JPH0775580A - 新規なｔ−ＰＡ改変体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】ｔ−ＰＡのアミノ酸配列中、天然型のｔ−ＰＡ
のアミノ酸配列の２７６位から３０６位に相当するアミ
ノ酸配列の少なくとも一部が対応関係を有するＵＫのア
ミノ酸配列に置換されており、さらに天然型のｔ−ＰＡ
の１１７位から１１９位、１８４位から１８６位及び４
４８位から４５０位に相当するＮ結合糖鎖付加コンセン
サス配列の少なくとも１つが、Ｎ結合糖鎖付加コンセン
サス配列以外の配列に置換されていることを特徴とする
ｔ−ＰＡ改変体。 【効果】本発明のｔ−ＰＡ改変体は、血漿塊特異性が向
上した新規なｔ−ＰＡ改変体であり、その結果として全
身性の出血傾向というｔ−ＰＡの副作用を減じることが
できる。さらに、改変体によっては血中半減期が延長す
るので、血栓症治療剤として有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、新規な組織プラスミノ
ーゲン活性化因子（以下、ｔ−ＰＡ）改変体に関する。
更に詳しくは、ｔ−ＰＡのアミノ酸配列中、天然型のｔ
−ＰＡの２７６位から３０６位までに相当するアミノ酸
配列の少なくとも一部が尿プラスミノーゲン活性化因子
（以下、ＵＫ）の対応するアミノ酸配列に置換されてお
り、さらに天然型のｔ−ＰＡの１１７位から１１９位、
１８４位から１８６位及び４４８位から４５０位に相当
するＮ結合糖鎖付加コンセンサス配列の少なくとも１つ
が、Ｎ結合糖鎖付加コンセンサス配列以外の配列に置換
されていることにより、血漿塊特異性が向上し、かつ改
変体によっては血中半減期が延長している新規なｔ−Ｐ
Ａ改変体に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】ｔ−ＰＡは、血漿中に存在する不活性型
酵素前駆体であるプラスミノーゲンを加水分解すること
によって活性型酵素であるプラスミンに変換する。プラ
スミンは、血管内に種々の原因によって生じた血栓、あ
るいは血漿塊のマトリックスを構成するフィブリンを分
解し、その結果血栓、血漿塊を溶解する（文献ａ）。Ｕ
Ｋやストレプトキナーゼなどの旧来の血栓溶解剤がフィ
ブリン特異性を全く有していないのに対し、ｔ−ＰＡは
比較的高いフィブリン特異性を有している。このためｔ
−ＰＡはフィブリン、ひいては臨床において血栓を特異
的に溶解する性質を有し、そして出血等の副作用の少な
い血栓溶解剤として注目されてきた。しかしながら、実
際ｔ−ＰＡを臨床に用いた場合、閉塞冠動脈の再開通に
は予想されていたよりも遙かに大量の投与が必要である
ことが明らかとなった（文献ｂ）。大量投与の結果、ｔ
−ＰＡはフィブリン特異的であるとはいえ若干は血液中
のフィブリノーゲンをも分解してしまうため、結局全身
性の出血傾向が生じてしまうという副作用が無視できな
い問題となっている。

【０００３】この様な観点から、より高い血栓特異性の
付与を目的としたｔ−ＰＡ改変体の作製も行われ、多数
の報告（文献ｃ，ｄ）がなされているが、未だ目的を充
分に達成したものは数少ない。成功例としては文献ｅ
に、天然型のｔ−ＰＡの２９６位から２９９位までの４
個のアミノ酸を全てアラニンに置換した改変体が示され
ているが、そのフィブリン特異性は４．４倍、血漿塊特
異性はせいぜい約３倍向上したに過ぎない。ここで血漿
塊特異性とは、文献ｅの著者らによって報告された方法
であり、血栓特異性評価において、試験管内における評
価を生体内により近い条件で行なう目的で、実際にヒト
血漿及び血漿塊を用いた試験方法により評価される血栓
特異性の指標である。従って、純粋なフィブリン及びフ
ィブリン塊を用いて行なわれるフィブリン特異性に比較
して、実際の臨床における血栓特異性をより反映すると
考えられる。

【０００４】また、ｔ−ＰＡの生体内での持続時間−い
わゆる血中半減期が数分と短いことが大量投与の一因と
なっており、上述の血栓特異性の問題と共にｔ−ＰＡを
臨床に用いる際の問題点となっている。このことから生
体内での持続時間を延長することを目的としたｔ−ＰＡ
改変体の作成も多数行われており、その中に、天然型の
ｔ−ＰＡの１１７位から１１９位、１８４位から１８６
位及び４４８位から４５０位に相当するＮ結合糖鎖付加
コンセンサス配列のいずれか、あるいは全部をＮ結合糖
鎖付加コンセンサス配列以外の配列に変異させたｔ−Ｐ
Ａ改変体、即ち該変異後の変異配列部分に糖鎖を持たな
いｔ−ＰＡ改変体が知られている。

【０００５】これらの報告の中で、特に天然型のｔ−Ｐ
Ａの１１７位から１１９位に相当するＮ結合糖鎖付加コ
ンセンサス配列に糖鎖を持たないｔ−ＰＡ改変体あるい
はその改変体にさらに別の部位の改変を付加した改変体
において、血中半減期が延長していることも知られてい
る（文献ｆ，ｇ，ｈ）。これらの報告は、生体内におけ
る安定性を向上させ、投与量を減少させるという意味で
は成功をおさめた。しかしながら前述の通り、これらの
報告においても天然型のｔ−ＰＡの血栓特異性は充分で
はないため、生体内での持続時間のみが延長されても結
局出血性副作用が発現するという問題は未解決のままで
ある。従って、高い血栓特異性、即ち血漿塊を特異的
に溶解するという血漿塊特異性を有するとともに、血
中半減期が天然型のｔ−ＰＡに比べて延長されている、
という２つの特性を有したｔ−ＰＡ改変体は、未だ知ら
れていない。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、天然型のｔ
−ＰＡと比較して血漿塊を特異的に溶解するという血漿
塊特異性が向上し、かつ改変体によっては血中半減期が
延長している新規なｔ−ＰＡ改変体を提供することを目
的とする。即ち、本発明の課題は、（１）血漿中−すな
わちフィブリノーゲン存在下ではプラスミノーゲン活性
化活性が非常に低く、従ってフィブリノーゲンの分解は
僅かであるが、血漿塊中−すなわちフィブリン存在下で
は天然型のｔ−ＰＡより高いプラスミノーゲン活性化活
性を発現し、それゆえフィブリンを充分に溶解する、す
なわち血漿塊特異性が向上しており、かつ（２）改変体
によっては血中半減期が延長しているため、臨床面で効
果の持続が期待されると共に投与量を減少させることの
可能な新規なｔ−ＰＡ改変体を提供することである。

