JPH02500484A - 因子８活性をもつ新規タンパク質、遺伝子工学で作った細胞を用いた、それらの製法及びそれらを含む医薬組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 因子■活性をもつ新規タンパク質、遺伝子工学で作った細胞を用いた、それらの 製法及びそれらを含む医薬組成物序文 （技術分野） 本発明は、因子〜ｉｌｌ　（ｆａｃｔｏｒ■）活性をもつ新規タンパク質及び遺 伝子工学的に作った細胞系及び微生物を用いた、それらの製法。

（背　景） 血友病へとは、血液凝固反応における基本的要素である因子■に欠換をもつ性と 結びついた出血病（ｂｌｅｅｄｉｎｇ　ｄｉｓｏｒｄｅｒ）である。

この病気は、男性の約０．０１％に起こる。ヘモフィリアＡは、健康な提供者か ら得られる因子■含有血漿を投与することで治療することができる。しかしなが ら、この治療にはいくつかの短所がある。因子＼佃の供給には限りがあるし、非 常に高価である。すなわち、血液中の因子■の濃度は、わずか約１００ｎｇ／ｍ １であり、現行の血漿分画法を用いた収量は低い。因子■源は、貯留した提供者 の血液であるので、受容者は、提供者の血液中に存在する、ヘバチチス（ｈｅｐ ａｔｉｔｉｓ）非Ａ、非Ｂ１ヘパチチスＢ又はエイズウィルスによって引き起こ されるものを含む、種々の感染症を受け入れる高い危険にさらされる。加えて受 容者は、外来因子■の効果を激減する、外来因子■に対する抗体を発生ずること もある。

因子■は３つの領域、Ｎ端領域、いわゆる゛ＡｌＡ２ドメイン”　；中央領域、 いわゆる“Ｂドメイン″　；及びＡ３、Ｃ１及びＣ２領域を含むＣ端領域を含ん でいる。ＡｌＡ２ドメイン及びＣ端領域は、Ｕ血清性に必須のものであると考え ている。因子■は、感受性因子■を初期分解から保護すると考えられている、タ ンパク質、ウォン・ウィルブランド（ｖａｎ　Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ）因子（ｖ ｄ）と結合して、血液中を循環する。

因子■は、従来の組換えＤＮＡ技術によって作ると、不満足な低い収率でしか得 られない。さらに、このタンパク質は、生産物が華則しにくくまた精製しにくい ことから、本来の鎖として存在するようには思われず、結果的に高価である。そ れゆえ、因子■活性をもち、好ましくは免疫原性が小さい化合物を大量に生産す る効率的方法を開発することが望まれている。

（関連文献） ヒ）ｍＲＮＡから得られる因子■ｃＤＮＡの分子クローニング及びひきつづく、 ホ乳類、イースト及びバクテリア細胞における因子■活性をもつタンパク質の生 産が報告されている。　ＷＯ８５１０１９６１、ＥＰ０４６０４５７、ＥＰＯ１ ５０７３５、ＥＰ０２５３４５５参照。トランスホームした微生物を用いた、因 子■活性をもつタンパク質の生産法は、ＥＰＯ２５３４５５に公開されている。

ヨーロッパ特許出Ｉｌ！ＥＰＯ１５０７３５及びＥＰ０１２３９４５及びブリン クハウス（Ｂｒｉｎｋｈｏｕｓ）等（１９８５）は因子■のタンパク質分解産物 における因子■活性を公開した。

２つの因子■のタンパク質分解産物、９２ｋＤａ及び８０ｋＤａポリペプチドの 複合体は、増加した因子■活性を示した。（フエイ（Ｆ　ａ　ｙ　）等、バイオ ケム・ハイオフィズ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｅｍ。

Ｂｉｏｐｂｙｓ、　Ａｃｔａ、）　（１９８６）　８７土、２６８−２７８、イ ートン（Ｅａｔｏｎ）等、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）　 （１９８６）１上、５０５−５１２）。

イートン（Ｅａｔｏｎ）等（バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｊｓ　ｔｒｙ ）（１９８６）二、８３４３−８３４７）は、中央領域から７６６７ミノａ（７ ９７−１５６２）が欠失したポリペプチドは因子■活性を保持していることを報 告している。さらに、この欠失ポリペプチドをコードするＤ　Ｎ　Ａを含むベク ターでトランスホームしたホ乳類細胞は、全長ポリペプチドをコードするＤＮＡ を含むベクターでトランスホームした細胞よりも高いレベルの生産を行った。

ＰＣＴ出願ＷＯ３６１０６１０１は、中央領域における８８０個までのアミノ酸 残基の欠失を持つ組換え因子■タンパク質が因子■活性を示すことを公開してい る。もっとも大きい欠失は、Ｔｈｒ−７６０からＡｓｎ−１６３９までに渡って いる（第１図のナンバリングに従かう）ｅこの組換え因子■の製造のための宿主 には、チャイニーズハムスターの卵巣細胞を含むホ乳類細胞が含まれる。

（本発明の概要） 因子■の誘導体及び断片を含む新しい組成物を、その製造のための発現ベクター 及び方法とともに提供している。この組成物は、好ましくはホ乳類細胞などの宿 王細胞を因子■コンシェナー（ｃｏｎｇｅｎｅｒ）をコードするＤＮＡ配列を含 む発現ベクターでトランスホームし、このトランスホームした細胞を生育させて 、この外因性Ｄ　Ｎ　Ａ配列を発現させ、そして、細胞溶解物又は、ならし増殖 培地から、生した因子■誘導体又はその断片を回収することにより製造する。こ の組成物は、増加した因子■活性を持っており、そして、または、減少した免疫 原性を有している。この組成物の用途には、ヘモフィリアＡの治療が含まれてい る。

（図の簡華な説明） 第１図は、対応するヌクレオチド配列とともに、因子■のＡｌａ−１からＴｙｒ −２３３２までのアミノ酸配列及びＭ（−１９）から５（−１）までのそのシグ ナル配列を含む、ｐＣＬＢ８９における因子■ｃＤＮＡ挿入物を示している。Ｆ −９７３はコドンＴＴＣによってコードされている。

第２図は全長の因子■タンパク質をコードする発現ベクターｐｃＬＢ２０１の構 造を示している。この環状プラスミドｐＣＬＢ２０１は、プラスミドｐＳＶ２由 来の４２１７ｂｐのＨｉｎｄ　ｍ−ＢｇｌＩｌ断片内のＥｃｏＲＩ部位で始まる ように示しである（ゴーマン（Ｇｏｒ＊ａｎ）、１９８５、ＤＮＡクローニング （グローバー（Ｇｌｏｖｅｒ）［）　Ｉ　ＲＬプレス、１４３−１６９頁；ムリ ガン（Ｍｕｌｌｉｇａｎ）及びバーブ（Ｂｅｒｇ）、プロシーディング・イン・ ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａ ｄ、　５ｃｉ）ＵＳＡ、（１９８１）７Ｂ、２０７２）、５Ｖ４０（７）初期プ ロモーター領域が示されているｉ　Ｓ　Ｖ　ｅｐｅ　このベクターは、５ａｌｌ 部位に挿入されているロウス・ザルコーマウィルスのロング・ターミナル・リピ ート（ＬＴＲ）を持つ、プラスミドｐＲ３Ｖ　−ｎｅ。

（ゴーマン（Ｇｏｒ＋ｍａｎ）　１９８５、上記）由来のＮｄｅ　Ｉ　−Ｈｉｎ ｄｍ断片をも含んでいる。全長の因子■は、７４４０ｂｐの５ａｌｌ−Ｈｐａｌ 断片によってコードされており、これを因子■ｃＤＮＡで示しである（Ｈ＝Ｈｉ ｎｄｎｌ、５ａｌ＝Ｓａｌｌ）、　ｐＣＬＢ　２０１の構築の際に失なわれた制 限エンドヌクレアーゼ切断部位は力ンコで囲んである。プラスミドの大きさは、 キロベース（ｋ　ｂ）で示した。

第３図は、欠失変異体因子■タンパク質の転移的発現のためのベクターを示して いる。

ａ、ｐＳＶ２誘導ベクターの境界標；２個の連続するプロモーター：５ｖ４ｏ初 期転写プロモーター（ＳＶｅｐ）及びラウス・ザルコーマ・ウィルスのロングタ ーミナルリピート（Ｒ３Ｖ−ＬＴＲ）；キャフビング部位（キャップサイト）及 びメツセンジャＲＮＡ（ｗＲＮＡ）の５′末端；開始コドン（ＡＴＣ，）　、読 み枠及び終来のポリアデニル化シグナル（ｐｏｌｙＡ）及び短かいイントロンを 含むｍＲＮＡの３′側非コード領域（第２図参照）。

ｂ、全因子■をコードするｃＤＮＡを含む７４４０ｂｐ　（塩基対）断片Ｓａｌ 　Ｉ　−Ｈｐａ　ｌが描かれている。読み枠の開始及び終止コドンを示じである 。また、ｐＣＬＢ２０２及びｐｃＬＢ２０３構築のための突然変異誘発に関係す る全ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ内の制限エンドヌクレアーゼ部位を示した。

Ｃ１因子■タンパク質の地図。血漿因子■の１９アミノ酸残基長のシグナルペプ チド及びドメイン又は反復構造を示した。ＡＩ、Ａ２及びＡ３は相同的アミノ酸 配列である。Ｂは独特な領域である一方、Ｃ１及びＣ２も相同的なものである（ ベハー（νｅｈａｒ）等、１９８４）。Ａ及びＣ反復を含むアミノ酸部位も示し た。地図の下に、因子■、すなわち、活性化タンパク質Ｃ（ＡＰＣ）　、）ロン ビン（Ｉｌａ）、活性化凝血因子Ｘ　（Ｘａ）　、及びトリプシン様プロテアー ゼじ？”で示す）を矢印で示した。因子Ｘａはここに示されているｌ１ａ−及び ＡＰＣ−切断部位を切断すると考えられている（イートン（Ｅａｔｏｎ）　）等 、ノマイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉ−ｓｔｒｙ（１９８６）２５，８３ ４３　８３４２；フェイ（Ｆａｙ）等、ハイオケム・バイオフィズ・アクタ（Ｂ ｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ、）（１９８６）８ユ土、２６８ −２７８）。それらの切断部位も示しである。Ｂ領域には多くの切断部位が含ま れている。

ｄ、活性化した因子■のサブユニット構造９２ｋＤａ及び８０ｋＤａの因子■ａ サブユニットを各々９２Ｋ及び８０にで示した。全配列中のアミノ末端及びカル ボキシ末端アミノ酸位置を示しである。

ｅ、”ｂ”に示したＰｓｔｌ及びＢａ５ＨＩ部位間の直接融合物を含。

むｐｃＬＢ２０２のｃＤＮＡ及びタンパク質の構造、この生成したクンバク質は 、Ａｌａ−８６７とＡｓｐ−１５６３の間のペプチド結合を含むことが示されて いる。タンパク質の全長は１６３７アミノ酸残基である。（反復境界位置及び特 異的タンパク質分解部位の境界標も図のとおりである、上記参照、）ｆ、ｂに示 しであるように、Ｍａｅｍ部位及びＨｇｌＡＴ部位の橋渡しをする４個の余分の アミノ酸をコードするＭａｕ！リンカ−配列を含むｐｃＬＢ２０３のｃＤＮＡ及 びタンパク質の構造、このタンパク質の全長は１４１１個のアミノ酸残基である 。（反復境界位置及び特異的タンパク質分解部位の境界標も図のとおりである、 上記参照。

第４図は、免疫沈殿及び；気泳動法を用いた、いくつかの欠失突然変異体因子■ クンバク質の分子量（サイズ）測定の結果を示している。

このオートラジオグラフは、ベクターｐｃＬＢ２０２　（レーン２）及びｐｃＬ Ｂ２０３　（レーン１）によって作られたクンバク質のレーンを示している０分 子量マーカーも示されている。

