HU213300B - Process for producing novel proteins with factor viii activity and pharmaceutical preparations containing them - Google Patents

Description

A találmány VIII. faktor aktivitású új proteinekre vonatkozik, valamint e proteinek előállítására génsebészeti technikával manipulált sejtvonalak és mikroorganizmusok használatát tartalmazó eljárásokkal.

Az A-hemofilia nemhez kötött véralvadási rendellenesség, amelyet a VIII. faktor hiánya jellemez. A VIII. faktor lényeges eleme a véralvadási folyamatnak. A betegség a férfi népesség körülbelül 0,01%-ánál fordul elő. Az A-hemofilia egészséges donoroktól származó VIII. faktort tartalmazó plazma adásával kezelhető. Azonban a kezelés számos hátránnyal jár. A VIII. faktorból korlátozott az ellátás és a készítmény nagyon drága. A vérben a VIII. faktor koncentrációja csupán körülbelül 100 pg/ml és a szokásos plazmafrakcionálási módszereket alkalmazva, a kitermelése alacsony. Minthogy a VIII. faktor donorvérek keverékéből nyerhető, igen nagy a kockázata annak, hogy a recipiens olyan fertőző betegségeket kap meg, mint amilyeneket a donor-vérekben esetleg jelenlévő hepatitisz non-A, non-B, a hepatitisz B és az AIDS vírus okoz. Ezenkívül a recipiens az exogén eredetű VIII. faktorral szemben antitesteket termelhet, s ezek nagyban csökkenthetik a hatékonyságát

A VIII. faktor három szakaszt foglal magába, egy N-terminális szakaszt, ez az un. „AlA2-domén”; egy középső szakaszt, amely a „B-domén” és a C-terminális szakaszt, amely az A3, C1 és C2 domént tartalmazza. Az AlA2-domént és a C-terminális szakaszt tartják esszenciálisnak az alvadási aktivitás szempontjából. A VIII. faktor egy proteinnel együtt kering a vérben, s ez a protein a von Willebrand faktor (vWf), amely feltehetően az érzékeny VIII. faktort védi a korai degradálódástól.

A VIII. faktor kitermelése igen alacsony, ha ismert rekombináns DNS technológiával állítják elő. Ezenfelül úgy találták, hogy a proteineket nem intakt lánc alakjában kapják meg, mivel a termékek izolálása és tisztítása nehézkes, ugyanakkor ennek következtében a költségek is magasak. Ennélfogva egy olyan hatékony eljárás kidolgozása volt kívánatos, amellyel VIII. faktor-aktivitású vegyületek termelhetők nagy mennyiségben, s e vegyületek előnyösen csökkentett immunogén hatással rendelkeznek.

Közlések állnak rendelkezésre a humán mRNS-ből kapott VIII. faktor cDNS molekuláris klónozásáról és ezen VIII. faktor-aktivitású proteineknek emlős, élesztő és bakteriális sejtekben való termeléséről. Lásd a WO 85/01 961 számú nemzetközi szabadalmi bejelentést, valamint az EP 0 160 457, EP 0 150 735 és EP 0 253 455 számú európai szabadalmi bejelentéseket. VIII. faktor-aktivitású proteineknek transzformált mikroorganizmusok használatával történő termelési eljárását tartalmazza a 0253455 számú európai szabadalmi bejelentés.

Az EP 0 150 735 és EP 0 123 945 számú európai szabadalmi bejelentésben és Brinkhous és mtsai közleményében (1985) a VIII. faktor hasítási termékeinek VIII. faktor-aktivitásáról van szó. A VIII. faktor két proteolitikus hasítási terméke, egy 92 kD és egy 80 kD polipeptid, fokozott VIII. faktor-aktivitást fejt ki [Fay és mtsai, Biochem. Biophys. Acta, 871, 268-278 (1986); Faton és mtsai, Biochemistry, 25, 505-512 (1986)].

Eaton és mtsai [Biochemistry, 25, 8343-8347 (1986)] arról számoltak be, hogy egy polipeptid, amelynél a középső szakaszból 766 aminosavat (797-1562) töröltek, megtartotta VIII. faktor-aktivitását, sőt azokkal az emlős sejtekkel, amelyeket ezen deletált polipeptidet kódoló DNS-t tartalmazó vektorral transzformáltak, magasabb termelési szintet értek el, mint azokkal a sejtekkel, amelyeket a teljes hosszúságú polipeptidet kódoló DNS-t tartalmazó vektorral transzformáltak.

A WO 86/06 101 számú nemzetközi szabadalmi bejelentés szerint azok a rekombináns VIII. faktor proteinek, amelyeknek a középső szakaszában egészen 880 aminosavig terjedő deléció van, VIII. faktor-aktivitást fejtenek ki. A legnagyobb deléció Thr-760-tól Asn1639-ig terjed (a számozás az 1. ábra szerinti). A rekombináns VIII. faktor előállításához gazdasejtekként emlős sejteket használtak, többek között kínai hörcsög-petefészek sejteket.

A találmány olyan új készítményekre vonatkozik, - beleértve az expressziós vektorokat és az előállítás módszereit - amelyek a VIII. faktor középső és N-terminális vagy C-terminális szakaszában deletált származékait és fragmentumait tartalmazzák. A készítmények előállítását úgy végezzük, hogy gazdasejtet, előnyösen emlős sejtet transzformálunk olyan expressziós vektorral, amely egy VIII. faktorral rokon vegyületet kódoló DNS-szekvenciát tartalmaz, a gazdasejtet tenyésztjük az idegen DNS-szekvencia kifejezése céljából, majd a sejtek lizátumából vagy a kondicionált táptalajból izoláljuk a kapott VIII. faktor származékot vagy fragmentumot. A készítmények fokozott VIII. faktor-aktivitással és/vagy csökkentebb immunogenitással rendelkezhetnek. A készítmények felhasználási területe magába foglalja az Ahemofilia kezelését,

Az alábbiakban az ábrák rövid leírása következezik.

Az 1. ábra bemutatja a pCLB89 vektorban lévő VIII. faktor cDNS inszertumot, mely magába foglalja a VIII. faktor Ala-l-től Tyr-2332-ig terjedő aminosav-szekvenciáját és ennek M(-19)-től S(-l)-ig terjedő szignál szekvenciáját. Az ábra a megfelelő nukleotid-szekvenciákat is feltünteti. Az F-973-at a TTC kódon kódolja.

A 2. ábrán a teljes hosszúságú VIII. faktor proteint kódoló pCLB201 expressziós vektor szerkezete látható.

A pCLB201 cirkuláris plazmid bemutatása az EcoRI pozícióval kezdődik, amely a pSV2 plazmidból [Gorman, DNA Cloning, (szerkesztette Glover), IRL Press, 143-169 oldal (1985) ; Mulligan és Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. , 78, 2072 (1981)] származó 4217 bp HindlII-BglII fragmentumon belül helyezkedik el. A korai SV40 promoter szakaszt a SVep jel mutatja. A vektor egy pRSV-neo plazmidból [Gorman, lásd fentebb (1985)] származó Ndel-HindlII fragmentumot tartalmaz, amely a Rous-szarkómavírus (RSV) hosszú ismétlődő végszakaszát (LTR - Long Terminál Repeat) hordozza a Sáli helyre beépítve. A teljes hosszúságú Vili. faktort a 7440 bp hosszú Sall-Hpal fragmentum kódolja, melynek jele: VIII. faktor cDNS (H = HindlII, Sál = Sáli). ApCLB201 szerkesztése folyamán elvesztett restrikciós endonukleáz hasítási helyeket zárójelbe tettük. A plazmid méretét kilobázis-párban adjuk meg.

HU 213 300 Β

A 3. ábra a deléciós mutáns VIII. faktor proteineket tranziens módon kifejező vektorokat ábrázolja:

a. A pSV2 vektor-származék szakasz-határainak jelzése: a két egymás után következő promotemél az SV40 korai transzkripciós promoter jele (SVep) és a Rousszarkómavírus hosszú ismétlődő végszakaszáé (RSV-LTR);

a capping hely jele (Capsite) és a messzendzser RNS 5' végének jele (mRNS); ezt követi a cDNS inszertum, mely a teljes hosszúságú VIII. faktor-kódoló régiót tartalmazza a start kodonnal (ATG), a nyílt leolvasási kerettel és a stop kodonnal (TGA) együtt; végül a mRNS 3' nem kódoló szakasza egy rövid intronnal és az SV40 DNS-ből származó poliadenilációs szignál (polyA) látható (összehasonlításul lásd a 2. ábrát).

b. A 7440 bp (bázis pár) hosszú Sall-Hpal fragmentum rajza, amely a teljes hosszúságú VIII. faktort kódoló cDNS-t hordozza. Megjelöltük a leolvasási keret start és stop kodonját. Bemutatjuk a teljes hosszúságú cDNS-en belül lévő azon restrikciós endonukleáz helyeket, amelyek a pCLB202 és pCLB203 szerkesztéséhez szolgáló mutagenezisekben szerepet játszanak.

c. A VIII. faktor térképe. Látható a 19 aminosav hosszú szignál peptid és a plazma eredetű VIII. faktor dómén vagy repeat szerkezete. Az Al, A2, A3 homológ aminosav szekvenciák. A B egy egyedi régió, míg a Cl és C2 ismét homológ [Vehar és mtsai, (1984)]. Az A és C repeat-eket határoló aminosav-pozíciókat jeleztük. Alul nyíllal jelöljük azon proteolitikus enzimek hasítási helyeit, amelyek a VIII. faktort bontják: aktivált protein C (APC), trombin (Ha), aktivált alvadási X. faktor (Xa) és egy tripszin-szerű proteáz („?”-el jelezve). Feltehető, hogy a Xa faktor a Ha és APC hasítási helyeket hasítja [Eaton és mtsai, Biochemistry, 25, 8343-8347 ( 1986); Fay és mtsai, Biochim. Ciphys. Acta, 871, 268-278 (1986)1. A hasítási helyeket megjelöltük. A B szakasz sok hasítási helyet tartalmaz.

d. Az aktivált VIII. faktor alegység szerkezete. A Villa, faktor 92 kD és 80 kD alegységeit 92K-val, illetve 80K-val jelöltük. Ezek amino-terminális és karboxiterminális aminosav-pozícióit megjelöltük a teljes hosszúságú szekvencián belül.

e. A pCLB202 cDNS és protein szerkezete. A pCLB202 a b. rajzon látható PstI és BamHI hely között egy közvetlen fúziót tartalmaz. A keletkezett proteint, amelyben az Ala-867 és Asp-1563 között peptid-kötés van, megjelöltük. A protein teljes hossza 1637 aminosav. (A repeat-eket határoló jelzéseket és a specifikus proteolitikus hasítási helyeket bejelöltük; lásd fentebb).

f. A b. rajzon látható MaelII és HgiAI helyet összekötő cDNS-nek és a 4 extra aminosavat kódoló Mlullinker szekvenciát tartalmazó pCLB203 proteinnek a szerkezete. A protein teljes hossza 1411 aminosav. (A repeat-eket határoló jelzéseket és a speciális proteolitikus hasítási helyeket bejelöltük; lásd fentebb).

