JPH01160481A - 新規なポリペプチド、その製法及び用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、プロウロキナーゼ（ウロキナーゼ前駆体）活
性を有する新規なポリペプチド、その製法及び疾患の制
御へのその用途に関する。

プラスミノゲンアクチベーターであるプロウロキナーゼ
（ＰＵＫ　）は、「１重鎖ウロキナーゼブラスミノゲン
アクチベータ−（５ＣＵＰＡ　）　Ｊ又は［腎プラスミ
ノゲンアクチベーター（ＫＰＡ　）　Ｊとも呼ばれ、４
１１個のアミノ酸から成る１本鎖ポリペプチドで、約５
４　ｋＤ　（キロダルトン）の分子量を有する。この成
熟プロウロキナーゼのアミノ酸配列を第１図に示す（Ｚ
、　Ｐｈｙｓｉｏｌ。

Ｃｂａｍ、３６３．１６６．１０４３．ｊ１５５（１９
８２）参照）。このプロウロキナーゼから　Ｌｙａ　１
５７−Ｐｈｅ１５８結合を制限プロテアーゼで溶解する
ことＫより２本鎖分子の高分子量ウロキナーゼ（ＨＵＫ
　）が生成する。このものはプロウロキナーゼと同じ分
子量を有する。Ｌｙｓ　１３５とＬｙｓ　１３６の間で
さらにプロテアーゼ溶解すると、約６６ｋＤの分子量を
有する低分子量ウロキナーゼ（ＬＵＫ　）が生成する。

ＬＵＫはＨＵＫと同様に２本鎖分子である。すべての３
つの形は、ヒトの尿又は血清中に自然な形で検出された
（　Ｊ、　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、２５７．５２７６　（１９８２）及び２６１
．１２６７（１９８６）参照）。他のもう１つの形はヒ
ト腫瘍細胞株ＣＡＬＵ−３（ＡＴＣＣ、ＨＴＢ−５５）
の突起物から単離されたもので３２　ｋＤの５ＣＵＰＡ
である。゛このプロウロキナーゼの形は１本鎖分子で、
アミノ酸１４４〜４１１から成る（Ｊ。

Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６１．１７１２０〜１７１
２６　（１９８６）参照）。

１本鎖の形も２本鎖の形もフィブリン溶解作用を有する
。２本鎖分子はもち論全身的に作用する。これはフィブ
リンもフィブリノーゲンも分解し、適用の際にしばしば
生命を脅かす出血を生じさせる。１本鎖の形だけが凝塊
特異的で、小さい全身的溶解を示すにすぎない。

本発明者らは、一般式 ％式％（） 〔式中Ｒは Ｙ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−８ｅｒ−８ｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ
−Ｇｌｕ−４１ｕ。

Ｙ−Ｐｒｏ−８ｅｒ−８ｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ
−（）ｌｕ。

Ｙ−８ｅｒ−８ｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ
。

Ｙ−３ｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ。

Ｙ−８ｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ。

Ｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ。

Ｙ−ＧＬｕ−Ｇｌｕ。

Ｙ−Ｇｌｕ又は （Ｙは水素原子、Ａｌａ又はＭｅｔである）、ＰＵＫ１
４４−１５５及びＰＵＫ　　　　はプロウロキナーゼの
アミノ酸１４４〜１５５及び１５７〜４１１、又は普通
のＬ−α−アミノ酸基を意味し、ただしＹが水素原子で
あるときはＸはＡｒｇでないものとする〕で表わされる
ポリペプチドが、例えば血清半減期の延長及び酵素安定
性の増大のような改善された性質を有することを見出し
た。

普通のアミノ酸とは、Ａｌａ　、　Ａｒｇ　、　Ａｓｎ
、Ａｓｐ％　Ｃｙｓ、　　Ｇｉｎ、　　Ｇｌｕ、　　（
）ｌｙ、　　Ｈｉｓｌ　１１ｅ１Ｌｅｕ　、　　Ｌｙｓ
　、Ｍｅｔ　、　　Ｐｈｅ　、　　Ｐｒｏ、　Ｓｅｒ　
、Ｔｈｒ　１Ｔｒｐ　、　Ｔｒｙ及びＶａｌである。

