JP3329340B2 - トロンビン活性化プラスミノーゲン誘導体 - Google Patents
トロンビン活性化プラスミノーゲン誘導体Info
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Description
118に開示された発明を改良したものであり、トロンビ
ンによって活性化されて繊維素溶解活性を示すかもしく
は血餅形成を阻害するプラスミノーゲン類似体に関す
る。また、そのような化合物の全部もしくは一部をコー
ドする核酸(DNA及びRNA)にも関する。この発明はま
た、それらの製法、それらを含有する医薬組成物、及び
血栓性疾患の治療におけるそれらの用途にも関する。
対物である繊維素溶解系の主要成分である。血液凝固の
過程において、酵素活性のカスケードは、血餅又は血栓
のフレームワークを形成するフィブリンネットワークの
生成に関連している。フィブリンネットワークの崩壊
(繊維素溶解)は、酵素プラスミンの作用によって行わ
れる。プラスミノーゲンは、プラスミンの不活性前駆体
であり、プラスミノーゲンのアルギニン561とバリン562
との間のペプチド結合の切断によって、プラスミノーゲ
ンからプラスミンへと変換する。生理学的条件下では、
この切断は、組織型プラスミノーゲン活性化因子(tP
A)もしくはウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因
子(uPA)によって触媒される。
るようになると、冠状動脈血栓症や心筋梗塞、深静脈血
栓症、卒中、末梢動脈閉塞、及び塞栓症のような病態に
導く不適切な部位に、脈管内血餅が形成されるであろ
う。このような場合には、繊維素溶解剤の投与が、血餅
溶解を促進するための効果的な治療法であることが示さ
れている。抗血栓剤もまた、血餅形成の予防に有用であ
る。
剤に伴う問題点は、それらが全身循環中におけるプラス
ミノーゲンを活性化するので、臨床的に有用な投与量で
は、血栓に特異的ではないということである。繊維素溶
解を増強するための他の方法は、我々の共継続中の特許
出願WO−A−9109118に開示されており、繊維素溶解活
性を示すかもしくは血餅形成を阻害するために活性化す
ることができる分子の使用に基づいている。活性化は、
血液凝固に関連する一以上の内因性酵素によって触媒さ
れる。この方法の利点は、繊維素溶解の血栓選択性又は
血餅形成活性の阻害が、活性化酵素の血栓特異的局在に
よって達成されることである。特に、WO−A−9109118
は、とりわけトロンビンによる切断によってプラスミン
に活性化することができるプラスミノーゲン類似体を開
示している。
(Aアルファ及びBベータ鎖)、因子XIII、因子V、因
子VII、因子VIII、プロテインC及び抗トロンビンIIIを
含むいくらかの蛋白における蛋白分解を触媒するセリン
プロテアーゼである。トロンビンによって認識されるの
に必要な構造は、部分的には、切断部位周辺の局所的ア
ミノ酸配列によって決定されるようであるが、変動可能
な程度で、切断部位から遠く離れた配列によっても決定
される。例えば、フィブリノーゲンAアルファ鎖におい
ては、残基P2(Val)、P9(Phe)及びP10(Asp)が、Ar
g(16)−Gly(17)ペプチド結合におけるα−トロンビ
ンによって触媒される切断に重要である(Ni,F.et al 1
989,Biochemistry 28 3082−3094)。WO−A−9109118
は、アルファ−トロンビンによる最適切断部位が、次の
構造:(i)P4−P3−Pro−Arg−P1'−P2'{P3とP4は各
々独立して(バリンのような)疎水性アミノ酸残基であ
り、P1'とP2'は各々独立して非酸性アミノ酸残基であ
る}、又は(ii)P2−Arg−P1'{P2又はP1'はグリシン
残基である} を持つことを開示している。従って、WO−A−9109118
において好ましいと開示されているトロンビン活性化プ
ラスミノーゲン類似化合物、及びその中で特に例示され
ているものはすべて、前述の構造(i)もしくは(ii)
と一致する切断部位を有している。
例示されたトロンビンによって切断可能なプラスミノー
ゲン類似体のうち、T19と名づけられたものが、使用し
た分析系において最も有効であることを示唆している。
それは、野生型プラスミノーゲンのPro(559)及びGly
(560)がVal−Glu−Leu−Gln−Gly−Val−Val−Proで
置き換えられている因子XIIIに基づく切断部位を有して
いる。従って、特別に例示された化合物の中で最も有効
であるT19のトロンビン切断部位は、WO−A−9109118に
よれば好ましいとされている上記の構造(i)の要件と
一致している。
て切断されない{Naito,K.and Fujikawa,K.(1991),J.