A 4. ábra néhány deléciós mutáns VIII. faktor protein molekulatömegének (méretének) meghatározása során kapott eredményeket mutatja be. A meghatározásokat immunprecipitációval és elektroforézissel végeztük.

Az autoradiogrammon a pCLB202 (2-es sáv) és pCLB203 (1 -es sáv) vektor által termelt proteinek sávj ai láthatók. A molekulatömeg markereket megjelöltük.

A találmány tárgyát új DNS szerkezetek és olyan új készítmények képezik, amelyek gazdasejtek által termelt VIII. faktor-aktivitást kifejtő polipeptideket tartalmaznak. A VIII. faktor-aktivitású polipeptidek közé tartoznak a VIII. faktor-protein deléciós mutánsai, amelyekből lényegében a teljes centrális szakasz, azaz a „B-domén”, valamint a 92 kD szakasz egy része törlődött. VIII. faktor aktivitású deletált polipeptideket kódoló DNS szekvenciát tartalmazó plazmid szerkezeteket használunk a gazdasejt transzformálására. A gazdasejtet ezután tenyésztjük a gén kifejezése céljából. A gazdasejt lehet eukarióta vagy prokarióta sejt.

A humán VIII. faktor szekvenciáját az 1. ábra mutatja be. Az aminosavak rövidítésére egybetűs jeleket használunk, s ezek a következők:

A = alanin,

R = arginin,

N =aszparagin,

D = aszparaginsav,

C - cisztein,

Q = glutamin,

E = glutaminsav,

G = glicin,

H = hisztidin,

I = izoleucin,

L = leucin,

K = lizin,

M =metionin,

F = fenilanin,

P = prolin,

S = szerin,

T = treonin,

W =triptofán,

Y = tirozin,

V = valin.

Az aminosav-szekvencia számozása A-l-el kezdődik, ami a 19 aminosavból álló szignál szekvencia utáni első aminosavat jelenti. A VIII. faktor utolsó aminosava az Y-2332. Ezt a számozást használjuk végig az eljárás folyamán. A találmány tárgyát képezik azok a VIII. faktor-szerű anyagok is - beleértve a VIII. faktor fragmentumokat, a polipeptid mutánsait és azokat a fúziós peptideket, amelyek a VIII. faktor funkcionális részeit tartalmazzák - amelyeknek a biológiai aktivitása - beleértve a véralvadásra ható aktivitást - olyan, mint a VIII. faktoré.

A találmány szerinti polipeptidekhez tartoznak a VIII. faktorral rokon polipeptidek, azaz olyan vegyületek, amelyek legalább egy olyan biológiai hatással rendelkeznek, mint a VIII. faktor és legalább egy olyan aminosav-szekvenciájuk van, ami lényegében a VIII. faktor aminosav-szekvenciájával azonos. A rokon polipeptid aminosav-szekvenciája lehet hosszabb vagy rövidebb, mint a VIII. faktoré. A biológiai aktivitás Ahemofiliás betegeknél alkalmazva úgy nyilvánul meg, hogy az alvadási zavar javul és/vagy a természetben előforduló VIII. faktorral immunológiai keresztreakció

HU 213 300 Β lép fel. A javulás előidézhető az alvadási kaszkádba való közvetlen beavatkozással vagy a VIII. faktor elleni antitestek megkötésével, hogy az ezután beadott VIII. faktor kevésbé károsodjék. Az „immunológiai keresztreakció” alatt azt értjük, hogy egy jelen találmány szerinti új polipeptiddel szemben képződött antitest keresztreagál az intakt VIII. faktorral. E polipeptidnek legalább egy biológiailag aktív szekvenciája van, például amely immunológiailag vagy mint epitóp aktív, de egynél több biológiailag aktív szekvenciája is lehet és az ilyen szekvencia biológiai tulajdonság szempontjából versenyképes lehet a természetben előforduló termékkel.

A szóban forgó új polipeptidek nagy részének képlete egy N-terminális szakaszt (Nr = N-terminal region), egy összekötő szakaszt (L_R = linking region) és egy C-terminális szakaszt (Cr = C-terminál region) tartalmaz. Az N_R-re jellemző aminosav-szekvencia lényegében megfelel egy olyan összefüggő szekvenciának, amely a teljes hosszúságú VIII. faktor A-l-től R-740-ig terjedő aminosav-szekvenciájában található (A1A2 dómén vagy 92KD polipeptid) vagy az A1A2 doménben lévő aminosavakból 5%-nál nem több aminosav törlődött. Az előnyös szekvenciák lényegében az A-l-től D-712-ig vagy az A-l-től R-740-ig teijedő szekvenciák.

Az L_r egy 1-4 aminosav terjedelmű rövid összekötő csoport vagy egy kötés lehet, amely alapjában véve a teljes hosszúságú VIII. faktor proteinben lévő „B dómén” szekvenciájához általában nem hasonlít. Tartalmazhat olyan szekvenciákat is, amelyek lényegében a B-domén S-741-től S-1637-ig terjedő teljes összefüggő szekvenciájának vagy e szekvencia bármely részének megfelelnek. Különleges fontosságúak azok az összetételek, amelyekben az L_R az S-741 - A-867 és a D-1563

- S-1637 terjedelmű szekvenciák valamelyikét tartalmazza.

A C_R-re jellemző aminosav-szekvencia lényegében hasonló ahhoz az összefüggő szekvenciához, amely a Q-1638-tól az Υ-2332-ig terjedő aminosavakat tartalmazó teljes hosszúságú VIII. faktor szekvenciában található és amelyből a Q-l 638-tól Υ-2332-ig tartó aminosavaknak nem több mint 5%-a törlődött.

Ez a szekvencia előnyösen lényegében a következő VIII. faktor szekvenciának megfelelő szekvenciákat tartalmazza: Q-1638 -Y-2332, E-7649 - Y2332, S-1669

- Y-2332 és előnyösebben a Q-1638 -Y-2332 szekvenciát.

A szóban forgó polipeptidek a VIII. faktor fragmentumai, amelyekből a teljes hosszúságú VIII. faktorhoz képest az aminosavak legfeljebb 40%-a törlődött.

Az immunogenitás biztosítása érdekében a VIII. faktorral rokon anyagokat nagyméretű immunogén polipeptid egységhez kapcsolhatjuk kovalens kötéssel. Ilyen immunogén polipeptidek például a következők: marhaszérum albumin, keyhole límpet hemocianin (KLH) és hasonlók.

Ezek a konjugált polipeptidek antitest-termelésre használhatók megfelelő gazdaszervezetben. Az antitestek felhasználhatók a VIII. faktor jelenlétének vagy távollétének és/vagy koncentrációjának a meghatározására testfolyadékokban. A VIII. faktor hiánya A-hemofiliára utal.

VIII. faktorral rokon anyagokat különbözőképpen állíthatunk elő. Előállíthatjuk úgy, hogy a teljes hosszúságú VIII. faktort proteolitikusan három régióra hasítjuk, előnyösen az Arg-740 és Gin-1638 előtt hasítunk, majd egyszer megrövidítjük az Ala-1- Pro-739 szekvencia amino- vagy karboxil-terminuszát legalább egy aminosawal és/vagy másszor megrövidítjük a Gln-1638 Tyr-2332 szekvencia amino- vagy karboxil-terminuszát legalább egy aminosavval. Az így kapott polipeptid fragmentumokat ezután vagy közvetlenül vagy egy közbülső összekötő csoporton keresztül fuzionálhatjuk vagy olyan összetételben kombináljuk a fragmentumokat, hogy VIII. faktor-aktivitást kaphassunk.

A VIII. faktorral rokon anyagokat - ide sorolhatók azok a fuzionált proteinek, amelyekben az N_R és C_R van egymással fuzionálva - rekombináns DNS technológiával is előállíthatjuk. A VIII. faktor gén izolálására használt módszerek ismertek e szakterületen, ilyenek a szintetizálás a genomiális DNS-ből való izolálás, a cDNSből való előállítás vagy ezek kombinációi. A gének manipulációjára szolgáló különböző technikák jól ismertek, ilyen a restrikció, emésztés, rezekció, ligálás, in vitro mutagenezis, primer repair, valamint a polilinkerek, az adapterek és hasonlók. Lásd: Maniatis és mtsai, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1982.

Az eljárás általában abból áll, hogy a VIII. faktort szintetizáló sejtekből egy genomiális gyűjteményt hozunk létre. A korrekt szekvencia-azonosítás valószínűségének fokozására egy VIII. faktort nem termelő sejtekből előállított cDNS gyűjteményt használhatunk a kereszthibridizáláshoz. A VIII. faktor-kifejeződés vizsgálatánál prokarióta expressziós vektorba - mint a pTZ18 és 19beépített restrikciós fragmentumokat használunk és a szűrést VIII. faktor antitestekkel végezzük a keresztreakciót adó peptidek észlelése céljából.

Ha már azonosítottuk a komplett gént, legyen az cDNS vagy kromoszómális DNS, a strukturális génben kívánt deléciókat többféleképpen valósíthatjuk meg. A deléciókat úgy lehet véghezvinni, hogy vagy enzimatikus úton hasítjuk a teljes hosszúságú VIII. faktor cDNS-t, s ezt követően a tisztított fragmentumokat módosítjuk és ligáljuk, vagy helyre irányuló mutagenezissel, főként a Kramer és mtsai által leírt [Nucl. Acids Rés., 12, 9441-9456 (1984)] loop-out mutagenezissel. Az így kapott gént ezután különböző jól ismert módon manipulálhatjuk, hogy létrejöjjön a kifejeződés.

Használhatunk prokarióta és eukarióta sejteket egyaránt, ezek lehetnek bakteriális, élesztő és emlős sejtek, például CHO sejtek, C127 sejtek, humán „293” sejtek, myeloma sejtek vagy specializált sejtek, mint a májsejtek és a COS sejtek. Azaz amikor a gént egy olyan gazdasejtben szándékozunk kifejezni, amely felismeri a VIII. faktor vad típusú transzkripciós és transzlációs szabályozó szakaszait, az egész gént - vad típusú 5’ - és 3'-szabályozó régióival együtt-vezetjük be egy megfelelő expressziós vektorba. Különböző olyan expressziós

HU 213 300 Β vektorok léteznek, amelyek emlősöket fertőző vírusok replikációs rendszerét használják, ilyenek a Simian vírus 40. Epstein-Barr vírus, a bovin papilloma vírus, vaccinia vírus, stb.

Ha a gént egy olyan gazdasejtben óhajtjuk kifejezni, amely nem ismeri fel a természetben előforduló vad-típusú transzkripciós és transzlációs szabályozó szakaszokat, további manipulációkra van szükség. Előnyös, hogy számos 3'-transzkripciót szabályozó régiót ismerünk és ezeket be lehet építeni a stop kodonoktól a leolvasási irányában (downstream). A strukturális géntől upstream elhelyezkedő nem kódoló 5' szakaszt el lehet távolítani endonukleázos restrikcióval, Bal31 rezekcióval, vagy ehhez hasonló módszerekkel. Másképpen úgy járhatunk el, hogy egy megfelelő restrikciós hely található a strukturális gén 5' terminuszának közelében, lehasíthatjuk a strukturális gént és egy adapter használatával hozzákötjük a strukturális gént a promoter szakaszhoz, amikor is az adapter szolgáltatja a strukturális gén elvesztett nukleotidjait.

