HU216870B - Eljárás szöveti plazminogén aktivátor előállítására - Google Patents

Eljárás szöveti plazminogén aktivátor előállítására Download PDF

Info

Publication number
HU216870B
HU216870B HU903267A HU326790A HU216870B HU 216870 B HU216870 B HU 216870B HU 903267 A HU903267 A HU 903267A HU 326790 A HU326790 A HU 326790A HU 216870 B HU216870 B HU 216870B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
ser
gly
leu
arg
pro
Prior art date
Application number
HU903267A
Other languages
English (en)
Other versions
HU903267D0 (en
HUT54734A (en
Inventor
Stephan Fischer
Ulrich Kohnert
Ulrich Martin
Rainer Rudolph
Anne Stern
Original Assignee
Roche Diagnostics Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Roche Diagnostics Gmbh filed Critical Roche Diagnostics Gmbh
Publication of HU903267D0 publication Critical patent/HU903267D0/hu
Publication of HUT54734A publication Critical patent/HUT54734A/hu
Publication of HU216870B publication Critical patent/HU216870B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6456—Plasminogen activators
    • C12N9/6459—Plasminogen activators t-plasminogen activator (3.4.21.68), i.e. tPA
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6456—Plasminogen activators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21069—Protein C activated (3.4.21.69)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
  • Luminescent Compositions (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Abstract

A találmány tárgya eljárás szöveti plazminőgén aktivátőr- (t–PA-)származék előállítására, mely nem glikőzilezett, és az alábbiaminősavszekvenciával rendelkezik: ŕ

