JPH01160481A - 新規なポリペプチド、その製法及び用途 - Google Patents
新規なポリペプチド、その製法及び用途Info
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- JPH01160481A JPH01160481A JP63266254A JP26625488A JPH01160481A JP H01160481 A JPH01160481 A JP H01160481A JP 63266254 A JP63266254 A JP 63266254A JP 26625488 A JP26625488 A JP 26625488A JP H01160481 A JPH01160481 A JP H01160481A
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
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-
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-
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、プロウロキナーゼ(ウロキナーゼ前駆体)活
性を有する新規なポリペプチド、その製法及び疾患の制
御へのその用途に関する。
性を有する新規なポリペプチド、その製法及び疾患の制
御へのその用途に関する。
プラスミノゲンアクチベーターであるプロウロキナーゼ
(PUK )は、「1重鎖ウロキナーゼブラスミノゲン
アクチベータ−(5CUPA ) J又は[腎プラスミ
ノゲンアクチベーター(KPA ) Jとも呼ばれ、4
11個のアミノ酸から成る1本鎖ポリペプチドで、約5
4 kD (キロダルトン)の分子量を有する。この成
熟プロウロキナーゼのアミノ酸配列を第1図に示す(Z
、 Physiol。
(PUK )は、「1重鎖ウロキナーゼブラスミノゲン
アクチベータ−(5CUPA ) J又は[腎プラスミ
ノゲンアクチベーター(KPA ) Jとも呼ばれ、4
11個のアミノ酸から成る1本鎖ポリペプチドで、約5
4 kD (キロダルトン)の分子量を有する。この成
熟プロウロキナーゼのアミノ酸配列を第1図に示す(Z
、 Physiol。
Cbam、363.166.1043.j155(19
82)参照)。このプロウロキナーゼから Lya 1
57−Phe158結合を制限プロテアーゼで溶解する
ことKより2本鎖分子の高分子量ウロキナーゼ(HUK
)が生成する。このものはプロウロキナーゼと同じ分
子量を有する。Lys 135とLys 136の間で
さらにプロテアーゼ溶解すると、約66kDの分子量を
有する低分子量ウロキナーゼ(LUK )が生成する。
82)参照)。このプロウロキナーゼから Lya 1
57−Phe158結合を制限プロテアーゼで溶解する
ことKより2本鎖分子の高分子量ウロキナーゼ(HUK
)が生成する。このものはプロウロキナーゼと同じ分
子量を有する。Lys 135とLys 136の間で
さらにプロテアーゼ溶解すると、約66kDの分子量を
有する低分子量ウロキナーゼ(LUK )が生成する。
LUKはHUKと同様に2本鎖分子である。すべての3
つの形は、ヒトの尿又は血清中に自然な形で検出された
( J、 Biol。
つの形は、ヒトの尿又は血清中に自然な形で検出された
( J、 Biol。
Chem、257.5276 (1982)及び261
.1267(1986)参照)。他のもう1つの形はヒ
ト腫瘍細胞株CALU−3(ATCC、HTB−55)
の突起物から単離されたもので32 kDの5CUPA
である。゛このプロウロキナーゼの形は1本鎖分子で、
アミノ酸144〜411から成る(J。
.1267(1986)参照)。他のもう1つの形はヒ
ト腫瘍細胞株CALU−3(ATCC、HTB−55)
の突起物から単離されたもので32 kDの5CUPA
である。゛このプロウロキナーゼの形は1本鎖分子で、
アミノ酸144〜411から成る(J。
Biol、 Chem、 261.17120〜171
26 (1986)参照)。
26 (1986)参照)。
1本鎖の形も2本鎖の形もフィブリン溶解作用を有する
。2本鎖分子はもち論全身的に作用する。これはフィブ
リンもフィブリノーゲンも分解し、適用の際にしばしば
生命を脅かす出血を生じさせる。1本鎖の形だけが凝塊
特異的で、小さい全身的溶解を示すにすぎない。
。2本鎖分子はもち論全身的に作用する。これはフィブ
リンもフィブリノーゲンも分解し、適用の際にしばしば
生命を脅かす出血を生じさせる。1本鎖の形だけが凝塊
特異的で、小さい全身的溶解を示すにすぎない。
本発明者らは、一般式
%式%()
〔式中Rは
Y−Lys−Pro−8er−8er−Pro−Pro
−Glu−41u。
−Glu−41u。
Y−Pro−8er−8er−Pro−Pro−Glu
−()lu。
−()lu。
Y−8er−8er−Pro−Pro−Glu−Glu
。
。
Y−3er−Pro−Pro−Glu−Glu。
Y−8er−Pro−Glu−Glu。
Y−Pro−Glu−Glu。
Y−GLu−Glu。
Y−Glu又は
(Yは水素原子、Ala又はMetである)、PUK1
