JP2631645B2 - 新規化合物、その製法及びそれを含む医薬組成物 - Google Patents
新規化合物、その製法及びそれを含む医薬組成物Info
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- JP2631645B2 JP2631645B2 JP61076420A JP7642086A JP2631645B2 JP 2631645 B2 JP2631645 B2 JP 2631645B2 JP 61076420 A JP61076420 A JP 61076420A JP 7642086 A JP7642086 A JP 7642086A JP 2631645 B2 JP2631645 B2 JP 2631645B2
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6456—Plasminogen activators
- C12N9/6459—Plasminogen activators t-plasminogen activator (3.4.21.68), i.e. tPA
-
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12Y304/21069—Protein C activated (3.4.21.69)
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- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は酵素の分解した種（ポリペプチド種）、その
種の単離、その種を含む製薬組成物及び血栓症の治療に
用いられるその用途に関する。
種の単離、その種を含む製薬組成物及び血栓症の治療に
用いられるその用途に関する。
ヒトのフイブリン溶解酵素である組織型プラスミノー
ゲン活性化因子（ｔ−PA）は血栓症の治療に用いられて
きている。しかしこの酵素の不利はその活性が肝臓を経
るクリアランス及び天然のアンチプロテアーゼによる不
活性化により生体内で急速に消失することにある。
ゲン活性化因子（ｔ−PA）は血栓症の治療に用いられて
きている。しかしこの酵素の不利はその活性が肝臓を経
るクリアランス及び天然のアンチプロテアーゼによる不
活性化により生体内で急速に消失することにある。
天然ｔ−PAの活性部位の不可逆的なブロツキングはｔ
−PA分子の急速なクリアランスに殆んど効果がなくそれ
故活性部位滴定剤例えばｐ−アニシン酸によるｔ−PAの
活性部位の可逆的ブロツキングがその生物学的半減期を
延長しないことも示唆された〔シー・コーニンガー（Ｃ
・Korninger）ら、1981,「スロング、ヘム、（Thromb.H
aem.）46,658〜661〕。
−PA分子の急速なクリアランスに殆んど効果がなくそれ
故活性部位滴定剤例えばｐ−アニシン酸によるｔ−PAの
活性部位の可逆的ブロツキングがその生物学的半減期を
延長しないことも示唆された〔シー・コーニンガー（Ｃ
・Korninger）ら、1981,「スロング、ヘム、（Thromb.H
aem.）46,658〜661〕。
天然のヒトｔ−PAは分子量（Mr）＝63,000及び65,000
の二つの形で存在する〔ディー・ペンニカ（Ｄ・Pennic
a）ら、1983,「ネーチユア（Nature）」301,214〜22
1〕。ｔ−PAの単離された活性の軽い鎖とは別に〔ディ
ー・シー・リケン（Ｄ・Ｃ・Rijken）,1984,「ヘモスタ
シス（Haemostasis）」14,14〕,t−PAの２種のフイブリ
ン溶解活性分解種が既に記載されている。Mr＝約55,000
〔イー・エル・ウイルソン（E.L.Wilson）ら、1980,
「キヤンサーレス．（Cancer Res.）」40,933〜938;シ
ー・フセン（C.Huessen）及びイー・ビー・ダウドル
（E.B.Dowdle），「アナル、ビオケム、（Anal.Bioche
m.）」102,196〜202;エル・シー・ギルバート（L.C.Gil
bert）及びジエー・テイ・ワクスマン（J.T.Wachsman）
「ビオキム、ビオフジ、アクタ、（Biochim.Biophys、A
cta.）」704,450〜460;ケー・スエイシ（K.Sueishi）
ら、1982,「ビオキム、ビオフジ、オクタ、」717,327〜
336〕及びMr＝約38,000〔イー・エル・ウイルソンら、1
980;エル・シー・ギルバート及びジエー・テイ・ワクス
マン,1982〕。しかし何れも単離そして分析されていな
い。
の二つの形で存在する〔ディー・ペンニカ（Ｄ・Pennic
a）ら、1983,「ネーチユア（Nature）」301,214〜22
1〕。ｔ−PAの単離された活性の軽い鎖とは別に〔ディ
ー・シー・リケン（Ｄ・Ｃ・Rijken）,1984,「ヘモスタ
シス（Haemostasis）」14,14〕,t−PAの２種のフイブリ
ン溶解活性分解種が既に記載されている。Mr＝約55,000
〔イー・エル・ウイルソン（E.L.Wilson）ら、1980,
「キヤンサーレス．（Cancer Res.）」40,933〜938;シ
ー・フセン（C.Huessen）及びイー・ビー・ダウドル
（E.B.Dowdle），「アナル、ビオケム、（Anal.Bioche
m.）」102,196〜202;エル・シー・ギルバート（L.C.Gil
bert）及びジエー・テイ・ワクスマン（J.T.Wachsman）
「ビオキム、ビオフジ、アクタ、（Biochim.Biophys、A
cta.）」704,450〜460;ケー・スエイシ（K.Sueishi）
ら、1982,「ビオキム、ビオフジ、オクタ、」717,327〜
336〕及びMr＝約38,000〔イー・エル・ウイルソンら、1
980;エル・シー・ギルバート及びジエー・テイ・ワクス
マン,1982〕。しかし何れも単離そして分析されていな
い。
天然のｔ−PAと異なりｔ−PAのMr＝55,000の種はフイ
ブリンクロツトに強く結合しないことが報告されている
「エル・バイヤイ（L.Banyai）ら、1983,FEBS,163,37〜
41〕。ｔ−PAのMr＝38,000/40,000の種がMr＝55,000の
種により失われたのと少くとも同じ部分の天然のｔ−PA
酵素を失つたのではないかと予想するのは不合理ではな
い。それ故Mr＝38,000/40,000の種がフイブリンの親和
性を示すと予想されなかつた。
ブリンクロツトに強く結合しないことが報告されている
「エル・バイヤイ（L.Banyai）ら、1983,FEBS,163,37〜
41〕。ｔ−PAのMr＝38,000/40,000の種がMr＝55,000の
種により失われたのと少くとも同じ部分の天然のｔ−PA
酵素を失つたのではないかと予想するのは不合理ではな
い。それ故Mr＝38,000/40,000の種がフイブリンの親和
性を示すと予想されなかつた。
驚くべきことにｔ−PAのMr＝38,000/40,000の種がヒ
トのフイブリンクロツトに顕著な親和性を保持すること
を本発明者は見い出した。さらにMr＝38,000/40,000の
種の形が生体内でクリアランス速度を低下させることが
驚くべきことに分つた。
トのフイブリンクロツトに顕著な親和性を保持すること
を本発明者は見い出した。さらにMr＝38,000/40,000の
種の形が生体内でクリアランス速度を低下させることが
驚くべきことに分つた。
Mr＝38,000/40,000の種は整理されそしてＮ末端配列
順アラニン−グリシン−リジン−チロシン−よりなるこ
とが分つた。これはペンニカらにより記載された天然の
ｔ−PAの配列順と比較され、その比較からその種のＮ−
末端アミノ酸残基が天然のｔ−PAの残基アラニン160に
相当し、Ｃ−末端アミノ酸残基がプロリン527に相当す
ることが帰納される。この種はアラニン160−プロリン
527ｔ−PA（以下アラ160−ｔ−PAとする）として示され
よう。
順アラニン−グリシン−リジン−チロシン−よりなるこ
とが分つた。これはペンニカらにより記載された天然の
ｔ−PAの配列順と比較され、その比較からその種のＮ−
末端アミノ酸残基が天然のｔ−PAの残基アラニン160に
相当し、Ｃ−末端アミノ酸残基がプロリン527に相当す
ることが帰納される。この種はアラニン160−プロリン
527ｔ−PA（以下アラ160−ｔ−PAとする）として示され
よう。
天然のｔ−PAは軽い（Ｂ）そして重い（Ａ）鎖よりな
る。Ｂ鎖は酵素の活性部位を含む。Ａ鎖が他の血漿蛋白
に見い出される構造に一致する多数の構造的及び機能的
領域を示す即ち２個の三重ジサルフアイド結合構造即ち
クリングル，成長因子様領域及びフイブロネクチン−フ
インガー様領域を示すことが分つた〔テイー・ナイ（T.