Biol.Chem.266 7353−7358}か、もしくはkcat/Km=1.6
×105M−1min−1で非常にゆっくり切断される(Gailan
i,D.and Broze,G.J.1991,Science 253,909−912)こと
が報告されている。このトロンビン基質の切断部位配列
は、WO−A−9109118おける好ましい一般式(i)及び
(ii)とは異なっている。因子XIにおいて、塩基性アミ
ノ酸Lysは、P3部位にある。しかしながら、因子XIのこ
の部位でのトロンビン切断活性は、因子XIIIの活性(k
cat/Km=1.4×105M−1sec−1;Naski et al.,1991,Bioch
emistry 30 934−941)に比べると非常に低いけれど
も、この発明において、P3部位に塩基性アミノ酸残基を
有するトロンビン切断配列を持つプラスミノーゲン類似
体が、T19に比べて驚くほど増大した活性を有すること
が発見された。そのような新規な類似体は、トロンビン
によってより迅速に切断され、連鎖色素分析において増
大した活性を示す。より重要なことには、そのような類
似体は、生体内条件に非常に類似している血餅溶解分析
(plasma clot lysis assay)において活性を有してい
る。
さらなる例は、P3がアルギニンである一本鎖ウロキナー
ゼに見られる。この部位での切断は、不活性二本鎖ウロ
キナーゼを産生する {Ichinose et al.,(1986)J.Biol.Chem.261 3486−
9}。補助因子がない場合には、一本鎖ウロキナーゼの
トロンビンによる切断もまた、kcat/Km=3.8×104M−1s
ec−1でかなりゆっくりである(de Munk et al.,1990
Fibrinolysis 4 161)。しかしながら、今では、ウロキ
ナーゼ切断部位を担持するプラスミノーゲン類似体は、
T19に比べて増大した活性を有することが示されてい
る。
示されているような)トロンビンにより活性化されてプ
ラスミン活性を有するプラスミノーゲン類似体を提供す
るという点で、WO−A−9109118に開示されている発明
の改良であるが、そのプラスミノーゲン類似体が、トロ
ンビン切断部位配列P4−P3−Pro−Arg−P1'−P2'(P3は
塩基性アミノ酸残基であり、P4は疎水性アミノ酸残基で
あり、P1'及びP2'はそれぞれ独立して非酸性アミノ酸残
基である)を含み、その部位がArgとP1'の間でトロンビ
ンによって切断可能であるという点に特に特徴がある。
酸蛋白であり、その切断部位がArg(560)−Val(561)
ペプチド結合であることを示したSottrup−Jensenらの
蛋白配列研究{Atlas of Protein Sequence and Struct
ure(Dayhoff,M.O.,ed.)5 suppl.3.p.95(1978)}に
従って番号付けされた。しかしながら、この発明の具体
例に有用で、かつForsgrenら{FEBS Letters 213 254−
260(1987)}により単離された、適切なプラスミノー
ゲンcDNAは、部位65に余分のIleを持つ791残基の蛋白を
コードしている。この明細書では、プラスミノーゲンの
アミノ酸番号は、使用したcDNAの番号に対応している。
プラスミノーゲンの構造には多形性があるかもしれず、
切断部位の番号が異なるプラスミノーゲンの形態がある
かもしれない。しかし、この発明は、そのような変形を
具体例の中に含むことを意図するものである。
ミノーゲン類似体」は、野生型プラスミノーゲンとは異
なる分子で、かつプラスミン活性を有する分子を形成す
るために切断されるかもしくは作用を受ける能力を持つ
分子を意味している。
は、野生型プラスミノーゲンのフィブリン結合作用を適
度に残すが、阻害特性における変化があるかもしれな
い。好ましいプラスミノーゲン類似体は、野生型プラス
ミノーゲンに匹敵する血漿半減期を持つが、この特性
は、本質的なものではない。
ビン切断部位配列(thrombin−cleavable site sequenc
e)においては、塩基性アミノ酸残基P3は、リジン又は
アルギニン残基であることができる;疎水性アミノ酸残
基P4は、バリン、イソロイシン又はロイシン残基である
ことができる;非酸性アミノ酸残基P1'及びP2'のそれぞ
れは、独立してバリン又はイソロイシン残基であること
ができる。
は、切断部位Thr−Thr−Lys−Ile−Lys−Pro−Arg−P1'
−P2'又は切断部位Leu−Arg−Pro−Arg(P1'及びP2'は
それぞれ独立して非酸性アミノ酸である)を含有する。