式Ｉのポリペプチドはアミノ酸３０２（Ａｓｎ、Ｍ１図
参照）においてグリコジル基を有しうる。

プロウロキナーゼのアミノ酸基１４４〜１５５及び１５
７〜４１１は第１図から明らかである。

本発明はさらに、式■のポリペプチドのためにコード化
するＤＮＡ配列、ならびにこのＤＮＡ配列を含有するベ
クターに関する。

新規ポリペプチドは、既知の方法により遺伝子工学的に
製造することができる。ここに記載する構成のだめの出
発点はＣＤＮＡクローン（以下ＰＵ２０と呼ぶ）で、こ
れはプロウロキナーゼのコード化配列及びさらに５′−
及び３′−非翻訳領域を包含する。コード化領域を含み
かつそれから蛋白質配列（第１図）が誘導されるｃＤＮ
Ａクローンの部分配列を、第２図に示す。成熟蛋白質は
、いわゆる「先導」配列の後の５ｅｒ１で始まりＬｅｕ
４１１の後で終る。

ｐＵ２０はヒトプロウロキナーゼ生産腫瘍細胞株Ｄｅｔ
ｒｏｉｔ　５６２　（ＡＴＣＣＡＣＣＬ　１３８　）か
ら得られた。すなわちこの細胞株からｍ−ＲＮＡを分離
し、そして２本領ｃＤＮＡに転写した。

このＣＤＮＡを市場で入手しうるクローニングベクター
ｐｕｃ　１８中に挿入したのち、ｃ　ＤＮＡライブラリ
ーを作成した。この場合に用いられる方法については、
例えばマニアナイスら著「モレキュラー・クローニング
Ｊ　、Ｃ３Ｈ−プレスが参照される。放射性標識された
オリゴヌクレオチドゾンデを用いるこの種の遺伝子バン
クの「スクリーニング」も、たびたび使用される方法で
、文献に記載されている。

ｐＵ　２０のＤＮＡ配列の部分は、制限エンドヌクレア
ーゼを用いて容易に入手できる。これらの断片は、場合
により化学的に合成されたオリゴヌクレオチド、アダプ
ター又は遺伝子断片と結合して、新規ポリペプチドのた
めにコード化するＤＮＡ配列をクローニングするために
利用することができる。この遺伝子断片又は合成りＮＡ
配列ヲクローニングベクター（例えば市販普通のプラス
ミドｐＢＲ５２２、ｐｕｃ　１８及びｐｕｃ　１９　）
の中に組込むことは、既知の手段により行われる。

蛋白質の発現を可能にする適当な化学的に合成されたコ
ントロール領域又は微生物もしくはファージから分離さ
れたコントロール領域を、遺伝子又は遺伝子断片に供給
することもできる。

こうして得られる雑種プラスミドを適当な宿主微生物に
形質転換することも既知であり、文献に詳細に記載され
ている。この雑種プラスミドに、大腸菌のペリプラズム
中へのポリペプチドの分泌を可能にする相当するシグナ
ル配列を与えることもできる。

補元動物細胞培養物ならびに酵母又は昆虫細胞中での発
現も同様の手段で行わせることができる。すなわちこの
場合はもち論真核性コントロール領域を用いなければな
らない。補乳動物細胞中で発現させる場合は、例えばウ
ィルス性ＳＶ４０プロモーターのコントロール下に発現
スベき外来遺伝子を定めるベクターを用いることができ
る。この種のプラスミドは真核性の複製起点を有しない
。許容される哺乳動物細胞への形質転換ののち、このプ
ラスミドの複製をゲノム中に組込んで有するクローンを
分離する。同様にして、発現すべき遺伝子を、真核性プ
ロモーターのコントロール下にウシ乳頭腫ウィルスを基
礎とするベクター上でクローニングすることができる。

