KR20000029755A - 트롬빈에의해활성화될수있는플라스미노겐활성화제 - Google Patents

트롬빈에의해활성화될수있는플라스미노겐활성화제 Download PDF

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Abstract

본 발명에 따른 플라스미노겐 활성화제(t-PA)는
a) 트롬빈에 의해 절단되어 이중쇄형으로 전환되도록 변형되고,
b) 효소형성성이 t-PA와 비교해 볼 때 1.2배 이상 더 높도록 변형되고,
c) 피브린 결합능이, 플라스미노겐 활성화제가 혈병 안으로 50% 이상 침투할 수 있을 정도로 감소된다. 이러한 플라스미노겐 활성화제는 향상된 피브린-특이성을 갖고 부작용을 더욱 감소시킨다.

Description

트롬빈에 의해 활성화될 수 있는 플라스미노겐 활성화제{Plasminogen activator capable of being activated by thrombin}
조직 플라스미노겐 활성화제(tissue plasminogen activator, t-PA)는 플라스미노겐이 플라스민으로 전환하는 반응을 촉매하는 몇가지 도메인으로 이루어진 세린 프로테아제이며, 피브린 용해성 처방에 사용된다.
많은 t-PA 변이체 및 돌연변이가 예를 들면 해리스(T.J.R.Harris)(1987) 및 크라우스(J.Krause)(1988)의 문헌에 공지되어 있다.
t-PA의 활성 메카니즘에 있어서, 피브린 용해현상이 t-PA와 플라스미노겐 활성화제 억제제-1(plasminogen activator inhibitor-1, PAI-1, 서핀 부류의 세린 프로테아제 억제제)의 상호작용에 의해 부분적으로 조절된다는 사실이 무엇보다도 공지되어 있다. PAI-1은 아미노산 296-302를 경유하여 t-PA에 일차적으로 결합한다. 이러한 영역의 돌연변이는 t-PA상에 미치는 PAI-1의 억제 효과를 감소시킨다(매디슨(E.L.Madison) 등, 1990). t-PA의 아미노산 영역 296-302와 PAI-1 사이의 상호작용 메카니즘에 대한 집중적인 연구가 계속되어 왔다[참조: 매디슨, Nature 339(1989) 721-723; 쇼헤트(R.V.Schohet), Thrombosis and Haemostasis 71(1994) 124-128; 레피노(C.J.Refino), Thrombosis and Haemostasis 70(1993) 313-319; 파오니(N.F.Paoni), Protein Engineering 6(1993) 529-534 and Thrombosis and Haemostasis 70(1993) 307-312; 베네트(W.F.Bennett), J.Biol.Chem.266(1991) 5191-5201; 이스트만(D.Eastman), Biochemistry 31(1992) 419-422].
비변형된 사람 t-PA(이후, t-PA로 지칭됨)는 플라즈마에서 발생하는 형태의 527개의 아미노산으로 구성되고 플라스민에 의해 두 개의 쇄로 끊어질 수 있으며, 이어서 이황화물 가교결합에 의해 함께 계속 유지된다. A쇄(중쇄로 명명되기도 함)는 4개의 구조적 도메인으로 구성된다. 핑거 도메인(finger domain)(아미노산 1-49)은 피브로넥틴에서 핑거 구조와 어떤 유사성을 갖는다. 성장 인자 도메인(아미노산 50-86)은 어느 정도까지는 쥐 및 사람 표피 성장 인자와 유사하다. 크링글 도메인(kringle domain)(아미노산 87-261)은 플라스미노겐의 제 4 및 제 5 크링글 도메인과 상당히 유사하다. t-PA의 핑거 및 크링글 2 도메인은 피브린 결합 및 피브린에 의한 단백분해 활성의 자극과 특히 관련된다. t-PA의 B쇄(아미노산 276-527, 프로테아제 도메인)은 세린 프로테아제이고 유로키나제 및 플라스민의 B쇄와 실질적으로 유사하다(해리스(1987) 및 크라우스(1988)).
t-PA의 효소 활성(플라스민에 대한 플라스미노겐의 촉매적 활성)은 피브린 또는 피브린 절단 산물이 존재하지 않으면 낮지만 이들 자극제가 존재하면 실질적으로 증가할 수 있다(10 배 이상 만큼). 생체내 t-PA의 작용 메카니즘은 예를 들면 다음 문헌에 개시되어 있다[참조: 코닝거(Korninger) 및 콜렌(Collen), Thromb. Haemostasis 46(1981) 561-565]. t-PA는 플라스미노겐을 플라스민으로 활성화시킨다. 플라스민은 피브린을 절단하여 가용성 피브린 절단 산물을 형성한다. t-PA는 혈액중에 존재하는 프로테아제/플라스민에 의해 아미노산 275(아르기닌)과 276(이소로이신) 사이에서 절단되어 활성화된다. 이러한 과정에서 두 개의 부분적 쇄는 시스테인 가교결합을 통해 연결된 체로 남아 있다.
피브린 및 피브린 절단 산물에 의해 활성을 자극하는 능력은 t-PA를 다른 공지된 플라스미노겐 활성화제(예: 유로키나제 또는 스트렙토키나제)와 구별짓는 t-PA의 본질적인 특징이다. 잠재적 자극성은 t-PA의 아미노산 서열을 변형시킴으로써 추가로 향상될 수 있다. 잠재적 자극성은 피브린의 존재하에 그리고 부재하에 촉매적 효율비(kcat/Km)로서 측정한다. kcat는 촉매반응의 속도 상수이고 Km은 미켈리스 상수(Michaelis constant)이다. t-PA의 잠재적 자극성은 아미노산 292 및/또는 305를 변형시킴으로써 19배 내지 81배 증가할 수 있다(매디슨 등, Science 262(1993) 419-421).
t-PA 유도체는 미국 특허 제 5,501,853 호로부터 공지되어 있으며, 여기서 아미노산 영역 272-280, 특히 영역 274-277에서 변형되고 글리코실화 부위(117-119 및 184-186)에서 추가로 변형된다. 이러한 t-PA 유도체는 향상된 단백분해 활성 및 플라스미노겐 분해 활성, 감소된 억제 민감성, 피브린에 대한 향상된 친화력 및/또는 플라스미노겐 분해 활성의 향상된 피브린 의존성을 갖는다.
트롬빈-활성화가능한 플라스미노겐 활성화제가 다음 문헌에 개시되어 있다[양(Wen-Pin Yang) 등, Biochemistry 33(1994) 2306-2312]. 이러한 키메라성 플라스미노겐 활성화제(59 D8-scu PA-t)는 안티-피브린 항체(59 D8)의 Fab 단편 및 부위-지향성 돌연변이원 생성에 의해 저분자 단쇄 유로키나제 플라스미노겐 활성화제(single chain urokinase plasminogen activator, scu PA)로부터 아미노산 Phe-157 및 Lys-158이 결실됨으로써 수득된 트롬빈-활성화가능한 저분자 단쇄 유로키나제 플라스미노겐 활성화제(scu PA-t)의 C-말단으로부터 생성되었다.
트롬빈-활성화가능한 플라스미노겐 돌연변이체가 다음 문헌에 개시되어 있다[참조: 도슨(K.N.Dawson) 등, J.Biol.Chem. 269(1984) 15982-15992]. 이러한 플라스미노겐 유도체는 절단 부위의 P3, P2 및 P1' 아미노산을 트롬빈-절단가능한 서열에 의해 치환하여 수득되었다.
파오니 등은 다음 문헌에서 아미노산 영역 296-299에서의 t-PA의 변형을 설명하고 있다[Protein Engineering 5(1992) 259-266].
트롬빈-활성화가능한 플라스미노겐 활성화제는 미국 특허 제 5,200,340 호에 개시되어 있으며, 이는 활성화를 위한 트롬빈 절단 부위를 함유하도록 변형된다. 또한 비록 성장 인자 도메인(EGF 도메인)이 이러한 t-PA 유도체에서 결실될 수 있더라고 피브린 결합 도메인(핑거 도메인) 및 크링글 구조가 보전되어야 한다는 것이 언급되어 있다.
국제 특허 공개공보 제 91/09118 호 및 국제 특허 공개공보 제 94/10318 호로부터, 플라스미노겐이 트롬빈에 의해 활성화되어 트롬빈 절단 부위를 도입함으로써 플라스민을 형성할 수 있다는 것을 알 수 있다. 트롬빈이 혈병 안에 함유되어 있으므로, 이러한 활성화는 주로 혈병 안에서 발생되도록 한다. 그러나, 이러한 방법의 단점은 변형된 플라스미노겐이 환자에게 다량으로 투여되어야 한다는 것이다.
본 발명은 트롬빈-활성화가능한 플라스미노겐 활성화제, 혈전색전성 질병(thromboembolic disease)을 치료하기 위한 약학 제제, 이러한 플라스미노겐 활성화제를 함유하는 약제학적 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.
도 1은 플라스마 혈병 침투 및 용해 모델을 도식적으로 나타낸다. 인열 과다로 인한 플라즈마 응고를 피하기 위해, 압력이 완충실(사선 영역)에 의해 생성되었다. 혈병(점 영역)상의 플라즈마와 완충물의 혼합은 방울 트랩을 도입함으로써 피하였다.