【０００７】従って、本発明のｔ−ＰＡ改変体は血漿塊
特異性が向上しているので、循環血漿中にある時はプラ
スミノーゲンの活性化およびそれに引き続くフィブリノ
ーゲンの分解が非常に少なく、フィブリンの存在する血
栓（血漿塊）局所に到達して初めて天然型のｔ−ＰＡよ
り高いプラスミノーゲン活性化活性を発現して血栓を溶
解するので、天然型のｔ−ＰＡに比べてはもとより、従
来の技術の欄に記載された文献を代表とする、フィブリ
ン特異性が向上した公知の改変体と比較した場合であっ
ても血漿塊特異性が高く、全身性の出血傾向という副作
用を生じ難いことが期待される。従って本発明は、実際
の臨床における治療用血栓溶解剤として安全性の高い新
規な血栓溶解剤を提供するものである。

【０００８】先の従来の技術の欄に記載したように、天
然型のｔ−ＰＡの１１７位から１１９位、１８４位から
１８６位及び４４８位から４５０位に相当するＮ結合糖
鎖付加コンセンサス配列をＮ結合糖鎖付加コンセンサス
配列以外の配列に置換させると該置換後の配列中に糖鎖
が結合しなくなることが知られており、該糖鎖を持たな
いｔ−ＰＡ改変体の中に、血中半減期が延長しているも
のが見い出されている（文献ｆ，ｇ，ｈ）。本発明のｔ
−ＰＡ改変体も、上記Ｎ結合糖鎖付加コンセンサス配列
の少なくとも１つがＮ結合糖鎖付加コンセンサス配列以
外の配列に置換を行なうため、改変体によっては血中半
減期が延長される。これにより、上述の血漿塊特異性に
加えて本発明の血栓症治療剤としての効用をさらに高め
るものと期待される。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、最近ｔ−
ＰＡの２７６位から３０６位までのアミノ酸配列のうち
少なくとも一部がＵＫの対応アミノ酸配列に置換された
ｔ−ＰＡ改変体が、優れた血漿塊特異性を示すことを見
いだしている。このような性質を有するｔ−ＰＡ改変体
の代表的化合物としては、例えばＣＳ１が挙げられる
（ＰＣＴ／ＪＰ９２／００４１５号明細書）。本発明者
らは、さらに研究を継続した結果、上記のような置換を
有し、さらに天然型のｔ−ＰＡの１１７位から１１９
位、１８４位から１８６位及び４４８位から４５０位に
相当するＮ結合糖鎖付加コンセンサス配列の少なくとも
１つが、Ｎ結合糖鎖付加コンセンサス配列以外の配列に
置換されることにより、血漿塊特異性がさらに向上し、
かつ改変体によっては血中半減期が延長している新規な
ｔ−ＰＡ改変体が得られることをはじめて見いだした。

【００１０】すなわち、本発明の要旨は、 （１）ｔ−ＰＡのアミノ酸配列中、天然型のｔ−ＰＡの
アミノ酸配列の２７６位から３０６位に相当するアミノ
酸配列の少なくとも一部が下記に示すような対応関係を
有するＵＫのアミノ酸配列に置換されており、さらに天
然型のｔ−ＰＡの１１７位から１１９位、１８４位から
１８６位及び４４８位から４５０位に相当するＮ結合糖
鎖付加コンセンサス配列の少なくとも１つが、Ｎ結合糖
鎖付加コンセンサス配列以外の配列に置換されているこ
とを特徴とするｔ−ＰＡ改変体、

【００１１】

【化２】

【００１２】（なお、アミノ酸配列において対応関係と
は、天然型のｔ−ＰＡの２７６位がＵＫの１５９位に対
応し、以下順次上段の配列が下段の配列に対応する関係
を示す。また、上記の配列表示における−は、ＵＫのア
ミノ酸配列への置換においてアミノ酸が欠失した状態で
対応するものとする。） （２）形質転換された原核性生物細胞または真核性生物
細胞において、前記（１）記載のｔ−ＰＡ改変体をコー
ドしているＤＮＡを発現させ得る組換え発現ベクター、 （３）前記（２）記載の組換え発現ベクターで形質転換
された原核性生物細胞または真核性生物細胞、並びに （４）前記（１）記載のｔ−ＰＡ改変体を有効成分とし
て含有することを特徴とする血栓症治療剤に関する。

【００１３】本発明において、天然型のｔ−ＰＡのアミ
ノ酸配列とは、Ｐｅｎｎｉｃａらにより既に報告された
５２７個のアミノ酸からなる配列をいう（文献ｉ）。ま
た、ＵＫのアミノ酸配列とはＨｏｌｍｅｓらにより既に
報告された４１１個のアミノ酸からなる配列をいう（文
献ｊ）。本発明のｔ−ＰＡ改変体は、天然型のｔ−ＰＡ
のアミノ酸配列の２７６位から３０６位に相当するアミ
ノ酸配列の少なくとも一部が、下記の対応関係を有する
ＵＫのアミノ酸配列に置換されているが、ここに言う天
然型のｔ−ＰＡの２７６位は一本鎖から二本鎖への開裂
部位の直後の位置にあって、これに対応するＵＫのアミ
ノ酸配列領域は、ＵＫの一本鎖前駆体であるプロＵＫの
二本鎖型（すなわちＵＫ）への開裂部位直後のアミノ酸
残基である１５９位を指す。

【００１４】

【化３】

【００１５】なお、アミノ酸配列において対応関係と
は、天然型のｔ−ＰＡの２７６位がＵＫの１５９位に対
応し、以下順次上段のｔ−ＰＡのアミノ酸配列が下段の
ＵＫのアミノ酸配列に対応する関係を指す。また、本発
明でいうＵＫの置換領域におけるアミノ酸配列は、天然
型のｔ−ＰＡの置換領域におけるアミノ酸配列よりアミ
ノ酸が１個少なく、天然型のｔ−ＰＡの２９５位に対応
するＵＫのアミノ酸（上記の配列表示において−で示さ
れる部分）は、ＵＫのアミノ酸配列への置換においてア
ミノ酸が欠失した状態で対応するものとする。従って、
本発明において天然型のｔ−ＰＡの２７６位から３０６
位に対応するＵＫのアミノ酸配列とは、ＵＫの１５９位
から１８８位のアミノ酸配列を指す。本発明のｔ−ＰＡ
改変体は、このような対応関係を有するＵＫのアミノ酸
配列に置換されているが、その置換領域は天然型のｔ−
ＰＡの２７６位から３０６位のすべてであってもよく、
その一部であってもよい。

