JPS62179390A - ヒト組織プラスミノ−ゲン活性化因子遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（以下
ＴＰＡと略す）をコードする染色体ＤＮＡ配列、該ＤＮ
Ａ配列と動物細胞内で機能するプロモーター領域のＤＮ
Ａ配列とを連結したＤＮＡ配列、及び該ＤＮＡ配列を有
するＤＮＡで形質転換されＴＰＡを産生ずるようになっ
た細胞、更にその細胞を利用したＴＰＡの製造法に係る
。

プラスミノーゲン活性化因子は、血液中に存在するプラ
スミノーゲンをフィブリン溶解活性を有するプラスミン
に変換する作用を有し、種々の血栓症の治療薬として用
いられている。

（従来の技術） 現在プラスミノーゲン活性化因子として、主に人尿から
調製されるウロキナーゼ及び連鎖球菌から得られるスト
レプトキナーゼが用いられている。

しかしながら、人尿からのウロキナーゼの生産は、原料
の品質の不安定性や健康人の尿の大量確保の困難さなど
の欠点を有している。又、ストレプトキナーゼは細菌由
来の蛋白であり、ヒトへの項四投与は免疫学的な危険性
と効果の減少を伴うと推定され、実際連鎖球菌の既感染
者にはストレプトキナーゼに対する抗体を有している者
がおり、結果的に効果の減少が観察されている。ウロキ
ナーゼと抗原性を異にするＴＰＡがヒト黒色腫、筋腫、
咽頭腫、神経芽腫、その他の組織由来の培養細胞から分
泌される事が見い出された［Ａ、　Ｇｒａｎｅｌ　１１
−ＰｉｐｅｒｎｏとＥ、Ａ、几ｅｉｃｈ（１９７８年）
　ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディスン
（Ｊ、Ｅｘｐ、八（ｅｄ、）、１４８巻、　２２３Ｎ　
；　Ｗ、Ｓ。

Ｔｕｃｋｅｒら（１９７８年）キャンサー・リサーチ。

３８巻、２９７頁；　Ｄ、　Ｖｅｔｔｃｒｌａｉｎら（
１９７９年）ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミ
ストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　）、　２５
４巻、５７５頁；Ｅ　、　Ｌ　、　Ｗｉ　１ｓｏｎら（
１９８０年）キャンサー・リサーチ、４０巻、９３８頁
〕。

ＴＩ’Ａの８ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に
よる推定分子量は約７０，０００であり、ウロキナーゼ
型プラスミノーゲン活性化因子に比べ大きい。ＴＰＡは
血液中にも見い出され、ウロキナーゼに比ベフィブリン
親和性が強く、又その活性はフィブリンによって増強さ
れるなどの理由から、治療薬としてウロキナーゼより優
れていると考えられている。またプラスミノーゲン活性
化因子投与後の出血傾向などの副作用が少ないとも考え
られている。

ＴＰＡの製造法として、本因子を生産する細胞株を培養
し、培養液から精製する方法がある〔Ｄ。

Ｃ０几１ｊｋｅｎとり、　０ｏｌｌｅｎ　（１９８１年
）ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー。

２５６巻、７０８５頁〕。この方法は、生産細胞のＴＩ
’Ａ生産能に大きく依存し、人世生産が困難である。Ｔ
ＰＡのＣＤＮＡ（相補ＤＮＡ）がクローニングされ、大
腸菌でＴＰＡ様蛋白の生産が可能になった（：　Ｄ、Ｐ
ｅｎｎ１ｃａら（１９８３年）ネイチャー（Ｎａｔｕｒ
ｅ）　、　８０１巻、２１４頁〕。しかし微生物によっ
てつくられるＴＰＡ様蛋白は、微生物の蛋白合成機構が
動物細胞のそれと多少異なる為に、つくられる蛋白のア
ミノ末端が天然のそれと異なる場合が多い。更に微生物
によってつくられるＴＰＡ様蛋白は、天然のＴＰＡが糖
鎖を有しているのに対し、糖鎖を含んでいない。

