ES2244989T3 - Metodos y acido desoxirribonucleico para la preparacion de la proteina del factor tisular. - Google Patents
Metodos y acido desoxirribonucleico para la preparacion de la proteina del factor tisular.Info
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Abstract
AISLADORES DE ADN QUE CODIFICAN UNA PROTEINA DE FACTOR DE TEJIDO Y DERIVADOS DEL MISMO Y METODOS DE OBTENER DICHO ADN Y PRODUCIR PROTEINA DE FACTOR DE TEJIDO Y DERIVADOS DEL MISMO UTILIZANDO SISTEMAS DE EXPRESION RECOMBINANTES PARA USO EN COMPOSICIONES TERAPEUTICAS PARA EL TRATAMIENTO DE TRASTORNOS DE COAGULACION.
Description
Métodos y ácido desoxirribonucleico para la
preparación de la proteína del factor tisular.
Esta invención se refiere a variantes o
fragmentos o polipéptidos de fusión de la proteína del factor
tisular que inducen coagulación, para su uso como medicamento.
La hemorragia es una de las manifestaciones más
serias y significativas de enfermedad. Esta puede suceder en un
sitio local o puede ser generalizada. La hemostasis primaria consta
principalmente de dos componentes: vasoconstricción y formación del
tapón de plaquetas. La formación del tapón de plaquetas puede
dividirse en varias fases: adherencia de las plaquetas a las
superficies subendoteliales expuestas por el traumatismo; reacción
de liberación de activación de las plaquetas; agregación de las
plaquetas, que da como resultado el secuestro de plaquetas
adicionales en el sitio, y la unión del fibrinógeno y las proteínas
de coagulación a la superficie de las plaquetas que da como
resultado la formación de trombina; y, la fusión que es la
coalescencia de la fibrina y las plaquetas fusionadas para formar un
tapón hemostático estable.
La coagulación sanguínea realiza dos funciones:
la producción de trombina que induce la agregación de las plaquetas
y la formación de fibrina que vuelve estable el tapón de plaquetas.
En el proceso de coagulación participan varias proenzimas y
profactores específicos, mencionados como "factores de
coagulación". El proceso consta de varias fases y termina con la
formación de fibrina. El fibrinógeno se convierte en fibrina por la
acción de la trombina. La trombina se forma por la proteolisis
limitada de una proenzima, la protrombina. Esta proteolisis se
realiza por el factor X activado (mencionado como factor X_{a})
que se une a la superficie de las plaquetas activadas y, en
presencia del factor Va y de calcio iónico, escinde la
protrombina.
La activación del factor X puede suceder mediante
cualquiera de dos vías separadas, la extrínseca o la intrínseca
(Figura 1). La cascada intrínseca consta de una serie de reacciones
en las que un precursor proteico se escinde para formar una proteasa
activa. En cada etapa, la proteasa recién formada catalizará la
activación de la proteasa precursora en la etapa posterior de la
cascada. Una deficiencia en cualquiera de las proteínas de la vía
bloquea el proceso de activación en esa etapa, evitando de ese modo
la formación del coágulo y típicamente da lugar a una tendencia a la
hemorragia. Las deficiencias en el factor VIII o factor IX, por
ejemplo, provocan los síndromes hemorrágicos graves de la hemofilia
A y B, respectivamente. En la vía extrínseca de la coagulación
sanguínea, el factor tisular, también mencionado como tromboplastina
tisular, se libera de las células dañadas y activa el factor X en
presencia del factor VII y calcio. Aunque en un principio se creía
que la activación del factor X era la única reacción catalizada por
el factor tisular y el factor VII, ahora se sabe que existe un bucle
de amplificación entre el factor X, el factor VII, y el factor IX
(Osterud, B., y S.I. Rapaport, Proc. Natl. Acad. Sci. [USA]
74:5260-5264 [1977]; Zur, M. et al.,
Blood 52: 198 [1978]). Cada una de las serina proteasas de
este esquema es capaz de convertir por proteolisis las otras dos en
la forma activada, amplificando de ese modo la señal en esta fase
del proceso de coagulación (Figura 1). Ahora se cree que la vía
extrínseca puede ser, de hecho, la vía fisiológica principal de la
coagulación sanguínea normal (Haemostasis
13:150-155 [1983]). Como el factor tisular no
se encuentra habitualmente en la sangre, el sistema no coagula
continuamente; el desencadenante de la coagulación sería por lo
tanto la liberación del factor tisular del tejido dañado.
Se cree que el factor tisular es una
glicoproteína integral de membrana que, como se ha analizado
anteriormente, puede desencadenar la coagulación sanguínea por la
vía extrínseca (Bach, R. et al., J. Biol. Chem.
256[16]: 8324-8331 [1981]). El factor tisular
consta de un componente proteico (previamente mencionado como
apoproteína-III del factor tisular) y un
fosfolípido. Osterud, B. y Rapaport, S.I., Proc. Natl. Acad. Sci.
74, 5260-5264 (1977). Se ha encontrado el
complejo en las membranas de monocitos y diferentes células de la
pared de los vasos sanguíneos (Osterud, B., Scand. J. Haematol.
32: 337-345 [1984]). Se ha informado de que
el factor tisular de diversos órganos y especies tiene una masa
molecular relativa de 42.000 a 53.000. Se ha descrito que la
tromboplastina tisular humana consta de una proteína del factor
tisular insertada en una bicapa de fosfolípidos en una proporción
óptima de proteína del factor tisular:fosfolípido de aproximadamente
1:80 (Lyberg, T. and Prydz, H., Nouv. Rev. Fr. Hematol.
25(5): 291-293 [1983]). Se ha informado sobre
la purificación del factor tisular a partir de diversos tejidos
tales como: cerebro humano (Guha, A. et al. Proc. Natl. Acad.
Sci. 83: 299-302 [1986] y Broze, G.H. et
al., J. Biol. Chem. 260[20]: 10917-10920
[1985]); cerebro bovino (Bach, R. et al., J. Biol. Chem.
256: 8324-8331 [1981]): placenta humana
(Bom, V.J.J. et al., Thrombosis Res.
42:635-643 [1986]; y, Andoh, K. et
al., Thrombosis Res. 43:275-286 [1986]);
cerebro ovino (Carlsen E. et al., Thromb. Haemostas.
48[3], 315-319 [1982]); y, pulmón (Glas, P.
and Astrup, T., Am. J. Physiol. 219,
1140-1146 [1970]). Se ha demostrado que la
tromboplastina tisular bovina y humana son idénticas en tamaño y
función (véase Broze, G.H. et al., J. Biol. Chem.
260[20], 10917-10920 [1985]). Está
ampliamente aceptado que aunque hay diferencias en la estructura de
la proteína del factor tisular entre especies no hay diferencias
funcionales medidas por ensayos de coagulación in vitro (Guha
et al. supra). Además, el factor tisular aislado de
diversos tejidos de un animal, por ejemplo, cerebro, pulmón,
arterias y venas de perro era similar en ciertos aspectos tales
como, coeficiente de extinción, contenido en nitrógeno y fósforo y
proporción óptima de fosfolípidos a lípidos pero difería ligeramente
en tamaño molecular, contenido en aminoácidos, reactividad con
anticuerpos y vida media en plasma (Gonmori, H. and Takeda, Y., J.
Physiol. 299[3], 618-626 [1975]). Todos los
factores tisulares de los diversos órganos de perro mostraron
actividad coagulante en presencia de lípidos. Idem. Está ampliamente
aceptado que para mostrar actividad biológica, el factor tisular
debe estar asociado a fosfolípidos in vitro (Pitlick, F.A.,
and Nemerson, Y., Biochemistry 9: 5105-5111
[1970] y Bach, R. et al. supra. en 8324). Se ha
demostrado que la retirada del componente fosfolipídico del factor
tisular, por ejemplo por el uso de una fosfolipasa, da como
resultado una pérdida de su actividad biológica in vitro
(Nemerson, Y., J.C.I. 47: 72-80 [1968]). La
relipidación puede restaurar la actividad del factor tisular in
vitro (Pitlick, F.A. and Nemerson, Y., supra y
Freyssinet, J.M. et al., Thrombosis and Haemostasis
55: 112-118 [1986]). Se han determinado las
secuencias amino terminales del factor tisular (Bach, R. et
al., Am. Heart Assoc. [Nov., 1986], Morrisey, J.H. et
al., Am. Heart Assoc. [Nov., 1986] y un fragmento peptídico CNBr
(Bach, R. et al. supra).
Durante mucho tiempo se ha creído que la infusión
de factor tisular comprometía la hemostasis normal. En 1834 el
fisiólogo francés de Blainville estableció primero que el factor
tisular contribuía directamente a la coagulación sanguínea (de
Blainville, H. Gazette Medicale Paris, Series 2, 524
[1834]). Además, de Blainville observó que la infusión intravenosa
de una suspensión de tejido cerebral provocaba la muerte inmediata
que observó que se correspondía con un estado hipercoagulativo que
daba lugar a coágulos sanguíneos diseminados ampliamente encontrados
en la autopsia. Ahora está bien aceptado que la infusión intravenosa
de tromboplastina tisular induce la coagulación intravascular y
puede provocar la muerte en diversos animales (Perros: Lewis, J. and
Szeto I.F., J. Lab. Clin. Med. 60: 261-273
[1962]; conejos: Fedder, G. et al., Thromb. Diath. Haemorrh.
27: 365-376 [1972]; ratas: Giercksky, K.E.
et al., Scand. J. Haematol. 17:
305-311 [1976]; y, ovejas: Carlsen, E. et
al., Thromb. Haemostas. 48: 315-319
[1982]).
Aunque el aislamiento del factor tisular se ha
descrito en la bibliografía como se ha mostrado anteriormente, la
estructura precisa de la proteína del factor tisular no se ha
establecido previamente. Aunque algunas cantidades de proteína del
factor tisular "purificado" han estado disponibles obtenidas de
diferentes tejidos, la baja concentración de proteína del factor
tisular en la sangre y los tejidos y el elevado coste, tanto
económico como de esfuerzo, de purificar la proteína de los tejidos,
hacen de esta un material poco frecuente. La memoria descriptiva
muestra cómo aislar el ADN que codifica la proteína del factor
tisular y producir cantidades útiles de proteína del factor tisular
humano usando técnicas recombinantes. La memoria descriptiva muestra
adicionalmente cómo preparar nuevas formas de la proteína del factor
tisular. Este y otros objetos de esta invención se harán evidentes a
partir de la memoria descriptiva como conjunto.
Las variantes y fragmentos y polipéptidos de
fusión de la proteína del factor tisular de uso en la invención
pueden conseguirse por un método que comprende: identificar y clonar
el ADNc que codifica la proteína del factor tisular humano;
incorporar ese ADNc en un vector de ADN recombinante; transformar un
hospedador apropiado con el vector que incluye ese ADN; expresar el
ADN de la proteína del factor tisular humano en dicho hospedador; y
recuperar la proteína del factor tisular humano que se produce. De
un modo similar, la memoria descriptiva hace posible producir
proteína del factor tisular humano y/o derivados de la misma por
técnicas recombinantes, así como proporcionar productos y métodos
relacionados con dicha producción de proteína del factor tisular
humano. El aislamiento y la identificación y la secuenciación del
ADN de la proteína del factor tisular eran problemáticos. El ARNm
era relativamente poco frecuente y hasta ahora no se conocía la
secuencia de aminoácidos completa de la proteína del factor
tisular.
La presente invención se refiere a la materia
objeto de las reivindicaciones adjuntas.
La memoria descriptiva contiene composiciones y
métodos para producir proteína del factor tisular humano por
tecnología de ADN recombinante, incluyendo: 1) el aislamiento e
identificación de la secuencia de ADN completa de la proteína y la
región flanqueante 5' y 3' de la misma; 2) la construcción de
vehículos de clonación y expresión que comprenden dicha secuencia de
ADN, posibilitando la expresión de la proteína del factor tisular
humano, así como conjugados N terminales con metionina, de fusión o
señal de los mismos; y 3) cultivos celulares viables, alterados
genéticamente debido a que contienen dichos vehículos y capaces de
producir proteína del factor tisular humano. Esta memoria
descriptiva contiene adicionalmente composiciones de ADN y métodos
para producir ADN que codifica para la producción celular de
proteína del factor tisular humano, y contiene nuevos compuestos,
incluyendo secuencias de ADN que se utilizan para obtener clones que
codifican la proteína del factor tisular. Esta invención se refiere
adicionalmente al uso nuevos derivados de la proteína del factor
tisular, en particular derivados que carecen de la secuencia señal y
la porción hidrófoba de la proteína cerca del extremo
C-terminal de la proteína que comprende la secuencia
de aminoácidos que constituye el dominio de unión transmembrana o de
membrana de la proteína del factor tisular.
La utilidad de la proteína del factor tisular
humano y los derivados de la misma para su uso en esta invención se
basa en parte en la nueva e inesperada observación de que la
infusión en perros hemofílicos de proteína del factor tisular, que
es la porción proteica del factor tisular que carece de fosfolípidos
de origen natural, que se mencionó previamente como apoproteína III
del factor tisular y que se creía previamente que era inactiva,
corregía la deficiencia hemostática. Se descubrió por primera vez
que la proteína del factor tisular corregía la diatesis hemorrágica,
es decir una tendencia a la hemorragia, asociada con la deficiencia
en el factor VIII in vivo. Se podría esperar que la infusión
de proteína del factor tisular fuera ineficaz en vista de los
artículos de la técnica anterior que describen que el factor tisular
tiene una necesidad absoluta de fosfolípidos. En contraste con el
trabajo de de Blainville y los posteriores investigadores en los
siguientes ciento cincuenta y dos (152) años, también se descubrió
que la proteína del factor tisular era no tóxica para los perros
cuando se infundía por vía intravenosa.
