ES2244989T3

ES2244989T3 - Metodos y acido desoxirribonucleico para la preparacion de la proteina del factor tisular.

Info

Publication number: ES2244989T3
Application number: ES97200009T
Authority: ES
Inventors: Richard Mark Lawn; Karen Lynne Wion; Gorden Allen Vehar
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1987-02-12
Filing date: 1988-02-12
Publication date: 2005-12-16
Anticipated expiration: 2008-02-12
Also published as: IL85411A0; DE3856580D1; NZ223506A; EP0278776A3; DE3855921D1; EP0787802A3; DE3855921T3; ES2068791T5; EP0278776B2; IL85411A; DE3856580T2; IE880380L; GR3024263T3; JP2869920B2; IE81149B1; ATE153696T1; AU1170588A; DE278776T1; ES2068791T3; AU617302B2

Abstract

AISLADORES DE ADN QUE CODIFICAN UNA PROTEINA DE FACTOR DE TEJIDO Y DERIVADOS DEL MISMO Y METODOS DE OBTENER DICHO ADN Y PRODUCIR PROTEINA DE FACTOR DE TEJIDO Y DERIVADOS DEL MISMO UTILIZANDO SISTEMAS DE EXPRESION RECOMBINANTES PARA USO EN COMPOSICIONES TERAPEUTICAS PARA EL TRATAMIENTO DE TRASTORNOS DE COAGULACION.

Description

Métodos y ácido desoxirribonucleico para la preparación de la proteína del factor tisular.

Esta invención se refiere a variantes o fragmentos o polipéptidos de fusión de la proteína del factor tisular que inducen coagulación, para su uso como medicamento.

La hemorragia es una de las manifestaciones más serias y significativas de enfermedad. Esta puede suceder en un sitio local o puede ser generalizada. La hemostasis primaria consta principalmente de dos componentes: vasoconstricción y formación del tapón de plaquetas. La formación del tapón de plaquetas puede dividirse en varias fases: adherencia de las plaquetas a las superficies subendoteliales expuestas por el traumatismo; reacción de liberación de activación de las plaquetas; agregación de las plaquetas, que da como resultado el secuestro de plaquetas adicionales en el sitio, y la unión del fibrinógeno y las proteínas de coagulación a la superficie de las plaquetas que da como resultado la formación de trombina; y, la fusión que es la coalescencia de la fibrina y las plaquetas fusionadas para formar un tapón hemostático estable.

La coagulación sanguínea realiza dos funciones: la producción de trombina que induce la agregación de las plaquetas y la formación de fibrina que vuelve estable el tapón de plaquetas. En el proceso de coagulación participan varias proenzimas y profactores específicos, mencionados como "factores de coagulación". El proceso consta de varias fases y termina con la formación de fibrina. El fibrinógeno se convierte en fibrina por la acción de la trombina. La trombina se forma por la proteolisis limitada de una proenzima, la protrombina. Esta proteolisis se realiza por el factor X activado (mencionado como factor X_{a}) que se une a la superficie de las plaquetas activadas y, en presencia del factor Va y de calcio iónico, escinde la protrombina.

La activación del factor X puede suceder mediante cualquiera de dos vías separadas, la extrínseca o la intrínseca (Figura 1). La cascada intrínseca consta de una serie de reacciones en las que un precursor proteico se escinde para formar una proteasa activa. En cada etapa, la proteasa recién formada catalizará la activación de la proteasa precursora en la etapa posterior de la cascada. Una deficiencia en cualquiera de las proteínas de la vía bloquea el proceso de activación en esa etapa, evitando de ese modo la formación del coágulo y típicamente da lugar a una tendencia a la hemorragia. Las deficiencias en el factor VIII o factor IX, por ejemplo, provocan los síndromes hemorrágicos graves de la hemofilia A y B, respectivamente. En la vía extrínseca de la coagulación sanguínea, el factor tisular, también mencionado como tromboplastina tisular, se libera de las células dañadas y activa el factor X en presencia del factor VII y calcio. Aunque en un principio se creía que la activación del factor X era la única reacción catalizada por el factor tisular y el factor VII, ahora se sabe que existe un bucle de amplificación entre el factor X, el factor VII, y el factor IX (Osterud, B., y S.I. Rapaport, Proc. Natl. Acad. Sci. [USA] 74:5260-5264 [1977]; Zur, M. et al., Blood 52: 198 [1978]). Cada una de las serina proteasas de este esquema es capaz de convertir por proteolisis las otras dos en la forma activada, amplificando de ese modo la señal en esta fase del proceso de coagulación (Figura 1). Ahora se cree que la vía extrínseca puede ser, de hecho, la vía fisiológica principal de la coagulación sanguínea normal (Haemostasis 13:150-155 [1983]). Como el factor tisular no se encuentra habitualmente en la sangre, el sistema no coagula continuamente; el desencadenante de la coagulación sería por lo tanto la liberación del factor tisular del tejido dañado.

Se cree que el factor tisular es una glicoproteína integral de membrana que, como se ha analizado anteriormente, puede desencadenar la coagulación sanguínea por la vía extrínseca (Bach, R. et al., J. Biol. Chem. 256[16]: 8324-8331 [1981]). El factor tisular consta de un componente proteico (previamente mencionado como apoproteína-III del factor tisular) y un fosfolípido. Osterud, B. y Rapaport, S.I., Proc. Natl. Acad. Sci. 74, 5260-5264 (1977). Se ha encontrado el complejo en las membranas de monocitos y diferentes células de la pared de los vasos sanguíneos (Osterud, B., Scand. J. Haematol. 32: 337-345 [1984]). Se ha informado de que el factor tisular de diversos órganos y especies tiene una masa molecular relativa de 42.000 a 53.000. Se ha descrito que la tromboplastina tisular humana consta de una proteína del factor tisular insertada en una bicapa de fosfolípidos en una proporción óptima de proteína del factor tisular:fosfolípido de aproximadamente 1:80 (Lyberg, T. and Prydz, H., Nouv. Rev. Fr. Hematol. 25(5): 291-293 [1983]). Se ha informado sobre la purificación del factor tisular a partir de diversos tejidos tales como: cerebro humano (Guha, A. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 83: 299-302 [1986] y Broze, G.H. et al., J. Biol. Chem. 260[20]: 10917-10920 [1985]); cerebro bovino (Bach, R. et al., J. Biol. Chem. 256: 8324-8331 [1981]): placenta humana (Bom, V.J.J. et al., Thrombosis Res. 42:635-643 [1986]; y, Andoh, K. et al., Thrombosis Res. 43:275-286 [1986]); cerebro ovino (Carlsen E. et al., Thromb. Haemostas. 48[3], 315-319 [1982]); y, pulmón (Glas, P. and Astrup, T., Am. J. Physiol. 219, 1140-1146 [1970]). Se ha demostrado que la tromboplastina tisular bovina y humana son idénticas en tamaño y función (véase Broze, G.H. et al., J. Biol. Chem. 260[20], 10917-10920 [1985]). Está ampliamente aceptado que aunque hay diferencias en la estructura de la proteína del factor tisular entre especies no hay diferencias funcionales medidas por ensayos de coagulación in vitro (Guha et al. supra). Además, el factor tisular aislado de diversos tejidos de un animal, por ejemplo, cerebro, pulmón, arterias y venas de perro era similar en ciertos aspectos tales como, coeficiente de extinción, contenido en nitrógeno y fósforo y proporción óptima de fosfolípidos a lípidos pero difería ligeramente en tamaño molecular, contenido en aminoácidos, reactividad con anticuerpos y vida media en plasma (Gonmori, H. and Takeda, Y., J. Physiol. 299[3], 618-626 [1975]). Todos los factores tisulares de los diversos órganos de perro mostraron actividad coagulante en presencia de lípidos. Idem. Está ampliamente aceptado que para mostrar actividad biológica, el factor tisular debe estar asociado a fosfolípidos in vitro (Pitlick, F.A., and Nemerson, Y., Biochemistry 9: 5105-5111 [1970] y Bach, R. et al. supra. en 8324). Se ha demostrado que la retirada del componente fosfolipídico del factor tisular, por ejemplo por el uso de una fosfolipasa, da como resultado una pérdida de su actividad biológica in vitro (Nemerson, Y., J.C.I. 47: 72-80 [1968]). La relipidación puede restaurar la actividad del factor tisular in vitro (Pitlick, F.A. and Nemerson, Y., supra y Freyssinet, J.M. et al., Thrombosis and Haemostasis 55: 112-118 [1986]). Se han determinado las secuencias amino terminales del factor tisular (Bach, R. et al., Am. Heart Assoc. [Nov., 1986], Morrisey, J.H. et al., Am. Heart Assoc. [Nov., 1986] y un fragmento peptídico CNBr (Bach, R. et al. supra).

Durante mucho tiempo se ha creído que la infusión de factor tisular comprometía la hemostasis normal. En 1834 el fisiólogo francés de Blainville estableció primero que el factor tisular contribuía directamente a la coagulación sanguínea (de Blainville, H. Gazette Medicale Paris, Series 2, 524 [1834]). Además, de Blainville observó que la infusión intravenosa de una suspensión de tejido cerebral provocaba la muerte inmediata que observó que se correspondía con un estado hipercoagulativo que daba lugar a coágulos sanguíneos diseminados ampliamente encontrados en la autopsia. Ahora está bien aceptado que la infusión intravenosa de tromboplastina tisular induce la coagulación intravascular y puede provocar la muerte en diversos animales (Perros: Lewis, J. and Szeto I.F., J. Lab. Clin. Med. 60: 261-273 [1962]; conejos: Fedder, G. et al., Thromb. Diath. Haemorrh. 27: 365-376 [1972]; ratas: Giercksky, K.E. et al., Scand. J. Haematol. 17: 305-311 [1976]; y, ovejas: Carlsen, E. et al., Thromb. Haemostas. 48: 315-319 [1982]).

Aunque el aislamiento del factor tisular se ha descrito en la bibliografía como se ha mostrado anteriormente, la estructura precisa de la proteína del factor tisular no se ha establecido previamente. Aunque algunas cantidades de proteína del factor tisular "purificado" han estado disponibles obtenidas de diferentes tejidos, la baja concentración de proteína del factor tisular en la sangre y los tejidos y el elevado coste, tanto económico como de esfuerzo, de purificar la proteína de los tejidos, hacen de esta un material poco frecuente. La memoria descriptiva muestra cómo aislar el ADN que codifica la proteína del factor tisular y producir cantidades útiles de proteína del factor tisular humano usando técnicas recombinantes. La memoria descriptiva muestra adicionalmente cómo preparar nuevas formas de la proteína del factor tisular. Este y otros objetos de esta invención se harán evidentes a partir de la memoria descriptiva como conjunto.

Las variantes y fragmentos y polipéptidos de fusión de la proteína del factor tisular de uso en la invención pueden conseguirse por un método que comprende: identificar y clonar el ADNc que codifica la proteína del factor tisular humano; incorporar ese ADNc en un vector de ADN recombinante; transformar un hospedador apropiado con el vector que incluye ese ADN; expresar el ADN de la proteína del factor tisular humano en dicho hospedador; y recuperar la proteína del factor tisular humano que se produce. De un modo similar, la memoria descriptiva hace posible producir proteína del factor tisular humano y/o derivados de la misma por técnicas recombinantes, así como proporcionar productos y métodos relacionados con dicha producción de proteína del factor tisular humano. El aislamiento y la identificación y la secuenciación del ADN de la proteína del factor tisular eran problemáticos. El ARNm era relativamente poco frecuente y hasta ahora no se conocía la secuencia de aminoácidos completa de la proteína del factor tisular.

La presente invención se refiere a la materia objeto de las reivindicaciones adjuntas.

La memoria descriptiva contiene composiciones y métodos para producir proteína del factor tisular humano por tecnología de ADN recombinante, incluyendo: 1) el aislamiento e identificación de la secuencia de ADN completa de la proteína y la región flanqueante 5' y 3' de la misma; 2) la construcción de vehículos de clonación y expresión que comprenden dicha secuencia de ADN, posibilitando la expresión de la proteína del factor tisular humano, así como conjugados N terminales con metionina, de fusión o señal de los mismos; y 3) cultivos celulares viables, alterados genéticamente debido a que contienen dichos vehículos y capaces de producir proteína del factor tisular humano. Esta memoria descriptiva contiene adicionalmente composiciones de ADN y métodos para producir ADN que codifica para la producción celular de proteína del factor tisular humano, y contiene nuevos compuestos, incluyendo secuencias de ADN que se utilizan para obtener clones que codifican la proteína del factor tisular. Esta invención se refiere adicionalmente al uso nuevos derivados de la proteína del factor tisular, en particular derivados que carecen de la secuencia señal y la porción hidrófoba de la proteína cerca del extremo C-terminal de la proteína que comprende la secuencia de aminoácidos que constituye el dominio de unión transmembrana o de membrana de la proteína del factor tisular.

La utilidad de la proteína del factor tisular humano y los derivados de la misma para su uso en esta invención se basa en parte en la nueva e inesperada observación de que la infusión en perros hemofílicos de proteína del factor tisular, que es la porción proteica del factor tisular que carece de fosfolípidos de origen natural, que se mencionó previamente como apoproteína III del factor tisular y que se creía previamente que era inactiva, corregía la deficiencia hemostática. Se descubrió por primera vez que la proteína del factor tisular corregía la diatesis hemorrágica, es decir una tendencia a la hemorragia, asociada con la deficiencia en el factor VIII in vivo. Se podría esperar que la infusión de proteína del factor tisular fuera ineficaz en vista de los artículos de la técnica anterior que describen que el factor tisular tiene una necesidad absoluta de fosfolípidos. En contraste con el trabajo de de Blainville y los posteriores investigadores en los siguientes ciento cincuenta y dos (152) años, también se descubrió que la proteína del factor tisular era no tóxica para los perros cuando se infundía por vía intravenosa.

