JPH0571228B2 - - Google Patents

Description

請求の範囲 １ ｔ−PAの領域GK1Lを有するタンパク質を
コードし、その際野生型ｔ−PA−遺伝子の領域
Ｋ２及びＦをコードする配列又は遺伝暗号の退行
変性の枠内でこれから誘導された配列が正確なエ
キソン／イントロン接触面でｔ−PA−遺伝子か
ら完全に欠失していることを特徴とする組換え
DNA。

２ 野生型ｔ−PA又は領域Ｇ、Ｋ１及びＬ以外
の領域をも含むｔ−PA変異体をコードするDNA
−配列から、ｔ−PA−遺伝子上における正確な
エキソン／イントロン−接触面の維持下に領域
Ｇ、Ｋ１及びＬをコードしない各配列を欠失させ
ることを特徴とする、請求項１記載の組換え
DNAの製法。

３ 領域Ｆ及びＫ２をコードする配列の欠失を意
図的な変異誘発によつて実施する請求項２記載の
方法。

４ 請求項１記載の組換えDNAのコピー１個以
上を組込まれた状態で含むことを特徴とする組換
えベクター。

５ SV40初期プロモータ及びマウスdhfr−遺伝
子を含む請求項４記載の組換えベクター。

６ プラスミドpSV−GK1L。

７ 請求項１記載の組換えDNA又は請求項４か
ら６までのいずれか１項記載のベクターで形質転
換されていることを特徴とする細胞系。

８ 真核、有利にはCHO−dhfr−細胞系である
請求項７記載の細胞系。

９ ｔ−PAの領域Ｇ、Ｋ１及びＬの、この順序
でのアミノ酸配列からなり、場合によつてはグリ
コシル化されていることを特徴とする繊維素溶解
特性を有するタンパク質。

１０ 請求項１記載のDNA又は請求項４から６
までのいずれか１項記載のベクターを適当な宿主
細胞に表現し、発現生成物を培地から又は宿主細
胞を溶解することによつて回収することを特徴と
する、繊維素溶解特性を有するタンパク質の製
法。

１１ 真核の、有利にはCHO−dhfr−細胞
（ECACC 88072103）を宿主細胞として使用し、
グリコシル化された生成物を得る請求項１０記載
の方法。

１２ アプロチニンを含む培地中で培養される宿
主細胞を使用する請求項１０又は１１記載の方
法。

１３ 請求項９記載のタンパク質を含むことを特
徴とする繊維素溶解剤。

明細書 ヒト組織プラスミノーゲンアクチベータ（ｔ−
PA）は分子量68000ダルトンのセリンプロテアー
ゼであり、酵素前駆体プラスミノーゲンを活性セ
リンプロテアーゼプラスミンに変換する。プラス
ミンは、血餅のタンパク質マトリツクスの主成分
であるフイブリンを溶解する。ｔ−PAはフイブ
リンに対して高い親和性を有し、またフイブリン
によつて活性化される（“Fibrinolysis”、２
（1988）、133−142参照）。従つてｔ−PAは医学的
に極めて重要視される。

例えばウロキナーゼ又はストレプトキナーゼの
ような他の公知のプラスミノーゲン活性化因子に
比べてｔ−PAの利点は、その触媒活性がフイブ
リンによつて刺激されることである。（“J.Biol.
Chem.”、257（1982）、2912−2919；“Biochem.
Biophys.Acta”、755（1983）、531−533参照）。

