JP2628345B2 - 新規な線維素溶解酵素 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は線維素溶解作用を有する組織型プラスミノー
ゲン活性化因子、それをコードするDNA配列、それを含
有する薬剤組成物、ならびにそれらの生産方法に関す
る。

詳細には、本発明は（ａ）組織型プラスミノーゲン活
性化因子の肝臓による取込みが減少する；および（ｂ）
その酵素が血漿阻害剤による不活性化に対して本質的に
抵抗する；ような手段で修飾された組織型プラスミノー
ゲン活性化因子（ｔ−PA）に関する。その結果、本発明
に包含される修飾ｔ−PAは以前に使用された（天然また
は組換え）ｔ−PA製剤よりも長い生物学的半減期を有す
ることにより特徴づけられる。

特に本発明は成長因子（Ｇ）ドメインが欠失され、ク
リングル１（K1）ドメインも欠失され、そしてさらにフ
ィンガー（Ｆ）ドメインも欠失され、且つアミノ酸残基
184の部位及び／又は448の部位でAsnがGlnで置換されて
いる線維素溶解作用を有する組織型プラスミノーゲン活
性化因子、および該プラスミノーゲン活性化因子をコー
ドするDNAを提供する。

本発明の他の面は真核細胞による天然または修飾ｔ−
PAの発現に関する。より詳細には、本発明はmRNAプロセ
ツシングシグナルを含み且つ異種細胞内での組換えタン
パク質の高生産を誘導する特定のDNA配列に関する。

〔従来の技術〕

心筋梗塞、肺塞栓症、脳卒中、深静脈血栓症、末梢動
脈血栓症および他の血栓症のような血管の疾患は血塊に
よる血管の部分的または完全閉塞によつて引き起こされ
る。フイブリン網状構造から成る血塊は線維素溶解酵素
によつて溶解される。プラスミンはこのような線維素溶
解酵素の１つであり、不活性なプロ酵素のプラスミノー
ゲンとして血液中に存在する。プラスミノーゲン活性化
因子はプラスミノーゲンをプラスミンへ転化し、続いて
プラスミンはフイブリンを可溶性断片に分解する。こう
して、プラスミノーゲン活性化因子は血栓溶解を誘導す
べく使用することができる。

組織プラスミノーゲン活性化因子は、それがフイブリ
ンに対して親和性を有する生理学的化合物であり、しか
もフイブリンの存在下でのみ効果的にプラスミノーゲン
を活性化するので、血栓溶解処理に非常に適していると
考えられる〔カミオロ（Camiolo）ら、Proc.Soc.Exp.Bi
ol.Med.138,p.277−280,1971およびランビー（Ranby,
M.）,Biochem.Biophys.Acta,704,p.461−469,1982を参
照〕。従つて、それは静脈内投与に適した血塊選択的溶
解剤である。最近タンパク質のストレブトキナーゼまた
は尿から分離されたウロキナーゼのような他のプラスミ
ノーゲン活性化因子もプラスミノーゲンを活性化する
が、血塊選択的ではない。その結果、循環性プラスミン
が生成され、その循環性プラスミンはフイブリノーゲ
ン、第VIII因子および第Ｖ因子のような凝血因子を分解
するので、出血を起こす可能がある。

臨床実験は急性心筋梗塞の治療に対しｔ−PAの血栓溶
解有効性を証明した〔TIMI研究グループ,N.Engl.J.Med.
312,p.932,1985;およびバーストレート（Verstraete）
ら、Lancet,1,p.842−847,1985を参照〕。しかしなが
ら、肝臓によるｔ−PAの急速なクリアランス（浄化）の
ために〔コーニンガー（Korninger）ら、Thromb.Haemos
tas.46,p.658−661,1981を参照〕、高用量50〜90mgを連
続輸液として投与して効果的な血栓溶解を誘導しなけれ
ばならなかつた。ヒトにおけるｔ−PAの生物学的半減期
はほんの数分であり〔チーフエンブルン（Tiefenbrun
n）ら、Circulation,71,p.110−116,1985を参照〕、少
量の活性化因子が実際に血塊へ到達するにすぎないであ
ろう。血塊溶解に利用しうるｔ−PAの量をさらに減ずる
もう１つの要因は血漿阻害剤との反応である。ｔ−PAは
多種多様の血漿プロテアーゼ阻害剤（最近発見された内
皮型および胎盤型のプラスミノーゲン活性化因子阻害剤
を含む）と複合体を形成することが分かつている〔ライ
ケン（Rijken）ら、J.Lab.Clin.Med.101,p.285−294,19
83;ウイマン（Wiman）ら、J.Biol.Chem.259,p.3644−36
47,1984;およびレカンダー（Lecander）ら、British J
ournal of Haemathology,57,p.407−412,1984を参
照〕。

本発明によるｔ−PAの修飾は、肝臓クリアランスゆえ
の短い生物学的半減期および血漿阻害剤による不活性化
に対する感受性の両方の問題を解決する。

ｔ−PAおよびその誘導体の情報を含むDNA配列は、真
核細胞内での発現のために適当なベクターに導入され
る。一時的にトランスフエクシヨンしたまたは安定に形
質転換した宿主細胞により生産される線維素溶解活性
は、プラスミノーゲン活性化因子の標準検定を用いるこ
とにより測定しうる。ここに記載される真核細胞発現ベ
クターは、天然源からの又は慣用法により化学合成され
たレプリコン、エンハンサー、プロモーターなどの成分
を用いて、当業者によく知られた技法により構築され
る。

普通の２倍体細胞と同様に、確立された細胞株は宿主
として適用している。大多数の異なる細胞株がｔ−PAま
たはその誘導体の発現のために使用可能である。例え
ば、CHOd^-,CHOK1およびBHKのような異なるハムスター細
胞株、CV−１およびCOSのようなサル細胞株、C127およ
び3T3のようなマウス細胞株、ならびにヒト細胞株を使
用することができる。また、昆虫細胞のような他の宿主
およびトランスゲニツク生物（transgenic organism）
もｔ−PAまたはｔ−PA誘導体の生産のために使用しう
る。

適当な宿主細胞へ導入後、ｔ−PAをコードするDNA配
列は宿主細胞ゲノムに安定に組込まれた形で、あるいは
染色体外DNAの形で含まれ、増幅される。

ｔ−PA遺伝子を含む配列は多重コピー数で細胞中に優
先的に存在する。ｔ−PA遺伝子コピー数増幅のための異
なる戦略が開発される。宿主細胞の染色体DNAへのベク
ターDNAの安定した組込みのために、および組込まれた
ベクターDNAのその後の増幅のために、増幅および選択
可能な遺伝子がｔ−PA発現ベクター中に挿入される。チ
ヤイニーズ・ハムスター卵巣細胞（CHO）は、増幅およ
び選択可能なマーカー遺伝子としてのジヒドロ葉酸還元
酵素（DHFR）遺伝子と共に使用するのが目下のところ好
適である〔カウフマン（Kaufman）ら、Mol.Cell.Biol.
7,p.1750−1759,1985を参照〕。

