JPH05502373A - ヒトプラスミノーゲン変異体を発現させる方法及びその原料 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 ヒトプラスミノーゲン変異体を発現させる方法及びその原料産業上の利用分野 本発明は、プラスミノーゲン変異体をコードしている遺伝子を発現させるための 方法及びそのための原料に関し、さらに詳細には、哺乳動物細胞系においてヒト プラスミノーゲン変異体を発現させるための方法及びそのための原料ならびにそ の産物に関する。

関連分野の説明 血餅タンパク質フィブリン又はその前駆体であるフィブリノーゲンがプラスミン 酵素（Ｐｍ）によってタンパク質溶解的に分解（フィブリツリシス）されること により、フィブリンが血管に有害に蓄積することが妨げられる。種々の障害では 、病因論的フィブリン沈着が自発的に分解されず、その結果、血栓が形成され、 血管に血餅（血栓）が生じる。多くの場合、実行できる処置は血栓溶解療法、即 ちＰｍによる血餅の溶解しかない。

Ｐｍは、プラスミノーゲン（Ｐｇ）と呼ばれる「プロ酵素」又は「チモーゲン」 前駆体か活性化されて循環系において産生される。血栓溶解療法はブラスミノー ケンアクチベーターを投与することにより行われる。このようなブラスミノーケ ンアクチベーターとしては、ストレプトキナーゼ（ＳＫ）、ウロキナーゼ（ＵＫ ）、及び組織プラスミノーケンアクチベータ−（ｔ−ＰＡ）が挙げられる。

ヒトＰｇ（ＨＰｇ）は、アミ／末端アミノ酸がＧｌｔ＋であり、７９１個のアミ ノ酸を含有する１本鎖の糖タンパク質として循環系に存在している（循環ＨＰｇ は従って、［Ｇｌｕ’］プラスミノーゲンと呼ぶことができる）［Ｆｏｒｓｇｒ ｅｎらのＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、　、　２１影２５４−２６０（１９８７）　；　 ＭａｌｉｎｏｗｓｋｉらのＢｉｏｃｈｅｍ、　２３：４２４３−４２５０（１９ ８４）　：　ＭｃＬｅａｎらのＮａｔｕｒｅ　３３０：１３２−１３７（１９８ ７）　；　５ｏｔｔｒｕｐ−ＪｅｎｓｅｎらのＰｒｏｇ、　ＣｈｅｔＩｌ、　Ｆ ｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ　ＴｈｒｏｍｂｏｌｙＨＰＨの炭水化物構造の分析によ り、それには２つのグリフシル化変異体が存在すること、即ち２つのグリコフル 化部位（Ａ　ｓｎ”’及び７ｈｒｓａｇ）を有する第１のものと、１つのグリフ シル化部位（Ｔｈｒ３４１１）を有する第２のものとが存在し、それらのサブ型 は不完全なシアル酸部分を有していること、が判明している［Ｃａ５ｔｅｌｌｉ ｎｏのＣｈｅｆｆｌ。

Ｒｅｖ、　、も：４３１−４４６（１９８１）］。これらの型及びサブ型は循環 プラスミノーゲンが示す翻訳後修飾の例である。

ＨＰｇはＡｒｇ”’−Ｖａｌ”’ペプチド結合の開裂によって活性化され、２本 鎖のジスルフィド結合セゾンプロテアーゼＣＬｙｓ”］　Ｐ　ｌｌｌを産する。

この分子も活性化の際に生成されるヒトＰｍ（ＨＰｍ）による自己分解の結果と して、アミノ末端７７アミノ酸を欠いている［Ｖｉ。

１ａｎｄ及びＣａ５ｔｅｌｌｉｎｏのＪ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　、　２５ １　：３９０６−３９１２（１９７６）］。この開裂は、ＳＫ、ＵＫ及びｔ−Ｐ Ａの中の１つの種々のアクチベーターによって触媒され得る「概説としては、Ｃ ａｇｔｅｌ　１ｉｎｏのＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、　３３：８４７−６５０（１９ ８３）を参照のこと］。後者２つのタンパク質はＨＰｇ内の適切なペプチド結合 の開裂を直接触媒してＨＰ−を与える酵素であるが、ＳＫはこのような特有の活 性を有しておらず、そのプラスミノーケンアクチベーター活性はＨＰｇ及びＨＰ ｍと複合体を形成する形成能に依存しており、上記の２つの分子の実際の又は潜 在的なプラスミン活性部位を利用することによりアクチヘーターとして機能する ものである［Ｃａ５ｔｅｌｌｉｎｏ、前掲］。

［Ｇｌｕ’］Ｐｇは２つの主要な変異体の型で血漿中に存在し、それらの変異体 はＡｓｎ２８”位のグリコジル化の程度がそれぞれ相違するものである［Ｈａｙ ｅｓ及びＣａ５ｔｅｌｌｉｎｏのＪ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　、　２５４　 ：８７６８−８７８０（１９７９）　；　Ｃａ５ｔｅ１１ｉｎｏ、前掲］。［Ｇ １ｕ’］Ｐｇ内の１−５６１残基を含む潜在的なプラスミン重鎮は、「クリング ルＪ　［５ｏｔｔｒｕｐ−Ｊｅｎｓｅｎら、前掲］と呼ばれるそれぞれが約８０ アミノ酸を含有する５つの高度に相同的な領域を含有している。これらのクリン グルは独立したドメインとして存在していると思われ［Ｃａ５ｔｅｌｌｉｎｏら のＪ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　、　２５６４７７ｇ−４７８２（１９８１） コ、ＨＰｇ及びＨＰｍの機能性にとって重要である。例えば、クリングル１ドメ イン（アミノ酸残基８４−１６２）はプラスミン又はプラスミノーゲンと、フィ ブリン及びフィブリノーゲンフタ−＜Ｃ（１→［ＵｒａｎｏらのＪ、　Ｂｉｏｌ 、　Ｃｈｅｍ、　、　２６２　：　１５９５９−１５９６４（１９８７）］、な らびに正の活性化エフェクターであるε−アミノカプロン酸（ＥＡ　ＣＡ　）［ ＭａｒｋｕｓらのＪ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　、　２５３ニア２７−７３２ （１９７８）］との相互作用にとって重要なようである。さらに、この同じセグ メントは、Ｉ（Ｐｍとその主要な血漿インヒビターであるα、−抗プラスミンと の初期の迅速な結合に関与している［Ｍｏｒｏｉ及びＡｏｋｉのＪ、　Ｂｉｏｌ 、　Ｃｈｅｍ、　、　２５１：５９５６−５９６５（１９７６）］。クリングル ４領域（残基３５８−４３５）は、−Ｇｌｕ’］Ｐｇの非常に太きなリガンド誘 発化フンホメーション改変［ＶｉｏｌａｎｄらのＡｒｃｈ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、 　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　、　１７０　：３００−３０５（１９７５）］、及び正の エフェクターＥＡＣＡの存在下にチモーゲンの活性化速度が付随して増大するこ と［Ｃ１ａｅｙｓ及びＶｅｒｍｙｅｌｉｎのＢｉｏｃｈｅｃ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ 、　Ａｃｔａ、　３４２．３５１−３５９（１９７４）コに関与することのでき る、［Ｇ　ｌｕ’］　Ｐ　ｇに存在する弱いＥＡＣＡ結合部位（群）を含有して いるようである。

血栓溶解療法は有用であるが、その治療力は血栓の部位におけるプラスミノーゲ ンの利用性によって抑制される。血栓溶解療法は結果としてプラスミノーゲンを 消費させるため、又は血栓に存在するブラスミ／−ケン量は不適切な士でしかな いため、又は血栓の年令及び虚血（血流の減少に由来する局所的な貧血）に関連 して局所プラスミノーゲンが枯渇するために、プラスミノーゲン濃度は制限され ることがある［ＡｎｄｅｒｌｅらのＨａｅｍｏｓｔａｓｉｓ、　１８：（補１） 、　１６５−１７５（１９８８）］。

従って、局所的に利用されるプラスミ／−ケン量を補ってやるのが望ましい。

血栓溶解療法に使用するためのプラスミノーゲンを得るために組換え発現系にお いて大量のプラスミノーゲンを発現させる方法は簡便な方法であるが、哺乳動物 細胞タイプでは細胞内ブラスミノーケンアクチベーターがほぼ至るところに存在 しているため、無傷のＨＰｇをそのような哺乳動物発現系において発現させるこ とは非常に困難であった。このようなアクチベーターが存在すると、産生される ＨＰｍによるプラスミノーゲンの自己消化が起こりかねず、そのような発現系の 条件付けされた細胞培地中には分解型のＨＰｇが現れることになる［Ｂｕｓｂｙ らのＦｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ、　２．６４（１９８８）］。

アミン末端アミノ酸配列分析、ＳＤＳ／ＰＡＧＥによる分子量の測定、セファロ ース−リシンアフィニティークロマトグラフィー移動、活性化特性、抗体反応性 、及び得られたプラスミンの活性に基づいて本質的にヒト血漿［Ｇ　ｌ’ｕ’］ 　Ｐ　ｇと適合すると思われる組換えヒトプラスミノーゲンが、昆虫細胞におい て産生されている（ｉｒＨＰｇ）　［Ｗｈｉｔｅｆｌｅｅｔ−ＳｍｉｔｈらのＡ ｒｃｈ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　、　２７１　：３９０−３９ ９（１９８９）］。これまで野生型の組換えＨＰ　ｇ（ｗｔ−ｒＨＰ　ｇ）の哺 乳動物細胞での発現が成功していなかったので、これは意義ある発見である。し かし、ストレプトキナーゼと血漿ＨＰｇ及びｉｒＨＰｇとから形成される等モル 複合体の動力学的性質を比較すると、それぞれの複合体内におけるＳＤＳ／ＰＡ ＧＥゲルの一時的な事象は、ＨＰｇのＨＰｍへの変換が迅速に起こる点で、Ｂ　 ａｊａｊ及びＣａｓｔｅｌ　１ｉｎｏのＪ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｌｍ、、２５２： 　４９２−４９８　（１９７７）に記載されている結果と同一であった。

このことは、ＨＰｇが複合体の安定な成分でないことを示唆している。

２７０−２８０位を包含するヒＩ−ｔ−Ｐ　Ａの開裂部位は、特定の酵素的開裂 に耐性又は免疫のあるｔ−Ｐ　Ａ変異体が作成されるように修飾できることが知 られている。例えば、２７５．２７６及び２７７位のタンパク質開裂部位にアミ ノ酸置換を有するｔ−ＰＡ変異体が開示されている［欧州特許公開束１！１９． ５７４号コ。２７５位にアルギニン以外のアミノ酸を有するｔ−ＰＡ変異体とし て好ましくは特徴付けられるこれらの変異体は、プロテアーゼ耐性の１本鎖ｔ− ＰＡ変異体と呼ばれ、これは１本鎖又は２本鎖のいずれかの型で存在し得る天然 のｔ−ＰＡとは異なり、２７５位のプロテアーゼ開裂に対して耐性であり、従っ てインビボにおいては２本鎖型へと代謝的に変換されない。このｔ−ＰＡ型は、 そのフィブリン結合性及びフィブリン刺激性が２本鎖ｔ−Ｐ　Ａと比較して増大 し、かつより安定である点から、生物学的及び経済的なある種の有用性を有して いると考えられる。プラスミノーケンアクチベーターの他の型はフィブリンと相 互作用できる１つのドメイン及びウロキナーゼのプロテアーゼドメインを含有す るものであり、その１つの例は２本鎖つロ牛ナーゼを形成しにくいように改変さ れたウロキナーゼである。１９８８年７月１４日公開のＷｏ　８ｇ１０５０８１ を参照のこと。

ＩＰＡのプロテアーゼ開裂部位を修飾することに関連した特許文献としてはさら に、例えばＥＰＯ特許番号２４１．２０９号、１９８６年１１月１２日公開の２ １１１．１５３号、１９８７年８月１９日公開の２３３，０１３号、１９８８年 １１月２３日公開の２９２．００９号、１９８８年１２月７日公開の２９３．９ ３６号、及び１９８８年１２月７日公開の２９３．９３４号、ならびにＴｏ　８ ８／１０１１９を挙げることができる。

本発明の目的は、ストレプトキナーゼなどのフィブリン溶解酵素との複合体内に おいてその複合体として安定であり、そのために天然のプラスミノーゲン分子よ りも活性の高いプラスミノーゲン分子を提供することにある。

本発明の他の目的は、内生の部位特異的なブラスミ／−ケンアクチベーターが実 際に欠如していないあらゆる組換え発現系（昆虫細胞など）において、プラスミ ノーゲン分子を生産することである。

本発明における上記の及び他の目的は当業者に明らかであろう。

本発明の要約 このように、本発明はその２本鎖型へのタンパク質分解的開裂に対して耐性であ るプラスミノーゲン、好ましくはヒトプラスミノーゲン、最も好ましくは［Ｇｌ ｕリプラスミノーゲンケンードしている核酸配列を提供するものである。

他の態様として、本発明は制御配列と作動可能に結合された核酸配列を含有する 発現ベクター、及びこのベクターを含有する宿主細胞、好ましくは真核生物細胞 、最も好ましくは哺乳動物宿主細胞を提供する。

さらに、本発明は上記のベクターを含有する細胞を培養する工程、及びその細胞 培養物又はその分子が分泌される場合には培養培地からプラスミノーゲンを回収 する工程をも好ましくは包含して（Ａる、プラスミノーゲンの生産方法を提供す る。

また、本発明は他の態様として、２本鎖型へのタン）−ｅ／）質分解的開裂に対 して耐性であるプラスミノーゲンを提供する。好ましくは、本発明プラスミノー ゲンはその５６１−５６２の２本鎖開裂部位力く突然変異された１本鎖配列変異 体である。

本発明はさらに、製薬的に許容され得る担体中に製剤化された上記プラスミノー ゲンの有効量を含有する、血栓溶解のための医薬組成物を提供する。この組成物 にはさらに、好ましくはプラスミノーゲンと複合化しているフィブリン溶解酵素 も包含される。

本発明はまた、血栓溶解療法を必要としている哺乳動物に上記医薬組成物の有効 量を投与することを特徴とする血栓溶解療法のための方法を提供する。

さらなる態様として、本発明は、加水分解により除去することのできる基によっ て保護（ブロック）されているフィブリン溶解活性にとって必須の触媒部位を有 する、フィブリン溶解酵素とプラスミノーゲンとの２元複合体（ｂｉｎａｒｙ　 ｃｏｍｐｌｅｘ）を調製するための方法であって、式：Ａ−Ｂ又はＥ−Ｆ ［式中、Ａはフィブリン溶解活性にとって必須の触媒部位に選択的であり、かつ 基Ｂから触媒部位に転移することのできる加水分解に不安定なプロノ牛ング基で あり、 ＢはＡを酵素に結合させることのできる基であり、Ｅはブロッキング剤を触媒部 位に局在化させる局在化基であり、Ｆはその局在化基から触媒部位に転移するこ とのできる加水分解的に不安定なブロッキング基である］ で示されるブロッキング剤の過剰量の存在下に、フィブリン溶解酵素を本発明の 開裂耐性プラスミノーゲンと混合し、２元複合体を形成させることを特徴とする 方法を提供する。

本明細書に記載の方法に従って調製されるプラスミノーゲン変異体はストレプト キナーゼとの複合体中でプラスミンに分解されず、急速（５３０秒）にアミド分 解活性及びブラスミ／−ケンアクチベーター活性の両活性を現す。

図面の簡単な説明 第１図は、ベクターｐＵＣ１１９ＰＮ１２７．６のヌクレオチド配列を表す。但 し、そのベクターの３８０９ヌクレオチド位はＴであるが、天然のヒトプラスミ ノーゲンをコードする配列を表している第１図に示す配列ではＣである。第１図 の配列にはさらに、天然の配列を有するヒトプラスミノーゲンの推定アミノ酸配 列も表している。

第２図は、ベクターｐＳＶＩ−ｔＰＡの構築を表している。

第３図は、ベクターｐｓｖ　！　２−ｔＰＡの構築を表している。

第４図は、ベクターｐｓＶＩ３−ｔＰＡの構築を表している。

第５図は、ベクターｐｓＶＩ５−ｔＰＡの構築を表している。

第６図は、ベクターｐｓＶ１６Ｂ−ｔＰＡの構築を表している。

第７図は、本発明に従ってＨＰｇ変異体を発現させるために使用されるｐＡ４７ ５Ｒ５６１ｓＰｇの構築を表している。

第８図は、昆虫細胞発現のために使用されるバキュロウィルス転移ベクターｐＡ Ｖ６の構築を模式的に表すフローチャートを表している。

本明細書に使用している「ブラスミ／−ケン」又はｒＰｇＪは、ウシ、ウマ、ブ タ、ヒツジ、イヌ、不ズミ及びネコブラスミ／−ケンなどのあらゆる種由来のプ ラスミノーゲン、ならびに第１図に示すアミノ酸配列を有しているヒトプラスミ ノーゲンを意味する。但し、これは、天然Ｐｇの生物活性、即ちプラスミノーケ ンアクチベータ−（例えば、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、又は組織ブラ スミノーケンアクチベーター）によって開裂されてプラスミンを産することがで きるか、又は天然ｐｇの少なくとも１つのエピトープに対して惹起された抗体と 免疫学的に交叉反応する免疫エピトープを有しているなどの生物活性を有するも のである。

ブラスミ／−ケン変異体は、天然ｐｇのアミノ酸配列が主として前もって規定し た突然変異によって、少なくとも１つの修飾がプラスミノーゲンをその２本鎖型 にするタンパク質分解的な開裂に対して耐性になるよう修飾されている分子とし て定義される。Ｐｇのアミノ酸配列変異体には例えば、欠失型、又は第１図に示 すアミノ酸ｐｇ配列内の残基の挿入型もしくは置換型がある。最終構築物が開裂 に対する所望の耐性及び生物活性を有している限り、欠失、挿入及び置換のあら ゆる組合わせ型も行え、それにより最終構築物を得ることができる。変異型ｐｇ をコードしているＤＮＡ内で行った突然変異は読み取り枠を外れた配列に起こさ ないことが好ましく、また二次元ｍＲＮＡ構造物を産しかねない相補領域を作成 しないことがさらに好ましいのは明白である［例えば、欧州特許公開第０７５． ４４４号を参照のこと］。

ｐｇにおける「２本鎖開裂部位」及び「２本鎖型へのタンパク質分解的開裂」の 部位にはＨＰｇの５６１位にアルギニン残基が少なくとも含有されている。しか し、５６１位に近接する、又はその幾つかの残基内のアミノ酸が種々変動しても それはプラスミノーゲンをその２本鎖型に変換する酵素によって認識されるドメ インの一部と考えられる。

具体的な態様では、「１本鎖プラスミノーゲン変異体」は、５６１−５６２開裂 部位における２本鎖型への変換に対して耐性であるプラスミノーゲンである。こ の特徴は、２本鎖活性化部位の単−又は多重アミノ酸置換である。このような活 性化部位は修飾されているので、プラスミノーゲンを通常はその２本鎖型に変換 する酵素によっては酵素学的に認識されず、従って加水分解されない。

トリプシン及びキモトリプシンとの類似性に基づけば、セリンブロチアーゼの２ 本鎖型が生成するために重要なことはＨＰｇ内の５６２位に遊離のα−アミノ基 が結果的に存在することと考えられる。

これを比較すれば、５６２位のα−アミノ基がプラスミノーゲンのセリン活性部 位の領域内のポリペプチド鎖と相互作用することかＡｒｇ５８１位の開裂の際に は自由なのであろう。従って、本発明はプラスミノーゲン分子の活性全体を減じ ることなく、このようなα−アミン基とプロテアーゼ活性部位との相互作用を妨 害するあらゆる突然変異を包含するものである。

「作動可能に結合」という表現は、構成成分の正常な機能を発揮させることがで きるような並置を意味する。従って、制御配列に「作動可能に結合した」暗号配 列とは、その暗号配列がこれら制御配列の制御のもとで発現することができ、ま た連結されたＤＮＡ配列が連続している配置、さらに、分泌リーダーの場合には 連続しておりかつ読み取り枠内にある配置を意味する。例えば、プレ配列あるい は分泌リーダーのためのＤＮＡは、それがポリペプチドの分泌に関与するプレタ ンパク質として発現されるなら、ポリペプチドのＤＮＡに作動可能に結合してい る。また、プロモーターあるいはエンハンサ−は、それが配列の転写に影響を与 えるなら、暗号配列に作動可能に結合している。さらに、Ｉノボソーム結合部位 は、それが暗号配列の翻訳を促進するように設置されているなら、その暗号配列 に作動用能に結合している。結合は都合の良い制限部位での連結（ライゲーショ ン）によって行なう。そのような部位か存在しない場合には、合成オリゴヌクレ オチドアダプター又はリンカ−を常法に従って用いる。