（特別な態様の説明） 本発明に従がい、因子■活性を有するポリペプチドを生産する新しいＤＮＡ構築 物及び新しい組成物が提供される。この、因子■活性を有するポリペプチドには 、９２キロダルトン（ｋＤａ）領域の一部だけでなく、全ての中央領域又は“Ｂ ドメイン”が実質的に欠失した、因子■の欠失変異体タンパク質が含まれる。因 子■活性を有する欠失ポリペプチドをコードするＤ　Ｎ　Ａ配列を含むプラスミ ド構築物を用いて、宿主細胞をトランスホームする。

それから、この宿主細胞を生育させ、この遺伝子を発現さセる。

この宿主細胞は、真核細胞でも原核細胞でも構わない。

ヒトの因子■は、第１図に示した配列をもっている。アミノ酸０１文字略記を用 いており、それは次のように定義される：Ａ−アラニン、Ｒ−アルギニン；　Ｎ 　１１＝アスパラギン、Ｄ−アスパラギンａ；Ｃ＝システィン；Ｑ−グルタミン ；Ｅ−グルタミン酸；Ｇ＝ニブリシンＨ−ヒスチジン；１ｗイソロイシン；Ｌ千 ロイシン；に−リジン：Ｍ−メチオニン；Ｆ−フェニルアラニン；２ｗプロリン ；Ｓ＝セリン；Ｔ−スレオニン；Ｗミトリブトファン；Ｙ＃ケロシン；及びＶ− バリン、アミノ酸配列の番号は、１９個のアミノ酸シグナル配列後の第１番目の アミノＭＡ−１から開始する。

因子■の最後のアミノ酸はＹ−２３３２である。この番号付けはこの明細書を通 して使用している。凝血活性を含む、本来の因子■の生物学的活性を有する因子 ■の機能部分を含む融合ペプチドだけでなく、因子■断片、そのポリペプチドの 変異体を含む因子■様物質も提供されている０本発明のポリペプチドは、因子■ のコンシェナー、すなわち、因子■の少なくとも１つの生物学的活性を有し、か つ、実質的に因子■と同じアミノ酸配列を有する、少なくとも１つのアミノ酸配 列を持つ物質を含んでいる。このコンシェナーは、因子■より大きい配列のこと もあるし、小さい配列のこともある。生物学的活性には、血友病患者に投与した とき、凝血欠損症を改善し、そして、または、天然の因子■と免疫学的に交叉反 応を起こす能力が含まれている。従ってこの改善は、凝血反応への直接的作用ま たは、因子■に対する抗体への反応によ２り、ひきつづいて投与する因子■の生 物学的活性へ○影響を少なくすることによって行なわれる。°免疫学的交叉反応 ”とは、本発明の新規ポリペプチドによって誘導される抗体が本来の因子■と交 叉反応を起こすことを意味する。このポリペプチドは、例えば、免疫反応的又は エピトープ的な、少なくとも１つの生物学的活性配列を有し、また、これらの配 列が生物学的活性に関し、天然の産物と競合する場合には、１つ以上の生物学的 活性配列をもつこともある。

問題となっているこのポリペプチドは、Ｎ末端領域Ｎ’、結合領域Ｌ６及びＣ末 端領域Ｃ１を含む式で大部分が表わすことができる。Ｎｌｌは、ＡｌＡ２ドメイ ン中のアミノ酸のうちせいぜい４５％、通常２０％だけ、好ましくは、１０％だ け、最も好ましくは５％だけが欠失している、全長の因子■のアミノ酸配列Ａ− １からＲ−７４０に見られる連続した配列じＡｌＡ２ドメイン”又は９２ｋＤａ ポリペプチド）に実質的に対応しているアミノ酸配列を有することを特徴として いる。好ましい配列は実質的に、Ａ−１からＤ−７１２、又はＡ−１からＤ−７ ４０の配列に対応している。

Ｌ、は、通常、全因子■タンパク質の′Ｂドメイン′の配列と実質的に同じでは ない、１個乃至２０個のアミノ酸の結合又は配列を有する短かい結合基のことで ある。またこれは、Ｂドメイン中のＳ−７４１からＳ−１６３７までの完全な配 列又はその一部の連続した配列に実質的に対応している配列を含むこともある。

Ｌ、がＳ−７４１からＳ−８６７及びＤ−１５６３からＳ−１６３７までの配列 の少なくとも１つを含んでいる組成物は特に興味深い。

ＣＲは、Ｑ−１６３８からＹ−２３３２のアミノ酸のうち、せいぜい２５％、通 常２０％だけ、好ましくは１０％だけが欠失している、Ｇｌｎ−１６３８からＴ ｙｒ−２３３２までのアミノ酸を含む、因子■の配列中にみられる連続した配列 と、実質的に同じアミノ酸配列を有することを特徴とする。この配列が因子■の 配列、Ｑ−１６３８からＹ＝２３３２、Ｅ−１６４９からＹ−２３３２、Ｓ−１ ６６９からＹ−２３３２及びＳ−１６９０からＹ−２３３２、より好ましくはＱ −１６３８からＹ−２３３２と実質的に対応する配列を含むことが望ましい。

本発明のポリペプチドは、全長の因子■もしくは、９２ｋＤａの断片又はその断 片と、８０ｋＤａのポリペプチド又はその断片との融合である融合タンパク質か ら、最高７５％のアミノ酸が欠失した因子■の断片でもありうる０通常このポリ ペプチドはアミノ酸のせいぜい約７５％、通常アミノ酸のせいぜい約４５％、よ り一般的には、アミノ酸のせいぜい約４０％を欠失している。

免疫原性を与えるため、因子■コンシェナーを、免疫原性ポリペプチドと共有結 合させる。このような免疫原の例には、ウシ血清アルブミン、キーホール・リン ベット・ヘモシアニン（Ｋ　Ｌ　Ｈ）及びそれに類するものが含まれる。このよ うな結合化ポリペプチドは、適当な宿主生物中で抗体を作るのに宵月である。こ の抗体は、体液中の因子■の存否及び、またはその濃度を測定するのに使用され 、因子■が無いことは、血友病Ａを示している。

（因子■コンシェナーの調製） 因子■コンシェナーは種々の方法で調製できる。これらは、全因子■の三つの領 域へのタンパク質分解切断、好ましくはＡｒｇ−７４０及びＧｌｎ−１６３８の 前切断と、ＡｌａｌからＰｒｏ−７３９までの配列のアミノ又はカルボキシ末端 から一度に少なくとも１個のアミノ酸を、そして、または、Ｇｌｎ−１６３８か らＴｙｒ　−２３３２までの配列のアミノ又はカルボキシ末端から少なくとも１ 個のアミノ酸を切り取ることにより得ることができる。得られた、このポリペプ チド断片を、中央結合基に直接融合するか、又はこの断片を組成物と合せて、因 子■活性を提供する。

Ｎｌ及びＣ１を融合した融合タンパク質を含む、因子■コンシェナーは、組換え ＤＮＡ技術によっても作ることができる。因子■を単離するのに用いる技術は、 当分野ではよく知られており、合成、ゲノムＤＮＡからの単離、ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ からの調製又はそれらの組合せなどが含まれている。遺伝子を取扱う種々の技術 が知られており、それには、制限処理、消化、切除、ライゲーション、インヒド ロ突然変異誘発、プライマー修復、及びポリリンカー及びアダプター等が含まれ る。マニアチス（Ｍａｎｉａｔｊｓ）等のモレキュラー・クローニング（（１９ ８２）ニューヨーク、コールドスプリング・ハーバ−、コールドスプリングハー ハーラボラトリー）参照。

一般的にこの方法には、因子■を合成する細胞由来のゲノムライブラリーを作る ことが含まれる。正しい配列を同定する確率を高めるため、因子■を産生じない 細胞由来のｃＤＮＡはクロスハイブリダイズするのに使用できる。ｐＴＺ１８又 は１９のような原核性発現ベクータに挿入された制限断片及び交叉反応ペプチド 断片又はそれに類するものを検出するため、因子■に対する抗体でスクリーニン グすることを用いる、因子■発現の検定法も使用しうる。

ｃＤＮＡでも染色体ＤＮＡでも、一度、完全な遺伝子が同定されれば、その構造 遺伝子中に望ましい欠失を起こすことは、種々の方法でできる。欠失は、全因子 ■ｃＤＮＡを酵素的に切断し、ついで、その精製断片の修正及びライゲーション 、又は、部位特異的突然変異誘発、特に、クレイマー（Ｋｒａｍｅｒ）等（ヌク レイツク・アシフズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、）　（１９ ８４）ユ、９４４１−９４５６）の報告にあるようなループアウト突然変異誘発 によって行うことができる。このようにして得た遺伝子を、当分野でよく知られ ている種々の方法で発現させることができる。

宿主には原核性及び真核性のどちの細胞も使用され、その中には、バクテリア、 イースト、ホ乳類細胞、例えば、ＣＨＯ細胞、Ｃ】２７細胞、ヒトの“２９３” 細胞、ミエローマ細胞、もしくは、肝細胞やＣＯ８細胞のような特定の細胞が含 まれる。それゆえ、この遺伝子が因子■の野生型の転写及び翻訳制御領域を認識 する宿主中で発現される場合、その野生型５′及び３′制御領域を含む全遺伝子 が適当な発現ベクターの中に導入されることになる。種々の発現ベクターは、シ ミアンウィルス４０、エプスタイン・バーウィルス、ボビン・パパローマ・ウィ ルス、ワクチニア・ウィルス、その他のホ乳類ウィルスに由来する複製システム を使用している。

この遺伝子が天然の野生型転写及び翻訳制御領域を認識できない宿主中で発現さ せる場合、さらに操作を必要とする。簡単に言えば、種々の、３′転写制御領域 が知られており、それを、終止コドンの下流に挿入するのである。構造遺伝子か ら上流に位置する５′非コード領域はエンドヌクレアーゼ制限、Ｂａ１３１切除 又はそれに類するもので取除かれる。別に、その構造遺伝子の５′末端近傍に、 都合のよい制限部位が存在する場合には、この構造遺伝子を制限処理し、構造遺 伝子をプロモーター領域に結合するアダプターが用いられる。この場合、アダプ ターは、構造遺伝子の失なわれたヌクレオチドを提供することになる。

転写の５′から３′方向に、制御の誘導を行う制御配列：好ましくは計画されて いる宿主細胞によって認識される分泌リーダー配列を含む、全因子■又は因子■ のコンシェナーをコードする読み枠及び翻訳及び転写の終止領域も含む、転写制 御領域及び翻訳開始領域を有する外来性発現カセットを提供するのに種々の戦略 がとられる。この発現カセットは、さらに少なくとも１つのマーカー遺伝子を含 んでいる。この開始及び終止領域は宿主中でも機能し、同種のものく元の宿主由 来）のときも異種のもの（外来のもの）のときもあるし、合成りＮＡ配列の場合 もありうる。従うで、発現カセットは天然のものに全部又は一部由来し、宿主細 胞と同種のものに全部又は一部由来することもあるし、宿主と異種のものに全部 由来することもある。本発明の種々のＤＮＡ構築物（ＤＮＡ配列、ベクター、プ ラスミド、発現カセット）は単離、そして、または、精製されるか、もしくは、 合成される（つまり天然のものではない）。

主通遺伝子発現のために翻訳開始コドンＡＴＧの囲りのヌクレオチド配列が動物 細胞の場合重要であることが分っている０例えば、コザフク（Ｋｏｚａｋ）　（ マイクロバイオロジカル・レヴユー（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｒｅｖｉｅｗｓ） 　（１９８３）土１．１〜４５）は、ＣＯＳ細胞におけるインシュリンのような ポリペプチドの発現に関するこれらの領域の影響を広く研究した。そこで、開始 コドンの囲りのヌクレオチド配列を修正する必要があるかもしれない、これは、 部位特異的突然変異誘発又は、発現しやすい遺伝子の開始領域に外来遺伝子を融 合することによって行なう。