またＴＩ’ＡのＤＮＡ配列にＳＶ４０の初期プロモータ
ーを接続したＤＮＡ配列とジヒドロ葉酸還元酵素をコー
ドするＤＮＡ配列から成るプラスミドでＣＨＯ（チャイ
ニーズ　ハムスター卵巣）細胞を形質転換し、更にメン
トロキセートを含む培地で遺伝子の増幅した細胞を選択
することによりＴＰＡの生産が試みられた（特開昭５９
−４２３２１）。

しかし、この生産法に用いられたＴＰＡのＤＮＡはｃＤ
ＮＡであった。また、ヒ１−ＴＰＡ染色体ＤＮＡをクロ
ーニングし、マウスの細胞を形質転換し、ＴＰＡ生産細
胞を育種した例がある（Ｂｒｏｖｉｍら（１９８５年）
ジーン（Ｇｅｎｅ）　、　８３巻。

２７９頁）。しかし、その方法はＴ　ｐ　ｈａ伝子のプ
ロモーター活性が低いため形質転換株のＴＩ’Ａ生産能
は制限されたものであった。

（発明が解決しようとする問題点） 高等生物の多くの蛋白は、核ＤＮＡ配列上に、いくつか
に分断されてコードされていることが知られている。成
熟型のメツセンジャーＲＮＡ（ｍ几ＮＡ）　　の配列を
コードしているＤＮＡ配列はエクソン（ｅｘｏｎ）　、
分断している配列は介在配列またはイントロン（ｉｎｔ
ｒｏｎ）と呼ばれている。

正常で機能のある蛋白の発現の為には、イントロンの正
しい泣面でのスプライシングが不可欠であるが、インシ
ュリン遺伝子とシミアンウィルス４０（ＳＶ４０）のプ
ロモーター領域を結合し、ＣＯ８細胞に導入した場合の
異常なスプライシングが報告されている［：　Ｌａｕｂ
　、　Ｏ，ら（１９８３年）ジャーナル・オブ・バイオ
ロジカル・ケミストリー、２５８巻、６０４Ｂ頁〕。ま
たアミラーゼの発現においては、組織特異的なスプライ
シングが存在し、同一の遺伝子から２つの異ったスプラ
・イシングを経て、唾液腺アミラーゼ吉肝臓アミラーゼ
が合成されることが知られている（Ｙｏｕｎｇ、　Ｒ。

Ａ、ら（１９８１年）セル、２３巻、４５１頁〕。

動物培養細胞にイントロンを含むＴＰＡｆｌ伝子を導入
し、ＴＰＡを産生ずるには正常なスプライシングが起こ
る必要があるが、本発明者らは、上記第８エクソンと第
９エクソンの間にＳｍａＩ　　都立が存在しないタイプ
のＴＰＡの染色体ＤＮＡ配列に培養細胞で機能する、す
なわちｍ　ＲＮ　Ａ合成を開始する事が可能なプロモー
ター領域のＤＮＡ配列を結合させ、種々の培養細胞に導
入した場合、正常にスプライシングされＴＰＡが著以分
泌される事を見い出し、本発明に至った。

以下に本発明を更に詳細に説明する。

（問題点を解決する為の手段） （１）ＴＩ’Ａ造伝子のクローニング ＴＩ’Ａのアミノ酸配列をコードしている遺伝子領域は
、遺伝子のクローニングの結果、約１８Ｋｂの長さを持
つことが確認された。またＮｙらはその遺伝子が最低１
４のエクソンと１３のイントロンから構成されている事
を示した〔Ｎｙら（１９８４年〕プロシーディング・オ
ブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス・
ニーニスニー、８１巻、５８５５頁〕。

