することができる。そのような改変は、例えば：連結、クローニング、および変異誘発を容易にするための制限酵素用の種々の認識配列を導入するための核酸配列の改変宿主細胞にとって好ましいコドンを取り込むための核酸配列の改変宿主細胞内での発現を最適化するためのさらなる調節要素および転写要素による核酸配列の伸長である。適切な発現ベクターの産生および発現のための全てのさらなる方法工程は、最高技術水準であり、当業者にはよく知られている。そのような方法は、例えば、 Sambrook et al．Molecular Cloning:A laboratory manual（1989）Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York,USAの”Expression of cloned genes in E .coli"に記載されている。本発明により用いられるグリコシル化されたプラスミノーゲンアクチベーターの生成は、真核生物宿主細胞内で行われる。本発明により用いられるグリコシル化されていないプラスミノーゲンアクチベーターの生成は、最初に得られるグリコシル化された生成物が当業者によく知られた方法により脱グリコシル化されなければならない真核生物宿主細胞内か、あるいは好ましくはグリコシル化しない宿主細胞内での、特に好ましくは原核生物宿主細胞内での発現により行われる。 E.coli、Streptmyces sp.、またはBacil1us subtilisは、例えば、原核宿主生物として適している。本発明のタンパク質を生成するために、原核生物細胞を、通常の方法で培養し、細菌を溶解後に通常の方法でタンパク質を単離する。タンパク質が不活性な形態で生成される場合（封入体）、それは可溶化され、当業者によく知られた方法により復元される。タンパク質を活性なタンパク質として当業者によく知られた方法により微生物から排出させることも可能である。これに適した発現ベクターは、好ましくは用いられる宿主細胞においてタンパク質の分泌に適したシグナル配列およびそのタンパク質をコードする核酸配列を有する。このベクターにより発現されるタンパク質は、この方法では、培地に分泌されるか（グラム陽性菌の場合）または細胞周辺腔（グラム陰性菌の場合）に分泌される。配列がシグナル配列と、本発明のｔ−ＰＡ誘導体をコードする配列との間に存在することが好都合であり、それはタンパク質がプロセシングの間にまたはプロテアーゼの処理により切断されるのを可能にする切断部位をコードする。本発明のプラスミノーゲンアクチベーターをコードするＤＮＡ配列がその中に導入されている基になるベクターの選択は、発現のために後に用いられる宿主細胞に依存する。適切なプラスミド並びにそのようなプラスミドの最小限の要件（例えば、複製の起点、制限切断部位）は、当業者によく知られている。プラスミドの代わりに、本発明の範囲内では、コスミドすなわち複製可能な二本鎖形態のファージ（λ、Ｍ１３）または当業者に公知のベクターを用いることも可能である。本発明のプラスミノーゲンアクチベーターが分泌のない原核生物内で産生される場合、それが形成する封入体を可溶性細胞粒子から分離して、プラスミノーゲンアクチベーターを含有している封入体を変性剤で還元条件下で処理することにより可溶化し、続いてＧＳＳＧで誘導体化し、ＧＳＨおよび非変性濃度の変性剤またはＬ−アルギニンを添加することによりプラスミノーゲンアクチベーターを復元する。ｔ−ＰＡおよび封入体からの誘導体を活性化するそのような方法は、例えば、ＥＰ−Ａ０２１９８７４およびＥＰ−Ａ０２４１０２２に記載されている。しかしながら、活性タンパク質を封入体から単離する他の方法もまた用いることができる。本発明のプラスミノーゲンアクチベーターは、好ましくはＬ−アルギニン、特に、１０〜１，０００mmol/lの濃度のアルギニンの存在下で精製される。外来タンパク質は、好ましくはアフィニティークロマトグラフィーにより、特にその上にＥＴＩ（エリトリナトリプシンインヒビター）が固定されている吸着ＥＴＩ吸着カラムによる精製の利点は、ＥＴＩ吸着カラム物質は、たとえアルギニン濃度が０．８mol/lという高さで存在しても、濃縮復元混合物を直接付加することができることである。本発明のプラスミノーゲンアクチベーターは、好ましくは０．６〜０．８mol/lのアルギニンの存在下でＥＴＩ吸着カラムにより精製される。この方法に用いられる溶液は、好ましくは７より高いpH、特に７．５〜８．６である。本発明のプラスミノーゲンアクチベーターは、アルギニン存在下で、ならびに非存在下でＥＴＩカラムから、pHを低下させることにより溶出する。