代表的な転写制御領域又はボロモーターには、バクテリアの場合は、ベーターギ ャルプロモーター、アミラーゼプロモーター、ラムダレフト及びライトプロモー ター、ｔｒｐ及びｌａｃプロモーター、ｔｒｐ−１ａｅ融合プロモーターその他 が含まれ、イーストの場合は、解糖酵素プロモーター（例えばＡＤＨ−１、−２ プロモーター）　、ＰＣＫプロモーター及びラクターゼプロモーター等が含まれ 、ホ乳類細胞の場合は、ＳＶ４０初期及び後期プロモーター、サイトメガロウィ ルス（ＣＭＶ）プロモーター：ベータ・アクチンプロモーター、アデノウィルス 主後期プロモーター等が含まれる。

真核細胞の場合、制御配列には、例えば、ＳＶ４０プロモーターのようなプロモ ーター配列に融合し、キメラプロモーターを作るか又は好ましくは、そのプロモ ーター配列の近くの発現カセット中に挿入したサイトメガロウィルス・エンハン サ−配列を含む。

この構造遺伝子の発現も、例えば、構造遺伝子の５′側又は３′側に連続して、 非常に増巾しやすい遺伝子マーカー遺伝子をライゲーションし、選択条件下でこ の宿主細胞を生育させることにより増巾することができる。その増巾可能遺伝子 の例には、ジヒドロフオレート・リダクターゼ遺伝子があり、その発現は、フオ レート・アンタゴニストであるメトトレキセート（ＩＩＩｔｘ）に耐性の細胞中 で増加する。ＣＯＳ細胞のようなホ乳類細胞における発現に対しては、メタロチ オネイン・プロモーター又はＳＶ４０初期転写ユニット転写プロモーター（ＳＶ ｅｐ）、特に５Ｖｅｐと連続する、ラウスザルコーマウィルス−ロング・ターミ ナル・リピート（１？５Ｖ−ＬＴＲ）プロモーターを使用する、因子■又はその コンシェナーを発現できる発現カセットは興味深い。例７に従かう、発現ベクタ ーと組合せたＣ１２７細胞で使用されるプロモータ及びプロモーター／エンハン サ−の組合せの例は、ハーウィツ（Ｈｕｒｗｉｔｚ）等（ヌクレイツク・アシフ ズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、）（１９８７）１上、７１３ ７−７１５３）によって報告されている。最適発現のためには発現カセットへの イントロンの導入が有利かもしれない、ｍＲＮＡの５′側部分にイントロンがあ ることさらに、融合遺伝子は、分泌リーダー及びプロセシングシグナルをコード する５′側配列を構造遺伝子に提供することにより作ることができる。因子■ポ リペプチドの分泌に対しては、天然の因子■リーダー配列を用いることが望まし いが、その他に、ベニシリナーゼ、アルファー因子、イムノグロブリン、Ｔ細胞 レセブター、外膜タンパク質、血清アルブミン、組織プラスミノーゲン活性化因 子、インシニリン、消化器官酵素などの分泌リーダーを含むシグナル配列も用い ることができる０分泌リーダーを、因子■又はそのコンシェナーの構造遺伝子に 適当な読み枠で融合することにより、成熟した因子■が培養培地中に分泌される 。

終止領域は、開始領域が得られた遺伝子又は別の遺伝子の３′領域に由来する。

多くの終止領域が知られており、同種、８Ｍ及び同属、異属の種々の宿主で満足 されるものであることが分っている。この終止領域には、ホ乳細胞における―Ｒ ＮＡの適正なプロセシングだめの配列、すなわち小さなイントロン及びポリアゾ ニレ−シランシグナルが含まれる。

この遺伝子カセットの構築の際、通常、種々のＤＮＡ断片を適当なりローニング ベクター中にクローニングし、そのＤＮＡの増殖、そのＤＮＡの修正又は、その 配列、リンカ−又はそれに類するものの結合又は除去による操作を行なう０通常 、このベクターは、大腸菌中、少なくとも、比較的高いコピー数複製することが 可能である。クローニングのための多くのベクターが容易に入手でき、それらに は、ｐＢＲ３２２、ｐＭＬ２、ｐＵＣ７−ｐＵＣ１９、ｐＳＰ６４、ｐｓＰ６５ 、ｐｓＰ１８、ｐｓＰ１９、ｐＴＺ１８とｐＴＺ１８Ｒ，ｐＴＺ１９とＰＴＺ１ ９Ｒ及びそれに類するものが含まれる。

このクローニングベクターは、少なくとも大腸菌中で機能する効率的複製オリジ ンを存することを特徴としている。また、このクローニングベクターは、少なく とも１個、通常多くの単一制限部位をもっており、また多重制限部位、特に置換 のための同制限部位２個を含んでいる。さらに、このクローニングベクターは、 トランスホーメーシテンのための選択を可能にする、１つ以上のマーカーを有し ている。このマーカーは、通常、抗生物質、重金属、トキシン又はこれらに類す るもの等の細胞毒試薬に対する耐性、栄養要求性宿主の相補性又は、ファージに 対する免疫性を提供する。ベクター及びカセットの適当な制限処理及び粘着末端 の切断又は充填による末端修正での平滑末端化、リンカ−付加及びテーリングに よりベクターを発現カセット又はその成分にライゲーション及び結合するための 相補的末端を作る。

ある例では、ベクターが異なる複製システムを必要とする異なる宿主中での複製 が可能なシャトルベクターが用いられる。シミアンウィルス４０　（ＳＶ４０） の複製オリジンを使用すればこのプラスミドはＣＯ５−１中で増殖する一方、ボ ビン・パピローマ・ウィルス（ＢＰＶ−１）ゲノムは、ｃ１２７細胞中での発現 ベクターのエビソーム維持に使用される（例えば、ハウレー（Ｈｏｗｌｅｙ）等 、メソフズ・イン・エンザイモロジ−（Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｌｌｏｌ、）　１ ０１．３８７−４０２．１９８３参照）。

この発現力セントは、適当な宿主内のエビソーム維持のための複製システムに含 まれるか、もしくは、それが、宿主ゲノムに組込まれているときには、複製シス テムは必要ない、宿主生物の種々のＤＮＡ構築物でのトランスホーメーク５ンの 方法は、本発明にとって重要ではない。このＤＮＡは、リン酸カルシウム沈殿化 ＤＮＡを用いたトランスホーメーション、エレクトロポレーシヨン、細胞をウィ ルスと接触させるトランスフェクシヨン、ＤＮＡを細胞に注入するマイクロイン ジエクシッンその他の従来技術に従って宿主中に導入される。

宿主生物としては、通常の一次細胞又は、−次培養組織に由来する細胞系列が微 性物細胞の他に使用される。この宿主細胞は、ホ乳類細胞系列、好ましくはハム スターＣＨＯ細胞、マウスＣ１２７細胞又はヒト°２９３°細胞であることが望 ましく、一方、イースト、好ましくはクルイベロミセス種（にｌｕｙｖｅｒｏｍ ｙｃｅｓ）又はバクテリア、好ましくはバチルス種（Ｂａｃ　ｉ　Ｉ　１ｕｓ） などの微生物細胞も使用される。

ホ乳類細胞系列の、因子■コンシェナーコード配列をもつ発現ベクターによる安 定なトランスホーメーション及びひきつづく宿種染色体内に挿入された、このベ クターの増巾のためにはチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）が特に適し ている。トランスホーメーションには、ｄｈｆｒ又はＧ　４１　Ｓ　（ｎｅｏ− ）耐性遺伝子のような選択性マーカー遺伝子をもつ発現ベクターによる宿主細胞 のトランスフェクション及びひきつづく染色体への組込み及び安定なトランスホ ーメーションの選択が含まれる。

宿主細胞系列の安定なｔランスホーメーションのための別の方法にはＢＰＶ−１ 配列を含む発現ベクターが含まれるｃｌＣ１２７細胞はこの目的によく適してい る。トランスホーメーションには、ＢＰＶ−１配列を含む発現ベクターによる宿 主細胞のトランスフェクションが含まれる。トランスホーメーションは、フォー カス形成で確認される。安定なトランスホーメーションは、例６又は例７に従う カビ・コーチスト（Ｋａｂｉ　Ｃｏａｔｅｓｔ　）を用いた因子■活性により確 認及びスクリーニングされる。・一方、この発現がＣＯ５−１細胞のｐＳＶ２由 来の発現ベクターによる転移的トランスホーメーションシステムで行なわれる場 合は、選択システムはない。一度、構造遺伝子が適当な宿主に導入されたなら、 その宿主を生育し、構造遺伝子を発現させる。この宿主細胞を適当な培地で高密 度に増殖することができる。このプロモーターが原核性システムのように誘導可 能な場合は、例えば温度変化、代謝産物又は栄養の涸渇又は過剰のような許容条 件で行うこともできる。

ホ乳類システムにおいて、増殖可能な遺伝子が構造遺伝子と連続して存在する場 合、増殖には適当な手段が採用されよう。

分泌が行なわれる場合、融合もしくは未融合の発現産物を従来法により生育培地 から単離する。分泌が起こらない場合は、宿主細胞を従来法に従かい収穫及び溶 解する。それからこの目的産物を、例えば、固定化抗体を用いたアフィニティー クロマトグラフィー、アミノヘキシル−セファロースでのクロマトグラフィー又 は混合高分子電解質法などの従来技術により単離・精製する。

この組換光産物は、グリコジル化されているものといないものがあり、また野生 型のグリフシル化のものとその他のグリコジル化のものもある。グリコジル化の 景は、それを生産する生物種だけでなく、その独自のペプチド配列にも部分的に 依存する。大腸菌細胞における産物の発現は、非グリコジル化産物を生ずる一方 、ホ乳類細胞中での産物の発現は野生型ペプチドと同様のグリコジル化された産 物を生ずるであろう。

（因子■コンシェナーの使用） この化合物は、インビボ及びインビトロで、巾広く使用される。

本化合物は血友病Ａの症状を示す患者の治療のための医薬製剤の活性成分として 用いることができる。医薬組成物とはホ乳類に投与する調製物を意味する。従っ て、因子■活性をもつ医薬製剤は、ホ乳類に投与１．血友病へに関係する症状、 適正な凝血不能を緩和する調製物である。この医薬組成物を作るに当り、一般的 に本ポリペプチドをこの分野でよく知られている操作に従がい、非経口的に許容 されるビヒクル及び他の適当な賦形剤と混合する。この医薬製剤は、溶液を作る のに適し、好ましくは受容者の血液と等張的な無菌溶液を添加することにより再 構成した、本ポリペプチドの無菌性凍結乾燥調製物であることが都合がよい。こ の医薬製剤は単一ユニット又は複数投与量の容器、例えばシールしたアンプル又 はバイアルで提供される。それらの使用法は、適当に症状に合せた、従来のヒト 因子■ポリペプチドの時と同様である。本ポリペプチドは、イン・ビボで、例え ば、静脈、腹腔内、皮下などの注射によって投与する。

さらに、本化合物は、インビボ、又ははインビトロで使用される本化合物に対す る抗体の生成に用いられる。この抗体は、免疫原として本ポリペプチドを用い、 特に、例えば完全フロインドアジュバント、水酸化アルミニウムゲルその他のよ うなアジュバントとともに、例えば、マウス、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ウサギ等の ホ乳類宿主に、このポリペプチドを注入する、従来法で調製することができる。

それから、この宿主を飼育し、ついで血液をポリクローナル抗体の単離に使用す るか、又は、マウスの場合、末梢血液リンパ細胞又は膵臓リンパ細胞（Ｂ細胞） を、本化合物に特異的なモノクローナル抗体の発現のためのこの染色体を不滅化 のため、適当なミエローマ細胞との融合に使用した。

ポリクローナル又はモノクローナル抗体のいずれも調製して、細胞又は血液など の生理的液体のような、サンプル中の本ポリペプチドの存在の診断又は検出に用 いることができる。本ポリペプチドを検出できないことで、血友病への状態を示 すことができる。

因子■ｍＲＮＡと相補的な配列を含むプローブを調製し、例えば、細胞中の因子 ■ｍＲＮＡの存在そして、または量で、この患者が因子■を作っているがその活 性を妨害する抗体を持っているかどうかを決めるのに用いるような診断の助力と しても使用される。ハイブリダイズする配列を含むと考えられている、細胞、組 織サンプル又は体液を含むテストサンプルを処理して細胞を溶解し、さらに塩酸 グアニジンなどの変性剤で処理して一本鎖ｍＲＮＡを放出させる。例えば３２Ｐ 又はビオチン化ヌクレオチドでラベル化したプローブと、その細胞性−ＲＮＡを ハイブリダイズして２本鎖複合体を作って、これを該ラベルで検出することがで きる。