La proteína del factor tisular humano y los
derivados de la misma para su uso en esta invención son útiles en el
tratamiento de diversos trastornos hemorrágicos crónicos,
caracterizados por una tendencia a la hemorragia, tanto heredada
como adquirida. Los ejemplos de dichos trastornos hemorrágicos
crónicos son deficiencias de los factores VIII, IX, o XI. Los
ejemplos de trastornos adquiridos incluyen: inhibidores adquiridos
de los factores de coagulación sanguínea por ejemplo, el factor
VIII, el factor de von Willebrand, los factores IX, V, XI, XII y
XIII; trastornos hemostáticos como consecuencia de una enfermedad
del hígado que incluye la síntesis disminuida de factores de
coagulación y DIC; la tendencia a la hemorragia asociada a
enfermedad renal aguda y crónica que incluye deficiencias en el
factor de coagulación y DIC; la hemostasis después de traumatismo o
cirugía; pacientes con malignidad diseminada que se manifiesta en
DIC con aumentos en los factores VIII, factor de von Willebrand y
fibrinógeno; y hemostasis durante cirugía cardiopulmonar y
transfusión sanguínea masiva. La proteína del factor tisular humano
y los derivados de la misma descritos en este documento también
pueden usarse para inducir la coagulación para problemas
hemorrágicos agudos en pacientes normales y en aquellos con
trastornos hemorrágicos crónicos.
Fig. 1 Diagrama que muestra la activación de la
coagulación sanguínea mediante la vía intrínseca.
Fig. 2 Secuencia de nucleótidos y aminoácidos de
la proteína del factor tisular humano. La secuencia de nucleótidos
de la proteína del factor tisular humano se determinó a partir del
análisis de la secuencia de ADN de un clon de tejido adiposo y en
parte confirmada por secuenciación de otros clones. Los aminoácidos
predichos de la proteína del factor tisular se muestran debajo de la
secuencia de ADN y se numeran desde el primer resto del extremo
N-terminal de la secuencia de la proteína. Los
números negativos de los aminoácidos hacen referencia a la secuencia
señal líder supuesta o preproteína, mientras que los números
positivos hacen referencia a la proteína madura.
Figs. 3a-3c (Mencionadas
colectivamente en este documento como Fig. 3). El ADNc de la
proteína del factor tisular humano y sitios de enzimas de
restricción.
Fig. 4 Construcción de un vector de expresión
pCISTF que codifica la proteína del factor tisular de longitud
completa para su uso en células hospedadoras de mamífero.
Fig. 4a Ilustra parte de la construcción de los
vectores de la serie pCIS2.8c usados en este documento.
Fig. 5 Perfil hidropático del factor tisular. La
secuencia de ADN traducido del factor tisular humano se trazó usando
el algoritmo de Kyte and Doolittle, J. Mol. Biol., 157: 105
(1982). La abscisa muestra la secuencia de aminoácidos comenzando en
el extremo amino maduro. Los puntos positivos en la ordenada indican
regiones hidrófobas de la proteína; cada punto representa la
hidropatía media de 6 aminoácidos sucesivos. En la parte inferior, N
marca la posición de sitios de glicosilación unidos a asparagina
predichos y 0 marca el grupo de restos de serina y treonina en los
aminoácidos 160-172. El dominio transmembrana
hidrófobo predicho abarca los restos 220-243 y se
indica por una barra rellena.
Fig. 6 Construcción de un vector de expresión pTF
2A12 que codifica la proteína del factor tisular de longitud
completa.
Figs. 7a-c Las Figs.
7a-c se mencionan colectivamente en este documento
como Fig. 7. Construcción de un mutante de la proteína del factor
tisular que tiene una cisteína sustituida por una serina en la
posición 245.
Figs. 8a-b Las Figs.
8a-b se mencionan colectivamente en este documento
como Figura 8. Construcción de un vector de expresión para la
proteína de fusión del factor tisular humano.
Fig. 9 El ensayo cromogénico es el resultado de
la expresión transitoria de la proteína del factor tisular en
células Cos.
Fig. 10 Construcción de un vector de expresión
para la proteína del factor tisular con el dominio citoplásmico
eliminado.
Como se usa en este documento, "proteína del
factor tisular" se refiere a una proteína capaz de corregir
diversos trastornos hemorrágicos, por ejemplo, induciendo la
coagulación, particularmente los trastornos asociados a deficiencias
en los factores de coagulación. La proteína del factor tisular es
distinta del factor tisular o la tromboplastina tisular de la
técnica anterior en que carece de la porción lipídica de origen
natural de la molécula. La proteína del factor tisular también
incluye la proteína del factor tisular asociada a fosfolípidos cuyo
lípido es distinto del lípido de origen natural asociado a la
tromboplastina tisular y presenta capacidad inductora de la
coagulación sin la toxicidad concomitante observada con la proteína
lipidada. La infusión de la proteína del factor tisular, como se
define en este documento, no provoca coagulación intravascular
diseminada. La capacidad de la proteína del factor tisular de
corregir diversos trastornos hemorrágicos se determina fácilmente
usando diversos modelos de hemorragia in vivo, por ejemplo,
inicio de la coagulación en perros hemofílicos usando la
determinación del tiempo de hemorragia de la cutícula (CBT) (Giles,
A.R. et al., Blood 60:727-730
[1982]).
La secuencia de aminoácidos de la figura 2 es la
de la pre-proteína del factor tisular. La
pre-proteína del factor tisular puede expresarse,
por ejemplo, en procariotas, que no procesan ni secretan la proteína
madura, por transformación con un vector de expresión que comprende
el ADN que codifica la pre-proteína del factor
tisular. Es preferible transformar células hospedadoras capaces de
conseguir dicho procesamiento para obtener la proteína del factor
tisular madura en el medio de cultivo o periplasma de la célula
hospedadora. Típicamente, las células hospedadoras eucariotas
superiores tales como células de mamífero son capaces de procesar la
pre-proteína del factor tisular y de secretar la
proteína del factor tisular madura después de la transformación con
el ADN que codifica la pre-proteína del factor
tisular.
Como alternativa, la proteína del factor tisular
madura secretada puede obtenerse ligando el extremo 5' del ADN que
codifica la proteína del factor tisular madura al extremo 3' del ADN
que codifica una secuencia señal reconocida por la célula
hospedadora. Se usa un vector de expresión que comprende las
secuencias de ADN ligadas para transformar células hospedadoras. La
célula hospedadora procesará la fusión expresada escindiendo
proteolíticamente el enlace peptídico entre la secuencia señal y el
primer aminoácido de la proteína del factor tisular y secretando la
proteína del factor tisular madura al periplasma de la célula
hospedadora o al medio, dependiendo de la célula hospedadora en
cuestión. Por ejemplo, en la construcción de un vector de expresión
procariota el líder de secreción de la proteína del factor tisular
humano, es decir, los aminoácidos -32 a -1, se remplaza por los
líderes de la fosfatasa alcalina bacteriana o de la enterotoxina II
estable al calor, y para levaduras el líder de la proteína del
factor tisular se remplaza por los líderes de la invertasa, del
factor alfa o de la fosfatasa ácida de levaduras. Los organismos
gram negativos transformados con una fusión señal
homóloga-proteína del factor tisular secretarán la
proteína del factor tisular madura al periplasma de la célula,
mientras que levaduras o bacillus sp. secretarán la proteína
del factor tisular madura al medio de cultivo.
Se incluyen en el alcance de la presente
invención derivados desglicosilados o no glicosilados de dichas
proteínas del factor tisular, y variantes de la secuencia de
aminoácidos biológicamente activas de la proteína del factor
tisular, incluyendo alelos, y derivados covalentes generados in
vitro de las proteínas del factor tisular que muestran actividad
de la proteína del factor tisular.
Las variantes de la secuencia de aminoácidos de
la proteína del factor tisular se incluyen en una o más de tres
clases: variantes de sustitución, inserción o deleción. Las
inserciones incluyen fusiones amino y/o carboxilo terminales así
como inserciones intrasecuencia de uno o múltiples restos de
aminoácidos. Las proteínas de fusión del factor tisular incluyen,
por ejemplo, híbridos de la proteína del factor tisular madura con
polipéptidos que son homólogos a la proteína del factor tisular, por
ejemplo, en el caso de la proteína del factor tisular humano, los
líderes de secreción de otras proteínas humanas secretadas. Las
proteínas de fusión del factor tisular también incluyen híbridos de
la proteína del factor tisular con polipéptidos homólogos a la
célula hospedadora pero no a la proteína del factor tisular, así
como, polipéptidos heterólogos tanto a la célula hospedadora como a
la proteína del factor tisular. Un ejemplo de dicha proteína de
fusión del factor tisular es la secuencia señal de gD del herpes con
la proteína del factor tisular madura. Las fusiones preferidas en el
alcance de esta invención son las fusiones amino terminales con
péptidos procariotas o péptidos señal de secuencias señal
procariotas, de levaduras, virales o de la célula hospedadora. No es
esencial que la secuencia señal esté desprovista de cualquier
secuencia madura residual de la proteína cuya secreción dirige
normalmente, pero esto es preferible para evitar la secreción de una
fusión de la proteína del factor tisular.
También se pueden introducir inserciones en la
secuencia codificante madura de la proteína del factor tisular.
Éstas, sin embargo, serán normalmente inserciones más pequeñas que
las de fusiones amino o carboxilo terminales, del orden de 1 a 4
restos. Un ejemplo representativo es la proteína del factor tisular
[Arg_{135}Arg_{136}\rightarrowArg_{135}ProArg_{137}], una
variante seleccionada por su resistencia a la hidrólisis con
tripsina en el resto Arg_{135}. A menos que se indique lo
contrario, las variaciones de la proteína del factor tisular
específicas descritas en este documento son variaciones de la
secuencia de la proteína del factor tisular madura; no son variantes
de la pre-proteína del factor tisular.
Las variantes de inserción de la secuencia de
aminoácidos de las proteínas del factor tisular son aquellas en las
que se introducen uno o más restos de aminoácidos en un sitio
predeterminado en la proteína del factor tisular diana. Muy
habitualmente, las variantes de inserción son fusiones de proteínas
o polipéptidos heterólogos al extremo amino o carboxilo terminal de
la proteína del factor tisular. Los derivados de la proteína del
factor tisular inmunogénicos se hacen fusionando un polipéptido
suficientemente grande para conferir inmunogenicidad a la secuencia
diana por entrecruzamiento in vitro o por cultivo de células
recombinantes transformadas con el ADN que codifica la fusión.
Dichos polipéptidos inmunogénicos pueden ser polipéptidos
bacterianos tales como trpLE, beta-galactosidasa y
similares.
Las variantes de deleción se caracterizan por la
eliminación de uno o más restos de aminoácidos de la secuencia de la
proteína del factor tisular. Típicamente, se delecionan no más de
aproximadamente 2 a 6 restos en un sitio cualquiera de la molécula
de proteína del factor tisular, aunque se emprenderá la deleción de
los restos -31 a -1 incluidos para obtener una
met-proteína del factor tisular, una variante
adaptada para la expresión directa intracelular de la
met-proteína del factor tisular madura. Otra
variante de deleción es la del dominio transmembrana localizado a
aproximadamente 220 a 242 restos de la molécula de proteína del
factor tisular.
Estas variantes generalmente se preparan por
mutagénesis específica de sitio de los nucleótidos del ADN que
codifica la proteína del factor tisular, produciendo de este modo el
ADN que codifica la variante, y expresando después el ADN en el
cultivo celular recombinante. Sin embargo, los fragmentos de la
variante de la proteína del factor tisular que tienen hasta
aproximadamente 100-150 restos pueden prepararse
adecuadamente por síntesis in vitro. Las variantes muestran
típicamente la misma actividad biológica cualitativa que el análogo
de origen natural, aunque las variantes también se seleccionan para
modificar las características de la proteína del factor tisular como
se describirá más completamente a continuación.
Aunque el sitio para introducir una variación de
la secuencia de aminoácidos está predeterminado, la mutación per
se no necesita estar predeterminada. Por ejemplo, para optimizar
el rendimiento de una mutación en un sitio dado, se puede realizar
mutagénesis aleatoria en el codón o región diana y explorar las
variantes de la proteína del factor tisular expresadas para la
combinación óptima de actividad deseada. Las técnicas para hacer
mutaciones de sustitución en sitios predeterminados en ADN que tiene
una secuencia conocida, son bien conocidas, por ejemplo mutagénesis
con cebador M13.
Las sustituciones de aminoácidos son típicamente
de restos individuales; las inserciones serán normalmente del orden
de aproximadamente 1 a 10 restos de aminoácidos; y las deleciones
variarán de aproximadamente 1 a 30 restos. Las deleciones o
inserciones se hacen preferiblemente en pares adyacentes, es decir,
una deleción de 2 restos o una inserción de 2 restos. Las
sustituciones, deleciones, inserciones o cualquier combinación de
las mismas pueden combinarse para alcanzar una construcción final.
Obviamente, las mutaciones que se realizarán en el ADN que codifica
la variante de la proteína del factor tisular no deben situar la
secuencia fuera de la fase de lectura y preferiblemente no crearán
regiones complementarias que podrían producir una estructura de ARNm
secundaria (documento EP 75.444A).
Las variantes de sustitución son aquellas en las
que al menos un resto en la secuencia de la Fig. 2 se ha eliminado y
en su lugar se ha insertado un resto diferente. Dichas sustituciones
se hacen generalmente de cuerdo con la siguiente Tabla 1 cuando se
desea modular finamente las características de la proteína del
factor tisular.
Resto Original | Sustituciones Ejemplares |
Ala | \hskip0,3cm ser |
Arg | \hskip0,3cm lys |
Asn | \hskip0,3cm gln; his |
Asp | \hskip0,3cm glu |
Cys | \hskip0,3cm ser |
Gln | \hskip0,3cm asn |
Glu | \hskip0,3cm asp |
Gly | \hskip0,3cm pro |
His | \hskip0,3cm asn; gln |
Ile | \hskip0,3cm leu; val |
Leu | \hskip0,3cm ile; val |
Lys | \hskip0,3cm arg; gln; glu |
Met | \hskip0,3cm leu; ile |
Phe | \hskip0,3cm met; leu; tyr |
Ser | \hskip0,3cm thr |
Thr | \hskip0,3cm ser |
Trp | \hskip0,3cm tyr |
Tyr | \hskip0,3cm trp; phe |
Val | \hskip0,3cm ile; leu |
Se hace cambios sustanciales en la función o la
identidad inmunológica seleccionando sustituciones que son menos
conservativas que las de la Tabla 1, es decir, seleccionando restos
que difieran más significativamente en su efecto sobre el
mantenimiento de (a) la estructura del esqueleto polipeptídico en el
área de la sustitución, por ejemplo, en forma de una conformación en
lámina o helicoidal, (b) la carga o la hidrofobicidad de la molécula
en el sitio diana o (c) el volumen de la cadena lateral. Las
sustituciones que en general se espera que produzcan los cambios más
grandes en las propiedades de la proteína del factor tisular serán
aquellas en las que (a) un resto hidrófilo, por ejemplo, serilo o
treonilo, se sustituye por (o mediante) un resto hidrófobo, por
ejemplo, leucilo, isoleucilo, fenilalanilo, valilo o alanilo; (b)
una cisteína o prolina se sustituye por (o mediante) cualquier otro
resto; (c) un resto que tiene una cadena lateral electropositiva,
por ejemplo, lisilo, arginilo, o histidilo, se sustituye por (o
mediante) un resto electronegativo, por ejemplo, glutamilo o
aspartilo; o (d) un resto que tiene una cadena lateral voluminosa,
por ejemplo, fenilalanina, se sustituye por (o mediante) uno que no
tiene una cadena lateral, por ejemplo, glicina.