Ny）ら、1984,「プロセ・ナトル・アカド・サイ（Proc.
Natl.Acad.Sci.）USA」，81,5355「ザ・ストラクチユア
・オブ・ザ・ヒユーマン・テイシユー・タイプ・プラス
ミノーゲン・アクチベーター・ジーン：コリレーシヨン
・オブ・イントロン・アンド・エキソン・ストラクチユ
アズ・ツウ・フアンクシヨナル・アンド・ストラクチユ
ラル・ドメンズ（The structure of the human tissue
−type plasminogen activator gene:Correlation of i
ntron and exon structures to functional and struct
ural domains）」。それ故ｔ−PA分子はFGK1K2Bとして
これらの領域により記載されＦはフインガー領域であり
Ｇは成長因子領域でありK1及びK2はクリングル構造であ
りそしてＢはＢ鎖である。
る。Ｂ鎖は酵素の活性部位を含む。Ａ鎖が他の血漿蛋白
に見い出される構造に一致する多数の構造的及び機能的
領域を示す即ち２個の三重ジサルフアイド結合構造即ち
クリングル，成長因子様領域及びフイブロネクチン−フ
インガー様領域を示すことが分つた〔テイー・ナイ（T.
Ny）ら、1984,「プロセ・ナトル・アカド・サイ（Proc.
Natl.Acad.Sci.）USA」，81,5355「ザ・ストラクチユア
・オブ・ザ・ヒユーマン・テイシユー・タイプ・プラス
ミノーゲン・アクチベーター・ジーン：コリレーシヨン
・オブ・イントロン・アンド・エキソン・ストラクチユ
アズ・ツウ・フアンクシヨナル・アンド・ストラクチユ
ラル・ドメンズ（The structure of the human tissue
−type plasminogen activator gene:Correlation of i
ntron and exon structures to functional and struct
ural domains）」。それ故ｔ−PA分子はFGK1K2Bとして
これらの領域により記載されＦはフインガー領域であり
Ｇは成長因子領域でありK1及びK2はクリングル構造であ
りそしてＢはＢ鎖である。
アラ160−ｔ−PA種はクリングル２（K2）とともに天
然のｔ−PAのＢ鎖より種としてなり残基アラ160はクリ
ングル１内に存在してアラ160−ｔ−PA種ではクリング
ル１の不充分なアミノ酸残基が存在してその領域につい
て構造的及び機能的の完全さをもたらす。
然のｔ−PAのＢ鎖より種としてなり残基アラ160はクリ
ングル１内に存在してアラ160−ｔ−PA種ではクリング
ル１の不充分なアミノ酸残基が存在してその領域につい
て構造的及び機能的の完全さをもたらす。
Ｂ鎖及びクリングル２よりなる遺伝子工学由来のｔ−
PAムテインの製造は既に記述されている〔ネーザランズ
・レツド・クロス・ブラツド・トランスフエージヨン・
サービス,EMBOワークシヨツプ・オン・プラスミノーゲ
ン・アクチベーシヨン，アマルフイ（Netherlands Red
Cross Blood Transfusion Service,EMBO workshop on P
lasminogen Activation,Amalfi）イタリー,1985年10月1
4〜18日そして第10回インターナシヨナル・コングレス
・オン・スロンボシス・アンド・ヘモスタシス（Intern
ational Congress on Thrombosis and Haemostasis）,U
SA,1985年７月14〜19日〕。しかし物質の単離及び精製
は記述されていない。
PAムテインの製造は既に記述されている〔ネーザランズ
・レツド・クロス・ブラツド・トランスフエージヨン・
サービス,EMBOワークシヨツプ・オン・プラスミノーゲ
ン・アクチベーシヨン，アマルフイ（Netherlands Red
Cross Blood Transfusion Service,EMBO workshop on P
lasminogen Activation,Amalfi）イタリー,1985年10月1
4〜18日そして第10回インターナシヨナル・コングレス
・オン・スロンボシス・アンド・ヘモスタシス（Intern
ational Congress on Thrombosis and Haemostasis）,U
SA,1985年７月14〜19日〕。しかし物質の単離及び精製
は記述されていない。
本発明によれば、天然のｔ−PA A鎖の唯一の機能的及
び構造的に無傷（intact）の領域としてのクリングル
（Kringle）２へ結合した天然のｔ−PAのフイブリン溶
解的に無傷のＢ鎖よりなる組織型プラスミノーゲン活性
化因子の精製されたフイブリン溶解活性があるポリペプ
チド種（species）が提供される。
び構造的に無傷（intact）の領域としてのクリングル
（Kringle）２へ結合した天然のｔ−PAのフイブリン溶
解的に無傷のＢ鎖よりなる組織型プラスミノーゲン活性
化因子の精製されたフイブリン溶解活性があるポリペプ
チド種（species）が提供される。
適当に分解した種は従来の方法例えばナトリウムドデ
シルサルフエートポリアクリルアミドゲル電気透析によ
り測定されるとき少くとも70％純粋である。
シルサルフエートポリアクリルアミドゲル電気透析によ
り測定されるとき少くとも70％純粋である。
好ましくは分解した種は少くとも80％純粋であり一層
好ましくは少くとも95％純粋である。
好ましくは少くとも95％純粋である。
一つの好ましい態様において分解した種はアラニン
160−プロリン527ｔ−PA（プロリン527はｔ−PAのＣ−
末端アミノ酸である）である。
160−プロリン527ｔ−PA（プロリン527はｔ−PAのＣ−
末端アミノ酸である）である。
他の好ましい態様では分解した種は38,000〜40,000の
範囲内の分子量を有する。
範囲内の分子量を有する。
本発明はさらに組換え宿主細胞にDNAをコードした本
明細書で限定したｔ−PAの分解した種を発現しそして分
解したｔ−PA生成物を回収することよりなる該分解種を
製造する方法を提供する。
明細書で限定したｔ−PAの分解した種を発現しそして分
解したｔ−PA生成物を回収することよりなる該分解種を
製造する方法を提供する。
発明の方法は従来の組換え技術例えばマニアチス（Ma
niatis）ら「モレキユラー・クローニング−エ−・ラボ
ラトリー・マニユアル（Molecular clonjng−A Laborat
ory Manual）」；コールド・スプリング・ハーバー（Co
ld Spring Harbor）1982に記載された技術により行われ
よう。
niatis）ら「モレキユラー・クローニング−エ−・ラボ
ラトリー・マニユアル（Molecular clonjng−A Laborat