ある目的のためには、因子■ｉ＋ＲＮＡ量を定量することが望ましい、このこと は、一本鎖の因子■ｍＲＮＡの既知量を含む対照サンプル中に検出されるラベル 量を、テストサンプル中に検出されるラベル量と比較することによって行なう０ 次に示す例は説明を目的とし、制限を目的とするものではない。

（実　験） 一般的なりローニング技術は、マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ　）　等（Ｄモレ キュラー・クローニングに報告されているものを使用した（１９８２、ＮＹ州、 Ｃ３Ｈ、コールド・スプリング・バーバー・ンボラトリー、ラボラトリ−・マニ ュアル）。全てのＤＮＡ修飾酵素は市販されているものを使用した。それらは、 製造業者の説明書に従って用いた。ＤＮＡ精製及び分画に用いた材料及び装置は 業者の説明書に従って使用した。

（例１） （発現ベクターｐｃＬＢ２０１の構築）ｐｃＬＢ２０１は、転写開始のため、右 方向！、ｍＲＳＶ−ＬＴＲプロモーターと全因子■ｃＤＮＡ　（第２図参照）を 含む発現ベクターである。これは、去りガン（Ｍｕｌｌｉｇａｎ　）及びバーブ （Ｂｅｒｇ　）のｐＳＶ２−ベクター（プロシーディング・イン・ナショナル・ アカデミ−・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ 、　）ＵＳＡ、（１９８１）７８．２０７２）がら誘導した。

プラスミドｐＳＶ２、ｔＰＡ（パン・シネベルド（ｖａｎＺｏｒｖｅｖｅｌｄ　 ）等、プロシーディング・イン・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス（ Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　）　Ｕ　Ｓ　Ａ。

（１９８６）８３．４６７０−４６７４＞の単一のＨｉｎｄＩ［１部位は、Ｈｉ ｎｄＩＩＩ粘着末端を平滑化し、５ａｌＩリンカ−（５′−ＣＧＴＣＧＡＣＧ− ３’　）をその平滑末端にライゲーションすることによって、Ｓｃｉ１部位に修 正した。５ａｌＩ部位を含むプラスミドを選択し、ｐｃＬＢ９１であると同定さ れた。このプラスミドは、Ｈｉｎｄ　ｍ８位に挿入した５ａｌｌリンカ−を含む こと以外、ｐＳＶ２、ｔＰＡと同じものである。ヒトの肝臓由来の因子■ｍＲＮ Ａの単離及びそのｃＤＮＡの調製、精製及び同定及びプラスミドＰＣＬＢ８９を 生成するプラスミドＰＥＰ１２１へのアッセンブリーは、ここに参考として組入 れである、特許出ＩＪＩＥＰ０２５３４５５で報告されている。因子■ｃＤＮＡ を含むｐＣＬＢ８９由来の、７４４０ｂｐ長の５ａｉｌ−Ｈｐａｌ断片（第１図 参照）を精製し、ついで、５ａｌＩ及びＢｇｌＩＩで消化したｐｃＬＢ９１に挿 入した。この発現ベクターｐｃＬＢ２００は、本来の５ａｌＩ部位と、充填した ＢｇｌＩ［部位にライゲーションしたＨｐａ１部位を含んでいる。

プラスミドｐＲｓＶｎｅｏ　（ゴーマン（Ｇｏｒｍａｎ　）　、ＤＮＡクローニ ング、１９８５、Ｄ、グローバー（Ｇｌｏｖｅｒ　）編、ＩＲＬプレス、ワシン トン、オックスフォード、ｐ１４３〜ｐ１６９）をＮｄｅＩ及びＨｉｎｄＩ［［ で消化し、ついでＤＮＡポリメラーゼのクレノーフラグメントとインキュベーシ ョンして平滑末端を作り、さらに、ロウス・ザルコーマ・ウィルス−ロング・タ ーミナル・リピート（Ｒ３Ｖ−ＬＴＲ）配列を含む０．６ｋｂの断片を単離し、 同様に平滑末端化したｐｃＬＢ２００の５ａｌＩ部位に挿入して、発現ベクター ｐｃＬＢ２０１を生成した（第２図参照）。

（例２） （ｐｃＬＢ２０２の構築） ヌクレオチド配列位置２６６０番のＰｓｔ１部位（第３ｂ図参照）から４７４９ 番のＢａｍＨＩ部位までが欠失した因子■の欠失変異体を、特許出願ＥＰＯ２５ ３４５５で報告されているように、プラスミドｐＧＢ８６０中で構築した。ｐＧ Ｂ８６０中の因子■ＤＮＡは中央領域の６９５個のアミノ酸をコードするＤＮＡ を欠失している。

発現ベク９−　ｐＣＬＢ２０２はＰＣＢ８６０及びｐｃＬＢ２０１から誘導した ０両プラスミドをＫｐｎｌ及びＸｂａｌ制限酵素で消化し、ｐｃＧ８６０由来の ３．１　ｋｂ　Ｋｐｎｌ−Ｘｂａｌ断片を、ｐＣＬＢ２０１由来の７　ｋｂ　Ｘ ｐｎｌ−Ｘｂａｌ断片とライゲーションした。

できたプラスミドｐｃＬＢ２０２は本来のＫｐｎｌ及びＸｂａ１部位を有する。

この構造を第３ｅ図に示した。

（例３） （ｐｃＬＢ２０３の構築） （Ａ）　ＰＣＬＢ　１００ ｐＣＬＢ８９由来の５ａｉｌ−Ｈｐａｌ　７４４０　ｂｐ断片（第２図参照）を 、５ａｌｌ及び３ａａｌで切断したプラスミドｐＳＰ６４（メルトン（Ｍｅｌｔ ｏｎ　）等、ヌクレイツク・アシフズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ 　Ｒｅｓ、　）（１９８４）１主、７０３５−７０５６）に挿入した。生成した プラスミドｐｃＬＢ１００は、本来の５ａｌＩ部位及びＳ■ａｌ末端に結合した Ｈｐａ末端を含んでいる。

（Ｂ）ｐｃＬＢｌｏｌ　（力ンコ内の数字は第１図のものと対応している） （１）プラスミドｐｃＬＢ１００をＫｐｎｌ及びＴｔｈｌｌｌｌで消化し、６３ １ｂｐの断片Ｋｐｎｌ　（１８１７）　−Ｔｔｈｌ　１１１（２４４７）を生成 した。この６３１ｂｐ断片を精製した後、Ｍａｅｌｌ＋で切断しく２１９９）　 、そのＭａｅｌ［ｌ粘着末端を充填して、３８３ｂｐの断片を作した。

（２）プラスミドｐｃＬＢ１００をＡｐａＩ及びＢａｎ１で消化し、６６９ｋｐ のＡｐａｌ　（６２００）　−Ｂａｎｌ　（５５３２）断片を単離した。

（３）プラスミドｐｃＬＢ１００をＨｇ１ＡＩで消化し、６３４ｂｐのＨｇ１Ａ Ｉ断片を作った。この断片を７４ＤＮＡポリメラーゼとインキュベートし平滑末 端とし、さらにＢａｎ１で消化し、５６５ｂｐの断片を作った。

＋４１　プラスミドｐｃＬＢ１００をＡｐａＩ及びＫｐｎＩで消化し、大腸菌に おける維持及び増殖のために必要なベクター配列を含む５．９ｋｂ長の断片（Ａ ｐａｌ　（６２００）　−Ｋｐｎｌ　（１８１７））を生成した。

（５）ステップ＋１１から（４）までで得た断片を精製し、ついで、これら断片 各等モル量と、１０倍モル量のＭｌｕｌリンカ−（ＣＣＡＣＧＣＧＴＧＧ）をラ イゲーションして、プラスミドＰＣＬＢＩＯＩを生成した。

プラスミドｐｃＬＢ１０１は、Ｋｐｎｌ、ＢａｎＴ及びＡｐａ１部位に加えて、 Ｍａｅｍ及びＨｇｌＡｌ部位の間にＭｌｕ＋リンカ−を含んでいる。アミノ酸Ｄ −７１２及びＱ−１６３８（第１図）の間の余分の４個のアミノａ　（Ｐ−Ｒ− Ｖ−Ａ）を３ｆ図に示す。

（Ｃ）ｐｃＬＢ２０３ ｐｃＬＢｌｏｌ及びｐｃＬＢ２０１を酵素Ｋｐｎｌ及びＸｂａｌで消化した。ｐ ＣＬＢ由来の２．４　ｋｂ　Ｋｐｎｌ−Ｘｂａｌ断片をｐＣＬＢ２００由来の７ ．０　ｋｂ　Ｋｐｎｌ　Ｘｂａ＋断片とライゲーションした。

生じたプラスミドｐｃＬＢ２０３は本来のＫｐｎＩ及びＸｂａ１部位を含んでい る。その構造を第３ｆ図に示す。

（例４） （ｐｃＬＢ２１２の構築） ｐｃＬＢ２１２を、クレイマー（Ｋｒａｗｈｅｒ　）等によって報告されている ループ・アウト突然変異誘発技術を用いて（（１９８４）ヌクレイツク・アシフ ズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　）上２，９４４１−９ ４５６）構築した。因子■ｃＤＮＡの中央領域の欠失突然変異誘発には、次に示 すオリゴヌクレオチドを用い、プライマー■ ３′　丁τＣ，ＣＡＡ、ＡＧＡ、ＴＣＡ、ＡＣＡ、ＣＴＧ、ＣＴＴ、ＴＴＧ、Ｇ ＧＴ、ＧＧＴ、ＣＡＧ、ＡＡＣ５’アミノ１３Ｌｙｓ−７１３から５ｅｔ−１６ ３７までをコードする配列の因子■ｃＤＮＡ内部欠失をおこした。

これに対応するタンパク質は、全長因子■タンパク質と比較して、９２５個のア ミノ酸残基の内部欠失を含んでいる。

ループ・アウト突然変異誘発のための目標断片を得るため、ｐｃＬＢ２０３（例 ３）由来のＨｉｎｄ　ｍ−Ｐｓｔｌ断片（１，４ｋｂ）を選択した＊　Ｈａｎｄ 　Ｉ［１部位のヌクレオチド位置（第１図）は修正される領域の上流である全長 因子■配列中の１０２５番のところであり、またＰｓｔ１部位は、その領域の下 流の部位５１６５番である。これらの部位を第２図に示す。この１．４ｋｂの断 片をＭ１３１ｍｐ９にサブクローンし、つづいてループアウト突然変異誘発を行 った。端書に欠失を起こした断片を選択後、次のステップに従がい、粘着性で、 唯一の制限酵素末端をもつ断片を作ることにより（第１凹の番号に準する）適当 な発現ベクター中に望ましい欠失を含む、Ｈｉｎｄ　ｍ　Ｐｓｔｌ断片のＫｐｎ 　Ｔ　−Ｐｓｔ　１部分を挿入する。

ステップ１．変異体因子４分子の発現のため、新しいプラスミドｐｃＬＢ２１１ を構築した。ｐＣＬ８８９由来の７４４０　ｂｐの５ａｌｌ　Ｈｐａｌ断片（第 １図）を、ホ乳類細胞中の後期ＳＶ４０プロモーターからの転写を可能とする発 現ベクターｐＳＶＬ（スウェーデン、アブサラ、ファルマシア社、１ｍ２７−４ ５０９−０１）に挿入した。このプラスミドｐＳＶＬをＸｈｏｌ及びＳ＠ａｌで 消化し、これら酵素の双方の５′突出末端は同一なので、生したプラスミドｐＣ ＬＢ２１１は、５ａｌｌ末端に結合したＸｈｏ＋末端及び）！ｐａｌ末端に結合 したＳｍａｌ末端を含んでいる。