44−155及びPUK はプロウロキナーゼの
アミノ酸144〜155及び157〜411、又は普通
のL−α−アミノ酸基を意味し、ただしYが水素原子で
あるときはXはArgでないものとする〕で表わされる
ポリペプチドが、例えば血清半減期の延長及び酵素安定
性の増大のような改善された性質を有することを見出し
た。
44−155及びPUK はプロウロキナーゼの
アミノ酸144〜155及び157〜411、又は普通
のL−α−アミノ酸基を意味し、ただしYが水素原子で
あるときはXはArgでないものとする〕で表わされる
ポリペプチドが、例えば血清半減期の延長及び酵素安定
性の増大のような改善された性質を有することを見出し
た。
普通のアミノ酸とは、Ala 、 Arg 、 Asn
、Asp% Cys、 Gin、 Glu、 (
)ly、 Hisl 11e1Leu 、 Lys
、Met 、 Phe 、 Pro、 Ser
、Thr 1Trp 、 Try及びValである。
、Asp% Cys、 Gin、 Glu、 (
)ly、 Hisl 11e1Leu 、 Lys
、Met 、 Phe 、 Pro、 Ser
、Thr 1Trp 、 Try及びValである。
式Iのポリペプチドはアミノ酸302(Asn、M1図
参照)においてグリコジル基を有しうる。
参照)においてグリコジル基を有しうる。
プロウロキナーゼのアミノ酸基144〜155及び15
7〜411は第1図から明らかである。
7〜411は第1図から明らかである。
本発明はさらに、式■のポリペプチドのためにコード化
するDNA配列、ならびにこのDNA配列を含有するベ
クターに関する。
するDNA配列、ならびにこのDNA配列を含有するベ
クターに関する。
新規ポリペプチドは、既知の方法により遺伝子工学的に
製造することができる。ここに記載する構成のだめの出
発点はCDNAクローン(以下PU20と呼ぶ)で、こ
れはプロウロキナーゼのコード化配列及びさらに5′−
及び3′−非翻訳領域を包含する。コード化領域を含み
かつそれから蛋白質配列(第1図)が誘導されるcDN
Aクローンの部分配列を、第2図に示す。成熟蛋白質は
、いわゆる「先導」配列の後の5er1で始まりLeu
411の後で終る。
製造することができる。ここに記載する構成のだめの出
発点はCDNAクローン(以下PU20と呼ぶ)で、こ
れはプロウロキナーゼのコード化配列及びさらに5′−
及び3′−非翻訳領域を包含する。コード化領域を含み
かつそれから蛋白質配列(第1図)が誘導されるcDN
Aクローンの部分配列を、第2図に示す。成熟蛋白質は
、いわゆる「先導」配列の後の5er1で始まりLeu
411の後で終る。
pU20はヒトプロウロキナーゼ生産腫瘍細胞株Det
roit 562 (ATCCACCL 138 )か
ら得られた。すなわちこの細胞株からm−RNAを分離
し、そして2本領cDNAに転写した。
roit 562 (ATCCACCL 138 )か
ら得られた。すなわちこの細胞株からm−RNAを分離
し、そして2本領cDNAに転写した。
このCDNAを市場で入手しうるクローニングベクター
puc 18中に挿入したのち、c DNAライブラリ
ーを作成した。この場合に用いられる方法については、
例えばマニアナイスら著「モレキュラー・クローニング
J 、C3H−プレスが参照される。放射性標識された
オリゴヌクレオチドゾンデを用いるこの種の遺伝子バン
クの「スクリーニング」も、たびたび使用される方法で
、文献に記載されている。
puc 18中に挿入したのち、c DNAライブラリ
ーを作成した。この場合に用いられる方法については、
例えばマニアナイスら著「モレキュラー・クローニング
J 、C3H−プレスが参照される。放射性標識された
オリゴヌクレオチドゾンデを用いるこの種の遺伝子バン
クの「スクリーニング」も、たびたび使用される方法で
、文献に記載されている。
pU 20のDNA配列の部分は、制限エンドヌクレア
ーゼを用いて容易に入手できる。これらの断片は、場合
により化学的に合成されたオリゴヌクレオチド、アダプ
ター又は遺伝子断片と結合して、新規ポリペプチドのた
めにコード化するDNA配列をクローニングするために
利用することができる。この遺伝子断片又は合成りNA
配列ヲクローニングベクター(例えば市販普通のプラス
ミドpBR522、puc 18及びpuc 19 )
の中に組込むことは、既知の手段により行われる。
ーゼを用いて容易に入手できる。これらの断片は、場合
により化学的に合成されたオリゴヌクレオチド、アダプ
ター又は遺伝子断片と結合して、新規ポリペプチドのた
めにコード化するDNA配列をクローニングするために
利用することができる。この遺伝子断片又は合成りNA
配列ヲクローニングベクター(例えば市販普通のプラス
ミドpBR522、puc 18及びpuc 19 )
の中に組込むことは、既知の手段により行われる。
蛋白質の発現を可能にする適当な化学的に合成されたコ
ントロール領域又は微生物もしくはファージから分離さ
れたコントロール領域を、遺伝子又は遺伝子断片に供給
することもできる。
ントロール領域又は微生物もしくはファージから分離さ
れたコントロール領域を、遺伝子又は遺伝子断片に供給
することもできる。
こうして得られる雑種プラスミドを適当な宿主微生物に