Una clase principal de variantes de sustitución o
deleción son aquellas que implican la región transmembrana, es
decir, hidrófoba o lipófila, de la proteína del factor tisular. La
región transmembrana de la proteína del factor tisular está
localizada a aproximadamente 220 a 242 restos de la proteína
codificada por el ADN de tejidos adiposos humanos. Esta región es un
dominio altamente hidrófobo o lipófilo que tiene el tamaño apropiado
para abarcar la bicapa lipídica de la membrana celular. Se cree que
la proteína del factor tisular se ancla a la membrana celular.
La deleción o sustitución de los dominios
transmembrana facilitarán la recuperación y proporcionarán una forma
soluble de la proteína del factor tisular recombinante reduciendo su
afinidad celular o por los lípidos de la membrana y mejorando su
solubilidad en agua de manera que no se requerirán detergentes para
mantener la proteína del factor tisular en solución acuosa.
Preferiblemente, el dominio transmembrana se elimina, en lugar de
sustituirlo para evitar la introducción de epítopos potencialmente
inmunogénicos. Una ventaja de la proteína del factor tisular con el
dominio transmembrana eliminado es que se secreta más fácilmente al
medio de cultivo. Esta variante es soluble en agua y no tiene una
afinidad apreciable por los lípidos de la membrana celular,
simplificando considerablemente de este modo su recuperación del
cultivo celular recombinante.
Las mutagénesis de sustitución o deleción pueden
emplearse para eliminar los sitios de glicosilación unidos a N u O
(por ejemplo, por deleción o sustitución de restos asparaginilo en
sitios de glicosilación Asn-X-Thr),
mejorar la expresión de la proteína del factor tisular o alterar la
vida media de la proteína. Como alternativa, se puede producir una
proteína del factor tisular no glicosilada en un cultivo de células
procariotas recombinantes. También pueden ser deseables deleciones o
sustituciones de cisteína u otros restos lábiles, por ejemplo para
aumentar la estabilidad oxidativa o para seleccionar el ordenamiento
del enlace disulfuro preferido de la proteína del factor tisular.
Uno de dichos ejemplos de sustitución de cisteína es la sustitución
de la cisteína por una serina en la posición 245. Las deleciones o
sustituciones de sitios de proteolisis potenciales, por ejemplo, Arg
Arg, se consigue por ejemplo delecionando uno de los restos básicos
o sustituyendo uno por restos de glutaminilo o histidilo.
Se entiende que un aislado de ADN significa ADN,
ADNc o ADN genómico sintetizado químicamente con o sin las regiones
3' y/o 5' flanqueantes. El ADN que codifica la proteína del factor
tisular se obtiene a partir de fuentes distintas de la humana a)
obteniendo una biblioteca de ADNc de la placenta, tejidos adiposos u
otros tejidos que contienen ARNm de la proteína del factor tisular,
tal como cerebro, del animal particular, b) realizando análisis de
hibridación con ADN marcado que codifica la proteína del factor
tisular humano o fragmentos de la misma (normalmente, mayor de 100
pb) para detectar clones en la biblioteca de ADNc que contienen
secuencias homólogas, y c) analizando los clones por análisis con
enzimas de restricción y secuenciación de ácidos nucleicos para
identificar clones de longitud completa. Si los clones de longitud
completa no están presentes en la biblioteca, entonces pueden
recuperarse fragmentos apropiados a partir de los diversos clones
usando la secuencia de ácidos nucleicos descrita por primera vez en
la presente invención y ligarse en sitios de restricción habituales
a los clones para ensamblar un clon de longitud completa que
codifica la proteína del factor tisular.
El uso de la molécula de proteína del factor
tisular con modificaciones Covalentes se incluyen en el alcance de
la invención. Dichas modificaciones se hacen haciendo reaccionar
restos de aminoácidos diana de la proteína recuperada con un agente
de derivatización orgánica que es capaz de reaccionar con las
cadenas laterales o los restos terminales seleccionados. Como
alternativa, se puede usar una modificación
post-traduccional en células hospedadoras
recombinantes seleccionadas para modificar la proteína. Los
derivados covalentes resultantes son útiles como inmunógenos o para
identificar restos importantes para la actividad biológica así como
para alterar las características farmacológicas de la molécula,
tales como vida media, afinidad de unión y similares, como sabría un
especialista en la técnica.
Ciertas derivatizaciones
post-traduccionales son el resultado de la acción de
células hospedadoras recombinantes sobre el polipéptido expresado.
Los restos de glutaminilo y asparaginilo se desaminan frecuentemente
de manera post-traduccional a los correspondientes
restos de glutamilo y aspartilo. Como alternativa, estos restos se
desaminan en condiciones ligeramente ácidas. Cualquier forma de
estos restos pertenece al alcance de esta invención.
Otras modificaciones
post-traduccionales incluyen hidroxilación de
prolina y lisina, fosforilación de grupos hidroxilo de restos de
serilo o treonilo, metilación de grupos
\alpha-amino de las cadenas laterales de lisina,
arginina e histidina (T.E. Creighton, Proteins: Structure and
Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco
páginas 79-86 [1983]), acetilación del amino
N-terminal y, en algunos casos, amidación del
carboxilo C-terminal.
Cuando se usa "forma esencialmente libre" o
"esencialmente pura" para describir el estado de la proteína
del factor tisular producido para su uso en la invención significa
que está libre de proteína u otros materiales normalmente asociados
a la proteína del factor tisular en su medio fisiológico in
vivo como por ejemplo cuando la proteína del factor tisular se
obtiene a partir de sangre y/o tejidos por extracción y
purificación. Otros materiales incluyen organismos infecciosos tales
como, por ejemplo, el agente causante del síndrome de
inmunodeficiencia adquirida (SIDA). La proteína del factor tisular
producida por el método de la presente invención tiene una pureza
mayor o igual al 95%.
En general, se usan procariotas para clonar
secuencias de ADN en la construcción de los vectores útiles en la
invención. Por ejemplo, es particularmente útil la cepa 294 de E.
coli K12 (ATCC Nº 31446). Otras cepas microbianas que pueden
usarse incluyen E. coli B y E. coli X1776 (ATCC Nº
31537). Estos ejemplos son ilustrativos en lugar de limitantes.
También se pueden usar procariotas para la
expresión. Se pueden usar las cepas mencionadas, así como E.
coli W3110 (F^{-}, \lambda^{-}, prototrófica, ATTC Nº
27325), bacilos tales como Bacillus subtilis, y otras
enterobacteriaceae tales como Salmonella typhimurium o
Serratia marcescans, y diversas especies de pseudomonas.
En general, con estos hospedadores se usan
vectores plasmídicos que contienen promotores y secuencias de
control que se obtienen de especies compatibles con la célula
hospedadora. Generalmente el vector tiene un sitio de replicación
así como una o más secuencias marcadoras que son capaces de
proporcionar selección fenotípica en células transformadas. Por
ejemplo, E. coli típicamente se transforma usando un derivado
de pBR322 que es un plásmido obtenido de una especie de E.
coli (Bolivar, et al., Gene 2: 95 [1977]). pBR322
contiene genes de resistencia a ampicilina y tetraciclina y de ese
modo proporciona un medio fácil para identificar las células
transformadas. El plásmido pBR322, u otro plásmido microbiano
también debe contener o estar modificado para que contenga
promotores y otros elementos de control habitualmente usados en la
construcción de ADN recombinante.
Los promotores apropiados para su uso con
hospedadores procariotas incluyen de manera ilustrativa los sistemas
promotores de la \beta-lactamasa y de la lactosa
(Chang et al., "Nature", 275: 615 [1978]; y
Goeddel et al., "Nature" 281: 544 [1979]), de la
fosfatasa alcalina, el sistema promotor del triptófano (trp)
(Goeddel "Nucleic Acids Res." 8: 4057 [1980] y
Publicación de la Solicitud EPO Nº 36.776) y promotores híbridos
tales como el promotor tac (H. de Boer et al., "Proc. Natl.
Acad. Sci. USA" 80: 21-25 [1983]). Sin
embargo, son apropiados otros promotores bacterianos funcionales.
Sus secuencias de nucleótidos son generalmente conocidas,
permitiendo de este modo al especialista en la técnica unirlas de
manera operativa al ADN que codifica la proteína del factor tisular
usando enlazadores o adaptadores para suministrar cualquier sitio de
restricción necesario (Siebenlist et al., "Cell"
20: 269 [1980]). Los promotores para su uso en sistemas
bacterianos también contendrán una secuencia
Shine-Dalgarno (S.D.) unida de manera operativa al
ADN que codifica la proteína del factor tisular.
Además de procariotas, también se pueden usar
microbios eucariotas tales como cultivos de levaduras.
Saccharomyces cerevisiae, o la levadura panadera común es el
microorganismo eucariota más habitualmente usado, aunque están
disponibles habitualmente varias cepas distintas. Para la expresión
en Saccharomyces, se usa habitualmente el plásmido YRp7, por
ejemplo (Stinchcomb, et al., Nature 282: 39 [1979];
Kingsman et al., Gene 7: 141 [1979]; Tschemper et
al., Gene 10: 157 [1980]). Este plásmido ya contiene el
gen trpI que proporciona un marcador de selección para una cepa
mutante de levadura que carece de la capacidad para crecer en
triptófano, por ejemplo ATCC Nº 44076 o PEP4-1
(Jones, Genetics 85: 12 [1977]). La presencia de la lesión
trpI como característica del genoma de la célula hospedadora de
levadura proporciona, por tanto, un medio eficaz de selección por
crecimiento en ausencia de triptófano.
Las secuencias promotoras apropiadas para su uso
con hospedadores de levadura incluyen los promotores de la
3-fosfoglicerato quinasa (Hitzeman et al.,
"J. Biol. Chem." 225: 2073 [1980]) u otras enzimas
glucolíticas (Hess et al., "J. Adv. Enzyme Reg."
7: 149 [1968]; y Holland, "Biochemistry" 17: 4900
[1978]), tales como la enolasa,
gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato descarboxilasa,
fosfofructoquinasa,
glucosa-6-fosfato isomerasa,
3-fosfoglicerato mutasa, piruvato quinasa,
triosafosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa, y glucoquinasa.
Otros promotores de levaduras, que son promotores
inducibles que tienen la ventaja adicional de la transcripción
controlada por las condiciones de crecimiento, son las regiones
promotoras de la alcohol deshidrogenasa 2, isocitocromo C, fosfatasa
ácida, las enzimas degradantes asociadas al metabolismo del
nitrógeno, la metalotioneína,
gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa, y las enzimas responsables de la utilización de
maltosa y galactosa. Los vectores y promotores apropiados para su
uso en la expresión de levaduras se describen adicionalmente en R.
Hitzeman et al., Publicación de Patente Europea Nº 73.657A.
Los potenciadores de levaduras también se usan ventajosamente con
los promotores de levaduras.
Los promotores preferidos que controlan la
transcripción de vectores en células hospedadoras de mamífero pueden
obtenerse a partir de diversas fuentes, por ejemplo, los genomas de
virus tales como: polioma, Virus del Simio 40 (SV40), adenovirus,
retrovirus, virus de la hepatitis-B y más
preferiblemente citomegalovirus, o a partir de promotores de
mamífero heterólogos, por ejemplo el promotor de la beta actina. Los
promotores tempranos y tardíos del virus SV40 se obtienen
adecuadamente en forma de un fragmento de restricción de SV40 que
también contiene el origen de replicación viral de SV40. Fiers et
al., Nature, 273: 113 (1978). El promotor temprano
inmediato de citomegalovirus humano se obtiene adecuadamente en
forma de un fragmento de restricción HindIII E. Greenaway, P.J.
et al., Gene 18: 355-360 (1982). Por
supuesto, también son útiles en este documento promotores de la
célula hospedadora o especies relacionadas.
La transcripción de un ADN que codifica la
proteína del factor tisular por eucariotas superiores se aumenta
insertando una secuencia potenciadora en el vector. Los
potenciadores son elementos de ADN que funcionan en configuración
cis, normalmente de aproximadamente 10 a 300 pb, que funcionan sobre
un promotor para aumentar su capacidad de iniciación de la
transcripción. Los potenciadores son relativamente independientes de
la orientación y la posición habiéndose encontrado 5' (Laimins, L.
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 78: 993 [1981]) y 3'
(Lusky, M.L., et al., Mol. Cell Bio. 3: 1108 [1983])
con respecto a la unidad de transcripción, dentro de un intrón
(Banerji, J.L. et al., Cell 33: 729 [1983]) así como
también dentro de la secuencia codificante en sí misma (Osborne,
T.F., et al., Mol. Cell Bio. 4: 1293 [1984]). Ahora se
conocen muchas secuencias potenciadoras de genes de mamífero
(globina, elastasa, albúmina, \alpha-fetoproteína
e insulina). Típicamente, sin embargo, se usará un potenciador de un
virus de células eucariotas. Los ejemplos incluyen el potenciador de
SV40 del lado tardío del origen de replicación
(100-270 pb), el potenciador del promotor temprano
de citomegalovirus, el potenciador del polioma del lado tardío del
origen de replicación, y potenciadores de adenovirus.
Los vectores de expresión usados en células
hospedadoras eucariotas (células nucleadas de levaduras, fúngicas,
de insecto, vegetales, animales o humanas) también pueden contener
secuencias necesarias para la terminación de la transcripción que
pueden afectar a la expresión del ARNm. Estas regiones se
transcriben como segmentos poliadenilados en la porción no traducida
del ARNm que codifica la proteína del factor tisular. Las regiones
3' no traducidas también incluyen sitios de terminación de la
transcripción.