ＴＰＡをコードする染色体ＤＮＡ配列とは、ＴＰＡの翻
訳開始アミノ酸であるメチオニンのコドンＡＴＧから終
止コドンＴＧＡまでの配列を含むＤＮＡ配列を示す。

ＴＰＡをコードする染色体ＤＮＡは、ヒトＤＮＡからク
ローン化される。ヒトＤＮＡは、例えばヒト白血球細胞
培養細胞或いは組織などを用い、Ｂ１１ｎらの方法（Ｂ
ｌｉｎ、Ｎ、ら（１９７６年）ヌクレイツク・アシッズ
・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　
）　、　　３巻、２８０Ｂ頁〕により調製される。ＴＰ
Ａ遺伝子のクローニングに用いるベクターはＣｈａｒｏ
ｎ　２８に代表されるλフアージベクター、ｐＢ几３２
２に代表されるプラスミドベクター或いはｐＥＩｏ　７
９に代表されるニスミツドなどが利用できる。−例とし
て、λファージをベクターとして用いる遺伝子操作法を
示す。ヒト高分子ＤＮＡを適切な制限酵素で切断後、λ
フアージベクターの置換可能領域の代りに挿入し、リコ
ンビナントファージＤＮＡをつくる。次にインビトロパ
ッケージングの手法を用い、感染性のあるファージ粒子
を作製する。次に宿主大腸菌とともにプレートにまき、
組換え型ファージのプラークを形成させる（：Ｅｎｑｕ
ｉｓｔ、　Ｌら（１９７９年）メソッズ・イン・エンザ
イモロジ−（Ｍｅｔｌ〕ｏｄｓ　ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏ
ｇｙ　）　、　６８巻、２８１頁：　Ｈｏｒｎ　ＴＢ、
（１９７９年）メソツズ・イン・エンザイモロジー、６
８巻、２９９頁〕。ＴＰＡをコードするＤＮＡ断片を持
つ組換え型ファージのプラーりの検出には、ＴＰＡをコ
ードするｃ　ＤＮＡやＴＰＡｉ伝子の一部のＤＮＡ配列
を持つ合成りＮＡをプローブとしたプラークハイブリダ
イゼーションの手法［Ｖｉｂｏ、　８．Ｌ、Ｃ，（１９
７９年）メンツズ・イン・エンザイモロジー、６８巻。

３８９頁；　８ｚｏｓｔａｋ、　Ｊ、Ｗ、ら（１９７９
年）メンツズ・イン・エンザイモロジー、６８巻。

４１９頁〕が利用できる。またＴＰＡの遺伝子を持つ組
換え型ファージは、プラークハイブリダイゼーションに
よって選択されたプラークから回収し宿主大腸菌と共に
培養することにより大全に調製できる。また組換え型フ
ァージのＤＮＡはフェノール法等により調製できる１：
Ｍａｎｉａｔｉｓ　、　Ｔら（１９８２年）　Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒＣｌｏｎｊｌｌｇ　ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ　ｍａｎｕａｌ　、　ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒ
ｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、］。

ＴＰＡａ伝子が複数のＤＮＡ断片にクローニングされた
場合は、それぞれの断片から完全なＴＰＡ遺伝子を再構
成することができる。実際に本発明者らは特願昭６０−
１５２８１０号に詳述した方法により’ｒｐＡａ伝子を
クローニングした。クローン化された遺伝子の塩基配列
はマキサム−ギルバート法［ｋｉａｘａｍ　、　Ａ、　
Ｍ、ら（１９８０年）　　メソツズ・イン・エンザイモ
ロジー、６５巻、４９９頁］、或いはＳａｎｇｅｒのダ
イデオキシ法［Ｓａｎｇｅｒ、　Ｆ、　（１９８１年）
サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　、　２１４巻、１２０
５頁〕等で決定される。またグイデオキシ法の一種であ
るファージＭ１３を用いたＭ１３法［Ｍｅｓｓｉｎｇ。

Ｊ、（１９８ａ年）メンツズ・イン・エンザイモロジー
、１０１巻、２０頁〕等が利用できる。

またクローン化された遺伝子の制限酵素地図の作製は通
常行なわれている方法が用いられる。

本発明者らは、ＴＰＡｉ伝子のクローニング、塩基配列
の決定並びに制限酵素による解析の結果、ＴＰＡ遺伝子
には第８エクソンと第９エクソンの間にＳｍａ　Ｉの認
識部位が存在するタイプと存在しないタイプの２種類が
存在し、ＳｍａＩ部位が存在しないタイプは存在するタ
イプに比べ、このｊ９ｍａ（部位の近傍が約Ｑ、３ｋｂ
　　欠落していることを見出した。

