JPS5942321A - ヒト組織プラスミノ−ゲン活性化因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ヒト面清及び／又はヒト［中に見い出される
ものに相当するヒトプラスミノーゲン活性化因子及びそ
の新規な形態、並びに該活性化因子を含有する組成物、
並びに特に均質な該活性化因子を治療に適用する上で意
義のある徂で製造するための手段及び方法に係る。

本発明は、ヒトプラスミノーゲン活性化因子をコードし
ているＤＮＡ配列及びそれから推定される該活性化因子
のアミノ酸配列を知見したことに部分的に起因するもの
である。この知見に基づき、組換ＤＮＡ技術を適用して
ヒトプラスミノーゲン活性化因子を製造することが可能
になり、しかもこの製造方法によると、現存する細胞培
養物に於（プる産生及び該細胞培養物からの単離という
工程を含む従来の単離方法に固有のある種の制約を受（
プることがなく、更に、市場認可に先立って必要とされ
る動物実験及び臨床試験に着手し且つこれを遂行するに
充分な質及び量で該活性化因子を製造することが可能に
なったのである。

本発明は、あらゆる点で、これらの関連する具体例に係
る。

本発明の詳細な説明し且つある場合にはその実施のため
の詳細を補うために使用する文献及びその他の資料は、
本明細書中参照番号を付して引用し、更に便宜のため本
明細書末尾に参考文献として列挙する。

Ａ、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子線維素溶解系
は凝固系と動的平衡状態にあり、−区　− 自然な開放性血管床を維持する。、凝固系はａ紛素をマ
トリックスとして沈着させ、これにより止血状態を回復
する。線雑素溶解系は、止血状態が達成された後、線紺
素網を除去する。この線紐累溶解過程は、面漿タンパク
前駆体であるプラスミノーゲンから生ずるタンパク分解
酵素、プラスミンによってもたらされる。プラスミノー
ゲンは活性化剤によって活性化されてプラスミンに変換
される。現在、２種の活性化剤、ストレプトキナーゼ及
びウロキナーゼが市販されている。この両者の効能は、
急性血管病例えば心筋梗塞、脳卒中、帥塞栓症、深部静
脈血栓症、末梢動ＨｒｊＩ塞症及びぞの伯の静脈面枠症
の治療とされている。総じて、これらの病気は重大な健
康上の危険の要因となる。

これらの疾病の基本的原因は、凝血塊（血栓又は血栓塞
栓）による血管の部分的又は重度の場合には全体的閉塞
にある。例えばヘパリン及びクマ６− リンを用いるような従来の凝固防止療法では、血栓又は
血栓塞栓の溶解を直接には何ら促進しない。

上述した血栓溶解剤即ちストレプトキナーゼ及びウロキ
ナーゼは実際に有効に使用されてきている。

黙しながら今日まで、これらの薬剤には夫々厳しい限界
があった。さらに、これらの薬剤ば線維素に対する高度
の親和性も有していない。従って、これらの薬剤は、循
環しているプラスミノーゲン及び線維素に結合している
プラスミノーゲンを比較的無差別に活性化する。循環血
液中で形成したプラスミンは、比較的急速に中和され、
有効な血栓溶解能を失う。残留するプラスミンは、数種
の血液凝固因子タンパク例えばフィブリノーゲン、第Ｖ
因子及び第■因子を分解して出血の可能性をもたらす。

さらに、ストレプトキナーゼは強度に抗原性であり、高
抗体ノ２価を有する患者は治療に対し効果を示さず又継
続して投与することもできない。ウロキナーゼによる治
療法は、該ウロキナーゼの製造工程が人間の尿又は組織
培養物から単離する工程を含むため高価であり、従って
一般に臨床的実用性に劣る。このような状況下で、ウロ
キナーゼは多くの研究の主題であった（例えば文献１乃
至６参照）。

いわゆるプラスミノーゲン活性化因子は種々のヒト組織
例えば子宮組織、血液、血清（文献７乃至１１参照）並
びに細胞培養物（文献９４参照）から単＊ｔされていた
。これらの組成及び／又はこれらを含有する組成物につ
いては文献１２及び１３に記載されている（文献１４乃
至１８参照）。これらの起源を有するプラスミノーゲン
活性化因子は、それらの免疫学的特性の差違に基づいて
２つの主なグループ、即ちウロキナーゼ型プラスミノー
ゲン活性化因子（ｕ−ＰＡ）及び組織型プラスミノーゲ
ン活性化因子（ｔ−ＰＡ）に分類される。（略号ｔ−Ｐ
Ａ及びｕ−ＰＡは、ＸＸＷ　　ｌｖｌｅｅｔｉｎｇ　ｏ
ｆ　ｔｈｅ　Ｉ　ｎ−ｔｃｒｎａｔｉｏｎａｌ　　Ｃｏ
ｍｍ１ｔｔｅｅ　　ｏｎ　　Ｔ　ｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　
　ａｎｄＨｅｍｏｓｔａｓｉｓ、　　Ｂｅｒｇａｍｏ、
　　Ｉｔａｌｙ、　　２７　Ｊｕｌｙ１９８２に於いて
提唱されたものである。）近年、ヒトメラノーマ（黒色
胛）セルライン（細胞株）がｔ−ＰＡを分泌することが
確認された。

このメラノーマ由来プラスミノーゲン活性化因子は、免
疫学的に及びアミノ酸組成に於いて、正常ヒト１１織か
ら単離されたプラスミノーゲン活性化因子と区別し得な
い特性を有することが示されている（文献１９及び８８
参照）。

比較的純粋な形態で単離されたこの物質の特性を検討し
た結果、高い活性を有する線雑素溶解因子であることが
知見された（文献２０参照）。

メラノーマセルラインから精製したｔ−ＰＡを使用して
行なわれたいくつかの研究の結果、ｔ−ＰＡがウロキナ
ーゼ型プラスミノーゲン活性化因子に９− 比較して線紺素に対してより高い親和力を有することが
示された（例えば文献９５乃至９８参照）。然しながら
、ｔ−ＰＡは血液、組織抽出物、血管潅流液及び細胞培
養物中に非常に低濃度でしか存在しないため、ヒトｔ−
ＰＡの血栓溶解剤としての可能性を更に深く研究するこ
とは困難であった。

ヒト由来の他のタンパクを実質的に含まない高品質のヒ
ト組織型プラスミノーゲン活性化因子（これは初期には
ヒトプラスミノーゲン活性化因子と呼ばれていた）を必
要充分な母で製造するために最も有効な方法は、組換Ｄ
ＮＡ技術及びそれに関連する技術の適用であろうという
ことは既に考えられていたことである。このような物質
が得られれば、それは恐らく種々の心血管障害又は心血
管病の治療に対して臨床応用できるような生物活性を示
すであろう。

充分ｍのヒトｔ−ＰＡが細胞培養に於いて産生きれるが
、５５二のコード配列を用いて更に改良することにより
産生レベルを更に向上することが可能である。この第二
のコード配列はジヒドロ葉酸還元酵素（Ｄ　Ｉ−（Ｆ　
Ｒ）を含み、Ｄ　ＨＦ　Ｒは外部制御パラメーター例え
ばメ１−１〜レキレ−１−（ｍｅｔｌＴＯ−ｔｒｃｘａ
ｔｃ、　　Ｍ　Ｔ　Ｘ　）の作用を受（プ、従って、Ｍ
ＴＸ淵度の調整によって発現を制御しｊ９る。

Ｂ、組換ＤＮΔ技術 組換ＤＮΔ技術は、かなり複鮪な応用の段階に達してい
る。分子生物学者は、種々のＤＮＡ配列をかなり容易に
組換え、形質転換された微生物又は細胞中で大量の外来
タンパク産物を産生し得る新たなりＮＡ体を作成し得る
。種々の平滑末端又は粘る末端を右するＤＮＡ断片をｉ
ｎ　ＶｉｔｒＯ結合し、特定生物を形質転換するのに有
用な発現ベクターを作成し、かくして所望の外来性産物
の効率的な合成を行なうための一般的手段及び方法は、
既に開発されており自由に使用覆ることかで・きる。然
しながら、個）Ｚの産物については、その製造７ＩＩ稈
はまだ若−１複肩１であり、常に成功を予測し１ｑる段
階にまでは科学は進歩していない。事実、実験的裏付（
）をせずに成功結果を予告Ｊる者・しいるが、このよう
イ【予言には実施不能というバしい危険が伴っている。

基本的要素、即ら複製のＡリジン、１種又は−でれ以［
−の表現型選択特性、発現１に１モーター、異種遺伝子
インリー１〜及び残りのベクターのＤＮΔ組換は、一般
に宿主細胞の外部で行なわれる。、得られる複製可能（
７組換発現ベクターＪなゎらプラスミドを形質転換によ
り細胞中へ導入し、得られる形質転換体を憎げ１ざｌる
ことにより大事の組換ベクターを得ることができる。コ
ードされているＤＮＡメツセージの転”ｊ　ｄ３よび翻
訳を支配η−る部分に対して迫伝子が適切に挿入されで
いれば、得られた発現ベクターを使用して挿入遺伝子が
コードしているポリペプチド配列を実際に産生ずること
ができ、この過程を発現と呼ぶ。微生物系で必要に応じ
て宿主細胞を溶菌し、且つ適当な方法にＪ：り仙のタン
パクから精製して目的産物を回収することができる。

実際、組換ＤＮＡ技術を用いるここにより、全くｗ種の
ポリペプチドを発現させることができ（いわゆる直接的
発現）、或いは同種ポリペプチドのアミノ酸配列の一部
と融合した異種ポリペプチドを発現させることもできる
。後者の場合、目的とづる生物活性産物は、しばしば、
細胞外環境に於いて開裂されるまで、融合した同種／異
種ポリペプチド中で生物的に不活性の形態で存在する（
文献２１及び２２参照）。

同様に、遺伝学及び細胞生理学を研究するための細胞培
養（セルカルチャー）又は組織培養の技術は充分に確立
されている。単離した正常細胞から継代処即にＪ−り永
久セルラインを調製しこれを紐持Ｊる手段及び方法も公
知である。研究に使用ηるためには、これらのセルライ
ンを液体培地中の固体支持体」−に維持するか、又は栄
養物を含有する懸濁液中で増殖させる。大端生産のため
には機械的問題が残るのみであろう（その仙の費用につ
いては、文献２３及び２４参照）。

又、生物Ｔ学においてはタンパク質生化学が有用１つ実
際上必要な手段である。所望のタンパクを産生する細胞
は、多数の４１！Ｉのタンパク、即ち細胞固有の代謝産
物をも産生する。これらの夾雑タンパク及びその伯の化
合物は、所望タンパクから除去されないと、所望タンパ
クによる治療処置の過程で動物又はヒトに投与した場合
有毒となる危険性がある。タンパク質生化学の技術に−
こり、目的とする特定システムに適覆る分離方法を使用
して目的用途に対し安全で均質な最終産物を得ることが
できる。更に、タンパク質生化学にＪこり、所望産物の
特性を明らかにし、細胞が何ら変化せず又は突然変異す
ることなく所望産物を確実に産生じたことを確認Ｊ−る
ことができる。臨床研究及び市場開発に成功するために
必要とされるバイオアッセイ、安定す！１試験及びその
他の研究過程には−１−記の和学分野も含まれる。

本発明は、組換ＤＮＡ技術の使用により、ヒ１〜組織プ
ラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）を好ましくは直
接的形態で製造し、しかも市場認可を得るための必須要
件である動物実験及び臨床試験を開始し口つ継続するの
に十分な吊で右利に製造し１■るという知見に基く。製
造されたヒトｔ−ＰＡは、ヒ］〜の様々な心血管障害又
は心血管病の予防処置又は治療処置での使用に適してい
る。従って、１つの角度から見た本発明の千要’、Ｉ？
Ｉ］的は、ｔ　−１〕、　Ａを使用ツるヒ［・の心面管
疾忠の治療方法及びｔ−ＰＡを使用づる薬剤組成物を提
供することである。

本発明は、更に、実質的に純粋＜ｒヒト１１械プラスミ
ノーゲン活性化因子を提供する。］盲仏子工学的に処理
された微（１−物又Ｉ−１細胞系により、従来よりも道
かに有効にヒ１へ組織プラスミノーゲン活性化因子を産
生し得、これにより従来は確信し得なかった産業利用の
機会が得られる。更に、宿主細胞次第でヒ１〜組械プラ
スミノーゲン活ｆＩｉ化因子は天然物質に比較して異＜
’にっだ程度でグリ］シル化を伴い得る。いずれにして
′ｂ、このように産生されるｔ−ＰＡは、非組換細胞に
於いでは伴われるのが酋通である夾雑物を含まないであ
ろう。

本発明は、又、ヒト組織プラスミノーゲン活ｆ１化因子
を発現しく１する形態で１−ドしている逍伝了配列を含
む複製可能なりＮＡ発現ベクター、該ベクターで形質転
換された微生物菌株又は細胞、並びにヒ１〜組織プラス
ミノーゲン活性化因子を産生し得る前記の如き形質転換
された微生物ぴ１株又は細胞株の培養及びそれらの培養
物に係る。更に別の角度から見た本発明の目的は、前記
の遠伝子配列、ＤＮＡ発現ベクター、微生物菌株及び細
胞の製造に有用な種々の方法及びその具体例を提供する
ことである。更に本発明は、前記の微生物の発酵培養及
びｌ１ｌｌ胞の培養の調製に係る。

Ａ、定義 本明細用に於いて、［ヒト１１械プラスミノーゲン活性
化因子］又は［ヒ１〜ｔ−ＰＡＪ又はｒ　ｔ−Ｐ　Ａ　
Ｊは、微生物培養系又は細胞培養系により産生され、プ
ロテアーゼ部分を含み月つヒト組織に天然に存在する組
織プラスミノーゲン活性化因子に対応す１７− る生物活Ｖ１形態のと１〜外囚性（組織型）プラスミノ
ーゲン活性化因子を意味する。本発明により産生される
ヒ１へ組織プラスミノーゲン話ｆノ１化囚子タンパクは
、決定されたＤＮＡ！仏子及び推定アミノ酸の配列決定
ににって定義されている。各個体毎に天然の相同変異（
ａｌｌｅｌｉｃ　Ｖａｒｉａｔｉｏｎ　）が存在し及び
／又は発生づることは理解されにう。これらの変異は、
全配ダ１に於（Ｊる１個以１−のアミノ酸の相違、又は
配列中の１個以−１−のアミノ酸の欠失、置換、挿入、
転位もしくは角加によって示される。更にグリ］シル化
の位置及び程度は宿主細胞環境の性質に依存するであろ
う。

１１換ＯＮ△技術を使用して、例えば、基本となるＤＮ
Ａの特定の部位に突然変異を誘発することにより、１個
又は多重のアミノ酸の置換、欠失、イ」加又は転位によ
って種々変性されＩζ種々のヒ］・組織プラスミノーゲ
ン活１ｊ１化囚了誘＞９体を製造することが可能である
。本明細書中で特に説明するヒト組織プラスミノーゲン
活性化因子の一般的特性である必須のクリングル（ｋｒ
ｉｎｇｌｅ　）領域とセリンプロテアーゼ領域とを維持
しているが他の部分は前記の如く変性された誘導体の製
造も可能である。ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子
中の前記の如き相同変巽及び変性は、全て本発明の範囲
内に包含される。更に、ヒト組織プラスミノーゲン活性
化因子の木質的特徴である活性が実質的に維持されてい
る限り、物理的及び生物学的に類似した他の近縁のヒト
外因性（組織型）プラスミノーゲン活性化因子も本発明
の範囲内に包含される。

本発明のヒト組織プラスミノーゲン活性化因子は、 （１）第一アミノ酸としてのメチオニンを有する（構造
遺伝子の手前にＡＴＧ開始コドンを挿入して得られる）
か、又は、 （２）メチオニンがＩＩＩＩＪＪ２１内又は細胞外で開
裂されている場合は、正常の第一アミノ酸を有するか、
又は、 （３）細胞内又は細胞外環境で特異的開裂可能なシグナ
ルポリペプチド又は従来のシグナルポリペプチド以外の
共役タンパク（ｃｏｎｊｕ−ｇａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉ
ｎ　）を伴う（文献２１参照）か、又は、 （４）外来の余分なポリペプチドの開裂が不要な成熟形
態で直接的に発現する。

発現ベクターが組織プラスミノーゲン活性化因子をシグ
ナルペプチドと共に発現すべく設計されており、所与の
宿主がシグナルペプチドを除去又は有効に除去し得ない
場合、特に最後のものが重要である。いずれにしても前
記の如き種々の形態で産生したヒトｔ−ＰＡを回収し、
種々の血管障害又は血管病の治療用に適するレベルまで
精製する。

更に、ｔ−ＰＡには、−重鎖タンパクと二本鎖タンパク
との双方の形態がある。二本鎖タンパクは一本鎖化合物
のタンパク分解により誘導される。

理論的には、二本鎖タンパクは産生線帷素と関連し、タ
ンパク分解による一本鎖物質から二本鎖物質への変換は
プラスミノーゲンからプラスミンへの転換部位で生じる
と想定される。本発明は、前記の如＜　ｉｎ　ｖｉｖｏ
で転換される一本鎖タンパクの投与、及び活性を有する
ことがすでに証明されている二本鎖タンパクの投与の双
方を含む。二本鎖タンパクは、−末鎖物質の産生後にｔ
ｎ　ｖｉｔｒｏタンパク分解変換によって製造され得る
。所謂クリングル領域は、セリンプロテアーゼ部分より
上流に位置しており、本発明の組織プラスミノーゲン活
性化因子を線維素マトリックスに結合させ、これにより
、実際に存在する血栓に対してｌ］織プラスミノーゲン
活性化因子の特異的活性を発揮せしめるために重要な役
割を果す。本発明により製造される組織プラスミノーゲ
ン活性化因子は天然物質に相当する酵素活性部分を含ん
でいる。ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子なる用語
は、このような部分を単独で含むか、又は完全な長さの
分子に達するまでの付加アミノ酸配列と共に含む産生物
と定義される。

要約すれば、本発明によるヒトｔ−ＰＡは、以下の如く
機能的に定義し得る。即ち、ヒトｔ−ＰＡは、プラスミ
ノーゲンからプラスミンへの転換を触媒し得、線維素に
結合し、前記の如き免疫学的特性に基いてｔ−ＰＡと分
類される。従って、ｔ−ＰＡの機能的誘導体は本発明の
範囲内に包含される。

本発明により産生されるヒトｔ−ＰＡの状態を形容すべ
く用いた「実質的に純粋な形態」とは、非組換細胞によ
り産生されたとき即ち「天然」環境で産生されたときと
１〜ｔ−ＰＡに通常伴うタンパク又は伯の物質を含まな
いことを意味する。

ｒＤｌ−ＩＦＲタンパク」とは、ジヒドロ葉酸還元酵素
（ＤＨＦＲ）に関連する活性を有し得、従って、ヒボキ
サンチン、グリシン及びデミジンを含まない培地（−Ｈ
ＧＴ培地）に於いて生存し得る細胞によって産生される
必要があるタンパクを意味する。通常、ＤＩ−ＩＦＲタ
ンパクを欠く細胞は該培地では増殖できないが、Ｄ　Ｈ
Ｆ　Ｒタンパクを有する細胞は該培地で増殖できる。

ｒＭＴＸ感受性細胞」とは、ＤＩ−ＩＦＩＩＩ害剤メト
トレキセート（ＭＴＸ）を含む培地で増殖し得ない細胞
を意味する。従ってｒＭＴＸ感受性細胞」とは、遺伝的
に変化しているか又は伯の方法で補足されていない場合
、ＭＴＸ淵度が０．２μ（Ｊ　／ｍ１以上になると周囲
及び培地が細胞のタイプに適した条件であっても増殖で
きない細胞を意味する。

細菌の如く成る秤の細胞は、ＭＴＸに感受性を示す筈の
Ｄ　ＨＦ　Ｒを含んでいるにも拘らず、細胞膜内部へＭ
ＴＸを透過さ「ないのでＭＴＸ感受性を示さない。一般
に、Ｄ　Ｉ−（Ｆ　Ｒタンパクとして野生型Ｄ　Ｉ−（
Ｆ　Ｒを含む細胞は、ＭＴＸを透過し得るか又は摂取し
得る限り、メトトレキセートに感受性であろう。

［野生型Ｄ　ＨＦ　ＲＪとは、使用する特定生物に通常
見出されるようなジヒドロ葉酸還元酵素を意味する。野
生型ＤＨＦＲは通常ｉｎ　ＶｉｔｒＯで低淵僚のメト１
〜レキセー１〜に感受性である。

ｒＭＴＸに対する結合親和力の低いＤ　Ｉ−Ｉ　Ｆ　Ｒ
タンパク」なる用語も機能的な定義である。これは、細
胞内部で生成されたときには、０．２μｇ／ｍ１以上の
ＭＴＸを含む培地でＭＴＸ感受↑１細胞を増殖せしめる
Ｄ　ＨＦ　Ｒタンパクを意味する。このにうな機能的定
義は、生物のｒＭＴＸに対する結合親和力の低いＤＨＦ
Ｒタンパク」を産生ずる能力及び産生されたタンパク自
体に依存することは明らかである。然しながら、本明細
書中でこの用語を使用する場合には、前記の双方のメカ
ニズム間の平衡は問題にならない。即ち本発明では、前
記の如きＭＴＸレベルで生存する能力を付与することが
操作の目的であり、産生したＤＩ−ＩＦＲ固有の性質に
加えて多量の発現が前記の如き能力を強化したか否かは
重要でない。前記の定義に適合する適当なりＨＦＲタン
パクの例としては、１９８３年１月１９日付出願の米国
特許出願第４５９，１５１号明ｉｌｌ書に開示されたも
のがあり、該特許出願明細書を本明細書中に引用して包
含する。

１発現ベクター」とは、内包するＤＮＡ配列が該配列を
発現させ得る別の配列に有効に（発現し得るように）結
合されている場合、該配列を発現させ得るベクターを意
味する。これらの発蜆ベク２５− ターは、本明細書中必ずしも明確に記述しなくても、宿
主生体中で、エビソームとして又は染色体ＤＮＡに組込
まれた部分として複製可能でなければならない。複製能
が欠如するとベクターは有効に作用し得ない。

要するに、「発現ベクター」なる用語も機能的定義であ
り、内包づる特定のＤＮＡコードを発現させ得る任意の
ＤＮＡ配列も、それが特定の配列に適用されるとき、発
現ベクターと相称され得る。

一般には、組換ＤＮＡ技術で使用される発現ベクターは
、しばしば「プラスミド」の形態にある。

「プラスミド」とは、環状二重鎖ＤＮＡループの呼称で
あり、ベクター形態のときには染色体に結合しない。プ
ラスミドの形態のベクターが最もよく使用されるので、
本明細書中では「プラスミド」及び「ベクター」なる用
語を互換的に使用している。黙しながら、本発明は、勿
論、同等の機能を果ザごとができ当業界で公知となる別
の形態の発現ベクターをも包含する。

「組換宿主細胞」とは、組換ＤＮＡ技術を用いて横組さ
れたベクターで形質転換された細胞を意味づ−る。前記
の如く、このような形質転１φによって多ルのｔ−ｐ△
が産生きれ得る。対照的に形質転１φされていない宿主
を用いるとｔ−ｐ△の産生量は道かに少なく、普通の場
合には検出不能な示でさえある。前記の如き細胞により
産生されたｔ−ｐ△は「組換ｔ−ｐ△」と相称され１ｑ
る。

Ｂ　、宿主細胞及びベクタ一 本発明で用いるベクター及び方法は、広範囲に亘る原核
生物及び真核生物の宿主細胞中での使用に適している。

一般に、本発明に有用′／、【ベクターを構築するため
のＤＮＡ配列のクローン化には原核生物が好ましい。例
えば１．［−２匹旦　１＜１２株２９４（ＡＴＣＣＮ　
ｏ、３１４４６　）が４Ｓｉに有用Ｃある。使用可能イ
１別の微生物菌株として、ｌ”、ｃｏｌｉ１３及び旦、
竺比Ｘ　１７７Ｇ　（ΔＴ　ＣＣＮ　ｏ、３１５３７　
）の如き一一、視し菌株がある。これらは勿論代表例ぐ
あり限定的なものではない。

原核生物は、又、発現のために６使用され得る。

前記の菌株及び旦、剪辻　Ｗ３＋１０　（Ｆ−、λ−。

ブ［ｌトド［］フ、ΔＴ　ＣＣＮ　Ｏ，２７３２５）　
、並びに桿菌類例えばＢａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌ
ｕｓ、　Ｈｌ（ｔびに他の腸内細菌類例えば５ａｌｌｌ
ＩＯｎｏＩｌａ　１ｙｐｈｉｍｌｌｒｉｔｌｌｌｌ又は
５ｅｒｒａｔｉａ　ｌ１ｌａｒＣ（！５ＱｎＳ　、並び
に種々のシコードｔナス種が使用され１！する。