別の増幅系はパピローマウイルスDNA、特にウシパピ
ローマウイルス１（BPV）の使用に基づくものである。
ウイルスゲノムの全部または一部が、C127または3T3の
ようなマウス細胞を安定して形質転換するために使用さ
れる。このウイルスゲノムはベクターDNAを高コピー数
で安定した染色体外要素として維持するための情報を含
んでいる〔サンブロツク（Sambrook）ら、EMBO J.1,p.9
1−103,1985を参照〕。

上記の真核細胞宿主−ベクター系において、ｔ−PA分
子またはその変異型の発現は異なる上流および下流の調
節DNA因子により影響を受ける。

本発明者らは、ヒトｔ−PA遺伝子由来のポリアデニル
化シグナルのような下流のプロセツシングシグナルを含
むDNAフラグメント（KGH 11）をヒトゲノムライブラリ
ーから分離して、その性状を決定した。この適当なDNA
フラグメントはヒトｔ−PA遺伝子の最後のエクソン配列
部分を含む。このセグメントはまたcDNAに表わされるの
で、重複領域の唯一の制限酵素部位を、２つの要素を連
結するための融合部位として使用することができるであ
ろう（第３図参照）。分析した真核細胞発現系におい
て、この相同構築物からの生産レベルは、ｔ−PA遺伝子
の下流のプロセツシングシグナルが含まれないことを除
いてあとは同一の発現ベクター構築物からのレベルより
も有意に高かつた。

組換えDNAおよび他の生命工学技術は、血管疾患を治
療するためのｔ−PAを効率よく生産するために利用され
た。有望な臨床実験はヒト黒色腫細胞から分離したｔ−
PAを用いてまず最初に行われた〔コーケン（Coken
D.）、Circulation,72,p.18−20,1985を参照〕。

ヒト黒色腫ｔ−PAのアミノ酸配列分析〔ワレン（Well
ｎ）ら、Eur.J.Biochem.132,p.681−686,1983を参
照〕は、DNAプローブの合成に必要とされる情報を提供
し、そのプローブを使用して初めに部分的cDNAを分離し
〔エドルンド（Edlund）ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8
0,p.349−352,1983を参照〕、その後全タンパク質をコ
ードする完全cDNA（第１図参照）を分離した。

ｔ−PAをコードするcDNA:sが分離され、異種細胞内で
ｔ−PAを生産する試みがなされた他の例は欧州特許出願
第93619号および同第178105号に記載されている。ま
た、ペニカ（Pennica）ら、Nature 301,p.214−221,198
3を参照されたい。

いろいろなヒトｔ−PA調製物のアミノ酸配列決定は、
そのＮ末端出発位置の差異を明らかにした。形成期分子
のプロセツシングの差ゆえに、L,SおよびＵ体のポリペ
プチドが生産される〔ポール（Pohl）ら、FEBS Lett.16
8,p.657−663,1985を参照〕。Ｌ体はＮ末端残基として
グリシンを有し、Ｓ体およびＵ体のＮ末端残基はそれぞ
れセリンおよびバリンである。ここで使用したｔ−PAの
アミノ酸配列のナンバリングシステムは、Ｎ末端セリン
を番号１とするＳ体に基づくものである。その結果、Ｌ
体のＮ末端グリシンは−３の位置にあり、そしてＵ体の
Ｎ末端バリンは４位置にある。本発明に従つて修飾され
る組織プラスミノーゲン活性化因子は、このような変異
体はすべて包含するものである。

ｔ−PA分子の異なる部分は他のタンパク質の部分との
相同性を示す。パテイ（Patthy L.）、Cell 41,p.657−
663,1985に論じられるように、天然ｔ−PA分子は“フイ
ンガードメイン”（Ｆ），“成長因子ドメイン”
（Ｇ），“クリングルドメイン”（クリングル１および
クリングル２に対してK1およびK2）、および“プロテア
ーゼドメイン”（Ｐ）とそれぞれ名づけられた５つの構
造ドメインから構成されている。従つて、天然ｔ−PAは
次式： Ｆ−Ｇ−K1−K2−Ｐ によつて表すことができる。

ヒトｔ−PA遺伝子のエクソン／イントロン接合点はす
でに決定されており〔ニー（Ny）ら、Proc.Natl.Acad.S
ci.USA 81,p.5355−5359,1984を参照〕、これらの接合
点の位置はアミノ酸配列の異なるドメイン間の境界を定
めるために使用できる。こうして、Ｆドメインはアミノ
酸残基４−50から成り、Ｇドメインは残基51−87から成
り、K1ドメインは残基88−176から成り、そしてK2ドメ
インは残基177−261から成る。K2ドメインのあとに残基
263−274から成る短い連結ペプチドが続く。Ｐドメイン
は５つのエクソンによりコードされ、残基275−527のア
ミノ酸配列内に含まれる〔ポール（Pohl）ら、Biochemi
stry,23,p,3701−3707,1984を参照〕。ヒトｔ−PAは一
本鎖のポリペプチド〔ポール（Pohl）ら、Biochemistr
y,23,p,3701−3707,1984を参照〕として合成されるが、
２本の鎖がジスルフイド結合を介して連結された二本鎖
形に変換しうる。重鎖（残基１−274）はF,G,K1およびK
2ドメインと短い連結ペプチドから成り、軽鎖（残基275
−527）はＰドメインから成る。

天然の一本鎖ｔ−PAが合成低分子量基質に対して活性
を示し且つプロテアーゼ阻害剤により阻害される事実
〔ランビー（Ranby）ら、Thromb.Res,27,p.175−183,19
82を参照〕は、一本鎖ｔ−PAが有意な酵素活性をもつこ
とを示している。この点において、ｔ−PAは、合成基質
に対して本質的に全く活性を示さず且つ阻害剤と反応し
ない他の一本鎖形のセリンプロテアーゼと相違してい
る。一本鎖ｔ−PAの酵素活性は一定のリシン残基（ｔ−
PA分子の277位）の存在によつて生ずることが示唆され
た〔ワレン（Wallｎ）ら、Eur.J.Biochem。132,p.681
−686,1983を参照〕。他のすべてのセリンプロテアーゼ
では、対応する位置（すなわち、活性化切断部位の後の
２位置）が小さい疎水性残基で占められている。