ory Manual）」；コールド・スプリング・ハーバー（Co
ld Spring Harbor）1982に記載された技術により行われ
よう。
好ましい態様においてアラ160−ｔ−PAの実質的に純
粋な形又はMr＝38,000〜40,000の種は例えばクロマトグ
ラフイを用いてｔ−PA分泌細胞系から得られる天然のｔ
−PAからの分離により得られる。
粋な形又はMr＝38,000〜40,000の種は例えばクロマトグ
ラフイを用いてｔ−PA分泌細胞系から得られる天然のｔ
−PAからの分離により得られる。
好ましくは分離法で用いられる天然のｔ−PAは部分的
に精製される〔例えばエム・ジエー・ブラウン（M.J.Br
owne）ら、1985,「ジーン（Gene）」33,279〕。
に精製される〔例えばエム・ジエー・ブラウン（M.J.Br
owne）ら、1985,「ジーン（Gene）」33,279〕。
クロマトグラフイは例えばセフアデツクス（Sephade
x）である適切な分子ふるいを用いて行われよう。
x）である適切な分子ふるいを用いて行われよう。
好ましくは少くとも２回のクロマトグラフイ工程が用
いられる。例えば限外過による濃縮は好ましくはそれ
ぞれのクロマトグラフイ工程後に行われる。
いられる。例えば限外過による濃縮は好ましくはそれ
ぞれのクロマトグラフイ工程後に行われる。
Mr＝38,000/40,000と名付けられる分解した種はMr＝3
8,000及びMr＝40,000の２種の変種に分離されそれらは
このやり方で異る天然のｔ−PAの２種の変種（Mr＝63,0
00及び65,000）とのアナロジーによりアミノ酸残基アス
パラギン184に炭水化物においてのみ恐らく異なること
が分つた〔ジー・ポール（G.Pohl）ら「バイオケミスト
リー（Biochemistry）1984,23,3701〜７参照〕。
8,000及びMr＝40,000の２種の変種に分離されそれらは
このやり方で異る天然のｔ−PAの２種の変種（Mr＝63,0
00及び65,000）とのアナロジーによりアミノ酸残基アス
パラギン184に炭水化物においてのみ恐らく異なること
が分つた〔ジー・ポール（G.Pohl）ら「バイオケミスト
リー（Biochemistry）1984,23,3701〜７参照〕。
他の好ましい態様において分解した種は約38,000の分
子量を有する。
子量を有する。
本発明のｔ−PAの分解した種は誘導化されて周知のｔ
−PA含有コンジユゲートに似た製薬上有用なコンジユゲ
ートをもたらす。例えば以下の通りである。
−PA含有コンジユゲートに似た製薬上有用なコンジユゲ
ートをもたらす。例えば以下の通りである。
（ａ）EP−Ａ−O155,388に開示された酵素−蛋白コンジ
ユゲート（フイブリン溶解活性に関係のある酵素上の触
媒部位は可逆性結合基によりそれに結合したヒト蛋白に
よりブロツクされている）； （ｂ）EP−Ａ−O152,732に開示された酵素−蛋白コンジ
ユゲート（フイブリン溶解活性に関係のある触媒部位以
外の部位により少くとも１種のヒト蛋白へ結合する少く
とも１種の任意にブロツクされてもよいフイブリン溶解
酵素よりなる）； （ｃ）特願昭60−269206号に開示された蛋白−重合体コ
ンジユゲート（可逆性結合基により少くとも１種の水溶
性重合体へ結合した製薬上有用な蛋白よりなる）；又は （ｄ）特願昭60−269206号に開示された酵素コンジユゲ
ート（除去しうるブロツキング基によりその活性中心を
通して共に結合した複数のフイブリン溶解酵素よりな
る）。
ユゲート（フイブリン溶解活性に関係のある酵素上の触
媒部位は可逆性結合基によりそれに結合したヒト蛋白に
よりブロツクされている）； （ｂ）EP−Ａ−O152,732に開示された酵素−蛋白コンジ
ユゲート（フイブリン溶解活性に関係のある触媒部位以
外の部位により少くとも１種のヒト蛋白へ結合する少く
とも１種の任意にブロツクされてもよいフイブリン溶解
酵素よりなる）； （ｃ）特願昭60−269206号に開示された蛋白−重合体コ
ンジユゲート（可逆性結合基により少くとも１種の水溶
性重合体へ結合した製薬上有用な蛋白よりなる）；又は （ｄ）特願昭60−269206号に開示された酵素コンジユゲ
ート（除去しうるブロツキング基によりその活性中心を
通して共に結合した複数のフイブリン溶解酵素よりな
る）。
本発明のｔ−PAの分解した種は前記のコンジユゲート
の任意のものの酵素又は（ヒト）蛋白成分として適切な
らばｔ−PAに代わるだろう。
の任意のものの酵素又は（ヒト）蛋白成分として適切な
らばｔ−PAに代わるだろう。
ｔ−PAの分解した種又はそのコンジユゲートは又誘導
化されてフイブリン溶解活性に必須の任意の触媒部位が
任意に除去しうるブロツキング基によりブロツクされて
もよい。
化されてフイブリン溶解活性に必須の任意の触媒部位が
任意に除去しうるブロツキング基によりブロツクされて
もよい。
アラ160−ｔ−PA種の活性部位の可逆性ブロツキング
又はMr＝38,000/40,000のｔ−PA種が生体内で遅いクリ
アランス速度をもたらすことが分つた。
又はMr＝38,000/40,000のｔ−PA種が生体内で遅いクリ
アランス速度をもたらすことが分つた。
それ故又本発明によればフイブリン溶解活性に必須の
触媒部位が除去しうるブロツキング基によりブロツクさ
れている前記の組織型プラスミノーゲン活性化因子のフ
イブリン溶解活性分解種を提供する。
触媒部位が除去しうるブロツキング基によりブロツクさ
れている前記の組織型プラスミノーゲン活性化因子のフ
イブリン溶解活性分解種を提供する。
本明細書において用語「除去しうるブロツキング基」
とは加水分解の擬一次速度定数が37℃でpH7.4で等張性
水性媒体で10-6／秒〜10-2／秒好ましくは10-3／秒〜10
-5／秒の範囲内にあるような速度で加水分解により除去
されうる基を含む。
とは加水分解の擬一次速度定数が37℃でpH7.4で等張性
水性媒体で10-6／秒〜10-2／秒好ましくは10-3／秒〜10
-5／秒の範囲内にあるような速度で加水分解により除去
されうる基を含む。
このようなブロツキング基はヨーロツパ特許第000987
9号に記載されておりそしてアシル基例えば置換されて
いてもよいベンゾイル又は置換されていてもよいアクリ
ロイルを含む。
9号に記載されておりそしてアシル基例えば置換されて
いてもよいベンゾイル又は置換されていてもよいアクリ
ロイルを含む。
ベンゾイルブロツキング基の適当な任意の置換基はハ
ロゲン，C1〜6アルキル，C1〜6アルコキシ，C1〜6アル
カノイルオキシ，C1〜6アルカノイルアミノ，アミノ又
はｐ−グアニジノを含む。
ロゲン，C1〜6アルキル，C1〜6アルコキシ，C1〜6アル
カノイルオキシ，C1〜6アルカノイルアミノ，アミノ又
はｐ−グアニジノを含む。