一般には、宿主細胞と適合刊の種から誘導されたレブリ
」ン及び制御配列を含むプラスミドベクターが、宿主と
関連して使用される。ベクターは、通常、複製部位と、
形質転換された細胞中ひの表現型選択を可能にし１ｑる
マーカー配列とを１０持している。例えば、１”、ｃｏ
ｔ：は、典型的には、旦。

００１１種から誘導９されるプラスミドｒｌｌ”３Ｒ３
２２を用いて形質転換される（（３ｏｌｉｖａｒ、　ｅ
ｔ　ａｌ、、　Ｇｃｎｅ。

２　：　９５（１９７７）　）。ｐＢＲ３２２は、アン
ピシリン及びデｌ〜ラザイクリン耐性渭伝子を含んでお
り、従って形質転換された細胞の筒中な同定手段となり
１ｑる。Ｉ）ＢＲ３２２プラスミド又は仙の微生物プラ
スミドは、微生物が自身のタンパクを発現ゴベく使用し
１ｑるプロモーターを含有するか又は含有すべく変ｆ１
されていなりればならない。組換１）　Ｎ△の構築に最
もよく使用されるプロモーターとしては、β−ラクタマ
ーげ〈ペニシリナーゼ）及びラフ１〜−スプロモーター
システム（Ｃｈａｎｇ。

Ｏｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｃ、　２７５：　　６１５
（１９７８）　：　ＩｔａｋＵｒａ。

ａｔ　ａｔ、、　５ｃｉｅｎｃｅ、　１９８　：　１０
５６（１９７７）　；Ｇｏｃｄｄｅｌ、　ｅｔ　ａｌ、
、　Ｎａｔｕｒｅ、　　２８１　　：　　５４４＜１９
７９）　）　、並びにトリプトファン（ｔｒｒｌ）プロ
モーターシステム（Ｇｏｃｄｄｃｌ、　ａｔ　ａｔ、、
　ＮｕｃｌｃｉｃＡ　ｃｉｄｓ　　ＲＯ３，、８：　４
０５７　（１９８０）　：欧州特許出願公開第００３６
７７６ｑ明細書）がアル、、１）Ｌｉａ（７）７ｃ：Ｉ
　モーターが最もＪ：＜使用されるが、他の微生物プロ
モーターｂ発児され口つ利用されており、それらのヌク
レＡヂド配列に関する詳細も既に公表されているため、
当業者はこれらのプロモーターをプラスミドベクターに
機能的に結合し得る（Ｓｉｅｂｅｎｌｉｓｔ、　ｅｔ　
ａｌ、、　　Ｃｅｌ＋、　　２０：　　２Ｇ９（１９８
０）　）。

原核生物以外に、酵母の如き真核微生物の使用も可能で
ある。３　ａｃｃｈａｒｏｍｙｃａｓ　Ｃ（！ｒＯＶｌ
ｓｆｎｅ又は普通のパン酵母が最もよく使用される真核
微生物であるが、多くの仙の菌株も使用され得る。

Ｓ　ａｃｃｈａｒｏｍｙｃａｓ中での発現のためには、
例えばプラスミドＹ　Ｒｐ７　（Ｓ　ｔｉｎｃｈｃｏｍ
ｂ、　ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ。

２８２：　３９　（１９７９）　；　Ｋ　ｉｎｇｓｍａ
ｎ、　Ｃｔ　ａｔ、、　　Ｇｃｎｃ。

＝７：　　１４１　（１９７９）　　：　Ｔ　ｓｃｈｏ
ｍｐｅｒ、　　ｅｔ　ａｔ、、　　Ｑｅｎｅ。

１０　：　　１５７　（１９８０）　）が常用される。

このプラスミドはｔｒｐｉｓ伝子を既に含有しており、
同遺伝子は、トリジ１〜フアン中での増殖能力が欠如し
た酵母突然変異株［例えば、△Ｔ　ＣＣＮ　０．４４０
７６又は　Ｐ　　Ｅ　　Ｐ　　４−１　　（Ｊ　　ｏｎ
ｅｓ、　　Ｇ　Ｃｎｅｔｉｃｓ、８５　：　　１２（１
９７７）　）　］の選択マーカーとなる。従って、酵母
宿主細胞ゲノムの特徴としてのｔｒｐ　１の損傷の存在
は、形質転換をトリプトファンの不在下での増殖によっ
て検出するための効果的なＭ境を提供する。

酵母ベクター中の適当なプロモーター配列として、例え
ば、３−ボスホグリセレー１−キナーゼ（１−ｌｉｔｚ
ｅｍａｎ、　ａｔ　ａｌ、、　　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　　
Ｃｈｃｍ、。

扶し：　２０７３　（１９８０）　）又は他の解糖系酵
素（１−１ｅｓｓ、　ｅｔ　ａｌ。　Ｊ　、　Ａｄｖ、
　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｒｅａ、、　７：１４９　（１９６Ｂ
）　；　ｌ−１ｏ１１ａｎｄ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂ　
ｉｏｃｈｅｍｉｓ−ｔｒＶ、　　１７　：　４９００　
（１９７８）　）に対するプロモーターがある。後者の
例に、エノラーゼ、グリレルアルデヒドー３−ホスフ丁
−］〜デヒドロゲナーげ、ヘキソキナーゼ、ピルベー１
〜デカルボキシラーゼ、ン１＼スボフルク１〜キナーゼ
、グルコース−６−小スフニー１〜イソメラーげ、３−
ホスホグリレリー１ヘムターげ、ピルベー１〜キナーゼ
、トリオースホスフェ−１〜イソメラーげ、ボスボグル
］−スイソメラーゼ及びグルコ４：ナーぜがある。適当
な発現プラスミドを構築Ｊるには、これらの遺伝子に伴
う停車配列を、発現ベクター中で発現したい配列の３′
末端に結合して、ＩＩＩＲＮ　Ａのポリアデニル化及び
停止を行なわせる。増殖条件によって転写が制御される
という付加的利点を右する別のプロモーターどしては、
アルコールデヒドロゲナーげ２、イソチトクロムＣ１酸
性ボスファターゼ、窒素代謝に関連する分解酵素、前記
グリセルアルデヒド−３−ホスフェ−１〜デヒドロゲナ
ーゼ並びにマルトース及びガラクトースの資化に関係す
る酵素（１−１ｏ　ｌ　１ａｎｄ。

」−掲）に対するプロモーター領域がある。酵母適合性
のプロモーター、複製のオリジン及び停止配列を含むい
かなるプラスミドベクターも適当に利用できる。

微生物以外に、多細胞生物から誘う９された細胞も宿主
として使用し得る。原則として、このような細胞はＹ１
稚動物又は無をＭ［＠物のいずれから得てもよい。黙し
ながら、を椎動物細胞の方が右利であり、近年では組織
培養でのを椎動物細胞の増殖がルーチンプロセスになっ
ている（　Ｔ　１ｓｓｕｅＣｕｌｔｕｒｅ、　Ａｃａｃ
ｌｅｍｉｃ　ｐｒｅｓｓ、　Ｋ　ｒｕｓｅ　ａｎｄＰａ
ｔｔｅｒｓｏｎ、　　（１９７３）　）　。前記の如き
有用な宿主細胞のセルラインの例どして、ＶＥＲＯ及び
ｌ−１ｅｔ−ａｌＴＩ胞株、ヂャイニーズハムスターの
卵巣（ＣＨＯ）セルライン並びにＷ　１３ｇ、　Ｂｌ−
ＩＫ。

３３− ＣＯＳ−７及びＭＤＣＫセルラインがある。前記の如ぎ
ｍ胞のための発現ベクターは、通常、（必要に応じて）
複製のオリジン、発現すべき遺伝子の前方に位置するプ
ロモーター、任意のリポソーム結合部位、ＲＮＡスプラ
イス（ｓｐｌｉｃｅ）部位、ポリアデニル化部位及び転
写終了配列を必要なものとして含む。

浦乳動物ＩＴＩ胞中で使用する場合、発現ベクターに対
する制御Ｔ１機能は、しばしば、ウィルス性物質によっ
て与えられる。例えば常用のプロモーターは、ポリオー
マウィルス、アデノウィルス２から誘導され、更に多く
の場合ザルウィルス４０（Ｓ　１ｍ１ａｎ　Ｖ　１ｒｕ
ｓ　４０．　３　Ｖ２Ｏ）から誘導される。

ＳＶ４０ウィルスの初期（ｅａｒｌｙ　）プロモーター
及び後期（ｒａｔｅ）プロモーターが特に有用である。

これは、いずれもＳＶ４０ウィルスの複製のオリジンを
併せて含む断片として、ウィルスから容易にＡ 得られるからである（　ＦｉｅｒＳ、　ｅｔ　ａｌ、、
　Ｎａｔｕｒｅ。

２７３　：　　１１３　（１９７８）参照）。断片がウ
ィルスの複製のオリジン中に位置するＢ（ＩＩＩ部位に
向ってｌ−１ｉｎｄｌ［部位から伸びる約２５０　ｂｐ
の配列を含む限り、ＳＶ４０断片の長さの長短は問わな
い。更に、所望の道伝子配列が通常伴っているプロモー
ター又は制御配列の使用も可能であり、このような配列
の使用が好ましい場合もしばしば見られる。但し、前記
の如き制御配列は宿主細胞系と適合しなければならない
。

複製のオリジンは、ＳＶ４０又は他のウィルス（例えば
ポリオーマ、アデノ、ＶＳＶ、ＢＰＶ等）起源から誘導
され１ｑる外来性オリジンを含むようにベクターを構築
して得てもよく、又は宿主細胞染色体複製メカニズムに
よって得てもよい。ベクターが宿主細胞染色体に組込ま
れる場合は、後者が良い場合もしばしばある。

ｔ−ｐΔ及びＤ　Ｉ−Ｉ　Ｆ　Ｒタンパクの双方を］−
ドしているＤＮＡ配列を含む本発明のベクターによって
トランスフェクションを行なう好ましい宿主細胞を選択
覆る際には、使用するＤ　＋−Ｉ　Ｆ　Ｒタンパクのタ
イプによって宿主を選択するのが適当である。

野生型Ｄ　ＨＦ　Ｒタンパクの場合には、Ｄ　ＨＦ　Ｒ
が欠如した宿主細胞を選択し、これにＪ：す、ＤＨＦＲ
コード配列を、ヒポキリ〜ンヂン、グリシン及びチミジ
ンを含まない選択培地でのトランスフェクションの成功
を示すマーカーとして使用するのが好ましい。この場合
の適当な宿主細胞としては、Ｄ　Ｉ−Ｉ　Ｆ　１１活性
が欠如したヂャイニーズハムスター卵巣（ＣＩ−１０）
セルラインがある。該セルラインは、ＩＪ　ｒｌａｕｂ
及びＣｈａｓｉｎ、　　Ｐ　ｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　　（ＵＳＡ）、　
７７：４２１６（１９８０）に記載の方法で調製され増
殖さ＋ｉｌｃものである。該文献を引用して本明細書中
に包含する。

他方、ＭＴＸに対する結合親和力の低いＤ　Ｉ−Ｉ　Ｆ
　Ｒタンパクを制御配列として使用する場合には、［）
ｌ−ＩＦＲ耐性細胞を使用する必要がない。

突然変異［））−ＩＦＲはメトトレキセートに耐性であ
るから、宿主細胞自体がメトトレキセート感受性であれ
ば、ＭＴＸ含有培地を選択の手段として使用し冑る。Ｍ
ＴＸを取込み得る多くの真核細胞はメトトレキセート感
受性であると考えられる。このような有用なセルライン
の１例として、Ｃｌ−１０株、ＣＨＯ−ＫＩ　　ＡＴＣ
ＣＮｏ、ＣＣｌ−６１がある。

後述の実施例では、ｔｒｐプロモーターシステムを用い
る旦−８姐紅の使用、宿主細胞としてＣＨＯＩＩｌ的の
使用、及びプロモーターとしてのＳＶ４０の複製のオリ
ジンを含む発現ベクターについて記載する。黙しながら
、原核生物又は真核生物宿主細胞の培養物中で所望のタ
ンパク配列を発現する発−９７− 現ベクターをＭ６築するために類似の技術を使用するこ
とは当業界で十分に公知の事実である。

Ｃ１使用方法 堅固な細胞壁障壁を持たない細胞を宿主細胞として使用
するときは、トランスフェクションは、Ｇ　ｒａｈａｍ
及びＶａｎｄｅｒ　　Ｅｂ、　　ｖｉｒｏｌｏｇｙ、　
　５２：５４６　　（１９７８）に記載のリン酸カルシ
ウム沈澱法で行なわれる。然しながら、ＤＮＡの細胞内
導入のためには、核注入又はプロ１〜プラスト融合の如
き他の方法も使用し得る。

原核細胞又は堅固なｍ膣壁１［９壁を有する細胞を使用
するとき、好ましいトランスフェクションの方法は、Ｆ
、　Ｎ、　Ｃｏｈｅｎ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　　（ＵＳＡ）
、６９：２１１０（１９７２）に記載の塩化カルシウム
を用いたカルシウム処理である。

所望のコード配列及び制御配列を有する適当な３８− ベクターの構築には、標準的な結合方法を使用する。単
離されたプラスミド又はＤＮＡ断片を開裂し、末端処理
し、所望形態で再結合して所要プラスミドを形成する。

開裂を行なうためには、適当な緩衝液中で１種（又は複
数種）の制限酵素で処理する。一般には、約１μｇのプ
ラスミド又はＤＮＡ断片に対し約１ユニツトの酵素を含
む緩衝溶液的２０μｍを使用する（特定の制限酵素に対
する適正な緩衝液及び基質量はメーカーによって処方さ
れている）。インキュベーション時間は３７℃で約１時
間である。インキュベーション後、フェノール及びクロ
ロホルム抽出でタンパクを除去し、エタノール沈澱によ
り水性画分から核酸を回収する。

平滑末端が必要な場合、生成物を１０ユニツトのポリメ
ラーゼＩ　（Ｋ　Ｉｅｎｏｗ　）により１５℃で１５分
間処理し、フェノール−クロロホルム抽出し、エタノー
ル沈澱する。

開裂した断片のサイズによる分離は、Ｄ。

Ｇｏｅｄｄｅｌ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　
　Ａｃ、ｉｄｓ　　Ｒｅｓ、、　８：４０５７　（１９
８０）に記載された６％ポリアクリルアミドゲルを用い
て行なう。この文献を引用して本明細書中に包含する。

結合を行なうためには、正しく整合すべく末端を適当に
処理したほぼ等モル量の所望成分を、０．５μｑのＤＮ
Ａに対し約１０ユニツトのＴ４ＤＮＡリガーゼで処理す
る。（開裂されたベクターを成分として使用する場合、
開裂されたベクターの再結合を阻止するために細菌のア
ルカリ性ホスファターゼによる予備処理を行なうとにい
。）構築したプラスミドの正しい配列を確認すべく行な
う解析のためには、結合混合物を用いてＥ。

阻■　Ｋ１２株２９４（ＡＴＣＣＮｏ、　３１４４６）
を形質転換し、適当な性質例えばアンピシリン耐性を利
用して所望の形質転換株を選択する。形質転換株からプ
ラスミドを調製し、制限解析し及び／又は配列決定する
（Ｍｅｓｓｉｎｇ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ　　Ｒｅｓ、、　９：　　３０９（１９８１
）又はＭａｘａｍ、　ｅｔａｔ、、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　
ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　　６５：　　４９９（
１９８０）　）。

ＤＨＦＲタンパクをコードしている配列の増幅を行なう
には、ＤＨＦＲ活性の競合阻害剤であるメトトレキセー
トを温度約２０−５００，０００　ｎＭで存在させて宿
主細胞を増殖させる。有効濃度範囲は、勿論、Ｄ　ＨＦ
　Ｒ遺伝子の性質、タンパク及び宿主の特性に依存する
。従って、上記の上限値及び下限値は確定値ではない。

ＤＨＦＲを阻害し得る他の葉酸類又は他の化合物を適正
濃度で使用することも可能である。然しながらやはりＭ
ＴＸが便利で入手し易く有効である。

Ｄ、好適具体例の概説 ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子を以下のように製
造した。

１、組織プラスミノーゲン活性化因子を有効に産生ずる
ヒトメラノーマ細胞をコンフルエン１〜な状態（ｃｏｎ
ｆ　１ｕｅｎｃｙ　）になるまで培養した。

２、リボヌクレアーゼ阻害剤の存在下で前記の細胞培養
物から得た細胞ペレットを抽出し細胞質ＲＮＡ全部を単
離した。

３、オリゴ−ｄＴカラムを用い全メツセンジャーＲＮＡ
　（ｍＲＮＡ）をポリアデニル化形態で単離した。酸性
尿素アガロースゲル電気泳動にかけてｌｌｌＲＮＡをサ
イズ分画した。

４、組織プラスミノーゲン活性化因子特異的ＲＮＡを含
むゲル画分を以下の方法で同定した。即ち、各ゲル画分
のＲＮＡをイヌのスイ臓ミクロソームを補充したウサギ
網状赤血球ライゼート（Ｉｙｓａｔｅ）系中ｔｎ　ｖｉ
ｔｒｏで翻訳しｋｎ　ｉｒＩられた翻訳産物を次にヒト
組織プラスミノーゲン粘性化因子特異的ｒ（ＩＧ抗体で
免疫沈降した。

５、適当なＲＮＡ（２１乃至２４Ｓ）を対応する一重鎖
相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に転換し、該ｃＤ　Ｎ　Ａから
二重鎖ｃＤＮΔを製造した。

ポリ−ｄＣを末端につなぎ、１種以上の表現型マーカー
を含むプラスミドの如きベクター内に挿入した。

６、前記の如く調製されたベクターを使用して細菌細胞
を形質転換し、クローン化ｃＤＮΔライブラリーを調製
した。ｔ−ｐＡ中の既知のアミノ酸配列のコドンと相補
的な放射混性標識−合成デオキシオリゴヌクレオヂドの
プールを調製しコロニーライブラリーのプローブに用い
た。このＪζうなプールの例として、例えば、（既知（
後記）のアミノ酸配列ニトリブトファン−グルタミン酸
−ヂ「１シン−システィン−アスパラギン酸（Ｗ　−Ｉ
Ｅ−Ｙ−Ｃ−Ｄ　）をコード覆る配列と相補的な）８種
の１４ヌクレＡヂド体（１４−ｍＣｒ）　、５’　−ｄ
ｉ’　Ｃ（Ａ）　ＣＡ（Ａ）ＴＡ　（０）ＴＣＣＣＡ−
３’のプールがＧ　　　　　　　　　　　Ｔ ある。

７、ポジティブな（ブ［Ｊ−ブに対して陽４ノー反応を
示した）ＣＩ）ＮΔクローンからプラスミドＤＮＡをｉ
ｌｌ離し配列決定した。

８、次に、配列決定したＤＮＡを適当な発現ベクターに
挿入覆べく　ｉｎ　ｖｉｔｒＯで末端処理し、該発現ベ
クターを適当な宿主細胞に形質転換し、宿主細胞をｊ８
養により増殖させ、所望のヒ１〜組織プラスミノーゲン
活牲化因子を産生さｌた。

９、前記の如く産生されたヒ１〜組織プラスミノーゲン
活性化因子は、セリンプロテアーゼ酵素部分に約２５１
個のアミノ酸を右しており、その上流にクリングルを含
む配列を有する。現在では該配列が線雑素結合の主因で
あると理解されている。成熟タンパク及びそのシグナル
プレ配列とは全部で５６２個のアミノ酸を含む。

前記の方法にＪ：って実質的に純粋なｔ−ＰＡを産生じ
得る。メ１〜トレキセ−１・感受性の付加的コード配列
を用いる本発明方法によれば、抗原的に活性なｔ−ＰＡ
タンパクを、宿主細胞の培養物中で１日に細胞当り　ｏ
、ｉｐｇより多い舟で産生しくｑる。適当な増幅条件を
使用すると、２０１）ｆｌより多い固を得ることも可能
である。換言すれば、９×１０Ｐｌｏｕｇｈユニツ１〜
より多いか、又は適当な増幅によって１８ｘ　１０　’
　Ｐ　ｔｏｕｇｈユニツ１−Ｊ：り多いｔ−ＰＡ活性を
産生するＪ：うな遺伝子発現レベルが達成される。

この点に於いて、本発明では、桑剤としてメ１−１−レ
キセードを用いる。メ１〜１へレキセー１〜は、これを
摂取し得るｌｌ１１１１２［には普通致死性を有するが
、制御されたＭＴＸレベルではｌ）　ｌ−Ｉ　Ｆ　Ｒ１
−ド配列を］−ドしでいる遺伝子の１１り幅により細胞
が１１１殖することを可能にするという性質を有してい
る（　Ｓ　ｃｈｉＩｌｌｋｅ、王、　Ｒｏｂｅｒｔ、　
ｅｔ　ａｔ、、　　３ｃｉｃｎｃｃ。

２０２　　：　１０５１　（１９７８）　　：　Ｊ、　
　Ｌ、　１３ｉｅｄｌｃｒ、　ｅｔ　ａｌ、。

Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、、　　３２：　　１５３Ｎ９７
２）　　；Ｓ、　　Ｆ。

Ｃｌ１ａｎ（１，ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｅ１ｌ、ユニ　　
３９１　（１９７Ｇ）参照）。

本発明のこの点の重要ｆ／ｌは、Ｄ　ＨＦ　Ｒ遺伝子の
増幅が、他のタンパクをコードしている関連配列の増幅
をも生起し得ることにある。関連タンパクが、Ｂ型肝炎
表面抗原（＋−Ｉ　Ｂ　ＳΔｇ）ＬＪ。

Ｃｈｒｉｓｔｍａｎ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　
　Ｎａｔｌ、　　Ａｃａｄ。

３　ｃｉ、、　　則：　１８１５　（１９８２）　）　
、旦、竺■タンパクＸＧ　ＰＲＴ　（Ｒｉｎｇｏｌｄ、
　Ｇｏｒｄｏｎ、　ｅｔ　ａｌ、、　　Ｊ　。

Ｍｏ１ｅｃ、ａｎｄ　　ＡＩ）Ｉ）Ｉ、　　　Ｇｅｎ、
、１：　　ＩＧ５（１９８１））　　、及び結合ＤＩ−
ＩＦＲ／ＳＶ４０プラスミド由来内在性配列（Ｒ，Ｆ、
　Ｋａｕｆｍａｎ、　ｅｔ　ａｔ、、　Ｊ９Ｍｏ！ｅｃ
。

Ｂ　ｉｏｌ、、　１５９　：　　６０１　（１９８２）
　）の場合に、前記の増幅現象が生じる。

メ１〜１へレキセード耐性を！ｊえる別のメカニズムは
、メト）〜レニ１−レートに対するＤ　ｌ−Ｉ　Ｆ　Ｒ
タンパクの結合親和力の低下従ってメ）〜トレキセー１
へ感受性の低下を含む（Ｗ、　Ｆ　、　Ｆ　１ｉｎｔｏ
ｆｆ、　ｅｔ　ａｔ、。

３ｏｍａｔ、　Ｃｅ１ｌ　ＧＯｎｅｔ、、　２：　２４
５　（１９７Ｇ）　）　。しかしこの場合にも増幅は同
様に生じるであろう。

野生型Ｄ　１１　Ｆ　Ｒ１及び白身の結合親和力の低下
ににすＭＴＸ耐性になっているＤＨＦＲに対する遺伝子
は、どちらもＭＴＸの存在により増幅されるようである
。即ち、基本的に、本発明は、ＭＴＸの存在下で、又は
形質転換された細胞をＭＴＸで予備処理することにより
、ｔ−ＰＡ配列の発現レベルを向上せしめる制御メカニ
ズムを得るために、Ｄ　ＨＦ　Ｒ配列の増幅が関連タン
パクをフードしている配列に与えるインバク１−を利用
している。

Ｆ、実施例 以下の実施例は本発明の代表例として示されたものであ
り限定的な性質を持たない。以下に記載の実施例に於い
ては、［、ｃｏｌｔ細胞及び導入されるＤ　ｌ−Ｉ　Ｆ
　Ｒタンパクのコード配列の型に適したＣ　ＨＯセルラ
インを宿主細胞として使用した。黙しながら、他の真核
細胞及び原核細胞も同様に本発明方法に適している。