도 2a 및 도 2b는 각각 트롬빈에 의한 r-PA(F274P, K277V)(A) 및 r-PA(B)의 절단성을 나타낸다(자세한 것은 실시예 8을 참조).
도 3a 및 도 3b는 각각 플라스민에 의한 r-PA(F274P, K277V)(A) 및 r-PA(B)의 절단성을 나타낸다(자세한 것은 실시예 9를 참조).
도 4는 트롬빈에 의한 r-PA(P272V, F274P, K277V)의 절단성을 나타낸다(자세한 것은 실시예 10을 참조).
도면의 주요부분에 대한 부호의 설명
1: 완충 저장액
2: 연동 펌프
3: 방울 트랩
4: 피브린 용해제를 위한 주사기
5: 혈병을 묻힌 피펫 팁(교차선 영역)
6: 튜브 클랩프
7: 압력 구성요소
본 발명의 목적은 높은 특이성 및 효율로 생체내에서 혈액을 용해시킬 수 있는 향상된 플라스미노겐 활성화제를 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 사람 조직형 플라스미노겐 활성화제를 기본으로,
a) 플라스미노겐 활성화제가 트롬빈에 의해 절단될 수 있고 이러한 절단에 의해 이중쇄형으로 전환되도록 변형되고,
b) 효소형성성(zymogenicity)이 사람 t-PA와 비교해 볼 때, 1.2배 이상, 바람직하게는 2배 이상 더 높도록 변형되고,
c) 피브린 결합성이, 플라스미노겐 활성화제가 혈병 안으로 50% 이상 침투할 수 있을 정도로 감소된
플라스미노겐 활성화제에 의해 달성된다.
이러한 플라스미노겐 활성화제는 특히 혈병상에서 작용하며 따라서 공지된 플라스미노겐 활성화제보다 부작용이 실질적으로 더 적다.
시작점은 사람 조직형 플라스미노겐 활성화제의 서열이다. 결과적으로 본 발명에 사용된 "사람 조직형 플라스미노겐 활성화제를 기본으로"란 표현은 본 발명의 플라스미노겐 활성화제의 서열이 사람 플라스미노겐 활성화제의 서열로부터 유도되었음을 의미한다. 이는 한편으로는 t-PA에 대한 구조적 특징(도메인) 특성부가 적어도 부분적으로 구조적으로 보유된다는 것을 의미한다. 예를 들면, 본 발명에 의해 크링글 2 및/또는 프로테아제 도메인의 구조는 여전히 보유되고 또한 본 발명에 따른 변형을 포함하는 플라스미노겐 활성화제가 본 발명의 의미로 사용될 수 있다는 것을 발견하였다. 또한 추가의 도메인이 보유되고 본 발명에 따르는 특징부가 아미노산의 결실, 돌연변이 및/또는 추가에 의해 발생할 수 있다. 아미노산 서열의 변화는 부위-지향성 돌연변이 또는 PCR과 같은 분야의 숙련인들에게 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 플라스미노겐 활성화제는 사람 조직형 플라스미노겐 활성화제와 비교하여, 아미노산 P1(275)와 P1'(276) 사이의 플라스민에 의한 본 발명에 따른 플라스미노겐 활성화제의 절단성이 감소되는 방식으로 변형된다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 플라스미노겐 활성화제에서 플라스민에 의한 절단성은 10% 이상, 더욱 바람직하게는 20% 이상, 및 가장 바람직하게는 50% 이상 감소된다. 이와 관련해서, 플라스민에 의한 절단성이 완전히 0이 될 필요는 없다. 특히 트롬빈 활성화는 본 발명에 따른 플라스미노겐 활성화제의 플라스민 절단성에 의해 향상될 수 있다.
그러나, 생리학적으로 적절한 절단성이 생체내에서 더 이상 발생되지 않는 정도로 절단성이 감소하는 것이 바람직하다. 결과적으로, 부작용을 극적으로 감소시킬 수 있다. 결론적으로, 응고 인자의 열화가 생체내에서 극적으로 감소되고 출혈 시간이 공지된 플라스미노겐 활성화제의 경우만큼 증가하지는 않는다.
플라스민에 의한 절단성은 생체외 시험으로 결정될 수 있다. 이를 위해서 플라스미노겐 활성화제를 플라스민의 양을 증가시키면서 25℃에서 5분 동안 항온처리하고 후속적으로 SDS 전기 영동을 플라스미노겐 활성화제의 크기에 따라 아크릴아미드 12.5 내지 15%를 함유하는 아크릴아미드 겔에서 수행한다(코너트(U.Kohnert) 등, Protein Engineering 5(1992) 93-100).
다음 문헌에 따라 명명되는 P1 및 P1' 사이에서 플라스민에 의해 전혀 절단되지 않거나 또는 단지 감소된 정도로 절단된 방식으로 플라스미노겐 활성화제를 변형시키는 방법이 당해 기술분야의 숙련인들에게 공지된 방식으로 수행될 수 있다[참조: Schechter, J. 및 Berger, A., Biochem. Biophys. Res Commun. 27(1967) 157-162]. 플라스민은 서열 R275-I276(아미노산은 하나의 문자 코드로 명명한다)을 절단한다. 예를 들면 플라스민에 의한 절단성은 하나 또는 두 개의 아미노 산을 변형시킴으로서 없어지거나 극적으로 감소한다.
플라스민에 의한 절단성은 또한 위치 P4-P3'(아미노산 272-278)을 변형시킴으로써 감소시킬 수 있다. 이러한 경우 P2는 바람직하게는 작은, 바람직하게는 소수성 및/또는 비방향족 아미노산(예: P)으로 전환된다. 결과적으로, 놀랍게도 플라스민 절단성의 감소에 덧붙여 트롬빈 절단성을 달성할 수 있다.
이러한 방법으로 다음 일반적인 조건중 하나 이상은 고수되는 것이 바람직하다:
(P) P4: 임의의 아미노산(P는 아님, 만일 P2가 P라면, 바람직하게는 L, I, V)
(Q) P3: 임의의 아미노산
(F) P2: 소수성 아미노산(F, H, G, V, L, I, T, A 또는 P, 특히 바람직하게는 P)
(R) P1: R 또는 K, 바람직하게는 R
(I) P1': V 또는 I, 바람직하게는 I
(K) P2': V, L, I 또는 K, 바람직하게는 V
(G) P3':G
P4는 특히 바람직하게는 V로 전환되고, P2는 P로 전환되고 P2'는 V로 전환된다. 이는 특히 바람직한 절단 부위(272-278)VQPRIVG를 생성한다(서열번호: 1).
트롬빈 절단 부위는 또한 현행 기술에 따라 도입될 수 있다. 그러나, 적절한 돌연변이는 바람직하게는 아미노산 264-288의 영역 안에 도입된다.
트롬빈에 대한 친화력을 도입하기 위해 t-PA의 변형은 또한 루프 459-471을 변형함으로써 달성될 수 있고, 자가용해 루프 417-425 및/또는 아미노산 Q475, K 505 및/또는 E506을 변형시킴으로서 달성될 수도 있다.
이러한 기재를 위한 효소의 특이성은 절단 부위(1차 서열)의 서열에 본질적으로 의존한다. 트롬빈 및 플라스민과 같은 세린 프로테아제의 경우, P1 잔기는 중요한 특이성 결정요인이다. 주름진 단백질 기질의 특이성은 또한 효소(트롬빈 또는 플라스민)와 기질(플라스미노겐 활성화제) 사이의 접촉 특성 뿐만 아니라 절단 부위의 형상 및 가요성에 달려 있다. 플라스민 및 트롬빈의 1차 특이성이 매우 유사하기 때문에(P1 위치에서 아르기닌 뒤에서 모두 절단됨), 플라스민에 의한 절단성(플라스민 활성화능)은 감소되고 트롬빈에 의한 절단성(트롬빈 활성화능)은 존재하거나 플라스민 활성화능보다 실질적으로 큰(2 내지 10배 이상) 플라스미노겐 활성화제를 수득하는 것이 용이하지 않다. 그러나, 놀랍게도 이러한 성질이 효소과 기질 사이의 2차 결합 부위를 변형시키고 활성화 루프의 구조적 및 동적 성질을 변형시킴으로써 수득될 수 있다는 것을 발견하였다.
플라스민 절단성을 감소시키면서 트롬빈-특이성 절단 부위를 도입하는 것을 바람직하게는 아미노산 264와 288 사이의 활성화 루프중에 돌연변이에 의해 1차 특이성을 변화시킴으로써 수행된다. 이러한 경우 영역 272-277(P4-P2')의 돌연변이가 특히 바람직하다.
트롬빈 절단성은 결합 루프의 가요성 및/또는 접근가능성을 변형시킴으로써 향상시킬 수 있다. 이를 위해 G 265(돌연변이가 낮은 가요성을 유도한다) 또는 R 267(돌연변이는 G 265와 E 401 사이의 염 가교결합의 변화 또는 절단을 유도한다)을 변형시키는 것이 특히 바람직하다. 영역 264와 267 사이의 삽입도 또한 바람직하다. R267은 S로 특히 바람직하게 변형된다(람바(D.Lamba) 등, J.Mol.Biol. 258(1996) 117-135).
