PT87721B - Provesso para a preparacao de novas proteinas com actividade de factor viii, de composicoes farmaceuticas que as contem, de sequencias de adn que codificam para estas proteinas e de vectores que contem estas sequencias de adn - Google Patents

Description

INTRODUÇÃO

Domínio técnico

A presente invenção refere-se a novas proteínas dotadas de actividade de factor ΙΠ e a métodos para a sua preparação usando linhas de células e microorganismos manipulados, geneticamente.

Antecedentes

A hemofilia A é uma afecção hemorrágica ligada ao sexo caracterizada por uma deficiência no factor VIII, um elemento essencial na cascata de coagulação do sangue. Esta doença ocorre em cerca de 0,01% da população masculina. A hemofilia A pode ser tratada por administração de plasma sanguíneo contendo factor VIII obtido a partir de dadores sãos. No entanto este tratamento tem várias desvantagens.. A disponibilidade de factor VIII é limitada a este produto é muito caro; a concentração de factor ^?III no sangue é apenas de cerca de 100 ng/ml e os rendimentos usando os métodos de fraccionamento correntes são baixos. !J%a vez que a fonte do factor VIII é uma mistura de s .migue de vários dadores, o receptor ocorre em alto risco de adquirir várias doenças infecciosas, incluindo as causadas pelos vírus da hepatite não-A, não-3, da hepatite 3 ou da oIDA, os quais podem estar presentes no sangue de um dos dadores. Além disso, os receptores podem desenvolver anticorpos contra o factor VIII exógeno, o que pode reduzir consideravelmente a sua efica cia.

factor VIII contém três .regiões, uma região N-terminal, o chamado domínio A1A2; uma região central, o chamado domínio 3; e uma região C-terminal contendo os domínios A3, Cl e C2. Crê-se que o domínio A1A2 e a região C-terminal são essenciais pira a actividade da coagulação. 0 factor VIII circula no sangue combinado com uma proteína, o factor de von dillebrand (wíf), que se crê proteger o factor Vh.II sensível contra a degradação precoce.

factor VIII é o . tido em rendimentos insatisfatoriamente baixos quando produzidos por processos conhecidos de ADN recombinante. Para além disco, aparentemente as proteínas não estão presentes sob a forma de uma cadeia intacta e daí que estas produtos sejam difíceis de isolar e de purificar e consequentemente que os custos de obtenção

sejao elevados. É portanto desejável desenvolver uma via efi ciente para produzir grandes quantidades de compostos dotados de actividade de factor VIII, tendo de preferência estes compostos uma actividade imunogénica reduzida.

biteratura relevante

T_em sido descritos processos de cionagem molecular de ADNc de factor VIII obtido a partir de ARNm humano e a subsequente produção de proteínas dotadas de actividade de factor VIII em células de mamíferos, deteve duras e de bactérias. Ver 85/0196.1, EP 0 1 604 5 7, EP O15G73 e EP 0253455. Na EP 0253455 descreve-se um método para a produção de proteínas dotadas de actividade de factor VIII usando microorganismos transformados. Os pedidos de r_atentes Europeias EP 0150735 e SP 0123945 e Brinkhous et al. (1935) descrevem actividade de factor VIII em produtos de cisão proteolitica do factor VIII. Um complexo de dois produtos de cisão proteolitica do factor VIII, um polipeptídeo de 32 kDA e um de 30 KDa apresentam actividade melhorada de factor VIII. (Fay et al., Biochem.. Bjophys. Acta (1986) 871:268 -278; Eaton et al., Biochemistry (1986) 25:505-512) .

Eaton et al., Siochemistry (1985) 25:8343-8347 descreve que um polipeptídeo no qual 766 ácados aminados (737-1562) foram suprimidos da região central mantêm a actividade de factor VIII. Para além disso, células de mamíferos transformadas com um vector contendo ADN que codifica para este polipeptídeo em que foi efectuada a supressão possuem um nível de produção superior ao das células transformadas com um vector contendo ADN que codifica para o polipeptídeo integral.

pedido de PCI S6/C61O1 descreve proteínas de factor VIII recombinante com supressões atê 830 ácidos aminados na região central que apresentam actividade de factor VIII. A_g supressões mais longas estendem-se desde

Thr-760 até Asn-1639 (numeração de acordo com a Figura 1).

A_s células hospedeiras para a preparação de factor VIII recomoinante incluem células de mamífero, incluindo as células de ovário de hamster chinês.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Proporcionam-se novas composições bem como vectores de expressão e métodos para a sua preparação, incluindo derivados e fragmentos de factor VIII. As composições são preparadas por transformação de uma célula hospedeira, de preferência de uma célula de mamífero, com um vector de expressão gue contém uma sequência de AON que codifica para um congénere de factor VIII, cultura de células hospedeiras transformadas a fim de expressar a sequência de ADN exógena e separação do derivado ou do fragmento de factor VIII resultante a partir do lisado celular ou do meio de cultura após tratamento. As composições podem possuir uma actividade de factor VIII melhorada e/ou uma imunogenicidade reduzida. A utilização das composições inclui o tratamento da hemofilia A.

3RgV3 DFSCRIÇÃQ DOS DBSINxxOS

A Figura 1 mostra a inserção de ADNc do factor VIII no plasmideo pCL389 incluindo a sequência de ácidos aminados desde Ala-1 até Tyr-2332 do factor VIII s a respectiva sequência de sinal desde 3(-19) até S(-l) com a correspondente sequência de nucleótidos. 0 codão TTG codifica para F-973.

A Figura 2 mostra a estrutura do vector de expressão pGL320l gue codifica para a proteína ^ractor VIII integral. 0 plasmideo circular pGia2Cl é apresentado começando com a posição IcoRI no fragmento HindiIl-BglII de 4217 pb derivado do plasmideo p3V2 (Gorman, 1985 D3A -Cloning (Só. Glover) IRL Press, IF. 143-169; hulligan e Berg, P_roc. N_Ati.

plasmídeo pCLB20l estão dimensão do olasmídeo é

Acad. Sei......USA (1.31) 78:2072). A regido precoce do promotor de SV40 encontra-se indicada: SVep. O vector contém também um fragmento Ndel-HindIII derivado do plasmídeo pRSV-neo (Gorman, 1985, supra) contendo a repetição terminal longa (RTL) do virus do sarcoma de t_ous inserida num local Sall.

factor VIII integral é codificado por um fragmento Sall-íipal de 7440 pb e encontra-se indicado: ADNc de factor VIII (H = HindIII, sal = Sall). Os locais de corte por endunucleoses de restrição perdidos durante a construção do representados entre parêntesis. A dada em pares de guilobases íkb).

Figura 3 mostra vectores para a expressão transitória das proteínas factor VIII mutantes de supressão;

a. As marcações do vector derivado de pS72: dois promotores situados aleatoriamente; o promotor de transcrição precoce de 3V40 (SVep) e a repetição terminai longa do vírus do sarcoma de R_ous (VSR-RTL); o local de remate (LocRem) e a extremidade 5' do ARN mensageiro (ARNm); a inserção do ARHc contendo a região codificação para o factor VIII integral com o codão início (ATG), o quadro e leitura livre eo codão paragem (TGA); a região 3‘ não codificante do ARRm com um intrão curto e o sinal de poliadenilação (poliA) derivado de AQN de 5740 (comparar com a Figura 2).

b. Rperesenta-se o fragmento SalI-HpaT de 7440 pb (pares de bases) contendo o ADNc de codificação para o factor VIII integral. Indicam-se os codões de início e da paragem no quadro de leitura. Mostram-se locais de restrição por endunucleoses no ADNc integral intervenientes na m.utagénese para a construção dos plasmíd.eos pCLB2O2 e pCLB2O3.

- 5 de de de

c. Mapa da proteína factor ''/III. Apresentam-se o peptídeo de sinal de 19 ácidos aminados de comprimento e o domínio ou estrutura de repetição do factor VIII de plasma. Al, A2 e A3 são sequências homólogas de ácidos aminados. 3 é uma região singular enquanto que Cl e C2 são novamente regiães homólogas (Vehar et al., 1984). São dadas as posições de ácidos aminados adjacentes às repetições A e C. Debaixo do pama, os locais de corte das enzimas proteoliticas que processam o factor VIII, isto é, a proteína activada C (:?AC), a trombina (IIa(, o factor X da coagulação activado (Xa) e uma protase semelhante a tripsina (indicada com ?) encontram-se indicados por flechas. Pensa-se que o factor xa corta os locais de corte IIa e PAG também apresentados (Eaton et al., Biochemistry (1986) /5:8343-8347? Fay et al., Biochem. Biophys. Acta (1936) 871:268-278). Apresentam-se os locais de corte respectivos. A região 3 contem locais de corte múltiplos.

d. A estrutura das sub-unidades do factor VIII activado, sub-unidades factor Vllla de 92 kDa e de 80 kDa, encontram-se indicados por 92k e 8Cx respectivamente. Indicam-se as respectivas posições amino terminal e carboxi terminal na sequência integral.

e. A estrutura do ADWc e da proteína do plasmídeo pCLB2O2 contendo uma fusão directa entre o local Pstl e o local Bamhl indicado em b. A proteína resultante está indicada e contém uma ligação peptídica entre a Ala-867 e o A_sp-1563. 0 comprimento total da proteína é de 1637 ácidos aminados. (indicam-se as marcas das posições extremas da repetição e os locais específicos de cisão proteolitica? ver acima).

f. A estrutura do ADWc e da proteína do plasmídeo pCLB2O3 contendo uma sequência de adaptação MluI que codifica para quatro ácidos aminados adicionais

que fazem ponte entre o local MaelII e o local HgiAr, conforme indicado em b. 0 comprimento total da proteína é de 1411 ácidos aminados.

(indicam-se as marcas das posições extremas da repetição e os locais específicos de cisão proteolítica? ver acima).

A Ei ç? ura 4 mostra os resultados de uma determinação de peso molecular (dimensão) de vários mutantes de supressão das proteínas factor VIII usando imunoprecipitação e electroforese.

A autorradiografia apresenta os pistas das proteínas feitas com os vectores pCbB2G2 (pista 2) e pCLS2O3 (pista 1). Os marcadores de peso molecular são os indicados.