Ｆ、１．Ｅ、　ｃｏｌｉでのヒトｔ−ＰＡ逍伝了の発現
Ｅ、１．Δ０図の説明 第１図は、プロテアーゼインヒビター、アプロチニンの
存在下（レーンｂ）又は不在下（レーンａ）で、ヒトメ
ラノーマ細１１１，４から３時間のパルス５ の間にｉｎ　ｖｉｖｏで分泌され免疫沈降させた［　　
Ｓ］−メヂオニンで標識された（　１種以上の）タンパ
クを示す１０％ＳＯＳアクリルアミドゲルのオートラジ
オグラムである。組織プラスミノーゲン活性化因子特異
的［ＩＧによる免疫沈降後、分子量約６５．０００．６
３，０００及び３５，０００を有する３つのバンドが観
察されたくレーンａ）。然しながら、プロテアーゼイン
ヒビターの存在下では、分子ｉ’Ｇ３５，０００の種は
観察されなかった（レーンｂ）。免疫前血清を使用する
といかなる産生物も免疫沈降しなかった（レーンＣ）。

標準物質として使用した１４Ｃで標識したタンパクの移
動及び分子量をレーンａの左方に示す。即ち、２００，
０００　　ミオシン（１」鎖）　；　　９２，５００　
　ホスホリラーゼＢ：　　６８，０００牛血漬アルブミ
ン：　　４３，０００　　オバルブミン（ｏｖａｌｂｕ
ｍｉｎ　）　：　　２５，７００　　ａ−キモトリプシ
ノーゲン：　　１ｇ、４００　　β−ラクトグロブリン
。

４９− 第２図は、酸性尿素アガロースゲルからり１離されたＲ
ＮＡ画分を翻訳した産物の免疫沈降物をゲル電気泳動に
かｆ、Ｊた結果を示？ｉｏイヌのスイ臓ミクロソームの
存在下で翻訳後に１１織プラスミノーゲン活性化囚子特
巽的ｒ（ＩＧで免疫沈降するど画分Ｎ０１７及び８で主
バンドが観察された。このバンドは分子量約６３．Ｏ’
ＯＯダル１〜ンを右する。両分ＮＯ，７及び８に移動づ
るｍＲＮＡのサイズは約２１乃至２４Ｓである。ＲＮΔ
尿素ゲル電気泳動後に決定され目つ見易いように臭化エ
ブジウムで染色されたリボソームＲＮＡマーカーの位置
が適当なゲルレーンの上方に示されている。

第３図は、３２Ｐ−ｄＴ“Ｃ（Ａ）ＣＡ（Ａ）ＴΔＧ　
　　　　Ｑ （０）ＴＣＣＣＡ　（Ｗ−Ｅ−Ｙ−Ｃ−Ｄ）プローブを
用いた９６個のコロニーのハイブリダイゼーションパタ
ーンを示す。９６個の形質転換株の各々をマイクロタイ
タープレー１〜上で増殖させ、レプリ力平板法で処即し
、ニトロセルロース膜上で増殖させた。次にコロニーを
溶解し、細菌性ＤＮＡを固定し、フィルターを　Ｐ−１
４ヌクレオチド体（Ｗ−Ｅ−Ｙ−Ｃ−Ｄ）プローブとハ
イブリダイズした。フィルターを洗浄してハイブリダイ
ズしなかったプローブを除去し、Ｘ線フィルムに露光し
た。このオートラジオグラムは４８個のフィルター（４
６００個の独立コロニー）の各々によって得られたパタ
ーンを示す。Ｎ　Ｏ，２５のフィルター上のポジティブ
な組織プラスミノーゲン活性化因子ＣＤＮＡを有するク
ローンの例を「１０（矢印）で示す。

第４図は、全長（ｆｕｌｌ　ｌｅｒ＋ｏｔｈ　）ヒト組
織プラスミノーゲン活性化因子ＣＤ　Ｎ　Ａの制限エン
ドヌクレアーゼマツプである。制限エンドヌクレアーゼ
開裂により生成した断片の数及びサイズの測定には、６
％アクリルアミドグル雷気気泳動用いた。

（第５図の）核酸配列にＪ：つて部位の位置を確認した
。最大のオープンリーディングフレーム（ｏｐｅｎ　ｒ
ｅａｄｉｎｇ　ｆｒａｍｅ、停止］トンに至るまでの最
良のＤＮＡ配列）のコード領域を長方形で示し、斜線領
域は推定されるシグナルペプチド配列を示す。点描領域
は推定される成熟組織プラスミノーゲン活性化因子配列
（５２７個のアミノ酸）を示す。

ｍＲＮＡの５′末端は左方、３′末端は右方に示す。

第５ａ、５ｂ及び５０図は、全長ヒト組織プラスミノー
ゲン活性化因子ｃＤＮ△のヌクレオチド配列及び推定さ
れるアミノ酸配列を示す。成熟配列に先行する３５個の
アミノＭ（−３５乃至−１）は連続した配列として示さ
れている。この３５個のアミノ酸配列は、成熟タンパク
のセリン（＋１）に先行する約１２乃至１５個のアミノ
酸の親木性゛プロ゛′配列を含み、該プロ配列の前にパ
従来の″疎水性シグナルが存在する（５′末端から−３
５まで伸びる）。分泌されたタンパクに於けるこの種の
プレープロ構造は、既に、例えばプレプロアルブミンに
関して記載されている。この理論に基く場合、分泌され
た組織プラスミノーゲン活性化因子の分子は全て、アミ
ノ末端としてのセリン（＋１）から始まるであろう。第
２のＩＩＩ！論によれば、親水性配列が組織プラスミノ
ーゲン活性化因子の機能に関与すると考えられており、
この機能は、ｉｏ、ｏｏｏダルトンのペプチドが天然プ
ラスミノーゲンのアミノ末端部分（アミン末’１ｍ’７
５基に因んで名付りられたＧｌｕ−プラスミノーゲン）
から開裂されて、ＬＶＳ−プラスミノーゲンとよばれる
新しいアミン末端を有するより小さい分子となるときに
プラスミノーゲンで観察されるのと同様な機能であると
考えられる。

Ｌｙｓ−プラスミノーゲンは、Ｑｌｕ−プラスミノーゲ
ンよりも活性化されてプラスミンになり易く、また線維
素に対する親和力もより大きい。プラス−５９− ミンはＱｌｕ−プラスミノーゲンからＬｙｓ−プラスミ
ノーゲンへの転換を触媒することが判明している。この
種のコントロールメカニズムはパポジティブフィードバ
ック″メカニズムとなる。最初に形成されたプラスミン
は、線維素を分解し同時に天然プラスミノーゲンよりも
活性化し易く基質により堅く結合し易いプラスミノーゲ
ン分子を生成する。その結果、線維素の分解が促進され
る。組織プラスミノーゲン活性化因子の親水性ペプチド
は同様なメカニズムににす、その開裂によって線雑素へ
の酵素の結合を修飾し得る。いずれにしても、３５個の
アミノ酸配列は、成熟タンパクのプレ配列と考えられる
。

第６図は、組織プラスミノーゲン活性化因子発現プラス
ミドｐΔｒｔｌＰΔ°の構築を示す概略説明図である。

出発プラスミドｐＰΔ２５Ｅ　１０を先ずｐｓＢで消化
して３７６　ｂｐ断片を単離し、次に該断５４− 片を図示の如く消化する。

第７図は、ｐΔＲＩＰＡ°によって形質転換された細胞
中で１ｑられた発現産物の線麓素溶解能のフィブリンプ
レートアッセイの結果を示す。

第８図は、（本発明の）組織プラスミノーゲン活性化因
子トリプシン消化によるペプチドのＨＰＬＣ（高速液体
クロマトグラフィー）トレース（２１０ｎｍに於（プる
吸収）を示す。矢印は、コロニーライブラリーに用いる
ヌクレオチドプローブを設計すべく使用されたペプチド
に対応するピークを示す。このピークで示されるペプチ
ドの完全配列は、Ｌ−Ｔ−Ｗ−Ｅ−Ｙ−Ｃ−Ｄ−Ｖ−Ｐ
−８−Ｃ−８−Ｔ−Ｃ−Ｇ−１であることが知見された
。ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子の正しいアミノ
酸配列を確認すべく、他の主たるピークの配列も同様に
して決定され知見された。アミノ酸を示すペプチドの文
字コードを以下に示す。

５５− Ａ５ｐ　　　Ｄ　　　アスパラギン酸 （Ｉｅ　　　［イソロイシン Ｔｈｒ　　　Ｔ　　　スレオニン １−ｅｕ　　　Ｌ　　　ロイシン Ｓｅｒ　　　Ｓ　　　セリン Ｔｙｒ　　　Ｙ　　　ヂロシン ＧＩＬＩ　　　Ｅ　　　グルタミン酸 ｐｈｅ　　　Ｆ　　　フェニルアラニンｐｒｏ　　　Ｐ
　　　プロリン Ｉ」ｉｓ　　　）−１ヒスデシン Ｇｌｙ　　　Ｇ　　　グリシン ＬＶＳ　　　Ｋ　　　リジン ＡＩａ　　　Ａ　　　アラニン Ａｒ！］　　　Ｒアルギニン ｃｙｓ　　　ｃ　　　システィン Ｔｒｐ　　Ｗ　　トリプトファン ＶａＩ　　Ｖ　　バリン ５６− Ｑ＋ｎ　　　Ｑ　　　グルタミン Ｍｅｔ　　　Ｍ　　　メチオニン ＡＳｎ　　　Ｎ　　　アスパラギン トリプヂツクペプチド解析（ｔｒｙｐＮｃ　ｐｅｐｔｉ
ｄｅａｎａｌｙｓｉｓ）用のサンプルは以下の如く調製
した。

ｉｍｇのｔ−Ｐ　Ａを１００倍容の１％ＮＨ４ＨＣＯ３
に対して透析し、凍結乾燥した。乾燥サンプルに、尿素
０．３６１（１、Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ溶液（Ｎ　ａ２Ｅ　Ｄ
　Ｔ　Ａ　５０＋１１！＋／１＋１１）　　０．０３ｍ
１　、ｔ−リス緩衝液（１００ｍｌ中に１７．３（ｌの
トリス塩基及び２９．７ｍｌの１Ｎ　　ＨＣＩを含有す
る）　　０．３１１１１及び２−メルカプトエタノール
０．０１ｍ１を添加した。

ＨＯを添加して容積をＱ、７５ｍ１に調整し、すンプル
を１ｍｌの気密性バイアルに入れた。バイアルを８Ｍ尿
素で」口端部に５０μｍの空間を残すように充填し、乾
燥Ｎ　で置換し、密封した。室温で４時間インキュベー
トし、５０μｍのヨード酢酸５７− （ＩＮ　　Ｎａ　０ｆ−ｌ中５４０１１１０　／１＋１
１＞を添加し、暗所で１５分間インキュベートした。次
いで、１％Ｎ　Ｈｌ（Ｇ　Ｏを含浸しフォイルで包んだ
３ Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｐ　Ｄ−１０カラムにかり、タンパ
クを含有する両分を集めた。（ＤＰＣＣ処即した）トリ
プシンをｔ−ＰＡに対して［１比ｉ　：　ｉｏｏで添加
し、３７℃で１６時間インキコベー１〜した。次いでサ
ンプルを凍結した。５ｙｎｃｈｒｏｎ　ＲＰ−４カラム
逆相クロマトグラフイーを使用して３　ｐｅｃｔｒａ　
　Ｐ　ｌ＋ｙｓｉｃｓＳＰ　８０００１−ＩＰＬＣ系で
ＨＰ　Ｌ　Ｃ解析した。０．１％トリフルオロ酢酸水溶
液中アレ１−二ｌ−リル密度勾配（０〜７０％）を使用
してペプチドを溶出した。

２１０ｎｍ及び２８０ｎｍに於ける吸収をモニターした
。

第９図は、Ｅ、ｃｏｌｉでの成熟ヒト組織プラスミノー
ゲン活性化因子の直接発現をコードするプラスミドの構
築を示す。５０μＱのプラスミドｐｐ　Ａ　１７を１規
３Ａ　Ｉ　、比組ｃ［及び比匝■で消化し、６％ポリア
クリルアミドゲル電気泳動にか【プた。約０．５μｇの
５５　ｈｐ江３ＡＩ−比胚■断片を回収した。同様にし
て、８０μｇのプラスミド１１１ＰΔ２５Ｅ１０から先
ず３００　ｂｐｐｌ　−Ｎ　ａｒＩ断片を単１］シ次に
この断片をｌ−１ｈａＩで消化することにより約３μｑ
の２６３　ｂｐ　ｌ−１ｈａＩ　　Ｎ　ａｒＩ断片を精
製した。全ての消化は３７℃にて１時間を要して行なわ
れ、反応産物を溶解し、６％ポリアクリルアミドゲルか
ら電気溶出した。図示の２種のデオキシオリゴヌクレオ
チド５’ｄＡＡＴＴＣＡＴＧＴＣＴＴＡＴＣΔΔＧＴ（
Ｉ）と５　ｄ　ＧＡＴＣＡＣＴＴＧＡＴＡＡＧＡＣＡＴ
Ｇ　（ＩＩ）とを固相ホスホ１〜リエステル法により合
成したく文献５１参照）。

６０　ｍＭの１へリス＜　Ｉ）Ｈ８）、１０ｍＭのＭｇ
Ｃｌ□　、１５　ｍＭのβ−メルカプトエタノール及び
５０μＣｉの［７Ｐ］△Ｔ　Ｐ　（Ａ　ｍｅｒｓｈａｍ
、　　５，０ＯＯＣｉｍｍｏド１）を含む３０μｍの反
応容量中で１００ｐ１００ｐのオーリゴヌクレＡヂド■
をリン酸化し、１２ユニットのＴ４ポリヌクレオチドキ
ナーゼを添加し、３７°Ｃで１５分間反応さμだ。次に
、１ｆ１１の１０　ｍＭΔＴＰ及び１２ユニツトのＴ４
−１プーゼを添加し更に３０分間反応さけた。フェノー
ル／Ｃｌ−１ｃＩ３　抽出後、リン酸化オリゴマー■及
び５′−ヒドロキシオリゴマー■を、０．５μｑの溶出
５５１月）３ａｕ３△ｌ−１−１ｈａＩ断片及び２μ０
の２ｆ３３　ｂｌｌ比匝Ｔ−頌ａｒＴ断片と合せてエタ
ノール沈澱した。

これらの断片を、２０　ｍＭの１へリス−１−ＩＣＩ　
　（１’１１−１７．５）　、１０　ｍＭのｆｖｌｏｃ
Ｉ　　、１０ｍＭのジヂオスレイトール、　０．５　ｍ
ＭのＡＴＰ及び１０００−’１　二ｙ　ｌ”のＴ４　Ｄ
ＮＡリガーゼを含む６０μｍの反応液中で、室温にて４
時間を要して結合した。混合物を、４８　　　　　＼コ
ニットの１ａｒＩ、２０ユニツ１〜のＩＥｃＯＲＩ及び
４０ユニツトのＢｏｌｌＴで１時間消化して（粘着性５
ａｕ３ＡＩ末端相互の結合にＪ、る手合を田止し）、６
％ゲル電気泳動させた。３３８　ｂｌ）の産物（約０．
１μｑ）を電気溶出によって回収した。プラスミドｐＰ
Δ２５Ｅ１０を又払■及びＢｇｌｌｆにより消化して、
１６４５１μ１１断片としてｔ−ＰＡコード配列の残部
（アミノ酸１１１−５２８）を単離した。プラスミドｐ
ｌ−ｅ　Ｉ　Ｆ　Ａ　ｔｒｐ　１０３は、ＬｅｌＦＡ遺
伝子に対して遠位のＥＣｏＲＩ部位が除去された（文献
５３）プラスミド＋）ｌｅＴＦ△２５の誘導体く文献５
２）である。３μＱのｐｌ−ｅ　ＩＦ　Ａ　ｔｒｐ　１
０３を、２０ユニツトのＥｃｏＲＩ及び２０ユニツトの
ＢＣＩＩＩＩを用いて３７℃で９０分間消化し、６％ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動し、大きい（〜４，２０
０　ｂｐ）ベクター断片を電気溶出にＪ：って回収した
。最終的な構築のために、８０ｎｇのＥｃｏＲＩ　−Ｂ
ＵＩＩＴｐｌ−ｅ　Ｉ　Ｆ　Ａ　ｔｒｐ　１０３断片を
、１１００ｎの１６／１５　ｂｐｌＱａｒＪ−凪■断片
及び２０ｎａの３３８　ｂｐ　Ｅ　ｃｏＲＩ−Ｎａｒ工
断片と、室温で１０時間かけて結合した。

−６１− この結合混合物を用いてｌ’１．ｃｏｌｉ　　Ｋ−１２
株２９４を形質転換した。３８個の形質転換株からプラ
スミドＤＮＡを調製しｌ”ｃｏＲＩで消化した。このう
ち１０個のプラスミドが所望の６００　ｂｐ及び４７２
１）ｐＥＣＯＲＩ断片を含有していた。ＤＮＡ配列解析
にＪ：り確認覆ると、これらのプラスミドの１つ（ｐｔ
−ｐＡ匡Ｌ１２）が圧プロモーター、合成りＮＡ及びｃ
ＤＮＡ間の接合部に所望のヌクレオチド配列を有してい
た。

第１０図は、本発明の組織プラスミノーゲン活性化因子
発現産物の線紐素溶解能のフィブリンプレートアッセイ
の結果を示す。５１１ｇ７ｍ１のテトラザイクリンを含
むルリアブロス（ｌ　ｕｒｉａ　ｂｒｏｔｈ）で　１晩
培養した旦−０剪■　Ｗ３１１０／ｐｔ　−Ｐ　Ａ　ｔ
ｒｐ　１２を、０．２％のグルコース、０．５％のカザ
ミノ酸及び５μｇ／ｍｌのテトラザイクリンを含むＭ９
培地中に１：　　１００に希釈した。細胞を６２− ３７℃でＡｏ、２になるまで増殖させ、インド−５５０ ル酢酸を最終）Ｃ１度が２０μ（＋　／ｍｌになるまで
添加した。遠心によりザンプルを０．５−０．６（〜２
Ｘ１０”細胞／１）のΔ５５０　　で採取し直ちに凍結
した。細胞ペレットを６Ｍの塩酸グアニジンに５Ｘ１０
”細胞／ｍｌで懸濁させ、１０秒間超音波処理し、２４
℃で３０分間インキュベートし、次いで２５ｍＭのトリ
スＨＣＩ　　（ｐｌ−１ｇ、ｏ）　、２５０ｍＭのＮａ
Ｃ１，０，２５ｍＭのＦＤＴΔ及びｏ、ｏｉ％のＴｗｃ
ｅｎ　８０に対して４時間透析した。透析後、ザンプル
を１３．０００ｘ　ｇで２分間遠心し、１０μｍの上清
を解析して組織プラスミノーゲン活性化因子の活性を定
量した。Ｇ　ｒａｎｅｌｌｉ−ｐ　１ｐｅｒｎｏ及びＲ
ｃｉｃｈの方法（文献８７）を準用し、プレートを３７
℃で３．５時間インキコベー１〜し溶解ゾーンを測定し
た。精製メラノーマ組織プラスミノーゲン活性化因子溶
液の希釈液と比較して定量した。

ヒトメラノーン細胞（Ｃ３ｏｗｅｓ　）を使用した（こ
の１ＩＩＩ胞は、例えばｌ　ｅｕｖｃｎ　Ｒｅ５ｅａｒ
ｃｈ　ａｎｄ　Ｄｅｖｅ−ｌｏｐｍｅｎｔ　ｖｚｂ、　
　Ｌ　ｅｕｖｃｎ、　　Ｉ’３　ｅｌｇｉｕｍ　（「）
　ｒ、　　ｌ）　。

Ｃｏ１１ｅｎ　）等から制限なく自由に入手可能である
。

文献８８参照）。炭酸水素ナトリウム（最終濃度０．１
２％）　、２１１１Ｍのグルタミン及び１０％の熱失活
牛１１６児血清を補充し１＝１００ｍｌのＥ　ａｒｌｅ
ｓ　Ｍ　ｉｎｉｍａｌＥ　５ｓｅｎｔｉａｌ　　Ｍ　ｅ
ｄｉａ中で、メラノーマ細胞ヲコンフルエントな状態に
なるまで単層培養した。メラノーマ細胞がヒト組織プラ
スミノーゲン活性化因子を有効に産生したことを確認す
べく、２４ウ工ルマイクロタイター皿でヒトメラノーマ
細胞をコンフルエントな状態になるまで培養した。０．
３３μＭのプロテアーゼインヒビター、アプロチニンの
存在下又は不在下で、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（Ｐ
ＢＳ）で１度洗浄し、血清及びメチオニンを含まない培
地０．３ｍｌを添加した。７５μＣｉの５ ［Ｓ］−メチオニンを添加し細胞を３７℃で３時間かけ
て標識した。３時間で標識した後、培地を細胞から除去
し、免疫沈降のために組織プラスミノーゲン活性化因子
特異的［Ｇ又は免疫前血清で処理した（文献５４）。免
疫沈降産物を１０％ＳＤＳアクリルアミドグル電気泳動
させ（文献６３）、平板ゲルを固定し、乾燥し、Ｘ線螢
光測定した（文献６４．第１図参照）。

Ｅ、１．Ｃ，メツセンジャーＲＮＡの単離及びサイズ分
画 メラノーマ細胞培養物から得た全ＲＮＡを、Ｗａｒｄ　
ｅｔ　ａｌ、の方法（文献５５）を準用して抽出した。

細胞を遠心によりペレットにし、次に１（ｌ　ｍＭのＮ
ａ　Ｃ＋　、１０　ｍＭのトリス−ＨＣｌ　　（Ｍ　７
，５）−６５＝ 及ヒ１．５　ｍＭのＭ（ＩＣＩ　　に再懸濁さけた。Ｎ
ρ−４０（最終濃度１％）を添加して細胞を溶解し、遠
心して核をペレット化した。全ＲＮＡを含む上清を多数
回のフェノール／クロロホルム抽出により更に精製した
。水相を０．２ＭＮａＣｌ溶液にし、次に２倍容のエタ
ノールを添加して全ＲＮＡを沈澱させた。オリゴ−ｄ７
−セルロースクロマトグラフィーを用い、全ＲＮＡ調製
物からｍＲＮ　Ａを精製した（文献５４）。典型的な収
量としては、ＩＯＱの培養メラノーマ細胞から５乃至１
０ｍｇの全ＲＮＡ及び５０乃至２００μ９のポリ（Ａ）
プラスｍＲＮ△が得られた。

尿素−アガロースゲル電気泳動を用いてポリΔ１ｍＲＮ
　Ａ　（２００ｕ（Ｊ　）　　（文献５６）　１７）分
１ｉ１ｉｉヲ行ａ　ッだ。１．７５％のアガロース、０
．０２５Ｍのクニ［ン酸ナトリウム（ｐＨ３，８）及び
６Ｍの尿素から成る平板アガロースゲル（文献５７及び
５８）を用いた。

電気泳動は２５ミリアンペア、４℃で７時間実施し、次
にゲルをカミソリの刃で分割した。各スライスを７０℃
で融解し、フェノールで２回、クロロホルムで１回抽出
した。次に両分をエタノール沈澱し、引続いてイヌのス
イ臓ミクロソーム（文献６１）を補充したウサギ網状赤
血球ライゼート系（３ｅｔｈｅｓｄａ　Ｒａｓｅａｒｃ
ｈ　ｌ　ａｈ、、文献５９及びａＯ）中ｉｎ　Ｖｉｔｒ
Ｏで、以下の如く翻訳してアッセイを実施した。２５　
ｍＭのＩ−ＩＥＰＥｓ　（Ｎ、２−ｅドｏ＊ジエチルピ
ペラジン−Ｎ−２−エタンスルホン酸緩衝液）　、４８
．３　ｍＭの塩化カリウム、１０１１１Ｍのリン酸りレ
アヂン、各ｓｏ　＋ｎＭの１９種のアミノ酸、１．１　
ｍＭの塩化マグネシウム、１６．６　ｍＭのＥＤＴＡ、
０．１６ｍＭのジチオスレイトール、８．３１１１Ｍの
ヘミン、１６．６μｇ７ｒｎ＋のクレアチンキナーゼ、
０．３３Ｉｌ１Ｍの塩化カルシウム、０．６６ｍＭのＥ
ＧＴＡ　（エチレングリコール−ビス−（β−アミノエ
チルエーテル）−Ｎ、Ｎ、Ｎ、Ｎ−テトラ酢＠緩衝液）
及び２３．３ＩＩＩＭの塩化プトリウムを含ｂＲＨ容ｆ
！１３０ｕ　Ｉ　ノｌ？１ｌ１１Ｆ２５μＣｉ　（１）
　［３５Ｓ　］−メヂオニン及び５００ｎｇの各ゲルス
ライスＲＮＡを用いて翻訳した。