アクリロイルブロツキング基の適当な任意の置換基は
C1〜6アルキル，フリル，フエニル又はC1〜6アルキルフ
エニルを含む。
C1〜6アルキル，フリル，フエニル又はC1〜6アルキルフ
エニルを含む。
除去しうるブロツキング基の例はｐ−アニソイル及び
N,N−ジメチル ４−アミノベンゾイルを含む。
N,N−ジメチル ４−アミノベンゾイルを含む。
除去しうるブロツキング基による活性中心のブロツキ
ングはヨーロツパ特許第0009879号に記載された方法に
より行われる。
ングはヨーロツパ特許第0009879号に記載された方法に
より行われる。
ｔ−PAの分解した種の上述の誘導体はｔ−PA種それ自
体について下記される方法及び組成物の任意のもので用
いられよう。
体について下記される方法及び組成物の任意のもので用
いられよう。
天然のｔ−PA分子の急速なクリアランスをきめる認識
部位は本発明の分解した種には存在しないフラグメント
上に存在することを本発明者の結果は示している。この
推定された部位は除去されると分子の活性中心は他の一
つのクリアランス機構により認識されるように思われ
る。従って活性中心のブロッキングは薬動力学（ファー
マコキネティクス）の性質を大きく改善する。
部位は本発明の分解した種には存在しないフラグメント
上に存在することを本発明者の結果は示している。この
推定された部位は除去されると分子の活性中心は他の一
つのクリアランス機構により認識されるように思われ
る。従って活性中心のブロッキングは薬動力学（ファー
マコキネティクス）の性質を大きく改善する。
本発明のｔ−PAの種は適当には製薬組成物の形で投与
される。
される。
従つて本発明は又製薬上許容しうる担体と組合わさつ
た本明細書で規定されたｔ−PAのフイブリン溶解活性分
解種又はその誘導体よりなる製薬組成物を提供する。
た本明細書で規定されたｔ−PAのフイブリン溶解活性分
解種又はその誘導体よりなる製薬組成物を提供する。
本発明による組成物はヒトへの静脈内投与に適した製
薬組成物として従来のやり方に従つて処方されよう。
薬組成物として従来のやり方に従つて処方されよう。
代表的には静脈内投与用の組成物は滅菌した等張性水
性緩衝液中の滅菌酵素の溶液である。必要ならば本組成
物は又劣化ｔ−PAを溶液に保つ溶解化剤及び注射の部位
の痛みを和らげる局所麻酔剤例えばリグノカインを含ん
でもよい。一般に本発明のｔ−PAは蛋白の量を活性単位
で示す熱的にシールされた容器例えばアンプル又はパツ
ク中の乾燥粉末又は水のない濃縮物の如き単位投与の形
で供給されよう。ｔ−PA種が除去しうるブロツキング基
を含む場合遊離の蛋白が遊離される時間の表示がなされ
よう。蛋白が灌流により投与されるときそれは滅菌製薬
グレードの「注射用水」又は生理食塩水を含む灌流瓶に
より処理されよう。蛋白が注射により投与されるならば
それは滅菌水又は生理食塩水のアンプルにより処理され
よう。注射しうる又は灌流しうる組成物は投与前に成分
を混合することにより作られよう。
性緩衝液中の滅菌酵素の溶液である。必要ならば本組成
物は又劣化ｔ−PAを溶液に保つ溶解化剤及び注射の部位
の痛みを和らげる局所麻酔剤例えばリグノカインを含ん
でもよい。一般に本発明のｔ−PAは蛋白の量を活性単位
で示す熱的にシールされた容器例えばアンプル又はパツ
ク中の乾燥粉末又は水のない濃縮物の如き単位投与の形
で供給されよう。ｔ−PA種が除去しうるブロツキング基
を含む場合遊離の蛋白が遊離される時間の表示がなされ
よう。蛋白が灌流により投与されるときそれは滅菌製薬
グレードの「注射用水」又は生理食塩水を含む灌流瓶に
より処理されよう。蛋白が注射により投与されるならば
それは滅菌水又は生理食塩水のアンプルにより処理され
よう。注射しうる又は灌流しうる組成物は投与前に成分
を混合することにより作られよう。
投与される物質の量は必要なフイブリン溶解の量、そ
れが要求される速度、血栓症の症状の重さ、クロツトの
位置及び大きさに依存しよう。用いられる正確な投与量
及び投与の方法は治療を担当する医師による環境に応じ
て病状の性質を見てきめられるべきである。しかし一般
に成長した血栓を治療される患者は例えば５回の投与の
注射により又は灌流により0.01〜10mg/体重kg（１日当
り）を投与されよう。
れが要求される速度、血栓症の症状の重さ、クロツトの
位置及び大きさに依存しよう。用いられる正確な投与量
及び投与の方法は治療を担当する医師による環境に応じ
て病状の性質を見てきめられるべきである。しかし一般
に成長した血栓を治療される患者は例えば５回の投与の
注射により又は灌流により0.01〜10mg/体重kg（１日当
り）を投与されよう。
上述の投与量の範囲内で有害な毒性学上の作用は本発
明の化合物では示されない。
明の化合物では示されない。
従つて本発明の他の態様において患者に有効且非毒性
の量の本明細書で規定されたｔ−PAのフイブリン溶解活
性分解種又はその誘導体を投与することよりなる血栓症
を治療する方法を提供する。
の量の本明細書で規定されたｔ−PAのフイブリン溶解活
性分解種又はその誘導体を投与することよりなる血栓症
を治療する方法を提供する。
本発明は又活性治療物質として用いられるそして特に
血栓症の治療に用いられる本明細書で規定されたｔ−PA
のフイブリン溶解活性分解種又はその誘導体を提供す
る。
血栓症の治療に用いられる本明細書で規定されたｔ−PA
のフイブリン溶解活性分解種又はその誘導体を提供す
る。
以下の実施例は本発明を説明する。
本明細書における分子量（Mr）は非還元条件下ナトリ
ウムドデシルサルフエートポリアクリルアミドゲル電気
透析により求められる見掛け上の分子量である。
ウムドデシルサルフエートポリアクリルアミドゲル電気
透析により求められる見掛け上の分子量である。
実施例１ アラニン160ｔ−PA（Mr＝38,000）の単離 組換えボウス（Bowes）黒色腫細胞（ボウス黒色腫細
胞から組織型プラスミノーゲン活性化因子を産生させる
方法はRijken D.C.及びCollen D,.J.Biol.Chem.256（19
81）7035−7041に記載されている）により無血清培地へ
分泌された組織型プラスミノーゲン活性化因子はSDS PA
GE〔ユー・ケー・レエムリ（U.K.Laemmli）,1970,「ネ
ーチユア」227,680〜682〕次にフイブリンザイモグラフ
イ〔エー・グラネリーピペルノ（A.Granelli−Pipern
o）及びイー・ライヒ（E.Reich）,1978,「ジエー・エク
スペ・メデ（J.Exp.Med.）」,148,223〜234〕により数
種のｔ−PAを含むことが示された。すべてのｔ−PA種は
亜鉛キレート及びリジンセフアローゼ（Sepharose,商標
名）のクロマトグラフイ〔エム・ジエー・ブラウン（M.
