FI114102B - Menetelmä trombiinin vaikutuksesta pilkkoutuvan plasminogeenianalogin valmistamiseksi - Google Patents

Description

11410?

Menetelmä trombiinin vaikutuksesta pilkkoutuvan plasminogeenianalogin valmistamiseksi 5 Tämä keksintö on parannus vireillä olevassa patenttihakemuksessamme WO-A-9109118 käsiteltyyn keksintöön ja se koskee menetelmää plasminogeenianalogien valmistamiseksi, jotka aktivoidaan trombiinilla, jotta niille saadaan fibrinolyyttinen aktiivisuus eli ne saadaan estämään verihyytymien muodostumista. Hakemuksessa esitetään myös nukleiinihappo (DNA tai RNA), joka koodaa kaikkia sellaisia yhdis-10 teitä tai osaa niistä. Lisäksi hakemuksessa esitetään myös niitä sisältäviä farmaseuttisia koostumuksia ja niiden käyttöä tromboottisten sairauksien hoidossa.

Plasminogeeni on fibrinolyyttisen systeemin avainkomponentti, joka on luonnon vastine veren hyytymissysteemille. Veren koaguloitumisprosessissa on fibriiniver-15 koston, joka muodostaa hyytymän rungon eli trombuksen, kehittymisessä mukana peräkkäisiä entsyymitoimintoja. Fibriiniverkoston hajoaminen (fibrinolyysi) tapahtuu plasmiinientsyymin vaikutuksesta. Plasminogeeni on plasmiinin epäaktiivinen esiaste ja plasminogeenin muuttumisen plasmiiniksi saa aikaan peptidisidoksen katkeaminen plasminogeenin argiinin 561 ja valiinin 562 väliltä. Fysiologisissa olosuhteissa 20 tätä pilkkoutumista katalysoi kudostyypin plasminogeeniaktivaattori (tPA) tai uroki-naasityypin plasminogeeniaktivaattori (uPA).

Mikäli tasapaino hyytymissysteemin ja fibrinolyyttisen systeemin välillä paikallisesti häiriintyy, saattaa epäsopiviin kohtiin muodostua suonensisäisiä hyytymiä, jotka joh-: ’ 25 tavat sellaisiin tilanteisiin kuten sepelvaltimotukokseen ja sydäninfarktiin, syviin las- :,,, kimotrombooseihin, aivoverenvuotoon, ääreisvaltimoiden tukoksiin ja emboliaan.

Tällaisissa tapauksissa fibrinolyyttisten aineiden antaminen on osoittautunut hyödyl- • liseksi hoidoksi hyytymän liukenemisen edistämiseksi. Antitromboottisia aineita ; ; voidaan käyttää myös hyytymien muodostumisen ehkäisemiseen.

30

Ongelmana suurimmassa osassa aineita, joita käytetään fibrinolyyttiseen hoitoon, on t kuitenkin se, että kliinisesti käyttökelpoisina annoksina ne eivät ole trombispesifisiä, '; ’ koska ne aktivoivat plasminogeenia yleensä verenkierrossa. Erästä vaihtoehtoista

• · I

• ‘lähestymistapaa fibrinolyysin tehostamiseksi käsitellään vireillä olevassa patenttiha- 35 kemuksessamme WO-A-9109118 ja se perustuu molekyylien, jotka voidaan aktivoi-,. ’ ·. da niin, että niillä on fibrinolyyttinen aktiivisuus eli että ne estävät hyytymien muo- !,dostumista, käyttöön. Aktivoitumista katalysoi yksi tai useampi endogeeninen veren ··* hyytymisessä mukana oleva entsyymi. Eräs tämän lähestymistavan etu on se, että 2 114102 fibrinolyysin trombiselektiivisyys eli veren hyytymisen esto saadaan aikaan aktivoivan entsyymin trombispesifisellä paikantumisella. Patenttihakemuksessa WO-A-9109118 käsitellään erityisesti, inter alia, plasminogeenianalogeja, jotka voidaan aktivoida plasmiiniksi trombiinilla pilkkomalla.

5

Trombiini (E.C. 3.4.21.5) on seriiniproteaasi, joka katalysoi monien proteiinien pro-teolyysiä, mukaanlukien fibrinogeeni (A alfa-ja B beta-ketjut), faktori XIII, faktori V, faktori VII, faktori VIII, proteiini C ja antitrombiini III. Rakenteen, jonka trombiini tarvitsee tunnistaakseen, näyttää osittain määräävän paikallinen aminohappo-10 sekvenssi pilkkomiskohdan ympärillä, mutta sen määrää myös vaihtelevassa määrin pilkkomiskohdasta etäällä oleva(t) sekvenssi(t). Esimerkiksi fibrinogeeni A:n alfa-ketjussa tähteet P2 (Vai), P9 (Phe) ja P10 (Asp) ovat ratkaisevia α-trombiinin katalysoimalle pilkkoutumiselle Arg(16)-Gly(17)-peptidisidoksen kohdalla (Ni, F et ai 1989, Biochemistry 28 3082-3094). Julkaisussa WO-A-9109118 sanotaan, että alfa-15 trombiinin optimipilkkomiskohtien rakenne saattaa olla (i) P4-P3-Pro-Arg-Pl’-P2\ jossa P3 ja P4 ovat kumpikin muista riippumatta jokin hydrofobinen aminohappotähde (kuten väliini) ja ΡΓ ja P2’ ovat kumpikin muista riippumatta hapoton aminohappotähde, tai (ii) P2-Arg-Pl\ jossa P2 tai ΡΓ on glysiinitähde. Niinpä trombiinilla aktivoitavissa plasminogeenianalogiyhdisteissä, jotka WO-A-9109118:ssa mainitaan 20 suositeltavimmiksi, ja kaikissa siinä erityisesti esimerkkeinä mainituissa yhdisteissä on pilkkomiskohdat, jotka ovat edellä mainittujen rakenteiden (i) tai (ii) mukaisia. WO-A-9109118:ssa mainituissa tuloksissa sanotaan, että erityisesti esimerkkeinä esitetyistä trombiinilla pilkkoutuvista plasminogeenianalogeista tunnuksella Tl9 merkitty on tehokkain käytetyissä koesysteemeissä. Siinä on pilkkomiskohta, joka perus-25 tuu faktori XII:een, villin tyypin plasminogeenin Pro:n (559) ja Gly:n (560) ollessa korvatut sekvenssillä Val-Glu-Leu-Gln-Gly-Val-Val-Pro. T19:n, joka on tehokkain erityisesimerkkeinä mainituista yhdisteistä, trombiinin pilkkomiskohta on siten edellä mainitun rakenteen (i) - jonka WO-A-9109118 mainitsee suositeltavimmaksi -•, ; mukainen.

:T: 30

Kirjallisuudessa on raportoitu faktori XI:n jäävän kofaktoreiden puuttuessa pilkkou-.' * tumatta trombiinilla [Naito, K. ja Fujikawa, K. (1991), J. Biol. Chem. 266 7353- 7358] tai pilkkoutuvan vain hitaasti, kun käytetään kcat/Km=l,6xl05M-lmin-l (Gai- • * lani, D. ja Broze, G.J., 1991, Science 253. 909-912). Tämän trombiinisubstraatin : ’.' 35 pilkkomiskohdan sekvenssi eroaa patenttihakemuksen WO-A-9109118 suositelta- :.,,· vimmista yleisistä kaavoista i) ja ii). Faktori XI:ssä eräs emäksinen aminohappo, .*. . Lys, on P3-asemassa. Vaikka trombiinin pilkkomisaktiivisuus tässä kohdassa faktori .·· ·. XF.ssä on hyvin pieni verrattuna faktori XIIF.een (kcat/Km=l,4xl05M-ls-l; Naski et ai, 1991, Biochemistry 30 934-941), on nyt kuitenkin havaittu tämän keksinnön 3 114102 mukaisesti, että plasminogeenianalogeilla, joiden trombiinin pilkkomissekvenssissä on emäksinen aminohappotähde asemassa P3, on yllättävästi parempi aktiivisuus T19:ään verrattuna. Tällaiset uudet analogit pilkkoutuvat nopeammin trombiinin vaikutuksesta ja niillä on parempi aktiivisuus kromogeenisessä määrityksessä (linked 5 chromogenic assay). Vielä merkittävämpää on, että tällaiset analogit ovat aktiivisia plasmahyytymän liuotuskokeessa, joka lähemmin muistuttaa olosuhteita in vivo.