Los vectores de expresión pueden contener un gen
de selección, también denominado un marcador seleccionable. Los
ejemplos de marcadores seleccionables apropiados para células de
mamífero son la dihidrofolato reductasa (DHFR), timidina quinasa o
neomicina. Cuando dichos marcadores seleccionables se transfieren
con éxito a una célula hospedadora de mamífero, la célula
hospedadora de mamífero transformada puede sobrevivir si se coloca
bajo presión selectiva. Hay dos categorías distintas de regímenes
selectivos ampliamente usadas. La primera categoría se basa en el
metabolismo de la célula y el uso de una línea celular mutante que
carece de la capacidad de crecer independiente de un medio
suplementado. Dos ejemplos son: las células CHO DHFR^{-} y las
células LTK^{-} de ratón. Estas células carecen de capacidad de
crecer sin la adición de nutrientes tales como timidina o
hipoxantina. Debido a que estas células carecen de ciertos genes
necesarios para una vía de síntesis de nucleótidos completa, no
pueden sobrevivir a menos que los nucleótidos ausentes se
proporcionen en un medio suplementado. Una alternativa a suplementar
el medio es introducir un gen DHFR o TK intacto en las células que
carecen de los genes respectivos, alterando de ese modo sus
requisitos de crecimiento. Las células individuales que no se
transformaron con el gen DHFR o TK no serán capaces de sobrevivir en
medios no suplementados.
La segunda categoría es la selección dominante
que se refiere a un esquema de selección usado en cualquier tipo de
célula y no requiere el uso de una línea celular mutante. Estos
esquemas típicamente usan un fármaco para detener el crecimiento de
una célula hospedadora. Aquellas células que tienen un gen nuevo
expresarían una proteína que transmite resistencia al fármaco y
sobreviviría a la selección. Los ejemplos de dicha selección
dominante usan los fármacos neomicina, Southern P. and Berg, P., J.
Molec. Appl. Genet. 1: 327 (1982), ácido micofenólico,
Mulligan, R.C. and Berg, P. Science 209: 1422 (1980) o
higromicina, Sugden, B. et al., Mol. Cell. Biol. 5:
410-413 (1985). Los tres ejemplos dados
anteriormente emplean genes bacterianos bajo control eucariota para
transmitir resistencia al fármaco apropiado G418 o neomicina
(geneticina), xgpt (ácido micofenólico) o higromicina,
respectivamente.
"Amplificación" se refiere al incremento o
replicación de una región aislada dentro del ADN cromosómico de una
célula. La amplificación se consigue usando un agente de selección
por ejemplo, metotrexato (MTX) que inactiva la DHFR. La
amplificación o preparación de sucesivas copias del gen DHFR da como
resultado mayores cantidades de DHFR que se están produciendo frente
a mayores cantidades de MTX. La presión de amplificación se aplica a
pesar de la presencia de DHFR endógena, añadiendo cantidades siempre
mayores de MTX al medio. La amplificación de un gen deseado puede
conseguirse cotransfectando una célula hospedadora de mamífero con
un plásmido que tiene un ADN que codifica una proteína deseada y el
gen de la DHFR o de la amplificación que permite la cointegración.
Se asegura que la célula necesite más DHFR, cuya necesidad se
satisface por la replicación del gen de selección, seleccionando
solamente las células que pueden crecer en presencia de una
concentración de MTX siempre mayor. Mientras el gen que codifica una
proteína heteróloga deseada está cointegrado con el gen de
selección, la replicación génica de este gen da lugar a la
replicación del gen que codifica la proteína deseada. El resultado
es ese aumento de copias del gen, es decir, un gen amplificado, que
codifica la proteína heteróloga deseada expresa más de la proteína
heteróloga deseada.
Las células hospedadoras apropiadas preferidas
para expresar los vectores de esta invención que codifican la
proteína del factor tisular en eucariotas superiores incluyen: la
línea CVI de riñón de mono transformada con SV40
(COS-7, ATCC CRL 1651); la línea de riñón
embrionario humano (293, Graham, F.L. et al. J. Gen Virol.
36: 59 [1977]); células de riñón de cría de hámster (BHK,
ATCC CCL 10); células de ovario de hámster
chino-DHFR (CHO, Urlaub and Chasin, Proc. Natl.
Acad. Sci. (USA) 77: 4216, [1980]); células de sertoli de
ratón (TM4, Mather, J.P., Biol. Reprod. 23:
243-251 [1980]); células de riñón de mono (CV1 ATCC
CCL 70); células de riñón de mono verde africano
(VERO-76, ATCC CRL-1587); células de
carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); células de riñón
canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de hígado de rata búfalo (BRL
3A, ATCC CRL 1442); células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75);
células de hígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor de mama de ratón
(MMT 060562, ATCC CCL51); y, células TRI (Mather, J.P. et
al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383: 44-68
[1982]).
"Transformación" significa introducir ADN en
un organismo de manera que el ADN sea replicable, en forma elemento
extracromosómico o por integración cromosómica. A menos que se
indique lo contrario, el método usado en este documento para la
transformación de células hospedadoras es el método de Graham, F.
and van der Eb, A., Virology 52: 456-457
(1978). Sin embargo, también se pueden usar otros métodos para
introducir ADN en células tales como por inyección nuclear o por
fusión de protoplastos. Si se usan células procariotas o células que
contienen construcciones de pared celular sustanciales, el método
preferido de transfección es el tratamiento con calcio usando
cloruro de calcio como se describe por Cohen, F.N. et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 69: 2110 (1972).
La construcción de vectores apropiados que
contienen las secuencias codificantes y de control deseadas emplea
técnicas de ligamiento convencionales. Los plásmidos aislados o los
fragmentos de ADN se escinden, se adaptan, y se religan en la forma
deseada para formar los plásmidos necesarios.
Para el análisis para confirmar las secuencias
correctas en los plásmidos construidos, se usan mezclas de
ligamiento para transformar la cepa 294 de E. coli K12 (ATCC
31446) y se seleccionan los transformantes con éxito por resistencia
ampicilina o tetraciclina donde sea apropiado. Se preparan plásmidos
a partir de los transformantes, se analizan por restricción y/o se
secuencian por el método de Messing et al., Nucleic Acids
Res. 9: 309 (1981) o por el método de Maxam et al.,
Methods in Enzymology 65: 499 (1980).
Las células hospedadoras se pueden transformar
con los vectores de expresión de esta invención y cultivar en medios
nutrientes convencionales modificados según sea apropiado para
inducir promotores, seleccionar transformantes o amplificar genes.
Las condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH y similares,
son las previamente usadas con la célula hospedadora seleccionada
para la expresión, y serán evidentes para el especialista en la
técnica.
"Transfección" se refiere a la captación de
un vector por una célula hospedadora se exprese de hecho o no
cualquier secuencia codificante. Se conocen varios métodos de
transfección por el especialista en la técnica, por ejemplo,
CaPO_{4} y electroporación. La transfección con éxito se reconoce
generalmente cuando sucede cualquier indicio de la operación de este
vector dentro de la célula hospedadora.
Para facilitar la comprensión de los siguientes
ejemplos se describirán ciertos métodos y/o términos que se
encuentran con frecuencia.
Los "plásmidos" se designan por una p
minúscula precedida y/o seguida de letras mayúsculas y/o números.
Los plásmidos de partida en este documento están disponibles en el
mercado, disponible por el público en una base no restringida, o
pueden construirse a partir de plásmidos disponibles de acuerdo con
procedimientos publicados. Además, se conocen en la técnica
plásmidos equivalentes a los descritos y serán evidentes para el
especialista en la técnica.
"Digestión" de ADN se refiere a la escisión
catalítica del ADN con una enzima de restricción que funciona sólo
en ciertas secuencias del ADN. Las diversas enzimas de restricción
usadas en este documento están disponibles en el mercado y sus
condiciones de reacción, cofactores y otras necesidades se usaron
como sabría un especialista en la técnica. Para propósitos
analíticos, se usa típicamente 1 \mug de plásmido o fragmento de
ADN con aproximadamente 2 unidades de enzima en aproximadamente 20
\mul de solución tampón. Para el propósito de aislar los
fragmentos de ADN para la construcción del plásmido, se digieren
típicamente de 5 a 50 \mug de ADN con 20 a 250 unidades de enzima
en un volumen mayor. Los tampones y las cantidades de sustrato
apropiados para las enzimas de restricción particulares se
especifican por el fabricante. Generalmente se usan tiempos de
incubación de aproximadamente 1 hora a 37ºC, pero pueden variar de
acuerdo con las instrucciones del proveedor. Después de la
digestión, la reacción se somete a electroforesis directamente en
gel de poliacrilamida para aislar el fragmento deseado.
"Recuperación" o "aislamiento" de un
fragmento de ADN dado de un producto de digestión con enzimas de
restricción significa la separación del producto de digestión en gel
de poliacrilamida o agarosa por electroforesis, la identificación
del fragmento de interés por comparación de su movilidad frente a la
de los fragmentos de ADN marcadores de peso molecular conocido, la
retirada de la sección del gel que contiene el fragmento deseado, y
la separación del gel del ADN. Este procedimiento es generalmente
conocido (Lawn, R. et al., Nucleic Acids Res. 9:
6103-6114 [1981], y Goeddel, et al., Nucleic
Acids Res. 8: 4057 [1980]).
"Desfosforilación" se refiere a la
eliminación de los fosfatos 5' terminales por tratamiento con
fosfatasa alcalina bacteriana (BAP). Este procedimiento evita la
"circularización" de los dos extremos escindidos por enzimas de
restricción de un fragmento de ADN o la formación de un bucle
cerrado que impediría la inserción de otro fragmento de ADN en el
sitio de restricción. Los procedimientos y reactivos para la
desfosforilación son convencionales (Maniatis, T. et al.,
Molecular Cloning, 133-134 Cold Spring
Harbor, [1982]). Las reacciones que usan BAP se realizan en Tris 50
mM a 68ºC para suprimir la actividad de cualquier exonucleasa que
pueda estar presente en las preparaciones de enzima. Las reacciones
se realizaron durante 1 hora. Después de la reacción el fragmento de
ADN se purifica en gel.
"Ligamiento" se refiere al proceso de
formación de enlaces fosfodiéster entre dos fragmentos de ácido
nucleico de doble cadena (Maniatis, T. et al., Id. en
146). A menos que se estipule otra cosa, el ligamiento puede
conseguirse usando tampones y condiciones conocidos con 10 unidades
de ADN ligasa T4 ("ligasa") por 0,5 \mug de cantidades
aproximadamente equimolares de los fragmentos de ADN a ligar.
"Rellenado" o "formación de extremos
romos" se refiere a los procedimientos por los cuales el extremo
de una cadena sencilla en el extremo cohesivo de un ácido nucleico
escindido por una enzima de restricción se convierte en una doble
cadena. Esto elimina el extremo cohesivo y forma un extremo romo.
Este proceso es una herramienta versátil para convertir un extremo
de corte por enzimas de restricción que puede ser cohesivo con los
extremos creados por una sola u unas pocas enzimas de restricción
distintas en un extremo compatible con cualquier endonucleasa de
restricción de corte romo u otro extremo cohesivo rellenado.
Típicamente, la formación de extremos romos se consigue incubando
2-15 \mug del ADN diana en MgCl_{2} 10 mM,
ditiotreitol 1 mM, NaCl 50 mM, tampón Tris 10 mM (pH 7,5) a
aproximadamente 37ºC en presencia de 8 unidades del fragmento Klenow
de la ADN polimerasa I y 250 \muM de cada uno de los cuatro
desoxinucleósidos trifosfato. La incubación termina generalmente
después de 30 minutos de extracción con fenol y cloroformo y
precipitación en etanol.
La proteína del factor tisular humano y su
producto de expresión recombinante se obtienen de acuerdo con el
siguiente protocolo:
1. Se sintetizaron químicamente sondas
oligonucleotídicas que representan un único codón de elección para
cada aminoácido correspondiente a la porción amino terminal de la
proteína del factor tisular, y el fragmento peptídico CNBr.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Se sintetizaron dos desoxioligonucleótidos
complementarios a los codones para las secuencias de aminoácidos de
la proteína del factor tisular, descritos a continuación, y se
radiomarcaron con \gamma^{32}P-ATP.
a)
y
b)
3. Se construyeron bibliotecas de ADNc cebado con
oligo (dT) en \lambdagt10.
4. Se exploró una biblioteca de ADNc de placenta
humana usando las sondas oligonucleotídicas sintetizadas
químicamente. No se obtuvieron placas positivas usando la sonda de
60 unidades (a). Se obtuvieron veintidós (22) placas positivas
usando la sonda de 81 unidades (b), la mitad de las cuales eran muy
débilmente positivas. Las once (11) mejores se eligieron para volver
a explorar para la purificación de placa. Se obtuvieron cinco placas
positivas en la segunda exploración. Se preparó el ADN a partir de
cada una de estas.
5. Se aislaron clones que tenían un ADNc total de
aproximadamente 2.800 pb de ADN inserto. Se emprendieron la
secuenciación y la caracterización de los clones de placenta. Como
el tamaño del ARNm en una transferencia de Northern fue de
aproximadamente 2,35 Kb, estos clones pueden tener contenidos
intrones sin eliminar. Por lo tanto se exploró una biblioteca de
tejido adiposo humano.
6. Se exploró una biblioteca de tejido adiposo
humano cebada con oligo (dT) usando un fragmento EcoRI de
1.400 pb de uno de los clones de placenta.
7. Se aislaron clones que tenían un ADNc total de
aproximadamente 2350 pb (incluyendo 150 a 200 pb para la cola poliA)
y 1800 pb de ADN inserto. Se secuenciaron los clones que contenían
2350 pb y que se suponía que contenían todo el ARNm del factor
tisular.
8. Se construye el ADNc de longitud completa que
codifica la proteína del factor tisular humano en un plásmido. Debe
apreciarse que el conocimiento de la secuencia de ADN completa de la
Fig. 2 posibilita preparar sondas extremadamente largas que tienen
una homología perfecta con el ADNc de la proteína del factor tisular
humano, simplificando, de este modo, considerablemente y aumentando
la eficacia del sondeo de bibliotecas de ADNc o genómicas de otras
especies, y haciendo posible prescindir de la purificación de la
proteína del factor tisular, de la secuenciación y de la preparación
de conjuntos de sondas.