La proteína del factor tisular humano y los derivados de la misma para su uso en esta invención son útiles en el tratamiento de diversos trastornos hemorrágicos crónicos, caracterizados por una tendencia a la hemorragia, tanto heredada como adquirida. Los ejemplos de dichos trastornos hemorrágicos crónicos son deficiencias de los factores VIII, IX, o XI. Los ejemplos de trastornos adquiridos incluyen: inhibidores adquiridos de los factores de coagulación sanguínea por ejemplo, el factor VIII, el factor de von Willebrand, los factores IX, V, XI, XII y XIII; trastornos hemostáticos como consecuencia de una enfermedad del hígado que incluye la síntesis disminuida de factores de coagulación y DIC; la tendencia a la hemorragia asociada a enfermedad renal aguda y crónica que incluye deficiencias en el factor de coagulación y DIC; la hemostasis después de traumatismo o cirugía; pacientes con malignidad diseminada que se manifiesta en DIC con aumentos en los factores VIII, factor de von Willebrand y fibrinógeno; y hemostasis durante cirugía cardiopulmonar y transfusión sanguínea masiva. La proteína del factor tisular humano y los derivados de la misma descritos en este documento también pueden usarse para inducir la coagulación para problemas hemorrágicos agudos en pacientes normales y en aquellos con trastornos hemorrágicos crónicos.

Breve descripción de los dibujos

Fig. 1 Diagrama que muestra la activación de la coagulación sanguínea mediante la vía intrínseca.

Fig. 2 Secuencia de nucleótidos y aminoácidos de la proteína del factor tisular humano. La secuencia de nucleótidos de la proteína del factor tisular humano se determinó a partir del análisis de la secuencia de ADN de un clon de tejido adiposo y en parte confirmada por secuenciación de otros clones. Los aminoácidos predichos de la proteína del factor tisular se muestran debajo de la secuencia de ADN y se numeran desde el primer resto del extremo N-terminal de la secuencia de la proteína. Los números negativos de los aminoácidos hacen referencia a la secuencia señal líder supuesta o preproteína, mientras que los números positivos hacen referencia a la proteína madura.

Figs. 3a-3c (Mencionadas colectivamente en este documento como Fig. 3). El ADNc de la proteína del factor tisular humano y sitios de enzimas de restricción.

Fig. 4 Construcción de un vector de expresión pCISTF que codifica la proteína del factor tisular de longitud completa para su uso en células hospedadoras de mamífero.

Fig. 4a Ilustra parte de la construcción de los vectores de la serie pCIS2.8c usados en este documento.

Fig. 5 Perfil hidropático del factor tisular. La secuencia de ADN traducido del factor tisular humano se trazó usando el algoritmo de Kyte and Doolittle, J. Mol. Biol., 157: 105 (1982). La abscisa muestra la secuencia de aminoácidos comenzando en el extremo amino maduro. Los puntos positivos en la ordenada indican regiones hidrófobas de la proteína; cada punto representa la hidropatía media de 6 aminoácidos sucesivos. En la parte inferior, N marca la posición de sitios de glicosilación unidos a asparagina predichos y 0 marca el grupo de restos de serina y treonina en los aminoácidos 160-172. El dominio transmembrana hidrófobo predicho abarca los restos 220-243 y se indica por una barra rellena.

Fig. 6 Construcción de un vector de expresión pTF 2A12 que codifica la proteína del factor tisular de longitud completa.

Figs. 7a-c Las Figs. 7a-c se mencionan colectivamente en este documento como Fig. 7. Construcción de un mutante de la proteína del factor tisular que tiene una cisteína sustituida por una serina en la posición 245.

Figs. 8a-b Las Figs. 8a-b se mencionan colectivamente en este documento como Figura 8. Construcción de un vector de expresión para la proteína de fusión del factor tisular humano.

Fig. 9 El ensayo cromogénico es el resultado de la expresión transitoria de la proteína del factor tisular en células Cos.

Fig. 10 Construcción de un vector de expresión para la proteína del factor tisular con el dominio citoplásmico eliminado.

Descripción detallada

Como se usa en este documento, "proteína del factor tisular" se refiere a una proteína capaz de corregir diversos trastornos hemorrágicos, por ejemplo, induciendo la coagulación, particularmente los trastornos asociados a deficiencias en los factores de coagulación. La proteína del factor tisular es distinta del factor tisular o la tromboplastina tisular de la técnica anterior en que carece de la porción lipídica de origen natural de la molécula. La proteína del factor tisular también incluye la proteína del factor tisular asociada a fosfolípidos cuyo lípido es distinto del lípido de origen natural asociado a la tromboplastina tisular y presenta capacidad inductora de la coagulación sin la toxicidad concomitante observada con la proteína lipidada. La infusión de la proteína del factor tisular, como se define en este documento, no provoca coagulación intravascular diseminada. La capacidad de la proteína del factor tisular de corregir diversos trastornos hemorrágicos se determina fácilmente usando diversos modelos de hemorragia in vivo, por ejemplo, inicio de la coagulación en perros hemofílicos usando la determinación del tiempo de hemorragia de la cutícula (CBT) (Giles, A.R. et al., Blood 60:727-730 [1982]).

La secuencia de aminoácidos de la figura 2 es la de la pre-proteína del factor tisular. La pre-proteína del factor tisular puede expresarse, por ejemplo, en procariotas, que no procesan ni secretan la proteína madura, por transformación con un vector de expresión que comprende el ADN que codifica la pre-proteína del factor tisular. Es preferible transformar células hospedadoras capaces de conseguir dicho procesamiento para obtener la proteína del factor tisular madura en el medio de cultivo o periplasma de la célula hospedadora. Típicamente, las células hospedadoras eucariotas superiores tales como células de mamífero son capaces de procesar la pre-proteína del factor tisular y de secretar la proteína del factor tisular madura después de la transformación con el ADN que codifica la pre-proteína del factor tisular.

Como alternativa, la proteína del factor tisular madura secretada puede obtenerse ligando el extremo 5' del ADN que codifica la proteína del factor tisular madura al extremo 3' del ADN que codifica una secuencia señal reconocida por la célula hospedadora. Se usa un vector de expresión que comprende las secuencias de ADN ligadas para transformar células hospedadoras. La célula hospedadora procesará la fusión expresada escindiendo proteolíticamente el enlace peptídico entre la secuencia señal y el primer aminoácido de la proteína del factor tisular y secretando la proteína del factor tisular madura al periplasma de la célula hospedadora o al medio, dependiendo de la célula hospedadora en cuestión. Por ejemplo, en la construcción de un vector de expresión procariota el líder de secreción de la proteína del factor tisular humano, es decir, los aminoácidos -32 a -1, se remplaza por los líderes de la fosfatasa alcalina bacteriana o de la enterotoxina II estable al calor, y para levaduras el líder de la proteína del factor tisular se remplaza por los líderes de la invertasa, del factor alfa o de la fosfatasa ácida de levaduras. Los organismos gram negativos transformados con una fusión señal homóloga-proteína del factor tisular secretarán la proteína del factor tisular madura al periplasma de la célula, mientras que levaduras o bacillus sp. secretarán la proteína del factor tisular madura al medio de cultivo.

Se incluyen en el alcance de la presente invención derivados desglicosilados o no glicosilados de dichas proteínas del factor tisular, y variantes de la secuencia de aminoácidos biológicamente activas de la proteína del factor tisular, incluyendo alelos, y derivados covalentes generados in vitro de las proteínas del factor tisular que muestran actividad de la proteína del factor tisular.

Las variantes de la secuencia de aminoácidos de la proteína del factor tisular se incluyen en una o más de tres clases: variantes de sustitución, inserción o deleción. Las inserciones incluyen fusiones amino y/o carboxilo terminales así como inserciones intrasecuencia de uno o múltiples restos de aminoácidos. Las proteínas de fusión del factor tisular incluyen, por ejemplo, híbridos de la proteína del factor tisular madura con polipéptidos que son homólogos a la proteína del factor tisular, por ejemplo, en el caso de la proteína del factor tisular humano, los líderes de secreción de otras proteínas humanas secretadas. Las proteínas de fusión del factor tisular también incluyen híbridos de la proteína del factor tisular con polipéptidos homólogos a la célula hospedadora pero no a la proteína del factor tisular, así como, polipéptidos heterólogos tanto a la célula hospedadora como a la proteína del factor tisular. Un ejemplo de dicha proteína de fusión del factor tisular es la secuencia señal de gD del herpes con la proteína del factor tisular madura. Las fusiones preferidas en el alcance de esta invención son las fusiones amino terminales con péptidos procariotas o péptidos señal de secuencias señal procariotas, de levaduras, virales o de la célula hospedadora. No es esencial que la secuencia señal esté desprovista de cualquier secuencia madura residual de la proteína cuya secreción dirige normalmente, pero esto es preferible para evitar la secreción de una fusión de la proteína del factor tisular.

También se pueden introducir inserciones en la secuencia codificante madura de la proteína del factor tisular. Éstas, sin embargo, serán normalmente inserciones más pequeñas que las de fusiones amino o carboxilo terminales, del orden de 1 a 4 restos. Un ejemplo representativo es la proteína del factor tisular [Arg_{135}Arg_{136}\rightarrowArg_{135}ProArg_{137}], una variante seleccionada por su resistencia a la hidrólisis con tripsina en el resto Arg_{135}. A menos que se indique lo contrario, las variaciones de la proteína del factor tisular específicas descritas en este documento son variaciones de la secuencia de la proteína del factor tisular madura; no son variantes de la pre-proteína del factor tisular.

Las variantes de inserción de la secuencia de aminoácidos de las proteínas del factor tisular son aquellas en las que se introducen uno o más restos de aminoácidos en un sitio predeterminado en la proteína del factor tisular diana. Muy habitualmente, las variantes de inserción son fusiones de proteínas o polipéptidos heterólogos al extremo amino o carboxilo terminal de la proteína del factor tisular. Los derivados de la proteína del factor tisular inmunogénicos se hacen fusionando un polipéptido suficientemente grande para conferir inmunogenicidad a la secuencia diana por entrecruzamiento in vitro o por cultivo de células recombinantes transformadas con el ADN que codifica la fusión. Dichos polipéptidos inmunogénicos pueden ser polipéptidos bacterianos tales como trpLE, beta-galactosidasa y similares.

Las variantes de deleción se caracterizan por la eliminación de uno o más restos de aminoácidos de la secuencia de la proteína del factor tisular. Típicamente, se delecionan no más de aproximadamente 2 a 6 restos en un sitio cualquiera de la molécula de proteína del factor tisular, aunque se emprenderá la deleción de los restos -31 a -1 incluidos para obtener una met-proteína del factor tisular, una variante adaptada para la expresión directa intracelular de la met-proteína del factor tisular madura. Otra variante de deleción es la del dominio transmembrana localizado a aproximadamente 220 a 242 restos de la molécula de proteína del factor tisular.

Estas variantes generalmente se preparan por mutagénesis específica de sitio de los nucleótidos del ADN que codifica la proteína del factor tisular, produciendo de este modo el ADN que codifica la variante, y expresando después el ADN en el cultivo celular recombinante. Sin embargo, los fragmentos de la variante de la proteína del factor tisular que tienen hasta aproximadamente 100-150 restos pueden prepararse adecuadamente por síntesis in vitro. Las variantes muestran típicamente la misma actividad biológica cualitativa que el análogo de origen natural, aunque las variantes también se seleccionan para modificar las características de la proteína del factor tisular como se describirá más completamente a continuación.

Aunque el sitio para introducir una variación de la secuencia de aminoácidos está predeterminado, la mutación per se no necesita estar predeterminada. Por ejemplo, para optimizar el rendimiento de una mutación en un sitio dado, se puede realizar mutagénesis aleatoria en el codón o región diana y explorar las variantes de la proteína del factor tisular expresadas para la combinación óptima de actividad deseada. Las técnicas para hacer mutaciones de sustitución en sitios predeterminados en ADN que tiene una secuencia conocida, son bien conocidas, por ejemplo mutagénesis con cebador M13.

Las sustituciones de aminoácidos son típicamente de restos individuales; las inserciones serán normalmente del orden de aproximadamente 1 a 10 restos de aminoácidos; y las deleciones variarán de aproximadamente 1 a 30 restos. Las deleciones o inserciones se hacen preferiblemente en pares adyacentes, es decir, una deleción de 2 restos o una inserción de 2 restos. Las sustituciones, deleciones, inserciones o cualquier combinación de las mismas pueden combinarse para alcanzar una construcción final. Obviamente, las mutaciones que se realizarán en el ADN que codifica la variante de la proteína del factor tisular no deben situar la secuencia fuera de la fase de lectura y preferiblemente no crearán regiones complementarias que podrían producir una estructura de ARNm secundaria (documento EP 75.444A).

Las variantes de sustitución son aquellas en las que al menos un resto en la secuencia de la Fig. 2 se ha eliminado y en su lugar se ha insertado un resto diferente. Dichas sustituciones se hacen generalmente de cuerdo con la siguiente Tabla 1 cuando se desea modular finamente las características de la proteína del factor tisular.