DSSCblqÃO SOS MWS dlSEBCIPIGCS Dd gCNGRETlSAÇÃO

De acordo com o objectivo da presente invenção, proporcionam-se novas construções de ADK e nov-is composições contendo células bosoedeiras cce produzem poliueptídeos dotados de actividade de factor 71? j . Os polipeptídeos dotados de actividade de factor VJ.7.1 incluem proteínas mutantes de supressão do factor VIII nas quais substancialmente toda a região central ou domínio b bem como uma porção da região de 92 guilo-Dalton (k:Oa) foram suprimidas. As construções plasmídicas contendo uma sequência de ADN que codifica para polipeptídeos com supressão dotadas de actividade de factor VIII são usadas para transformar uma célula hospedeira. A célula hospedeira é em seguida cultivada a fim c.e expressar o gene. A célula hospedeira pode, ser tanto uma célula eucariótica como uma célula procariotica.

factor 7III humano tem a sequência, apresentada na Vigura 1. Usam-se as abreviaturas de uma letra para os ácidos aminados, as quais tem os seguintes signifi

- Ί Γ

caâos; Ά. = alanina; R - arginina; N = asparagina; D - ácido aspártico; C = cisteina; Q = glutamina; 3 - ácido glutâmico;

G = glicina: H - histidina; I = isolaucina; L = leucina:

K = lisina: M = metionina; F = fenilalanina; i « prolina;

S = ser ina; T = treonina; = triptofano; Y - tirosina:e V = valina. A numeração da sequência de ácidos arninados inicia-se com A-l, o primeiro ácido aminado depois da sequência de sinal de 19 ácidos arninados. 0 último ácido aminado do factor VIII é Y-2332. S_sta numeração é utilizada em toda a memória descritiva. Também se descrevem materiais afins do factor VIII, incluindo fragmentos do factor VIII, mutantes de polipeptídeo bem como psptídeos de fusão contendo porções funcionais do factor 7ΙΠ dotadas da actividade biológica do factor VIII intacto, incluindo a actividade de coagulação do sangue.

Os polipeptxdeos da presente invenção incluem congéneres do factor VIII, nomeadamente compostos dotados de pelo menos uma actividade biológica do factor VIII e possuindo pelo menos uma sequência de ácidos arninados como o factor VIII. A actividade biológica inclui a capacidade para corrigir a deficiência de coagulação, guando administrados a pacientes com bemofilia A, e/ou a reactividade cruzada imunológica com o factor ΌΊ de ocorrência natural. A correcção pode deste modo ser efectuado tanto por acção direc ta na cascata de coagulação ou por liçjação a ant icorpos contra o factor VIII de tal modo que a actividade biológica de factor VIII administrado subsequentemente é menos afectada. For reactividade cruzada imunológica entende-se que um anticorpo induzido por um polipeptídeo novo da presente invenção apresentará urna reacção cruzada com o factor VIII intacto. 0 polipeptídeo terá pelo menos uma sequência biologicamente activa, p_or exemplo imunológica ou epi tópica, e pode possuir mais do gue uma sequência tiologicamente activa, podendo esta sequência competir com um produto de ocorrência natural para a prop.'ieda.de biológica.

ί Ϊ

Os novos polipeptiâeos de interesse terão na sua maior parte uma fórmula contendo uma região e-terminal. N_n, uma região de ligação, A-,, e uma região G-terminal, C_R. A região Np é caracterizada por possuir uma sequência de ácidos aminados que corresponde substancialmente a uma sequência que se encontra na sequência A-l a R-740 do factor VIII integral (o domínio A1A2 ou o polipeptídeo de 92 kDa), tendo sido suprimidos do domínio A1A2 não mais do que 45 % dos ácidos aminados, normalmente não mais do que 20% de preferência não mais do que 10% e de modo especialmente preferido não mais do que 5 %. A_s sequências preferidas correspondem substancialmente o seguência desde A-l até D-712 ou desde A-l até R-740.

L·. pode ser um grupo de ligação curto com 1 a 20 ácidos aminados, uma ligação ou qualquer sequência de ácidos aminados, normalmente não substancialmente semelhantes à sequência do domínio tí da proteína factor VIII integral. B_sta região pode conter igualmente sequências que correspondem substancialmente a sequências consecutivas do domínio B até à sequência completa S-741 a S-1637, ou qualquer porção desta. São de particular interesse as composições em que L_R contém pelo menos uma das sequências S-741 até A-867 ou D-1563 até S-1637.

G é caracterizado por possuir uma semuêr

R * cia de ácidos aminados sufostancialmente semelhantes a uma. sequência consecutiva que se encontra na sequência do factor \ΊΙΙ que inclui os ácidos aminados desde Gln-1638 até Tyr-2332, em que não foram suprimidos mais do que 25 % dos ácidos aminados desde Q-1638 até *6-2332, normalmente não mais do que 20%, de preferência não mais do que 10 %. A sequência inclui de preferência sequências que correspondem substancialmente à sequência do factor VEII desde .-1633 até Y-2332, desde Ξ-1643 até .-2332, desde £-1659 até Y-2332 e desde S-1690 até Y-2332, de modo especialmante preferido desde Q-1638 até Y-2332.

_ Q _

Os polipeptídeos de interesse poetem ser fragmentos do factor VIII nos quais até um máximo de 75 % dos ácidos aminados foram suprimidos do factor VIII integral ou proteínas de fusão nas quais a proteína de 92 κba ou um fragmento desta se encontra fundido ao polipeptídeo de 80 xDa ou a um fragmento deste. 0 polipeptídeo não possuirá normalmente mais do gue cerca de 75 V _; os ácidos aminados suprimidos, normalmente não mais do que cerca de 45 % dos ácidos aminados suprimidos, mais normalmente não mais do gue cerca de 40 % dos ácidos aminados suprimidos.

A fim de proporcionar a imunogenicidade os congéneres do factor ^III podem! ser unidos por ligações covalentes a uma entidade polipeptxdina imunogénica grande. Exemplos destas entidades imunogénícas são a albumina da soro de bovino, a hemocianina de Megatbura crenulata (xeyhole limpet hemocyanin = x\L.H) e produtos semelhantes. Estes polipeptídeos conjugados serão úteis para induzir anticorpos num organismo hospedeiro apropriado. Os anticorpos podem ser úteis para a determinação da presença ou da ausência e/ou da concentração do factor VIII num fluído corporal, podendo a. sua ausência ser indicação de hemofilia A.

Preparação de conqénerers do factor VIII

Os congéneres do factor VIII podem ser obtidos de vários modos. Podem ser ootidos por cisão profceolítica do factor VIII integral em três regiões, de preferência por cisão antes da Arg-740 e Gln-1638 seguida de truncagem de extremidade amino-terminal ou carboxi-terminal da sequência desde Ala-1 até FrO-739 pelo menos de um ácido aminado de cada vez. Os fragmentos polipeptídicos obtidos podem então ser fundidos directamente ou por meio de um grupo âe ligação central, ou os fragmentos podem ser combinados numa composição a fim de se obter a actividade do factor ’.ΊΙΙ.

p_odem também preparar-se congéneres do factor VIII, incluindo proteínas de fusão nas quais as re10 «WMJ5

giões Ν e se encontram fundidas. As técnicas usadas para o isolamento do gene do factor VIII são conhecidas da especialidade, incluindo síntese, isolamento a partir de AD11 genómico, preparação a partir de ADNc ou por combinação dastas técnicas. A_s várias técnicas para a manipulação dos genes são bem conhecidas e incluem digestão de restrição, reacção, ligação, mutagénese in vitro, reparação de iniciadores e poli-ligantes ou adaptatores, etc.. Ver Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Spring riarbor Laboratory, Col Spring H_grbor, New Υογκ, 1982.

Geralmente os métodos compreendem a preparação dum banco genómico a partir de células gue sintetizam o factor VIII. A fim de melhorar a probabilidade de identificação da sequência correcta, pode utilizar-se para hibridação cruzada um banco de ADNc de células gue não produzem factor VIII. P_ode utilizar-se um método de análise para detectar a expressão de factor VIII usando fragmentos de restrição inseridos num vector de expressão procariótico como por exemplo pTZ 18 ou 19 e escrutinando os anticorpos para o factor VIII a fim de detectar um fragmento peptídico que apresente reacção cruzada ou um método afim.

IJ_T;a vez que tenha sido identificado um gene completo, seja sob a forma de ADNc ou de ADN cromossomal podem praticar-se as supressões pretendidas no gene estrutural de vários modos. As supressões podem ser feitas por corte enzimático do ADNc do factor VIII integral por modificação e ligação dos fragmentos purificados ou por mutagénese dirigida para um local, especialmente por mutagénese de eliminação de laçada, conforme descrito por Nramer et al., Nucl. Acids Res. (1984) 12:9441-9456.

gene obtido deste modo pode em seguida ser manipulado de vários modos bem conhecidos da técnica a fim de proporcionar a expressão.

II

Podem utilizar-se tanto hospedeiras procarióticos como eucarióticos, o gue pode incluir bactérias, leveduras, células de mamíferos, por exemplo células CiIC, células C127, células humanas 293, células da mieloma ou células especializadas, corno por exemplo células de fígado e células 00S. Oeste modo o gene devera ser expresso num hospedeiro gue reconhece as regiões de regulação de transcrição e de tradução de tipo selvagem do factor VIII, podem introduzir-se num vector de expressão apropriada o gene completo com as suas regiões de regulação 5¹ e 3' de tipo selvagem. Existem vários vectores de expressão gue utilizam sistemas de replicação para vírus de mamíferos, como o vírus de simio 40, o virus de Spstein-Sarr, o vírus do papiioma bovino, o virus da varíola bovina, etc..

Quando o gene se destina a ser expressão num hospedeiro gue não reconhece as regiões de regulação de transcrição e de tradução de tipo selvagem de ocorrência natural, será necessária uma manipulação adicional.São conheci das várias regiões de regulação de transcrição 3¹ e podem ser, de modo conveniente, inseridas a juzante dos codões de paragem. A região 5' não codificante a montante do gene estrutural pode ser eliminada por restrição com uma endunucleose, resserção com Bal31, ou por técnicas semelhantes. Em alternativa, guando está presente um local de restrição conveniente nas proximidades da extremidade 5' do gene estrutural, o gene estrutural pode ser submetido a restrição e pode ser utilizado um adaptador para a ligação do gene estrutural à região do promotor, compensando a adaptador os nucleótidos per didos do gene estrutural.

Podem empregar-se várias estratégias para proporcionar um bloco integrado de expressão estranho, o qual pcssui na direcção 5¹-3¹ da transcrição uma região de regulação de transcrição e uma região de início de tradução gue podem também incluir regiões de regulação gue possibilitam a indução da regulação; um quadro de leitura livre que

codifica para o factor VIII integral ou para um congénere ' do factor VIII, incluindo as proteínas mutantes de supressão, ' de preferência incluindo uma sequência guia de secreção rsconhje cida pela célula hospedeira propo ta; e regiões de terminação I

I de tradução e de transcrição. 0 bloco integrado de e.varessão pode ainda incluir pelo menos um gene de marcação. As regiões de início e de terminação são funcionais na célula ospedeira e podem ser homólogas (derivadas do hospedeiro original) ou heterólogas (derivado de uma fonte estranha) ou sequências de ADN sintéticas. 0 bloco integrado de expressão pode deste modo ser inteira ou parcialmente derivado de fontes naturais e inteira ou parcialmente derivado de fontes homólogas em relação à célula hospedeira ou heterólogas em relação à célula hospedeira. A_g varias construções de ADN (sequências de ADN, vectores, plasmídeos, blocos integrados de expressão) da presente invenção são isolados e/ou purificados ou sintetizados e portanto não são de ocorrência natural

Verificou-se que as sequências nucleótidicas adjacentes ao codão de início de tradução ATG são importantes em células animais para uma expressão óptima do gene. F_or exemplo, Kozak, Microbiol. Reviews(1983) 47:1-45 estudou extensivamente o efeito destas regiões sobre a expressão de polipeptideos como por exemplo a insulina em células GOS. D_este modo, pode ser necessário modificar as sequências nucleótidas adjacentes ao codão de início. Esta modificação pode ser feita por mutagén.ese dirigida ou por fusão do gene exógeno à região de início de um gene de alto grau de expressão.