9. Después se construye el ADNc que codifica la
proteína del factor tisular humano en un vehículo de expresión que
se usa para transformar una célula hospedadora apropiada, que
después se hace crecer en un cultivo para producir la proteína del
factor tisular deseada.
10. La proteína del factor tisular biológicamente
activa que se produce de acuerdo con el procedimiento anterior tiene
263 aminoácidos.
Los siguientes ejemplos solamente ilustran el
mejor modo contemplado hoy en día para poner en práctica la
invención, pero no deben considerarse limitantes de la
invención.
El ADN que codifica la proteína del factor
tisular puede obtenerse por síntesis química cuando se conoce la
secuencia de ADN completa, explorando los transcritos inversos de
ARNm de diversos tejidos, o explorando bibliotecas genómicas de
cualquier célula. Como no se conocían ni la secuencia completa de
aminoácidos ni la de ADN de la proteína del factor tisular en el
momento de esta invención, no fue posible la síntesis química de la
secuencia de ADN completa que codifica la proteína del factor
tisular.
Se preparó una biblioteca de ADNc de placenta
humano como se ha descrito previamente (Ullrich, A. et al.,
Nature 309: 418-425 [1984]). Se preparó un
ADNc de doble cadena a partir de ARN de tejido adiposo humano usando
la transcriptasa inversa de un modo conocido y, después de
tratamiento con ARNasa H de E. coli se usó ADN polimerasa I
para sintetizar la segunda cadena y después se ligó a
oligonucleótidos sintéticos que contenían sitios de restricción para
SalI, SstI, XhoI y un extremo saliente
EcoRI, como se ha descrito previamente (Gubler, U. and
Hoffman, B.J., Gene 25: 263 [1983]). Este ADN se insertó en
el sitio EcoRI de \lambdagt10 (Huynh, T. et al.,
DNA Cloning Techniques [ed. Grover, D.][1984]).
Se diseñaron dos sondas oligonucleotídicas que
representaban una posible elección de codón para cada aminoácido de
la secuencia de aminoácidos N-terminal (60
nucleótidos) y la secuencia de aminoácidos interna próxima al
extremo C-terminal (81 nucleótidos) y se
sintetizaron en base a las siguientes secuencias de aminoácidos
presentadas en una reunión de la American Heart Association como se
ha mencionado anteriormente:
Se obtuvieron clones de ADNc de la proteína del
factor tisular usando las sondas de ADN primero para explorar una
biblioteca de ADNc de placenta humana. Se usó un fragmento
EcoRI de 1400 pb de un clon de placenta para explorar una
biblioteca de ADNc de tejido adiposo humano.
Se hicieron crecer aproximadamente 1 millón de
fagos a partir de la biblioteca de ADNc de placenta humana cebado
con oligo(dT) en \lambdagt10 en veinticinco (25) placas
Petri de 15 cm a partir de los cuales se recogieron filtros de
nitrocelulosa por triplicado. Los filtros se hibridaron con cada una
de las sondas oligonucleotídicas marcadas en el extremo con ^{32}P
en NaCl 0,75 M, citrato trisódico 75 mM, fosfato sódico 50 mM (pH
6,8), solución de Denhardt 5X, formamida al 20 por ciento, sulfato
de dextrano al 10 por ciento y 0,2 g/l de ADN de esperma de salmón
sonicado y hervido a 42ºC durante una noche y lavado durante 2 horas
en NaCl 0,30 M, citrato trisódico 30 mM, NaDodSO_{4} al 0,1 por
ciento a 42ºC. Se observaron veintidós (22) positivos duplicados de
hibridación con los filtros hibridados con la sonda próxima al
extremo C-terminal de la proteína del factor
tisular. Se escogieron los once (11) mejores para la purificación en
placa. La sonda del extremo amino terminal de la proteína del factor
tisular no logró hibridar. Cinco clones fueron positivos después de
la purificación en placa. Se preparó ADN a partir de cada uno de
estos y después se analizó por digestión con EcoRI. Un clon
era más corto y parecía ser un clon parcial. Cuatro clones que eran
idénticos en base a un producto digerido con EcoRI fueron los
mejores candidatos para clones de ADNc de longitud completa. Los
fragmentos EcoRI de tres de los clones, el clon parcial y dos
de los supuestos clones de longitud completa, se subclonaron en
vectores del fago M13 para la secuenciación del ADN por terminación
de cadena didesoxi (Messing, J. et al., Nucleic Acids Res.
9: 309-321 [1981]).
Se hibridó un fragmento EcoRI de 1400 pb
de un clon de ADNc de placenta a una transferencia de Northern a la
que se había unido ARNm. Se determinó que el tamaño del ARNm de la
proteína del factor tisular fue de aproximadamente 2,35 kb en las
muestras de placenta que fueron positivas en el ensayo. Los clones
de ADNc de placenta tenían una longitud de aproximadamente 2800 pb
incluyendo los nucleótidos correspondientes a la cola poliA del
ARNm. Estos clones eran aproximadamente 450 pb más largos que la
longitud del ARNm observado en la transferencia de Northern. Se
observaron codones de terminación y codones de metionina en las tres
fases de lectura inmediatamente cadena arriba del ADN que codifica
el extremo amino terminal de la proteína, sugiriendo la ausencia de
una secuencia señal. La carencia de una secuencia señal
inmediatamente 5' de la secuencia que representa el extremo NH_{2}
terminal de la proteína madura en los clones de placenta se confirmó
por comparación con los clones de tejido adiposo descritos a
continuación. También se determinó por comparación de las secuencias
de placenta y tejido adiposo que los clones de placenta contenían
una secuencia intermedia o intrón no presente en el clon de tejido
adiposo. La presencia del intrón en el clon de placenta sugiere un
mal mecanismo de corte y empalme en la placenta haciendo del
aislamiento y la clonación del ADN de la
pre-proteína del factor tisular una tarea muy
difícil.
Debido a la discrepancia de longitud entre los
clones de placenta aislados y el ARNm determinado en la
transferencia de Northern, también se aisló el ADNc de la proteína
del factor tisular a partir de una biblioteca de tejido adiposo. Se
eligió una biblioteca de ADNc de tejido adiposo construida en
\lambdagt10 porque el tejido adiposo tiene cantidades de ARNm del
factor tisular comparables al tejido placentario. La biblioteca se
exploró usando un fragmento EcoRI de 1400 pb de un clon de
placenta radiomarcado con \gamma^{32}P-ATP en
condiciones más rigurosas que las usadas para explorar la biblioteca
de placenta. (Las condiciones anteriores se modificaron para usar
formamida al 50% en la hibridación; y el lavado en NaCl 0,03 M,
citrato trisódico 3 mM, NaDodSO_{4} al 0,1 por ciento, a 60ºC). Se
obtuvieron catorce dobles positivos de intensidades variadas. Se
eligieron doce para purificación en placa. Después de volver a
explorar para la purificación en placa, se obtuvieron 8 dobles
positivos fuertes. Se preparó ADN a partir de cada uno de estos
positivos. Cuatro de estos, que fueron idénticos después de la
digestión con EcoRI, fueron los mejores candidatos para
clones de ADNc de longitud completa. Uno de estos se eligió para el
análisis por secuenciación de ADN y \lambdaTF14 marcado. El tamaño
de estos clones fue aproximadamente de 2350 pb, incluyendo la
longitud de la cola poliA. Este fue el mismo tamaño que el observado
en la transferencia de Northern como se ha descrito anteriormente.
Un quinto clon fue más corto que los clones de 2350 pb descritos
anteriormente.
Dos de los clones de ADNc de tejido adiposo eran
más cortos que el ARNm de longitud completa (aproximadamente 1800
pb) y tenían patrones de digestión con EcoRI que eran
marcadamente diferentes de los supuestos clones de longitud
completa. El análisis de estos clones indica que son clones
parciales ya que incluyen el ADN correspondiente a una porción del
ARNm de la proteína del factor tisular. El octavo clon tenía sólo
aproximadamente 850 pb y no se eligió para análisis adicional.
La secuencia de nucleótidos del ADNc de la
proteína del factor tisular se muestra en la Fig. 2. De los cuatro
clones de tejido adiposo que tenían un patrón de digestión con
EcoRI idéntico, uno se secuenció completamente y correspondía
a la secuencia mostrada en la Figura 2. El clon \lambdaTF14
contiene aproximadamente 2217 pb de inserto, que incluye
aproximadamente 90 nucleótidos de la cola poli(A) (que no se
muestra en la Fig. 2). La secuencia de ADNc contiene 99 pb de la
secuencia 5' no traducida. El patrón de digestión con EcoRI
del supuesto clon de longitud completa comprendía tres fragmentos de
aproximadamente 900, 750 y 650 pb. Un quinto clon parecía diferir en
el patrón de digestión con EcoRI en el fragmento del extremo
5'. Dos de los clones de tejido adiposo tenían un patrón de
digestión con EcoRI que indicaba que eran más cortos que los
clones de longitud completa pero aún contenían un fragmento
EcoRI más largo que cualquier fragmento de los clones de
longitud completa. Esto puede deberse a un polimorfismo de
EcoRI o a la presencia de un intrón. El clon más largo se
secuenció por completo. La integridad de la secuencia codificante se
evaluó a partir de la presencia de una larga fase de lectura abierta
que comenzaba con un codón de inicio, ATG. Después del codón
iniciador ATG están los codones para una secuencia líder hidrófobo o
señal.
El extremo 5' del ADNc contiene un codón de
inicio ATG, para el aminoácido metionina, seguido de una fase de
lectura abierta continua que codifica un polipéptido de 295
aminoácidos. Los primeros 32 restos aminoácidos son en su mayor
parte aminoácidos hidrófobos y probablemente representan un péptido
señal amino-terminal. La secuencia
amino-terminal que sigue corresponde a la secuencia
de la proteína del factor tisular purificada del tejido. La
secuencia de ADNc predice que la proteína del factor tisular madura
contiene 263 aminoácidos con un peso molecular calculado de
aproximadamente 29.500. Se sabe que la proteína del factor tisular
es una glicoproteína de membrana con una masa molecular relativa de
42.000 a 53.000 en geles de poliacrilamida-SDS. La
secuencia de ADN traducida predice cuatro (4) sitios de
glicosilación unidos a asparagina. El perfil hidropático de la
proteína (Fig. 5) revela que los tres primeros de estos sitios se
localizan en regiones hidrófilas, aumentando la probabilidad de que
estén en la superficie de la proteína y de hecho glicosilados. Del
mismo modo, un grupo de 7 a 13 restos (aminoácidos
160-172) que son serina o treonina, que indican
posibles sitios de glicosilación unida a O, también pertenece a una
región de hidrofilicidad predicha. El perfil hidropático también
revela un grupo notable de restos hidrófobos cerca del extremo
carboxi terminal (Fig. 5). Esta región, que abarca los aminoácidos
220-243, probablemente comprende el dominio de
anclaje a membrana del factor tisular. Una búsqueda de las bases de
datos de secuencias no reveló homología significativa del factor
tisular con las secuencias proteicas disponibles. Particularmente,
no había homología marcada con el factor VIII, un cofactor proteico
de la proteasa de la coagulación factor IX. Esto es inesperado
porque los complejos tanto factor VIII-factor IX,
como factor tisular-factor VII catalizan la
activación del factor X, y las proteasas de cada complejo (factor IX
y VII) son altamente homólogas (F.S. Hagen et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 83:2412 [1986] y Yoshitake et
al., Biochemistry 24:3736 [1985]). Ahora se puede
observar que estas interacciones no están reflejadas en una
similitud de la secuencia proteica primaria de los dos
cofactores.
La secuencia de ADNc implica que el factor
tisular maduro se libera por escisión con peptidasa señal de un
prepéptido sin procesamiento adicional del propéptido. Los 32
aminoácidos desde la metionina inicial hasta el extremo amino
terminal maduro comienzan con una región cargada seguida de una
secuencia "central" hidrófoba de 14 restos. El prepéptido
termina en ala-gly-ala;
ala-X-ala es la secuencia más
frecuente que precede la escisión con peptidasa señal (O. Perlman
et al., Mol. Biol. 167:391 [1983]).
Se supone que el codón de la metionina en el
nucleótido 100-102 (Figura 2) inicia la traducción
de la pre-proteína del factor tisular. Los cinco
nucleótidos precedentes y el que sigue a este ATG son elecciones
habituales para los nucleótidos de alrededor de los sitios de
iniciación de la traducción en ARNm eucariota, aunque no se
encuentran en completa identidad con el consenso descrito por Kozak,
M., Nucl. Acids Res. 12:857 [1984]. Los clones de ADNc
caracterizados parecen contener casi toda la región 5' no traducida
del mensaje.
El ADNc contiene una región 3' no traducida de
1139 nucleótidos en la que la señal de poliadenilación habitual
AATAAA precede a la cola poli(A) por 23 nucleótidos. Una
característica notable de la región no traducida es la presencia de
una secuencia repetida de la familia Alu de 300 pb. Hay
aproximadamente 300.000 copias de la repetición Alu en el genoma
humano, y numerosos ejemplos de su presencia en los intrones de los
genes, donde se retiran por corte y empalme durante la maduración
del ARNm (C.W. Schmid et al., Science 216:1065 [1982]
y P.A. Sharp, Nature 301:471 [1983]). Aunque el ARNm
poli(A)^{+} citoplásmico también contiene secuencias
Alu, ha habido sólo dos informes específicos previos de secuencias
tipo Alu en la secuencia 3' no traducida de los ARNm: en los
antígenos de histocompatibilidad clase 1 de ratón y rata, y en el
receptor de lipoproteína de baja densidad humano (L. Hood et
al., Ann. Rev. Immunol. 1:529 [1983]; B. Majello et
al., Nature 314:457 [1985] y T. Yamamoto et al.,
Cell 39:27 [1984]). Las secuencias Alu a menudo están
flanqueadas por repeticiones directas cortas, como una consecuencia
probable de su inserción en el genoma en mellas de doble cadena
escalonadas. La secuencia Alu de la región 3' del ADNc del factor
tisular está flanqueada por una repetición directa de 11
nucleótidos, como se indica mediante flechas en la Fig. 2.