この方法では、pHの値は好ましくは酸の範囲、特に好ましくはpH４．０〜５．５である。本発明のさらなる主題は、本発明の血栓溶解性が活性なタンパク質を含有する医薬組成物であり、ここで、このタンパク質は好ましくはヒト組織タイププラスミノーゲンアクチベーターのプロテアーゼドメイン、および場合によりクリングル２ドメインを血栓溶解活性を生じる唯一の構造として含有する。用いられる本発明のプラスミノーゲンアクチベーターは、本発明の化合物が薬学的に受容可能な担体と通常組み合わされた治療剤を製造するするため、当業者によく知られた方法で処方される。そのような組成物は、典型的には、０．１〜７mg/kg、好ましくは０．７〜５mg/kg、特に好ましくは１〜３mg/kg体重という有効量を用量として含有する。治療用組成物は、通常、滅菌された水溶液または滅菌された可溶性乾燥処方物（例えば、凍結乾燥物）の形態である。この組成物は、通常、等張溶液を調製するために用いられる適切な量の薬学的に受容可能な塩を含む。さらに、アルギニン緩衝液、リン酸緩衝液のような緩衝液は、適切なpH値（好ましくは５．５〜７．５）を安定化させるために用いることができる。本発明の化合物の用量のレベルは、当業者により難なく決定することができる。それは、例えば、適用のタイプ（点滴またはボーラス）および治療の期間に依存する。それらの半減期が延びたため（in vivoでの崩壊に関して）、本発明の化合物は、特にボーラス適用に適している（単一ボーラス、多重ボーラス）。ボーラス適用に適した形態は、例えば、２５〜１，０００mgの本発明の化合物、プラスミノーゲンアクチベーターの可溶性を促進する物質（例えば、アルギニン）および緩衝液を含むアンプル剤である。投与は、好ましくは静脈内だけでなく、皮下、筋肉内、または動脈内にも行われる。さらに、本発明のプラスミノーゲンアクチベーターは、点滴してもよいし、局所的に適用してもよい。本発明の化合物は、多重ボーラス（好ましくは二重ボーラス）で投与することができる。適切な時間間隔は、２０〜１８０分であり、３０〜９０分の間隔が特に好ましく、３０〜６０分の間隔が非常に特別に好ましい。さらに、本発明の化合物を１時間〜２日間という時間で点滴することもまた可能である。本発明の化合物は、全ての血栓塞栓性疾患、例えば、急性心臓梗塞、脳梗塞、動脈塞栓症、脚部深静脈血栓症、急性動脈閉塞などの処置に特に適している。本発明の化合物は、より長い血栓溶解が行われなければならない準慢性の血栓塞栓性疾患の処置のために、特に好ましく用いられる。本発明の化合物を、例えばヘパリンのような凝固の阻害物質（抗凝固剤）および／または副作用をほとんど持たない血管拡張効果を増大する血小板凝集の阻害物質と組み合わせて用いることが好ましい。抗凝固物質の投与は、本発明の化合物の投与と同時に、あるいは異なる時間に行うことができる。血流を刺激する物質または微小循環を改良する物質の添加もまた好ましい。以下の実施例、刊行物、配列表および図面は、本発明の請求項から誘導される保護範囲をさらに明確にする。記載される方法は、改変後も本発明の主題を依然として説明する実施例として理解されるべきである。「ｒ−ＰＡ」により、以下では、ヒトｔ−ＰＡのＫ２ドメインおよびＰドメインからなる組換えプラスミノーゲンアクチベーターが理解される。そのようなプラスミノーゲンアクチベーターの製造は、例えば、米国特許第５,２２３,２５６号に記載されている。ｒ−ＰＡ（Ｆ２７４ＰＮＫ２７７Ｖ）により、Ｋ２およびＰドメインからなるプラスミノーゲンアクチベーターのアミノ酸２７４（Ｆ）が、アミノ酸Ｐによって置き換わられており、アミノ酸２７７（Ｋ）がアミノ酸Ｖによって置き換わられている（アミノ酸の命名はT.J.Harris（1987）と同じである）ことが理解される。図１は、血餅浸透および溶解モデルの概略図である。剪断種（shear strain）による血漿凝固を避けるため、緩衝液チャンバー（斜線の領域）により圧力を生じさせた。緩衝液を血漿と血餅（斑点の領域）上で混合することは、気泡トラップを組込むことにより回避した。１：緩衝液貯蔵部；２：嬬動ポンプ；３：気泡トラップ；４：フィブリン溶解剤用の注入シリンジ；５：血餅の入ったピペットチップ（網掛けの領域）；６：チューブクランプ；７：圧力要素図２は、それぞれｒ−ＰＡ（Ｆ２７４Ｐ、Ｋ２７７Ｖ）（Ａ）およびｒ−ＰＡ（Ｂ）のトロンビンによる切断を示す（詳細は実施例８参照）。図３は、それぞれｒ−ＰＡ（Ｆ２７４Ｐ、Ｋ２７７Ｖ）（Ａ）およびｒ−ＰＡ（Ｂ）のプラスミンによる切断を示す（詳細は実施例９参照）。