本明細書で用いる「細胞」、「セルライン」及び「細胞培養物」は相互に交換使 用することができ、これらの表現はすべてその子孫をも包含する。従って、「形 質転換体」あるいは「形質転換細胞」には、最初の被細胞及びこれから導びかれ る培養物（その継代数は問わない）が含まれる。意図した突然変異あるいは偶然 の突然変異のために、全ての子孫が正確に同一のＤＮＡ内容物を含んでいないこ ともある。最初の被細胞においてスクリーニングされる機能と同じ機能を有する 突然変異子孫がこれらの用語に包含される。別の意味か意図されている場合は、 その文脈から明白であろう。

「制御配列」は、作動可能に結合した暗号配列が特定の宿主生物中で発現するの に必要なりＮＡ配列を意味する。原核生物に適した制御配列としては、例えばプ ロモーター、場合によってオペレーター配列、リホソーム結合部位、また、場合 によっては未だよく理解されていない他の配列か挙げられる。真核細胞はプロモ ーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを利用することが知られてい る。

「発現系」は、作動可能に結合した所望の暗号配列と制御配列とを含有するＤＮ Ａ配列であって、これらの配列で形質転換された宿主がそのコードされているタ ンパク質を産生ずることができるようなりＮＡ配列を意味する。形質転換を行な うため、この発現系をベクターに含有させることができ、それを本明細書では「 発現ベクター」と呼んでいる。しかし、関係しているＤＮＡが後に宿主染色体に 組込まれることもある。

Ｂ１本発明を実施するための方法 本発明の目的に沿う変異型プラスミノーゲンは、その２本鎖型へのタンパク質分 解的開裂、一般にはプラスミンに対して耐性であるものである。その変異型配列 はヒトプラスミノーゲンを基礎とするものが好ましい。このような変異体は組換 え及び合成又は部分合成の両者などのあらゆる手段によって調製することができ るが、好ましい変異体はＨＰｇかＨＰｍに変換する際の重要な開裂部位に位置す る１つのアミノ酸残基、好ましくは５６１位のアルギニンか他のアミノ酸、好ま しくはりシン以外のもの、最も好ましくはジカルボキシ含有アミノ酸又はセリン と置換されているものである。従って、最も好ましい変異体は、以下に説明する 命名法を用いて示せば、Ｒ５６１Ｓ−ＨＰｇ、　Ｒ５６１Ｅ−ＨＰｇ、及びＲ５ ６１Ｇ−ＨＰｇとなる。［ＨＰｇについてｒＡ４７５Ｊなる命名は、４７５位に アラニン残基を有している天然配列ＨＰｇを意味しており、これは４７５位にバ リンを有するｐＵｃｌ　１９ＰＮ１２７．６中に見いだされる配列とは対照的で ある。以下で使用し、請求の範囲で使用しているＲ５６１Ｓ−ＨＰｇ、Ｒ５６１ Ｅ−ＨＰｇ及びＲ５６１Ｇ−ＨＰｇなる命名は、特に明記しない限り、４７５位 にアラニンを有するＨＰｇを意味する。］ 本発明の変異体はＰｇをコードしているＤＮＡ内のヌクレオチドを部位特異的突 然変異し、その変異体をコードしているＤＮＡを得、次いでそのＤＮＡを適当な 宿主細胞内で発現させることによって調製することができる。

タンパク質分解に耐性であるｐｇをコードするＤＮＡはまた、宿主細胞内で発現 させる前に多くの手法により化学的に合成でき、組み立てることもできる［例え ば、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓの米国特許第４．５００．７０７号；　Ｂａ１ｌａｎｃ ｌらのＢｉｏｃｈ畑ｉｅ、　６７：７２５−７３６（１９８５）　；　Ｅｄｇｅ らのＮａｔｕｒｅ　２９ベニ　７５６−７６２（１９ｇ２）を参照のことコ。

他の態様では、本発明の変異体はグリコジル化されていなくてもよく、これは真 核生物宿主内で発現されるプラスミノーゲンをグリコペプチダーセＦのような目 的に適った適当な酵素で処理することにより得ることがてきる。

本明細書に記載するＨＰｇ変異体を簡略命名法によって命名するだめの数字は、 推定の成熟Ｐｇのアミノ酸配列に沿ったアミノ酸残基／位置を表していることに 留意すべきである。アミノ酸の特定には以下のようなアミノ酸の１文字アルファ ベットを使用している：Ａｓｐ　Ｄ　アスパラキンｍ　ｌ１ｅＩ　イソロイシン Ｔｈｒ　Ｔ　スレオニン　ＬｅｕＬ　ロイシン５ｅｒＳ　セリン　Ｔｙｒ　Ｙ　 チロシンＧｌｕ　Ｅ　’）’ルタミン酸Ｐｈｅ　Ｆ　フェニルアラニンＰｒｏＰ 　プロリン　Ｈｉｓ　ＨヒスチジンＧｌｙＧ　グリシン　Ｌｙｓ　Ｋ　リジンＡ ｌａ　Ａ　アラニン　Ａｒｇ　ＲアルギニンＣｙｓＣシスティン　Ｔｒｐ　Ｗ　 Ｓ！ノブトファンＶａｔ　Ｖ　バリン　Ｇｉｎ　Ｑ　グルタミンＭｅｔ　Ｍ　メ チオニン　Ａｓｎ　Ｎ　アスパラギン本明細書における置換型変異体の命名は、 文字、その後の数字、その後の文字から構成される。最初の文字（最も左側）は 野生型の成熟Ｐｇ内のアミノ酸を示す。その後の数字は、そのアミノ酸の置換が 行われたアミノ酸の位置を示し、第２の文字（右側）は野生型アミノ酸を置換す るのに使用したアミノ酸を示している。挿入型変異体の命名は、文字１、次いで 野生型成熟Ｐｇ内における挿入開始前の残基の位置を示す数字、次いで挿入が施 されたすべてを示す１つ又はそれ以上の大文字から構成される。欠失型変異体の 命名は、文字ｄ、次いで欠失の開始位置の数字から欠失の終止位置までの数字（ なお、この位置は野生型の成熟ｐｇに基づく）から構成される。多重突然変異は 、読み易さの点から表記中のカンマによって分離して表す。

この命名法を例示すれば以下のようになる。野生型Ｐｇの５６１位のアルギニン がグルタミン酸残基と置き換わっている置換型変異体は、Ｒ５６１Ｅと命名され る。連続した５６１−５６２の位置のＲＶがＥＥと置き換わっている多重置換を 有する置換型変異体はＲ５６１Ｅ、Ｖ５６２Ｅと命名される。システィン及びバ リンが野生型Ｐｇの５６０位の後に挿入されている挿入型変異体は、１５６０Ｃ Ｖと命名される。５６１から５６２位のアミノ酸が野生型成熟Ｐｇから欠失して いる欠失型変異体は、ｄ５６１−５６２と命名される。ｒＨＰｇＪなる表記は各 突然変異の後ろに従う。

殆どの欠失及び挿入ならびに特に置換は、組換えＰｇ分子の特性に本質的な変化 をもたらさないと期待される。しかし、置換、欠失又は挿入の過剰効果を先立っ て予測するのが困難であるなら、例えばｐｇの活性部位又は免疫エピトープを修 飾する場合は、当業者なら、その効果が通常のスクリーニング検定によって評価 できることは理解されよう。例えば、変異体は通常、天然Ｐｇをコードする核酸 の部位特異的突然変異、その変異型核酸の組換え細胞培養物での発現、及び要す れば例えばウサギポリクローナル抗−ｐｇカラムの免疫アフィニティー吸着によ るその細胞培養物からの精製によって調製することができる。

次いで、その変異体は所望の特性についての適当なスクリーニング検定によりス クリーニングすればよい。例えば、ある種の抗体への親和性などのＰｇにおける 免疫学的特性の変化は、競合免疫検定によって測定することができる。活性化レ ベルの変化は、適当な検定法により測定される。酸化還元又は熱安定性、ハイド ロフオビシティー、タンパク質溶解的分解に対する感受性、又は担体との凝集性 もしくは重合体になる傾向などのタンパク質特性の修飾は、当業者に周知の方法 により検定することかできる。

本明細書に開示したベクター及び方法は、広範囲の原核生物及び真核生物にわた る宿主細胞で使用するのに適しており、比較的好ましいものは真核生物、最も好 ましいものは哺乳動物宿主である。

一般に、目的のベクターの最初のクローニング、増幅、又は保存には原核生物が 好ましい。ベクターＤＮＡはある種の原核生物から容易に得ることができる。大 腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）　Ｋ　１２　株ＭＭ２９４（ＡＴＣＣＮｏ、　３１．４４ ６）がこの目的に特に有用である。使用できる他の微生物株には、Ｅ、ｃｏｌｉ 　Ｂ及びＥ、ｃｏｌｉ　Ｘ　１７７６　（ＡＴＣＣＮｏ、３１，５３７）のよう な大腸菌株が含まれる。勿論、これらの例は例示を意図するものであって、限定 のためのものではない。

一般に、宿主細胞に適合する種から導かれるレプリコン及び制御配列を含有する プラスミドベクターを、これらの原核生物宿主と組合せて使用する。通常、この ベクターは、複製部位、ならびに形質転換された細胞における表現型選択を付与 できるマーキング配列を保持する。例えば、大腸菌は大腸菌種由来のプラスミド ｐＢＲ３２２［例えば、Ｂｏｌｉｖａｒら、　Ｇｅｎｅ　２−：　９５　（１９ ７７）を参照］を用いて形質転換するのが普通である。ｐＢＲ３２２はアンピシ リン及びテトラサイクリン耐性のための遺伝子を含有しているので、形質転換細 胞を同定するための容易な手段を与える。また、このｐＢＲ３２２プラスミドあ るいは他の微生物プラスミドもしくはファージは、選択マーカー遺伝子の発現の ために、その微生物によって使用され得るプロモーターを含有するか、又は含有 するように修飾されなければならない。

原核生物宿主における組換えＤＮＡ構築に最も普通に用いられるプロモーターに は、β−ラクタマーゼ（ベニシリナーゼ）及びラクトースプロモーター系［Ｃｈ ａｎｇら、　Ｎａｔｕｒｅ　３７５　：　６１５　（１９７ｇ）　；　Ｉｔａｋ ｕｒａら＋　５ｃｉｅｎｃｅ　１９８　：　１０５６　（１９７７）　；　Ｇｏ ｅｄｄｅｌら、Ｎａｔｕｒｅ　２８１　：　５４４　（１９７９）］、ならびに トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系［Ｇｏｅｄｄｅｌら、Ｎ６］か含まれ る。これらが最も普通に用いられるか、その他の微生物プロモーターも発見され 、そして利用されている。これらのヌクレオチド配列の詳細は公表されており、 当業者はこれらをプラスミドベクターに機能的に連結することかできる［例えば 、５ｉｅｂｅｎｌｉｓｔら。

Ｃｅ１ｌ　２０　：　２６９　（１９ｇ［１）を参照］。

発現のためには、酵母培養物などの真核微生物を用いる。Ｓ　ａｃｃｈａｒｏｍ ｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ又は通常のパン酵母が最も普通に用いられる真 核微生物であるが、他の多数の菌株も普通に利用することができる。Ｓ　ａｃｃ ｈａｒｏｍｙｃｅｓ中で発現させるためには、例えばプラスミドＹＲｐ　７　［ Ｓｔ　ｉｎｃｈｃｏｍｂら、Ｎａｔｕｒｅ　２８２：　３９　（１９７９）　： 　Ｋｉｎｇｓｍａｎら、Ｇｅｎｅ７　：　１４１　（１９７９）　；　Ｔｓｃｈ ｅｍｐｅｒら、　Ｇｅｎｅ　１０　：　１５７　（１９８０）］が普通に用いら れる。このプラスミドは、トリプトファン中で増殖する能力を欠く酵母の突然変 異株、例えばＡＴＣＣＮｏ、４４，０７６又はＰＥＰ４−１０Ｊｏｎｅｓ、　Ｇ ｅｎｅｔｉｃｓ　８５　：　１２　（１９７７）コのための選択マーカーを与え るｔｒｐ　１遺伝子を既に含有している。次いで、酵母宿主細胞ゲノムの性質と してｔｒｐｌ欠損が存在すると、トリプトファンの不存在下での増殖によって形 質転換を検出するための有効な環境が得られる。

酵母ベクターにおける適切な促進配列（プロモーター配列）には、３−ホスホグ リセレートキナーゼのためのプロモーター［Ｈｉｔｚｅｍａｎら、　Ｊ、Ｂｉｏ ｌ、Ｃｈｅｍ、　２５５：　２０７３　（１９１３０）］、又はその他の解糖系 酵素、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナ ーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルベートデカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナー ゼ、グルコース−６−ホスフェート　イソメラーゼ、３−ホスホグリセレート　 ムターゼ、ピルベート　キナーゼ、トリオセホスフェート　イソメラーゼ、ホス ホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼなどのプロモーター［Ｈｅ５ｓ ら、　Ｊ、Ａｄｖ、Ｅｎｚｙｌ！ｌｅ　Ｒｅｇ、７：　１４９　（１９６ｇ）及 びＨｏ１ｌａｎｄら、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１７　：　４９００　（１ ９７８）］が含まれる。生育条件によって転写が制御されるという別の利点を有 する他のプロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロムＣ１ 酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関与する分解ｍ素、及ヒ上記のグリセルアルデ ヒド−３−ホスフエートデヒドロゲナーゼ、及びマルトース及びガラクトース利 用に関与する酵素のプロモーター領域である。酵母に適合するプロモーター、複 製起点及び終止配列を含有するあらゆるプラスミドベクターが適切である。

微生物に加えて、多細胞生物由来の細胞培養物も宿主として用いることができる 。原理的には、を推動物の培養物又は無を推動物の培養物の由来を問わず、この ような細胞培養物の全てが利用可能である。

無を推動物宿主での発現のために、多くのバキニロウィルス株及び変異体、なら びにＡｅｄｅｓ　ａｅｇｙｐｔｉ（蚊）、Ａｅｄｅｓ　ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ（ 蚊）、Ｄｒｏｓｐｈｉｌａ　ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ（ミバエ）、及びＢｏｍ ｂｙｘ　ｍｏｒｉ宿主細胞などの宿主由来の対応する寛容的な昆虫宿主細胞が同 定されている［例え株は公に入手可能であり、例えばＡｕｔｏｇｒａｐｈａ　ｃ ａｌｉｆｏｒｎｉｃａ　Ｎ　Ｐ　ＶのＬ−１変異体及びＢｏｍｂｙｘ　ｍｏｒｉ 　Ｎ　Ｐ　Ｖの＋３ｅ−５株及び類似のウィルスは、本発明に従い、特に５ｐｏ ｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞のトランスフェクトのためにウィル スとして使用することができる。

しかし、を推動物細胞が最も重要であり、を推動物細胞の培養（Ｍ織培養）での 増殖は近年ではルーチン操作となっている［Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ、　 Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｋｒｕｓｅ及びＰａｔｔｅｒｓｏＪ　（１９ ７３）コ。

このような有用なを推動物宿主セルラインの例には、ＳＶ４０配列で形質転換さ れタサル腎ＣＶＩライフ（ＣＯＳ　−７；　ＡＴＣＣＣＲＬ　１６５１）；ヒト 肝腎ライン［２９３；　Ｇｒａｈａｍら、Ｊ、Ｇｅｎ、Ｖｉｏｌ、　３６：　５ ９　（１９７７）１；幼ハムスター腎細胞（Ｂ　ＨＫ　；　ＡＴＣＣＣＣＬ　１ ０）　；チャイニーズハムスター卵巣細胞［Ｕｒｌａｕｂ及びＣｈａｓｉｎ、　 Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７７：　４２１６　（１９８ ０）］　：　７ウスセルトリ細胞［ＴＭ４　；　Ｍａｔｈｅｒ、　Ｂｉｏｌ、Ｒ ｅｐｒｏｄ、　２３：　２４３−２５１　（１９８０）］　；　サル腎細胞（Ｃ Ｖ　Ｉ　；　ＡＴＣＣＣＣＬ　７０）　；　７フリカミドリザル腎細胞ｆＶＥ　 ＲＯ−７６；　ＡＴＣＣＣＲＬ−１５８７）　；ヒト頚癌細胞（ＨＥＬＡ　；Ａ ＴＣＣＣＣＬ　２）；イヌ腎細胞（Ｍ　Ｄ　ＣＫ　；　ＡＴＣＣＣＣＬ３４）； バッフアロラット肝細胞（Ｂ　ＲＬ　３　Ａ、　；　ＡＴＣＣＣＣＬ　１４４２ ）　；ヒト肺細胞（Ｗ　１３８　；　ＡＴＣＣＣＣＬ　７５）　：ヒト肝細胞（ Ｈｅｐ　Ｇ　２　；　ＨＢ　８０６５）；マウス乳腫瘍細胞（ＭＭＴ　０６０５ ６２　：　ＡＴＣＣＣＣＬ　５１）　：う／ト肝癌細胞［ＨＴＣ，Ｍｌ、５４　 ；Ｂａｕｍａｎｎら、　Ｊ、Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、　８５：　１−８　（１９８ ０）］　；及びＴＲＩ細胞［Ｍａｔｈｅｒら、　Ａｎｎａｌｓ　Ｎ、Ｙ、Ａｃａ ｄ、Ｓｃｉ、　３８３：　４４−６８　（１９８２）’］が含まれる。安定な発 現のために本発明で最も好ましい真核生物宿主はチャイニーズハムスター卵巣セ ルラインチアル。

哺乳動物細胞中で使用するためには、発現ベクター上の制御機能がウィルス原料 から提供されることか多い。例えば、一般的に使用されるプロモーターは、ポリ オーマ、アデノウィルス２、レトロウィルス、サイトメガロウィルス、そして最 も多くはサルウィルス４０（ＳＶ４０）のゲノムから導かれる。他のプロモータ ーは、例えばβ−アクチンプロモーターなどのヘテロローガスな供給源由来のプ ロモーターである。ＳＶ４０ウィルスの初期及び後期プロモーターは、ＳＶ４０ のウィルス性複製起点をも含有する断片としてこのウィルスから容易に得られる ので特に有用である［Ｆｉｅｒｓら、　Ｎａｔｕｒｅ２７３　：　１１３　（１ ９７８）コ。ＨｉｎｄｌＩ［部位からＢｇ１１部位（ウィルスの複製起点中に位 置する）に同かって延びる約２５０ｂｐの配列が含まれているなら、比較的小さ いか又は比較的大きいＳＶ４０断片を用いることもてきる。ヒトサイトメガロウ ィルスの即時型プロモーターはＨｉｎｄｌｌＩ制限断片として好都合に得られる ［Ｇｒｅｅｎａｗａｙら、　Ｇｅｎｅ　１８・３５５−３６０（１９８２）］。

また、目的の遺伝子配列に正常には結合しているプロモーター又は制御配列を用 いることも、この制御配列が宿主細胞系に適合する場合には可能であるし、また 、望ましいことが多い。

高等真核生物によるＰｇをコードするＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサ −配列を挿入することによって増大する。エンハンサ−は、通常は約１０〜ａｏ ｏｂｐのンス作用性のＤＮＡ要素であり、プロモーターの転写開始活性を増強す るように作用する。エンハンサ−は、その配向及び位置には比較的非依存性であ り、転写単位の５　’　［Ｌａ１ｍ１ｎｓら、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ 、Ｓｃｉ、　７８：　９９３　（１９８１）］及び３°［Ｌｕしかし、本発明の ためにはこのエンハンサ−要素をプロモーター配列の上流に設置するのが好まし い。現在では多数のエンハンサ−配列カ補乳動物遺伝子（グロビン、エラスター ゼ、アルブミン、α−フェトプロティン及びインスリン）から既知となっている 。しかし、真核生物細胞ウィルス由来のエンハンサ−を用いるのが普通である。

その例には、ＳＶ４０の複製起点の後期側のエンハンサ−（ｂｐｌ。

Ｏ〜２７０）、サイトメガロウィルスの初期プロモーターエンハンサ−、ポリオ ーマの複製起点の後期側のエンハンサ−１及びアデノウィルスのエンハンサ−か 含まれる。本発明で最も好ましいのはＳＶ４０のエンハンサ−領域でアル。

哺乳動物宿主細胞で用いる発現ベクターはポリアデニル化部位をも含有している であろう。ポリアデニル化領域の例は、例えば５Ｖ４０（初期及び後期）又はＨ ＢＶなどのウィルスから導かれる領域である。

複製起点は、外性の起点口例えば、ＳＶ４０又は他のウィルス（ポリオーマ、ア デノ、ＶＳＶ、ＢＰＶなど）供給源から導かれる］を含むようにベクターを構築 することによって得るか、又は宿主細胞から得ることかできる。ベクターが宿主 細胞の染色体中に組込まれるときには、後者が充分であることが多い。

発現ベクターは、選択マーカーとも呼ばれる選択遺伝子を含んでいるのが適切で あろう。選択遺伝子は、ベクターで形質転換された宿主細胞の生存又は増殖に必 要なタンパク質をコードしている。哺乳動物細胞に適した選択マーカーの例には 、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）又はネオマイ シンが含まれる。