Különböző stratégiákat alkalmazhatunk egy olyan idegen expressziós kazetta elkészítése céljából, amely a transzkripció 5' —> 3' irányában egy transzkripciót szabályozó szakaszt és egy transzlációt indító szakaszt tartalmaz és amely még magába foglalhat olyan szabályozó szekvenciákat, amelyek a szabályozás indukcióját teszik lehetővé; a kazetta tartalmazhat egy nyitott leolvasási keretet, amely a teljes hosszúságú VIII. faktort vagy a VIII. faktorral rokon anyagokat, így a deletált mutáns proteineket is kódolja; kívánatos még, hogy olyan szekréciós vezérszekvenciát tartalmazzon, amelyet a kiszemelt gazdasejt felismer; tartalmaz még transzlációt és transzkripciót leállító szakaszokat. Az expressziós kazetta ezenkívül még legalább egy marker gént is tartalmazhat. A gazdasejtben indító és leállító szakaszok működnek és ezek vagy homológ (az eredeti gazdából származó) vagy heterológ (idegen forrásból származó) vagy szintetikus DNS szekvenciák lehetnek. Azaz az expressziós kazetta egészben vagy részben természetes forrásokból származhat, továbbá vagy teljesen vagy részben a gazdasejttel homológ vagy a gazdasejthez viszonyítva heterológ forrásból származhat. A találmány szerinti különböző szerkezetek (DNS szekvenciák, vektorok, plazmidok, expressziós kazetták) izoláljuk és/vagy tisztítjuk vagy szintetizáljuk, tehát nem „természetben előforduló” szerkezetek.

Megállapították, hogy azok a nukleotid szekvenciák, amelyek az ATG transzlációt indító kodont körülveszik, az optimális gén expresszió szempontjából igen fontosak az állati sejtekben. Kozák [Microbiol. Reviews, 47, 1—45 (1983)] behatóan tanulmányozta ezeknek a szakaszoknak a hatását a polipeptidek expressziójára, például COS sejtekben az inzulin expressziójára. Tehát feltehetően szükség van az iniciációs kodon körüli nukleotid szekvenciák módosítására. Ez megoldható helyre irányuló mutagenezissel vagy pedig úgy, hogy fuzionáljuk az idegen gént egy igen magas színvonalon kifejeződő gén iniciációs szakaszával.

Transzkripciót szabályozó szakaszok vagy promoterek például a következők: baktériumoknál a béta-gal promoter, amiláz promoter, a lambda fág bal és jobb promoterei, a trp és lac promoter, a trp-lac fúziós promoter, stb.: élesztőnél a glükolitikus enzimek promoterei, mint az ADH-1 és ADH-2 promoter, a PGK promoter és a laktáz promoter és ezekhez hasonlók; emlős sejtek esetén az SV40 korai és késői promoterek, a cytomegalovirus (CMW) promoter, béta-aktim promoter, az adenovirus főbb késői promoterei és hasonlók.

Eukarióta sejtekben a szabályozó szekvenciák tartalmazhatják például a cytomegalovirus enhancer szekvenciáját, amely egy promoter szekvenciával, például az SV40 promoterrel fuzionált, miáltal egy kiméra promoter jön létre, vagy pedig be van építve az expressziós kazettában máshol, előnyösen a promoter szekvencia szoros közelségében.

A strukturális gén kifejeződését meg lehet úgy is sokszorozni, hogy például egymásután Egálunk egy domináns, sokszorozható gén-markert meghatározó gént a strukturális génhez 5' vagy 3' felé és a gazdasejteket szelektív körülmények között tenyésztjük. Sokszorozható gén például a dihidrofolát reduktáz (dhfr) génje, amelynek megnövelhetjük a kifejeződését olyan sejtekben, amelyeket a folát antagonista metotrexáttal (mtx) szemben rezisztenssé tettünk. Az emlős sejtekben - mint például COS sejtekben - megvalósuló expresszió szempontjából fontosak az olyan expressziós kazetták, amelyek ki tudják fejezni a VIII. faktort vagy a vele rokon anyagokat, s ezek metallotoinein promotert használnak vagy az SV40 korai transzkripciós promoterét (SVep), főként pedig a Rous-szarkómavírus hosszú ismétlődő végszakasz (RSV-LTR) promotert a SVep-el együtt egymás utáni elhelyezkedésben.

Hurwitz és mtsai [Nucl. Acids Rés., 15, 7137-7153 (1987)] leírtak olyan promotereket és promoter/enhancer kombinációkat példaként, amelyeket a C127 sejtekben lehet használni - 7. példa szerint - expressziós vektorokkal kombinációban. Az optimális expresszió érdekében jó hatású lehet egy intron bevezetése az expressziós kazettába. A mRNS 5' részében előnyös egy intron jelenléte.

Fuzionált gént ezenkívül úgy készíthetünk el, hogy a strukturális gén részére olyan 5' -szekvenciáról gondoskodunk, amely egy szekréciós vezér-szekvenciát és egy processzor szignált kódol. A VIII. faktor polipeptidek szekretálásához előnybe helyezzük a természetben előforduló VIII. faktor vezér-szekvenciáját, de fel lehet használni más szignál szekvenciákat is, mint a penicillináz, alfa-faktor, immun-globulin, T-sejt receptorok, külső membrán proteinek, szérum albumin, szöveti plazminogén aktivátor, inzulin, az emésztő traktus enzimeinek és ehhez hasonlóknak a szekréciós vezérszekvenciáit. Ha egy szekréciós vezér-szekvenciát a VIII. faktor vagy rokonai strukturális génjével fuzionálunk - a megfelelő leolvasási keretben - az érett VIII. faktor a táptalajba szekretálódhat.

A terminációs szakasz annak a génnek a 3' szakaszából származhat, amelyből az iniciációs szakaszt vettük vagy pedig egy másik génből. A terminációs régiók nagy választékát ismerjük, amelyekről megállapították, hogy számos azonos és különböző nembéli és fajtájú gazda5

HU 213 300 Β sejtben megfelelnek. A terminációs szakasz tartalmazhat olyan szekvenciákat, amelyek a mRNS-nek emlős sejtekben való megfelelő feldolgozását szolgálják, például egy kis intront és egy poliadenilációs szignált.

Az expressziós kazetta szerkesztése folyamán a különböző DNS fragmentumokat rendszerint beklónozzuk egy megfelelő klónozó vektorba, amelyben lehetőség van a DNS meghosszabbítására, a DNS módosítására vagy manipulálására szekvenciák, linkerek összekapcsolása vagy eltávolítása révén vagy hasonló módon. Rendes körülmények között a vektorok végül is viszonylag nagy kópiaszámmal képesek replikálódni E. coliban. Klónozáshoz számos vektor könnyen beszerezhető, ilyenek például a következők: pBR322, pML2, pUC7-pUC19, pSP64, pSP65, pSP18, pSP19, pTZ18, és pTZ18R, pTZ19 és pTZ19R és hasonlók.

A klónozó vektorokat az jellemzi, hogy hatékony replikációs origójuk van és legalább E. coliban működőképesek. A klónozó vektor legalább egy egyedi restrikciós hellyel rendelkezik, rendszerint azonban több egyedi restrikciós hellyel, de tartalmazhat sokszoros klónozó helyeket is, főként pedig ugyanazon restrikciós helyből kettőt, szubsztitúció céljára. A klónozó vektor ezenkívül egy vagy több olyan markert tartalmaz, amely(ek) lehetővé teszi(k) a transzformáció szempontjából való szelektálást. A markerek általában a citotoxikus szerekkel - ilyenek az antibiotikumok, nehéz fémek, toxinok és hasonlók - szemben rezisztenciát kölcsönöznek, vagy auxotróf gazdasejt esetében kiegészülést vagy egy fág elleni immunitást biztosítanak. A vektornak az expressziós kazettához vagy ennek egy részéhez való kapcsolását úgy oldjuk meg, hogy a vektort és a kazettát megfelelő módon hasítjuk és ha szükséges, módosítjuk a végeket akár úgy, hogy a túllógó végeket visszavágjuk vagy betöltjük, hogy tompa végekhez jussunk vagy linkerek hozzáadásával vagy farkazással alakítunk ki komplementer végeket a ligáláshoz.

Bizonyos esetekben ingázó vektort használunk, amikor is a vektor különböző replikációs rendszereket igénylő különböző gazdasejtekben képes replikálódni. Előnybe helyezzük a simian vírus 40 (S V40) replikációs origójának a használatát, amely lehetővé teszi, hogy a plazmid COS-1 sejtekben szaporodjék, míg a bovin papilloma vírus (BPV-1) genomját arra használjuk, hogy az expressziós vektorokat Cl27 sejtekben episzómálisan tartsuk fenn [lásd például: Howley és mtsai, Meth. Enzymol., 101, 387—402 (1983)].

Az expressziós kazetta része lehet egy olyan replikációs rendszernek, amely egy megfelelő gazdasejtben az episzómális fennmaradást biztosítja, de az is lehetséges, hogy nincs ellátva replikációs rendszerrel és ekkor a gazda genomjába van integrálva. Az a mód, ahogyan a gazdasejtet a különböző DNS szerkezetekkel transzformáljuk, lényeges a találmány szempontjából. A DNS-t ismert technikák szerint építhetjük be a gazdasejtbe, ilyen a kalcium-foszfáttal precipitált DNS használatával való transzformálás, az elektroporáció, a transzfekció, amikor a sejteket vírussal hozzuk érintkezésbe, a DNS-nek a sejtekbe való mikroinjiciálása és ehhez hasonló módszerek.

Gazdasejt gyanánt normál primér sejteket vagy tenyésztett primér szövetekből származó sejtvonalakat, valamint mikrobiális sejteket használhatunk. Előnyös, ha a gazda egy emlős sejtvonal, ilyenek a hörcsög CHO sejtek, az egér Cl27 sejtek vagy a humán „293” sejtek, de használhatók a mikrobiális sejtek is, például az élesztősejtek, előnyösen a Kluyveromyces fajok, vagy a baktériumok, előnyösen a Bacillus fajok.

Egy emlős sejtvonal stabil transzformálásához, melyet úgy végzünk, hogy VIII. faktorral rokon anyagot kódoló szekvenciát hordozó expressziós vektort használunk és ezután a gazda kromoszómájába beépített vektort szaporítjuk, a kínai hörcsög petefészek (CHO) sejtek különösen alkalmasak. A transzformálás abból áll, hogy a gazdasejtet szelekciós marker gént - ilyen a dhff vagy a G418 (neo-) rezisztencia gén vagy ehhez hasonlók tartalmazó expressziós vektorral transzficiáljuk, ez ezután beépül a kromoszómába, majd a stabil transzformáció alapján szelekciót végzünk.