（２）ＴＰＡ発現ベクターの作製 動物培養細胞内で機能する他の遺伝子、すなわちＴＩ’
Ａ遺伝子以外のプロモーター領域の配列をＴＰＡ染色体
ＤＮＡ配列の５′側に接続し、細胞に導入することによ
りＴＰＡの非生産細胞を高生産細胞に形質転換できる。

この場合、ＴＰＡのｍＲＮＡ合成は、接続したプロモー
ター領域の制御下におかれ、たとえば接続したプロモー
ター領域が構成的な蛋白の遺伝子のプロモーター領域で
あれば、細胞内でＴＰＡのｍＲＮＡは常時合成され、従
って細胞はＴＰＡの構成的生産細胞になる。もし接続す
るプロモーター領域が誘導蛋白のものであれば、形質転
換細胞はＴＰＡを誘導蛋白として生産する。

動物培養細胞で機能するプロモーターの一つとして８Ｖ
４０のアーリープロモーターが知られている。このプロ
モーターは８Ｖ４０ＤＮＡのＨｉｎｄ　■−ｐｖｕ　■
フラグメント、約８４０ベースペア（ｂｐ）に含まれて
いる。機能するプロモーター領域とは、ｍＲＮＡの合成
開始点は含むが、それらのプロモーターが調節している
蛋白の最初のアミノ酸であるメチオニンのコドンは含ま
ないプロモーター領域の配列をさす。

ＳＶ４０のアーリープロモーター領域の配列と第８エク
ソンと第９エクソンの間にＳｍａ１部位のないＴＰＡ染
色体ＤＮＡ配列を接続したＤＮＡ配列を詩つＤＮＡ（Ｔ
ＰＡ発現ベクターｐＳＶｅＰＡ−ｔ）の作製を後記実施
例に示した。

（３）ＴＰＡ遺伝子の導入と発現 遺伝子を細胞に導入した場合、導入遺伝子は宿主染色体
ＤＮＡに安定に組み組まれる場合がある。遺伝子が組み
込まれる染色体上の位置は一見でたらめであり、また組
み込まれるＤＮＡのコピー数も不規則である。Ｔ　Ｐ　
Ａ　Ｒ云子を細胞に導入した場合、組み込まれた位置や
コピー数が細胞ごとに異なり、各々の細胞のＴＰＡ生産
量は異なる。従って細胞をクローン化することにより種
々の生産量を有する細胞を得ることができる。

機能するプロモーターを接続したＴＰＡ染色体ＤＮＡ配
列は、例えばリン酸カルシウム法或いは細胞融合法で動
物培養細胞に導入することができる。ＴＰＡの培地から
の回収精製は公知の方法が適用できる。即ちキレ−ティ
ング・セファロース、リジン−セファロース、Ｃ０ｎＡ
−セファロース、イオン交換体或いはセファデックス・
ゲル等でのクロマトグラフィーや電気泳動で回収、精製
できる。

Ｔ　Ｐ　Ａの活性は、プラスミノーゲン含有フィブリン
平板を用いる方法（Ｍａｃｋｉｅ、Ｍら（１９８１年）
ブリティッシュ・ジャーナル・オブ・ヘマトロジー（Ｂ
ｒｉｔｉｓｈ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆＩ’（ａｅｍａｔ
ｏｌｏｇｙ）　、　４７巻、７７頁〕やプラスミンの合
成発色基質８２２５１の分解を測定する方法ＣＡｌ　ｆ
ｅｎ、　Ｒ，Ａ、とＰｅｐｐｅｒ、　Ｄ、　Ｓ、　（１
９８１年）　Ｔｈｒｏｍｂｏｓ、Ｈａｅｍｏｓｔａｓ、
　４５巻、４３ｉ〕によって測定できる。