가요성을 증가시키기 위해 사용될 수 있는 돌연변이는 R267을 S로 변화시키고 바람직하게는 P4를 F로, P3를 G로, P2를 P로 및 P2'를 V로 함께 변이시킨다.
트롬빈 절단성 및 특이성은 2차 특이성 결합 부위를 변화시킴으로써 추가로 향상될 수 있다. 이를 위해 루프 459-471은 예를 들면 완전히 또는 부분적으로 결실될 수 있다. 이러한 루프는 서열번호: 2(즉, GDTRSGGPQANLH)의 아미노산으로 구성된다.
이러한 루프에서 서열번호: 3(즉, PQANLH)의 영역은 바람직하게는 완전하게 또는 부분적으로 결실되거나(이때, H는 바람직하게는 보전된다) 아미노산 서열이 변형된다:
서열번호: 4(즉, GIPRIV) 및 서열번호: 5(즉, AQPRIK)는 바람직하게는 아미노산 272-277의 영역에 사용된다.
서열번호: 7(즉, GLSQASQGIPRIV)를 265와 277 사이의 아미노산 영역에서 사용하는 것이 또한 유리하다. 이때, t-PA 고유 서열은 서열번호: 6(즉, GLRQYSQPQFRIK)과 같다:
서열번호: 8(즉, GLRQYSQAQGIPRIV)은 이러한 영역에 또한 바람직하다:
이러한 서열에서, 아미노산 G 및 I는 이를 연장하기 위해 Q와 P(고유 서열: Q 및 F) 사이에 삽입된다. 이러한 삽입은 바람직하게는 264와 276 사이의 임의의 부위에서 수행된다.
절단 부위(서열번호: 1)가 P4의 F로의 돌연변이, P3의 G로의 돌연변이, P2의 P로의 돌연변이 및 P2'의 V로의 돌연변이 및 R267의 S로의 돌연변이중 하나 이상, 바람직하게는 모두와 결합된 본 발명에 따른 화합물이 또한 특히 바람직하다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 플라스미노겐 활성화제는 단일쇄형의 활성을 극적으로 감소시키지만 이중쇄형의 활성을 감소시키지는 않고 따라서 효소형성성이 1.2배 이상, 바람직하게는 2배 이상 향상된다.
효소형성성은 이중쇄형의 활성과 단일쇄형의 활성의 비율로서 이해된다. 활성은 아미드 분해성으로 결정된다. 이러한 플라스미노겐 활성화제는 부작용을 극적으로 감소시키면서 높은 선택도 및 생체내 혈전용해의 효율을 달성한다. 단일쇄형의 적절하고 바람직한 돌연변이는 예를 들면 다음 문헌에서 설명된다[참조: 매디슨 등, Science 262(1993) 419-421].
효소형성성(플라스미노겐 활성화제의 이중쇄의 아미드 분해성 활성대 단일쇄형 활성의 비)을 증가시키기 위해, K429를 Q로 및/또는 H417을 T로 변형시키고/변형시키거나 K429와 H417 사이의 상호작용을 억제하고나 간섭하는 것이 특히 바람직하다(사람 조직형 플라스미노겐 활성화제로부터 유도된 모든 플라스미노겐 활성화제 모두에 대해서도).
본 발명에 따른 특히 바람직한 화합물은 서열번호: 1(즉, VQPRIVG)의 절단 부위(272-278)와 K 429의 Q로의 추가의 돌연변이 및/또는 H417의 T로의 돌연변이를 함유한다:
피브린 결합은 피브린 결합에 대해 특이성인 t-PA의 도메인(피브린 결합 도메인, 핑거 도메인)을 결실시킴으로써 또는 이를 핑거 도메인을 통한 피브린 결합이 발생하지 않도록 또는 단지 경미한 정도로(전혀 작용적으로 활성이 아닌 핑거 도메인) 발생하도록 이를 변형시켜서 감소시킬 수 있다. 피브린 결합이 감소되면 플라스미노겐 활성화제가 혈병 안으로 침투하고(바람직하게는 50% 이상의 정도로) 균일하게 분산할 수 있게 한다. 이는 트롬빈에 의해 절단되고 그 활성을 활성 이중쇄형으로 나타낸다. 따라서 이러한 방식으로 피브린 결합이 감소된 플라스미노겐 활성화제는 더 이상 t-PA의 높은 친화력 피브린 결합을 나타내지 않는다. 작용의 구체적인 메카니즘은 플라스미노겐 활성화제의 잠재능을 증가시키고 특히 부작용을 극적으로 감소시킨다. 본 발명에 따른 플라스미노겐 활성화제의 혈병으로의 침투는 생체외 모델로 결정될 수 있다. 혈병 침투도 및 혈병에서의 분산도는 육안으로 확인될 수 있다. 평가를 위해, 미국 특허 제 5,233,256 호에 기술된 바와 같은 플라스미노겐 활성화제는 혈병 안으로 침투하고 균일하게 분산하고 따라서 정의에 따라 100% 값을 나타내는 표준으로서 사용된다(3 ㎍/mL의 농도로 측정됨). 유럽 특허 공고공보 제 0 093 619 호에 따르는 재조합 사람 조직형 플라스미노겐 활성화제는 정의에 따라 혈병 안으로 침투하지 않고 표면에 본질적으로 결합하는 추가의 표준물질로서 사용된다. 실시예 3c에 기술된 절차를 사용하여 혈병 침투도를 검사한다. 이들 표준물질을 비교해보면 "혈병으로의 비침투"란 플라스미노겐 활성화제의 훨씬 많은 부분(80% 이상)이 혈병의 4분의 1에 존재한다는 것을 의미하는 한편 "균일한 분포"란 플라스미노겐 활성화제의 50% 이상이 혈병 안으로 추가로 침투하고 따라서 나머지 4분의 3에 존재한다는 것을 의미한다.
혈병 용해의 특이성 및 효율은 본 발명에 따르는 플라스미노겐 활성화제가 사용되면 추가로 증가하고 또한 비특이성 피브린 결합을 전혀 갖지 않거나 단지 조금만 갖는다. 이러한 분자는 혈병의 내부 안으로 침투되고 따라서 플라스미노겐은 혈병에서 플라스민으로 효율적으로 활성화된다. 이러한 플라스미노겐 활성화제는 예를 들면 t-PA의 프로테아제 도메인을 기본으로 하거나(국제 특허 공개공보 제 96/17928 호) 또는 크링글 2 도메인 및 프로테아제 도메인을 본질적으로 함유하는 물질을 기본으로 하지만 t-PA 도메인으로서 핑거 도메인은 기본으로 하지 않는다(국제 특허 공개공보 제 90/09437 호, 미국 특허 제 5,223,256 호, 유럽 특허 공고공보 제 0 297 066 호, 유럽 특허 공고공보 제 0 196 920 호).
바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따르는 플라스미노겐 활성화제는 PAI-1에 의해 억제될 수 없도록 추가로 변형된다. 이러한 변형은 바람직하게는 아미노산 296-302의 돌연변이에 의해 활성화되고(매디슨 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87(1990) 3530-3533) 특히 바람직하게는 아미노산 296-299(KHRR)을 AAAA(국제 특허 공개공보 제 96/01312 호에 의해 치환됨으로써 활성화된다.
본 발명에 따르는 화합물은 바람직하게는 t-PA(알트플라즈, Alteplase)와 대조적으로 정맥내 환괴 주입 투여용에 적합한 혈전용해성 활성 단백질이다. 이는 낮은 투여량으로 효과적이고 실제적으로 알트플라즈의 표준 임상 침출물과 동일한 혈전용해 작용을 한다.
특이성의 증가 및 출혈 부작용의 관련된 감소 덕분에 본 발명에 따른 화합물을 모든 혈전색전성 질병 치료용의 예외적으로 가치있는 혈전용해제이다. 이전에 단지 심근경색 및 대량 폐 색전증(massive plumonary embolism)과 같은 극도로 치명적인 질병에만 인정되었던 혈전용해제와 대조적으로, 이러한 변이체를 사용하면 본 발명에 따른 화합물에 의해 심부 정맥 혈전증과 같은 덜 치명적인 질병에도 혈전증을 치료할 기회가 제공된다. 또한 본 발명에 따른 화합물을 기본으로 한 혈전용해제는, 광범위하게 사용하지 못했던 주된 원인이 출혈 합병증의 위험이었기 때문에 지금까지보다 더 넓은 기준으로 사용될 수 있다. 이와 무관하게, 이러한 본 발명에 따른 화합물은 또한 심근경색 또는 폐 색전증과 같은 급성 질병에서 유리하게 사용할 수 있다.