A gazda-sejtvonalak stabil transzformálásának egy másik módszere szerint BPV-1 szekvenciákat tartalmazó expressziós vektorokat használunk. Erre a célra a Cl27 sejtek igen alkalmasak. Transzformáláskor a BPV-1 szekvenciákat tartalmazó expressziós vektorral transzficiáljuk a gazdasejtet. A transzformált sejtek tarfoltok révén ismerhetők fel. Stabil transzformált sejtek előállítása és VIII. faktor aktivitásra való szűrése a KABI Coatest segítségével végezhető a 6. és 7. példában leírtak szerint. Ezzel szemben ha a kifejezést tranziens transzformációs rendszerben végezzük - ilyenek a pSV2-ből származó expressziós vektorokkal transzformált COS-1 sejtek — akkor nincs szelekciós lépés. Amint a strukturális gént bevittük a megfelelő gazdasejtbe, a gazdasejtet elszaporíthatjuk a strukturális gén kifejezése céljából. A gazdasejt nagy sűrűséget érhet el egy megfelelő tápoldatban. Ahol a promoter indukálható, mint például prokarióta rendszerben, permissziv feltételeket kell használnunk, például hőmérséklet-változtatást, kimerítést vagy egy anyagcseretermék vagy tápanyag túlsúlyát, vagy ehhez hasonló módszereket. Emlős rendszerben, ahol a strukturális gént követően egy sokszorozható gént használunk, a sokszorozáshoz megfelelő módszereket kell alkalmazni.

Szekréció esetén a fuzionált vagy füzionálatlan expressziós terméket a táptalajból hagyományos módszerekkel izolálhatjuk, Ha nem történik szekréció, a gazdasejteket learatjuk és a szokásos módon lizáljuk, A kívánt terméket ezután a szokásos módszerek segítségével izoláljuk és tisztítjuk, például affinitás-kromatográfiásan, immobilizált antitestekkel, aminohexil-Sepharose kromatográfiával, vagy kevert polielektrolit módszerrel.

A rekombináns termék lehet glükozilált és nem glükozilált, s a glükoziláció lehet vad-típusú vagy más típusú. A glükoziláció mértéke részben a konkrét peptid szekvenciájától függ, részben attól a szervezettől, amelyben termelődött. így tehát E.coli sejtekben a termék kifej eződése nem glükozilált terméket eredményez, míg az emlős sejtekben való kifejeződés olyan terméket eredményez, amelynek a glükozilációja a vad-típusú pepiidéhez hasonló.

HU 213 300 Β

A találmány szerinti vegyületeket sokféle módon fel lehet használni, úgy in vivő, mint in vitro. A szóban forgó vegyületeket A-típusú hemofilia tüneteit mutató betegek kezelésére szolgáló gyógyszerkészítmények hatóanyagaként használhatjuk fel. Azaz egy VIII. faktor-hatású gyógyszerkészítmény egy olyan készítmény, amely emlősöknél alkalmazható az A-hemofíliával kapcsolatos tünetek enyhítésére. A gyógyszerkészítmény előállításánál a találmány szerinti polipeptidekhez általában parenterálisan adható hordozókat és más megfelelő kötőanyagokat keverünk az ezen szakterületen ismert eljárások szerint. A gyógyszerkészítményben a szóban forgó polipeptid alkalmas módon, mint steril liofilizált készítmény jelenik meg, amelyet oldatok készítésére alkalmas olyan steril oldat hozzáadásával vihetünk újra oldatba, amely a recipiens véréhez viszonyítva előnyösen izotoniás. A gyógyszerkészítmény egyadagos és többadagos tartályokban kerülhet forgalomba, például leforrasztott ampullákban vagy üvegekben. Felhasználásuk az ismert humán VIII. faktorral analóg módon történhet, megfelelően beállítva a hatékonyságát. A találmány szerinti polipeptid in vivő alkalmazható, például injekcióban, intravénásán, peritoneálisan, szubkután vagy hasonló módon.

A szóban forgó vegyületeket ezenkívül fel lehet használni az ezen vegyületekkel szembeni antitestek előállítására, amelyek in vivő és in vitro egyaránt alkalmazást nyerhetnek. Az antitestek előállíthatok hagyományos módon, akár, úgy, hogy az említett polipeptidet immunogén gyanánt használjuk, s egy emlős gazdába injiciáljuk, például egérbe, marhába, kecskébe, birkába, nyúlba, stb., mégpedig adjuvánssal, például komplett Freund adjuvánssal, alumínium-hidroxid géllel vagy hasonlókkal. A gazdát ezután elvéreztetjük, és a vérből a poliklonális antitesteket izoláljuk. Egér esetében a perifériás vér-limfocitákat vagy a lép limfocitáit (B sejtek) megfelelő myeloma sejttel fuzionáljuk abból a célból, hogy a szóban forgó vegyületekre specifikus antitestek monoklonális expreszióját meghatározó kromoszómák örökéletűvé váljanak.

Akár poliklonális, akár monoklonális antitesteket állítunk elő, ezekkel az illető polipeptidnek egy mintában - ami állhat sejtekből vagy lehet egy fiziológiás folyadék, mint a vér - való jelenlétét diagnosztizálhatjuk, illetve határozhatjuk meg. Ha nem sikerül a szóban forgó polipeptidet kimutatni, ez A-hamofilia esetére utalhat.

VIII. faktor mRNS-el komplementer szekvenciákat tartalmazó szondákat szintén készíthetünk és ezeket diagnosztikumként használhatjuk. Például egy sejtben a VIII. faktor mRNS j elenléte és/vagy mennyisége alapján meghatározható, hogy a beteg által termelt VIII. faktor hatását a képződött antitestek gátolják-e. Egy sejteket tartalmazó vizsgálati minta, szövet minta vagy testfolyadék - amelyről feltételezzük, hogy hibridizáló szekvenciákat tartalmaznak - esetén úgy járunk el, hogy a sejteket lizáljuk, majd denaturáló szerrel, például guanidinhidrokloriddal kezeljük, hogy felszabadítsuk az egyszálú mRNS-t. A jelzett szondákat (például ³²P-vel vagy biotinnal módosított nukleotidokat) a sejt mRNSével hibridizáljuk, s a keletkezett kettősszálú komplexet a jelzés alapján határozhatjuk meg. Bizonyos célokra kívánatos lehet, hogy a VIII. faktor mRNS-t mennyiségileg határozzuk meg. Ezt úgy végezzük, hogy az ismert mennyiségű egyszálú VIII. faktor mRNS-t tartalmazó referencia mintákban észlelt jelzett anyag mennyiségét összehasonlítjuk a vizsgálati mintában észlelt anyag mennyiségével.

A következő példák a találmány magyarázatául szolgálnak és nem korlátozzák a találmány oltalmi körét.

Általános klónozó technikákat használtunk, ahogyan Maniatis és mtsai leírták [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, CSH, NY, (1982)]. Minden DNS-módosító enzimet a kereskedelemből szereztünk be és ezeket az előállítók előírásai szerint alkalmaztuk. A DNS tisztításához és elválasztásához szükséges anyagokat és készülékeket a szállító cégek előírásai szerint használtuk.

1. példa

A pCLB201 expressziért vektor szerkesztése

A pCLB201 egy olyan expressziós vektor, amely az RSV-LTR promotert a transzkripció megindításához megfelelő irányban tartalmazza, valamint a teljes hosszúságú VIII. faktor cDNS-t (lásd a 2. ábrát). A vektor a Mulligan és Berg-féle [Proc.Natl, Acad, Sci, ,78,2072 (1981)] pSV2 vektorból származik.

A pSV2.tPA plazmid [Van Zonneveld és mtsai, Proc, Natl. Acad,Sci,, 83,4670—4674 (1986)] egyetlen HindlII helyét Sáli hellyé módosítjuk azáltal, hogy a ragadós HindlII végeket tompa végekké alakítjuk és Sáli linkereket (5 '-CGTCGACG-3 ') kapcsolunk a tompa végekhez. Kiválasztottunk egy Sáli helyet tartalmazó plazmidot és pCLB91-nek neveztük el. Ez a plazmid azonos a pSV2. tPA plazmiddal, Kivéve, hogy a HindlII helyre beépítve Sáli linkért tartalmaz.

Az EP 0 253 455 számú európai szabadalmi bejelentés - melynek megállapításai itt referenciaként szerepelnek - leírja a Vili. faktor mRNS izolálását humán májból, majd cDNS-ének előállítását, tisztítását és azonosítását és beépítését a pEP121 plazmidba, melynek következtében a pCLB89 plazmid keletkezik. A pCLB89 plazmid 7440 bp hosszú Sall-Hpal fragmentumát, amely a VIII. faktor cDNS-t tartalmazza, tisztítjuk és beépítjük a Sall-gyel és BglII-vel emésztett pCLB91-be. A kapott pCLB200 expressziós vektor egy intakt Sáli helyrét tartalmaz egy BglII helyhez ligáit Hpa I hellyel együtt, amelyet betöltöttünk.

A pRSVneo plazmidot [Gorman, DNA Cloning, D. Glover, IRL-press, Washington, Oxford (1985) 143-169 oldal] Ndel-gyel és HindilII-mal emésztjük, és a DNS polimeráz Klenow fragmentjével inkubáljuk a tompa végek kialakítása érdekében, majd izoláljuk a Rousszarkómavírus hosszú ismétlődő végszakasz (RSV-LTR) szekvenciát tartalmazó 0,6 kb hosszú fragmentumot és beépítjük a pCL8200 Sáli helyére, amelyet hasonló módon tompa végűvé alakítottunk. A keletkezett expressziós vektor a pCLB201 (lásd a 2. ábrát).

HU 213 300 Β

2. példa

A pCLB 2 02 szerkesztése

A pGB860 plszmidban megszerkesztjük a VIII. faktor egy deléciós mutánsát, amelyben a deléció a 2660 nukleotid pozíciónál lévő PstI helytől a 4749 pozícióban lévő BamHI helyig tart (lásd a 3. ábrát). Ezt a műveletet az EP 0 253 455 számú európai szabadalmi bejelentés leírja A pGB860-ban lévő VIII. faktor DNSben a centrális szakasz 695 aminosavát kódoló DNS törlődött.

A pCLB202 expressziós vektor a pGB860-ból és pCLB201-ből szármázik. Mindkét plazmidot KpnI és Xbal restrikciós enzimmel emésztjük. A pGB860-ból származó 3,1 kb KpnI-Xbal fragmentumot a pCLB201ből származó 7 kb KpnI-Xbal fragmentummal ligáljuk. A kapott pCLB202 plazmid intakt KpnI és Xbal helyet tartalmaz. Szerkezete a 3e. ábrán látható.

3. példa

A pCLB203 szerkesztése (A) pCLBlOO:

A pCLB89-ből származó 7440 bp Sall-Hpal fragmentumot (lásd a 2. ábrát) a Sall-gyel Smal-gyel hasított p5P64 plazmidba [Méltón és mtsai, Nucl. Acids, Rés., 12, 7035-7056 (1984)] építjük be. Ekkor a pCLBlOO plazmid keletkezik, amely egy intakt Sáli helyet és a Smal-véghez kapcsolódó egy Spal véget tartalmaz.