形質転換することも既知であり、文献に詳細に記載され
ている。この雑種プラスミドに、大腸菌のペリプラズム
中へのポリペプチドの分泌を可能にする相当するシグナ
ル配列を与えることもできる。
形質転換することも既知であり、文献に詳細に記載され
ている。この雑種プラスミドに、大腸菌のペリプラズム
中へのポリペプチドの分泌を可能にする相当するシグナ
ル配列を与えることもできる。
補元動物細胞培養物ならびに酵母又は昆虫細胞中での発
現も同様の手段で行わせることができる。すなわちこの
場合はもち論真核性コントロール領域を用いなければな
らない。補乳動物細胞中で発現させる場合は、例えばウ
ィルス性SV40プロモーターのコントロール下に発現
スベき外来遺伝子を定めるベクターを用いることができ
る。この種のプラスミドは真核性の複製起点を有しない
。許容される哺乳動物細胞への形質転換ののち、このプ
ラスミドの複製をゲノム中に組込んで有するクローンを
分離する。同様にして、発現すべき遺伝子を、真核性プ
ロモーターのコントロール下にウシ乳頭腫ウィルスを基
礎とするベクター上でクローニングすることができる。
現も同様の手段で行わせることができる。すなわちこの
場合はもち論真核性コントロール領域を用いなければな
らない。補乳動物細胞中で発現させる場合は、例えばウ
ィルス性SV40プロモーターのコントロール下に発現
スベき外来遺伝子を定めるベクターを用いることができ
る。この種のプラスミドは真核性の複製起点を有しない
。許容される哺乳動物細胞への形質転換ののち、このプ
ラスミドの複製をゲノム中に組込んで有するクローンを
分離する。同様にして、発現すべき遺伝子を、真核性プ
ロモーターのコントロール下にウシ乳頭腫ウィルスを基
礎とするベクター上でクローニングすることができる。
この種の発現プラスミドは、20〜100の複製数で許
容されるマウス繊維芽細胞株C127中にエビシーマと
して残留する。
容されるマウス繊維芽細胞株C127中にエビシーマと
して残留する。
この真核性発現系は、その産生物を有効かつ多くは天然
の形で分泌させることができる利点を有する。さらにこ
れは、その産生物を翻訳後修飾する能力を有する。
の形で分泌させることができる利点を有する。さらにこ
れは、その産生物を翻訳後修飾する能力を有する。
真核細胞中で発現させると、プロウロキナーゼはアミノ
酸302 (Asn )においてグリコシド側鎖をも有
する。微生物はグリコシド側鎖を合 成することができ
ない。微生物中で発現されるたいていの蛋白質は、例え
ばプロウロキナーゼ及びこれから本発明により導かれる
ポリペプチドも、細胞中で変性された封入体として得ら
れ、蛋白質化学的に巻戻さねばならない。さらに微生物
は、イニシエーターアミノ酸のメチオニンを出来上った
蛋白質から脱離させることがしばしばできない。微生物
中での発現の際に末端メチオニンを脱離すること及び多
(の場合封入体の形成を防止することは、分泌系の使用
により達成できる。この系を用いる場合にはもちろん、
N末端は脱離位置にとって重要なアミノ酸例えばアラニ
ンをもしばしば有する。微生物中での発現は多くの問題
を有するが、得られる粗蛋白質を活性な酵素に再生する
ことができる場合には、これはプロウロキナーゼにおけ
ると同様に好ましい発現系であり、この場合は微生物中
での発現が好ましい。
酸302 (Asn )においてグリコシド側鎖をも有
する。微生物はグリコシド側鎖を合 成することができ
ない。微生物中で発現されるたいていの蛋白質は、例え
ばプロウロキナーゼ及びこれから本発明により導かれる
ポリペプチドも、細胞中で変性された封入体として得ら
れ、蛋白質化学的に巻戻さねばならない。さらに微生物
は、イニシエーターアミノ酸のメチオニンを出来上った
蛋白質から脱離させることがしばしばできない。微生物
中での発現の際に末端メチオニンを脱離すること及び多
(の場合封入体の形成を防止することは、分泌系の使用
により達成できる。この系を用いる場合にはもちろん、
N末端は脱離位置にとって重要なアミノ酸例えばアラニ
ンをもしばしば有する。微生物中での発現は多くの問題
を有するが、得られる粗蛋白質を活性な酵素に再生する
ことができる場合には、これはプロウロキナーゼにおけ
ると同様に好ましい発現系であり、この場合は微生物中
での発現が好ましい。
遺伝子コードの変性により、異なるDNA配列例えば化
学的に合成されたプロウロキナーゼ遺伝子又は異なるト
リプレットを有するその一部を新規ポリペプチドを発現
させるために利用することも可能である。
学的に合成されたプロウロキナーゼ遺伝子又は異なるト
リプレットを有するその一部を新規ポリペプチドを発現
させるために利用することも可能である。
新規な有効物質は動脈性及び静脈性の閉塞性疾患におけ
る血栓溶解のために使用することができ、ヒトプロウロ
キナーゼに比して改善された性質を示す。
る血栓溶解のために使用することができ、ヒトプロウロ
キナーゼに比して改善された性質を示す。
したがって、本発明の対象は、少な(とも1種の新規ポ
リペプチドを、所望により製剤上容認される賦形剤又は
結合剤中に含有する医薬である。
リペプチドを、所望により製剤上容認される賦形剤又は
結合剤中に含有する医薬である。
新規蛋白質は他のフィブリン溶解剤例えばウロキナーゼ
