JPH0571228B2 - - Google Patents
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
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- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6456—Plasminogen activators
- C12N9/6459—Plasminogen activators t-plasminogen activator (3.4.21.68), i.e. tPA
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12Y304/21069—Protein C activated (3.4.21.69)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
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Description
請求の範囲
1 t−PAの領域GK1Lを有するタンパク質を
コードし、その際野生型t−PA−遺伝子の領域
K2及びFをコードする配列又は遺伝暗号の退行
変性の枠内でこれから誘導された配列が正確なエ
キソン/イントロン接触面でt−PA−遺伝子か
ら完全に欠失していることを特徴とする組換え
DNA。
コードし、その際野生型t−PA−遺伝子の領域
K2及びFをコードする配列又は遺伝暗号の退行
変性の枠内でこれから誘導された配列が正確なエ
キソン/イントロン接触面でt−PA−遺伝子か
ら完全に欠失していることを特徴とする組換え
DNA。
2 野生型t−PA又は領域G、K1及びL以外
の領域をも含むt−PA変異体をコードするDNA
−配列から、t−PA−遺伝子上における正確な
エキソン/イントロン−接触面の維持下に領域
G、K1及びLをコードしない各配列を欠失させ
ることを特徴とする、請求項1記載の組換え
DNAの製法。
の領域をも含むt−PA変異体をコードするDNA
−配列から、t−PA−遺伝子上における正確な
エキソン/イントロン−接触面の維持下に領域
G、K1及びLをコードしない各配列を欠失させ
ることを特徴とする、請求項1記載の組換え
DNAの製法。
3 領域F及びK2をコードする配列の欠失を意
図的な変異誘発によつて実施する請求項2記載の
方法。
図的な変異誘発によつて実施する請求項2記載の
方法。
4 請求項1記載の組換えDNAのコピー1個以
上を組込まれた状態で含むことを特徴とする組換
えベクター。
上を組込まれた状態で含むことを特徴とする組換
えベクター。
5 SV40初期プロモータ及びマウスdhfr−遺伝
子を含む請求項4記載の組換えベクター。
子を含む請求項4記載の組換えベクター。
6 プラスミドpSV−GK1L。
7 請求項1記載の組換えDNA又は請求項4か
ら6までのいずれか1項記載のベクターで形質転
換されていることを特徴とする細胞系。
ら6までのいずれか1項記載のベクターで形質転
換されていることを特徴とする細胞系。
8 真核、有利にはCHO−dhfr−細胞系である
請求項7記載の細胞系。
請求項7記載の細胞系。
9 t−PAの領域G、K1及びLの、この順序
でのアミノ酸配列からなり、場合によつてはグリ
コシル化されていることを特徴とする繊維素溶解
特性を有するタンパク質。
でのアミノ酸配列からなり、場合によつてはグリ
コシル化されていることを特徴とする繊維素溶解
特性を有するタンパク質。
10 請求項1記載のDNA又は請求項4から6
までのいずれか1項記載のベクターを適当な宿主
細胞に表現し、発現生成物を培地から又は宿主細
胞を溶解することによつて回収することを特徴と
する、繊維素溶解特性を有するタンパク質の製
法。
までのいずれか1項記載のベクターを適当な宿主
細胞に表現し、発現生成物を培地から又は宿主細
胞を溶解することによつて回収することを特徴と
する、繊維素溶解特性を有するタンパク質の製
法。
11 真核の、有利にはCHO−dhfr−細胞
(ECACC 88072103)を宿主細胞として使用し、
グリコシル化された生成物を得る請求項10記載
の方法。
(ECACC 88072103)を宿主細胞として使用し、
グリコシル化された生成物を得る請求項10記載
の方法。
12 アプロチニンを含む培地中で培養される宿
主細胞を使用する請求項10又は11記載の方
法。
主細胞を使用する請求項10又は11記載の方
法。
13 請求項9記載のタンパク質を含むことを特
徴とする繊維素溶解剤。
徴とする繊維素溶解剤。
明細書
ヒト組織プラスミノーゲンアクチベータ(t−
PA)は分子量68000ダルトンのセリンプロテアー
ゼであり、酵素前駆体プラスミノーゲンを活性セ
リンプロテアーゼプラスミンに変換する。プラス
ミンは、血餅のタンパク質マトリツクスの主成分
であるフイブリンを溶解する。t−PAはフイブ
リンに対して高い親和性を有し、またフイブリン
によつて活性化される(“Fibrinolysis”、2
(1988)、133−142参照)。従つてt−PAは医学的
に極めて重要視される。
PA)は分子量68000ダルトンのセリンプロテアー
ゼであり、酵素前駆体プラスミノーゲンを活性セ
リンプロテアーゼプラスミンに変換する。プラス
ミンは、血餅のタンパク質マトリツクスの主成分
であるフイブリンを溶解する。t−PAはフイブ
リンに対して高い親和性を有し、またフイブリン
によつて活性化される(“Fibrinolysis”、2
(1988)、133−142参照)。従つてt−PAは医学的
に極めて重要視される。
例えばウロキナーゼ又はストレプトキナーゼの
ような他の公知のプラスミノーゲン活性化因子に
比べてt−PAの利点は、その触媒活性がフイブ
リンによつて刺激されることである。(“J.Biol.
Chem.”、257(1982)、2912−2919;“Biochem.
Biophys.Acta”、755(1983)、531−533参照)。
ような他の公知のプラスミノーゲン活性化因子に
比べてt−PAの利点は、その触媒活性がフイブ
リンによつて刺激されることである。(“J.Biol.