TABLA 1

Resto Original	Sustituciones Ejemplares
Ala	\hskip0,3cm ser
Arg	\hskip0,3cm lys
Asn	\hskip0,3cm gln; his
Asp	\hskip0,3cm glu
Cys	\hskip0,3cm ser
Gln	\hskip0,3cm asn
Glu	\hskip0,3cm asp
Gly	\hskip0,3cm pro
His	\hskip0,3cm asn; gln
Ile	\hskip0,3cm leu; val
Leu	\hskip0,3cm ile; val
Lys	\hskip0,3cm arg; gln; glu
Met	\hskip0,3cm leu; ile
Phe	\hskip0,3cm met; leu; tyr
Ser	\hskip0,3cm thr
Thr	\hskip0,3cm ser
Trp	\hskip0,3cm tyr
Tyr	\hskip0,3cm trp; phe
Val	\hskip0,3cm ile; leu

Se hace cambios sustanciales en la función o la identidad inmunológica seleccionando sustituciones que son menos conservativas que las de la Tabla 1, es decir, seleccionando restos que difieran más significativamente en su efecto sobre el mantenimiento de (a) la estructura del esqueleto polipeptídico en el área de la sustitución, por ejemplo, en forma de una conformación en lámina o helicoidal, (b) la carga o la hidrofobicidad de la molécula en el sitio diana o (c) el volumen de la cadena lateral. Las sustituciones que en general se espera que produzcan los cambios más grandes en las propiedades de la proteína del factor tisular serán aquellas en las que (a) un resto hidrófilo, por ejemplo, serilo o treonilo, se sustituye por (o mediante) un resto hidrófobo, por ejemplo, leucilo, isoleucilo, fenilalanilo, valilo o alanilo; (b) una cisteína o prolina se sustituye por (o mediante) cualquier otro resto; (c) un resto que tiene una cadena lateral electropositiva, por ejemplo, lisilo, arginilo, o histidilo, se sustituye por (o mediante) un resto electronegativo, por ejemplo, glutamilo o aspartilo; o (d) un resto que tiene una cadena lateral voluminosa, por ejemplo, fenilalanina, se sustituye por (o mediante) uno que no tiene una cadena lateral, por ejemplo, glicina.

Una clase principal de variantes de sustitución o deleción son aquellas que implican la región transmembrana, es decir, hidrófoba o lipófila, de la proteína del factor tisular. La región transmembrana de la proteína del factor tisular está localizada a aproximadamente 220 a 242 restos de la proteína codificada por el ADN de tejidos adiposos humanos. Esta región es un dominio altamente hidrófobo o lipófilo que tiene el tamaño apropiado para abarcar la bicapa lipídica de la membrana celular. Se cree que la proteína del factor tisular se ancla a la membrana celular.

La deleción o sustitución de los dominios transmembrana facilitarán la recuperación y proporcionarán una forma soluble de la proteína del factor tisular recombinante reduciendo su afinidad celular o por los lípidos de la membrana y mejorando su solubilidad en agua de manera que no se requerirán detergentes para mantener la proteína del factor tisular en solución acuosa. Preferiblemente, el dominio transmembrana se elimina, en lugar de sustituirlo para evitar la introducción de epítopos potencialmente inmunogénicos. Una ventaja de la proteína del factor tisular con el dominio transmembrana eliminado es que se secreta más fácilmente al medio de cultivo. Esta variante es soluble en agua y no tiene una afinidad apreciable por los lípidos de la membrana celular, simplificando considerablemente de este modo su recuperación del cultivo celular recombinante.

Las mutagénesis de sustitución o deleción pueden emplearse para eliminar los sitios de glicosilación unidos a N u O (por ejemplo, por deleción o sustitución de restos asparaginilo en sitios de glicosilación Asn-X-Thr), mejorar la expresión de la proteína del factor tisular o alterar la vida media de la proteína. Como alternativa, se puede producir una proteína del factor tisular no glicosilada en un cultivo de células procariotas recombinantes. También pueden ser deseables deleciones o sustituciones de cisteína u otros restos lábiles, por ejemplo para aumentar la estabilidad oxidativa o para seleccionar el ordenamiento del enlace disulfuro preferido de la proteína del factor tisular. Uno de dichos ejemplos de sustitución de cisteína es la sustitución de la cisteína por una serina en la posición 245. Las deleciones o sustituciones de sitios de proteolisis potenciales, por ejemplo, Arg Arg, se consigue por ejemplo delecionando uno de los restos básicos o sustituyendo uno por restos de glutaminilo o histidilo.

Se entiende que un aislado de ADN significa ADN, ADNc o ADN genómico sintetizado químicamente con o sin las regiones 3' y/o 5' flanqueantes. El ADN que codifica la proteína del factor tisular se obtiene a partir de fuentes distintas de la humana a) obteniendo una biblioteca de ADNc de la placenta, tejidos adiposos u otros tejidos que contienen ARNm de la proteína del factor tisular, tal como cerebro, del animal particular, b) realizando análisis de hibridación con ADN marcado que codifica la proteína del factor tisular humano o fragmentos de la misma (normalmente, mayor de 100 pb) para detectar clones en la biblioteca de ADNc que contienen secuencias homólogas, y c) analizando los clones por análisis con enzimas de restricción y secuenciación de ácidos nucleicos para identificar clones de longitud completa. Si los clones de longitud completa no están presentes en la biblioteca, entonces pueden recuperarse fragmentos apropiados a partir de los diversos clones usando la secuencia de ácidos nucleicos descrita por primera vez en la presente invención y ligarse en sitios de restricción habituales a los clones para ensamblar un clon de longitud completa que codifica la proteína del factor tisular.

El uso de la molécula de proteína del factor tisular con modificaciones Covalentes se incluyen en el alcance de la invención. Dichas modificaciones se hacen haciendo reaccionar restos de aminoácidos diana de la proteína recuperada con un agente de derivatización orgánica que es capaz de reaccionar con las cadenas laterales o los restos terminales seleccionados. Como alternativa, se puede usar una modificación post-traduccional en células hospedadoras recombinantes seleccionadas para modificar la proteína. Los derivados covalentes resultantes son útiles como inmunógenos o para identificar restos importantes para la actividad biológica así como para alterar las características farmacológicas de la molécula, tales como vida media, afinidad de unión y similares, como sabría un especialista en la técnica.

Ciertas derivatizaciones post-traduccionales son el resultado de la acción de células hospedadoras recombinantes sobre el polipéptido expresado. Los restos de glutaminilo y asparaginilo se desaminan frecuentemente de manera post-traduccional a los correspondientes restos de glutamilo y aspartilo. Como alternativa, estos restos se desaminan en condiciones ligeramente ácidas. Cualquier forma de estos restos pertenece al alcance de esta invención.

Otras modificaciones post-traduccionales incluyen hidroxilación de prolina y lisina, fosforilación de grupos hidroxilo de restos de serilo o treonilo, metilación de grupos \alpha-amino de las cadenas laterales de lisina, arginina e histidina (T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco páginas 79-86 [1983]), acetilación del amino N-terminal y, en algunos casos, amidación del carboxilo C-terminal.

Cuando se usa "forma esencialmente libre" o "esencialmente pura" para describir el estado de la proteína del factor tisular producido para su uso en la invención significa que está libre de proteína u otros materiales normalmente asociados a la proteína del factor tisular en su medio fisiológico in vivo como por ejemplo cuando la proteína del factor tisular se obtiene a partir de sangre y/o tejidos por extracción y purificación. Otros materiales incluyen organismos infecciosos tales como, por ejemplo, el agente causante del síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA). La proteína del factor tisular producida por el método de la presente invención tiene una pureza mayor o igual al 95%.

En general, se usan procariotas para clonar secuencias de ADN en la construcción de los vectores útiles en la invención. Por ejemplo, es particularmente útil la cepa 294 de E. coli K12 (ATCC Nº 31446). Otras cepas microbianas que pueden usarse incluyen E. coli B y E. coli X1776 (ATCC Nº 31537). Estos ejemplos son ilustrativos en lugar de limitantes.

También se pueden usar procariotas para la expresión. Se pueden usar las cepas mencionadas, así como E. coli W3110 (F^{-}, \lambda^{-}, prototrófica, ATTC Nº 27325), bacilos tales como Bacillus subtilis, y otras enterobacteriaceae tales como Salmonella typhimurium o Serratia marcescans, y diversas especies de pseudomonas.

En general, con estos hospedadores se usan vectores plasmídicos que contienen promotores y secuencias de control que se obtienen de especies compatibles con la célula hospedadora. Generalmente el vector tiene un sitio de replicación así como una o más secuencias marcadoras que son capaces de proporcionar selección fenotípica en células transformadas. Por ejemplo, E. coli típicamente se transforma usando un derivado de pBR322 que es un plásmido obtenido de una especie de E. coli (Bolivar, et al., Gene 2: 95 [1977]). pBR322 contiene genes de resistencia a ampicilina y tetraciclina y de ese modo proporciona un medio fácil para identificar las células transformadas. El plásmido pBR322, u otro plásmido microbiano también debe contener o estar modificado para que contenga promotores y otros elementos de control habitualmente usados en la construcción de ADN recombinante.

Los promotores apropiados para su uso con hospedadores procariotas incluyen de manera ilustrativa los sistemas promotores de la \beta-lactamasa y de la lactosa (Chang et al., "Nature", 275: 615 [1978]; y Goeddel et al., "Nature" 281: 544 [1979]), de la fosfatasa alcalina, el sistema promotor del triptófano (trp) (Goeddel "Nucleic Acids Res." 8: 4057 [1980] y Publicación de la Solicitud EPO Nº 36.776) y promotores híbridos tales como el promotor tac (H. de Boer et al., "Proc. Natl. Acad. Sci. USA" 80: 21-25 [1983]). Sin embargo, son apropiados otros promotores bacterianos funcionales. Sus secuencias de nucleótidos son generalmente conocidas, permitiendo de este modo al especialista en la técnica unirlas de manera operativa al ADN que codifica la proteína del factor tisular usando enlazadores o adaptadores para suministrar cualquier sitio de restricción necesario (Siebenlist et al., "Cell" 20: 269 [1980]). Los promotores para su uso en sistemas bacterianos también contendrán una secuencia Shine-Dalgarno (S.D.) unida de manera operativa al ADN que codifica la proteína del factor tisular.

Además de procariotas, también se pueden usar microbios eucariotas tales como cultivos de levaduras. Saccharomyces cerevisiae, o la levadura panadera común es el microorganismo eucariota más habitualmente usado, aunque están disponibles habitualmente varias cepas distintas. Para la expresión en Saccharomyces, se usa habitualmente el plásmido YRp7, por ejemplo (Stinchcomb, et al., Nature 282: 39 [1979]; Kingsman et al., Gene 7: 141 [1979]; Tschemper et al., Gene 10: 157 [1980]). Este plásmido ya contiene el gen trpI que proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura que carece de la capacidad para crecer en triptófano, por ejemplo ATCC Nº 44076 o PEP4-1 (Jones, Genetics 85: 12 [1977]). La presencia de la lesión trpI como característica del genoma de la célula hospedadora de levadura proporciona, por tanto, un medio eficaz de selección por crecimiento en ausencia de triptófano.

Las secuencias promotoras apropiadas para su uso con hospedadores de levadura incluyen los promotores de la 3-fosfoglicerato quinasa (Hitzeman et al., "J. Biol. Chem." 225: 2073 [1980]) u otras enzimas glucolíticas (Hess et al., "J. Adv. Enzyme Reg." 7: 149 [1968]; y Holland, "Biochemistry" 17: 4900 [1978]), tales como la enolasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructoquinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato quinasa, triosafosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa, y glucoquinasa.

Otros promotores de levaduras, que son promotores inducibles que tienen la ventaja adicional de la transcripción controlada por las condiciones de crecimiento, son las regiones promotoras de la alcohol deshidrogenasa 2, isocitocromo C, fosfatasa ácida, las enzimas degradantes asociadas al metabolismo del nitrógeno, la metalotioneína, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, y las enzimas responsables de la utilización de maltosa y galactosa. Los vectores y promotores apropiados para su uso en la expresión de levaduras se describen adicionalmente en R. Hitzeman et al., Publicación de Patente Europea Nº 73.657A. Los potenciadores de levaduras también se usan ventajosamente con los promotores de levaduras.

Los promotores preferidos que controlan la transcripción de vectores en células hospedadoras de mamífero pueden obtenerse a partir de diversas fuentes, por ejemplo, los genomas de virus tales como: polioma, Virus del Simio 40 (SV40), adenovirus, retrovirus, virus de la hepatitis-B y más preferiblemente citomegalovirus, o a partir de promotores de mamífero heterólogos, por ejemplo el promotor de la beta actina. Los promotores tempranos y tardíos del virus SV40 se obtienen adecuadamente en forma de un fragmento de restricción de SV40 que también contiene el origen de replicación viral de SV40. Fiers et al., Nature, 273: 113 (1978). El promotor temprano inmediato de citomegalovirus humano se obtiene adecuadamente en forma de un fragmento de restricción HindIII E. Greenaway, P.J. et al., Gene 18: 355-360 (1982). Por supuesto, también son útiles en este documento promotores de la célula hospedadora o especies relacionadas.

La transcripción de un ADN que codifica la proteína del factor tisular por eucariotas superiores se aumenta insertando una secuencia potenciadora en el vector. Los potenciadores son elementos de ADN que funcionan en configuración cis, normalmente de aproximadamente 10 a 300 pb, que funcionan sobre un promotor para aumentar su capacidad de iniciación de la transcripción. Los potenciadores son relativamente independientes de la orientación y la posición habiéndose encontrado 5' (Laimins, L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 78: 993 [1981]) y 3' (Lusky, M.L., et al., Mol. Cell Bio. 3: 1108 [1983]) con respecto a la unidad de transcripción, dentro de un intrón (Banerji, J.L. et al., Cell 33: 729 [1983]) así como también dentro de la secuencia codificante en sí misma (Osborne, T.F., et al., Mol. Cell Bio. 4: 1293 [1984]). Ahora se conocen muchas secuencias potenciadoras de genes de mamífero (globina, elastasa, albúmina, \alpha-fetoproteína e insulina). Típicamente, sin embargo, se usará un potenciador de un virus de células eucariotas. Los ejemplos incluyen el potenciador de SV40 del lado tardío del origen de replicación (100-270 pb), el potenciador del promotor temprano de citomegalovirus, el potenciador del polioma del lado tardío del origen de replicación, y potenciadores de adenovirus.

Los vectores de expresión usados en células hospedadoras eucariotas (células nucleadas de levaduras, fúngicas, de insecto, vegetales, animales o humanas) también pueden contener secuencias necesarias para la terminación de la transcripción que pueden afectar a la expresión del ARNm. Estas regiones se transcriben como segmentos poliadenilados en la porción no traducida del ARNm que codifica la proteína del factor tisular. Las regiones 3' no traducidas también incluyen sitios de terminación de la transcripción.