図４は、ｒ−ＰＡ（Ｐ２７２Ｖ、Ｆ２７４Ｐ、Ｋ２７７Ｖ）のトロンビンによる切断を示す（詳細は実施例１０参照）。実施例１本発明の化合物の組換え産生ａ）発現プラスミドの構築ＥＰ０３８２１７４に記載された最初のプラスミドｐＡ２７ｆｄは、以下の構成要素を含んでいる：ｔａｃプロモーター、ＡＴＧ開始コドンを含むｌａｃオペレーター領域、クリングル２ドメインおよびプロテアーゼドメインを含むｔ−ＰＡ突然変異タンパク質のコード領域、およびｆｄ転写ターミネーター。最初のベクターはプラスミドｐｋｋ２２３−３である。 Morinaga et al．Biotechnology（1984）636の方法を実質的に用いて、変異を導入した。ヘテロ二本鎖の形成のため、２つの適切なフラグメントをｐＡ２７ｆｄから単離した（例えば、フラグメントＡ：大きなＢａｍＨＩフラグメント、フラグメントＢ：ＰｖｕＩで直鎖状化したベクター）。用いたオリゴヌクレオチドおよびそれによって得られた変異を表１に列挙する。ヘテロ二本鎖調製物は、プラスミドｐＵＢＳ５２０と共にE.coli内で形質転換された（Brinkmann et al.，Gene 85（1989）109）。形質転換体を、アンピシリンおよびカナマイシン（各場合に５０μg/ml）を栄養培地に添加することにより選択した。各調製物から得られたプラスミドを表１に示す。ｂ）E.coli内での発現発現収率を調べるため、それぞれのプラスミド（表１参照）およびｐＵＢＳ５２０を含有するE.coliを、ＬＢ培地内で（Sambrook et al.，1989，MolecularCl oning,Cold Spring Harbor)、アンピシリンおよびカナマイシン存在下で（各々５０μg/ml)、５５OnmでのＯＤが０．４になるまで培養した。発現は、５mmol/l のＩＰＴＧの添加により開始した。培養物をさらに４時間インキュベーションした。続いて、E.coli細胞を遠心分離により集め、緩衝液（５０mmol/l Tris-HClp H８、５０mmol/lＥＤＴＡ）で再懸濁した；この細胞を音波処理により破砕した。不溶性タンパク質画分を、再度遠心分離により集め、上記の緩衝液で音波処理により再懸濁した。この懸濁物を１／４体積の適用緩衝液（２５０mmol/lTris-H ClpH６．８、１０mmol/lＥＤＴＡ、５％ＳＤＳ、５％メルカプトエタノール、５０％グリセロールおよび０．００５％ブロモフェノールブルー）と混合し、１２．５％ポリアクリルアミドゲルにより分析した。対照として、同じ調製を、ＩＰＴＧで誘導されていない各プラスミドを含有するE.coliの培養物を用いて行い、ゲルで分離した。約４０kDの分子量を有する明瞭なバンドが、ＩＰＴＧで誘導した培養物の調製物で、ゲルをクーマシーブルーＲ２５０（３０％メタノールおよび１０％酢酸に溶解）で染色した後に見ることができる；このバンドは対照調製物には存在しない。活性な化合物を生成するためのさらなる工程は、ＥＰ−Ａ０３８２１７４の実施例２および３と同じである。実施例２ In vivoでの特徴づけ D.Collen（J.Clin.Invest．71（1983）368-376）によって確立された頚静脈血栓症のウサギモデルを用いて、本発明のタンパク質の血栓溶解能と効率を調べた。この方法では、放射活性で標識した血栓を動物の頚静脈内で生じさせた。この動物を、１００IU/kgのヘパリンにより皮下で抗凝固化した。Altep1ase（組換え野 Company，Biberach，Germanyから市販されている）、実施例１に記載したタンパから市販されている）または溶媒（０．２Ｍアルギニンホスフェート緩衝液）をウサギの静脈内に投与した。プラセボ（偽薬）群には静脈内に単一ボーラス注射で１mg/kg溶媒を与えた。A lteplase群には、全用量で１．４５mg/kgを投与し、そのうち０．２mg/kgを最初のボーラス注射として投与し、０．７５mg/kgを３０分注射として、続いて０．５mg/kgを６０分連続注射として（総注入：９０分間）投与した。ストレプトキナーゼ群には６４，０００IU/kgの６０分間静脈注射を与えた。本発明のタンパク質を用いる群には、静脈内単一ボーラス注射を与えた。Alteplaseおよびストレプトキナーゼの群の場合、これらは標準的な規則であると認められる。治療の開始から２時間後、残りの血栓を取り除き、血栓の溶解（血栓溶解）の程度を、血栓内の放射活性の減少により測定した。血漿を得るための血液試料を治療前および治療開始の２時間後に採取した。活性化されたトロンボプラスチンの時間は標準的な手順により測定した。さらに、血栓溶解治療のための失血を定量した。