Chem.”、257(1982)、2912−2919;“Biochem.
Biophys.Acta”、755(1983)、531−533参照)。
t−PA(アミノ酸配列、フエハール(Vehar)
その他、“Bio/Technology”、2(1984)、1051
〜1057参照)は、その一本鎖形において1本の重
鎖(H−鎖)と1本の軽鎖(L−鎖)とからな
り、これらはジスルフイド架橋によつて結合され
ている。その二本鎖形は一本鎖前駆体形からプラ
スミン又は他のプロテアーゼでアミノ酸(A.S.)
275と276の間で特異的に切断することによつて生
じる。32000ダルトンのL−鎖は、ウロキナーゼ
又はプラスミンののような他のセリンプロテアー
ゼに対して相同性を有する酵素活性範囲を含む
(“Proc.Natl.Acad.Sci.USA”、81(1984)、5335−
5339)。39000ダルトンのH−鎖上の各領域はフイ
ブロネクチン(A.S.1−49)に対して相同性のフ
インガー領域(F)、マウス−及びヒト表皮増殖因子
(A.S.50−87)に対して相同性の増殖因子領域(G)
及びプラスミノーゲン中のクリングル構造に対し
て相同性の2つのクリングル領域K1(A.S.88−
175)及びK2(A.S.176−262)である。
その他、“Bio/Technology”、2(1984)、1051
〜1057参照)は、その一本鎖形において1本の重
鎖(H−鎖)と1本の軽鎖(L−鎖)とからな
り、これらはジスルフイド架橋によつて結合され
ている。その二本鎖形は一本鎖前駆体形からプラ
スミン又は他のプロテアーゼでアミノ酸(A.S.)
275と276の間で特異的に切断することによつて生
じる。32000ダルトンのL−鎖は、ウロキナーゼ
又はプラスミンののような他のセリンプロテアー
ゼに対して相同性を有する酵素活性範囲を含む
(“Proc.Natl.Acad.Sci.USA”、81(1984)、5335−
5339)。39000ダルトンのH−鎖上の各領域はフイ
ブロネクチン(A.S.1−49)に対して相同性のフ
インガー領域(F)、マウス−及びヒト表皮増殖因子
(A.S.50−87)に対して相同性の増殖因子領域(G)
及びプラスミノーゲン中のクリングル構造に対し
て相同性の2つのクリングル領域K1(A.S.88−
175)及びK2(A.S.176−262)である。
H−鎖の個々の領域の機能に関してはすでに知
られている。すなわち、フイブリンへのt−PA
の結合、従つてまたフイブリンの存在でt−PA
の触媒活性を刺激するのに関与するのは領域K2
又は/及びFのみで、領域K1はこれに関与しな
い(欧州特許出願公開第0234051号明細書)。
られている。すなわち、フイブリンへのt−PA
の結合、従つてまたフイブリンの存在でt−PA
の触媒活性を刺激するのに関与するのは領域K2
又は/及びFのみで、領域K1はこれに関与しな
い(欧州特許出願公開第0234051号明細書)。
“EMBO”、7(1988)、2731−2740からは、
H−鎖からの完全な領域K1及びF、並びに領域
K2の1部を含むt−PA変異体の活性もフイブ
リンによつて刺激可能であることが公知である。
H−鎖からの完全な領域K1及びF、並びに領域
K2の1部を含むt−PA変異体の活性もフイブ
リンによつて刺激可能であることが公知である。
しかしH−鎖の個々の領域がフイブリンに対す
るt−PA−分子の活性をどの程度生ぜしめまた
プラスミノーゲン切断活性をどの程度刺激するの
かは未解決である。
るt−PA−分子の活性をどの程度生ぜしめまた
プラスミノーゲン切断活性をどの程度刺激するの
かは未解決である。
本発明の課題は、t−PAに比べてより大きな
プラスミノーゲン切断活性を有しまたその触媒活
性を同様にフイブリン又はフイブリノーゲンによ
つて刺激することのできるt−PA−変異体を得
ることにある。
プラスミノーゲン切断活性を有しまたその触媒活
性を同様にフイブリン又はフイブリノーゲンによ
つて刺激することのできるt−PA−変異体を得
ることにある。
この課題は本発明によれば、t−PAの領域の
GK1Lを有するタンパク質をコードし、その際領
域K2及びFをコードする配列又は遺伝暗号の退
行変性の枠内でこれから誘導された配列、すなわ
ち正確なエキソン/イントロン接触面に相当する
配列がt−PA−遺伝子上で完全に欠失されてい
る、組換えDNAを製造することによつて解決さ
れる。従つて本発明による組換えDNAではt−
PAcDNAのヌクレオチド715〜972及び199〜339
が欠けている(番号は“Natur”、301、(1983)、
214−221による)。活性の刺激可能性にとつて重
要なものとみなされる、H−鎖の領域K2及びF
は、本発明による組換えDNAの遺伝子生成物で
あるt−PA変異体GK1Lでは欠けているにもか
かわらず、このGK1Lには予想外にもフイブリン
による触媒活性の刺激可能性は保持されている。
GK1Lを表現する細胞からの上澄みの触媒活性は
驚くべきことには、t−PAを表現する細胞から
の上澄みの活性よりも明らかに高い。
GK1Lを有するタンパク質をコードし、その際領
域K2及びFをコードする配列又は遺伝暗号の退
行変性の枠内でこれから誘導された配列、すなわ
ち正確なエキソン/イントロン接触面に相当する
配列がt−PA−遺伝子上で完全に欠失されてい
る、組換えDNAを製造することによつて解決さ