この種の発現プラスミドは、２０〜１００の複製数で許
容されるマウス繊維芽細胞株Ｃ１２７中にエビシーマと
して残留する。

この真核性発現系は、その産生物を有効かつ多くは天然
の形で分泌させることができる利点を有する。さらにこ
れは、その産生物を翻訳後修飾する能力を有する。

真核細胞中で発現させると、プロウロキナーゼはアミノ
酸３０２　（Ａｓｎ　）においてグリコシド側鎖をも有
する。微生物はグリコシド側鎖を合　成することができ
ない。微生物中で発現されるたいていの蛋白質は、例え
ばプロウロキナーゼ及びこれから本発明により導かれる
ポリペプチドも、細胞中で変性された封入体として得ら
れ、蛋白質化学的に巻戻さねばならない。さらに微生物
は、イニシエーターアミノ酸のメチオニンを出来上った
蛋白質から脱離させることがしばしばできない。微生物
中での発現の際に末端メチオニンを脱離すること及び多
（の場合封入体の形成を防止することは、分泌系の使用
により達成できる。この系を用いる場合にはもちろん、
Ｎ末端は脱離位置にとって重要なアミノ酸例えばアラニ
ンをもしばしば有する。微生物中での発現は多くの問題
を有するが、得られる粗蛋白質を活性な酵素に再生する
ことができる場合には、これはプロウロキナーゼにおけ
ると同様に好ましい発現系であり、この場合は微生物中
での発現が好ましい。

遺伝子コードの変性により、異なるＤＮＡ配列例えば化
学的に合成されたプロウロキナーゼ遺伝子又は異なるト
リプレットを有するその一部を新規ポリペプチドを発現
させるために利用することも可能である。

新規な有効物質は動脈性及び静脈性の閉塞性疾患におけ
る血栓溶解のために使用することができ、ヒトプロウロ
キナーゼに比して改善された性質を示す。

したがって、本発明の対象は、少な（とも１種の新規ポ
リペプチドを、所望により製剤上容認される賦形剤又は
結合剤中に含有する医薬である。

新規蛋白質は他のフィブリン溶解剤例えばウロキナーゼ
、　ＴＰＡ’、ストレプトキナーゼ、これる。

本発明の他の態様を下記実施例により詳細に説明する。

実施例 １、ヒトプロウロキナーゼのためのＣＤＮＡクローンの
分離： プロウロキナーゼを産生ずるヒト腫瘍細胞株Ｄｅｔｒｏ
ｉｔ、　５６２　（ＡＴＣＣ４ＣＣＬ　１５Ｂ　）を、
　「イーグル最小必須」培地中で、ＮａＨＣＯ３３％、
胎児子ウシ血清１０％、アミノ酸１％、Ｈｅｐｅｓ　２
．４％、ｐＨ７，５と共に３７℃及び５％Ｃ０２雰囲気
中で合流するまで培養した。培地を傾しゃして除去し、
細胞を生理食塩水で洗浄し、溶解緩衝液（グアニジニウ
ムインチオシアネート６Ｍ。

くえん酸ナトリウム５ｍＭ（’ｐＨ７）、メルカプトエ
タノール０．１Ｍ、ザルコシル０．５％）中テ溶解した
。ＲＮＡを５．７　Ｍ　ＣｓＣ１−クツションにより１
０００００　ｇで１夜沈降させた。ポリＡ＋−ＲＮＡを
含有する分画をオリゴ（ｄＴ）−セルロース上での２回
のアフイニテイクロマトグラフイにより分別した。

酵素ＡＭＶ−逆転トランスクリプ奔ゼ及びオリゴ（ｄＴ
）ｊ２−１８をスターターとして用いて、このポリ人−
ＲＮＡを１本鎖ｃＤＮＡ中に転写した。

第２の鎖の合成は大腸菌−ＤＮＡ−ポリメラーゼ１を用
いて行った。この２本鎖ＣＤＮＡに、酵素ターミナルト
ランスフェラーゼを用いてそれぞれ５′−末端において
約１０〜２０ｄＧ−基を合成付加させた。制限エンドヌ
クレアーゼＳｐｈ［Ｋより線状化され、そしてそのダー
末端において前記のように約１０〜２０　ｄＣ−基が合
成付加されている市販のプラスミドｐｕＣ１８を用いて
同様に操作した。両方のＤＮＡを相互に融合させ、この
雑種を大腸菌株ＨＢ　１０１のコンピテントな細胞に形
質転換させた。このクローンを選択マーカーとしてのア
ンピシリン１００μ９／ｍｌを含ｔｒ　ＢＬ　−板上に
広ケ、コロニーをニトロセルロース上に移した。

フィルター上の微生物を複製させ、溶菌し、そして変性
されたＤＮＡをフィルターに固定した。

ＤＮＡ−合成装置（アプライド・バイオシステムズ製、
３８０Ａ型）を用いて、発表されたヒトプロウロキナー
ゼのＤＮＡ配列と相同性の４種の１７−オリゴヌクレオ
チドゾンデを製造した。