Eräs lisäesimerkki trombiinin pilkkomiskohdasta, jossa P3 on emäksinen aminohappotähde, todetaan yksiketjuisessa urokinaasissa, jossa P3 on arginiini. Pilkkominen 10 tässä kohdassa tuottaa epäaktiivisen kaksiketjuisen urokinaasin [Ichinose et ai., (1986) J. Biol. Chem. 261 3486-9). Kofaktoreiden puuttuessa yksiketjuisen urokinaasin pilkkoutuminen trombiinin vaikutuksesta tapahtuu sekin kohtuullisen hitaasti, kun käytetään kcal/Km=3,8xl04-ls-l; (de Munk et ai., 1990, Fibrinolysis 4 161); plasminogeenianalogeilla, joilla on urokinaasipilkkomiskohta, on nyt kuitenkin osoitettu 15 olevan parempi aktiivisuus Tl9;ään verrattuna.

Esillä oleva keksintö onkin parannus hakemuksessa WO-A-9109118 selitettyyn keksintöön siinä mielessä, että se koskee menetelmää plasminogeenianalogin valmistamiseksi, joka voidaan aktivoida trombiinilla niin, että sille saadaan plasmiiniaktiivi-20 suus (kuten yleisesti mainitaan hakemuksessa WO-A-9109118), mutta joka on erityisesti tunnettu siitä, että sillä on trombiinin pilkkomiskohtasekvenssi P4-P3-Pro-Arg-ΡΓ-Ρ2’, jossa P3 on jokin emäksinen aminohappotähde, P4 on jokin hydrofobinen aminohappotähde ja ΡΓ ja P2’ ovat kumpikin muista riippumatta hapoton aminohappotähde, mainitun kohdan voidessa katketa trombiinin vaikutuksesta Arg:n ja ΡΓ:η 25 välistä.

: ": Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on kuvattu oheisissa patenttivaatimuksissa.

• * ’ * . Plasminogeeni on numeroitu Sottrup-Jensenin et ai. [julkaisussa Atlas of Protein • · < · Sequence and Structure (Dayhoff, M.O., toim.) 5 lisäys 3, s. 95 (1978)] proteiinisek- • I » *·* * venssitutkimuksen mukaisesti, jossa tutkimuksessa mainitaan, että plasminogeeni on 30 790 aminohapon proteiini ja että pilkkomiskohta on Arg(560)-Val(561) -peptidi-si- ..[’ dos. Kuitenkin eräs sopiva plasminogeeni cDNA, jota voidaan käyttää keksinnön : tässä toteutusmuodossa ja jonka Forsgren et ai eristivät [FEBS Letters 213 254-260 t (1987)] koodaa 791 tähteen proteiinia, jossa on ylimääräinen Ile asemassa 65. Tässä • » selityksessä plasminogeenissa olevien aminohappojen numerointi vastaa käytetyn ’·;' 35 cDNA:n numerointia. Plasminogeenin rakenteessa voi esiintyä monimuotoisuutta, ja

• I

’·.·*,! saattaa esiintyä plasminogeenimuotoja, joissa pilkkomiskohdan numerointi on erilai- : ”: nen, mutta tarkoituksena on, että sellaiset variantit sisältyvät toteutusmuotoon.

4 114102

Senpä vuoksi termi “plasminogeenianalogi“ tässä selityksessä käytettynä tarkoittaa molekyyliä, joka poikkeaa villin tyypin plasminogeenista ja jolla on kyky pilkkoutua tai johon muuten voidaan vaikuttaa niin, että se muodostaa molekyylin, jolla on plas-5 miiniaktiivisuus.

Keksinnön mukaisella menetelmällä valmistetuissa plasminogeenianalogeissa, jotka sisältyvät keksinnön tähän toteutusmuotoon, säilyy villin tyypin plasminogeenin fibriinin sitomisaktiivisuus riittävässä määrin, mutta esto-ominaisuudet ovat saatta-10 neet niissä muuttua; suositeltavimpien plasminogeenianalogien plasman puoliintumisaika on vertailukelpoinen villin tyypin plasminogeenin ajan kanssa, mutta tämä ominaisuus ei ole olennainen.

Keksinnön mukaisella menetelmällä valmistetuissa plasminogeenianalogeissa 15 olevassa trombiinin pilkkomis-kohdassa emäksinen aminohappotähde P3 voi olla lysiini- tai arginiinitähde; hydrofobinen aminohappotähde P4 voi olla väliini-, isoleusiini- tai leusiinitähde; ja hapottomat aminohappotähteet ΡΓ ja P2’ voivat kumpikin olla muista riippumatta väliini- tai isoleusiinitähde.

20 Keksinnön alaan sisältyvät erityiset plasminogeenianalogit sisältävät pilkkomiskoh-dan Thr-Thr-Lys-Ile-Lys-Pro-Arg-Pl ’-P2' tai pilkkomiskohdan Leu-Arg-Pro-Arg, joissa ΡΓ ja P2’ ovat kumpikin muista riippumatta jokin hapoton aminohappotähde. Kuten mainittiin, ΡΓ ja P2’ voivat olla leusiini- tai valiinitähteitä.

25 Erityisiä ja suositeltavia keksinnön mukaisella menetelmällä valmistettuja yhdisteitä ovat plasminogeenianalogit: * ;* · a) joissa Pro(559):n, Gly(560):n korvaavat Thr, Thr, Lys, Ile, Lys, Pro ja *· ' · Val(562):n korvaa Ile. Tässä analogissa aminohappo 563 on väliini kuten villissä :.; : tyypissä. Tämä mutantti on nimetty BB10151 :ksi.

: 30 b) joissa Cys(558):n Pro(559):n, Gly(560):n korvaavat Ala, Gly, Gin, Lys, Thr,

Leu, Arg, Pro; ja Cys(556):n korvaa Ala. Tässä analogissa aminohapot 562 ja 563 ·· ovat valiineja kuten villissä tyypissä. Tämä mutantti on nimetty BB 10156:ksi.

c) joissa Cys(558):n, Pro(559):n, Gly(560):n korvaavat Ala, Leu, Arg, Pro; ja • I « , .·. Cys(566):n korvaa Ala. Tässä analogissa aminohapot 562 ja 563 ovat valiineja kuten • · · : ·’ 35 villissä tyypissä. Tämä mutantti on nimetty BB10170:ksi.

*··· d) joissa Pro(559):n, Gly(560):n korvaavat Vai, Glu, Leu, Gin, Gly, Leu, Arg, Pro.

:Y: Tässä analogissa aminohapot 562 ja 563 ovat valiineja kuten villissä tyypissä. Tämä .*·. mutantti on nimetty BBl0171:ksi.

e) joissa Cys(558):n, Pro(559):n, Gly(560):n korvaavat Ala, Thr, Thr, Lys, Ile, Lys, 5 114102

Pro; Val(562):n korvaa Ile; ja Cys(566):n korvaa Ala. Tämä mutantti on nimetty BB10158:ksi.

Keksinnön mukaisella menetelmällä valmistetut plasminogeenianalogit on määritelty 5 erityisesti niiden trombiinin pilkkomiskohdan sekvenssin laatua silmällä pitäen, koska juuri yllättävän nopea pilkkoutuminen tässä kohdassa korostaa yhdisteiden parempaa trombolyyttistä vaikutusta. On kuitenkin todennäköistä, että keksinnön mukaisella menetelmällä valmistetut plasminogeenianalogit (so. sellaiset, jotka sisältävät nyt identifioidut uudet pilkkomiskohtasekvenssit) saattavat sisältää muitakin 10 muutoksia (villin tyypin plasminogeeniin verrattuna), joita voivat olla yksi tai useampi lisäys, deleetio tai substituutio pilkkomiskohdasta enemmän tai vähemmän etäämpänä olevissa kohdissa. Eräs esimerkki sellaisesta muutoksesta olisi yhden tai useamman “kringle“-domainin lisäys, poisto, korvaus tai muuttaminen fibriininsito-misaktiivisuuden muuttamiseksi tai a2-antiplasmiinin sitoutumisen heikentämiseksi. 15 Eräs erityisesimerkki olisi kringle 1 :ssä sijaitsevan lysiinin sitomiskohdan mutaatio, jolla vaikutettaisiin a2-antiplasmiinin sitoutumiseen tässä kohdassa. Sellaiset variantit voivat olla resistenttejä a2-antiplasmiinin vaikutuksesta tapahtuvalle inhibiitiolle. Suositeltavia toteutusmuotoja ovat BB10189, BB 10190 ja BB10192, jotka ovat plasminogeenianalogit BB10153, BB10170 ja BB10171, vastaavassa järjestyksessä, 20 lisämuutoksin Asp 137 —> Ser ja Asp 139 —> Ser.