れる。従つて本発明による組換えDNAではt−
PAcDNAのヌクレオチド715〜972及び199〜339
が欠けている(番号は“Natur”、301、(1983)、
214−221による)。活性の刺激可能性にとつて重
要なものとみなされる、H−鎖の領域K2及びF
は、本発明による組換えDNAの遺伝子生成物で
あるt−PA変異体GK1Lでは欠けているにもか
かわらず、このGK1Lには予想外にもフイブリン
による触媒活性の刺激可能性は保持されている。
GK1Lを表現する細胞からの上澄みの触媒活性は
驚くべきことには、t−PAを表現する細胞から
の上澄みの活性よりも明らかに高い。
本発明の1対象は、t−PA又は領域G、K1
及びL以外の領域も含むt−PA変異体をコード
するDNA−配列から、t−PA−遺伝子上におけ
る正確なエキソン/イントロン−接触面の維持下
に、領域G、K1及びLをコードしない各配列を
欠失させることにより、本発明の組換えDNAを
製造する方法である。領域K2及びFをコードす
るDNAの欠失を意図的な変異誘発によつて起こ
させる方法が特に有利である。
及びL以外の領域も含むt−PA変異体をコード
するDNA−配列から、t−PA−遺伝子上におけ
る正確なエキソン/イントロン−接触面の維持下
に、領域G、K1及びLをコードしない各配列を
欠失させることにより、本発明の組換えDNAを
製造する方法である。領域K2及びFをコードす
るDNAの欠失を意図的な変異誘発によつて起こ
させる方法が特に有利である。
本発明の1対象は、本発明による組換えDNA
のコピー1つ以上を含む組換えベクターである。
この場合優れた1実施態様は、真核細胞中に組換
えDNAを発現させるのに適したベクターである。
本発明の特に優れた1実施態様はSV40−初期プ
ロモター及びマウス−dhfr−遺伝子を含むGK1L
−遺伝子を有する真核ベクターである。しかし最
も好ましいのは本発明によるプラスミドpSV−
GK1Lである。
のコピー1つ以上を含む組換えベクターである。
この場合優れた1実施態様は、真核細胞中に組換
えDNAを発現させるのに適したベクターである。
本発明の特に優れた1実施態様はSV40−初期プ
ロモター及びマウス−dhfr−遺伝子を含むGK1L
−遺伝子を有する真核ベクターである。しかし最
も好ましいのは本発明によるプラスミドpSV−
GK1Lである。
本発明の1対象は、本発明による組換えDNA
又は本発明によるベクターで形質転換されている
細胞系である。特に好ましいのは真核細胞系であ
り、最も好ましいのは、本発明による組換え
DNA又は本発明によるベクターを含むCHO−
dhfr−細胞系(例えばECACC 88072103)であ
る。
又は本発明によるベクターで形質転換されている
細胞系である。特に好ましいのは真核細胞系であ
り、最も好ましいのは、本発明による組換え
DNA又は本発明によるベクターを含むCHO−
dhfr−細胞系(例えばECACC 88072103)であ
る。
本発明の1対象はt−PAの領域G、K1及び
Lの、この順序でのアミノ酸配列からなりかつ場
合によつてはグリコシル化されている繊維素溶解
特性を有するタンパク質である。本発明は同様
に、本発明による組換えDNA又は本発明による
組換えベクターを適当な宿主細胞に表現し、この
発現生成物を培地から又は宿主細胞を溶解するこ
とによつて回収することにより、繊維素溶解特性
を有するタンパク質を製造する方法に関する。こ
の場合本発明によるタンパク質を真核宿主細胞、
有利にはCHO−dhfr−宿主細胞からグリコシル
化された形で得る方法が有利である。驚くべきこ
とには本発明によるプラスミドpSV−GK1Lで形
質転換されたGK1Lを分泌するCHO−dhfr−細
胞からの上澄みは、野生型t−PA−遺伝子が存
在する相応する発現ベクターpSV−FGK1K2Lで
形質転換されている細胞からの上澄みよりも一層
高い触媒活性を有する。
Lの、この順序でのアミノ酸配列からなりかつ場
合によつてはグリコシル化されている繊維素溶解
特性を有するタンパク質である。本発明は同様
に、本発明による組換えDNA又は本発明による
組換えベクターを適当な宿主細胞に表現し、この
発現生成物を培地から又は宿主細胞を溶解するこ
とによつて回収することにより、繊維素溶解特性
を有するタンパク質を製造する方法に関する。こ
の場合本発明によるタンパク質を真核宿主細胞、
有利にはCHO−dhfr−宿主細胞からグリコシル
化された形で得る方法が有利である。驚くべきこ
とには本発明によるプラスミドpSV−GK1Lで形
質転換されたGK1Lを分泌するCHO−dhfr−細
胞からの上澄みは、野生型t−PA−遺伝子が存
在する相応する発現ベクターpSV−FGK1K2Lで
形質転換されている細胞からの上澄みよりも一層
高い触媒活性を有する。
特に有利なのはアプロチニンを含む培地中で培
養される宿主細胞を使用する方法である。
養される宿主細胞を使用する方法である。
この場合予想外にも、その培地がアプロチニン
を含む宿主細胞の上澄みではその活性及びフイブ
リンによる刺激の程度は一層高い。
を含む宿主細胞の上澄みではその活性及びフイブ
リンによる刺激の程度は一層高い。
最後に本発明の1対象は、本発明によるタンパ
ク質を含む繊維素溶解剤である。
ク質を含む繊維素溶解剤である。
次の各実施例は本発明を第1図及び第2図との
関連において詳述するものである。