このような選択マーカーが哺乳動物宿主細胞中に成功裏に移転されると、その形 質転換された哺乳動物宿主細胞は選択圧のもとに置かれたときでも生存すること ができる。

広（用いられている２種類の別カテゴリーの選択法が存在する。

第１のカテゴリーは、添加された培地とは無関係に増殖する能力を欠く突然変異 セルラインの使用と細胞の代謝に基づいている。例を２つ挙げると、ＣＨＯＤＨ ＦＲ−細胞及びマウスＬＴＫ〜細胞である。これらの細胞は、チミジン又はヒポ キサンチンなどの栄養素の添加なして増殖する能力を欠いている。これらの細胞 は完全なヌクレオチド合成経路に必要なある種の遺伝子を欠いているので、この 欠失したヌクレオチドが添加培地に供給されなければ生存することができない。

培地に添加を行うことの代替法は、無傷のＤＨＦＲ又はＴＫ遺伝子をそのそれぞ れの遺伝子を欠いている細胞中に導入し、それらの増殖要件を変えることである 。ＤＨＦＲ又はＴＫ遺伝子で形質転換されていない個々の細胞は、未添加の培地 では生存することができないであろう。従って、これら細胞を直接選択するには 、添加栄養素の不存在下での細胞増殖か必要である。

第２のカテゴリーは優性選択であり、これは突然変異セルラインの使用を必要と しない選択法である。通常、この方法は宿主細胞の増殖を抑制する薬物を用いる 。新規な遺伝子を保持するこれら細胞は薬物耐性を与えるタンパク質を発現し、 選択に耐えるであろう。

この優性選択に用いる薬物の例には、ネオマイシン［５ｏｕｔｈｅｒｎ及びＢｅ ｒｇ、　Ｊ、Ｍｏ１ｅｃ、Ａｐｐｌ、Ｇｅｎｅｔ、ｌ：　３２７　（１９８２） ］、ミコフェノール酸［Ｍｕｌｌｉｇａｎ及びＢｅｒｇ＋　５ｃｉｅｎｃｅ　２ ０９：　１４２２　（１９８０）コ、又はノ＼イグロマイノンｒｓｕｇｄｅｎら 、　Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、　Ｆ−：　４１０−４１３　（１９８５）］ が含まれる。

ここに挙げた３つの例は、真核性の制御下に細菌遺伝子を用いて、適当な薬物、 即ちネオマイシン（Ｇ４１８又はジェ不チシン）、ｘｇｐｔ（ミコフェノール酸 ）、又はハイグロマイシンのそれぞれに対する耐性を与えるものである。

本発明の方法によれば、十分な量のボワベブチドが細胞培養によって生産される が、二次暗号配列を用いる改良によって生産レベルをさらに増大させられる。あ る二次暗号配列は、メトトレキセート（ＭＴＸ）などの外因的に制御されるパラ メーターの影響を受けるジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）からなり、従ってメ トトレキセート濃度を制御することによって発現を制御することができる。

目的とするタンパク質及びＤＨＦＲタンパク質の両者をコードするＤＮＡ配列を 含有する本発明のベクターによるトランスフェクションにとって好ましい宿主細 胞を選択する際には、使用するＤＨＦＲタンパク質の型に従って宿主を選択する のが適切である。野生型ＤＨＦＲタンパク質を使用する場合には、ＤＨＦＲが欠 失している宿主細胞を選択するのが好ましく、これにより、ヒボキサンチン、グ リシン及びチミジンを欠く選択培地中での成功したトランスフェクションのため の標識としてＤＨＦＲ暗号配列を使用することか可能になる。この場合の適切な 宿主細胞は、Ｕｒｌａｕｂ及びＣｈａｓｉｎ［Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ 、ｓｃｉ、（ＵＳＡ）　７７：　４２１６　（１９８０）］の記述のように調製 し、増殖させた、ＤＨＦＲ活性を欠失しているチャイニーズハムス９−卵巣（Ｃ ＨＯ）セルラインである。

一方、ＭＴＸに対して低い結合親和性を有するＤＨＦＲタンパク質を制御配列と して使用する場合には、ＤＨＦＲ欠失細胞を使用する必要はない。突然変異ＤＨ ＦＲはメトトレキセートに対して耐性であるので、宿主細胞自体かメトトレキセ ート感受性である場合には、ＭＴＸを含む培地を選択の手段として使用すること ができる。

ＭＴＸを吸収することができる真核生物細胞のほとんどは、メトトレキセート感 受性であると考えられる。このような有用なセルラインの１つは０８０株、ＣＨ Ｏ−Ｋ　１　（ＡＴＣＣＮｏ、　ＣＣＬ６１）である。

目的の暗号配列及び制御配列を含有する適切なベクターの構築には、ｇｒ＄的な 連結（ライゲーシヨン）技法を用いる。単離したプラスミド又はＤＮＡ断片を切 断し、加工し、再連結して、必要なプラスミドを所望の形態として調製する。

平滑末端が必要であれば、得られた調製物をポリメラーゼＩ（タレ／−）１Ｏ単 位で１５分間１５℃で処理し、フェノールークＯＯホルム抽出し、次いてエタノ ール沈澱すればよい。

切断した断片のサイズ分離は、ＧｏｅｄｄｅｌらＣＮｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ 　Ｒｅｓ、　８：　４０５７　（１９８０）Ｊに記述されている６％ポリアクリ ルアミドゲルを用いて行うことができる。

構築したプラスミド中の正しい配列を確認するための分析には、通常、連結混合 物を用いｒＥ、ｃｏｌｉ　Ｋ　１２　２９４株（ＡＴＣＣ３１，４４６）あるい は他の適当な大腸菌株を形質転換し、適当な時点に成功裏の形質転換体をアンピ シリンもしくはテトラサイクリン耐性によって選択する。Ｍｅｓｓｉｎｇら［Ｎ ｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　９：　３０９　（１９８１）］の方法、 もしくはＭａｘａｍら［’Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍ、　６５：　４９９　（１９８ ０）］の方法により、形質転換体からプラスミドを調製し、制限マツピング及び ／又はＤＮＡ配列決定によって分析する。

ＤＮＡを哺乳動物細胞宿主に導入し、安定な形質転換体用の培地中で選択した後 、ＤＨＦＲ活性の競合的阻害物質であるメトトレキセート約２００〜５００ｎＭ 濃度の存在下で宿主細胞培養物を生育させることによって、ＤＨＦＲタンパク質 をコードする配列の増幅を行なう。濃度の有効範囲は勿論そのＤ［（ＦＲ遺伝子 の性質及び宿主の特徴に大きく依存する。明確かつ一般的に定義した上限及び下 限を確定することはできない。他の葉酸類似体もしくはＤＨＦＲを阻害する他の 化合物も適切な濃度で使用することができる。しかし、ＭＴＸ自体が便利であり 、容易に入手でき、また効果的である。

フィブリン溶解酵素及びブラスミ／−ケン間に形成されるｖｉ会合体スミス（Ｓ ＩＩｌｉｔｈ）らの米国特許第４．８０８．４０５号に記載されているように血 栓溶解薬として使用することができ、それは以下の実施例５で説明している。簡 単に説明すれば、ストレプトキナーゼとプラスミノーゲンとの２元複合体であっ て、加水分解によって除去し得る基によりブロックされたフィブリン溶解活性に 必須の触媒部位を有する複合体からなる酵素誘導体を、ｐＨ７，４，３７°Ｃの 等優性水性媒質中においてその誘導体の加水分解の擬−次速度定数が１Ｏ−６ｓ ｅｃ　−１から１０−３ｓｅｃ−’となるように調製すればよい。但し、触媒部 位をブロックする基はｐ−グアニジ／−ベンゾイル基ではない。このような基に 適するものは、ベンゾイル、置換ベンゾイル、アクリロイル又は置換アクリロイ ル基などのアシル基などである。

この複合体を調製するための方法は、式：Ａ−Ｂ又はＥ−ＦＥ式中、Ａはフィブ リン溶解活性にとって必須の触媒部位に選択的であり、かつ基：Ｂから触媒部位 に転移することのできる基であり、ＢはＡを酵素に結合させることのできる基で あり、Ｅはプロ、キング剤を触媒部位に局在化させる局在化基であり、Ｆはその 局在化基から触媒部位に転移することのできる基である］で示されるプロ、キン グ剤の過剰量の存在下に、ストレプトキナーゼとプラスミノーゲンとを混合し、 次いで要すれば、そのようにして生成させた誘導体を単離することを特徴とする 。好ましくは、加水分解によって除去され得る基はアンル基であり、最も好まし くはベンゾイル、置換ベンゾイル、アク１ノロイル、又は置換アクリロイル基で あり、例えばハロゲン、Ｃ，−Ｃ，アルキル、Ｃ，−Ｃ，アルコキン、Ｃ，−Ｃ ，アルカ／イルオキシもしくはＣ，−Ｃ，アルカメイルアミンによって置換され ているベンゾイル、又はＣ，−Ｃ，アルキル、フｒＪル、フェニルもしくはＣ， −Ｃ，アルキルフェニルによって置換されているアクリロイルなどか挙げられる 。さらに、ＡＢがｐ−二トロフェニルーｐ“−グアニジ／ベンゾエートであり、 基　Ｅかｐ−アミジノフェニル又はｐ−アセトアミドフェニルであり、基：Ｆが ヘンジイル又はアク１ノロイル基であるのが好ましい。

本発明はさらに、ヒトプラスミノ−ケン変異体を含有する医薬組成物をも包含す る。このような組成物は好ましくは、等優性の水性緩衝液又は医薬品級の「注射 用水」などの製薬的に許容され得る担体を含有する。さらに、本発明は製薬的に 許容され得る担体と共に、フィブリン溶解酵素、好ましくはその酵素とプラスミ ノーゲン変異体との複合体、より好ましくはストレプトキナーゼとプラスミノー ゲン変異体との２元複合体、最も好ましくは内部ペプチド結合の開裂を有さない ｐ−アニソイルストレプトキナーゼ／プラスミノーゲン複合体［Ｓｍ　ｉ　ｔ　 ｈらの米国特許第４．８０８．４０５号、前掲］を含有してなる医薬製剤をも包 含する。さらに本発明の１つの態様では、フィブリン溶解活性に関与する複合体 の活性部位を加水分解によって除去し得る基によりブロックするに当たり、ｐＨ ７，４，３７℃の等優性水性媒質中におけるその複合体の加水分解の擬−次速度 定数が１０−’Ｓｅｃ”から１０−３ｓｅｃ−’となるようにする。

本発明の組成物はヒトへの非経口的投与に適合する標準的な手法により製剤化さ れる。

通常、静脈内投与用の組成物は、滅菌した等張水性緩衝液中の滅ｍ誘導体の溶液 である。必要であれば、その組成物には、複合体のための安定化剤を添加できる 。一般には、その複合体は単位投与剤形の形態、例えばアンプルなどの密封容器 中に入れた乾燥粉末又は水不含の濃縮物として供給する。注入投与の場合、滅菌 した医薬品級の注射用水を含有する注入用ボトルから複合体を投与する。注射投 与の場合は、滅菌した注射用水のバイアルから複合体を投与する。

注射用又は注入用組成物は、投与前に各成分を混合することにより詔製される。

投与する複合体の有効量は、必要なフィブリン溶解の量及び必要なその速度、血 栓塞栓の程度、ならびに血餅の位置及び大きさなどの多くの因子によって変わる が、一般には得ようとしている成績、即ち血餅の溶解性によってその看は定まる 。例えば、肺塞栓症の患者又は生命を脅かす血栓を有する愚者には、急速に作用 する物質のポーラス投与が必要となるであろう。他方、手術後の血栓の生成を予 防したい場合は、ゆっくりと作用する物質が少量あれば実際上有用であろう。使 用する正確な投与量及び投与方法は原菌によって観察される所見に応じて決定さ れ得るものである。しかし、一般には、中程度の大きさの血栓を処置すべき患者 には注射（８回までの投与）又は注入のいずれかによって、体重１ｋｇ当たり０ ．１０から１．　Ｏｚｇの投与量で投与する。

実施例及び請求の範囲を簡素にするために、頻繁に使用する方法のいくつかを簡 略化した用語で表現する。

「トランスフェクション」は、いずれかの暗号配列が実際に発現されるか否かに かかわらず、宿主細胞による発現ベクターの取込みを意味する。数多くのトラン スフェクション法が当業者に知られている（例えば、ＣａＰＯ，及び電気穿孔法 ）。一般に、成功裏のトランスフェクションは、このベクターの作用の何らかの 徴候がその宿主細胞内に生じたときに認められる。

口形質転換」は、ＤＮＡが染色体外要素として、又は染色体構成要素として複製 されるように生物内にＤＮＡを導入することを意味する。使用する宿主細胞に応 じて、その細胞に適した標準的技術を用いて形質転換を行う。Ｃｏｂｅｎ、　Ｓ 、　Ｎ、　「Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　（ＵＳＡ）　６ ９：　２１１０　（１９７２）］、Ｍａｎｄｅｌら［Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、　 ５３：　１５４　（１９７０）］、及びさらに最近になってＬｉｌｊｅｓｔｒｏ ｍら［Ｇｅｎｅ赳：　２４１−２４６　（１９８５）］が記述しているような塩 化カルシウムを用いるカルシウム処理法は、堅固な細胞壁Ｉｌｉ！壁を有する原 核細胞及び他の細胞に一般的に用いられている。そのような細胞壁を持たない哺 乳動物細胞には、リン酸カルシウム沈殿法が好ましい［Ｇｒａｈａｍ、　Ｆ、及 びｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ、　Ａ、のＶｉｒｏｌｏｇｙ５２：　４５６−４５７　 （１９７８）　：　Ｋｉｎｇｓｔｏｎ、　ｉｎ　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｆ’ｒｏｔｏ ｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｆａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、　Ａｕ５ｕｂｅｌｓ＆ １ＣＪｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ、　Ｎｅｔｖ　Ｙｏｒｋ：１９８７） 、　ｉ、　W １−１．　ａ、　３］。浦乳動物細胞宿主系の形質転換の全般的態様はＡＸ１３ １の米国特許Ｎｏ、　４．３９９．２１６（１９８３年８月１６日発行）に記載 されている。酵母の形質転換は、通常、Ｖａｎ　Ｓｏｌｉｎｇｅｎ、　Ｐ、ら［ Ｊ、Ｂａｃｔ、　１３０：　９４６　（１９７７）コ及びＨｓ　ｉａｏ、　Ｃ， Ｌ、ら［Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、（ＵＳＡ）　７６：　３８２ ９　（１９７９）コの方法に従って行う。しかし、核注入あるいはプロトプラス ト融合ことかできる。

「プラスミド」は、小文字ｐ、これに先行及び／又はこれに続く大文字及び／又 は数字によって表示される。本発明の出発プラスミドは市販されているか、制限 されていない供給源から誰でも入手可能であるか、又は公表された方法に従って そのような入手可能なプラスミドから構築することができる。さらに、他の等価 なプラスミドが当分野で知られており、当業者には明白であろう。

本発明において用いるｒＰｃＲＪの技術は、一般に、ごく微量の特定のＤＮＡ片 を米国特許Ｎ　ｏ、　４．６８３．１９５（１９８７年７月２８日発行）に記述 されている複製連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて増幅することができるという技術を 意味する。通常は、目的の配列の両末端又はそれを越えた部分の配列情報か利用 可能であることを必要とし、これによってオリゴヌクレオチドブライマーを設計 すればよい。これらのプライマーは互いに向き合い、増幅しようとする鋳型の反 対側の鎖と同一であるか、もしくは類似しているであろう。この２つのプライマ ーの５′末端ヌクレオチドは、増幅される原料物質の両末端と一致している。Ｐ ＣＲを用いれば、全ゲノムＤＮＡ、全細胞ＲＮＡから転写されたｃＤＮＡ、バク テリオファージあるいはプラスミド配列などから特定のＤＮＡ配列を増幅するこ とができるＬ一般的；こ（よ、ＨｏＥｒｌ　ｉｃｈｍのＰＣＲＴｅｃｈｎｏｌｏ ｇｙ（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ　Ｐｒｅｓｓ、　ＮＹ、　１９８９）を参照］。

本発明において用いるｒＰＣＲ突然変異誘発」の技術６よ、次のような技術を意 味する［Ｅｒ１ｉｃｈ（上記）のＲ旧ｇｕｃｈｉの章（６１−７０頁）を参照１ ゜少量の鋳型ＤＮＡをＰＣＨの出発物質として使用するとき（±、鋳型ＤＮＡ中 の対応する領域と配列がわずか（こ異なって（′Ｉるプライマーを用いれば、プ ライマーが鋳型と異なって０る位置のみ力く鋳型配列と異なっている特別のＤＮ Ａ断片を比較的大量（こ生成させることができる。プラスミドＤＮＡ中に突然変 異を導入するため（こｉｔ、一方のプライマーをその突然変異の位置に重なるよ うζこし、そして突然変異を含むように設計する。他方のプライマーの配ｙ＋１ 　ｉｔプラスミドの反対側の鎖の配列の部分と同一でなけれ（ｆならな（Ｘ力く 、この配列はプラスミドＤＮＡに沿うどんな場所（こ位置して（Ｘでもよ℃１゜ しかし、第２のプライマーの配列は、プライマー看こよって囲まれたＤＮＡの全 増幅領域が最終的には容易に配列決定されｔ尋るよう１こ、第１の配列から２０ ０ヌクレオチド以内ζこ位置して０るの力（好ましい。ここに記したプライマー 対と同様のプライマー対を用いるＰＣＲ増幅により、プライマーによって特定し た突然変異の位置にお０て異なり、さらにおそらくは他の位置において異なるＤ ＮＡ断片の集団が得られることになる（鋳型のコピーは若干間違う傾向にあるの で）。

以下に説明する方法においては、製造物質に対する鋳型の比率は極めて低く、そ の結果、製造されたＤＮＡ断片の大部分は所望の突然変異を含んでいる。この製 造物質を、通常のＤＮＡ技術を使用し、ＰＣＲ鋳型として用いてプラスミド中の 対応領域を置換するのに用いる。突然変異の第２プライマーを用いることによっ て、又は異なる突然変異プライマーによ、る第２のＰＣＲを行なって、得られた ２つのＰＣＲ断片を３（又はそれ以上）部分連結で同時にベクター断片に連結す ることによって、別位置の突然変異を同時に導入することができる。

後記の実施例で用いたＰＣＲ突然変異誘発の操作は次のようである。増幅しよう とする領域の外側のプラスミドＤＮＡ中に唯一の認識部位を有する制限エンドヌ クレアーゼで消化することによって、鋳型プラスミドＤＮＡ（１μｇ）を直線化 した。この物質のうち１〜５ｎｇを、０．５ｅ＋１の反応バイアル中、最終容量 ５０μｍで１６．６ｍＭ（ＮＨ，）、Ｓｏ、、６７ｍＭ　トソスーＨＣＩ（ｐＨ ８，８）、６．７のＭＭｇＣ＋、、６．７μＭ　ＥＤＴＡ、１０ｍＭ　２−メル カプトエタノール、それぞれ１ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びＴＴＰ 、１７０μｇ／ωｌウン血ｌ青アルフ゛ミン、それぞれ２５ピコモルのオリコ゛ ヌクレオチドブライマー、ならびに１μｌのＴｈｅｒｍｕｓ　ａＱｕａｔｉｃｕ ｓ　（Ｔａｑ）　ＤＮＡポリメラーゼ（５単位／　μｌ　；　Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅ ｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ、　Ｎｏｒｖｉａｌｋ、　ＣＴ　ａｎｄ　Ｅｍｅｒｙｖｉ ｌｌｅ、　ＣＡから購入）を含むＰＣＲ混合物に加えた。この反応混合物に３５ μｌの鉱油を重層し、ＤＮＡ　Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ− Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓから購入）中に入れた。このＤＮＡ　Ｔｈｅｒｍａｌ　 Ｃｙｃｌｅｒは次のようにプログラムした 時間−遅延・ファイル　１２分間　９４℃熱−サイクル・ファイル　１分間　５ ０’Ｃ２〜３分間　６８〜７２°Ｃ １分間　９４℃ ２０サイクル 時間−遅延・ファイル　４分間　５０’Ｃ時間−遅延・ファイル　１２分間　ｅ Ｂ°Ｃ浸漬・ファイル　４℃ 上に示したそれぞれのファイルは次の行のファイルにつながっている。プログラ ムの終了時に、反応バイアルをＴｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒがら取り出し、水 相を新しいバイアルに移し、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール （５０：５０：１容量比）で抽出し、エタノール沈澱させ、常法によってＤＮＡ を回収した。次いで、この物［、ベクター中に挿入するための適切な処理に付し た。