ｔ−PA（アミノ酸配列、フエハール（Vehar）
その他、“Bio／Technology”、２（1984）、1051
〜1057参照）は、その一本鎖形において１本の重
鎖（Ｈ−鎖）と１本の軽鎖（Ｌ−鎖）とからな
り、これらはジスルフイド架橋によつて結合され
ている。その二本鎖形は一本鎖前駆体形からプラ
スミン又は他のプロテアーゼでアミノ酸（A.S.）
275と276の間で特異的に切断することによつて生
じる。32000ダルトンのＬ−鎖は、ウロキナーゼ
又はプラスミンののような他のセリンプロテアー
ゼに対して相同性を有する酵素活性範囲を含む
（“Proc.Natl.Acad.Sci.USA”、81（1984）、5335−
5339）。39000ダルトンのＨ−鎖上の各領域はフイ
ブロネクチン（A.S.1−49）に対して相同性のフ
インガー領域(F)、マウス−及びヒト表皮増殖因子
（A.S.50−87）に対して相同性の増殖因子領域(G)
及びプラスミノーゲン中のクリングル構造に対し
て相同性の２つのクリングル領域Ｋ１（A.S.88−
175）及びK2（A.S.176−262）である。

Ｈ−鎖の個々の領域の機能に関してはすでに知
られている。すなわち、フイブリンへのｔ−PA
の結合、従つてまたフイブリンの存在でｔ−PA
の触媒活性を刺激するのに関与するのは領域Ｋ２
又は／及びＦのみで、領域Ｋ１はこれに関与しな
い（欧州特許出願公開第0234051号明細書）。

“EMBO”、７（1988）、2731−2740からは、
Ｈ−鎖からの完全な領域Ｋ１及びＦ、並びに領域
Ｋ２の１部を含むｔ−PA変異体の活性もフイブ
リンによつて刺激可能であることが公知である。

しかしＨ−鎖の個々の領域がフイブリンに対す
るｔ−PA−分子の活性をどの程度生ぜしめまた
プラスミノーゲン切断活性をどの程度刺激するの
かは未解決である。

本発明の課題は、ｔ−PAに比べてより大きな
プラスミノーゲン切断活性を有しまたその触媒活
性を同様にフイブリン又はフイブリノーゲンによ
つて刺激することのできるｔ−PA−変異体を得
ることにある。

この課題は本発明によれば、ｔ−PAの領域の
GK1Lを有するタンパク質をコードし、その際領
域Ｋ２及びＦをコードする配列又は遺伝暗号の退
行変性の枠内でこれから誘導された配列、すなわ
ち正確なエキソン／イントロン接触面に相当する
配列がｔ−PA−遺伝子上で完全に欠失されてい
る、組換えDNAを製造することによつて解決さ
れる。従つて本発明による組換えDNAではｔ−
PAcDNAのヌクレオチド715〜972及び199〜339
が欠けている（番号は“Natur”、301、（1983）、
214−221による）。活性の刺激可能性にとつて重
要なものとみなされる、Ｈ−鎖の領域Ｋ２及びＦ
は、本発明による組換えDNAの遺伝子生成物で
あるｔ−PA変異体GK1Lでは欠けているにもか
かわらず、このGK1Lには予想外にもフイブリン
による触媒活性の刺激可能性は保持されている。
GK1Lを表現する細胞からの上澄みの触媒活性は
驚くべきことには、ｔ−PAを表現する細胞から
の上澄みの活性よりも明らかに高い。

本発明の１対象は、ｔ−PA又は領域Ｇ、Ｋ１
及びＬ以外の領域も含むｔ−PA変異体をコード
するDNA−配列から、ｔ−PA−遺伝子上におけ
る正確なエキソン／イントロン−接触面の維持下
に、領域Ｇ、Ｋ１及びＬをコードしない各配列を
欠失させることにより、本発明の組換えDNAを
製造する方法である。領域Ｋ２及びＦをコードす
るDNAの欠失を意図的な変異誘発によつて起こ
させる方法が特に有利である。

本発明の１対象は、本発明による組換えDNA
のコピー１つ以上を含む組換えベクターである。
この場合優れた１実施態様は、真核細胞中に組換
えDNAを発現させるのに適したベクターである。
本発明の特に優れた１実施態様はSV40−初期プ
ロモター及びマウス−dhfr−遺伝子を含むGK1L
−遺伝子を有する真核ベクターである。しかし最
も好ましいのは本発明によるプラスミドpSV−
GK1Lである。