関連において詳述するものである。
この場合第1図はプラスミドpSV−GK1Lの製
造法を示すものであり、第2図は野生型−t−
PA及びGK1Lの、フイブリノーゲンで刺激され
た触媒活性を比較して示すグラフ図である。
造法を示すものであり、第2図は野生型−t−
PA及びGK1Lの、フイブリノーゲンで刺激され
た触媒活性を比較して示すグラフ図である。
例 1
フインガー及びクリングル2−領域が欠失され
ているt−PA−誘導体の製造(GK1L) t−PAcDNAからの欠失変異体FGK1Lを、
“Bio/Technology”、2(1984)、636−639から
公知の方法により意図的な変異誘発でクリングル
2−領域を欠失することによつて製造した。出発
プラスミドとしてはt−PAヌクレオチド配列190
−1809が存在するpePA133(その製造は欧州特許
出願公開第0242836号明細書を参照)を使用した。
変異誘発プライマー1
(5′GCCTGCTCTGAGTCCACCTGCGGC3′)を
使用して、ヌクレオチド715〜972(エキソン及
び)を除去した(“Natur”、301(1983)、214−
221に記載されたt−PA−cDNAの番号に相応す
る)。次いで欠失変異体FGK1Lをコードするプラ
スミドp7745を、変異誘発プライマー1でコロニ
ーハイブリツド形成により分離し、配列を決定し
た。真核細胞に後に発現させるにはt−PAシグ
ナル配列の再構成が非要であつた。
ているt−PA−誘導体の製造(GK1L) t−PAcDNAからの欠失変異体FGK1Lを、
“Bio/Technology”、2(1984)、636−639から
公知の方法により意図的な変異誘発でクリングル
2−領域を欠失することによつて製造した。出発
プラスミドとしてはt−PAヌクレオチド配列190
−1809が存在するpePA133(その製造は欧州特許
出願公開第0242836号明細書を参照)を使用した。
変異誘発プライマー1
(5′GCCTGCTCTGAGTCCACCTGCGGC3′)を
使用して、ヌクレオチド715〜972(エキソン及
び)を除去した(“Natur”、301(1983)、214−
221に記載されたt−PA−cDNAの番号に相応す
る)。次いで欠失変異体FGK1Lをコードするプラ
スミドp7745を、変異誘発プライマー1でコロニ
ーハイブリツド形成により分離し、配列を決定し
た。真核細胞に後に発現させるにはt−PAシグ
ナル配列の再構成が非要であつた。
まずFGK1LcDNAにリーダー配列及び3′UT
(3′非翻訳領域)(原cDNA−配列)を施した。こ
のためpUC12のポリリンカー内に位置77までの
5′UT(5′非翻訳領域)、リーダー配列及びヌクレ
オチド位置208までのt−PAのN−末端配列を含
むプラスミドp7,1、DSM4719をPst,及び
H3indで切断した(約2.7kb)。付加的に次のt
−PAcDNA配列を含む断片を分離した。すなわ
ちp7745から、ヌクレオチド位置209〜421を含む
Pst/Hae−断片並びにヌクレオチド位置421〜
1273を有するHae/EcoR−断片(この場合
変異誘発によつてヌクレオチド位置715〜972は欠
失されている)をまたpePA98.1(その製造は欧州
特許出願公開第0242836号参照)からヌクレオチ
ド位置1274〜2165を有するEcoR/Hind−断
片を分離した。
(3′非翻訳領域)(原cDNA−配列)を施した。こ
のためpUC12のポリリンカー内に位置77までの
5′UT(5′非翻訳領域)、リーダー配列及びヌクレ
オチド位置208までのt−PAのN−末端配列を含
むプラスミドp7,1、DSM4719をPst,及び
H3indで切断した(約2.7kb)。付加的に次のt
−PAcDNA配列を含む断片を分離した。すなわ
ちp7745から、ヌクレオチド位置209〜421を含む
Pst/Hae−断片並びにヌクレオチド位置421〜
1273を有するHae/EcoR−断片(この場合
変異誘発によつてヌクレオチド位置715〜972は欠
失されている)をまたpePA98.1(その製造は欧州
特許出願公開第0242836号参照)からヌクレオチ
ド位置1274〜2165を有するEcoR/Hind−断
片を分離した。
これらの断片を結合し、E.coli、DSM3689に
形質転換した。プラスミドを有する形質転換細胞
を、アンピシリン50μg/mlを添加することによ
つて培地中で選択した。pcPA159で表される真
正プラスミドは制限酵素−分析によつて立証され
た。このプラスミドからFGK1LcDNAをXba
−Hind−断片として分離することができた
(シグナル配列を有するが、独自のポリアデニル
化部位を有さない)。この断片は位置2160
(“Nature”、301(1983)、214−221)でBgl−部
位までに7つのヌクレオチド5′非翻訳領域
(5′UT)及び3′非翻訳領域(3′UT)を含む。
形質転換した。プラスミドを有する形質転換細胞
を、アンピシリン50μg/mlを添加することによ
つて培地中で選択した。pcPA159で表される真
正プラスミドは制限酵素−分析によつて立証され
た。このプラスミドからFGK1LcDNAをXba
−Hind−断片として分離することができた
(シグナル配列を有するが、独自のポリアデニル
化部位を有さない)。この断片は位置2160
(“Nature”、301(1983)、214−221)でBgl−部