【００１６】本発明において、Ｎ結合糖鎖付加コンセン
サス配列とはタンパク質全般において共通の公知のアミ
ノ酸配列であり、「アスパラギン−Ｘ（プロリン以外の
アミノ酸）−セリン又はスレオニン」を指す。従って、
天然型のｔ−ＰＡにおける１１７位から１１９位のＮ結
合糖鎖付加コンセンサス配列とは「アスパラギン−セリ
ン−セリン」のアミノ酸配列を指し、１８４位から１８
６位のそれは「アスパラギン−グリシン−セリン」のア
ミノ酸配列を指し、４４８位から４５０位のそれは「ア
スパラギン−アルギニン−スレオニン」のアミノ酸配列
を指す。本発明において、Ｎ結合糖鎖付加コンセンサス
配列以外の配列とは、上記のＮ結合糖鎖付加コンセンサ
ス配列「アスパラギン−Ｘ（プロリン以外のアミノ酸）
−セリン又はスレオニン」以外の配列を指し、通常これ
らのコンセンサス配列におけるアミノ酸の置換、挿入、
削除等によりＮ結合糖鎖付加コンセンサス配列以外の配
列からなる改変体を作製することができる。例えば、ア
ミノ酸の置換による方法としては、天然型のｔ−ＰＡの
１１７位、１８４位及び４４８位に相当するアスパラギ
ンを他のアミノ酸（例えば、グルタミン等）に置換する
のも１つの方法である。

【００１７】本発明においては、これらのＮ結合糖鎖付
加コンセンサス配列の少なくとも１つが、Ｎ結合糖鎖付
加コンセンサス配列以外の配列に置換されているもので
ある。例えば、次のような態様が挙げられる。 天然型のｔ−ＰＡの１１７位から１１９位、１８４
位から１８６位及び４４８位から４５０位に相当するＮ
結合糖鎖付加コンセンサス配列のすべてがＮ結合糖鎖付
加コンセンサス配列以外の配列に置換されたもの、 Ｎ結合糖鎖付加コンセンサス配列のうち、天然型の
ｔ−ＰＡの１１７位から１１９位及び１８４位から１８
６位に相当するＮ結合糖鎖付加コンセンサス配列のみが
Ｎ結合糖鎖付加コンセンサス配列以外の配列に置換され
たもの、 Ｎ結合糖鎖付加コンセンサス配列のうち、天然型の
ｔ−ＰＡの１１７位から１１９位及び４４８位から４５
０位に相当するＮ結合糖鎖付加コンセンサス配列のみが
Ｎ結合糖鎖付加コンセンサス配列以外の配列に置換され
たもの、 Ｎ結合糖鎖付加コンセンサス配列のうち、天然型の
ｔ−ＰＡの１１７位から１１９位に相当するＮ結合糖鎖
付加コンセンサス配列のみがＮ結合糖鎖付加コンセンサ
ス配列以外の配列に置換されたもの。

【００１８】本発明のｔ−ＰＡ改変体は、前記のように
ＵＫのアミノ酸の置換領域を有し、かつＮ結合糖鎖付加
コンセンサス配列を改変したものであれば特に制限され
ることはなく、種々の改変体を挙げることができる。な
かでも好ましい例としては、例えば、次のような態様が
挙げられる。 天然型のｔ−ＰＡのアミノ酸配列の２７６位から３
０６位のアミノ酸配列がＵＫの１５９位から１８８位の
アミノ酸配列に置換されており、さらに天然型のｔ−Ｐ
Ａの１１７位、１８４位及び４４８位に相当するアスパ
ラギンがグルタミンに置換されたｔ−ＰＡ改変体、 天然型のｔ−ＰＡのアミノ酸配列の２７６位から３
０６位のアミノ酸配列がＵＫの１５９位から１８８位の
アミノ酸配列に置換されており、さらに天然型のｔ−Ｐ
Ａの１１７位及び１８４位に相当するアスパラギンがグ
ルタミンに置換されたｔ−ＰＡ改変体、 天然型のｔ−ＰＡのアミノ酸配列の２７６位から３
０６位のアミノ酸配列がＵＫの１５９位から１８８位の
アミノ酸配列に置換されており、さらに天然型のｔ−Ｐ
Ａの１１７位及び４４８位に相当するアスパラギンがグ
ルタミンに置換されたｔ−ＰＡ改変体、 天然型のｔ−ＰＡのアミノ酸配列の２７６位から３
０６位のアミノ酸配列がＵＫの１５９位から１８８位の
アミノ酸配列に置換されており、さらに天然型のｔ−Ｐ
Ａの１１７位に相当するアスパラギンがグルタミンに置
換されたｔ−ＰＡ改変体。 なかでも、後述の試験例で示すように血漿塊特異性が特
に顕著に向上したものとしては前記ののｔ−ＰＡ改変
体（ＣＳ１Ｙ）が、血漿塊特異性に加え、さらに血中半
減期が特に顕著に延長したものとしては前記ののｔ−
ＰＡ改変体（ＣＳ１Ｚ）が挙げられる。

【００１９】本発明のｔ−ＰＡ改変体は、前記のような
置換の領域を有するが、これらの領域以外のアミノ酸配
列については特に限定されない。即ち、天然型のｔ−Ｐ
Ａのアミノ酸配列と同一であってもよく、あるいは本発
明のｔ−ＰＡ改変体の特性に影響を与えない範囲で変異
体のアミノ酸であってもよい。本発明のｔ−ＰＡ改変体
の調製は、例えば天然型のｔ−ＰＡの１１７位から１１
９位、１８４位から１８６位及び４４８位から４５０位
に相当するＮ結合糖鎖付加コンセンサス配列の少なくと
も一つをコンセンサス配列以外の配列に置換したｔ−Ｐ
Ａ改変体をまず作製し、次にこのｔ−ＰＡ改変体におい
て、天然型のｔ−ＰＡのアミノ酸配列の２７６位から３
０６位に相当するアミノ酸配列の少なくとも一部を、対
応関係を有するＵＫのアミノ酸配列に置換することによ
って行うことができる。