、 TPA’、ストレプトキナーゼ、これる。
、 TPA’、ストレプトキナーゼ、これる。
本発明の他の態様を下記実施例により詳細に説明する。
実施例
1、ヒトプロウロキナーゼのためのCDNAクローンの
分離: プロウロキナーゼを産生ずるヒト腫瘍細胞株Detro
it、 562 (ATCC4CCL 15B )を、
「イーグル最小必須」培地中で、NaHCO33%、
胎児子ウシ血清10%、アミノ酸1%、Hepes 2
.4%、pH7,5と共に37℃及び5%C02雰囲気
中で合流するまで培養した。培地を傾しゃして除去し、
細胞を生理食塩水で洗浄し、溶解緩衝液(グアニジニウ
ムインチオシアネート6M。
分離: プロウロキナーゼを産生ずるヒト腫瘍細胞株Detro
it、 562 (ATCC4CCL 15B )を、
「イーグル最小必須」培地中で、NaHCO33%、
胎児子ウシ血清10%、アミノ酸1%、Hepes 2
.4%、pH7,5と共に37℃及び5%C02雰囲気
中で合流するまで培養した。培地を傾しゃして除去し、
細胞を生理食塩水で洗浄し、溶解緩衝液(グアニジニウ
ムインチオシアネート6M。
くえん酸ナトリウム5mM(’pH7)、メルカプトエ
タノール0.1M、ザルコシル0.5%)中テ溶解した
。RNAを5.7 M CsC1−クツションにより1
00000 gで1夜沈降させた。ポリA+−RNAを
含有する分画をオリゴ(dT)−セルロース上での2回
のアフイニテイクロマトグラフイにより分別した。
タノール0.1M、ザルコシル0.5%)中テ溶解した
。RNAを5.7 M CsC1−クツションにより1
00000 gで1夜沈降させた。ポリA+−RNAを
含有する分画をオリゴ(dT)−セルロース上での2回
のアフイニテイクロマトグラフイにより分別した。
酵素AMV−逆転トランスクリプ奔ゼ及びオリゴ(dT
)j2−18をスターターとして用いて、このポリ人−
RNAを1本鎖cDNA中に転写した。
)j2−18をスターターとして用いて、このポリ人−
RNAを1本鎖cDNA中に転写した。
第2の鎖の合成は大腸菌−DNA−ポリメラーゼ1を用
いて行った。この2本鎖CDNAに、酵素ターミナルト
ランスフェラーゼを用いてそれぞれ5′−末端において
約10〜20dG−基を合成付加させた。制限エンドヌ
クレアーゼSph[Kより線状化され、そしてそのダー
末端において前記のように約10〜20 dC−基が合
成付加されている市販のプラスミドpuC18を用いて
同様に操作した。両方のDNAを相互に融合させ、この
雑種を大腸菌株HB 101のコンピテントな細胞に形
質転換させた。このクローンを選択マーカーとしてのア
ンピシリン100μ9/mlを含tr BL −板上に
広ケ、コロニーをニトロセルロース上に移した。
いて行った。この2本鎖CDNAに、酵素ターミナルト
ランスフェラーゼを用いてそれぞれ5′−末端において
約10〜20dG−基を合成付加させた。制限エンドヌ
クレアーゼSph[Kより線状化され、そしてそのダー
末端において前記のように約10〜20 dC−基が合
成付加されている市販のプラスミドpuC18を用いて
同様に操作した。両方のDNAを相互に融合させ、この
雑種を大腸菌株HB 101のコンピテントな細胞に形
質転換させた。このクローンを選択マーカーとしてのア
ンピシリン100μ9/mlを含tr BL −板上に
広ケ、コロニーをニトロセルロース上に移した。
フィルター上の微生物を複製させ、溶菌し、そして変性
されたDNAをフィルターに固定した。
されたDNAをフィルターに固定した。
DNA−合成装置(アプライド・バイオシステムズ製、
380A型)を用いて、発表されたヒトプロウロキナー
ゼのDNA配列と相同性の4種の17−オリゴヌクレオ
チドゾンデを製造した。
380A型)を用いて、発表されたヒトプロウロキナー
ゼのDNA配列と相同性の4種の17−オリゴヌクレオ
チドゾンデを製造した。
これらのゾンデは下記の配列を有する。
5’ TCAGCAGCACATA()CAT 3’5
’ AACCAGGGCTGGTTCTC3’5’ A
CCATGCACTCTTGGAC3’5’ TGCT
GGTCACAGGTCAT 5’これらのオリゴヌク
レオチドゾンデを5′−末端においてγ−32P −A
TPで標識し、ニトロセルロースフィルターを、6×セ
ツトの緩iM (1×セツト=NaC1o、15M、
)リス−HCl (pH7,4)0.015M、gD
Tx・o、oolu)、SDS ’[1゜1%及びデキ
ストラン硫酸塩10%の中で42℃で1夜振とうしなか
らゾンデと共に保温した。
’ AACCAGGGCTGGTTCTC3’5’ A
CCATGCACTCTTGGAC3’5’ TGCT
GGTCACAGGTCAT 5’これらのオリゴヌク
レオチドゾンデを5′−末端においてγ−32P −A
TPで標識し、ニトロセルロースフィルターを、6×セ
ツトの緩iM (1×セツト=NaC1o、15M、
)リス−HCl (pH7,4)0.015M、gD
Tx・o、oolu)、SDS ’[1゜1%及びデキ
ストラン硫酸塩10%の中で42℃で1夜振とうしなか
らゾンデと共に保温した。
フィルターを6×上セツト5DS1%中で42°Cでよ
く洗浄したのち、このフィルターをX線フィルムと共に
照射し、そして配列相同性を有するクローンを調べた。