位までに7つのヌクレオチド5′非翻訳領域
(5′UT)及び3′非翻訳領域(3′UT)を含む。
FGK1Lからフインガー領域F(エキソン)を
欠失させるために変異誘発プライマー2
(5′GATCTTACCAATGCAGCGAGC3′)を使
用した。意図的に変異誘発によつてt−PA−
cDNA上のヌクレオチド199〜339を除去した。領
域組成GK1Lを有する組換えDNAを有するプラ
スミドを変異誘発プライマー2でコロニーハイブ
リツド形成することにより分離し、配列を決定し
た。この場合次のようにして処理した。固定化
DNAを有するフイルタを65℃で4時間、0.2%
SDS、1.0%サルコシル(SarkosylR)、4×SET
(NaCl0.6mモル/、トリス−HCl0.2モル/、
PH8.0、EDTA4mモル/)及び4×デンハーツ
溶液(Denhardts−Lo¨sung)(0.08%フイコル
(FicollR)、0.08%ポリビニルピロリドン、0.08%
ウシ血清アルブミン)中で前ハイブリツド処理し
た。
欠失させるために変異誘発プライマー2
(5′GATCTTACCAATGCAGCGAGC3′)を使
用した。意図的に変異誘発によつてt−PA−
cDNA上のヌクレオチド199〜339を除去した。領
域組成GK1Lを有する組換えDNAを有するプラ
スミドを変異誘発プライマー2でコロニーハイブ
リツド形成することにより分離し、配列を決定し
た。この場合次のようにして処理した。固定化
DNAを有するフイルタを65℃で4時間、0.2%
SDS、1.0%サルコシル(SarkosylR)、4×SET
(NaCl0.6mモル/、トリス−HCl0.2モル/、
PH8.0、EDTA4mモル/)及び4×デンハーツ
溶液(Denhardts−Lo¨sung)(0.08%フイコル
(FicollR)、0.08%ポリビニルピロリドン、0.08%
ウシ血清アルブミン)中で前ハイブリツド処理し
た。
ハイブリツド形成は46℃で12時間0.2%SDS、
1.0%サルコシル、4×SET、4×デンハーツ中
でまたフイルタ当たり5.106cpmのキナーゼ化変
異誘発プライマーを用いて行つた。フイルタを室
温で3×5分間、引続き37℃で1×10分間及び50
℃で1×5分間、4×SET及び0.2%SDS中で洗
浄した。
1.0%サルコシル、4×SET、4×デンハーツ中
でまたフイルタ当たり5.106cpmのキナーゼ化変
異誘発プライマーを用いて行つた。フイルタを室
温で3×5分間、引続き37℃で1×10分間及び50
℃で1×5分間、4×SET及び0.2%SDS中で洗
浄した。
例 2
CHO−細胞からのGK1L免疫学的特性化t−
PA−cDNA及びGK1L−cDNAを、プラスミド
pKCR(“Proc.Natl.Acad.Sci.USA”、78(1981)、
1527−1531)の唯一のBamH−切断部位に、
Xba−Hind−断片として挿入し、これから
プラスミドpKCR−FGK1K2L及びpKCR−
GK1Lを得た。このため各断片の端部を重合酵素
クレノウ断片で補充した。双方のc−DNAは
5′−末端で7つの真正ヌクレオチドを含み、その
固有のポリアデニル化部位を欠いていた。両プラ
スミドは抗生物質アンピシリン(Amp)に対し
細菌抵抗性を付与した。双方のc−DNAの発現
はSV40初期−プロモータによつて促進される。
このプラスミドではc−DNAの後に家兎−β−
グロビンの大きなイントロン及び、家兎−β−グ
ロビン及びSV40ののポリアデニル化部位が続く。
この発現カセツトを分離するため、pKCR−
FGK1K2L及びpKCR−GK1LをSa1で部分切
断することによつて直線状にし、次いでAatで
切断し、突出している端部をヌクレアーゼS1で
分解した。この断片を低融点アガロースゲルから
分離し、pAdD26SV(A)(“J.Mol.biol.”、159
(1982)、601−621)の充填された唯一のEcoR
−切断部位に結合挿入した。pAdD2.6SV(A)は、
アデノウイルス2(AMLP)の主要後期−プロ
モータによつて促進されるマウス−DHFR−
cDNA用の発現カセツト及びSV40−複製起点を
含み、抗生物質テトラサイクリンに対して細菌抵
抗性を付与する。合成プラスミドpSV−
FGK1K2L及びpSV−GK1L内でのt−PA用発
現カセツトの配向を制限分析によつて検査した。
第1図はプラスミドpSV−GK1Lの製造並びにこ
のプラスミド上の個々の要素の位置を略示するも
のである。
PA−cDNA及びGK1L−cDNAを、プラスミド
pKCR(“Proc.Natl.Acad.Sci.USA”、78(1981)、
1527−1531)の唯一のBamH−切断部位に、
Xba−Hind−断片として挿入し、これから
プラスミドpKCR−FGK1K2L及びpKCR−
GK1Lを得た。このため各断片の端部を重合酵素
クレノウ断片で補充した。双方のc−DNAは
5′−末端で7つの真正ヌクレオチドを含み、その
固有のポリアデニル化部位を欠いていた。両プラ
スミドは抗生物質アンピシリン(Amp)に対し
細菌抵抗性を付与した。双方のc−DNAの発現
はSV40初期−プロモータによつて促進される。
このプラスミドではc−DNAの後に家兎−β−
グロビンの大きなイントロン及び、家兎−β−グ
ロビン及びSV40ののポリアデニル化部位が続く。