본 발명에 따라 사용된 플라스미노겐 활성화제는 진핵세포 및 원핵세포 분야의 숙련인들에게 친숙한 방법에 의해 생성될 수 있다. 본 발명에 따른 화합물은 바람직하게는 유전자 엔지니어링으로 생산된다. 이러한 과정은 이러한 생성방법을 청구하고 있는 국제 특허 공개공보 제 WO 90/09437 호, 유럽 특허원 제 0 297 066 호, 유럽 특허원 제 0 302 456 호, 유럽 특허원 제 0 245 100 호 및 유럽 특허원 제 0 400 545 호에 개시되어 있다. 돌연변이는 올리고뉴클레오티드 지향적 부위-특이성 돌연변이원 생성에 의해 t-PA의 cDNA 또는 이의 유도체 안으로 도입될 수 있다. 부위-특이성 돌연변이원 생성은 예를 들면 졸러(Zoller) 및 스미쓰(Smith)(1984)에 의해 설명되고 쿤켈(T.A. Kunkel)(1985) 및 모리나가(Morinaga) 등(1984)에 따라 변형된다. PCR 돌연변이원 생성 과정 또한 적절하며 예를 들면 오스벨(Ausubel) 등(1991)의 문헌에 개시되어 있다.
이러한 방식으로 수득된 핵산이 사용된 숙주 세포에 적절한 발현 벡터상에 존재할 때, 상기 핵산이 사용되어 본 발명에 따른 플라스미노겐 활성화제를 발현한다.
본 발명에 따른 단백질의 핵산 서열은 추가로 변형될 수 있다. 이러한 변형은 예를 들면 다음과 같다:
리게이션, 클로닝, 및 돌연변이원 생성의 단계들을 촉진시키기 위해 제한효소를 위한 각종 인식 서열을 도입시키기 위한 핵산 서열의 변형;
숙주 세포에 바람직한 코돈을 도입시키기 위한 핵산 서열의 변형;
숙주 세포에서 발현을 최적화시키기 위한 추가의 조절 인자 및 전사 인자에 의한 핵산 서열의 연장.
적절한 발현 벡터의 생성 및 발현을 위한 모든 추가의 단계는 현재 기술 수준으로 수행되며 이는 당해 기술분야의 숙련인들에게 친숙하다. 이러한 방법은 예를 들면 다음 문헌에 기술되어 있다[참고: 삼브룩(Sambrook) 등, "Expression of cloned genes in E. coli" in Molecular Cloning: A laboratory manual(1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA.].
본 발명에 따라 사용된 글리코실레이트화 플라스미노겐 활성화제의 생성은 진핵 숙주 세포 안에서 수행된다. 본 발명에 따라 사용된 비글리코실레이트화 플라스미노겐 활성화제의 생성은 진핵 숙주 세포에서 수행되고, 이때 초기에 수득된 글리코실레이트화 산물은 당해 기술분야의 숙련인들에 친숙한 방법에 의해 탈-글리코실레이트화되어야 하거나 또는 바람직하게는 원핵 숙주 세포에서 특히 바람직하게는 비-글리코실레이트화 숙주 세포에서의 발현에 의해 탈-글리코실레이트화되어야 한다.
이.콜라이(E.coli), 스트렙토마이시스 속(streptomyces spec.), 또는 바실러스 서브틸리스(bacillus subtilis)는 예를 들면 원핵 숙주 세포 기관으로서 적절하다. 본 발명에 따른 단백질을 생성하기 위해, 원핵 세포는 통상적인 방식으로 발효되고 단백질은 박테리아 분해 후 통상적인 방식으로 단리된다. 단백질이 비활성 형태로 생성되면(신체를 포함함), 당해 기술분야의 숙련인들에게 친숙한 방법에 따라 용해되고 탈변성된다. 당해 기술분야의 숙련인들에게 친숙한 방법에 따라 미생물로부터 활성 단백질로서 단백질을 분비할 수도 있다. 이를 위한 적절한 발현 벡터는 사용된 숙주 세포에서 단백질 및 이러한 단백질을 코딩하는 핵산 서열 분비에 적절한 시그날 서열을 함유한다. 이러한 벡터로 발현된 단백질은 배지로 분비되거나(그람-양성 박테리아의 경우) 또는 이러한 과정중 세포질 공간(그람-음성 박테리아의 경우)으로 분비된다. 서열이 시그날 서열과, 조작과정중에 또는 프로테아제로 처리에 의해서 단백질을 절단 해버릴 수 있는 절단 부위를 코딩하는 본 발명에 따른 t-PA를 위한 서열 코딩 사이에 존재하는 것이 적절하다.
본 발명에 따른 플라스미노겐 활성화제를 코딩하는 DNA 서열이 도입된 염기 벡터의 선택은 발현에 나중에 사용되는 숙주 세포에 달려 있다. 적절한 플라스미드 뿐만 아니라 이러한 플라스미드를 위한 최소한의 필요요소(복제원, 제한 절단 부위 등)은 당해 기술분야의 숙련인들에게 친숙한 것이다. 플라스미드 대신 본 발명의 범주 안에 코스미드, 파지(λ, M13)의 복제성 두가닥 형태 또는 당해 기술분야의 숙련인들에게 공지된 그 밖의 벡터를 포함시킬 수 있다.
본 발명에 따른 플라스미노겐 활성화제가 분비 없이 원핵세포에서 생성되면, 가용성 세포 입자로부터 형성하는 봉입체를 분리시키고, 환원 조건하에 탈변성제로 처리하여 플라스미노겐 활성화제를 함유하는 봉입체를 용해시키고, 후속적으로 GSSG로 도출해내고 플라스미노겐 활성화제를 GSH 및 탈변성제를 비탈변성 농도로 첨가하거나 L-아르기닌을 첨가함으로서 탈변성화하는 것이 바람직하다. 봉입체로부터 t-PA 및 이의 유도체를 활성화시키기 위한 이러한 과정은 유럽 특허원 제 0 219 874 호 및 유럽 특허원 제 0 241 022 호에 기술되어 있다. 그러나, 봉입체로부터 활성 단백질을 단리시키기 위한 그 밖의 과정 또한 사용될 수 있다.
본 발명에 따라 플라스미노겐 활성화제는 바람직하게는 특히 10 내지 1000 mmol/l의 아르기닌 농도로 L-아르기닌의 존재하에 정제되는 것이 바람직하다.
외부 단백질들은 바람직하게는 친화 크로마토그래피 및 특히 바람직하게는 흡착 칼럼(이러한 칼럼상으로 ETI(erythrina trypsin inhibitor)가 부동화된다)에 의해 분리된다. 세파로즈(Sepharose, 등록상표)가 예를 들면 지지 물질로서 사용된다. ETI 흡착 칼럼에 의해 정제하는 장점은 ETI 흡착 칼럼 물질에 0.8 mol/l의 아르기닌 농도의 존재하에서조차 진한 탈변성 혼합물로 바로 적재할 수 있다는 것이다. 본 발명에 따른 플라스미노겐 활성화제는 바람직하게는 아르기닌 0.6 내지 0.8 mol/l의 존재하에 ETI 흡착 칼럼에 의해 정제되는 것이 바람직하다. 이러한 과정에 사용된 용액은 바람직하게는 7 이상의 pH, 특히 바람직하게는 7.5 내지 8.6의 pH를 갖는다.
본 발명에 따른 플라스미노겐 활성화제는 아르기닌의 존재하에 또는 부재하에 pH를 낮춤으로써 ETI 칼럼으로부터 용출된다. 이러한 과정에서 pH 값은 특히 바람직하게는 pH 4.0과 5.5 사이의 산 범위에서 바람직하다.
본 발명의 추가의 요지는 본 발명에 따른 혈전용해성 활성 단백질을 함유하는 약제학적 조성물이고, 이때 단백질은 바람직하게는 프로테아제 도메인을 함유하고 선택적으로 사람 조직형 플라스미노겐 활성화제의 크링글 2를 혈전용해 활성을 생성하는 구조물로서만 함유한다.
본 발명에 따라 사용된 플라스미노겐 활성화제는 당해 기술분야의 숙련인들에게 친숙한 방식으로 제형될 수 있으며 본 발명에 따른 화합물이 통상적으로 약제학적으로 허용가능한 담체와 결합된 처방 제제를 생성한다. 이러한 조성물은 일반적으로 0.1 내지 7 mg/체중 kg, 바람직하게는 0.7 내지 5 mg/체중 kg 및 특히 바람직하게는 1 내지 3 mg/체중 kg의 효과량을 투여량으로서 함유한다. 처방학적 조성물은 살균 수용액 형태 또는 동결건조물과 같은 살균 가용성 건조 제형 형태가 통상적이다. 이러한 조성물은 통상적으로 등장액을 제조하는데 사용되는 약제학적으로 허용가능한 염의 적절한 양을 함유한다. 아르기닌 완충제와 같은 완충제에 덧붙여, 포스페이트 완충제가 적절한 pH(바람직하게는, 5.5 내지 7.5)를 안정화시키기 위해 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 화합물의 투여량은 당해 기술분야의 숙련인들에 의해 난점없이 결정될 수 있다. 예를 들면 투여 유형(침출물 또는 환괴) 및 처방 기간에 좌우된다. 연장된 반감기(생체내 열화와 관련됨) 때문에, 본 발명에 따른 화합물은 환괴 투여에 특히 적절하다(하나의 환괴, 여러개의 환괴). 환괴 적용을 위한 적절한 형태는 예를 들면 본 발명에 따른 화합물 25 내지 1000 mg, 플라스미노겐 활성화제의 용해도를 증가시키는 물질(예: 아르기닌) 및 완충제를 함유하는 앰풀이다. 투여는 바람직하게는 정맥내이지만 또한 피하, 근육내 또는 동맥내로 투여한다. 또한, 본 발명에 따른 플라스미노겐 활성화제는 침출되거나 국소적으로 적용될 수 있다.