【００２０】具体的には、例えば天然型のｔ−ＰＡのｃ
ＤＮＡの１１７位、１８４位及び４４８位に相当するア
スパラギンをコードするコドンを部位特異的変異により
他のアミノ酸（例えばグルタミン）をコードするコドン
に置換し、さらに天然型のｔ−ＰＡの２７６位から３０
６位に相当する領域を含むＥｃｏＲＩ断片を制限酵素消
化によって切り出し、これに代えて、天然型のｔ−ＰＡ
の２７６位から３０６位のアミノ酸配列がＵＫの１５９
位から１８８位のアミノ酸配列に置換されたｔ−ＰＡ類
似体遺伝子ＣＳ１（ＰＣＴ／ＪＰ９２／００４１５号明
細書）より調製した対応するＥｃｏＲＩ制限断片を挿入
し、適当な発現ベクターと連結してから、これを宿主内
に導入して形質転換を行ない、形質転換宿主細胞を培養
することにより、本発明のｔ−ＰＡ改変体を調製するこ
とができる。以下、個々の技術の詳細について述べる。
また、本発明においては、このような調製順序を逆にし
て、まず対応するＵＫの配列の置換を行った後、部位特
異的変異によりＮ結合糖鎖付加コンセンサス配列の改変
を行ってもよい。

【００２１】本発明のｔ−ＰＡ改変体の作成には、通常
天然型のｔ−ＰＡをコードするｃＤＮＡを原材料として
用いるのが好都合である。天然型のｔ−ＰＡをコードす
るｃＤＮＡは、たとえばボーズメラノーマ細胞からのク
ローニングによって、たとえば文献ｋに記載されている
ように既に取得されており、従ってそのｃＤＮＡ配列、
アミノ酸配列も知られている。プラスミド中にクローニ
ングしたｔ−ＰＡｃＤＮＡの特定の配列を置換する方法
は、既に自由に行える状況になっており、置換の手法と
しては、ゾラー及びスミスらの方法が参照される（文献
ｋ）。

【００２２】置換されるべき塩基配列を含む変異プライ
マーの作製は、ホスホアミダイト法（文献ｌ）が有効に
利用され、オリゴヌクレオチドの合成と精製は、アプラ
イドバイオシステムズ社のモデル３８１Ａ ＤＮＡシン
セサイザー及び同社のオリゴヌクレオチド精製用カート
リッジを利用するのが便利である。また、目的とする置
換、あるいは挿入されたＤＮＡ配列を確認するために
は、ジデオキシ法（文献ｍ）の原理を用い、例えばＴａ
ｑポリメラーゼを利用したサイクルシークエンスの手法
により行うことができる。そのためには、アプライドバ
イオシステムズ社のモデル３７３Ａ ＤＮＡシークエン
サーが有効に用いられる。その他、実施例に記載されて
いるような制限酵素によるＤＮＡの切断、それにより生
ずるＤＮＡ断片のポリアクリルアミドゲル電気泳動によ
る分離、回収、あるいは連結等の遺伝子操作は全て公知
であり、主として文献ｎが参照される。

【００２３】このようにして得られたｔ−ＰＡ改変体を
コードするｃＤＮＡは、ＣＤＭ８（ｏｒｉ^- ）等、周知
の発現ベクターに連結された後、適当な宿主に導入され
ることにより、本発明の最終目的物質であるｔ−ＰＡ改
変体タンパクを発現・生産することができる。宿主とし
ては、原核性生物細胞または真核性生物細胞のいずれで
もよく、例えば大腸菌株や動物細胞株は、とくに記載の
ない限り既に広く普及しており入手は容易である。例え
ば動物細胞宿主としては、ＣＯＳ−１，ＣＨＯ細胞が挙
げられる。発現プラスミドを用い適当な動物細胞宿主を
形質転換するには、電気パルス法（文献ｏ）を用いれば
よい。形質転換された細胞の培養上清は、適当な希釈に
よりそのまま種々の活性測定に使用され得る程度のｔ−
ＰＡ改変体を含んでいる。培養上清中に産生されたｔ−
ＰＡ改変体は、亜鉛キレートアガロース、コンカナバリ
ンＡアガロース、セファデックスＧ−１５０等を用いる
公知の方法（文献ｐ）等によって、容易に精製すること
ができる。

【００２４】このようにして得られた本発明のｔ−ＰＡ
改変体は、高い血漿塊特異性を有するので、血栓症治療
剤として生体内に投与された場合、天然型のｔ−ＰＡと
比較して全身性の出血傾向という副作用が減少した血栓
症治療剤の有効成分とすることができる。血漿塊特異性
とは、前記のようにヒトの血漿及び血漿塊を用いて血漿
塊に対する特異性を評価したものであり、実際の臨床に
おける血栓特異性をより反映するものと考えられる。具
体的には後述の実施例において記載した方法により評価
がなされる。また本発明のｔ−ＰＡ改変体は、改変体に
よっては血中半減期が延長されるため、天然型のｔ−Ｐ
Ａと比較して低投与量で効果を発揮する血栓症治療剤の
有効成分とすることができる。従って、高い血漿塊特異
性を有することによる副作用の減少と共に、更に血中半
減期の延長を考慮して低投与量とすることが可能とな
る。本発明のｔ−ＰＡ改変体は、常法により容器に所定
量分注し、凍結乾燥を行うことにより極めて容易に製剤
化することができる。この凍結乾燥品は、製剤的に容認
されるキャリアー物質、例えば生理食塩水に溶解し、静
脈内又は冠動脈内への注射によって投与される。投与量
は、現在臨床で用いられている天然型のｔ−ＰＡの投与
量程度でも良いが、本発明のｔ−ＰＡ改変体は副作用が
少ないので該投与量より多く使用することもできる。ま
た血中半減期が延長していることにより天然型のｔ−Ｐ
Ａより少量でも同等の効果が期待し得る。投与方法は、
単回静注、持続静注あるいは投与予定量の一部を最初に
静注し、残りを持続静注するなどの方法で行われる。

【００２５】

【実施例】以下、本発明の一例として実施例により本発
明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例
によりなんら限定されるものではない。なお、以下の実
施例で使用されるｐＣＤＭ８−ＣＳ１は特開平４−１４
４６８２号公報に記載のｐＣＤＭ８−ＣＳＴＵと同一の
もので、天然型のｔ−ＰＡの２７６位から３０６位のア
ミノ酸配列がＵＫの１５９位から１８８位の配列に置換
された公知のプラスミドである。該プラスミドの名称は
ＰＣＴ／ＪＰ９２／００４１５号明細書においてｐＣＤ
Ｍ８−ＣＳＴＵをｐＣＤＭ８−ＣＳ１と名称変更した
為、本明細書においても同様にｐＣＤＭ８−ＣＳ１と称
して以下のプラスミドの構築に用いた。