このため、長さ４cm、深さ０．３cmの決められた皮膚切開を動物の腿部に血栓溶解剤の投与前にテンプレートと解剖用メスを用いて行った。これによって生じる出血は、自然な凝固により止まった。治療を始めた後、スポンジを傷口の上に置いたが、それは血栓溶解のために再開した出血による血液を吸収する。漏れ出た血液の量は、スポンジの重量を測ることにより（その正味の重量を差し引いた後）測定し、したがって、出血の副作用の程度が説明される。 Alteplaseおよび実施例１の本発明のタンパク質は、非常に活性な血栓溶解物質であり、溶媒対照と比較して著しく血栓を溶解する。実施例３血餅溶解活性の比較ａ）血餅溶解アッセイの手順血餅溶解アッセイでは、ｔ−ＰＡおよび実施例１の組換えタンパク質の活性を測定した。試料を各場合に必要とされる濃度に緩衝液（０．０６ＭＮａ₂ＨＰＯ₄、pH７．５、とにより調整した。０．１mlの試料を１mlのヒトフィブリノーゲン溶液（ＩＭＣＯ）（２mg/ml０.００６MＮａ₂ＨＰＯ₄、pH７．４、０．５mg/mlＢＳＡ、０．０１％１００μlのプラスミノーゲン溶液（１０IU/ml０．０６ＭＮａ₂ＨＰＯ₄／トロンビン溶液（３０U/ml０．０６ＭＮａ₂ＨＰＯ₄、pH７．４、０．５mg/ml 試験管の底に到達するのに要する時間を停止させた。ｂ）動的血漿モデルにおける活性の測定この動的血漿モデルでは、本発明の物質をin vivo条件と非常に似た条件下で試験する。この物質を血餅を介して血漿に添加するが、それを、鼓動によって生じる圧力に似た蠕動圧力の作用の下で行う。２００μlのクエン酸血漿を、２０μlの０．２５mol/lＣａl₂溶液と混合し、３７℃でインキュベーションした。０．１６Uのトロンビンを添加し、この混合物を１mlのピペットチップ(Eppendorff，Hamburg，GER)に入れた。このピペットチップを垂直に２分間２３℃で保持し、６０分間０．０１mol/lTris/HCl、pH７．４、０．１５mol/lＮａＣl₂、０．０２５mol/l ＣａＣｌ₂、０．０１％性チューブからなるスウィッチングシステム（図１）で測定した。嬬動ポンプにより流れが生じ、２つの平行な支流に別れる。支流Ａは、この支流を塞ぐ血餅で満たされた１mlのピペットチップを有する。支流Ｂは支流Ａと平行に流れる不明の（Blind）支流である。支流Ｂの圧力はチューブクランプにより１０mbarに調整した。血漿（１ml）を血餅に適用した。ポンプのスウィッチをＯＮにして各々の個々の血餅の安定性を１５分間調べた。フィブリン溶解剤（最終血漿濃度は０．５〜１０μg/mlで、実施例１のタンパク質またはＣＨＯ−ｔ−ＰＡについては２０μg/ml）を、筋肉内注射用の皮下注射針を付けた１mlのツベルクリンシリンジ（Braun，Melsungen，GER）により注意深く血漿に注入した。血餅溶解時間を、フィブリン溶解酵素の添加と、血栓溶解剤の添加前の値の５０％までの圧力の減少との間の時間差として計算した。圧力は、水換算圧電性圧力検出系により測定し、コンピューター補助文書化プログラムにより文書化した。ｃ）静的モデルにおける血餅浸透８００μlのヒトクエン酸血漿（健康なドナー）を、７５μlのＣａ緩衝液（５０mmol/lTris/HCl、pH７．２、０．２５mol/l ＣａＣｌ₂）、２０μlのゼラチン溶液（0．９％ＮａＣｌ中１０％w/v）および１００mlのトロンビン溶液（８U/ml 、０．０５mol/lクエン酸ナトリウム／ＨＣｌ、pH６．５、０．１５mol/lＮａＣｌ）と混合した。この混合物８００μlを注意深く２mlカラム（Pierce,Rockfort ，IL，USA）に移した。血餅は、３時間３７℃でインキュベーションすることにより形成される。２mlの緩衝液（０．００８mol/lＮａ₂ＨＰＯ₄、０．００１mol /lＫＨ₂ＰＯ₄、０．００３mol/l ＫＣｌ、０．１３７mol/l G1u-Gly-Arg-クロロメチルケトンで阻害されているプラスミノーゲンアクチベーターを用いて所望の濃度（０、０．５、１、２および３μg/ml）に調整し、この溶液１mlを血餅の表面に適用した。残りの緩衝液は廃棄した。血餅の表面をＰＢＳ緩衝液（０．００８mol/l Ｎa₂ＨＰＯ₄、０．００１mol/l ＫＨ₂ＰＯ₄、０．００３mol/lＫＣｌ、０．および１３７mol/lＮａＣｌ）２mlで洗浄し、タンパク質をＰＢＳ中グルタルアルデヒド溶液２mlを添加することにより固定する。続いて、血餅表面を２mlの５０mmol/l Tris/HCl、pH８．０で洗浄し、ｔ− ＰＡに対するペルオキシダーゼ標識ポリクローナル抗体（２５０mU/ml）１mlと共にインキュベーションする。