前述した様に、P1'及びP2'は、イソロイシン又はバリン
残基であることができる。
ノーゲン類似体である: a)Pro(559)、Gly(560)がThr、Thr、Lys、Ile、Ly
s、Proで置換され、かつVal(562)がIleで置換されて
いるプラスミノーゲン類似体。この類似体では、アミノ
酸563は、野生型と同様にバリンである。この突然変異
体は、BB10151と名付けられている。
Gln、Lys、Thr、Leu、Arg、Proで置換され、かつCys(5
66)がAlaで置換されているプラスミノーゲン類似体。
この類似体では、アミノ酸562及び563は、野生型と同様
にバリンである。この突然変異体は、BB10156と名付け
られている。
u、Arg、Proで置換され、かつCys(566)がAlaで置換さ
れているプラスミノーゲン類似体。この類似体では、ア
ミノ酸562及び563は、野生型と同様にバリンである。こ
の突然変異体は、BB10170と名付けられている。
y、Leu、Arg、Proで置換されているプラスミノーゲン類
似体。この類似体では、アミノ酸562及び563は、野生型
と同様にバリンである。この突然変異体は、BB10171と
名付けられている。
Thr、Lys、Ile、Lys、Proで置換され、Val(562)がIle
で置換され、かつCys(566)がAlaで置換されているプ
ラスミノーゲン類似体。この突然変異体は、BB10158と
名付けられている。
断部位配列の性質を特に参照することによって定義され
た。それは、その類似体が、その部位で驚くほど迅速に
切断され、そのことが、その化合物の改良された血栓溶
解活性の基礎となるからである。しかしながら、この発
明によるプラスミノーゲン類似体(即ち、今定義された
新しい切断部位配列を含んでいる)は、迅速に切断され
るという利点は失うことなく、切断部位からより遠方も
しくはあまり遠方ではない部位で、一以上の付加、欠失
又は置換といった(野生型プラスミノーゲンと比較され
るような)他の修飾を含んでいてもよい。そのような修
飾の例には、フィブリン結合活性を変えるか、もしくは
α2−アンチプラスミン結合を抑制するための一以上の
クリングルドメインの付加、除去、置換又は改変が挙げ
られるであろう。特別な例としては、この部位へのα2
−アンチプラスミンの結合を防ぐためのクリングル1に
位置するリジン結合部位の突然変異が挙げられるであろ
う。このような変異型は、α2−アンチプラスミンによ
る阻害に対して耐性であろう。好ましい具体例として
は、BB10189、BB10190及びBB10192があり、それらは各
々、Asp 137>Ser及びAsp 139>Serの追加の突然変異を
有するプラスミノーゲン類似体BB10153、BB10170及びBB
10171である。
れるジスルフィド結合によって切断部位に加えられる制
約を除去するために、一つもしくは両方のシステインを
アラニン残基で置換することによって、Cys(558)とCy
s(566)との間のジスルフィド結合形性を防止するため
の突然変異が挙げられるであろう。上記の好ましい具体
例の中で、変異型BB10156、BB10158及びBB10170は、こ
のような開ループ(open−loop)修飾を有している。
77又は78個のアミノ酸が除去されているプラスミノーゲ
ン類似体のLys−プラスミノーゲン変異型が挙げられる
であろう。このような変異型は、野生型Glu−プラスミ
ノーゲンと比較した場合にLys−プラスミノーゲンにお
いて観察されたように、フィブリン結合活性を増大して
いるであろう(Bok,R.A.and Mangel,W.F.1985,Biochemi
stry 24 3279−3286)。欠失に関連するさらなる例に
は、クリングル1もしくはクリングル1〜4ドメインが
α2−アンチプラスミン結合を抑制するために除去され
ているプラスミノーゲン類似体の変異型が挙げられるで
あろう。このような変異型は、α2−アンチプラスミン
による阻害に対して耐性であろう。クリングル1〜4の
欠失はまた、分子のフィブリン結合及び薬物動態学的特
性を変化させるであろう。
ン類似体については、プラスミン阻害剤結合を防止する
セリンプロテアーゼドメイン中に突然変異を導入するこ
とが好ましいであろう{配列番号2(SEQ ID 2)は、野
生型プラスミンのセリンプロテアーゼドメインを示し、
この明細書では、そのドメインに対する番号付けは、配
列番号2の番号を用いている)。この突然変異は、組織
プラスミノーゲン活性化因子に対する阻害剤結合を防止
することが示された位置に類似する位置に存在していて
もよく(Madison,E.L.et al 1989 Nature 339 721−72