Toinen esimerkki olisi mutaatio, jolla estettäisiin disulfidisidoksen muodostuminen Cys(558):n ja Cys(566):n väliin, esimerkiksi korvaamalla yksi tai molemmat kysteii-nit alaniinitähteillä, jolloin poistettaisiin kysteiinitähteiden väliin muodostuneen 25 disulfidisidoksen aiheuttama paine pilkkomiskohtaan. Edellä kuvatuista suositelta-vista toteutusmuodoista varianteissa BB10156, BB10158 ja BB10170 on tällaiset ’ ·· ·' avoin silmukka -modifikaatiot.

·.: | Eräs esimerkki modifikaatiosta, jossa käytettäisiin deleetiota, olisi plasminogeeni- : T: 30 analogin lys-plasminogeenivariantti, jossa aminoterminaaliset aminohapot 68, 77 tai 78 olisi poistettu. Sellaisilla varianteilla saattaisi olla parempi fibriininsitomisaktiivi-• · · suus, kuten on havaittu lys-plasminogeenilla villin tyypin glu-plasminogeeniin ver- rattuna (Bok, R.A. ja Mangel, W.F. 1985, Biochemistry 24, 3279-3286). Vielä eräs esimerkki, jossa käytetään deleetiota, olisivat plasminogeenianalogin variantit, joissa : · ’ 35 kringle 1- tai kringle 1-4 -domainit olisi poistettu, a2-antiplasminogeenin vaikutuk- •...: sesta tapahtuvan eston heikentämiseksi. Kringle-domainien 1 -4 poistaminen muuttai- .y: si myös molekyylin fibriininsitomis- ja farmokineettisiä ominaisuuksia.

Esillä olevan keksinnön mukaisella menetelmällä valmistetun plasminogeenin erit- 6 114102 täin hyytymäselektiivistä analogia varten saattaa olla suositeltavaa tehdä seriiniprote-aasidomainiin mutaatio, joka häiritsee plasmiini-inhibiittorin sitoutumista (SEQ ID2 kuvaa villin tyypin plasmiinin seriiniproteaasidomainia ja kun tässä viitataan tuohon domainiin numeroilla, käytetään numerointia SEQ ID2). Tämä mutaatio voisi olla 5 asemassa, joka on analoginen sen kanssa, joka on osoittautunut estävän inhibiittorin sitoutumista kudosplasminogeeniaktivaattoriin (Madison, E.L. et ai., 1989, Nature 339, 721-724), tai se voisi olla jossakin muussa asemassa, joka estää inhibiittoria sitoutumasta plasminogeeniin; sellaisia modifikaatioita kuvataan vireillä olevassa patenttihakemuksessa PCT/GB 9301632, jossa kuvataan kymotrypsiinisuperperheen 10 endopeptidaaseja, jotka ovat resistenttejä seriiniproteaasi-inhibiittoreille. Sellainen resistenssi saadaan aikaan endopeptidaasissa tai sen prekursorissa tehtävällä muutoksella, joka aikaansaa jonkin seuraavista: a) konformaatiomuutoksen proteaasin paikallisessa laskoksessa; 15 b) muutoksen proteaasin ja inhibiittorin keskinäisissä orientaatioissa kompleksin muodostuessa; c) muutoksen proteaasin steerisessä rungossa inhibiittorin alueella; d) muutoksen sähköstaattisen potentiaalin kentässä inhibiittorin sitoumiskohdan alueella; tai 20 e) minkä tahansa edellä mainittujen kombinaation.

Eräs suositeltava toteutusmuoto on BB10158, jossa on A4-mutaatio (Glu606 —»

Lys), jota kuvataan julkaisussa PCT/GB 9301632 (BB10199). Tämä mutaatio on rakennettu katkaisemaan ioni-interaktiot plasminogeenin pinnalla, mikä häiritsee 25 sitoutumista antiplasmiiniin. Mutageneesi suoritettiin käyttämällä 24 emäksen oligo- nukleotidia 5’CTT GGG GAC TTC TTC AAG CAG TGG3’, joka on rakennettu muuttamaan Glu606 —> Lys. Muissa suositeltavissa toteutusmuodoissa on, joko : : yksinään tai yhdistelminä, mutaatioita Glu606:ssa, Glu623:ssa, Phe583:ssa, :,; : Met585:ssä tai Lys607:ssä. Glu606- ja Glu623-mutaatiot on esitetty esimerkkeinä v : 30 julkaisussa PCT/GB 9301632. Eräs esimerkki tästä toteutusmuodosta on BB10153, joka on plasminogeenianalogi BB10151, jossa on lisämuutokset Glu606 —> Lys ja ··· Glu623 —> Lys.

•» » · • »* • » • · • · *

Muissa keksinnön mukaisella menetelmällä valmistetuissa monimutaatioisissa plas- • · * • ’ 35 minogeenianalogeissa voi olla yksi tai useita muutoksia estämässä, vähentämässä tai :‘ muuttamassa glykosylaatiomalleja. Sellaisia muutoksia sisältävien plasminogeeni- analogien puoliintumisaika saattaa olla pitempi, plasman suorituskyky huonompi . ja/tai niiden spesifinen aktiivisuus suurempi.

* · » 7 114102

Keksinnön alaan sisältyvällä menetelmällä valmistettujen plasminogeenianalogien suositeltavimmat tunnusmerkit pätevät myös, milloin se on tarkoituksenmukaista, muihinkin hakemuksessa esitettyihin yhdisteisiin, mutatis mutandis.

5 Keksinnön mukaisella menetelmällä valmistetut plasminogeenianalogit voidaan syntetisoida millä tahansa sopivalla tavalla. Keksinnön mukaisesti saadaan käyttöön tällaisen plasminogeenianalogin valmistusmenetelmä, jossa peräkkäisiä aminohappotähteitä kytketään toisiinsa ja/tai ligatoidaan oligopeptidejä. Vaikka proteiineja voidaan periaatteessa syntetisoida kokonaan tai osaksi kemiallisin keinoin, on suositelit) tavaa valmistaa ne vastaavan nukleiinihapposekvenssin ribosomi-translaation avulla, suositeltavimmin in vivo. Proteiini voidaan glykosyloida sopivasti.

On suositeltavaa valmistaa keksinnön mukaisia proteiineja käyttämällä rekombinant-ti-DNA-tekniikkaa. Luonnossa esiintyvää plasminogeenia koodaava DNA voidaan 15 saada cDNA:sta tai genomikloonista tai se voidaan syntetisoida. Aminohappojen substituutiot, lisäykset tai deleetiot suoritetaan suositeltavimmin paikkaspesifisellä mutageneesikäsittelyllä. Plasminogeenianalogeja koodaavia DNA-sekvensejä voidaan saada menettelytavoilla, jotka ovat tuttuja geenitekniikan alaan perehtyneille.

20 Proteiinien valmistusmenetelmä, jossa käytetään rekombinantti-DNA-tekniikkaa, käsittää tavallisesti vaiheet, joissa ekspressiovektoriin insertoidaan jokin sopiva koodaava sekvenssi ja transferoidaan vektori isäntäsoluun. Niinpä hakemuksessa esitetään synteettinen eli rekombinanttinukleiinihappo, joka koodaa edellä kuvattua proteiiniyhdistettä. Nukleiinihappo voi olla RNA tai DNA ja se voi olla jonkin vek-25 torin muodossa, kuten plasmidina, kosmidina tai faagina. Vektori voidaan sovittaa transfektoimaan tai transformoimaan prokaryoottisia (esimerkiksi bakteeri-) soluja ja/tai eukaryoottisia (esimerkiksi hiiva- tai nisäkäs-) soluja. Vektori käsittää kloo-; nauspaikan ja tavallisesti ainakin yhden markkerigeenin. Ekspressiovektorissa on ; ; promoottori, joka on operatiivisesti kytketty kloonauspaikkaan insertoitavaan sek- : : : 30 venssiin, ja suositeltavimmin sekvenssi, joka mahdollistaa proteiinituotteen sekretoi- tumisen.

