JPH02501263A - ヒトの組織因子のクローニングと形質発現 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒトの組織因子のクローニングと形質発現本発明はヒトの組織因子についてのク ローン化したＤＮＡの配列暗号化を含み、適当な宿主の中にレプリカ培養（複製 ）できる新規の組換え（体）ベクターに関する。また、本発明はヒトの組織因子 のＤＮＡコーディング（暗号）、及びこれから暗号化した、実質的に純粋なヒト の組織因子並びにその機能的部分に関する。更に、本発明はヒトの組織因子を発 現できる発現ベクターを含む形質転換宿主並びにヒトの組織因子の新規な可溶形 態を提供する。

ヒト及び動物における（血液の）凝固システムは止血の維持と血栓（血餅、血塊 ）に対する主たる寄与者である。凝固は、本質的には、不活性酵素の前駆体、す なわち、酵素原として通常血液その他の組織に存在する各血餅形成因子が次々に 活性化されてタンパク分解酵素となり、今度はこの酵素が血餅形成配列における 次の酵素を選択的に侵して、これを活性酵素に変換するという一種のカスケード 反応である。各段階でカスケード的増幅が行われるので、当初における小さな刺 激も最終的には相当量のフィブリンクロット（繊維生成物である。

血液凝固カスケードは、当初は２つの別個の経路であるが、最終的にはこれらが 一つに収束する。経路の一つは血液に対して「内因性」であるが、他の一つは「 外因性」と称される。外因性と言われる理由はこれが、通常は血液中に存在しな い凝固因子によって誘発されるものだからである。外傷につづく止血において主 な役割を果すのは内因性の経路の方であるとされている。外因性経路は、多数の 病理学的環境、例えば、漫（広汎）性内皮損傷、悪性ガン、内置（素）血症、妊 娠合併症などにおいて活性化される。

現在では、第■因子、即ち、ビタミンに依存性血漿凝固因子タンパクと組織因子 、即ち、通常は血液細胞とは結合していない細胞定着タンパクが相互に作用し合 う、という相当有力な証拠がある（例えば、ネマージン、血液７１．１−８．１ ９８８年回顧号参照）。

この相互作用の結果、酵素的活性を有する活性複合体が生じ、他の２種のタンパ ク、即ち、因子Ｘと因子■をその活性のある酵素型、即ち、因子Ｘａと因子ＩＸ ａに各変換することによって凝固を開始させることになる（一般の慣習により、 活性血液凝固因子の酵素前駆体はローマ数字によって区別し、活性型は下付き文 字“ａ”で表わす。例えば、因子Ｘは酵素前駆体、因子Ｘａは活性因子を表わす ものとする）。

組織因子は、通常状態では血液と直接には接触しないほとんどすべての細胞の表 面に存在する血液凝固促進タンパクである。しかしながら、種々の薬理学的メデ ィエータ−（伝達物質）、例えば腫瘍憤死因子（ＴＮＦ）、インターロイキン１ 、エンドトキシン（内毒素）で刺激すると内皮培養細胞や単核球内に組織因子を 誘導できる。外因性血液凝固経路は因子■、即ち、ビタミンに依存性のセリンプ ロテアーゼ酵素前駆体と複合体を作る組織因子によって誘発される。一種の血液 凝固酵素補助因子である組織因子による因子■の活性化は、カルシウムの存在の 下で生じ、且つ因子■におけるコンフォメーション（配座）の変化に由来する。

例えば、ネマージン他、止血と血栓症、５ｐａｅｔ、　Ｔ、　Ｆｌ。

ｅｄＨ，、グリュン＆ストラットン、ニューヨーク、ｖｏｌ。

６、ｐｐ、２３７〜２６１，１９８２．カーソン。

Ｐｒｏｇ、Ｃｌ１ｎ、Ｐａ！ｂｏｌ　・９　：　１〜１４．　１９８４を参照） 。

しかしながら、因子■が活性化し、且つ血液凝固を開始させる原因となるコンフ ォメーション変化の正確な様子は今なお明らかにされていない。

組織因子と血液凝固因子■は、血液凝固のカスケード反応において極めて重要な 成分である。因子■を顕著に欠く個体にしばしば見られる激しい出血は、血液凝 固の外因性経路の生理学的重要性を立証するものである。これとは対照的に凝固 の内因性経路の初期段階に関わりをもつタンパク、例えば高分子キニノーゲン、 プレカリクレイン、因子■を欠く固体の場合には無症候性である。