본 발명에 따른 화합물은 다수의 환괴로서(바람직하게는 이중 환괴로서) 투여될 수 있다. 적절한 시간 간격은 20 내지 180분이고, 30 내지 90분의 간격이 특히 바람직하고 30 내지 60분의 간격이 가장 바람직하다. 또한, 본 발명에 따른 화합물을 침출물로서 1시간 내지 2일동안 투여하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 화합물은 예를 들면 급성 심근경색, 뇌경색, 폐 색전증, 다리 심부 정맥 혈전증, 급성 동맥 폐색 등과 같은 모든 혈전색전성 질병의 치료에 특히 적절하다. 본 발명에 따른 화합물은 더욱 긴 혈전용해가 수행되어야 하는 잠재적 만성 혈전색전성 질병을 치료하는데 특히 바람직하다.
본 발명에 따른 화합물을 헤파린과 같은 응고 억제제(항응고제) 및/또는 거의 부작용 없는 혈관확장 효과를 증가시키는 혈소판 응집 억제제와 조합하여 사용하는 것이 바람직하다. 항응고제의 투여는 본 발명에 따르는 화합물의 투여와 동시에 또는 다른 시간에 수행할 수 있다. 혈액 유동을 자극하는 물질 또는 미소순환을 향상시키는 물질을 첨가하면 바람직하다.
하기 실시예, 간행물, 서열 목록 및 도면은 본 발명을 추가로 밝하며, 본 발명의 보호 범위는 특허청구범위로부터 유도된다. 설명된 과정은 변형 후 본 발명의 요지를 계속해서 설명하는 예로서 이해된다.
다음에서, "r-PA"는 사람 t-PA의 도메인 K2 및 P로이루어진 재조합 플라스미노겐 활성화제로 이해된다. 이러한 플라스미노겐 활성화제의 생성은 예를 들면 미국 특허 제 5,223,256 호에 개시되어 있다.
r-PA(F274P, K277V)는 도메인 K2 및 P로 이루어진 플라스미노겐 활성화제중 아미노산 274(F)가 아미노산 P에 의해 대체되었고 아미노산 277(K)가 아미노산 V에 의해 대체되었다는 것을 이해해야 한다(아미노산 명명은 해리스(1987)에 따른다.
실시예 1
본 발명에 따른 화합물의 재조합체 제조방법
a) 발현 플라스미드의 구조
유럽 특허 제 0 382 174 호에 설명된 초기 플라스미드 pA27fd는 다음 성분을 함유한다: tac 촉진제, ATG 시작 코돈을 함유하는 lac 작동자 영역, 크링글 2 도메인 및 프로테아제 도메인을 함유하는 t-PA 뮤테인에 대한 코딩 영역 및 fd 전사 종결자. 초기 벡터는 플라스미드 pkk 223-3이다.
다음 문헌의 방법은 돌연변이를 도입하기 위해 필수적으로 사용되었다[참조: 모리나가 등, Biotechnology(1984) 636]. 헤테로듀플렉스 형성에 있어서, 두 개의 적절한 단편(예: 단편 A: 큰 BamHI 단편, 단편 B: PvuI로 선형화된 벡터)이 pA27fd로부터 단리된다.
사용된 올리고뉴클레오티드 및 이로부터 생성된 돌연변이는 하기 표 1에 열거되어 있다.
헤테로듀플렉스 제제는 플라스미드 pUBS520과 함께 이.콜라이 안에서 형질전환되었다(브링크만(Brinkmann) 등, Gene 85(1989) 109). 형질전환체는 앰피실린 및 카나마이신(각각의 경우 50 ㎍/mL)을 영양 배지에 첨가하여 선택되었다.
제제 각각으로부터 생성된 플라스미드를 또한 하기 표 1에 나타낸다.
b) 이.콜라이에서의 발현
발현 수율을 검사하기 위해 각각의 플라스미드(표 1 참조) 및 pUBS520을 함유하는 이.콜라이를 앰피실린 및 카나마이신(각각 50 ㎍/mL)의 존재하에 550 nm에서 0.4의 OD까지 LB 배지 안에서 배양하였다(삼브룩 등, 1989, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor). 발현은 5 mmol/1IPTG를 첨가함으로써 개시되었다.
배양물을 추가의 4시간 동안 항온처리하였다. 후속적으로 이.콜라이 세포를 원심분리에 의해 수거하여 완충액(50 mmol/l Tris HCl pH 8, 50 mmol/l EDTA)중 재현탁시키고; 세포를 음파처리에 의해 용해하였다. 불용성 단백질 단편을 다시 원심분리에 의해 수거하여 상기 완충액에 음파처리에 의해 재현탁시켰다. 현탁액을 1/4 체적 적용 완충액(250 mmol/l Tris-HCl pH 6.8, 10 mmol/EDTA, 5% SDS, 5% 머캅토에탄올, 50% 글리세롤 및 0.005% 브로모페놀 블루)과 혼합하고 12.5% SDS 폴리아크릴아미드 겔로 분석하였다. 대조군으로서 동일한 제조과정을 IPTG로 유도되지 않고 겔중에서 분리되는 각각의 플라스미드를 함유하는 이.콜라이 배지로 수행하였다. 약 40 kD의 분자량을 갖는 뚜렷한 밴드를 쿠마시 블루 R250(coomassie blue R250)으로 겔을 염색한 후 IPTG-유도된 배지의 제조할 때 볼 수 있고(30% 메탄올 및 10% 아세트산중에 용해됨), 이러한 밴드는 대조 제제중에 존재하지 않는다.
활성 화합물을 제조하기 위한 추가의 단계는 유럽 특허원 제 0 382 174 호의 실시예 2 및 실시예 3에 상응한다.
돌연변이 부위 사용된 올리고뉴클레오티드 플라스미드
a) 272P→V, 274F→P, 277K→V G.TAC.AGC.CAG.GTT.CAG.CCT.CGC.ATC.GTT.GGA.GGG.CTC.T1) pttPA-1
b) 267R→S, 272P→F, 273Q→G, 274F→P, 277K→V C.TGC.GGC.CTG.AGC.CAG.TAC.AGC.CAG.TTT.GGC.CCT.CGC.ATC.GTT.GGA.GGG.CTC.T pttPA-2
c)429K→Q G.GAG.CGG.CTG.CAG.GAG.GCT.CAT.G3) pttPA-3
d) b) 및 c) 플라스미드 pttPA-2로부터 출발하고 올리고뉴클레오티드 c)를 사용함 pttPA-4
e) 417H→T C.TAC.GGC.AAG.ACC.GAG.GCC.TTG.T4) pttPA-5
f) a) 및 e) 플라스미드 pttPA-1로부터 출발하고 올리고뉴클레오티드 e)를 사용함 pttPA-6
g) b) 및 e) 플라스미드 pttPA-2로부터 출발하고 올리고뉴클레오티드 e)를 사용함 pttPA-7
1) 서열번호: 92) 서열번호: 103) 서열번호: 114) 서열번호: 12
실시예 2
생체내 특성화
콜렌(D.Collen, J. Clin. Invest. 71(1983) 368-376)에 의해 확립된 경정맥 혈전용해의 래빗 모델을 사용하여 혈전용해능 및 본 발명에 따른 단백질의 효과를 검사하였다. 이러한 방법에서 방사활성 표지된 혈전을 동물의 경정맥중에서 생성하였다. 동물을 100 IU/kg 헤파린으로 피하 항응고되도록 하였다. 알트플라즈(재조합 야생형 플라스미노겐 활성화제, 독일 비베라프 소재의 토마에 캄파니(Thomae Company)로부터 악틸라이즈(Actilyse, 등록상표)로서 시판중인 "t-PA"), 실시예 1에 기술된 단백질, 스트렙토키나제(독일 마르부르크 소재의 베링그 캄파니(Behring Company)로부터 스트렙타제(Streptase, 등록상표)로서 시판중임) 또는 용매(0.2 M 아르기닌 포스페이트 완충액)를 래빗에 정맥내 투여하였다.
플라시보 집단은 환괴 1 mg/용매 kg을 정맥내 단일 환괴 주입하였다. 알트플라즈 집단은 초기 환괴 주입으로서 이를 1.45 mg/kg, 0.2 mg/kg의 총 투여량으로 정맥내 투여하였고, 30분 침출물로서 0.75 mg/kg을 60분 연속 침출물(총 침출물: 90 분)로서 0.5 mg/kg 투여하였다. 스트렙토키나제 집단은 64,000 IU/kg의 60분 정맥내 침출물을 받았다. 본 발명에 따르는 단백질을 갖는 집단은 단일 환괴를 정맥내 주입하였다. 알트플라즈 및 스트렙토나제는 인정된 표준근거이다.