Regiões de regulação de transcrição ou promotores ilustrativos incluem, para bactérias, o promotor de beta-gal, o promotor de amilase, os promotores lambda esgue. do e direito, os promotores trp e lac, o promotor de fusão trp-lac, etc.; para leveduras, promotores de enzima glicolíticas, como por exemplo os promotores eT-h-l e 2, o promotor

fgk, e o promotor de lactose, entre outros; para células de mamífero, os promotores de SV4O precoce e tardio, o promotor do citomegalovirus (CMV), o promotor de beta-actina, os promotores tardios maiores de adenovirus, etc..

Rm células eucarióticas, as sequências de regulação podem incluir, por exemplo, a sequência de intensificação do citomegalovirus, a qual pode ser fundida a uma sequência promotora, como seja o promotor de SV4O, formando um promotor, qdmérico, ou pode ser inserido em outro local do bloco integrado de expressão, de preferencia na proximidade da sequência do promotor.

A expressão do gene estrutural também pode ser amplificado, por exemplo por ligação em série de um gene para um marcador genético amplificável 5' <ju 3' em relação ao gene estrutural e por cultura das células hospedei ras sob condições de selecção. Um exemplo de um gene amplificável é o gene para a redutase de d i-hidro folato (rdbf), cuja expressão podê ser aumentada em células tornadas resistentes ao metotrexato (mtx), um antagonista de folato. Os blocos integrados de expressão com capacidade para expressão do factor VIII ou de um seu congénere que utilise um promotor de metalofcioneina ou o promotor de transcrição da unidade de transcrição precoce de 3V40 (SVep), em especial o promotor de virus do sarcoma de Rous-repetição terminal longa (VSR-RTb) em série com o promotor de SVep são de interesse para a expressão em células de mamífero, como tr exemplo células COS. Foram descritos por exemplo por Hurwitz et al., Nucl. Acids Res. (1987) /5:7137-7153 exemplos de promotores e de combinações promotor/intensificador que podem ser usados em células G127 em combinação com vectores de expressão de acordo com o Exemplo 7. Para a expressão óptima, pode ser benéfica a introdução de um intrão no bloco integrado de expressão. P_referem-se um intrão na parte 5’ do ARNm.

Para além disso, é possível preparar um gene fundido integrando uma sequência 5* no gene estrutu14

ral que codifica para o guia de secreção e um sinal de proI cessamento. Para a secreção dos polipeptídeos do factor I i

VIII usa-se de preferência a sequência guia do factor VIII de ocorrência natural mas podem também ser usadas outras sequências de sinal, incluindo guias de secreção de penicilinase, do factor alfa, de imunoglobulina, de receptores de células T, das proteínas exteriores das membranas, da albumina do soro, do activador de plasminogénio de tecido, da insulina e das enzimas do tracto digestivo entre outras.

P_or meio da fusão de um guia de secreção em concordância de quadro de leitura com um gene estrutural para o factor VIII ou para um seu congénere, é possível obter a secreção do factor VIII madura para o meio de cultura.

A região de terminação pode ser derivada da região 3' do gene a partir do qual a região de início foi obtida ou de um gene diferente. Conhecem-se muitas regiões de terminação e verificou-se que estas são satisfatórias numa variedade de hospedeiros dos mesmos ou ds diferentes géneros e espécies. A região de terminação pode incluir sequências para o processamento adequado do AP,Um numa célula de mamífero: isto é, um pequeno iutrão e um sinal de poliadenilação.

Durante a construção do bloco integrado de expressão, os vários fragmentos de ADN serão normalmente clonados num vector de clonagem apropriado o que permite a expressão do ADN, a modificação do AON ou a manipulação por junção ou remoção das sequências, de adaptadores, etc.. Normalmente os vectores terão a capacidade de replicação em pelo menos um número de cópias relativamente alto em. S. coli.

Ê relativamente fácil de dispor de vários vectores para clonagem, incluindo vectores como pBN322, pML2, pUC7-pUC19, pSP64, pSP65, pSPl8, pSPl9, pTll8 e pTZISl, pTZ19 e pT219R, etc,.

Os vectores de clonagem são zados por terem uma origem eficiente de rsplicação caracteripelo menos

funcional em 5. coli. 0 vector de clonagem deve também ter pelo menos um local de restrição singular, normalmente vários * locais de restrição singulares, e pode também incluir locais de restrição múltiplos, particularmente locais de restrição em duplicado para substituição. Para alem dis.o, o vector de clonagem deve ter um ou vários marcadoras que proporcionam a selecção da transformação. Cs marcadores devem normalmente conferir resistência a agentes citotóxicos, como por exemplo a antibióticos, a metais pesados, a toxinas, etc., ou proporcionar completetacão de um hospedeiro auxotrónico ou imunidade a um fago. P_or restrição apropriada do vector e do bloco integrado e, se adequado, por modificação das extremidades, por eliminação de bases ou por preenchimento das extremidades desalinhadas a fim de proporcionar extremidades alinhadas. Por adição de adaptatores ou por auição de caudas é possível obter extremidades complementares para ligação e juntar o vector ao bloco integrado de expressão ou a um componente deste.

En alguns casos, pode utilizar-se um vector lançadeira sendo o vector capaz de replicação em hospedeiras diferentes necessitando de sistemas de replicação diferentes. De preferência emprega-se uma origem de replicação de vírus de símio 40 (SV40), o que permite que o plasmídeo seja propagado em 005-1, enquanto que o genoma do vírus do papiloma de bovino (BI^JV-1) é usado para a manutenção epissomal de vectores de expressão em células 0127 (ver por exemplo Howley et al·., Meth., gnzymol. 1Q1í387-4Q2, 1983).

bloco integrado de expressão pode ser incluído num sistema de replicação para a manutenção epissomal num hospedeiro celular ou pode ser proporcionado sem um sistema de replicação, podendo integrar-se no genoma do hospedeiro. 0 modo de transformação do organismo hospedeiro com as várias construções de ΛΏΝ não é crítico para a presente invenção. 0 ADN pode ser introduzido no hospedeiro da acordo com técnicas conhecidas, como por exemplo por transformação,

usando ADN precipitado por fosfato de cálcio, electroporação, transfecção por contacto das células coai um virus, microinjecção do ADN nas células ou outras.

Ppdem ser usadas como organismo hospedeiro células primárias normais ou de linhas da células derivadas de culturas de tecido primário como células microbianas. A célula hospedeiras é de preferência uma linha de células de mamífero, de preferência células da hamster diO, células de rato Cl27 ou células humanas 293 mas também podem ser usadas células microbianas, por exemplo de leveduras, de preferência de uma espécie de ^luyyeromyces, ou de bactérias, de preferência de uma espécie de Bacillus.

Para a transformação estável de uma linha de células de mamífero com o vector de expressão contendo a sequência de codificação para o congénere de factor '/III e para subsequente amplificação do vector inserido no cromossoma do hospedeiro, são especialmente adequadas células de ovário de hamster chinês (CHO). A transformação implica a transfecção da célula hospedeira com o vector de expressão juntamente com um gene marcador selectável como por exemplo o gene de rdhf ou um gene de resistência a G418 (neo) ou semelhante e a subsequente integração no cromossoma e a selecção das células que apresentam urna transformação estável.

Oytro método para a transformação estável para linhas de células hospedeiras utiliza vectores de expressão contendo sequências de 3PV-1. Ag células 3127 são apropriadas para este fim. A transformação implica transfecção da célula hospedeira com o vector de expressão contendo sequências de 3VF-1. Os transformantes são recoàhecidos pala formação de focos. Os transformantes estáveis são estabelecidos e seleccionam-se os que apresentam actividade os factor VIII usando o ensaio de xabi Coatest de acordo com os exemplos 6 e 7. P_or outro lado, quando a expressão é levada

a efeito num sistema de transformação transitório, como por exemplo em células OOS-1 com vectores de expressão derivados de pSV2, não existe a fase de selecção. ^TJma vez que o gene estrutural tenha sido introduzido no hospedeiro adequado, o hospedeiro pode ser cultivado a fim de expressar o gene estrutural. A célula hospedeira pode ser cultivada até uma alta densidade num meio apropriado. Quando o promotor é inductível, como por exemplo num sistema procariótico, devem utilizar-se então condições permissivas, por exemplo uma mudança de temperatura, exaustão ou excesso de um produto metabólico ou de um nutriente ou semelhantes. Num sistema de células de mamífero, guando se usa um gene amplificavel em série com o gene estrutural, deverão empregar-se os msios apropriados para amplificação.

Quando se proporciona uma secreção, o produto da expressão, quer seja fundado ou. não fundido, pode ser isolado a partir do meio de cultura por métodos ncrmais. Quando não se proporciona uma secreção, as células hospedeiras podem ser separadas e lisadas de acordo com métodos habituais. 0 produto desejado em em seguida isolado e purificado por técnicas normais, por exemplo por cromatografia de afinidade com anticorpos imobilizados, cromatografia em amino-hexil-sepharose ou pelo método do polielectrólito misto.

Os produtos recombinantes podem ser glico silados ou não-glicosilados, tendo uma glicosilação de tipo selvagem ou de outro tipo. 0 grau de glicosilação depende em parte da sequência do peptídeo particular bem como do organismo no qual é produzido. D_este modo, a expressão do produto em células de 2. coli tem como resultado um produto glicosilado e a expressão do produto em células de mamífero tem como resultado um produto com uma glicosilação semelhante ao do peptídeo do tipo selvagem.

Utilizações dos congéneres de factor '7111

- 18 i

Os compostos da presente invenção podem ser usados de vários modos, tanto in vivo como in vitro.