３０℃で９０分間インキュベートした。リポソーム（文
ｗＸ６１）を除去すべく　Ｅ　Ｉ）丁Ａを用いて粗ミク
ロソームから調製したイヌのスイ臓ミクロソーム膜を、
文献６２に記載の如くヌクレアーげで処理し、最終濃度
７Ａ２６ｏ　ユニツｌ−／ｍｌで翻訳混合物中に存在さ
せた。翻訳産物又は免疫沈降翻訳産物を、文献６３に記
載の如く、ドデシル硫酸ナトリウム中の１０％ポリアク
リルアミドゲル電気泳動にかけて解析した。未染色の平
板ゲルを固定し、乾燥して螢光測定した（文献６４）。

各ゲル画分から得られた翻訳産物をつ晋ナギの抗ヒト組
織プラスミノーゲン活性化因子特異的ＩＧＧで免疫沈降
させた。主な免疫沈降ポリペプチドバンドは、分子量約
６３，０００ダルトンのＲＮＡ画分Ｎ０．７及び８（２
１乃至２４Ｓの移動麿）の翻訳産物中に見られた。免疫
沈降の際に免疫前ＩｇＧを使用すると前記のバンドが見
られなかった。このことは、これらのポリペプチドが組
織プラスミノーゲン活性化因子特異的であることを意味
する。

５μ９のゲル分画ｍＲＮＡ（ゲルスライス７のｍＲＮ　
Ａ　）を使用し、標準法（文献５２．　Ｇ５７ｉ１”６
６）で二重鎖ＣＤ　Ｎ　Ａを調製した。ｃＤ　Ｎ　Ａを
６％ポリアクリルアミドゲルでサイズ分画し、３５０　
ｂｐより長いｃＤＮＡ　（１２５ｎＧ）を電気溶出した
。ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフエラー
ゼ（文献６７）を用いて３Ｏｎ（］のｃＤ　Ｎ　Ａにデ
オキシ（Ｃ）残塁をつなぎ、同様に圧鉄工部位にデオキ
シ（Ｇ）残塁（文献６７）を末端に結合したプラスミド
ＩＩＢＲ３２２（文献６８）　３００ｎ（Ｉとアニール
した。

アニールした混合物を次に［、ｃｏｌｉ　　Ｋ１２株２
９４（ＡＴＣＣＮｏ、３１４４６　）に形質転換し、得
られたテトラザイクリン耐性コロニーを、５μｇ／ｍｌ
のテ！〜ラサイクリン含有Ｌ−ブロス（文献９３）を入
れたマイクロタイタープレートの個々のウェルに接種し
た。４６００個の形質転換株のｃＤ　Ｎ　Ａライブラリ
ーをニトロセルロースフィルター上で増殖させ、各コロ
ニーのＤＮＡをフィルターに固定した（文献６９）。８
種のデオキシオリゴヌクレオチドｄＴＣ（Ａ）ＣＡ（Ａ
）ＴΔ（０）ＴＣＣＣＡＧ　　　　　　　　　　　Ｇ　
　　　　　　　　　　　Ｔを、４種の１４ヌクレオチド
体の２種のプール中で同相ホスホトリエステル法（文献
５１）によって化学的に合成した。３２　ｐ−標識プロ
ーブを前記８種の１４ヌクレオチド体（文献５２）のプ
ールから調製した。４６００個の形質転換株を含有する
フィルターのセットを、リン酸ナトリウム（＋）ｌ−１
６，８）’５０ｍＭ、５ｘＳＳＣ’、超音波処理サケ精
子ＤＮＡ１５０μａ　／ｍｌ、５×デンハルト溶液及び
１０％ホルムアミド中で、前記標識プローブ５Ｘ　１０
７Ｃ，ｐ８ｍ。

とハイブリダイズした。室温に１６時間放置した後、フ
ィルターを室温で６×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ中で良
く洗浄し、次いでＸ−線フィルムに露光し１こ　。

Ｅ、１．Ｅ、ＤＮＡ７０７（ＤｍｇＡ 文献１９及び２０に記載の方法で精製ヒト組織プラスミ
ノーゲン活性化因子を得た。

合成プローブの作製の最適領域を見い出すべく分子を以
下の如く検査した。

タンパクをトリプシン消化し易くするために還元及びカ
ルボキシメチル化した。組織プラスミノーゲン活性化因
子２ｍｇのサンプルを先ずｏ、ｏｉ％Ｔｗｅｅｎ　８０
に対して室温で１晩透析した。凍結乾燥したタンパクを
次に０．５６　Ｍのトリス−１−Ｉ　ＣＩ緩衝液（＋１
１−１８．６）、８Ｍの尿素及び５１１１ＭのＥＤＴ△
を含む液１２１に溶解した。０．１ｍｌのβ−メルカプ
トエタノールを添加してジスルフィド結合を還元した。

反応は窒素下４５℃で２時間行なった。１．４Ｍのヨー
ド酢酸の１Ｎ　　ＮａＯＨ溶液１．０１を添加して還元
ジスルフィドをアルキル化しカルボキシメチル化誘導体
を得た。室温に２０分間放置後、０．０１％Ｔｗｅｅｎ
　８０に対して室温で１８時間透析して反応を停止し、
凍結乾燥した。

得られた凍結乾燥カルボキシメチル化タンパクを釦１の
０．１Ｍリン酸す１−リウムＭ衝液（ｐＨ７，５）に再
度溶解した。トリプシン（ＴＰＣＫ。

Ｌ−１−トシルアミド−２−フェニルエヂルクロロメヂ
ルケトンで処理したトリプシン）を（１：５０の割合で
）添加し、３７℃で消化した。３時間、６時間及び１２
時間後にサンプル（０，１ｍ１）を取出した。

１２時間後にトリプシンを再度添加した。２４時間後に
サンプルを凍結して反応を停止し、ＨＰＬＣに注入でき
るまで保存した。ＳＤＳゲルによりサンプルの消化の程
度を測定した。３時間後のサンプルでかすかなバンドが
見られる以外、全てのゲルに変化はなかった。このこと
は、２４時間で完全な消化が行なわれ、大きいペプチド
が残存しないことを示す。

約０．５１のサンプルを２系列操作型の高分解能Ａｌｔ
ｅｘ　　Ｃ−８ウルトラスフエア（ｕ＋ｔｒａｓｐｈｅ
ｒｅ）５μカラムに注入した。アセトニトリルの勾配を
徐々に与えた（　５分で１乃至５％、１００分で５乃至
３５％、３０分で３５乃至５０％）。２系列操作のうち
の１系列の操作で溶出液を２つの波長（２１Ｏｎ’ｍ及
び２８０ｎＩＩｌ）でモニターした。２つの波長での吸
収比を用いてトリプトファンを含むペプチドを検出した
。

７３− 最も多くのトリプトファンを含むと思われるペプチドビ
ーク、又は伯の理由で有用と考えられたペプチドビーク
の配列決定を最初に行なった。これにより大部分のトリ
ス］・ファンの周辺の配列を決定し得た。約２５個の最
良と思われるペプチドビークの配列決定後、−列に並べ
た全部の配列データをプールして組織プラスミノーゲン
活性化因子の一次構造の予備モデルが得られた。このデ
ータ及びモデルからいくつかの可能なプローブの位置を
決定した。

１【 ５μＱ　／ＩＩのテトラサイクリンを含むＬＢ（文献９
３）を入れたマイクロタイタープレートの各ウェルにコ
ロニーを１個ずつ接種し、１％までＤＭＳＯを添加して
一２０℃に保存した。コロニー−７Ａ　− ライブラリーの２個のコピーをニド〔１セルロースフイ
ルター上で増殖ざゼ、各コロニーから得たＤＮＡをＧ　
ｒＵｎｓｔ（！ｉｎ　　ｌ−１０ｊＪｎＱＳＳ法（文献
６９）でフィルターに固定した。

３２Ｐ−４票識−丁Ｃ（Ｇ）ＣΔ（Ｇ）ＴＡ（１）ＴＣ
ＣＣΔプローブを、前記の如く合成オリゴマーから調製
した（前記（Ｗ−Ｅ−Ｙ−Ｃ−Ｄ）１４ヌクレ副ヂド体
プール）。５０　ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐｌ−ｌ　
６．８）、５ＸＳＳＣ（文献８０）、１５０Ｐ９／ｍ１
の超音波処理ザク−精子ＤＮＡ、５×デンハル１〜溶液
（文献８５）及び１０％ホルムアミド中、４．６００個
の形質転換株を含むフィルターを、室温で２時間プレハ
イブリダイズし、次に同じ溶液中で５０ｘ　ｉｏ６カウ
ント／分の（票識プローブとハイブリダイズした。室温
で　１晩インキユベートし、フィルターを６Ｘ　Ｓ　Ｓ
　Ｃ及びｏ、１％ＳＤＳ中室温で３０分間３回洗浄し、
２Ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃで１回洗浄し、次にＱ　ｕｐｏｎｔ、
　ｌ−ｉｇｈｔｎｉｎｇ　　ｐ　ｌｕｓ増感スクリーン
でＫｏｄａｋ　　ＸＲ−５Ｘ線フィルムに１６０ｈ間露
光した。

ポジティブなハイブリダイゼーション反応を示した１２
個のコロニーからプラスミドＤＮＡを単離したく文献７
１）。次に、断片をＭ１３ベクターｍｐ７（文献７３）
中でリブクローン化した後、クローンから得たＣＤＮＡ
インザー１への配ＩＪＪを、ＣＣ１１ａｌｎｔｅｒ：ｎ
ａｔ：ｏｎ法（文献７２）及びＭ　ａＸａｍ　　Ｇ　！
　ｌ　ｈｅｒ　１化学法（文献７４）にＪこり決定した
。第３図は、ポジティブな組織プラスミノーゲン活性化
因子クローンのハイブリダイゼーションパターンを示す
フィルターＮ　Ｏ，２５の図である。コロニー２５Ｆ１
０中のＣＤＮ△ＤＮＡノートのアミノ酸配列と、精製組
織プラスミノーゲン活性化因子から得られたペプチド配
列（前記）との比較、及び旦、岬旦中で産と１］される
発現産物（詳細は後記）とから、このｃＤ　Ｎ　Ａイン
サートが組織プラスミノーゲン活性化因子をコードする
ＤＮＡであることが判明した。

プラスミドｐＰ　Ａ　２５Ｆ　１０のＣＤ　Ｎ　Ａイン
サートは、（第５図に示すようにヌクレオチド２４３か
ら始まる）　　２３０４　ｂｐの長さを有しており、そ
の最長のオープンリーディングフレームは５０８個のア
ミノ酸からなるタンパク（ＭＷ　５６，７５６　）をコ
ードしており、７４５１）ｐの３′非翻訳領域を含む。

このｃＤ　Ｎ　ＡクローンにはＮ−末端をコードする配
列が欠如している。

第６図に示す如く、５０ＰｇのＤＰ　Ａ　２５Ｅ　１０
　（前記）をＰＳｔＩで消化し、６％ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動で３７６　ｂｐの断片を単離した。この
断片約３μｇを電気溶出でゲルから単離し、３０ユニツ
トの旦恵１を用いて３７℃で１時間消化し、フェノール
−クロロホルムで抽出し、エタノール沈澱−７７− ざゼだ。これにＪ：す［）ｄｅＩ粘着末端が得られる。

反応混合物に５ユニツ１へのＤＮＡポリメラーゼ■（Ｋ
　ｌｅｎｏｗ断片）並びに各０．１　ｍＭのｄＡ　Ｔ　
Ｐ　。

ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴ’Ｐを添加し４℃で８時
間インキュベー１−シて、前記のＤｄｅＩ粘着末端を伸
ばして平滑末端とした。フェノール−クロロホルム抽出
後、ＤＮＡを１５コニツ１〜のＮａｒＩで２時間消化し
、反応混合物を６％ポリアクリルアミドゲル電気泳動に
か１プだ。約０．５μｇの所望の１２５　ｂｐ平滑末端
−ｆＱａｒ■断片を回収した。この断片は、成熟全長組
織プラスミノーゲン活１１１化囚子タンパクのアミノ酸
のうちＮ　Ｏ，６９からＮ　０．１１０までのアミノ酸
をコードしている。

１６４５　ｂｐ工ａｒＩ−ＢＱＩＵ断片を中断するため
に、３０μ０の　ｐｐ　Ａ　２５Ｅ　１０を３０ユニツ
ｌ−のＮａ、ｒＩ及び３５ユニツトのＢＯＩＩＩにより
３７℃で２時間消化し、反応混合物を６％ポリアクリル
アミドゲル電気泳７８− 動にかけた。約６μ９の所望の１６４５　ｔａｐ　Ｎａ
ｒＩ　−Ｗ旺■断片を回収した。

プラスミドｐ△ＲｒｓＲｃはプラスミドｐＳ　ＲＣｅｘ
１６　（文献７９）の誘導体であり、後者に於いては、
圧プロモーターに近位でＳＲＣｍ伝子に遠位のｌ：ｃｏ
ＲＩ部位がＤＮＡポリメラーゼエ（文献２８）で修復す
ることにより除去されており、ホスホトリエステル法（
文献７５）で合成された自己相補的オリゴデオキシヌク
レオヂド　ＡΔＴＴＡＴＧＡＡＴＴＣＡＴがん匝■部位
の直ぐ隣りの残存［ｃｏＲＩ部位に挿入されている。２
０μ９のｐΔＲＩＳＲＣをＥｃｏＲＩで完全に消化し、
フェノール−クロロボルム抽出し、エタノール沈澱した
。次に、２５　ＩＩＩＭの酢酸ナトリウム（ｐｌ−１４
，６）、１ｍＭのＺｎＣｌ２　及び０．３ＭのＮａ　Ｃ
ｌの中でプラスミドを１００ユニツトのヌクレア一ゼＳ
１で１６℃、３０分間消化し、配列ＡＴＧをもつ平滑末
端を形成した。フェノ−ルーフ［１０ボルム抽出及びエ
タノール沈澱後、ＤＮＡをＢａｍ１−（Ｉで消化し、６
％ポリアクリルアミドゲル電気泳動にか（づ、大きい（
４，３００ｂｐ）ベクター断片を電気溶出で回収し１こ
　。

０．２μｇのベクター、０．０６μΩの１２５　ｂｐ平
滑末端−Ｘ４１断片及び０．６μ９の１６４５　ｂｏ生
肛■−ＢｏｌＴｒ断片とを、１０ユニツ１へのＴ４ＤＮ
△リガーゼで、室温で７時間を要して互いに結合して発
現プラスミドを構築し、Ｅ　、　ｃｏｌｉ　２９４株（
ＡＴＣＣＮｏ、３１４４６　）をアンピシリン耐性に形
質転換ずべく使用した。プラスミドＤＮＡを２６個のコ
ロニーから調製しＬｌ■及びｌＥＣ０ＲＩで消化した。

そのうち１２個のプラスミドが所望の４１５ｂｐ及堕Ｔ
〜Ｌ剪ＲＩ断片及び４７２　ｂｐ旦竺ＲＩ−断片を含ん
でいた。ＤＮＡの配列解析により、これらのプラスミド
のいくつかが、出発点であるアミノＭ　Ｎ　Ｏ，６９（
ゼリン）に対して正しく扉面された△ＴＧ開始ロドンを
有することが確認された。

これらのプラスミドの１つ、ｐΔＲＩＰＡ°を試験した
ところ、所望の組織プラスミノーゲン活性化因子を産生
じていた（第７図）。

Ｅ、１．Ｈ，全長組織プラスミノーゲン活性化因子ＣＤ
ＮΔ ０．４μｇの合成オリゴヌクレオチド　５’　Ｔ　Ｔ　
ＣＴＧＡＧＣＡＣＡＧＧＧＣＧ３’　（これはｔ−ＰＡ
ｍＲＮ　Ａのヌクレオチド２５６−２７１に相補的であ
る）を合成しく文献５１）、これをプライマーとして使
用し、標準法（文献６５及び６６）により、７．５μｇ
のゲル画分Ｎ０９８のｍＲＮＡ（前記）から、二重鎖Ｃ
ＤＮＡを調製した。ＣＤＮＡを６％ポリアクリルアミド
ゲルでサイズ分画した。３００　ｂｐより犬８１− ぎいリーイズ画分（３６ｎｇ）を電気溶出した。ターミ
ナルデオキシジデシル１〜ランスフエラーゼ（文献６７
）を用イテ５ｒｌｑのＣＤＮＡにデＡキシ（Ｃ）残基を
つなぎ、同様にｐｓ１４部位（文献６７）にデオキシ（
Ｇ）残基をつないだ５０ｎｇのプラスミド１’ｌＢ　Ｒ
３２２（文献６８〉とアニールした。次にアニールした
混合物をＥ、ｃｏｌｉ　　Ｋ１２株２９４に形質転換し
た。約１，５００個の形質転換株が得られた。

ｂ）ヒトゲノムＤＮＡのナザンハイプリダイゼーション ｃＤＮΔのプライミング反応が、クローンｐｐ　Ａ　２
５Ｅ　１０のＮ−末端から１３　ｂｐとハイブリダイズ
した合成断片を用いて行なわれたので、（１６ヌクレオ
チド体配列を含む）この２９　ｂｌｌ領域には、ＣＤＮ
△ＤＮＡンをスクリーニングするための適当な制限断片
は得られなかった。従って、Ｎ−末ＤＮ１！′１織プラ
スミノーゲン活性化因子をコードしている配列を含みプ
ライマーで伸延したｃＤＮＡクローンを同定するために
は、と１〜組織プラスミノーゲン活性化因子ゲノムのク
ローン（文献７６）を単離することが必要であった。

このプロセスの第１段階では、唯一の相同組織プラスミ
ノーゲン活性化因子の遺伝子がヒトゲノムＤＮＡ中に存
在することを確認した。このためにサザンハイブリダイ
ゼーションを実施した。この方法に於いては、５μｇの
高分子量ヒトリンパ球ＤＮＡ　（文献８０の如く調製）
を種々の制限エンドヌクレアーゼで完全に消化し、１．
０％アガロースゲル電気泳動（文献８１）にか（ブ、ニ
トロセルロースフィルターにプロットした（文献７７）
。

ｃＤＮＡクローンＩ）Ｐ　Ａ　２５Ｅ　１０のＣＤＮΔ
ＤＮＡ−１〜＜　２３２　ｂｐ胆ニー圧肚工断片）の５
′末端から３２Ｐ、−標識ＤＮＡプローブをＩ製しく文
献７６）、前記ニトロセルロースフィルターとハイブリ
ダイズした（文献８２）。３５Ｘ１０６カウン１−７分
のプローブを４０時間ハイブリダイズし次に洗浄した（
文献８２参照）、２種のエンドヌクレアーゼ消化パター
ンから唯一のハイブリダイズＤＮＡ断片：ＢｏｌＩ［（
５，７１（ｔ＋ｐ）及びＰｖｕＴＩ　（４，２Ｋｂｐ）
が得られた。２種のハイブリダイズＩ）ＮＡ断片が１−
Ｎｎｃ　ＩＩ　（５，ＩＫｂｌｌ及び４．３Ｋ　ｂｐ）
で観察された。

両者を総合したデータによれば、ヒトゲノム中に唯一の
組織プラスミノーゲン活性化因子が存在すること、及び
該遺伝子が少なくとも１個の介在遺伝子を有することが
判明した。

組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子を担うλファー
ジ組換体を同定するために、組織プラスミノーゲン活性
化因子クローンｐＰ△２５Ｅ　１０がら調製された放射
性プローブとのヌクレオチド相同性を検出する方法を用
いたａ１００万個の組換λファージを１０，０ＯＯｐｆ
ｕ　／　１５ＣＩＩＩプレートの密度でｏｐｓｏｓｕｐ
Ｆを宿主としてプレートアウトし、Ｂ　ｅｎｔｏｎ及び
Ｄ　ａｖｉｓの方法（文献７８）により、各プレート毎
にニトロセルロースフィルターレプリカを調製した。標
準法（文献８３）を使用し、プラスミドｐＰ　Ａ　２５
Ｅ　１０の５′末喘から３４　ｂｐに位置する２３２　
ｂｐ胆ニー凪■断片を用いて、３２ｐ−標識ＤＮＡプロ
ーブを調製した。５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｌ１Ｈ
６，５）、５ｘＳＳＣ（文Ｍ７７）、０．０５ｍａ　／
ｍｌの超音波処理サケ精子ＤＮＡ、５ｘデンハルト溶液
（文献８４）及び５０％ホルムアミド中で、各ニトロセ
ルロースフィルターを４２℃で２時間プレハイブリダイ
ズし、次に、１０％デキストラン硫酸ナトリウム（文献
８５）を含む同じ溶液中で、５０ｘ　１０　　カラ２８
フ分の標識プローブとハイブリダイズした。４２℃で１
晩インキユベートし、−〇　Ｑ　− フィルターをｏ、２ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃ及び０．１％ＳＤＳ
中５０℃、３０分間で４回洗浄し、２Ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃで
室温で１回洗浄し、次にＤＩＩｐＯｎｔ　ＣｒｏｎＯＸ
増感スクリーンでＸＲ−５Ｘ−線フィルムに１晩露光し
た。全部で１９個のクローンがプローブとハイブリダイ
ズした。６個の組換体から文献８６に記載の方法でファ
ージＤＮＡを調製した。コロニースクリーニング用のＰ
ｖｕＩ［断片を調製するために、これらのポジティブな
ハイブリダイゼーションを示す組換体の中からλクロー
ンＣを選択した。３０μＱのＤＮＡをユ■を用いて３７
℃で１時間消化し　１．０％アガロースゲル電気泳動に
か【）た。組織プラスミノーゲン活性化因子をコードす
る配列を含有することが既に判明した４、２Ｋ　ｂｐの
断片を電気溶出して精製した。後述の如きコロニーハイ
ブリダイゼーションを行なうために標準法（文献８３）
を用いて３２Ｐ−標識プローブを調製した。

８６− 久 コロニーをプレートからニトロセルロースフィルターに
移して増殖させ、各コロニーから得たＤＮＡをＧ　ｒｕ
ｎｓｔｅｉｎ　−１−１ｏｇｎｅｓｓ法（文献６９）で
フィルターに固定した。単離した組織プラスミノーゲン
活性化因子λゲノムのりＤ−ンから４．２Ｋ　ｂｐｐｖ
ｕｌ’［断片をプライムする仔牛胸腺（文献８３）にＪ
：つて　Ｐ−標識プローブを製造した。１，５００個の
形質転換株を含むフィルターを１１２Ｘ　１０　　ｃｐ
ｍの３２ｐ−ゲノムｐｖＪ断片とハイブリダイズした。

Ｆ　ｒｉｔｓｃｈ　ｅｔ　ａｔ、により記載された条件
（文献８２）を用いてハイブリダイゼーションを１６時
間継続した。フィルターをよく洗い次にＤ　ｔｌＤＯｎ
ｔｌ　１０ｈｔｎｉｎｏ　−ｐ　Ｉｕｓ増感スクリーン
と共にＫ　ｏｄａｋＸＲ−５Ｘ−線フィルムに１６乃至
４８時間露光した。

１８個のコロニーが明らかにゲノムプローブとハイブリ
ダイズした。プラスミドＤＮＡをこれらのコロニーの各
々から単１ｉｌｌ　Ｌ、ニトロセルロースフィルターに
固定し、最初のブライミング反応に使用した３２ｐ−標
識合成オリゴヌクレオチド（１６ヌクレＡチド体）とハ
イブリダイズした。１８個のクローンのうらの７個がキ
ナーゼににって活性化した１６ヌクレＡヂド休とハイブ
リダイズした。ｍ１３ベクタ−ｍｐ７　　（文献７３）
中での断片のサブクローン化後に配列を解析すると、１
種類のクローン（ｒｌＰＡ１７）が組織プラスミノーゲ
ン活性化因子の正しい５′末端領域、シグナルリーダー
配列及び８４　ｂｐ　ｓ／非翻訳領域を含むことが判明
した。

ｒｌＰ　Ａ　１７のＣＤ　Ｎ　Ａインサートの長さは２
７１　ｂｐである。これはその合成にプライマーとして
使用したヘキザデ力ヌクレオチド配列を含んでおり、こ
れによりそのＤＮＡ配列をｒｌＰ　Ａ　２５Ｅ　１０の
配列と合わせて整列することが可能になった。これら２
種のｃＤ　Ｎ　ＡクローンｐＰＡ２５Ｅ１ｏ及びｐＰ△
１７から、ヌクレオチド配列及びそれに対応するｔ−Ｐ
　Ａのアミノ酸配列を決定した（第５図）。２種のクロ
ーンｐＰΔ２５Ｅ１０及びｐＰ　Ａ　１７から、第５図
の完全ヌクレオチド配列及び全長組織プラスミノーゲン
活性化因子クローンの制限パターン（第４図）を決定し
た。