く洗浄したのち、このフィルターをX線フィルムと共に
照射し、そして配列相同性を有するクローンを調べた。
相同性クローンを分離して個別化した。
こうして分離されたクローンの1つはpU20であった
。そのコード化領域及び隣接範囲の配列を第2図に示す
。
。そのコード化領域及び隣接範囲の配列を第2図に示す
。
2、対照物質のプロウロキナーゼを発現させるための雑
種プラスミドの製造: 出発点はプラスミドpU20(実施例1)であった。こ
のものから制限されたTaq I / Ba:mHI−
消化によって、ヌクレオチド162〜1329のプロウ
ロキナーゼ遺伝子の断片を切断し、ゲル電気泳動により
分離した(断片1)。プラスミドpuc 18をEco
Rl及びSal Iにより線状イヒし、これにより断片
2を生成した。
種プラスミドの製造: 出発点はプラスミドpU20(実施例1)であった。こ
のものから制限されたTaq I / Ba:mHI−
消化によって、ヌクレオチド162〜1329のプロウ
ロキナーゼ遺伝子の断片を切断し、ゲル電気泳動により
分離した(断片1)。プラスミドpuc 18をEco
Rl及びSal Iにより線状イヒし、これにより断片
2を生成した。
この断片1及び2を、それぞれプロウロキナーゼの5′
−末端(3/4 )ならびに3′−末端(5/6)を再
び産生ずるオリゴヌクレオチドアダプター3/4及び5
/6と連結した。オリゴヌクレオチド3/4の使用によ
り、5′−末端においてEcoRl−切断位が欠失され
た。こうして第3図に示す雑種プラスミドpPUKが得
られ、このものはプロウロキナーゼ遺伝子を種々の発現
ベクター中に転移するための容易にクローニングしうる
C1aI / 5ail −rカセット」として利用で
きるようにした。
−末端(3/4 )ならびに3′−末端(5/6)を再
び産生ずるオリゴヌクレオチドアダプター3/4及び5
/6と連結した。オリゴヌクレオチド3/4の使用によ
り、5′−末端においてEcoRl−切断位が欠失され
た。こうして第3図に示す雑種プラスミドpPUKが得
られ、このものはプロウロキナーゼ遺伝子を種々の発現
ベクター中に転移するための容易にクローニングしうる
C1aI / 5ail −rカセット」として利用で
きるようにした。
EcoRI C1al
amHI
Sal I
雑種プラスミドpPUKをC1a lにより開裂し、突
出した5′−末端をDNAポリメラーゼ■のフレノウ断
片及びdCTP及びdGTPにより充填した。
出した5′−末端をDNAポリメラーゼ■のフレノウ断
片及びdCTP及びdGTPにより充填した。
エンドヌクレアーゼSal Iによる後切断及びゲル電
気泳動精製により、ウロキナーゼ遺伝子を有する断片が
得られた。この断片をEcoRIにより開裂し、突出末
端を「ムング豆ヌクレアーゼ」を用いて製造業者の指示
に従って除去したのち、Sal Iにより切断した市販
の発現ベクターpKK223−3(ファルマシア注文4
27−4935−01 )に挿入した。断片の連結によ
り、第4図に示す発現プラスミドpKK 223/ P
UKが得られた。このプラスミドを、大腸菌株に12J
M105(ファルマシア注文扁27−1550−01
)のコンピテントにした細胞内に形質転換した。この菌
株は、普通の生長条件下でプロウロキナーゼを複製する
lac −IJプレツサーを有するエピゾームF′IQ
を含有する。イソプロピル−β−D−チオガラクトシド
(IPTG )の含量を対数的生長相において0.5m
Mにすることにより、プロウロキナーゼ遺伝子の発現を
誘発させた。この場合プロウロキナーゼが細胞内で変性
されていわゆる「封入体」として得られた。このものは
細菌の溶解により精製することができ、これからプロウ
ロキナーゼを蛋白質化学的に再生して精製することがで
きる。
気泳動精製により、ウロキナーゼ遺伝子を有する断片が
得られた。この断片をEcoRIにより開裂し、突出末
端を「ムング豆ヌクレアーゼ」を用いて製造業者の指示
に従って除去したのち、Sal Iにより切断した市販
の発現ベクターpKK223−3(ファルマシア注文4
27−4935−01 )に挿入した。断片の連結によ
り、第4図に示す発現プラスミドpKK 223/ P
UKが得られた。このプラスミドを、大腸菌株に12J
M105(ファルマシア注文扁27−1550−01
)のコンピテントにした細胞内に形質転換した。この菌
株は、普通の生長条件下でプロウロキナーゼを複製する
lac −IJプレツサーを有するエピゾームF′IQ
を含有する。イソプロピル−β−D−チオガラクトシド
(IPTG )の含量を対数的生長相において0.5m
Mにすることにより、プロウロキナーゼ遺伝子の発現を
誘発させた。この場合プロウロキナーゼが細胞内で変性
されていわゆる「封入体」として得られた。このものは
細菌の溶解により精製することができ、これからプロウ
ロキナーゼを蛋白質化学的に再生して精製することがで
きる。
3、N−末端短縮物を発現するための雑種プラスミドの
製造ニ プラスミドpPUK (第3図、実施例2)を、メチラ
ーゼ陰性菌株GM 1813により継代培養した。次い
でC1al / Ba1l−切断により、ヌクレオチド
582までを含むプロウロキナーゼの5′−末端を分離
した。この5′−末端を合成オリゴヌクレオチドを用い