Os compostos da presente invenção podem ser usados como ingrediente activo de composições farmacêuticas para o tratamento de pacientes com sintomas de hemofilia A. ?_or composição farmacêutica entende-se qualquer preparado que possa ser administrado a mamíferos. Deste modo, uma composição farmacêutica com actividade de factor VIII é um preparado que pode ser administrado a mamíferos a fim de aliviar os sintomas associados com a hemofilia A e com a falta de capacidade para a adequada coagulação do sangue. Na preparação da composição farmacêutica, geralmente os polipaptídeos da presente invenção são misturados com substâncias veiculares, parsnteralmente aceitáveis ou com outros excipientes adequados de acordo com os procedimentos conhecid s da técnica. A_s composições farmacêuticas podem ser constituídas, de modo conveniente, por um preparado liofilizado estéril do polipeptídeo da presente invenção que pode reconstituído por adição de uma solução estéril adequada para a produção de soluções, de preferência isotónica com o sangue do receptor. A composição farmacêutica, pode apresentar-se sob a forma de um contentor de uma unidade ou multi-dose, por exemplo ern -ampolas ou em frascos selados. 0 modo de utilização destas formas é análogo ao do polipeptídeo factor VIII humano, ajustado de forma apropriada para a potência, 0 polipeptídeo da presente invenção pode ser administrado in vivo, por exemplo por injecção por via intravenosa, parotoneal, subcutânea, etc..

Os compostos da presente invenção podem ainda ser usados para a preparação de anticorpos contra os compostos da presente invenção, os quais podem ser usados in vivo ou in vivo. Os anticorpos podem ser preparados de modo habitual por utilização do polipeptídeo da presente invenção como imunogénio injectando o polipeptídeo num hospedeiro mamífero, por exemplo num rato, numa vaca, numa cabra, numa ovelha, num coelho, etc., em especial com um adjuvante, por exemplo adjuvante completo de Preund, gel de hidróxido de alu- 19 -

mínio ou outro semelhante. C hospedeiro pode mais tarda ser sangrado e o sangue pode ser utilizado para o isolamento dos anticorpos policlonais ou, no caso do rato, os linfócitos do sangue periférico ou os linfócitos esplénicos (células 3) podem ser utilizados para fusão com uma célula de rnieloma a fim de imortalizar os cromossomas para a expressão monoclonal de anticorpos específicos para os compostos da presente invenção.

Podem preparar-se tanto anticorpos policlonais como monoclonais, os quais pode então ser usados para o diagnóstico ou para a detecção dos polipeptídeos da presente invenção numa amostra como por exemplo em células ou num fluído fisiológico, por exemplo em sangue. A impossibilidade de detectar o polipeptídeo da presente invenção pode indicar uma condição de hemofilia A.

A_g amostras que contém sequências complementares do ARNm do factor VIII podem também ser preparadas e utilizadas como um meio de diagnóstico. £_Or exemplo a presença e/ou a quantidade de ARNm de factor VIII numa célula podem ser utilizadas para determinar o paciente está-se fabricando factor VIII mas desenvolveu anticorpos que prejudicam a sua actividade. Uma amostra que se pretenda analisar contendo uma célula, uma amostra de tecido ou um fluído corporal que se suspeite contenha sequências de hibridação podem ser tratados de modo a que todas as células sejam lisadas e em seguida tratadas com um agente de desnaturação, como por exemplo cloridrato de guanidina, a fim de libertar o ARNm dé cadeia simples. A amostra marcada com, por exemplo, 32P ou com nucleótidos biotenilados pode ser em. seguida hibridada com o ARNm celular de modo a formar um complexo de dupla cadeia que pode ser detectado por meio da marca. Para alguns fins pode ser conveniente quantificar a quantidade do ARNm do factor VIII. Ssta quantidade pode ser conseguida por comparação da quantidade da marcação detsctada em amostras de referência contendo quantidades conhecidas de ARNm de factor

VIII de cadeia simples com a quantidade de marcação dstectada na amostra em análise.

Os exemplos que se seguem destinam-se a ilustrar a invenção sem de qualquer forma limitar o seu âmbito.

PARTS SXPSR1MSNTAL

F_oram usadas técnicas gerais de clonagem conforme descritas por Maniatis et al., i-l^lecular Gloning: A Laboratory Manuel, Cold Spring Larbor Laboratory CSH, NY, 1982. Todas as enzimas de modificação de ADN foram obtidas a partir de fornecedores comerciais. Estas enzimas usadas de acordo com as instruções dos fornecedores. Os materiais e os aparelhos para a purificação e para a separação de ADN foram usados de acordo com as instruções do fornecedor.

Exemplo 1

Construção do Vector de Expressão pCLB201 plasmídeo pC /3 201 é um vector de expressão que contém o promotor VSR-RTL na orientação corre· ta para o início da transcrição e o ADNc do factor VIII integral (yer Figura 2). E_ste plasmídeo é derivado do vector p3V2 de Mulligan e Bgrg, P_roc. bati. Açad_._ Sei. USA (1981) 78:2072.

local HindIII singular do plasmídeo pSV2.tíA (Van Lonneveld et al., P_roc, N_atl. Acad. Sei ISA (1981) 83:4670-4674) foi modificado num local Sall por modificação das extremidades HindIII coesivas para se obter extremidades alinhadas e por ligação de adaptadores Sall (5'-CGTCGACG-3¹) às extremidades alinhadas. Seleccionou-se um plasmídeo contendo um local Sall e identificou-se este plasmídeo por pCLB91. S_ste plasmídeo é idêntico ao plasmídeo pSV2.tI-A excepto na circunstância, de conter um adapta·

dor Sall inserido num local Hindlll.

No pedido de Patente EP 025345o, j cuja memória descritiva se dá aqui como reproduzida, descre- I ve-se o isolamento do ARNm do factor VIII a partir do fígado humano e a preparação, a purificação e a identificação do respectivo ADNc e a sua integração no plasmídeo pR£l21 dando como resultado o plasmídeo pCLB89. F_vrificou-se um fragmento Sall-Hpal de 7440 pb de comprimento a partir do plasmídeo pCLQ89 contendo o ADNc do factor VIII (ver Figura

1) e inseriu-se este fragmento em pCLtíSl digerido continha um local Sall intacto com o local Hpal ligado ao local BclII que tinha sido preenchido.

plasmídeo pA^Vnoo (Oorrnan, DqA Olonlr g 1985, ed. D.Glover, IRL-press, Washington, Oxford, pp.

143-169) foi digerido com Ndel e HindiII e foi incubado com o fragmento de Klenow de polimerass ce ADN a fim de criar extremidades alinhadas e isolau-se o fragmento de 0, 6 kb contendo uma sequência de vírus do sarcoma de Rous-repetição terminal longa (VSE-NTL) que se inseriu no local Sall do plasmídeo pCL8200, o qual tinha sido de modo semelhante dotado de extremidades alinnadas, a fira de dar origem ao vector de expressão pCL3201 (yer Figura 2).

Exemplo 2

Construção do plasmídeo pGI.3202

Construiu-se no plasmídeo pCBSõG, conforme descrito no pedido de p_atente Ek 0253455, um mutante de supressão do factor VIII contendo uma supressão desde o local PstI na posição 2660 da sequência nucleotídica (ver Figura 3b) até ao local BamHI na posição 4749 (ver Figura 3b). 0 ADN do factor VIII no plasmídeo pGL860 tinha uma supressão do ADN de codificação para 695 ácidos aminados na região central.

vector de expressão pCL32O2 foi derivado dos pàasmídeos pGB86G e pC.· j201. Digerirsm-se os dois plasmídeos com as enzimas de restrição .><ρη1 e x3al. Liyou-se o fragmento kpnl-Xbal de 3,1 kb no plasmideo pCG386C ao fragmento Kpnl-Xbal de 7 kb no plasmideo ρϋ;^2Οΐ. c plasmideo resultante tinha locais kpnl e Xbal intactos. A estrutura deste plasmideo é apresentada na Figura 3e.

Bvemplo 3

Construção do plasmideo pCL32O3 (A) pCLBlOO;

Inseriu-se o fragmento Sal£-Hpal· de 7440 pb (_ver figura 2) do plasmideo pCL389 no plasmideo pSP64 (Melton et, al.. Nucleic Acids Xes. (1524) 12:7035-7056) gue tinha sido cortado com 3all e Smal. 0 plasmideo resultante. pCLSIOO, continha um local Sall intacto e uma extremidade Hpal ligada a uma extremidade Smal.

(B) pCLBlOi; (os numeros entre parêntesis referem-se à Figura 1) (1) Digeriu-se o plasmideo pCLhlQG com κρηΐ e Tthllll gerando um fragmento de 631 pb : Λ,ρηΙ (1817) a Tthllll (2447). 1· urificou-se o fragmento de 631 pb retirado em seguida com MaelII (2199). A extremidade MaelII coesiva foi preenchida, resultando um fragmento de 383 pb.

(2) Digeriu-se o plasmideo pCLBlOO com Ap.a^I e Bani, isolou-se o fragmento Apal (6200)-Bani (5532) de 669 pb.

(3) Digeriu-se o plasmideo pCGBIQO com MgiAI, dando origem a um fragmento xgil de 634 pb. Incubou-ss o

fragmento com polimerase de ADN T4 a fim de tornar as extremidades alinhadas e em seguida digeriu-se com 3anl obtendo-se um fragmento de 565 pb.

(4) Digeriu-se o plasmídeo pCLBIOO com Apal e xepnl, obtendo-se um fragmento de 5,9 kb de comprimento (Apal (6200) a r.pnl (1317)) contendo sequências vectoriais para manutenção e propagação em b.coli.

(5) F_urificaram-se os fragmentos o?-tidos nas fases (1) a (4) e ligaram-se quantidades eguimolares dos fragmentos e um excesso molar de dez vezes de um adaptador MluI (CCACGCGTGG), dando origem ao plasmídeo pCí.3101. 0 plasmídeo pCLBIOl continha um adaptador hlul entre os locais naelll e iigiAl (ver Figura 3b) além dos locais upnl, bani e Apal. '.3 Figura 3£ mostram-se 4 ácidos aminados suplementares (P-b-v-A) entre os ácidos aminados D-712 e q-1638 (Figura 1).

(C) pCL32Q3;

Digeriram-se os plasmídeos pCLMOl e pCL320l com as enzimas kpnl e Abai. C fragmento κρηΙ-AbaZ de 2,4 kb do plasmídeo pCLblOl oi ligado cotr. o fragmento kpnl-Xbal de 7,0 kb derivado do plasmídeo pCLB200. C plasmídeo resultante pCLB2O3 possuía os locais Kpnl e Xbal intactos. A sua estrutura é apresentada na Figura 3f,

Sy.emplo 4

Construção do plasmídeo pCi.3,212 plasmídeo pCE3212 foi construído usando a técnica de mutagénase de eliminação de laçada conforme descrito por Kramer et al., (1984) Nncleic Acids fies. 12;9441-9456. Levou-se a efeito a mutagénese por supressão da região central do ADNc do factor VIII usando o seguinte oli24

gonucleótico;

Iniciador IV

3' TTC. CAA. AGA. TGA. AGA. GTG. GTT. TTG. GGT. GGT. GAG. AAG 5’ a fim de produzir no ADNc do factor VIII uma supressão ictern? das sequências que codificam para os ácidos aminados Lys 713 até Ser-1637.