El ADNc de la proteína del factor tisular humano
de longitud completa estaba contenido en el clon \lambdaTF14 de
ADNc. El ADNc de longitud completa se insertó en un plásmido de
expresión que comprendía el potenciador y el promotor de
citomegalovirus, el sitio donante de corte y empalme y el intrón de
citomegalovirus, el intrón de la región variable y el sitio aceptor
de corte y empalme de Ig, el sitio de poliadenilación y de
terminación de la transcripción de SV40. La construcción del vector
de expresión, mostrado en la Fig. 4, se emprendió del siguiente
modo.
El vector básico mencionado como pCIS2.8c26D
usado aquí está basado en pF8CIS descrito en la Solicitud Europea Nº
87308060.0 (Solicitud de Estados Unidos Nº 07/071.674, presentada el
9 de julio de 1987 y 06/907.185, presentada el 12 de septiembre de
1986, Certificado Nº 373P1.
Como se muestra en la Figura 4a, se cambió un
único nucleótido precedente al sitio ClaI en pF8CIS de
guanosina a timidina de manera que no se necesitaría una cepa
dam^{-} de E. coli para el corte del sitio
ClaI.
Se realizó un ligamiento en tres partes que
comprendía los siguientes fragmentos: a) el fragmento
ClaI-SatII de 12617 pb de pF8CIS (aislado a partir de
una cepa dam^{-} y tratada con BAP); b) el fragmento
SstII-PstI de 216 pb de pF8CIS; y c) un
oligonucleótido sintético PstI-ClaI corto que se había
tratado con quinasa (véase Figura 4a, un asterisco indica el
nucleótido cambiado). Este ligamiento en tres partes genera el
vector de expresión pCIS2.8c24D que es idéntico al pCIS2.8c6D y
pCIS2.8c28D en las porciones usadas para expresar el factor
tisular.
Este vector se modificó para retirar la secuencia
que codifica el factor VIII por un producto de digestión
ClaI-HpaI. La región se sustituyó por un polienlazador
para permitir sitios de clonación adicionales. La secuencia del
polienlazador usado se da a continuación.
Los sitios ClaI y HpaI del vector
original se regeneran y se añadieron sitios para las enzimas
XbaI, XhoI, NotI. Este vector se llama
pCIS2.CXXNH. La región codificante para el factor tisular se
subclonó a partir de \lambdaTF14 usando el sitio SalI
presente en la unión 5' del vector \lambda y el ADNc y un sitio
NcoI localizado 3' de la región codificante en la porción no
codificante del ADNc. Primero se creó un extremo 3' romo digiriendo
con NcoI seguido de una reacción de rellenado que contenía el
fragmento de Klenow de la ADN polimerasa y los 4 dNTP. Cuando el ADN
de \lambdaTF14 se cortó posteriormente con SalI se creó un
fragmento de aproximadamente 1232 pb con la secuencia saliente TCGA
en el extremo 5' y un extremo 3' romo que contenía la región
codificante del factor tisular. Este se ligó en el vector
pCIS2.CXXNH que se había cortado con XhoI (produciendo un
saliente TCGA) y HpaI (romo). El nuevo vector se denominó
pCIS.TF o se mencionó alternativamente como pCISTFI.
Se transfectaron células de riñón embrionario
humano (células 293) y células de riñón de mono (células Cos) con el
vector de expresión pCIS.TF que contenía el ADNc de la proteína del
factor tisular. 48 horas después de la transfección las células se
recogieron y ensayaron para la actividad de proteína del factor
tisular por el ensayo cromogénico descrito a continuación. Las
células se retiraron de las placas de 100 mm por suspensión en 1 ml
de tampón fosfato sódico 0,01 M, pH 7,0, que contenía NaCl 0,15 M.
La absorbancia a 500 nm se ajustó a 0,750 para ajustar la densidad
celular diferencial en las placas. Las células se sonicaron durante
1 min y se añadió Triton X-100 hasta una
concentración final del 0,1 por ciento. Las muestras se hicieron
girar a temperatura ambiente durante 90 minutos y los restos
celulares se retiraron por filtración a 10.000 x g. Se relipidaron
los extractos solubilizados con detergente diluyendo 2 \mul de la
muestra en 0,8 ml de Tris-HCl 0,05 M, pH 7,5, que
contenía NaCl 0,1 M, albúmina de suero bovina al 0,1 por ciento
(tampón TBS). Se añadieron cincuenta \mul de una solución de 5
mg/ml de fosfatidilcolina (lecitina) en ácido desoxicólico al 0,25
por ciento y 25 \mul de CdCl_{2} y la solución se incubó durante
30 minutos a 37ºC.
Se ensayó la proteína del factor tisular
recombinante para su capacidad de funcionar en un ensayo cromogénico
específico. Los resultados se muestran en la Fig. 9. Como se
esperaba, se encontró que diversas concentraciones de tromboplastina
de cerebro de conejo (factor tisular en bruto) reaccionaron en el
análisis. Las células de control COS-7 (que
contenían el vector de expresión parental sin ADNc del factor
tisular) tuvieron una actividad sólo ligeramente por encima del
blanco del ensayo (con la adición de la mezcla de relipidación sola)
(Fig. 9). Las células transfectadas con el plásmido de expresión del
factor tisular, en contraste, mostraron una fuerte reacción positiva
en el ensayo, demostrando de este modo que el ADNc codifica el
factor tisular.
El plásmido pTF2A12 se diseñó para expresar la
proteína del factor tisular madura en E. coli usando el
promotor de la fosfatasa alcalina y la secuencia líder STII (Patente
de Estados Unidos Nº 4.680.262). Este plásmido se construyó como se
muestra en la Figura 6, por ligamiento de cuatro fragmentos de ADN,
el primero de los cuales fue el ADN dúplex sintético:
El fragmento anterior codifica los primeros 12
aminoácidos de la proteína del factor tisular madura. El segundo fue
un fragmento de restricción BbvI-EcoRI de 624 pares de
bases de pCISTF, descrito anteriormente, que codifica los
aminoácidos 13 a 216. El tercero fue un fragmento
EcoRI-BamHI de 518 pares de bases de pCISTF que
codifica los últimos 47 aminoácidos de la proteína del factor
tisular. El plásmido pAPSTII HGH-1 (Patente de
Estados Unidos Nº 4.680.262) se digirió con NsiI BamHI
de 930 pb para producir un fragmento.
Los cuatro fragmentos se ligaron entre sí para
formar el plásmido pTF2A12, como se muestra en la Figura 6, y se
usaron para transformar células de la cepa 294 de E. coli
K12. Los transformantes se seleccionaron por resistencia a
ampicilina y el plásmido pTF2A12 se seleccionó por análisis de
restricción y secuenciación didesoxi.
Se hicieron crecer células de la cepa 294 de
E. coli K12 que contenían los vectores de expresión durante
una noche a 29ºC en medios con bajo contenido en fosfato que
contenían 50 \mug/ml de carbenicilina. Los sedimentos celulares de
1 ml de cultivo con una absorbancia de 1 a 600 nm se resuspendieron
en 200 \mul de Tris-HCl 50 mM pH 7,5, NaCl 150 mM,
Triton X-100 al 1%, 1 mg/ml de lisozima. Las
suspensiones se sonicaron por pulsos durante 1 minuto seguido de
centrifugación a 10.000 x g para retirar los restos celulares. Se
relipidaron los extractos solubilizados con detergente diluyendo 10
\mul de la muestra en 0,8 ml de Tris-HCl 0,05 M pH
7,5 que contenía NaCl 0,1 M, albúmina de suero bovina al 0,1%
(tampón TBS). Se añadieron cincuenta \mul de una solución de 5
mg/ml de fosfatidilcolina en ácido desoxicólico al 0,25% y 25 \mul
de CdCl_{2} y la solución se incubó durante 30 minutos a 37ºC.
La actividad del factor tisular se detecto por
ensayo cromogénico como se describe a continuación.
El plásmido pTFIII se diseña para expresar una
forma mutante madura de la proteína del factor tisular en E.
coli. Esta mutación convierte la cisteína de la posición 245 de
la proteína del factor tisular madura en serina. Los elementos de
control de la expresión, el promotor de la fosfatasa alcalina y la
secuencia líder STII son idénticos a los usados en la construcción
del plásmido pTF2A12.
El plásmido TFIII se hizo en tres etapas, las dos
primeras de las cuales reconstruyen el extremo carboxilo del gen.
Los plásmidos pTF100-1 y pTR80-3 son
los resultados de las dos primeras etapas.
El plásmido pTF100-1 se construyó
a partir de tres fragmentos de ADN (véase Fig. 7a). El primero es el
vector de clonación pTrp14 (Patente de Estados Unidos Nº 4.663.283)
en el que se retira un fragmento EcoRI-XbaI no
esencial (Figura 7). El segundo fue un fragmento
EcoRI-FokI de 32 pares de bases que codifica los
aminoácidos 217 a 228 de la proteína del factor tisular madura. El
tercer fragmento que codifica los aminoácidos
229-245 fue un ADN dúplex sintetizado químicamente
en el que el codón de la posición 245 se cambió a TCT (subrayado) de
TGT:
Los tres fragmentos se ligaron entre sí formando
el plásmido pTF100-1 y se transformaron en la cepa
294 de E. coli K12. Los transformantes se seleccionaron por
resistencia a ampicilina y el plásmido pTF100-1 se
seleccionó por análisis de restricción y secuenciación didesoxi.
El plásmido pTF80-3 se construyó
a partir de dos fragmentos de ADN (Figura 7b). El primero fue un
vector plasmídico pHGH207 (Patente de Estados Unidos Nº 4.663.283)
en el que se había retirado el fragmento XbaI-BamI de
930 pares de bases. El segundo fue el ADN dúplex de 68 unidades
sintetizado químicamente:
Los dos fragmentos se ligaron entre sí formando
el plásmido pTF80-3 y se transfectaron en la cepa
294 de E. coli K12. Los transformantes se seleccionaron por
resistencia a ampicilina y el plásmido pTF80-3 se
seleccionó por análisis de restricción y secuenciación didesoxi.
El plásmido pTFIII se construyó a partir de
cuatro fragmentos de ADN (Figura 7c). El primero fue el vector
pAPSTIIHGH (Patente de Estados Unidos Nº 4.680.262) en el que se
había retirado el fragmento NsiI-BamHI de 930 pares de
bases. El segundo fue un fragmento de restricción
NsiI-EcoRI de 650 pares de bases de pTF2A12 (véase
Ejemplo 4 anterior) que codificaba los aminoácidos 1 a 217 de la
proteína del factor tisular madura. El tercero fue un fragmento
EcoRI-XbaI de 80 pares de bases de
pTF100-1 que codificaba los aminoácidos 218 a 245 de
la proteína del factor tisular madura mutante. El cuarto fue un
fragmento XbaI-BamHI de 60 pares de bases de
pTF80-3 que codificaba para los últimos 18
aminoácidos. Los cuatro fragmentos se ligaron entre sí y se
transformaron en la cepa 294 de E. coli K12. Los
transformantes se seleccionaron por resistencia a la ampicilina y el
plásmido pTFIII se seleccionó por análisis de restricción.
Se construyó una fusión con la secuencia señal de
gD del herpes (Publicación EP Nº 0139416, publicada el 2 de mayo de
1985) y la porción madura del ADNc del factor tisular humano usando
los elementos de control del vector pRK7. pRK7 y pRK5 (véase a
continuación) se construyeron del siguiente modo.
El plásmido de partida fue pCIS2.8c28D descrito
anteriormente. Los números de base en los párrafos 1 a 6 se refieren
a pCIS2.8c28D con la base uno de la primera T del sitio EcoRI
precediendo al promotor de CMV. El promotor temprano y el intrón de
citomegalovirus y el origen y la señal poliA de SV40 se colocaron en
plásmidos separados.
1. El promotor temprano de citomegalovirus se
clonó en forma de un fragmento EcoRI de pCIS2.8c28D
(9999-12-1) en el sitio EcoRI
de pUC118 (Yanish-Perron et al. Gene
33:103 [1985]). Se eligieron doce colonias y se exploraron
para la orientación en la que el ADN de cadena sencilla elaborado a
partir de pUC118 permitiría la secuenciación desde el sitio
EcoRI en 1201 hasta el sitio EcoRI en 9999. Este clon
se llamó pCMVE/P.
2. Se hizo un ADN de cadena sencilla a partir de
pCMVE/P para insertar un promotor de SP6 (Green M.R. et al.,
Cell 32:681-694 [1983]) por mutagénesis
dirigida de sitio. Se usaron un oligómero de 110 unidades sintéticas
que contenía el promotor de SP6 (Véase Nucleic Acids Res.
12:7041 [1984] figura 1); secuencias desde -69 a +5 del
promotor de SP6 junto con fragmentos de 18 pb de cualquier extremo
del oligómero correspondiente a las secuencias de CMVE/P. La
mutagénesis se hizo por técnicas convencionales y se exploró usando
un oligómero de 110 unidades marcado a alta o baja rigurosidad. Se
eligieron seis clones potenciales y se secuenciaron. Se identificó
un positivo y se llamó pCMVE/PSP6.
3. Se examinó el promotor de SP6 y demostró ser
activo, por ejemplo, añadiendo ARN polimerasa de SP6 y comprobando
el ARN de tamaño apropiado.
4. Se hizo un adaptador
Cla-NotI-Sma para insertarlo desde el sitio
ClI (912) al sitio SmaI de pUC118 en pCMVE/P (etapa 1)
y pCMVE/PSP6 (etapa 2). Este adaptador se ligó en el sitio
ClaI-SmaI de pUC118 y se exploró para los clones
correctos. El enlazador se secuenció ambos y los clones se llamaron
pCMVE/PSP6-L y pCMVE/P-L.
5. Se cortó pCMVE/PSP6-L con
SmaI (en la unión enlazador/pUC118) y HindIII (en
pUC118). Se insertó un fragmento HpaI (5573) a HindIII
(6136) de pSVORAA\DeltaRI 11, descrito a continuación, en
SmaI-HindIII de pCMVE/PSP6-L. Este
ligamiento se exploró y se aisló un clon y se llamó
pCMVE/PSP6-L-SVORAA\DeltaRI.
a) Se aisló el origen y la señal poliA de SV40 en
forma de un fragmento XmnI (5475) - HindIII (6136) de
pCIS2.8c28D y se clonó en los sitios HindIII a SmaI de
pUC119. Esto se llamó pSVORAA.
b) El sitio EcoRI en 5716 se retiró por
digestión parcial con EcoRI y se rellenó con Klenow. Las
colonias obtenidas del auto-ligamiento después del
rellenado se exploraron y el clon correcto se aisló y se llamó
pSVORAA\DeltaRI 11. El sitio EcoRI delecionado se examinó
por secuenciación y demostró ser correcto.
c) Se aisló el fragmento HpaI (5573) a
HindIII (6136) de psVORAA\DeltaRI 11 y se insertó en
pCMVE/PSP6-L (véase 4 anterior).