Los vectores de expresión pueden contener un gen de selección, también denominado un marcador seleccionable. Los ejemplos de marcadores seleccionables apropiados para células de mamífero son la dihidrofolato reductasa (DHFR), timidina quinasa o neomicina. Cuando dichos marcadores seleccionables se transfieren con éxito a una célula hospedadora de mamífero, la célula hospedadora de mamífero transformada puede sobrevivir si se coloca bajo presión selectiva. Hay dos categorías distintas de regímenes selectivos ampliamente usadas. La primera categoría se basa en el metabolismo de la célula y el uso de una línea celular mutante que carece de la capacidad de crecer independiente de un medio suplementado. Dos ejemplos son: las células CHO DHFR^{-} y las células LTK^{-} de ratón. Estas células carecen de capacidad de crecer sin la adición de nutrientes tales como timidina o hipoxantina. Debido a que estas células carecen de ciertos genes necesarios para una vía de síntesis de nucleótidos completa, no pueden sobrevivir a menos que los nucleótidos ausentes se proporcionen en un medio suplementado. Una alternativa a suplementar el medio es introducir un gen DHFR o TK intacto en las células que carecen de los genes respectivos, alterando de ese modo sus requisitos de crecimiento. Las células individuales que no se transformaron con el gen DHFR o TK no serán capaces de sobrevivir en medios no suplementados.

La segunda categoría es la selección dominante que se refiere a un esquema de selección usado en cualquier tipo de célula y no requiere el uso de una línea celular mutante. Estos esquemas típicamente usan un fármaco para detener el crecimiento de una célula hospedadora. Aquellas células que tienen un gen nuevo expresarían una proteína que transmite resistencia al fármaco y sobreviviría a la selección. Los ejemplos de dicha selección dominante usan los fármacos neomicina, Southern P. and Berg, P., J. Molec. Appl. Genet. 1: 327 (1982), ácido micofenólico, Mulligan, R.C. and Berg, P. Science 209: 1422 (1980) o higromicina, Sugden, B. et al., Mol. Cell. Biol. 5: 410-413 (1985). Los tres ejemplos dados anteriormente emplean genes bacterianos bajo control eucariota para transmitir resistencia al fármaco apropiado G418 o neomicina (geneticina), xgpt (ácido micofenólico) o higromicina, respectivamente.

"Amplificación" se refiere al incremento o replicación de una región aislada dentro del ADN cromosómico de una célula. La amplificación se consigue usando un agente de selección por ejemplo, metotrexato (MTX) que inactiva la DHFR. La amplificación o preparación de sucesivas copias del gen DHFR da como resultado mayores cantidades de DHFR que se están produciendo frente a mayores cantidades de MTX. La presión de amplificación se aplica a pesar de la presencia de DHFR endógena, añadiendo cantidades siempre mayores de MTX al medio. La amplificación de un gen deseado puede conseguirse cotransfectando una célula hospedadora de mamífero con un plásmido que tiene un ADN que codifica una proteína deseada y el gen de la DHFR o de la amplificación que permite la cointegración. Se asegura que la célula necesite más DHFR, cuya necesidad se satisface por la replicación del gen de selección, seleccionando solamente las células que pueden crecer en presencia de una concentración de MTX siempre mayor. Mientras el gen que codifica una proteína heteróloga deseada está cointegrado con el gen de selección, la replicación génica de este gen da lugar a la replicación del gen que codifica la proteína deseada. El resultado es ese aumento de copias del gen, es decir, un gen amplificado, que codifica la proteína heteróloga deseada expresa más de la proteína heteróloga deseada.

Las células hospedadoras apropiadas preferidas para expresar los vectores de esta invención que codifican la proteína del factor tisular en eucariotas superiores incluyen: la línea CVI de riñón de mono transformada con SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); la línea de riñón embrionario humano (293, Graham, F.L. et al. J. Gen Virol. 36: 59 [1977]); células de riñón de cría de hámster (BHK, ATCC CCL 10); células de ovario de hámster chino-DHFR (CHO, Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 77: 4216, [1980]); células de sertoli de ratón (TM4, Mather, J.P., Biol. Reprod. 23: 243-251 [1980]); células de riñón de mono (CV1 ATCC CCL 70); células de riñón de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); células de riñón canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de hígado de rata búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); células de hígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor de mama de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51); y, células TRI (Mather, J.P. et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383: 44-68 [1982]).

"Transformación" significa introducir ADN en un organismo de manera que el ADN sea replicable, en forma elemento extracromosómico o por integración cromosómica. A menos que se indique lo contrario, el método usado en este documento para la transformación de células hospedadoras es el método de Graham, F. and van der Eb, A., Virology 52: 456-457 (1978). Sin embargo, también se pueden usar otros métodos para introducir ADN en células tales como por inyección nuclear o por fusión de protoplastos. Si se usan células procariotas o células que contienen construcciones de pared celular sustanciales, el método preferido de transfección es el tratamiento con calcio usando cloruro de calcio como se describe por Cohen, F.N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 69: 2110 (1972).

La construcción de vectores apropiados que contienen las secuencias codificantes y de control deseadas emplea técnicas de ligamiento convencionales. Los plásmidos aislados o los fragmentos de ADN se escinden, se adaptan, y se religan en la forma deseada para formar los plásmidos necesarios.

Para el análisis para confirmar las secuencias correctas en los plásmidos construidos, se usan mezclas de ligamiento para transformar la cepa 294 de E. coli K12 (ATCC 31446) y se seleccionan los transformantes con éxito por resistencia ampicilina o tetraciclina donde sea apropiado. Se preparan plásmidos a partir de los transformantes, se analizan por restricción y/o se secuencian por el método de Messing et al., Nucleic Acids Res. 9: 309 (1981) o por el método de Maxam et al., Methods in Enzymology 65: 499 (1980).

Las células hospedadoras se pueden transformar con los vectores de expresión de esta invención y cultivar en medios nutrientes convencionales modificados según sea apropiado para inducir promotores, seleccionar transformantes o amplificar genes. Las condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH y similares, son las previamente usadas con la célula hospedadora seleccionada para la expresión, y serán evidentes para el especialista en la técnica.

"Transfección" se refiere a la captación de un vector por una célula hospedadora se exprese de hecho o no cualquier secuencia codificante. Se conocen varios métodos de transfección por el especialista en la técnica, por ejemplo, CaPO_{4} y electroporación. La transfección con éxito se reconoce generalmente cuando sucede cualquier indicio de la operación de este vector dentro de la célula hospedadora.

Para facilitar la comprensión de los siguientes ejemplos se describirán ciertos métodos y/o términos que se encuentran con frecuencia.

Los "plásmidos" se designan por una p minúscula precedida y/o seguida de letras mayúsculas y/o números. Los plásmidos de partida en este documento están disponibles en el mercado, disponible por el público en una base no restringida, o pueden construirse a partir de plásmidos disponibles de acuerdo con procedimientos publicados. Además, se conocen en la técnica plásmidos equivalentes a los descritos y serán evidentes para el especialista en la técnica.

"Digestión" de ADN se refiere a la escisión catalítica del ADN con una enzima de restricción que funciona sólo en ciertas secuencias del ADN. Las diversas enzimas de restricción usadas en este documento están disponibles en el mercado y sus condiciones de reacción, cofactores y otras necesidades se usaron como sabría un especialista en la técnica. Para propósitos analíticos, se usa típicamente 1 \mug de plásmido o fragmento de ADN con aproximadamente 2 unidades de enzima en aproximadamente 20 \mul de solución tampón. Para el propósito de aislar los fragmentos de ADN para la construcción del plásmido, se digieren típicamente de 5 a 50 \mug de ADN con 20 a 250 unidades de enzima en un volumen mayor. Los tampones y las cantidades de sustrato apropiados para las enzimas de restricción particulares se especifican por el fabricante. Generalmente se usan tiempos de incubación de aproximadamente 1 hora a 37ºC, pero pueden variar de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Después de la digestión, la reacción se somete a electroforesis directamente en gel de poliacrilamida para aislar el fragmento deseado.

"Recuperación" o "aislamiento" de un fragmento de ADN dado de un producto de digestión con enzimas de restricción significa la separación del producto de digestión en gel de poliacrilamida o agarosa por electroforesis, la identificación del fragmento de interés por comparación de su movilidad frente a la de los fragmentos de ADN marcadores de peso molecular conocido, la retirada de la sección del gel que contiene el fragmento deseado, y la separación del gel del ADN. Este procedimiento es generalmente conocido (Lawn, R. et al., Nucleic Acids Res. 9: 6103-6114 [1981], y Goeddel, et al., Nucleic Acids Res. 8: 4057 [1980]).

"Desfosforilación" se refiere a la eliminación de los fosfatos 5' terminales por tratamiento con fosfatasa alcalina bacteriana (BAP). Este procedimiento evita la "circularización" de los dos extremos escindidos por enzimas de restricción de un fragmento de ADN o la formación de un bucle cerrado que impediría la inserción de otro fragmento de ADN en el sitio de restricción. Los procedimientos y reactivos para la desfosforilación son convencionales (Maniatis, T. et al., Molecular Cloning, 133-134 Cold Spring Harbor, [1982]). Las reacciones que usan BAP se realizan en Tris 50 mM a 68ºC para suprimir la actividad de cualquier exonucleasa que pueda estar presente en las preparaciones de enzima. Las reacciones se realizaron durante 1 hora. Después de la reacción el fragmento de ADN se purifica en gel.

"Ligamiento" se refiere al proceso de formación de enlaces fosfodiéster entre dos fragmentos de ácido nucleico de doble cadena (Maniatis, T. et al., Id. en 146). A menos que se estipule otra cosa, el ligamiento puede conseguirse usando tampones y condiciones conocidos con 10 unidades de ADN ligasa T4 ("ligasa") por 0,5 \mug de cantidades aproximadamente equimolares de los fragmentos de ADN a ligar.

"Rellenado" o "formación de extremos romos" se refiere a los procedimientos por los cuales el extremo de una cadena sencilla en el extremo cohesivo de un ácido nucleico escindido por una enzima de restricción se convierte en una doble cadena. Esto elimina el extremo cohesivo y forma un extremo romo. Este proceso es una herramienta versátil para convertir un extremo de corte por enzimas de restricción que puede ser cohesivo con los extremos creados por una sola u unas pocas enzimas de restricción distintas en un extremo compatible con cualquier endonucleasa de restricción de corte romo u otro extremo cohesivo rellenado. Típicamente, la formación de extremos romos se consigue incubando 2-15 \mug del ADN diana en MgCl_{2} 10 mM, ditiotreitol 1 mM, NaCl 50 mM, tampón Tris 10 mM (pH 7,5) a aproximadamente 37ºC en presencia de 8 unidades del fragmento Klenow de la ADN polimerasa I y 250 \muM de cada uno de los cuatro desoxinucleósidos trifosfato. La incubación termina generalmente después de 30 minutos de extracción con fenol y cloroformo y precipitación en etanol.

La proteína del factor tisular humano y su producto de expresión recombinante se obtienen de acuerdo con el siguiente protocolo:

1. Se sintetizaron químicamente sondas oligonucleotídicas que representan un único codón de elección para cada aminoácido correspondiente a la porción amino terminal de la proteína del factor tisular, y el fragmento peptídico CNBr.

\vskip1.000000\baselineskip

2. Se sintetizaron dos desoxioligonucleótidos complementarios a los codones para las secuencias de aminoácidos de la proteína del factor tisular, descritos a continuación, y se radiomarcaron con \gamma^{32}P-ATP.

a)

1

y

b)

2

3. Se construyeron bibliotecas de ADNc cebado con oligo (dT) en \lambdagt10.

4. Se exploró una biblioteca de ADNc de placenta humana usando las sondas oligonucleotídicas sintetizadas químicamente. No se obtuvieron placas positivas usando la sonda de 60 unidades (a). Se obtuvieron veintidós (22) placas positivas usando la sonda de 81 unidades (b), la mitad de las cuales eran muy débilmente positivas. Las once (11) mejores se eligieron para volver a explorar para la purificación de placa. Se obtuvieron cinco placas positivas en la segunda exploración. Se preparó el ADN a partir de cada una de estas.

5. Se aislaron clones que tenían un ADNc total de aproximadamente 2.800 pb de ADN inserto. Se emprendieron la secuenciación y la caracterización de los clones de placenta. Como el tamaño del ARNm en una transferencia de Northern fue de aproximadamente 2,35 Kb, estos clones pueden tener contenidos intrones sin eliminar. Por lo tanto se exploró una biblioteca de tejido adiposo humano.

6. Se exploró una biblioteca de tejido adiposo humano cebada con oligo (dT) usando un fragmento EcoRI de 1.400 pb de uno de los clones de placenta.

7. Se aislaron clones que tenían un ADNc total de aproximadamente 2350 pb (incluyendo 150 a 200 pb para la cola poliA) y 1800 pb de ADN inserto. Se secuenciaron los clones que contenían 2350 pb y que se suponía que contenían todo el ARNm del factor tisular.

8. Se construye el ADNc de longitud completa que codifica la proteína del factor tisular humano en un plásmido. Debe apreciarse que el conocimiento de la secuencia de ADN completa de la Fig. 2 posibilita preparar sondas extremadamente largas que tienen una homología perfecta con el ADNc de la proteína del factor tisular humano, simplificando, de este modo, considerablemente y aumentando la eficacia del sondeo de bibliotecas de ADNc o genómicas de otras especies, y haciendo posible prescindir de la purificación de la proteína del factor tisular, de la secuenciación y de la preparación de conjuntos de sondas.

9. Después se construye el ADNc que codifica la proteína del factor tisular humano en un vehículo de expresión que se usa para transformar una célula hospedadora apropiada, que después se hace crecer en un cultivo para producir la proteína del factor tisular deseada.

10. La proteína del factor tisular biológicamente activa que se produce de acuerdo con el procedimiento anterior tiene 263 aminoácidos.

Los siguientes ejemplos solamente ilustran el mejor modo contemplado hoy en día para poner en práctica la invención, pero no deben considerarse limitantes de la invención.