【００２６】実施例１：３カ所の糖鎖欠失置換、即ち１
１７位、１８４位及び４４８位のアスパラギンコドンの
グルタミンコドンへの置換を有するｔ−ＰＡ改変体中間
プラスミドｐＣＤＭ８−ＸΔＥＥの構築 ｐＴＺＢ００５は、４４８位アスパラギンのグルタミン
への置換（以下、Ｎ４４８Ｑ置換と略す）以外に４６２
位アルギニンのグリシンへの置換（以下、Ｒ４６２Ｇ置
換と略す）を含む改変体をコードしている（文献ｑ）。
Ｎ４４８Ｑ置換部位とＲ４６２Ｇ置換部位の間にはＮｓ
ｐＩ切断部位が存在するので、これを利用してＮ４４８
Ｑ置換のみを含むＥｃｏＲＩ−ＮｓｐＩ断片２７０ｂｐ
を切り出した。ＮｓｐＩ切断部位は多数存在することか
ら、天然型のｔ−ＰＡの塩基配列をコードするｐＣＤＭ
８−００１（後述）よりＮｓｐＩ−ＳｍａＩ断片１７０
ｂｐを切り出し、先の断片とともにｐＵＣ１９（東洋紡
績（株）製）のＥｃｏＲＩ−ＳｍａＩ間に挿入し、Ｎ４
４８Ｑ置換のみを含むＥｃｏＲＩ−ＳｍａＩ断片を保持
するｐＵＣＥＳ（Ｎ４４８Ｑ）を構築した（図１）。該
断片の存在を制限酵素消化によって確認した後、Ｅｃｏ
ＲＩ及びＳｍａＩで消化し４４０ｂｐのフラグメントＥ
Ｓを得た。

【００２７】一方ｐＴＺＢ０１５は、ｐＴＺＢ００９〜
０１２（文献ｑ）構築の過程で副産物として得られたプ
ラスミドであり、１１７位アスパラギンのグルタミンへ
の置換（以下、Ｎ１１７Ｑ置換と略す）および１８４位
アスパラギンのグルタミンへの置換（以下、Ｎ１８４Ｑ
置換と略す）以外に２７位アルギニンのグリシンへの置
換（以下、Ｒ２７Ｇ置換と略す）及び８３位システイン
のセリンへの置換（以下、Ｃ８３Ｓ置換と略す）を含む
改変体をコードしている。Ｃ８３Ｓ置換部位とＮ１１７
Ｑ置換部位の間にはＮａｒＩ切断部位が存在することか
ら、これを利用してＮ１１７Ｑ置換及びＮ１８４Ｑ置換
のみを含むＮａｒＩ−ＥｃｏＲＩ断片２８０ｂｐ（フラ
グメントＮＥ）を切り出した。

【００２８】哺乳類細胞において種々の改変体を発現さ
せるためのベクターには、ｐＣＤＭ８（ＢｇｌII）を利
用した。本ベクターはＣＤＭ８（ｏｒｉ^- ）のＣＭＶプ
ロモーター下流のスタッファー配列を除いてＢｇｌIIサ
イトを導入したものであり（文献ｑ）、ｐＣＤＭ８−０
０１はｐＣＤＭ８（ＢｇｌII）のＢｇｌII部位に天然型
のｔ−ＰＡｃＤＮＡを挿入したものである（文献ｑ）。
ｐＣＤＭ８−００１をＮａｒＩ及びＳｍａＩで消化後脱
リン酸化処理を行い、これにフラグメントＮＥ及びフラ
グメントＥＳを挿入した。大腸菌ＭＣ１０６１／ｐ３株
を形質転換し、得られたクローンが目的のものであるか
否かの識別は、約４８０ｂｐのＥｃｏＲＩ断片の有無
（ない方が目的物）で行い、目的物が得られたことを確
認した。得られた目的のクローンを、ｐＣＤＭ８−ＸΔ
ＥＥと命名した。以上の構築過程を図１および図２に示
した。

【００２９】実施例２：３カ所の糖鎖欠失置換、即ち１
１７位、１８４位及び４４８位のアスパラギンコドンの
グルタミンコドンへの置換を有するＣＳ１の類縁体であ
るＣＳ１Ｘ、ＣＳ３Ｘを哺乳類細胞で発現し得るプラス
ミドｐＣＤＭ８−ＣＳ１Ｘ、ｐＣＤＭ８−ＣＳ３Ｘの構
築 ｐＣＤＭ８−ＣＳ１由来の約４８０ｂｐのＥｃｏＲＩ断
片中には天然型のｔ−ＰＡの２７６位から３０６位に相
当するアミノ酸配列が、対応関係を有するＵＫのアミノ
酸配列（１５９位から１８８位）に置換された領域（配
列番号：１）を含む。この領域中にＥｃｏＲＩ切断部位
が存在するため、目的の４８０ｂｐの断片を得るため
に、部分消化を行った。

【００３０】ｐＣＤＭ８−ＣＳ３は、文献ｉの第６図に
示される合成オリゴヌクレオチド、イ及びロの替わりに
本発明におけるＣＳ４Ｍ（配列番号：２）及びＣＳ４Ｒ
（配列番号：３）を用いて同様の手法で構築されたプラ
スミドであり、ＣＳ１の類縁体であるＣＳ３（天然型の
ｔ−ＰＡの２９４位から３０６位に相当するアミノ酸配
列が対応関係を有するＵＫのアミノ酸配列（配列番号：
４）に置換されたｔ−ＰＡ類縁体）を発現可能な形でコ
ードしている。ｐＣＤＭ８−ＣＳ３中のＵＫへの置換領
域にはＥｃｏＲＩ切断部位は存在しないので、これをＥ
ｃｏＲＩで完全消化してＥｃｏＲＩ断片を調製した。こ
れらを、ＥｃｏＲＩ消化後脱リン酸化処理を行ったｐＣ
ＤＭ８−ＸΔＥＥとライゲーションさせ、大腸菌ＭＣ１
０６１／ｐ３株を形質転換した。このようにして得られ
た形質転換株から、ＰＣＲを用いた挿入断片の有無の確
認及び制限酵素消化による確認により、目的のクローン
を選択した。得られたプラスミドを各々ｐＣＤＭ８−Ｃ
Ｓ１Ｘ及びｐＣＤＭ８−ＣＳ３Ｘと命名した。以上の構
築過程を図３に示した。

【００３１】実施例３：２カ所の糖鎖欠失置換、即ち１
１７位及び１８４位のアスパラギンコドンのグルタミン
コドンへの置換を有するＣＳ１類縁体であるＣＳ１Ｙを
哺乳類細胞で発現し得るプラスミドｐＣＤＭ８−ＣＳ１
Ｙの構築 ｐＣＤＭ８−ＣＳ１Ｙは、実施例２により得られたｐＣ
ＤＭ８−ＣＳ３ＸとｐＣＤＭ８−ＣＳ１より構築した。
すなわち、ｐＣＤＭ８−ＣＳ３ＸのＮ１８４Ｑ置換とＵ
Ｋ配列への置換領域の間、およびｐＣＤＭ８−ＣＳ１の
これに相当するＮ１８４ＱとＵＫ置換領域の間にはＳｃ
ａＩ切断部位が存在する。ＳｃａＩ切断部位はｐＣＤＭ
８ベクター側にも１カ所存在するのでこれを利用し、ｐ
ＣＤＭ８−ＣＳ３ＸとｐＣＤＭ８−ＣＳ１をＳｃａＩで
消化後、ライゲーションすることにより構造遺伝子の後
半領域をｐＣＤＭ８−ＣＳ１のそれと乗せ換えた。得ら
れたクローンについて制限酵素消化により目的物である
ことを確認し、これをｐＣＤＭ８−ＣＳ１Ｙと命名し
た。以上の構築過程を図４に示した。