Description

A találmány foglalkozik egy új t-PA-származékkal, egy olyan DNS-szekvenciával, amely ezt az új t-PAszármazékot kódolja, egy olyan kifejező plazmiddal, amely a t-PA-származékot kódoló DNS-szekvenciát tartalmazza; foglalkozik továbbá egy eljárással a nevezett plazmid előállítására, eljárással a t-PA-származék előállítására és egy, a nevezett t-PA-származékot tartalmazó alvadásgátló szerrel.
Az alvadt vér fő komponensként a polimer fibrin fehérjemátrixát tartalmazza. A fibrin egy fibrinolitikus rendszer révén fiziológiás viszonyok között egy olyan reakciósorban („kaszkád”) oldódik fel, amely a véralvadáshoz hasonlít. A központi reakció itt a plazminogén aktiválása plazminná, amely például a szöveti plazminogén aktivátor (t-PA, tissue type plasminogen activator) segítségével megy végbe. A plazmin viszont oldja a fibrint, amely az alvadt vér fehérjemátrixának fő komponense. A természetes vagy eukariótákban géntechnológiai úton előállított és onnan kivont t-PA en50 zim aktivitása, nevezetesen a plazminogén katalitikus aktiválása plazminná, a fibrin vagy fibrinogén hasítási termékek távollétében nagyon csekély; ezeknek a fehérjéknek a jelenlétében viszont jelentősen emelkedhet akár több, mint tízszeresére is.
A t-PA a vérben jelen levő proteázok révén egy A és egy B láncra hasad. A két láncrész egy ciszteinhíddal marad összekötve. A t-PA aktivitásának stimulálhatósága döntő előny a többi ismert plazminogén aktivátorral, például az urokinázzal vagy a streptokinázzal szemben [lásd például Hoylaerts és munkatársai: J.
HU 216 870 Β
Bioi. Chem. 257, 2912-2919 (1982); Nieuwenhuizen
W. és munkatársai: Biochem. Biophys. Acta 755, 531-533 (1983)].
A t-PA in vivő hatásmechanizmusát például Korniger és Collen írják le [Thromb. Hámostasis 46, 561-565 (1981)]. Az enzimek fibrinfelületekre összpontosuló aktivitása miatt ez előnyös szemek tűnt a patológiás érelzáródások (például szívinfarktusnál) elleni harcban, amint ezt klinikai kísérletekkel igazolni is tudták [Collen és munkatársai: Circulation 70, 1012 (1984); Circulation 73, 511 (1986)].
A t-PA hátrányaként viszont figyelembe kell venni plazmakoncentrációjának gyors leesését, vagyis nagy kiürülésí sebességét (clearance rate). Ennek eredménye az, hogy nagy mennyiségű t-PA-ra van szükség, hogy in vivő a trombusok hatásos oldódását érjük el. A magas kezelési adagok pedig mellékhatásokat okozhatnak, például vérzékenységet.
A 0 196920 lajstromszámú európai szabadalmi leírás ismerteti a t-PA-nak egyik természetes bomlástermékét, amely a t-PA-nak már csak a 2. horog- és proteáztartományát tartalmazza, és amelynek N-terminális aminosava a 160. alanin, a Pennica és munkatársai által leírt aminosavszekvenciát véve figyelembe [Natúré 301, 214-221 (1983)]. Ennek a t-PA bomlásterméknek a kiürülés! sebessége azonban nem különbözik jelentősen a természetes t-PA kiürülési sebességétől. A katalitikus hatásnak egy blokkoló csoport bevezetésével történő kémiai módosítása révén itt lehet ja10 vulást elérni.
A találmány feladata tehát a t-PA megváltoztatása olyan módon, hogy a létrejövő származéknak jelentősen csökkent kiürülési sebessége és ennek megfelelően a vérplazmában meghosszabbodott félélettartama le15 gyen. A trombuslizáló hatásnak és a fibrin révén történő stimulálhatóságnak viszont meg kell maradnia.
A találmány tehát olyan szöveti plazminogén aktivátorral (t-PA-származék, amelyet a későbbiekben KlK2P-nek is nevezünk) foglalkozik, amely nincs gli20 kozilezve és aminosavszekvenciája az alábbi:
(M)
Ser Tyr Gin Val Ile Asp Thr Arg Alá Thr Cys Tyr Glu Asp Gin 15 Gly
5 10
Ile Ser Tyr Arg Gly Thr Trp Ser Thr Alá Glu Ser Gly Alá Glu Cys
20 25 30
Thr Asn Trp Asn Ser Ser Alá Leu Alá Gin Lys Pro Tyr Ser Gly Arg
35 40 45
Arg Pro Asp Alá Ile Arg Leu Gly Leu Gly Asn His Asn Tyr Cys Arg
50 55 60
Asn Pro Asp Arg Asp Ser Lys Pro Trp Cys Tyr Val Phe Lys Alá Gly
65 70 75 80
Lys Tyr Ser Ser Glu Phe Cys Ser Thr Pro Alá Cys Ser Glu Gly- Asn
85 90 95
Ser Asp Cys Tyr Phe Gly Asn Gly Ser Alá Tyr Arg Gly Thr His Ser
100 105 110
Leu Thr Glu Ser Gly Alá Ser Cys Leu Pro Trp Asn Ser Met Ile Leu
115 120 125
Ile Gly Lys Val Tyr Thr Alá Gin Asn Pro Ser Alá Gin Alá Leu Gly
130 135 140
Leu Gly Lys His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Asp Alá Lys Pro
145 150 155 160
Trp Cys His Val Leu Lys Asn Arg Arg Leu Thr Trp Glu Tyr Cys Asp
165 170 175
Val Pro Ser Cys Ser Thr Cys Gly Leu Arg Gin Tyr Ser Gin Pro Gin
180 185 190
Phe Arg Ile Lys Gly Gly Leu Phe Alá Asp Ile Alá Ser His Pro Trp
195 200 205
Gin Alá Alá Ile Phe Alá Lys His Arg Arg Ser Pro Gly Glu Arg Phe
210 215 220
Leu Cys Gly Gly Ile Leu Ile Ser Ser Cys Trp Ile Leu ?er Alá Alá
225 230 235 240
HU 216 870 Β
His Cys Phe Gin Glu Arg Phe Pro Pro His His Leu Thr Val Ile 255 Leu
245 250
Gly Arg Thr Tyr Arg Val Val Pro Gly Glu Glu Glu Gin Lys Phe Glu
260 265 270
Val Glu Lys Tyr Ile Val His Lys Glu Phe Asp Asp Asp Thr Tyr Asp
275 280 285
Asn Asp He Ala Leu Leu Gin Leu Lys Ser Asp Ser Ser Arg Cys Ala
290 295 300
Gin Glu Ser Ser Val Val Arg Thr Val Cys Leu Pro Pro Ala Asp Leu
305 310 315 320
Gin Leu Pro Asp Trp Thr Glu Cys Glu Leu Ser Gly Tyr Gly Lys His
325 330 335
Glu Ala Leu Ser Prc· Phe Tyr Ser Glu Arg Leu Lys Glu Ala His Val
340 345 350
Arg Leu Tyr Pro Ser Ser Arg Cys Thr Ser Gin His Leu Leu Asn Arg
355 360 365
Thr Val Thr Asp Asn Met Leu Cys Ala Gly Asp Thr Arg Ser Gly Gly