(B) pCLB 101:

(A zárójelben lévő számok az 1. ábra számozásának felelnek meg.)

1. A pCLB 100 plazmidot KpnI-gyel és Tth 1111-gyel emésztjük, s így egy 631 bp fragmentumot kapunk: Kpnl(1817)-Tthllll(2447). A 631 bp fragmentumot tisztítjuk, majd hasítunk MaeIII(2199)-al. A MaelII ragadós véget betöltjük, s így egy 383 bp fragmentumhoz jutunk.

2. A pCLBlOO plazmidot Apai-gyei és Banl-gyel emésztjük. A 669 bp ApaI(6200)-BanI(5532) fragmentumot izoláljuk.

3. A pCLBlOO plazmidot HgiAI-gyel emésztjük, s így kapjuk a 634 bp hosszú HgiAI fragmentumot. A fragmentumot T4 DNS polimerázzal inkubáljuk, hogy tompa végekhez jussunk, majd Banl-gyel emésztünk, miáltal egy 565 bp fragmentum keletkezik.

4. A pCLBlOO plazmidot Apall-gyel és KpnI-gyel emésztjük, s ekkor egy 5,9 kb hosszú fragmentum [ApaI(6200)-KpnI(1817)] keletkezik, amely vektor szekvenciákat tartalmaz az E.coliban való fenntartás és szaporítás céljára,

5. Az (1)-(4) lépésekben kapott fragmentumokat tisztítjuk és a fragmentumok ekvimoláris mennyiségeit és a tízszeres moláris túlsúlyban lévő Mlul-linkert (CCACGCGTGG) ligáljuk, s így keletkezik a pCLB 101 plazmid. A KpnI, Báni és Apai helyeken kívül a pCLBlOl plazmid egy Mlul-linkert tartalmaz a MaelII és HgiAI helyek között (lásd a 3b, ábrát), A 3f ábrán látható, hogy négy további aminosav (P-V-A) található aD-712 és Q-1638 aminosavak (1. ábra) között, (C) pCLB203 :

A pCLBlOl-et és pCLB201-et a KpnI és Xbal enzimekkel emésztjük. A pCLBlOl-ből származó 2,4 Kb KpnI-Xbal fragmentumot a pCLB201-ből származó 7,0 kb KpnI-Xbal fragmentummal ligáljuk. A kapott pCLB203 plazmid intakt KpnI és Xbal helyet tartalmaz. Szerkezetét a 3f. ábra mutatja be.

4. példa

A pCLB212 szerkesztése

A pCL8212 szerkesztését a Kramer és mtsai [Nucl. Acids Rés., 12, 9441-9456 (1984)] által leírt loop-out mutagenezis technikával végezzük. A VIII. faktor cDNS centrális szakaszának deléciós mutagenezisét az alábbi nukleotid használatával végezzük: a ' TTC. CAA. AGA. TCA. ACA. CTG. GTT. TTG. GGT. GGT. CAG. AAC 5 ' primer IV a VIII. faktor cDNS-ban azoknak a belső szekvenciáknak a törlését idézi elő, amelyek a Lys-713tóla Ser-1637-ig terjedő aminosavakat kódolják.

A megfelelő proteinben - összehasonlítva a teljes hosszúságú VIII. faktor proteinnel - 925 aminosav csoportot érintő belső deléció van.

Hogy a loop-out mutagenezishez egy cél-fragmentumot kapjunk, kiválasztottuk a pCLB203-ból származó 1,4 kb HindlII-PstI fragmentumot (3. példa). A teljes hosszúságú VIII. faktor szekvenciában a HindlII hely nukleotid pozíciója (1. ábra) 1025 a módosítandó szakasz felett (upstream), a PstI hely pozíciója pedig 5165 e szakasz alatt (downstream). Ezeket a helyeket a 2. ábrán megjelöltük. Az 1,4 kb fragmentumot az M13mp9be szubklónozzuk, majd a loop-out mutagenezis következett. Kiválasztjuk a pontos deléciót tartalmazó fragmentumot, ezután a kívánt deléciót tartalmazó HindlIIPstl fragmentum Kpnl-Pstl részét beépítjük egy megfelelő expressziós vektorba oly módon, hogy ragadós, egyedi restrikciós enzimes végű fragmentumokat készítünk (a számok az 1. ábra számozásának felelnek meg) a következő lépések szerint:

1. lépés. A mutáns VIII. faktor molekulák expressziójához egy új plazmidot szerkesztünk, s ez a pCLB211 plazmid, A pCLB89-ből származó 7440 bp Sall-Hpal fragmentumot (1. ábra) beépítjük a pSVL expressziós vektorba (Pharmacia, Uppsala, Svédország; No. 27-4509-01), amely emlős sejtekben lehetővé teszi a transzkripciót egy késői SV40 promoter révén. A pSVL plazmidot Xhol-gyel és Smal-gyel hasítjuk. A kapott pCL8Bll plazmid a Sáli véghez kapcsoltan egy Xhol véget tartalmaz, mivel mindkét 5' kinyúló vége ezeknek az enzimeknek azonos és egy Smal véget a Hpal véghez kapcsoltan.

2. lépés. A pCLB211 plazmidot Apai-gyei és Sallgyel emésztjük. Izoláljuk az 1,4 Kb ApaI(6200)-Sall(a pCLB211 pSVL részében egyetlen ilyen hely) fragmentumot.

3. lépés. A pCLBlOO plazmidot Ndel-gyel, Pstl-gyel és Apai-gyei emésztjük. Két fragmentumot izolálunk: az egyik a 363 bp PstI (5165) -Ndel(5527) fragmentum, a másik a 674 bp Ndel (5527) - Apai (6200) fragmentum.

4. lépés. A pCLBlOO plazmidot KpnI-gyel és Saclgyel hasítjuk. Izoláljuk az 1799 bp KpnI (1817) Sacl(19) fragmentumot.

5. lépés. A pCLB211 plazmidot Sall-gyel és Sacl8

HU 213 300 Β gyei emésztjük. A 4,5 kb Sáli (a pSVL vektorban az egyetlen ilyen hely) - Sacl(19) fragmentumot izoláljuk.

6. lépés. A kívánt deléciót szekvencia analízissel bizonyítottan tartalmazó M13 bakteriofágot KpnI-gyel és Pstl-gyel emésztjük. Egy 584 bp Pstl(5165)-KpnI( 1819) fragmentumot izolálunk.

7. lépés. A 2-6 lépésben izolált hat fragmentum ekvimoláris mennyiségeit összekeverjük és ligázzal reagáltatjuk. Egy olyan plazmidot szelektálunk amely mind a hat fragmentumot tartalmazza. A pCLB212 plazmidban fejeződik ki a 3b vegyület (II. táblázat). A 3b vegyület abban különbözik a 3 vegyülettől (a 3f. ábra mutatja be), hogy elvesztette a Mlul-linkert és a megfelelő négy aminosavat.

5. példa

A pCLB208, pCLB209 és pCLB210 szerkesztése a pCLB208, pCLB209 és pCLB210 plazmidokat loop-out mutagenzis technikával szerkesztjük meg, Kramer és mtsai szerint [Nucl. Acids Rés., 12, 9441-9456(1984)].

(A) Loop-out mutagenezis.

A VIII. faktor cDNS középső szakaszának deléciós mutagenezisét az alábbi oligonukleotidokkal végezzük:

Primer I:

3' TTA. CGG. TAA. CTT. GGT. TCT. CTT. TAT. TGA. GCA. TGA. TGA 5’

Primer II:

3’ TTA. CGG. TAA. CTT. GGT. TCT^-AGT. CAA. CTT. TAC. TTC. TTC 5’

Primer III:

3' TTA. CGG. TAA. CTT. GGT. TCT. TCG. AAA. GTT. TTC. TTT. TGT 5'

A mutagenezisek következtében a VIII. faktor cDNSből a következő aminosavakat kódoló szekvenciák törlődnek : S-741 - R-1648 (primer I). S-741 - 1-1668 (primer II) és S-741 - 1-1689 (primer III), A megfelelő proteinekben 908 (I), 928 (II), illetve 949 (III) aminosav belső deléciója valósult meg.

(B) A cél-fragmantumok előállítása

Loop-out mutagenezishez alkalmas fragnentumhoz úgy jutunk el, hogy egy pCLBlOl-ből származó 0,8 kb fragmentumot készítünk a következőképpen:

A pCLBlOl plazmidot EcoRI-gyel emésztjük, az EcoRI helyeket betöltjük, majd KpnI-gyel emésztünk. Egy 479 bp Kpnl(1819) - EcoRI(2297) fragmentumot izolálunk (a nukleotid pozíciók számozását az 1. ábra tartalmazza). A pCLBlOl plazmidot BamHI-gyel emésztjük, a ragadós végeket betöltjük, majd újból emésztünk Pstl-gyel. Egy 416 bp BamrHI (4749) Pstl(5165) fragnentumot izolálunk. Az izolált fragmentumok ekvimoláris mennyiségeit ligáljuk és az M13mpl9-be szubklónozzuk. Az Ml3 bakteriofágban lévő 895 bp KpnI - PstI fragmentumot - ez a módosítandó szakasztól upstream helyű 1819-es nukleotidtól az e szakasztól downstream helyű 5165-nukleotidig terjed és a VIII. faktort kódoló szekvenciában nagy deléciót tartalmaz - választjuk ki a loop-out mutagenezishez. Az

I. II és III primerrel kapott pontos deléciókkal rendelkező fragmentumot szelektáljuk az M13 bakteriofágban. A kívánt deléciót tartalmazó KpnI-PstI fragmentumot a pCLB211-ből (lásd a 4. példát) származó egy megfelelő expressziós vektorba építjük be a következő lépések szerint, ragadós, egyedi restrikciós enzimes végeket tartalmazó fragmentumok készítésével (a számozás az

1. ábra szerinti):

(1) A pCLB211 plazmidot Apai-gyei és Sall-gyel emésztjük. Izoláljuk az 1,4 kb ApaI(6200) - Sáli (a pCLB211 pS VL részében lévő egyedi ilyen hely) fragmentumot.

(2) Az Ndel-gyel, Pstl-gyel és Apall-gyel emésztett pCLBlOO plazmidból izolálunk egy 363 bp Pstl(5165-Ndel(5527) fragmentumot és egy 674 bp Ndal(5527) - Apai (6200) fragentumot.

(3) A pCLBlOO plazmidot KpnI-gyel és Sacl-gyel emésztjük és izoláljuk az 1799 bp Kpnl( 1817) - Sacl( 19) fragmentumot.

(4) A pCLB211 plazmidot Sall-gyel és Sacl-gyel emésztjük. Izoláljuk a 4,5 kb Sall(egyedi ilyen hely a pSVL vektorban) - Sacl(19) fragmentumot.