6. Se cortó
pCMVE/PSP6-L-SVOrAA\DeltaRI (etapa
5) con EcoRI en 9999, se hizo romo y se
auto-ligó. Se identificó un clon sin un sitio
EcoRI y se llamó pRK.
7. Se cortó pRK con SmaI y BamHI.
Este se rellenó con Klenow y se religó. Las colonias se exploraron.
Se identificó un positivo y se llamó pRK\DeltaBam/Sma 3.
8. El sitio HindIII se convirtió en un
sitio HpaI usando un convertidor. (Un convertidor es un trozo
de ADN usado para cambiar un sitio de restricción por otro. En este
caso un extremo sería complementario a un extremo cohesivo
HindIII y el otro extremo tendría un sitio de reconocimiento
para HpaI.) Se identificó un positivo y se llamó
pRK\DeltaBam/Sma, HIII-HpaI 1.
9. Se cortó pRK\DeltaBam/Sma, HIII-HpaI
1 con PstI y NotI y se ligaron en el mismo un
enlazador RI-HIII y un enlazador
HIII-RI. Se encontraron clones para cada enlazador.
Sin embargo, también se determinó que habían entrado demasiados
convertidores HpaI (dos o más convertidores generan un sitio
PvuII). Por lo tanto, estos clones tuvieron que cortarse con
HpaI y auto-ligarse.
10. Se cortaron el clon 3 de
RI-HIII y el clon 5 de HIII-RI con
HpaI, se diluyeron, y se auto-ligaron. Se
identificaron los positivos. El clon RI-HIII se
llamó pRK5. Se cortó un clon HIII-RI con
HpaI, se diluyó y se auto-ligó. Después de la
exploración, se identificó un clon positivo y se llamó pRK7.
El vector pRK7 contiene el promotor y el
potenciador de CMV y un donante de corte y empalme, el intrón y el
aceptor de corte y empalme de Ig, el promotor de SP6, la señal poliA
de SV40 y el origen de replicación de SV40; no tiene gen de la DHFR.
La construcción del vector de expresión de la proteína del factor
tisular se emprendió del siguiente modo: se clonó el ADNc de la
proteína del factor tisular de \lambdaTF14 en el sitio SalI
de pSP64 y se llamó pSP64TF (Promega Corporation, 1987). Se cortó
pSP64 que contenía el ADNc del factor tisular con NcoI. Se
ligó un convertidor de 18 unidades que estaba tratado con quinasa al
extremo NcoI para cambiar el sitio NcoI a un sitio
XbaI. La secuencia de los enlazadores usados fue:
Después se digirió pSP64 con BbvI y se
aisló en gel un fragmento de 1030 pb. Un ADN dúplex
PvuII-BbvI de aproximadamente 100 pb que no se trató
con quinasa, contenía las secuencias del primer sitio de activación
de la trombina del factor VIII y los primeros 12 aminoácidos de la
proteína del factor tisular humano madura. La secuencia de los
aproximadamente 100 pb fue la siguiente:
El fragmento PvuII-BbvI se ligó al
fragmento de aproximadamente 1030 pb. Se aisló en gel un fragmento
de aproximadamente 1130 pb. Este fragmento PvuII-XbaI
se ligó después en un vector pSP64 llamado pSP64ThTF. Se obtuvo un
clon que se secuenció en el área que comprende el oligómero de 100
unidades sintético. Este plásmido se digirió con PvuII y
XbaI en un intento de aislar una gran cantidad del inserto.
Sin embargo, el sitio XbaI no se digirió. Por lo tanto, el
inserto se aisló en gel cortando con PvuII y SalI. El
sitio SalI está en la parte restante del polienlazador de pSP64 y
localizado al lado del sitio XbaI. El segundo fragmento que
contenía la secuencia señal de gD del herpes más algo de la región
5' no traducida comprendía un fragmento de 275 pb obtenido del
pgD-DHFR (Publicación EP Nº 0139417, publicada el 2
de mayo de 1985), que se digiere con PstI-SacII y un
fragmento sintético SacII-PvuII de 103 pb que tiene la
siguiente secuencia:
El tercer segmento se obtuvo digiriendo pRK7 con
PstI-SalI y aislando en gel un fragmento de
aproximadamente 4700 pb. El ligamiento de tres partes final usó: a)
el fragmento PvuII-SalI que contenía el primer sitio
de activación de la trombina 5' del ADNc que codifica la proteína
del factor tisular; b) el fragmento PstI-PvuII que
contenía la secuencia señal de gD del herpes; y c) el fragmento pRK
que contenía los elementos de control. Se obtuvieron los 3 trozos
descritos anteriormente y los clones y se determinó que eran
correctos por digestión con enzimas de restricción y
secuenciación.
Se transfectaron células de riñón embrionario
humano (293S) con el vector de expresión que contenía la proteína de
fusión del factor tisular-gD del herpes. Las células
293 humanas se recogieron 15 horas después de la transfección
transitoria. El medio de cultivo se retira y se añaden 2 ml de
tampón de extracción (Tris-HCl 5 mM); NaCl 150 mM:pH
7,5 [TBS] que contenía Triton X-100 al 0,1%) por
placa de cultivo tisular de 100 mm. Las células se suspenden y se
hacen girar (extremo sobre extremo) durante 45-60
minutos a 4ºC. El extracto se centrifuga a 8000 x g durante 20 min y
después se carga directamente en la columna de anticuerpo monoclonal
(3,5 mg 5B6/ml de Sepharose activada con CNBr) a un caudal de 0,8
ml/min. La preparación de un anticuerpo frente a gD del herpes se
describe en la Publicación EP Nº 1.139.416, publicada el 2 de mayo
de 1985. La columna de anticuerpo se lava con 10 ml de tampón de
extracción para restituir la Absorbancia (280 nm) a la línea basal.
Después la columna se lava con Tris-HCl 50 mM; NaCl
1 M; Triton X-100 al 0,1%, pH 7,5 y se eluye con
glicina 0,1 M; NaCl 150 mM; Triton X-100 al 0,1%, pH
2. El pH se ajusta a neutralidad con Tris HCl 1 M, pH 8,5.
La porción gD de la proteína de fusión
gD-factor tisular se escindió de la proteína de
fusión usando trombina. Se unieron covalentemente 1110 unidades de
trombina (0,33 mg de proteína) a 0,5 ml de Sepharose activada con
CNBr de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se incuban
5000 unidades de la proteína de fusión gDTF con aproximadamente 150
\mul de trombina-Sepharose durante 90 minutos a
37ºC (girada extremo sobre extremo). Después la
trombina-Sepharose se retira por centrifugación.
La actividad del factor tisular se detectó por
ensayo cromogénico como se describe a continuación.
Se construyó el vector pRKTF\Delta244, como se
muestra en la Figura 10, para expresar una proteína del factor
tisular que carecía de dominio citoplásmico, aminoácidos 244 a 263.
El vector se construyó por ligamiento de tres partes. La primera
parte fue un fragmento de 859 pb obtenido por digestión de pCISTF1
con EcoRI y ClaI. Los 859 pb se aislaron en gel. La
segunda porción se aisló en gel después de digestión con
ClaI-BamHI de pRK5 como se ha descrito anteriormente.
La tercera parte fue un oligómero de 87 unidades
EcoRI-BamHI sintetizado químicamente que tenía la
siguiente secuencia:
El ligamiento de tres partes usó: a) el fragmento
de 859 pb que codifica los aminoácidos 1-216; b) el
fragmento de 4700 pb de pRK5; y, c) el oligómero de 87 unidades que
codifica los aminoácidos 217-243. Este nuevo vector
se llamó pRKTF\Delta244 (véase Figura 10).
Se transfectaron células de riñón embrionario
humano (293) con el vector de expresión pRKTF\Delta244. Después de
tres días, se purificó la proteína del factor tisular con el dominio
citoplásmico suprimido como se ha describe previamente y se ensayó
en el ensayo cromogénico descrito a continuación. El factor tisular
con el dominio citoplásmico suprimido mostró una fuerte reacción
positiva en el ensayo demostrando que la proteína del factor tisular
con el dominio citoplásmico suprimido era eficaz en este ensayo de
coagulación in vitro.
La proteína del factor tisular se purificó usando
purificación por inmunoafinidad usando un anticuerpo monoclonal IgG
que se une a la proteína del factor tisular humano.
La proteína del factor tisular humano se
sintetizó en cultivo recombinante como se ha descrito anteriormente.
Se inyectaron los siguientes inmunógenos en un ratón BALB/c (29.1.C)
de acuerdo con el programa descrito a continuación: proteína del
factor tisular humano recombinante (rTF) (0,07 mg/ml que tiene una
actividad específica de 17040 U/mg); proteína del factor tisular
recombinante obtenida de la fusión factor tisular-gD
escindida por trombina para retirar las secuencias de gD del herpes
del extremo amino terminal (rTF:gDThr) (0,72 mg/ml que tiene una
actividad específica de 4687 U/mg) y la fusión factor tisular
recombinante-gD del herpes (rTF-gD)
(aproximadamente 150.000 U/mg) en el siguiente programa de
inmunización:
Día | Vía de Administración | Inmunógeno |
1. | subcutánea (sc) | 0,25 ml de r-TF en adyuvante completo de Freund |
14. | mitad sc y mitad intraperitoneal (ip) | 0,25 ml de r-TF:gD en adyuvante incompleto de Freund |
28. | I.P. | 0,25 ml de r-TF:gD en PBS |
42. | I.P. | 0,25 ml de r-TF:gD en PBS |
62. | I.P. | 0,25 ml de r-TF:gD en PBS |
75. | I.P. | 0,25 ml de r-TF:gD en PBS |
85. | Intraesplénica | 0,1 ml de r-TF:gDThr en PBS** |
** 10-40 \mug/ml |
El título anti-TF ensayado
radio-inmunoprecipitación (RIP) y ELISA aumentó
gradualmente durante toda la inmunización hasta el día 85.
El ensayo RIP se usó 0,005 ml de sueros de
ratones inmunizados y no inmunizados diluidos con 0,495 ml de PBSTA
(PBS que contenía albúmina de suero bovina al 0,5% [BSA] y Triton
X-100 al 0,1%). Se añadieron 50.000 cpm de
^{125}I-rTF y la mezcla se incubó durante 2 horas
a temperatura ambiente. El ^{125}I-rTF complejado
con anticuerpo se hizo precipitar incubando durante 1 hora a
temperatura ambiente con 0,05 ml de perlas SPA. Las perlas SPA
constaban de proteína A de estafilococos unida a perlas de sepharose
CL-4B que se habían pre-incubado con
IgG de conejo anti-ratón y almacenado en Tris 50 mM
pH 8, MgCl_{2} 10 mM, BSA al 0,1% y NaN_{3} al 0,02%. Las perlas
se sedimentaron, se lavaron tres veces con PBSTA y se contaron en un
contador gamma.
El ELISA constaba de 0,1 ml de rTF (0,5
\mug/ml) en tampón carbonato pH 9,6 adsorbido a pocillos de
microtitulación durante 2 horas a 37ºC. La adsorción no específica
adicional a los pocillos se bloqueó durante 1 hora a 37ºC con PBSA
(PBS que contenía BSA al 5%). Los pocillos se lavaron 3 veces con
PBST (PBS que contenía Tween 80 al 0,1%) y se añadieron las muestras
de suero diluidas en PBS y se incubaron durante una noche a 4ºC. Los
pocillos se lavaron 3 veces con PBST. Se añadieron 0,1 ml de
inmunoglobulina de cabra anti-ratón conjugada con
peroxidasa de rábano rusticano a cada pocillo y se incubaron durante
1 hora a temperatura ambiente. Los pocillos se lavaron otra vez y se
añadió O-fenilendiamina como sustrato y se incubó
durante 25 minutos a temperatura ambiente. La reacción se paró con
H_{2}SO_{4} 2,5 M y se leyó la absorbancia de cada pocillo a los
492 min.
En el día 89 se recogió el bazo del ratón 29.1.C,
se alteró y las células del bazo se fusionaron con células de
mieloma de ratón no secretoras P3 X63-Ag8.653 (ATCC
CRL 1580) usando el procedimiento de fusión con PEG de S. Fazakas de
St. Groth et al., J. Immun. Meth.,
35:1-21 (1980). El cultivo fusionado se
sembró en 4 placas que contenían cada una 96 pocillos de
microtitulación y se cultivó en medio HAT (hipoxantina, aminopterina
y timidina) por técnicas convencionales (Mishell and Shiigi,
Selected Methods in Cellular Immunology, W.H. Freeman &
Co., San Francisco, páginas 357-363 [1980]). Se
determinó la actividad anti-TF de los sobrenadantes
del cultivo por ELISA y RIP. Se encontró que veinte positivos tenían
actividad anti-TF. De estos, se expandieron 12
fusiones estables que secretaban anti-TF y se
clonaron por dilución limitante usando procedimientos publicados
(Oi, V.J.T. & Herzenberg, L.A., "Immunoglobulin Producing
Hybrid Cell Lines" en Selected Methods in Cellular
Immunology, páginas 351-372, Mishell, B.B. and
Shiigi, S.M. [eds], W.H. Freeman & Co. [1980]). La selección de
los clones se basó en: la observación macroscópica de los clones
individuales, ELISA y RIP: Se determinó el isotipo del anticuerpo
usando un kit de determinación de isotipo Zymed de acuerdo con el
protocolo adjunto. (Zymed Corp.) Se produjeron grandes cantidades de
anticuerpos monoclonales específicos por inyección de células de
hibridoma clonadas en ratones cebados con pristano para producir
tumores ascíticos. Después se recogieron los fluidos ascíticos y se
purificaron en una columna de proteína
A-Sepharose.