これらのゾンデは下記の配列を有する。

５’　ＴＣＡＧＣＡＧＣＡＣＡＴＡ（）ＣＡＴ　３’５
’　ＡＡＣＣＡＧＧＧＣＴＧＧＴＴＣＴＣ３’５’　Ａ
ＣＣＡＴＧＣＡＣＴＣＴＴＧＧＡＣ３’５’　ＴＧＣＴ
ＧＧＴＣＡＣＡＧＧＴＣＡＴ　５’これらのオリゴヌク
レオチドゾンデを５′−末端においてγ−３２Ｐ　−Ａ
ＴＰで標識し、ニトロセルロースフィルターを、６×セ
ツトの緩ｉＭ　（１×セツト＝ＮａＣ１ｏ、１５Ｍ、　
　）リス−ＨＣｌ　（ｐＨ７，４）０．０１５Ｍ、ｇＤ
Ｔｘ・ｏ、ｏｏｌｕ）、ＳＤＳ　’［１゜１％及びデキ
ストラン硫酸塩１０％の中で４２℃で１夜振とうしなか
らゾンデと共に保温した。

フィルターを６×上セツト５ＤＳ１％中で４２°Ｃでよ
く洗浄したのち、このフィルターをＸ線フィルムと共に
照射し、そして配列相同性を有するクローンを調べた。

相同性クローンを分離して個別化した。

こうして分離されたクローンの１つはｐＵ２０であった
。そのコード化領域及び隣接範囲の配列を第２図に示す
。

２、対照物質のプロウロキナーゼを発現させるための雑
種プラスミドの製造： 出発点はプラスミドｐＵ２０（実施例１）であった。こ
のものから制限されたＴａｑ　Ｉ　／　Ｂａ：ｍＨＩ−
消化によって、ヌクレオチド１６２〜１３２９のプロウ
ロキナーゼ遺伝子の断片を切断し、ゲル電気泳動により
分離した（断片１）。プラスミドｐｕｃ　１８をＥｃｏ
Ｒｌ及びＳａｌ　Ｉにより線状イヒし、これにより断片
２を生成した。

この断片１及び２を、それぞれプロウロキナーゼの５′
−末端（３／４　）ならびに３′−末端（５／６）を再
び産生ずるオリゴヌクレオチドアダプター３／４及び５
／６と連結した。オリゴヌクレオチド３／４の使用によ
り、５′−末端においてＥｃｏＲｌ−切断位が欠失され
た。こうして第３図に示す雑種プラスミドｐＰＵＫが得
られ、このものはプロウロキナーゼ遺伝子を種々の発現
ベクター中に転移するための容易にクローニングしうる
Ｃ１ａＩ　／　５ａｉｌ　−ｒカセット」として利用で
きるようにした。

ＥｃｏＲＩ　　　　Ｃ１ａｌ ａｍＨＩ Ｓａｌ　Ｉ 雑種プラスミドｐＰＵＫをＣ１ａ　ｌにより開裂し、突
出した５′−末端をＤＮＡポリメラーゼ■のフレノウ断
片及びｄＣＴＰ及びｄＧＴＰにより充填した。

エンドヌクレアーゼＳａｌ　Ｉによる後切断及びゲル電
気泳動精製により、ウロキナーゼ遺伝子を有する断片が
得られた。この断片をＥｃｏＲＩにより開裂し、突出末
端を「ムング豆ヌクレアーゼ」を用いて製造業者の指示
に従って除去したのち、Ｓａｌ　Ｉにより切断した市販
の発現ベクターｐＫＫ２２３−３（ファルマシア注文４
２７−４９３５−０１　）に挿入した。断片の連結によ
り、第４図に示す発現プラスミドｐＫＫ　２２３／　Ｐ
ＵＫが得られた。このプラスミドを、大腸菌株に１２Ｊ
Ｍ１０５（ファルマシア注文扁２７−１５５０−０１　
）のコンピテントにした細胞内に形質転換した。この菌
株は、普通の生長条件下でプロウロキナーゼを複製する
ｌａｃ　−ＩＪプレツサーを有するエピゾームＦ′ＩＱ
を含有する。イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド
（ＩＰＴＧ　）の含量を対数的生長相において０．５ｍ
Ｍにすることにより、プロウロキナーゼ遺伝子の発現を
誘発させた。この場合プロウロキナーゼが細胞内で変性
されていわゆる「封入体」として得られた。このものは
細菌の溶解により精製することができ、これからプロウ
ロキナーゼを蛋白質化学的に再生して精製することがで
きる。