, · · ·. Keksinnön mukaisella menetelmällä valmistetut plasminogeenianalogit voidaan

• I

‘ 1' ekspressoida käyttämällä julkaisussa WO-A-9109118 kuvatun tyyppistä vektoria, «* » : ’,: 35 joka käsittää ensimmäisen nukleiinihapposekvenssin, joka koodaa jotakin proteiinia •,., · tai sisältää kloonauspaikan ja on operatiivisesti kytketty toiseen nukleiinihapposek- . v. venssiin, joka sisältää vahvan promoottori- ja voimistajasekvenssin, joka on johdettu /.. > t ihmisen sytomegaloviruksesta, kolmannen nukleiinihapposekvenssin, joka koodaa polyadenylaatiosekvenssiä, joka on peräisin SV40:stä, ja neljännen nukleiinihappo- 114102 8 sekvenssin, joka koodaa selektoitavaa markkeria, joka ekspressoituu SV40-promoot-torista ja jossa on lisä-SV40-polyadenylaatiosignaali selektoitavan markkerisekvens-sin 3’-päässä.

5 On selvää, että termiä “vektori44 käytetään tässä selityksessä funktionaalisessa merkityksessä eikä sen pidä käsittää välttämättä rajoittuvan yhteen nukleiinihappomole-kyyliin. Niinpä esimerkiksi edellä määritellyn vektorin ensimmäinen, toinen ja kolmas sekvenssi voivat olla ensimmäisessä nukleiinihappomolekyylissä ja neljäs sekvenssi voi olla toisessa nukleiinihappomolekyylissä.

10 Tämä vektori tekee mahdolliseksi plasminogeenianalogien ilmentymisen ja sekretoi-tumisen soluviljelyalustaan biologisesti aktiivisessa muodossa ilman että tarvitaan mitään biologisia tai kemiallisia lisätoimenpiteitä.

15 Keksintö koskee menetelmää edellä kuvattuja plasminogeenianalogeja koodaavan nukleiinihapon valmistamiseksi ja tämä menetelmä käsittää peräkkäisten nukleotidien kytkemisen toisiinsa ja/tai oligo- ja/tai polynukleotidien ligatoinnin.

Lisäksi hakemuksessa esitetään edellä kuvatulla tavalla nukleiinihapolla ja/tai vekto- 20 rilla transformoitua solua tai solulinjaa. Sopivia transformoitavia soluja tai solulinjo-ja ovat sekä prokaryoottiset (esimerkiksi Escherichia coli) että eukaryoottiset solut, kuten hiivasolut (mukaanlukien Saccharomyces cerevisiae ja Pichia pastoris) ja nisä-kässolut. Suositeltavimpia ovat nisäkässolut, jotka kasvavat jatkuvassa viljelyalus-tassa ja jotka voidaan transfektoida tai muutoin transformoida standardimenetelmillä.

25 Esimerkkejä sopivista soluista ovat kiinalaisen hamsterin munasarjasolut (CHO), hiiren myeloomasolulinjat kuten NSO ja P3X63-Ag8.653, COS-solut, HeLa-solut, BHK-solut, melanoomasolulinjat, kuten Bowes-solulinja, hiiren L-solut, ihmisen . hepatoomasolulinjat, kuten Hep G2, hiiren fibroblastisolut ja hiiren NIH 3T3 -solut.

·,: ' CHO-solut ovat erityisen suositeltavia isänniksi plasminogeenin ja plasminogeeni- : : : 30 analogien ekspressioon.

114102 9 fibrinolyysin epätasapainon aiheuttamien tilojen ennalta ehkäisyssä ja/tai hoidossa, kun halutaan saada aikaan paikallinen fibrinolyyttinen ja/tai antikoaguloiva aktiivisuus. Sellaisia tiloja ovat sydän-ja aivoinfarkti, valtimo-ja laskimotromboosi, trom-boembolia, postkirurgiset adheesiot, tromboflebiitti ja diabeettiset vaskulopatiat ja 5 syöpään liittyvät koaguloinnin epätasapainot.

Hakemuksessa esitetään koskee myös tässä kuvatun keksinnön mukaisella menetelmällä valmistetun plasminogeenianalogin käyttöä trombolyyttisen, antitromboottisen tai trombolyyttis-antitromboottisen aineen valmistuksessa.

10

Lisäksi hakemuksessa esitetään farmaseuttinen tai veterinäärinen koostumus, joka käsittää yhden tai useamman tässä kuvatun keksinnön mukaisella menetelmällä valmistetun plasminogeenianalogin ja jonkin farmaseuttisesti tai veterinäärisesti hyväksyttävän kantajan. Sellainen koostumus voidaan sovittaa suun kautta, intravenoosina 15 tai intramuskulaarisena injektiona tai infuusiona annettavaksi. Sopivia injektoitavia koostumuksia ovat valmisteet, joissa steriili(t) plasminogeenianalogi(t) on (ovat) isotonisessa fysiologisessa keittosuolaliuoksessa ja/tai puskurissa ja ne voivat sisältää myös jotakin paikallispuudutetta injektion aiheuttaman kivun lievittämiseksi. Samanlaisia koostumuksia voidaan käyttää infuusiota varten. Kun yhdiste on tarkoi-20 tus antaa paikallishoitona, se voidaan formuloida emulsiovoiteeksi, voiteeksi tai liuokseksi jossakin sopivassa perusaineessa.

Hakemuksessa esitetyt yhdisteet voidaan toimittaa yksikköannosmuodossa, esimerkiksi kuivana jauheena tai vedettömänä konsentraattina jossakin hermeettisesti sulje-25 tussa säiliössä, kuten ampullissa tai pikkupussissa.

Annettava ainemäärä riippuu vaaditusta fibrinolyysi- tai hyytymänestomäärästä, halutusta vaikutusnopeudesta, tromboembolisen tilan vakavuudesta ja hyytymän koosta. Annettavan tarkan annoksen määrittelee lääkäri nimenomaan tilan, jota kek-' · 30 sinnön mukaisilla yhdisteillä on määrä hoitaa, laadun vuoksi. Ohjeellisena arvona kuitenkin kypsän trombin vuoksi hoidettava potilas saa tavallisesti vuorokausiannok-,,;: ‘ sena plasminogeenianalogia 0,01 - 10 mg/painokilo joko injektiona esimerkiksi enin- Γ' : tään 5 annoksena tai infuusiona.

• · · 35 Seuraavat kuviot ja keksinnön esimerkit esitetään keksinnön havainnollistamiseksi * ·; * ’ eikä sen rajoittamiseksi. Piirustuksissa, joihin esimerkeissä viitataan: : ; · kuvio 1 esittää BB10151:n pilkkomisnopeutta trombiinilla; i * * • » • * I · » 114102 ίο kuvio 2 esittää tuloksia kromogeenisesta määrityksestä Jossa verrataan BB10151 :n ja T19:n aktivoitumista trombiinilla; kuvio 3 esittää BB10151 :n hyytymän liuottamisaktiivisuutta.

5 Esimerkki 1 - BB10151 :n rakentaminen, ilmentäminen ja puhdistus

Plasminogeeni-cDNA:n eristäminen ja vektoreiden pGWH ja pGWHgP rakentaminen on kuvattu julkaisussa WO-A-91/09118. pGWHgP:ssä transskriptio plasmino-geeni-cDNA:n kautta voi initioitua HCMV-promoottorissa/voimistajassa ja siinä käytetään selektoitavaa markkeria gpt.

10

Geenitekniikan menetelmät, ekspressio ja proteiinien puhdistaminen, joita käytetään seuraavassa modifoidun plasminogeeniesimerkin valmistuksessa, ovat geenitekniikan alaan perehtyneille tuttuja. Useimpien menetelmien kuvaus voidaan löytää jostakin seuraavista laboratoriokäsikirjoista: ’’Molecular Cloning”, jonka ovat kirjoitta-15 neet T. Maniatis, E.F. Fritsch ja J. Sambrook ja julkaissut Cold Spring Harbor Laboratory, Box 100, New York, tai ’’Basic Methods in Molecular Biology”, jonka ovat kirjoittaneet L.G. Davis, M.D. Dibnerja J.F. Batteyja julkaissut Elsevier Science Publishing Co Inc., New York.

20 Lisä- ja muunnettuja menetelmiä esitetään yksityiskohtaisesti tuonnempana mene-telmäosassa.

BB10151 on plasminogeenianalogi, jossa aminohappotähteet Pro(559), Gly(560) on korvattu seuraavilla: Thr, Thr, Lys, Ile, Lys, Pro ja Val(562) on korvattu Ile:lla pilk-25 komissilmukan, jonka trombiini (Seq. ID. 1) pystyy pilkkomaan, muodostamiseksi.