本発明の１対象は、本発明による組換えDNA
又は本発明によるベクターで形質転換されている
細胞系である。特に好ましいのは真核細胞系であ
り、最も好ましいのは、本発明による組換え
DNA又は本発明によるベクターを含むCHO−
dhfr−細胞系（例えばECACC 88072103）であ
る。

本発明の１対象はｔ−PAの領域Ｇ、Ｋ１及び
Ｌの、この順序でのアミノ酸配列からなりかつ場
合によつてはグリコシル化されている繊維素溶解
特性を有するタンパク質である。本発明は同様
に、本発明による組換えDNA又は本発明による
組換えベクターを適当な宿主細胞に表現し、この
発現生成物を培地から又は宿主細胞を溶解するこ
とによつて回収することにより、繊維素溶解特性
を有するタンパク質を製造する方法に関する。こ
の場合本発明によるタンパク質を真核宿主細胞、
有利にはCHO−dhfr−宿主細胞からグリコシル
化された形で得る方法が有利である。驚くべきこ
とには本発明によるプラスミドpSV−GK1Lで形
質転換されたGK1Lを分泌するCHO−dhfr−細
胞からの上澄みは、野生型ｔ−PA−遺伝子が存
在する相応する発現ベクターpSV−FGK1K2Lで
形質転換されている細胞からの上澄みよりも一層
高い触媒活性を有する。

特に有利なのはアプロチニンを含む培地中で培
養される宿主細胞を使用する方法である。

この場合予想外にも、その培地がアプロチニン
を含む宿主細胞の上澄みではその活性及びフイブ
リンによる刺激の程度は一層高い。

最後に本発明の１対象は、本発明によるタンパ
ク質を含む繊維素溶解剤である。

次の各実施例は本発明を第１図及び第２図との
関連において詳述するものである。

この場合第１図はプラスミドpSV−GK1Lの製
造法を示すものであり、第２図は野生型−ｔ−
PA及びGK1Lの、フイブリノーゲンで刺激され
た触媒活性を比較して示すグラフ図である。

例 １ フインガー及びクリングル２−領域が欠失され
ているｔ−PA−誘導体の製造（GK1L） ｔ−PAcDNAからの欠失変異体FGK1Lを、
“Bio／Technology”、２（1984）、636−639から
公知の方法により意図的な変異誘発でクリングル
２−領域を欠失することによつて製造した。出発
プラスミドとしてはｔ−PAヌクレオチド配列190
−1809が存在するpePA133（その製造は欧州特許
出願公開第0242836号明細書を参照）を使用した。
変異誘発プライマー１
（5′GCCTGCTCTGAGTCCACCTGCGGC3′）を
使用して、ヌクレオチド715〜972（エキソン及
び）を除去した（“Natur”、301（1983）、214−
221に記載されたｔ−PA−cDNAの番号に相応す
る）。次いで欠失変異体FGK1Lをコードするプラ
スミドp7745を、変異誘発プライマー１でコロニ
ーハイブリツド形成により分離し、配列を決定し
た。真核細胞に後に発現させるにはｔ−PAシグ
ナル配列の再構成が非要であつた。

まずFGK1LcDNAにリーダー配列及び3′UT
（3′非翻訳領域）（原cDNA−配列）を施した。こ
のためpUC12のポリリンカー内に位置77までの
5′UT（5′非翻訳領域）、リーダー配列及びヌクレ
オチド位置208までのｔ−PAのＮ−末端配列を含
むプラスミドp7，１、DSM4719をPst，及び
H₃indで切断した（約2.7kb）。付加的に次のｔ
−PAcDNA配列を含む断片を分離した。すなわ
ちp7745から、ヌクレオチド位置209〜421を含む
Pst／Hae−断片並びにヌクレオチド位置421〜
1273を有するHae／EcoR−断片（この場合
変異誘発によつてヌクレオチド位置715〜972は欠
失されている）をまたpePA98.1（その製造は欧州
特許出願公開第0242836号参照）からヌクレオチ
ド位置1274〜2165を有するEcoR／Hind−断
片を分離した。