ステップ乙　プラスミドｐＣＬＢ２１１をＡｐａＩ及び５ａ１１で消化し、１． ４ｋｂのＡｐａｌ　（６２００）−５ａｌｌ　（ｐｃＬＢ２１１のｐＳＶＬ部分 中部分−存在する）断片を単離した。

ステップ３．プラスミドｐｃＬＢ１００をＮｄｅｌ、Ｐｓｔｌ及びＡｐａＩで消 化し、２つの断片、３６３　ｂｐ　（７）Ｐｓｔｌ　（５１６５）−Ｎｄｅｌ　 （５５２７）断片及び６７４ｂｐのＮｄｅｌ　（５５２７）−Ａｐａｌ　（６２ ００）を単離した。

ステップ４．プラスミドｐｃＬＢ１００をＫｐｎｌ及び５ａｃｌで消化し、１７ ９９ｂｐのＫｐｎｌ　（１８１７）　−３ａｃｌ　（１９）を単離した。

ステップ５．プラスミドｐｃＬＢ２１１を５ａｉｌ及び５ａｃＩで消化し、４． ５ｋｐのＳｍ口　（ｐＳＶＬベクター中唯−存在する）−３ａｃＩ　（１９）断 片を得た。

ステップ６、配列分析で確認された望ましい欠失をもつＨ４ｎｄｍ　（１０２５ ）−Ｐｓｔｌ　（５１６５）断片を含むＭ１３バクテリオファージをＫｐｎｌ及 びＰｓｔｌで消化し、５８４ｂｐのＰｓｔｌ（５１６５）　Ｋｐｎｌ　（１８１ ９）断片を単離した。

ステップ７、ステップ２からステップ６までで単離した断片を各々等モル量混合 し、ラゲーションした。６個全ての断片を含むプラスミドを単離した。このプラ スミドＰＣＬＢ２１２は代表的化合物３６（第■表）を発現した。この化合物は ＭｌｕＩリンカ−及び対応する４個のアミノ酸を欠いている点で化合物３　（第 ３ｆ図で説明されている）と異なっている。

（例５） ｐＣＬＢ２０８、ｐＣＬＢ２０９及びｐｃＬＢ２１０の構築クレイマー（Ｋｒａ ｗｎｅｒ　）等によって報告されているループアウト突然変異誘発技術（ヌクレ イツク・アシンズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　）（１ ９８４）１主、９４４１−９４５６）を用いて、ｐｃＬＢ２０８、ｐｃＬＢ２０ ９及びｐｃＬＢ２１０を構築した。

（ａ）　ループアウト突然変異誘発 因子■ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａの中央領域の欠失突然変異は次に示すオリゴヌクレオチド を用いて行ない、 プライマー１＝ ３　’　ＴＴＡ、ＣＧＧ、Ｔ為Ａ、Ｃ７丁、Ｃ０丁、ＴＣＴ、ＣＴＴ、ＴＡＴ、 ＴＧＡ、ＧＣＡ、ＴＧＡ、丁ＧＡ５’プライマーＩＩ： ３′　丁ＴＡ、ＣＧＧ、ＴＡＡ、ＣＴＴ、ＧＧＴ、ＴＣＴ、ＡＧＴ、ＣＡＡ、Ｃ ７丁、ＴＡＣ，ＴＴＣ，丁ＴＣ５’プライマー■： ３　’　ＴＴＡ、ＣＧＧ、ＴＡＡ、ＣＴＴ、Ｃ０丁、ＴＣＴ、ＴＣＧ、ＡＡＡ、 ＧＴＴ、ＴＴＣ，ＴＴＴ、丁ＧＴ　５　’因子■ｅＤＮＡ中、アミノ１ｆｉｓ− ７４１がらＲ１６４Ｂ　（ブライ？−１）Ｓ−７４１から１−１６６８　（ブラ イ？−１１）及びＳ−７４１からＲ−１６８９（プライマー■）をコードする配 列の内部欠失を起こした。対応するタンパク質は各々、９０８個（１）、９２８ 個（ＩＩ）及び９４９個（Ｉｌｌ）のアミノ酸残基の内部欠失を含んでいる。

Ｑ））　標的断片の調製 ループアウト突然変異誘発のための標的断片を得るため、ｐｃＬＢ１０１由来の ０．８ｋｐの断片を以下のように構築した。

プラスミドｐＣＬＢＩＯＩをＥｃｏＲＴで消化し、そのＥｃｏＲ１部位を充填し てからさらにＫｐｎｌでの消化を行った。４７９ｂｐのＫｐｎｌ　（１８１９） 　−ＥｃｏＲＩ　（２２９７）断片（ヌクレオチド位置の番号は第１図で示した もの）を単離した。プラスミドｐｃＬＢ１０１をＢａｍＨｌで消化した。その粘 着末端を充填しさらにＰｓｔｌで消化した。４１６ｂｐのＢａｍＨＩ　（４７４ ９）−Ｐｓｔｌ　（５１６５）断片を単離した。これらの断片を等モル量づつラ イゲーションし、Ｍ１３ｍｐ１９マンバーにサブクローンした。

修正する領域の上流１８１９番からその領域の下流５１６５番までに、８９５ｂ ｐのＫｐｎｌ　Ｐｓｔｌ断片を含み、かつ、因子■コード配列中に大きな欠失を もつＭ１３バタテリオファージをループアウト突然変異誘発のために選択した。

バクテリオファージＭ１３中プライマー１、■又はｍで得られた精密な欠失をも つ断片を選択した後、望ましい欠失を含むＫｐｎｌ　Ｐｓｔｌ断片を、次に示す ステ、ブを用い、粘着性の唯一の制限酵素末端をもつ断片を作るｐｃＬ８２１１ 由来の適当な発現ベクター（例４参照）中に挿入した（番号は第１図に準する） 。

ｉｌ＋　プラスミドｐＣＬＢ２１１をＡｐａｌ及び５ａｌｌで消化し、１．４　 ｋｐ　Ａｐａｌ　（６２００）　−３ａｌｌ　（ｐｃＬＢ２１１のｐｓｖＬ部分 に唯一存在する）断片を単離した。

ｆ２）　Ｎｄｅｌ、Ｐｓｔｌ及びＡｐａｌで消化したプラスミドｐＣＬＢ１００ から、３６３ｂｐのＰｓｔｌ（５１６５）　Ｎｄｅｌ（５５２’、）断片及び６ ７４ｂｐのＮｄｅｌ　（５５２７）　−Ａｐａｌ　（６２００）断片を単離した 。

（３）プラスミドｐｃＬＢ１００をＫｐｎｌ及び５ａｃｌで消化し、１７９９ｂ ｐのＫｐｎｌ　（１８１７）　−５ａｃｌ　（１９）断片を単離した。

（４）プラスミドｐｃＬＢ２１１を５ａｉｌ及び５ａｃｌで消化し、４．５ｋｂ の５ａｌｌ　（ｐｓＶＬベクター中唯−存在する）　−３ａｃ１（１９）断片を 単離した。

（５）望ましい突然変異をもつ断片を含むバタテリオファージＭ１３のＤＮＡを １（ｐｎｌ及びＰｓｔｌで消化し、望ましい突然変異を含むＫｐｎ　Ｉ　−Ｐｓ ｔ　Ｉ断片を三つ全ての突然変異誘発用として単離した。

（６）上記＋１１〜（６）の６個の断片を隼離し、等モル混合しライゲーション した。全ての望ましい断片を含むプラスミドをハイブリダイゼーシヲン及び制限 酵素消化によって選択した。上に示したプライマーＩ、■、■を用い、三つの新 しい発現ベクターを、第１表に示した代表的化合物の発現のために構築した。

１、　プライマー■を用いて、化合物７用にｐｃＬ８２０８．２、　プライマー ■を用いて、化合物８用にｐｃＬＢ２０９．３、　プライマー■を用いて、化合 物９用にｐＣＬＢ２１０゜（例６） 組換え因子■ＤＮＡの一時的発現及び生産されたタンパク質の検定 Ａ、　ＣＯ５−１のトランスフェクション及び代謝的ラベル化先の例に従って得 た発現ベクターを、ＤＥＡＥトランスフェクション技術を用いて、ＣＯ３−１に 導入した。ベクターＤＮＡを２時間、ＤＥＡＥ−デキストランとインキュベーシ ョンすることによって沈殿させ、ついでロバタ等（ヌクレイツク・アシンズ・リ サーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　）１主、５７０７　（１９８ ４））及び、ルスマン及びマグヌソン（Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ　）　（ヌクレイツ ク・アシソズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｊｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　）（１９８ ３）土工、１２９５）によって報告されているように、２時間のクロロキン・シ ョック処理を行った。ＣＯ５−１細胞の増殖及びならし培地で用いる培地には、 １０％（ｖ／ν）の熱失活化ウシ胎児血清（フロー社）を補ったイスコブＤＭＥ Ｍ　（フロー社）を用いた。この培地を４８時間後に収穫した。

トランスフェクトした細胞中のタンパク質の代謝的ラベル化は無血清ＲＰＭＩ培 地を用いて行った（ギプコ社）、トランスフェクションから２日後、トランスフ ェクシントを４時間、５０μＣｉ／ｍＡのＬ−″ＳＳ−メチオニン（アマ−ジャ ム、１９８５．３７０Ｍ　Ｂｅｑ／３３０ｕＥ１比活性１００　Ｃｉ　／ｓ　Ｍ ｏｌｅ以上）とインキュベーションし、その後そのならし培地を収穫した。タン パク質の分解を抑制するため、フェニルメタンスルホニルフルオライド（ＰＭＳ Ｆ）のようなプロテアーゼ・インヒビターを収穫後のならし培地に加えた。タン パク質のグルコシル化を阻止するため、ならし培地にタニカマイシンを添加した （最終濃度０．００１■／＋ｒ＋１）、）ランスフェクション後４日目にならし 培地を収穫し、生産されたタンパク質を検定した。

８０組換え因子■の生物学的活性 ＋１１標準凝集又は凝血検定法及び（２）発色活性検定法（カビコアテスト（Ｋ ａｂｉ　Ｃｏａｔｅｓｔ　）　）を用いて因子■活性をこのならし培地について 検定した。

標準凝集又は凝血検定法（いわゆる活性化部分トロンボプラスチン時間）は、ベ ルドカンプ（Ｖｅｌｄｋａａｐ　）等（トロンボ・ジアス・ヘモル（Ｔｈｒｏｓ ＋ｂ、　Ｄｉａｔｈ、　Ｈａｅ＋５ｏｒｒｈ　）　（１９６Ｂ　）　％１主、２ ７９）によって報告されているヘモフイリア・プラズマを用いて行った。ならし 培地は試験前にクエン酸化した。

発色活性検定又はカビ・コーチスト検定法は、記述しである全ての容積を４分の １にし、２５μにのならし培地をテストした以外は、製造業者カビービトラム（ Ｋａｂｉ−νｉｔｒｕｍ　）によって示されている操作に従って行った。因子■ 様タンパク質を１５分間活性化し、その時点で発色基質（Ｓ　２２２２）を加え た。

因子■活性の阻害は、標準ベセスダプロトコールに従って測定した（キャスバ− （Ｋａｓｐｅｒ　）等、トロンボ・ジアス・ヘモル（丁ｈｒｏｍｂ、Ｄｉａｔｈ 、Ｈａｅｍｏｒｒｈ　）　（１９７５）　、　３　４　、８６９−８７１）、使 用するイムノグロブリンは、使用前にイオン交換及びプロティンＡセファロース クロマトグラフィーで精製した。

因子■の生物学的活性検定用の標準物質は、ミリリンドル当り１ユニツトの因子 ■活性又は抗原を含むことが分っているクエン酸化した血漿である（最１ｔ１度 ０．５ｍＭ）。

種々の欠失タンパク質の生物学的活性を第ｎ表に示す、欠失をもつ変異体タンパ ク質は、因子■凝血活性を示した。

さらに、この組換えタンパク質溶液の明確となった活性は、インヒビターをもつ 患者から得られた血漿由来の因子■活性そして、またはいわゆるインヒビター・ 血清のインヒビターであることが分っている抗体、すなわち、患者の血液中の因 子■に対する抗体の添加後に、阻害されるようであった。