Se centrifugaron aproximadamente 5 ml de fluido
ascítico a 3000 rpm en un Sorvall 6000 a 4ºC durante 10 minutos. La
capa clara de pristano y la capa de lípidos se retiraron con una
pipeta pasteur. El fluido ascítico se transfirió a un tubo de
centrífuga de 50 ml. El fluido ascítico se filtró en esterilidad a
través de un filtro 0,45 M. Se añadieron 1,11 g de KCl a los fluidos
ascíticos para producir una concentración final de KCl 3 M.
Los fluidos ascíticos se cargaron en una columna
de 10 ml que contenía SPA Sepharose (Fermentech). La columna se lavó
con KCl 3 M. La IgG de ratón se eluyó con 3 a 4 volúmenes de la
columna de ácido acético 0,1 M en NaCl 0,15 M pH 2,8.
El anticuerpo D3 se acopló a CNBr Sepharose de
acuerdo con las instrucciones del fabricante a 3 mg de IgG por ml de
Sepharose. (Véase el manual de instrucciones de Pharmacia Co.). Se
hicieron crecer células 293S transfectadas en una mezcla 1:1 de
F-12 de Ham (sin glicina, hipoxantina y timidina) y
DMEM (sin glicina). Las adiciones al medio basal incluyen: suero de
ternera fetal sometido dializado o diafiltrado al 10%, metotrexato
50 nM, L-glutamina 2,0 mM y tampón HEPES 10 mM.
Se descongela un vial congelado de 293S (63/2S
CISTF) en un matraz de cultivo tisular que contiene el medio
descrito. Cuando el cultivo alcanza la confluencia se trata con
tripsina con una mezcla de tripsina-EDTA y una
pequeña porción de la población celular se usó para inocular
matraces más grandes. Los cultivos se controlaron diariamente por
microscopía de fases para determinar el crecimiento (porcentaje de
confluencia), morfología y salud general. Cuando los cultivos en
frascos rotativos fueron confluentes (habitualmente en
5-7 días), las células se trataron con tripsina y se
contaron. Las células se enumeraron y se determinaron sus
viabilidades por la técnica de exclusión con azul de tripano. Las
cantidades típicas de células de un frasco rotativo de 850 cm^{2}
confluente estaban entre 1 y 4 x 10^{8} células. Las células se
suspendieron en fosfato sódico 0,01 M, NaCl 0,15 M. Las células se
recogieron por centrifugación a 5000 rpm. Las células se
resuspendieron en 50 ml de TBS que contenía Triton X al 1% por
matraz. Los cultivos se incubaron una hora a temperatura ambiente y
después se centrifugaron a 8000 x g durante 20 minutos. El
sobrenadante se cargó en la columna de D3-Sepharose
descrita anteriormente. La columna se lavó y se eluyó con ácido
acético 0,1 M, NaCl 150 mM y Tween 80 al 0,05%.
Se relipidaron todas las muestras extraídas del
medio de cultivo antes del ensayo. Como se ha analizado
anteriormente el factor tisular tiene una necesidad absoluta de
fosfolípidos para mostrar actividad en sistemas de ensayo in
vitro (Pitlick and Nemerson, Supra). Se homogeneizaron
gránulos de lecitina en Tris 0,05 M, NaCl 0,1 M pH 7,4 (TBS) que
contenían desoxicolato sódico al 0,25% a una concentración de 1
mg/ml. Esta solución (PC/DOC) se usó para relipidar el factor
tisular del siguiente modo. La proteína del factor tisular se diluyó
en TBS que contenía albúmina de suero bovina al 0,1% (TBSA). Se
colocaron cincuenta microlitros en un tubo de ensayo de poliestireno
de 12x75 mm y se añadieron 50 \mul de solución PC/DOC. Después se
añadieron trescientos cincuenta (350) microlitros de TBSA junto con
25 \mul de CdCl_{2}. Esta mezcla de relipidación se dejó incubar
a 37ºC durante 30 minutos.
Para el ensayo cromogénico, las muestras de
proteína del factor tisular relipidadas se diluyeron en TBSA. Se
colocaron diez microlitros en un tubo de ensayo con 50 \mul del
reactivo factor IX_{a}/factor X y 2 \mul de una solución de
factor VII purificado, 30 unidades/ml. Los tubos se calentaron hasta
37ºC y se añadieron 100 \mul de CaCl_{2} 25 mM. Las muestras se
incubaron durante 5 min a 37ºC antes de la adición de 50 \mul de
sustrato cromogénico específico para el factor Xa, S2222, que
también contenía el inhibidor de trombina sintético I2581. La
reacción se dejó continuar durante 10 min y se paró por la adición
de 100 \mul de solución de ácido acético glacial al 50%. Se
detectó la absorbancia a 405 nm. Se construyó una curva patrón
usando tromboplastina de cerebro de conejo (disponible en el mercado
de Sigma, St. Louis, MO. Nº de catálogo TO263) asignando
arbitrariamente a este reactivo 100 unidades de factor tisular/ml.
Se hicieron diluciones de 1:10 a 1:1000. La absorbancia se trazó en
la abscisa en papel para gráficos semilog con la dilución del patrón
trazada en la ordenada.
Se añadieron 100 \mul de plasma hemofílico a 10
\mul de proteína del factor tisular relipidada o libre de lípidos
o TBSA como control en un tubo de vidrio siliconado para evitar la
activación no específica a través de la fase de contacto de la
coagulación. Los reactivos se calentaron hasta 37ºC y se añadieron
100 \mul de CaCl_{2} 25 mM y se cronometró la formación de
coágulos (Hvatum, Y. and Pyrdz, H., Thromb. Diath. Haemorrh.
21, 217-222 [1969]).
La proteína del factor tisular se infundió en
perros hemofílicos usando el procedimiento de Giles, A.R. et
al., Blood 60, 727-730 (1982).
La carencia de toxicidad de la proteína del
factor tisular se determinó primero en un perro normal por inyección
en forma de bolo de dosis de aproximadamente 50 U de proteína del
factor tisular/kg y 100 U de proteína del factor tisular/kg. Se
realizó la determinación del tiempo de hemorragia de la cutícula
(CBT) (Giles supra) antes de la infusión y 30 minutos después
de cada inyección. Se sacó sangre y se anticoaguló para los ensayos
de coagulación a diversos momentos puntuales durante el experimento.
Para demostrar la actividad de la proteína del factor tisular de
evitar el factor VIII in vivo, se realizaron experimentos
usando perros hemofílicos. Los animales en ayunas fueron
anestesiados y se realizó un CBT antes de cualquier infusión.
Después se administró la proteína del factor tisular por inyección
en forma de bolo y se realizaron CBT en diversos momentos puntuales
hasta 90 min después de la infusión. Se administraron varias dosis
de la proteína del factor tisular. Se sacaron muestras de sangre a
lo largo de toda la duración de cada experimento y se analizaron
para el factor V, y los tiempos de protrombina y la tromboplastina
parcial. Los CBT de más de 12 min se consideraron extremadamente
anormales. Esas uñas se cauterizaron para evitar una pérdida
excesiva de sangre.
Se administraron dosis de proteína del factor
tisular que representaban 100 U/kg de proteína del factor tisular en
relipidación en el ensayo cromogénico a un perro anestesiado normal.
El CBT en este animal fue de aproximadamente 3 min antes de
cualquier infusión. Había cierta reducción en WBCT a los 5 minutos
aunque volvía al normal a los 15 minutos. Los niveles del factor V
fueron normales 30 minutos después de cada infusión. Los tiempos de
protrombina y tromboplastina parcial fueron iguales al final del
experimento y los CBT también estuvieron en el intervalo normal. Por
tanto, la infusión de la proteína del factor tisular se toleró bien
en perros normales y no se encontró evidencia de coagulación
intravascular diseminada.
Se administraron 100 U/kg de proteína del factor
tisular a un perro hemofílico con un CBT prolongado característico
de hemofilia A. El CBT se normalizó a los 5 minutos y 20 minutos
después de esta infusión. Un segundo experimento usando 100 U/kg de
proteína del factor tisular dio un CGR normal a los 20 minutos y un
cierto acortamiento de CBT a los 90 minutos. El efecto procoagulante
no se mantuvo 90 min después de la infusión ya que el efecto del CBT
se prolongó de nuevo en este momento puntual.
Las variantes o fragmentos o polipéptidos de
fusión del factor tisular pueden formularse de acuerdo con métodos
conocidos para preparar composiciones farmacéuticamente útiles, por
los que la proteína del factor tisular producto de las mismas se
combina en mezcla con un vehículo portador farmacéuticamente
aceptable. Los vehículos apropiados y su formulación, incluyendo los
de otras proteínas humanas, por ejemplo, albúmina de suero humana,
se describen por ejemplo en Remington's Pharmaceutical
Sciences por E.W. Martin, que se incorpora por la presente como
referencia. Dichas composiciones contendrán una cantidad eficaz de
la proteína de la misma junto con una cantidad apropiada de vehículo
para preparar composiciones farmacéuticamente aceptables apropiadas
para la administración eficaz al hospedador. Dichas composiciones
debe ser estables durante períodos de tiempo apropiados, deben ser
aceptables para la administración a seres humanos, y deben ser
fácilmente fabricables. Un ejemplo de dichas composición sería una
solución diseñada para administración parenteral. Aunque las
formulaciones en solución farmacéutica se proporcionan en forma de
líquido apropiada para su uso inmediato, dichas formulaciones
parenterales también pueden proporcionarse en forma congelada o
liofilizada. En el primer caso, la composición debe descongelarse
antes de su uso. La última forma se usa a menudo para potenciar la
estabilidad del agente medicinal contenido en la composición en una
amplia diversidad de condiciones de almacenamiento. Dichas
preparaciones liofilizadas se reconstituyen antes de su uso por la
adición de un diluyente o diluyentes farmacéuticamente aceptables
apropiados, tales como agua estéril o solución salina fisiológica
estéril. La proteína del factor tisular de esta invención se
administra para proporcionar una composición terapéutica que induce
la coagulación para diversos trastornos hemorrágicos crónicos,
caracterizados por la tendencia a la hemorragia, tanto heredada como
adquirida. Los ejemplos de dichos trastornos hemorrágicos crónicos
son deficiencias en los factores VIII, IX, o XI. Los ejemplos de
trastornos adquiridos incluyen: inhibidores adquiridos de los
factores de coagulación sanguínea por ejemplo, el factor VIII, el
factor de von Willebrand, los factores IX, V, XI, XII y XIII;
trastorno hemostático como consecuencia de enfermedad del hígado que
incluye la síntesis disminuida de factores de coagulación y DIC;
tendencia a la hemorragia asociada con enfermedad renal aguda y
crónica que incluye deficiencias en el factor de coagulación y DIC;
hemostasis después de traumatismo o cirugía; pacientes con
malignidad diseminada que se manifiesta en DIC con aumentos en el
factor VIII, factor de von Willebrand y fibrinógeno; y hemostasis
durante cirugía cardiopulmonar y transfusión sanguínea masiva.
Claims (10)
1. Método para preparar una composición
terapéutica que induce la coagulación sanguínea,
caracterizada en que comprende combinar un vehículo portador
farmacéuticamente aceptable con:
A) una variante o fragmento biológicamente activo
de la proteína del factor tisular cuya secuencia se da en la Figura
2, donde al menos un aminoácido se ha insertado, delecionado o
sustituido selectivamente, induciendo dicha variante o fragmento la
coagulación; o
B) una proteína del factor tisular biológicamente
activa cuya secuencia se da en la Figura 2, o una variante o
fragmento biológicamente activo de dicha proteína del factor
tisular, donde al menos un aminoácido se ha insertado, delecionado o
sustituido selectivamente, induciendo dicha variante o fragmento la
coagulación, donde la proteína del factor tisular o dicha variante o
fragmento de la misma carece de glicosilación o tiene glicosilación
no de mamífero.
C) un polipéptido de fusión que comprende una
proteína del factor tisular biológicamente activa cuya secuencia se
da en la Figura 2, o una variante o fragmento biológicamente activo
de dicha proteína del factor tisular, donde al menos un aminoácido
se ha insertado, delecionado o sustituido selectivamente, induciendo
dicha variante o fragmento la coagulación, y otro polipéptido
fusionado a la misma.
2. Método, de acuerdo con la reivindicación 1,
donde dicha variante de la proteína del factor tisular
biológicamente activa en (A) en una en la que en comparación con la
proteína del factor tisular nativa, se remplaza un aminoácido
seleccionado de modo que (a) se remplaza un resto hidrófilo por un
resto hidrófobo, o (b) se remplaza un resto de cisteína o prolina
por otro resto de aminoácido o (c) se remplaza un resto que tiene
una cadena lateral electropositiva por un resto electronegativo o
(d) se remplaza un resto que tiene una cadena lateral voluminosa por
un resto que tiene una cadena lateral pequeña o glicina.
3. Método de acuerdo con la reivindicación 1,
donde dicha variante de la proteína del factor tisular
biológicamente activa en (A) es una en la que el dominio
transmembrana de la proteína del factor tisular nativa no está
presente.
4. Método de acuerdo con la reivindicación 1,
donde dicha variante de la proteína del factor tisular
biológicamente activa en (A) es una en la que hay un sitio
seleccionado que es un sitio de proteolisis potencial en la proteína
del factor tisular nativa que es resistente a la proteolisis.
5. Método de acuerdo con la reivindicación 4,
donde dicho sitio de proteolisis potencial en la proteína del factor
tisular nativa que comprende una arginina se remplaza por otro
aminoácido o no está presente.
6. Método de acuerdo con la reivindicación 5,
donde la arginina se remplaza por glutamina o histidina.
7. Método de acuerdo con la reivindicación 1,
donde dicha variante de la proteína del factor tisular
biológicamente activa (A) es una en la que un resto de cisteína de
la proteína del factor tisular nativa se remplaza por otro resto de
aminoácido.
8. Método de acuerdo con la reivindicación 7,
donde el resto de cisteína es la cisteína 245 y el otro resto de
aminoácido es serina.
9. Método de acuerdo con la reivindicación 1,
donde dicha variante de la proteína del factor tisular
biológicamente activa (A) es una en la que un sitio de glicosilación
unido a N o unido a O de la proteína del factor tisular nativa no
está presente.
10. Método de acuerdo con la reivindicación 1,
donde dicha composición se prepara a partir del polipéptido de
fusión (B).
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