4)、又はプラスミノーゲンに対する阻害剤結合を防止
する別の位置に存在していてもよい。そのような修飾
は、セリンプロテアーゼ阻害剤に対して耐性を示すキモ
トリプシンスーパーファミリーのエンドペプチダーゼを
開示している、共継続中の特許出願PCT/GB 9301632に記
載されている。そのような耐性は、下記の一つを誘発す
るエンドペプチダーゼもしくはその前駆体の修飾によっ
て提供される: a)プロテアーゼの局部の折りたたみにおける立体配座
の変化; b)複合体形成に関するプロテアーゼと阻害剤の相対配
向における変化; c)阻害剤の領域におけるプロテアーゼの立体的なバル
クにおける変化; d)阻害剤結合部位の領域における静電的ポテンシャル
場における変化;又は e)上記の何れかの組み合わせ。
載されているA4突然変異(Glu 606からLysへ)を有する
BB10158である(BB10199)。この突然変異は、アンチプ
ラスミンへの結合を防止する、プラスミノーゲンの表面
上のイオン相互作用を遮るために設計されている。突然
変異誘発は、Glu 606をLysに変換するために設計され
た、24塩基オリゴヌクレオチド5'CTT GGG GAC TTC
TTC AAG CAG TGG3'を用いて行われた。他の好ましい
具体例は、単独もしくは組み合わせて、Glu 606、Glu 6
23、Phe 583、Met 585又はLys 607に突然変異を有して
いる。Glu 606及びGlu 623突然変異は、PCT/GB 9301632
に例示された。この具体例における1つの例は、BB1015
3であり、それは、Glu 606からLysへ及びGlu 623からLy
sへの追加の突然変異を有するプラスミノーゲン類似体B
B10151である。
は、グリコシル化パターンを防止、抑制又は変化させる
ための一以上の修飾を含んでいてもよい。そのような修
飾が導入されているプラスミノーゲン類似体は、より長
い半減期、減少した血漿クリアランス及び/又はより高
い比活性を有するであろう。
い特徴は、適切な場合には、必要な変更を加えて、この
発明の他の化合物にも適用される。
体は、何れかの便利な方法で合成することができる。こ
の発明の第二の観点によれば、連続するアミノ酸残基を
共にカップリングすること、及び/又はオリゴペプチド
を結合することからなる、そのようなプラスミノーゲン
類似体の製法方法が提供される。原則として、蛋白は、
化学的手段によって完全に又は部分的に合成することが
できるけれども、対応する核酸配列の、好ましくはin v
ivoでのリボソーム翻訳によって製造するのが好まし
い。蛋白は、適切にグリコシル化されてもよい。
のが好ましい。天然に生じるプラスミノーゲンをエンコ
ードするDNAは、cDNAもしくはゲノムクローンから得る
ことができるか、又は合成することができる。アミノ酸
置換、付加又は欠失は、部位特異的突然変異誘発によっ
て導入されるのが好ましい。プラスミノーゲン類似体を
エンコードするDNA配列は、遺伝子工学の分野における
当業者が熟知している手順によって得ることができる。
常、発現ベクター中に適切なコーディング配列を挿入
し、そのベクターを宿主細胞中に移す工程を含むであろ
う。従って、この発明の第三の観点によれば、上記の蛋
白性化合物をコードする合成もしくは組み換え核酸が提
供される。核酸は、RNAでもDNAでもよく、プラスミド、
コスミド又はファージのようなベクターの形態であって
もよい。ベクターは、原核(例えば、細菌)細胞及び/
又は真核(例えば、酵母もしくは哺乳動物)細胞を形質
移入もしくは形質転換するのに適応することができる。
ベクターは、クローニング部位及び通常少なくとも一つ
のマーカー遺伝子を含むであろう。発現ベクターは、ク
ローニング部位に挿入される配列に操作的に連結された
プロモーター、及び好ましくは蛋白産物を分泌させるこ
とができる配列を有するであろう。
118に記載されたタイプのベクターを用いて発現させる
ことができる。そのベクターは、ヒトサイトメガロウイ
ルス由来の強力なプロモーター及びエンハンサー配列を
含む第二核酸配列に操作的に連結された、蛋白をコード
するか又はクローニング部位を表現する第一核酸配列、
SV40由来のポリアデニル化配列をエンコードする第三核
酸配列、及びSV40プロモーターから発現される選択可能
なマーカーをコードし、その選択可能なマーカー配列の
3'末端に追加のSV40ポリアデニル化シグナルを持つ第四
核酸配列からなっている。用語「ベクター」は、この明
細書中においては、機能的な意味で用いられると理解さ
れるべきであり、必ずしも単一の核酸分子に限定される