上記リシン残基をイソロイシンと交換したｔ−PAの突
然変異体を生産するために、組換えDNA技術を応用する
試みがなされた（国際特許出願PCT/US85/01613を参
照）。しかしながら、この修飾は肝臓によるｔ−PAの急
速な取込みを減ずることが期待できない。なぜならば、
急速なクリアランスがその分子の酵素的に不活性な重鎖
中の構造により仲介されるからである〔リジケン（Rijk
en,D.C.）およびエメイス（Emeis,J.J.）、Biochem.J.2
38,p.643−646,1986を参照〕。

〔発明の概要〕

本発明の主な目的は、生体内で比較的長い生物学的半
減期を有する線維素溶解活性組織型プラスミノーゲン活
性化因子を提供することである。本発明の他の目的は、
天然ヒトｔ−PAと比較して、血漿阻害剤による阻害に対
してそれほど感受性でない活性化因子を提供することで
ある。

本発明のこれらの目的および他の目的は以下の記載か
ら明らかであり、成長因子（Ｇ）ドメインのほかにK1ド
メインも欠失された線維素溶解活性組織型プラスミノー
ゲン活性化因子により得られる。さらに、本発明のプラ
スミノーゲン活性化因子は１つまたはそれ以上の次の位
置または領域：すなわちアミノ酸残基177,184,277およ
び448の位置、およびＦドメイン（修飾される場合に
は、その一部または全部が欠失される）において修飾さ
れている。

Ｆドメインは場合により欠失され、かつ184位はその
位置でのグリコシル化を防ぐために修飾されるのが好ま
しい。184位および448位はこれらの位置でのグリコシル
化を防ぐために両方とも修飾されるのが特に好ましい。

本明細書において、グリコシル化位置184および448の
修飾について述べる場合、その修飾とはグリコシル化が
起こらないようなものである。従つて、問題の位置はＮ
−グリコシル化コンセンサス（共通）配列を修飾するこ
とにより、Ｎ−グリコシル化を妨げるように修飾され
る。

本発明の特に好適な態様では、Ｆドメインが全部欠失
され、そしてアミノ酸位置184および448はこれらの位置
でグリコシル化が起こらないように修飾される。

このようなプラスミノーゲン活性化因子において、ア
ミノ酸残基277の位置で追加の修飾を行うのが好まし
く、この種の修飾はその側鎖において陽電荷を示さない
アミノ酸残基への変更の形であり得る。このような修飾
の列は、277位のリシン残基の代わりにバリン残基を使
用することである。

本発明の別の好適な態様では、成長因子ドメインの修
飾のほかにその分子の唯一の修飾として、あるいはアミ
ノ酸残基277位の修飾との組合せで、追加の修飾がK1ド
メインにおいてなされる。

本発明のさらに別の態様では、その分子の修飾がアミ
ノ酸残基184位においてなされ、それにより通常のｔ−P
Aでは起こるその位置でのＮ−グリコシル化がもはや起
こらない。184位におけるこの種の修飾では、そのアス
パラギン残基がグルタミン残基によつて置換される。

アミノ酸位置184および277での上記修飾のほかに、K1
ドメインを、場合によりＦドメインの修飾との組合せ
で、修飾することも好適である。

本発明によれば、異なるドメインのこのような全ての
修飾は、それぞれのドメインの一部または全部の欠失に
より構成される。

本発明はまた上記のような線維素溶解活性プラスミノ
ーゲン活性化因子をコードするヌクレオチド配列から成
るDNA配列を包含する。さらに、本発明はこのようなDNA
配列を発現しうる複製可能な発現ベクターを含む。さら
に、本発明はこの種の複製可能な発現ベクターで形質転
換した宿主細胞を包含する。

本明細書で先に示したように、本発明の線維素溶解活
性プラスミノーゲン活性化因子は天然ｔ−PAに比べてよ
り長い生物学的半減期を示し、それ故に血管の疾病のよ
うな血栓症を治療するための薬剤組成物および方法にお
いて特に有用である。

本発明の修飾ｔ−PAは薬学的に有用な組成物の既知製
法を用いて処方される。従つて、本発明はまた治療上有
効な量の修飾ｔ−PAを、薬学的に許容される担体と共に
含有してなる薬剤組成物を包含する。得られる組成物は
血栓症を治療するのに有効な量、例えば血塊を溶解する
のに有効な量、の修飾ｔ−PAを患者に与えるであろう。

種々の剤形がこのような薬剤組成物の投与を可能にす
べく製造される。こうして、例えば非経口投与は心臓血
管系の疾患をもつ患者のために用いられる。投与量およ
び投与回数はその場の状況に応じて選択されるであろ
う。本発明の修飾ｔ−PAは天然ｔ−PAよりも長い半減期
を有するために、投与量は従来技術のｔ−PAによる療法
において現在使用されている投与量よりもかなり少なく
なる。従つて、一般的に、血栓症の治療においては１日
あたり約1mg/kg（体重）までの用量が投与されるであろ
う。この種の投与は注射または輸液により行われる。

静脈投与用の組成物は、無菌状態の等張水性溶液に修
飾ｔ−PAを溶解した溶液剤の形をとり得る。このような
溶液はｔ−PAを溶解状態に維持するための可能化剤を含
むことができる。

本発明の他の面によれば、血栓症をもつ患者に有効量
の本発明プラスミノーゲン活性化因子を投与することか
ら成る、血栓症の治療方法が提供される。

本発明の別の面では、天然ｔ−PAと比較して増大した
生物学的半減期を有し且つフイブリン親和性を保持する
これらの修飾ｔ−PA分子が血栓の生体内局在化のために
使用される。この酵素は好ましくは活性部位のアミノ酸
残基の化学的修飾により、あるいはこれらの残基をコー
ドするDNA配列の修飾により不活性化される。ジイソプ
ロピルフルオロホスフエート（DFP）、フツ化フエニル
メチルスルホニル（PMSF）、Ｎ−ｐ−トシル−Ｌ−リシ
ルクロロメタン（TLCK）またはペプチドクロロメチルケ
トン（例えばＨ−Ｄ−Phe−Gly−ArgCH₂Cl）のような試
薬によるセリンプロテアーゼの化学的不活性化のため
に、多くの公知方法が存在する。遺伝子修飾による不活
性化は特定部位の突然変異誘発（例えば実施例２）を使
用して行われ、それにより活性部位の残基のいずれかを
コードするDNA配列を変化させる。好ましくは、天然の
全長ｔ−PAのSer−478に相当するセリン残基がアラニン
に変えられる。