血餅を１mlのＰＢＳで洗浄した後、抗体結合タンパク質を、ペルオキシダーゼによって不溶性の赤色色素に転換される３−アミノ −９−エチルカルバゾールと共にインキュベーションすることにより測定する。本発明のプラスミノーゲンアクチベーターは、血餅の表面に集中することはなく、むしろ血餅の内部に浸透し一様に分散する。血餅の免役学的に染色された部分の強度は、血漿中の本発明のプラスミノーゲンアクチベーターの濃度の増加に伴って増大する。実施例４フィブリン結合の比較この実施例では、実施例１の血栓溶解性が活性なタンパク質を、それらのフィブリンに結合する能力について調べ、この性質に関してAlteplaseと比較する。 A1teplaseおよび本発明のタンパク質の試料を、１．５μｇタンパク質/mlの溶液として調製した。続いて、血栓溶解性が活性なタンパク質の試料（１００μl ）を、７７０μlの緩衝液（０．０５M Tris/HCl、pH７．４、０．１５ＮａＣｌ、１０μlのアプロチニン（３．７５mg/ml）、１０μlのウシトロンビン（１００U /mlの濃度）および増加する量のフィブリノーゲン（１０μg/ml〜３００μg/ml ）と、それぞれ混合した。全ての溶液は水性であった。トロンビンがフィブリノーゲンを不溶性のフィブリン血餅に転換することは公知である。成分を混合し、１時間３７℃でインキュベーションした。続いて、上清をフィブリン血餅から遠心分離により分離し（１５分間、１３，０００rpm、４℃）、上清に存在するプラスミノーゲンアクチベータータンパク質の量を、標準的なＥＬＩＳＡにより測定した。実施例５プラスミノーゲン溶解活性と刺激能の比較プラスミノーゲン溶解活性の刺激能の測定のための公知の手順は、Verheijene t alによりThromb.Haemost．48(1982)266-269に記載されている。刺激物質として作用するフィブリノーゲンフラグメントは、ヒトフィブリノーゲンを臭化シアン（ヒトフィブリノーゲン１ｇ、水１００ml中ＣｎＢｒ１．３ｇ）で７０％v/vのギ酸中で１７時間以上室温で処理し、続いて蒸留水に対して透析することにより調製した。アッセイを行う場合、５ng/nlのｔ−ＰＡまたは、同じ濃度の実施例１のタン０．３mmol Ｓ２２５１基質（発色性基質H-D-Val-Leu-Lys-p-ニトロアニリドＨＣｌ）、および１２０μg/mlフィブリノーゲンフラグメントを含む１mlの０．１ mol/l Tris/HCl（pH７．５）中でインキュベーションした。混合物を２時間２５ ℃でインキュベーションし、４０５nmでの吸収率を反応を中断することなく対照ブランクの値に対して測定した。発色性基質Ｓ２２５１の切断は、酵素のプラスミノーゲン溶解活性の測定値として測定した。刺激能はフィブリノーゲンフラグメントありの活性をフィブリノーゲンフラグメントなしの活性で除したものとして計算する。希釈した試料２５μlをピペットでマイクロタイタープレートのウェルに入れた。続いて、２００μlの試薬混合物を添加し、４０５nmでの吸収を２時間にわたってブランクの値に対して測定する（２５μl、０．１mol/l Tris、pH７.５、０．１５％Ａ試料＝（Ａ試料ｔ−ＡＢｖｔ）−（Ａ試料０−ＡＢＶ０）Ａ試料ｔ＝２時間後の試料の値ＡＢｖｔ＝２時間後の試薬ブランクの値Ａ試料０＝時間ｔ＝０の試料の値ＡＢＶ０＝時間ｔ＝０の試薬ブランクの値試薬混合物：１ml ｔ−ＰＡ刺激物質（１mg/mlヒトフィブリノーゲンの臭化シアンフラグメント）１ml 基質溶液（３mmol/lＳ２２５１、H-D-Va1-Leu-Lys-pNA;Chromogenix,Mo elndal，SE）１ml プラスミノーゲン溶液（７U/mlプラスミノーゲン、Boehringer Mannhei mGmbH）刺激係数の計算：刺激係数を計算するため、ｔ−ＰＡの刺激物質の存在下での活性を、ｔ−ＰＡの刺激物質非存在下での活性で除する。各々の場合、希釈は、どちらの調製物でも同じ吸光度が達成されるように適切であるべきである。１mlのＨ₂Ｏを１mlのｔ−ＰＡ刺激物質の代わりにｔ−ＰＡ刺激物質を含まない反応混合物に添加する。活性は、刺激物質の非存在下で並びに存在下で同じ方法で測定する。刺激係数Ｆは以下のように計算する：比活性はプラスミノーゲン溶解活性（KU/ml）とタンパク質濃度（mg/ml）の比率である。実施例６組織プラスミノーゲンアクチベーターの実施例１の組換えタンパク質のボーラス注射は、冠動脈血栓のイヌモデルにおいて効果的で信頼性のある血栓溶解を誘導する E.coli内で産生された実施例１のタンパク質により引き起こされた血栓溶解は、電気的刺激により誘導された左の冠状動脈の血栓症のイヌモデルにおいて評価することができる。