と解釈されるべきではない。それで、例えば、上記で定
義されたベクターの第一、第二及び第三配列が第一核酸
分子中で表現され、第四配列が第二核酸分子中で表現さ
れてもよい。
追加の生物学的もしくは化学的手順も必要とすることな
く、生物学的に活性な形態で発現させかつ細胞培養培地
中に分泌させることができる。
ドを共にカップリングすること、及び/又はオリゴ−及
び/又はポリ−ヌクレオチドを結合することからなる、
上記のプラスミノーゲン類似体をエンコードする核酸を
製造する方法が提供される。
び/又はベクターによって形質転換された細胞もしくは
細胞系が提供される。形質転換される適切な細胞もしく
は細胞系には、原核細胞(例えば、大腸菌)及び酵母細
胞{サッカロミセス・セレビシエ(Sacchromyces cerev
isiae)及びピチア・パストリス(Pichia pastoris)を
含む}及び哺乳動物細胞のような真核細胞の両方が含ま
れる。連続培養で生育し、かつ標準技術によって形質移
入もしくは形質転換されることができる哺乳動物細胞が
好ましい。適切な細胞の例には、チャイニーズハムスタ
ー卵巣(CHO)細胞、NSO及びP3X63−Ag8.653のようなマ
ウス骨髄腫細胞系、COS細胞、ヒーラ細胞、BHK細胞、ボ
ウス(Bowes)細胞系のようなメラノーマ細胞系、マウ
スL細胞、HepG2のようなヒト肝癌細胞系、マウス繊維
芽細胞及びマウスNIH3T3細胞が含まれる。CHO細胞は、
プラスミノーゲン及びプラスミノーゲン類似体を発現す
るための宿主として特に好ましい。
ことができ、エレクトロポレーションが特に適切であ
る。
ゲン類似体の有効量を患者に投与することからなる、凝
固と繊維素溶解間の不均衡によって引き起こされる病態
の予防及び/又は治療に用いることができる。従って、
この発明のさらなる観点によれば、医薬、特に局部的な
繊維素溶解及び/又は抗凝固活性を生じることが望まれ
る、凝固と繊維素溶解間の不均衡によって引き起こされ
る病態の予防及び/又は治療に用いるための、この明細
書中に開示されたプラスミノーゲン類似体が提供され
る。そのような病態には、心筋及び脳梗塞、動脈及び静
脈血栓症、血栓塞栓症、外科的手術後癒着、血栓性静脈
炎及び糖尿病性血管障害、及び癌に関連した凝固不均衡
が含まれる。
解抗血栓剤の製造における、この明細書に開示されたプ
ラスミノーゲン類似体の用途を提供する。
ーゲン類似体と、医薬的に及び/又は獣医学的に許容さ
れる担体とからなる医薬もしくは獣医薬用組成物も提供
される。そのような組成物は、経口、静脈内もしくは筋
肉内注射によるか、又は注入による投与に適応させるこ
とができる。適切な注射可能な組成物には、等張の生理
的塩類溶液及び/又は緩衝液中の滅菌したプラスミノー
ゲン類似体が含まれ、それはまた、注射の痛みを緩和す
るために局所麻酔剤を含んでいてもよい。類似の組成
を、注入用に用いることができる。化合物が局所治療剤
として投与される場合には、適切な基材中のクリーム、
軟膏又はローション剤として処方することができる。
密封して閉じられた容器中のドライパウダー又は無水濃
縮物として、単一投与量形態で供給することができる。
くは凝固阻害の量、必要とされる作用速度、血栓塞栓部
位の重大さ、及び血餅の大きさに依存するであろう。正
確な投与量は、本発明の化合物によって治療を意図する
病態の性質のために、医者によって決定されるであろ
う。しかしながら、ガイドラインとして、成熟血栓の治
療が行われる患者は、一般に、例えば5回までの投薬に
おける注射か、又は注入のいずれかで、0.01〜10mg/kg
体重のプラスミノーゲン類似体の一日当たの投与量を受
けるであろう。
ために提供されるもので、それによって限定されるもの
ではない。実施例に言及された図面において、 図1は、トロンビンによるBB10151の切断速度を示し
ている。
較する色素分析の結果を示している。
gPの構築は、WO−A−9109118に記載されている。
写は、HCMVプロモーター/エンハンサーで開始すること
ができ、選択可能なマーカーgptが用いられる。
操作、発現及び蛋白精製の技術は、遺伝子工学の分野に
おける当業者に公知である。その技術のほとんどの記載
は、以下の実験便覧の1つに見ることができる:Cold Sp
ring Harbor Laboratory,Box 100,New York,によって出
版されたT.Maniatis,E.F.Fritsch及びJ.Sambrookによる
“Molecular Cloning"又はElsevier Science publishin
g Co.Inc.,New Yorkによって出版されたL.G.Davis,M.D.