Ｃ０因子■との免疫学的交叉反応性 （１１モノクローナル抗体の調製 凍結沈殿物のアガロースゲルロ過によって得た精製ヒト因子■−フォン・ウィル ブランド因子複合体又は医療目的で使用される因子■濃縮物でＢａ１ｂ／Ｃマウ スを免疫化した（オランダ、アムステルダム、オランダ・レッド・クロス・〕゛ ラランドランスフエージ雪ン・サービスのセントラル・ラボラトリ−）、ヴアン ・モリク（Ｖａｎ　Ｍｏｕｒｉｋ　）とモクター（Ｍｏｃｈｔａｒ　）、バイオ ヒム・バイオフィズ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ ＋　）　２２土、６７７−６７９　（１９７０）、リンパ細胞ハイブリダイゼー シジンは、ガルフレ（Ｇａ１ｆｒｅ　）等の方法で行った（ネイチャー（Ｎａｔ ｕｒｅ）　、２６６．５５０−５５２）、因子■に対するモノクローナル抗体を 生産するクローンの選択に用いた技術の説明は別に報告されている（ステル（Ｓ ｔｅｍ）、１９８４、博士論文、オランダ、アムステルダム大学）、因子■に対 するモノクローナル抗体は、ヨーロッパ特許出＠ＥＰＯ２５３４５５で報告され ているよウニ、因子■ポリペプチドとそれらとの反応性に従がって同定した。

（２）因子■ポリペプチドに対するポリクローナル抗体ウサギを、クロマトグラ フィーで精製した因子■調製物を用いた標準操作で免疫化した（ステル（５ｔｅ ｌ　）上述）、このようにして得た抗体を、精製したポリペプチド又は精製した 因子■−フォン・ウィルブランド因子を用い、ヨーロッパ特許出願ＥＰ０２５３ ４５５に報告されているイムノブロッティングにより同定した。この抗体をポリ アクリルアミドゲル電気泳動によって単離し、ついで標的タンパク質としてニト ロセルロースシートに転移した。三種のポリクローナル抗血清が得られた。　Ｒ Ｈ６３２７１、ＲＨ６３２７２及びＲＨ６３２７５，この抗血清は、８０ｋＤａ の二重バンド、９２ｋＤａのポリペプチド及び大きい方のポリペプチドと反応し た。またこれらの抗血清は、因子■の小さい方の断片とも反応した。

（３）　イライザ法（ＥＬＩＳＡ） 新しく開発されたイライザ法（酵素結合免疫吸着検定法）を用いて、ならし培地 中の因子■抗原を検出した。このイライザプレートに、０．０５Ｍ炭酸バンファ （ｐＨ９，８）中の因子■特異的モノクローナル抗体ＣＬＢ、ＣＡｇＡ　（５■ ／ｌ）の適当な希釈物をウェル当り２００μＥ加えることによりコーティングし た。このプレートをシールし、４℃で一晩インキニベーションした。全てのイン キュベーシヨンの間、このプレートを０．０５％トウィーン２０を含むＰＢＳで ３回洗浄し、それを少なくとも一分間放置しておいた。

テストサンプル又は正常な血漿の一連の希釈物を二つづつウェル中にピペットで 入れた（ウェル当り２００μｍ）、このプレートをシールし、撹拌することなし に、３７℃で２時間インキュベーションし、その後、上述のように洗浄した。抗 原の希釈用に、５０ｓＭ）リス・Ｈ（ｌバッファ、２％ウシ血清アルブミン及び １、０　Ｍ塩化ナトリウム（ｐＨ７，４）を含むバンファを用いた。

ＣＬＢ−ＣＡｇ　１１７−ホースラデイシユ・パーオキシダーゼ結合体’ｆｒ、 ５０　ｍＭ　トリス・ＨＣｆバンファ；０．２％トウイーン２０及び】、０Ｍ塩 化ナトリウム（ｐＨ７，４）を含むバンファで約１００００倍（必要とされる活 性に依存）に希釈した。この希釈物のうち２００μｌを各ウェルに加え、このプ レートをシールして、暗所、３７℃で２時間インキュベートした。

上述のように、このプレートを洗浄後、０．１　Ｍ酢酸塩／クエン酸バフファ　 （ｐＨ５，５）中のテトラメチルベンジン（ＴＭＢ）（０，１ｇ／ｌ）及び過酸 化水素（０，００６％）の新しく調製した溶液１５０μｉを各ウェルに加えた。

このプレートを暗所、室温で３０分間インキニベーションした。この酵素反応を 、２Ｎｇｍ１５０μｌの添加で停止させた。吸光度をイライザマイクロリーター を用い、４５０ｎｍで測定した。第ｎ表に示したように、培地中の因子■タンパ ク質量の増加とほぼ比例する、ｗＥ続的ならし培地の因子■活性の増加があった 。

Ｄ、　サイズ測定 生産した因子■タンパク質のサイズは、次に示すゲル電気泳動によって決定した 。

血漿由来の因子■に対して生成させたモノクローナル及びポリクローナル抗体を 、免疫沈殿法に用いた。この抗体をプロティンＡセファロース上に固定しく１０ ■プロティンＡセファロース当り１５μｌの血清）、その後、代謝的にラベル化 した組換え因子■様化合物とインキユベートした。この固定化組換えタンパク質 を、１０％ベータ・メルカプトエタノールを用いて還元した後、５％ポリアクリ ルアミドＳＤＳゲル電気泳動システム（レムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）、ネイチ＋− （Ｎａｔｕｒｅ）　（１９７２）　２２７．６８０−６８５）で分離した。第４ 図及び第ｍ表に示したように、この組換え因子■様タンパク質は、グリコジル化 したタンパク質に期待されるサイズであった。小さい方のバンドもコントロール レーン中に存在した。

第■表に示されている結果に基づき、本発明の組換え因子■様タンパク質は、ア スパラギン結合グリコジル化のインヒビターとして知られている、タニカマイシ ンを含む培地と含まない培地中で形成されたタンパク質のサイズに有意な差があ ることから、グリコジル化されていると結論することができる。

（例　７） 因子■活性を有するタンパク質を生産する安定な細胞系列の構築 Ａ、ＣＨＯ細胞における発現 リン酸カルシウム沈殿技術（グラハム（Ｇｒａｈａｍ）及びファン・デルーｘブ （Ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ）　、ピロｃｔジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）＜１９７３） 　５２．４５６−４６７）を用い、プラスミドｐｃＬＢ２０３　（１０μｇ）及 びｐＡｄＤ２６ＳＶ　（Ａ）−３＜１ｔ−ｔｇ、コラツマ７　（Ｋａｕｆｍａｎ ）と、シャープ（Ｓｈａｒｐ）、モレキュラー、アンド　セル・バイオロジー（ Ｍｏ１．　Ｃｅ１ｌ、　Ｂｉｏｌ）　（１９８２）　２．　１３０４−１３１９ ）を、ｄｒｆｒ−欠失ＣＨＯ細胞（チェイン：／　（（：ｈａｓｉｎ）及びアー ローブ（Ｕｒｌａｕｂ）、プロシーディング・イン・ナショナル・アカデミ−・ オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、　Ａｃａｃｔ、　Ｓｃｉ、）Ｕ　Ｓ　 Ａ、　（１９８０）　７７．４２１６−４２２０）中に導入した。因子■及びｄ ｈｆｒコード配列の増巾は、コウフマン（Ｋａｕｆｍａｎ）及びシャープ（Ｓｈ ａｒｐ）によって報告されているように（ジャーナル・オブ・モレキュラー・バ イオロジー（ＪｌＭｏｌ、　Ｂｉｏｌ、）　（１９８２）　１５９．６０１−６ ２１）、メトトレキセートを徐々に濃度を上げつつ、段階的に添加することによ って行った。　２００ｎＭのｍｔｘに耐性の各トランスホーマントをつり上げ、 安定な細胞系列であると確定した。これら細胞系列のいくつかは、培養培地ｌＴ ｌ１当り、約７５ｍＵの因子■活性を生産した。この培養培地中に分泌された因 子■活性の量は、濃度を高くしたｍｔｘを用いて、さらに因子■コード配列を増 巾することによって、より高めることができた。

Ｂ、Ｃ１２７細胞における発現 上述したように、発現ベクターを真核細胞に導入すると、それらは宿主細胞のゲ ノムに組込まれる。つづいて、その発現カセットが増巾される。発現ベクターの 組込の代用物にはエビソームととしての安定な維持がある。後者の例は、エピソ ームＢＰＶ−システムを用いた“変異体”因子■タンパク質の１つの発現である （ハウレー（Ｈｏ１１１１ｅｙ）等、メソラス・イン・エンザイモロジーＢＰＶ −１ゲノム（Ｂａ＋１１８１切断したもの）をＢａｎ＋８１の両部位上にＸｈｏ ＩＲ位を含む、ＰＴＺ１８Ｒ（ファルマシア）のＢａｍＨＩ切断誘導体に導入し た。つづいて、生じたｐＴＺ　Ｘ　−ＢＰＶプラスミドをＸｈｏｌで切断し、Ｘ ｈｏＩ突出末端をもつ２．９ｋｂ　ｐ”ｒｚ断片及びｇｋｂＢＰＶ断片を得た。

後者の断片を、唯一の５ａ１１部位で切断したプラスミドｐｃＬＢ２１２にライ ゲーションした（本来のｐＳＶＬベクターの位置２０４０番）。生じたプラスミ ドベクターｐｃＢ８８１はＳＶ４０の後期プロモーター、（主にＢドメインの） ２７７５ｂｐを欠く因子■ｃＤＮＡコード配列及びＳＶ４０の後期ポリアゾニレ −ジョンシグナルを含む。ＢＰＶ−ゲノムの存在のため、このベクターは、マウ スの０１２７細胞のような適当な宿主細胞中エピソームとして維持される。プラ スミドｐＵ８８８１（１０μｇ）を、リン酸カルシウム沈殿技術を用い、Ｃ１２ ７細胞中にトランスフェクトした（グラハム（Ｇｒａｈａｍ）及びファン・デレ ーｘブ（Ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ）上述）。

トランスフェクションから１４日後、フォーカスを単離につづいて、安定な細胞 系列を確保した。いくつかの細胞系列は、培養培地ｍｌ当り４０ｍＵの因子■活 性を生産した。

（例　８） （ｐｃＬＢ２０４の構築） クレーマー（Ｋｒａｎ＋ｅｒ　）等（１９８４）によって報告された、ループア ウト突然変異誘発技術を用いて、ｐｃＬＢ２０４を構築した（一般的方法２参照 ）。因子■ｃＤＮＡの中央領域の欠失突然変異は、次のオリゴヌクレオチドを用 いて行ない、プライマー■ ３’　ＴＡＧ、　ＧＴＴ、　ＴＡＡ、　ＧＣＧ、　ＡＧＴ、　ＣＡＡ、　ＧＴＴ 、　ＴＴＧ、　ＧＧＴ、　ＧＧＴ、　ＣＡＧ、　ＡＡＣ５’アミノ酸Ａｈａ−３ ７５から５ｅｒ−１６３７をコードする配列の、因子■ｃＤＮＡ内部欠失を生じ させた。

対応するタンパク質は、１２６３個のアミノ酸の内部欠失を含んでいる。

ループアウト突然変異誘発の標的断片を得るため、ｐＣＬＢ２０３（例３）由来 の１．４ｋｂのＨｉｎｄ　ＩＩＩ−Ｐｓｔｌ断片を選択した。ＨｉｎｄｌＩ［部 位のヌクレオチド位置く第１図）は修正する領域の上流にある、全因子■配列に おける１０２５番である。またＰｓｔＩ部位は、その領域の下流５１６５番の位 置にある。これらの部位を第２図に示した。この１．４ｋｂの断片をＭ１３ｍｐ ９にサブクローンし、ループアウト突然変異誘発を行った。バタテリオファージ Ｍ１３において、プライマーＶを用いて得られた精密な欠失を含む断片を選択し た後、望ましい欠失を含むＨｉｎｄｌＩＩ−Ｐｓｔｌ断片を、次に示すステップ を用い、粘着性で唯一の制限酵素末端（番号に第１図に示す）を作って、ｐＣＬ Ｂ２０１由来の適当な発現ベクター中に挿入した。