Tämä kohta perustuu potentiaaliseen trombiinin pilkkomiskohtaan faktorissa XI. Menettelytavat, joita tässä esimerkissä käytetään, ovat olennaisesti kuten julkaisussa : ; WO-A-9109118, esimerkeissä 2 ja 3, kuvataan, jolloin mutageneesireaktio toteutet- • : tiin plasminogeenin 1,87kb Kpnl-HincII-palasella, joka oli kloonattu bakteriofagi . : : 30 Ml 3mpl 8:aan. Yksisäikeinen templaatti valmistettiin ja mutaatio suoritettiin oligo- nukleotidi-ohjatulla mutageneesilla. Tässä tapauksessa käytettiin 48 emäksen pituis-: , . ta oligonukleotidia ; (5’CACCCCCCTACGATTCTAGGTTTAATTTTAGTTGTACATTTCTTCGGC3’) • < · (SEQ.ID.4) mutageneesin ohjaamiseen.

35 *,,,: Plasmidi-DNA vietiin CHO-soluihin elektroporaation avulla käyttäen 800 V ja •. 25 pF. Selektiivistä elatusainetta, joka sisälsi 250 μΐ/ml ksantiinia, 5 pg/ml mykofe- , ·, : nolihappoa, 1 x hypoksantiini-tymidiiniä (HT), lisättiin soluihin 24 tuntia transfekti- $ I t π 114102 on jälkeen ja väliaine vaihdettiin joka toinen - kolmas päivä. Maljat Joista saatiin gpt-resistenttejä kolonioita, seulottiin plasminogeenituotannon kannalta käyttäen ELISA-määritystä. Solut, jotka tuottivat suurimmat antigeenitasot, kloonattiin uudelleen ja parhaille tuottajille suoritettiin scale up pulloihin, joissa tuotantoa monitoroi-5 tiin huolellisesti. Kaikista näistä solulinjoista varastoitiin pakastettuja varastoja. Tuottajasoluille suoritettiin scale up pyöriviin pulloihin käsitellyn kasvualustan aikaansaamiseksi, josta plasminogeeniproteiini puhdistettiin käyttäen lysiiniä SEPHAROSE 4B (Sana SEPHAROSE on tavaramerkki.) Solulinja, jota käytettiin tämän mutanttiproteiinin tuottamiseen, oli 123.C6.

10

Esimerkki 2 - BB10153 :n rakentaminen BB10153 on BB10151 :n johdos, joka sisältää kaksi lisämutaatiota (Glu606 -» Lys ja Glu623 —> Lys) a2-antiplasmiinin sitoutumisen huonontamiseksi. BB10151:n 663bp:n EcoRV-SpHI -palanen (kloonattu pUC:hen - katso esimerkki 1) poistettiin 15 ja korvattiin ekvivalentilla 663bp:n palasella antiplasmiinille resistentistä mutantista A3A4. Tämän rakentaminen kuvataan PCT/GB9301632:n esimerkissä 5. 24 emäksen oligonukleotidia 5’CTTGGGGACTTCTTCAAGCAGTGG35 (SEQ ID 3) käytettiin muutamaan Glu606 —» Lys ja 27 emäksen oligonukleotidia S’GTTCGAGATTCACTTTTTGGTGTGCACS’ (SEQ ID 5) käytettiin muuttamaan 20 Glu623 -» Lys. Täyspitkä plasminogeeni kloonattiin sitten ekspressiovektoriin pGWIH ennen gpt-selektiomarkkerin insertoimista, kuten julkaisun WO-A-9109118 esimerkissä 2 kuvataan.

Esimerkki 3 - BB10156:n, BB10158:n ja BB10170:n rakentaminen 25 DNA:ta, joka koodaa plasminogeenimutanttia BB 10150, käytettiin templaattina BB10156:n, BB10158:n ja BB10170:n tuottamiseen. BB 10150 on plasminogeeni-, ; analogi, jossa aminohappotähteet Pro(559), Gly(560) on korvattu Vallila, Pro.lla, ; Vallila ja jossa on lisämutaatiot Cys(558) -» Alaja Cys(556) -» Ala disulfidisidok- ; > : sen muodostumisen estämiseksi. BB 10150:n avattu pilkkomissilmukkasekvenssi on ί ; 30 esitetty Seq. I.D.6:ssa. BB10150 valmistettiin mutageneesin avulla käyttäen kahta oligonukleotidialuketta [5’ CTAGGTACAACCGCTTTCTTCGGCT 3’ (Seq. I.D. 7) ·. ; ; ja 5’ GGTGGGCCACCGCCCCCCCCAC 3’ (Seq. I.D. 8)] ja mutantin T13 ... 1,87 kbin Kpnl-HincII -palasta (katso patenttihakemus WO-A-9109118, esimerkki 13 ja Seq. I.D. 9) kloonattuna M13 :een.

35 *’ >’ Plasminogeenianalogit BB10156, BB10158 ja BB10170 rakennettiin kaikki paik- ;' ‘ · kaspesifisellä mutageneesilla käyttäen edellä kuvattua mutanttia BB10150 M13:ssa ; -,; templaattina, joten niissä on kaikissa samat Cys -» Ala mutaatiot tähteissä 558 ja 114102 12 566. BB10156 on plasminogeenianalogi, jossa aminohappotähteet Pro(559),

Gly(560) ovat korvatut seuraavasti Gly, Gin, Lys, Thr, Leu, Arg, Pro (Seq. I.D. 10). BB10158 plasminogeenianalogi, jossa aminohappotähteet Pro(559), Gly(560) on korvattu seuraavasti. Thr, Thr, Lys, lie, Lys, Pro ja Val(562) on korvattu Heila (Seq.

5 I.D. 11). BB 10170 on plasminogeenianalogi, jossa aminohappotähteet Pro(559), Gly(560) on korvattu seuraavasti: Leu, Arg, Pro (Seq. I.D. 12). Oligonukleotidit, joita käytettiin alukkeina kussakin mutageneesissa, on esitetty alla:

Mutantti Oligonukleotidisekvenssi 10 BB10156 (Seq. I.D. 13) 5’ CAACCCTAGGTCTAAGTGTTTTCTGACCCGCTTTCTTCG 3’ BB10158 (Seq. I.D. 14) 5’ CAACCCTAGGTTTGATCTTCGTTGTCGCTTTCTTCG 3’ BB10170 (Seq. I.D. 15) 15 5 ’ C AC A ACCCTAGGTCTAAGCGCTTTCTTCGG 3 ’

Kussakin tapauksessa DNA-sekvensoinnin jälkeen mutaatio kloonattiin suoraan pGWIHg-plasminogeeniekspressiovektoriin käyttäen restriktioentsyymejä Hindlll ja SpII. Nämä kohdat oli aikaisemmin sisällytetty plasminogeenin äärimmäiseen 5’-20 päähän ja kohtaan 1850 vastaavasti mutageneesin avulla; tämä menettely ei vaikuttanut plasminogeeniaminohapon koodaamaan sekvenssiin.

Esimerkki 4 BB10169:n ja BB10171:n rakentaminen ....: 25 BB 10169 on plasminogeenianalogi, jossa aminohappotähteet Pro(559), Gly(560) on korvattu seuraavasti: Vai, Glu, Leu, Gin, Gly, Ile, Lys, Pro ja Val(562) on korvattu • * ·

Ile.lla (Seq. I.D. 16). BB 10169 valmistettiin oligonukleotidi-ohjatulla mutageneesilla BB10151:een Ml3:ssa käyttäen 42 emäksen oligonukleotidia :/'j 5’ GATTCTAGGTTTAATGCCCTGCAGTTCCACACATTTCTTCGG 3’ • · · :·· : 30 (Seq. I.D. 17), minkä jälkeen se kloonattiin pGWIHg-plasminogeeniin käyttäen v " HindIII:a ja SpII:a. BB10171 on plasminogeenianalogi, jossa aminohappotähteet

Pro(559), Gly(560) on korvattu seuraavasti: Vai, Glu, Leu, Gin, Gly, Leu, Arg, Pro i: (Seq. I.D.l8). BB10171 :n rakentamiseen käytettiin templaattina yksisäikeistä M13:a : BB10l69:stä. Mutageneesi käynnistettiin käyttäen alukkeena 39 emäksen oligonuk- *:. 35 leotidia 5’ CACCCCCCTACCACTCTGGGTCTCAGGCCCTGCAGTTCC 3’ (Seq. I.D. 19) '‘ ja DNA:n sekvensoinnin jälkeen se kloonattiin ekspressiovektoriin käyttäen :.v Hindlll.aja SpII:a.

• · * • · 13 11410?