ＤＮＡの「消化」は、ＤＮＡ中の特定のヌクレオチド配列にだけ作用する酵素に よるＤＮＡの触媒的切断を意味する。このような酵素は制限酵素と呼ばれ、また 、それぞれが特異的に作用する配列は制限部位と呼ばれる。本発明で使用する種 々の制限酵素は市販されており、酵素供給元によって確立された反応条件、補助 因子及び他のＺ要条件を用いている。制限酵素は一般に、それぞれの制限酵素か 最初に得られた微生物を表す大文字とそれに続く他の文字、次いて個々の酵素を 指定する数字で構成される略号で表示される。通常、約１μｇのプラスミドある いはＤＮＡ断片を、約２０μｍの緩衝液中、約１〜２単位の酵素と共に使用する 。個々の制限酵素に適した緩衝液及び基質量は製造元によって特定されている。

通常は３７°Ｃて約１時間のインキュヘ−／ヨンが用いられるが、供給元の指示 に従って変更することもある。インキュベーションの後、フェノール及びクロロ ホルム抽出によってタンパク質を除去し、エタノール沈澱によって水性分画から 消化した核酸を回収する。それが適切であれば、制限酵素による消化の後に、末 端５゛リン酸基に細菌アルカリホスファターゼ媒介の加水分解を行なって、１つ のＤＮＡ断片中の２つの末端か「環化する」、もしくは閉じたループを形成する （これはその制限部位に他のＤＮＡ断片を挿入することを阻害するであろう）の を阻害する。特に述べない限り、プラスミドの消化の後に５′末端脱リン酸化は 行わない。脱リン酸化の方法及び試薬は通常のものを用いるＥＴ、　Ｍａｎｉａ ｔｉｓら　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ ｙ　Ｍａｎｕａｌ　（Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ：　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂ ｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８２）　１３３−１３４頁（１９８２）コ。

制限消化によって得たあるＤＮＡ断片の「回収」あるいは「単離」とは、消化物 をポリアクリルアミドもしくはアガロースケル電気泳動によって分離し、その移 動度を既知分子世の標識ＤＮＡ断片の移動度と比較することによって目的の断片 を同定し、その目的の断片を含有するゲル部分を切り出し、ゲルとＤＮＡを分離 することを意味する。この操作は広く知られている。例えば、Ｒ，Ｌａｗｎら［ Ｎｕｃｌｅｉｃ「連結（ライゲーション）ヨは、２つの二本鎖核酸断片間にホス ホジエステル結合を形成させる過程を意味する［Ｔ、　Ｍａｎｉａｔｉｓら、１ ４６頁（１９８２）　；上記コ。特に述べない限り、連結は、既知の緩衝液及び 条件を用い、はぼ等モル量の連結しようとするＤＮＡ断片０．５μｇあたり１０ 単位のＴ４　ＤＮＡリガーゼ（”リガーゼ“）を用いて行なうことができる。

形質転換体からのＤＮＡの「調製」とは、プラスミドＤＮＡを微生物培養物から 単離することを意味する。特に述べない限り、Ｍａｎｉａｔｉｓら［９０頁（１ ９８２）　；上記］のアルカリ／ＳＤＳ法を使用することができる。

「オリゴヌクレオチド」は、既知の方法、例えば、Ｆｒｏｅｈｌｅｒら［＼ｕｃ １．ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、　１４：　５３９９−５４０７　（１９８６）］に記 述されているデオキシヌクレオシドバーホスホネート中間体経由で、もしくはＥ Ｐ特許公開Ｎｏ、　２６６、０３２（１！１８８年５月４日分開）に記述されて いるような固相法を用いるホスホトリエステル、ホスファイト又はホスホルアミ ダイトの化学で化学的に合成された、短い一本鎖もしくは二本鎖のポリデオキシ ヌクレオチドである。次いで、これらをポリアクリルアミドゲルで精製する。

「部位特異的突然変異」は当業界では標準的な手法であり、所望の突然変異を示 す限定的なミスマツチ以外は突然変異させようとする１本鎖ファージＤＮＡと相 補的である合成オリゴヌクレオチドブライマーを使用して行う。簡単に説明すれ ば、そのファージと相補的である鎖の合成を指令するプライマーとして合成オリ ゴヌクレオチドを使用し、得られた２本鎖ＤＮＡをファージを支持する宿主細菌 に導入する。このようにして形質転換した細菌の培養物をト、ブ寒天にプレート し、ファージを有する単一の細胞からプラークを形成させる。理論的には、新た なプラークの５０％が１本鎖としての突然変異体を有するファージを含有する。

５０％は元の配列である。

得られたプラークをハイブリダイズする際は、ハイブリダイゼーションが正確に 適合（マツチ）できるが、元の鎖とのミスマツチはハイブリダイゼーションが防 止されるに十分である温度において、得られたプラークをキナーゼ処理した合成 プライマーとハイブリダイズする。次いで、プローブとハイブリダイズするプラ ークを選択し、培養し、ＤＮＡを回収する。

以下に実施例を挙げて、本発明を実施する上で現在知られる最良の態様を説明す るが、これらは本発明の限定を意図するものではな実施例１ ｔ−ＰＡ中間体発現ベクターの構築 正しくイントロンを除去した場合の効能を増大させるという特定の目的のために 、スプライス・ドナー−イントロン−スプライス・アクセプタ一単位の特徴の多 くを変えることによって、親ベクターｐＳＶＩ−ｔＰＡから種々のｔ−Ｐ　Ａベ クターを導いた。

ａ、ｐｓＶＩ−ｔＰＡ 既に開示されている２種類の哺乳動物発現ベクターｐＲＫ−ｔＰＡ及びｐＥ３４ ８ＤＨＦＲＵｃの部分を結合させテｐｓ　Ｖ　Ｉ　−ｔＰ　Ａを創製した。

哺乳動物発現ベクターｐＲＫ−ｔＰＡは、ｐＲＫ　５　［ＥＰ　３０７．２４７ （上記）に開示されている；ここで、出発プラスミドｐＣＩ　Ｓ　２．８ｃ２８ ＤはＥＰ　２７８．７７６（１９８８年８月１７日公開）に開示されているコと ｔ−ＰＡ　ｃＤＮ　Ａ　ＪＰｅｎｎｉｃａら、Ｎａｔｕｒｅ　３ｆ）１：　２１ ４　（１９＋３３）コから調製した。ｐＲＫ　５に挿入するためのｃＤＮＡを、 制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄＩ［Ｉ（ＡＴＧ開始コドンの５′側の４９塩基 対を切断する）叉び制限エンドヌクレアーゼＢａ１ｌ（ＴＧＡ停止フドンの下流 の２７６塩基対を切断する）による切断によって調製した。このｃＤＮＡを、予 めＨｉｎｄｌｌＩ及びＳｍａｌて切断しておいたｐＲＫ５に通常の連結法（Ｍａ ｎｉａｔｉｓら。

Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕ ａｌ、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−、ニューヨーク１９８２ ）を用いて連結した。

この構築物をｐＲＫ−ｔＰＡと命名し、図２に示す。

ｐＲＫ−ｔＰＡは、ヒト２９３線維芽細胞への一時的なトランスフェクションに よりｔ−Ｐ　Ａを効率的に合成させる。このベクターは、サイトメガロウィルス の即時型遺伝子のエンハンサ−及びプロモータ＋、ＣＭＶ−Ｉ　Ｅスプライス・ ドナ一部位及び関連イントロンの一部、バクテリオファージＳＰ６プロモーター 、■ｇｖＨイントロンの一部及び関連スプライス・アクセプター、ｔ−ＰＡをコ ードしているｃＤＮＡ、ＳＶ４０の初期ポリアデニル化（”ポリＡ”）領域、な らびにＳＶ４０の複製起点（ｏｒｉ“）をプラスミドｐＵｃ１１８中に含有シて いる。

ベクターｐＥ３４８ＤＨＦＲＵｃｌ：Ｖａｎｎｉｃｅ及びＬｅｖｉｎｓｏｎのＪ 、　Ｖｉｒｏｌエンハンサ−及び初期プロモーター領域を含有し、次いでネズミ ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＦ（ＦＲ）をコードしているｃＤＮＡ、続いて５８４ ｂｐのＢ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）のポリＡシグナルを、プラスミドｐＭＬｌ中 のＨＢＶのＢａｍＨＩがらＢｇｌＩＩ部位に含有している。

このプラスミドは、ＳＶ４０配列のすぐ上流にポリワンカーを含有している。

ベクターｐＲＫ−ｔＰＡ及び１）Ｅ３４８ＤＨＦＲＵＣ（７）−ＮＩを次ノヨう にして単離した（図２）。

（１）　ベクターｐＲＫ　−ｔ　Ｐ　Ａを制限酵素Ｓａｃ［で消化し、次いで大 腸！１ｌＤＮＡポリメラーゼｒ（”ｐｏｌｌ”）の大きい（”フレノウ”）断片 （フラグメント）で処理して、Ｓ　ａｃ　■切断によって生成した３゛突出末端 を除去した。これに続いて制限酵素５ｐｅｌによる消化を行なった。

ＣＭＶ転写配置１ｆの一部、スプライス・ドナー−イントロン−スプライス・ア クセプタ一単位（図２中の”イントロン”）、ｔ−ＰＡのｃＤＮＡ、ＳＶ４０の ポリＡ及びｏｒｉ領域、ならびにｐＵｃ１１８を含有する大きい方の断片（ＣＭ Ｖの５′末端に由来する少数のヌクレオチドを含有する）を、断片の電気泳動分 離の後にポリアクリルアミドゲルから単離した（”ゲル単離”）。

（２）ベクターｐＥ３４８ＤＨＦＲＵＣを酵素Ｃ１ａｌで消化し、得られた５゛ 突出末端を４種すへてのデオキシリボヌクレオチド（ｄＮＴＰ　：ｄＡＴＰ、ｄ ＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ＴＴＰ）の存在下にフレノウｐｏｌＴを用いて充填した。次 いで、Ｘｂａｌで消化した後、小さい方のＸｂａＩ−Ｃ１ａＩ断片（３６０ヌク レオチド）に存在するＳＶ４０の転写調節配列（Ｓ　Ｖ　４０初期転写開始部位 を含むエンハンサ−及び初期プロモーター）をゲル単離した。

単離したｐＲＫ−ｔＰＡ及びｐＥ３４８ＤＨＦＲＵＣの断片を連結してベクター ｐＳＶＩ−ｔＰＡを作成した。

ｂ、ｐｓｖ　Ｉ　２−ｔＰＡ ベクターｐ５　Ｖ　ｒ　２−ｔＰＡを図３に示すようにして調製した。ここで、 へ’）９−ｐｓＶＩ−ｔＰＡのスプライス・ドナ一部位は、以下に記載のように して調製した３つの断片の連結によって突然変異させた。ｐｓＶＩ−ｔＰＡの５ ′エキソン／イントロンの境界に対してヌクレオチド−３（Ｇ）及び−１（Ｃ） をそれぞれＣ及びＧに変えて、このスプライス・ドナー配列がコンセンサス（共 通）配列：ＣｋＧ／ＧＵＡＡＧＵと同一になるようにした。これを次のようにし て行なった。

（１）ベクターｐｓｖｒ−ｔｐＡをＨｉｎｄＩｎ及びＢｇｌＩＩて切断し、３８ １位と６１８位の２つのＨｉｎｄＩＩＩ部位の間のスプライス・ドナー−イント ロン−スプライス・アクセプタ一単位を主として含有する小さい断片、６１８位 と７７０位のＨｉｎｄＩｎ及びＢｇｌＩＩ部位の間に位置するｔ−ＰＡ　ｃＤＮ Ａの５′部分を含有する別の小さな断片、ならびにｐＳＶＩ−ｔＰＡ　ＤＮＡの 残りの部分を含有する大きな断片を得た。細菌アルカリホスファターゼ（ＢＡＰ ”）処理の後に、これら３つの断片をゲル電気泳動によって分離し、最も大きい 断片を回収した。

（２ン　ベクターｐｓ　Ｖ　Ｉ−ｔＰＡをＲｓａｌ及びＢｇｌＩＩで別々に消化 し、４４３位のＲｓａ１部位から７７０位のＢｇｌ［部位まで延びる３２７ヌク レオチドの断片をゲル単離した。この断片は、イントロンの３°部分、スプライ ス・アクセプター、及びｔ−ＰＡ　ｃＤＮＡの５゛部分を含有している。

（３）　２種類のオリゴヌクレオチド（図３〜図７中の”プライマー′）を合成 シタ。第１のもの（ＳＶＩ３７９）はｐｓＶＩ−ｔＰＡのヌクレオチド３７９〜 ４００（上側の鎖）に対応するものであるが、制限エンドヌクレアーゼＥ　ａｇ 　Ｉによって認識される配列（ＣＧ　Ｇ　ＣＣＧ）が得られるように３９０位に ＧからＣへの変化が導入されており、そしてＨｉｎｄｌＩＩ部位に重なっている 。これは、次の配列を有していた（変化の位置には下線を引いた）： ５’　−ＡＡＡＡＧＣＴＴＡＴＣＣＧＧＣＣＧＧＧＡＡＣ〜３″。

第２のオリゴヌクレオチド（ＳＶＩ４４８）は４４８位と４２７位の間のｐｓＶ Ｉ−ｔＰＡの下側の鎖に配列が一致するものであるが、１１番目のヌクレオチド にＧからＣへの変化及びヌクレオチド−１３にＣからＧへの変化を有している。

この配列は、２カ所の単一ヌクレオチド変化のすぐ５°側にＲｓａ１部位を含ん でいる。このオリゴヌクレオチド配列は次のようであった（対応するｐｓＶＩ− ｔＰＡ配列との相違点には下線を引いた）・ ５’　−ＣＧＧＴＡＣＴＴＡＣＣＴＧＡＣＴＣＴＴＧＧＣ−３’　。

これら２種類のオリゴヌクレオチドを用い、ＰＣＲによって３７９位と４４８位 の間のｐｓＶＩ−ｔＰＡの領域（スプライス・ドナーを含む）を増幅した。この ＰＣＲ生成物をＨｉｎｄｌＩ［及びＲｓａ［で消化し、得られた６２ヌクレオチ ドの断片をケル単離した。

３種類の単離した断片を連結し、大腸ｍＭＭ２９４に導入した。

プラスミドＤＮＡをいくつかのアンピシリン耐性コロニーから単離し、所望の順 序で連結した３つの断片を有する１つの単離体（ｐＳＶＩ２−ｔＰＡ）のヌクレ オチド配列を決定して、２種類のプライマーにより特定したヌクレオチド変化の 存在及び増幅した断片から得られる領域の完全性について確認を行った。

ベクターｐＳＶＩ３−ｔＰＡを図４に示すようにして調製した。ｐＳＶＩ２−ｔ ＰＡ配列と同一の１つのオリゴヌクレオチド及び所望の変化が特定された１つの 突然変異オリゴヌクレオチドをそれぞれの場合に用いて、ｐｓＶＩ２−ｔＰＡの ２つの隣接領域をＰＣＲにより増幅した。これらの断片を用いてｐＳＶ［２−ｔ ＰＡ中の対応領域を置換した。単離したこれら断片は次のようであった。

（１）ベクターｐｓＶＩ２−ｔＰＡをＨｉｎｄＩＩ［で消化し、消化物をＢＡＰ で処理し、２つのＨｉｎｄＩＩ［断片をゲル電気泳動によって分離した。大きい 方の断片をゲルから回収した。これは、スプライス・ドナー−イントロン−スプ ライス・アクセプタ一単位を含む２３７ヌクレオチドのＨｉｎｄＩＩ［断片を除 いて全ｐＳＶ　Ｉ　２−ｔＰＡ配列を含有していた。

（２）新しいオリゴヌクレオチド（ＳＶＩ５２５Ｂａｍ）を、ｐＳＶ１２−ｔＰ Ａイントロン内のＡＴＧ　トリヌクレオチドのＰＣＲ突然変異誘発のために合成 した。これは５２５ヌクレオチドから４９７ヌクレオチドまでのｐＳＶＩ２−ｔ ＰＡの下側の鎖と配列が一致するものであるが、５１６位にＴからＡへの変化、 ５１９位にＡからＣへの変化、及び５２３位にＴからＧへの変化を有している。

この第１の変化はＡＴＧトリヌクレオチドをＴＴＧに変えるために設計した。

第２及び第３の変化は酵素ＢａｍＨＩの認識配列（ＧＧＡＴＣＣ）を創製するた めのものである。ＳＶＩ５２５Ｂａｍのヌクレオチド配列は次のようであった（ ｐｓｖ　＋　２−ｔＰＡ配列との相違点には下線を引いた）： ５’　−ＴＡＧＧＡＴＣＣＡＡＡＡＧＧＴＴＡＴＧＴＡＴＴＡＡＴＴＧＴ−３’ 　。

オリゴヌクレオチド５Ｖ１３７９（上記）及びＳＶＩ５２５Ｂａｍを用いて、Ｓ ＶＩ５２５８ａｍによって特定される変化を導入しながらｐＳＶＩ２−ｔＰＡの ３７９位と５２５位間の領域をＰＣＲ突然変異誘発により増幅した。この反応生 成物をＨｉｎｄＩＩ［及びＢａｍＨＩで消化し、得られた１３７ヌクレオチドの 断片をゲル単離した。

（３）　オリゴヌクレオチドＳＶＩ５３９Ｂａｍを、ｐｓＶＩ２−ｔＰＡの分枝 点領域のＰＣＲ突然変異誘発のために合成した。これは５３９位から５７３位ま でのｐＳＶＩ２−ｔＰＡ配列（上側の鎖）と一致するものであるか、次の変化を 有していた　即ち、５４１位のＴの代わりにＧ、５４４位のＣの代わりにＴ、５ ４５位のＡの代わりにＣ，５５３位のＡの代わりにＣ：そして、５５５位のＡの 代わりにＧｏこの最初の３つの変化はＢａｍＨＩ認識部位を創製するためのもの であるが、後の２つは分岐配列（ｂｒａｎｃｈｐｏｉｎｔ　５ｅｑｕｅｎｃｅ、 Ｂ　Ｐ　Ｓ　）コンセンサスに類似するシグナルを創製するためのものであった 。

このＳＶＩ５３９８ａｍのヌクレオチド配列は次のようであった（ｐＳＶＩ２（ ＰＡ配列からの変化には下線を引いた）：５’−ＧＧＧＧＡＴＣＣＴＡＴＡＧＡ ＣＴＧＡＣＡＴＣＣＡＣＴＴＴＧＣＣＴＴＴＣ−３’。

オリゴヌクレオチド５ＶＩ６２５を合成した。これは６２５位から６０３位まで のｐＳ　Ｖ　Ｉ　２−ｔＰＡ配列の下側の鎖と一致するものであるが、６１７位 にＡからＣへの変化を有し、ＢｓｔＢＩ認識部位（ＴＴＣＧＡＡ）が創製される ように設計したものである。この５ＶＩ６２５の配列は次のようであった（変化 には下線を引いた）・５’　−ＣＣＡＡＧＣＴＴＣＧＡＡＣＣＧＡＧＧＴＧＣＡ Ｇ−３’　。

オリゴヌクレオチドＳＶＩ５３９Ｂａｍ及び５ＶＩ６２５を用いて、ヌクレオチ ド５３９及び６２５ｒＪｊノｐＳ　Ｖ　Ｉ　２−ｔＰＡノ領域ヲｐｃＲによって 増幅し、同時に所望の変化を導入した。このＰＣＲ生成物をＨｉｎｄｌＩ［及び ＢａｍＨｒで消化し、７７ヌクレオチドの断片をケル精製した。

３つの断片（図４）を連結し、これを大腸菌ＭＭ２９４に導入した。

プラスミドＤＮＡを多数のアンピシリン耐性コロニーから単離し、１つのコピー それぞれに３つの断片すべてか存在していることを適当な制限酵素による消化及 びゲル電気泳動によって分析した。これら断片の相対的な配向もこの分析によっ て決定した。ｐＳＶＩ２−ｔＰＡと同じ順序で３つの構成断片が並んでいる１つ の組換えプラスミド（ｐＳ　Ｖ　１３〜ｔＰＡ）のヌクレオチド配列を、３つの 組換え部位（２つのＨｉｎｄＩＩ［部位及びＢａｍＨＩ部位）をまたぐ領域にお いて決定した（これら部位の間の全配列を含む）。

ｄ、ｐｓｖＩ　５−ｔＰＡ ベクターｐｓＶ１５−ｔＰＡは、ｐｓＶＩ３−ｔＰＡから、イントロンの一部と スプライス・アクセプターをＰＣＲ生成させた突然変異断片で置換することによ って構築した（図５に示すように）。ｐｓＶＩ３−ｔＰＡの３゛スプライスに対 してヌクレオチド−１６（Ｇ）をヌクレオチドＴに変えて、遮断されていない１ ６ヌクレオチド長のポリピリミジン域をスプライス・アクセプターの一部として 創製した。