ステップ１．プラスミドｐＣＬＢ２０１をＡＶａ＋及びＸｂａＩで消化し、約６ 　ｋｂのベクター断片−Ａｖａｌ　（７３７）　−ＸｂａＩ（６９５１）−を作 った。

ステップ２．　Ａｖａｌ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化することによりプラスミドｐ ｃＬＢ２０１から２８９ｂＰ長の断片を得る。：Ａｖａｌ（７３７）　−Ｈｌｎ ｄ　ＩＩＩ　（１０２５＞。

ステラ７”３．　ＰｓｔＪ及びＮｄｅｌで消化することにより、プラスミドｐｃ ＬＢ２０１から３６３ｂｐの断片−Ｐｓｔｌ　（５１６５）−Ｎｄｅｌ　（５５ ２７）−を得る。

ステラ７”４．　Ｎｄｅｌ及びＸｂａｌで消化することによりプラスミドＰＣＬ Ｂ２０１から１４２５ｂｐの断片−Ｎｄｅｌ　（５５２７）−Ｎｂａｌ　（６９ ５１）−を得る。

ステップ５．望ましい突然変異をもつ断片を含むＭ　１３バクテリオフアージを Ｈｉｎｄｌ］及びＰｓｔｌで消化する。

ステップ６、　この５個の断片を単離し、等モル量づつ混合しライゲーションし た。全ての断片をもつプラスミドを選択した。先に示したように、プライマー■ を用いて、第１表に示した代表的化合物の発現のための新しい発現ベクターを構 築した。すなわち、プライマー■を用いて化合物４を作るためにプラスミドＰＣ ＬＢ２０４を構築した。

本発明のＤＮＡ構築物及び方法は、因子■コンシェナーをコードする欠失変異体 遺伝子を宿主細胞に導入することにより、因子■活性をもつポリペプチドを作る 方法を提供している。本組成物は血友病Ａの症状の治療に使用しつる。

この明細書に示されている全ての刊行物及び特許出願は本発明が関与する分野の 専門家のレベルを対象に示されている。各刊行物又は特許出願が特別に、及び個 々に参考として引用されているのと同程度に、ここで示されている全ての刊行物 及び特許出願を参考として引用している。

これまでに本発明について十分説明してきたので、多くの変化や修正が、以下の 請求の範囲の精神又は範囲を逸脱することなしに行うことが可能であることは、 普通の当業者にとって明白であろう。

引　用　文　献 ブリンクハウスら（１９８５）　（Ｂｒｉｎｋｈｏｕｓ、　Ｍ、Ｍ、　ｅｔ　ａ ｌ、、（１９８５）Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ８２．　８ ７５２−８７５６）バルクら（１９８６）　（Ｂｕｒｋｅ、　Ｒ，Ｌ、　ｅｔａ ｌ、、（１９８６）Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｗ、２　６　１　、１　２　５　７　 ４　−　１　２　５　７　８　）カーターら（１９８５）　（Ｃａｒｔｅｒ、　 Ｐ、　ｅｔａｌ、、（１９８５）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１３ 　、４４３１　）カシンら（１９８０）　（Ｃｈａｓｉｎ、　Ｌ、　Ａ、　ａｎ ｄ　Ｌｌｒｌａｕｂ、　Ｇ、　（１９８０）Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓ ｃｉ、ＩＳＡ　７７、４２１６　４２２０）イートンら（１９８６ａ）　（Ｅａ ｔｏｎ、　Ｄ、　Ｌ、　ｅｔ　ａｌ、、（１９８６ａ）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ ｙ　２５．５０５−５１２）イートンら（１９８６ｂ）（Ｅａｔｏｎ、Ｄ、Ｌ、 ｅｔａｌ、、（１９８６ｂ）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２５．８３４３８３４ ７）フェイら（１９８６）（Ｆａｙ、Ｊ、Ｆ、ｅｔａｌ、、（１９８６）Ｂｊｏ ｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ　８−ヱーＬ、２６８−２７８）ガルフレ ら（１９７７）　（Ｇａｌｆｒｅ、　Ｇ、　ｅｔａｌ、、（１９７７）Ｎａｔｕ ｒｅ　２６６、５５０−５５２）グルズマン（１９８］）　（Ｇ］ｕｚｍａｎ、 　Ｙ、、（１９８１）Ｃｅｌｌ　２３．１７５−１８２） ゴーマン（１９８５）　（Ｇｏｒａ＋ａｎ、　Ｃ，、（１９８５）ＤＮＡ　ｅｌ ｏｎｉｎｇ（Ｅｄ、：　Ｄ、　Ｇｌｏｖｅｒ）＋ＩＲＬ−ｐｒｅｓｓ、　Ｗａｓ ｈｉｎｇｔｏｎ。

０ｘｆｏｒｄ、　ｐｐ、　１４３−１６９）グラハムら（１９７３）　（Ｇｒａ ｈａｍ、　Ｆ、　ａｎｄ　Ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｆｂ、　Ａ、（１９７３）Ｖｉｒｏ ｌｏｇｙ　５２．４５６４６７）ハナハン（１９８３）　（Ｈａｎａｈａｎ、　 Ｄｏ、（１９８３）Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　１６６、５５７−５８０）ホ ーリー、ザーハー及びＯ−（］　９８３　）　（Ｈｏｗｌｅｙ、　Ｐ、　Ｍ、、 ５ａｒｖｅｒ。

Ｎ、ａｎｄ　Ｌａｗ、Ｍ、Ｆ、（１９８３）Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、上皇 上、３８７−４０２）ハルピッら（１９８７）　（Ｈｕｒｗｉｔｚ、　Ｄ、　Ｒ ，、ｌｏｄｇｅｓ、　Ｒ，＋　Ｄｒｏｈａｎ。

Ｗ、ａｎｄ　５ａｒｖｅｒ、Ｈ，（１９８７）Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ 、１５　、　７１３７　７１５３　＞カスバーら（１９７５）　（ｌｉａｓｐｅ ｒ、　Ｃ，Ｌ　ｅｔａｌ、、　（１９７５）Ｔｈｒｏｍｂｓ、Ｄｉａｔｈ、Ｈａ ｅｍｏｒｒｈ、　３　４．　８　６　９　８　７　１）カウフマンら（１９８２ ）　（Ｋａｕｆｍａｎ、　Ｒ，Ｊ、　ａｎｄ　５ｈａｒｐ、　Ｐ、　Ａ。

Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、２．　１３０４　１３１９）カウフマンら（１９ ８２ａ　）　（Ｋａｕｆ＋ｎａｎ、　Ｒ，Ｊ、　ａｎｄ　５ｈａｒｐ、　Ｐ、　 Ａ。

（１９８２ａ） Ｊ、Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、１５９　、　６０　１−６２１　）コザフク（１９８ ３）　（Ｋｏｚａｋ、　Ｍ、　（１９８３）？１ｉｅｒｏｂｉｏ１．　Ｒｅｖ、 ±７．１−４５）クレイマーら（１９８４）　（Ｋｒａｍｅｒ、　Ｗ、　ｅｔａ ｌ、、（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１２　、　９４４ １　９４５６　）ラエムリ　（１９７０）　（Ｌａｅｍｍｌｉ、　Ｕ、　Ｌ、　 （１９７０）Ｎａｔｕｒｅ　２じ！７．６８０−６８５）ラスマンら（１９８３ ）　（Ｌｕｔｔ＋ｗ＋ａｎ、　Ｈ，ａｎｄ　Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ、　Ｇ、（１９ ８３）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１　１　、　１　２９５）マニ アナイス（１９８２）　（Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、　ｅｔａｌ、　（１９８２ ）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏ ｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）マクザムら（１９８０）　（Ｍａｘａｍ、　Ａ、　 Ｍ、　ａｎｄ　Ｇ１１ｂｅｒｔ、　１１．（１９８０）Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚ ｙｍｏｌ、６５．　４９９−５６０）メルトンら（１９８４）　（Ｍｅｌｔｏｎ 、　Ｄ、　Ａ、　ｅｔａｌ、、　（１９８４）マリガンら（１９８１）　（Ｍｕ ｌｌｉｇａｎ、　Ｒ，ａｎｄ　Ｂｅｒｇ、　Ｐ、　（１９８１）Ｐｒｏｃ、　Ｎ ａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、７８．　２０７２）サンガーら（１ ９７７）　（Ｓａｎｇｅｒ、　Ｆ、　ｅｔａｌ、、（１９７７）Ｐｒｏｃ、　Ｎ ａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　７４．　５４６ｊ　５４６７）ステル （１９８４）　（Ｓｔｅｌ、　Ｈ，ν、（１９８４）Ｐｈ、Ｄ、ｔｈｅｓｉｓ、 Ｌｌｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、Ｔｈｅ　Ｎｅｔｈｅｒｌ ａｎｄｓ）トーレら（１９８６）　（Ｔｏｏｌｅ、　Ｊ、　Ｔ、、　ｅｔａｌ、 、　（１９８６）Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ｌ！ＳＡ　 ８３．　５９３９　５９４２）パンモウリクら（１９７０）（νａｎ　Ｍｏｕｒ ｉｋ、　Ｊ、　Ａ、　ａｎｄ　Ｍｏｃｈｔａｒ。

Ｊ、Ａ、、（１９７０） Ｂｉｏｃｈｉｓ＋、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ　２２１　、　６７７　６７９　 ）パンシネベルトら（１９８６）（νａｎ　Ｚｏｎｎｅｖｅｌｄ、　Ａ、　Ｊ、 、　ｅｔ　ａｌ、。

フェアーら（１９８４）　（Ｖｅｈａｒ、　Ｇ、　Ａ、、　ｅｔａｌ、、　（１ ９８４）Ｎａｔｕｒｅ　３１２．　３３７−３４２）ベルドカンブら（１９６８ ）（〜’ｅｌｄｋａｍｐ、　Ｊ、　Ｊ、　ｅｔ　ａｌ、、（１９６８）Ｔｔ＋ｒ ｏｍｂ、Ｄｉａｔｈｅｓ　Ｈａｅｍｏｒｒｈ、１９．　２７９）ウッドら（１９ ８４）　（Ｗｏｏｄ、　Ｗ、　１．　ｅｔａｌ、、　（１９８４）％ａｔｕｒｅ 　３１２．３３０−３３７）ヤニンーペロンら（１９８５）　（Ｙａｎｉｓｃｈ −Ｐｅｒｒｏｎ、　Ｃ，ｅｔ　ａ！、＋表１ 欠損変異体因子■タンパク質 化合物　Ｎａ　−Ｄｅｌ、　Ｌ、＠　’Ｄｅ１．　Ｃｍ　”Ｄｅｌ、　ベクター １、　Ａ−１＝Ｒ−７４００Ｓ−７４１−５−１６３７００４６３８−Ｙ−２３ ３２０ｐｃＬＢ２０１２、　Ａ−１−Ｒ−７４００Ｓ−７４１→Ａ−８６７＋Ｄ −１５６３→５１３６７６９５　Ｑ−１６３８−Ｙ−２３３２０ｐｃＬＢ２０２ ３、　Ａ−１−Ｄ−７１２２８Ｐ−Ｒ−シーＡ　８９７　Ｑ−１６３８−＝Ｙ− ２３３２０ｐｃＬＢ２０３３ｂ、　Ａ−１−＝Ｄ−７１２２８　Ｐｅｐｔｉｄｅ ｂｏｎｄ　８９７Ｑ−１６３８−Ｙ−２３３２０ｐｃＬＢ２１２４、＾−１→Ｖ −３７４３６６　Ｐｅｐｔｉｄｅｂｏｎｄ　８９７　Ｑ−１６３８＝Ｙ−２３３ ２０ｐｃＬＢ２０４７、　Ａ−１−＝Ｒ−７４０　０　Ｐｅｐｔｉｄｅｂｏｎｄ 　８９７　Ｅ−１６４９＝Ｙ−２３３２１１ｐｃＬＢ２０８８、　Ａ４−”Ｒ− ７４００Ｐｅｐｔｉｄｅｂｏｎｄ　８９７　Ｓ−１６６９−Ｙ−２３３２３１ｐ ｃＬＢ２０９９、　Ａ−１＝Ｒ−７４００Ｐｅｐｔｉｄｅｂｏｎｄ　８９７　Ｓ −１６９０−Ｙ−２３３２５２ｐｃＬＢ２１０＝　因子■アミノ酸の連続した配 列を意味する。