完全な２５３０　ｂｐ　ｃＱ　Ｎ　Ａ配列は単一のオー
プンリーディングフレームを含んでおり、これはヌクレ
オチド８５〜８７のＡＴＧコドンで始まっている。

このＡＴＧを含めて５６２個のコドンがあり、その後ヌ
クレオチド１７７１〜１７７３にＴＧＡ停止トリプレッ
トがある。このＡＴＧは、恐らく、それが最初に遭遇さ
れる場合、翻訳開始部位として作用し、このＡＴＧの前
方にはヌクレオチド４〜６の位置に同位相（ｉｎ　ｐｈ
ａｓｅ）で停止コドンがある。アミ８９− ノ酸ＮＯ６１と印したセリンは、精製メラノーマ細胞ｔ
−ＰＡのＮ　Ｈ−末端の配列決定に基づいている。この
セリンの前に３５個のアミノ酸があり、このうちＮＨ−
末端の２０〜２３個は、分泌ｔ−ＰΔが有する疎水性シ
グナルベプヂドを構成していると思われる。残りの１２
〜１５個の親水性アミノ酸は成熟ｔ−ｐΔの第一アミノ
酸の直前にあり、血清アルブミンに見られるものに類似
する゛プロ″配列を構成している。３′−非翻訳領域は
７５９個のヌクレオチドから成り、ヘキザヌクレオチド
ＡＡＴΔΔＡ（位置２４９６〜２５０１　）を含んであ
る。このヘキ（」ヌクレオチドは、多くの真核生物ｍＲ
Ｎ△のポリアデニル化部位に先行する。

天然の組織プラスミノーゲン活性化因子の分子は、３５
個のシスティン残基を有しており、従って１１個のジス
ルフィド結合により安定化される可能性を有する。第１
２図に示した概略図は、他のセリ−〇　〇 ンブロテアーゼとの相同性に塁いて構成される。

１個の可ｆｊヒなＮ−グリコジル化部位があり、このう
ち３個はクリングル領域のａｓｎ、□７．　　ａｓｎ、
８４゜ａｓｎ２．８　　に存在しており、他の可能な部
位はＬ鎖領域のａｓｎ　　　に存在している。構造上の
オリゴ４８ 糖リガンドの違いが種々の分子形態（分子量６５．００
０及び６３，０００の種）の原因である。

アミノ酸分析用のｔ−ＰΔサンプルは、０．１％Ｎ　＋
−１１−Ｉ　ＣＯに対して充分に透析し減圧乾燥し３ て調製した。残基を６Ｎ　　ｌ−１ｃＩに懸濁し、バイ
アルを真空密」４した。加水分解は１１０’Ｃで２４時
間実施した。次いで、得られた加水分解物をＢ　ｅｃｋ
ｍａｎ　　Ｓ　ｙｓｔｅｍ　６３００　　アミノ酸分析
器で解析した。

分子量は、ゲル分析にＪ：り以下の如く決定した。

ｌａｅｍｍｌｉの方法（文献６３）を使用してＳＤＳポ
リアクリルアミドゲル電気泳動を行なった。グルは、１
０％アクリルアミド及び０．２７％メチレンビスアクリ
ルアミドから成っていた。す゛ンブルの還元が必要なと
きには、メルカプトエタノールの代わりにジヂＡスレイ
１ヘールを用いて還元し、１３ｉ。

−Ｒａｄ低分子吊ＳＤＳ標準混合物を標ｔ１ｔ−どして
使用した。Ｍ　ｏｒｒｉｓｓｅｙ、△ｎａ１．　３ｉｏ
ｃｈｅｍ、　１１７゜３０７　（１９８１）の方法に従
って銀染色を行なった。

種々の分子ｍを有するｔ−ＰＡを、溶出液どしてアルギ
ニンを用いてリジン−セファ０−ス上で分前した。単離
したタンパクは、検出可能なＨ３のＳＤＳゲル電気泳動
による交差汚染（ｃｒｏｓｓｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏ
ｎ　）を含ま４ｒかった。各タイプのタンパクを、先ず
還元し、カルボキシメチル化し、前記の如くトリプシン
瀾化した。この消化生成物を、Ｃ０ｎ−八−アガロース
（Ｓ　：（１ｍａ礼製）ニかｃノ、０．２Ｍのα−メチ
ルマンノシドで溶出した。Ｃ０Ｄ−へ樹脂に結合しα−
メチルマンノシドで溶出するペプチドを、前記１−Ｉ　
Ｐ　Ｌ　Ｃを用いて解析した。

高分子量のｔ−ＰＡは３Ｔ’ｒの主要なペプチドを含ん
でおり、低分子量のｔ−ＰＡは２ｉのＣｏｎ−Ａに結合
するペプチドを含んでいた。これらのペプチドをタンパ
ク質配列分析にＪ：り同定した。その結果、１）両者の
タイプのｔ−ＰＡで残基１１７及び４４８がグリコジル
化されていること、２）残塁１８４が、高分子量のタイ
プのｔ−ＰＡではグリコジル化されＣｏｎ−Ａに結合す
るが、低分子量のタイプのｔ−ｐΔは、（グリコジル化
残塁１８４を含有し且つ）ＣＯＤ−八に結合するペプチ
ドを合んでいないこと、及び、３）残基２１８のアスパ
ラギンがグリコジル化されていないようであることが判
明した。

直接発現 部分クローンＩ’ＪＰ　Ａ　１７とｐｐ　Ａ　２５Ｅ　
１０との双方Ｑ　　− に共通の±ｈａＪ制限エンドヌクレアーげ部位を用いる
ことにより、完全］−ド配列の再構築が可能であった。

アミノ酸５−２３に対応する５５ｂ０３　ａｕ　３Ａ　
ｌ−１−１ｈａ　Ｉ制限断片をプラスミドρＰ１７かう
単Ｎｔシた。３ａｕ３ＡＩ制限部位はＨＬ定成熟コード
配列のコドン４に位質しており、シグナルペプチドをコ
ードする領域を除去ずべく使用した。同様に（アミノ酸
２４−１１０をコードする）２６３１叩比匝工−エ扛Ｉ
断片をプラスミドｐＰ　Ａ　２５Ｅ　１０から単離した
。アミノ酸１−４のコドンを再生しΔＴＧ翻訳１７ｎ始
フドンを組込んでＦＣＯＲＩ粘着末端を形成する２種の
合成デオキシオリゴヌクレオチドを設計した。次に、こ
れら３種の断片をηいに結合し、アミノｌ　１−１１０
をコードする３３８　ｂＤ断片を形成した。次に該断片
及びｐＰＡ２５Ｅ　１０カ６１５Ｊり１６４５　ｂｒｌ
　ＮａｒＩ−ＢＧＩＴｒ断片を、プラスミドρＩＱＩＦ
Ａ江と１０３（文献５３）＝９４− のｐｃｏＲ１部位及びル旺■部位の間に結合し、発現プ
ラスミドＩ）ｔ　−Ｐ　Ａ　ｔｒｐ　１２を調製した。

印しプロモーター、Ａペレーター及びｔｒｐリーダーベ
プヂドのＳ　ｈｉｎｃ　−Ｄ　ａ１ｇａｒｎｏ配列を含
むがリーターペプヂドＡＴＧ間始コドン（文献５２）を
含まない旦、姐旦　肛ｌノペロンの３００　ｔａｐ断片
の制御下でクローン化ｔ−ｐΔ遺伝子を転写した。

プラスミドａｔ　−Ｐ　Ａ　ｔｒｐ　１２を含むｌ：、
ｃｏｌｉＫ１２株　Ｗ３１１０　（Ａ　Ｔ　ＣＣＮ　ｏ
、２７３２５　）を増殖し、線維素溶解能アッセイのた
めの抽出物を調製した。

組織プラスミノーゲン活性化因子の活性を測定する１つ
の方法としてフィブリンプレートアッセイ（文献８７）
がある。この方法では、プラスミノーゲン及び線帷素を
含むアガロースプレート中でのプラスミンによる線紐素
の消化の程度を測定することによってプラスミン生成量
を測定する。プラスミンはフィブリンプレート中に透明
な溶解ゾーンを形成し、このゾーンの面積をリンプル中
の組織プラスミノーゲン活性化因子の徂と相関させ得る
。フィブリンプレー１〜アツレイを使用して、ｐｔ　−
Ｐ　Ａ　ｔｒｐ　１２クローンから得た抽出物の組織プ
ラスミノーゲン活性化因子の活性を試験すると、透明溶
解ゾーンが明らかである。この線紐素溶解能は抗ｔ−Ｐ
ＡＩＱＧによって阻害されるが、免疫前１！ＩＧ又は抗
ウロキナーゼＩＬＪＧによっては明害されイｒい。対照
として白血球インターフエ［１ンプラスミドｐＬｅＴＦ
Δ　ｔｒＤ　１０３を含む細胞から得られた抽出物につ
いて試験したところ、活性は全く検出されなかった。精
製ｔ−ＰＡについて得られた標準曲線にＪ：れば、１０
　　個の細胞当り約２０コニツトの抽出活性が得られる
と推定し得る（精製ｔ−ＰＡでは、９０，０ＯＯＰ　１
ｏｕｏｈ　］−−ッｈ　＝　１１１１ｇ）く第１０図）
。

Ｅ、１．Ｊ、配列解析 配列解析はＥ　ｄｍａｎ分解（文献８３ｂ）に基いて行
なった。サンプルを３　ｅｃｋｍａｎ　８９０３又は８
９０Ｃスピン力ツプシーケンザー（ｓｐｉｎｎｉｎｇ　
ｃｕｐｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）のカップに導入した。カッ
プ内の担体として、ボリブレノ　（ポリ−Ｎ、Ｎ、Ｎ。

Ｎ１−テトラメチル−Ｎ−トリメチレンヘキサメヂレン
　ジアンモニウム　ジアセテート）（文献６３Ｃ）を使
用した。シーケンサ−を寒冷トラップ及びいくつかのプ
ログラム変化によって変更し、バックグラウンドビーク
を低減させた。試薬としては、Ｂ　ｅｃｋｍａｎ’　ｓ
　　シーケンスグレード０．ＩＭＱｕａｄｒｏｌ緩衝液
、フェニルイソチオシアネート及びヘプタフルオロ醋酸
を用いた。

収集したＥ　ｄｍａｎサイクルをマニュアルに従って２
−アニリノ−５−チアゾリノン誘導体に転換した。

１−クロロブタンを窒素下で乾燥した。次いで、１、Ｏ
ＮのトＩＣ１水溶液を２−アニリノ−５−デアシリ９７
− ノンに添加し、７０℃で１０分間加熱して３−フェニル
−２−ヂΔヒダントイン（Ｐ　Ｔ　Ｉ−１１導体）に転
１堕した。次に、Ｐ　Ｔ　Ｈ−アミノ酸残基を５０％ア
セ１〜ニトリル及び水に溶解し、逆相高圧液体クロマト
グラフに注入した。次に、転換バイアル内に導入されシ
ーケンサ−からのサイクルと同様にして処理されたＰ　
Ｔ　Ｈ−アミノ酸の標準混合物の保持時間との比較によ
って各Ｐ　Ｔ　１−１−アミノ酸を同定した。

ａ、理論 組織プラスミノーゲン活性化因子の感受性アラセイは、
組織プラスミノーゲン活性化因子が触媒するプラスミノ
ーゲンからプラスミンへの転換をモニターして行なうこ
とができる。プラスミンは色素原基質アッセイが可能な
酵素である。これらのアッセイは、発色団の１−リベブ
チドのタンパク分解的開裂に基く。開裂速度は、被検プ
ロ７アーゼの特異性及び濃度の双方に直接関連する。組
織プラスミノーゲン活性化因子を含む溶液をプラスミノ
ーゲン溶液とインキコベートした接に形成されるプラス
ミンの量の測定がアッセイのベースとなる。活性化因子
の吊が多い程、形成されるプラスミンの量も多い。（Ｋ
ａｂｉ　Ｇｒｏｕｐ、　　Ｉ　ｎｃ、。

Ｑ　ｒｅｅｎｗｉｃｈ、　ＣＴから購入した）色素原基
質５２２５１の開裂をモニターすることににリプラスミ
ンを測定する。

ｂ０手順 サンプルを（０，０１２ＭのＮａＣ１を含む０．０５Ｍ
ｆ７）　Ｉ−’Ｊ　７．−１−Ｉ　ＣＩ、　ｌ）Ｈ７，
４中の）　　０，７Ｊ］／＋１１１のプラスミノーゲン
ｏ、１０ｍ１と混合し容量を０．１５ｍ１に調整する。

混合物を３７℃で１０分間インキュベートし、０．３５
ｍ１の３２２５１（上記緩衝液中の１−０ｍＭ溶液）を
添加し、３７℃で反応を３０分間継続覆る。木酢Ｍ（２
５μｍ）を添加して反応を停止ざゼる。サンプルを遠心
し４０５ｎｍでの吸収を測定Ｊ゛る。

標準ウロキナーゼ溶液との比較により活ｆＩｍが定量で
きる。溶液にフィブリノーゲン（０，２ｍｇ）を添加し
、これにより全長組織プラスミノーゲン活性化因子を検
出すべくアッセイ条件を変更した。

フィブリノーゲンは検出される組織プラスミノーゲン活
性化因子の活ｆ１を刺激し、従って活ｆｌレベルをやや
上昇させる。活性をｐ　ｌｏｕｇｈユニットで記録シタ
。９０，０ＯＯＰ　Ｉｏｕｇｌ＋　、：ｌ　ニットは、
精Ｉ！ＡｔＥＩ織プラスミノーゲン活竹化因了　１ｍｇ
が示す活性に等しい。

２、プラスミン形成の間接アッレイ ａ、即論 組織プラスミノーゲン活性化因子の活性の感受性アッセ
イが開発されたく文献８７）。このアッセイは、線１ｆ
ｌ素及びプラスミノーゲンを含む寒天プレート中でのプ
ラスミンににる線雑素消化の程度を測定することによっ
てプラスミン形成を決定することに基く。プラスミンは
フィブリンプレー１・中に透明な溶解ゾーンを形成する
。この溶解ゾーンの面積をサンプル中の組織プラスミノ
ーゲン活性化因子の量と相関させ得る。

ｂ−１」 Ｇ　ｒａｎａｌ　ｌ　ｉ−ｐ　１ｐｅｒｎｏ及びＲｅ１
Ｃｈの方法（文献８７）に準じて、プレートを３７℃で
３．５時間インキュベニ１〜して溶解ゾーンを測定した
。標準ウロキナーゼ溶液との比較によって定量をおこな
った。

Ｅ、１．１．組織プラスミノーゲン活性化因子の活性の
検出 １、細菌増殖及びサンプル調製 ２０μｑ／ｍｌのアンピシリンを含む５ｍｌのＬＢ増殖
培地を入れた試験管にプラスミド ｐΔＲＴ　１〕Δ°を含むし、剪旦コロニーを接種した
。細胞を３７℃で１晩増殖させた。この培養物のサンプ
ルを、２０μａ　／ｍｌのアンピシリンを含む３００ｍ
　ｌのＭ９培地に１：１００で希釈した。細胞を３７℃
の振盪フラスコ中で４時間増殖したところ、５５０ｎｍ
の吸光度が０．４１９になった。トリア１〜フアンに類
似のインドールアクリル酸を濃度３０μｇ／ｍ１まで添
加した。細胞を９０分間インキュベートしたところ、５
５０ｎｍの吸光度が０．６２８になった。遠心により細
胞を回収し、０．０１　ＭのＩＥＤＴＡを合む０，８ｍ
ｌの０．０１Ｍ＋−リス（ｐｌ−１ａ、ｏ）に再懸濁さ
せた。得られた懸濁液を室温で１８時間急激に撹拌した
。サンプルを遠心し、上清を用いて組織プラスミノーゲ
ン活性化因子の活性をアッセイした。

ｐｔ　−Ｐ　Ａ　ｔｒｐ　１２の発現に関しては、Ｅ、
１．△。

第１０図の説明に於番プる詳細な記載を参照されたい。

２、活性検出 表１および表２は、アラはイに用いた旦、刈区抽出物の
各々が示したプラスミノーゲンの活性化の結果を示す。

活性はプラスミノーゲンの存在に依存して発生する（族
１参照）。この活性は、ウサギの免疫前血清の影響を受
（プないが、精製メラノーマ細胞から誘導された組織プ
ラスミノーゲン活性化因子（文献８８）に対する抗血清
により顕著に阻害される（表１及び表２参照）。これは
、「。

ｃｏｌｉ抽出物がプラスミノーゲンを活性化する活性を
生成し、この活性が組織プラスミノーゲン活性化因子に
対する抗体によって阻害されることを示す。

第７図は線維素溶解能に関するフィブリンプレートアッ
セイの結果を示す。中列の左から右に向って濃度０．２
４．０．１４．０．１０．０．０５及び０．０２ｐ　ｌ
０ｔｏ）ｈユニットで標準沿のウロキナーゼを添加した
。下列は、各ウェルに同量の酵素を添加した天然組織プ
ラスミノーゲン活性化因子のザンプルであり、列の左か
ら右に向って組織プラスミノーゲン活性化因子、抗プラ
スミノーゲン活性化因子＋免疫前血清、組織プラスミノ
ーゲン活性化因子＋１１織プラスミノーゲン活性化囚子
抗体が各ウェルに収容されている。上列の各ウェルは８
ｆｌｌの組換組織プラスミノーゲン活性化因子６．ｃｏ
＋＋抽出物を収容しており、左から右へ向って、第１ウ
エルは抽出物のみ、第２ウエルは免疫前面清が添加され
た抽出物及び第３ウエルは組織プラスミノーゲン活性化
因子抗体が添加された抽出物を夫々含む。免疫前面清が
天然及び組換組織プラスミノーゲン活性化因子に影響を
与えないこと、並びに組織プラスミノーゲン活性化因子
抗体が天然抽出物及び３．ＣＯＩ＋抽出物の双方の活性
を阻害することが明らかである。ウロキナーゼ標準に基
いて、抽出物は２，５Ｐ　Ｉｏｕｏｈユニット／１より
やや少ない活性を含有している。この値は表１の１．３
ｐ　ｔｏｕｇｈユニット／ｍｌより有利である。

以下の表１及び表２は前記のＥ、１．　ｌ（，１，ｂに
記載の如〈実施されたアッセイの結果を示す。

１０５− 表１ｐΔＲＩＰＡ°を含む１ｍ、ｃｏｌｉ培養抽出物パ
ーセン１−　　　ｔ１惇値 抽出物 （プラスミノーゲン非含有）　　　０．０４３　　　（
０）抽出物　　　　　　　　　　　０．４５１　　（１
００）　　　　　　　１．３抽出物士免疫前面清　　　
　　０．４７７　　１０Ｇ　　　　　　　１．４抽出物
＋抗ｔ−ＰＡ抗体　　　　０．０７９　　　９注）１．
得られた値からブランク（０，０４３）を減算し抽出物
で得られた値で除算したパーセント活性。

表２　　ｐｔ−ＰＡｔｒｐ　１２の「、ＧＯ１ｉ培養抽
出物ザンプル　　　　　　　　Δ　　　　　　　　パー
セント活性−−４０５ 抽ｊｌｊ物　　　　　　　　　　　　０．６５７　　　
　　　　　（１００）抽出物＋免疫前血清　　　　　　
０．６６５　　　　　　　　１０１抽出物−１−抗ｔ−
ＰΔ抗体　　　　　０．０５９　　　　　　　　　９第
１０図は、組織プラスミノーゲン活ｆノｉ化因子発現プ
ラスミドを含むし９皿の１０１−発酵培養物からの抽出
物を用いて実施したフィブリンプレー１〜アツセイの結
果を示す。組織プラスミノーゲン活性化因子を含む抽出
物の線維前溶解能が第１０図のウェルａで示される。こ
の線組素溶解能は抗ｔ−ＰＡ　　ＩＧＧ（ウェルＣ）に
より阻害されるが、免疫前１ｏ　Ｇ　（ウェルｂ）又は
抗ウロキナーゼ［（Ｉ　Ｇ　（つ■ルｄ）では阻害され
ない。また、対照としての白面法インターフェロンプラ
スミドｐｌｅｌＦ△　ｔｒｐ　１０３　（ウｘ　ルｈ　
）　ヲ含（ｌ　ｍ胞”’Ｃ”調製された抽出物では活性
が全く検出されない。

ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰΔ）をコ
ードする配列を、１９８３年１月１９日刊出願の米国特
許出願第４５９，１５１号明細書に記載の如くＭＴＸに
対する結合親和力の低い突然変異Ｄ　Ｉ−Ｉ　Ｆ　Ｒを
含む発現プラスミドに以下の手順で挿入する（第１１図
〉。該特許出願を引用して本明細書中に包含する。

オーバーラツプするｔ−ＰＡプラスミド、＋１Ｐ　Ａ　
２５Ｆ　１０、ＩＭＰ　Ａ　１７及びｐΔＲＴＰＡ’　
　（前記）から３種の断片を以下の如く調製した。プラ
スミドｐＰ　Ａ　１７を邸■で消化し、Ｋ　ｌｃｎｏｗ
ＤＮΔポリメラーゼエを用いて充填し、ｐｓｔ■で再度
切断した。その結果生成された５′末端ｔ−ｐΔ配列を
含む約２００　ｂｐの断片を単離した。第２のｔ−ｐΔ
断片を得るために、ｐΔＲＩＰＡ’をｐｓＢ及び［ａｒ
Ｉで消化し、約３１０ｂｔ）の断片を単離した。第３の
ｔ−Ｐ△断片を得るために、ｐＰ　Ａ　２５Ｅ　１０を
又炊■及び１旺■で消化し、約１６４５　ｂｐの断片を
単離した。最後の断片はｔ−ＰＡ１０Ｑ− をコードする領域の殆／Ｖどを含んでおり更にいくらか
の３′非翻訳配列を含んでいる。

１−Ｉ　Ｂ　Ｖ表面抗原を発現するプラスミドＩＩＥ３
４２（ｐｌ−Ｉ　Ｂ　ｓ　３４８−Ｅとも摺移される）
は、１　（！ＶｉｎＳＯｎ　ｅｔ　ａｔ、により１９８
１年１２月　３０イｑ出願の米国特許出願第３２６，９
８０号明細書に記載されている。該出願を引用して水門
ｔ（ｔＮｊａ中に包含する。要約すれば、ザルウィルス
ＳＶ４０のオリジンを単離するために、ＳＶ４０　　Ｄ
ＮＡをｌ−ｌ　ｉｎｄ　ｍ　テ消化してコンバーター（
ＡＧＣ：ＴＧＡΔＴＴＣ）を添加して出国ｄＩ末端を１
剪ＲＩ末端に変換した。このＤＮＡをＰｖｕ■で切断し
ＰＩリンカ−を添加した。ＥＣ０ＲＩで消化後、オリジ
ンを含む３４８　ｂｐ断片をポリアクリルアミドゲル電
気泳動及び電気溶出で甲離し、ＤＢＲ３２２中でクロー
ン化した。

ＨＢＶ　（Ａｎｉｍａｌ　Ｖｉｒｕｓ　　Ｇｅｎｅｔｉ
ｃｓ、　（Ｃｈ、５　）Ａｃａｄ、Ｐｒｅｓｓ、　Ｎ、
　Ｙ、　　（１９８０）　）の［ｃｏＲＩ及１１０− び１肚■による消化で１ｑられた１９８６　ｂｐ断片（
これは１−ＩＦ（ＳＡ（］をコードする遺伝子を含／Ｖ
でいる）を、ＥＣｏＲＩ部位及び比視ＨＩ部位でプラス
ミドｐＭ　Ｌ　（Ｌｕ５ｋｙ　ｅｔ　ａｔ、、　　Ｎａ
ｔｕｒｅ、　２９３：　７９（１９８１）　）にクロー
ン化して発現プラスミド１）ｌ−Ｉ　Ｂ　５３４８−Ｅ
を構築した。（ｐＭＬは、サル細胞中でのプラスミド複
製を阻害する配列が除去された欠失を有する１）ＢＲ３
２２の誘導体でおる）。

得られたプラスミド（ｐＲＩ−Ｂ（ＩＩ）を次にＥｃｏ
Ｒ］’：で直線化し、ＳＶ４０のオリジン領域を示す３
４８　ｂｐ断片をＤＲＩ−Ｂ（ＩＩの江ＲＩ部位に導入
した。オリジン断片はいずれの配向でも挿入され得る。