【００３２】実施例４：１カ所の糖鎖欠失置換、即ち１
１７位のアスパラギンコドンのグルタミンコドンへの置
換を有するＣＳ１類縁体であるＣＳ１Ｚを哺乳類細胞で
発現し得るプラスミドｐＣＤＭ８−ＣＳ１Ｚの構築 ｐＣＤＭ８−ＸΔＥＥのＮ１１７Ｑ置換とＮ１８４Ｑ置
換をコードする塩基配列の間には唯一のＢｓｔＸＩ認識
部位が存在する。実施例１により得られたｐＣＤＭ８−
ＸΔＥＥをＢｓｔＸＩ及びＳｍａＩで消化し、これにｐ
ＣＤＭ８−ＣＳ１由来のＢｓｔＸＩ−ＳｍａＩ断片を挿
入した。このようにして得られたクローンについて、制
限酵素消化により目的の挿入が起きたことを確認し、ｐ
ＣＤＭ８−ＣＳ１Ｚと命名した。以上の構築過程を図５
に示した。

【００３３】実施例５：２カ所の糖鎖欠失置換、即ち１
１７位及び４４８位のアスパラギンコドンのグルタミン
コドンへの置換を有するＣＳ１類縁体であるＣＳ１Ｗを
哺乳類細胞で発現し得るプラスミドｐＣＤＭ８−ＣＳ１
Ｗの構築 ｐＣＤＭ８−ＸΔＥＥのＥｃｏＲＩ切断部位及びＮ４４
８Ｑ置換をコードする塩基配列の間にはＳａｃＩ切断部
位が存在する。ｐＣＤＭ８−ＣＳ１のこれに相当する部
分にもＳａｃＩ切断部位が存在する。さらにｐＣＤＭ８
ベクター側、より詳しくはＣＭＶプロモーター直後にＳ
ａｃＩ切断部位が存在するので、これを利用し、ｐＣＤ
Ｍ８−ＸΔＥＥとｐＣＤＭ８−ＣＳ１をＳａｃＩ消化
後、ライゲーションすることにより、ｐＣＤＭ８−ＸΔ
ＥＥの構造遺伝子の前半部分をｐＣＤＭ８−ＣＳ１のそ
れと乗せ換えることができる。得られたクローンについ
て制限酵素消化により目的物であることを確認すればよ
い。これをｐＣＤＭ８−ＣＳ１Ｗと命名できる。

【００３４】実施例６：本発明の血栓溶解タンパク質の
ＣＯＳ−１細胞での発現及び分泌 ｐＣＤＭ８−ＣＳ１Ｘ、ｐＣＤＭ８−ＣＳ１Ｙ、ｐＣＤ
Ｍ８−ＣＳ１Ｚ、およびコントロールとしてｐＣＤＭ８
−ＣＳ１を用いて既述の電気パルス法によりＣＯＳ−１
細胞を形質転換した。リジンセファロースクロマト処理
した牛胎児血清１０％およびアプロチニン１０μｇ／ｍ
ｌを含有するＤＭＥＭ培地で２４時間培養後、培地を無
血清かつアプロチニン無含有ＤＭＥＭ培地に交換し、さ
らに９６時間培養を継続した。培養液を遠心後その上清
を回収し、これに１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）含有
ＤＭＥＭ培地を１／９量添加し、凍結保存した。この凍
結保存上清を改変体試料と称し、以後の評価に用いた。

【００３５】試験例１：蛋白量の定量 実施例６により得られた各培養上清中の改変体試料の蛋
白量については、市販のキット（バイオプール社製）を
用いた酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）により測定した。

【００３６】試験例２：血漿塊特異性の評価 ヒト血漿を用いて血漿中及び血漿塊中における前記実施
例６により得られた各改変体試料のプラスミノーゲン活
性化活性を、発色性合成基質Ｓ−２２５１を用いた反応
系で測定した。方法は、文献ｅに示されている方法に準
じて行った。 １）血漿塊中プラスミノーゲン活性化活性（血漿塊系に
おける活性） ９６穴プレートのウェル中に６０国際単位／mlのトロン
ビン（0.01％ Tween 80 含有ＰＢＳ）１０μl を添加し
た。次に0.01％ Tween 80 含有ＰＢＳで２００ng／mlに
希釈された各改変体試料４０μl を添加し、さらに反応
混合液〔血漿９０μl 、Ｓ−２２５１ ９．１ｍＭ（0.
01％(v/v) Tween 80含有ＰＢＳ）１０μｌ〕１００μｌ
を添加した。３７℃でインキュベートを開始後、プレー
トリーダーを用いて４０５nmにおける吸光度（Ｏ
Ｄ₄₀₅ ）を経時的に測定した。同時にフィブリンによる
濁度の影響を補正するため、４９０nmにおける吸光度
（ＯＤ₄₉₀）を測定し、各時間でそのＯＤ₄₉₀ 値をＯＤ
₄₀₅ から差し引いた。吸光度（ＯＤ₄₀₅ −ＯＤ₄₉₀ ）値
を時間の二乗に対してプロットし、最小二乗法により算
出される直線部分の勾配を活性の指標とした。その結果
を表１に示す。

【００３７】２）血漿中プラスミノーゲン活性化活性
（血漿系における活性） 血漿塊中プラスミノーゲン活性化活性と同様に行った。
ただし、トロンビンの代わりに０．０１％ Tween 80 含
有ＰＢＳを用いた。表１に各改変体試料のプラスミノー
ゲン活性化活性を反応速度（mODx10^-6/min² ）で示す。
血漿塊特異性は、このようにして得られたデータから
「血漿塊系における活性」／「血漿系における活性」の
比で表した。