370 375 380
Pro Gin Ala Asn Leu His Asp Ala Cys Gin Gly Asp Ser Gly Gly Pro
385 390 395 400
Leu Val Cys Leu Asn Asp Gly Arg Met Thr Leu Val Gly Ile Ile Ser
405 410 415
Trp Gly Leu Gly Cys Gly Gin Lys Asp Val Pro Gly Val Tyr Thr Lys
420 425 430
Val Thr Asn Tyr Leu Asp Trp Ile Arg Asp Asn Met Arg Pro
435 440 445
Meglepő módon megállapítottuk, hogy a natív t-PA-ban meglevő további tartományok kiiktatásának nincs befolyása a fehérjék trombolitikus hatékonyságára, és a mutein fibrinfüggő stimulálhatósága azonos a natív t-PA-éval.
A találmány foglalkozik továbbá azzal a DNS-szek35 venciával, amely a találmány szerinti t-PA-származékot kódolja, és amelynek aminosavszekvenciája az alábbi:
ATGTCTTACCAAGTGATCGATACCAGGGCCACGTGCTACGAGGACCAGGGCATCAGCTAC
AGGGGCACGTGGAGCACAGCGGAGAGTGGCGCCGAGTGCACCAACTGGAACAGCAGCGCG
TTGGCCCAGAAGCCCTACAGCGGGCGGAGGCCAGACGCCATCAGGCTGGGCCTGGGGAAC
CACAACTACTGCAGAAACCCAGATCGAGACTCAAAGCCCTGGTGCTACGTCTTTAAGGCG
GGGAAGTACAGCTCAGAGTTCTGCAGCACCCCTGCCTGCTCTGAGGGAAACAGTGACTGC
TACTTTGGGAATGGGTCAGCCTACCGTGGCACGCACAGCCTCACCGAGTCGGGTGCCTCC
TGCCTCCCGTGGAATTCCATGATCCTGATAGGCAAGGTTTACACAGCACAGAACCCCAGT
GCCCAGGCACTGGGCCTGGGCAAACATAATTACTGCCGGAATCCTGATGGGGATGCCAAG
CCCTGGTGCCACGTGCTGAAGAACCGCAGGCTGACGTGGGAGTACTGTGATGTGCCCTCC
TGCTCCACCTGCGGCCTGAGACAGTACAGCCAGCCTCAGTTTCGCATCAAAGGAGGGCTC
TTCGCCGACATCGCCTCCCACCCCTGGCAGGCTGCCATCTTTGCCAAGCACAGGAGGTCG
CCCGGAGAGCGGTTCCTGTGCGGGGGCATACTCATCAGCTCCTGCTGGATTCTCTCTGCC
GCCCACTGCTTCCAGGAGAGGTTTCCGCCCCACCACCTGACGGTGATCTTGGGCAGAACA
TACCGGGTGGTCCCTGGCGAGGAGGAGCAGAAATTTGAAGTCGAAAAATACATTGTCCAT
AAGGAATTCGATGATGACACTTACGACAATGACATTGCGCTGCTGCAGCTGAAATCGGAT
HU 216 870 Β
TCGTCCCGCTGTGCCCAGGAGAGCAGCGTGGTCCGCACTGTGTGCCTTCCCCCGGCGGAC CTGCAGCTGCCGGACTGGACGGAGTGTGAGCTCTCCGGCTACGGCAAGCATGAGGCCTTG TCTCCTTTCTATTCGGAGCGGCTGAAGGAGGCTCATGTCAGACTGTACCCATCCAGCCGC TGCACATCACAACATTTACTTAACAGAACAGTCACCGACAACATGCTGTGTGCTGGAGAC ACTCGGAGCGGCGGGCCCCAGGCAAACTTGCACGACGCCTGCCAGGGCGATTCGGGAGGC CCCCTGGTGTGTCTGAACGATGGCCGCATGACTTTGGTGGGCATCATCAGCTGGGGCCTG GGCTGTGGACAGAAGGATGTCCCGGGTGTGTACACAAAGGTTACCAACTACCTAGACTGG ATTCGTGACAACATGCGACCG 1341
A találmány szerint előállított DNS-szekvencia a találmány szerinti t-PA-származék kifejezésére szolgál, amikor egy kifejező plazmidban helyezkedik el. Egy ilyen kifejező plazmid a találmány további tárgya, akárcsak az a kifejező plazmid, amely egy ettől eltérő DNS-szekvenciát tartalmaz, de amely ugyancsak a találmány szerinti t-PA-származékot kódolja.
A genetikai kód degenerációja miatt a bemutatott DNS-szekvenciától eltérő szekvenciák tartozhatnak ide.
A kifejező plazmid egy replikációs origón (origin of replication) kívül tartalmaz előnyösen - a t-PA-származékot kódoló szekvencia mellett - kiegészítésként még egy szabályozható promotorszerkezetet (például tac-promotor), egy hatékony terminátort (például fd), és egy szelekciós markert (például β-laktamáz gén).
A találmány foglalkozik továbbá a pA33 plazmiddal. Ennek a plazmidnak az előállítását az 1. példában írjuk le; ez a plazmid egy olyan DNS-szekvenciát tartalmaz, amely a találmány szerinti t-PA-származékot kódolja.
A találmány további tárgya másrészt egy eljárás kifejező plazmidok előállítására; az eljárást az jellemzi, hogy valamely DNS-szekvenciát, amely a találmány szerinti t-PA-fehérjét vagy annak valamely származékát - amely az I. horog-, a II. horog- és a proteáztartományon kívül rendelkezik a t-PA fehérje még további területeivel is - kódolja, valamely plazmidba beviszünk, és irányított mutagenezissel eltávolítjuk azokat a területeket, amelyek azokat az aminosavakat kódolják, amelyek a találmány szerinti t-PA-származékban nincsenek jelen.
Annak a plazmidnak, amelybe a találmány szerinti t-PA-származékot kódoló DNS-szekvenciát bevisszük, kiválasztása függ a származék kifejezéséhez később alkalmazandó gazdasejttől. A megfelelő plazmidok, valamint azok a minimális követelmények, amelyek egy ilyen plazmidhoz szükségesek (például replikációs origó, restrikciós hasítóhelyek) a szakember számára ismertek. A találmány keretében plazmid helyett alkalmazhatunk valamely kozmidot, fágok (λ, Ml3) replikatív, kétszálú formáját, vagy más, szakember számára ismert vektorokat is. A helyre irányított mutagenezis (site-directed mutagenesis) eljárást Morinaga és munkatársai írják le [Biotechnology 21, 634 (1984)], és lényegében úgy végezzük el, ahogyan ott leírták.
A találmány további tárgya eljárás egy találmány szerinti t-PA-származék előállítására; az eljárást az jellemzi, hogy valamely találmány szerinti plazmidot megfelelő gazdasejtben kifejezünk és a terméket a tenyészközegből, vagy a gazdasejtek feltárása után abból a folyadékból, amelyben a feltárást végeztük (például puffer vagy maga a tenyészközeg), kinyeqük. A találmány sze15 rinti t-PA-származék előállításához gazdasejtként előnyösen prokarióta sejteket alkalmazunk. Ennél különösen előnyös, ha az itt képződő úgynevezett „zárványtestek”-et („inclusion bodies”, oldhatatlan fehérjeaggregátumok) először az oldható sejtrészektől elválasztjuk, a t-PA-t tartalmazó zárványtesteket guanidin-hidrokloriddal végzett kezeléssel szolubilizáljuk, utána oxidált glutationnal származékba visszük, végül a t-PA-származékot L-arginin és guanidin-hidroklorid hozzáadásával természetes állapotba hozzuk (renaturáljuk). A t-PA aktiválásáról zárványtestekből hozzáférhető pontos leírás például az alábbi európai szabadalmi közzétételi iratokban: EP-A 0219 874 és EP-A 0241022. Bármilyen más eljárás aktív fehérjék kinyerésére zárványtestekből ugyanúgy alkalmazható a találmányunk szerinti eljárás munkamenetében.