Esimerkki 5 -BB10189:n. BB10190:n ja BB10191:n rakentaminen ja ekspressio Plasminogeenianalogeissa BB10189, BB10190 ja BB10191 on kringle 1 :n kaksois-mutaatio Asp(137) -> Ser ja Asp(139) -» Ser lysiinin sitoutumiskohdan tuhoami-5 seksi. Mutaatio suoritettiin BB10153-, BB10170-ja BB10171-taustoissa (katso esimerkit 2, 3 & 4) käyttäen 28 emäksen pituista oligonukleotidia 5’ CCCTGCGGAGAGTTGGATGGATTCCTGC 3’ (Seq. I D. 20).

Mutaatio kloonattiin sitten pGWIHg.plasminogeeniin käyttäen restriktioentsyymejä Hindlll ja SpII.

10

Esimerkki 6 - BB 10181 :n rakentaminen BB10181 :ssä on BB10170:n pilkkomiskohtasekvenssi ja lisämutaatio Phe(583)

Arg cc2-antiplasmiinin sitoutumisen häiritsemiseksi. BB 10181 rakennettiin BB10150-perustaisen välirakenteen kautta käyttäen M13:a,joka sisälsi täyspitkän 15 BB 10150:n templaattina, ja oligonukleotidia 5’ GAAGTGCATTCCTCTCCTCGTACGAAG 3’ (Seq. I D. 21) alukkeena. Mutatoitu BB10150-geeni kloonattiin sitten pGW 1 Hg.hen käyttäen restriktioentsyymejä Hindlll ja SMal. BB10181-ekspressiovektori tehtiin sitten tästä välituotteesta korvaamalla Hindlll-SplI -palanen tästä plasmidista vastaavalla osalla 20 BB10170:stä (katso esimerkki 3).

Esimerkki 7 - BB 10186:n rakentaminen BB 10186:ssa on BB 10171 :n pilkkoutumiskohtasekvenssi ja lisämutaatio Met(585) -> Arg a2-antiplasmiinin sitoutumisen häiritsemiseksi. BB10186 tehtiin samalla ta-*:**: 25 valla kuin edellä esimerkissä 6 kuvattiin BB 1018 l .n kohdalla. BB10150 välirakenne ·* ·*, tehtiin käyttäen 25 emäksen pituista oligonukleotidia 5’ CCACAGAAGTGTCTTCCAAACCTCG 3’ (Seq. I.D. 22) : minkä jälkeen se kloonattiin pGWlHg:hen. BB10186 tehtiin sitten palasenvaihdolla : käyttäen Hindlll-SplI-fragmenttia BB10171:stä (katso esimerkki 4).

30

Esimerkki 8 - BB 10199:n rakentaminen . . BB10199:ssä on BB10158:n pilkkomiskohtasekvenssi ja lisämutaatio Glu(606) -> ::;.' Lys a2-antiplasmiinin sitoutumisen häiritsemiseksi. BB 10199 valmistettiin olennai- ' · ’ sesti kuten PCT/GB9301632:n esimerkeissä 2 ja 3 kuvataan. BB 10158:n (katso /^/35 edellä esimerkki 3) fragmenttia Kpnl-EcoRV käytettiin korvaamaan vastaavaa : /· BB 1015l.n fragmenttia. Glu(606) -> Lys rakenne kloonattiin pUC:hen ja kloonattiin . sitten lopulliseen ekspressiovektoriin, kuten PCT/GB93/01632:ssa kuvataan.

• · * i4 114102

Esimerkki 9 - BB10151 :n pilkkominen

Plasminogeenimutantteja (12,5 pg) inkuboitiin 2,8 pg:n kanssa trombiinia kuten kuvataan menetelmässä 1. Plasminogeenimutanttien pilkkoutumisajan kesto määritet-5 tiin kvantitatiivisella geeliskannauksella; 50 % pilkkoutumisajasta T19:11a ja BB10151 :llä olivat 9 ja 3 minuuttia, vastaavassa järjestyksessä. Geeliskannaustulok-set BB 10151 :n pilkkoutumisesta on esitetty kuviossa 1.

Esimerkki 10 - BB 10151 :n aktivoiminen 10 Puhdistetun BB10153-proteiinin aktivoituminen määritettiin käyttäen kromogeenista analyysiä (katso menetelmä 2.1). Kokeen tulokset on esitetty kuviossa 2, jossa absor-banssin nousu 405 nm:ssä ajan mittaan osoittaa plasmiinin aktiivisuuden kehittyvän, kun BB10151 :tä inkuboidaan trombiinin kanssa. Tl 9 on esitetty vertailun vuoksi ja sen todettiin olevan suunnilleen 2 kertaa tehottomampi kuin BB10151 tässä kokees-15 sa.

Esimerkki 11 - Plasmahyytymän liuotus BB10153:n ja T19:n kyky liuottaa plasmahyytymä määritettiin, kuten kuvataan menetelmässä 2.2. ja tällaisen kokeen tulokset on esitetty kuviossa 3. BB10151 20 (20 pg/ml) pystyi aikaansaamaan hyytymän täydellisen liukenemisen, kun sen sijaan T19 ei liuottanut hyytymää edes konsentraatioilla 150 pg/ml. BB10153:n todettiin siis olevan vähintään 7 kertaa aktiivisempi kuin Tl9 plasmahyytymän liukenemisen käynnistämisessä.

....: 25 Keksinnön mukaisten muiden plasminogeenianalogien edustavia esimerkkejä vertailtiin plasmahyytymän liuottamisen kannalta konsentraatioilla 40 pg/ml ja tulokset * 1 · taulukossa 1 osoittavat, että niillä on samanlainen aktiivisuus kuin BB10151 :llä.

* · t 1 • · · ♦ · · • · · 1 » · · φ · • · · • I · · 1 1 • » ·

Taulukko 1 15 11410?

Plasminogeenianalogi 50% hyytymästä liuottamiseen kulunut aika (min) BB10151_4^5_

Tl9 ei liuennut BB10158 12£_ BB10199 6_ BB10153_4,1_ BB10171_4A_ BB10156 6fi_ BB10170 3A_ 5 Menetelmät 1. Pilkkoutumisanalvvsi

Plasminogeenianalogien trombiinilla pilkkoutuvuus tutkittiin käyttäen SDS PAGE -analyysiä pelkistävissä olosuhteissa. Tyypilliset 0,125 ml:n inkubointitilavuudet : v 100 mM Tris HCl:ssä, pH 7,4, muodostuvat plasminogeenianalogista, esimerkeissä '.. ·, 10 esitettyinä konsentraatioina, ja trombiinista, esimerkeissä esitettyinä konsentraatioi- na. Inkuboinnit suoritettiin 37 °C:ssa. Vertailuinkuboinnit suoritettiin samoissa olo- • * * suhteissa ilman trombiinia. Aktivointireaktiot pysäytettiin saostamalla proteiini li- f · · •;; / säämällä trikloorietikkahappoa, jolloin lopulliseksi konsentraatioksi tuli 20 %, ja * · · ** * seisottamalla 4 C:ssa >4 tuntia. Sitten sakka pelletoitiin, pestiin asetonilla ja lietet- 15 tiin uudelleen SDS PAGE -näytepuskuriin (0,1 m Tris pH 6,8, 10% glyserolia, 1% ! ,i : SDS, 0,5% merkaptoetanolia ja 0,05% bromifenoli-sinistä). Näytteet analysoitiin v : joko 8-25% gradienttigeeleillä tai 12% geeleillä. Saadut geelit analysoitiin käyttäen ,:. SHIMADZU-geeliskanneria, joka skannaa geelin ja laskee proteiinipitoisuuden nau- ’···. hasta määrittämällä alueet huippujen alapuolelta. (Sama SHIMADZU on tavara- 20 merkki). Plasminogeenin pilkkoutumisnopeus määritettiin siten mittaamalla plasmi- ::· nogeeninauhan katoaminen suunnilleen 92 kDa:n kohdalla ja plasmiinin raskaan • · • · * • · * i6 114102 ketjun nauhan katoaminen suunnilleen 66 kDa.n kohdalla.

2. Aktivointianalvvsi 2.1. Kromogeeninen määritys (Linked Chromogenic Assay) 5 Plasminogeenianalogia ja trombiinia inkuboidaan yhdessä kromogeenisen substraatin S2251 ollessa läsnä ja aktivoinnilla tuotettu plasmiini pilkkoo välittömästi S2251 :n johtaen absorbanssin nousuun 405 nm:ssä. Koe suoritetaan 88 pl:n kokonaistilavuudessa puskurissa, joka sisältää 50 mM Tris HCl, 0,1 mM EDTA, 0,005% Triton X100 ja 0,1% HSA. S2251 lisätään lopulliseen pitoisuuteen 0,35 mg/ml ja 10 käytetty plasminogeenianalogikonsentraatio on 3 gg/ml. Käytetty trombiinikonsent-raatio on 4,55 NIHU/ml. 100 ,ul:n eriä reaktiosta poistetaan 37 °C:ssa inkuboinnin aikana ja lisätään 25 pl:aan 4 % etikkahappoa, mikrotitrauslevyihin, reaktion pysäyttämiseksi. Ajan kuluttua umpeen levyt luetaan mikrolevylukijassa 405 nm:n aallonpituudella.