リン脂質と結合する細胞膜定着糖タンパクである組織因子は、通常は血行中には 存在しない。しかしながら、血管が破裂すると、血漿凝固因子の一つである因子 ■は、組織因子と複合体を形成することによって、触媒として活性の種を作るの であって、これによって内因性経路の成分である因子■（血漿トロンボプラスチ ン成分）が活性化されてＩＸａが形成されると同時に、血液凝固の外因性経路に も内因性経路にも関わりをもつ因子Ｘ（スチュワード因子）が活性化されてＸａ となる。組織因子は、このように、ヒトの血液凝固経路における重要成分なので ある。ヒトの組織因子は凝固障害をモニターし研究するための一種の診断用試薬 として用いることのできる重要な物質であり、且つ凝固阻止剤として使用できる 可能性をもっている。ヒトの組織因子の化学的且つ生物学的性格づけは、このよ うに、人体における血液凝固のしくみを理解するのに明らかな重要性をもってい る。

凝固カスケード反応の諸相がこれまで明らかにされているにもかかわらず、生体 内で血液凝固が開始するときの実態については、なお十分には理解されていない 。特に、組織因子の役割はなお完全には研究されていない。凝固の内因性、外因 性各経路におけるその役割はごく最近に認識されたにすぎないからである。例え ばネマージン他、Ｐｒｏｇ、止血＆血栓症６　：　２３７〜２６１．１９８２並 びにネマージン、血液７１：１〜８．１９８８参照。加えて、試験管内での組織 因子の機序を明らかにしようとする努力も、研究用として適量の純タンパクを得 ることが困難なために阻害されてきた。因子■と組織因子の触媒作用による諸反 応の動力学解析を容易にするため、ウシの脳から組織因子をとって均一に精製す ることが行われている。Ｂａｃｂ他。

Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｂｅｍ、２５６　：　８３２４〜８３３１．　１９８１゜免疫 学的親和性クロマトグラフィーなどのタンパクを単離するのに用いられる従来の 精製技術は、ウシの組織因子に対して単クローン性抗体を使用する場合ですら煩 雑なものであり、詳細な実験や臨床にタンパクを使用する場合にその正確な量を めるに適さない。

同様に、剖検材料から取ったヒトの脳や妊娠満期の胎盤から少量のヒトの組織因 子を精製することが行わレテイル。ブローズ他、Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｂｅｍ　２ ６０　：１０９１７〜１０９２０，１９８５．グハ他、　ＰｒｏｃＮａｔｌ、Ａ ｅａｄ、Ｓｃｉ、８３　：　２９９〜３０２．　１９８６゜精製されたヒトの組 織因子を、還元条件及び非還元条件の下、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ−Ｐ ＡＧＥ）中でポリアクリルアミド電気泳動によって分析したところ、分子量４６ ，０００のポリペプチド単鎖であるように思われた。ヒトのタンパクはウシの脳 の組織因子と同じ＜、トリプシンとキモトリプシンによる切断に抵抗する。しか しながら、いくつかの免疫学的研究の示すところによれば、ウシとヒトとの組織 因子は似たような機能を示すものの、両者のタンパクの間には交叉反応性はほと んど認められない。

ヒトの組織因子のアポタンパク（アポリボ蛋白）全体についてＤＮＡシーケスコ ーディング（塩基配列暗号）をクローン化してみれば、この生物学的に重要なタ ンパクの遺伝子配列及びタンパク質配列順序が決定できるであろう。ヒトの組織 因子の遺伝子暗号は染色体１に位置していることが知られている。なおまた、組 織因子及びこれから暗号化したタンパクのアミノ酸配列順序のためのＤＮＡ配列 コーディング（暗号）に関する情報を提供する場合、組織因子についてのＤＮＡ コーディングが一旦与えられれば、染色体遺伝子の構造に関する重要な情報が得 られる。その上、クローン化したヒトの組織因子の遺伝子を適当な宿主の中に発 現させれば臨床用、診断用、また実験研究用としてすぐに使用できる組織因子が 提供されることになろう。

組織因子によって開始された血液凝固（すなわち、外因性凝固経路）に関係する タンパクをコード化（暗号）するＤＮＡ塩基配列については、組織因子自体を除 き、すでにクローン化され、決定されている。

最近のいくつかの報告には、ヒトの組織因子の一部についての相補的ＤＮＡ　（ ｃＤＮＡ）コーディングのクローン化について述べられている。モリセー他、１ ９８７、　Ｆｅｄ　、　Ｐｒｏｃ、　４６　：　７１６　（＾ｂｓｊｒ、）　； スカルバチ他、１９８７．Ｆｅｄ、Ｐｒｏｃ４６ａ　：　２２４２（Ａｂｓｔｒ 、）。これらの研究では組織因子タンパク全体についてのクローン化されたＤＮ Ａ断片のコーディングは得られていない。但し、ヒトの組織因子のアポ蛋白全体 に関するｃＤＮＡのクローン・コーディングのクローン化と配列を開示した米国 特許出願第０６２１６６号が登録された日以降いくつかの刊行物の中でヒトの組 織因子に関するｃＤＮＡクローン・コーディングの単離と配列についての報告が なされている。例えば、モリセー他、細胞５０．１２９〜１３５゜１９８７　； スパイサー他、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｊ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ　、８４　：５１４８〜 ５１５２．１９８７．スカルバチ他、生化学２６　：　５２３４〜５２３８．１ ９８７．フィッシャー他、血液４８．８９〜９９．１９８７）を参照。