また、このベクターを修飾して、このベクター中のスプライス・ドナー配列（Ｇ ／ＧＴＡＡＧＴ）に相補性である配列ＧＡＣＴＴＮＴＴ内に埋設された３′スプ ライス点に対して−２３の位置に潜在的な分枝アクセプターヌクレオチドを含ま せた。このＢＰＳと重なるのは、”広い″ＢＰＳコンセンサスに一致し、Ｕ　２ 　ｓｎＲＮ　Ａ配列に相補性である別のＢＰＳ（ＴＡＣＴＧＡＣ）である。この ＢＰＳ中の分枝アクセプターヌクレオチドは３′スプライス点に対して−２７の 位置に存在している。最後に、このベクターを、ｐｓＶｒ３−ｔＰＡ中の２つの ＢＰＳのすぐ上流に第３のＢＰＳを挿入することによって修飾する。この第３の ＢＰＳは保存性の酵母ＢＰＳ（ＵＡＣＵＡ゛スプライス点に対して−３４の位置 に存在している。

ｐｓＶ１５−ｔＰＡを創製するための断片は次のようにして調製した。

（１）ベクターｐｓＶｒ３−ｔＰＡをＢａｍＨＩて消化し、得られた５°突出末 端を４種すべてのｄＮＴＰの存在下にＴ４ＤＮＡポリメラーゼで充填した。次い で、この物質をＢｓｔＢＩで消化し、ＢＡＰで処理シ、ｐＳＶＩ３−ｔＰＡのス プライス・アクセプター配列及びイントロンの一部を除くすべてを含有する大き い方の断片をゲル単離した。

（２）中間生成物を単離することなく連続的なＰＣＲ増幅において使用するため に２つの新しいオリゴヌクレオチドを合成した。多種の突然変異を導入するこの 方法を採用して、標的に対して多数の誤対合（ミスマツチ）を存する単一の長い オリゴヌクレオチドの使用を避けたく比較的長い合成オリゴヌクレオチドは正し くなＩ、ｓ配列の分子を比較的大きな比率で含有していることか多い）。さらに 、将来においてこの第１のオリゴヌクレオチドを単独で用いて、分枝点及びスプ ライス・アクセプター領域がｐｓＶＩ３−ｔＰＡと異なるベクターを創製するこ とができるであろう。

第１のすｌＪゴヌクレｔ−Ｆ−ド５ＶＩ４は、ｐｓＶＩ３−ｔＰＡ（５４５〜５ ５７位）と共通する３°末端の１３ヌクレオチドを有していた。

これラヌクレオチドノ前に、５２３〜５４４位のｐＳＶＩ３−ｔＰＡ配列に類似 するが同一ではない２２ヌクレオチドの配列が存在していた。この相違は次のよ うであった（下では下線を引いた）、即ち、５２８位にＧからＴへの変化；５３ ５位にＡからＴへの変化；５３７位にＣからＡへの変化、５３８位にＣからＴへ の変化；５３９位にＡからＴへの変化；そして、５４４位にＧからＴへの変化を 有する。この最後の変化はスプライス・アクセプターのポリピリミジン域の延長 を引き起こすであろうし、また、最初の変化はｐＳＶＩ３−ｔＰＡ配列ＧＡＣＴ ＧＡＣをＢＰＳコンセンサス配列（Ｕ２に対合する）に一致するように変えるで あろう。残りの４つの単一ヌクレオチド変化は、スプライス・ドナーに相補性で ある配列を創製するように設計した。５ＶＩ４の配列は次のようである：５’− ＣＴＡＴＡＴＡＣＴＧＡＣＵＴＡＴＴＣＴＴＴＴＣＣＴＴＴＣＴＣＴＣＣＡＣ− ３’。

第２のオリゴヌクレオチド（ＳＶＩ５）は５ＶＩ４の中心部分と重なる。これは ５ＶＩ４の５個の５゛末端ヌクレオチドが異なっており、５″方回に延長して酵 母のＢＰＳ（ＴＡＣＴＡＡＣ）を導入したものである。この配列は次のようであ る（下線は対応するｐＳＶＩ３−ｔＰＡ配列との相違点を示す） ５″−Ｃ丁ＡＣＴＡＡＣＴＡＣＴＧＡＣＴＴＡＴＴＣＴＴＴ−３’　。

このｐＳＶＩ３−ｔＰＡのＢＰＳ／スプライス・アクセプター領域を、オリゴヌ クレオチド対５ＶＩ４／５ＶＩ６２５を用いるＰＣＲ突然変異誘発によって増幅 し、突然変異させた。このＰＣＲ生成物を希釈し、すりゴヌクレオチド対５ＶＩ ５／５ＶＩ６２５で再増幅した。この生成物をＴ４ＤＮＡポリメラーゼ及びＴ４ ポリヌクレオチドキナーゼで処理し、制限酵素ＢｓｔＢＩで切断し、７１ヌクレ オチド断片をゲル単離した。

この２種類の単離した断片（図５）を連結し、形質転換された（アンビンリン耐 性）細菌コロニーからプラスミドＤＮ’Ａを得、ｐｓＶ■３−ｔＰＡについて上 記したようにして分析した。所望のイントロン変化のすべてを保持する単離体の １つをｐｓＶＩ５−ｔＰＡと命名した。

配列決定によって、スプライス・ドナー−イントロン−スプライス・アクセプタ 一単位の外側に予期しない別の変化が同定された。

２個の付加的なヌクレオチド（ＧＣ）がｐｓＶ１５−ｔＰＡ中ノｐｓ　Ｖ　Ｉ３ −ｔ　Ｐ　ＡのＢｓｔＢＩ部位内に存在しくＴ　Ｔ　ＣＧ　Ａ　ＡかＴＴＣＧＣ ＧＡＡに変化）、従ってこの部位がｐＳＶ丁５−ｔＰＡに存在しなくなった。し かし、この２つの付加的なヌクレオチドは酵素ＮｒｕＩの認識部位を創製した（ この部位はこのベクター中で１つしかない）。この付加的なヌクレオチドは、連 結に用いた２つの構成断片のＢｓｔＢＩ突出末端の予期しない充填の結果である 可能性が最も高い。

ｅ、ｐｓＶ１６Ｂ−ｔＰＡ ｐＳＶ夏８Ｂ−ｔＰＡはｐｓ　Ｖ　Ｉ　５−ｔＰＡについて上記した方法と同様 の方法によって創製した。即ち、部分的に重なる突然変異オリゴヌクレオチドに よる２回の連続増幅を用いて、ｐＳＶ　［３−ｔＰＡのイントロン−スプライス ・アクセプター領域中に所望の変化を創製した（図６に示す）。

第１のオリゴヌクレオチド（ＳＶＩＳＡ）は次の配列を有しくｐＳＶＩ３−ｔＰ Ａ、５２３〜５５０位との相違点には下線を引いた）・５’−ＣＣＴＧＡＣＡＣ ＴＧＡＣＡＴＣＣＡＣＴＴＴＴＣＣＴＴＴＣ−３’　；また、第２のオリゴヌク レオチド（ＳＶＩ６Ｂ）は次の配列を有していた（ｐＳ　Ｖ　ｒ　３−ｔＰＡ） ５２３〜５４５位と比較しテ）：５’−ＣＥＴＡＣＴＧＡＣＡＣＴＧＡＣ″Ｊａ ｒｃｃＡｃｒｒＴｒｃ−ａ’。

５ＶＩ６Ａにおけるヌクレオチド置換は、５２４位のＴから０１５２６位のＴか らＧ１５２８位のＧからｃｌ及び５４４位のＧがらＴであった。Ｓｖ■６Ｂによ って特定される変化は、ｐＳＶＩ３−ｔＰＡのヌクレオチド５２５と５２６の間 のＣの挿入、ヌクレオチド５２６と５２７の開のＧの挿入、Ｃによる５２８位の Ｇの置換、及び５４４位のＧからＴへの変化であった。これらの変化は、ｐＳＶ Ｉ３−ｔＰＡのＢＰＳを最適化し、それと正に境界を接する第２のＢＰＳを５′ 側に導入するために設計した。これら２つの分枝点配列は中心のＣのところで重 なり、これらを５ＶＩ６Ｂ配列において［コ内に示す。

ｐＳＶ　Ｉ　５−ｔＰＡについｒ記載したようにして、５ＶＩ６２５ｆ７）存在 下でオリゴヌクレオチドＳＶ　Ｉ　６Ａ及びＳＶ　Ｉ　６Ｂによる連続増幅を行 なって、ｐＳＶＩ３−ｔＰＡのイントロン−スプライス・アクセプタ一単位を修 飾した。また、ＰＣＲ生成物の酵素処理、ゲル単離、及びｐＳＶＩ３−ｔＰＡの 大きいＢａｍＨＩ　−ＢｓｔＢ　Ｉ断片への連結もｐＳＶＩ５−ｔＰＡについて 記載したようにして行なった。アンビンリン耐性の細菌コロニーの１つからのプ ラスミドＤＮＡ（このプラスミド単離体をｐＳ　Ｖ　Ｉ　６　Ｂ−ｔＰＡと命名 した）のヌクレオチド配列分析により、５ＶＩ６Ｂオリゴヌクレオチドによって 特定される修飾に加えていくつかの予期しない変化が示された。即ち、５４５位 がｐＳ　Ｖ　Ｉ　３−ｔＰＡのＣではなくＴであり、５５０位もＣではなくＴで あり、そしてｐｓＶＩ５−ｔＰＡ中にＮｒｕＩ制限部位を創製する付加的なジヌ クレオチドもｐＳＶＩ６Ｂ−ｔＰＡ配列中に存在していた。この初めの２つの変 化はｔ−ＰＡの発現に悪影響を及ぼすものとは予想されず、補正しなかった。

２　広目的の親ベクターｐＳＶＩ６Ｂ５の構築広く利用できる別種ポリペプチド の発現のための親ベクターをｐＳＶＩ６Ｂ−ｔＰＡから導いた。ｐｓＶ１６Ｂ５ と呼ぶこのベクター（大腸菌株ＡＴＣＣＮｏ、　６８．１５１を形質転換）は、 ｐＳＶ＋６８−ｔＰＡ中のｔ−ＰＡｃＤＮＡの代わりにポリリンカー領域を担持 している。これらのポリ１ノンカー領域は好都合かつ唯一の制限エンドヌクレア ーゼ認識部位を与え、これらの部位を用いて所望のポリペプチドをコードしてい る任意の配列を導入することができる。

ベクターｐＳＶＩ６Ｂ５は、図７に示し以下に説明するように４工程で創製した 。初めの３工程は、ｐｓＶ１６Ｂ−ｔＰＡからＢａｍＨｒ、Ｈｉｎｄｌｌｌ、及 び５ａｌＩ制限部位をそれぞれ除去することからなる。その結果、最後の工程で ｔ−Ｐ　Ａ　ｃＤ　Ｎ　Ａをポリリンカーで置換することにより、ポリリンカー のこれら酵素の部位が、得られた親発現プラスミド中で唯一のものとなった。

ａ、第１の中間体プラスミドｐＳ　Ｖ　１６　Ｂ　−ｔ　Ｐ　Ａｄ（ｂ）ノ構築 ヘクターｐｓ　Ｖ　Ｉ　６　Ｂ−ｔＰＡをＢａｍＨｌ（イントロン内だけを切断 する）で消化し、得られた５゛突出末端をｄＮＴＰの存在下にＴ４ＤＮＡポリメ ラーゼで充填し、直線化されたベクターをゲル単離し、そしてＴ４ＤＮＡリガー ゼで処理して再環化した。これによりＢａｌ！ｌＨ１認識配列が失われ、代わり に、酵素Ｃ１ａｌの認識配列か創製された。しかし、プラスミドＤ　Ｎ　Ａをｄ ａｍ”大腸菌から得るときには、メチル化によりＣ１ａｌはこの配列を切断する ことかできない。

ｂ　第２の中間体プラスミドｐＳ　Ｖ　１６８−ｔＰ　Ａｄ（ｂｈ）の構築プラ スミドｐｓ　Ｖ　１６　Ｂ−ｔＰ　Ａｄ（ｂ）をＨｉｎｄｌｌＩ（スプライス単 位の両側を切断する）で消化し、５′突出末端を４種すべてのｃ［ＮＴＰの存在 下にＴ４ＤＮＡポリメラーゼで充填し、反応混合物の一部をＢＡＰて処理した。

この処理及び未処理の両温合物中に存在する２種類の断片をゲル電気泳動によっ て分離し、大きい方の断片は処理した混合物から、そして小さい方の断片は未処 理の混合物から単離した。これら２つの断片を連結してプラスミドｐＳ　Ｖ　Ｉ 　６　Ｂ−ｔＰ　Ａｄ（ｂｈ）を創製した。画構成断片のＨｉｎｄｌｌＩ末端の 充填によって、得られるプラスミド中に２つのＨｉｎｄｊ１１部位か存在しなく なり、同時に酵素Ｎｈｅｌの２つの新しい認識部位か創製された。

Ｃ１第３の中間体プラスミドｐＳ　Ｖ　Ｉ　６８−ｔＰＡｄ（ｂｈｓ）の構築単 一の５ａｌｌ認識部位を、この酵素による消化、ｄＮＴＰの存在下でのＴ４ＤＮ Ａポリメラーゼ処理、直線プラスミドＤＮＡのケル単離、及びＴ　４　Ｄ　Ｎ　 Ａリガーゼを用いる再環化によってプラスミドｐｓ　Ｖ　１６８−ｔ　Ｐ　Ａｄ （ｂｈ）から除去した。これにより、新たにＰｖｕｒ認識部位か創製される結果 になった。

ｄ、プラスミドｐｓＶ１６Ｂ５及びｐｓＶ１６Ｂ７の構築最後の多目的の親プラ スミドを創製するために、次のようにして２種類の断片を調製した。

（１）　プラスミドｐＳ　Ｖ　ｒ　６　Ｂ　−ｔ　ＰＡｄ（ｂｈｓ）をＰｓｔＩ 及びＣ１ａＩで消化した。このプラスミド中にはＣ１ａｌの認識部位が３カ所存 在する。１つはｔ−ＰＡ配列の前のイントロン中に、１つはｔ−ＰＡ　ｃＤＮＡ とＳＶ４０初期ポリＡポリの境界に、そして１つはポリＡ領域の末端近くに存在 する。これら部位の１つだけ（第２の部位）がメチル化に対して非感受性である 。従って、ｄａｍ″ＭＭ２９４から調製したプラスミドＤＮＡはＣ１ａｌによっ てこの部位でのみ切断された。

Ｐｓｔｌ認織部位はスプライス単位とｔ−ＰＡ　ｃＤＮＡの連結点に位置してお り、さらにいくつかがこの位置とメチル化−非感受性のＣｌａｌ部位の間のｔ− ＰＡ配列中に存在している。従って、ＰｓｔＩとＣ１ａ■による切断によって、 ｔ−ＰＡの配列を含有する数個の比較的小さい断片とｔ−ＰＡのｃＤＮＡを除＜ 　ｐＳ　Ｖ　Ｉ　６　Ｂ−ｔＰＡｄ（ｂｈｓ）配列のすべてを含有する大きい断 片か得られた。この大きい方の断片をゲル単離した。

（２）　２つのオリゴヌクレオチドを合成した。これらは、第１のオリゴヌクレ オチド（５Ａと呼ぶ）の全長（４７ヌクレオチド）にわたって相補性であった。

第２のオリゴヌクレオチド（５Ｂンは、その５′末端のところが２ヌクレオチド 延び、その３゛末端のところが４ヌクレオチド延びていた（以下の５Ｂ配列にお いて下線を引いた）。従って、これら相補性のオリゴヌクレオチドをアニーリン グすると、１つの５゛及び１つの３°突出末端（”オーパーツ〜ング）を有する ＤＮＡ断片か得られた。４ヌクレオチドの３′突出末端の配列はＴＧＣＡ−３° であり、これはＰｓｔ［認識部位のＰｓｔｌ切断によって創製される３°オーバ ーハングと相補性である。２ヌクレオチドの５′突出末端はジヌクレオチド５’ −ＣＧからなり、これはＣ１ａＴ制限部位のＣ１ａｌ切断によって創製される５ ′オーバーハングと相補性である。さらに、これら２つのオリゴヌクレオチド配 列を、多数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位を与えるように設計した（これら の一部を、以下に示す各オリゴヌクレオチド配列の下に示す）。オリゴヌクレオ チドＳＡの配列は次のよってある５’　−ＴＣＧＡＴＴＧＡＡＴＴＣＣＣＣＧＧ ＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡＧＴＣＧＡＣＣＴＧＣＡＧＡＡＧＣＴＴ−３″均四Ｒ １違＋ａｌシ四Ｈ１月」Ｉ　シリＩ　力匹Ｉル罰ｄＤＩオリゴヌクレオチド５Ｂ の配列は次のようである。

５’　−ＣＧＡＡＧＣＴＴＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣ ＣＣＧＧＧＧＡＡＴ丁ＣＡＡ丁ＣＧＡＴＧＣＡ−３’Ｈｉｎｄｌｌｌ　Ｐｓｔｌ 　５ａｌｌ　Ｘｂａｌ　ＢａｍＨＩ　Ｓｍａｌ　ＥｃｏＲＩ　Ｃ１ａｌオリゴヌ クレオチド５Ａ及び５Ｂをアニーリングし、単離したｐＳ　Ｖ　Ｉ　６　Ｂ−ｔ ＰＡｄ（ｂｈｓ）断片に連結してプラスミドｐＳＶＩ６８５を創製した。Ｐｓｔ ｌオーバーハングをアニーリングしたオリゴヌクレオチドのＴＧＣＡ−３’オー バーハングに連結してもＰｓｔ１部位は再生されず、ＣｌａＩ部位が創製された 。このリンカ−の他の末端におけるＣ１ａｌオーバーハングの５’−ＣＧオーバ ーハングへの連結はＣｌａｌ部位を再生しなかった。

実施例２ ＨＰｇ及びＲ５６１ＳＰｇ発現ベクターの構築、それによるＣＨＯ細胞の形質転 換、及び精製 一般的方法 この実施例及び以後の実施例において、ｃＤＮＡを突然変異するために使用する オリゴヌクレオチドは、以下のいずれかにより合成した・（１）バイオサーチ（ Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ、サン・ラフアニル、　ＣＡ）サイクロン　２−カラムＤＮ Ａ合成装置に基つくホスホルアミタイト化学を使用し、アプライド・バイオシス テムズ（ＡＩ）ｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ。

フォスター・ンティー、　ＣＡ）オリゴヌクレオチド精製カートリ、ジにより精 製する、又は（２）　ＦｒｏｅｈｌｅｒらのＮｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、 　＋　１４：５９３３−５４０７（１９８６）に記載されているＨ−ホスホネー ト化学を使用する。

細胞トランスフェクションは、リン酸カルシウム法により行った［１（ｉｎｇｓ ｔｏｎのＣｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂ ｉｏｌｏｇｙ、前掲ヨ。

ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ、バロ・アルド、　ＣＡ）Ｌ５　６５．ｉｉ製用超 遠心機を使用する、Ｃ５Ｃ（／エチジウムブロマイド（ＥｔＢｒ）グラジェント （勾配）遠心によって、プラスミドＤ　Ｎ　Ａを精製したＵＭｏ○「ｅのＣｕｒ ｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、 Ａｕ５ｕｂｅＬら１ｌＷＣＪｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆５ｏｎｓ、ニューヨーク、 １９８７）、ｐ、　１．７．１−１．７．４］。垂直回転（Ｖｔ　ｉ、　６５． １）遠心は、１５°Ｃ，５５，○○Ｏｒｐｍで７時間使用し、ＤＮＡバンドを分 離した。遠心管から所望の物質を得た後、プラスミドＤＮＡをＣｓＣ４で飽和さ せたイソプロパツール溶液中に抽出し、そのプラスミドＤＮＡからＥｔＢｒを除 去した。次いて、細胞トランスフェクションを行う前に、得られたＤＮＡを１ｍ Ｍ　トリス−ＨＣＱｌｏ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、ｐＨ７，１の緩衝液に対して透析 した。

Ｒ５６１Ｓ発現ベクターｐＡ４７５Ｒ５６１ｓＰｇの構築ｐＵＣ１１９ＰＮ１２ ７．６と命名されるベクター（その配列は、ヌクレオチド３８０９に関する上記 のもの以外、第１図に示されている）を以下のようにして調製した。５検体から 単離した肝ｍＲＮＡより構築したｎ−オリゴ（ｄＴ）−プライム化ｃＤＮＡライ ブラリーから、第１のｃＤＮＡを単離した［ＯｋｙａｍａらのＭｏ１．　Ｃｅ１ １．　Ｂｉｏｌ、　、　２：１６１−１７０（１９８２）及びＧｕｂｌｅｒらの Ｇｅｎｅ、　２５：２６３−２６９（１９８３）″Ｊｏサイズ選択したｃＤＮＡ （６００塩基対よりも大きい）をλｇｔｌｏバクテリオファージベクター［スト ラタンーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、サンジエゴ、カリホルニア］内に連結し 、増幅することなくスクリーニングした（：ＤｒａｙｎａらのＮａｔｕｒｅ、　 ３２７：６３２−６３４（１９８７）］。得られたｃＤＮＡを以下のリンカ−を 使用してλｇｔｌｏベクターに連結した。