（発明の効果） 以上、詳記した通り、本発明によれば、極めて安全性の
高い天然型のＴＰＡを大量に供給することが可能となる
という効果を奏することができる。

（実施例） 以下に実施例を示すが、本発明に係る諸実験は内閣総理
大臣の定める［組換えＤＮＡ実験指針］に従って行った
。

実施例Ｉ ＴＰＡ遺伝子のクローニング ＴＰＡ遺伝子は部分的に４種類の組換え型ファージＤＮ
Ａ中にクローニングされた。第１図に示した４種のＤＮ
Ａ断片は、それらの組換え型ファージλＰＡＢｇｌ　　
５．７．λＰＡＢｃｏ　１１゜λＰＡ８ｓｔ　　９．０
及びλＰＡＢｇｌ　　６．０に含まれるＴＰＡ遺伝子断
片を示す。図中、黒く塗った部分はエクソンで、左から
右へ第２エクソンから第１４エクソンを示し、エクソン
の番号はＮｙらＣＮｙら（１９８４年）プロシーデイン
グズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイ
エンス・ニーニスニー、８１巻、５８５５頁〕の番号、
付けに従った。λＰＡＢｇｌ　　５．７．λＰＡＥｃｏ
　１１゜λＰＡ８ｓｔ　９．０及びλＰＡＢｇｌ　　６
．０　　の作製については特願昭６０−１５２８１０号
に詳述した。

λＰＡ８Ｓｔ９−８はλＰＡＳｓｔ９．０　　と同時に
得られたファージクローンテアリ、λＩ’Ａ３５ｔ　９
．０と同様にＴＰＡｆｉ伝子の５ｓｔＩ約９Ｋｂ断片を
有している。λＰＡＳｓｔ　９．０及びλＰＡＳｓｔ９
−８のＤＮＡに含まれるＴＰＡの５ｓｔＩ約９ＫｂのＤ
ＮＡ断片をそれぞれプラスミドＰＵＣ１２（ベーリンガ
ー・マンハイム社より入手）にサブクローニングし、ｐ
ＰＡｓｓｔ９及びｐＰＡｓ　５ｔ９−８を作製した。

実施例２ りＰＡ８ｓｔ９とＩ）ＰＡＳ　ｓｔ　９−８の比較ｐＰ
Ａｓｓｔ９及びｐＰＡＳｓｔ　９−８に含まれるＴＰＡ
遺伝子の制限酵素による解析及び塩基配列の決定を行っ
た結果、第２図に示したように両者のＤＮＡの間に５ｍ
ａｉ　　部位に関して差が認められた。すなわちＩ）Ｐ
Ａ８ｓｔ　９−８の第８と第９エクソンの間に存在する
８ｍａＩ部位がｐＰＡＳ　ａｔ　９にはなく、またその
近傍的０．８Ｋｂが欠−、’＝Ｓ　Ｌ／ていることが判
明した。またｐＰＡＳｓｔ９及びｐＰＡｓ　ｓｔ　９−
８のそれぞれのＤＮＡを制限酵素８ｓｔＩ及び８ｍａ　
Ｉで切断し、アガロースゲル電気泳動にかけて生じる断
片の大きさを測定した結果、ｐＰＡ８ｓｔ９からはプラ
スミドｐＵＣ１２に由来する約２．７Ｋｂの他に約０．
４Ｋｂと８．５Ｋｂの断片が、またｐＰＡｓ　ｓｔ　９
−８からはＩ）ＵＣ！１２由来の約２．７Ｋｂの他に約
０．４Ｋｂ　、６．５Ｋｂ及び２Ｋｂの断片が生じた。

次に第１０と第１１エクソンを含むＥ　ｃｏ　Ｒｌ−Ｈ
ｌｎｄ　■約０．８Ｋｂ　断片をニックトランスレーシ
ョンによって”Ｐ　’ｌＪａ　Ｌ／たものをプローブと
してサザンハイブリダイゼーションを行った結果、上記
断片のうちｐＰＡＳ　ｓｔ９では８．５Ｋｂ断片が、ま
たｐＰＡＳ　ｓｔ　９−８では２Ｋｂ断片が検出された
。

以上のことはヒ）ＴＰＡ遺伝子には第８エクソンと第９
エクソンの間に差のある２つのタイプが存在することを
示している。

実施例８ 塩基配列の決定 λＰＡＢｇｌ　　５．７．　　λＰＡＥｃｏｌｌ、λＰ
Ａ８ｓｔ９．０及びλＰＡＢｇｌ　　６．０に含まれる
ＴＰＡ遺伝子の塩基配列をＭ２Ｒ法によって決定した。