【００３８】

【表１】

【００３９】ＣＳ１改変体は、血漿中のプラスミノーゲ
ン活性化活性が非常に低く、血漿塊中では天然型のｔ−
ＰＡと同等のプラスミノーゲン活性化活性を示し、それ
ゆえ天然型のｔ−ＰＡより高い血漿塊特異性を有するこ
とが既に判明しているが（ＰＣＴ／ＪＰ９２／００４１
５号明細書）、表１の結果より、本発明のｔ−ＰＡ改変
体は、ＣＳ１改変体と比較して血漿中のプラスミノーゲ
ン活性化活性は同等であるが、血漿塊中においてはＣＳ
１より高い活性を有しており、結果として血漿塊特異性
はＣＳ１改変体よりさらに高いことが明らかとなった。
従って、本発明のｔ−ＰＡ改変体は、全身性の出血傾向
というｔ−ＰＡの副作用を減じることができる。

【００４０】試験例３：血中半減期の評価 血中半減期評価用に、ＣＨＯ細胞発現用プラスミドを構
築した。一例を示すと、ｐＣＤＭ８−００１（文献ｑ）
のＢａｍＨＩ断片を公知のｐＢ２Ｌ２（文献ｒ記載）の
ＢｇｌIIサイトに挿入したプラスミド、ｐＢＬ００１を
ＢｇｌII、ＳｍａＩで切断し、ここにｐＣＤＭ８−ＣＳ
ｌ、ｐＣＤＭ８−ＣＳｌＹ、ｐＣＤＭ８−ＣＳｌＺのＢ
ｇｌII−ＳｍａＩ断片を挿入することにより、ｐＢＬ−
ＣＳｌ、ｐＢＬ−ＣＳｌＹ、ｐＢＬ−ＣＳｌＺを得た。
これら各プラスミドと公知のプラスミドｐＡｄＤ２６Ｓ
Ｖｐ（Ａ）３（文献ｒ）を用いて、公知の方法（文献
ｒ）によりＣＨＯ細胞の形質転換を行った。無血清培地
にて培養後、上清を抗ｔ−ＰＡ抗体カラム処理、ＣＭセ
ファロースカラム（ファルマシア製）処理することによ
り、２本鎖型が９０％以上の各改変体試料（ＣＳｌ、Ｃ
ＳｌＹ、ＣＳｌＺ）を得、これらを用いて血中半減期を
測定した。対照として、同様の手法により得られた天然
型ｔ−ＰＡ（ただし、２本鎖化はプラスミンセファロー
ス処理により行った）を用いた。

【００４１】即ち、日本白色種家兎（９週齢）各群３匹
を無麻酔下、固定して左総頸動脈にカニューレを挿入
し、薬物投与５分前にカニューレより１ｍｌ採血した
（０．１ｍｌの３．８％クエン酸３ナトリウム含有）。
０．０１％ Tween８０を含む生理食塩水（ｐＨ３）で１
ｍｇ／ｍｌに希釈した各薬物を右耳介静脈より約１０秒
間で急速注入し（体重１ｋｇあたり１ｍｌ投与）、薬物
投与１、３、５、１０、２０、３０、６０、１２０、２
４０および３６０分後に上記と同様に１ｍｌ採血した。
得られた血液を１１，０００ｒｐｍ×２分間（４℃）に
て遠心して上清を得、ｔ−ＰＡの濃度測定に使用するま
で−７０℃にて保存した。

【００４２】各血漿中のｔ−ＰＡ濃度の測定は、バイオ
プール社製の測定キットを用いてＥＬＩＳＡにより行
い、ｔ−ＰＡ抗原濃度を測定した。すなわち、血漿を１
０ｍＭのベンズアミジン塩酸塩、５ｍＭのＥＤＴＡおよ
び１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含むリン酸緩衝生理食塩液
（ｐＨ７．４、以下ＰＢＳ／ＢＡ）で１０倍以上に希釈
した。希釈血漿サンプル２００μｌを抗ｔ−ＰＡＩｇＧ
でコーティングした９６穴マイクロプレートのウエルに
添加して室温にて３時間放置した。プレートをＰＢＳ／
ＢＡで洗浄後、同緩衝液で６００倍希釈したホースラデ
ィッシュペルオキシダーゼ標識抗ｔ−ＰＡＩｇＧを２０
０μｌ添加して室温にて２時間放置した。プレートを洗
浄後、ペルオキシダーゼの発色基質液を２００μｌ添加
して室温において１５分間放置し、５０μｌの４．５Ｍ
の硫酸を添加することにより反応を停止し、各ウエルの
４９０ｎｍにおける吸光度を測定した。キット添付のｔ
−ＰＡ標準品を用いて同様な操作を行うことにより検量
線を作成し各サンプル中のｔ−ＰＡ抗原濃度を算出し
た。

【００４３】得られたデータは表２に示すが、本発明の
ｔ−ＰＡ改変体であるＣＳ１Ｙ、ＣＳ１Ｚは天然型ｔ−
ＰＡと比較して、血中半減期の延長が認められた。特
に、ＣＳ１Ｚはα相において約２倍の延長が認められ
た。なお、天然型のｔ−ＰＡの２７６位から３０６位の
アミノ酸配列がＵＫの１５９位から１８８位の配列に置
換されてはいるが、Ｎ結合糖鎖付加コンセンサス配列に
おけるアミノ酸が置換されていないＣＳ１は、天然型ｔ
−ＰＡと同様の血中半減期であった。表中、ＡＵＣは０
〜３６０分までの血中濃度曲線下面積を、またＣＬｔは
血漿総クリアランスを表す。これら血中半減期、ＡＵ
Ｃ，ＣＬｔは、非線形最小二乗プログラム（ＭＵＬＴ
Ｉ）を用い、２−コンパートメントモデルにあてはめる
ことにより算出した。このように本発明のｔ−ＰＡ改変
体は、改変体によっては天然型ｔ−ＰＡと比較して血中
半減期が延長するので、血中での有効濃度を効果的に保
持することが可能である。また、これにより低投与量と
したり、前記のように高い血漿塊特異性を有することか
ら副作用が少なく臨床上有用性の高い血栓症治療剤とす
ることができる。

【００４４】

【表２】

【００４５】引用文献 ａ）欧州特許出願公開 No.0041766 A2 ｂ）The TIMI study group : N. Engl. J. Med., 320,
618, 1989. ｃ）特開昭62-24 号公報 ｄ）特開昭62-253380 号公報 ｅ）国際公開 No.9002798 ｆ）D. Lau et al. : BIO/TECHNOLOGY, 5, 953, 1987. ｇ）特開昭62-282582 号公報 ｈ）G. R. Larsen et al. : J. Biol. Chem., 263, 102
3, 1988. ｉ）Pennica et al. : Nature, 301, 214, 1983. ｊ）Holmes et al. : BIO/TECHNOLOGY, 3, 923, 1985. ｋ）M. J. Zoller et al. : Methods in Enzymology, 1
00, 468, 1983. ｌ）S. L. Beaucage et al. : Tetrahedron Letters, 2
2, 1859, 1981. ｍ）F. Sanger et al. : Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
74, 5463, 1977. ｎ）T. Maniatis et al. : Molecular Cloning, A Labo
ratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory. 198
2. ｏ）高山伸一郎、細胞工学 6, 771, 1987. ｐ）D.C. Rijken et al. : Biochemica Biophysyca Act
a, 580, 140-153, 1979. ｑ）特願平2-87005 号 ｒ）特開昭61-12288号公報