Dibner及びJ.F.Batteyによる“Basic Methods in Molec
ular Biology"。
れる。
プを生じるために、アミノ酸残基Pro(559)、Gly(56
0)がThr、Thr、Lys、Ile、Lys、Proで置き換えられ、V
al(562)がIleで置き換えられているプラスミノーゲン
類似体である(配列番号1)。この部位は、因子XIにお
ける潜在的トロンビン切断部位に基づいている。この実
施例で用いた手順は、本質的に、突然変異誘発反応がバ
クテリオファージM13mp18中にクローン化されたプラス
ミノーゲンの1.87kb Kpn I〜Hinc IIフラグメントに関
して行われたWO−A−9109118の実施例2及び3に記載
のとおりである。一本鎖の鋳型を調製し、突然変異を、
オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発によって作成し
た。この場合、48塩基長のオリゴヌクレオチド(5'CACC
CCCCTACGATTCTAGGTTTAATTTTAGTTGTACATTTCTTCGGC3')
(配列番号4)を突然変異誘発を指示するために用い
た。
ロポレーションによってCHO細胞中に導入した。選択培
地{250μl/mlキサンチン、5μg/mlミコフェノール
酸、1×ヒポキサンチン−チミジン(HT)を含む}を形
質移入24時間後の細胞に加え、培地を2〜3日毎に交換
した。gpt−耐性コロニーを生じるプレートを、エライ
ザ(ELISA)分析を用いてプラスミノーゲン産生に関し
てスクリーニングした。高レベルの抗原を産生する細胞
を再クローン化し、最高の産生物を、産生を注意深くモ
ニターするためのフラスコ中に拡大化した。これら全て
の細胞系の凍結ストックを貯蔵した。産生細胞を、条件
培地を提供するためにローラーボトル中に拡大化し、そ
れからプラスミノーゲン蛋白をリジンセファロース4B
(用語セファロースは商品名である)を用いて精製し
た。この突然変異蛋白を産生するために用いた細胞系
は、123.C6であった。
るために二つの追加突然変異(Glu 606をLysに、Glu 62
3をLysに)を含むBB10151の誘導体である。BB10151(pU
Cにクローン化されたもの、実施例1参照)の663 bp Ec
oR V〜Sph Iフラグメントを除去し、アンチプラスミン
耐性を持つ突然変異体A3A4からの同等の663 bpフラグメ
ントで置き換えた。この構築は、PCT/GB9301632の実施
例5に記載されている。24塩基オリゴヌクレオチド5'CT
T GGG GAC TTC TTC AAG CAG TGG3'(配列番号3)が、G
lu−606をLysに変換するのに用いられ、27塩基オリゴヌ
クレオチド 5'GTTCGAGATTCACTTTTTGGTGTGCAC3'(配列番号5)が、G
lu 623をLysに変換するのに用いられた。次いで、WO−
A−9109118の実施例2に記載されたgpt選択マーカーを
挿入する前に、完全長のプラスミノーゲンを、発現ベク
ターpGW1H中にクローン化した。
るDNAを、BB10156、BB10158、BB10170を産生するための
鋳型として用いた。BB10150は、アミノ酸残基Pro(55
9)、Gly(560)がVal、Val、Proに置き換えられ、かつ
ジスルフィド結合形成を防止するためにCys(558)から
Alaへの、及びCys(566)からAlaへの追加突然変異を有
するプラスミノーゲン類似体である。BB10150の開切断
ループ配列(opened cleavage loop seqence)は、配列
番号6に示されている。BB10150は、二つのオリゴヌク
レオチドプライマー{5'CTAGGTACAACCGCTTTCTTCGGCT3'
(配列番号7)及び5'GGTGGGCCACCGCCCCCCCCAC3'(配列
番号8)}と、M13中にクローン化された突然変異体T13
(特許出願WO−A−9109118、実施例13及び配列番号9
参照)の1.87kb Kpn I〜Hinc IIフラグメントを用いて
突然変異誘発によって作成された。
0はすべて、残基558及び556に、同じCysからAlaへの突
然変異を有するように、鋳型として前記のM13中におけ
る変異体BB10150を用いて、部位特異的突然変異誘発に
よって構築された。BB10156は、アミノ酸残基Pro(55
9)とGly(560)がGly、Gln、Lys、Thr、Leu、Arg、Pro
で置き換えられているプラスミノーゲン類似体である
(配列番号10)。BB10158は、アミノ酸残基Pro(559)
とGly(560)がThr、Thr、Lys、Ile、Lys、Proで置き換
えられ、かつVal(562)がIleで置き換えられているプ
ラスミノーゲン類似体である(配列番号11)。BB10170
は、アミノ酸残基Pro(559)とGly(560)がLeu、Arg、
Proで置き換えられているプラスミノーゲン類似体であ
る(配列番号12)。それぞれの突然変異を誘発するため
に用いられたオリゴヌクレオチドを、以下に示す: 各々の場合について、DNA配列決定に従い、突然変異