(5) A kívánt mutációval rendelkező fragmentumot tartalmazó Ml3 bakteriogáfot KpnI-gyel és Pstl-gyel emésztjük. A kívánt mutációt tartalmazó KpnI-PstI fragmentumot izoláljuk mindhárom mutagenazis szempontjából.

(6) A fenti (1)-(5) lépésekben izolált hat fragmentum ekvimoláris mennyiségeit összekeveijük és ligáz reakciót végzünk. Hibridizálás és restrikciós enzimes emésztés segítségével szelektáljuk az összes kívánt fragmentumot tartalmazó plazmidokat. A fenti I, II és III primerek használatával az alábbi három új expressziós vektort szerkesztjük meg az I, táblázatban feltüntetett mintavegyületek kifejezésére:

1. pCLB208 a 7. vegyülethez a primer I-gyel,

2. pCLB209 a 8. vegyülethez a primer II-vél és

3. pCLB210 a 9. vegyülethez a primer III-mal.

6. példa

A rekombináns VIII. faktor DNS tranziens expressziója és a kapott proteinek vizsgálata (A) A COS-1 sejtek transzfakciója és metabolikus jelzés.

Az előző példák szerint előállított expressziós vektorokat COS-1 sejtekbe vezetjük be DEAE transzfekciós technikával. A vektor DNS kicsapását úgy végezzük, hogy 2 órán át inkubáljuk DEAE-dextránnal, majd klorokin sokkot alkalmazunk 2 órán át Lopata és mtsai [Nucl. Acids Rés., 12, 5707 (1984)], valamint Luthman és Magnusson [Nucl. Acids Rés., 11,1295 (1983)] szerint. A COS-1 sejtek tenyésztéséhez és a kondicionált táptalajhoz az Iscove féle DMEM (FLOW cég) oldatot használjuk, 10% (térftérf) hővel inaktivált fetális borjúszérummal (FLOW) kiegészítve. A tápoldatot a transzfekció után 48 óra múlva kicseréljük. A kondicionált tápoldatot 48 órával később összegyűjtjük.

A transzficiált sejtekben a proteinek metabolikus jelzését szérum mentes RPMI-tápoldat (GIBCO cég) használatával végezzük. A transzfekció utáni második napon a transzficiált sejteket 4 órán át 50 pCi/ml L-³’Smetioninnal (Amersham cég, 1985; 370 MBeq/300-μΙ;

HU 213 300 Β specifikus aktivitás: > 100 ci/mmól) inkubáljuk, majd egy éjszakán át inkubáljuk 1 mM L-metioninnal, mielőtt a kondicionált táptalajt learatnánk. Abból a célból, hogy megakadályozzuk a protein degradációját, az aratás előtt proteáz inhibitorokat, ilyen a fenil-metil-szulfonil- fluorid (PMSF), adunk a kondicionált tápoldathoz. A protein glükoziláctójának a gátlására tunicamycint adhatunk a kondicionált táptalajhoz 0,001 mg/ml végkoncentrációban. A kondicionált táptalajokat a transzfekciót követő 4. napon fejtjük le és a termelt proteineket megvizsgáljuk.

(B) A rekombináns VIII. faktor biológiai aktivitása

A kondicionált táptalaj VIII. faktor aktivitásának meghatározásához 1) standard koagulációs vagy alvadási vizsgálatot és 2) kromogén aktivitási vizsgálatot (KABI Coatest) használhatunk.

A standard koagulációs vagy alvadási vizsgálatot (az un. aktivált parciális tromboplasztin időt) Veldkamp és mtsai [Thromb. Diath. Haenorrh., 19,279 (1968)] szerint végezzük, hemofiliás plazma használatával. A kondicionált táptalajhoz citrátot adunk a vizsgálat előtt.

A kromogén aktivitási vizsgálatot vagy Rabi Coatestet a Kabi-Vitrum cég által rendelkezésünkre bocsátott eljárás szerint végeztük, azt kivéve, hogy az előírt térfogatokat néggyel osztottuk és 25 μΐ kondicionált táptalajt teszteltünk. A VIII. faktor-szerű proteineket 15 percig aktiváljuk, mialatt hozzáadjuk a kromogén szubsztrátumot (S2222).

A VIII. faktor aktivitás gátlását a standard Bethesda technológia [Kasper és mtsai, Thromb. Diath. Haemorrh. 34, 869-871 (1975)] szerint mérjük. A használt immunglobulinokat ioncserélő és protein-A-Sepharose kromatográfiával tisztítjuk a felhasználás előtt.

A VIII. faktor biológiai aktivitása vizsgálatánál használt standard egy citrátos plazma (0,05 mM végkoncentrációval) pool volt, amelyről feltételeztük, hogy 1 egységnyi VIII. faktor aktivitást vagy antigént tartalmaz ml-enként.

A deletált proteinek biológiai aktivitása különbözött, amint ezt a II. táblázat mutatja.

A deletált proteinek VIII. faktor alvadási aktivitást fejtettek ki.

Ezenfelül azt találtuk, hogy a rekombináns protein oldatban megállapított biológiai aktivitás gátlódik olyan antitestek hozzáadása után, amelyekről tudjuk, hogy a plazma eredetű, VIII. faktor aktivitás inhibitorai és/vagy olyan un. inhibitor-szérumok hozzáadására, amelyeket inhibitorokat tartalmazó betegektől vettünk le, azaz olyanoktól, akiknek VIII. faktor elleni antitesteket tartalmazott a vérük, (C) Immunológiai kereszt-reakciók VIII. faktorral (1) Monoklonális antitestek előállítása

Balb/c egereket immunizálunk tisztított humán VIII. faktor-von Willebrand faktor komplex-szel, amelyet gyógyászati célra használt VIII. faktor koncentrátum krioprecipitátumából (Holland Vöröskereszt Vértranszfúziós szolgálatának Központi Laboratóriuma, Amszterdam, Hollandia) agaróz gél szűréssel állítunk elő [Van Mourik és Mochtar. Biochim. Biophys. Acta, 221, 677-679 (1970)]. A limfocita hibridizálást Galfre és mtsai [Natúré, 266, 550-552 (1977)] leírása szerint végezzük. A VIII. faktorral szemben monoklonális antitestet termelő kiónok kiválasztására használt technikák leírását doktori tézis tartalmazza (Stel, doktori tézisek, Amszterdami Egyetem, Hollandia, 1984). A VIII. faktor elleni monoklonális antitestek azonosítását a VIII. faktor polipeptidekkel való reakciójuk alapján végeztük az EP 0 254 355 számú európai szabadalmi bejelentésben leírtak szerint.

(2) VIII. faktor polipeptidek elleni poliklonális antitestek előállítása

Nyulakat immunizálunk kromatográfiásan tisztított VIII. faktor készítményekkel (Stel, lásd fentebb) standard eljárásokkal. Az így kapott antitestek vizsgálatát immunobiot módszerrel végeztük az EP 0 253 455 számú európai szabadalmi bejelentésben leírtak szerint, tisztított VIII. faktor - von Willebrand faktor komplex vagy tisztított polipeptidek használatával. Az antitesteket poliakrilamid gél elektroforézissel izoláljuk, majd nitrocellulóz lemezekre visszük, cél-proteinek gyanánt. Három különböző antiszérumot kaptunk: RH 63 271, RH 63 272 és RH 63 275. Az antiszérumok a 80 KD dublettel, a 92 KD polipeptiddel, továbbá nagyobb molekulatömegü polipeptidekkel reagáltak. Ezek az antiszérumok a VIII. faktor kisebb fragmentumaival is reagáltak.

(3) ELISA

Egy újonnan kidolgozott ELISA-t (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) használtunk a VIII. faktor antigénnek a kondicionált táptalajban való kimutatására. A CLB,CAgA VIII. faktor-specifikus monoklonális antitestet megfelelően hígítjuk (5 mg/1) 0,05 mólos karbonát-pufferrel (pH = 9,8) és az oldatból 200 μΐ-eket mérünk az ELISA lemezek tartályaiba a fedés végett. A lemezeket zárjuk és 4 °C-on inkubáljuk egy éjszakán át. Minden inkubálás között a lemezeket háromszor mossuk 0,05% Tween-20 tartalmú PBS-el úgy, hogy az oldatot legalább 1 percig hagyjuk a lemezeken.

A vizsgálandó mintákból vagy normál plazmából hígítást sort készítünk, s a hígításokból kétszer 200 mieket pipettázunk a tartályokba. A lemezeket zárjuk és 37 °C-on inkubáljuk 2 órán át rázás nélkül, majd mosás következik a fent leírtak szerint. Az antigén hígításához puffért (pH = 7,4) használunk, amely 50 mM trisz. HCl-puffert, 2% marhaszérum albumint és 1,0 M nátrium-kloridot tartalmaz.

A CLB,CAgl 17-torma-peroxidáz konjugátumokat körülbelül 10 000-szeresre hígítjuk (a kívánt érzékenységtől függően) 50 mM trisz. HCl-t, 0,2% Tween-20-at és 1,0 M nátrium-kloridot tartalmazó pufferrel (pH = 7,4). Ebből a hígításból 200 ml-eket mérünk minden tartályba, a lemezeket lezárjuk és 2 órán át 37 °C-on inkubáljuk sötét helyen.

A lemezeket mossuk, mint fent leírtuk, majd tetrametilbenzidin (TMB ; 0,1 g/1 ) és hidrogén-peroxid (0,006%) 0,1 mólos acetát/citromsav pufferben (pH = 5,5) Készített oldatából 150 μΐ-eket adunk minden tartályhoz.

A lemezeket 30 percig inkubáljuk szobahőmérsékleten, sötét helyen. Az enzim-reakciót 150 μΐ 1M kénsav

HU 213 300 Β hozzáadásával állítjuk le. Az abszorpciót 450 nm-en határozzuk meg ELISA mikro-leolvasó készülékben. A II. táblázatból kitűnik, hogy a mind erősebben kondicionált tápoldatok VIII. faktor aktivitása növekedett és ez közel arányos volt a a tápoldatban lévő VIII. faktor proteinek mennyiségi növekedésévéi.

(D) Méretmeghatározás

A termelt VIII. faktor proteinek méretét gél-elektroforézissel határozzuk meg az alábbiak szerint.

A plazma-eredetű VIII. faktorral szembeni monoklonális és poliklonális szérumokat használjuk az immun-precipitációhoz. Az antitesteket A-Sepharosa-on immobilizáljuk (15 μΐ szérum/10 mg protein-A-Sepharose), majd a metabolikus úton jelzett rekombináns VIII. faktorszerű vegyületekkel inkubáljuk. Az immobilizált rekombináns proteineket 10 %-os béta-merkapto-etanollal redukáljuk, ezután 5 %-os poliakrilamid-SDS gél-elektroforézis rendszerben [Laemmli, Natúré, 227, 680-685 ( 1972 )] választjuk el. A 4. ábra és a III. táblázat mutatja, hogy a VIII. faktorszerű proteinek méretére olyan értékeket kaptunk, mint amiket a glükozilált proteinekre vártunk. Kisebb sávok szintén látszanak a kontroll nyomvonalán.