実施例７アミド分解（amidolytic）活性の測定アミド分解活性を測定するため、２００mlの緩衝液（０．１mol/l Tris/HCl、ター溶液（緩衝液で１〜１２μg/mlの濃度に希釈した）を５分間３７℃でインキュベーションした。測定は、２００μlのＳ２２８８（６mmol/l、H-D-Ile-Pro-A rg-p-ニトロアニリンジヒドロクロリド、Kabi，Vitrum，Sweden）を添加することにより開始した。Ｓ２２８８基質を３７℃で予め平衡化した。アミド分解活性を、４０５nmでの吸光度の最初の２．５分間以内での増加から、９７５0l/mol/c mというｐ−ニトロアニリンの吸光係数を用いて計算した。実施例８トロンビンによるｒ−ＰＡ（Ｆ２７４Ｐ、Ｋ２７７Ｖ）の切断１．手順各場合に、４４μｇのｒ−ＰＡ（Ｆ２７４Ｐ、Ｋ２７７Ｖ）およびｒ−ＰＡ（標準）を１５分間３７℃でプレインキュベーションし、やはり１５分間３７℃でプレインキュベーションした下記に示したユニットのヒトトロンビン（Sigma）と混合し、３０分間３７℃でインキュベーションした。続いて、試料をＳＤＳサンプル緩衝液と（０．１２５mol/l Tris/HCl、pH８．８、４．６％(w/v)ＳＤＳ、４mol/l 尿素、０．１％ブロモフェノールブルー、０．３mol/lジチオエリスリトール）、１：１(v/v)の比で混合し、３分間９５℃でインキュベーションし、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析した。２．結果ｒ−ＰＡ（Ｆ２７４Ｐ、Ｋ２７７Ｖ）のトロンビンによる切断を図２に示す。データは、増加する量のトロンビンがｒ−ＰＡ（Ｆ２７４Ｐ、Ｋ２７７Ｖ）を完全に二本鎖形態に転換することを示している。トロンビンによって切断されるｒ −ＰＡ（Ｆ２７４Ｐ、Ｋ２７７Ｖ）のプロテアーゼおよびクリングル２ドメインは、プラスミン消化によって調製した二本鎖形態（ｒ−ＰＡ（ｔｃ））のｒ−ＰＡの対応するドメインと同じレベルで泳動した。ｒ−ＰＡ（Ｆ２７４Ｐ、Ｋ２７７Ｖ）（Ａ）とは異なり、記載した条件下では、ここでは標準として用いたｒ−ＰＡ（Ｂ）はトロンビンによって切断されなかった。Ａ：レーン１：分子量標準* レーン２：ｒ−ＰＡレーン３：ｒ−ＰＡ（ｔｃ）** レーン４：ｒ−ＰＡ（Ｆ２７４Ｐ、Ｋ２７７Ｖ）レーン５：ｒ−ＰＡ（Ｆ２７４Ｐ、Ｋ２７７Ｖ）＋トロンビン緩衝液レーン６：ｒ−ＰＡ（Ｆ２７４Ｐ、Ｋ２７７Ｖ）＋０．０５５ＮＩＨユニットトロンビンレーン７：ｒ−ＰＡ（Ｆ２７４Ｐ、Ｋ２７７Ｖ）＋０．５５ＮＩＨユニットトロンビンレーン８：ｒ−ＰＡ（Ｆ２７４Ｐ、Ｋ２７７Ｖ）＋２．７４ＮＩＨユニットトロンビンレーン９：トロンビン（５ＮＩＨユニット）レーン１０：分子量標準* Ｂ：レーン１：分子量標準* レーン２：ｒ−ＰＡレーン３：ｒ−ＰＡ（ｔｃ）** レーン４：ｒ−ＰＡ＋トロンビン緩衝液レーン５：ｒ−ＰＡ＋０．０５５ＮＩＨユニットトロンビンレーン６：ｒ−ＰＡ＋０．５５ＮＩＨユニットトロンビンレーン７：ｒ−ＰＡ＋２．７４ＮＩＨユニットトロンビンレーン８：トロンビン（５ＮＩＨユニット）レーン９：分子量標準* *）分子量標準；リゾチーム（１４，３０７Da）、ダイズトリプシンインヒビター（２０，１００Da）、トリオースホスフェートイソメラーゼ（２６，６２６Da ）、アルドラーゼ（３９，２１２Da）、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（５５，５６２Da）、フルクトース−６−リン酸キナーゼ（８５，２０４Da）、β−ガラクトシダーゼ（１１６，３５３Da）、α−２−マクログロブリン（１７０，０００Da ） **）ｒ−ＰＡ（ｔｃ）：ｒ−ＰＡをプラスミンと共にインキュベーションすることにより得られる二本鎖形態のｒ−ＰＡ。実施例９プラスミンによるｒ−ＰＡ（Ｆ２７４Ｐ、Ｋ２７７Ｖ）の切断１．手順各場合において、２５μｇのｒ−ＰＡ（Ｆ２７４Ｐ、Ｋ２７７Ｖ）およびｒ− ＰＡ（標準）を１５分間３７℃でプレインキュベーションし、やはり１５分間３７℃でプレインキュベーションした下記に示したユニットのプラスミン（ヒト）と混合し、１０分間３７℃でインキュベーションした。続いて、試料をＳＤＳサンプル緩衝液（０．１２５mol/1Tris/HCl、pH８．８、４．６％(w/v)ＳＤＳ、４ mol/l尿素、０．１％ブロモフェノールブルー、０．３mol/lジチオエリスリトール）と、１：１(v/v)の比で混合し、４分間９５℃でインキュベーションし、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析した。