J.Browne）ら、1985,「ジーン」,33,279〕により精製し
限外過により濃縮した。濃縮物を0.05MNH4HCO3へ緩衝
液交換しそして凍結乾燥した。ｔ−PA種をセフアデツク
ス（Sephadex,商標名）Ｇ−75のカラムを通す再生した
凍結乾燥物のクロマトグラフイにより分離した。Mr＝約
38,000の種を含む画分を発色性基質Ｈ−Ｄ−イレ−プロ
−アルグｐ−ニトロアニリドHClを用いて又はSDSPAGE次
にフイブリンザイモグラフイにより同定した。これらの
画分を集め限外過により濃縮しそしてセフアデツクス
Ｇ−75のカラムのクラマトグラフイに再びかけた。Mr＝
約38,000のｔ−PAの種を含む画分を前述の如く同定し集
め限外過により濃縮しそして凍結乾燥のため又は生体
内の直接使用のために適当な緩衝液へ緩衝液交換され
た。
胞から組織型プラスミノーゲン活性化因子を産生させる
方法はRijken D.C.及びCollen D,.J.Biol.Chem.256（19
81）7035−7041に記載されている）により無血清培地へ
分泌された組織型プラスミノーゲン活性化因子はSDS PA
GE〔ユー・ケー・レエムリ（U.K.Laemmli）,1970,「ネ
ーチユア」227,680〜682〕次にフイブリンザイモグラフ
イ〔エー・グラネリーピペルノ（A.Granelli−Pipern
o）及びイー・ライヒ（E.Reich）,1978,「ジエー・エク
スペ・メデ（J.Exp.Med.）」,148,223〜234〕により数
種のｔ−PAを含むことが示された。すべてのｔ−PA種は
亜鉛キレート及びリジンセフアローゼ（Sepharose,商標
名）のクロマトグラフイ〔エム・ジエー・ブラウン（M.
J.Browne）ら、1985,「ジーン」,33,279〕により精製し
限外過により濃縮した。濃縮物を0.05MNH4HCO3へ緩衝
液交換しそして凍結乾燥した。ｔ−PA種をセフアデツク
ス（Sephadex,商標名）Ｇ−75のカラムを通す再生した
凍結乾燥物のクロマトグラフイにより分離した。Mr＝約
38,000の種を含む画分を発色性基質Ｈ−Ｄ−イレ−プロ
−アルグｐ−ニトロアニリドHClを用いて又はSDSPAGE次
にフイブリンザイモグラフイにより同定した。これらの
画分を集め限外過により濃縮しそしてセフアデツクス
Ｇ−75のカラムのクラマトグラフイに再びかけた。Mr＝
約38,000のｔ−PAの種を含む画分を前述の如く同定し集
め限外過により濃縮しそして凍結乾燥のため又は生体
内の直接使用のために適当な緩衝液へ緩衝液交換され
た。
生成物をMr＝約38,000のｔ−PAと確認した。その理由
は、（１）それがｔ−PA及びｔ−PAB鎖に免疫学的な類
似点を有しそしてｕ−PAとは免疫学的に相違する、
（２）非還元条件下のSDSPAGEによりそれがPAGEブルー8
3〔ブリテイシユ・ドラツグ・ハウスズ（British Drug
Houses），英国〕を用いる蛋白の染色により又はフイブ
リンザイモグラフイ（第１図）によりMr＝約38,000を有
する、（３）ヒトフイブリンプレートの用量反応がMr＝
63,000/65,000のｔ−PAのそれと平行でありそしてｕ−P
Aのそれとは平行ではないそして（４）ｕ−PAが結合し
ない精製したヒトフイブリンクロツト定量において分子
が顕著なフイブリン結合活性を有する（実施例４参照）
からである。
は、（１）それがｔ−PA及びｔ−PAB鎖に免疫学的な類
似点を有しそしてｕ−PAとは免疫学的に相違する、
（２）非還元条件下のSDSPAGEによりそれがPAGEブルー8
3〔ブリテイシユ・ドラツグ・ハウスズ（British Drug
Houses），英国〕を用いる蛋白の染色により又はフイブ
リンザイモグラフイ（第１図）によりMr＝約38,000を有
する、（３）ヒトフイブリンプレートの用量反応がMr＝
63,000/65,000のｔ−PAのそれと平行でありそしてｕ−P
Aのそれとは平行ではないそして（４）ｕ−PAが結合し
ない精製したヒトフイブリンクロツト定量において分子
が顕著なフイブリン結合活性を有する（実施例４参照）
からである。
実施例２ 部分的に精製されたアラニン160ｔ−PA（Mr＝40,000）
の単離 亜鉛キレート及びリジンセフアロースを用いるｔ−PA
の精製（実施例１に記載）中回収されたｔ−PA活性の小
さなしかし変化する部分がリジンセフアロースカラムの
非吸着画分（Vo）に常にある。SDSPAGE次にフイブリン
ザイモグラフイにより分析すると見掛けMr＝40,000のｔ
−PA様種がこれらの製品に検出される。新しいリジンセ
フアロースカラムのクロマトグラフイに再びかけられる
とこの物質はそれに吸着しそして0.02Mトリス/0.5M NaC
l/0.5ML−アルギニン/0.01％ツウイーン（Tween）80pH
7.5を用いて次に解離される。限外過による濃縮後存
在する活性化因子の種の部分的な分離はセフアデツクス
G75のカラムを通る１回の通過により達成される。カラ
ムの画分された溶離物はSDS PAGE/フイブリンザイモグ
ラフイにより分析されそしてMr＝40,000に富んだ画分を
集め濃縮した。フイブリンザイモグラフイによる分析は
Mr＝40,000の種と実施例１のMr＝38,000の種との間のは
つきりした区別を示した（第１図）。
の単離 亜鉛キレート及びリジンセフアロースを用いるｔ−PA
の精製（実施例１に記載）中回収されたｔ−PA活性の小
さなしかし変化する部分がリジンセフアロースカラムの
非吸着画分（Vo）に常にある。SDSPAGE次にフイブリン
ザイモグラフイにより分析すると見掛けMr＝40,000のｔ
−PA様種がこれらの製品に検出される。新しいリジンセ
フアロースカラムのクロマトグラフイに再びかけられる
とこの物質はそれに吸着しそして0.02Mトリス/0.5M NaC
l/0.5ML−アルギニン/0.01％ツウイーン（Tween）80pH