A proteína correspondente contém uma supressão interna de 925 resíduos de ácidos aminados em comparação com a proteína integral do factor VIU.

A fim de obter um fragmento alvo de mutagénese de eliminação de laçada seleccionam-se um fragmento HindIII-PstI de 1,4 κ’ο derivado do plasmídeo pC±.32O3 (Exemplo 3). A posição do nucleótido (Figura 1) do local HindIII é a posição 1025 na sequência do factor VIII integral a montante da região a ser modificada e o local PstI está na posição 5165 a juzante da região. Estes locais estão indicados na Figura 2. 0 fragmento de 1,4 kb foi subclonado em M13mp9 efectuando-se sni seguida a mutagénese de eliminação de laçada. Após seleccionar o fragmento com a supressão correcta, este foi seguido pela inserção da fracção Kpnl-FstI do fragmento HindiIl-PstI contendo a supressão pretendida de fragmentos com extremidades coesivas específicas de restrição (os inúmeros refarem-se à Figura 1), de acordo com as seguintes fases:

Fase 1. Para a expressão das moléculas mutantes factor VIII construiu-se um novo plasmídeo /Vil. l_rseriu-se o fragmento Sall-vpal de 7440 pb (Figura 1) derivado de pCt'389 no vector de expressão pSVL (Pharmacia,

N2 27-4509-01, Uppsala, Suécia) a fim de permitir a transcrição de um promotor tardio ('^T40 era células de mamífero. Cortou-se o plasmídeo pfVl·, com xhol e SmaZ.

plasmídeo resultante, pCLB211, contém uma extre midade Xhol ligada a uma que as duas extremidades mas são idênticas, a uma uma extremidade HPal.

extie midade Sall, uma vez salientes 5' destas enziextremidade Smal ligada a

Fase 2. Digeriu-se o plasmídeo pHLB211 com Apal e Sall

Isolou-se o fragmento Apal (6200)-Sall (singular na fracção de pSVL do plasmídeo pCLB211) de 1,4 kb.

Fase 3. Digeriu-se o plasmídeo pCLBIOO com Ndel, PstI e Apal. Isolaram-se dois fragmentos; um fragmento PstI (5165)-Ndel (5527) de 363 bp e um segundo fragmento Ndel (5527)-Apal(6200) de 674 pb.

Fase 4. Digeriu-se o plasmídeo pCLBIOO com Kpnl e Saci.

Isolou-se um fragmento Kpnl (1817)-SacI (19) de 1799 Pb.

Fase 5. Digeriu-se o plasmídeo pOLB211 com Sall e Saci.

Isolou-se um fragmento Sall (singular no vector pSVL) -Saci (19) de 4,5 kb.

Fase 6. Digeriu-se com Kpnl e PstI um facteriófago M13 contendo um fragmento HindIII (1025)-PstI (5165) com a supressão pretendida, conforme se verificou por análise de sequência. Isolou-se um fragmento PstI (5165)4KpnI (1819) de 584 pb.

Fase 7. Misturaram-se em quantidades equimolares e ligaram-se os seis fragmentos isolados das fases 2 a 6 0 plasmídeo pCLB212 expressava o composto 3b do exemplo ( Quadro II). 0 composto 3b difere do composto 3 (representado na figura 3f) por não ter o adaptador MluI e os quatro ácidos aminados correspondentes.

Construção dos plasmídeos pCLB2O8, PCLB2O9 e pCLB2lO

Os plasmídeos pCLB2O8, pCLB2O9 e pCLB2lO foram construídos por meio da técnica de mutagénese de eliminação de laçada conforme descrito

Nucleic Acids Res. (1984) /2:9441-9456,

a) Mntaqenese de......eliminação de laçada

Levou-se a efeito uma mutagénese de supressão da região central do ADNc do factor VIII usando os seguintes oligonucleótidos:

Iniciador I:

3' TTA. OGG. TAA. CTT. GGT. TCT. CTT.TAT. TGA. GCA. TGA. TGA 5'

Iniciador II:

3* TTA. CGG. TAA. CTT. GGT. TCT. AGT. CAA. CTT. TAC. TTC.TTC 5'

Iniciador III:

3· TTA. CGG. TAA. CTT. GGT. TCT. TCG. AAA. GTT. TTC. TTT.TGT. 5’ a fim de produzir supressões internas no ADNc das sequências o

de codificação para os ácidos aminados S-741 a R-1648 (Iniciador I), S-741 a 1-1668 (Iniciador II) a S-741 a R-1689 (iniciador III). A_s proteínas correspondentes contém supressões internas de 908 (I), 928 (II) e 949 (III) resíduos de ácidos aminados, respectivamente.

B. Preparação de Fragmentos Alvo

A fim de obter um fragmento alvo para mutagénese por eliminação de laçada,construiu-se um fragmento de 0,8 kb derivado do plasmídeo pCLBlol do modo seguinte.

Digeriu-se o plasmídeo pCLBlol com EçoRI, preencheram-se os locais EcoRI e fez-se uma outra digestão com Kpnl. Isolou-se um fragmento Kpnl (1819)-EcoRI (2297) de 479 pb (os números das posições dos nucleótidos estão de acordo com a Figura 1). Dfgeriu-se o plasmídeo pCLBlol com BamHI; preencheram-se as extremidades coesivas e fez-se uma outra digestão com FstI. Isolou-se um fragmento BamHI (4749)-PstI (5165) de 416 pb. Ligaram-se estes fragmentos em quantidades eguimolares e subclonaram-se em Ml3mpl9 âmbar. Seleccionou-se para a mutagénese de eliminação de laçada o bacteriófago M13 contendo um fragmento Kpnl-PstI de 895 pb a partir da posição 1819 a montante da região a ser modificada até à posição 5165 a juzante deste região e com uma supressão extensa na sequência de codificação do factor VIII. Após selecção do fragmento com a supressão exacta obtido com os iniciadores I, II e III no bacteriófago M13, inseriu-se o fragmento κρηΙ-PstI contendo a supressão pretendida num vector de expressão adequado derivado do plasmídeo pCLB211 (ver Exemplo 4) usando as seguintes fases e preparando fragmentos com extremidades coesivas com locais de restrição por enzimas singulares (os números referem-se à Fignra 1):

(l). Digeriu-se o plasmídeo pCLB211 com Apal e S_all.

isolou-se o fragmento Apal (fí200)-Sall (singular na fracção de pSVL do plasmídeo pGLB211).

(2) Isolou-se um fragmento PstI (5165)-NdeI (5527) de 1,4 kb e um fragmento Ndel (s527)-Apal (¢200) de 674 pb a partir do plasmídeo pCLBIOO digerido com Ndel,

PatI e Apal.

(3) Digeriu-se o plasmídeo pCLBIOO com Knpl e S»cl e isolou-se um fragmento Kpnl (1817)-Saci (19).

Γ

(4) · Digeriu-se o plasmídeo pCLB211 com Sall e Saci.

Isolou-se o fragmento Sall (singular no vector pSVL)-S_acI (19).

(5) . Digeriu-se com Kpnl e PstI o bacteriófago Ml3 contendo o fragmento com a mutação pretendida. Isolaram-se para as três mutagéneses os fragmentos Kpnl e PstI contendo a mutação pretendida.

(6(. Isolaram-se os seis fragmentos de (1) a (5). misturaram-se em quantidades equimolares e ligaram-se. S_elecclonaram-se por hiBridação e digestão com enzimas de restrição plasmídeos contendo todos os fragmentos pretendidos. Construíram-se três novos vectores expressão para expressão do composto do exemplo descrito no Quadro I usando os iniciadores I,

II e III apresentados anteriormente.

1. pCLB2O8 para o composto 7 com o iniciador I;

2. pHLB para o composto 8 com o iniciador II; e

3. pCLB21O para o composto 9 com o iniciador III.

Exemplo 6

Expressão transitória do ADN do Factor VIII recombinante e

ANalise das proteínas produzidas

A. Tranafecção de células COS-1 e marcação metabólica

I_ntroduziram-se em células OOS-1 usando uma técnica de transfecção em DEAE os vectores de expressão obtidos de acordo com os exemplos anteriores. P_recipSpu-se o ADN do vector por incubação com DEAE-dextrano durante 2 horas, seguida de tratamento com choque de cloroquina du29 Β8Α

rante 2 horas conforme descrito por I^pata et al.,Nndeic Acida Res. 12:5707, (1984) e L_u6hman e Magnusson, Nucleic

Acida Res. (1983) 11:1295. 0 meio utilizado para a cultura das células OOS-1 e também para o toeio condicionado foi o meio DMEM de Iscove (Flow) suplementado com 10 % (v/v) de soro fetal de vitela (Flow). 0 meio foi mudado 48 h após a transfeoção. 0 meio condicionado foi separado 48 h mais tarde.

A marcação metabólica das proteínas nas células transfectadas foi levada a efeito usando meio R'MI isento de soro (Gibco). Dois dias depois da transfecção incubaram-se os transfectantes durante 4 b com 5R uCi/ml de

L- S-metionina (Amersham, 1985; 370 MBeq/330 ul; actividade especificai superior a 100 Ci/mMole), e incubou-se novamente de um dia para o outro com L-metionina 1 mH antes de separar o meio condicionado. A fim de evitar a degradação da proteína, adicionaram-se inibidores de protease como por exemplo fluoreto de fenil-metano-sulfonilo (FFMS) ao meio condicionado depois da separação. A fim de inibir a glicosilação da protéína pode adicionar-se tunicamicina ao meio (concentração final 0,001 mg/ml). 0 meio condicionado foi separado 4 dias após a transcfeçção; as proteínas produzidas foram analisadas.

B. Actividade biológica do factor VIII recombinante meio condicionado foi analisado a fim de se determinar a actividade de factor VIII usando (1) a analise normal de coagulação ou análise de coágulo e (2) a análise de actividade cromogénica (Kabi Coatest).

A análise normal de coagulação ou análise de coágulo (designada por tempo de tromboplastina parcial activada) foi levada a efeito usando plasma de hemofílicos descrito por Veldkamp et al., Thromb.Dlath.Haemorrh. (1988) 19:-279. 0 meio condicionado foi tratado com citrato da análise antes.

A análise de actividade cromogénica ou análise de Kabi Goatest foi levada a efeito de acordo com os procedimentos fornecidos pelo fabricante Kabi-Vitrum, excepto no facto de que todos os volumes indicados foram difididos por quatro e de que se analisaram 25 ul do meio condicionado. As proteínas semelhantes a factor VIII foram activàdas durante 15 minutos adicionando-se nesse momento o substrato cromogénico (S2222).

A actividade de inibição do factor VIII foi medido de acordo com o protocolo normal de Bethesda (Kasper et al.,Thomb. Diath. Haemorrh. (1975) 45:869-371.