Ｅｃｏ　ＲＩ　Ｓａｃ　［／Ｓｓｔ　ｌ　Ｓａｌ　ｌλｇｔ　１０　：　ＧＡＡ ＴＴＣＴ　ＣＧＡＧＣＴＣＧＴＣＧＡＣＣ：　ｃＤ　Ｎ　Ａヒトプラスミノーゲ ７ｃＤＮＡの１，３０８−１，３８０ヌクレオチドに相当する７５塩基オリコヌ クレオチドプローブ（ＰＬ、１）を用いて、λｇｔｌｏｃＤＮＡクローンを回収 したＥＦｏｒｓｇｒｅｎらのＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、　、　２１３：２５４−２６ ０（１９８７）コ。５ｘＳＳＣ（１５０ｍＭ　ＮａＣｆ！、１５ｍＭ　クエン酸 三ナトリウム）、５０ｍＭ　リン酸ナトリウム（ｐＨ６゜７）、５×デンハート （Ｄｅｎｈａｒｄｔ’　ｓ）溶液、２０％ホルムアミド、１０％デキストラン硫 酸、及び２０μｇ　／ｘＱ煮沸した音波処理済みサケ精液ＤＮＡ中において、４ ２°Ｃで一晩フイルターをハイブリクイズし、２ＸＳＳＣ１０１％ＳＤＳ中、５ ５℃で１時間洗浄し、Ｘ線フィルムに感光した。λｇｔｌｏクローン（λｇｔｌ 　Ｏ：ｐｍｇｎ＃１２７と命名）を５ｓｔｌで切断し、５ｓｔｌ切断したｐＬＩ ｃｌ、１９に連結して、上記以外は第１図に示すヌクレオチド及び推定のアミノ 酸配列のｐＵｃ１１９ＰＮ１２７．６を得た。ｐＵＣ１１９ＰＮ１２７．６の（ Ｇ　ｌｕ’ｌ　Ｐ　ｇのヌクレオチド配列は、Ａｌａの代わりにＶａ１４７５が 存在していることを示している。

このクローンの配列決定を完全に行った。ｐＵｃ１１９ベクターにサブクローン した後、２本鎖ＤＮＡから直接的に、又は１本鎖鋳型［ＣｈｅｎらのＤＮＡ、　 ４：１６５−１７０（１９８５）］のいずれかに基づいてサブクローンした２重 鎖ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　［ＳａｎｇｅｒらのＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　 Ｓｃｉ、　、　Ｕ、　Ｓ、　Ａ、　７４：５４６３−５４６７（１９７７）］の 両鎖のジブオキ／鎖終止法により、ＤＮＡ配列分析を行った。

５６１位のセリン以外は正確なヒトＰｇ配列を含有するベクターｐＡ４７５Ｒ５ ６１ｓＰｇを以下のようにして構築し、それを第７図に示す。

ｐｓＶＩ６ＢｔＰＡをＥｃｏＲＩで消化し、得られたＥｃｏＲＩ部位か平滑末端 となるまで充填し、次いてＰｓｔＩで切断し、大きな断片を単離する。ｐＵＣ１ １９ＰＮ１２７．６をＳ　ｐｈ　Ｉで切断し、得られたＳ　ｐｈ　１部位が平滑 末端となるまで充填し、次いでＥｃｏＲＩて切断し、ＨＰｇｃＤＮＡの３°末端 を含有する小さな断片を単離する。

ｐＵｃｌ　１９ＰＮ１２７．６をＰｓｔｌ及びＥｃｏＲＩても切断し、Ｈｐｇを コードするｃＤＮＡの完全な５゛末端を含有する小さな断片も単離した。これら ２つの小さな断片とｐｓＶＩ６ＢｔＰＡから得た大きな断片とをＴ４１／ガーゼ を用いて共に連結し、プラスミドｐＳＶＩ６ＢＰ１ｇｎを調製した。このプラス ミドをＰｓｔｌ及びＥｃｏＲＩて開裂し、次いで小さな断片（２４８ｂｐ）を単 離した［断片Ａ］。ｐＳＶｒ６ＢＰ１ｇｎをさらにＨＰｇのｃＤＮＡの部位特異 的突然変異にかけるにあたり、ＫｕｎｋｅｌらのＭｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍ、　、 　１５４：３６７−３８２（１９８７）に記載された方法により、以下に記載の Ｒ５６１Ｓ変化を有するプライマーを使用して行った・ ５’　−ＡＣＣＣＣＣＣＴＡＣＡＡＣＧＧＡＴＣＣＡＧＧＡＣＡＴＴＴＣＴＴＣ −３’これらの突然変異の結果としてｃＤＮＡに挿入された新たなりａｍＨ１制 限エンドヌクレアーゼ部位の存在によって、得られたクローンをスクリーニング した。得られたプラスミドをｐｓＶＩＲ５６１ＳＰｇ、Ｃ２と命名した。このプ ラスミドを５ｐｈｌで切断し、得られたＳ　ｐｈ　Ｉ部位が平滑末端になるまで 充填し、次いでＥｃｏＲＩで切断し、小さな断片（２，３２ｋｂ）を単離した［ 断片Ｂ］。ｐＳＶＩ６ＢｔＰＡプラスミドをＥｃｏＲＩで開裂させ、得られたＥ ｃｏＲ１部位が平滑末端になるまで充填し、次いでＰｓｔＩで切断し、大きな断 片を単離することで、そのｐｓＶＩ６ＢｔＰＡプラスミドから第３の断片を調製 した［断片Ｃ］。

断片Ａ、Ｂ及びＣをＴ４リガーゼで連結し、突然変異したプラスミノーゲン及び ｐｓＶｒ６ＢｔＰＡのヘクター要素を含有するプラスミドｐＲ５６１３Ｐｇを得 た。

ベクター供給源としては、ｐｓＶＩ６ＢｔＰＡの代わりに他の発現ベクターを利 用することもできよう。例えば、ｐＥ３４２−ｔ−ＰＡ［米国特許第４．７６６ 、　ｆ１７５号コは、ｐＥ３４２−ｔ−ＰＡのｔ−ＰＡコード化ＤＮＡをｐＵＣ １１９ＰＮ　１２７．６由来のプラスミノーゲンＣＤＮＡと置換することにより 、ベクター断片として利用できよう。

その際、他の発現ベクター由来の調節要素を当業者に既知の手法によりＨＰｇｃ ＤＮＡと作動可能に結合すれば、ＨＰｇ発現ベクターを調製することができる。

最終ベクターｐＡ４７５Ｒ５６１ｓＰｇは以下のようにして調製した：　ｐＲ５ ６１ｓＰｇをＡｈａｌＩ及びＥｃｏＲＩで開裂し、得られた小さな突然変異Ｐｇ 断片（１００３ｂｐ）を単離する［断片Ｄ］。さらに、ｐｓＶＩ６ＢＰＩｇｒ＋ もＳ　ｍａ　Ｉ及びＥｃｏＲＩで開裂し、ベクター断片（４，３９４ｋｂ）を単 離する［断片Ｅ］。最後に、ｐＳＶＩ６ＢＰ１ｇｎをＨＰｇのｃＤＮＡの部位特 異的突然変異にかけるにあたり、Ｋｕｎｋｅｌら（前掲）の方法により、以下に 記載の突然変異プライマー（下線を施した塩基が強要した突然変異を示している ）を使用し、Ｖ４７５Ａ突然変異を作成した： ５’　−ＧＴＡＡＣＡＧＴＧＧＴＴＧＣＣＣＴＣＴＴＧＣＣＴＣ−３゜ＥｃｏＲ Ｉ／ＢｓｔＥＩＩ制限エンドヌクレアーゼ消化により、陽性コロニーをスクリー ニングした。適切な大きさの断片を含有するクローンを、アミノ酸４５５−５０ ２位に相当する領域にわたり配列決定した。

上記のようにして突然変異したｐ　Ｓ　Ｖ　ｒ　６　Ｂ　Ｐ　ＩｇｎをＳ　ｍａ 　ｒ及びＡｈａｌＩで切断し、小さな断片（１，５５ｋｂ）を単離した［断片Ｆ １゜断片り、Ｅ及びＦを連結し、最終プラスミドｐＡ４７５Ｒ５６Ｉｓｐｇを調 製した。

プラスミノーゲン発現ベクターｐＡ４７５Ｐｇの構築Ｒ５６１Ｓ突然変異を伴わ ないＡ４７５突然変異を含有するプラスミド（即ち、天然の配列のプラスミノー ゲンを含有するプラスミド）を以下のようにして調製した：　ｐｓＶＩ６ＢＰ１ ｇｎをＡｈａｌＩ及びＥｃｏＲＩで切断し、小さな断片を単離した［断片Ｇ］。

断片Ｅ及びＦ（既述）及びＧを連結し、プラスミドｐＡ４７５Ｐｇを調製した。

ＦＡＩ−１発現ベクターｐＲＫＰＡＩ−１の構築ヒトβ−移動性内皮細胞型プラ スミノーゲンアクチベーターインヒビター（ＦＡＩ−Ｉ）をコードしている発現 ベクターは以下のようにして調製した：　ＰＡＩ−１のクローニング及び配列は 、Ｎｙらの−２５４４（１９８６）に記載されている。ヒトへそ内皮細胞ｃＤＮ ＡライブラリーからＰＡＩ−１ｃＤＮＡをλクローンとして入手し、それをＥｃ ｏｌｉ　（大腸菌ン内て複製するｐＵｃ１８クローニングベクター内に入れた。

このプラスミドをＢｇｌＩ［で切断し、平滑末端化し、ＥｃｏＲＩて切断した。

約１４３０ｂｐの得られた小さな断片をゲル精製した。ｐＲＫ５もＳｍａｌで切 断し、次いでＥｃｏＲＩて切断し、４７１２ｂｐのベクター断片を単離し、ゲル 精製した。これら２つの断片をＴ４リガーセを用いて共に連結し、ミニ調製の消 化を行い、挿入物の方向を確認した。この最終ベクターをｐＲＫＰＡＩ−Ｉと命 名した。

ｐＡ４７５Ｒ５６１ＳＰｇ又はｐＡ４７５Ｐｇによる形質転換ＣＨＯｄｈｆｒ細 胞１：１ｌｒｌａｕｂ及びＣｈａｓｉｎ、前掲］を６０ｚｘ平板中に５×１０５ 細胞／平板で２つ設置した。ＤＮＡはリン酸カルシウムのプロトコールにより以 下のプラスミドの組合わせを用いてトランスフェクトした： （ａ）ｐＡ４７５Ｒ５６１ＳＰｇ（５０μＣ又は５μｇ／平板）、ｐＲＫＰＡＩ −１（４，２ｔｔＱ又は５μｇ／平板）、及びｐＦＤｌｌ［ｓｉｍｏｎｓｅｎ及 びＬｅｖｉｎｓｏｎのＰｒｏｃ、　Ｎａｔ　１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　、　 Ｕ、　Ｓ、　Ａ、　８０　：２４９５−２S９９（１ ９８３）］に記載されているＤＨＦＲ−コード化プラスミド（６μＱ又は０．５ μｇ／平板）； （ｂ）ｐＡ４７５Ｒ５６１ｓＰｇ（５０μρ又は５μｇ／平板）、及びｐＦＤｌ ｌ（６μＱ又は０．　５μｇ／平板）：（ｃ）　ｐＡ４７５Ｐｇ（５０μｃ又は ５μｇ／平板）、ｐＲＫＰＡ　ｌ−１（４，２μ２又は５μｇ／平板）、及びｐ ＦＤｌｌ（６μｇ又は０、　５μｇ／平板）： （ｄ）　ｐＡ４７５　Ｐｇ（５０μＱ又は５μｇ／平板）、及びｐＦＤｌｌ（６ μＱ又は０．　５μｇ／平板）。

透析濾過（ｄｉａｆ　１ｌｔｅｒｅｄ）　したウシ脂汗血清を７％含有する選択 培養培地に細胞を分配し、６０肩震平板当たりプラスミドＱ、１．０゜１．０１ 、Ｏ８２、ｏ　２及び０．３μｇとした。１２日経過後、４つの形質転換（上記 ａ−ｄ）から各１つの平板をリン酸緩衝化食塩水で洗浄し、選択培養培地及び７ ％プラスミノーゲン枯渇つ／脂汗血清を加えた。この工程は細胞から産生された ものでないプラスミノーゲンを除去するものである。プラスミノーゲンを産生し ているクローンをフィルター上の発現量に基づきスクリーニングした。形質転換 ａ−ｄの各３つのクローンを綿棒で取り上げ、１２ウエルの平板に入れた。これ ら１２個のクローンを１０ｃｚ平板中で発育させ、培地を非選択培養培地と交換 した。

収穫された培地をＥＴＩＳＡタンパク質測定法にかけた。ｐＡ４７５Ｒ５６１Ｓ Ｐｇ及びｐＲＫＲＡ［−１りｏ−７＃２は少なくともＩＲｇ／Ｑの活性を与える ことが見いだされた。Ｒ５６１Ｓ−ＨＰｇ＠質の５つのローラーボトルを精製の ために作成した。Ｂ　ｒｏｃｋｗａｙ及びＣａ５ｔｅｌｌｉｎｏのＡｒｃｈ、　 Ｂｊｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　、　１５１：１！１４−１９９（１９７ ２）によって改変したＤ　ｅｕｔｓｃｈ及びＭｅｒｔｚの５ｃｉｅｎｃｅ　１７ ０：１０９５−１０９６（１９７０）の方法に従い、セファロース−リジンのア フィニティークロマトグラフィーにより、Ｒ５６１Ｓ−ＨＰｇ物質をＣＨＯ培養 上清から精実施例２に記載した一般的方法をこの実施例でも使用した。

ＨＰｇ及びＲ５６１Ｅ−ＨＰｇバキュロウィルス発現発現ツクタープラスミドｐ Ｕｃ１１９ＰＮ１２７．６内（ＢａｍＨＩ／ＮａｅＩ断片中）でＨＰｇをコード しているｃＤＮＡを実施例２に記載しているようにして突然変異させ、実施例２ に記載のようにＶ４７５Ａ変化を起こし、天然配列Ｐｇを作成した。突然変異プ ライマー：５°−ＣＣＣＣＣＣＴＡＣＡＡＣＣＣＴＣＣＣＧＧＧＡＣＡＴＴＴＣ ＴＴＣＧＧ−３’を使用し、得られたプラスミドを実施例２に記載しているよう にして突然変異させ、Ｒ５６１Ｅ変化を作成した。

この改変法に伴う新たに生成する５ｒＡａｌ制限工ンドヌクレアーゼ開裂部位の 存在について、この突然変異の陽性コロニーをスクリーニングした。Ａ４７５Ｈ ＰｇｃＤＮＡ及びＡ４７５．Ｒ５６１Ｅ変化ｇｃＤＮＡが挿入された組換えバキ ュロウィルス転移ベク９−ｐＡＶ６を、ＡｃＭＮＰＶポリヘトリン（ＰＨ）遺伝 子の回りのＤＮＡ配列を含有するように構築した。ｐＡＶ６はＰ）ｌ遺伝子の５ ′側に位置するＸｂｏ１部位からポリヘトリン開始コドン（ＡＴＧ）の−８ヌク レオチドまでの１．８ｋｂ内にポリへドリンプロモーターを含有しており、さら にポリヘトリン遺伝子内のＫｐｎ工部位からこの同じ遺伝子の３′側のＢａｍＨ １部位までに伸長する１、５ｋｂ断片をも包含している。Ｘｂｏｌ及びＢａｍＨ Ｉ部位はこれら断片のクローニングの際に喪失した。

ｐＡＶ６を以下のようにして構築し、それを第８図に示す。ポリヘトリン遺伝子 及びフランキング配列を含有する、ｐＥｃｏＲＩ−１と命名されるオートグラフ ァ・カリホルニ力（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ　ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）ＤＮＡの ７．　２ｋｂ　ＥｃｏＲ！断片［５ｗ１ｔｈらのＪ、　Ｖｉｒｏｌ、　、　４５ ：２１５−２２５（１９８３）　；　５ｇ１ｉｔｈらのＪ、　Ｖｉｒｏｌ、　、 　４６：５８４−５９３（１９８３）コをＸｈｏＩ及びＢａｍＨＩて切断した（ Ｓａｉｌ及びＸｈｏＩ消化により適合する末端が生成される）。得られたＸｈｏ 　ｒ　／　Ｂ　ａｍＨＩ断片を５ａｉｌ及びＢａ１ＨＩで切断したｍｐ１９ベク ター［ベセスタ・リサーチ・ラボラトリーズ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒ ｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ガイセルスバーグ、ＭＤｌ内に連結し、ｍ ｐｌ　９　Ｘｈｏ　−Ｂａｍと命名される構築物を作成した。得られたｍｐ１９ Ｘｈｏ−ＢａｎプラスミドをＥｃｏＲＶ及びＫｐｎｒで切断し、第１の合成オリ ゴヌクレオチド［以下に引用するすべてのオリゴヌクレオチドと同様にアプライ ド・バイオシステムズ（フォスター・シティ−、ＣＡ）から市販されている３８ ０Ａ型自動ＤＮＡ合成装置により構築コを切断１ｌｌｐ　１９　Ｘｈｏ　−Ｂ　 ａｍ内に連結し、ｍｐ１９ＡＩＤと命名されるベクターを作成した。第１の合成 オリゴヌクレオチドは以下の配列を含有し、指定した制限部位及び転写開始部位 を含有している： −転写開始 ５’　−ＧＡＴＴＡＣＡＴＧＧＡＧＡＴＡＡＴＴＡＡＡＡＴＧＡＴＡＡＣＣＡＴ ＣＴＣＧＣＡＡＡＧＧＡＴＣＣＧＡＡＴＴＣＧＴＣＧＡＣＧＧＴＡＣに の第１の合成オリゴヌクレオチドはＥ　ｃｏＲＶ部位から推定のＣＡＰ部位まで のｍｐ　１９　Ｘｈｏ　−Ｂ　ａｍ内のＸｈｏ　Ｉ　／　Ｂ　ａｍＨＩ断片の５ ゛末端の配列が置き換わっており、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、５ａｌｆ及びＫｐ ｎ１部位を有する多重クローニング部位を含有している。

次に、ｐＵＣ１２ベクター［Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒ ａｔｏｒｉｅｓｌをＨｉｎｄｌＩ［及び５ｓｔｒで切断し、ｒｎｐ１９ＡＩＤを Ｈ１ｎｄｌＩＩ及びＫｐｎｌで切断し、ポリヘトリン遺伝子の５′末端をフラン キングしている配。

列を含有する１、８ｋｂ断片を単離する。プラスミドｐＥｃｏＲＩ−ＩをＢａｍ ＨＩ及びＫｐｎＩで切断し、得られた消化産物の中から、ボソヘドワン遺転子内 のＫｐｎ１部位からその３”フランキング領域のＢａｍ８１部位までの１．５ｋ ｂ断片を分離した。これら３つの断片［ｐＵＣｌ２．１．８ｋｂ及び１．５ｋｂ ］を、配列：　５’−ＧＡＴＣＡＧＣＴを有する第２の合成オリゴヌクレオチド と共に連結し、ｐＡＶｌと命名される構築物を調製した。

ｐＡＶｌをＢａｍＨＩ及びＫｐｎｒで切断した後、得られた断片を第３の合成オ リゴヌクレオチドと連結し、ｐＡＶ２と命名した構築物配列を有している ５’　−ＧＡＴ　ＣＴＡ　ＧＡＴ　ＣＴＧ　ＡＧＣＴＣＧ　ＣＧＡ　ＴＧＧ　Ａ ＴＣＣＣＧ　ＧＧＴ　ＡＡＣＣＧＧ　ＴＡＣ３’　−ＡＴ　ＣＴＡ　ＧＡＣＴＣ Ｇ　ＡＧＣＧＣＴ　ＡＣＣＴＡＧ　ＧＧＣＣＣＡ　ＴＴＧ　ＧＣｌ）　Ｂ　Ｒ３ ２２［Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入 手した４゜４ｋｂプラスミド］をＨｉｎｄｌｌｌ及び５ａｉＴで切断し、クレノ ー断片で充填し、連結して、プラスミドｐＤＳを構築した。従って、プラスミド ｐＤＳはＨｉｎｄｎ［と５ａｉＴ間の配列を欠いており、５ａｉＴ部位を喪失し ているが、ＨｉｎｄＩ［Ｉ部位は保持している。

プラスミドｐＡＶ２をＨｉｎｄｆＩ［及びＢａｍＨｒで切断し、１．５ｋｂＨｉ ｎｄ［／　Ｂ　ａｍＨＩ断片（５°フランキング配列を含有する断片）を単離し た。次いで、ｐＡＶ２をＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩで切断し、多重クローニング 部位内のＢａｍＨｒｉ位からその３゛フランキング配に隣接するＥｃｏＲ１部位 まで伸長する１、５ｋｂ　ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ断片を単離した。プラスミド ｐＤｓをＨｉｎｄｎ［及びＥｃｏＲＩで切断し、ｐＡＶ２から作成した上記２つ の断片と連結した。得られたプラスミドをｐＡＶ３と命名する。