その結果、本願発明の特許請求の範囲第２項に記載した
エクソンの配列が見い出された。この塩基配列はＮｙら
の決定した配列１：Ｎｙ、Ｔ、ら（１９８４年）プロシ
ーデイングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オ
ブ・サイエンス・ニーニスニー。

８１巻、５８５５頁〕と同一であった。

実施例４ 発現ベクター１）ＳＶｅＰＡ−１の作製発現ベクターｐ
８ＶｅＰＡ−１は第３図に示した手順によって作製した
。ｐＰＡｅｌＶ−２から、ＳＶ４０のプロモーター領域
及びＴＰＡの第２エクソンから第１４エクソンを含む約
１８Ｋｂ　　８ａｌ　Ｉ断片をｐｓＶｅ８ａｌ　　Ｉの
８ａｌ　Ｉ部位に導入し、ｐ８ＶｅＰＡ−１を作製した
。ＴＰＡａ伝子の５′側にはＳＶ４０のｏｒｉを含むプ
ロモーター領域が、８′側にはＳＶ４０のポリ・アデニ
ル化・シグナルを含む配列が接続している。ｐＰＡｅｌ
Ｖ−２及びｐｓＶｅ８ａｌ　Ｉの作製については特願昭
６０−１５２８１０号に詳述した。

実施例５ ＴＰＡ発現ベクターの動物培養細胞への導入とＴＰＡの
生産 ＴＰＡ発現ベクターｐ８ＶｅＰＡ−１を種々の培養細胞
へＷｉｇｌｅｒらの方法（Ｗｉｇｌｅｒら（１９７７年
）セル、１１巻、２２８頁〕に準じてプラスミドの導入
を行った。プラスミド−リン酸カルシウム共沈澱物を予
め５％牛脂児血清（Ｆｅ２）を含むイーグルＭＥＭ培地
で生育させた細胞（２Ｘ１０５細胞／１６ｍ１！培地／
直＋　ｅ　ｃｒｔｔ培養皿）に加え、１５時間後に培地
を更新し、２４時間培養した。

培地を、５％Ｆ　ＯＳ　＋　２５１’ｌ　／ｍＺミ＝＋
７ｚノール酸、２５０μＩ／ｍｌキサンチンを含むＭＥ
Ｍ培地に変え、更に３週間培養をつづけ、ミコフェノー
ル酸耐性株を分離した。ミコフェノール酸耐性株を９６
穴マルチデイツシユの底面全面に生育させ、５％ＦＣ８
を含むＭＥＭ培地で４８時間培養し、培地中に含まれる
ＴＰＡ活性をプラスミノーゲン含有フィブリン平板を用
いて測定した（：Ｍａｃｋｉｅ　、　Ｍら（１９８１年
）ブリティッシュ・ジャーナル・オブ・ヘマトロジ−（
ＢｒｉｔｉｓｈＪｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉ（ａｅｍａｔ
ｏｌｏｇｙ）　、　４７巻、７７頁〕。

活性はウロキナーゼ（ミドリ十字）の活性に換算してユ
ニットで示した。表−１に示した様に用いた細胞の全て
でＴＰＡ生産株が分離された。なおＬ９２９（ＣＣ！Ｌ
−１）、０ＨＯ−Ｋｌ（ｃＣＬ−６１）、Ｖｅｒｏ（Ｃ
（ｊＬ−８１）及びＷＩ−２ＧＶＡ４　（ＣＯＬ　−９
５，１）はいずれもアメリカン・タイプ・カルチャー・
コレクションより入手した。

表−１各種形質転換細胞によるＴＰＡの生産棄　一種の
宿主細胞に対して１００株以上のミコフェノール酸耐性
株を分離したが、そのうちのＴＥＡを生産した代表的な
８株のＴＰＡ生産量を活性（ユニット）で示した。