本発明はまた、本発明による修飾プラスミノーゲン活
性化因子をコードするヌクレオチド配列から成るDNA配
列を包含する。

さらに、本発明は、哺乳動物細胞内でのヒトタンパク
質の発現のために、ヒトｔ−PA遺伝子に由来する下流の
mRNAプロセツシングシグナルを含むDNAフラグメントの
好適な使用を包含する。このDNAフラグメントは第３図
に示すヌクレオチド配列および制限酵素切断位置により
特徴づけられる。

さらに、本発明は、形質転換宿主細胞内でこの種のDN
A配列を発現しうる複製可能な発現ベクターを提供す
る。さらに、本発明は、上記の複製可能な発現ベクター
で形質転換された宿主細胞を包含する。

本発明のさらに別の面によれば、 ａ）修飾プラスミノーゲン活性化因子をコードするDNA
配列を発現しうる複製可能な発現ベクターを作製し； ｂ）工程ａ）から得られるベクターを用いて培養宿主細
胞を形質転換して組換え宿主細胞を形成し； ｃ）上記の組換え宿主細胞を、プラスミノーゲン活性化
因子コード化DNA配列の発現を可能にする条件下で培養
して、上記プラスミノーゲン活性化因子を生産させ； ｄ）得られたプラスミノーゲン活性化因子を回収する； ことから成る、本発明の修飾プラスミノーゲン活性化因
子の生産方法が提供される。このような方法においては
真核宿主細胞が用いられる。

例として、１つの本発明化合物は成長因子ドメインお
よび第１クリングルドメインを欠くことにより天然ヒト
ｔ−PAと異なつている。天然ｔ−PAのPro−47からGlu−
175までのアミノ酸残基が欠失され、そしてVal−46がGl
y−176に直接続いている。この例示化合物と天然ｔ−PA
分子との他の差異は、第２クリングルドメイン中のＮ−
グリコシル化部位（天然分子ではAsn−184に存在する）
がこのアスパラギン残基のグルタミンへの変換によりグ
リコシル化に利用できなくなつていることである。天然
ｔ−PA分子のLys−277に相当する位置のリシン残基はバ
リンに変えられる。以上のように修飾された化合物はFK
2（Gln）Ｐ（Val）と表される。その他の例示化合物で
は、天然ｔ−PA分子のGys−６からCys−173までの残基
が欠失され、アミノ酸配列中のIle−５の後にSer−174
が続く。天然分子のAsn−184およびLys−277に相当する
残基は、最初の化合物と同じ方法で修飾される。この２
番目の化合物はK2（Gln）Ｐ（Val）と表される。

これらの例示化合物は表１に示す。

残基に対して示された番号は天然ヒトｔ−PA配列から
引用したものである（第１図参照）。

本発明によるヒトｔ−PAの修飾は好ましくは、成長因
子ドメインの修飾または欠失、少なくとも１つのグリコ
シル化部位の除去、およびプロテアーゼドメイン中の第
２残基（Lys）の他のアミノ酸残基（その側鎖が陽電荷
を示さないもの）への修飾の組合せである。

これらの線維素溶解活性修飾ｔ−PA分子は、血流中で
天然の非修飾ｔ−PA（天然または組換え体）よりも長い
生物学的半減期を有し、阻害剤との複合体形成による不
活化に対してもそれほど感受性でない。効果的な血栓溶
解は、非修飾ｔ−PAに対して現在使用されている用量よ
りも比較的少ない用量のこれらのｔ−PA変異型により得
られる。

理論によつて束縛されるのを欲しないが、本発明者ら
は、修飾ｔ−PA:sのようなより小さい分子が血塊中によ
り速く拡散し、それによつて非修飾全長ｔ−PAよりも効
果的に血栓溶解を誘発すると推測する。我々の結果はま
た、これらのより小さいｔ−PA分子が真核細胞によつて
一層効果的に発現されることを示す。また、一本鎖形の
修飾分子が血漿阻害剤と反応しないか、又は非修飾ｔ−
PAよりも遅く反応するということは、大規模生産にとつ
て重要であるだろう。大抵の場合に、プロテアーゼ阻害
剤を含む血清を培地に補給しなければならないので、こ
のことは組織培養物からの線維素溶解活性分子の生産量
を増大させる。分泌された非修飾ｔ−PAのかなりの部分
がウシ胎児血清に由来する阻害剤と複合体を形成するこ
とが報告されている〔シユロイニング（Schleuning W.
D.）．線維素溶解に関する第VIII回国際会議の抄録番号
82,ウイーン,1986を参照〕。

これらの修飾された線維素溶解酵素は組換えDNA技術
を用いて生産される。修飾分子をコードするDNAは、全
長ｔ−PA cDNAを適当な制限酵素で消化し、特定部位の
突然変異誘発および／またはDNAフラグメントの化学合
成のような技術を利用することにより構築される。これ
らの方法は組換えDNA技術の分野で通常の知識を有する
者によく知られている。

修飾された線維素溶解分子をコードするDNAは、真核
または原核細胞内での発現のための適当なベクターに導
入される。

この分子の精製は、適当な改変を伴う天然ヒトｔ−PA
のために開発された既知方法により行うことができる。
適切な精製方法は、タンパク質精製の分野で通常の知識
を有する者によつて開発されるだろう。

ヒトｔ−PA下流プロセツシングシグナルに融合された
天然または修飾ヒトｔ−PAコード配列の上流にプロモー
ター因子だけでなくエンハンサー因子を含む転写単位を
使用することにより、分析した全ての真核細胞系、例え
ばC127,NIH3T3,Swiss3T3のようなマウス細胞、CHOd^-1,C
HOK1,NAK,RS1610のようなハムスター細胞、CV−1,COS−
1,COS−７のようなサル細胞において高レベル発現が得
られる。発現レベルは、ヒト以外の真核生物遺伝子また
はウイルス遺伝子からの下流プロセツシングクジナルを
使用したときに比べて、相同なコーデイング／下流プロ
セツシング単位を使用したときの方が実質的に高かつ
た。ｔ−PA発現配列は最後のエクソンと更に下流の配列
に関してヒトゲノムに見られるこの領域の配列と同一で
ある。この領域は第３図に示すヌクレオチド配列および
制限酵素切断部位により特徴づけられる。

この改良された相同単位は、cDNAの最後のエクソン領
域中に対応部位へ、mRNAプロセツシングシグナルを与え
る要素を融合することにより得られる。

ウサギによるターンオーバー（回転速度）検定 天然および修飾ｔ−PAを10〜30μｇの静脈内ボーラス
用量として注入した。耳動脈中のカニユーレから、血液
試料を頻繁に採取し、10％クエン酸ナトリウムと混合し
た。遠心後、血漿試料はヒト黒色腫ｔ−PAに対するポリ
クローナル抗体を利用する酵素結合免疫吸着検定（ELIS
A）により組換えｔ−PAについて検定した。