Ejemplo 1 Clonación del ADNc

El ADN que codifica la proteína del factor tisular puede obtenerse por síntesis química cuando se conoce la secuencia de ADN completa, explorando los transcritos inversos de ARNm de diversos tejidos, o explorando bibliotecas genómicas de cualquier célula. Como no se conocían ni la secuencia completa de aminoácidos ni la de ADN de la proteína del factor tisular en el momento de esta invención, no fue posible la síntesis química de la secuencia de ADN completa que codifica la proteína del factor tisular.

Se preparó una biblioteca de ADNc de placenta humano como se ha descrito previamente (Ullrich, A. et al., Nature 309: 418-425 [1984]). Se preparó un ADNc de doble cadena a partir de ARN de tejido adiposo humano usando la transcriptasa inversa de un modo conocido y, después de tratamiento con ARNasa H de E. coli se usó ADN polimerasa I para sintetizar la segunda cadena y después se ligó a oligonucleótidos sintéticos que contenían sitios de restricción para SalI, SstI, XhoI y un extremo saliente EcoRI, como se ha descrito previamente (Gubler, U. and Hoffman, B.J., Gene 25: 263 [1983]). Este ADN se insertó en el sitio EcoRI de \lambdagt10 (Huynh, T. et al., DNA Cloning Techniques [ed. Grover, D.][1984]).

Se diseñaron dos sondas oligonucleotídicas que representaban una posible elección de codón para cada aminoácido de la secuencia de aminoácidos N-terminal (60 nucleótidos) y la secuencia de aminoácidos interna próxima al extremo C-terminal (81 nucleótidos) y se sintetizaron en base a las siguientes secuencias de aminoácidos presentadas en una reunión de la American Heart Association como se ha mencionado anteriormente:

Extremo amino terminal

3

Próximo al extremo C-terminal

4

Se obtuvieron clones de ADNc de la proteína del factor tisular usando las sondas de ADN primero para explorar una biblioteca de ADNc de placenta humana. Se usó un fragmento EcoRI de 1400 pb de un clon de placenta para explorar una biblioteca de ADNc de tejido adiposo humano.

Se hicieron crecer aproximadamente 1 millón de fagos a partir de la biblioteca de ADNc de placenta humana cebado con oligo(dT) en \lambdagt10 en veinticinco (25) placas Petri de 15 cm a partir de los cuales se recogieron filtros de nitrocelulosa por triplicado. Los filtros se hibridaron con cada una de las sondas oligonucleotídicas marcadas en el extremo con ^{32}P en NaCl 0,75 M, citrato trisódico 75 mM, fosfato sódico 50 mM (pH 6,8), solución de Denhardt 5X, formamida al 20 por ciento, sulfato de dextrano al 10 por ciento y 0,2 g/l de ADN de esperma de salmón sonicado y hervido a 42ºC durante una noche y lavado durante 2 horas en NaCl 0,30 M, citrato trisódico 30 mM, NaDodSO_{4} al 0,1 por ciento a 42ºC. Se observaron veintidós (22) positivos duplicados de hibridación con los filtros hibridados con la sonda próxima al extremo C-terminal de la proteína del factor tisular. Se escogieron los once (11) mejores para la purificación en placa. La sonda del extremo amino terminal de la proteína del factor tisular no logró hibridar. Cinco clones fueron positivos después de la purificación en placa. Se preparó ADN a partir de cada uno de estos y después se analizó por digestión con EcoRI. Un clon era más corto y parecía ser un clon parcial. Cuatro clones que eran idénticos en base a un producto digerido con EcoRI fueron los mejores candidatos para clones de ADNc de longitud completa. Los fragmentos EcoRI de tres de los clones, el clon parcial y dos de los supuestos clones de longitud completa, se subclonaron en vectores del fago M13 para la secuenciación del ADN por terminación de cadena didesoxi (Messing, J. et al., Nucleic Acids Res. 9: 309-321 [1981]).

Se hibridó un fragmento EcoRI de 1400 pb de un clon de ADNc de placenta a una transferencia de Northern a la que se había unido ARNm. Se determinó que el tamaño del ARNm de la proteína del factor tisular fue de aproximadamente 2,35 kb en las muestras de placenta que fueron positivas en el ensayo. Los clones de ADNc de placenta tenían una longitud de aproximadamente 2800 pb incluyendo los nucleótidos correspondientes a la cola poliA del ARNm. Estos clones eran aproximadamente 450 pb más largos que la longitud del ARNm observado en la transferencia de Northern. Se observaron codones de terminación y codones de metionina en las tres fases de lectura inmediatamente cadena arriba del ADN que codifica el extremo amino terminal de la proteína, sugiriendo la ausencia de una secuencia señal. La carencia de una secuencia señal inmediatamente 5' de la secuencia que representa el extremo NH_{2} terminal de la proteína madura en los clones de placenta se confirmó por comparación con los clones de tejido adiposo descritos a continuación. También se determinó por comparación de las secuencias de placenta y tejido adiposo que los clones de placenta contenían una secuencia intermedia o intrón no presente en el clon de tejido adiposo. La presencia del intrón en el clon de placenta sugiere un mal mecanismo de corte y empalme en la placenta haciendo del aislamiento y la clonación del ADN de la pre-proteína del factor tisular una tarea muy difícil.

Debido a la discrepancia de longitud entre los clones de placenta aislados y el ARNm determinado en la transferencia de Northern, también se aisló el ADNc de la proteína del factor tisular a partir de una biblioteca de tejido adiposo. Se eligió una biblioteca de ADNc de tejido adiposo construida en \lambdagt10 porque el tejido adiposo tiene cantidades de ARNm del factor tisular comparables al tejido placentario. La biblioteca se exploró usando un fragmento EcoRI de 1400 pb de un clon de placenta radiomarcado con \gamma^{32}P-ATP en condiciones más rigurosas que las usadas para explorar la biblioteca de placenta. (Las condiciones anteriores se modificaron para usar formamida al 50% en la hibridación; y el lavado en NaCl 0,03 M, citrato trisódico 3 mM, NaDodSO_{4} al 0,1 por ciento, a 60ºC). Se obtuvieron catorce dobles positivos de intensidades variadas. Se eligieron doce para purificación en placa. Después de volver a explorar para la purificación en placa, se obtuvieron 8 dobles positivos fuertes. Se preparó ADN a partir de cada uno de estos positivos. Cuatro de estos, que fueron idénticos después de la digestión con EcoRI, fueron los mejores candidatos para clones de ADNc de longitud completa. Uno de estos se eligió para el análisis por secuenciación de ADN y \lambdaTF14 marcado. El tamaño de estos clones fue aproximadamente de 2350 pb, incluyendo la longitud de la cola poliA. Este fue el mismo tamaño que el observado en la transferencia de Northern como se ha descrito anteriormente. Un quinto clon fue más corto que los clones de 2350 pb descritos anteriormente.

Dos de los clones de ADNc de tejido adiposo eran más cortos que el ARNm de longitud completa (aproximadamente 1800 pb) y tenían patrones de digestión con EcoRI que eran marcadamente diferentes de los supuestos clones de longitud completa. El análisis de estos clones indica que son clones parciales ya que incluyen el ADN correspondiente a una porción del ARNm de la proteína del factor tisular. El octavo clon tenía sólo aproximadamente 850 pb y no se eligió para análisis adicional.

Ejemplo 2 Secuencia de ADN del ADNc de la Proteína del Factor Tisular

La secuencia de nucleótidos del ADNc de la proteína del factor tisular se muestra en la Fig. 2. De los cuatro clones de tejido adiposo que tenían un patrón de digestión con EcoRI idéntico, uno se secuenció completamente y correspondía a la secuencia mostrada en la Figura 2. El clon \lambdaTF14 contiene aproximadamente 2217 pb de inserto, que incluye aproximadamente 90 nucleótidos de la cola poli(A) (que no se muestra en la Fig. 2). La secuencia de ADNc contiene 99 pb de la secuencia 5' no traducida. El patrón de digestión con EcoRI del supuesto clon de longitud completa comprendía tres fragmentos de aproximadamente 900, 750 y 650 pb. Un quinto clon parecía diferir en el patrón de digestión con EcoRI en el fragmento del extremo 5'. Dos de los clones de tejido adiposo tenían un patrón de digestión con EcoRI que indicaba que eran más cortos que los clones de longitud completa pero aún contenían un fragmento EcoRI más largo que cualquier fragmento de los clones de longitud completa. Esto puede deberse a un polimorfismo de EcoRI o a la presencia de un intrón. El clon más largo se secuenció por completo. La integridad de la secuencia codificante se evaluó a partir de la presencia de una larga fase de lectura abierta que comenzaba con un codón de inicio, ATG. Después del codón iniciador ATG están los codones para una secuencia líder hidrófobo o señal.

El extremo 5' del ADNc contiene un codón de inicio ATG, para el aminoácido metionina, seguido de una fase de lectura abierta continua que codifica un polipéptido de 295 aminoácidos. Los primeros 32 restos aminoácidos son en su mayor parte aminoácidos hidrófobos y probablemente representan un péptido señal amino-terminal. La secuencia amino-terminal que sigue corresponde a la secuencia de la proteína del factor tisular purificada del tejido. La secuencia de ADNc predice que la proteína del factor tisular madura contiene 263 aminoácidos con un peso molecular calculado de aproximadamente 29.500. Se sabe que la proteína del factor tisular es una glicoproteína de membrana con una masa molecular relativa de 42.000 a 53.000 en geles de poliacrilamida-SDS. La secuencia de ADN traducida predice cuatro (4) sitios de glicosilación unidos a asparagina. El perfil hidropático de la proteína (Fig. 5) revela que los tres primeros de estos sitios se localizan en regiones hidrófilas, aumentando la probabilidad de que estén en la superficie de la proteína y de hecho glicosilados. Del mismo modo, un grupo de 7 a 13 restos (aminoácidos 160-172) que son serina o treonina, que indican posibles sitios de glicosilación unida a O, también pertenece a una región de hidrofilicidad predicha. El perfil hidropático también revela un grupo notable de restos hidrófobos cerca del extremo carboxi terminal (Fig. 5). Esta región, que abarca los aminoácidos 220-243, probablemente comprende el dominio de anclaje a membrana del factor tisular. Una búsqueda de las bases de datos de secuencias no reveló homología significativa del factor tisular con las secuencias proteicas disponibles. Particularmente, no había homología marcada con el factor VIII, un cofactor proteico de la proteasa de la coagulación factor IX. Esto es inesperado porque los complejos tanto factor VIII-factor IX, como factor tisular-factor VII catalizan la activación del factor X, y las proteasas de cada complejo (factor IX y VII) son altamente homólogas (F.S. Hagen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:2412 [1986] y Yoshitake et al., Biochemistry 24:3736 [1985]). Ahora se puede observar que estas interacciones no están reflejadas en una similitud de la secuencia proteica primaria de los dos cofactores.

La secuencia de ADNc implica que el factor tisular maduro se libera por escisión con peptidasa señal de un prepéptido sin procesamiento adicional del propéptido. Los 32 aminoácidos desde la metionina inicial hasta el extremo amino terminal maduro comienzan con una región cargada seguida de una secuencia "central" hidrófoba de 14 restos. El prepéptido termina en ala-gly-ala; ala-X-ala es la secuencia más frecuente que precede la escisión con peptidasa señal (O. Perlman et al., Mol. Biol. 167:391 [1983]).

Se supone que el codón de la metionina en el nucleótido 100-102 (Figura 2) inicia la traducción de la pre-proteína del factor tisular. Los cinco nucleótidos precedentes y el que sigue a este ATG son elecciones habituales para los nucleótidos de alrededor de los sitios de iniciación de la traducción en ARNm eucariota, aunque no se encuentran en completa identidad con el consenso descrito por Kozak, M., Nucl. Acids Res. 12:857 [1984]. Los clones de ADNc caracterizados parecen contener casi toda la región 5' no traducida del mensaje.

El ADNc contiene una región 3' no traducida de 1139 nucleótidos en la que la señal de poliadenilación habitual AATAAA precede a la cola poli(A) por 23 nucleótidos. Una característica notable de la región no traducida es la presencia de una secuencia repetida de la familia Alu de 300 pb. Hay aproximadamente 300.000 copias de la repetición Alu en el genoma humano, y numerosos ejemplos de su presencia en los intrones de los genes, donde se retiran por corte y empalme durante la maduración del ARNm (C.W. Schmid et al., Science 216:1065 [1982] y P.A. Sharp, Nature 301:471 [1983]). Aunque el ARNm poli(A)^{+} citoplásmico también contiene secuencias Alu, ha habido sólo dos informes específicos previos de secuencias tipo Alu en la secuencia 3' no traducida de los ARNm: en los antígenos de histocompatibilidad clase 1 de ratón y rata, y en el receptor de lipoproteína de baja densidad humano (L. Hood et al., Ann. Rev. Immunol. 1:529 [1983]; B. Majello et al., Nature 314:457 [1985] y T. Yamamoto et al., Cell 39:27 [1984]). Las secuencias Alu a menudo están flanqueadas por repeticiones directas cortas, como una consecuencia probable de su inserción en el genoma en mellas de doble cadena escalonadas. La secuencia Alu de la región 3' del ADNc del factor tisular está flanqueada por una repetición directa de 11 nucleótidos, como se indica mediante flechas en la Fig. 2.

Ejemplo 3 Expresión de la Proteína del Factor Tisular Humano en un Hospedador Eucariota

El ADNc de la proteína del factor tisular humano de longitud completa estaba contenido en el clon \lambdaTF14 de ADNc. El ADNc de longitud completa se insertó en un plásmido de expresión que comprendía el potenciador y el promotor de citomegalovirus, el sitio donante de corte y empalme y el intrón de citomegalovirus, el intrón de la región variable y el sitio aceptor de corte y empalme de Ig, el sitio de poliadenilación y de terminación de la transcripción de SV40. La construcción del vector de expresión, mostrado en la Fig. 4, se emprendió del siguiente modo.