プラスミドｐＡＶ３をＢａｍＨＩ及び５ａｉｌで切断した。ｐＡＣ３７３ヘクタ ー［Ｓｍ１ｔｈらのＭｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　、　３：２１５６−２ １６７（１９８３）］（ポリヘトリン遺伝子の５′側約１ｋｂの５ａｉＴ部位か ら一８位ヌクレオチド（ｒＡＴＧＪ開始コドンのｒＡＪが＋１）に挿入されたＢ ａｍＨＩ部位までにＮＰＶウィルスＤＮＡを含存するベクター）をＢａｎＨＩ及 び５ａｉｌで切断し、ＢａｍＨＩ／５ａｉｌ切断ｐＡＶ３に連結し、ｐＡＶ４と 命名するベクターを調製した。

このベクターｐＡＶ４をＥｃｏＲＩで切断し、得られた末端をクレノー断片で充 填し、連結し、ｐＡＶ６と命名するベクターを得た［これはｐＡＶ４のＥｃｏＲ Ｉ部位を欠いている］。

［ｐＵＣｌ　１９ＰＮ１２７．６由来の天然配列ＨＰｇをコードしているＢａｍ Ｈｒ／Ｎａｅｒ断片をプラスミドｐＡＶ８のＢａｍＨＩ及びＳｍａ１部位に挿入 することにより作成した転移ベクターｐＡＶ６ＨＰｇは、ＨＰｇシグナル及び成 熟［Ｇ　ｌｕ’］　Ｐ　ｇコード化配列に連結されたＡｃＭＮＰＶポリヘトリン （ＰＨ）プロモーターを含有している。このプラスミドは、ＭＤ２０８５２．　 ロックビル、バークローン・ドライブ１２３０１番に住所を有するアメリカン・ タイプ・カルチャー・コレクションへ１９８９年４月１８日に受託番号６７．９ ２９の下、宿主Ｅ、ｃｏｌｉ　ＤＨ５α内として、寄託されている。］上記のＡ ４７５−ＨＰｇ及びＡ４７５．Ｒ５６１Ｅ−ＨＰｇｃＤＮＡをｐＡＶ６のＢａｍ ＨＩ及びＳｍａＩ部位に挿入し、それぞれｐＡＶＡ４７５Ｐｇ及びｐＡＶＡ４７ ５Ｒ５６１ＥＰｇを調製し、ソレラヲ使用して、以下に記載するようにしてスボ ドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞 の培養培地を感染させた。

転移ベクターによる昆虫細胞の形質転換Ｗｈｉｔｅｆｌｅｅｔ−３ｍｉｔｈら（ 前掲）に記載されているようにして、ｐＡＶＡ４７５Ｐｇ又はｐＡＶＡ４７５Ｒ ５６１ＥＰｇ及び野生型ウイルスＤＮＡの構築物を使用し、培養スポドブテラ・ フルギベルダ細胞を同時トランスフェクトした。転移ベクターのホモローガス（ 同種）なポリへドリンフランキング領域とウィルスとの間の交差により、ＰＨ遺 伝子の代わりにＨＰｇ遺伝子を有する完全長の組換えウィルスが、細胞内では得 られている。

オートグラフ７’カリホルニ力（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ　ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃ ａ）の核ポリへドロシスウィルス（ＡｃＭＮＰＶ）のＡｃＴＲ温度−不活化耐性 株を組換え構築のための宿主ウィルスとして使用した。クローンされた（例えば 、ＭＤ、ロックビル、パークローン・ドライブ１２３０１番に住所を宵するアメ リカン・タイプ・カルチャー・コレクションから受託番号ＡＴＣＣＣＲＬ　ｌ　 ７１１の下に入手可能なＳｆ９細胞）、又はクローンされていないスボドブテラ ・フルギペルダセルラインを使用し、すべてのウィルス成育と増殖のための宿主 細胞を得ることができるＪＶａｕｇｈｎらのＩｎ　Ｖｉｔｒｏ、　１３：２１３ −２１７（１９７７）′Ｊ、昆虫細胞を培養するための操作は、Ｇｉｂｃｏ粉末 化Ｇｒａｃｅ’ｓ　Ａｎｔｅｒａｅａ培地、ヒンクスぐ旧ｎｋ’　ｓ）培地［Ｔ ＮＭ−ＫＨ培地の代わり］、及びペニシリン／ストレプトマイシン／アムホテリ シンＢ抗生物質混合物を３８頁の操作に使用した以外は、３ｕｍｍｅｒｓらのＴ ｅｘａｓ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　ＥｘｐｅｒｉＩｎｅｎｔ　５ｔａｔｉｏ ｎ　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ　Ｎｏ、　１５５５．　（１９８７）、　１０−３１頁及 び３８頁に記載されているものである。

詳細に説明すれば、１０％ウシ胎仔脂汗（Ｆ　Ｂ　Ｓ　）を加えたＲｉｎｋ’　 ｓ培地［Ｈｉｎｋ、　Ｎａｔｕｒｅ　２２６：４６６−４６７（１９７０）且ス ミス（Ｓｍｉｔｈ）らの−ｏｌ、ｃｅＩｌ、　ＢｉｏＬ　、前掲コ中、スボドブ テラ・フルギベルダ細胞（３Ｘ１０’）を６０ｘｍ培養皿に付着させる。２時間 後、その培地を取り出し、ｐＡＶＲ５６１ＥＰｇ転移プラスミドＤＮＡ（Ｉａｇ ）を加えたＡｃＭＮＰＶ由来の野生型ＤＮＡ（０，１μｇ）のＮａＣＱ（０，８ ｇ／の、ＫＣｉ２（０，３７ｇ／＋２）／Ｎａ、Ｈ，ＰＯ，・２　Ｈ，○（０， １２５ｇ／２）、デキストロース（１ｇ／の、及びヘベス［Ｈｅｐｅｓ］　−Ｎ 　ａｏ　Ｈ（５ｇ　ＩＱ＞　［ｐＨ７，２］中の懸濁液０．５ｚＱ内で細胞をイ ンキュベートした。２７℃で一晩インキユベートした後、そのＤＮＡ懸濁液を、 １０％ＦＢＳを加えたＨｉｎｋ’　ｓ培地に移し、その中で５日間インキュベー トした。

スボドプテラ・フルギペルタ細胞はまた、セルグロｒｃｅｌ１ｇｒｏｌ遅速度磁 力撹拌装置［Ｔｈｅｒｍｏｌｙｎｅ　Ｃｏｒｐ、、　アイオワ、ブブーク］のコ ーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ）　［ニューヨーク、ニューヨーク］遅速度撹拌用容 器を使用することによっても培養することかできる。１ｏｏＯ＋ｙ（容量撹拌用 容器それぞれに不完全脂ｎｋ’　ｓ培地（上記のように８．３％ＦＢＳ及びベニ ンジン／ストレプトマイシン／アムホテｌ）ンンＢ混合物を添加）３００ｆｆＣ を加える。次いで、その容器を５Ｘ１０”個細胞と共にインキュベートし、ＢＯ ｒｐｍで撹拌する。密度か２−３×１０６細胞／ＩＱになったなら、細胞懸濁液 １５０−２５０ｘ（！を取り出し、それを新たな培地と置き換えることで、細胞 を継代培養した。懸濁−発育細胞はフラスコに接着しているため、それは単層を 必要とする操作に使用することができる。

細胞はさらに、Ｊ　Ｒ，Ｓ　ｃｉｅｎｔｉｆｉｃＥカワホルニア、ウッドラント コから製造されている、規格化低タンパク質培地ＥＸ−ＣＥＬＬ４００中ででも 発育させることができる。この培地は細胞を単層で培養するため、スピナーフラ スコ懸濁培養に、又はエアリフトバイオリアクター「例えばＭａｉｒｏｒｅｌ　 ＩａらのＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、　ｊｊ：１４０６−１４１ｆｌ（１９８ ８）］に完全Ｈｉｎｋ’　ｓ培地の代わりとして使用することができる。

発育させた後、組換えタンパク質Ａ４７５−ＨＰｇ及びＡ４７５゜Ｒ５６１Ｅ− ＨＰｇを、上記のＣＨＯ−発現プラスミノーゲンについて説明しているアフィニ ティークロマトグラフィーによって精製した。

実施例４ Ｐｏｒｔｏｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ気相配列決定装置により、実施例２及び ３に従って調製したプラスミノ−ケン及びその変異体をアミノ末端アミノ酸配列 分析する前に、そのタンパク質をペプチド支持ディスクに吸着させた。スペクト ラ・フィケンクスＨＰＬＣシステムを使用するベックマン逆相ＯＤＳカラム（５ μ、４．６ｔｉｘ２５０ｉπ）により、ＰＴＨアミノ酸を分離した。このシステ ムは８８００型３組ＨＰＬＣポンプ、８４８０型ＵＶ／Ｖｉｓ検出器、４２７０ 型記録積分器、及びＨＰＬＣカラムへの試料のオンライン注入のためのＰ　Ｉ　 ２０３０インターフエイスから構成されている。以下の直線グランエンド条件下 、５５°Ｃで２０ＰＴＨアミノ酸の光学分割を行った：出発溶液として８８％溶 液Ａ（氷酢酸１π１２／テトラヒドロフラン２０ｍＱ／トリエチルアミンｏ、０ ５ｍ（１／水５００ｙ、Ｑまで、３ＮＮａＯＨてｐＨ４，１０に調節）／１２％ 溶液Ｂ（アセトニトリル中、１％テトラヒドロフラン）から、６０％溶液Ａ／１ ２％溶液Ｂ［限界溶液］までを２４．５分かけて、流速１　ｚ（１／分で行う。

次いで、溶液Ｂにより同じ流速でさらに５．５分続けると、その間に最後の４つ のＰＴＨ−アミノ酸が溶出された。

２、ウェスターンプロット分析 実施例２及び３のタンパク質試料を、非還元条件下の１０％（Ｗ／Ｖ）ポリアク リルアミドゲルのＳ　Ｄ　Ｓ　／　Ｐ　Ａ　Ｇ　Ｅ　［ＬａｅｍｗｌｉのＮａｔ ｕｒｅ　２２７：６８０−６８５（１９７０）］により分離した。分離したタン パク質バンドを確立された操作［ＢｕｒｎｅｔｔｅのＡｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅ ｍ、　、　１１２：１９５−２０３（１９８１）］に従ってイムモビロンーＰ　 （Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ）　［Ｍｉｌｌ　１ｐｏｒｅ、　ＭＡ、ベッドフォー ド］膜に移し、次いでＴＢＳ［０，０５Ｍ　トリス塩酸、０．１５ＭＮａＣＱ、 ｐＨ７，４、ブロッキング緩衝液］中、１％（ｗ／ｖ）ゲラチン［Ｂｉ。

−Ｒａｄ　Ｅ［Ａ級っで１時間３７°Ｃでインキュベートした。この移行の際の 正確な条件は、２５１１１Ｍトリス−ＨＣＱ／２００ｆｆ１Ｍグリシン／１５％ （ｖ／ｖ）メタノール、ｐＨ８，３中、４°Ｃｌ２Ｏポルト、１２時間であった 。この溶液を、４μｇ／ｍＱ、モノクローナル不ズミ抗−ＨＰｇ１４ｈｉｔｅｆ ｌｅｅｔ−Ｓｍｉｔｈら、前掲］をブロッキング緩衝液中に含有する別の溶液と 置き換え、次いで室温で２時間混合下にインキュベートした。ＴＢＳ中、０，０ ５％（ｖ／ｖ）　Ｔ　ｗｅｅｎ　２０を室温で３回交換することにより、得られ たフィルターを１５分かけて洗浄した。次いて、そのフィルターをウサギ抗−マ ウスＩｇＧ−アルカリホスファターゼ会合体［ングマ〕と共に混合しながら、室 温でブロンキング緩衝液中、２時間インキュベートし、次いて上記のように洗浄 した。基質溶液［水ＩＩＩＩρ中、ニトロブルーテトラゾリウム１６．５ｍｇ／ ７０％（Ｖ／ｖ）水性ＤＭＦ０．５ｘｆｆ／リン酸ブロモクｏｏインドリル８． 　５ｘｇ。

これを０．１Ｍ　トリス−ＨＣＱｌｏ、ＬＭ　ＮａＣｌ２１０．００５ＭＭｇＣ ｌ２ｔ　（ｐＨ９，５）　５０ｗＱ　！＝加える。］と共に室温でインキュベー トした後、陽性のバンドを室温で視覚化した。

１００ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ−ＮａＯＨ／１０ｍＭ　ＥＡＣＡＳｐＨ７，４を含有す る緩衝液０，２ｒｔｔＱを温度２５°Ｃに維持させた分光光度計キュベツトに入 れた。次いで、所望の濃度の発色基質：Ｈ−Ｄ−Ｖａｌ−Ｌ−ｏイシンーＬ−Ｌ ｙｓ−ｐＮＡ［５２２５１、Ｈｅ１ｅｎａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ’、ＴＸ 、バーモント］を加え、次いて所要の水を加える。所望の前形成させた化学量論 的ＳＫ−ＨＰｇ又はＳ　Ｋ−ＨＰｍ複合体（終濃度：６−６−１Ｏｎを加え、こ の基質を加水分解した。５２２５１の加水分解の速度を４０５ｎｍにおいて２− ５分間連続的に記録した。

既述（Ｕｒａｎｏら、前掲）のようにして吸光度を初期活性化速度に変換し、そ の速度データを通常のＬ　１ｎｅｔｖｅａｖｅｒ−Ｂ　ｕｒｋプロットに従って 分析した。化学量論的量のストレプトキナーゼ（Ｓ　Ｋ）［Ｃａ５ｔｅｌｌｉｎ 。

らのＭｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　４５　：　２４４−２５７　（１９ ７８）に記載されている方法に従って調製］、及び実施例２及び３に記載の望ま しいプラスミノーゲンを２５℃でインキュベートすることにより、酵素複合体を 形成させた。

１００ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ−ＮａＯＨ／１０ｍＭ　ＥＡＣＡ、ｐＨ７，４を含有す る緩衝液０．２１を温度２５°Ｃに維持させた分光光度計キュベツトに入れた。

次いで、５２２５１（終濃度：　０．　５ｍＭ）０．　０８ＲＱを加えた後、所 要の水、種々の濃度のウシプラスミノーゲン（Ｂｐｇ、組換えＰｇｓを精製する ために用いた方法と同じ方法により新鮮なウシ血漿から精製）、及び最後に、既 述のようにして調製したＳＫ−ＨＰｇ又はＳＰＣ−ＨＰｍアクチベーター複合体 （終濃度・０゜２ｎＭ）を加えた。生成されるウシプラスミンによる５２２５１ の加水分解によって生じるｐ−ニトロアニリドの放出を記録することにより、Ｂ Ｐｇの活性化の速度を連続検定ＣＵｒａｎｏら、前掲コによりモニターした。得 られたデータをこのタイプの先の試験にて説明しているようにＬｉｎｅｗｅａｖ ｅｒ−Ｂｕｒｋプロットによって分析した［Ｕｒａｎｏら、前掲」。これらの条 件下では、ＢＰｇはＳＫ単独では活性化されなかった。

５、ＨＰｇの脱グリコリル化 所望のＨＰｇ調製物（１０ｍＭ　リン酸ナトリウム（ｐＨ７，４）中）を酵素濃 度０．　４単位／μｇ（ＨＰｇ）のグリコペプチダーゼＦ［ベーリンガー・マン ハイム、ＩＮ、　インディアナポリス］で処理した。この反応を３７°Ｃで２４ 時時間待させた。調査したすべての試料から、これらの条件がＡ　ｓｎ”’連結 −炭水化物を除去するのに適当であることが見いだされた。次いで、この混合物 を分子量１０，０００排除（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ　１０）微小濃縮チューブ［Ａ ｍ１ｃｏｎ、　ＭＡ、ダンパー刈の遠心にかけ、タンパク質試料からＪ離したオ リゴサツカライドを分離した。

Ｂ、結果 野生型Ａ４７５［Ｇ１ｕ’コＰｇ　ｃＤＮＡ（ｗｔ−ｉｒＨＰｇを与える。Ｔｈ １ｔｅｆ　ｆｅｅｔ−８ｏ＋ｉｔｈら、前掲）及び、タンパク質中にＲ５８１Ｅ 突然変異を含有する野生型Ａ４７５ＨＰｇ（Ｒ５６１Ｅ−ＨＰｇ）のｃＤＮＡを 含有する組換えバ牛ユ口ウイルスで昆虫細胞を感染させ、２つの組換えヒトプラ スミノーゲンを入手した。Ｒ５６１Ｓ突然変異を含有する野生型（Ａ　４７５配 列）を有する別の組換えタンパク質をＣＨ○細胞で産生させた（Ｒ５６１Ｓ−Ｈ Ｐｇ）。これらの電気泳動の動きにより、これらすべての組換えタンパク質は高 度に精製されており、ヒｌ−［Ｇ　ｌｕ’］　Ｐ　ｇに関連する分子量特性を有 していることが証明された。以下の説明では、便宜的にＡ４７５突然変異には言 及していないが、以下で引用する組換え的に生産したＨＰｇタンパク質にはすへ てこの突然変異が存在している。

報告したすべてのプラスミノーゲンのアミノ末端アミノ酸配列分析は配列　ＮＨ ！−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａｓｐを示しており、これはすべてのも のがシグナルポリペプチドの開裂に際して正しくプロセッシングされることを示 唆し、また精製組換えタンパク質とヒト血漿ＨＰｇとの開の小さな動きの差異は 、血漿−１昆虫細胞−及びＣＨＯ細胞−誘導化プラスミノーゲン間のグリコジル 化の差異に由来する若干の分子量変動を反映しているのかもしれないことも示唆 している。

組換え野生型及び変異型プラスミン（ノーケン）とＳＫとの化学量論的複合体の 定常状態アミド分解活性を以下の第１表に示し、ＳＫとヒト血漿誘導化プラスミ ン（ノーケン）との化学量論的複合体（即ち、組換えＰｇと同様に精製した天然 ヒト血漿［Ｇ　Ｉｕ’ｌ　Ｐ　ｇのアフィニティークロマトグラフィー１型）の それとを比較した。複合体それぞれの充分なアミド分解活性は１−５分で展開さ れ、５分のインキュベート時間を使用し、この試験に使用する酵素を生成させた 。

ＳＫ−ＨＰｍ”　０．３５±０．０５　３１２±１６　８９１３に−ｗｔ−ｉｒ ■Ｐｍ　０．３３±０．０４　３１２土１２　９４５ＳＫ−Ｒ５８ＬＥ−ＨＰｇ 　Ｏ，１７±０．０５　２７２±１８　１６００ＳＫ−Ｒ５６１Ｓ−ＦＩＰｇ　 ０．２８±０．０６　３６８±２０　１３１４ＳＫ−Ｒ５８１Ｓ−ＨＰｇ△ＣＨ Ｏ”　０．５０±［１，０６３７７±１８　７３４ａ）ヒト血漿プラスミン ｂ）Ａｓｎ２ａ８が脱グリコジル化されたＨＰｇ変異体ｗｔ−ｉｒＨＰ　ｇ及び ヒト血漿ＨＰｇの場合、５分のインキュベート時間の複合体をＳＤＳ／ＰＡＧＥ 分析すると、期待されたとおりこれらはＳＫと［Ｌｙｓ’すＨＰｌｌとから構成 されていることが明らかに示された［Ｂａｊａｊ及びＣａ５ｔｅｌｌｉｎｏのＪ 、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　、　２５２：４９２−４９８（１９７７）コ。

活性−開裂部位−変異型プラスミノーゲンについては、突然変異の性質から複合 体内でのＨＰｇからＨＰｍへの変換が排除されるので、ＳＫ及び相当するＨＰｇ から構成される複合体も期待された。

第１表のデータは、ヒト血漿ＨＰｍ又はｔｖｔ−ｉｒＨＰ　ｍのいずれがを含有 するＳＫ−Ｆ（Ｐｍ複合体は５２２５１に対して実際上同一の定常状態動力学定 数（ｋｉｎｅｔｉｃ　ｃｏｎｓｔａｎｔｓ）を有していることを示している。同 様に、ＳＫと２つの変異型ＨＰｇ、ｌ製物、即ちＲ５６１Ｅ−ＨＰｇ及びＲ５６ １Ｓ−１イＰｇとの化学量論的複合体にはアミド分解活性が存在している。これ ら２つのＳＫ−ＨＰｇ１合体の動力学定数の値と前者のＳＫ−ＨＰｍｎ１合体の それとを比較すると、種々のＳＫ−ＨＰｇ及びＳＫ−）（Ｐｍ複合体のアミド分 解定常状態特性には若干の相違しかないことが判明した。