寄託：微生物、組換えDNA分子、および本発明の修飾
ｔ−PA DNAコード配列、ならびにそれらを作製するのに
有用な出発物質は1987年６月16日にドイツ国ゲツチンゲ
ンＤ−3400、グリスバツハストラーゼ８、“Deutsche S
ammlung von Mikroorganismen"のカルチヤーコレクシヨ
ンに寄託され、そこで以下のように同定された： A:JM83 （pKGE22） 寄託番号:DMS4142 B:HB101（pKGE81） 寄託番号:DMS4143 C:HB101（pKGE83） 寄託番号:DSM4144 D:HB101（pKGE105） 寄託番号:DSM4145 E:HB101（pKGE114） 寄託番号:DSM4146 本発明は次の実施例を参照することによりさらに理解
されるであろう。これらの実施例は純粋に例示的であ
り、特許請求の範囲に記載の本発明の真の範囲を制限す
るものとして解釈されるべきではない。

実施例１ ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−PA）をコ
ードする遺伝子のクローニング 細胞培養 高レベルのｔ−PAを構成的に生産する形質転換ヒト細
胞株Bowes黒色腫細胞は、１％非必須アミノ酸（Flo
w）、グルタミン（2mM）、ペニシリン（50IU/ml）、ス
トレプトマイシン（50μg/ml）、ヘペス（20mM、pH7.
2）および10％ウシ胎児血清を補給したイーグル最少必
須培地中37℃でガラス製のローラーボトル中にて培養し
た。

メツセンジヤーRNAの調製 黒色腫細胞の全面生長培養物をトリプシン処理して収
穫した。氷冷したリン酸緩衝溶液（pH7.2）で洗つた
後、細胞を遠心により回収した。細胞沈殿物は4M GuSCN
中で溶解し、その後全RNAをGuHCl溶液から選択的にエタ
ノール沈殿させた。

メツセンジヤーRNAはオリゴーdTセルロースでのクロマ
トグラフイーにより全RNA調製物から精製した。得られ
たポリA⁺mRNAは50mMLiCl、20mMトリス−HCl、1mM EDTA
−Li、１％LiDS中の10〜30％ショ糖から成るショ糖勾配
上でpH7.8にて大きさにより分画化した。

黒色腫細胞mRNAからのcDNAバンクの作製 23Sに相当するショ糖分画は、ドツト・ブロツト・ハ
イブリダイゼーシヨンによりｔ−PA mRNAに富むことが
分かつた。この濃縮分画からのmRNA5μｇを用いて、ヘ
デン（Hedｎ）ら、FEBS Lett.194,p.327−332,1986に
詳述される如く改変した岡山＆バーグ法〔Okayama＆Ber
g,Mol.Cell.Biol.3,p.280−289〕によりcDNAライブラリ
ーを作製した。開示された方法に従つて作製したcDNA含
有プラスミドpT4は大腸菌5Kを形質転換するために使用
した。得られた遺伝子バンクは約５×10⁴個の独立クロ
ーンから成つていた。

ｔ−PA配列含有クローンのスクリーニング 分離した部分的ｔ−PA cDNAクローン〔エドルンド（E
dlund）ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA80,p.349−352,198
3を参照〕を用いて、ｔ−PA配列含有クローンについて
遺伝子ライブラリーをスクリーニングした。cDNAクロー
ンの476bp EcoRIフラグメントは市販のニツク・トラン
スレーシヨンキツト（NEN）を使つて、比活性約５×10⁷
cpm/μｇへ³²P−dCTPでニツク・トランスレーシヨンし
た。細菌コロニーはPALLフイルターへ製造者の指示する
方法により移行させ、50％ホルムアミド、５×SSC、250
μg/ml酵母RNA中37℃で一晩ニツク・トランスレーシヨ
ンしたDNAプローブとハイブリダイズさせた。周囲温度
において２×SSCで３回洗つた後、フイルターを乾燥さ
せてＸ線フイルムに露出させた。

ｔ−PA cDNAの塩基配列決定 pKG12と名づけた１つのクローンがオートラジオグラ
フイー後に同定された。制限酵素Kpn IおよびPst Iでの
消化は、pKG12が約2.5kbの挿入物を含むことを明らかに
した。この挿入物はM13mp10およびmp11〔メツシング（M
essing）、J.Methods Enzymol.101,p.20−78,1983を参
照〕にサブクローニングし、そしてジデオキシ・チエイ
ン・ターミネーシヨン法〔サンガー（Sanger）ら、PNA
S、74,p.5463−5467,1977を参照〕を用いてDNA配列を解
析した。クローンpKG12はヒトｔ−PAの全コード領域、
並びに102bp5′隣接DNA、760bp3′隣接DNAおよびポリＡ
尾部を含むことが判明した。pKG12の完全なDNA配列を第
１図に示す。

真核細胞発現のためのｔ−PAのサブクローニング 第２図に示すように、全コード配列、全部の５′非コ
ード領域、および559bpの３非コードDNAは2350bpの部分
Aval×XmnIフラグメントに含まれる。

このフラグメントを得るため、pKG1225μｇは30単位
のXmnIを用いて37℃で一晩完全に切断した。AvaI（９単
位）を加え、切断を37℃でさらに１時間20分続行した。
生成した種々の切断産物は0.6％低ゲル化温度アガロー
スゲル（LGT−アガロース、BioRad社）で分離した。235
0bpバンドを切り出し、68℃で融解し、その後フエノー
ル抽出を行つてエタノール沈殿させた。精製したフラグ
メントはdNTP:sの存在下にDNAポリメラーゼのクレノウ
断片を用いて修復反応により平滑末端とした。このフラ
グメントにBamHIリンカー（５′−CGCGGATCCGCG−
３′）をT4DNAリガーゼにより付加した。BamHIでの切断
および0.7％LGT−アガロース電気泳動による過剰のBamH
Iリンカーフラグメントの除去後に、ｔ−PAフラグメン
トをBamHIで切断したpUC8に連結させた。得られたブラ
スミド（pKGE22と称す）はHindIII/BamHIフラグメント
内に大部分のｔ−PA cDNAを含む。推定上のポリアデニ
ル化シグナルAATAAAを有するXmnI部位の下流の配列は除
去された。

連結混合物を使用して、コンピテント大腸菌JM83細胞
を形質転換した。50μg/mlのアンピシリンおよび25μl/
平板のジメチルホルムアミド中２％Ｘ−galを含む寒天
平板上で白色コロニーを選択した。