３、Ｎ−末端短縮物を発現するための雑種プラスミドの
製造ニ プラスミドｐＰＵＫ　（第３図、実施例２）を、メチラ
ーゼ陰性菌株ＧＭ　１８１３により継代培養した。次い
でＣ１ａｌ　／　Ｂａ１ｌ−切断により、ヌクレオチド
５８２までを含むプロウロキナーゼの５′−末端を分離
した。この５′−末端を合成オリゴヌクレオチドを用い
て補完すると、新規ポリペプチドのためにコード化する
遺伝子配列が生成した。下記の合成りＮＡ断片Δ１３５
〜Δ１４６との連結により、雑種プラスミドｐＰＵＫΔ
１３５〜ｐＰＵＫ　Δ１４３　（以下にまとめてｐＰＵ
ＫΔＸ　ト呼ばれる）が生成した（第５図）。これらの
ＤＮＡ配列を用いて実施例２に記載したと同様にして、
大腸菌中で本発明のポリペプチドを遺伝子工学的に合成
することができた。

△１３５： Ｃ１ａ　１ Ｂａｌ［ Δ１３６： ｌａｌ Δ１３７： Δ１３８： △１６９： △１４０　： Δ１４１　： △１４２： Ｃ１ａｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　Ｂａ１ｌ△１４６： ４、アミノ酸が１５６位で交換している短縮したＰＵＫ
を発現するための雑種プラスミドの製造：雑種プラスミ
ドｐＰＵＫ△Ｘ（実施例３、第５図）をＢａ１ｌにより
完全に、そしてＥｃｏＲｌにより部分的に切断した。ベ
クターに含有される断片をゲル電気泳動により精製し、
合成オリゴヌクレオチド８４／８５．８６／８７又は８
８／８９と連結した。

Ａｒｇ１５６ｏｏｌｎ１５６ ＴＴＣＴＡＡ　ＴＡＡ　ＣＣＧ　ＣＣＡ　ＣＴＴＡＡ−
ｌＡｒｇ１５６−＋Ｌ。ｕ１５６ １５に うして雑種プラ、Ｘ　　）”ｐＰＵＫ△ＸＹ（Ｙｌ！Ｌ
ｙｓ１５６、Ｇ１ｎ１５６又はＬｅｕ１５６を意味する
）が生成した（第６図）。これらのＤＮＡ断片を用いて
実施例２に記載したと同様にして、大腸菌中で本発明の
ポリペプチドを遺伝子工学的に合成した。

５、大腸菌中で発現されたポリペプチドの精製及び再生
： 前記のプロウロキナーゼのポリペプチドを、標準法によ
り大腸菌中で発現させたのち、精製して再生した。

細胞ペレット（湿潤混合物１００ｇ）を、溶液（燐酸塩
緩衝液ｐＨ８，０の５０　ｍＭ　、　ＥＤＴＡ　１０　
ｍＭ。

ＤＴＴ　１　ｍＭ及びツイーン８０の０．　Ｄ　Ｄ　５
％）５００１ｎＩ！中に移し、再懸濁させた。超音波で
溶解した細胞を遠心分離し、封入体を含有するペレット
を、燐酸塩緩衝液ｐＨ８，０の５０　ｍＭ　、　ＮａＣ
ｌＩＭ、ＤＴＴｌｍＭ及びツイーン８０の０．００５％
の溶液で洗浄した。

この洗浄された封入体を遠心分離しく１００００ｇで１
０分間）、６Ｍ−グアニジニウム塩酸塩に溶解した。こ
れは燐酸塩緩衝液ｐＨ８，０の５０　ｍＭ、　ＤＴＴ　
５　ｍＭ、　ＥＤＴＡ　１　ｍＭ及びグアニジニウム塩
酸塩６Ｍの溶液２００ｍ１中で室温で６０分間攪拌する
ことにより行った。不溶性蛋白質を遠心分離した。ＰＵ
Ｋ変異体の再生はこの溶液を、燐酸塩緩衝液ｐＨ９，０
の５０　ｍＭ　、グアニジニウム塩酸塩１．５Ｍ、アル
ギニン０．５　、ｈｉ、ＧＳＨ１ｍＭ　１（）ＳＳＧ　
０．１　ｍＭ　、　ＥＤＴＡ　１　ｍＭ及びツイーン８
０のｏ、　ｏ　ｏ　ｓ％の溶液中で、蛋白質濃度が０．
２〜［１，３〜９　／　ｍｌとなるように希釈すること
により行った。