A találmányunk szerinti eljárást előnyösen L-arginin jelenlétében, elsősorban 25-1000 mmol/l közti koncentrációjú L-arginin jelenlétében végezzük.
Az idegen fehérjéktől történő elválasztást a talál35 mány egyik előnyös kiviteli módjában affinitáskromatográfiával végezzük ÉTI („Erythrina-Trypsin-Inhibitor”) adszorpciós oszlopon. Ennél az ÉTI valamely hordozóanyagon (adszorbensen), például BrCN-szefarózon van rögzítve. Az ETI-adszorpciós oszlopon végzett tisz40 tításnak az az előnye, hogy az ETI-adszorpciós oszlop anyaga közvetlenül a koncentrált reoxidációs kiindulási anyaggal terhelhető még nagyon magas, akár 0,8 mol/1 fölötti argininkoncentráció jelenlétében is. A p-t-PA aggregálódását, amely az alacsonyabb argininkoncent45 rációnál, 25 mmol/l alatt, végbemehet, ilyen módon elkerülhetjük. Különösen előnyösen megy végbe ezért a p-t-PA-készítmény tisztítása ETI-adszorpciós oszlopon 0,2-1,0 mol/1, még előnyösebben 0,5-1,0 mol/1 arginin jelenlétében. A KlK2P/Pro-t (mely a K1K2P előnyös változata) tartalmazó oldat pH-ja eközben előnyösen 6,5-nál magasabb, még előnyösebben 7-nél magasabb.
Az ETI-oszlopról történő elúció pH-csökkenés mellett történik arginin jelenlétében olyan körülmények kö55 zött, amelyek a prokariótákban kifejezett t-PA jó oldhatóságát teszik lehetővé. A pH az elúciónál előnyösen a savas tartományban van, különösen előnyösen a 4-6 közti tartományban.
A találmány szerint előállított K1K2P/Pro készít60 mény fajlagos t-PA-aktivitása a 0,4-106 NE/mg fölötti
HU 216 870 Β tartományban, előnyösen a 0,6-106 NE/mg fölötti tartományban van, és az aktivitás stimulálhatósága fibrinogén hasítási termékekkel több, mint tízszeres, előnyösen több, mint húszszoros (aktivitás fibrinogén peptidek jelenlétében / aktivitás fibrinogén peptid nélkül). A találmány szerinti készítmények tisztasága 90%-nál, előnyösen 95%-nál, még előnyösebben 98%-nál nagyobb.
A találmány szerinti t-PA-származék ezért különösen alkalmas a gyógyászatban való felhasználásban alvadt vérrögök feloldására; a találmány foglalkozik az ilyen jellegű gyógyszerkészítményekkel is.
Az alábbi példák további magyarázattal szolgálnak a találmányhoz, a mellékelt ábrákkal együtt.
Az 1. ábra vázlatosan bemutatja a pA33 plazmid előállítását.
A 2. ábra a t-PA-aktivitás plazmabeli koncentrációjának időbeli lefutását mutatja be a kereskedelemben kapható t-PA (ACTILYSE) intravénás bóluszinjekciója után, összehasonlítva a találmány szerinti t-PA-származékkal, az összefüggést lineáris függvényben ábrázolva.
A 3. ábra ugyanezt mutatja be, de a koncentrációlefutást logaritmikus függvényben ábrázolva.
1. példa
A pA33 plazmid megalkotása
Kiindulási plazmidként a pePa 133 plazmid szolgál, amelyet az EPA 0 242 836 számú európai szabadalmi közrebocsátási irat ír le. Az összes kísérleti lépést a specifikus mutagenezishez, azaz az F és E tartományok kiiktatását a pePa 133-ból (lásd 1. ábra) lényegében Morinaga és munkatársai eljárását [Biotechnologie 21, 634 (1984)] felhasználva végezzük el. Ehhez a pePA 133-nél két hasítási toldatot létesítünk. Az A toldatot EcoRI-gyel hasítjuk és a legnagyobb fragmentumot izoláljuk. A B toldatot Xhol-gyel hasítjuk és így a terméket linearizáljuk. A heteroduplex készítéséhez az alábbi oligonukleotidot alkalmazzuk:
5’ TAC CAA GTG ATC GAT ACC AGG GCC 3’
A fent nevezett mutagenezis-oligonukleotiddal végzett telephibridizálással olyan kiónokat azonosítunk, amelyek a keresett pA33 plazmidot tartalmazzák. Ezt a plazmidot restrikciós elemzéssel azonosítjuk és az Sspl-restrikciós hasítási hely hiányára ellenőrizzük, amely hasítási hely a t-PA kifejező kazetta ujjtartományt kódoló részében fekszik.
2. példa
Aktív K1K2P/Pro előállítása E. coli-bői
a) A sejt lizálása és a zárványtestek (ZT) előállítása
1,6 kg nedves sejtmasszát (E. coli DSM 3689), amely a pA33 plazmiddal van transzformálva, 10 1, 4 °C hőmérsékletű, 0,1 mol/1 trisz-HCl-t, 20 mmol/1 EDTA-t tartalmazó oldatban (pH 6,5) szuszpendáljuk. Ehhez 2,5 g lizozimot adunk és 4 °C hőmérsékleten 30 percig inkubáljuk; ezután teljes sejtfeltárást végzünk nagynyomású diszpergálással. A feltáró oldathoz 5 1 oldatot keverünk, amely 0,1 mol/1 triszHCl-ből, 20 mmol/1 EDTA-ból, 6% Triton XI00ból és 1,5 mol/1 NaCl-ból áll (pH 6,5), és tovább inkubálunk 30 percen át 4 °C hőmérsékleten. Ezután következik az állomány oldhatatlan részeinek (ZT) elválasztása centrifúgálással.
Az üledéket 10 liter olyan oldatban szuszpendáljuk, amely 0,1 mol/1 trisz-HCl-ből és 20 mmol/1 EDTA-ból áll (pH 6,5), majd 30 percen át 4 °C hőmérsékleten inkubáljuk és ezután a ZT készítményt centrifúgálással izoláljuk.
b) A ZT szolubilizálása
8,7 g ZT-t (nedves tömeg) 100 ml olyan oldatban szuszpendálunk, amely 0,1 mol/1 trisz-ből, 6 mol/1 guanidinből és 0,1 mol/1 DTE-ből áll (pH 7,5), majd 30 percen át 25 °C hőmérsékleten kevertetjük.
A pH-érték beállítás után 3-ra (25%-os HCl-oldattal) dialízist végzünk 4 mol/1 guanidin HCl-lel (pH 2,5) szemben (3x3 liter, 24 óra, 4 °C hőmérséklet).
c) Származékképzés