この断片は複製のオリジン以外に初期及び後期のＳＶ４
０プロモーターをコードしているので、オリジンの配向
次第でどちらかのプロモーターが作用し該プロモーター
の制御下でＨＢ　Ｖ　遺伝子が発現し得た。（ｐＨＢ　
Ｓ　３４８−Ｅは初期プロモーターの制御下で発現した
ｌ−Ｉ　Ｂ　ｓを示す）。

ｐＥ３４２を修飾するために、ｐ［３４２をＥＣ０ＲＩ
で部分消化し、Ｋ　１ｅｎｏ＊　Ｄ　ＮＡポリメラーゼ
エを用いて開裂部位を充填し、プラスミドを再結合し、
これにＪζす、ｐ「３４２中のＳＶ４０オリジンに先行
する一ＥＣＯＲＩ部位を除去する。（９られたプラスミ
ド即ち　ｐＦ　３４２△Ｒ１をＥｃｏＲＩで消化し、Ｋ
　Ｉｅｎｏｗ　Ｄ　Ｎ　Ａボリメラーげ■を用いて充填
し、３ｑｍｌ−ＩＩで再疫切断する。アクリルアミドゲ
ル電気泳動後、約３５００　ｂｐ断片を電気溶出し、フ
ェノール／クロロホルム抽出し、エタノール沈赦させる
。

前記の如く調製されたｐ３４２Ｆ　３５００１）１１ベ
クター及び約２１６０　ｂｐの前記ｔ−ＰＡ断片を標準
法にＪ：り互いに結合した。ｔ−ＰＡをコードする３種
の断片を適正方向で含むプラスミドを単離し、特性決定
し、ｐＥ　３４２−ｔ−ＰＡと命名した。このプラスミ
ドを３ａｃＪ（で消化し細菌性アルカリ性ホスファター
ゼ（ＢＲＬ社製）で処理した。ＤＨＦＲ配列を（該配列
の発現用制御配列と共に）与えるために、＋１ＥＩ−Ｉ
ＥＲの３ａｃ■消化によッテ約１７００１）ｐ　（Ｄｒ
片を生成した。＜ｐＥｌ−ＩＥＲは前記米国特許出願第
４５９，１５１号明細書に記載の突然変異ＤＨＦＲを発
現するプラスミドである）。この断片を１１Ｆ　３４２
−ｔ−Ｐ　Ａプラスミドに結合し、ｐＥ　Ｔ　Ｐ’Ａ　
Ｅ　Ｒ４００を作製した。該プラスミドはｐＥ　ＨＥ　
Ｒに類似しているがＨＢｓＡｇをコードする領域がｔ−
ｐΔからのｃＤ　Ｎ　Ａ配列で置換されている。

Ｆ、２．Ｂ　　ｔ−ＰＡ配列の発現及び増幅Ｑ　ｒａｈ
ａｍ及びＶａｎｄｅｒ　　Ｅｂの方法（前記）で１１Ｅ
ＴＰＡＥＲ４００（ＤＥＴＰＥＲ）をｄＭｒＣｌ−１ｏ
−ＤｔＪＸ　　Ｂ１１細胞及びＤＨＦＲ”ＣＨＯ−に１
　　（ＡＴＣＣＣＣＬ６１）ｗＩ胞ニドランスフ１１３
− エクトした。グリシン、ヒポ−１４ノンヂン及びチミジ
ンを含まない培地で増殖し形質転換された旧１ｉｒ−細
胞を選択した。１１００ｎ以」−のＭＴＸ中で増殖して
形質転換されたＤ　＋−，Ｉ　Ｆ　Ｒ細胞を選択した。

適当な選択培地上に発生した］ロニーを、クローン化リ
ングで単離し同じ培地中で数世代まで増殖した。

増幅のために、コロニーから細胞を分割して５ｘｉｏ４
．１０５．　２．５ｘ１０５．　５ｘ１０５及び１ｏ６
ｒ＋ＭのＭＴＸを含む培地に入れ、この操作を数回繰返
した。極めて低い細胞密度（１ｏ２−１０３細胞／プレ
ート）で細胞を１　ｏｃｍの冊にプレートし、１５１ら
れたコロニーを単離した。

Ｆ、２．Ｃアッセイ方法 １−ランスフエクトされ増幅されたコロニー中のｔ−Ｐ
Ａの発現は、Ｅ、１．　Ｋ、１．ｂで説明した方法（前
記）と同様の方法で簡便に検定され得る。

ＤＨＦＲ及びｔ−ｐΔ配列の同時増幅は、増幅されたコ
ロニーのコンフルエントな単層から下記の如＜ＤＮＡを
単層してアッセイする。１５０ｍｍプレー１−のコンフ
ルエントな単層を５０ｍ　ｌの無菌ＰＢＳで洗浄し、５
ｍｌの０５１％Ｓ　Ｄ　Ｓ　、　　０．４ＭＣａＣ１□
　及び０．ＩＭ　　ＥＤＴＡ　（ｐＨ８）を添加して溶
解する。５乃至１０分後、混合物を取出し、フェノール
抽出し、クロロホルム抽出し、エタノール沈澱させる。

０．１ｍｇ／ｍｌまでＲＮ　ａｓｅを添加した１０　ｍ
Ｍ　トリス−ＨＣｌ　　（ｐｌ−１８）及び１ｍＭＥＤ
Ｔ△（Ｔ［）からなる液１ｍｌ　（１５０ｍｍプレート
当り）にＤＮＡを再懸濁させ、溶液を３７℃で３０分間
インキュベートする。次にＳＤＳを０．１％まで添加し
、プロナーゼ（シグマ社製）を０．５ｍｇ／ｍ１まで添
加する。３７℃で３乃至１６時間インキュベートした後
、溶液を再度フェノール抽出、クロロホルム抽出し、エ
タノール沈澱させる。ＤＮＡペレットを０．５ｎ＋１の
水に再懸濁さけ、制限酵素でＷｊ化する。約５乃至１０
７１ｊ］の消化ＤＮＡをアガロースゲル［１％のアガロ
ースを含む１〜リス−酢Ｍ緩衝液（４０ｍＭトリス、１
ｍＭ　　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ　、酢酸でｐ）−１８，２に調
整）］の電気泳動にかける（Ｃｒｏｕｓｅ　ｅｔ　ａｌ
、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　　Ｃｈｅｍ、、２５７　ニア
８８７　（１９８２）　）。ブロモフェノールブルー染
料がゲルの厚み２／３まで移行した後、ゲルを取出し臭
化エチジウムで染色する。紫外線でＤＮＡを見えるよう
にし、１ナザン法（Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、、並：
５０３　（１９７５）　）によりＤＮＡをゲルからニト
ロセルロースフィルターに移行させる。次にフィルター
を、（前記の如く調製されハイブリダイズされた）ｐＥ
ｌ−ＩＥＲの１７００　ｂｐ影咳■断片又はｐＥ　Ｔ　
Ｐ　Ｅ　Ｒの約１９７０　ｂｐの比旺■断片から製造さ
れたニック翻訳プローブとハイブリダイズさせる。

［，３野生型Ｄ　ＨＦ　Ｒタンパクを使用するｔ−ｐΔ
の産生 Ｅ、３．Ａ　　ベクターの構築 ｐＥ　Ｔ　Ｐ　Ｅ　Ｒの構築に使用した方法と同様の方
法で、野生型ＤＨＦＲをコードするＤＮＡ配列を含むプ
ラスミドｐＥ　Ｔ　Ｐ　Ｆ　Ｒを構築した。実施例Ｅ、
２．Ａに記載の如く構築するが、Ｄ　Ｉ−（Ｆ　Ｒタン
パク遺伝子配列の起源としてプラスミドｐＥｌ−ＩＥＲ
の代わりに、出願中のＧ　ｅｎｅｎｔｃｃｈＤ　ｏｃｋ
ｅｔ　Ｎ　ｏ、１００　／９２に記載のプラスミドｐＥ
　３４２．　ＨＢＶ、　Ｅ４０ｏ、０２２を使用した。

野生型Ｄ　Ｉ−Ｉ　Ｆ　Ｒと突然変異株Ｄ　ＨＦ　Ｒと
の間の１個の塩基対の相違以外はプラスミド ＋１Ｅ３４２．ＨＢＶ、　Ｅ４００．Ｄ２２は　Ｉ）Ｅ
ＨＦＲと同様である。従って、得られるプラスミド ｐＥ　Ｔ　Ｐ　Ｆ　Ｒは全ての点でＩＩＥ　Ｔ　Ｐ　Ｅ
　Ｒと類似しているが、突然変異ＤＨＦＲをコードする
ＤＮＡ１１７− 配列の代わりに、野生−ｓ’ｐ　Ｄ　ｌ−（Ｆ　Ｒをコ
ードするＤＮＡ配列が含まれている。

Ｅ、３．［１３ｔ−ＰＡ配列の発現 Ｇ　ｒａｈａｍ及びＶａｎｄｅｒ　　Ｅｂのリン酸カル
シウム沈澱法により　ｐＥ　Ｔ　Ｐ　Ｆ　Ｒを使用し′
ＣＤＨＦＲが欠如したＣ１１０細胞（ＩＪ　ｒｌａｕｂ
及びＣｈａＳｉｎ（前記））をトランスフェクトした。

選択用培地（−ＦＩＧＴ）で発生した２１個のコロニー
をアッセイするために、Ｑｒａｎｃｌｌｉ−Ｐ　１ｐｅ
ｒｎｏ、　ｅｔ　ａ！、、　Ｊ　。

ＥＸｌｌ、　Ｍｅｄ、、ユ４８　：　　２２３　（１９
７ｇ）に記載の如く、線維素及びプラスミノーゲンを含
む寒天プレート中の線維素のｄｊ化によって測定される
プラスミン形成を検出した。

次にＥ、１．に、に記載の方法にＪ：す、最もポジティ
ブなりローンのうち４個の細胞当りのプラスミン形成を
定量的に検定した。

前記の如き定量的測定により、４個の被検クロ１１８− −ンが、ユニツ１〜／細胞／日で示すと、等しいか又は
同等の培地内ｔ−Ｐ　Ａ分泌を示すことが知見された。

２個のクローンからの接種物を−ＨＧＴ培地を含む別の
プレー１−に移してサブクローンを調製した。得られた
サブクローンのうちの２種、１８Ｂ及び１を使用して更
に解析を進めた。

Ｅ、３．０　　増幅及びｔ−ＰΔ産生レベル増幅を促進
すべく前記サブクローンを５０　ｎＭのＭＴＸ中で１０
０ｍｍプレート当り２×１０　　の細胞を含むようにプ
レートした。生存した細胞を前記の如くアッセイすると
、全ての場合に、未増幅の組織プラスミノーゲン活性化
因子の活性の約１０倍の活性が検出された。これらのク
ローンの２個を選択して１−１５及び１８３−９と命名
し更に研究を進めた。

サブクローン１−１５を更に増幅するために、５００ｎ
ＭのＭＴＸを含む１００ｕ＋ｍプレートに２×１０　　
個の細胞を接種した。このようにして増幅された細胞の
アッセイによれば　ｊ−ｐΔ産生昂は更に増加していた
（約３倍）。Ｅ、１．にの方法で定量的に検定するとレ
ベルはｚｘｉｏ＝ユニット／細胞／日であった。次に、
これらの増幅細胞の一部分を１０．０００　ｎＭのＭＴ
Ｘの存在下に移して維持した。

勺ブクローン１〜１５及び１８Ｂ−９を表３に示した条
件で約１乃至２力月雑持した後に再度検査した。

表　　３ セルライン　　　　　　　増殖条件　　　　　　　　ｎ
ｇ　ｔ−ＰＡ／細胞／日１−１５　　　５００ｎＭ　Ｍ
ＴＸ　　　　　　　　　　　２８，５ｘ１０−３００ １−１５　　　　５００ｎＭ　ＭＴＸ　　　　　　　　
　　　２６．０Ｘ１０−３００ １−１５５ｏｏ（−ＨＧＴ培地、ＭＴＸなし＞　　　　
　　　　８．３Ｘ１０−３１−１５　　　　　　＜−１
−ＩＧＴ培地、ＭＴＸなし）　　　　　　　１８，０Ｘ
１０−３００ １−１５　　　　　１０ＢＭ　　ＭＴＸ　　　　　　　
　　　　　　　２９，３ｘ１０−３１０．０００ １−１５□。、。。。１０ＢＭ　ＭＴＸ　　　　　　　
　　４９，０Ｘ１０−３１８Ｂ−９５０ＢＭ　　ＭＴＸ
　　　　　　　　　　　　１４，３Ｘ１０−３１８８−
９　　　５０ＢＭ　ＭＴＸ　　　　　　　　　　１４，
４ｘ１０−３１８Ｂ−９（−１−ＩＧＴ培地、ＭＴＸな
し）　　　　　　　１４．３Ｘ１０−３１８８−９　　
　　　（−１−ＩＧＴ培地、ＭＴＸなし＞　　　　　　
　１４．４Ｘ１０−３１　　　　　　　（−ＨＧＴ培地
、ＭＴＸなし）　　　　　　　　１．０Ｘ１０−３１　
　　　　　　（−１−ＩＧＴ培地、ＭＴＸなし）　　　
　　　　　０．７Ｘ１０−３表３　注＊ 培地中のｔ−ｐΔを以下の如くラジオイノ９ノアツセイ
で定量的にアッセイした。精製ｔ−ｐΔ及びメラノーマ
細胞から誘導された精製ヨード化トレーサーｔ−ＰＡを
、燐酸緩衝生理食塩水（１’１１４７．３）、０．５％
牛血清アルブミン、０．０１％Ｔ　ｗｅａｎ　８０及び
０．０２％ＮａＮ　　を含む緩衝液中で濃度１２．５乃
至４００ｎｇ　／１＋１１まで順次希釈した。適当な希
釈度の被検定培地サンプルを放射活性標識１〜レーサー
タンパクに添加した。１：　１０．０００１釈のウザギ
抗ｔ−ｐΔ抗血清のＴ（ＩＧ画分の存在下で抗原を室温
で１晩インキユベートした。ヤギ抗つザギＩ（ＩＧイム
ノビーズ（３ｉｏ１’？：　ａｄ社製）に室温で２時間
吸収させて抗体−抗原コンプレックスを沈澱させた。

希生理食塩水を添加してビーズを洗浄し、次に４℃、２
０００Ｘ　Ｑで１０分間遠心した。上清を捨て、沈澱物
中の放射活性をモニターした。参照標準との比較にＪこ
つて濃麿を決定した。

セルラインは以下の如くである。セルライン１１１＋１
は、ＩＩＭＩのオリジナルセットから選択された未増幅
クローンである。“’　１−１５５００　”は最初に５
０　ｎＭのＭＴＸ中で増幅されて１−１５を生じ次に５
００ｎＭのＭＴＸに移されて更に増幅されたセルライン
１１１１＋の増幅サブクローンである。１−１５．。、
。。。

は１０，０００　ｎＭのＭＴＸの存在下で更に増幅され
た１−１５のサブクローンである。セルライン００ １８３−９は４個のオリジナルクローンの１個から選択
され５００ＭのＭＴＸで増幅されたサブクローンである
。

全ての」１９幅細胞は、未増幅細胞が示したよりも増加
したｔ−ＰΔ産生レベルを示す。未増幅培養物でも０．
５ｐｏ／１０胞／日より高いｔ−ＰＡ産生母を示すが、
増幅の結果として５０ｐｇ／細胞／臼に近いレベルが得
られる。

「、薬剤組成物 本発明の化合物は、本発明のヒ１−ｆｆｉ織プラスミノ
ーゲン活性化因子産物が薬剤上許容され得るキャリアビ
ヒクルに混合されて成る薬剤的に有用な組成物を調製す
べく公知方法で処方され１ｑる。伯のヒトタンパク例え
ばヒト血清アルブミンを包含する適当なビヒクル及びそ
の処方は、例えばＦ。

Ｗ、　ＭａｒｔｉｎによるＲ　ｅｍｉｎ（ｌｔｏｎ’　
Ｓ　　ｐ　ｈａｒｍａｃｃｕ−ｔｉｃａｌ　３　ｃｉｃ
ｎｃｅｓに記載されている。該文献を引用して本明細書
中に包含する。前記の如き組成物は、宿主への有効投与
に適した薬剤上許容され得る組成物を調製するための適
当量のビヒクルと共に有効量の本発明タンパクを含有す
るであろう。

例えば、本発明のヒト組織プラスミノーゲン活性化因子
は、心血管病又は心血管障害に苦しむ患者に非経口的に
投与され得る。用量及び投与速度は現在臨床に用いられ
ている他の心血管血栓溶解剤と同様でよい。例えば、肺
塞栓症の患者には、初回に約４４０１Ｕ／ｋｃ＋を静注
し、以後的４４０１ｔＪ／　ｋｇ／時ずつ１２時間静注
する。

本発明の実質的に均質なヒト組織プラスミノーゲン活性
化因子を、非経口的に投与するための適当な剤形の一例
としては、２５０００ＩＬＩの組織プラスミノーゲン活
性化因子活性、２５ｍｇのマンニトール及び４５ｍｇの
ＮａＣ１を含むバイアルを５ｍｌの注射用無菌水で復元
し、静脈内投与のために適正量の０．９％食塩注躬剤又
は５％デキスｌ−ロース注射剤と混合すればよい。

Ｇ、　組換ヒ１〜ｔ−ｐ△の詳細な説明本明細書中では
、実施例に於いて調製されたヒトｔ−ｐ△の特定具体例
の構造を遺伝子をコードする配列の解明及びタンパク質
生化学技術の双方にＪ：す、ある程度詳細に説明した。

一般に理解されているタンパク構造を第１２図に示す。

−１９ら　− Ｃｏｌｌｃｎ及び彼の共同研究者（文献８８）にＪ：っ
て、二本鎖ヒトｔ−ＰＡは一本鎖分子がタンパク分解的
開裂により、ジスルフィド結合で接続された２個のポリ
ペプチドになる結果形成されることはすでに明らかにさ
れていた。本発明にＪ：って、１−４鎖（分子量３０８
８２　）がＮＨ２−末端部から誘導され、Ｌ鎖（分子量
２８１２６）がＣ００Ｈ−末端領域からなるという結論
が得られる。二本鎖分子のＮ−末端配列決定によれば、
二本鎖形態は１個のアルギニル−イソロイシン結合（第
１２図の矢印）の開裂により生成されると思われる。

ヒ１〜ｔ−ｐΔ（第１２図）の１」鎖領域の１部分の一
次構造は、プラスミノーゲン（文献８９）及びプロトロ
ンビン（文献４０及び４１）のクリングル領域に対して
高度の配列相同性を示す。クリングル領域とは、プロト
ロンビンのプロ断片中で最初に発見された特徴的１−リ
プルジスルフィド構造を意味し１２６− ており、これに関してはＭａｇｎｕｓｓｏｎ　ａｔ　ａ
ｔ、　　（文献９１及び９２）が初めて詳細に記載した
。ｔ−ＰＡの一次配列から２個の所謂クリングル領域が
明らかになる。これらの領域は、各々が８２個のアミノ
酸を含んでおり、プラスミノーゲンの５個のクリングル
領域と高度の相同性を有する。残りのＮ−末端の９１個
のアミノ酸は従来のクリングル領域との相同性を殆んど
有していない。黙しながら、１１個の付加的システィン
残塁が検出されるので、この領域も多数のジスルフィド
結合を含む構造を有し得ると推測し得る。

ヒトｔ−ｐ△のし鎖の触媒部位、所謂セリンプロテアー
ゼ領域は、他のセリン酵素同様に、ヒスチジン　　、ア
スパラギン酸　　及びセリン。７８　　残３２２　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　３７１基から形成
されている可能性が大きい。更に、これらの残基を包囲
するアミノ酸配列は、トリプシン、プロトロンビン及び
プラスミノーゲンの如き他のセリンプロテアーゼの対応
する部分に極めて良く相同している。

本発明を好ましい特定具体例に関して説明してぎたが、
本発明は前記具体例だりに限定されるべぎでないことが
理解されにう。

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、　　Ｗｅｉｍａｒ、Ｗ、、ｅｔ　　ａｌ、Ｊｈｅ　　
１−ａｎｃｅｔ。

Ｖｏｌ、ＩＩ　、Ｎｏ、８２５４．ｐ、１０１８　（１
９８１）。

２１、英国特許出願公開Ｎ　ｏ、２００７６７６△。

−１２９− ２２、Ｗｅｔｚｅｌ、　　　Ａｍｃｒｉｃａｎ　　３ｃ
ｉｅｎｔｉｓｔ、６８，６６４（１９８０）　　。

２３、　Ｍ　ｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、　２ｄ　Ｅｄ、
ｌ−１ａｒｐｃｒ　ａｎｄ　Ｑｏｗｐｕｂｌｉｃａｔｉ
ｏｎｓ、　　　）ｎｃ、、　　　ｌ−１ａｇｅｒｓ１−
１ａ。

Ｍａｒｙｌａｎｄ　　（１９７３）、ｅｓｐ、ｐｐ、１
１２２　　ｅｔ　　ｓｅｑ。

２４、　５ＣｉｅｎｔｉｆｉＯＡｍｅｒｉｃａｎ、　　
２４５．　１０６（１９８７）　。

２５、英国特許出願公開Ｎ　ｏ、２０５５３８２　Ａ　
。

２６、西独特許出願公開２６４４４３２゜２７、　Ｃｈ
ａｎｇ　ｅｔ　ａｔ、、　　Ｎａｔｕｒｅ、　　２７５
．６１７（１９７８）　。

２８、　　ｌ　ｔａｋｕｒａ　ｅｔ　ａｌ、、　　３ｃ
ｉｅｎｃｅ、　１９８．　１０５６（１９７７）　。

２９、　Ｑｏｅｄｄｅｌ　ｅｔ　ａｔ、、　　Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ　　Ａｃ１ｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ、　　８．４０
５７　　（１９８０）　。

３０、欧州特許出願公開Ｎ　００００３６７７６゜３１
、５ｉｅｂｅｎｌｉｓｔ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｃｅｌ＋　
２０　、２６９（１９８０）　。

一１ワ凸− ３２、　３ｔｉｎｃｈｃｏｍｂ　ｅｔ　ａｌ、、　　Ｎ
ａｔｕｒｃ、　　２８２．　３９（１９７９）。

３３、　　Ｋ　ｉｎｇｓｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、、　　Ｇ
ｅｎｅ、　　７．　１４１　（１９７９）　。

３４、　　Ｔｓｃｈｕｍｐｅｒ　ｅｔ　ａｔ、、　　Ｇ
ｅｎｅ、　　１０．　１５７（１９８０）。

３５、Ｍｏｒｔｉｍｅｒ　　ｅｔ　　ａｔ。Ｍ　ｉＣｒ
ｏｌ）ｉｏｌｏｇｉｃａｌＲｅｖｉｅｗｓ、４４，５１
９　　（１９ｇ　　）。

３６、　　Ｍ　１ｏｚｚａｒｉ　　ｅｔ　　ａｌ、、　
　Ｊ　ｏｕｒｎａｌ　　ｏｆＢａｃｔｅｒｉｏｌｏａｙ
、　　１３４．４８　　（１９７８）　。

３７、Ｊｏｎｅｓ、　　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、　　８５．
　２３（１９７７）　。

３８、　　ｌ−１１−１ｉｔｚｅ、　　ｅｔ　　ａｔ、
、Ｊ、Ｂｉｏｌ、　　　Ｃｈｅｍ、。

２５５、　１２０７３　　（１９８０）　。

３９、　　Ｈｅ５ｓ　　ｅｔ　　ａｌ。Ｊ、Ａｄｖ、Ｅ
ｎｚｙｍｅ　　Ｒｅａｕｌ、。

７、　１４９　（１９６８）　　。

４０、　　ｌ」ｏｌｌａｎｄ　　ｅｔ　　ａｌ、、　　
　３ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　　　１７゜４９００　
（１９７８）。

４１、Ｂ　ｏｓｔｉａｎ　　ｅｔ　　ａｌ、、　　　Ｐ
　ｒｏｃ、　　　Ｎ　ａｔｌ、　Ａ　ｃａｄ。

Ｓｃｉ、、（ＵＳＡ）　、　　７７、４５０４　（１９
８０）　。

４２、Ｔｈｅ　　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　　１３ｉｏ１ｏ
ｇｙ　　ｏｆ　　’（ａａＳｔ（Ａｌｌ（１１１−１８
，１９８１）　　、　　Ｃｏ１ｄ　　５ｐｒｉｎａＨａ
ｒｂｏｒ　　Ｌ　ａｂｏｒａｔｏｒｙ、　　　Ｃｏ１ｄ
　　３ｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、　　　Ｎ　ｅｗ　　Ｙ
　ｏｒｋ。