蛋白質の精製は、硫酸アンモニウム沈殿、アフイニテイ
クロマトグラフイ及びイオン交換クロマトグラフィによ
り行った。このためには、再生溶液に硫酸アンモニウム
（４０〜７０％）を添加し、ペレットを燐酸塩５０ｍＭ
、グアニジニウム塩酸塩Ｉ　Ｍ、　ＮａＣ１０，Ｉ　Ｍ
及びツイーン８０のｏ、　ｏ　ｏ　ｓ％の溶液に移し、
Ｚｎ−キレート（ファルマシア）−クロマトグラフィカ
ラムの上に載せ、前記の緩衝液中のＥＤＴＡ　５０　ｍ
Ｍを用いて４°Ｃで溶離させた。溶離した蛋白質を、燐
酸塩１０　ｍＭ、　ＮａＣ１１０ｍＭ及びツイーン８０
の０．００５％の溶液に対して４℃で透析し、Ｓ−セフ
ァロース（ファルマシア）の上に載せた。

ＰＵＫ変異体を燐酸塩５０　ｍ）Ｊ　、　ＮａＣ１４０
０ｍＭ及びツイーン８０００．００５％の溶液によりカ
ラムから溶離させた。

基質Ｓ−２４４４（カリガラス）を用いる直接のアミド
分解試験において、精製された蛋白質の巷由比活性は０
．５〜１．５　Ｘ　１０５Ｕ／ｍ９の範囲にある。

６、アミノ酸が１５６位で交換しているＰＵＫポリペプ
チドの強化されたプロテアーゼ抵抗性：プロウロキナー
ゼをＡｒｇ　１５６の後方でトロンビン切断することに
より、もはや活性化することができず、かつ凝塊の溶解
にもはや利用されない２本鎖分子が生成する。１５６位
のアミノ酸交換を有する前記のポリペプチドは、トロン
ビンにより全く不活性化されないか又はきわめてわずか
な程度に不活性化されるにすぎない。

前記のポリペプチドを代表して、１５６位にグルタミン
又はロイシンを有する各分子について、この改善された
性質を説明する。

トロンビン不活性化試験を、次のように実施した。プロ
ウロキナーゼ（又はその変異体）を６　Ｑ　００　Ｕ／
ｍｌに希釈しく燐酸塩ｐＨ６，７の５０鯛、ＮａＣ１３
００ｍＭ、ツイーン８０の０．００５％）、トロンビア
　（５Ｕ／ｍｉ　）と共に３７℃で保温した。１５分の
間隔で一定割合を取出し、アミド分解試験で測定した。

アミド分解試験においてプロウロキナーゼの活性は、ト
ロンビン単位が増大するにつれて低下することが示され
た（第７図）。すなわち活性化プロウロキナーゼは、ト
ロンビン２Ｕ（曲線ａ）の添加の場合に保温時間１５分
後に、その出発活性の８６％を有し、６０分後に５９％
を有した。一方トロンピン１０Ｕ（曲線ｂ）１７）添加
の場合は、同じ保温時間において出発活性の５０％なら
びに６６％が測定された。プロウロキナーゼをトロンビ
ン無添加で同じ条件下で保温すると、１時間の期間゛に
わたり常に出発活性の１００％を示した。プロウロキナ
ーゼの代わりにＰＵＫ変異体（Ｇ１ｎ１５６又はＬｅｕ
１５６）をトロンビン不活性化試験に使用した。第７図
から明らかなように、この変異体はトロンビン５Ｕを添
加して３０分間保温したのち、出発活性の１００％を有
していた（曲線Ｃ）。プロウロキナーゼの１５６位のア
ミノ酸交換（Ａｒｇ→Ｇｉｎ又はＬｅｕ　）は、トロン
ビンが変異体においてもはや蛋白質溶解活性を有せず、
そして不活性な２本鎖物質を生成しないように作用する
。