처방한지 2시간 후 잔사성 혈전을 제거하고 혈전 용해 정도(혈전용해성)를 혈전에서 방사활성을 감소시킴으로써 결정하였다. 플라즈마를 수득하기 위한 혈액 시료를 처방 전 및 처방한지 2시간에 취하였다. 활성화된 트롬보플라스틴 시간을 표준 절차에 의해 측정하였다. 또한 혈전용해 처방에 기인한 혈액 손실을 정량화하였다. 이를 위해 동물의 허벅지에서 모형 및 외과용 메스를 사용하여 길이 4 ㎝ 및 깊이 0.3 ㎝의 소정의 피부 절개부를 혈전용해제를 투여하기 전에 취하였다. 이로서 유발된 출혈이 자연스러운 응고에 의해 정지하였다. 처방을 시작한 후 스폰지를 환부에 대고 혈전용해로 인해 다시 시작한 출혈로부터 혈액을 흡수하였다. 스폰지를 칭량하여(스폰지의 순 중량을 뺀 후) 빠져나간 혈액량을 측정하고 출혈 부작용 정도를 기술하였다.
알트플라즈 뿐만 아니라 실시예 1의 본 발명에 따른 단백질은 매우 활성인 혈전용해 물질이고 용매 대조군과 비교하여 트롬빈을 상당히 용해시킨다.
실시예 3
혈병 용해 활성의 비교
a) 혈병 용해 평가의 절차
혈병 용해 평가에서, t-PA의 활성 및 실시예 1의 재조합 단백질을 측정하였다.
시료를 각각의 경우 완충액[0.06 M Na2HPO4, pH 7.5, 5 mg/mL BSA(소 혈청 알부민), 0.01% 트윈(Tween, 등록상표) 80]을 첨가하여 요구되는 단백질 농도로 조절하였다. 0.1 mL 시료를 1 mL 사람 피브리노겐 용액(IMCO)(2 mg/mL 0.006 M Na2HPO4, pH 7.4, 0.5 mg/mL BSA, 0.01% 트윈 80)과 혼합하였고 5분 동안 37℃에서 항온처리하였다. 후속적으로 각각의 플라스미노겐 용액(10 IU/mL 0.06 M Na2HPO4/H3PO4, pH 7.4, 0.5 mg/mL BSA, 0.01% 트윈 80) 100 ㎕ 및 트롬빈 용액(30 U/mL 0.06 M Na2HPO4/H3PO4, pH 7.4, 0.5 mg/mL BSA, 0.01% 트윈 80)을 첨가하고 시험 혼합물을 다시 37℃에서 항온처리하였다. 2분 후, 테플론(Teflon, 등록상표)을 피브린 혈병에 놓고 볼이 시험관의 바닥까지 도달하는데 걸린 시간을 멈추었다.
b) 동적 플라즈마 모델에서 활성 측정
이러한 동적 플라즈마 모델에서, 본 발명에 따른 물질을 생체내 조건과 매우 유사한 조건하에 검사한다. 상기 물질을 플라즈마에 혈병을 통해 연동 압력의 작용하에 첨가한다(이는 심장 박동에 의해 발생된 압력과 유사하다).
200 ㎕ 시트레이트 플라즈마를 0.25 mol/l CaCl2용액 20 ㎕와 혼합하고 37℃에서 항온처리하였다. 0.16 U 트롬빈을 첨가하고 혼합물을 1 mL 피펫 팁(독일 함부르크 소재의 에펜도르프(Eppendorff))에 넣었다. 피펫 팁을 23℃에서 2분 동안 수직으로 유지하고, 0.01 mol/l Tris/HCl에서 60분 동안 항온처리하고(pH 7.4, 0.15 mol/l NaCl2, 0.025 mol/lCaCl20.01% 트윈 80) 혈병 용해 기구 안에 넣었다. 혈병 용해 활성을 탄성관으로 이루어진 스위칭 시스템(도 1)에서 측정하였다. 연동 압력에 의해 유동이 생성되고 두 개의 평행 가지로 나뉘었다. 가지 A는 이러한 가지를 폐쇄하는 플라즈마 혈병으로 충진된 1 mL 용량 피펫을 함유한다. 가지 B는 가지 A에 평행하게 수행되는 블라인드 라인이다. 가지 B에서의 압력을 튜브 클램프에 의해 10 mbar로 조절하였다. 플라즈마(1 mL)를 혈병에 적용하였다. 펌프를 스위치 온하고 각각의 개별적인 혈병의 안정성을 15분 동안 확인하였다. 피브린 용해제(0.5 및 10 사이의 최종 플라즈마 농도 및 실시예 1의 단백질에 대해 20 ㎍/mL 또는 CHO-t-PA)를 플라즈마 안으로 근육내 주입을 위한 피하조직 핀으로 1mL 튜버쿨린 주사기에 의해 주의깊게 주입하였다(독일 멜준겐 소재의 브라운(Braun)). 혈병 용해 시간을 피브린 용해 효소의 첨가와 피브린 용해제의 첨가 전의 50%까지 압력 감소 사이의 시간 차로서 계산하였다. 압력을 물-검량된 압전(piezoelectric) 압력 감지 시스템에 의해 컴퓨터 보조된 문헌화 프로그램에 의해 문헌화하였다.
c) 정적 모델에서 혈병의 침투
800 ㎛ 사람 시트레이트 플라즈마(건강한 공여자)를 75 ㎕ Ca 완충액(50 mmol/l Tris/HCl, pH 7.2, 0.25 mol/l CaCl2), 20 ㎕ 젤라틴(0.9% NaCl중 10% 중량/체적) 및 100 mL 트롬빈 용액(8 U/mL, 0.05 mol/l 나트륨 시트레이트/HCl, pH 6.5, 0.15 mol/l NaCl)과 혼합한다. 이러한 혼합물 800 ㎕을 2 mL 칼럼으로 주의깊게 옮겼다(미국 일리노이즈주 록포트 소재의 피어스(Pierce)). 플라즈마 혈병을 37℃에서 3시간 동안 항온처리함으로써 형성한다. 2 mL 완충액(0.008 mol/l Na2HPO4, 0.001 mol/l KH2PO4, 0.003 mol/l KCl, 0.137 mol/l NaCl, 0.1% 소 혈청 알부민, 0.01 % 트윈 80)을 플라스미노겐 활성화제로 조절하고, 이를 Glu-Gly-Arg-클로로메틸 케톤으로 목적하는 농도(0, 0.5, 1, 2 및 3 ㎍/mL)까지 미리 억제하고 이러한 용액 1 mL를 혈병의 표면에 적용하였다. 나머지 완충액을 버린다. 혈병의 표면을 PBS 완충액(0.008 mol/Na2HPO4, 0.001 mol/l KH2PO4, 0.003 mol/l KCl 및 0.137 mol/NaCl) 2 mL로 세척하고 단백질을 PBS중 글루타르알데히드 용액 2 mL를 첨가함으로서 정착시킨다. 후속적으로 혈병 표면을 2 mL 50 mmol/l Tris/HCl, pH 8.0으로 세척하고 1 mL 퍼옥시다제-표지된 t-PA(250 mU/mL)에 대한 다클론성 항체로 항온처리한다 혈병을 PBS 1 mL로 세척한 후, 항체-결합된 단백질을 불용성 적색 안료 안으로 퍼옥시다제에 의해 전환된 3-아미노-9-에틸카바졸을 항온처리함으로써 결정한다.
본 발명에 따르는 플라스미노겐 활성화제는 혈병의 표면에서 농축될 뿐만 아니라 혈병 안으로 침투하여 균일하게 분산된다. 혈병의 면역학적으로 염색된 부분의 강도는 플라즈마 안에서 본 발명에 따른 플라스미노겐 활성화제의 농도를 증가시키면서 증가한다.
실시예 4
피브린 결합비교
이러한 예에서 실시예 1의 혈전용해 활성 단백질을 피브린에 결합하는 능력에 대해 실험하고 이러한 성질에 대해 알트플라즈와 비교한다.
알트플라즈의 시료 및 본 발명에 따른 단백질을 1.5 ㎍ 단백질/mL의 용액으로서 제조하였다. 후속적으로 혈전용해 활성 단백질의 시료(100 ㎕)를 각각 완충제 770 ㎕(0.05 M Tris/HCl, pH 7.4, 0.15 NaCl, 0.01% 트윈 80)와 혼합하였고, 10 ㎕ 소 혈청 알부민 용액(100 mg/mL), 10 ㎕ 아프로티닌(3.75 mg/mL), 10 ㎕ 소 트롬빈(농도 100U/mL) 및 증가량의 피브리노겐(10㎍/mL 내지 300 ㎍/mL)과 혼합하였다. 모든 용액은 수성이었다. 트롬빈이 피브리노겐을 불용성 피브린 혈병으로 전환시킨다는 것이 공지되어 있다.
성분을 혼합하고 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 후속적으로 상청액을 피브린 혈병으로부터 원심분리(15분, 13,000rpm, 4℃)에 의해 분리하였고 상청액중 존재하는 플라스미노겐 활성화제 단백질의 양을 표준 ELISA에 의해 측정하였다.