２．結果ｒ−ＰＡ（Ｆ２７４Ｐ、Ｋ２７７Ｖ）（Ａ）およびここでは標準として用いたｒ−ＰＡ（Ｂ）のプラスミンによる切断を図３に示す。データは、ｒ−ＰＡ（Ｂ）が増加する量のプラスミンとのインキュベーションにより二本鎖形態に転換されることを示している。用いた条件下では、適用した量のｒ−ＰＡは２５mUのプラスミンにより完全に二本鎖形態に転換される。これとは対照的に、ｒ−ＰＡ（Ｆ２７４Ｐ、Ｋ２７７Ｖ）（Ａ）は、プラスミンによる著しく低い切断を示した。０．０２５Uおよび０．１Uのプラスミンとインキュベーションする場合、プラスミンによる著しいｒ−ＰＡ（Ｆ２７４Ｐ、Ｋ２７７Ｖ）の切断は観察されない。２５μｇのｒ−ＰＡ（Ｆ２７４Ｐ、Ｋ２７７Ｖ）（Ａ）を２５mUのプラスミンとインキュベーションする場合でさえ、完全な切断は起こらない。トロンビンによって切断されるｒ−ＰＡ（Ｆ２７４Ｐ、Ｋ２７７Ｖ）のプロテアーゼおよびクリングル２ドメインは、プラスミンセファロース消化によって調製した二本鎖形態（ｒ−ＰＡ（ｔｃ））のｒ−ＰＡの対応するドメインと同じレベルで泳動し、その結果、変種の切断は、ｒ−ＰＡにおいてのように、アミノ酸２７５と２７６との間（番号付けはHarris,Prot.Engineeringl,449-458(1987)による）で起ることが推測されなければならない。Ａ：レーン１：分子量標準* レーン２：ｒ−ＰＡレーン３：ｒ−ＰＡ（ｔｃ）** レーン４：ｒ−ＰＡ（Ｆ２７４Ｐ、Ｋ２７７Ｖ）レーン５：ｒ−ＰＡ（Ｆ２７４Ｐ、Ｋ２７７Ｖ）＋０．２５mUプラスミンレーン６：ｒ−ＰＡ（Ｆ２７４Ｐ、Ｋ２７７Ｖ）＋０．２５mUプラスミンレーン７：ｒ−ＰＡ（Ｆ２７４Ｐ、Ｋ２７７Ｖ）＋１２．５mUプラスミンレーン８：ｒ−ＰＡ（Ｆ２７４Ｐ、Ｋ２７７Ｖ）＋２５mUプラスミンＢ：レーン１：分子量標準* レーン２：ｒ−ＰＡレーン３：ｒ−ＰＡ（ｔｃ）** レーン４：ｒ−ＰＡ＋０．２５mUプラスミンレーン５：ｒ−ＰＡ＋２．５mUプラスミンレーン６：ｒ−ＰＡ＋１２．５mUプラスミンレーン７：ｒ−ＰＡ＋２５mUプラスミン *）分子量標準；リゾチーム（１４，３０７Da）、ダイズトリプシンインヒビター（２０，１００Da）、トリオースリン酸イソメラーゼ（２６，６２６Da）、アルドラーゼ（３９，２１２Da）、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（５５，５６２ Da）、フルクトース−６−リン酸キナーゼ（８５，２０４Da）、β−ガラクトシダーゼ（１１６，３５３Da）、α−２−マクログロブリン（１７０，０００Da） **）ｒ−ＰＡ（ｔｃ）：ｒ−ＰＡをプラスミンセファロースと共にインキュベーションすることにより得られる二本鎖形態のｒ−ＰＡ。実施例１０トロンビンによるｒ−ＰＡ（Ｐ２７２Ｖ、Ｆ２７４Ｐ、Ｋ２７７Ｖ）の切断１．手順４０μgのｒ−ＰＡ（Ｐ２７２Ｖ、Ｆ２７４Ｐ、Ｋ２７７Ｖ）を１５分間３７ ℃でプレインキュベーションし、やはり１５分間３７℃でプレインキュベーションした下記に示したユニットのウシトロンビン（Sigma）と混合し、３０分間３７℃でインキュベーションした。続いて、試料をＳＤＳサンプル緩衝液（０．１２５mol/lTris/HCl、pH８．８、４．６％(w/v)ＳＤＳ、４mol/l尿素、０．１％ブロモフェノールブルー、０．３mol/lジチオエリスリトール）と、１：１(v/v) の比で混合し、３分間９５℃でインキュベーションし、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析した。２．結果ｒ−ＰＡ（Ｐ２７２Ｖ、Ｆ２７４Ｐ、Ｋ２７７Ｖ）のトロンビンによる切断を図４に示す。データは、増加する量のトロンビンがｒ−ＰＡ（Ｐ２７２Ｖ、Ｆ２７４Ｐ、Ｋ２７７Ｖ）を完全に二本鎖形態に転換することを示している。トロンビンによって切断されるｒ−ＰＡ（Ｐ２７２Ｖ、Ｆ２７４Ｐ、Ｋ２７７Ｖ）のプロテアーゼおよびクリングル２ドメインは、プラスミンでの消化によって調製した二本鎖形態（ｒ−ＰＡ（ｔｃ））のｒ−ＰＡの対応するドメインと同じレベルで泳動した。レーン１：分子量標準* レーン２：ｒ−ＰＡレーン３：ｒ−ＰＡ（ｔｃ）** レーン４：ｒ−ＰＡ（Ｐ２７２Ｖ、Ｆ２７４Ｐ、Ｋ２７７Ｖ）レーン５：ｒ−ＰＡ（Ｐ２７２Ｖ、Ｆ２７４Ｐ、Ｋ２７７Ｖ）＋トロンビン緩衝液レーン６：ｒ−ＰＡ（Ｐ２７２Ｖ、Ｆ２７４Ｐ、Ｋ２７７Ｖ）＋０．０５５ＮＩＨユニットロンビンレーン７：ｒ−ＰＡ（Ｐ２７２Ｖ、Ｆ２７４Ｐ、Ｋ２７７Ｖ）＋０．