AIII. táblázatban bemutatott eredmények alapján azt a következtetést vonhatjuk le, hogy a jelen találmány szerinti rekombináns VIII. faktorszerű proteinek glukoziláltak, mivel szignifikáns különbség van a tunicamycint tartalmazó és tunicamycint nem tartalmazó táptalajban képződött proteinek mérete között, ugyanis a tunicamycin ismert inhibitora az aszparaginhoz kapcsolódó glükozilációnak.

7. példa

VIII. faktor aktivitású proteineket termelő stabil sejtvonalak szerkesztése (A) Kifejeződés CHO sejtekben

ApCLB203 plazmidot (10 pg) és apAdD26SV/A/-3 plazmidot [1 pg ; Kaufman és Sharrp, Mól. Cell. Bioi., 2,1304-1319 (1982)] bevezetjük dhfr deficiens

CHO sejtekbe [Chasin és Urlaub. Proc. Natl. Acad. Sci., 77, 4216—4220 (1980)], kalcium-foszfát precipitációs technika [Graham és Van dér Eb, Virology, 52,456-467 (1973)] segítségével. A VIII. faktor és a dhfr kódoló szekvenciák szaporítását úgy érjük el, hogy a sejtekhez hozzáadunk fokozatosan növekvő koncentrációban metotrexátot (mtx) Kaufman és Sharp [J, Mól. Bioi. , 159, 601-621 (1982)] előírása szerint. Egymástól független, 200 nM mtx-re rezisztens transzformált sejteket szűrtünk ki és megállapítottuk, hogy ezek stabil sejtvonalak. Számos ilyen sejtvonal mintegy 75 mE VIII. faktor aktivitást termelt táptalaj ml-enként A táptalajba szekretálódott VIII. faktor aktivitás mennyiségét tovább növelhetjük, ha a VIII. faktor kódoló szekvenciákat tovább szaporítjuk növekvő mtx koncentrációk használatával.

(B) Kifejeződés Cl27 sejtekben

A fent leírtak szerint, az expressziós vektorok eukarióta sejtekbe is bevezethetők, ahol a gazdasejt genomjába integrálódnak. Az expressziós kazetták ezt követően sokszorozódhatnak, Az expressziós vektor integrálásának egy másik formája, ha episzómálisan stabilan fennmarad. Ez utóbbira példa az egyik „mutáns” VIII. faktor protein expressziója episzómális BPV-rendszer alkalmazása esetén [Howley és mtsai Meth. Enzymol., 101, 387-402 (1983)]. A BFV-1 genomot (BamHI-gyel hasítva) először a pTZ18R (Pharmacia) egy BamHI-gyel hasított származékába vezetjük be, amely a BamHI hely mindkét oldalán Xhol helyeket tartalmaz. Ezután a kapott pTZX-BPV plazmidot Xhol-gyel hasítjuk, amikoris egy 2,9 kb pTZ-fragmentumot és egy 9 kb BPV-fragmentumot kapunk Xhol kiálló végekkel. Ez utóbbi fragmentumot a pCLB212 plazmidba Egáljuk, amelyet előzőleg egyetlen Sáli helyén (az eredeti pSLV vektor 2040, pozíciója) hasítottunk. A keletkezett pGB881 vektor az SV40 késői promotert, a VIII. faktor cDNS-t kódoló szekvenciát - melyből 2775 bp hiányzik (főként a B-domén) - és az SV40 késői poliadenilációs szignálját tartalmazza. A BPV-genom jelenléte következtében ez a vektor episzómálisan tartható fenn olyan megfelelő gazdasejtekben, mint amilyenek az egér C 127 sejtek.

A pGB881 plazmiddal (10 pg) transzficiáljuk a C127 sejteket kalcium-foszfát precipitációs technika segítségével (Graham és Van dér Eb, lásd fentebb). A transzfekció után 14 nappal izoláljuk a transzficiált sejteket, majd stabil sejtvonalakat állítunk elő. Számos sejtvonal táptalaj ml-enként 40 mE értékű VIII. faktor aktivitást termelt.

8. példa

A pCLB204 szerkesztése

A pCLB204 plazmidot a Kramer és mtsai által leirt [lásd: General Methods, 2 (1984)] loop-out mutagenezis technikával szerkesztjük meg. A VIII. faktor cDNS középső szakaszának deléciós mutagenezisét a

3' TAG. GTT. TRA. GCG. AGT. CAA. GTT. TTG. GGT. GGT. CAG. AAC 5' képletű primer V-tel végezzük, amikoris a VIII. faktor cDNS-ben belső deléció keletkezik az Ala-375-től Ser1637-ig (primer V) teijedő aminosavakat kódoló szekvenciákban.

A megfelelő protein belsejéből 1263 aminosav törlődött.

Hogy a loop-out mutagenezishez egy cél-fragmentumhoz jussunk, kiválasztottuk a pCLB203-ból (3. példa) származó 1,4 kb HindlII-PstI fragmentumot, A HindlII hely nukleotid pozíciója a teljes hosszúságú VIII. faktor szekvenciában 1025-nél (1. ábra) van, a módosítandó szakasz felett (upstream), a PstI hely 5165. pozíciója a szakasz alatt (downstream) található. Ezek a helyek a 2. ábrán láthatók. Az 1,4 kb fragmentumot az M13mp9be szubklónozzuk, majd elvégezzük a loop-out mutagenezist. Az M13 bakteriofábban a primer V-tel kapott pontos deléciót tartalmazó fragmentumot kiválasztjuk, majd a kívánt deléciót tartalmazó HindlII-PstI fragmentumot beépítjük a pCLB201-ből származó megfelelő expressziós vektorba a következő lépések alkalmazásával és ragadós, egyedi restrikciós enzim végekkel ellátott fragmentumok előállításával (a számozás az 1. ábra számozásának felel meg).

HU 213 300 Β

1. lépés. A pCLB201 plazmidot Aval-gyel és Xbalgyel emésztjük, s ekkor egy körülbelül 6 kb Aval(737) - Xbal(6951) vektor fragmentum keletkezik.

2. lépés. A pCLB201 plazmidot Aval-gyel és HindlII-gyel emésztjük, amikoris egy 289 bp hosszú Aval(737) - HindIII(1025) fragmentum keletkezik.

3. lépés. A pCLB201 plazmidot Pstl-gyel és Ndelgyel emésztjük, miáltal egy 363 bp hosszú Pstl(5165)-Ndel(5527) fragmentumot kapunk.

4. lépés. A pCLB201 plazmidot Ndal-gyel és Sbalgyel emésztjük, melynek eredményeképpen az 1425 bp Ndel(5527) - Xbal(6951) fragmentumhoz jutunk.

5. lépés. A kívánt mutációval rendelkező fragmentumot tartalmazó Μ13 bakteriofágot HindlII-mal és Pstlgyel emésztjük.

6. lépés. Az öt fragmentumot izoláljuk, ekvimoláris mennyiségeit összekeverjük és ligáljuk. Azokat a plazmidokat választjuk ki, amelyek az összes fragmentumot tartalmazzák. A fent bemutatott primer V segítségével egy új expressziós vektort szerkesztünk az I. táblázatban szereplő minta-vegyület expresszi ója céljára : pCLB204 a 4. vegyület számára a primer V-tel.

A jelen találmányban leírt DNS szerkezetek és módszerek VIII. faktor aktivitású polipeptidek előállítására adnak eljárást, mely szerint egy VIII. faktorral rokon anyagot kódoló deléciós mutáns gént vezetünk be egy gazdasejtbe. A találmány tárgyát képező készítmények az A-hemofiliás kórképek kezelésében nyernek felhasználást.

A leírásban említett minden közlemény és szabadalmi bejelentés a szakismeretek szintjére utal azok számára, akik e találmánnyal kapcsolatos szakterületen tevékenykednek. Minden irodalmi közlemény és szabadalmi bejelentés olyan mértékben tekinthető a leírásban referenciaként, amennyire az egyes közleményeket vagy szabadalmi bejelentéseket speciálisan és egyedileg szükséges referenciaként alkalmazni.

A találmány teljes leírása az ezen szakterületen átlagos jártassággal rendelkezők számára világosan megmutatja, hogy a leíráshoz képest számtalan változtatást és módosítást végezhetnek anélkül, hogy a szabadalmi igénypontok szellemétől vagy oltalmi körétől eltérnének.

IRODALOM

Brinkhous, K.M, et al., (1985)

Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 8752-8756

Bürke, R.L. et al. , (1986)

J. Bioi. Chem. 261, 12574-12578.

Carter, P. et al., (1985)

Nucleic Acids Rés. 13, 4431

Chasin, L.A. and Urlaub, G. (1980)

Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216-4220

Eaton, D. L. et al., (1986a)

Biochemistry 25, 505-512

Eaton, D.L. et al., (1986b)

Biochemistry 25, 8343-8347

Fay, J.F. et al. ,(1986)

Biochem. Biophys. Acta 871, 268—278

Galfré, G. et al., (1977)

Natúré 266, 550-552

Gulzman, Y., (1981)

Cell 23, 175-182

Gorman, C., (1985)

DNA cloning (Ed. : D. Glover), IRL-press, Washington Oxford, pp. 143-169

Graham, F. and Van dér Eb, A. (1973)

Virology 52, 456—467

Hanahan, D., (1983)

J. Mól. Bioi, 166, 557-580

Howley P. M., Sarver, N. and Law, M. F. (1983) Meth. Enzymol. 101, 387—402

Hurwitz, D. R., Hodges, R., Drohan, W. and Sarver, H. (1987)

Nucl. Acids Rés. 15, 7137-7153 Kasper, C.K. etal. ,(1975)

Thrombs. Diath. Haemorrh. 34, 869-871 Kaufman, R. J. and Sharp, P.A. (1982)

Mól. Cell. Bioi. 2, 1304-1319 Kaufamn, R. J. and Sharp, P.A. (1982a)

J. Mól. Bioi. 159, 601-621 Kozák, M. (1983)

Microbiol. Rév. 47, 1—45 Kramer, W. et, al., (1984)

Nucleic Acids Rés. 72, 9441-9456 Laemmli, U. K., (1970)

Natúré 227, 680-685 Luthman, H. and Magnusson, G. (1983)

Nucleic Acids Rés. 77, 1295 Maniatis, T. et al., (1982)

Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory

Maxam, A. M. and Gilbert, W. (1980)

Methods Enzymol. 65, 499-560

Méltón, D. A. et al,, (1984)

Nucleic Acids Rés. 72, 7035-7056

Mulligan, R. and Berg, P. (1981)

Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 2072

Sanger, F. et al., (1977)

Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467

Stel, Η. V. ,(1984)

Ph.D. thesis, University of Amsterdam, The Netherlands

Toole, J. T. ,et al,, (1986)

Proc. Natl. Acad. Sci, USA 83, 5939-5942

Van Mourik, J. A. and Mochtar, J. A., (1970) Biochim, Biophys. Acta 227, 677-679

Van Zonneveld, A. J., et al,, (1986)

Proc. Natl. Acad. Sci USA 83, 4670-4674

Vehar, G.A., et al., (1984)

Natúré 372, 337-342

Veldkamp, J. J. et al., (1968)