これらの断片を結合し、E.coli、DSM3689に
形質転換した。プラスミドを有する形質転換細胞
を、アンピシリン50μｇ／mlを添加することによ
つて培地中で選択した。pcPA159で表される真
正プラスミドは制限酵素−分析によつて立証され
た。このプラスミドからFGK1LcDNAをXba
−Hind−断片として分離することができた
（シグナル配列を有するが、独自のポリアデニル
化部位を有さない）。この断片は位置2160
（“Nature”、301（1983）、214−221）でBgl−部
位までに７つのヌクレオチド５′非翻訳領域
（5′UT）及び3′非翻訳領域（3′UT）を含む。

FGK1Lからフインガー領域Ｆ（エキソン）を
欠失させるために変異誘発プライマー２
（5′GATCTTACCAATGCAGCGAGC3′）を使
用した。意図的に変異誘発によつてｔ−PA−
cDNA上のヌクレオチド199〜339を除去した。領
域組成GK1Lを有する組換えDNAを有するプラ
スミドを変異誘発プライマー２でコロニーハイブ
リツド形成することにより分離し、配列を決定し
た。この場合次のようにして処理した。固定化
DNAを有するフイルタを65℃で４時間、0.2％
SDS、1.0％サルコシル（Sarkosyl^R）、４×SET
（NaCl0.6mモル／、トリス−HCl0.2モル／、
PH8.0、EDTA4mモル／）及び４×デンハーツ
溶液（Denhardts−Ｌｏ¨sung）（0.08％フイコル
（Ficoll^R）、0.08％ポリビニルピロリドン、0.08％
ウシ血清アルブミン）中で前ハイブリツド処理し
た。

ハイブリツド形成は46℃で12時間0.2％SDS、
1.0％サルコシル、４×SET、４×デンハーツ中
でまたフイルタ当たり5.10⁶cpmのキナーゼ化変
異誘発プライマーを用いて行つた。フイルタを室
温で３×５分間、引続き37℃で１×10分間及び50
℃で１×５分間、４×SET及び0.2％SDS中で洗
浄した。

例 ２ CHO−細胞からのGK1L免疫学的特性化ｔ−
PA−cDNA及びGK1L−cDNAを、プラスミド
pKCR（“Proc.Natl.Acad.Sci.USA”、78（1981）、
1527−1531）の唯一のBamH−切断部位に、
Xba−Hind−断片として挿入し、これから
プラスミドpKCR−FGK1K2L及びpKCR−
GK1Lを得た。このため各断片の端部を重合酵素
クレノウ断片で補充した。双方のｃ−DNAは
5′−末端で７つの真正ヌクレオチドを含み、その
固有のポリアデニル化部位を欠いていた。両プラ
スミドは抗生物質アンピシリン（Amp）に対し
細菌抵抗性を付与した。双方のｃ−DNAの発現
はSV40初期−プロモータによつて促進される。
このプラスミドではｃ−DNAの後に家兎−β−
グロビンの大きなイントロン及び、家兎−β−グ
ロビン及びSV40ののポリアデニル化部位が続く。
この発現カセツトを分離するため、pKCR−
FGK1K2L及びpKCR−GK1LをSa1で部分切
断することによつて直線状にし、次いでAatで
切断し、突出している端部をヌクレアーゼS1で
分解した。この断片を低融点アガロースゲルから
分離し、pAdD26SV(A)（“J.Mol.biol.”、159
（1982）、601−621）の充填された唯一のEcoR
−切断部位に結合挿入した。pAdD2.6SV(A)は、
アデノウイルス２（AMLP）の主要後期−プロ
モータによつて促進されるマウス−DHFR−
cDNA用の発現カセツト及びSV40−複製起点を
含み、抗生物質テトラサイクリンに対して細菌抵
抗性を付与する。合成プラスミドpSV−
FGK1K2L及びpSV−GK1L内でのｔ−PA用発
現カセツトの配向を制限分析によつて検査した。
第１図はプラスミドpSV−GK1Lの製造並びにこ
のプラスミド上の個々の要素の位置を略示するも
のである。