５５ＮＩＨユニットトロンビンレーン８：ｒ−ＰＡ（Ｐ２７２Ｖ、Ｆ２７４Ｐ、Ｋ２７７Ｖ）＋２．７４ＮＩＨユニットトロンビンレーン９：分子量標準* *）分子量標準；リゾチーム（１４，３０７Da）、ダイズトリプシンインヒビター（２０，１００Da）、トリオースリン酸イソメラーゼ（２６，６２６Da）、アルドラーゼ（３９，２１２Da）、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（５５，５６２ Da）、フルクトース−６−リン酸キナーゼ（８５，２０４Da）、β−ガラクトシダーゼ（１１６，３５３Da）、α−２−マクログロブリン（１７０，０００Da） **）ｒ−ＰＡ（ｔｃ）：ｒ−ＰＡをプラスミンと共にインキュベーションすることにより得られる二本鎖形態のｒ−ＰＡ。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９８年６月１８日（１９９８．６．１８）【補正内容】請求の範囲１．ヒト組織タイププラスミノーゲンアクチベーターに基づく一本鎖プラスミノーゲンアクチベーターであって、ａ）プラスミノーゲンアクチベーターをトロンビンによって切断することができ、そのような切断により二本鎖形態に転換される、ｂ）酵素原性が、ヒトプラスミノーゲンアクチベーターと比較して、少なくとも１．２倍より高い、そしてｃ）そのフィブリン結合が、プラスミノーゲンアクチベーターが５０％以上血餅に浸透し得る程度に低下している、ような方法において、アミノ酸の欠失、変異および／または付加により改変されている、プラスミノーゲンアクチベーター。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考） //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/64 Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ

Claims

【特許請求の範囲】１．ヒト組織タイププラスミノーゲンアクチベーターに基づくプラスミノーゲンアクチベーターであって、ａ）プラスミノーゲンアクチベーターがトロンビンによって切断され得、そのような切断により二本鎖形態に転換されるような方法で改変されており、ｂ）酵素原性が、ヒトプラスミノーゲンアクチベーターと比較して、少なくとも１．２倍より高いように改変されており、そしてｃ）そのフィブリン結合が、プラスミノーゲンアクチベーターが５０％以上血餅に浸透し得る程度に低下している、プラスミノーゲンアクチベーター。２．アミノ酸Ｐ１（２７５）とＰ１’（２７６）との間でプラスミンにより切断されるその能力が、１０％以上、好ましくは２０％以上低下するような方法で改変されている、請求項１記載のプラスミノーゲンアクチベーター。３．一様に血餅に浸透している請求項１または２記載のプラスミノーゲンアクチベーター。４．Ｇ２６４とＡ２８８との間のアミノ酸領域が、プラスミノーゲンアクチベーターがトロンビンによって切断され得るような方法で改変されている、請求項１〜３のいずれか１項記載のプラスミノーゲンアクチベーター。５．アミノ酸領域４５９〜４７１、４１７〜４２５および／またはアミノ酸Ｑ４７５、Ｋ５０５および／またはＥ５０６が改変されている、請求項１〜４のいずれか１項記載のプラスミノーゲンアクチベーター。６．アミノ酸Ｇ２６５および／またはＲ２６７が改変されているか、および／または少なくとも１つのアミノ酸が２６４と２６７との間の領域に挿入されている、請求項１〜５のいずれか１項記載のプラスミノーゲンアクチベーター。７．フィンガードメインが欠失している、請求項１〜６のいずれか１項記載のプラスミノーゲンアクチベーター。８．ヒト組織タイププラスミノーゲンアクチベーターのプロテアーゼドメインあるいはクリングル２ドメインとプロテアーゼドメインのみを含む、請求項７記載のプラスミノーゲンアクチベーター。９．血栓塞栓症疾患の処置用の医薬組成物を製造するための請求項１〜８記載のプラスミノーゲンアクチベーターの使用。１０．請求項１〜８のいずれか１項記載のプラスミノーゲンアクチベーターの組換え産生のための方法であって、原核生物または真核生物宿主細胞を、該組織プラスミノーゲンアクチベーターを発現することができるベクターを用いて形質転換し、この細胞を培養して該プラスミノーゲンアクチベーターを単離する、方法。１１．治療的に有効な量の請求項１〜８のいずれか１項記載のプラスミノーゲンアクチベーターおよび任意の薬学的補助物質、増量剤または添加剤の医薬組成物。