A fent nevezett dializátumot oxidált glutationra (GSSG) 50 mmol/l-re és trisz-re 100 mmol/l-re beállítjuk és a pH-értéket 5 mol/l-es NaOH-oldattal 7,5-re titráljuk. A keletkezett keveréket 90 percig inkubáljuk 25 °C hőmérsékleten. A pH-értéket 3-ra állítjuk be 25%-os HCl-lel, majd dialízist végzünk 10 mmol/1 HCl-lel szemben (3x100 ml, 48 óra, 4 °C hőmérséklet).
d) Renaturálás literes reakcióedényt megtöltünk 0,8 mol/1 Arg/HCl-t (pH 8,5), 1 mmol/1 EDTA-t és 1 mmol/1 GSH-t (glutation) tartalmazó oldattal. A renaturálást 20 °C hőmérsékleten végezzük háromszor 100 ml, előzetesen 6 ml/1 guanidin-HCl-lel (pH 2,5) szemben dializált származék hozzáadásával, 24 órás időközönként.
A renaturálás után olyan anyagot kapunk, amelynek fajlagos aktivitása 50-75 NE/mg. [Az ennek alapjául szolgáló vizsgálatot lásd: Lili Η.: Z. gesamte inn. Med. ihre Grenzgeb. 42, 478-486 (1987).]
e) A renaturálás termékének koncentrálása
A renaturálási lépés termékét hemodializátor segítségével koncentrálhatjuk.
3. példa
A K1K2P/Pro tisztítása E. coliból
A K1K2P/Pro tisztítását E. coliból affinitáskromatográfiával végezzük ÉTI (Erythrina-Trypsin-Inhibitor)-szefarózon
A renaturálási lépés termékét hemodializátoron (Asahi AM 300) 1:500 arányban koncentráljuk, egy éjszakán át 0,8 mol/1 Arg/HCl-lel (pH 7,5) szemben dializáljuk, majd centrifugáljuk. Egy 0,8 mol/1 Arg/HCllel (pH 7,5) kiegyensúlyozott ETI-szefaróz oszlopot (120 ml) 1,8 1 dializátummal terhelünk 4 oszloptérfogat (OT)/óra sebességgel, majd addig mossuk pufferral [0,8 mol/1 Arg/HCl (pH 7,5) és 0,5 mol/1 HC1], amíg az eluátum abszorpciója 280 nm-nél el nem éri a puffer
HU 216 870 Β vak értékét. A második mosás után 5 OT 0,3 mol/1 Arg/HCl-lel (pH 7,0), az elúciót 0,3 mol/1 Arg/HCl-lel (pH-4,5) végezzük.
Térfogat ml Aktivitás NE/ml Fehérje koncent- ráció mg/ml Fajlagos aktivitás NE/ml F*
Dializátum 1800 74 1,05 70 15
K1K2P- eluátum 200 610 0,82 744 28
F*=Stimulálás fibrinnel=aktivitás fibrin jelenlétcben/aktivitás fibrin nélkül.
4. példa
Az E. coliból tisztított K1K2P/Pro jellemzése
a) Fehérjekémiai jellemzés -SDS-PAGE és fordított fázisú HPLC
Az ETI-szefarózon végzett affinitáskromatográfiával tisztított anyag homogenitását SDS-PAGE-val és fordított fázisú HPLC-vel (FF-HPLC) mutatjuk ki. A tisztított anyag elektroforézises elemzése után az E. coli-ból kapott K.1K2P relatív futási távolságából 50800+2000 Dalton látszólagos molekulatömeget számítunk ki. A denzitométeres értékelés >90% tisztaságot ad.
Az FF-HPLC a fehéijék különféle kölcsönhatásán alapul hidrofób matricákkal. Ezt a tulajdonságot használjuk fel, mint analitikai eljárást a tisztasági fokozat mennyiségi értékeléséhez.
Az E. coliból kapott tisztított K1K2P/Pro elemzését Nucleosil 300 elválasztó oszlopon végezzük trifluor-ecetsav/acetonitril gradiens segítségével („A” puffer: 1,2 ml trifluor-ecetsav 1000 ml H2Oban; „B” puffer: 300 ml H2O, 700 ml acetonitril, 1 ml trifluor-ecetsav; 0-100%). A kromatográfiás elemzés összegzése >95% tisztaságot ad. -N-terminális szekvencia
Az N-terminális szekvenciát ABI 470 Sequenator szekvenciaelemzővel határozzuk meg, standard programmal és on-line PTH-kimutatással. A talált szekvencia, S1-Y2-Q3-V4-I5-D6-T7-R8A9-T10-C11-Y12-E13-D14, összhangban vana DNS-szekvenciából levezetett, várt szekvenciával.
b) Aktivitás-meghatározás
Az E. coliból kapott K1K2P in vitro aktivitását Lili H. és munkatársai szerint határozzuk meg [Z. gesamte inn. Med. ihre Grenzgeb. 42, 478-486 (1987)]. A fajlagos aktivitás (FA) értéke 650000+ 200000 NE/mg. Az E. coliból kapott K1K2P/Pro stimulálhatósága a fibrinogén BrCN-fragmentum révén ebben a vizsgálatban 25-30 (aktivitás a fibrinogén fragmentum jelenlétében, osztva az aktivitással fibrinogén fragmentum nélkül).
c) In vitro kötődés fibrinre
A K1K2P/Pro in vitro kötődését fibrinre a Higgins és Vehar által leírt eljárással határozzuk meg [Higgins D. L., Vehar G. A.: Biochem. 26, 7786-7791 (1987)].
Ez a meghatározás azt eredményezi, hogy a
K1K2P/Pro, a CHO sejtekből kapott t-PA-val ellentétben, nem mutat említésre méltó fibrinkötést.
5. példa
A K1K2P/Pro farmakokinetikája nyulakon
A KlK2P/Pro-t farmakológiai tulajdonságait illetően fehér új-zélandi nyulakon hasonlítjuk össze az actilyse-sel. Mindkét fibrinolitikumot 200000NE/testtömeg kg adagban intravénásán injektáljuk 1 perc alatt. Plazmamintákat veszünk az injekció után, meghatározott időpontokban. A plazma t-PA aktivitását Verheijen J. H. és munkatársai spektrofotometriás vizsgálata alapján [Thromb. Haemostas. 48, 266 (1982)], Lili H. módosítása szerint [Z. Ges. Inn. Med. 42, 478 (1987)] méljük.
A farmakokinetikai paraméterek kiszámításához nemlineáris regresszión alapuló számítógépes programot alkalmazunk, amelyet Huang Η. Y. módosított [Aero-Astronautics Report 64, Rice University 1-30 (1969)]. A görbeillesztésnél egyedenként különbözően 1 vagy 2 rekeszes modellt alkalmazunk. A kiszámítás előtt a kapott értékekből a testhez eleve tartozó alap leolvasási értéket mindig kivonjuk.
A K1K2P/Pro a 6 állat közül csak kettőnél tűnt el egy gyors a- és egy lassú β-fázissal. Ennél a két állatnál az alfa-fázis rész az összes eltűnésben 53%-ot tesz ki. Ezzel ellentétben az actilyse-csoportban az összes állat gyors alfa-fázist mutat, amelynek értéke az összes eltűnésben több, mint 70%-ot tesz ki. A K1K2P/Pro túlnyomórészt csak olyan felezési idővel tűnik el, amely 15,1+3,1 percet tesz ki. Ezzel szemben az actilyse 1,63 perces gyors felezési időt és egy 10,1 perces lassú felezési időt mutat (1. táblázat). A K1K2P/Pro összplazma-kiürülése 6,3+1,5 ml/kg/perc értéket mutat és ez jelentősen kevesebb, mint az actilyse-nél (¢1^^=22,9+9,1 ml/kg/perc).