【図面の簡単な説明】 第１図はＴＰＡをコードしている遺伝子領域及び組換え
型ファージλＰＡＢｇｌ　　５．７．λＰＡＥ　ｃ　。 １１、λＰＡＳｓｔ　　９及びλＰＡＢｇｌ　　６゜Ｏ
にクローニングされたＴＰＡの遺伝子断片を示す。 第２図はプラスミドｐＰＡｓｓｔ９及びｐＰＡｓｓｔ９
−８の構造を示した模式図であり、ＥＨｏ、８はプロー
ブとして使用したＥｃｏＲｌ−Ｈｌｎｄ　ｍ　約０．８
Ｋｂ断片を示す。 第３図はプラスミドｐＳＶｅＰＡ−１の作製法を示す模
式図である。図中、ＴＰＡ、Ａｍｐ　、ＳＶｅ。 Ｏｒｌ、Ｅｃｏｇｐｔ　ｌ　ｐＡは、それぞれＴＰＡ遺
伝子或いはＴＰＡｉ伝子の一部、アンピシリン耐性遺伝
子、ＳＶ４０のＤＮＡ複製起点を含む初期遺伝子プロモ
ーター領域、プラスミドの複製起点、Ｅｃｏｇｐｔ　３
１伝子、ＳＶ４０のポリ（４）付加シグナルを含む領域
を示す。 全ての図中、Ｅ　、　Ｂａ　ｓ　Ｂｇ　ｅ　８　Ｓ　ｔ
　Ｃ＊　ＨｐｅＥＩｉ、に、８ａ及び８ｍは、それぞれ
制限酵素ＥｃｏｎＩ　、Ｂａｍ１ｌＩＩ、Ｂｇｌ　Ｉｌ
、８ｓｔ　Ｉ　、（：！ｌａ　Ｉ　。 ＥＩｐａ　ＬＨｉｎｄＩｎ　、Ｋｐｎ　Ｉ、８ａｌ　Ｉ
及び８ｍａ工の認識部位を示す。 特許出願人　　鐘淵化学工業株式会社 代理人　弁理士　　浅　野　真　− 第１囚 ３Ｓ 第２図 Ｋｂ

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）第８エクソンと第９エクソンの間に制限酵素Ｓｍ
   ａＩの認識部位がないヒト組織プラスミノーゲン活性化
   因子をコードする染色体 ＤＮＡ配列。
2. （２）第２エクソン乃至第１４エクソンのポリペプチド
   をコードしている部分の塩基配列が以下の塩基配列であ
   る特許請求の範囲第１項記載の染色体ＤＮＡ配列。 第２エクソン 【ＤＮＡ配列があります】 第３エクソン 【ＤＮＡ配列があります】 第４エクソン 【ＤＮＡ配列があります】 第５エクソン 【ＤＮＡ配列があります】 第６エクソン 【ＤＮＡ配列があります】 第７エクソン 【ＤＮＡ配列があります】 第８エクソン 【ＤＮＡ配列があります】 第９エクソン 【ＤＮＡ配列があります】 第１０エクソン 【ＤＮＡ配列があります】 第１１エクソン 【ＤＮＡ配列があります】 第１２エクソン 【ＤＮＡ配列があります】 第１３エクソン 【ＤＮＡ配列があります】 第１４エクソン 【ＤＮＡ配列があります】
3. （３）第８エクソンと第９エクソンの間に制限酵素Ｓｍ
   ａＩの認識部位がないヒト組織プラスミノーゲン活性化
   因子をコードする染色体 ＤＮＡ配列に、培養細胞で機能する他の遺伝子のプロモ
   ーター領域の配列を接続したＤＮＡ配列。
4. （４）第８エクソンと第９エクソンの間に制限酵素Ｓｍ
   ａＩの認識部位がないヒト組織プラスミノーゲン活性化
   因子をコードする染色体 ＤＮＡ配列に、培養細胞で機能する他の遺伝子のプロモ
   ーター領域の配列を接続したＤＮＡ配列を有するＤＮＡ
   によつて形質転換された培養細胞。
5. （５）第８エクソンと第９エクソンの間に制限酵素Ｓｍ
   ａＩの認識部位がないヒト組織プラスミノーゲン活性化
   因子をコードする染色体 ＤＮＡ配列に、培養細胞で機能する他の遺伝子のプロモ
   ーター領域の配列を接続したＤＮＡ配列を有するＤＮＡ
   によつて形質転換された培養細胞を培養してヒト組織プ
   ラスミノーゲン活性化因子を生成せしめ、これを採取す
   ることを特徴とするヒト組織プラスミノーゲン活性化因
   子の製造方法。