15 2.2. Plasmahvvtvmän liuotuskoe in vitro

Valmistetaan seos, jossa on 50 μΐ kaniinin plasmaa (antikoaguloitu 3.8% trinat-riumsitraatilla), 50 μΐ APTT-reagenssia (Instrumentation Labs) ja sopiva tilavuus-määrä plasminogeenianalogia 0,1 M Tris HCl.ssa, pH 7,4, tilavuuteen 200 μΐ samalla 20 puskurilla 96-kuoppaisen mikrotitrauslevyn kuoppaan. Erillinen kuoppa sisältää 4,4 μΐ 500 mM CaCl2 sekoitettuna 50,6 pl:aan samaa puskuria. Levyä inkuboidaan 37 °C:ssa 30 minuuttia ja hyytyminen käynnistetään siirtämällä 50 μΐ CaCL:a kuoppaan, joka sisältää plasminogeenianalogia. Hyytymän muodostumisen ja liukenemisen edistymistä seurataan mittaamalla absorbanssi 405 nm:ssä (viitearvo 620 nm) 25 aika ajoin jatkuvan 37 °C:ssa 1 tunnin kestävän inkuboinnin aikana.

» * I t · *... Seq. I.D.:t • · • · * .* 1 Cys Thr Thr Lys Ile Lys Pro Arg lie Vai (jly Giv Cys » · · ··/. 2 Vai Vai Glv Gly Cys Vai Ala His Pro His Ser Trp Pro Trp Gin Vai

Ser Leu Arg Thr Arg Phe Gly Met His Phe Cys Gly Gly Thr Leu Ile Ser : Pro Glu Trp Vai Leu Thr Ala Ala His Cys Leu Glu Lys Ser Pro Arg Pro • * * ·

Ser Ser Tyr Lys Vai Ile Leu Gly Ala His Gin Glu Vai Asn Leu Glu Pro His Gly Gin Glu Ile Glu Vai Ser Arg Leu Phe Leu Glu Pro Thr Arg Lys ,···, Asp Ile Ala Leu Leu Lys Leu Ser Ser Pro Ala Vai Ile Thr Asp Lys Vai Ile Pro Ala Cys Leu Pro Ser Pro Asn Tyr Vai Vai Ala Asp Arg Thr Glu Cys I f · i7 114102

Phe IJe Thr Glv Trp Glv Glu Thr Gin Gly Thr Phe Glv Ala Gly Leu Leu Lys Glu Ala Gin Leu Pro Vai Ile Glu Asn Lys Val Cvs Asn Arg Tyr Glu Phe Leu Asn Gly Arg Val Gin Ser Thr Glu Leu Cys Ala Glv His Leu Ala Gly Gly Thr Asp Ser Cys Gin Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cvs Phe Glu Lys Asp Lys Tyr He Leu Gin Gly Val Thr Ser Trp Gly Leu Glv Cys Ala Arg Pro Asn Lys Pro Gly Val Tyr Val Arg Val Ser Arg Phe Val Thr Trp lie Glu Gly Val Met Arg Asn Asn 3 5'CTT GGG GAC TTC TTC AAG CAG TGG3' 4 5GACCCCCCTACGATTCTAGGTTTAATTTTAGTTGTACATTT CTTCGGC3' 5 S'GTTCGAGATTCACi 1 fT'TGGTGTGCACS' 6 Ala Val Val Pro Arg Val Val Glv Glv Ala 7 5’ CTAGGTACAACCGCTTTCTTCGGCT 3' 8 5’ GGTGGGCCACCGCCCCCCCCAC 3' 9 Cvs Val Val Pro Arg Val Val Glv Glv Cvs 10 Ala Gly Gin Lys Thr Leu Arg Pro Arg Val Val Gly Gly Ala 11 Ala Thr Thr Lys lie Lys Pro Arg He Val Gly Gly Ala 12 Ala Leu Arg Pro Arg Val Val Gly Gly Ala 13 5' CAACCCTAGGTCTAAGTGTTTTCTGACCCGCTTTCTTCG 3' H·;. 14 5' CAACCCTAGGTTTGATCTTCGTTGTCGCTTTCTTCG 3' 15 5' CACAACCCTAGGTCTAAGCGCTTTCTTCGG 3' : 16 Cys Val Glu Leu Gin Gly He Lys Pro Arg lie Val Gly Gly Cys 17 5'GATTCTAGGTTTAATGCCCTGCAGTTCCACACATTTCTTCGG3' V · 18 Cys Val Glu Leu Gin Gly Leu Arg Pro Arg Val Val Gly Gly Cys 19 5' CACCCCCCTACCACTCTGGGTCTCAGGCCCTGCAGTTCC 3' 20 5’ CCCTGCGGAGAGTTGGATGGATTCCTGC 3' V : 21 5' GAAGTGCATTCCTCTCCTCGTACGAAG 3' ·:· 22 5' CCACAGAAGTGTCTTCCAAACCTCG 3' III· • · · I 1 • « · · • · # t I I • · I · » · · * · · • 1

Claims (11)

1. Analogiamenetelmä trombiinin vaikutuksesta pilkkoutuvan plasminogeeniana-login valmistamiseksi, tunnettu siitä, että: 5 a) isäntäsolu transformoidaan tai transfektoidaan replikoituvalla ekspressiovekto-rilla, joka käsittää nukleiinihapon, joka koodaa plasminogeenianalogia, joka voidaan aktivoida trombiinilla niin, että sillä on plasmiiniaktiivisuus, joka plasminogeeniana-logi sisältää pilkkomiskohtasekvenssin P4-P3-Pro-Arg-Pl'-P2', joka korvaa natiivi-plasminogeenin pilkkomiskohtasekvenssin ja jossa P3 on jokin emäksinen amino-10 happotähde, P4 on jokin hydrofobinen aminohappotähde ja ΡΓ ja P2' ovat muista riippumatta hapottomia aminohappotähteitä, mainitun pilkkomiskohtasekvenssin voidessa pilkkoutua trombiinin vaikutuksesta Arg:n ja Pl':n välistä; b) mainittua isäntäsolua viljellään riittävän pitkän ajan ja riittävissä olosuhteissa, jotta mainittua plasminogeenianalogia koodaava geeni pääsee ilmentymään; 15 c) otetaan talteen mainittu plasminogeenianalogi.