Összességében kimutatható, hogy a K1K2P/Pro, mint t-PA-mutáns, a technika mai állása szerint az actilyse-sel összhasonlítva, egyértelműen javított farmakokinetikai profilt mutat (2. és 3. ábrák).
6. példa
A K1K2P/Pro farmakodinamikája nyulakban
A trombolitikus hatékonyság vizsgálatára Collen D. és munkatársai pontosított juguláris vénás trombózisos nyúlmodelljét alkalmazzuk [J. Clin. Invest. 71, 368 (1983)]. A fibronolitikumot, illetve az oldószert 1 perc alatt bóluszként injektáljuk. Ezután a trombolízis sebességét értékeljük és az alvadási rendszer kiválasztott paramétereit, valamint a trombocitaszámot meghatározzuk (2. táblázat).
Azonos adagoknál (200000 NE/testtömeg kg) a K1K2P/Pro intravénás bóluszinjekció után statisztikusan szignifikánsan nagyobb trombózissebességet ér el (50,7+6,5%), mint az actilyse (24,1 ±3,7%). A trombolitikus hatékonyságban a KlK2P/Pro-val összehasonlítható actilyse-adag 800000 NE/testtömeg kg értéket tesz ki (2. táblázat).
A K1K2P/Pro actilyse-sel összehasonlítva azonos hatású adagolásainál az oldószercsoporthoz viszonyítva csekély hatás mutatkozik a fibrinogén, plazminogén és
HU 216 870 Β alfa2-antiplazmin alvadási paramétereire, amely az actilyse azonos hatású adagjának kihatásaitól sem különbözik.
A K1K2/Pro tehát olyan mutáns, amely a juguláris vénás trombózis nyúlmodelljén bóluszinjekció után trombolitikus hatékonyságot mutat, amely az actilysesel összehasonlítva jelentősen fokozott mértékű. A K1K2/Pro emelett fibrinfajlagosságát olyan mértékben megőrzi, hogy ez az actilyse-nél talált értékkel megegyezik.
1. táblázat
Farmakokinetikai paraméterek a plazmakoncentráció időadatainak számítógépes értékelésével levezetve a narkotizált nyulakban K1K2P/Pro vagy Actylise 200 000 NE/testtömeg kg iv. bóluszinjekciója után kialakuló t-PA-aktivitás alapján
Fibrinolitikum *1/2 (perc) h/2 (perc) Cinj. (NE/ml) vc* (ml/kg) Clteir* (ml kg-1 perc1) ΓΔΤ * ^rtiextrapol. (NEml-'-h)
Actilyse 1,63 10,1 3051,9 63,2 22,9 161,1
(n=6) (n=5) ±1318,8 ±29,3 ±9,1 ±49,8
K1K2P/Pro 8,9 15,1 1659,9 119,1 6,3 556,4
(n=6) (n=2) ±3,1 ±354,4 ±26,6 ±1,5 ±118,8
Középértékistandard eltérés *Vc=a központi rekesz eloszlási térfogata
ClteijeS=összplazma-kiürülés
GAT=görbe alatti terület; egy fibrolinitikum alkalmazásánál bóluszinjckcióhoz a görbe alatti terület (GAT) különösen érdekes, mivel ez időnként összehasonlítást tesz lehetővé a plazmában uralkodó koncentrációról.
2. táblázat
A trombolízissebesség, a vérlemezkeszám és az alvadási rendszer kiválasztott paraméterei actilyse, K.1K2P vagy oldószer bóluszinjekciója (több, mint 1 perc) után a juguláris vénás trombózis nyúlmodelljében
Oldószer Actilyse 200 000 NE/testtömeg kg K1K2P/Pro 200000 NE/testtömeg kg Actilyse 800 000 NE/testtömeg kg
Trombolízissebesség (%) 12,9±0,9 24,1 ±3,7 50,7±6,5 44,6±4,8
Fibrinogén (%) 89,5±2,1 90,5±2,6 81,1±5,1 81,4±3,4
Plazminogén (%) 90,5±2,7 83,8±4,4 60,1 ±4,3 69,6±3,3
a2-antiplazmin (%) 90,9±4,4 100,8 ±5,3 67,6±6,7 74,2 ±5,9
PTT (%) 113,8±4,9 112,9±4,3 113,l±3,O 115,1±5,5
Trombocita (%) 86,1±12,1 91,4±4,9 84,4±8,3 86,3 ±2,8
Az alvadási paraméterek és a trombocitaszám a kiindulási (injekció előtti) értékek%-ában vannak megadva PTT=részleges trombocitaidő
Középérték±standard deviáció. Minden csoport 6 állatból áll.
7. példa
Optimális kifejeződés E. coliban 45
A kifejeződés hatékonyságának fokozására a
KlK2P-t kódoló génszekvenciát valamely plazmidba magasabb példányszámban klónozzuk. Ehhez a P 39 31 933 4 számú német szövetségi köztársaságbeli szabadalmi bejelentésben leírt pePa 126.1 plazmidot alkalmazzuk. Ez a plazmid lényegében a pKK223-3 plazmidból és a t-PA-t kódoló szekvenciából van összeállítva, amint ezt az EP-A-0242 835 számú európai szabadalmi közzétételben le van írva.
Ebbe a plazmidba mindenekelőtt egy fd-terminátor szekvenciáját integráljuk. Ebből a célból a pePa 126.1 plazmidot HindlII restrikciós enzimmel linearizáljuk. Az így hasított plazmidot gélelektroforetikus úton elválasztjuk és preparatív úton kinyerjük. A pLBUl plazmidot [Gentz és munkatársai: PNAS 78 (8) 4963 (1981)] HindlII-mal emésztjük és egy mintegy 360 bp nagyságú HindlII fragmentumot, amely az fd-terminátort tartalmazza, gélelektroforézissel és gélelúcióval elkülönítjük. A linearizált pePa 126.1 plazmidot és pLBUl-ből a fentiek szerint készített 360 bp-s HindlII fragmentumot ligáljuk. A ligálás termékét a P 50 3931933.4 számú bejelentésben leírt pUBS 500 plazmiddal együtt E. coli-ba (DSM 2102) transzformáljuk. A kiónok közül kiválasztjuk azokat, amelyek a kívánt pePa 126 fd plazmidot tartalmazzák, amely a pePa 126.1 kiindulási plazmidtól abban különbözik, hogy egy 55 második HindlII hasítóhelyet is tartalmaz.
A pePa 126 fd plazmidból két fragmentumot nyerünk: egy 3,4 kb nagyságú BamHI/Pvul fragmentumot és egy mintegy 1,3 kb nagyságú Pvul/Xmal fragmentumot. Mindkét fentnevezett fragmentumot egy, a 60 pA33 plazmidból származó, mintegy 1,6 kb nagyságú
HU 216 870 Β
BamHI/Xmal fragmentumhoz ligáljuk és a pUBS 500 plazmidot E. coliba transzformáljuk. Az így létrejövő plazmidot pA33 fd-nek nevezzük, és ezt a pePa 126 fd-től azzal lehet megkülönböztetni, hogy egy