この発現カセツトを分離するため、pKCR−
FGK1K2L及びpKCR−GK1LをSa1で部分切
断することによつて直線状にし、次いでAatで
切断し、突出している端部をヌクレアーゼS1で
分解した。この断片を低融点アガロースゲルから
分離し、pAdD26SV(A)(“J.Mol.biol.”、159
(1982)、601−621)の充填された唯一のEcoR
−切断部位に結合挿入した。pAdD2.6SV(A)は、
アデノウイルス2(AMLP)の主要後期−プロ
モータによつて促進されるマウス−DHFR−
cDNA用の発現カセツト及びSV40−複製起点を
含み、抗生物質テトラサイクリンに対して細菌抵
抗性を付与する。合成プラスミドpSV−
FGK1K2L及びpSV−GK1L内でのt−PA用発
現カセツトの配向を制限分析によつて検査した。
第1図はプラスミドpSV−GK1Lの製造並びにこ
のプラスミド上の個々の要素の位置を略示するも
のである。
組換えベクターdSV−FGK1K2L及びpSV−
GK1LでCHOdhfr−細胞(ECACC 88072103)
を形質転換した(“Proc.Natl.Acad.Sci.USA”、
76(1979)、4350−4354)。このためpSV−
FGK1K2L又はpSV−GK1L20μgを有する燐酸
カルシウム−沈殿物を4mlを容量で製造した
(“Virology”、52(1973)、456−467)。沈殿物1
mlを培養液10ml中の細胞3×105〜1×106に加え
た。細胞を8〜16時間インキユベートし、その後
培養液を除去し、細胞をTBS(トリス−HCl25m
モル/、PH7.4、NaCl 1137mモル/、KCl
5mモル/、NaH2PO40.6mモル/)10mlで
洗浄し、次いで適当な培地でインキユベートし
た。CHO−dhfr−細胞(ECACC 88072103)を
トランスフエクシヨン48時間後1:10に変え、そ
の後選択培地で培養した(“J.Mol.Biol.”、159
(1982)、601−621)。生じたクローンをトランス
フエクシヨン2〜3週間後にクローン化シリンダ
を用いたトリプシン処理し、大量培養のため引き
上げ、その上澄みをEL1SAによりt−PA−免疫
反応性に関して検査した(“Gene”、51(1987)、
31−41)。ポジのクローンをメトトレキセート
20nモル/を有する培地中でインキユベートし
た。2週間後メトトレキセート−耐性コロニーが
生じた。これを全面培養し、培地内でメトトレキ
セート10nモル/に曝した。耐性細胞を徐々に
高くなるメトトレキセート濃縮液(300nモル/
、500nモル/、1μモル/及び5μモル/)
に曝した。各クローンを限界希釈法により分離
し、最良のt−PA生産者を選出した。
GK1LでCHOdhfr−細胞(ECACC 88072103)
を形質転換した(“Proc.Natl.Acad.Sci.USA”、
76(1979)、4350−4354)。このためpSV−
FGK1K2L又はpSV−GK1L20μgを有する燐酸
カルシウム−沈殿物を4mlを容量で製造した
(“Virology”、52(1973)、456−467)。沈殿物1
mlを培養液10ml中の細胞3×105〜1×106に加え
た。細胞を8〜16時間インキユベートし、その後
培養液を除去し、細胞をTBS(トリス−HCl25m
モル/、PH7.4、NaCl 1137mモル/、KCl
5mモル/、NaH2PO40.6mモル/)10mlで
洗浄し、次いで適当な培地でインキユベートし
た。CHO−dhfr−細胞(ECACC 88072103)を
トランスフエクシヨン48時間後1:10に変え、そ
の後選択培地で培養した(“J.Mol.Biol.”、159
(1982)、601−621)。生じたクローンをトランス
フエクシヨン2〜3週間後にクローン化シリンダ
を用いたトリプシン処理し、大量培養のため引き
上げ、その上澄みをEL1SAによりt−PA−免疫
反応性に関して検査した(“Gene”、51(1987)、
31−41)。ポジのクローンをメトトレキセート
20nモル/を有する培地中でインキユベートし
た。2週間後メトトレキセート−耐性コロニーが
生じた。これを全面培養し、培地内でメトトレキ
セート10nモル/に曝した。耐性細胞を徐々に
高くなるメトトレキセート濃縮液(300nモル/
、500nモル/、1μモル/及び5μモル/)
に曝した。各クローンを限界希釈法により分離
し、最良のt−PA生産者を選出した。
野生型t−PA又はGK1Lの構成性分泌を示し
たCHO−細胞を、10%ウシ胎児血清で補足され
たDMEM−培地(ダルベツコの修飾イーグル培
地)中で、アプロチニン(50μg/ml)の存在及
び不存在において培養した。上澄みをアルギニン
0.3モル/に施し、HClでPH7.5に調整し、ET
−セフアロースカラムに施した(“J.Biol.
Chem.”、259(1984)、11635−11638)。タンパク
質をクエン酸塩緩衝液20mモル/(PH2.5)で
溶出し、引続きトリス−HCl20mモル/(PH
7.5)に対して透析した。
たCHO−細胞を、10%ウシ胎児血清で補足され
たDMEM−培地(ダルベツコの修飾イーグル培
地)中で、アプロチニン(50μg/ml)の存在及
び不存在において培養した。上澄みをアルギニン
0.3モル/に施し、HClでPH7.5に調整し、ET
−セフアロースカラムに施した(“J.Biol.