2. Förfarande enligt patentkrav 1, kännetecknat av att i nämnda plasminogen-analog är nämnda alkaliska aminosyrarest P3 en lysin- eller argininrest, nämnda hydrofoba aminosyrarest P4 är valin, isoleucin eller leucin och nämnda syrafria aminosyrarester PI' och P2' är oberoende av andra valiner, isoleuciner eller leuciner. 5 3. Förfarande enligt patentkrav 1, kännetecknat av att i nämnda plasminogen- analog är spjälkpunktsekvensen vald ur en grupp, som bildas av: Cys Thr Thr Lys Ile Lys Pro Arg Ile Vai Gly Gly Cys 1 5 10 eller Cys Vai Glu Leu Gin Gly Ile Lys Pro Arg Ile Vai Gly Gly Cys 10 1 5 10 15 eller Cys Vai Glu Leu Gin Gly Leu Arg Pro Arg Vai Vai Gly Gly Cys 1 5 10 15 och den är i en position, som motsvarar Cys(588)-Cys(566)-positionen hos nativ-plasminogenens spjälkningspunktsekvens. 15 4. Förfarande enligt vilket som heist av patentkraven 1-3, kännetecknat av att i nämnda plasminogenanalog är förutom ersättning av nämnda spjälkningspunktsekvens dessutom den ena eller bäda av aminosyror motsvarande nativplasminogenens ,.. : aminosyror Cys(558) och Cys(566) ersatta med en alanin- eller serinrest (-rester). * I · :"'; 5. Förfarande enligt patentkrav 4, kännetecknat av att i nämnda plasminogen- .·. : 20 analog är spjälkningspunktsekvensen vald ur en grupp, som bildas av: : Ala Thr Thr Lys Ile Lys Pro Arg Ile Vai Gly Gly Ala 0 : 1 5 10 .;, eller Ala Gly Gin Lys Thr Leu Arg Pro Arg Vai Vai Gly Gly Ala 1 10 25 eller Ala Leu Arg Pro Arg Vai Vai Gly Gly Ala 1 5 10 : V: eller Ala Thr Thr Lys Ile Lys Pro Arg Ile Vai Gly Gly Ala 1 5 10 114102 och den är i en position, som motsvarar Cys(588)-Cys(566)-positionen hos nativplas-minogenens spjälkningspunktsekvens.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainitussa plasminogeenianalogissa mainittu emäksinen aminohappotähde P3 on lysiini- tai arginiinitähde, mainittu hydrofobinen aminohappotähde P4 on väliini, isoleusiini tai 20 leusiini ja mainitut hapottomat aminohappotähteet ΡΓ ja P2' ovat muista riippumatta valiineja, isoleusiineja tai leusiineja.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainitussa . plasminogeenianalogissa pilkkomiskohtasekvenssi on valittu ryhmästä, jonka muo- 25 dostavat: :" ’: Cys Thr Thr Lys Ile Lys Pro Arg Ile Vai Gly Gly Cys 1 5 10 I I · . *: ·, tai Cys Vai Glu Leu Gin Gly Ile Lys Pro Arg Ile Vai Gly Gly Cys V 30 1 5 10 15 ► $ •;;; tai Cys Vai Glu Leu Gin Gly Leu Arg Pro Arg Vai Vai Gly Gly Cys 15 10 15 '..! ja se on asemassa, joka vastaa natiiviplasminogeenin pilkkomiskohtasekvenssin

35 Cys(558) - Cys(566) asemaa. * « * · I 19 114102

4. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainitussa plasminogeenianalogissa mainitun pilkkomiskohtasekvenssin korvaamisen lisäksi toinen natiiviplasminogeenin aminohappoja Cys(558) ja Cys(566) vastaavista aminohapoista tai ne molemmat on korvattu alaniini- tai seriinitähteellä 5 (-tähteillä).

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainitussa plasminogeenianalogissa pilkkomiskohtasekvenssi on valittu ryhmästä, jonka muodostavat:

10 Ala Thr Thr Lys Ile Lys Pro Arg Ile Vai Gly Gly Ala 1 5 10 tai Ala Gly Gin Lys Thr Leu Arg Pro Arg Vai Vai Gly Gly Ala 1 10 tai Ala Leu Arg Pro Arg Vai Vai Gly Gly Ala 15 1 5 10 tai Ala Thr Thr Lys Ile Lys Pro Arg Ile Vai Gly Gly Ala 1 5 10 ja se on asemassa, joka vastaa natiiviplasminogeenin pilkkomiskohtasekvenssin Cys(558) - Cys(566) asemaa. 20 ,. j 6. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, ; ·. että mainitussa plasminogeenianalogissa on mainitun pilkkomiskohtasekvenssin li- ’ · · ·. säksi yksi tai useampi seuraavista natiiviplasminogeenin (SEQ ID NO:2) seriinipro- • · teaasidomainin korvausmutaatioista: Glu-62 Lys tai Ala, Ser-17 Leu, Arg-19 Glu .* .* 25 tai Ala tai Glu-45 Lys, Arg tai Ala. • ♦ · *·* " 7. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainitussa plasminogeenianalogissa on mainitun pilkkomiskohtasekvenssin .,;; * lisäksi yksi tai useampi seuraavista natiiviplasminogeenisekvenssin korvausmutaa- : 30 tioista: Phe(583) Arg, Met(585) Arg, Glu(606) Lys, Glu(623) Lys, Asp(137) Ser :v. tai Asp(l39) Ser. *;* 8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainitussa i t ·.·'.· plasminogeenianalogissa on mainitun pilkkomiskohtasekvenssin lisäksi N-terminaa-

35 Unen tylpistys, joka vastaa lys-plasminogeenimuotoja. 20 114102

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainitussa plasminogeenianalogissa mainitun pilkkomiskohtasekvenssin lisäksi on poistettu aminohappotähteet, jotka vastaavat natiiviplasminogeenin aminoterminaalisia 5 aminohappoja 68, 77 tai 78.

10. Patenttivaatimuksen 4 tai 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainitussa plasminogeenianalogissa pilkkomiskohtasekvenssi on: Cys Thr Thr Lys Ile Lys Pro Arg Ile Vai Gly Gly Cys 10 1 5 10 ja se on asemassa, joka vastaa natiiviplasminogeenin pilkkomiskohtasekvenssin Cys(558) - Cys(566) asemaa, ja että natiiviplasminogeenin Glu(606) ja Glu(623) on molemmat korvattu lysiinitähteillä.

11. Patenttivaatimuksen 4 ja 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainitussa plasminogeenianalogissa pilkkomiskohtasekvenssi on: Cys Vai Glu Leu Gin Gly Leu Arg Pro Arg Vai Vai Gly Gly Cys 1 5 10 15 ja se on asemassa, joka vastaa natiiviplasminogeenin pilkkomiskohtasekvenssiä 20 Cys(558) - Cys(566), ja että natiiviplasminogeenin Met(585) on korvattu arginiini- tähteellä. : . Patentkrav ;' . 1. Analogförfarande för att framställa en plasminogenanalog som spjälks under • · « *· ' effekten av trombin, kännetecknat av att: • · · i 25 a) man transformerar eller transfekterar en värdcell med en replikerande expressions- * t < v : vektor, som innefattar nukleinsyra, vilken kodar plasminogenanalogen, som kan ak- tiveras med trombin, sä att den har en plasminaktivitet, vilken plasminogenanalog in-_^· nehäller en spjälkningspunktsekvens P4-P3-Pro-Arg-Pl'-P2', som ersätter nativplas- minogenens spjälkningspunktsekvens och varvid P3 är en alkalisk aminosyrarest, P4 . 30 är en hydrofob aminosyrarest och PI 'och P2' är var och en oberoende av andra syra- *.,; fria aminosyrarester, varvid nämnda spjälkningspunktsekvens kan spjälkas mellan ' -; · ‘ Arg och P Γ med trombin; : Y: b) nämnda värdcell odlas tillräckligt länge och under tillräckliga förhällanden, sä att : en gen som kodar nämnda plasminogenanalog kan uttryckas; 35 c) nämnda plasminogenanalog tas tili vara. 114102

6. Förfarande enligt vilket som heist av patentkraven 1-5, kännetecknat av att i nämnda plasminogenanalog finns förutom nämnda spjälkningspunktsekvens en eller 5 flera av följande substitutionsmutationer av nativplasminogenens (SEQ ID NO:2) serinproteasdomän: Glu-62 Lys eller Ala, Ser-17 Leu, Arg-19 Glu eller Ala eller Glu-45 Lys, Arg eller Ala.

7. Förfarande enligt vilket som heist av patentkraven 1-6, kännetecknat av att i nämnda plasminogenanalog finns förutom nämnda spjälkningspunktsekvens en eller 10 flera av följande substitutionsmutationer av nativplasminogensekvens: (Phe583) Arg, (Met585) Arg, Glu(606) Lys, Glu(623) Lys, Asp(137) Ser eller Asp(139) Ser.

8. Förfarande enligt patentkrav 1, kännetecknat av att i nämnda plasminogenanalog finns förutom nämnda spjälkningspunktsekvens en N-terminal avtrubbning, som motsvarar lys-plasminogenformer. 15

9. Förfarande enligt patentkrav 8, kännetecknat av att i nämnda plasminogen analog är förutom nämnda spjälkningspunktsekvens ocksä de aminosyrarester av-lägsnade, vilka motsvarar nativplasminogenens aminoterminala aminosyror 68, 77 eller 78.

• *’ 10. Förfarande enligt patentkrav 4 eller 7, kännetecknat av att i nämnda plasmino- 20 genanalog är spjälkningspunktsekvensen: Cys Thr Thr Lys Ile Lys Pro Arg Ile Vai Gly Gly Cys ; l 5 ίο .och den är i en position, som motsvarar Cys(588)-Cys(566)-positionen hos nativplas- *· t minogenens spjälkningspunktsekvens, och att nativplasminogenens Glu(606) och T 25 Glu(623) bäda är ersatta med lysinrester.

• · · ‘ ‘ 11. Förfarande enligt patentkrav 4 och 7, kännetecknat av att i nämnda plasmino- : V: genanalog är spjälkningspunktsekvensen: «il