４３、　　Ｃｈａｍｂｏｎ、　　Ａｎｎ、　　Ｒｅｖ、
　　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　　４４゜６１３　（
１９７５）。

４４、　　Ｔｉ５ｓｕｅ　　Ｃｕ１ｔｕｒｃ、　　Ａｃ
ａｄｅｍｉｃ　　ｐｒｅｓｓ。

Ｋ　ｒｕｓｅ　　ａｎｄ　　ｐａｔｔｃｒｓｏｎ　ｃｄ
ｓ、、（１９７３）。

４５、Ｑｌｕｚｍａｎ、　　Ｃｅ１ｌ、　　２３，１７
５　　（１９８１）。

４６、３ｏｌｉｖａｒ　　ｅｔ　　ａｔ、、　　　Ｑｅ
ｎｃ、　　２．９５　　（１９７７）。

４７、　１−ｕｓｋｙ　ｅｔ　ａｌ、、　　Ｎａｔｕｒ
ｅ、　　２９３．　７９（１９８１）。

４８、　　Ｇｌｕｚｍａｎ　　ｅｔ　　ａｔ、、　　　
Ｃｏ１ｄ　　３ｐｒｉｎｇ　　ｌ−１−１ａｒｂｏｒＳ
Ｖ、　　Ｑｕａｎｔ、　　Ｂｉｏｌ、、　　４４．　２
９３　　（１９８０）　。

４９、　　「１ｅｒｓ　　ｅｔ　　ａｌ、、　　　Ｎａ
ｔｕｒｅ、　　　２７３，１１３（１９７８）。

５０、　　ＲＱｄｄｙＣｔ　ａｌ、、　　３ｃｉｅｎｃ
ｅ、　２００．　４９４（１９７８）。

５１、　　Ｃｒｅａ　ｅｔ　ａｔ、、　　Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ　　Ａｃ１ｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ、　　８．２３３１
　　（１９８０）　。

５２、　　Ｑｏｃｄｄｅｌ　ａｔ　ａｌ、、　　Ｎａｊ
Ｕｒｅ、　　２８７．　４１１（１９８０）。

５３、　Ｇｒａｙ　ｅｔ　ａｌ、、　　Ｎａｔｕｒｅ、
　　２９５．５０３（１９８２）　。

５４、　　Ｏｐｐｅｒｍａｎｎ　ａｔ　ａｌ、、　　Ｖ
ｉｒｏｌｏｇｙ、　　１０８．　４７（１９８１）。

５５、　　Ｗａｒｄ　ａｔ　ａｌ、、　　Ｊ　、　　Ｖ
　１ｒｏ１．、　９．　６１（１９７２）。

５６、Δｖｉｖ　ｅｔ　ａｌ、、　　Ｐｒｏｃ、　　Ｎ
ａｔｌ、　　Δｃａｄ。

Ｓｃｉ、、（ＵＳＡ）、組、　１４０８　（１９７２）
　。

５７、　１−ｅｈｒａｃｈ　ｅｔ　ａｔ、、　　３ｉｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　　１６゜４７４３　（１９７７
）。

５８、　　Ｌｙｎｃｈ　ｅｔ　ａｌ、、　　ｖｉｒｏｌ
ｏｇｙ、　　９８．　２５１（１９７９）。

一’ｌ　　、”Ｉ　　３− ５９、　　Ｌｏｄｉｓｈ、　　Ａｍ、　　Ｒｅｖ、　ｏ
ｆ　　３ｉｏｃｈｃｍ、、　　４５゜４０　（１９７６
）　　。

６０、ｐｅｌｈａｍ　ｅｔ　ａｌ、、　　Ｆｕｒ、　　
Ｊ、　　Ｂｉｏｃｌ）ｅｍ、、　　４３゜２４７　　（
１９７６）　　。

６１、　　Ｂ　１ｏｂｅｌ、　　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、　
　Ｃｅ１ｌ　　［３ｉｏｌｏｇｙ、　　６７゜８５２　
（１９７５）。

６２、５ｈｉｃｌｄｓ　ｅｔ　ａｌ、、　　Ｊ、　Ｂｉ
ｏｌ、　　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ。

２５３．３７５３　　（１９７８）。

６３．１ａｅｍｍｌｉ、Ｎａｔｕｒｅ、　　２２７，６
８０（１９７０）。

６４、　　Ｂｏｎｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　　Ｅｕｒ、
　　Ｊ　、　　Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ、、　　４Ｇ。

８３（１９７４）。

６５、Ｑｏｅｄｄｅｌ　　ｅｔ　　ａｌ、、　　　Ｎａ
ｔｕｒｃ、　　２８１，５４４（１９７９）　　。

６６、　　Ｗｉｃｋｅｎｓ　　ｅｔ　　ａｌ、、　　　
Ｊ、３ｉｏ１．　　　Ｃｈｃｍ、。

２５３．２４８３　　（１９７８）。

６７、　　Ｃｈａｎｇ　ｅｔ　ａｌ、、　　ｊ’Ｊａｔ
ｌｌｒｅ、　　２７５．　６１７（１９７ｇ）。

１３４− ６８、Ｂｏ白ｖａｒ　ｅｔ　ａｌ、、　　Ｇｅｎｅ、　
　２．９５　　（１９７７）　。

６９．Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ　ｅｔ　　ａｔ、、　　ｐｒ
ｏｃ、　　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、、ＬＩＳＡ、　７２．３９６１
　（１９７５）　。

７０、　　ｌ−１ａｎａｈａｎ　ｅｔ　ａｌ、、　　Ｇ
ｅｎｅ、　　１０．６３（１９８０）　。

７１、Ｂｉｒｎｂｏｉｍ　ｅｔ　　ａｌ、、Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ　　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、、　　７．１５１３　　（
１９７９）　　。

７２、Ｓｍ１ｔｈ、　　Ｍｅｔｈｏｄｓ　　Ｅｎｚｙｍ
ｏｌ、、　　６５．４９９（１９８０）。

７３、Ｍｅｓｓｉｎｇ　　ｅｔ　　ａｔ、、　　Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ　　、Ａ、ｃｉｄｓＲｅｓ、、　　９，３０９
（１９８１）　　。

７４、　　Ｍａｘａｍ　ｅｔ　ａｔ、、　　Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ　ｉｎ　　ｅｎｚｙｍｏｌ、。

６５．４９９　　（１９８０）。

７５、　　Ｃｒｅａ　　ｅｔ　　ａｌ、、　　Ｐｒｏｃ
、　　Ｎａｔｌ、　　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、、　　　７５．５７６５（１９７８）。

７Ｇ、　　Ｌａｗｎ　ｅｔ　ａｌ、、　　Ｃｅ１ｌ、　
　１５．　１１５７（１９７８）　　。

７７．５ｏｕｔｈｅｒｎ、　　Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、
、９８，５０３（１９７５）。

７８．３ｅｎｔｏｎ　ｅｔ　　ａｔ、、３ｃｉｅｎｃｃ
、１９６，１８０（１９７７）。

７９、ＭＣＧｒａｔｈ　　ａｎｄ　　　１−ｅｖｉｎｓ
ｏｎ、　　　Ｎａｔｕｒｅ。

１に１１１）工４２３く１９８２）　。

８０、　　Ｂｆｉｎ　ｅｔ　　ａｌ、、　　Ｎｕｃｌｃ
ｉｃ　　Ａｃｔａ　　Ｒｅｓ、、　　３゜２３０３　　
（１９７６）　　。

８１、　Ｌ　ａＷｎ　　ｅｊ　　ａｌ、、５ｃｉｅｎｃ
ｅ、２１２．１１５９（１９８１）。

８２、　Ｆｒ＋ｔｓｃｈ　　ｅｔ　　ａｌ、、　　　Ｃ
ｅ１ｌ、　　１９．　９５９（１９８０）。

８３、Ｔａｙｌｏｒ　　ｅｔ　　ａｌ、、［３ｉｏｃｈ
ｅｍ、Ｂ　１ｏｐｈｙｓ。

Ａｃｔａ、　　４４２．　３２４（１９７Ｂ）　。

８３ｂ、Ｅｄｍａｎ　　ｅｔ　　ａｌ、、　　　ｌ：ｕ
ｒｏｐｅａｎ　　Ｊ　、　　Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ、。

１．８０　　（１９６７）。

８４、Ｄｅｎｈａｒｄｔ、　　　Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉ
ｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ。

Ｃｏｍｍ、、２３，６４１　　（１９６６）。

８５、Ｗａｈｌ　ｅｔ　ａｔ、、　　Ｐｒｏｃ、　　Ｎ
ａｔｌ、　　Ａｃａｄ。

５ｃｉ０．（ＬＪＳＡ）、胆、　３６８３　（１９７９
）　。

８６．１）ａｖｉｓ　　ｅｔ　　ａｔ、、　　Ａｄｖａ
ｎｃｅｄ　　３ａｃｔｅｒｉａｌ（３ｅｎｅｔｉｃｓ、
　　Ｃｏ１ｄ　　３ｐｒｉｎｇ　　）ｌａｒｂｏｒＬａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ　　、Ｎｅｗ　　Ｙｏｒｋ　　（１９
８０）　　。

８７、Ｑｒａｎｅｌｌｉ−Ｐｉｐｅｒｎｏ　　ｅｔ　　
ａｌ、、　　　Ｊ、ＥＸＩＴ。

Ｍｅｄ、、　　　１４８，２２３゜ ８Ｂ、　　Ｒｉｊｋｅｎ　　ｅｔ　　ａｌ、、Ｊ、Ｂｉ
ｏｌ、　　　Ｃｈｅｍ、、２５６゜７０３５　　（１９
８１）。

８９．５ｏｔｔｒｕｐ−Ｊｅｎｓｅｎ　　ｅｔ　　ａｌ
、、　　Ｐｒｏｏｒｅｓｓ　　ｉｎＣｈｅｍｉｃａｌ　
　Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ　ａｎｄＴｈｒｏｎ＋ｂｏ
ｌｙｓｉｓ、　　Ｖ　０１．３．　　Ｒａｖｅｎ　　Ｐ
　ｒｅｓｓ。

Ｎ、Ｙ、Ｌ１９１　　（１９７８）。

９０．３　ｏｔｈｒｕｐ−Ｊ　ｅｎｓｅｎ　　ｅｔ　　
ａｌ。Ｐ　ｒｏＣ，Ｎ　ａｔ＋。

Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、、（ＵＳＡ）、７２．２５７７
（１９７５）。

９１、Ｍａｏｎｕｓｓｅｎ　　ｅｔ　　ａｔ、、　　　
ｐｒｏｔｅｏ＋ｙｓ＋ｓ　　ａｎｄＰｈｙｓｉｏｌｏｏ
ｉｃａｌ　　Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ、　　　Ｒ１ｂｂａ
ｎｓ１３７− ｅｔ　　ａｌ、、　　　Ｅ　ｄｓ、、　　Ａ　ｃａｄｅ
ｍｉｃ　　Ｐ　ｒｅｓｓ。

Ｎｅｗ　　Ｙｏｒｋ、ｐ、２０３（１９７６）。

９２、Ｍａｇｎｕｓｓｅｎ　　ｅｔ　　ａｌ。　　ｐ　
ｒｏｔｅａｓｅｓ　　ａｎｄ３ｉｏｌｏｇｉｃａｌ　　
Ｃｏｎｔｒｏｌ、　　Ｃｏ１ｄ　　３ｐｒｉｎｇ１−１
ａｒｂｏｒ　　Ｉ−ａｂｏｒａｔｏｒｙ、　　Ｎ、Ｙ、
、ｐ、１２３（１９７５）。

９３、Ｍｉｌｌｅｒ、　　　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　
　ｉｎ　　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒＧｅｎｅｔｉｃｓ、ｐ、
４３１−３．Ｃｏ１ｄ　　５ｐｒｉｎ。

ト１ａｒｂｏｒ　　　１−ａｂ、、　　　　Ｃｏ１ｄ　
　５ｐｒｉｎｏ　　　ｌ」　ａｒｂｏｒ。

Ｎｅｗ　　Ｙｏｒｋ　　（１９７２）。

９４、Ｒｅ１Ｃｈ、Ｅ、、　　　Ｐｒｏｔｅａｓｅｓ　
ａｎｄＢｉｏｌｏａｉｃａｌ　　Ｃｏｎｔｒｏｌ、　　
（Ｉｂ１ｄ　　）９．３３３−３４１゜ ９５、Ｍａｔｓｕｏ、　　Ｑ、、ｅｔ　　ａｌ、、　　
Ｔｈｒｏｍ。

Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ、　　４５．　２２５（１９８
１）　。

９Ｇ、Ｋｏｒｉｒ＋ｇｅｒ、　　　Ｃ０，ｅｔ　　ａｔ
□　　Ｔｈｒｏｍ。

１−１ａｅｍｏｓ１−１ａｅ、　　４６．　５６１．　
６６２　　（１９８１）　。

１９０− ９７．１−１ｏｙｌａｅｒｔｓ、Ｍ、、ｅｔ　　ａｌ、
、　　Ｊ、Ｆ３ｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、、２５７．２９１２　　（１９８２）。