Chem.”、259(1984)、11635−11638)。タンパク
質をクエン酸塩緩衝液20mモル/(PH2.5)で
溶出し、引続きトリス−HCl20mモル/(PH
7.5)に対して透析した。
精製したタンパク質の分割量を、シトクロム
c10μgを添加しながら−20℃でアセトン4容量
で1時間沈殿処理し、引続きレムリ(Laemmli)
試料緩衝液に溶かした。タンパク質試料を3分間
煮沸し、12.5%SDS−ポリアクリルアミドゲル上
で不連続緩衝系を使用して分離した(レムリ、
“Nature”、227(1970)、680−685)。電気泳動処
理後ゲルをニトロセルロースフイルターに電気ブ
ロツドした。フイルタをTBSで洗浄し、次いで
室温で30〜60分間TBS+0.05トウイーン
(Tween)+3%ゼラチンで飽和し、最後に水で
短時間洗浄した。その後メンブランフイルタをヒ
トt−PAに対するペルオキシダーゼ−複合ヤギ
抗体の1:1000希釈液でTBS+0.5%ウシ血清ア
ルブミン中において室温で1時間処理した。免疫
複合体を可視化するため、フイルタを更にTBS、
メタノール中のテトラメチルベンジジン2.5mモ
ル/及びナトリウムジオクチルスルホサクシネ
ート4.5mモル/からなる1:1溶液及び過酸
化水素0.005%で3回洗浄した後、クエン酸緩衝
液0.1モル/中でPH5でインキユベートした。
ポリアクリルアミド−ゲル電気泳動用標識として
は次のタンパク質、すなわちミオシン200kD、ホ
スホリラーゼ(b)92.5kD、ウシ血清アルブミン
69kD、オボアルブミン46kD、カルボアンヒドラ
ーゼ30kD、トリプシンインヒビター21.5kD及び
リゾチーム14kDを含むレインボーミツクス(Ra
−inbow−Mix)[アメルシヤム(Amerscham)]
を使用した。
c10μgを添加しながら−20℃でアセトン4容量
で1時間沈殿処理し、引続きレムリ(Laemmli)
試料緩衝液に溶かした。タンパク質試料を3分間
煮沸し、12.5%SDS−ポリアクリルアミドゲル上
で不連続緩衝系を使用して分離した(レムリ、
“Nature”、227(1970)、680−685)。電気泳動処
理後ゲルをニトロセルロースフイルターに電気ブ
ロツドした。フイルタをTBSで洗浄し、次いで
室温で30〜60分間TBS+0.05トウイーン
(Tween)+3%ゼラチンで飽和し、最後に水で
短時間洗浄した。その後メンブランフイルタをヒ
トt−PAに対するペルオキシダーゼ−複合ヤギ
抗体の1:1000希釈液でTBS+0.5%ウシ血清ア
ルブミン中において室温で1時間処理した。免疫
複合体を可視化するため、フイルタを更にTBS、
メタノール中のテトラメチルベンジジン2.5mモ
ル/及びナトリウムジオクチルスルホサクシネ
ート4.5mモル/からなる1:1溶液及び過酸
化水素0.005%で3回洗浄した後、クエン酸緩衝
液0.1モル/中でPH5でインキユベートした。
ポリアクリルアミド−ゲル電気泳動用標識として
は次のタンパク質、すなわちミオシン200kD、ホ
スホリラーゼ(b)92.5kD、ウシ血清アルブミン
69kD、オボアルブミン46kD、カルボアンヒドラ
ーゼ30kD、トリプシンインヒビター21.5kD及び
リゾチーム14kDを含むレインボーミツクス(Ra
−inbow−Mix)[アメルシヤム(Amerscham)]
を使用した。
GK1Lを発現するプラスミドpSV−GK1Lを含
む細胞の培養上澄みはt−PAに対する坑体での
処理に際して約50000ダルトンの免疫反応バンド
(GK1Lの一本鎖形に相当)、約31000ダルトンの
バンド(L−鎖に相当)及び約19000ダルトンの
バンド(H−鎮に相当)を生じる。細胞培地がプ
ロテアーゼ阻害物質にアプロチニンを含む場合、
二本鎖分子の量は一本鎖分子に比べて減少する。
む細胞の培養上澄みはt−PAに対する坑体での
処理に際して約50000ダルトンの免疫反応バンド
(GK1Lの一本鎖形に相当)、約31000ダルトンの
バンド(L−鎖に相当)及び約19000ダルトンの
バンド(H−鎮に相当)を生じる。細胞培地がプ
ロテアーゼ阻害物質にアプロチニンを含む場合、
二本鎖分子の量は一本鎖分子に比べて減少する。
これに対しt−PAは65000〜68000ダルトンの
バンド(一本鎖形に相当)1本と、34000又は
31000ダルトンのバンド(H−又はL−鎖に相当)
2本を有する。
バンド(一本鎖形に相当)1本と、34000又は
31000ダルトンのバンド(H−又はL−鎖に相当)
2本を有する。
例 3
t−PA及びGK1Lのフイブリノーゲンで刺激
された触媒活性の比較 t−PA及びGK1Lを、例2に記載したように
してCHO−細胞の上澄みから増殖させた。この
場合t−PA又はGK1Lを分泌するCHO−細胞を
アプロチニン(50μg/ml)の存在又は不存在で
培養した。活性試験を実施するため上澄みを1:
250に希釈した。これは無視し得る程度に僅少な
阻害剤の濃縮化をもたらした。プラスミノーゲン
分離活性は間接的な分光光度計テストによつて測
定した(“Thromb.Haemos−tasis”、48(1982)、
266−269)。t−PAはプラスミノーゲンを、色素
原基質の結合を加水分解する活性セリンプロテア
ーゼプラスミンに変換し、その405nmでの吸収を
3時間までの期間測定した。変更された実験でト
シル化されたGly−Pro−Lys−p−ニトロアニリ
ド(クロモジム(ChromozymR)PL)を色素原
基質として使用した。この試験は25℃で、CNBr
で分離されたフイブリノーゲン(120μg/ml)
の不存在又は存在において、トリス−HCl0.1モ
ル/、PH7.5、トウイーン80 0.15モル/及び
プラスミノーゲン0.13μモル/及びクロモジム
PL0.30mモル/中で実施した。色素原基質から
のp−ニトロフエノールの遊離に対する尺度とし
て405nmでの吸光を測定し、インキユベート期間
の関数として示した。結果は第2図に示す。
された触媒活性の比較 t−PA及びGK1Lを、例2に記載したように
してCHO−細胞の上澄みから増殖させた。この
場合t−PA又はGK1Lを分泌するCHO−細胞を
アプロチニン(50μg/ml)の存在又は不存在で
培養した。活性試験を実施するため上澄みを1:
250に希釈した。これは無視し得る程度に僅少な
阻害剤の濃縮化をもたらした。プラスミノーゲン
分離活性は間接的な分光光度計テストによつて測
定した(“Thromb.Haemos−tasis”、48(1982)、
266−269)。t−PAはプラスミノーゲンを、色素