7.5を用いて次に解離される。限外過による濃縮後存
在する活性化因子の種の部分的な分離はセフアデツクス
G75のカラムを通る１回の通過により達成される。カラ
ムの画分された溶離物はSDS PAGE/フイブリンザイモグ
ラフイにより分析されそしてMr＝40,000に富んだ画分を
集め濃縮した。フイブリンザイモグラフイによる分析は
Mr＝40,000の種と実施例１のMr＝38,000の種との間のは
つきりした区別を示した（第１図）。
実施例３ アラニン160ｔ−PA（Mr＝38,000）の純度の確認 実施例１に記載されたアラニン160ｔ−PA（Mr＝38,00
0）の製品の高純度は下記のテストで示された。
0）の製品の高純度は下記のテストで示された。
（１）SDS PAGE次に蛋白の染色後非還元サンプルはMr＝
38,000で単一の大きなバンドを示した。
38,000で単一の大きなバンドを示した。
（２）セクアル・リミテツド（Sequal Ltd.）〔英国，
アバデイーン〕により行われるＮ−末端配列分析は「ア
ラニン−グリシン−リジン−チロシン−」の分子のＡ鎖
部分についてのＮ−末端配列を与えた。混入した蛋白は
これらの残基の同定を妨げたに違いない。
アバデイーン〕により行われるＮ−末端配列分析は「ア
ラニン−グリシン−リジン−チロシン−」の分子のＡ鎖
部分についてのＮ−末端配列を与えた。混入した蛋白は
これらの残基の同定を妨げたに違いない。
（３）SDSPAGE次にフイブリンザイモグラフイ後単一の
溶解が存在した（第１図）。
溶解が存在した（第１図）。
実施例４ アラニン160ｔ−PAのフイブリン結合の確認 用いられるフイブリン結合テストはデイー・シー・リ
ケン（D.C.Rijken）及びデイー・コレン（D.Collen）
〔「ジエー・バイオロ・ケム．（J.Biol.Chem）」（198
1），256,7035〕のそれと同様であつた。主としてプラ
スミノーゲン活性化因子を含むフイブリノーゲン溶液を
トロンビンにより又はそれなしに処理されそしてすべて
沈でんしうる物質（例えばフイブリン）を遠心分離によ
り単離した。上澄み液をフイブリンプレート定量を用い
て定量した（実施例７記載）。２種の処理（トロンビン
により又はそれなしに）の上澄み液の間の活性化因子の
濃度中の差はクロツトに吸着した物質の量に等しかつ
た。
ケン（D.C.Rijken）及びデイー・コレン（D.Collen）
〔「ジエー・バイオロ・ケム．（J.Biol.Chem）」（198
1），256,7035〕のそれと同様であつた。主としてプラ
スミノーゲン活性化因子を含むフイブリノーゲン溶液を
トロンビンにより又はそれなしに処理されそしてすべて
沈でんしうる物質（例えばフイブリン）を遠心分離によ
り単離した。上澄み液をフイブリンプレート定量を用い
て定量した（実施例７記載）。２種の処理（トロンビン
により又はそれなしに）の上澄み液の間の活性化因子の
濃度中の差はクロツトに吸着した物質の量に等しかつ
た。
1.5mg/mlの最初のフイブリノーゲン〔カビ（Kabi）グ
レードＬ〕の濃度及び約100〜101U/mlの範囲内のアラニ
ン160ｔ−PAの４種の濃度を用いフイブリンクロツトへ
吸着されたアラニン160ｔ−PAの量は元の溶液中の量の5
5％であつた。
レードＬ〕の濃度及び約100〜101U/mlの範囲内のアラニ
ン160ｔ−PAの４種の濃度を用いフイブリンクロツトへ
吸着されたアラニン160ｔ−PAの量は元の溶液中の量の5
5％であつた。
実施例５ Ｎ′Ｎ′ジメチル ４−アミノベンゾイルアラニン160
ｔ−PA（Mr＝38,000）の合成 0.02Mホスフエート,0.15M塩化ナトリウム,0.01％ツウ
イーン80pH7.4（PBS/TW）中の5.5nモルのアラニン160ｔ
−PA（140μg/ml）を30分間25℃で３倍 モル過剰の
Ｎ′,N′ジメチル ４−アミノ安息香酸 ４−アミジノ
フエニルエステルHClにより処理した。遊離のアシル化
剤を次にセフアデツクスＧ−25を用いてPBS/TWへの緩衝
液交換により除去しそして生成物を−70℃で貯蔵した。
合成に用いた方法はヨーロツパ特許第0009879号に記載
されたのと同じであつた。
ｔ−PA（Mr＝38,000）の合成 0.02Mホスフエート,0.15M塩化ナトリウム,0.01％ツウ
イーン80pH7.4（PBS/TW）中の5.5nモルのアラニン160ｔ
−PA（140μg/ml）を30分間25℃で３倍 モル過剰の
Ｎ′,N′ジメチル ４−アミノ安息香酸 ４−アミジノ
フエニルエステルHClにより処理した。遊離のアシル化
剤を次にセフアデツクスＧ−25を用いてPBS/TWへの緩衝
液交換により除去しそして生成物を−70℃で貯蔵した。
合成に用いた方法はヨーロツパ特許第0009879号に記載
されたのと同じであつた。
37℃で0.1Mトリス,0.15M塩化ナトリウム,20％（V/V）
グリセロール,0.01％ツウイーン80pH7.4中で行われた脱
アシル化により3.4×10-4／秒の脱アシル化速度定数
（２回の測定の平均）を得た。
グリセロール,0.01％ツウイーン80pH7.4中で行われた脱
アシル化により3.4×10-4／秒の脱アシル化速度定数
（２回の測定の平均）を得た。
実施例６ ｐ′−アニソイルアラニン160ｔ−PAの合成 ホスフエート緩衝された生理食塩水〔PBS「Ａ」；デ
ユルベコ（Dulbecco）〕/0.01％ツウイーン80/0.025M L
−リジン/10mg/mlのマンニトール/1mM E−アミノカプロ
エート（EACA）中の21nモルのアラニン160ｔ−PA（0.5m
g/ml）を30分間25℃で３倍モル過剰のｐ−アミジノフエ
ニル ｐ′−アニセートHClにより処理した。遊離のア
シル化剤をセフアデツクスG25を用いてPBS「Ａ」/0.01
％ツウイーン80/0.02MEACAへの緩衝液交換により除去し