As imunoglobulinas usadas foram purificadas por permuta iónica e por cromatografia em proteína A-Sepharose antes de utilização.

O padrão das análises de actividade biológica para o factor VIII era um conjunto de plasma tratado por citrato (concentração final 0,5 mM) que se considerou conter 1 U de actividade de factor VIII ou de antigene por ml.

No Quadro II apresenta-se a actividade biológica para várias das proteínas em que foram praticadas supressões. As proteínas mutantes com supressões apresentavam actividade de coagulação de factor VIII.

Além do exposto, a actividade estabelecida da solução da proteína recombinante é aparentemente inibida a seguir à adição de anticorpos conhecidos como inibidores da actividade de factor VIII derivado do plasma e/ou dosdssignados soros inibidores obtidos a partir de pacientes com inibidores, isto é, anticorpos contra factor VIII no respectivo sangue.

C. Reactividade cruzada imunolóqica com o Factor viii (1) Preparação de anticorpos monoclonais.

Imunizaram-se ratos Balb/o com o complexo factor VIII humano purificado-factor de von Willebrand obtido por filtração em gel de agarose de um crioprecipitado ou de um concentrado de factor VIII utilizado para fins terapêuticos (Laboratorio C_entral dD Serviço de Transfusão Sanguínea da Cruz Vermelha dos Paises-B_aixos, Amesterdão, Paises-Baixos), Van Mourik e Mochtar, Blochim.Biophys. Acta 221:677-679 (1970). Levou-se a efeito uma hibridação de linfócitos conforme descrito por Galfre et al., N_ature (1977) 266:550-552. A descrição das técnicas usadas para a selecção de clones gue produzem anticorpos monoclonais contra factor VIII foi apresentada noutro local (Stel, 1984, Tese de Doutoramento, U_niversidade de Amesterdão, Paises-Baixos). Identificaram-se anticorpos monoclonais contra o factor VIII de acordo com a respectiva reactividade com os polipeptídeos do factor VIII conforme descrito no pedido de Patente Europeia EP 0253455.

(2) Anticorpos monoclonais contra os polipeptídeos do factor viii.

Imunizaram-se coelhos por procedimentost .hormalizados com um preparado de factor VIII que tinha sido purificado por cromatografia (Stel, supra). Os anticorpos deste modo obtido foram identificados por técnica de mancha imunológica, conforme descrito no pedido de P_a ^tent® Europeia EP 0253455, usando factor VIII purificado-factor de von Willebrand ou polipeptídeos purificados. Os anticorpos foram isolados por electroforese em gel de poliacrilamida e em seguida foram transferidos para folhas de nitrocelulose como proteínas alvo. Foram obtidos três anti-soros policlonais diferentes: RH 63271, RH 63272 e RH 63275. Os anti-soros reagiram com o polipeptídeo de dobleto 80 kDa, 92 kDa e com polipeptídeos maiores. Estes anti-soros reagiram também com fragmentos menores do factor VIII.

(3) ELISA

Usou-se um método de ELISA (A_nálise por Imunossorvente Ligado a E_nzimas) agora desenvolvido a fim de detectar o antigene de factor VIII no meio condicionado. 0 método é como se segue. Revestiram-se placas de ELISA por adição de 200 /il/alvéolo de uma diluição apropriada do anticorpo monoclonal específico contra o factor VIII CLB.CAgA (5 mg/1) em tampão de carbonato de 0,05 M de pH 9.8. As placas foram seladas e incubadas de um dia para o outro a 4°C. Entre todas as lavagens as placas foram lavadas três vezes com PBS contendo 0.05 % de Tween-20 que foi deixada nas placas durante pelo menos um minuto.

Pipetou-se uma série de diluições de amostras de ensaio ou de plasma normal para alvéolos (200 _zul/alvéolo) em duplicado. A_s placas foram seladas e incubadas a 37°C durante 2 h sem agitação e em seguida foram lavadas conforme descrito anteriormente. Para a diluição do antigene usou-se um tampão que continha tampão de Tris-HCl 50 mM, 2% de albumina de soro de bovino e cloreto de sódio 1,0 M a pH 7,5.

Diluiram-se conjugados de CLB-CAgll7-peroxidase de rábano bastardo aproximadamente 10 000 vezes ( de acordo com a sensibilidade requerida) num tampão contendo tampão de Tris-HCl 50 mM, 0,2 % de Tween-20 e cloreto de sódio 1,0 M a pH 7,4. Desta diluição adicionaram-se 200 ul a cada alvéolo, selaram-se as placas e incubaram-se durante 2 h a 37°C ao abrigo da luz.

.·

I

K

It'¹ ·

Após lavagem das placas conforme descrito anteriormente, adicionaram-se a cada alvéolo 150 >il de uma solução preparada de fresco de tetrametilbenzidina (TMB) (0,1 g/1) e de peróxido de hidrogénio (0,006 %) em tampão de acetato de 0,1 M/ácido cítrico a pH5.5. I_ncubaram-se as placas durante 30 minutos ao abrigo da luz à temperatura ambiente. Fez-se parar a reacção enzimática por adição

de 150 μ1 de ácido sulfúrico 2 N. A adsorção foi determinada a 450 nm com um microleitor de ELISA. Conforme se mostra no Quadro II há um aumento de actividade de factor VIII de sucessivos meios condicionados que era aproximadamente proporcional ao aumento de uma quantidade de proteínas factor VIII no meio.

D. Paterminação da dimensão

A dimensão das proteínas factor VIII produzidas foi estabelecida usando electroforese em gel conforme se segue.

Usaram-se para imunoprecipitação os soros monoclonais e policlonais suscitados contra o factor VIII derivados de plasma. Os anticorpos foram imobilizados em proteína A-Sepharose (15 ^μΐ de soro por 10 mg de proteína A-Sepharose e em seguida foram incubados eom os compostos semelhantes a factor VIII recombinante marcados por via metabólica. Reduziram-se as proteínas recombinantes imobilizados usando beta-mercaptoetanol a 10% e em seguida separaram-se num sistema de electroforese em gel de poliacrilamida SDS (Laemmli, N*ture (1972) 2/7:680-685). Conforme se mostra na Figura 4 e no Quadro III, as proteínas semelhantes a factor VIII recombinante possuem a dimensão esperada para as proteínas glicosiladas. As bandas menores estavam também presentes na pista de comparação.

Com base nos resultados apresentados no Quadro III pode também concluir-se que se proteínas semelhantes a factor VIII recombinante da presente invenção estão glicosilados, uma vez que existe uma diferença significativa entre a dimensão das proteínas formadas em meio com e semtunicamicina, um conhecido inibidor da glicosilação ligada a asparagina.

Exemplo 7

Construção de Linhas de células Estáveis que produzem Proteícom Actividade de F_actor VIII

f li ií

J

I*

I ir í:

A. Expressão em células CHO

Introduziram-se os plasmídeos pCLB2O3 (10 /ig) e pAdD266SV(A)-3 (1 /ig, Kaufman e Sharp, Mol.Cell Biol. (1982) ^:1304-1319) em células CHO deficientes em rdhf (Chasin e Urlaub, Proc.Natl.Acad.Sci. USA (1980)

77:4216-4220) usando a técnica de precipitação com fosfato de cálcio (Grham e Van der Eb, Viroloqy (1973) 52:456-467).

A amplificação das sequências de codificação do factor VIII e do rdhf foi conseguida por administração gradual de concentrações crescentes de metotrexato (mtx) conforme descrito por Kaufman e Sharp, J.Mnl.Bj.ol. (1982) 159:601-621. Seleccionaram-se transformantes independentes resistentes a mtx 200 nM e estabeleceram-se como linhas de células estáveis, várias destas linhas de células produziram <erca de 75 mU de actividade de factor VHI/ml de meio de cultura. F_oi possível aumentar a quantidade de actividade de factor VIII segregada para o meio de cultura por amplificação adicional das sequências de codificação do factor VIII usando mtx em concentrações crescentes.

B. Expressão em Células Cl27 fé tr* r

1' fc s

P

F jli

WTl gu

I

1’ fc ·

Conforme descrito anteriormente, podem introduzir-se vectores de expressão em células ^ucarióticas, sendo aqueles integrados no genoma de célula hospedeira.

Em seguida os blocos integrados de expressão podem ser amplificados. Uma alternattiva à integração do vector de expressão ê a sua manutenção estável sob a forma de um epissoma. Um ewemplo consiste na expressão de uma das proteínas de factor VIII mutantes usando o sistema de BVP epissomal (Howley et al.« Meth.Bnzymol. (1983) 101:387-40 2). 0 genoma de 3VP-1 (cortado com BamHl) foi introduzido em primeiro lugar num derivado cortado com BamHl do plasmídeo pTZ18R (Pharmacia) que contém locais Xhol de ambos os lados do local BamHl. Subsequentemente cortou-se o plasmídeo pTZX-BVP resultante usando Xhol, dando origem a um fragmento pTZ de 2, 9 kb e a um

fragmento de BPV de 8 kb com extremidades salientes Xhol.

Egte ultimo fragmento foi ligado no plasmídeo pCLB212 cortado previamente no seu único local Sall (na posição 2040 no vector original pSVL). 0 vector de expressão resultante pGB881 contém o pròmotor tardio SV4o, uma sequência de codificação do ADNc do factor VIII a que faltam 2775 pb (principalmente do domínio B) e o sinal de poliadenilação tardio SV4O. Devido a presença do genoma de BPV este vector pode ser mantido sob a forma de um epissoma nas células hospedeiras apropriadas, como por exemplo células Cl27 de rato. Transfectaram-se com o plasmídeo pCB881 (10 jug) células Cl27 usando a técnica de precipitação com fosfato de cálcio (Graham e Van der Sfc>, supra). Isolaram-se focos 14 dias após transfecção e estabeleceram-se subsequentemente linhas de células estáveis, várias linhas de células produziram 40 mU de actividade de factor VIII/ml de meio de cultura.

Exemplo 8

CONSTRUÇÃO DO PLASMÍDEO pCLB204 plasmídeo pCLB2O4 foi construído usando a técnica de mutagénese de eliminação de laçada conforme descrita por Kramer et al. (1984) (ver General Methods,

2). A mutagénese de supressão da região central do ADNc do factor VIII foi levada a efeito usando o seguinte oligonucleótido;

iniciador IVí

3' TAG. GTT. TAA.GCG. AGT. CAA. GTT. TTG. GGT. GGT. CAG. AAC 5' t

a fim de provocar supressões internas no ADNc do factor VIII dassequências de codificação para os ácidos aminados desde Ala-375 até Ser-1637 (iniciador IV).

ií · A proteína correspondente contém su• pressões internas de 1263 ácidos aminados.