ｌ延長された生体内半減期： 実施例３〜５に記載のポリペプチドは、著しく高められ
た生体内半減期を有する。その代表的な例として、式Ｉ
においてＹがＭｅｔでＸ７！＋ＺＡｒｇであるポリペプ
チド（４）、ならびにＹがＭｅｔでＸがＧｌｎであるポ
リペプチド（Ｂ）について説明する。

これらの化合物は薬力学的実験において、約３５０ｇの
雄性スプラーギューダウレイラットに１〜／ｋｌ？を静
脈内ポーラス注射したのち、　ＰＵＫと比較して延長さ
れた半減期を示した。

このために、プラスミンによる活性化後の化合物の血清
活性を、発色体基質５２４４４（カリガラス）を用いる
アミド分解試験において測定した。その結果を法衣に示
す。

化合物　　　　　半減期（分） ＰＵＫ　　　　　　　　　　　　　　　　３Ａ　　　　
　　　　　　　　　　　１０Ｂ〉１０

【図面の簡単な説明】

第１図は成熟プロウロキナーゼのアミノ酸配列を示し、
第２図は第１図のポリペプチド配例のためのｃＤＮＡク
ローンのコード化領域及び隣接範囲の配列を示し、第３
図及び第４図は対照物質としてのプロウロキナーゼの発
現用雑種プラスミドｐＫＫ　２２３　／　ＰＵｘを製造
するための工程図、第５図は本発明のＮ末端短縮ポリペ
プチドの発現用雑種プラスミドｐＰＵＫ△Ｘを製造する
ための工程図、第６図は１５６位のアミノ酸が交換して
いる本発明の短縮プロウロキナーゼの発現用雑種プラス
ミドｐＰＵＫΔＸＹを製造するための工程図、そして第
７図は本発明のポリペプチドの活性（血清半減期）を示
すグラフである。 出願人　　ピーニーニスエフ・アクチェンゲゼルシャフ
ト代理人　弁理士　小　　　林　　　正　　　雄＞　　
　為　　−−う　　　１＋−１ −（Ｊ　　　　（！＋　　　　（＋−ＣＬ　　　　Ｌ　
　　　（ＪＩ＋　　　為　　−１＋−−ψ 乙　　　−Φ　　　龜　　　く　　　■　　　の１１開
平１−１６０４８１（１１） ■開平１−１６０４８１（１２） １Ｎ開平１−１６０４８１（１４） イコ【夏１４−−亀ノ「１暫υ璽４−’・−◆オリコ゛
５１６ ＦＩＧ、６

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、一般式 Ｒ−ＰＵＫ＾１＾４＾４＾−＾１＾５＾５−Ｘ−ＰＵＫ
   ＾１＾５＾７＾−＾４＾１＾１（ I ）〔式中Ｒは Ｙ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ
   −Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、Ｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒ
   ｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、Ｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｐ
   ｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、Ｙ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−
   Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、Ｙ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ
   −Ｇｌｕ、 Ｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、 Ｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、 Ｙ−Ｇｌｕ又は Ｙ （Ｙは水素原子、Ａｌａ又はＭｅｔである）、ＰＵＫ＾
   １＾４＾４＾−＾１＾５＾５及びＰＵＫ＾１＾５＾７＾
   −＾４＾１＾１はプロウロキナーゼのアミノ酸１４４〜
   １５５及び１５７〜４１１、Ｘは普通のＬ−α−アミノ
   酸基を意味し、ただしＹが水素原子であるときはＸはＡ
   ｒｇでないものとする〕で表わされるポリペプチド。 ２、第１請求項に記載のポリペプチドのためにコード化
   するＤＮＡ配列。 ３、第１請求項に記載のポリペプチドのためにコード化
   する遺伝子配列を含有するベクター。 ４、第１請求項に記載のペプチド配列のためにコード化
   する遺伝子を宿主微生物中で発現させることを特徴とす
   る、第１請求項に記載のポリペプチドの遺伝子工学的製
   法。 ５、少なくとも１種の第１請求項に記載のポリペプチド
   を、所望により製剤上容認される賦形剤又は結合剤の中
   に含有する医薬。 ６、少なくとも１種の第１請求項に記載のポリペプチド
   と他のフィブリン溶解物質を含有する、第５請求項に記
   載の医薬。