Claims (16)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Eljárás szöveti plazminogén aktivátor- (t-PA-) származék előállítására, mely nem glikozilezett és az alábbi aminosavszekvenciával rendelkezik:
    EcoRI-gyel végzett restrikciós lépésnél a második legkisebb EcoRI fragmentum, amely a pePa 126 fd-nél mintegy 610 bp hosszúságú, a pA33 fd-nél mintegy 250 bp-vel meg van rövidítve.
    (M)
    Ser Tyr Gin Val Ile 5 Asp Thr Arg Alá Thr 10 Cys Tyr Glu Asp Gin 15 Gly Ile Ser Tyr Arg 20 Gly Thr Trp Ser Thr 25 Alá Glu Ser Gly Alá Glu 30 Cys Thr Asn Trp 35 Asn Ser Ser Alá Leu 40 Alá Gin Lys Pro Tyr 45 Ser Gly Arg Arg Pro 50 Asp Alá Ile Arg Leu 55 Gly Leu Gly Asn His 60 Asn Tyr Cys Arg Asn 65 Pro Asp Arg Asp Ser 70 Lys Pro Trp Cys Tyr 75 Val Phe Lys Alá Gly 80 Lys Tyr Ser Ser Glu 85 Phe Cys Ser Thr Pro 90 Alá Cys Ser Glu Gly 95 Asn Ser Asp Cys Tyr 100 Phe Gly Asn Gly Ser 105 Alá Tyr Arg Gly Thr His 110 Ser Leu Thr Glu 115 Ser Gly Alá Ser Cys 120 Leu Pro Trp Asn Ser 125 Met Ile Leu Ile Gly 130 Lys Val Tyr Thr Alá 135 Gin Asn Pro Ser Alá 140 Gin Alá Leu Gly Leu 145 Gly Lys His Asn Tyr 150 Cys Arg Asn Pro Asp 155 Gly Asp Alá Lys Pro 160 Trp Cys His Val Leu 165 Lys Asn Arg Arg Leu 170 Thr Trp Glu Tyr Cys 175 Asp Val Pro Ser Cys 180 Ser Thr Cys Gly Leu 185 Arg Gin Tyr Ser Gin Pro 190 Gin Phe Arg Ile 195 Lys Gly Gly Leu Phe 200 Alá Asp Ile Alá Ser 205 His Pro Trp Gin Alá 210 Alá Ile Phe Alá Lys 215 His Arg Arg Ser Pro 220 Gly Glu Arg Phe Leu 225 Cys Gly Gly Ile Leu 230 Ile Ser Ser Cys Trp 235 Ile Leu Ser Alá Alá 240 His Cys Phe Gin Glu 245 Arg Phe Pro Pro His 250 His Leu Thr Val Ile 255 Leu Gly Arg Thr Tyr 260 Arg Val Val Pro Gly 265 Glu Glu Glu Gin Lys Phe 270 Glu Val Glu Lys 275 Tyr Ile Val His Lys 280 Glu Phe Asp Asp Asp 285 Thr Tyr Asp Asn Asp 290 Ile Alá Leu Leu Gin 295 Leu Lys Ser Asp Ser 300 Ser Arg Cys Alá Gin 305 Glu Ser Ser Val Val 310 Arg Thr Val Cys Leu 315 Pro Pro Alá Asp Leu 320
    HU 216 870 Β
    Gin Leu Pro Asp Trp 325 Thr Glu Cys Glu Alá Leu Ser 340 Pro Phe Tyr Ser Arg Leu Tyr 355 Pro Ser Ser Arg Cys 360 Thr Val 370 Thr Asp Asn Met Leu 375 Cys Pro 3B5 Gin Alá Asn Leu His 390 Asp Alá Leu Val Cys Leu Asn 405 Asp Gly Arg Trp Gly Leu Gly 420 Cys Gly Gin Lys Val Thr Asn 435 Tyr Leu Asp Trp Ile 440
    Glu Leu 330 Ser Gly Tyr Gly Lys 335 His Glu 345 Arg Leu Lys Glu Alá 350 His Val Thr Ser Gin His Leu 365 Leu Asn Arg Alá Gly Asp Thr 380 Arg Ser Gly Gly Cys Gin Gly 395 Asp Ser Gly Gly Pro 400 Met Thr 410 Leu Val Gly Ile Ile 415 Ser Asp 425 Val Pro Gly Val Tyr 430 Thr Lys Arg Asp Asn Met Arg 44S Pro
    azzal jellemezve, hogy a fenti aminosavszekvenciát kódoló DNS-t, vagy ettől eltérő, a genetikai kód degenerációja keretein belül levő DNS-szekvenciát tartalmazó gazdasejtet az aminosav kifejeződésének megfelelő körülmények között tenyésztjük. 25 (Elsőbbsége: 1989.05.31.)
  2. 2. Eljárás DNS-szekvencia előállítására, mely az 1. igénypont szerinti t-PA-származékot kódolja és az alábbi szekvenciával rendelkezik:
    atgtcttaccaagtgatcgataccagggccacgtgctacgaggaccagggcatcagctac AGGGGCACGTGGAGCACAGCGGAGAGTGGCGCCGAGTGCACCAACTGGAACAGCAGCGCG TTGGCCCAGAAGCCCTACAGCGGGCGGAGGCCAGACGCCATCAGGCTGGGCCTGGGGAAC CACAACTACTGCAGAAACCCAGATCGAGACTCAAAGCCCTGGTGCTACGTCTTTAAGGCG GGGAAGTACAGCTCAGAGTTCTGCAGCACCCCTGCCTGCTCTGAGGGAAACAGTGACTGC TACTTTGGGAATGGGTCAGCCTACCGTGGCACGCACAGCCTCACCGAGTCGGGTGCCTCC TGCCTCCCGTGGAATTCCATGATCCTGATAGGCAAGGTTTACACAGCACAGAACCCCAGT GCCCAGGCACTGGGCCTGGGCAAACATAATTACTGCCGGAATCCTGATGGGGATGCCAAG CCCTGGTGCCACGTGCTGAACAACCGCAGGCTGACGTGGGAGTACTGTGATGTGCCCTCC TGCTCCACCTGCGGCCTGAGACAGTACAGCCAGCCTCAGTTTCGCATCAAAGGAGGGCTC TTCGCCGACATCGCCTCCCACCCCTGGCAGGCTGCCATCTTTGCCAAGCACAGGAGGTCG CCCGGAGAGCGGTTCCTGTGCGGGGGCATACTCATCAGCTCCTGCTGGATTCTCTCTGCC GCCCACTGCTTCCAGGAGAGGTTTCCGCCCCACCACCTGACGGTGATCTTGGGCAGAACA TACCGGGTGGTCCCTGGCGAGGAGGAGCAGAAATTTGAAGTCGAAAAATACATTGTCCAT AAGGAATTCGATGATGACACTTACGACAATGACATTGCGCTGCTGCAGCTGAAATCGGAT TCGTCCCGCTGTGCCCAGGAGAGCAGCGTGGTCCGCACTCTGTGCCTTCCCCCGGCGGAC CTGCAGCTGCCGGACTGGACGGAGTGTGAGCTCTCCGGCTACGGCAAGCATGAGGCCTTG TCTCCTTTCTATTCGGAGCGGCTGAAGGAGGCTCATGTCAGACTGTACCCATCCAGCCGC tgcacatcacaacatttacttaacagaacagtcaccgacaacatgctgtgtgctggagac actcggagcggcgggccccaggcaaacttgcacgacgcctgccagggcgattcgggaggc cccctggtgtgtctgaacgatggccgcatgactttggtgggcatcatcagctggggcctg ggctgtggacagaaggatgtcccgggtgtgtacacaaaggttaccaactacctagactgg ATTCGTGACAACATGCGACCG 1341 azzal jellemezve, hogy a fenti, az 1. igénypont szerinti
  3. 3. Eljárás kifejező plazmid előállítására, azzal jellet-PA-származékot kódoló DNS-szekvenciát állítjuk elő. mezve, hogy a 2. igénypont szerint előállított DNS(Elsőbbsége: 1989. 05. 31.) 60 szekvenciát, vagy egy olyan, ettől eltérő DNS-szekven10
    HU 216 870 Β ciát, amely a genetikai kód degenerációja keretein belül van és az 1. igénypont szerinti fehérjét kódolja, valamely megfelelő plazmidba inzertáljuk.
    (Elsőbbsége: 1989.05.31.)
  4. 4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a pA33 plazmidot állítjuk elő.
    (Elsőbbsége: 1989. 05. 31.)
  5. 5. Eljárás a 3. vagy 4. igénypont szerinti kifejező plazmid előállítására, azzal jellemezve, hogy egy DNSszekvenciát, amely a teljes t-PA-fehérjét vagy egy olyan származékát, amely az I. horog-, a II. horog- és a proteáztartományon kívül a t-PA-fehéije további tartományait tartalmazza, kódolja, valamely plazmidba beviszünk, és irányított mutagenezissel eltávolítjuk az azokat az aminosavakat kódoló tartományokat, amelyek az 1. igénypont szerinti t-PA-származékban nem találhatók.
    (Elsőbbsége: 1989.05.31.)
  6. 6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a t-PA-fehérjét vagy származékát kódoló DNSszekvenciaként a megfelelő cDNS-t alkalmazzuk.
    (Elsőbbsége: 1989.05.31.)
  7. 7. Eljárás az 1. igénypont szerinti t-PA-származék előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely, 3. vagy
    4. igénypont szerint előállított plazmidot megfelelő gazdasejtbe transzformáljuk, és a kifejezési terméket a tenyészközegből vagy a gazdasejtek feltárása után kinyerjük.
    (Elsőbbsége: 1989.05.31.)
  8. 8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdasejtként prokarióta sejteket, előnyösen E. coli sejteket alkalmazunk.
    (Elsőbbsége: 1989.05.31.)
  9. 9. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az aktív fehérjéből képzett zárványtesteket elválasztjuk, ezeket guanidin-hidrokloriddal végzett kezeléssel szolubilizáljuk, majd oxidált glutationnal származékba visszük, végül a t-PA-származékot L-arginin és GSH hozzáadásával renaturáljuk.
    (Elsőbbsége: 1989.05.31.)
  10. 10. Az 5-9. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a renaturálás után a t-PAszármazékot a renaturálási elegyben bekoncentráljuk, majd affmitáskromatografálással tisztítjuk.
    (Elsőbbsége: 1989.07. 14.)
  11. 11. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kromatográfiás tisztításhoz ETI-adszorpciós oszlopot alkalmazunk.
    (Elsőbbsége: 1989.07. 14.)
  12. 12. Az 5-11. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 25-1000 mmol/1 arginin jelenlétében dolgozunk.
    (Elsőbbsége: 1989.07. 14.)
  13. 13. Az 5-12. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kromatográfiás tisztítást a renaturálási lépés koncentrátumával, amely 251000 mmol/1, előnyösen 200-1000 mmol/1 L-arginint tartalmaz, ETI-adszorpciós oszlopon végezzük.
    (Elsőbbsége: 1989. 07. 14.)
  14. 14. A 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kromatográfiás tisztításhoz vezetett koncentrátum pH-értékét 7,0-nál nagyobbra állítjuk be.
    (Elsőbbsége: 1989.07. 14.)
  15. 15. Az 5-14. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az eluálást 4 és 6 közötti pH-értéken végezzük.
    (Elsőbbsége: 1989.05.31.)
  16. 16. Eljárás gyógyászati készítmény előállítására vérrögök feloldására, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerint előállított t-PA-származékot legalább egy szokásos, gyógyászatilag elfogadható adalékanyaggal keverjük.
HU903267A 1989-05-31 1990-05-30 Eljárás szöveti plazminogén aktivátor előállítására HU216870B (hu)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE3917781 1989-05-31
DE3923339A DE3923339A1 (de) 1989-05-31 1989-07-14 Gewebs-plasminogen-aktivator-derivat