＊　全因子■と比較して、各領域内の欠失アミノ酸の数を、“Ｄｅｌ”を伴う各 欄にリストした。アミノ酸の番号付けは第１図のものを使用している。

表　■：因子■活性及びタンパク質量 １　２３３２　（０）　１．０　−６）　−”　−”　＜５ｍＵ２　１６３７　 （６９５）　６．７　２　＜１％　〈１％　７ｍＵ３　１４１１　（９，２５） 　１７．３　５　＜２％　く１％　２０ｍ１１３ｂ　１４０７　＜９２５）　１ ５．０　ＮＤ”　ＮＤ”　ＮＤ”　２０ｍ１１４　１０６９（１２６３）　０　 ０　０　０　２０ｍＵ７　１４２４（９０８）　１５．０　ＮＤ　ＮＤ　Ｎｉ１ 　Ｎ１０８　１４０４（９２ｇ）　１５．０　１ｔＤ　ＮＤ　ＮＯＮＤ９　１３ ８３（９４９）　ＯＮＤ　ＮＤ　ＮＤ　ＮＤｍｏｃｋ　（ｐＳν２）００ １）第１表参照　２）発色検定法（カビツーテスト）に従がう３）標準凝血検定 法　４）ＣＬＢ、ＣＡｇＡ、因子■に対する抗体（５ｔｅ１．　Ｐｈ、Ｄ、Ｔｈ ｅｓｉｓ、Ｌｌｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、　ＴｈｅＮｅ ｔｈｅｒｌａｎｄｓ、　１９８４　）５）患者Ｊの血清由来のインヒビター ６）失活と判別するには初期活性が低すぎるもの。

７）　４８時間インキュベーション後のならし培地。因子■１ユニットは１１０ ０ｎの因子■タンパク質に相当する。

８）酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）；　９）　ＮＤ−測定せず表　■１ 分泌因子■タンパク質のサイズ２　ｐｃＬＢ２０２　１６３７　６９５　１８８ ｋＤａ　１９２ｋＤａ　１８５ｋＤａ３　ｐｃＬＢ２０３　１４１１　９２５　 １６２ｋＤａ　１６８ｋＤａ　１５８ｋＤａ３ｂ　ｐｃＬＢ２１２　１４０７　 ９２５　１６２ｋＤａ　１６８ｋＤａ４　ｐｃＬＢ２０４　１０６９　１２６３ 　１２３ｋＤａ　１３５ｋＤａ１）第１表参照。

２）　長さは、発勇ベクターの因子■コード配列中のアミノ酸の総数である。

３）　欠失とは、相当する発現ベクター中の全因子■コード配列から欠失したア ミノ酸を意味している。

４）　既知アミノ酸組成に基づいて決定された、キロダルトン表示のサイズ。

５）　ラベル化タンパク質の免疫沈殿とその後の電気泳動で測定した、キロダル トン表示のサイズ。

６）　タニカマイシン（０，ＯＯ１ｍｇ／ｖａＲ）を含む培地中で生育させた細 胞由来のタンパク質の、キロダルトン表示のサイズ。

４５１０　４５：！の　４５　＝ｅ　４５４の　４５５の　４５６０７：５ａ７ ＝＝ａ７：＝砧り＋４２７Ｍｇの７＝６のＴＣＡＧＴＣ口ＴＧＣＡＴＴＴＣＴＴ ＴＧＧＴＧＧＧＧＧＧＣＣＡＧＧＡＧＧＧＴＧＣＡＴＣＣＡＡＴＴＴＡＡＣＴＴ ＡＡＣＴＣＴＴａｌｌの　８１２の　１１１１ｍ＋５　８１４８　８１５２　８ １６２ＧＴＡＡＣＡＧＧＧＧＡＡ＾ＴＴＡＴＡＴＡＣＣＧＴＧＡＣＴＧＡＡＡ＾ Ｃ：ＴＡＧＡＧＴ仁ＣＴＡＣＴＴＡＣ＾Ｔ＾ＧＴＴＧ＾＾＾τ浄書（内容に変更 なし） Ｑ　、Ω　Ｑ　−口　■　− Ｆユｇｕｒｅ　！ ワ Ｌ 特許庁長官　吉　１）文　毅　殿 １、ｅ件Ｏｆｉ示Ｐ　ＣＴ／　ＮＬ　８８／　０００２８３、Ｍ正をする者 事件との関係　比願人 ５、補正命令の日付　平成１年１１月７日国際調査報告 Ｉ、ｌＩ閂赫〜＾―−一〜−ＰＣＢ／ＮＬ　８８／Ｃｏｏ：８国際調査報告 ＮＬεεＤｏり２８

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）因子ＶＩＩの生物学的活性を有し、一般式ＮＲ−ＬＲ−ＣＲ （式中、ＮＲは、因子ＶＩＩのＡｌＡ２ドメイン由来の連続する配列の少なくと も一部と実質的に同じ配列を含むもので、該Ａ１Ａ２ドメイン中の全アミノ酸の 多くとも約４５パーセントが欠失しており、かつ該配列が実質的に因子ＶＩＩの Ｎ末端領域の全てを含むものであり、 ＬＲは、１個のペプチド結合、１個乃至２０個のアミノ酸からなる配列又は、少 なくとも１個のアミノ酸を含み、そしてＣＲは因子ＶＩＩのアミノ酸１６３８番 から２３３２番の連続した配列の少なくとも一部と実質的に同じ配列を含むもの で、Ｑ−１６３８からＹ−２３３２までの全アミノ酸配列の多くとも約２５パー セントが欠失しており、かつ該配列が因子ＶＩＩのＣ末端の実質的に全てを含む ものである） により、該タンパク質の該アミノ酸配列が表わされるタンパク質． （２）ＮＲが上述Ａ１Ａ２ドメイン中の全アミノ酸の多くとも約５パーセントが 欠失しているアミノ酸配列を含む、請求の範囲（１）記載のタンパク質。 （３）ＮＲが実質的に因子ＶＩＩのアミノ酸１番から７１２番もしくは７４０番 までに相当するアミノ酸配列を含む、請求の範囲（１）記載のタンパク質。 （４）ＣＲがＱ−１６３８からＹ−２３３２までの全アミノ酸の多くとも約１０ パーセントが欠失しているアミノ酸配列を含む、請求の範囲（１）記載のタンパ ク質。 （５）ＣＲが実質的に因子ＶＩＩのアミノ酸１６３８、１６４９、１６６９又は １６９０番から２３３２番に相当するアミノ酸配列を含む、請求の範囲（１）記 載のタンパク質。 （６）ＬＲが１つのペプチド結合、Ｐ−Ｒ−Ｖ−Ａ又は因子ＶＩＩのアミノ酸約 ７４１番から約８６７番及び約１５６３番から約１６３７番のうちの少なくとも １つを含む、請求の範囲（１）記載のタンバク質。 （７）ＬＲが１つのペプチド結合を含み、ＮＲが実質的に１番から７１２番又は １番から７４０番のアミノ酸に相当するアミノ酸配列を含み、かつ、ＣＲが実質 的に因子ＶＩＩのアミノ酸１６３８番から２３３２番、１６４９番から２３３２ 番、１６６９番から２３３２番又は１６９０番から２３３２番に相当するアミノ 酸配列を含む、請求の範囲（１）記載のタンパク質。 （８）ＬＲがＰ−Ｒ−Ｖ−Ａを含み、ＮＲが実質的に因子ＶＩＩのアミノ酸１番 から７１２番に相当するアミノ酸配列を含み、かつＣＲが実質的に因子ＶＩＩの アミノ酸１６３８番から２３３２番に相当するアミノ酸配列を含む、請求の範囲 （１）記載のタンパク質。 （９）ＬＲが実質的に因子ＶＩＩのアミノ酸７４１番から８６７番及び１５６３ 番から１６３７番の少なくとも１つに相当する配列を含み、ＮＲが実質的に因子 ＶＩＩのアミノ酸１番から７４０番に相当するアミノ酸配列を含み、かつ、ＣＲ が実質的に因子ＶＩＩのアミノ酸１６３８番から２３３２番に相当するアミノ酸 配列を含む、請求の範囲（１）記載のタンパク質。 （１０）ＬＲは、実質的に、アミノ酸１５６３番から１６３７番に相当する配列 に融合した、アミノ酸７４１番から８６７に相当する配列を含む、請求の範囲（ ９）記載のタンパク質。 （１１）請求の範囲（１）乃至（１０）記載のタンパク質をコードするＤＮＡ配 列。 （１２）転写の方向に、宿主細胞中で機能する転写制御領域及び翻訳開始領域、 請求の範囲（１）乃至（１０）記載のタンパク質をコードするＤＮＡ配列及び該 宿主細胞中で機能する翻訳及び転写の終止領域を含み、該ＤＮＡ配列の発現が該 開始及び終止領域により制御される発現ベクター。 （１３）上記転写制御領域がＲＳＶ−ＬＴＲプロモーターの上流に連続に結合す るＳＶ４０初期プロモーターを含む、請求の範囲（１２）記載の発現ベクター。 （１４）発現ベクターｐＣＬＢ２０１、ｐＣＬＢ２０２、ｐＣＬＢ２０３、ｐＣ ＬＢ２０８、ｐＣＬＢ２０９、ｐＣＬＢ２１０、ｐＣＬＢ２１２、もしくはｐＧ Ｂ８８１。 （１５）転写の方向に、宿主細胞中で機能する転写制御領域及び翻訳開始領域、 請求の範囲（１）乃至（１０）記載のタンパク質をコードするＤＮＡ配列及び該 宿主細胞中で機能する翻訳及び転写終止領域を含み、かつ該ＤＮＡ配列の発現が 該開始及び終止領域で制御される発現ベクターを含む、トランスホームした宿主 細胞及びその子孫。 （１６）上記細胞がホ乳類細胞である、請求の範囲（１５）記載の、トランスホ ームした細胞及びその子孫。 （１７）上記細胞がＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞又はＣ１２７細胞である、請求の範 囲（１６）記載の、トランスホームした細胞及びその子孫。 （１８）上記細胞が原核細胞又はイースト細胞である、請求の範囲（１５）記載 の、トランスホームした細胞及びその子孫。 （１９）上記細胞がバチルス種又はクルイベロミセス種由来のものである、トラ ンスホームした細胞及びその子孫。 （２０）転写の方向に、宿主細胞中で機能する転写制御領域及び翻訳開始領域、 請求の範囲（１）乃至（１０）記載のタンパク質をコードするＤＮＡ配列及び該 宿種細胞中で機能する翻訳及び転写終止領域を含み、かつ、該ＤＮＡ配列の発現 が該開始及び終止領域により制御される発現ベクターを含む宿主細胞を栄養培地 で生育させること及び該タンパク質を単離することを含む、因子ＶＩＩの欠失変 異体であるタンパク質を調製する方法．（２１）生理学的に許容しうるキャリヤ ー中、請求の範囲（１）乃至（１０）記載の、因子ＶＩＩの欠失変異体を含む症 状緩和量のタンパク質を含有する、因子ＶＩＩ欠換症状緩和組成物。 因子ＶＩＩ活性を有する新しいタンパク質、遺伝子操作細胞を用いるその製法及 びそれらを含む医薬組成物本公開の概要 因子ＶＩＩ活性を有する新しいポリペプチドがその製法及びそれらを含む組成物 とともに提供されている。このポリペプチドは、因子ＶＩＩの誘導体及び断片を 含んでおり、実質的に天然の因子ＶＩＩの一部と同じ配列を有している。そのポ リペプチドは血友病の治療に使用できる。