９８、　　Ｋｏｒｉｎｇｅｒ、　　　　Ｃ，、ｅｔ　　
ａｔ、、　　　ｌｈｒｏｍｂ。

１−１ａｃｍｏｓｔ１−１ａ、４６　６８５　（１９８
１）。

【図面の簡単な説明】

第１図は、プロテアーゼインヒビターの存在下及び不在
下での、メラノーマ細胞から抽出した抗ｔ−ｐΔＩａＧ
により沈降し得る３５Ｓ−標識タンパクの１０％ＳＤＳ
　　ＰＡＧＥの結果を示す図である。 第２図は、メラノーマ細胞から誘導されたｍＲＮＡ画分
の免疫沈降した翻訳産物の電気泳動の結果を示す図であ
る。 第３図は、ヒトｔ−ＰＡの５個のアミノ酸配列に基いて
調製した　Ｐ−標識１４ヌクレオヂド体のプールをプロ
ーブとして用いたどぎの、ＣＤＮΔで形質転換された９
６個のコロニーのハイブリダイゼーションパターンを示
す図である。 第４図は、全長ヒトｔ−ｐΔＣＤＮＡの制限エンドヌク
レアーげマツプである。 第５ａ図、第５ｂ図及び第５Ｃ図は、全長ヒ１−ｔ−Ｐ
Ａ　ｃＤＮＡのヌクレオヂド配列及びそれから推定され
たアミノ酸配列を示す図である。 第６図は、発現プラスミドｐΔＲＩ　ＰＡ’の構築工程
図である。 第７図は、ｐΔＲＩ　ＰＡｏで形質転換された細胞の線
維水溶解能のフィブリンプレートアッセイの結果を示す
図である。 第８図は、ヒ１−ｔ−ＰＡのトリプシン消化によって得
られたペプチドのｌ−Ｉ　Ｐ　Ｌ　Ｃの結束を示すトレ
ース図である。 第９図は、旦、剪拝中での成熟ヒＩ〜ｔ−ＰＡの直接発
現をコードするプラスミドの構築工程図である。 第１０図は、ｐｔ　−Ｐ　Ａ　ｔｒｐ　１２で形質転換
された旦。 ｃｏｌｉにＪ：り産生されるヒトｔ−Ｐ△の線維水溶解
能に対Ｊ−るフィブリンプレートアッセイの結果を示す
図である。 第１１図は、Ｄｌ−ＩＦＲ（突然変異体又は野生型）／
１−ＰＡをコードしているｌ１ｉｌｉ乳類組織培養細胞
を形質転換するのに適したプラスミドの構築工程図であ
る。 第１２図は、本明細書中のＥ、１．に例示した方法で調
製されたヒト組織プラスミノーゲン活性化因子の概略図
である。 ＴＴ　ＣＴ　ＧＡＧＣＡ　ＣＡ　ＧＧＧ　ＣＴＧＧＡ　
ＧＡ　ＧＡＡＡＡ　ＣＣＴ　ＣＴ　Ｇ　ＣＧＡＧＧＡＡ
Ａ　ＧＧＧＡＡ　ＧＧＡ　Ｇ　ＣＡＡＧＣＣＧ　Ｔ　Ｇ
Ａ−２０ ａｙｓ　Ｃｙｓ　ｖａｌ　ｌｅｕ　ｌｅｕ　ｌｅｕ　ｃ
ｙｓ　ｇｌｙ　ａｈａ　ｖａｌ　ｐｈｅ　ｖａｌ　ｓｅ
ｒ　ｐｒｏ　５ｅｒＴＧＣＴＧＴ　ＧＴＧ　ＣＴＧ　Ｃ
ＴＧ　ＣＴＧ　ＴＧＴ　ＧＧＡ　ＧＣＡ　ＧＴＣＴＴＣ
ＧＴｒ　ＴＣＧ　ＣＣＣＡＧＣ０ ＣＹＳ　　ＴＲＰ　　ＣＹＳ　　ＡＳＮ　　ＳＥＲＧＬ
Ｙ　　ＡＲＧ　ＡＬＡ　　ＧＬＮ　　ＣＹＳ　　）ＩＩ
ｓ　　ＳＥＲＶＡＬ　　ＰＲＯＶＡＬＴＧＣＴＧＧ　　
ＴＧＣＡＡＣＡＧＴ　ＧＧＣＡＧＧ　　ＧＣＡ　　ＣＡ
Ｇ　ＴＧＣＣＡＣＴＣＡ、ＧＴＧ　　ＣＣＴ　　ＧＴＣ
３０ ＬＹＳ　　ｐＲＯＴＹＲＳＥＲＧＬＹ　ＡＲＧ　ＡＲＧ
　　ＰＲＯＡＳＰ　ＡＬＡ　　ＩＬＥ　ＡＲＧ　ＬＥＬ
Ｉ　　ＧＬＹ　　ＬＥＵＡＡＧ　　ＣＣＣＴＡＣＡＧＣ
ＧＧＧ　ＣＧＧ　ＡＧＧ　　ＣＣＡ　　ＧＡＣＧＣＣ，
ＡＴＣＡＧＧ　　ＣＴＧ　ＧＧＣＣＴＧ６０ ＴＲＰ　　ＣＹＳ　　ＴＹＲＶＡＬ　　ＰＨＥ　　ＬＹ
Ｓ　　ＡＬＡ　　ＧＬＹ　　ＬＹＳ　　ＴＹＲＳＥＲＳ
ＥＲＧＬＬＩ　　ＰＨＥ　　ＣＹＳＴＧＧ　ＴＧＣＴＡ
ＣＧＴＣＴＴＴ　ＡＡＧ　ＧＣＧ　ＧＧＧ　ＡＡＧ　Ｔ
ＡＣＡＧＣＴＣＡ　ＧＡＧ　ＴＴＣＴＧＣＡＳＮ　　Ｇ
ＬＹ　ＳＥＲＡＬＡ　　ＴＹＲＡＲＧ　　ＧＬＹ　ＴＨ
Ｒ）ＩＩｓ　　ＳＥＲＬＥＬＩ　　ＴＨＲＧＬＵ　　Ｓ
ＥＲＧＬＹＡＡＴ　　ＧＧＧ　　ＴＣＡ　　ＧＣＣＴＡ
ＣＣＧ丁　ＧＧＣＡＣＧ　　ＣＡＣＡＧＣＣＴＣＡＣＣ
ＧＡＧ　　ＴＣＧ　　ＧＧＴ５０ ＨＩＳＶＡＬＬｌｌｌＩＪｓＡＳＮＡＲＧＡＲＧＬＥＩ
ＪＴＨＲＴＲＰＧＬＵＴＹＲＣＹ５ＡＬＰＶＡＬＣＡＣ
ＧＴＧ　　ＣＴＧ　ＡＡＧ　ＡＡＣＣＧＣＡＧＧ　　Ｃ
ＴＧ　ＡＣＧ　ＴＧＧ　　ＧＡＧ　　ＴＡＣＴＧＴ　　
ＧＡＴ　　ＧＴＧ１０ ＡＲＧ　ＰＨＥ　　ＬＥＩＩ　　ＣＹＳ　　ＧＬＹ　Ｇ
ＬＹ　　ＩＬＥ　　ＬＥＵ　　ＩＬＥ　ＳＥＲＳＥＲＣ
ＹＳ　　ＴＲＰ　　ｒＬＥ　　ＬＥＵＣＧＧ　ＴＴＣＣ
ＴＧ　　ＴＧＣＧＧＧ　ＧＧＣＡＴＡ　　ＣＴＣＡＴＣ
ＡＧＣＴＣＣＴＧＣＴＧＧ　ＡＴＴ　ＣＴＣ００ ＶＡＬＣＹＳＬＥＬＩＰＲＯＰＲＯＡＬＡＡＳＰＬＥＵ
ＧＬＮＬＥＬＩＰＲＯＡＳＰＴＲＰＴＨＲＧＬｕＧＴＧ
　ＴＧＣＣＴＴ　ＣＣＣＣＣＧ　ＧＣＧ　ＧＡＣＣＴＧ
　　ＣＡＧ　ＣＴＧ　ＣＣＧ　ＧＡＣＴＧＧ　ＡＣＧ　
ＧＡＧ■３９８００３ ＠１９８３年４月７日■米国（ＵＳ） ■４８３０５２ ０発　明　者　ウィリアム・ジャック・コアーアメリカ
合衆国カリフォルニア ９４４０３サン・マテウ・ブランソ ン・ドライヴ３９１６ ０発　明　者　ダイアン・ペニカ アメリカ合衆国カリフォルニア ９４４０４フオスター・シティ−・ シュノー・レイン８１５・１／２ ０発　明　者　ゴートン・アレン・ヴイハーアメリカ合
衆国カリフォルニア ９４０７０サン・カーロス・メイプ ル・ウェイ１４ ゴ孔続７市正召］ ［和５８年８　Ｉ］５　Ｅｌ １、事件の表示　　　昭和５８年特許願第７９２０５号
２、発明の名称　　　ヒ１〜組織プラスミノーゲン活性
化因子３、補正をＪる者 事イ′１どの関係　　特許出願人 名　称　　　　ジエネンテツク・インコーホレイデッド
４、代　理　人　　　東京都新宿区新宿１丁口１番１４
８　山田ビル（郵便番ｆ’３１６０）電話（０３）　　
３５４−８６２３５、補正命令の１］何　　　自　発 ８、補正の内容 （１）　明細ｍ中特許請求の範囲を別紙のとおり補正す
る。 （２）　明細書中鎖５８頁５行目のｒ　（ＤＰＣＣ処理
した）」を、［（ジフェニル　カルバミル　クロリド（
Ｄ　Ｐ　Ｃ，Ｃ）処１里シた）」と補正する。 （３）　明細書中鎖６４頁９〜１０行目の「Ｅ　ａｒｌ
ｅｓＭｔｎｉｍａｌ　　［５ｓｅｎｔｉａｌ　　Ｍｅｄ
ｉａＪを、「Ｅ　ａｒｌｃｓＭ　ｉｎｉｍａｌ　　Ｅ　
５ｓｅｎｔｉａｌ　　Ｍ　ｅｄｉａ　（米国バージニア
州マツクレーンのＦＩＯＷ　Ｌ　ａｌｌｏｒａｊｏｒ！
ｅＳ礼製）」と補正する。 （４）　明細書中鎖６６頁１〜２行目のｒＮＰ−４０Ｊ
と「（Ｒ終濃度１％）」との間に、 「（ＮＯＮ　ＩＤＥＴ　　Ｐ−４０，米国メリーランド
州ロックヴイルのＢ　ＲＬ　（Ｂ　ｅｔｈｅｓｄａ　Ｒ
ｅｓｅａｒｃｈｌ　ａｂｏｒａｔＯｒｉｅｓ　）礼装）
」を加入する。 （５〉　明細書中箱７９頁３行目の「プラスミドｐΔ１
でｌ５ＲＣＪを、 「プラスミドｐΔＲＩ　ｅｘｓｒｃ　Ｊと補正する。 （６）　明細田中第　１０３０１３行目〜第１０４頁１
２行目の［第７図は線紺素溶解能・・・・・・・・・抽
出物を夫々含む。」を、［第７図は線維素溶解能に関す
るフィブリンプレートアッセイの結果を示す。中央の縦
列の下から上に向って濃度０，２４．０，１４．０．１
０゜０．０５及び０．０２ｐ　ｌｏｇ（１１１１ニット
で標準ｈ１のウロキナーげを添加した。右側の縦列は、
各ウェルに同はの酵素を添加した天然組織プラスミノー
ゲン活性化因子のサンプルであり、同縦列の下から上に
向って組織プラスミノーゲン活性化因子、組織プラスミ
ノーゲン活性化因子＋免疫前血清、組織プラスミノーゲ
ン活性化因子＋組織プラスミノーゲン活性化因子抗体が
各ウェルに収容されている。 左側の縦列の各ウェルは８ｐｉの組換組織プラスミノー
ゲン活性化因子（：、ｃｏｌｉ抽出物を収容しており、
下から上へ向って、第１ウエルは抽出物のみ、第２ウエ
ルは免疫前血清が添加された抽出物及び第３ウエルは組
織プラスミノーゲン活性化因子抗体が添加された抽出物
を夫々含む。」と補正する。 （７）　明細書中鎖１０８頁１２行目の［全く検出され
ない。］の後に、［ウェルｅ、ウェルｆ及びウェルｇは
それぞれ０．２．　０．１及び０．０２ユニツトの精製
されたメラノーマｔ−ＰＡを含む。」を加入する。 （８）　明細書中温１０８真下から　１行目〜第１０９
頁１行目の［，１９８３年１月１９日付出願の米国特許
出願第４５’ｌｌ、１５１号明ＩＩＩ＠に記載の如く」
を削除する。 （９）　明細書中箱１０９頁４〜５行目の「該特許出願
を引用して本明細書中に包含する。」を削除する。 （１０）　　明細書中箱１１０頁５〜７行目の「１−ｅ
Ｖｉｎ４− ８ｏｎ　ｅｔ　ａｌ、により・・・・・・記載されてい
る。−１を、「１９８３年３月９日付で公開されたｌ　
ｃｖｉｎｓｏｎ　ｅｔａｌ、のヨーロッパ特許出願第０
０７３６５６号に記載されている。」と補正する。 （１１）　　明細書中筒１１３頁７行目のしプラスミド
である）。」と「この断片を」との間に下記文章を加入
する。 ［即ち、ｐＦｆ−ＩＥＲは第１３図に示す如く調製され
たプラスミドであり、１１３４２　Ｅは１９８３年３月
９日付で公開された１−ｅｖｉｎｓｏｎ等の］−ロツパ
特許出願第００７３６５６号に記載されており、ｐｌ−
ＩＢＭ−Ｔ−１Ａ及ｔＦＦｌｓＶＲはｌｊｕ等のＤＮＡ
、　　１：２１３　　（１９８２）に記載されており、
１ＩＦＲ４００は以下の如く調製される。 ５Ｖ４０１ＪＪ製オリジンを合む５４０１１ｐの１−ｆ
ｉｎｄＩＦ−１−１ｉｎｄｌｌ［断片（Ｌ　ｔｕ等、　
ＤＮＡ　１：２１３　　（１９８２）　）をＥＣｏＲＴ
部位と）−ｆｉｎｄｍ部位との間でプラスミドｐＭＬ（
Ｍ。 １−ｕｓｋｙ及びＭ　、　　Ｂｏｔｃｈａｎ、　　Ｎ　
ａｔｕｒｃ　、　２９３　ニア！１（１０８１）　）に
結合した。ｌ−１ｉｎｄ■で消化する前に４ｄＮ丁Ｐの
存在下でＫ　ｌｅｎｏｗ曇 ＤＮＡポリメラーゼ■を添加して該プラスミドのＥＣｏ
ＲＩ部位とＳＶ４０の１−（ｉｎｄｌＩ部位とを平滑末
端化した。得られたプラスミドｐＥ　Ｓ　Ｖをｌ−１ｉ
ｎｄ■及びＢａｍ１−ＩＩにより消化し、２９００ｂｐ
のベクター断片を単離した。 該断片に対し、ＥＣｏＲＩ部位にポリリンカー（多数制
限部位を含むＤＮＡ断片）を含むにうに修飾されたＨＢ
Ｖからの２０２５ｂｐの１−ｆｉｎｄ　ｍ−ＢＣｌＩＩ
Ｔｉ片を結合した。　ｌ−１，Ｂ　Ｖ断片は表面抗原遺
伝子を含んでおり、前出の１−１１等、　ＤＮＡ　１：
２１３　、１９８２に記載の如くクローン化したＨＢＶ
　　ＤＮＡのＥｃｏＲＩ−ＢｇｌｌＴ消化にＪ、って得
られる、。 二重鎖リンカ−ＤＮＡ断片（５’１ｌＡＡＧＣＴＴＡＴ
ＣＧΔＴＴＣＴ−△ＧΔΔＴＴＣ３／　、、、　＞をｌ
−１ｉｎｄｌＩ［及びＥＣＯＲ，ＴにＪ、って消化し、
ト１ＢＶ断ハにイ」加し、Ｅ　ｃｏＲＩ　−Ｂ（ＩＩＩ
Ｉ断片をｌ−１ｉｎｄ　ＩＩＩ　−ＢｆｌｌｌＴ断片に
転換した。リンカ−とｌ−Ｉ　Ｂ　Ｖ断片とベクターど
から成る三部分を同時に結合Ｊることも可能であるが、
先ずｌ−ｌ　ｉｎｄ　ｍ　−Ｅ　ｃｏＲＴリンカ−をク
ローン化したＩ」ＢＶＤＮＡに付加し、次に制限酵素を
用いるプラスミドの同時消化によってｌ−１ｉｎｄ　Ｉ
［［−１３ｏｌＨ断片を切除する方法がＪ：り右利であ
るためこの方法を使用した。得られたプラスミド ｐｃＶＦｓＶｌ−ＩＢＶは、ｐｆ３Ｒ３２２由来の１）
ＭＬからの細菌性複製オリジンと同じくｐＭＬからのア
ンピシリン耐性マーカーと、消化１−Ｉ　Ｂ　Ｍ断片の
転写を初期プロモータが指示するように配向されたＳＶ
４０断片と１−Ｉ　Ｂ　Ｖからの表面抗原渭伝子とを含
む。 １−Ｉ　Ｂ　Ｖ断片はまた哺乳類細胞の細胞質に通常形
成される如ぎポリアデニル化ｍＲＮＡを産生ずるための
ポリアデニル化シグナルを与える。）−ＩＢｓ　Ａａコ
ード領域は、ＥＣ０ＲＩによる消化と前記の如きＫ　１
ｅｎＯＷＤＮΔポリメラーゼににる末端充填と３ａｍ１
−Ｉ　Ｉによる部分消化とによって除去される。 Ｄ　Ｉ−Ｉ　Ｆ　ＲをコードするｃＤ　Ｎ　ＡからのＦ
ｎｕ　４ＨＩ−ＢｇＩＩＩ断片が該領域に挿入される。 、（７られたプラスミドは第１４図に示されている。Ｉ
ＩＦＤｌｌは野生型Ｄ　Ｉ−Ｉ　Ｆ　ＲｃＤＮＡプラス
ミドｐＤＨＦＲ−１１（Ｎｕｎｂｅｒｇ等、　Ｃｅ１ｌ
　１９：　３５５　（ｉ９８０）　）のｌ”ｎｕ４１−
ＩＩ−ＢＯＩＩＩ断片を用いて構築されたものであり、
Ｉ）ＦＲ４００はｐＲ４００，１２からの同様の断片を
用いて構築されたものである。 ＯＲ、’１００．１２は、メト１〜レキＬ！−１へ耐性
Ｄ　Ｉ−Ｉ　Ｆ　ＲをコードするＤＮＡ配列を含む組換
プラスミドであり、突然変異３Ｔ　６Ｒ４００細胞（Ｄ
、　Ａ、　Ｈａｂｅｒ及びＲ，Ｔ、　Ｓｃｈｉｍｋｅ。 Ｃｅ１ｌ　、　２６：３５５　　＜１９８１）　）から
ｌｌｌＲＮＡを単離し、単離１ｎＲＮ△からｃＤＮＡラ
イブラリを調製し、ｐｓｔｌ：開裂ｐＢＲ３２２にＣＤ
　Ｎ　Ａを結合し、旦、剪杖株２９４（ＡＴＣＣ３１４
４６）を形質転換し、ネズミのＤ　Ｉ−ＩＦＲｃＤＮＡ
　（Ｊ、　Ｈ，Ｎｕｎｂｅｒｇ等、前出）からのＣＤＮ
ＡインプートのＰｓＬＩ−８Ｑｌ■消化物を用いて形質
転換体をプローブし、適正な突然変異ＤＨＦＲコード配
列を有するプラスミドを含むコロニーを選択することに
よって調製される。」 （１２）　　明細少中鎖１１７頁９〜１０行目の「出願
中のＧｅｎｅｎｔｅｃｈ　　Ｄｏｃｋｅｔ　Ｎｏ、１０
０　／９２に記載の」を削除で−る。 （１３）　　明細書中東１１７頁下から３行目の「であ
る。」と「従って、］との間に下記文章を加入する。 「該プラスミドはＩＮＦ　Ｄ　１１を１）ＦＲ４００に
置ぎかえてｐＥ　ＨＥ　Ｒと同様にして構築される（第
１３図及び第１４図参照）。又は、第１５図に示す如く
構築される。第１５図の ＩＩＥ　３４２．Ｄ　２２は　ｐＤ　ＨＦ　Ｒ−１１（
Ｎ　ｕｒｂｅｒｇ。 前出）から由来しており、（Ｄ３４２　Ｅの初期プロモ
ータの上流のＥＣｏＲＩ部位の欠失ににり得られた）　
　ＩＩＥ　　３４２ΔＲ１は第１６図に記載されている
。」 （１４）　　明細書中東１３１頁７行目のｒ　（１９８
）　Ｊを「（１９８０）」と補正する。 （１５）　　明細書中鎖１４１頁１０行目の後に下記文
章を加入する。 ［第１３図は、ｐＥ　ｌ−ｉ　Ｅ　Ｒの構築工程図であ
る。 第１４図は、ｐＦ　Ｒ４００及びｐＦ　Ｄ　ｉｌの調製
説明図である。 第１５図は、ＩＩＥ　３４２．１−１１３Ｖ　、　Ｅ　
４００．　Ｄ　２２の構築工程図である。 第１６図は、ｐＦ３Ａ２．Ｄ２２の構築工程図である。 」 （１６）　　図面中箱４図を別紙のとおり補正する。 （１７）　　図面中箱５ａ図、第５ｂ図及び第５Ｃ図を
別紙のとおり補正する。 （１８）　　図面中箱１１図を別紙のとおり補正する。 （１９）　　図面中箱１３図、第１４図、第１５図及び
第１６図を別紙のとおり追加する。 ２、特許請求の範囲 （１）　ヒト由来の他のタンパクを実質的に含有しない
ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子。 （２）　天然のグリコジル化を伴わないヒト粗織プラス
ミノーゲン活性化因子。 （３）　組換宿主細胞によって産生されるヒト組織プラ
スミノーゲン活性化因子。 （４）　実質的に純粋な形態にあるヒト組織プラスミノ
ーゲン活性化因子。 （５）　前記ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子の通
常の第一アミノ酸のＮ−末端から伸延するポリペプチド
配列を含有することを特徴とする特許請求の範囲第１項
乃至第４項のいずれかに記載のヒト組織プラスミノーゲ
ン活性化因子。 （６）　ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子をコード
している配列を含有するＤＮＡ配列。 （７）　形質転換微生物又は形質転換細胞に於い１− て、特許請求の範囲第６項に記載のＤＮＡ配列を発現さ
せ得る複製可能な発現ベクター。 （８）　プラスミドｐΔＲＩＰΔ°又はｐｔ　−Ｐ　Ａ
　ｔｒｐ　１２゜ （９）　特許請求の範囲第７項又は第８項に記載のベク
ターで形質転換された微生物又はｍ胞。 （１０）　　大腸菌（Ｌ、ｃｏｌｉ）菌株を形質転換し
て得られることを特徴とする特Ｌｔ［請求の範囲第９項
に記載の微生物。 （１１）　　特許請求の範囲第１項乃至第５項のいずれ
かに記載のヒト粗織プラスミノーゲン活性化因子の治療
上有効量を、薬剤上許容し得るキャリヤーと混合して含
有する組成物。 （１２）　　非経口投与に適づる形態にあることを特徴
とする特許請求の範囲第１１項に記載の組成物。 （１３）　　血管の疾病もしくは障害の治療に於ける、
又は前記治療に有用な薬剤組成物の製造に於【プる、−
／１　□□ 特許請求の範囲第１項乃至第５項のいずれかに記載のヒ
ト組織プラスミノーゲン活性化因子の使用。 （１４）　　ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子をコ
ードしているＤＮＡ配列を組換宿主細胞に於いて発現さ
せることを特徴とする方法。 （１５）　　ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子をコ
ードしているＤＮＡ配列を適当な宿主細胞に於いて発現
させ得る複製可能な発現ベクターを調製し、 宿主細胞を形質転換して組換宿主細胞を得、前記ヒト組
織プラスミノーゲン活性化因子をコードしているＤＮＡ
配列を発現させ得る条件下で、前記組換宿主細胞を培養
してヒト組織プラスミノーゲン活性化因子を産生さＶ。 前記ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子を回収する ことを特徴とするヒト組織プラスミノーゲン活性化因子
の製造方法。 グリコジル化部位はグリコジル化されておらず、ミノー
ゲン活性化因子。 特開昭５９−４２３２１（５２） 手続ン市道′Ｅ、書（方式） １．事件の表示　　　昭和５８年特Ｒ１Ｆ願第７９２０
５号２、発明の名称　　　ヒト組織プラスミノーゲン活
性化因子３、補正をする者 事件との関係　　特許出願人 名　称　　　　ジエネンテツク・インコーホレイテッド
４、代　理　人　　　東京都新宿区新宿１丁目１番１４
号　山田ピル５、補正指令の日付　　　昭和５８年８月
１０日６、補正により増加する発明の数 ７、補正の対象　　　図面 ８、補正の内容　　　図面中、鮮明に描いた第５図及び
第１２図をＧＴＴＣＴＧＡＧＣＡＣＡＧＧＧＣＴＧＧＡ
ＧＡＧＡＡＡＡＡＴＴＴＡＡＧＧＧＡＣＧＣＴＧＴＧＡ
ＡＧＣＡＡＴＧＣＧＴＧ　ＡＴＣＴＧＣＡＧＡ　　ＧＡ
Ｔ　　ＧＡＡ　ＡＡＡ０ ＧＬＮ　　ＳＥＲＴＲＰ　　ＬＥＵ　　ＡＲＧ　　ＰＲ
ＯＶＡＬＣＡＧ　　ＴＣＡ　　ＴＧＧ　　ＣＴＧ　　Ｃ
ＧＣＣＣＴ　　ＧＴＧ０ ＣＹＳ　　ＴＲＰ　　ＣＹＳ　　ＡＳＮ　　ＳＥＲＧＬ
Ｙ　ＡＲＧＴＧＣＴＧＧ　　ＴＧＣＡＡＣＡＧＴ　　Ｇ
ＧＣＡＧＧ０ ＬＹＳ　　ＳＥＲＣＹＳ　　ＳＥＲＧＬＵ　　ＰＲＯＡ
ＲＧＡＡＡ　ＡＧＴ　　ＴＧＣＡＧＣＧＡＧ　　ＣＣＡ
　　ＡＧＧ０ ＧＬＮ　　ＡＬＡ　　ＬＥ（Ｊ　　ＴＹＲＰＨＥ　　Ｓ
ＥＲＡＳＰＣＡＧ　　ＧＣＣＣＴＧ　　ＴＡＣＴＴＣＴ
ＣＡ　　ＧＡＴ０ ＰＨＥ　　ＡＬＡ　　ＧＬＹ　　ＬＹＳ　　ＣＹＳ　　
ＣＹＳ　　ＧＬＵＴＴＴ　　ＧＣＴ　　ＧＧＧ　　ＡＡ
Ｇ　　ＴＧＣＴＧＴ　　ＧＡＡＣＣＴＣＴＧＣＧＡＧＧ
ＡＡＡＧＧＧＡＡＧＧＡＧＣＡＡＧＣＣＧＴＧＡＡＣＧ
　　ＣＡＧ　　ＡＴＧ　　ＡＴＡ　　ＴＡＣＣＡＧ　　
ＣＡＡ　　ＣＡＴ０ ＣＴＣＡＧＡ　　ＡＧＣＡＡＣＣＧＧ　　ＧＴＧ　　Ｇ
ＡＡ　　ＴＡＴＧＣＡ　　ＣＡＧ　　ＴＧＣＣＡＣＴＣ
Ａ　　ＧＴＧ　　ＣＣＴ　　ＧＴＣ０ ＴＧＴ　　ＴＴＣＡＡＣＧＧＧ　　ＧＧＣＡＣＣＴＧＣ
ＣＡＧＴＴＣＧＴＧ　　ＴＧＣＣＡＧ　　ＴＧＣＣＣＣ
ＧＡＡ　　ＧＧＡ０ ＩＬＥ　　ＡＳＰ　　ＴＨＲＡＲＧ　　ＡＬＡ　　ＴＨ
ＲＣＹＳ　　ＴＹＲＡＴＡ　ＧＡＴ　ＡＣＣＡＧＧ　　
ＧＣＣＡＣＧ　　ＴＧＣＴＡＣ００ ＡＲＧ　　ＧＩ ＧＡＧ　ＧＡＣＣＡＧ　ＧＧＣＡＴＣＡＧＣＴＡＣＡＧ
Ｇ　Ｇ（ＡＧＴ　　ＧＧＣＧＣＣＧＡＯＴＧＣＡＣＣＡ
ＡＣＴＧＧ　　Ａ〕３０ １　ＰＲＯＡ： ＣＣＡＧノ ＧＧＧ　ＡＡＣＣＡＣＡＡＣＴＡＣＴＧＣＡＧＡ　ＡＡ
ＣＣ１−１ＧＬＹじ ＥＧＧＧＡノ ＡＧＣＡＣＣＣＣＴ　　ＧＣＣＴＧＣＴＣＴ　　ＧＡＧ
　　ＧＧＡ　　Ａ＋−Ｙ　　ＴＲＩＲＴＲＰ　　ＳＥＲ
ＴＨＲＡＬＡ　　ＧＬＵ″ＪＣＡＣＧ　　ＴＧＧ　ＡＧ
ＣＡＣＡ　　ＧＣＧ　　ＧＡＧ２０ λＣＡＧＣＡＧＣＧＣＧ　　ＴＴＧ　　ＧＣＣＣＡＧ；
Ｐ　　ＡＬＡ　　ＩＬＥ　　ＡＲＧ　　ＬＥＵ　　ＧＬ
Ｙ　　ＬＥＵ＼ＣＧＣＣＡＴＣＡＧＧ　　ＣＴＧ　　Ｇ
ＧＣＣＴＧ５０ ｍＡ　　ＧＡＴ　　ＣＧＡ　　ＧＡＣＴＣＡ　　ＡＡＧ
　　ＣＣＣ１’Ｓ　　ＴＹＲＳＥＲＳＥＲＧＬＵ　　Ｐ
ＨＥ　　ＣＹＳλＧ　　ＴＡＣＡＧＣＴＣＡ　　ＧＡＧ
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ＴＴ　　ＧＧＧＣＣＣＴＣＣＴＧＣＴＣＣＡＣＣＴＧＣ
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ＴＴ　　ＧＣＣハハＵ　しハし　八Ｉｊｂ　ハらら　Ｔ
ＣＧ　　ＣＣＣＧＧＡ　　ＧＡＧ４３０ ＴＧＴ　　ＣＴＧ　ＡＡＣＧＡＴ　ＧＧＣＣＧＣＡＴＧ
　ＡＣＴＧＧＣＣＴＧ　　ＧＧＣＴＧＴ　　ＧＧＡ　　
ＣＡＧ　　ＡＡＧ　　ＧＡＴ２０ ＶＡＬ　　ＴＨＲＡＳＮ　　ＴＹＲ、ＬＥＵ　　ＡＳＰ
　　ＴＲＰ　　ＩＬＥＧＴＴ　　ＡＣＣＡＡＣＴＡＣＣ
ＴＡ　　ＧＡＣＴＧＧ　　ＡＴＴＣＣＡＧＧＡＡＣＡＣ
ＣＣＧＡＣＴＣＣＴＣＡＡＡＡＧＣＡＡＡＴＧＣＴＧＣ
ＡＡＡＧＧＣＧＣＡＧＴＧＣＴＴＣＴＣＴＡＣＡＧＡＣ
ＴＴＡＣＧＡＧＡＣＣＣＴＡＣＡＧＧＧＡＧＡＧＧＧＡ
ＡＧＡＧＴＧＣＡＨＩｓ　　ＶＡＬ　　ＡＲＧ　　ＬＥ
ＬＩ　　ＴＹＲＰＲＯ５ＥＲＣＡＴ　　ＧＴＣＡＧＡ　
　ＣＴＧ　　ＴＡＣＣＣＡ　　ＴＣＣ５０ ＣＴＴ　　ＡＡＣＡＧＡ　　ＡＣＡ　　ＧＴＣＡＣＣＧ
ＡＣＡＲＧ　　ＳＥＲＧＬＹ　　ＧＬＹ　　ＰＲＯＧＬ
Ｎ　　ＡＬＡＣＧＧ　　ＡＧＣＧＧＣＧＧＧ　　ＣＣＣ
ＣＡＧ　　ＧＣＡ８０ ＬＥＬＩ　　ＶＡＬ　　ＧＬＹ　　ＩＬＥ　　ＩＬＥ　
　ＳＥＲＴＲＰＴＴＧ　　ＧＴＧ　　ＧＧＣＡＴＣＡＴ
ＣＡＧＣＴＧＧ１０ ＶＡＬ　　ＰＲＯＧＬＹ　　ＶＡＬ　　ＴＹＲＴＨＲＬ
ＹＳＧＴＣＣＣＧ　　ＧＧＴ　　ＧＴＧ　　ＴＡＣＡＣ
Ａ　　ＡＡＧ２７

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）　ヒ１〜由来の他のタンパクを実質的に含有しな
   いヒト組織プラスミノーゲン活性化因子。 （２）　天然のグリコシル化を伴わないヒ１〜組織プラ
   スミノーゲン活性化因子。 （３）　組換宿主細胞によって産生されるヒト組織プラ
   スミノーゲン活性化因子。 〈４）　実質的に純粋な形態にあるヒト組織プラスミノ
   ーゲン活性化因子。 く５）　前記ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子の通
   常の第一アミノ酸のＮ−末端から伸延づ−るポリペプチ
   ド配列を含有することを特徴とする特許請求の範囲第１
   項乃至第４項のいずれかに記載のヒ１〜１１織プラスミ
   ノーゲン活性化因子。 １− （６）　ヒ１〜組織プラスミノーゲン活ｆ１化囚了を］
   −ドしている配列を含有覆るＤＮＡ配列。 （７〉　形質転換微生物又は形質転換細胞に於いて、特
   許請求の範囲第６項に記載のＤＮＡ配列を発現させ得る
   複製可能な発現ベクター。 （８）　プラスミドρΔＲｒ　ＰＡｏ又は＋１ｔ　−Ｐ
   　Ａ　ｔｒｐ　１２゜ （９）　特許請求の範囲第７項又は第８項に記載のベク
   ターで形質転換された微生物又は細胞。 （１０）　　犬賜菌（１’：、ｃｏｌｉ）菌株を形質転
   換して得られることを特徴とする特許請求の範囲第９項
   に記載の微生物。 （１１）　　特許請求の範囲第１項乃至第５項のいずれ
   かに記載のヒト組織プラスミノーゲン活性化因子の治療
   上有効量を、薬剤−Ｊ：　＊ｒ容しく！するキャリ（７
   −と混合して含有する組成物。 （１２）　　非経口投与に適する形態にあることを特徴
   とする特許請求の範囲第１１項に記載の組成物。 （１３）　　血管の疾病もしくは障害の治療に於ける、
   又は前記治療に有用な薬剤組成物の製造に於ける、特許
   請求の範囲第１項乃至第５項のいずれかに記載のヒト組
   織プラスミノーゲン活性化因子の使用。 （１４）　　ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子をコ
   ードしているＤＮＡ配列を組換宿主細胞に於いて発現さ
   せることを特徴とする方法。 （１５）　　ヒト１１１１１プラスミノーゲン活性化因
   子をコードしているＤＮＡ配列を適当な宿主細胞に於い
   て発現させ得る複製可能な発現ベクターを調製し、 宿主細胞を形質転換して組換宿主細胞を得、前記ヒト組
   織プラスミノーゲン活性化因子をコードしているＤＮＡ
   配列を発現させ得る条件下で、前記組換宿主細胞を培養
   してヒト組織プラスミノーゲン活性化因子を産生させ、 前記ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子を回収する ことを特徴とするヒト組織プラスミノーゲン活ｆｌｔ化
   因子の製造方法。