ヒト血漿ＨＰｍ又は昆虫発現ＨＰｍのいずれがとの等モルＳＫ複合体は殆ど同一 であり、このことは昆虫細胞がヒト血漿のものと同等のタンパク質を産生ずるこ とを示している。開裂部位耐性の変異型ｉｒＨＰｇとのＳＫＩ合体のに＋ｅは、 いずれがのプラスミンとのその同じ複合体の値よりも若干低く、これは５Ｋ−Ｈ ＰＪＪ合体と比較してＳＫ−ＨＰｇ複合体に動力学的な相違があり得ることを示 している。

ＨＰｇのＡｓｎ”９一連結炭水化物が定常状態のアミド分解動力学定数に認めら れる小さな差異に役割を果しているか否がを決定するため、Ｒ５６１Ｓ−ＨＰｇ （ＣＨＯ細胞由来）をグリコベプチターセＦで脱グ１ノフンル化した。ＳＫとこ の型のＨＰｇとの化学量論的複合体はそのグリコジル化体よりも若干高いＫｍ値 しが示さず、このことはＡｓｎ２８”の炭水化物の存在は少なくともＣＨＯ細胞 発現物質に存在する型については、５Ｋ−Ｒ５６１Ｓ−ＨＰｇ複合体のこの動力 学的性質に大きな役割を果すものでないことを示唆している。

以下の第２表は、種・々のブレ形成化学量論的ＳＫ−ＨＰｇ及びＳＫ−ＨＰｍ複 合体がプラスミノーゲンのアクチベーターとして機能する個々の能力を触媒レベ ルで表す定常状態動力学的パラメーターを示すものである。ＢＰｇはＳＫ単独に よる活性化に対して感受性でないため、それをブラスミ／−ケンの供給源として 選択した。

第２表 ＳＫ−ＨＰｇ”　１．７２　＋　０．０６　１．７９　＋　０．０７　１．０４ ＳＫ−４１Ｐｍ”　７．　（ｔｏ±１．ｆ４　Ｑ、６１１，０９　０．１１！Ｉ ＳＫ−ｗｔ−ｉｒＨＰｇｃｌｏ、　９８±０．１２　４．１４±０．５２　４． ２２ＳＫ−ｗｔ−ｉｒｌ（Ｐｍ”　９．８０±１．０６　２．２Ｂ±Ｑ、２３　 ０．３２ＳＫ−Ｒ５６１Ｅ−ＨＰｇ　０．７２±０．０７　７．００±０．８４ 　９．７２ＳＫ−Ｒ５６１Ｓ−ｔ（Ｐｇ　０．９ｇ±０．１０　３．５４±０． ３６　３．６１ＳＫ−Ｒ５６１Ｓ−Ｆ！ＰｇΔＣＩＯ”　０．４９±０．１１　 ８．５２±１．００　１７．４ａ）ヒト血漿プラスミノーゲン。この複合体は、 ＳＫ及びＨＰｇを３０秒間ブレインキュベートして形成させた。この時点で複合 体中に残っている最初のＨＰｇに対する相対パーセンテイジは約８０％であった 。約２０％がこの複合体中にＨＰｍとして存在していた。

ｂ）ヒト血漿プラスミン。この複合体は、ＳＫ及びＨＰｇを３分間ブレインキュ ベートして形成させた。ＳＫとの複合体中におけるＨＰｍの相対パーセンティジ は１００％であった。

Ｃ）昆虫細胞発現させた野生型ヒトプラスミノーゲン。この複合体は、ＳＫ及び ｗｔ−ｉｒＨＰｇを３０秒間ブレインキュベートして形成させた。この時点て複 合体中に残ってい４最初のＨＰｇに対する相対バーセンテイジは約８０％であっ た。約２０％がこの複合体中にＨＰｍとして存在していた。

ｄ）昆虫細胞発現させた野生型ヒトプラスミン。この複合体は、ＳＫ及びｗｔ− ｉｒＨＰｇを３分間ブレインキュベートして形成させた。ＳＫとの複合体中にお けるＨＰｍの相対バーセンテイシは約１００％であった。

ｅ）　Ａ、ｓｎ”’が脱グリコジル化されたＲ５６１Ｓ−ＨＰｇとＳＫとの化学 量論的複合体。

Ｓ　Ｋ　−［Ｌ　ｙｓ７８］　Ｐ　ｍ（血漿ＨＰｇを用いて生成）複合体（３分 のブレインキュベート時間、第２表）の動力学的性質を比較すると、昆虫発現Ｈ Ｐｍを含有する複合体は、主として活性化のｋ　ｃａｔの相違により、ヒト血漿 ＨＰｍを含有するものよりも相当に活性が高いことが示された。さらに、５Ｋ− Ｒ５６１Ｅ−ＨＰｇ複合体についてのプラスミノーゲン活性化のための二次元特 異性定数は、Ｋｍが減少しかつｋ　ｃａｔ値が増大していることから、ＳＫ−ｗ ｔ〜ｉｒＨＰｍのその値よりも約３０倍高かった。

ＳＫ−ｉｒＨＰｍ複合体（３分のブレインキュベート時間）及び５Ｋ−Ｒ５６１ Ｅ−ＨＰｇ複合体を用いて得られた上記のデータの比較及びこれらのデータから 、ＨＰ、を含有する複合体はＨＰｍを含有する同じ複合体よりもプラスミノーケ ンアクチベーターとして相当に有効であるように思われる。さらに、得られた複 合体におけるＢＰｇの活性化能に対する、化学量論レベルのＳＫと血漿［Ｇ１ｕ ’］Ｐｇ及びｗｔ−ｉｒＨＰ　ｇとの各ブレインキュベート時間の効果を分析す ることにより、上記のことを示す証拠が得られる。

ブレインキュベートの初期には（５３０秒）、ＳＤＳ／ＰＡＧＥは、複合体か各 プラスミノーゲンについて約８０％のＨＰｇ、及び２０％のＨＰｍを依然として 含有していることを示した。１分後及びそれ以後では、複合体中のすべてのＨＰ ｇがＨＰｍに変換していた。Ｂｐｇ活性化の活性レベルは、〉１分ブレインキュ ベートした試料におけるよりも、３０秒の試料中におけるほうが相当に高く、こ のことはＳＫ−ＨＰｇ複合体のほうがＳＫ−ＨＰｍ複合体よりもＢＰｇの活性化 に有用であることを強く支持している。

ヒト血漿ＨＰｇ及びｗｔ−ｉｒＨＰｇから短いブレインキュベート時間（３０秒 ）で調製したＳＫ複合体によるＢＰｇの活性化、についての動力学定数を上記の 第２表に示している。第２表のデータから分かるように、Ｋｍ値は、複合体内の すへてのＨＰｇがＨＰｍに変換された相当する試料から得られる値よりも劇的に 減少している（第２表における３０秒及び３分のブレインキュベート時間につい てのデータを比較）。同様の実験をＲ５６１Ｅ−ＨＰｇ及びＲ５６１Ｓ−ＨＰｇ を用いて行った場合、このような初期の活性ピークは認められなかった。複合体 の一時的な一定のアクチベーター活性が認められたに過ぎない。

最後に、哺乳動物細胞から発現させた変異型ＨＰｇ（Ｒ５６１Ｓ　−ＨＰｇ）は ＳＫとの化学世論的複合体として、昆虫発現タンパク質（Ｒ５６１Ｅ−ＨＰｇ） に類似しているが同一でない、ＢＰｇ活性化に対する定常状態動力学的値を宵し ていた。後者のタンパク質を含有する酵素複合体のｋ　ｃａｔは、前者のＨＰｇ から形成される複合体のそれよりも約２倍高かった。変異型組換えＨＰｇｌ製物 のグリコジル化の差異は、これらの同じプラスミノ−ケンを含有するＳＫ複合体 のブラスミノーケンアクチベーター活性に一役割を果し得ることが、第２表のデ ータから読み取ることができる。従って、Ｓ　Ｋ−Ｒ５６ＩＥ−ＨＰｇ複合体に よるＢＰｇの活性化のｋ　ｃａｔは、グリコペプチダーゼピー説グリコシル化Ｒ ５６１Ｓ−ＨＰｇから調製した同し：１．６体の相当する値よりも２．４倍低く 、またＫｍ値は約２倍高い。これらの相違は同じ複合体のアミド分解活性の分析 では明らかにされなかった（第１表）。従って、ＣＨ○発現した変異型Ｆ（Ｐｇ の脱グリコジル化体ばＳＫとの等モル複合体として、形成される複合体をより効 果的なりＰｇのアクチベーターにすることができる。

すべての動力学的検定には緩衝液成分としてＥＡＣＡを含有させていることに留 意すべきである。この物質を存在させることで、最大の活性化速度を得、さらに 本明細書で試験するいずれかのプラスミノーゲンとの検定混合物中における［Ｇ ｌｕ’］Ｐｇ及び［Ｌｙｓ７８］Ｐｇの量の相違に起因して活性化速度に差異が 生じ得るおそれを排除した。

結論として、ＨＰｇのＳＫ複合体内での安定化により、その複合体のプラスミノ ーゲン活性化能が極めて増大されることが示された。

さらに、プラスミノーゲンの安定型が哺乳動物細胞において発現されたので、そ れによりストレプトキナーゼと複合体化した時に安定であるプラスミノーゲンを 効率的に調製することができる。また、このような発現では、ＨＩ　ＶＳＨＴＬ Ｖ−１，非Ａ、非Ｂ型肝炎ウィルスなとの肝炎ウィルスのような有害なヒトウィ ルスを含有するおそれのあるヒト血漿をプラスミノーゲンの供給源として使用す る必要かない。

実施例５ フィブリン溶解酵素とプラスミノーゲンとから形成される複合体は、血栓溶解薬 として使用することができる。フィブリン溶解酵素の触媒部位は、特定の条件下 での加水分解により除去し得る基によってブロックすることができる。スミス［ Ｓｍ１ｔｈ］らの米国特許第４．８０８゜４０５号（前掲）及びＳ＋ｉｔｈらの Ｎａｔｕｒｅ岨倶５０５−５０８（１９８１）。従って、本発明のＲ５６１Ｅ− ＨＰｇ又はＲ５６１Ｓ−ＨＰｇは単独で、又はフィブリン溶解酵素との複合体と して、アシル化フィブリン溶解酵素との複合体として、アンル化プロ酵素として 、又はフィブリン溶解酵素もしくはアシル化フィブリン溶解酵素との複合体中の アンル化プロ酵素として、血栓溶解薬に使用することができる。本発明のアシ層 化ストレプトキナーゼ／アシル化プラスミノーゲン複合体は以下のようにして調 製することができる： ストレプトキナーゼ（約４５１ｚｇ、スウェーデン、ストックホルムのＡＢＫａ ｂｉから入手）をリジン／マンニトール緩衝液（約１１０１のｐＨ７，０及び滅 菌グリセリン（約６０ｍのと混合し、４°Ｃで５分間撹拌すればよい。滅菌濾過 したｐ−アミジノ−フェニル−ｐ′−アニセートのＤＭＳ○溶液（約１５だＱ、 約２０ｍＭ）を２分かけて加え、得られた混合物を４℃で５分間撹拌すればよい 。本発明のＲ５６１Ｅ−ＨＰｇ又はＲ５６１Ｓ−ＨＰｇ（約８０９Ｒｇ）を２分 かけて加え、得られた混合物を４°Ｃで６０分間撹拌する。

本発明の医薬組成物は次のようにして調製することができる・ヒト血清アルブミ ン（臨床用級ＸＩ　８．９ｖｉ２２０％Ｗ／Ｖ）を上記の混合物に加え、４°Ｃ で２分間撹拌する。リジン／マンニトール緩衝液を加え、その容量を約４００ｖ ｔＱとする。次いで、その液体を１８℃で約２５時間透析濾過（ｄｉａｆｉｌｔ ｅｒ）　Ｌ、透析濾過液約２４００ｍＱを採取する。次に、液体を０．２２μの 滅菌フィルターて濾過し、滅菌貯蔵器に移し、その一部を滅菌した凍結乾燥用バ イアル中に分散させ、次いて凍結乾燥すればよい。

材料の寄託 以下の株はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション［アメリカ合衆国Ｍ Ｄ、ロックビル１　バークローン・ドライブ１２３０１番ｍ（ＡＴＣＣ）に寄託 されている。

株　ＡＴＣＣ受託番号　寄託臼 ２！１４／ｐｓＶ１８８５　６．！１．１５１　１９８９年１０月２５日この寄 託物は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の規定 （ブダペスト条約）のちとに為されている。これによると、寄託の日から３０年 間にわたり生存培養物の維持が保証される。これら微生物は、ブダペスト条約の 条項のもとで、及びジェネンテク、インコーポレイテッドとＡＴＣＣとの間の契 約の条件のもとてＡＴＣＣから入手可能となるであろう。即ち、関連の米国特許 が発行されたとき、又は米国もしくは外国特許出願のいずれかが公開されたとき のどちらか早いときに公衆への培養物子孫の永久的かつ非制限の入手可能性か保 証されており、また、３５　ＵＳＣ！１１２２及びそれに則る長官の規則（８８ ６０Ｇ　６３８への具体的な言及を有する３７　ＣＦＲｇｉ、ｔ４を含む）に従 って米国特許商標局長官によって決定された者への該子孫の入手可能性が保証さ れている。

本出願の譲受人は、寄託微生物が適当な条件下で培養したときに死ぬか、失われ るか、又は破壊されたときには、通知後速やかに同培養物の生存試料と交換する ことに同意している。寄託された微生物の入手可能性は、特許法に従っていずれ かの政府機関の権限のもとに認可された権利に反して本発明を実施するライセン スであると解すべきてはない。

上に記述した明細書は、当業者が本発明を実施することを可能ならしめるに十分 であると考えられる。本発明は寄託された培養物によってその範囲が限定される ものではない。これは、寄託された具体例が本発明のある種の態様の具体的な例 示を意図するものであるためであり、また、機能的に等価なあらゆる培養物が本 発明の範囲内にあるためである。本発明における原料の寄Ｊモは、本明細書に含 まれる記述が本発明のあらゆる態様（最良を態様を含む）の実施を可能ならしめ るに不十分であるということを認めるものではなく、また、それによって示され る特定の例に特許請求の範囲を限定するものでもない。実際には、本明細書に示 し、かつ記述したものに加えて本発明の各種の修飾が上の記述から当業者には明 らかとなり、そしてそれらは添付した請求の範囲内に含まれるであろう。

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。　い　。４　ご８ 国際調査報告 １ｍ−１ｍ１ｍ＋ｌ　ｋｍｍｋｃｍ−喝６Ｎｏ　ｐ（Ｔ／υＳ　９０１０６３４ ５１ＭｍｌＪｍＭｌ　ａｍ−ｔｏＩＩＩｓｍ、ＰＣＴ／ｌ＋’；　ｇＯ）０６１ ４５国際調査報告

Claims (42)

【特許請求の範囲】
1. １．２本鎖型へのタンパク質分解的開裂に対して耐性であるプラスミノーゲンを コードする核酸配列。
2. ２．プラスミノーゲンがヒトプラスノーゲンである請求項１に記載の配列。
3. ３．プラスミノーゲンが、天然配列のプラスミノーゲンにおける５６１位のアル ギニン残基が別のアミノ酸に置換されている変異体である請求項２に記載の配列 。
4. ４．アルギニン残基がリジン以外のアミノ酸に改変されている請求項３に記載の 配列。
5. ５．変異体がＲ５６１Ｅ−ＨＰｇ、Ｒ５６１Ｇ−ＨＰｇ、又はＲ５６１Ｓ−ＨＰ ｇである請求項４に記載の配列。
6. ６．プラスミノーゲン暗号配列と作動可能に結合したプロモーターを含有する請 求項１に記載の配列。
7. ７．プラスミノーゲン暗号配列と作動可能に結合したシグナル配列をさらに含有 する請求項６に記載の配列。
8. ８．シグナル配列が哺乳動物宿主細胞に認識されるものである請求項７に記載の 配列。
9. ９．プラスミノーゲンがグリコシル化されていない請求項１に記載の配列。
10. １０．制御配列と作動可能に結合している請求項１に記載の核酸配列を含有する 発現ベクター。
11. １１．Ｒ５６１Ｅ−ＨＰｇをコードする請求項１０に記載のベクター。
12. １２．請求項１０に記載のベクターを含有する宿主細胞。
13. １３．真核生物細胞である請求項１２に記載の宿主細胞。
14. １４．哺乳動物細胞である請求項１３に記載の宿主細胞。
15. １５．原核生物細胞である請求項１２に記載の宿主細胞。
16. １６．２本鎖型へのタンパク質分解的開裂に対して耐性であるプラスミノーゲン 。
17. １７．１本鎖プラスミノーゲン変異体である請求項１６に記載のプラスミノーゲ ン。
18. １８．２本鎖開裂部位が突然変異している請求項１７に記載のプラスミノーゲン 。
19. １９．天然配列プラスミノーゲンの５６１位アルギニンが他のアミノ酸に置き換 わっているヒトプラスミノーゲンである請求項１８に記載のプラスミノーゲン。
20. ２０．アルギニンとの置換に使用されるアミノ酸がリジンでない請求項１９に記 載のプラスミノーゲン。
21. ２１．Ｒ５６１Ｅ、Ｒ５６１Ｓ、又はＲ５６１Ｇである請求項２０に記載のプラ スミノーゲン。
22. ２２．請求項１６に記載のプラスミノーゲンの有効量及び製薬的に許容され得る 担体を含有してなる、血栓溶解に有効な医薬組成物。
23. ２３．フィブリン溶解酵素をさらに含有する請求項２２に記載の組成物。
24. ２４．フィプリン溶解酵素の活性部位がアシル化されている請求項２３に記載の 組成物。
25. ２５．フィプリン溶解酵素がプラスミノーゲンと複合体化している請求項２３に 記載の組成物。
26. ２６．フィブリン溶解酵素がストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、組織プラスミ ノーゲンアクチベーター、又はそれらの組合わせ物である請求項２４に記載の組 成物。
27. ２７．複合体がｐ−アニソイルストレプトキナーゼ／プラスミノーゲン複合体で あって、内部ペプチド結合開裂を伴わないものである請求項２６に記載の組成物 。
28. ２８．等張性である請求項２２に記載の組成物。
29. ２９．滅菌濾過している請求項２２に記載の組成物。
30. ３０．血栓溶解治療を必要としている哺乳動物に請求項２２に記載の組成物の有 効量を投与することを特徴とする血栓溶解療法。
31. ３１．血栓溶解治療を必要としている哺乳動物に請求項２６に記載の組成物の有 効量を投与することを特徴とする血栓溶解療法。
32. ３２．組成物がｐ−アニソイルストレプトキナーゼ／プラスミノーゲン複合体で あって、内部ペプチド結合開裂を伴わないものを含有している請求項３１に記載 の血栓溶解療法。
33. ３３．哺乳動物がヒトである請求項３０に記載の血栓溶解療法。
34. ３４．加水分解により除去し得る基によってブロックされているフィプリン溶解 活性に必須の触媒部位を有する、フィプリン溶解酵素及びプラスミノーゲンから なる２元複合体の調製方法であって、式：Ａ−Ｂ又はＥ−Ｆ で示される過剰量のブロッキング剤 ［式中、Ａはフィプリン溶解活性にとって必須の触媒部位に選択的であり、かつ 基：Ｂからその触媒部位に転移することのできる加水分解に不安定なブロッキン グ基であり、ＢはＡを酵素に結合させることのできる基であり、Ｅはブロッキン グ剤を触媒部位に局在化させる局在化基であり、Ｆはその局在化基から触媒部位 に転移することのできる加水分解的に不安定なブロッキング基である］ の存在下に、フィプリン溶解酵素を請求項１６に記載のプラスミノーゲンと混合 することを特徴とする方法。
35. ３５．２元複合体を単離する工程をさらに包含する請求項３４に記載の方法。
36. ３６．プラスミノーゲンが、天然配列プラスミノーゲンの５６１位のアルギニン 残基を別のアミノ酸と置き換えたヒトプラスミノーゲンであり、フィプリン溶解 酵素がストレプトキナーゼである請求項３４に記載の方法。
37. ３７．プラスミノーゲンがＲ５６１Ｅ−ＨＰｇ、Ｒ５６１Ｓ−ＨＰｇ、又はＲ５ ６１Ｇ−ＨＰｇである請求項３６に記載の方法。
38. ３８．加水分解に不安定なブロッキング基がアシル基である請求項３４に記載の 方法。
39. ３９．アシル基がベンジル、置換ベンゾイル、アクリロイル、又は置換アクリロ イル基である請求項３８に記載の方法。
40. ４０．Ａ−Ｂがｐ−ニトロフェニル−ｐ′−グアニジノベンゾエートである請求 項３８に記載の方法。
41. ４１．Ｅがｐ−アミジノフェニル又はｐ−アセトアミドフェニル基である請求項 ３８に記載の方法。
42. ４２．Ｆがベンゾイル又はアクリロイル基である請求項３８に記載の方法。