組換えベクターdSV−FGK1K2L及びpSV−
GK1LでCHOdhfr−細胞（ECACC 88072103）
を形質転換した（“Proc.Natl.Acad.Sci.USA”、
76（1979）、4350−4354）。このためpSV−
FGK1K2L又はpSV−GK1L20μｇを有する燐酸
カルシウム−沈殿物を４mlを容量で製造した
（“Virology”、52（1973）、456−467）。沈殿物１
mlを培養液10ml中の細胞３×10⁵〜１×10⁶に加え
た。細胞を８〜16時間インキユベートし、その後
培養液を除去し、細胞をTBS（トリス−HCl25m
モル／、PH7.4、NaCl 1137mモル／、KCl
5mモル／、NaH₂PO₄0.6mモル／）10mlで
洗浄し、次いで適当な培地でインキユベートし
た。CHO−dhfr−細胞（ECACC 88072103）を
トランスフエクシヨン48時間後１：10に変え、そ
の後選択培地で培養した（“J.Mol.Biol.”、159
（1982）、601−621）。生じたクローンをトランス
フエクシヨン２〜３週間後にクローン化シリンダ
を用いたトリプシン処理し、大量培養のため引き
上げ、その上澄みをEL1SAによりｔ−PA−免疫
反応性に関して検査した（“Gene”、51（1987）、
31−41）。ポジのクローンをメトトレキセート
20nモル／を有する培地中でインキユベートし
た。２週間後メトトレキセート−耐性コロニーが
生じた。これを全面培養し、培地内でメトトレキ
セート10nモル／に曝した。耐性細胞を徐々に
高くなるメトトレキセート濃縮液（300nモル／
、500nモル／、1μモル／及び5μモル／）
に曝した。各クローンを限界希釈法により分離
し、最良のｔ−PA生産者を選出した。

野生型ｔ−PA又はGK1Lの構成性分泌を示し
たCHO−細胞を、10％ウシ胎児血清で補足され
たDMEM−培地（ダルベツコの修飾イーグル培
地）中で、アプロチニン（50μｇ／ml）の存在及
び不存在において培養した。上澄みをアルギニン
0.3モル／に施し、HClでPH7.5に調整し、ET
−セフアロースカラムに施した（“J.Biol.
Chem.”、259（1984）、11635−11638）。タンパク
質をクエン酸塩緩衝液20mモル／（PH2.5）で
溶出し、引続きトリス−HCl20mモル／（PH
7.5）に対して透析した。

精製したタンパク質の分割量を、シトクロム
c10μｇを添加しながら−20℃でアセトン４容量
で１時間沈殿処理し、引続きレムリ（Laemmli）
試料緩衝液に溶かした。タンパク質試料を３分間
煮沸し、12.5％SDS−ポリアクリルアミドゲル上
で不連続緩衝系を使用して分離した（レムリ、
“Nature”、227（1970）、680−685）。電気泳動処
理後ゲルをニトロセルロースフイルターに電気ブ
ロツドした。フイルタをTBSで洗浄し、次いで
室温で30〜60分間TBS＋0.05トウイーン
（Tween）＋３％ゼラチンで飽和し、最後に水で
短時間洗浄した。その後メンブランフイルタをヒ
トｔ−PAに対するペルオキシダーゼ−複合ヤギ
抗体の１：1000希釈液でTBS＋0.5％ウシ血清ア
ルブミン中において室温で１時間処理した。免疫
複合体を可視化するため、フイルタを更にTBS、
メタノール中のテトラメチルベンジジン2.5mモ
ル／及びナトリウムジオクチルスルホサクシネ
ート4.5mモル／からなる１：１溶液及び過酸
化水素0.005％で３回洗浄した後、クエン酸緩衝
液0.1モル／中でPH５でインキユベートした。
ポリアクリルアミド−ゲル電気泳動用標識として
は次のタンパク質、すなわちミオシン200kD、ホ
スホリラーゼ(b)92.5kD、ウシ血清アルブミン
69kD、オボアルブミン46kD、カルボアンヒドラ
ーゼ30kD、トリプシンインヒビター21.5kD及び
リゾチーム14kDを含むレインボーミツクス（Ra
−inbow−Mix）［アメルシヤム（Amerscham）］
を使用した。