実施例２ K2（Gln）Ｐ（Val）の構築 F,GおよびK1ドメインを欠失したｔ−PA分子をコード
する遺伝子を構築するために使用した戦略（strategy）
は、初めに103位のBg1IIから716位のEcoRI部位にまで及
び613bp制限フラグメントを除き、次いでオリゴヌクレ
オチドリンカーを用いてK2ドメインをシグナルペプチド
へ直接融合することであつた。

613bpの内部Bg1II/EcoRIフラグメントの除去により、
F,GおよびK1ドメインをコードする領域が欠失される。
リンカー断片を用いて、プロセツシングされた成熟ｔ−
PAの５個のＮ末端アミノ酸残基を伴うK2ドメインの欠失
部分を修復した。さらに、グリコシル化部位Asn184をG1
nに変え、177位のアスパラギン残基をセリン残基で置換
した。

シグナルペプチドとK2ドメインとを融合させるリンカ
ーフラグメントは、ホスホルアミダイト法〔エルンブラ
ツド（Elmblad）ら、Nuc1.AcidsRes.10,p.3291−3301,1
982を参照〕を用いて２本の相補的な116bpオリゴヌクレ
オチドを合成することにより作製した。

合成した116−merそれぞれ50ピコモルは、マニアチス
らの方法〔Maniatisら、モレキユラー・クローニング：
実験室マニユアル、コールド・スプリング・ハーバー・
ラボラトリー、1982を参照〕によりT4ポリヌクレオチド
キナーゼ（New England Biolabs社）を用いてリン酸化
した。２本のDNA鎖は70℃で５分間加熱することにより
アニーリングし、その後60分間かけて温度を20℃へ低下
させた。５ピコモルの二本鎖リンカーは標準連結条件
〔マニアチスらの上記文献を参照〕を用いて、EcoRIお
よびHindIIIで消化した0.1ピコモルのM13mp8へ連結させ
た。その後、連結混合物を使用して、コンピテント大腸
菌JM103を形質転換した。組換え体はＸ−gal平板上で白
色ブラークとして選別された。一本鎖フアージDNAを分
離し、17−merM13ユニバーサル・シークエンシング・プ
ライマー３′−GTAAAACGACGGCCAT−５′を用いてジデオ
キシ法により塩基配列を決定した。正確な配列をもつ１
つのクローンから日本鎖複製型（RF）をつくり、その後
の構築作業のために使用した。

上記のM13クローンからの二本鎖DNAはBg1IIおよびEco
RIで完全に消化した。生成した110bpフラグメントを1.2
％LGT−アガロースゲル（米国BioRad社）から回収し
た。プラスミドpKGE22をBg1IIおよびEcoRIで部分消化
し、種々の切断産物を0.6％LGT−アガロースゲルで分離
した。103位のBg1IIから716位のEcoRIまでのｔ−PAの内
部領域を欠失した4381bpフラグメントが単離された。11
0bp Bg1II/EcoRIオリゴヌクレオチドリンカーは、T4DNA
リガーゼを用いてpKGE22の4381bp部分Bg1II/EcoRI消化
物へ連結させて、プラスミドpKGEP75を得た。この連結
混合物を用いて、コンピテント大腸菌HB101細胞を形質
転換した。Amp（50μg/ml）を含む選択平板上に現れる
クローンからプラスミドDNAを調製した。

次に、非修飾ｔ−PA配列の277位にアミノ酸に相当す
るリシン残基は、特定オリゴヌクレオチドの突然変異誘
発によりバリン残基に変更した。

プラスミドpKGEP75はSalI/SacIで消化し、そして0.9
％LGT−アガロースゲルから0.9Kbフラグメントを回収し
た。このフラグメント（アミノ酸277をコードするDNA配
列を含む）はM13mp19にクローニングした。0.9kbSalI/S
acI挿入物を保有するM13クローンの一本鎖DNAを調製し
た。この一本鎖DNAは合成オリゴヌクレオチド（５′−G
CCCTCCCACGATGCGAAA−３′）とハイブリダイズさせた。
アニーリングは１×TM緩衝液（10mMトリス−HCl,10mM M
gCl₂,pH8.0）中70℃で５分行つた。１時間後、温度が20
℃に下がつたとき、１μ10×TM緩衝液、１μ10mM A
TP,1μl20mM dNTP,1μ100mMDTT,5単位クレノウ断片お
よび12単位T4DNAリガーゼを添加した。伸長／連結反応
は15℃で４時間実施した。

得られた二本鎖DNAを直接使用してコンビテント大腸
菌JM103細胞を形質転換し、200個のプラークは５′末端
を³²Pで標識したミスマツチ（誤対合）プライマーとハ
イブリダイズさせた。50℃で洗浄液後に強いハイブリダ
イゼーシヨン信号を与える１つのプラークを精製し、二
本鎖複製型をつくつた。Lys Val修飾を含む900bpのSalI
/SacIフラグメントは、SalIおよびSacIでの切断，それ
に続く0.9％LGT−アガロースゲル電気泳動により回収さ
れた。このフラグメントはSalI/SacIで消化したpKGEP75
にクローニングし、これによりプラスミドpKGE114を得
た。

プラスミドpKGE114はK2（Gln）Ｐ（Val）で表される
例示化合物をコードしている。

実施例３ FK2（Gln）Ｐ（Val）の構築 プラスミドpKGEP114では、K2ドメインがBamHI部位に
より先行される。この部位を利用して、K2ドメインのす
ぐ前にＦドメインをコードする領域を導入した。

特定部位の突然変異誘発により、ｔ−PA cDNA配列の
ＦドメインとＧドメインとの接合点にBamHI部位を作つ
た。プラスミドpKGE22はSalIおよびEcoRIで完全に消化
した。シグナル配列およびF,G,K1ドメインに及び800bp
フラグメントをLGTアガロースゲル電気泳動後に回収
し、M13mp19にサブクローニングした。一本鎖型のM13ク
ローンは、in vitro突然変異誘発のための鋳型として役
立つた。合成24bpオリゴヌクレオチドミスマツチプライ
マー（５′−GCAACTTTTGGATCCCACTGAGTG−３′）を用い
てアミノ酸残基47および48をPro−ValからGly−Serへ変
換し、それによつてＧドメインとK1ドメインとの接合点
にBamHI部位を作つた。³²P標識24bpミスマツチプライマ
ーにより強いハイブリダイゼーシヨン信号を与える１つ
のプラークを精製し、二本鎖DNAを作製した。

その二本鎖DNAはSalIおよびBamHIで消化し、シグナル
配列およびＦドメインだけでなく５′非翻訳領域を含む
フラグメントを0.8％LGTアガロースから回収した。