A fim de obter um fragmento alvo para mutagéneses de eliminação de laçada seleccionou-se um fragmento HlndlII-Pstl de 1,4 kb derivado de pCLB203 (Exemplo

3). A posição nucleótidica (Figura 1) do local nd III situa-se a 1025 da sequência a montante da região a ser modificada; e local PstI situa-se na posição 5165 a juzante da região. E_stes locais estão indicados na Fig. 2. 0 fragmento de 1,4 kb foi subclonado em Ml3mp9 levando-se a efeito em seguida a mutagénese de eliminação de laçada. Após selecção do fragmento com a supressão correcta obtida com o iniciador IV no bacteriófago Ml3, o fragmento H/ndlIl-Pstl contendo a supressão pretendida foi inserido num derivado do plasmídeo pCLB201 usando as seguintes fases e preparando fragmentos com extremidades coesivas de enzimas de restrição singulares (os aúmeros referentes à Figura 1);

fase 1. Digeriu-se o plasmídeo pCLB20l com Aval e Xbal gerando um fragmento de vector - de Aval (737) até Xbal (6951) - de cerca de 6 kb.

fase 2. Digeriu-se o plasmídeo pCLB20l com Aval e HindIII obtendo-se um fragmento de 289 pb de comprimento: de A_val (737) até HindIII (1025) fase 3. Digeriu-se o plasmídeo pGLB201 com PstI e Ndel, obtendo-se um fragmento - de PstI (5165) até Ndel (5527) - de 363 pb.

fase 4. Digeriu-se o plasmídeo pCLB201 com Ndel e Xbal, obtendo-se um fragmento - de Ndel (5527) até Xbal (6951) - de 1425 pb.

fase 5. Digeriu-se com HindIII e PstI o bacteriófago Ml3 contendo o fragmento com a mutação pretendida.

fase 6. I_golaram-se os cinco fragmentos, misturaram-se em quantidades equimolares e ligaram-se. Seleccionaram-se os plasmídeos contendo todos os fragmentos. Usando

o iniciador IV, apresentado anteriormente, construiu-se um novo vector de expressão para a expressão do composto do exemplo descrito no Quadro I:

pCLB2O4 para o composto 4 com o iniciador IV

As construções de ADN e os métodos da presente invenção proporcionam um meio para a preparação de plasmideos dotados de actividade de factor VIII por introdução de um gene mutante de supressão que codifica para um congénere do factor VIII numa célula hospedeira. São também proporcionados processos para a preparação de composições para o tratamento dos sintomas de hemofilia A.

T_odas as publicações e pedidos de paten· tes mencionados na presente memória descritiva indicam o nível de especialidade dos especialistas na técnica a que a presente invenção se dirige. T_odas as publicações e pedidos de patente são dados por reproduzidos na presente memória descritiva como se cada publicação ou pedido de patente fosse específica e individualmente indicado como sendo dado por reproduzido.

Tendo sido a presente invenção agora descrita em pormenor, será evidente para um especialista na técnica que podem ser feitas muitas alterações e modificações sem abandonar o espírito e o âmbito das reivindicações em anexo.

referencias (Referências das páginas 34 a 36 do original)

(0 φ

Ρ c

te ρ

Μ

Ο μ

υ «

ΡΜ ©

«σ <β δ

SI φ

ρ ο

CU φ

Ό

Ο κο

Μ η

φ μ

ρ g

(Q $

(0

Φ μ

CU *

Μ

Φ σ

μ

Q.

G χ w ρί μ

§* * ω

Μ §· cn αί ο

Ρ

Φ

Ο &

r-f υ

CU

οι	η	οι	tJ·	00	cn	o
ο	Ο	ι—1	O	O	O	H
ΟΙ	ΟΙ	OJ	oí	OI	O1	O1
03	ra	m	03	ra	m	m
	ra	ra	ra	ra	ra	ra
υ	υ	u	u	u	υ	υ
Ρ.	CU	Pí	CU	cu	cu	CU

o	O	O	o	o	rd	r—1	Ol
					I—1	ra	ra
O1	OI	Ol	OJ	Ol	Ol	Ol	Ol
ra	ra	ra	ra	ra	ra	ra	ra
ra	ra	ra	ra	ra	ra	ra	ra
OI	Ol	Ol	Ol	Ol	Ol	Ol	Ol
1	1	1	1	1	1	1	1
!*	Jm	>1	><	r*		>>	í*

τ ΐ Τ Τ Τ ΤΓ τ

00		G0	00	00	00	01	σι	o
ra		CO	ra	co	co	V	ra	σί
ra		νϋ	ra	<0	ω	ra	ra	ra
ι—1		rH	H	H |	|	H I	H |	H |
ά		Λ	Λ	a	I a	1 w	1 cn	1 cn
				o-	o-	o-	o·	o-
		ra	o-	cn	σι	Ol	Oi	Ol
o		cn	01	00	00	co	ω	ω
		ra	00
				Φ	to	(0	(0	<0
		o-		0	0	0	0	u
		ra		•H	•rl	•H	-H	•H
o·	+	ra		Φ5	Ό	Ό	Ό	U
ra	o-	r—1		Ή	Ή	'rl	*rl	Ή
ra	ra	W		P	P	P	P	P
Η	00			cu	CU	CU	CU	CU
1	1	Φ		Φ	Φ	(D	Φ	Φ
cn		1		cu	cu	cu	cu	CU
		ra
4>>	φ	ra	<	0	0	O	0	O
T	1	ra	J	MJ	MJ	MJ	MJ	MJ
ι-1	H	rH	>	o	O	O>	Ch	O
V	sh	I	1	Φ	to	(0	(0	(0
Ο-	ο-	Q	oí	01	Cn	cn	cn	cn
Ι	ι		1	•rl	•rl	•H	•H	rl
cn	cn		PU	ι—(	i—1	r—1	ι—1	i—1
			ω	00	ra	O	o	O
o	o		Ol	Ol	ra
					ra
o	o		Ol	Ol	Th	o	o	o
Th	Th		ι—1	r-1	o-	Th	Th	Th
o-	Ο-		Ο-	Ο-	ra	ο-	Ο-	ο-
1	Ι		Ι	Ι	J	ι	Ι	ι
0Í	aí		Q	P	>	oí	oí	oí

τ τ τ τ τ τ τ τ

4: 4:

CM γ—I rH γΗ γΗ γΗ r—I <<<<<<

(η Η rf > CO Ο\

	H H £	Μ Ο Ό
H H	μ 0 -P 0 to M-l O £ 0 o 0	Ο Μ) Ο Π) μ 1 G < μ
μ 0	MJ o (0 μ (0	& G cn ο
P	&	MJ
0	ε	σ>
(0	ο	Φ
m	ο	0
o	ε	•Η Ό
TJ	φ	G
m 0	ο MJ	•Η ίθ
Ό (0	•Η cn	ε
G	Φ	ο
•rl	μ	ο
ε to	φ	cn
m O Ό •H	Ό ίβ Ο ε	Φ § rH Ο	•
U	φ	υ	Η
'tO	ω	03	«5
Φ	ο	φ	μ
Ό	TJ	>	3
•Η	τ|	cn
(0	ε	4J	•rl
P	-Η	Ο	Pm
CU	μ	φ	Φ
G	Pu	CU
μ	G	ω	G
μ	cn	φ
φ		μ	Φ
Ρ	03		Ό
G	ο	03	Φ
-Η	Ό	Φ	Ο
G	(0	G	•Η
-Η	C		Ό
	•rl	0	C
(0	ε	Ό	•Η
•rl	φ	ίθ
υ		Ρ	Φ
G	cn	G
<φ	ο	Φ	'Φ
G	Ό	03
cn	•rl	Φ	cn
φ	ϋ	μ	0
CO	'10	CU	Ό
φ	φ	Φ	Φ G
ε	Ό	'φ	•Η
G	Ο	Η	ε φ
Φ	μ	Φ
O	φ	μ	03
•rl	ε	σι	Ο
M-t	'G	φ	Ό
•rl	C	Ρ	•rl
G		G	Ο
cn	0	•rl	'Φ
Ή cn T	*

- 39 ir ι σ

-Η -Η

Ε +J

U Ο C Φ Κ0 (0 +> θ'

Φ <0 Φ Ό β Ό

δ 13 < cu s

¾ σ

ΓΊ ¹ .Q Φ *0 Μ Ο»

Ή

Ό Φ Φ (0 Ο CU Φ η ρ Ό'Ο Ο Φ & ο Ό φ Ή -Ρ ο g >* . 0) (0 · < 3 m σ» Ο Φι4 (0

-Η >

Ή +>

υ +» <ο

CU (0 XOU ο

Μ

Ο

4J

U (0

Ή

Ε

Μ ο

β +ί (0 φ Λ χΌ r- οι

Φ Η Ε

Ό Ε 0 (0 X. Μ

Ό 9 Ο •Η Ε · >

-rl $

(0

X) •Η ΰ

(0

WJ φ

Φ φ φ

Μ ⁰ Ο· *3 3 (0 Φ β

S β Μ Φ Ο β Ό •Η ·Η U Ο φ

ο +J φ

ο ι· ο

ο

l·,.

ο

W

W

Η fe .

(0 W) Ό ϋ>

Φ ΟΡ WJP (>Φ Ρ Ο Λ Ο Η Ή β Ρ ρ σ» ιη «ο

Ό

Ρ υ ο ©

J® Ρ η φ β£) Φ «ο ΕΡ Ρ 03 Ό ©

Φ	Φ
Ω	Α
Λ	2
ιη	00
00	ιη
Ρ	Ρ

Φ	φ	φ	Φ
Ω	Ω	Ω	Ω
X	X	X	X
CJ	00	00	ιη
03	30	Ό	η
Ρ	rH	Ρ	r-4

&

ρ5 §

a

Ζ

Η §

W

Ω ά

Η

Η

Η

Ο β

Ό

Φ α

% Ο Ό ί® (0 0» Ρ β 3 φ υ β Η •Η Φ >σ ο «*>

ω (0 φ

β (λ η

ΓΊ

Φ ο ϋ»β η β η ο Φ

Ρ Μ υ a Φ X > Φ

Φ	φ	φ	φ	φ
Ω	Α	Ω	Ω	Ω
X	X	X	X	X
ιη	00	(Μ	OQ	η
30	ω	30	30	ΓΊ
ίΊ	Ρ	Ρ	Ρ	Ρ

			η
ιη	ιη	ιη	30
03	ΓΜ	OJ	OJ
30	03	03	Ρ

Μ	γ-	Η	Γ-	03
ί*3	γο	r-4	Ο	30
η	30			Ο
Μ	Ρ	rd	Ρ	Ρ

Ρ CJ ΓΟ Ο $ R 8 <1 8

9 3 3 9 ο υ υ □ υ

Οι Ο) ή & d

Η

Ο β

Ό

Φ σ

Μ φ

>

ο

Ό

Ο

1® ο

φ ο

Ρ

Ρ •Η σ

ο ο

φ

Ό

Φ •Η

Ο β

<Φ

Ο¹

Φ

0)

Φ β

Ο

Ό

Φ β

Ρ ε

φ

Ο

Ό

Ρ υ

»·φ φ

Ό

Φ

Ρ

Ο

Ρ ο

β φ

ε '3 β

'Φ

Ο

Ρ β

φ ε

•Η β

&

ο ο

ΓΜ

Ο

ΙΦ ο

φ

U

Η

Ρ •Η

Ό

Ο

Ο φ

Ό

Φ •Η

Ο β

«φ

ÍT

Φ

Φ

Φ Φ Ό -Ρ β

Φ φ Ο Ό Ό β ε

Ή β

φ &

φ φ

β β

ο

U ε

φ φ

Ό •Η υ

φ χ:

β ο

ο ο

ι® ο

•Η ω

ο φ ο ο Ό WJ φ φ β

•Η ε

φ a χ φ φ ο

Ό Φ • Ρ Ό ο υ ΙΦ 'Φ β 03 ο 03 φ -Ρ φ Ό Ο β a ο X Ρ φ φ ε ο

υ φ

Ό

Φ

Φ

Φ

Λ

Φ β

Φ

Ό

Φ β

•Η ε

β φ

Ρ φ

ρ β

ο φ

Ή υ

β §

φ β

>Η

Φ

Ρ

Ο β

a φ

<?