が、制限酵素Hind III及びSpl Iを用いて、pGW1Hg・プ
ラスミノーゲン発現ベクター中に直接クローン化され
た。これこれらの部位は、突然変異誘発を介して、それ
ぞれプラスミノーゲンの5'末端及び1850に予め導入され
ていた。プラスミノーゲンアミノ酸コーディング配列
は、この手順によって影響されなかった。
al、Glu、Leu、Gln、Gly、Ile、Lys、Proに置き換えら
れ、かつVal(562)がIleに置き換えられているプラス
ミノーゲン類似体である(配列番号16)。BB10169は、4
2塩基オリゴヌクレオチド5'GATTCTAGGTTTAATGCCCTGCAGT
TCCACACATTTCTTCGG3'(配列番号17)を用いる、M13中に
おけるBB10151のオリゴヌクレオチド特異的突然変異誘
発と、それに続くHind III及びSpl Iを用いる、pGW1Hg
プラスミノーゲン中へのクローン化によって作成され
た。BB10171は、アミノ酸残基Pro(559)とGly(560)
がVal、Glu、Leu、Gln、Gly、Leu、Arg、Proに置き換え
られているプラスミノーゲン類似体である(配列番号1
8)。BB10169からの1本鎖M13を、BB10171構築用の鋳型
として用いた。突然変異誘発を、39塩基オリゴヌクレオ
チド5'CACCCCCCTACCACTCTGGGTCTCAGGCCCTGCAGTTCC3'
(配列番号19)を用いて行い、DNA配列決定に従って、H
ind III及びSpl Iを用いて、発現ベクター中にクローン
化した。
現 プラスミノーゲン類似体BB10189、BB10190及びBB1019
1は、リジン結合部位を不能にするために、Asp(137)
からSerへ、Asp(139)からSerへのクリングル1二重突
然変異(kringle 1 double mutation)を有している。
突然変異を、BB10153、BB10170及びBB10171を基本に
(実施例2、3及び4参照)、28塩基長のオリゴヌクレ
オチド5'CCCTGCGGAGAGTTGGATGGATTCCTGC3'(配列番号2
0)を用いて行った。次いで、突然変異を、制限酵素Hin
d III及びSpl Iを用いて、pGW1Hg・プラスミノーゲン中
に直接クローン化した。
プラスミンの結合を防止するためのPhe(583)からArg
への追加突然変異を有している。BB10181は、鋳型とし
て完全長のBB10150を含むM13を、プライマーとしてオリ
ゴヌクレオチド5'GAAGTGCATTCCTCTCCTCGTACGAAG3'(配
列番号21)を用いて、中間のBB10150に基づく構築物を
介して構築された。次いで、突然変異したBB10150遺伝
子を、制限酵素Hind III及びSma Iを用いて、pGW1Hg中
にクローン化した。次いで、この中間構築物から、この
プラスミドからのHind III〜Spl IフラグメントをBB101
70からの対応する部分で置き換えることによって、BB10
181発現ベクターを作成した(実施例3参照)。
プラスミンの結合を防止するためのMet(585)からArg
への追加突然変異を有している。BB10186は、BB10181の
ための上記実施例6に記載された方法に類似の方法で作
成された。中間のBB10150構築物は、25塩基長のオリゴ
ヌクレオチド5'CCACAGAAGTGTCTTCCAAACCTCG3'(配列番
号22)を用いて作成され、pGW1Hg中にクローン化され
た。次いで、BB10186を、BB10171からのHind III〜Spl
Iフラグメントを用いて、フラグメントスイッチ(fragm
ent awitch)によって作成した(実施例4参照)。
プラスミンの結合を防止するためのGlu(606)からLys
への追加突然変異を有している。BB10199は、本質的
に、PCT/GB9301632の実施例2及び3に記載されたよう
に作成された。BB10158のKpn I〜EcoR Vフラグメント
(上記実施例3参照)が、pUC中にクローン化されたBB1
0151のGlu(606)からLysへの構築物の対応するフラグ
メントを置き換えるために用いられ、次いで、PCT/GB93
01632に記載されているような最終発現ベクター中にク
ローン化された。
に記載されたように、2.8μgのトロンビンとともにイ
ンキュベートした。プラスミノーゲン突然変異体の切断
に関するタイムコースを、定量的ゲルスキャニング(qu
antitative gel scanning)により測定した。T19及びBB
10151の50%切断時間は、それぞれ9分と3分であっ
た。BB10151の切断に関するゲルスキャンデータを、図
1に示す。
性化に関して分析した(方法2.1参照)。この分析の結
果を、図2に示す。図2においては、時間とともに405n
mの吸光度が上昇しており、それは、トロンビンととも
にBB10151をインキュベートすることにより、プラスミ
ン活性が生じることを例証している。T19は、比較のた
めに示され、この分析では、BB10151の約2分の1の効
果であることが分かった。
載されているように測定し、その分析の結果を図3に示