GK1Lを発現するプラスミドpSV−GK1Lを含
む細胞の培養上澄みはｔ−PAに対する坑体での
処理に際して約50000ダルトンの免疫反応バンド
（GK1Lの一本鎖形に相当）、約31000ダルトンの
バンド（Ｌ−鎖に相当）及び約19000ダルトンの
バンド（Ｈ−鎮に相当）を生じる。細胞培地がプ
ロテアーゼ阻害物質にアプロチニンを含む場合、
二本鎖分子の量は一本鎖分子に比べて減少する。

これに対しｔ−PAは65000〜68000ダルトンの
バンド（一本鎖形に相当）１本と、34000又は
31000ダルトンのバンド（Ｈ−又はＬ−鎖に相当）
２本を有する。

例 ３ ｔ−PA及びGK1Lのフイブリノーゲンで刺激
された触媒活性の比較 ｔ−PA及びGK1Lを、例２に記載したように
してCHO−細胞の上澄みから増殖させた。この
場合ｔ−PA又はGK1Lを分泌するCHO−細胞を
アプロチニン（50μｇ／ml）の存在又は不存在で
培養した。活性試験を実施するため上澄みを１：
250に希釈した。これは無視し得る程度に僅少な
阻害剤の濃縮化をもたらした。プラスミノーゲン
分離活性は間接的な分光光度計テストによつて測
定した（“Thromb.Haemos−tasis”、48（1982）、
266−269）。ｔ−PAはプラスミノーゲンを、色素
原基質の結合を加水分解する活性セリンプロテア
ーゼプラスミンに変換し、その405nmでの吸収を
３時間までの期間測定した。変更された実験でト
シル化されたGly−Pro−Lys−ｐ−ニトロアニリ
ド（クロモジム（Chromozym^R）PL）を色素原
基質として使用した。この試験は25℃で、CNBr
で分離されたフイブリノーゲン（120μｇ／ml）
の不存在又は存在において、トリス−HCl0.1モ
ル／、PH7.5、トウイーン80 0.15モル／及び
プラスミノーゲン0.13μモル／及びクロモジム
PL0.30mモル／中で実施した。色素原基質から
のｐ−ニトロフエノールの遊離に対する尺度とし
て405nmでの吸光を測定し、インキユベート期間
の関数として示した。結果は第２図に示す。

ｔ−PA（アプロチニンを含まない上澄みから分
離した）のプラスミノーゲン分離活性は塗り潰し
た円で示されており、ｔ−PA（アプロチニンを含
む上澄みから分離）の活性は白地の円で、GK1L
（アプロチニンを含む上澄みから分離）の活性は
塗り潰した四角でまたGK1L（アプロチニンを含
まない上澄みから分離）の活性は白地の四角で示
されている。±CNBrはテスト中CNBrで処理さ
れたフイブリノーゲン−断片の存在又は不存在を
示す。（＋）又は（−）はアプロチニン含有又は
アプロチニン不含の組織培養上澄みからのタンパ
ク質が精製されたか否かを示す。

第２図から、フイブリノーゲンの存在でGK1L
の触媒活性が刺激されることは明白である。

この場合驚くべきことには、GK1Lを発現する
細胞からの上澄みの触媒活性はフイブリノーゲン
を有する場合もまた有さない場合も、野生型ｔ−
PAを発現する細胞からの上澄みのそれよりも明
らかに高い。培地中にアプロチニンが存在する場
合、GK1Lの活性はフイブリノーゲンの存在する
場合には高く、フイブリノーゲンが存在しない場
合にはアプロチニンが存在しない場合よりも低
い。