El vector básico mencionado como pCIS2.8c26D usado aquí está basado en pF8CIS descrito en la Solicitud Europea Nº 87308060.0 (Solicitud de Estados Unidos Nº 07/071.674, presentada el 9 de julio de 1987 y 06/907.185, presentada el 12 de septiembre de 1986, Certificado Nº 373P1.

Como se muestra en la Figura 4a, se cambió un único nucleótido precedente al sitio ClaI en pF8CIS de guanosina a timidina de manera que no se necesitaría una cepa dam^{-} de E. coli para el corte del sitio ClaI.

Se realizó un ligamiento en tres partes que comprendía los siguientes fragmentos: a) el fragmento ClaI-SatII de 12617 pb de pF8CIS (aislado a partir de una cepa dam^{-} y tratada con BAP); b) el fragmento SstII-PstI de 216 pb de pF8CIS; y c) un oligonucleótido sintético PstI-ClaI corto que se había tratado con quinasa (véase Figura 4a, un asterisco indica el nucleótido cambiado). Este ligamiento en tres partes genera el vector de expresión pCIS2.8c24D que es idéntico al pCIS2.8c6D y pCIS2.8c28D en las porciones usadas para expresar el factor tisular.

Este vector se modificó para retirar la secuencia que codifica el factor VIII por un producto de digestión ClaI-HpaI. La región se sustituyó por un polienlazador para permitir sitios de clonación adicionales. La secuencia del polienlazador usado se da a continuación.

5

Los sitios ClaI y HpaI del vector original se regeneran y se añadieron sitios para las enzimas XbaI, XhoI, NotI. Este vector se llama pCIS2.CXXNH. La región codificante para el factor tisular se subclonó a partir de \lambdaTF14 usando el sitio SalI presente en la unión 5' del vector \lambda y el ADNc y un sitio NcoI localizado 3' de la región codificante en la porción no codificante del ADNc. Primero se creó un extremo 3' romo digiriendo con NcoI seguido de una reacción de rellenado que contenía el fragmento de Klenow de la ADN polimerasa y los 4 dNTP. Cuando el ADN de \lambdaTF14 se cortó posteriormente con SalI se creó un fragmento de aproximadamente 1232 pb con la secuencia saliente TCGA en el extremo 5' y un extremo 3' romo que contenía la región codificante del factor tisular. Este se ligó en el vector pCIS2.CXXNH que se había cortado con XhoI (produciendo un saliente TCGA) y HpaI (romo). El nuevo vector se denominó pCIS.TF o se mencionó alternativamente como pCISTFI.

Se transfectaron células de riñón embrionario humano (células 293) y células de riñón de mono (células Cos) con el vector de expresión pCIS.TF que contenía el ADNc de la proteína del factor tisular. 48 horas después de la transfección las células se recogieron y ensayaron para la actividad de proteína del factor tisular por el ensayo cromogénico descrito a continuación. Las células se retiraron de las placas de 100 mm por suspensión en 1 ml de tampón fosfato sódico 0,01 M, pH 7,0, que contenía NaCl 0,15 M. La absorbancia a 500 nm se ajustó a 0,750 para ajustar la densidad celular diferencial en las placas. Las células se sonicaron durante 1 min y se añadió Triton X-100 hasta una concentración final del 0,1 por ciento. Las muestras se hicieron girar a temperatura ambiente durante 90 minutos y los restos celulares se retiraron por filtración a 10.000 x g. Se relipidaron los extractos solubilizados con detergente diluyendo 2 \mul de la muestra en 0,8 ml de Tris-HCl 0,05 M, pH 7,5, que contenía NaCl 0,1 M, albúmina de suero bovina al 0,1 por ciento (tampón TBS). Se añadieron cincuenta \mul de una solución de 5 mg/ml de fosfatidilcolina (lecitina) en ácido desoxicólico al 0,25 por ciento y 25 \mul de CdCl_{2} y la solución se incubó durante 30 minutos a 37ºC.

Se ensayó la proteína del factor tisular recombinante para su capacidad de funcionar en un ensayo cromogénico específico. Los resultados se muestran en la Fig. 9. Como se esperaba, se encontró que diversas concentraciones de tromboplastina de cerebro de conejo (factor tisular en bruto) reaccionaron en el análisis. Las células de control COS-7 (que contenían el vector de expresión parental sin ADNc del factor tisular) tuvieron una actividad sólo ligeramente por encima del blanco del ensayo (con la adición de la mezcla de relipidación sola) (Fig. 9). Las células transfectadas con el plásmido de expresión del factor tisular, en contraste, mostraron una fuerte reacción positiva en el ensayo, demostrando de este modo que el ADNc codifica el factor tisular.

Ejemplo 4 Expresión de la Proteína del Factor Tisular Humano en un Hospedador Procariota

El plásmido pTF2A12 se diseñó para expresar la proteína del factor tisular madura en E. coli usando el promotor de la fosfatasa alcalina y la secuencia líder STII (Patente de Estados Unidos Nº 4.680.262). Este plásmido se construyó como se muestra en la Figura 6, por ligamiento de cuatro fragmentos de ADN, el primero de los cuales fue el ADN dúplex sintético:

6

El fragmento anterior codifica los primeros 12 aminoácidos de la proteína del factor tisular madura. El segundo fue un fragmento de restricción BbvI-EcoRI de 624 pares de bases de pCISTF, descrito anteriormente, que codifica los aminoácidos 13 a 216. El tercero fue un fragmento EcoRI-BamHI de 518 pares de bases de pCISTF que codifica los últimos 47 aminoácidos de la proteína del factor tisular. El plásmido pAPSTII HGH-1 (Patente de Estados Unidos Nº 4.680.262) se digirió con NsiI BamHI de 930 pb para producir un fragmento.

Los cuatro fragmentos se ligaron entre sí para formar el plásmido pTF2A12, como se muestra en la Figura 6, y se usaron para transformar células de la cepa 294 de E. coli K12. Los transformantes se seleccionaron por resistencia a ampicilina y el plásmido pTF2A12 se seleccionó por análisis de restricción y secuenciación didesoxi.

Se hicieron crecer células de la cepa 294 de E. coli K12 que contenían los vectores de expresión durante una noche a 29ºC en medios con bajo contenido en fosfato que contenían 50 \mug/ml de carbenicilina. Los sedimentos celulares de 1 ml de cultivo con una absorbancia de 1 a 600 nm se resuspendieron en 200 \mul de Tris-HCl 50 mM pH 7,5, NaCl 150 mM, Triton X-100 al 1%, 1 mg/ml de lisozima. Las suspensiones se sonicaron por pulsos durante 1 minuto seguido de centrifugación a 10.000 x g para retirar los restos celulares. Se relipidaron los extractos solubilizados con detergente diluyendo 10 \mul de la muestra en 0,8 ml de Tris-HCl 0,05 M pH 7,5 que contenía NaCl 0,1 M, albúmina de suero bovina al 0,1% (tampón TBS). Se añadieron cincuenta \mul de una solución de 5 mg/ml de fosfatidilcolina en ácido desoxicólico al 0,25% y 25 \mul de CdCl_{2} y la solución se incubó durante 30 minutos a 37ºC.

La actividad del factor tisular se detecto por ensayo cromogénico como se describe a continuación.

Ejemplo 5 Expresión de un Mutante de la Proteína del Factor Tisular Humano

El plásmido pTFIII se diseña para expresar una forma mutante madura de la proteína del factor tisular en E. coli. Esta mutación convierte la cisteína de la posición 245 de la proteína del factor tisular madura en serina. Los elementos de control de la expresión, el promotor de la fosfatasa alcalina y la secuencia líder STII son idénticos a los usados en la construcción del plásmido pTF2A12.

El plásmido TFIII se hizo en tres etapas, las dos primeras de las cuales reconstruyen el extremo carboxilo del gen. Los plásmidos pTF100-1 y pTR80-3 son los resultados de las dos primeras etapas.

El plásmido pTF100-1 se construyó a partir de tres fragmentos de ADN (véase Fig. 7a). El primero es el vector de clonación pTrp14 (Patente de Estados Unidos Nº 4.663.283) en el que se retira un fragmento EcoRI-XbaI no esencial (Figura 7). El segundo fue un fragmento EcoRI-FokI de 32 pares de bases que codifica los aminoácidos 217 a 228 de la proteína del factor tisular madura. El tercer fragmento que codifica los aminoácidos 229-245 fue un ADN dúplex sintetizado químicamente en el que el codón de la posición 245 se cambió a TCT (subrayado) de TGT:

7

Los tres fragmentos se ligaron entre sí formando el plásmido pTF100-1 y se transformaron en la cepa 294 de E. coli K12. Los transformantes se seleccionaron por resistencia a ampicilina y el plásmido pTF100-1 se seleccionó por análisis de restricción y secuenciación didesoxi.

El plásmido pTF80-3 se construyó a partir de dos fragmentos de ADN (Figura 7b). El primero fue un vector plasmídico pHGH207 (Patente de Estados Unidos Nº 4.663.283) en el que se había retirado el fragmento XbaI-BamI de 930 pares de bases. El segundo fue el ADN dúplex de 68 unidades sintetizado químicamente:

8

Los dos fragmentos se ligaron entre sí formando el plásmido pTF80-3 y se transfectaron en la cepa 294 de E. coli K12. Los transformantes se seleccionaron por resistencia a ampicilina y el plásmido pTF80-3 se seleccionó por análisis de restricción y secuenciación didesoxi.

El plásmido pTFIII se construyó a partir de cuatro fragmentos de ADN (Figura 7c). El primero fue el vector pAPSTIIHGH (Patente de Estados Unidos Nº 4.680.262) en el que se había retirado el fragmento NsiI-BamHI de 930 pares de bases. El segundo fue un fragmento de restricción NsiI-EcoRI de 650 pares de bases de pTF2A12 (véase Ejemplo 4 anterior) que codificaba los aminoácidos 1 a 217 de la proteína del factor tisular madura. El tercero fue un fragmento EcoRI-XbaI de 80 pares de bases de pTF100-1 que codificaba los aminoácidos 218 a 245 de la proteína del factor tisular madura mutante. El cuarto fue un fragmento XbaI-BamHI de 60 pares de bases de pTF80-3 que codificaba para los últimos 18 aminoácidos. Los cuatro fragmentos se ligaron entre sí y se transformaron en la cepa 294 de E. coli K12. Los transformantes se seleccionaron por resistencia a la ampicilina y el plásmido pTFIII se seleccionó por análisis de restricción.

Ejemplo 6 Expresión de una Proteína de Fusión del Factor Tisular Humano

Se construyó una fusión con la secuencia señal de gD del herpes (Publicación EP Nº 0139416, publicada el 2 de mayo de 1985) y la porción madura del ADNc del factor tisular humano usando los elementos de control del vector pRK7. pRK7 y pRK5 (véase a continuación) se construyeron del siguiente modo.

Construcción de pKR5 y pKR7

El plásmido de partida fue pCIS2.8c28D descrito anteriormente. Los números de base en los párrafos 1 a 6 se refieren a pCIS2.8c28D con la base uno de la primera T del sitio EcoRI precediendo al promotor de CMV. El promotor temprano y el intrón de citomegalovirus y el origen y la señal poliA de SV40 se colocaron en plásmidos separados.

1. El promotor temprano de citomegalovirus se clonó en forma de un fragmento EcoRI de pCIS2.8c28D (9999-12-1) en el sitio EcoRI de pUC118 (Yanish-Perron et al. Gene 33:103 [1985]). Se eligieron doce colonias y se exploraron para la orientación en la que el ADN de cadena sencilla elaborado a partir de pUC118 permitiría la secuenciación desde el sitio EcoRI en 1201 hasta el sitio EcoRI en 9999. Este clon se llamó pCMVE/P.

2. Se hizo un ADN de cadena sencilla a partir de pCMVE/P para insertar un promotor de SP6 (Green M.R. et al., Cell 32:681-694 [1983]) por mutagénesis dirigida de sitio. Se usaron un oligómero de 110 unidades sintéticas que contenía el promotor de SP6 (Véase Nucleic Acids Res. 12:7041 [1984] figura 1); secuencias desde -69 a +5 del promotor de SP6 junto con fragmentos de 18 pb de cualquier extremo del oligómero correspondiente a las secuencias de CMVE/P. La mutagénesis se hizo por técnicas convencionales y se exploró usando un oligómero de 110 unidades marcado a alta o baja rigurosidad. Se eligieron seis clones potenciales y se secuenciaron. Se identificó un positivo y se llamó pCMVE/PSP6.

3. Se examinó el promotor de SP6 y demostró ser activo, por ejemplo, añadiendo ARN polimerasa de SP6 y comprobando el ARN de tamaño apropiado.

4. Se hizo un adaptador Cla-NotI-Sma para insertarlo desde el sitio ClI (912) al sitio SmaI de pUC118 en pCMVE/P (etapa 1) y pCMVE/PSP6 (etapa 2). Este adaptador se ligó en el sitio ClaI-SmaI de pUC118 y se exploró para los clones correctos. El enlazador se secuenció ambos y los clones se llamaron pCMVE/PSP6-L y pCMVE/P-L.

5. Se cortó pCMVE/PSP6-L con SmaI (en la unión enlazador/pUC118) y HindIII (en pUC118). Se insertó un fragmento HpaI (5573) a HindIII (6136) de pSVORAA\DeltaRI 11, descrito a continuación, en SmaI-HindIII de pCMVE/PSP6-L. Este ligamiento se exploró y se aisló un clon y se llamó pCMVE/PSP6-L-SVORAA\DeltaRI.

a) Se aisló el origen y la señal poliA de SV40 en forma de un fragmento XmnI (5475) - HindIII (6136) de pCIS2.8c28D y se clonó en los sitios HindIII a SmaI de pUC119. Esto se llamó pSVORAA.

b) El sitio EcoRI en 5716 se retiró por digestión parcial con EcoRI y se rellenó con Klenow. Las colonias obtenidas del auto-ligamiento después del rellenado se exploraron y el clon correcto se aisló y se llamó pSVORAA\DeltaRI 11. El sitio EcoRI delecionado se examinó por secuenciación y demostró ser correcto.

c) Se aisló el fragmento HpaI (5573) a HindIII (6136) de psVORAA\DeltaRI 11 y se insertó en pCMVE/PSP6-L (véase 4 anterior).