す。BB10151(20μg/ml)は、血餅を完全に溶解するこ
とができたが、一方T19は、150μg/mlまでの濃度では、
血餅を溶解しなかった。従って、BB10151は、血餅の溶
解を誘発することに関して、T19より少なくとも7倍高
い活性を持つことが分かった。この発明の他のプラスミ
ノーゲン類似体の代表的な例について、40μg/mlの濃度
で、血餅溶解活性を比較した。表1におけるその結果
は、それらがBB10151と同様の活性を有していることを
示している。
クリルアミドゲル電気泳動(SDS PAGE)を用いて、トロ
ンビンによる切断に対する感受性に関して評価する。10
0mMトリス塩酸塩pH7.4中の0.125mlの典型的なインキュ
ベーション容量は、実施例に示された濃度でのプラスミ
ノーゲン類似体と、実施例に示された濃度でのトロンビ
ンとから成っている。インキュベーションを、37℃で行
う。対照のインキュベーションを、トロンビンを入れず
に同じ条件下で行う。活性化反応を、20%の最終濃度に
なるまでトリクロロ酢酸を加えて蛋白を沈澱させ、4℃
で4時間以上放置することにより停止した。次いで、沈
殿をペレット化し、アセトンで洗浄し、SDS PAGEサンプ
ル緩衝液(0.1mトリスpH6.8、10%グリセロール、1%S
DS、0.5%メルカプトエタノール及び0.5%ブロモフェノ
ールブルー)中に懸濁した。サンプルを、8−25%勾配
ゲルか又は12%ゲル上で分析した。結果として得られた
ゲルを、ゲルを走査し、かつピーク下面積を測定するこ
とによってバンド中の蛋白濃度を計算する、島津ゲルス
キャナーを用いて分析した(用語島津は、商品名であ
る)。従って、プラスミノーゲンの切断速度を、約92kD
aにおけるプラスミノーゲンバンドの消失と、約66kDaに
おけるプラスミンH鎖バンドの出現を測定することによ
って、決定した。
251の存在下で共にインキュベートする。活性化によっ
て産生されたプラスミンは、S2251を直接切断し、それ
によって405nmでの吸光度が上昇する。分析は、50mMト
リス塩酸塩,0.1mM EDTA、0.005%トリトンX100及び0.1
%HSAを含む緩衝液中の総容量880μlで行われる。S225
1を終濃度0.35mg/mlになるまで加える。用いたプラスミ
ン類似体濃度は、3μg/mlである。用いたトロンビン濃
度は、4.55NIHU/mlである。反応の100μlアリコート
を、37℃でのインキュベーション中に除去し、反応を停
止するために、マイクロタイタプレート中の25μlの4
%酢酸に加える。タイムコースが完了した時点で、プレ
ートを、405nmの波長のマイクロプレートリーダーで読
み取る。
血漿(3.8%のクエン酸三ナトリウムで凝固阻止されて
いる)、50μlのAPTT試薬(Instrumentation Labs)及
び適当な容量のプラスミノーゲン類似体の混合物を、96
穴マイクロタイタプレートのウエル中で、同じ緩衝液を
用いて200μlに調製する。異なるウエルには、50.6μ
lの同じ緩衝液で混合された4.4μlの500mM塩化カルシ
ウムが含まれている。プレートを37℃で30分間インキュ
ベートし、50μlの塩化カルシウムをプラスミノーゲン
類似体を含むウエルに移すことによって、凝固を開始す
る。血餅の形成及び溶解の進行を、37℃で1時間連続し
てインキュベートする間、間隔を置いて405nm(620nmの
リファレンス)での吸光度を測定することによって、追
跡する。
Claims (5)
- 【請求項1】ArgとP1'の間でトロンビンによって切断可
能である切断部位配列P4−P3−Pro−Arg−P1'−P2'(塩
基性アミノ酸残基P3がリジン又はアルギニン残基であ
り;かつ疎水性アミノ酸残基P4がバリン、イソロイシン
又はロイシンであり;かつ非酸性アミノ酸残基P1'及びP
2'が、それぞれ独立してバリン、イソロイシン又はロイ
シンである)を含む、1もしくはそれ以上の付加、欠損
もしくは置換体を含んでいてもよい、トロンビンによっ
て活性化されてプラスミン活性を持つことができるプラ
スミノーゲン類似体。 - 【請求項2】切断部位配列Thr−Thr−Lys−Ile−Lys−P
ro−Arg−Ile−Valを含む請求項1に記載の化合物。 - 【請求項3】切断部位配列が、野生型プラスミノーゲン
のPro(559)、Gly(560)に対応する配列がThr−Thr−
Lys−Ile−Lys−Proで置換され、かつVal(562)がIle
で置換されるように挿入されている請求項1に記載の化
合物。 - 【請求項4】前記の切断部位配列に加えて、野生型プラ
スミノーゲンのGlu(606)及びGlu(623)に対応するア
ミノ酸残基が、それぞれリジン残基によって置換されて
いる請求項3に記載の化合物。 - 【請求項5】請求項1〜4のいずれか1つに記載の化合
物と、医薬的もしくは獣医学的に許容される担体とから
なる、血液の凝固と繊維素溶解間の不均衡によって引き
起こされる病態の予防及び/又は治療用の繊維素溶解及
び/又は抗凝固活性を有する医薬もしくは獣医薬用組成
物。
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