Thromb. Diathes Haemorrh. 19, 279

Wood, W. I, et al. ,(1984)

Natúré, 372, 330-337

Yanisch-Perron, C. et al., (1985)

Gene 33, 103-119

HU 213 300 Β

I. táblázat

Deléciós mutáns VIII. faktor proteinek

Vegyü- let	Nr	NR ♦Del.	Lr	Lr ♦Del.	Cr	Cr ♦Del.	Expressziós vektor
1.	A-l—»R-740	0	S—741®S—1637	0	Q-1638—>Y-2332	0	pCLB201
2.	A-l->R-740	0	S-741->A-867+ D-1563-»S1637	695	Q-1638->Y-2332	0	pCLB202
3.	A-1->D-712	28	P-R-V-A	897	Q-1638->Y-2332	0	pCLB203
3b.	A-1->D-712	28	peptidkötés	897	Q-1638->Y-2332	0	pCLB212
4.	Λ-l—>V-374	366	peptidkötés	897	Q-1638->Y-2332	0	pCLB204
7.	A-l—>R-740	0	peptidkötés	897	Q-1649^Y-2332	11	pCLB208
8.	A-l->R-740	0	peptidkötés	897	Q-1669-»Y-2332	31	pCLB209
9.	Λ--1—>R-740	0	peptidkötés	897	Q-1690-»Y-2332	52	pCLB210

—> A VIII. faktor aminosavak egy megszakítás nélküli szekvenciája * A Del. jelzéssel ellátott oszlopokban az illető szakaszban törlődött aminosavak száma szerepel a teljes hosszúságú VIII. faktorral összevetve. Az aminosavak számozása az 1. ábra számainak felel meg.

II. táblázat

VIII. faktor aktivitás és proteinek mennyisége

Vegyület/1	Aminosavak	Vili. faktor aktivitás (mE/ml) 7/	Maradék aktivitás 224 CLB.CAg pat.J52	Antigén meghatározás8'
hossza	(deléciója)	2* kromogén '	standard32
			vizsgálat
1	2332	(0)	1,0	_«)	J>)	_6)	<5 mU
2	1637	(695)	6,7	2	<1%	<1%	7 mU
3	1411	(925)	17,3	5	<2%	<1%	20 mU
3b	1407	(925)	15,0	nd9’	nd9’	nd9)	20 mU
4	1069	(1263)	0	0	0	0	20 mU
7	1424	(908)	15,0	ND	ND	ND	ND
8	1404	(928)	15,0	ND	ND	ND	ND
9	1383 (pSV2)	(949)	0 0	ND 0	ND	ND	ND 0

Lásd az I. táblázatot ²’ Kromogén meghatározás (KABI Coatest)

Standard alvadási vizsgálat ⁴’ CLB. CAgA VIII. faktor elleni monoklonális antitest (Stel, doktori tézisek Amszterdami Egyetem, Hollandia, 1984) ⁵’ J. beteg szérumából izolált inhibitor ⁶’ A kezdeti aktivitás túl alacsony volt ahhoz, hogy az esetleges inaktíválódást észlelni lehessen

Kondicionált táptalajok aktivitása 48 órás inkubálás után. Egy egység (Ε) VIII. faktor 100 ng VIII. faktor proteinnek felel meg.

⁸’ ELISA (= enzyme-linked immunosorbent assay) ⁹’ ND (= nőt determined) nem vizsgáltuk

III. táblázat

A szekretált Vili, faktor proteinek mérete

Vegyület/1	Expressziós vektor	Hosszúság2’	Deléció3’	Méret	Glükoziláció gátlás6’
számított4’	meghatározott5’
1	pCLB 201	2322	0	265 kDa
2	pCLB 202	1637	695	188 kDa	192 kDa	185 kDa
3	pCLB 203	1411	925	162 kDa	168 kDa	158 kDa
3b	pCLB 212	1407	925	162 kDa	168 kDa
4	pCLB 204	1069	1263	123 kDa	135 kDa

’’ Lásd az I. táblázatot ²’ Hosszúság = az expressziós vektorban lévő VIII. faktort kódoló szekvencia által meghatározott aminosavak száma ³’ Deléció = a megfelelő expressziós vektorban lévő teljes hosszúságú VIII. faktort hódoló szekvenciából törlődött aminosavak száma.

⁴’ Az ismert aminosav összetétel alapján számított méret kilodaltonban kifejezve.

⁵’ A jelzett protein immunprecipitációval, majd elektroforézissel meghatározott mérete kilodaltonban kifejezve. Tunicamycint tartalmazó táptalajban tenyésztett sejtekből származó proteinek mérete kilodaltonban kifejezve.

Claims (22)

1. Eljárás VIII. faktor biológiai aktivitású proteineket kódoló deléciós DNS-szekvenciák előállítására, azzal jellemezve, hogy izolált VIII. faktor-gén genomiális DNS-szekvenciáit módosítjuk úgy, hogy a VIII. faktor fehérje 741-1637. aminosavmaradékából álló B doménjét kódoló DNS-szekvenciát deletáljuk, vagy delécióval és inszercióval 4 aminosavmaradékot kódoló DNS-szekvenciára rövidítjük; és a VIII. faktor fehétje 1-740. aminosavmaradékából álló A1A2 doménjét kódoló DNS-szekvenciában legfeljebb 5%-os deléciót hozunk létre, vagy a VIII. faktor fehérje 1638-2332. aminosavmaradékából álló C_R szakaszát kódoló DNS-szekvenciában legfeljebb 2%-os deléciót hozunk létre.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a VIII. faktor fehérje 741-1637. aminosavmaradékából álló B doménjét kódoló DNS-szekvenciát deletáljuk; és a VIII. faktor fehérje 1-740. aminosavmaradékából álló A1A2 doménjét kódoló DNS-szekvenciát delécióval az 1-712. aminosavmaradékokat kódoló DNSszekvenciára rövidítjük.

3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a VIII. faktor fehérje 741-1637. aminosavmaradékából álló B doménjét kódoló DNS-szekvenciát delécióval és ezt követően a P-R-V-A aminosavszekvenciát kódoló szakasz inszertálásával 4 aminosavmaradékot kódoló DNS-szekvenciára rövidítjük.

4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a VIII. faktor fehérje 741-1637. aminosavmaradékából álló B doménjét kódoló DNS-szekvenciát deletáljuk; és a VIII. faktor fehérje 1638-2332. aminosavmaradékából álló C szakaszát kódoló DNS-szekvenciát delécióval az 1649-2332. aminosavmaradékokat kódoló DNS-szekvenciára rövidítjük.

5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a VIII. faktor fehérje 741-1637. aminosavmaradékából álló B doménjét kódoló DNS-szekvenciát deletáljuk; és a VIII. faktor fehérje 1638-2332. aminosavmaradékából álló C szakaszát kódoló DNS-szekvenciát delécióval az 1669-2332. aminosavmaradékokat kódoló DNS-szekvenciára rövidítjük.

6. Az 1-5.igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy VIII. faktort tartalmazó sejtekből izolált VIII. faktor gént enzimes hasítást követő módosítással és a módosított fragmentumok ligálásával vagy helyspecifikus mutagenezissel deletálunk.

7. Eljárás VIII. faktor biológiai aktivitású proteineket kódoló DNS-szekvenciákat tartalmazó expressziós vektorok előállítására, azzal jellemezve, hogy a transzkripció irányába haladva egy gazdasejtben funkcionáló transzkripció szabályzó szakaszt és transzlációt indító szakaszt, egy 1. igénypont szerint előállított, VIII. faktor biológiai aktivitású proteint kódoló DNS-szekvenciát, valamint transzlációs és transzkripciós terminátor szakaszokat tartalmazó DNS-szakaszt megfelelő vektorba inszertálunk.

8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy transzkripció szabályzó szakaszként egy RSVLTR promotert és ettől 5'-irányban tandem kapcsolódó SV40 korai promotert inszertálunk.

9. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 3. igénypont szerint előállított DNS-szakaszt megfelelő vektorba inszertálva a pCLB203 plazmidot állítjuk elő.

10. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 4. igénypont szerint előállított DNS-szakaszt megfelelő vektorba inszertálva a pCLB208 plazmidot állítjuk elő.

11. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az 5. igénypont szerint előállított DNS-szakaszt megfelelő vektorba inszertálva a pCLB209 plazmidot állítjuk elő.

12. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 2. igénypont szerint előállított DNS-szakaszt megfelelő vektorba inszertálva a pCLB212 plazmidot állítjuk elő.

13. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 2. igénypont szerint előállított DNS-szakaszt megfelelő vektorba inszertálva a pGB881 plazmidot állítjuk elő.

14. Eljárás VHI. faktor biológiai aktivitású proteinek termelésére képes transzformált gazdasejt előállítására, azzal jellemezve, hogy egy gazdasejtet egy, a 7-13. igénypontok bármelyike szerint előállított expressziós vektorral transzformálunk.

15. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy emlős sejtet transzformálunk.

16. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy COS sejtet, CHO sejtet vagy Cl27 sejtet transzformálunk.

17. Eljárás VIII. faktor biológiai aktivitású,

Nr-Lr-Cr általános képletű proteinek - a képletben Lr jelentése kötés vagy P-R-V-A aminosavszekvencia;

Nr jelentése a VIII. faktor protein 1-740. aminosavmaradékaiból álló AlA2-doménjéből származtatható szekvencia, amelyben kívánt esetben az AlA2-domén összes aminosavmaradékának legfeljebb 5%-a deletált; és

C_R jelentése a VIII. faktor protein 1638-2332. aminosavmaradékaiból álló szakaszából származtatható szekvencia, amelyben kívánt esetben a szakasz összes aminosavainak legfeljebb 2%-a deletált előállítására, azzal jellemezve, hogy megfelelő táptalajon tenyésztünk egy 14-16. igénypontok bármelyike szerint előállított transzformált gazdasejtet, és a termelt proteint ismert módon kinyerjük a tenyészetből.

18. A 17. igénypont szerinti eljárás, azzaljellemezve, hogy a 12. vagy 13. igénypont szerint előállított plazmiddal transzformált gazdasejtet tenyésztünk.

19. A 17. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 9. igénypont szerint előállított plazmiddal transzformáit gazdasejtet tenyésztünk.

HU 213 300 Β

20. A 17. igénypont szerinti eljárás, azzaljellemezve, hogy a 10. igénypont szerint előállított plazmiddal transzformált gazdasejtet tenyésztünk.

21. A 17. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 11. igénypont szerint előállított plazmiddal transzformált gazdasejtet tenyésztünk.

22. Eljárás hatóanyagként VIII. faktor biológiai aktivitású proteint tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy egy, a 17-21. igénypontok bármelyike szerinti eljárással előállított, VIII. faktor biológiai aktivitású proteinnek a VIII. faktor hiánya által fellépő tünetek enyhítésére hatásos mennyi5 ségét a gyógyszertechnológiában szokásosan használt hordozó, hígító, adjuváns és/vagy más segédanyagokkal kombinálva ismert módon gyógyszerkészítménnyé alakítjuk.