6. Se cortó pCMVE/PSP6-L-SVOrAA\DeltaRI (etapa 5) con EcoRI en 9999, se hizo romo y se auto-ligó. Se identificó un clon sin un sitio EcoRI y se llamó pRK.

7. Se cortó pRK con SmaI y BamHI. Este se rellenó con Klenow y se religó. Las colonias se exploraron. Se identificó un positivo y se llamó pRK\DeltaBam/Sma 3.

8. El sitio HindIII se convirtió en un sitio HpaI usando un convertidor. (Un convertidor es un trozo de ADN usado para cambiar un sitio de restricción por otro. En este caso un extremo sería complementario a un extremo cohesivo HindIII y el otro extremo tendría un sitio de reconocimiento para HpaI.) Se identificó un positivo y se llamó pRK\DeltaBam/Sma, HIII-HpaI 1.

9. Se cortó pRK\DeltaBam/Sma, HIII-HpaI 1 con PstI y NotI y se ligaron en el mismo un enlazador RI-HIII y un enlazador HIII-RI. Se encontraron clones para cada enlazador. Sin embargo, también se determinó que habían entrado demasiados convertidores HpaI (dos o más convertidores generan un sitio PvuII). Por lo tanto, estos clones tuvieron que cortarse con HpaI y auto-ligarse.

10. Se cortaron el clon 3 de RI-HIII y el clon 5 de HIII-RI con HpaI, se diluyeron, y se auto-ligaron. Se identificaron los positivos. El clon RI-HIII se llamó pRK5. Se cortó un clon HIII-RI con HpaI, se diluyó y se auto-ligó. Después de la exploración, se identificó un clon positivo y se llamó pRK7.

El vector pRK7 contiene el promotor y el potenciador de CMV y un donante de corte y empalme, el intrón y el aceptor de corte y empalme de Ig, el promotor de SP6, la señal poliA de SV40 y el origen de replicación de SV40; no tiene gen de la DHFR. La construcción del vector de expresión de la proteína del factor tisular se emprendió del siguiente modo: se clonó el ADNc de la proteína del factor tisular de \lambdaTF14 en el sitio SalI de pSP64 y se llamó pSP64TF (Promega Corporation, 1987). Se cortó pSP64 que contenía el ADNc del factor tisular con NcoI. Se ligó un convertidor de 18 unidades que estaba tratado con quinasa al extremo NcoI para cambiar el sitio NcoI a un sitio XbaI. La secuencia de los enlazadores usados fue:

Enlazador NcoI - XbaI Oligómero de 18 unidades

9

Después se digirió pSP64 con BbvI y se aisló en gel un fragmento de 1030 pb. Un ADN dúplex PvuII-BbvI de aproximadamente 100 pb que no se trató con quinasa, contenía las secuencias del primer sitio de activación de la trombina del factor VIII y los primeros 12 aminoácidos de la proteína del factor tisular humano madura. La secuencia de los aproximadamente 100 pb fue la siguiente:

Fusión Factor Tisular/Trombina

10

El fragmento PvuII-BbvI se ligó al fragmento de aproximadamente 1030 pb. Se aisló en gel un fragmento de aproximadamente 1130 pb. Este fragmento PvuII-XbaI se ligó después en un vector pSP64 llamado pSP64ThTF. Se obtuvo un clon que se secuenció en el área que comprende el oligómero de 100 unidades sintético. Este plásmido se digirió con PvuII y XbaI en un intento de aislar una gran cantidad del inserto. Sin embargo, el sitio XbaI no se digirió. Por lo tanto, el inserto se aisló en gel cortando con PvuII y SalI. El sitio SalI está en la parte restante del polienlazador de pSP64 y localizado al lado del sitio XbaI. El segundo fragmento que contenía la secuencia señal de gD del herpes más algo de la región 5' no traducida comprendía un fragmento de 275 pb obtenido del pgD-DHFR (Publicación EP Nº 0139417, publicada el 2 de mayo de 1985), que se digiere con PstI-SacII y un fragmento sintético SacII-PvuII de 103 pb que tiene la siguiente secuencia:

Fragmento Sintético SacII-PvuII (Líder HSVgD)

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El tercer segmento se obtuvo digiriendo pRK7 con PstI-SalI y aislando en gel un fragmento de aproximadamente 4700 pb. El ligamiento de tres partes final usó: a) el fragmento PvuII-SalI que contenía el primer sitio de activación de la trombina 5' del ADNc que codifica la proteína del factor tisular; b) el fragmento PstI-PvuII que contenía la secuencia señal de gD del herpes; y c) el fragmento pRK que contenía los elementos de control. Se obtuvieron los 3 trozos descritos anteriormente y los clones y se determinó que eran correctos por digestión con enzimas de restricción y secuenciación.

Se transfectaron células de riñón embrionario humano (293S) con el vector de expresión que contenía la proteína de fusión del factor tisular-gD del herpes. Las células 293 humanas se recogieron 15 horas después de la transfección transitoria. El medio de cultivo se retira y se añaden 2 ml de tampón de extracción (Tris-HCl 5 mM); NaCl 150 mM:pH 7,5 [TBS] que contenía Triton X-100 al 0,1%) por placa de cultivo tisular de 100 mm. Las células se suspenden y se hacen girar (extremo sobre extremo) durante 45-60 minutos a 4ºC. El extracto se centrifuga a 8000 x g durante 20 min y después se carga directamente en la columna de anticuerpo monoclonal (3,5 mg 5B6/ml de Sepharose activada con CNBr) a un caudal de 0,8 ml/min. La preparación de un anticuerpo frente a gD del herpes se describe en la Publicación EP Nº 1.139.416, publicada el 2 de mayo de 1985. La columna de anticuerpo se lava con 10 ml de tampón de extracción para restituir la Absorbancia (280 nm) a la línea basal. Después la columna se lava con Tris-HCl 50 mM; NaCl 1 M; Triton X-100 al 0,1%, pH 7,5 y se eluye con glicina 0,1 M; NaCl 150 mM; Triton X-100 al 0,1%, pH 2. El pH se ajusta a neutralidad con Tris HCl 1 M, pH 8,5.

La porción gD de la proteína de fusión gD-factor tisular se escindió de la proteína de fusión usando trombina. Se unieron covalentemente 1110 unidades de trombina (0,33 mg de proteína) a 0,5 ml de Sepharose activada con CNBr de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se incuban 5000 unidades de la proteína de fusión gDTF con aproximadamente 150 \mul de trombina-Sepharose durante 90 minutos a 37ºC (girada extremo sobre extremo). Después la trombina-Sepharose se retira por centrifugación.

La actividad del factor tisular se detectó por ensayo cromogénico como se describe a continuación.

Ejemplo 7 Expresión de la Proteína del Factor Tisular con el Dominio Citoplásmico Suprimido

Se construyó el vector pRKTF\Delta244, como se muestra en la Figura 10, para expresar una proteína del factor tisular que carecía de dominio citoplásmico, aminoácidos 244 a 263. El vector se construyó por ligamiento de tres partes. La primera parte fue un fragmento de 859 pb obtenido por digestión de pCISTF1 con EcoRI y ClaI. Los 859 pb se aislaron en gel. La segunda porción se aisló en gel después de digestión con ClaI-BamHI de pRK5 como se ha descrito anteriormente. La tercera parte fue un oligómero de 87 unidades EcoRI-BamHI sintetizado químicamente que tenía la siguiente secuencia:

Oligómero de 87 unidades

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El ligamiento de tres partes usó: a) el fragmento de 859 pb que codifica los aminoácidos 1-216; b) el fragmento de 4700 pb de pRK5; y, c) el oligómero de 87 unidades que codifica los aminoácidos 217-243. Este nuevo vector se llamó pRKTF\Delta244 (véase Figura 10).

Se transfectaron células de riñón embrionario humano (293) con el vector de expresión pRKTF\Delta244. Después de tres días, se purificó la proteína del factor tisular con el dominio citoplásmico suprimido como se ha describe previamente y se ensayó en el ensayo cromogénico descrito a continuación. El factor tisular con el dominio citoplásmico suprimido mostró una fuerte reacción positiva en el ensayo demostrando que la proteína del factor tisular con el dominio citoplásmico suprimido era eficaz en este ensayo de coagulación in vitro.

Ejemplo 8 Purificación de la Proteína del Factor Tisular

La proteína del factor tisular se purificó usando purificación por inmunoafinidad usando un anticuerpo monoclonal IgG que se une a la proteína del factor tisular humano.

La proteína del factor tisular humano se sintetizó en cultivo recombinante como se ha descrito anteriormente. Se inyectaron los siguientes inmunógenos en un ratón BALB/c (29.1.C) de acuerdo con el programa descrito a continuación: proteína del factor tisular humano recombinante (rTF) (0,07 mg/ml que tiene una actividad específica de 17040 U/mg); proteína del factor tisular recombinante obtenida de la fusión factor tisular-gD escindida por trombina para retirar las secuencias de gD del herpes del extremo amino terminal (rTF:gDThr) (0,72 mg/ml que tiene una actividad específica de 4687 U/mg) y la fusión factor tisular recombinante-gD del herpes (rTF-gD) (aproximadamente 150.000 U/mg) en el siguiente programa de inmunización:

Día	Vía de Administración	Inmunógeno
1.	subcutánea (sc)	0,25 ml de r-TF en adyuvante completo de Freund
14.	mitad sc y mitad intraperitoneal (ip)	0,25 ml de r-TF:gD en adyuvante incompleto de Freund
28.	I.P.	0,25 ml de r-TF:gD en PBS
42.	I.P.	0,25 ml de r-TF:gD en PBS
62.	I.P.	0,25 ml de r-TF:gD en PBS
75.	I.P.	0,25 ml de r-TF:gD en PBS
85.	Intraesplénica	0,1 ml de r-TF:gDThr en PBS**
** 10-40 \mug/ml

El título anti-TF ensayado radio-inmunoprecipitación (RIP) y ELISA aumentó gradualmente durante toda la inmunización hasta el día 85.

El ensayo RIP se usó 0,005 ml de sueros de ratones inmunizados y no inmunizados diluidos con 0,495 ml de PBSTA (PBS que contenía albúmina de suero bovina al 0,5% [BSA] y Triton X-100 al 0,1%). Se añadieron 50.000 cpm de ^{125}I-rTF y la mezcla se incubó durante 2 horas a temperatura ambiente. El ^{125}I-rTF complejado con anticuerpo se hizo precipitar incubando durante 1 hora a temperatura ambiente con 0,05 ml de perlas SPA. Las perlas SPA constaban de proteína A de estafilococos unida a perlas de sepharose CL-4B que se habían pre-incubado con IgG de conejo anti-ratón y almacenado en Tris 50 mM pH 8, MgCl_{2} 10 mM, BSA al 0,1% y NaN_{3} al 0,02%. Las perlas se sedimentaron, se lavaron tres veces con PBSTA y se contaron en un contador gamma.

El ELISA constaba de 0,1 ml de rTF (0,5 \mug/ml) en tampón carbonato pH 9,6 adsorbido a pocillos de microtitulación durante 2 horas a 37ºC. La adsorción no específica adicional a los pocillos se bloqueó durante 1 hora a 37ºC con PBSA (PBS que contenía BSA al 5%). Los pocillos se lavaron 3 veces con PBST (PBS que contenía Tween 80 al 0,1%) y se añadieron las muestras de suero diluidas en PBS y se incubaron durante una noche a 4ºC. Los pocillos se lavaron 3 veces con PBST. Se añadieron 0,1 ml de inmunoglobulina de cabra anti-ratón conjugada con peroxidasa de rábano rusticano a cada pocillo y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Los pocillos se lavaron otra vez y se añadió O-fenilendiamina como sustrato y se incubó durante 25 minutos a temperatura ambiente. La reacción se paró con H_{2}SO_{4} 2,5 M y se leyó la absorbancia de cada pocillo a los 492 min.

En el día 89 se recogió el bazo del ratón 29.1.C, se alteró y las células del bazo se fusionaron con células de mieloma de ratón no secretoras P3 X63-Ag8.653 (ATCC CRL 1580) usando el procedimiento de fusión con PEG de S. Fazakas de St. Groth et al., J. Immun. Meth., 35:1-21 (1980). El cultivo fusionado se sembró en 4 placas que contenían cada una 96 pocillos de microtitulación y se cultivó en medio HAT (hipoxantina, aminopterina y timidina) por técnicas convencionales (Mishell and Shiigi, Selected Methods in Cellular Immunology, W.H. Freeman & Co., San Francisco, páginas 357-363 [1980]). Se determinó la actividad anti-TF de los sobrenadantes del cultivo por ELISA y RIP. Se encontró que veinte positivos tenían actividad anti-TF. De estos, se expandieron 12 fusiones estables que secretaban anti-TF y se clonaron por dilución limitante usando procedimientos publicados (Oi, V.J.T. & Herzenberg, L.A., "Immunoglobulin Producing Hybrid Cell Lines" en Selected Methods in Cellular Immunology, páginas 351-372, Mishell, B.B. and Shiigi, S.M. [eds], W.H. Freeman & Co. [1980]). La selección de los clones se basó en: la observación macroscópica de los clones individuales, ELISA y RIP: Se determinó el isotipo del anticuerpo usando un kit de determinación de isotipo Zymed de acuerdo con el protocolo adjunto. (Zymed Corp.) Se produjeron grandes cantidades de anticuerpos monoclonales específicos por inyección de células de hibridoma clonadas en ratones cebados con pristano para producir tumores ascíticos. Después se recogieron los fluidos ascíticos y se purificaron en una columna de proteína A-Sepharose.