실시예 5
플라스미노겐 용해 활성 및 자극성의 비교
플라스미노겐 활성의 자극성을 측정하기 위한 공지된 절차가 다음 문헌에 개시되어 있다[참조: 버헤이젠(Verheijen) 등, Thromb.Haemost. 48(1982) 266-269].
자극제로서 작용하는 피브리노겐 단편을 사람 피브리노겐을 70% 체적/체적 포름산중 시나오겐 브로마이드(1 g, 사람 피브리노겐, 100 mL 물중 1.3 g CNBr)로 17시간 동안 후속적으로 증류수에 대해 투석하면서 실온에서 처리하였다.
시험이 수행될 때, 5 ng/nl t-PA 또는 실시예 1의 등가 농도의 단백질을 0.1% 체적/체적 트윈 80, 0.13 μmol/l Glu-플라스미노겐, 0.3 mmol 기질 S2251(색소원 기질 H-D-Val-Leu-Lys-p-니트로아닐리드 HCl) 및 120 ㎍/mL 피브리노겐 단편을 함유하는 1 mL 0.1 mL/l Tris/HCl(pH 7.5)중에 항온처리하였다. 혼합물을 25℃에서 2시간 동안 항온처리하고 405 nm에서 흡수율을 반응을 방해하지 않으면서 대조 블랭크 값에 대해 측정하였다. 색소원 기질 S2251의 절단여부를 효소의 플라스미노겐 활성을 측정하여 측정하였다. 자극성을 피브리노겐 단편있는 활성을 피브리노겐 단편없는 활성으로 나누어 계산한다.
각각의 경우, 0.1 mol/Tris, pH 7.5, 0.15% 트윈 80로 적절하게 미리 희석시킨 시료 25 ㎕를 마이크로티터 플레이트의 웰 안에 피펫으로 떨어뜨렸다. 후속적으로 200 ㎕ 시약 혼합물을 첨가하고 405 nm에서 흡수도를 2시간에 걸쳐 블랭크 값에 대해 측정하였다(25 ㎕, 0.1 mol/lTris, pH 7.5, 200 ㎕ 시약 혼합물과 함께 0.15% 트윈 80).
상기 식에서,
A시료t는 2시간 후 시료값이고,
ABVt는 2시간 후 시약 블랭크 값이고,
A시료0은 t=0일 때 시료값이고,
ABV0은 t=0일 때 시약 블랭크 값이다.
시료 혼합물
시험 완충액(0.1 mol/l Tris, pH 7.5, 0.15% 트윈 80) 5 mL
t-PA 자극제(사람 피브리노겐의 1 mg/mL 시아노겐 브로마이드 단편) 1 mL
기질 용액(3 mmol/l S2251, H-D-Val-Leu-Lys-pNA; SE 모엔달 소재의 크로모제닉스 (Chromogenix) 1 mL
플라스미노겐 용액(7U/mL 플라스미노겐, 베링거 만하임 게엠베하(Boehringer Mannheim GmbH)) 1 mL
자극제 인자의 계산:
자극 인자를 계산하기 위해서, t-PA 자극제의 존재하의 활성을 t-PA 자극제의 부재하의 활성으로 나눈다. 각각의 경우, 희석액은 대략 동일한 흡수도가 모든 제제중에 달성되도록 되어야 한다. 1 mL H2O를 1 mL t-PA 자극제 대신 반응 혼합물에 t-PA 자극제 없이 첨가한다.
활성을 자극제의 존재하에 뿐만 아니라 부재하에 동일한 방식으로 측정한다. 자극 인자 F를 다음 수학식 2와 같이 계산한다:
비활성(specific activity)은 플라스미노겐 활성(KU/mL)을 단백질 농도(mg/mL)로 나눈 값이다.
실시예 6
조직 플라스미노겐 활성화제의 실시예 1의 재조합 단백질의 환괴 주입물은 관상 혈전용해의 도그(dog) 모델에서 효과적인 신뢰할만한 혈전용해를 유도한다
이.콜라이에서 생성된 실시예 1의 단백질에 의해 야기된 혈전용해를 전기적 자극에 의해 유도된 좌측 관상 동맥의 혈전색전증의 도그 모델에서 평가할 수 있다.
실시예 7
아미드 분해 활성의 측정
아미드 분해 활성을 측정하기 위해 200 mL 완충액(0.1 mol/l Tris/HCl, pH 7.5, 0.15 % 트윈 80) 및 플라스미노겐 활성화제 용액(1 내지 12 ㎍/mL의 농도까지 완충액으로 희석시킴) 200 ㎕을 37℃에서 5분 동안 항온처리하였다. S2288 200 ㎕(6 mmol/l, H-D-Ile-Pro-Arg-p-니트로아닐린 디하이드로클로라이드, 스웨덴 소재의 카비 비트룸(Kabi Vitrum))을 첨가하여 측정하기 시작했다. S2288 기질을 37℃에서 예비평형화하였다. 아미드 분해 활성을 9750 l/mol/cm의 p-니트로아닐린의 흡광계수로 처음 2.5분 안에 405 nm에서 흡수도의 증가로부터 계산한다.
실시예 8
트롬빈에 의한 r-PA(F274P, K277V)의 절단성
1. 과정
각각의 경우 44 ㎍ r-PA(F274P, K277V) 및 r-PA(표준)를 37℃에서 15분 동안 미리 항온처리하고 하기 설명하는 37℃에서 15분 동안 역시 미리 항온처리된 사람 트롬빈(시그마)의 단위와 혼합하고, 이를 37℃에서 30분 동안 항온처리하였다. 후속적으로 시료를 SDS 시료 완충액(0.125 mol/l Tris/HCl, pH 8.8, 4.6%(중량/체적) SDS, 4 mol/우레아, 0.1% 브로모페놀 블루, 0.3 mol/l 디티오에리트리톨)과 1:1(체적/체적)의 비율로 혼합하고, 95℃에서 3분 동안 항온처리하고 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동법에 의해 분석하였다.
2. 결과
트롬빈에 의해 r-PA(F274P, K277V)의 절단성이 도 2에 나타나 있다. 데이타는 증가량의 트롬빈이 r-PA(F274P, K277V)를 이중쇄형으로 완전히 전환시킨다는 것을 입증한다. 프로테아제 및 r-PA(F274P, K277V)의 크링글 2 도메인은 플라스민 분해에 의해 제조된 이중쇄형(r-PA(tc))에서 r-PA의 상응하는 도메인의 동일한 양으로 트롬빈 수행에 의해 절단된다.
r-PA(F274P, K277V)(A)와는 다르게, 기술된 조건하에 본원에서 표준물질로서 사용된 r-PA(B)는 트롬빈에 의해 절단되지 않는다.
A
래인 1 분자량 표준물질*
래인 2 r-PA
래인 3 r-PA(tc)**
래인 4 r-PA(F274P, K277V)
래인 5 r-PA(F274P, K277V) + 트롬빈 완충액
래인 6 r-PA(F274P, K277V) + 0.055 NIH 단위 트롬빈
래인 7 r-PA(F274P, K277V) + 0.55 NIH 단위 트롬빈
래인 8 r-PA(F274P, K277V) + 2.74 NIH 단위 트롬빈
래인 9 트롬빈(5NIH 단위)
래인 10 분자량 표준물질*
B
래인 1 분자량 표준물질*
래인 2 r-PA
래인 3 r-PA(tc)**
래인 4 r-PA + 트롬빈 완충액
래인 5 r-PA + 0.055 NIH 단위 트롬빈
래인 6 r-PA + 0.55 NIH 단위 트롬빈
래인 7 r-PA + 2.74 NIH 단위 트롬빈
래인 8 트롬빈(5NIH 단위)
래인 9 분자량 표준물질*
*) 분자량 표준물질: 리소자임(14,307 Da), 소이빈 트립신 억제제(20,100 Da), 트리오즈 포스페이트 이소머라제(26,626,Da), 알돌라제(39,212 Da), 글루타메이트 데하이드로제나제(55,562 Da), 프럭토즈-6-포스페이트-키나아제(85,204 Da), β-갈락토시다아제(116,353 Da), α-2-마크로글로불린(170,000 Da)**) r-PA(tc): 플라스민으로 r-PA의 항온처리헤 의해 수득된 r-PA의 이중쇄형
실시예 9
플라스민에 의한 r-PA(F274P, K277V)의 절단성
1. 과정
각각의 경우 25 ㎍ r-PA(P274P, K277V) 및 r-PA(표준)를 37℃에서 15분 동안 미리 항온처리하고 하기 설명하는 37℃에서 15분 동안 역시 미리 항온처리된 트롬빈(사람)의 단위와 혼합하고, 이를 37℃에서 10분 동안 항온처리하였다. 후속적으로 시료를 SDS 시료 완충액(0.125 mol/l Tris/HCl, pH 8.8, 4.6%(중량/체적) SDS, 4 mol/우레아, 0.1% 브로모페놀 블루, 0.3 mol/l 디티오에리트리톨)과 1:1(체적/체적)의 비율로 혼합하고, 95℃에서 4분 동안 항온처리하고 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동법에 의해 분석하였다.