て補完すると、新規ポリペプチドのためにコード化する
遺伝子配列が生成した。下記の合成りNA断片Δ135
〜Δ146との連結により、雑種プラスミドpPUKΔ
135〜pPUK Δ143 (以下にまとめてpPU
KΔX ト呼ばれる)が生成した(第5図)。これらの
DNA配列を用いて実施例2に記載したと同様にして、
大腸菌中で本発明のポリペプチドを遺伝子工学的に合成
することができた。
製造ニ プラスミドpPUK (第3図、実施例2)を、メチラ
ーゼ陰性菌株GM 1813により継代培養した。次い
でC1al / Ba1l−切断により、ヌクレオチド
582までを含むプロウロキナーゼの5′−末端を分離
した。この5′−末端を合成オリゴヌクレオチドを用い
て補完すると、新規ポリペプチドのためにコード化する
遺伝子配列が生成した。下記の合成りNA断片Δ135
〜Δ146との連結により、雑種プラスミドpPUKΔ
135〜pPUK Δ143 (以下にまとめてpPU
KΔX ト呼ばれる)が生成した(第5図)。これらの
DNA配列を用いて実施例2に記載したと同様にして、
大腸菌中で本発明のポリペプチドを遺伝子工学的に合成
することができた。
△135:
C1a 1
Bal[
Δ136:
lal
Δ137:
Δ138:
△169:
△140 :
Δ141 :
△142:
C1al
Ba1l△146: 4、アミノ酸が156位で交換している短縮したPUK
を発現するための雑種プラスミドの製造:雑種プラスミ
ドpPUK△X(実施例3、第5図)をBa1lにより
完全に、そしてEcoRlにより部分的に切断した。ベ
クターに含有される断片をゲル電気泳動により精製し、
合成オリゴヌクレオチド84/85.86/87又は8
8/89と連結した。
Ba1l△146: 4、アミノ酸が156位で交換している短縮したPUK
を発現するための雑種プラスミドの製造:雑種プラスミ
ドpPUK△X(実施例3、第5図)をBa1lにより
完全に、そしてEcoRlにより部分的に切断した。ベ
クターに含有される断片をゲル電気泳動により精製し、
合成オリゴヌクレオチド84/85.86/87又は8
8/89と連結した。
Arg156ooln156
TTCTAA TAA CCG CCA CTTAA−
lArg156−+L。u156 15に うして雑種プラ、X )”pPUK△XY(Yl!L
ys156、G1n156又はLeu156を意味する
)が生成した(第6図)。これらのDNA断片を用いて
実施例2に記載したと同様にして、大腸菌中で本発明の
ポリペプチドを遺伝子工学的に合成した。
lArg156−+L。u156 15に うして雑種プラ、X )”pPUK△XY(Yl!L
ys156、G1n156又はLeu156を意味する
)が生成した(第6図)。これらのDNA断片を用いて
実施例2に記載したと同様にして、大腸菌中で本発明の
ポリペプチドを遺伝子工学的に合成した。
5、大腸菌中で発現されたポリペプチドの精製及び再生
: 前記のプロウロキナーゼのポリペプチドを、標準法によ
り大腸菌中で発現させたのち、精製して再生した。
: 前記のプロウロキナーゼのポリペプチドを、標準法によ
り大腸菌中で発現させたのち、精製して再生した。
細胞ペレット(湿潤混合物100g)を、溶液(燐酸塩
緩衝液pH8,0の50 mM 、 EDTA 10
mM。
緩衝液pH8,0の50 mM 、 EDTA 10
mM。
DTT 1 mM及びツイーン80の0. D D 5
%)5001nI!中に移し、再懸濁させた。超音波で
溶解した細胞を遠心分離し、封入体を含有するペレット
を、燐酸塩緩衝液pH8,0の50 mM 、 NaC
lIM、DTTlmM及びツイーン80の0.005%
の溶液で洗浄した。
%)5001nI!中に移し、再懸濁させた。超音波で
溶解した細胞を遠心分離し、封入体を含有するペレット
を、燐酸塩緩衝液pH8,0の50 mM 、 NaC
lIM、DTTlmM及びツイーン80の0.005%
の溶液で洗浄した。
この洗浄された封入体を遠心分離しく10000gで1
0分間)、6M−グアニジニウム塩酸塩に溶解した。こ
れは燐酸塩緩衝液pH8,0の50 mM、 DTT
5 mM、 EDTA 1 mM及びグアニジニウム塩
酸塩6Mの溶液200m1中で室温で60分間攪拌する
ことにより行った。不溶性蛋白質を遠心分離した。PU
K変異体の再生はこの溶液を、燐酸塩緩衝液pH9,0
の50 mM 、グアニジニウム塩酸塩1.5M、アル
ギニン0.5 、hi、GSH1mM 1()SSG
0.1 mM 、 EDTA 1 mM及びツイーン8
0のo、 o o s%の溶液中で、蛋白質濃度が0.
2〜[1,3〜9 / mlとなるように希釈すること
により行った。
0分間)、6M−グアニジニウム塩酸塩に溶解した。こ
れは燐酸塩緩衝液pH8,0の50 mM、 DTT
5 mM、 EDTA 1 mM及びグアニジニウム塩
酸塩6Mの溶液200m1中で室温で60分間攪拌する
ことにより行った。不溶性蛋白質を遠心分離した。PU
K変異体の再生はこの溶液を、燐酸塩緩衝液pH9,0
の50 mM 、グアニジニウム塩酸塩1.5M、アル
ギニン0.5 、hi、GSH1mM 1()SSG
0.1 mM 、 EDTA 1 mM及びツイーン8
0のo、 o o s%の溶液中で、蛋白質濃度が0.