Se centrifugaron aproximadamente 5 ml de fluido ascítico a 3000 rpm en un Sorvall 6000 a 4ºC durante 10 minutos. La capa clara de pristano y la capa de lípidos se retiraron con una pipeta pasteur. El fluido ascítico se transfirió a un tubo de centrífuga de 50 ml. El fluido ascítico se filtró en esterilidad a través de un filtro 0,45 M. Se añadieron 1,11 g de KCl a los fluidos ascíticos para producir una concentración final de KCl 3 M.

Los fluidos ascíticos se cargaron en una columna de 10 ml que contenía SPA Sepharose (Fermentech). La columna se lavó con KCl 3 M. La IgG de ratón se eluyó con 3 a 4 volúmenes de la columna de ácido acético 0,1 M en NaCl 0,15 M pH 2,8.

El anticuerpo D3 se acopló a CNBr Sepharose de acuerdo con las instrucciones del fabricante a 3 mg de IgG por ml de Sepharose. (Véase el manual de instrucciones de Pharmacia Co.). Se hicieron crecer células 293S transfectadas en una mezcla 1:1 de F-12 de Ham (sin glicina, hipoxantina y timidina) y DMEM (sin glicina). Las adiciones al medio basal incluyen: suero de ternera fetal sometido dializado o diafiltrado al 10%, metotrexato 50 nM, L-glutamina 2,0 mM y tampón HEPES 10 mM.

Se descongela un vial congelado de 293S (63/2S CISTF) en un matraz de cultivo tisular que contiene el medio descrito. Cuando el cultivo alcanza la confluencia se trata con tripsina con una mezcla de tripsina-EDTA y una pequeña porción de la población celular se usó para inocular matraces más grandes. Los cultivos se controlaron diariamente por microscopía de fases para determinar el crecimiento (porcentaje de confluencia), morfología y salud general. Cuando los cultivos en frascos rotativos fueron confluentes (habitualmente en 5-7 días), las células se trataron con tripsina y se contaron. Las células se enumeraron y se determinaron sus viabilidades por la técnica de exclusión con azul de tripano. Las cantidades típicas de células de un frasco rotativo de 850 cm^{2} confluente estaban entre 1 y 4 x 10^{8} células. Las células se suspendieron en fosfato sódico 0,01 M, NaCl 0,15 M. Las células se recogieron por centrifugación a 5000 rpm. Las células se resuspendieron en 50 ml de TBS que contenía Triton X al 1% por matraz. Los cultivos se incubaron una hora a temperatura ambiente y después se centrifugaron a 8000 x g durante 20 minutos. El sobrenadante se cargó en la columna de D3-Sepharose descrita anteriormente. La columna se lavó y se eluyó con ácido acético 0,1 M, NaCl 150 mM y Tween 80 al 0,05%.

Ejemplo 9 Ensayo para la Proteína del Factor Tisular 1. Ensayo cromogénico del factor tisular

Se relipidaron todas las muestras extraídas del medio de cultivo antes del ensayo. Como se ha analizado anteriormente el factor tisular tiene una necesidad absoluta de fosfolípidos para mostrar actividad en sistemas de ensayo in vitro (Pitlick and Nemerson, Supra). Se homogeneizaron gránulos de lecitina en Tris 0,05 M, NaCl 0,1 M pH 7,4 (TBS) que contenían desoxicolato sódico al 0,25% a una concentración de 1 mg/ml. Esta solución (PC/DOC) se usó para relipidar el factor tisular del siguiente modo. La proteína del factor tisular se diluyó en TBS que contenía albúmina de suero bovina al 0,1% (TBSA). Se colocaron cincuenta microlitros en un tubo de ensayo de poliestireno de 12x75 mm y se añadieron 50 \mul de solución PC/DOC. Después se añadieron trescientos cincuenta (350) microlitros de TBSA junto con 25 \mul de CdCl_{2}. Esta mezcla de relipidación se dejó incubar a 37ºC durante 30 minutos.

Para el ensayo cromogénico, las muestras de proteína del factor tisular relipidadas se diluyeron en TBSA. Se colocaron diez microlitros en un tubo de ensayo con 50 \mul del reactivo factor IX_{a}/factor X y 2 \mul de una solución de factor VII purificado, 30 unidades/ml. Los tubos se calentaron hasta 37ºC y se añadieron 100 \mul de CaCl_{2} 25 mM. Las muestras se incubaron durante 5 min a 37ºC antes de la adición de 50 \mul de sustrato cromogénico específico para el factor Xa, S2222, que también contenía el inhibidor de trombina sintético I2581. La reacción se dejó continuar durante 10 min y se paró por la adición de 100 \mul de solución de ácido acético glacial al 50%. Se detectó la absorbancia a 405 nm. Se construyó una curva patrón usando tromboplastina de cerebro de conejo (disponible en el mercado de Sigma, St. Louis, MO. Nº de catálogo TO263) asignando arbitrariamente a este reactivo 100 unidades de factor tisular/ml. Se hicieron diluciones de 1:10 a 1:1000. La absorbancia se trazó en la abscisa en papel para gráficos semilog con la dilución del patrón trazada en la ordenada.

2. Ensayo de una fase para la actividad del factor tisular

Se añadieron 100 \mul de plasma hemofílico a 10 \mul de proteína del factor tisular relipidada o libre de lípidos o TBSA como control en un tubo de vidrio siliconado para evitar la activación no específica a través de la fase de contacto de la coagulación. Los reactivos se calentaron hasta 37ºC y se añadieron 100 \mul de CaCl_{2} 25 mM y se cronometró la formación de coágulos (Hvatum, Y. and Pyrdz, H., Thromb. Diath. Haemorrh. 21, 217-222 [1969]).

Ejemplo 10 Eficacia y Carencia de Toxicidad de la Proteína del Factor Tisular en un Modelo de Hemofilia Canino

La proteína del factor tisular se infundió en perros hemofílicos usando el procedimiento de Giles, A.R. et al., Blood 60, 727-730 (1982).

La carencia de toxicidad de la proteína del factor tisular se determinó primero en un perro normal por inyección en forma de bolo de dosis de aproximadamente 50 U de proteína del factor tisular/kg y 100 U de proteína del factor tisular/kg. Se realizó la determinación del tiempo de hemorragia de la cutícula (CBT) (Giles supra) antes de la infusión y 30 minutos después de cada inyección. Se sacó sangre y se anticoaguló para los ensayos de coagulación a diversos momentos puntuales durante el experimento. Para demostrar la actividad de la proteína del factor tisular de evitar el factor VIII in vivo, se realizaron experimentos usando perros hemofílicos. Los animales en ayunas fueron anestesiados y se realizó un CBT antes de cualquier infusión. Después se administró la proteína del factor tisular por inyección en forma de bolo y se realizaron CBT en diversos momentos puntuales hasta 90 min después de la infusión. Se administraron varias dosis de la proteína del factor tisular. Se sacaron muestras de sangre a lo largo de toda la duración de cada experimento y se analizaron para el factor V, y los tiempos de protrombina y la tromboplastina parcial. Los CBT de más de 12 min se consideraron extremadamente anormales. Esas uñas se cauterizaron para evitar una pérdida excesiva de sangre.

Se administraron dosis de proteína del factor tisular que representaban 100 U/kg de proteína del factor tisular en relipidación en el ensayo cromogénico a un perro anestesiado normal. El CBT en este animal fue de aproximadamente 3 min antes de cualquier infusión. Había cierta reducción en WBCT a los 5 minutos aunque volvía al normal a los 15 minutos. Los niveles del factor V fueron normales 30 minutos después de cada infusión. Los tiempos de protrombina y tromboplastina parcial fueron iguales al final del experimento y los CBT también estuvieron en el intervalo normal. Por tanto, la infusión de la proteína del factor tisular se toleró bien en perros normales y no se encontró evidencia de coagulación intravascular diseminada.

Se administraron 100 U/kg de proteína del factor tisular a un perro hemofílico con un CBT prolongado característico de hemofilia A. El CBT se normalizó a los 5 minutos y 20 minutos después de esta infusión. Un segundo experimento usando 100 U/kg de proteína del factor tisular dio un CGR normal a los 20 minutos y un cierto acortamiento de CBT a los 90 minutos. El efecto procoagulante no se mantuvo 90 min después de la infusión ya que el efecto del CBT se prolongó de nuevo en este momento puntual.

Composiciones Farmacéuticas

Las variantes o fragmentos o polipéptidos de fusión del factor tisular pueden formularse de acuerdo con métodos conocidos para preparar composiciones farmacéuticamente útiles, por los que la proteína del factor tisular producto de las mismas se combina en mezcla con un vehículo portador farmacéuticamente aceptable. Los vehículos apropiados y su formulación, incluyendo los de otras proteínas humanas, por ejemplo, albúmina de suero humana, se describen por ejemplo en Remington's Pharmaceutical Sciences por E.W. Martin, que se incorpora por la presente como referencia. Dichas composiciones contendrán una cantidad eficaz de la proteína de la misma junto con una cantidad apropiada de vehículo para preparar composiciones farmacéuticamente aceptables apropiadas para la administración eficaz al hospedador. Dichas composiciones debe ser estables durante períodos de tiempo apropiados, deben ser aceptables para la administración a seres humanos, y deben ser fácilmente fabricables. Un ejemplo de dichas composición sería una solución diseñada para administración parenteral. Aunque las formulaciones en solución farmacéutica se proporcionan en forma de líquido apropiada para su uso inmediato, dichas formulaciones parenterales también pueden proporcionarse en forma congelada o liofilizada. En el primer caso, la composición debe descongelarse antes de su uso. La última forma se usa a menudo para potenciar la estabilidad del agente medicinal contenido en la composición en una amplia diversidad de condiciones de almacenamiento. Dichas preparaciones liofilizadas se reconstituyen antes de su uso por la adición de un diluyente o diluyentes farmacéuticamente aceptables apropiados, tales como agua estéril o solución salina fisiológica estéril. La proteína del factor tisular de esta invención se administra para proporcionar una composición terapéutica que induce la coagulación para diversos trastornos hemorrágicos crónicos, caracterizados por la tendencia a la hemorragia, tanto heredada como adquirida. Los ejemplos de dichos trastornos hemorrágicos crónicos son deficiencias en los factores VIII, IX, o XI. Los ejemplos de trastornos adquiridos incluyen: inhibidores adquiridos de los factores de coagulación sanguínea por ejemplo, el factor VIII, el factor de von Willebrand, los factores IX, V, XI, XII y XIII; trastorno hemostático como consecuencia de enfermedad del hígado que incluye la síntesis disminuida de factores de coagulación y DIC; tendencia a la hemorragia asociada con enfermedad renal aguda y crónica que incluye deficiencias en el factor de coagulación y DIC; hemostasis después de traumatismo o cirugía; pacientes con malignidad diseminada que se manifiesta en DIC con aumentos en el factor VIII, factor de von Willebrand y fibrinógeno; y hemostasis durante cirugía cardiopulmonar y transfusión sanguínea masiva.

Claims

1. Método para preparar una composición terapéutica que induce la coagulación sanguínea, caracterizada en que comprende combinar un vehículo portador farmacéuticamente aceptable con:

A) una variante o fragmento biológicamente activo de la proteína del factor tisular cuya secuencia se da en la Figura 2, donde al menos un aminoácido se ha insertado, delecionado o sustituido selectivamente, induciendo dicha variante o fragmento la coagulación; o

B) una proteína del factor tisular biológicamente activa cuya secuencia se da en la Figura 2, o una variante o fragmento biológicamente activo de dicha proteína del factor tisular, donde al menos un aminoácido se ha insertado, delecionado o sustituido selectivamente, induciendo dicha variante o fragmento la coagulación, donde la proteína del factor tisular o dicha variante o fragmento de la misma carece de glicosilación o tiene glicosilación no de mamífero.

C) un polipéptido de fusión que comprende una proteína del factor tisular biológicamente activa cuya secuencia se da en la Figura 2, o una variante o fragmento biológicamente activo de dicha proteína del factor tisular, donde al menos un aminoácido se ha insertado, delecionado o sustituido selectivamente, induciendo dicha variante o fragmento la coagulación, y otro polipéptido fusionado a la misma.

2. Método, de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicha variante de la proteína del factor tisular biológicamente activa en (A) en una en la que en comparación con la proteína del factor tisular nativa, se remplaza un aminoácido seleccionado de modo que (a) se remplaza un resto hidrófilo por un resto hidrófobo, o (b) se remplaza un resto de cisteína o prolina por otro resto de aminoácido o (c) se remplaza un resto que tiene una cadena lateral electropositiva por un resto electronegativo o (d) se remplaza un resto que tiene una cadena lateral voluminosa por un resto que tiene una cadena lateral pequeña o glicina.

3. Método de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicha variante de la proteína del factor tisular biológicamente activa en (A) es una en la que el dominio transmembrana de la proteína del factor tisular nativa no está presente.

4. Método de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicha variante de la proteína del factor tisular biológicamente activa en (A) es una en la que hay un sitio seleccionado que es un sitio de proteolisis potencial en la proteína del factor tisular nativa que es resistente a la proteolisis.

5. Método de acuerdo con la reivindicación 4, donde dicho sitio de proteolisis potencial en la proteína del factor tisular nativa que comprende una arginina se remplaza por otro aminoácido o no está presente.

6. Método de acuerdo con la reivindicación 5, donde la arginina se remplaza por glutamina o histidina.

7. Método de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicha variante de la proteína del factor tisular biológicamente activa (A) es una en la que un resto de cisteína de la proteína del factor tisular nativa se remplaza por otro resto de aminoácido.

8. Método de acuerdo con la reivindicación 7, donde el resto de cisteína es la cisteína 245 y el otro resto de aminoácido es serina.

9. Método de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicha variante de la proteína del factor tisular biológicamente activa (A) es una en la que un sitio de glicosilación unido a N o unido a O de la proteína del factor tisular nativa no está presente.

10. Método de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicha composición se prepara a partir del polipéptido de fusión (B).