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HU903267D0 HU903267D0 (en) 1990-10-28
HUT54734A HUT54734A (en) 1991-03-28
HU216870B true HU216870B (hu) 1999-09-28

Family

ID=25881452

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU903267A HU216870B (hu) 1989-05-31 1990-05-30 Eljárás szöveti plazminogén aktivátor előállítására

Country Status (17)

Country Link
EP (1) EP0400545B1 (hu)
JP (1) JPH0327286A (hu)
AT (1) ATE119940T1 (hu)
AU (1) AU623781B2 (hu)
CA (1) CA2017636C (hu)
CZ (1) CZ267690A3 (hu)
DD (1) DD300109A5 (hu)
DE (2) DE3923339A1 (hu)
ES (1) ES2070210T3 (hu)
FI (1) FI101475B1 (hu)
HU (1) HU216870B (hu)
IE (1) IE66006B1 (hu)
IL (1) IL94539A (hu)
NO (1) NO902405L (hu)
NZ (1) NZ233796A (hu)
PT (1) PT94227B (hu)
ZA (1) ZA904089B (hu)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3942144A1 (de) * 1989-12-20 1991-06-27 Boehringer Mannheim Gmbh Stabilisierung von k1k2p pro
WO1997038123A1 (en) * 1996-04-05 1997-10-16 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for producing soluble, biologically-active disulfide bond-containing eukaryotic proteins in bacterial cells

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SU1662352A3 (ru) * 1982-05-05 1991-07-07 Генентек, Инк (Фирма) Штамм бактерий ЕSснеRIснIа coLI - продуцент активатора плазминогена тканевого типа
FR2594845B1 (fr) * 1986-02-21 1989-12-01 Genetica Preparation par voie microbiologique de l'activateur tissulaire humain du plasminogene (t-pa) et conversion de l'enzyme ainsi obtenue en sa forme active
DE3643158A1 (de) * 1986-04-21 1987-11-19 Boehringer Mannheim Gmbh Gewebs-plasminogen-aktivator(tpa) - derivat und seine herstellung
FI100106B (fi) * 1986-12-05 1997-09-30 Novartis Ag Menetelmä plasminogeenin yksisäikeisen yhdistelmäaktivaattorin valmist amiseksi
IL87276A (en) * 1987-08-03 1995-07-31 Fujisawa Pharmaceutical Co Analog of a tissue plasminogen activator containing the Pringle 2 and protease regions only, DNA encoding it, processes for its preparation, and pharmaceutical preparations containing it
US5094953A (en) * 1988-03-21 1992-03-10 Genentech, Inc. Human tissue plasminogen activator variants
DE3903581A1 (de) * 1989-02-07 1990-08-16 Boehringer Mannheim Gmbh Gewebs-plasminogenaktivator-derivat

Also Published As

Publication number Publication date
JPH0327286A (ja) 1991-02-05
PT94227B (pt) 1997-01-31
NO902405L (no) 1990-12-03
PT94227A (pt) 1991-02-08
ATE119940T1 (de) 1995-04-15
CA2017636A1 (en) 1990-11-30
FI101475B (fi) 1998-06-30
CZ282035B6 (cs) 1997-04-16
DE59008693D1 (de) 1995-04-20
AU5600990A (en) 1990-12-06
EP0400545A1 (de) 1990-12-05
CA2017636C (en) 2000-05-02
NO902405D0 (no) 1990-05-30
HU903267D0 (en) 1990-10-28
EP0400545B1 (de) 1995-03-15
HUT54734A (en) 1991-03-28
IE901848L (en) 1990-11-30
IE66006B1 (en) 1995-11-29
FI902700A0 (fi) 1990-05-30
AU623781B2 (en) 1992-05-21
IL94539A (en) 1996-08-04
FI101475B1 (fi) 1998-06-30
NZ233796A (en) 1992-07-28
IL94539A0 (en) 1991-03-10
DD300109A5 (de) 1992-05-21
ZA904089B (en) 1991-03-27
DE3923339A1 (de) 1990-12-06
ES2070210T3 (es) 1995-06-01
CZ267690A3 (en) 1997-04-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA2025900C (en) Derivative of tissue-type plasminogen activator
JP2631645B2 (ja) 新規化合物、その製法及びそれを含む医薬組成物
KR970005251B1 (ko) 크링글 치환이 있는 돌연변이 이체 티-피에이
Orsini et al. Efficient renaturation and fibrinolytic properties of prourokinase and a deletion mutant expressed in Escherichia coli as inclusion bodies
IL90146A (en) Glycosylation derivatives of tissue plasminogen activator
HU217101B (hu) Javított fibrinolitikus tulajdonságokkal és thrombingátló hatással rendelkező bifunkciós urokinázvariánsok
US5149533A (en) Modified t-PA with kringle-/replaced by another kringle
FI114102B (fi) Menetelmä trombiinin vaikutuksesta pilkkoutuvan plasminogeenianalogin valmistamiseksi
HU216870B (hu) Eljárás szöveti plazminogén aktivátor előállítására
JPH1080271A (ja) 血管障害治療のための改良法
Li et al. Biochemical properties of recombinant mutants of nonglycosylated single chain urokinase-type plasminogen activator
US5908625A (en) Use of the protease domain of human plasminogen activator for the treatment of thromboembolic diseases
JP2000504941A (ja) トロンビンによって活性化され得るプラスミノーゲンアクチベーター
Browne et al. Protein engineering and comparative pharmacokinetic analysis of a family of novel recombinant hybrid and mutant plasminogen activators
JPH0775580A (ja) 新規なｔ−ＰＡ改変体

Legal Events

Date Code Title Description
HMM4 Cancellation of final prot. due to non-payment of fee