ο ί® ο

φ

Ρ •Η a

Ρ

Ο φ

β a

ο α

ε

Η β

ο a

φ

Ό

Φ β

Η ε

β φ

Ρ φ

Ό β

Ο

I β

ο υ

φ β

Ρ rH

U

Φ

Ό ε

β φ

®

Ό

Φ >

•Η

Ρ

Ρ

U

Φ

Φ 'Φ υ

φ φ

Ό φ

φ β

Μ

Φ

Ρ ο · β — a ρ ε ω \ ό σ> ε β ο

φ	'3		Ρ		Ρ	ω	Ρ	ο
Ό	β	Ρ	γ—I		Ρ	φ	Ρ	ο
		φ	(0		φ	φ	φ	κ
β	Ο	β	Ω		Ω	β	Ω	ο
0		σ	1		1	0	1
Ρ	Φ	φ	0		Ο	Ρ	Ο
Ο	Ο	Ρ	Ρ		γΗ	ο	Ρ	φ
Φ	Ρ	α	Ρ		Ρ	β	Ρ	β
>	Ρ	Ρ	3	•	3	Ρ	3	Ρ
	Ρ		σ	φ	σ’	ο	σ’	U
0	β	Η		0		φ		Ρ
β	σ»	Η	ε	Ό	ε	Ρ	ε	ε
	Ρ	Η	φ	Φ	φ	φ	φ	®
Η	φ	>		β				σ

Ρ β ο

Ρ β υ a ο β ι® ο Φ Ρ ® υ φ φ Ρ ο

ι®

Φ Φ t!

ω φ S ο

-Η Τ>

Ό Ρ

Ο < 'Φ

Ο ί® ω

β φ

ε

Ή

Ό

Φ Ο Ό I® ω

Φ β Ό Φ •η ε 3 ρ σ> ό φ φ <

ο

Ό β

φ

Ρ ιη

Claims (1)

1. REIVINDICAÇÕES

   - lô Processo para a preparação de uma proteína dotada de actividade biológica de factor VIII em que a sequência de ácidos aminados é representada pela fórmula na qual:

   Ng contém uma sequência substancialmente idêntica a pelo menos uma porção de uma sequência consecutiva do domí nio A1A2 do factor VIII, tendo sido suprimidos não mais do que cerca de 45% do número total de ácidos aminados no referido domínio A1A2 e contendo a referida sequência substancialmente toda a região N-terminal do factor VIII;

   Lr contém uma ligação peptídica, uma sequência de 1 a 20 ácidos aminados ou pelo menos um ácido aminado e

   Cr oontém uma sequência substancialmente idêntica a pelo menos uma porção de uma sequência consecutiva desde o ácido aminado 1638 até ao ácido aminado 2332 do factor VIII, tendo sido suprimidos não mais do que cerca de 25% do número total de ácidos aminados, desd o ácido aminado Q-1638 até ao ácido aminado Y-2332 e contendo a referida sequência substancialmente toda a região C-terminal do factor VIII, caracterizado por compreender as fases de:

   cultivar num meio nutriente uma célula hospedeira contendo um vector de expressão que contém, na direcçâo da transcrição, uma região de regulação da transcri ção e uma região de início de tradução funcionais na célula hospedeira, uma sequência de ADN que codifica para a proteína anteriormente definida e regiões da terminação de tradução e de transcrição funcionais na referida célula hospedeira, sendo a expressão da referida sequência de áDN regulada pelas referidas regiões de início e de terminação e isolar a referida proteína.

   - 2ê Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por na fórmula da proteína obtida

   Ng conter uma sequência de ácidos aminados na qual foram suprimidos não mais do que 5 por cento do número total de ácidos aminados do referido domínio A1A2.

   - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por na fórmula da proteína obtida

   N_r conter uma sequência de ácidos aminados correspondente «Bubstanciaimente aos ácidos aminados desde 1 até 712 ou até 740 do factor VIII.

   ii p fir¹ .

   IBS'

   I¹

   I «pi r :

   - 4& Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por na fórmula da proteína obtida C_R conter uma sequência de ácidos aminados na qual não mais do que 10 por cento do número total de ácidos aminados desde Q-1658 até Y-2552 foram suprimidos.

   kΜ jl i

   3!

   I !* w ^f

   Ái r

   Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por na fórmula da proteína obtida G_T, conter uma sequência de ácidos aminados correspondendo subs tancialmente aos ácidos aminados desde 1638, 1649, 1669 ou 1690 até 2332 do factor VIII.

   - 6^ Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por na fórmula da proteína obtida conter uma ligação peptídica, conter a sequência de ácidos aminados -P-R-V-A- ou pelo menos um dos ácidos aminados de cerca de 741 até cerca de 867 e de cerca de 1563 até cerca de 1637 do factor VIII.

   _ 7S _

   Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por na fórmula da proteína obtida conter uma ligação peptídica; conter uma sequência de ácidos aminados correspondente substancialmente aos ácidos aminados de 1 até 712 ou de 1 até 740; e conter uma sequência de ácidos aminados correspondendo substancialmente aos ácidos aminados de 1638 até 2332, de 1649 até 2332, de 1669 até 2332 ou de 1690 até 2332 do factor VIII.

   í- - 8& 1 r

   ' Processo de acordo com a reivindica!· i çâo 1, caracterizado por na fórmula da proteína obtida * ’ conter P-R-V-A; Bt> conter uma sequência de ácidos aminados ;. correspondendo substancialmente aos ácidos aminados 1 a 712 JL do referido factor VIII; e 0^ conter uma sequência de ácidos aminados correspondendo substancialmente aos ácidos aminados 1638 a 2332 do factor VIII.

   _ 9& Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por na fórmula da proteína obtida K, conter uma sequência correspondendo substancialmente pelo menos um dos ácidos aminados 741 até 867 e 1563 até 1637 do faotor VIII; N·^ conter uma sequência de ácidos aminados correspondendo substaacialmente aos ácidos aminados 1 a 740 do factor VIII; e C-^ conter uma sequência de ácidos aminados correspondendo substancialmente aos ácidos aminados 1638 a 2332 do factor VIII.

   j,

   - 10 & -

   Processo de acordo com a reivindicação 9» caracterizado por conter uma sequência correspondendo substancialmente aos ácidos aminados de 741 até 867 fun didos com os ácidos aminados de 1563 até 1637.

   - 11§ 4 £

   fis || íl

   It

   Processo para a preparação de uma sequência de ADN que codifica para qualquer das proteínas obtidas de acordo com qualquer das reivindicações anteriores caracterizado por compreender as fases de se isolar 0 gene para 0 factor VIII a partir dum banco genómico obtido a partir de células que produzem factor VIII e suprimirem-se secções do ADN genómico por corte enzimático seguidas de modificação e de ligação dos fragmentos purificados ou de mutagénese dirigida.

   St'

   I

   - 45 Sl

   - 12®

   Processo para a preparação de um vector de expressão caracterizado por se integrarem num vector apropriado na direcção da transcrição uma região de regulação de transcrição e uma região de início de tradução funcionais numa célula hospedeira, uma sequência de ADN que codifica para qualquer das proteínas definidas nas reivindicações 1 a 10 e regiões de terminação de tradução e de transcrição funcionais na referida célula hospedeira, sendo a expressão da referida sequência de ADN regulada pelas referidas regiões de início e de terminação.

   - 13® Prooesso de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por a referida região de regulação de transcrição conter um promotor SV40 precoce ligado em série a montante de um promotor RSV-LTR.

   I ¹ í

   ?

   í fi

   - 14® Processo de acordo com qualquer das reivindicações 12 ou 13, caracterizado por o vector de expressão obtido ser escolhido de entre o grupo constituído por pCLB20l, pCLB202, pCLB203, pCLB208, pCLB209, pCLB210, pCLB212 ou pGB881.

   - 15® ^; Processo para a preparação de uma célula hospedeira transformada e da respectiva descendência ’ caracterizado por se transformar uma célula hospedeira apro:* priada com um vector de expressão contendo na direcção da f/ transcrição uma região de regulação de transcrição e uma re| - 46 ST” gião de início de tradução funcionais numa célula hospedeira, uma sequência de ADN que codifica para qualquer ias proteínas definidas nas reivindicações 1 a 10 e regiões de terminação de tradução e de transcrição funcionais na referida célula hospedeira, sendo a expressão da referida sequência de ADN regulada pelas referidas regiões de início e de terminação.

   - 16S Processo de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por a referida célula ser uma célula de mamífero,

   - 17^s Processo de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por a referida célula ser uma célula COS, uma célula CHO ou uma célula C127.

   - 18« Processo de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por a referida céiula ser uma célula procariótica ou uma célula de levedura.

   - 19^â Processo de acordo com a reivindicação 18, caracterizado por a referida célula ser de uma das espécies Bacillus ou Klyveromyoes.

   - 47 - 2& Processo para a preparação de uma composição farmacêutica útil para o alívio dos sintomas da deficiência em factor VIII caracterizado por se incorporar como substância activa uma quantidade suficiente para o alívio dos sintomas da referida deficiência de uma proteína contendo um mutante de supressão do factor VIII quando obtida de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 10 juntamente com uma substância veicular farmacêutica aceitável.

   A requerente declara que o primeiro pedido desta patente foi apresentado como pedido de patente europeu em 12 de Junho de 1987, sob o N^s. 87201121.8.

   Lisboa, 14 de Junho de 1988 í, ΪΕ OFiSliV BA FOTROm iN»W5T'RÈ<-