【００４６】

【発明の効果】本発明のｔ−ＰＡ改変体は、血漿塊特異
性が向上した新規なｔ−ＰＡ改変体であり、その結果と
して全身性の出血傾向というｔ−ＰＡの副作用を減じる
ことができる。さらに、改変体によっては血中半減期が
延長するので、血栓症治療剤として有用である。

【００４７】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：３０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ile Ile Gly Gly Glu Phe Thr Thr Ile Glu Asn Gln Pro Trp Phe Ala 1 5 10 15 Ala Ile Tyr Arg Arg His Arg Gly Gly Ser Val Thr Tyr Val 20 25 30

【００４８】配列番号：２ 配列の長さ：５０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ アンチセンス：Ｎｏ 配列 CGC ATC AAA GGA GGG CTC TTC GCC GAC ATC GCC TCC CAC CCC TGG CAG 48 GC 50

【００４９】配列番号：３ 配列の長さ：５３ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ アンチセンス：Ｙｅｓ 配列 T GGC CGC CTG CCA GGG GTG GGA GGC GAT GTC GGC GAA GAG CCC TCC 46 TTT GAT G 53

【００５０】配列番号：４ 配列の長さ：１２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、プラスミドｐＣＤＭ８−ＸΔＥＥの構
築の概略図の一部（前半部分）を示す。

【図２】図２は、プラスミドｐＣＤＭ８−ＸΔＥＥの構
築の概略図の一部（後半部分）を示す。

【図３】図３は、プラスミドｐＣＤＭ８−ＣＳ１Ｘおよ
びプラスミドｐＣＤＭ８−ＣＳ３Ｘの構築の概略図を示
す。

【図４】図４は、プラスミドｐＣＤＭ８−ＣＳ１Ｙの構
築の概略図を示す。

【図５】図５は、プラスミドｐＣＤＭ８−ＣＳ１Ｚの構
築の概略図を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 5/10 9/64 Ｚ 9152−4Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 9/64 Ｚ Ｃ１２Ｒ 1:91） 8412−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 安喰 英夫 大阪市中央区道修町２丁目２番８号 住友 製薬株式会社内

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 組織プラスミノーゲン活性化因子（以
   下、ｔ−ＰＡと略す）のアミノ酸配列中、天然型のｔ−
   ＰＡのアミノ酸配列の２７６位から３０６位に相当する
   アミノ酸配列の少なくとも一部が下記に示すような対応
   関係を有する尿プラスミノーゲン活性化因子（以下、Ｕ
   Ｋと略す）のアミノ酸配列に置換されており、さらに天
   然型のｔ−ＰＡの１１７位から１１９位、１８４位から
   １８６位及び４４８位から４５０位に相当するＮ結合糖
   鎖付加コンセンサス配列の少なくとも１つが、Ｎ結合糖
   鎖付加コンセンサス配列以外の配列に置換されているこ
   とを特徴とするｔ−ＰＡ改変体。 【化１】 （なお、アミノ酸配列において対応関係とは、天然型の
   ｔ−ＰＡの２７６位がＵＫの１５９位に対応し、以下順
   次上段の配列が下段の配列に対応する関係を示す。ま
   た、上記の配列表示における−は、ＵＫのアミノ酸配列
   への置換においてアミノ酸が欠失した状態で対応するも
   のとする。）
2. 【請求項２】 天然型のｔ−ＰＡの１１７位から１１９
   位、１８４位から１８６位及び４４８位から４５０位に
   相当するＮ結合糖鎖付加コンセンサス配列のすべてがＮ
   結合糖鎖付加コンセンサス配列以外の配列に置換され
   た、請求項１記載のｔ−ＰＡ改変体。
3. 【請求項３】 Ｎ結合糖鎖付加コンセンサス配列のう
   ち、天然型のｔ−ＰＡの１１７位から１１９位及び１８
   ４位から１８６位に相当するＮ結合糖鎖付加コンセンサ
   ス配列のみがＮ結合糖鎖付加コンセンサス配列以外の配
   列に置換された、請求項１記載のｔ−ＰＡ改変体。
4. 【請求項４】 Ｎ結合糖鎖付加コンセンサス配列のう
   ち、天然型のｔ−ＰＡの１１７位から１１９位に相当す
   るＮ結合糖鎖付加コンセンサス配列のみがＮ結合糖鎖付
   加コンセンサス配列以外の配列に置換された、請求項１
   記載のｔ−ＰＡ改変体。
5. 【請求項５】 Ｎ結合糖鎖付加コンセンサス配列のう
   ち、天然型のｔ−ＰＡの１１７位、１８４位及び４４８
   位に相当するアスパラギンの少なくとも１つが他のアミ
   ノ酸に置換された、請求項１記載のｔ−ＰＡ改変体。
6. 【請求項６】 天然型のｔ−ＰＡの１１７位、１８４位
   及び４４８位に相当するすべてのアスパラギンが他のア
   ミノ酸に置換された、請求項５記載のｔ−ＰＡ改変体。
7. 【請求項７】 Ｎ結合糖鎖付加コンセンサス配列のう
   ち、天然型のｔ−ＰＡの１１７位及び１８４位に相当す
   るアスパラギンのみが他のアミノ酸に置換された、請求
   項５記載のｔ−ＰＡ改変体。
8. 【請求項８】 Ｎ結合糖鎖付加コンセンサス配列のう
   ち、天然型のｔ−ＰＡの１１７位に相当するアスパラギ
   ンのみが他のアミノ酸に置換された、請求項５記載のｔ
   −ＰＡ改変体。
9. 【請求項９】 他のアミノ酸がグルタミンである、請求
   項５〜８いずれかに記載のｔ−ＰＡ改変体。
10. 【請求項１０】 形質転換された原核性生物細胞または
    真核性生物細胞において、請求項１〜９いずれかに記載
    のｔ−ＰＡ改変体をコードしているＤＮＡを発現させ得
    る組換え発現ベクター。
11. 【請求項１１】 請求項１０記載の組換え発現ベクター
    で形質転換された原核性生物細胞または真核性生物細
    胞。
12. 【請求項１２】 請求項１〜９いずれかに記載のｔ−Ｐ
    Ａ改変体を有効成分として含有することを特徴とする血
    栓症治療剤。