た。生成物を−70℃に貯蔵した。
ユルベコ（Dulbecco）〕/0.01％ツウイーン80/0.025M L
−リジン/10mg/mlのマンニトール/1mM E−アミノカプロ
エート（EACA）中の21nモルのアラニン160ｔ−PA（0.5m
g/ml）を30分間25℃で３倍モル過剰のｐ−アミジノフエ
ニル ｐ′−アニセートHClにより処理した。遊離のア
シル化剤をセフアデツクスG25を用いてPBS「Ａ」/0.01
％ツウイーン80/0.02MEACAへの緩衝液交換により除去し
た。生成物を−70℃に貯蔵した。
PBS「Ａ」/0.01％ツウイーン80で行われた脱アシル化
により3.9×10-4／秒の脱アシル化速度定数を得た。脱
アシル化前に少くとも93％の物質がアシル型であつた。
により3.9×10-4／秒の脱アシル化速度定数を得た。脱
アシル化前に少くとも93％の物質がアシル型であつた。
実施例７ モルモツトの血流中のフイブリン溶解活性の定量 オスのダンキン・ハートレー（Dunkin Hartley）モル
モツト（350〜450g）をウレタン（25％V/V溶液;6ml/kg
i.p.）により麻酔した。１本の頸動脈を血液サンプルの
採取のためにカニヌレートした。１本の大腿静脈をヘパ
リンの注入（50U/kg i.v.）及びテスト中の化合物の注
入のためにカニヌレートした。ヘパリン化の約５分後に
投与前の血液サンプルをとりそして0.1容量の129mMのく
えん酸三ナトリウムと混合した。テスト中の化合物を次
に10秒かけて注入した（1ml/kg）。さらに血液サンプル
を正確に2,4,8,16,30及び60分後にとつた。ヘパリン処
理（50U/kg i.v.）をカニヌーラ開通性を維持するため
にサンプリングの30分後に繰返した。すべてのくえん酸
塩添加血液サンプルをそれぞれの実験の終りまで氷上に
保ち次に血漿を得るために４℃で15分間1700gで遠心分
離した。ユーグロブリン画分を0.1mlの各血漿を水中の
氷冷0.011％（V/V）酢酸1.82mlへ加えることにより沈で
んさせた。氷中に30分間置いた後すべての管を４℃で15
分間遠心分離した。上澄み液を捨て各管の内壁を注意深
く拭いて乾燥させそして各沈でんを0.01％（V/V）ツウ
イーン80を含む0.4mlのホスフエート緩衝生理食塩水pH
7.4に再溶解した。一部（30μｌ）を次に四分割のフイ
ブリンプレートに適用した。フイブリンプレートは125m
MNaCl中の0.029Mバルビトン（pH7.4）に溶解した0.4％
（W/V）ヒトフイブリノーゲン〔カビ（Kabi），グレー
ドL,フロー・ラボラトリーズ（Flow Laboratories），
スコツトランド〕から製造され10×10cmの正方形のプラ
スチツク皿〔ステリリン（Sterilin）〕へ10mlピペツト
で移しそして0.3mlのウシトロンビン〔50NIH単位/ml,パ
ーク・デービス（Parke−Davis）、英国〕との急速な混
合によりクロツトされた。プレートを通常18〜24時間し
かしもし必要ならばそれより長く37℃でインキユベート
しそして水性ブロモフエノールブルーにより染めた。そ
れぞれの溶解帯についてそれぞれ直角の２本の直径をベ
ルニエ（Vernier）コンパスを用いて測つた。それぞれ
のサンプルのすべての直径を平均しそしてこの平均値を
補正曲線を参照してフイブリン溶解活性へ転換した。曲
線は各動物の投与前の血漿へテスト中の化合物の周知の
量を加えることにより得られた。これらの標準は実験用
サンプルと同じ方法及び同じ時間を用いて処理された。
補正曲線を作るために直径（mm）は化合物のlog10濃度
に対してプロツトされた。それぞれの実験用サンプル中
の化合物の血漿濃度はそれぞれのモルモツトについて50
mlの血漿/kg体重の推定に基いて予想されるものの％と
して示された。
モツト（350〜450g）をウレタン（25％V/V溶液;6ml/kg
i.p.）により麻酔した。１本の頸動脈を血液サンプルの
採取のためにカニヌレートした。１本の大腿静脈をヘパ
リンの注入（50U/kg i.v.）及びテスト中の化合物の注
入のためにカニヌレートした。ヘパリン化の約５分後に
投与前の血液サンプルをとりそして0.1容量の129mMのく
えん酸三ナトリウムと混合した。テスト中の化合物を次
に10秒かけて注入した（1ml/kg）。さらに血液サンプル
を正確に2,4,8,16,30及び60分後にとつた。ヘパリン処
理（50U/kg i.v.）をカニヌーラ開通性を維持するため
にサンプリングの30分後に繰返した。すべてのくえん酸
塩添加血液サンプルをそれぞれの実験の終りまで氷上に
保ち次に血漿を得るために４℃で15分間1700gで遠心分
離した。ユーグロブリン画分を0.1mlの各血漿を水中の
氷冷0.011％（V/V）酢酸1.82mlへ加えることにより沈で
んさせた。氷中に30分間置いた後すべての管を４℃で15
分間遠心分離した。上澄み液を捨て各管の内壁を注意深
く拭いて乾燥させそして各沈でんを0.01％（V/V）ツウ
イーン80を含む0.4mlのホスフエート緩衝生理食塩水pH
7.4に再溶解した。一部（30μｌ）を次に四分割のフイ
ブリンプレートに適用した。フイブリンプレートは125m
MNaCl中の0.029Mバルビトン（pH7.4）に溶解した0.4％
（W/V）ヒトフイブリノーゲン〔カビ（Kabi），グレー
ドL,フロー・ラボラトリーズ（Flow Laboratories），
スコツトランド〕から製造され10×10cmの正方形のプラ
スチツク皿〔ステリリン（Sterilin）〕へ10mlピペツト
で移しそして0.3mlのウシトロンビン〔50NIH単位/ml,パ
ーク・デービス（Parke−Davis）、英国〕との急速な混
合によりクロツトされた。プレートを通常18〜24時間し
かしもし必要ならばそれより長く37℃でインキユベート
しそして水性ブロモフエノールブルーにより染めた。そ