2. 결과
표준물질로서 본원에 사용된 r-PA(F274P, K277V)(A) 및 r-PA(B)의 플라스민에 의한 절단성이 도 3에 나타나 있다. 데이타는 r-PA(B)가 플라스민의 양을 증가시키면서 항온처리에 의해 이중쇄형으로 전환시킨다는 것을 입증한다. 사용된 조건하에 적용된 양의 r-PA는 25 mU 플라스민에 의해 이중쇄형으로 완전히 전환된다.
이와는 대조적으로, r-PA(F274P, K277V)(A)는 플라스민에 의해 현저하게 열등한 절단성을 나타낸다. 0.025 U 및 0.1 U 플라스민으로 항온처리할 때, 플라스민에 의해 r-PA(F274P, K277V)의 어떠한 절단도 아직 관찰되지 않는다. 25 ㎍ r-PA(F274-P, K277V)을 25 mU 플라스민으로 항온처리할 때조차도 어떠한 완전한 절단도 발생하지 않는다.
트롬빈에 의해 절단된 r-PA(F274P, K277V)의 프로테아제 및 크링글 2 도메인은 플라스민 세파로즈로 분해에 의해 제조된 이중쇄형(r-PA(tc))중 r-PA의 상응하는 도메인과 동일한 양으로 수행하여 변이체의 절단이 r-PA에서와 같이, 아미노산 275와 276(해리스에 따라 번호매김, Prot. Engineering 1, 449-458(1987)) 사이에 발생하는 것으로 추정된다.
A
래인 1 분자량 표준물질*
래인 2 r-PA
래인 3 r-PA(tc)**
래인 4 r-PA(F274P, K277V)
래인 5 r-PA(F274P, K277V) + 0.25 mU 플라스민
래인 6 r-PA(F274P, K277V) + 0.25 mU 플라스민
래인 7 r-PA(F274P, K277V) + 12.5 mU 플라스민
래인 8 r-PA(F274P, K277V) + 25 mU 플라스민
B
래인 1 분자량 표준물질*
래인 2 r-PA
래인 3 r-PA(tc)**
래인 4 r-PA + 0.25 mU 플라스민
래인 5 r-PA + 2.5 mU 플라스민
래인 6 r-PA + 12.5 mU 플라스민
래인 7 r-PA + 25 mU 플라스민
*) 분자량 표준물질: 리소자임(14,307 Da), 소이빈 트립신 억제제(20,100 Da), 트리오즈 포스페이트 이소머라제(26,626,Da), 알돌라제(39,212 Da), 글루타메이트 데하이드로제나제(55,562 Da), 프럭토즈-6-포스페이트-키나아제(85,204 Da), β-갈락토시다아제(116,353 Da), α-2-마크로글로불린(170,000 Da)**) r-PA(tc): 플라스민 세파로즈로 r-PA의 항온처리헤 의해 수득된 r-PA의 이중쇄형
실시예 10
트롬빈에 의한 r-PA(P272V, F274P, K277V)의 절단성
1. 과정
40 ㎍ r-PA(P272V, F274P, K277V)를 37℃에서 15분 동안 미리 항온처리하고 하기 설명하는 37℃에서 15분 동안 역시 미리 항온처리된 소 트롬빈(시그마)의 단위와 혼합하고, 이를 37℃에서 30분 동안 항온처리하였다. 후속적으로 시료를 SDS 시료 완충액(0.125 mol/l Tris/HCl, pH 8.8, 4.6%(중량/체적) SDS, 4 mol/우레아, 0.1% 브로모페놀 블루, 0.3 mol/l 디티오에리트리톨)과 1:1(체적/체적)의 비율로 혼합하고, 95℃에서 3분 동안 항온처리하고 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동법에 의해 분석하였다.
2. 결과
트롬빈에 의해 r-PA(P272V, F274P, K277V)의 절단성이 도 4에 나타나 있다. 데이타는 증가량의 트롬빈이 r-PA(P272V, F274P, K277V)를 이중쇄형으로 완전히 전환시킴을 입증한다. 트롬빈에 의해 절단된 프로테아제 및 r-PA(P272V, F274P, K277V)의 크링글 2 도메인은 플라스민으로 분해에 의해 제조된 이중쇄형(r-PA(tc))중 r-PA의 상응하는 도메인과 동일한 양으로 수행된다.
래인 1 분자량 표준물질*
래인 2 r-PA
래인 3 r-PA(tc)**
래인 4 r-PA(P272V, F274P, K277V)
래인 5 r-PA(P272V, F274P, K277V) + 트롬빈 완충제
래인 6 r-PA(P272V, F274P, K277V) + 0.055 NIH 단위 트롬빈
래인 7 r-PA(P272V, F274P, K277V) + 0.55 NIH 단위 트롬빈
래인 8 r-PA(P272V, F274P, K277V) + 2.74 NIH 단위 트롬빈
래인 9 분자량 표준물질
*) 분자량 표준물질: 리소자임(14,307 Da), 소이빈 트립신 억제제(20,100 Da), 트리오즈 포스페이트 이소머라제(26,626,Da), 알돌라제(39,212 Da), 글루타메이트 데하이드로제나제(55,562 Da), 프럭토즈-6-포스페이트-키나아제(85,204 Da), β-갈락토시다아제(116,353 Da), α-2-마크로글로불린(170,000 Da)**) r-PA: 플라스민으로 r-PA의 항온처리에 의해 수득된 r-PA의 이중쇄 형태
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29. Schechter, J. und Berger, A., Biochem. Biochem. Biophys. Res. Commun. 27(1967) 157-162
30. Schohet, R.V., Thrombosis and Haemostasis 71(1994) 124-128
31. 미국 특허 제 5,200,340 호
32. 미국 특허 제 5,223,256 호
33. 미국 특허 제 5,501,853 호
34. 웬-핀 양(Wen-Pin Yang) 등, Biochemistry 33(1994) 2306-2312
35. 국제 특허 공개공보 제 WO 90/09437 호
36. 국제 특허 공개공보 제 WO 91/09118 호
37. 국제 특허 공개공보 제 WO 94/10318 호
38. 국제 특허 공개공보 제 WO 96/01312 호
39. 국제 특허 공개공보 제 WO 96/17928 호
40. 졸러(Zoller) 및 스미쓰(Smith), DNA 3(1984)479-488

Claims (11)

  1. 사람 조직형 플라스미노겐 활성화제를 기본으로,
    a) 트롬빈에 의해 절단될 수 있고 이러한 절단에 의해 이중쇄형으로 전환되도록 변형되고,
    b) 효소형성성(zymogenicity)이 사람 플라스미노겐 활성화제와 비교해 볼 때 1.2배 이상 더 높도록 변형되고,
    c) 피브린 결합성이, 플라스미노겐 활성화제가 혈병 안으로 50% 이상 침투할 수 있을 정도로 감소된
    플라스미노겐 활성화제.
  2. 제 1 항에 있어서,
    아미노산 P1(275)와 P1'(276) 사이에서 플라스민에 의해 절단되는 능력이 10% 이상, 바람직하게는 20% 이상 감소되도록 변형된 플라스미노겐 활성화제.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    혈병에 균일하게 침투되는 플라스미노겐 활성화제.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항중 어느 한 항에 있어서,
    G264와 A288 사이의 아미노산 영역이, 플라스미노겐 활성화제가 트롬빈에 의해 절단될 수 있도록 변형된 플라스미노겐 활성화제.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항중 어느 한 항에 있어서,
    아미노산 영역 459-471, 417-425 및/또는 아미노산 Q475, K505 및/또는 E506이 변형된 플라스미노겐 활성화제.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항중 어느 한 항에 있어서,
    아미노산 G265 및/또는 R267이 변형되고/변형되거나 하나 이상의 아미노산이 영역 264와 267 사이에 삽입된 플라스미노겐 활성화제.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항중 어느 한 항에 있어서,
    핑거 도메인(finger domain)이 결실된 플라스미노겐 활성화제.
  8. 제 7 항에 있어서,
    프로테아제 도메인 또는 크링글 2 도메인 및 사람 조직형 플라스미노겐 활성화제만을 함유하는 플라스미노겐 활성화제.
  9. 혈전색전성 질병(thromboembolic disease)을 치료하기 위한, 약제학적 조성물을 제조하기 위한 제 1 항 내지 제 8 항중 어느 한 항에 따르는 플라스미노겐 활성화제의 용도.
  10. 원핵 숙주 세포 또는 진핵 숙주 세포를 제 1 항 내지 제 8 항중 어느 한 항에 따르는 조직 플라스미노겐 활성화제를 발현할 수 있는 벡터로 형질전환시키고, 상기 세포를 배양하여 상기 플라스미노겐 활성화제를 단리함을 포함하는, 상기 플라스미노겐 활성화제의 재조합체를 제조하는 방법.
  11. 치료학적 효과량의 제 1 항 내지 제 8 항중 어느 한 항에 따르는 플라스미노겐 활성화제, 및 선택적으로 약제학적 보조 물질, 충진제 또는 첨가제를 포함하는 약제학적 조성물.
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