例示化合物FK2（Gln）Ｐ（Val）をコードするプラス
ミドpKGEP115を得るために、プラスミドpKGEP114をSalI
で完全に消化し、その後BamHIで部分切断した。５′非
翻訳領域およびシグナル配列を欠いたｔ−PA遺伝子を伴
うpUC8ベクターに相当するフラグメントを切り出し、そ
してシグナル配列およびＦドメインを含むSalI/BamHIフ
ラグメントに連結した。

実施例４ 真核細胞による線維素溶解活性ｔ−PAおよびｔ−PA誘
導体の発現 エンハンサーおよびプロモーター配列を含むDNAフラ
グメントおよびヒトｔ−PA遺伝子の下流領域からのゲノ
ムフラグメントに連結された実施例２および３で作製し
たような修飾cDNA:sおよび適当な極性を有する実施例１
のような全長cDNAを制御する発現単位は、様々な細胞系
内での発現のために数種のベクターに導入した。

真核細胞発現ベクターは慣用のトランスフエクシヨン
法により細胞内に導入した。所定の宿主細胞クローンで
の一時的発現または安定した発現は酵素結合免疫吸着検
定（ELISA）を用いて検定し、そして線維素溶解活性は
プラスミノーゲン含有フイブリン平板で検定した。

Ａ） COS−７サル細胞による一時的発現 SV40後期プロモーター、ポリアデニル化シグナル、SV
40由来の小さいｔイントロン、細菌レプリコンおよび選
択マーカーを含む発現ベクター（pML2d）を構築した。C
OS発現ベクターの基本的特徴は、cDNA配列がSalI/Bg1II
適合性付着末端を用いてSV40後期プロモーターと３′ポ
リアデニル化シグナル配列の間に挿入されるということ
である。全長ｔ−PA cDNA、K2（Gln）Ｐ（Val）およびF
K2（Gln）Ｐ（Val）のコード配列はそれぞれベクターpK
GE22,pKGEP114およびpKGEP115由来のSalI/BamHIフラグ
メント上に得られた。これらのフラグメントはSalI/Bg1
II消化COS発現ベクターに連結して、ベクターpKGE74、p
KGE114およびpKGE115を得た。

これらの発現プラスミドはDEAE−デキストラントラン
スフエクシヨンプロトコール〔サンペイラツク＆ダナ
（Sompayrac＆Danna）、J.Virol.Methods 5,335−341,1
982を参照〕を用いてCOS−７細胞へ導入した。培地をト
ランスフエクシヨンの48時間後と72時間後に収穫し、抗
原および線維素溶解活性について検定した。さらに、SD
S/ポリアクリルアミドゲル電気泳動、それに続くフイブ
リンオートグラフイーによつて固定した（第４図を参
照）。

Ｂ） C127マウス細胞での安定した発現 安定的に形質転換されたマウス細胞による修飾または
天然ｔ−PAの生産のために、高コピー数の染色体外複製
が可能なベクターが使用された。ベクターpKGE83が構築
され、このベクターではｔ−PA遺伝子がマウスメタロチ
オネインプロモーター（mMT−１）の支配下にあり、そ
してポリアデニル化シグナルおよびｔ−PA遺伝子のエク
ソン14を包含するヒトゲノムフラグメント由来のその他
の下流シグナルが含まれる。真核細胞複製起点、プラス
ミド維持配列および宿主細胞の形質転換はウシパピロー
マウイルス（BPV）によりもたらされる。

出発プラスミドはpUC8のHinDIIIとBamHI部位間のｔ−
PA遺伝子、mMT−１プロモーター因子およびSV40の小さ
いｔイントロンならびにポリアデニル化シグナルを含む
pMTtPA、およびpML2d−BPV変異体のpKGE50である。

プラスミドpMTtPAおよびpKGE50はBamHIおよびSa1Iで
消化した。pMTtPAからｔ−PAと調節因子を含む3.9Kbフ
ラグメントを分離し、全BPVゲノムおよびpML2d配列を含
むBamHI/Sa1Iフラグメントに連結し、それによりpKGE61
を得た。

次の工程で、プラスミドpKGE27（ヒトｔ−PA遺伝子の
エクソン14以上の領域を包含するゲノムフラグメントを
含む）をApaIおよびSa1Iで消化した。ポリアデニル化シ
グナル配列のようなプロセツシングシグナルを含むこの
フラグメントは、ApaIおよびSa1Iで消化したpKGE61へ挿
入した。得られたプラスミドをpKGE83と名づけた。

pKGE83と類似しているが、実施例２のようにして修飾
したcDNAを含むプラスミドpKGE113は、pKGE83由来の10.
2Kb ApaI/BamHIフラグメントの連結により構築された。
このプラスミドは全BPV−１ゲノム、pML2d配列、ｔ−PA
遺伝子の遠位部分、mMT−１プロモーター因子を含む0.7
Kb BamHI/Sa1Iフラグメント、およびcDNA修飾を含むSa1
I/ApaIフラグメントを含んでいる。

これらの宿主ベクター系は完全なまたは修飾されたｔ
−PAの高レベル発現が可能である。表２は異なるプラス
ミドを用いてトランスフエクシヨンした後のC127細胞に
おける発現レベルを示す。線維素溶解活性およびELISA
検出可能タンパク質の量は、修飾ｔ−PA産生クローンの
方が全長分子をコードする対応ベクターでトランスフエ
クシヨンしたものよりも多量であつた。また、発現レベ
ルはヒトｔ−PA下流プロセツシングシグナルを含むゲノ
ムフラグメントを使用したときに増大すると結論づける
ことができる。

上記ベクターはリン酸カルシウム法〔ウイグラー（Wi
egler）ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA76,p.1373−1376,1
978を参照〕を用いてマウスC127細胞にトランスフエク
シヨンされた。細胞はハーベイ（Harvey）肉腫ウイルス
５′LTR（ロング・ターミナル・リピート）の制御下に
あるネオマイシン耐性をコードする遺伝子を含むプラス
ミドpKGE53と共に同時トランスフエクシヨンした。ネオ
マイシン類似体G418を培地に加え（1mg/ml）、G418含有
培地中で約２週間培養した後40〜100クローンを分離し
た。これらのクローンは別個に増殖させ、ELISA検定で
ｔ−PA抗原の発現について検定した。