れぞれの溶解帯についてそれぞれ直角の２本の直径をベ
ルニエ（Vernier）コンパスを用いて測つた。それぞれ
のサンプルのすべての直径を平均しそしてこの平均値を
補正曲線を参照してフイブリン溶解活性へ転換した。曲
線は各動物の投与前の血漿へテスト中の化合物の周知の
量を加えることにより得られた。これらの標準は実験用
サンプルと同じ方法及び同じ時間を用いて処理された。
補正曲線を作るために直径（mm）は化合物のlog10濃度
に対してプロツトされた。それぞれの実験用サンプル中
の化合物の血漿濃度はそれぞれのモルモツトについて50
mlの血漿/kg体重の推定に基いて予想されるものの％と
して示された。
第２図はｔ−PAのMr＝38,000の種のＮ′Ｎ′−ジメチ
ル ４−アミノベンゾイル（DAB）誘導体がｔ−PA又は
ｔ−PAのDAB−誘導体よりもモルモツトの循環からはる
かに遅く排出されることを示す。
ル ４−アミノベンゾイル（DAB）誘導体がｔ−PA又は
ｔ−PAのDAB−誘導体よりもモルモツトの循環からはる
かに遅く排出されることを示す。
第１図はアラニン160ｔ−PAの２種の変種のナトリウム
ドデシルサルフエートボリアクリルアミドゲル電気透析
次にフイブリンザイモグラフイを示す。 高純度アラ160ｔ−PA（Mr＝38,000）〔レーンＡ〕又は
部分的に精製されたアラ160ｔ−PA（Mr＝40,000）〔レ
ーンＢ〕又は両方の混合物〔レーンＣ〕は主として実施
例１に記載されたようにSDS PAGE次にフイブリンザイモ
グラフイにより分析された。生成物中のフイブリン溶解
活性種は溶解されないフイブリンに対して明確な溶解帯
として現われる。レーンＤはフイブリン溶解マーカー蛋
白である。 第２図はモルモツトの血流中のフイブリン溶解活性を示
す。 投与後の分に対する最初の理論上の濃度（％）のプロツ
トにおいてプロツトの印は次の通りである。 天然のｔ−PA（ｎ＝７） ・ DAB t−PA（ｎ＝４） △ Mr＝38,000t−PA（ｎ＝４） ▲ DAB Mr＝38,000t−PA（ｎ＝４） ｎ＝動物の数 誤差の線は平均の標準誤差である。
ドデシルサルフエートボリアクリルアミドゲル電気透析
次にフイブリンザイモグラフイを示す。 高純度アラ160ｔ−PA（Mr＝38,000）〔レーンＡ〕又は
部分的に精製されたアラ160ｔ−PA（Mr＝40,000）〔レ
ーンＢ〕又は両方の混合物〔レーンＣ〕は主として実施
例１に記載されたようにSDS PAGE次にフイブリンザイモ
グラフイにより分析された。生成物中のフイブリン溶解
活性種は溶解されないフイブリンに対して明確な溶解帯
として現われる。レーンＤはフイブリン溶解マーカー蛋
白である。 第２図はモルモツトの血流中のフイブリン溶解活性を示
す。 投与後の分に対する最初の理論上の濃度（％）のプロツ
トにおいてプロツトの印は次の通りである。 天然のｔ−PA（ｎ＝７） ・ DAB t−PA（ｎ＝４） △ Mr＝38,000t−PA（ｎ＝４） ▲ DAB Mr＝38,000t−PA（ｎ＝４） ｎ＝動物の数 誤差の線は平均の標準誤差である。
Claims (11)
- 【請求項１】天然のｔ−PA A鎖の唯一の機能的及び構造
的に無傷の領域としてのクリングル（Kringle）２へ結
合した天然のｔ−PAのフイブリン溶解的に無傷のＢ鎖よ
りなる組織型プラスミノーゲン活性化因子の精製された
フイブリン溶解活性があるポリペプチド種（specie
s）。 - 【請求項２】ポリペプチド種が38,000〜40,000の範囲内
の分子量を有する特許請求の範囲第（１）項記載の種。 - 【請求項３】ポリペプチド種が約38,000の分子量を有す
る特許請求の範囲第（２）項記載の種。 - 【請求項４】ポリペプチド種がアラニン160−プロリン
527ｔ−PAである特許請求の範囲第（１）項記載の種。 - 【請求項５】フイブリン溶解活性に必須な触媒部位が加
水分解の擬一次速度定数が37℃でpH7.4で等張性水性媒
体で10-6／秒〜10-2／秒の範囲内にあるような速度で加
水分解により除去されうるアシル基によりブロツクされ
ている、天然のｔ−PA A鎖の唯一の機能的及び構造的に
無傷の領域としてのクリングル２へ結合した天然のｔ−
PAのフイブリン溶解的に無傷のＢ鎖よりなる組織型プラ
スミノーゲン活性化因子の精製されたフイブリン溶解活
性があるポリペプチド種の誘導体。 - 【請求項６】フイブリン溶解活性に必須な触媒部位が
Ｎ′,N′ジメチル４−アミノベンゾイルによりブロツク
されている、アラニン160-プロリン527ｔ−PAであるポ
リペプチド種の誘導体。 - 【請求項７】フイブリン溶解活性に必須な触媒部位がｐ
−アニソイルによりブロツクされている、アラニン160-
プロリン527ｔ−PAであるポリペプチド種の誘導体。 - 【請求項８】天然のｔ−PA A鎖の唯一の機能的及び構造
的に無傷の領域としてのクリングル２へ結合した天然の
ｔ−PAのフイブリン溶解的に無傷のＢ鎖よりなる組織型
プラスミノーゲン活性化因子の精製されたフイブリン溶
解活性があるポリペプチド種と製薬上許容しうる担体と
からなる血栓症の治療に用いられる製薬組成物。 - 【請求項９】ｔ−PA分泌細胞系から得られる天然のｔ−
PAから天然のｔ−PA A鎖の唯一の機能的及び構造的に無
傷の領域としてのクリングル２へ結合した天然のｔ−PA
のフイブリン溶解的に無傷のＢ鎖よりなる組織型プラス
ミノーゲン活性化因子の精製されたフイブリン溶解活性
があるポリペプチド種を分離する該種を製造する方法。 - 【請求項１０】ポリペプチド種が約38,000の分子量を有
する特許請求の範囲第（９）項記載の方法。 - 【請求項１１】ポリペプチド種がアラニン160−プロリ
ン527ｔ−PAである特許請求の範囲第（９）項記載の方
法。
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