2〜[1,3〜9 / mlとなるように希釈すること
により行った。
蛋白質の精製は、硫酸アンモニウム沈殿、アフイニテイ
クロマトグラフイ及びイオン交換クロマトグラフィによ
り行った。このためには、再生溶液に硫酸アンモニウム
(40〜70%)を添加し、ペレットを燐酸塩50mM
、グアニジニウム塩酸塩I M、 NaC10,I M
及びツイーン80のo、 o o s%の溶液に移し、
Zn−キレート(ファルマシア)−クロマトグラフィカ
ラムの上に載せ、前記の緩衝液中のEDTA 50 m
Mを用いて4°Cで溶離させた。溶離した蛋白質を、燐
酸塩10 mM、 NaC110mM及びツイーン80
の0.005%の溶液に対して4℃で透析し、S−セフ
ァロース(ファルマシア)の上に載せた。
クロマトグラフイ及びイオン交換クロマトグラフィによ
り行った。このためには、再生溶液に硫酸アンモニウム
(40〜70%)を添加し、ペレットを燐酸塩50mM
、グアニジニウム塩酸塩I M、 NaC10,I M
及びツイーン80のo、 o o s%の溶液に移し、
Zn−キレート(ファルマシア)−クロマトグラフィカ
ラムの上に載せ、前記の緩衝液中のEDTA 50 m
Mを用いて4°Cで溶離させた。溶離した蛋白質を、燐
酸塩10 mM、 NaC110mM及びツイーン80
の0.005%の溶液に対して4℃で透析し、S−セフ
ァロース(ファルマシア)の上に載せた。
PUK変異体を燐酸塩50 m)J 、 NaC140
0mM及びツイーン8000.005%の溶液によりカ
ラムから溶離させた。
0mM及びツイーン8000.005%の溶液によりカ
ラムから溶離させた。
基質S−2444(カリガラス)を用いる直接のアミド
分解試験において、精製された蛋白質の巷由比活性は0
.5〜1.5 X 105U/m9の範囲にある。
分解試験において、精製された蛋白質の巷由比活性は0
.5〜1.5 X 105U/m9の範囲にある。
6、アミノ酸が156位で交換しているPUKポリペプ
チドの強化されたプロテアーゼ抵抗性:プロウロキナー
ゼをArg 156の後方でトロンビン切断することに
より、もはや活性化することができず、かつ凝塊の溶解
にもはや利用されない2本鎖分子が生成する。156位
のアミノ酸交換を有する前記のポリペプチドは、トロン
ビンにより全く不活性化されないか又はきわめてわずか
な程度に不活性化されるにすぎない。
チドの強化されたプロテアーゼ抵抗性:プロウロキナー
ゼをArg 156の後方でトロンビン切断することに
より、もはや活性化することができず、かつ凝塊の溶解
にもはや利用されない2本鎖分子が生成する。156位
のアミノ酸交換を有する前記のポリペプチドは、トロン
ビンにより全く不活性化されないか又はきわめてわずか
な程度に不活性化されるにすぎない。
前記のポリペプチドを代表して、156位にグルタミン
又はロイシンを有する各分子について、この改善された
性質を説明する。
又はロイシンを有する各分子について、この改善された
性質を説明する。
トロンビン不活性化試験を、次のように実施した。プロ
ウロキナーゼ(又はその変異体)を6 Q 00 U/
mlに希釈しく燐酸塩pH6,7の50鯛、NaC13
00mM、ツイーン80の0.005%)、トロンビア
(5U/mi )と共に37℃で保温した。15分の
間隔で一定割合を取出し、アミド分解試験で測定した。
ウロキナーゼ(又はその変異体)を6 Q 00 U/
mlに希釈しく燐酸塩pH6,7の50鯛、NaC13
00mM、ツイーン80の0.005%)、トロンビア
(5U/mi )と共に37℃で保温した。15分の
間隔で一定割合を取出し、アミド分解試験で測定した。
アミド分解試験においてプロウロキナーゼの活性は、ト
ロンビン単位が増大するにつれて低下することが示され
た(第7図)。すなわち活性化プロウロキナーゼは、ト
ロンビン2U(曲線a)の添加の場合に保温時間15分
後に、その出発活性の86%を有し、60分後に59%
を有した。一方トロンピン10U(曲線b)17)添加
の場合は、同じ保温時間において出発活性の50%なら
びに66%が測定された。プロウロキナーゼをトロンビ
ン無添加で同じ条件下で保温すると、1時間の期間゛に
わたり常に出発活性の100%を示した。プロウロキナ
ーゼの代わりにPUK変異体(G1n156又はLeu
156)をトロンビン不活性化試験に使用した。第7図
から明らかなように、この変異体はトロンビン5Uを添
加して30分間保温したのち、出発活性の100%を有
していた(曲線C)。プロウロキナーゼの156位のア
ミノ酸交換(Arg→Gin又はLeu )は、トロン
ビンが変異体においてもはや蛋白質溶解活性を有せず、
そして不活性な2本鎖物質を生成しないように作用する
。
ロンビン単位が増大するにつれて低下することが示され
た(第7図)。すなわち活性化プロウロキナーゼは、ト
ロンビン2U(曲線a)の添加の場合に保温時間15分
後に、その出発活性の86%を有し、60分後に59%
を有した。一方トロンピン10U(曲線b)17)添加
の場合は、同じ保温時間において出発活性の50%なら
びに66%が測定された。プロウロキナーゼをトロンビ
ン無添加で同じ条件下で保温すると、1時間の期間゛に
わたり常に出発活性の100%を示した。プロウロキナ
ーゼの代わりにPUK変異体(G1n156又はLeu
156)をトロンビン不活性化試験に使用した。第7図
から明らかなように、この変異体はトロンビン5Uを添
加して30分間保温したのち、出発活性の100%を有
していた(曲線C)。プロウロキナーゼの156位のア
ミノ酸交換(Arg→Gin又はLeu )は、トロン
ビンが変異体においてもはや蛋白質溶解活性を有せず、
そして不活性な2本鎖物質を生成しないように作用する
。
l延長された生体内半減期:
実施例3〜5に記載のポリペプチドは、著しく高められ
た生体内半減期を有する。その代表的な例として、式I
においてYがMetでX7!+ZArgであるポリペプ
チド(4)、ならびにYがMetでXがGlnであるポ
リペプチド(B)について説明する。
た生体内半減期を有する。その代表的な例として、式I
においてYがMetでX7!+ZArgであるポリペプ
チド(4)、ならびにYがMetでXがGlnであるポ
リペプチド(B)について説明する。
これらの化合物は薬力学的実験において、約350gの
雄性スプラーギューダウレイラットに1〜/kl?を静
脈内ポーラス注射したのち、 PUKと比較して延長さ
れた半減期を示した。
雄性スプラーギューダウレイラットに1〜/kl?を静
脈内ポーラス注射したのち、 PUKと比較して延長さ
れた半減期を示した。
このために、プラスミンによる活性化後の化合物の血清
活性を、発色体基質52444(カリガラス)を用いる
アミド分解試験において測定した。その結果を法衣に示
す。
活性を、発色体基質52444(カリガラス)を用いる
アミド分解試験において測定した。その結果を法衣に示
す。
化合物 半減期(分)
PUK 3A
10B〉10
10B〉10
第1図は成熟プロウロキナーゼのアミノ酸配列を示し、
第2図は第1図のポリペプチド配例のためのcDNAク
ローンのコード化領域及び隣接範囲の配列を示し、第3
図及び第4図は対照物質としてのプロウロキナーゼの発
現用雑種プラスミドpKK 223 / PUxを製造
するための工程図、第5図は本発明のN末端短縮ポリペ
プチドの発現用雑種プラスミドpPUK△Xを製造する