原基質の結合を加水分解する活性セリンプロテア
ーゼプラスミンに変換し、その405nmでの吸収を
3時間までの期間測定した。変更された実験でト
シル化されたGly−Pro−Lys−p−ニトロアニリ
ド(クロモジム(ChromozymR)PL)を色素原
基質として使用した。この試験は25℃で、CNBr
で分離されたフイブリノーゲン(120μg/ml)
の不存在又は存在において、トリス−HCl0.1モ
ル/、PH7.5、トウイーン80 0.15モル/及び
プラスミノーゲン0.13μモル/及びクロモジム
PL0.30mモル/中で実施した。色素原基質から
のp−ニトロフエノールの遊離に対する尺度とし
て405nmでの吸光を測定し、インキユベート期間
の関数として示した。結果は第2図に示す。
t−PA(アプロチニンを含まない上澄みから分
離した)のプラスミノーゲン分離活性は塗り潰し
た円で示されており、t−PA(アプロチニンを含
む上澄みから分離)の活性は白地の円で、GK1L
(アプロチニンを含む上澄みから分離)の活性は
塗り潰した四角でまたGK1L(アプロチニンを含
まない上澄みから分離)の活性は白地の四角で示
されている。±CNBrはテスト中CNBrで処理さ
れたフイブリノーゲン−断片の存在又は不存在を
示す。(+)又は(−)はアプロチニン含有又は
アプロチニン不含の組織培養上澄みからのタンパ
ク質が精製されたか否かを示す。
離した)のプラスミノーゲン分離活性は塗り潰し
た円で示されており、t−PA(アプロチニンを含
む上澄みから分離)の活性は白地の円で、GK1L
(アプロチニンを含む上澄みから分離)の活性は
塗り潰した四角でまたGK1L(アプロチニンを含
まない上澄みから分離)の活性は白地の四角で示
されている。±CNBrはテスト中CNBrで処理さ
れたフイブリノーゲン−断片の存在又は不存在を
示す。(+)又は(−)はアプロチニン含有又は
アプロチニン不含の組織培養上澄みからのタンパ
ク質が精製されたか否かを示す。
第2図から、フイブリノーゲンの存在でGK1L
の触媒活性が刺激されることは明白である。
の触媒活性が刺激されることは明白である。
この場合驚くべきことには、GK1Lを発現する
細胞からの上澄みの触媒活性はフイブリノーゲン
を有する場合もまた有さない場合も、野生型t−
PAを発現する細胞からの上澄みのそれよりも明
らかに高い。培地中にアプロチニンが存在する場
合、GK1Lの活性はフイブリノーゲンの存在する
場合には高く、フイブリノーゲンが存在しない場
合にはアプロチニンが存在しない場合よりも低
い。
細胞からの上澄みの触媒活性はフイブリノーゲン
を有する場合もまた有さない場合も、野生型t−
PAを発現する細胞からの上澄みのそれよりも明
らかに高い。培地中にアプロチニンが存在する場
合、GK1Lの活性はフイブリノーゲンの存在する
場合には高く、フイブリノーゲンが存在しない場
合にはアプロチニンが存在しない場合よりも低
い。
Applications Claiming Priority (2)
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---|---|---|---|
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---|---|
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JPH0571228B2 true JPH0571228B2 (ja) | 1993-10-06 |
Family
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Family Applications (1)
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---|---|---|---|
JP2511463A Granted JPH04500010A (ja) | 1989-08-23 | 1990-08-22 | t―PA―変異体GK1L |
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---|---|
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EP (1) | EP0440763B1 (ja) |
JP (1) | JPH04500010A (ja) |
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DE (2) | DE3927865A1 (ja) |
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---|---|---|---|---|
AU2000268170A1 (en) * | 2000-09-04 | 2002-03-22 | Hunan Royal Biotech | A cell line expressing mutant human tissue-type plasminogen activator, constructing strategy and method of expressed protein preparation |
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR950000303B1 (ko) * | 1985-12-20 | 1995-01-13 | 디 엎죤 캄파니 | 조직 플라스미노겐 활성화 인자(tpa) 상사체를 제조하는 방법 |
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1989
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1990
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- 1990-08-22 AT AT90912217T patent/ATE120236T1/de not_active IP Right Cessation
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Publication number | Publication date |
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