Ｃ） CHO細胞での安定した発現 発現ベクターpKGE25はSV40プロセツシングシグナルお
よびSV40初期プロモーターの支配下にある全長ｔ−PA c
DNA、マウス乳癌ウイルスMMTV5′LTRにより支配されるD
HFRの転写単位、ポリアデニル化シグナル、SV40由来の
その他の下流プロセツシングシグナル、およびpBR322由
来の原核細胞複製シグナルを含むDNAフラグメントを包
含する。このベクターをDHFR欠損CHO細胞〔ウーラウブ
＆チエイシン〔Urlaub＆Chasin）,Proc.Nat1.Acad.Sci.
USA77,p.4216−4220,1980を参照〕にトランスフエクシ
ヨンし、形質転換体を分離し、そして次第に増加する濃
度のジヒドロ葉酸還元酵素阻害剤メトトレキセート（MT
X）中で生育させた。

１個の代表的形質転換体（pKGE25 7:9）において得ら
れた発現レベルをMTXの増幅に相関させて表３に示す。

CHOd^-細胞はヌクレオシドを含む培地Ｆ−12中で培養
した。トランスフエクシヨン後この培地をヌクレオシド
不含イーグルα−MEMに変えた。生存クローンは次第に
増加する濃度のメトトレキセート中で培養することによ
り増殖させた。ｔ−PA抗原の生産はELISA検定で分析し
た。

【図面の簡単な説明】

第１図は全長ヒトｔ−PA cDNAのヌクレオチド配列およ
び推定上のアミノ酸配列を示す。 第２図はベクターpKG12中の全長ｔ−PA cDNAと、実施例
１に記載されるような真核細胞発現（pKGE22）のために
修飾されたｔ−PA cDNAとの間の関係を示す模式図であ
り、異なるドメインをもつｔ−PAタンパク質が下段に示
される。 第３図はpKG12におけるヌクレオチドナンバリングと関
連させた、クローンKGH11に含まれるヒトゲノムDNAフラ
グメントの模式図である。そこに記載のヌクレオチド配
列は３′隣接ゲノムDNAおよびポリＡシグナルを保有す
る最後のエクソン部分を表す。 第４図はCOS細胞により生産された全長ヒトｔ−PAおよ
び修飾型ｔ−PAのSDS/ポリアクリルアミドゲル電気泳動
後のフイブリンオートグラフイーである。 第５図はウサギ血漿からの天然全長ヒトｔ−PA（pKGE7
4）および修飾型ｔ−PA（pKGE114,115）の排出を示すグ
ラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ａ６１Ｋ 37/54 ＡＣＢ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 ビエーン・レーベンアドラー スウエーデン国．テーバイ．エス 183 64．カールショルムスベーゲン ３ エフ (56)参考文献 特開 昭62−48378（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−130690（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−247384（ＪＰ，Ａ) 欧州公開207589（ＥＰ，Ａ１) 欧州公開225286（ＥＰ，Ａ２) ＦＥＢＳ ｌｅｔｔ．，189（１) （1985），Ｐ．145−149 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ，83（1986）Ｐ．4670−4674

Claims (9)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】成長因子（Ｇ）ドメインが欠失され、クリ
   ングル１（K1）ドメインも欠失され、そしてさらにフィ
   ンガー（Ｆ）ドメインも欠失され、且つアミノ酸残基18
   4の部位及び／又は448の部位でAsnがGlnで置換されてい
   ることを特徴とする線維素溶解作用を有する組織型プラ
   スミノーゲン活性化因子。
2. 【請求項２】成長因子（Ｇ）ドメインが欠失され、クリ
   ングル１（K1）ドメインも欠失され、そしてさらにフィ
   ンガー（Ｆ）ドメインも欠失され、且つアミノ酸残基18
   4の部位及び／又は448の部位でAsnがGlnで置換されてい
   る線維素溶解作用を有する組織型プラスミノーゲン活性
   化因子をコードするヌクレオチド配列から成るDNA。
3. 【請求項３】哺乳動物細胞内でヒトタンパク質を発現さ
   せるための、ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子遺
   伝子に由来する下流mRNAプロセッシングシグナルをさら
   に含む、請求項２記載のDNA。
4. 【請求項４】成長因子（Ｇ）ドメインが欠失され、クリ
   ングル１（K1）ドメインも欠失され、そしてさらにフィ
   ンガー（Ｆ）ドメインも欠失され、且つアミノ酸残基18
   4の部位及び／又は448の部位でAsnがGlnで置換されてい
   る線維素溶解作用を有する組織型プラスミノーゲン活性
   化因子をコードするヌクレオチド配列からなるDNAを形
   質転換宿主細胞内で発現しうる複製可能な発現ベクタ
   ー。
5. 【請求項５】成長因子（Ｇ）ドメインが欠失され、クリ
   ングル１（K1）ドメインも欠失され、そしてさらにフィ
   ンガー（Ｆ）ドメインも欠失され、且つアミノ酸残基18
   4の部位及び／又は448の部位でAsnがGlnで置換されてい
   る線維素溶解作用を有する組織型プラスミノーゲン活性
   化因子をコードするヌクレオチド配列からなるDNAを形
   質転換宿主細胞内で発現しうる複製可能な発現ベクター
   により形質転換された宿主細胞。
6. 【請求項６】治療上有効な量の成長因子（Ｇ）ドメイン
   が欠失され、クリングル１（K1）ドメインも欠失され、
   そしてさらにフィンガー（Ｆ）ドメインも欠失され、且
   つアミノ酸残基184の部位及び／又は448の部位でAsnがG
   lnで置換されている線維素溶解作用を有する組織型プラ
   スミノーゲン活性化因子および薬学的に許容しうる担体
   を含有する血栓症の治療用薬剤組成物。
7. 【請求項７】非経口投与に適した剤形である、請求項６
   記載の組成物。
8. 【請求項８】成長因子（Ｇ）ドメインが欠失され、クリ
   ングル１（K1）ドメインも欠失され、そしてさらにフィ
   ンガー（Ｆ）ドメインも欠失され、且つアミノ酸残基18
   4の部位及び／又は448の部位でAsnがGlnで置換されてい
   る線維素溶解作用を有する組織型プラスミノーゲン活性
   化因子の生産方法であって、 ａ）上記プラスミノーゲン活性化因子をコードするDNA
   配列を発現しうる複製可能な発現ベクターを作製し； ｂ）工程ａ）から得られるベクターを用いて宿主細胞培
   養物を形質転換し、それにより組換え宿主細胞を形成
   し； ｃ）該組換え宿主細胞をプラスミノーゲン活性化因子コ
   ード化DNA配列を発現させる条件下で培養して、上記プ
   ラスミノーゲン活性化因子を生産させ；そして ｄ）生産されたプラスミノーゲン活性化因子を採取する ことから成る組織型プラスミノーゲン活性化因子を生産
   する方法。
9. 【請求項９】真核宿主細胞を使用する、請求項８記載の
   方法。