ための工程図、第6図は156位のアミノ酸が交換して
いる本発明の短縮プロウロキナーゼの発現用雑種プラス
ミドpPUKΔXYを製造するための工程図、そして第
7図は本発明のポリペプチドの活性(血清半減期)を示
すグラフである。 出願人 ピーニーニスエフ・アクチェンゲゼルシャフ
ト代理人 弁理士 小 林 正 雄>
為 −−う 1+−1 −(J (!+ (+−CL L
(JI+ 為 −1+−−ψ 乙 −Φ 龜 く ■ の11開
平1−160481(11) ■開平1−160481(12) 1N開平1−160481(14) イコ【夏14−−亀ノ「1暫υ璽4−’・−◆オリコ゛
516 FIG、6
第2図は第1図のポリペプチド配例のためのcDNAク
ローンのコード化領域及び隣接範囲の配列を示し、第3
図及び第4図は対照物質としてのプロウロキナーゼの発
現用雑種プラスミドpKK 223 / PUxを製造
するための工程図、第5図は本発明のN末端短縮ポリペ
プチドの発現用雑種プラスミドpPUK△Xを製造する
ための工程図、第6図は156位のアミノ酸が交換して
いる本発明の短縮プロウロキナーゼの発現用雑種プラス
ミドpPUKΔXYを製造するための工程図、そして第
7図は本発明のポリペプチドの活性(血清半減期)を示
すグラフである。 出願人 ピーニーニスエフ・アクチェンゲゼルシャフ
ト代理人 弁理士 小 林 正 雄>
為 −−う 1+−1 −(J (!+ (+−CL L
(JI+ 為 −1+−−ψ 乙 −Φ 龜 く ■ の11開
平1−160481(11) ■開平1−160481(12) 1N開平1−160481(14) イコ【夏14−−亀ノ「1暫υ璽4−’・−◆オリコ゛
516 FIG、6
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、一般式 R−PUK^1^4^4^−^1^5^5−X−PUK
^1^5^7^−^4^1^1( I )〔式中Rは Y−Lys−Pro−Ser−Ser−Pro−Pro
−Glu−Glu、Y−Pro−Ser−Ser−Pr
o−Pro−Glu−Glu、Y−Ser−Ser−P
ro−Pro−Glu−Glu、Y−Ser−Pro−
Pro−Glu−Glu、Y−Ser−Pro−Glu
−Glu、 Y−Pro−Glu−Glu、 Y−Glu−Glu、 Y−Glu又は Y (Yは水素原子、Ala又はMetである)、PUK^
1^4^4^−^1^5^5及びPUK^1^5^7^
−^4^1^1はプロウロキナーゼのアミノ酸144〜
155及び157〜411、Xは普通のL−α−アミノ
酸基を意味し、ただしYが水素原子であるときはXはA
rgでないものとする〕で表わされるポリペプチド。 2、第1請求項に記載のポリペプチドのためにコード化
するDNA配列。 3、第1請求項に記載のポリペプチドのためにコード化
する遺伝子配列を含有するベクター。 4、第1請求項に記載のペプチド配列のためにコード化
する遺伝子を宿主微生物中で発現させることを特徴とす
る、第1請求項に記載のポリペプチドの遺伝子工学的製
法。 5、少なくとも1種の第1請求項に記載のポリペプチド
を、所望により製剤上容認される賦形剤又は結合剤の中
に含有する医薬。 6、少なくとも1種の第1請求項に記載のポリペプチド
と他のフィブリン溶解物質を含有する、第5請求項に記
載の医薬。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE3735917.7 | 1987-10-23 | ||
DE19873735917 DE3735917A1 (de) | 1987-10-23 | 1987-10-23 | Neue polypeptide, ihre herstellung und verwendung |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH01160481A true JPH01160481A (ja) | 1989-06-23 |
Family
ID=6338943
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP63266254A Pending JPH01160481A (ja) | 1987-10-23 | 1988-10-24 | 新規なポリペプチド、その製法及び用途 |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0312941A3 (ja) |
JP (1) | JPH01160481A (ja) |
DE (1) | DE3735917A1 (ja) |
DK (1) | DK587688A (ja) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE4101736A1 (de) * | 1991-01-22 | 1992-07-23 | Gruenenthal Gmbh | Neue als plasminogenaktivatoren einsetzbare polypeptide, dafuer codierende plasmide und verfahren zu deren herstellung und deren verwendung |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5219569A (en) * | 1985-04-22 | 1993-06-15 | Genentech, Inc. | Protease resistant urokinase |
NL8601240A (nl) * | 1986-05-15 | 1987-12-01 | Leuven Res & Dev Vzw | Plasminogeenactivator en trombolytisch geneesmiddel. |
-
1987
- 1987-10-23 DE DE19873735917 patent/DE3735917A1/de not_active Withdrawn
-
1988
- 1988-10-15 EP EP88117186A patent/EP0312941A3/de not_active Withdrawn
- 1988-10-21 DK DK587688A patent/DK587688A/da not_active Application Discontinuation
- 1988-10-24 JP JP63266254A patent/JPH01160481A/ja active Pending
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Publication number | Publication date |
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DE3735917A1 (de) | 1989-05-03 |
EP0312941A2 (de) | 1989-04-26 |
DK587688D0 (da) | 1988-10-21 |
DK587688A (da) | 1989-06-14 |
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