本発明は、ヒトの組織因子のアポ蛋白全体、組織因子のアポ蛋白またはクローン 化されたｃＤＮＡによってコード化されるその機能部分につきコード化を行う配 列をもった完全単一クローン化ｃＤＮＡ、並びに、ヒトの組織因子のアポ蛋白全 体、端を切り取った可溶性のヒトの組織因子タンパク及び適当な宿主におけるｉ 能的部分をコード化し、且つ、これらを発現すべく誘発できるクローン化された ｃＤＮＡを含む組換え（体）ベクトルを提供するものである。

発明の要約 本発明に基づき、ヒトの組織因子アポ蛋白全体及びその機能的部分をコード化（ 暗号）するような配列のクローン化ＤＮＡをもち適当な宿主の中で機能的なヒト の組織因子アポ蛋白と可溶性組織因子を発現させる発現ベクターの生成を提供す るようなレプリカ培養（複製）の可能な組換え（体）ベクターについて記述する 。この組換え（体）ベクターはヒトの組織因子に関し同定可能なヒトの胎盤のｃ ＤＮＡライブラリーを含む組換え（体）クローニング・ベクターをスクリーニン グし、且つヒトの組織因子アポ蛋白全体に関するｃＤＮＡコーディング（暗号） を含む組換え（体）ベクターを単離することによって得られたものである。

クローン化した胎盤ｃＤＮＡのライブラリーを作ることのできる適当な組換え体 のクローニング・ベクターには、バクテリア（細菌）等の原核生物宿主の中でレ プリカ培養できるベクター、あるいは、酵母、昆虫細胞ないし動物やヒトの細胞 等の真核生物宿主の中でレプリカ培養できるベクターを含む。適当な原核生物ベ クターにはプラスミド、コスミッド及びバクテリオファージを含む。但し、これ らのみに限定するものではない。適当な真核生物ベクターには、なかんづく、ワ クチニアウィルス、ウシの乳頭腫ウィルス、シミアンウィルス４０　（ＳＶ４０ ）及びバキュロウィルスを含む。当業者にとっては、本発明の実施において広範 囲のクローニング・ベクターと宿主を利用できることは自ら明瞭であろう。

更に、本発明はヒトの組織因子アポ蛋白全体につきコード化（暗号）を行う２１ ４７塩基対（ｂ　ｐ）ｃＤＮＡ、このようなｃＤＮＡの塩基配列、並にｃＤＮＡ によってコード化されるヒトの組織因子タンパク及びその機能的部分を提供する 。このｃＤＮＡは、クローン化されたヒトの胎盤のｃＤＮＡライブラリーから同 定し単離したものである。成熟した組織因子のアポ蛋白、即ち、２６３のアミノ 酸のポリペプチド単鎖の一つは、ヌクレオチド１１２から９９７にまたがるｃＤ ＮＡ断片のひとつの読取り枠（ＯＲＦ）によってコード化される。この読取り枠 に対応するｍＲＮＡの実際上の翻訳産物は、翻訳後切断した成熟したヒトの組織 因子アポ蛋白を形成する３２アミノのリーダー配列順序又はシグナルペプチドを 有する２９５のアミノ酸の前駆体タンパク質である。

更に、式１に示すようなヌクレオチド９０乃至１３４０を含む２１４７ｂｐｃＤ ＮＡ１．２５ｋｂ（キロベース）の断片を分離した。この切断は読取り枠金体並 びに５′−と３′−のフランキング（両側）シーケンス（配列）を含んでおり、 制限酵素（エンドヌクレアーゼ）に消化されてヒトの（胎盤の）ゲノムＤＮＡ且 つ組織因子の遺伝子を９．５ｋｂＤＮＡにまで局在化し、かつまた、適当な宿主 の中でヒトの組織因子のアポ蛋白とヒトの可溶性組織因子を含むその機能的部分 とを発現する組換え（体）発現ベクターを作る目的でこれを使用した。

更に本発明は、適当な被形質転換体宿主の中でヒトの機能的組織因子を発現する ような組換え（体）形質発現ベクターを提供する。適当な形質発現ベクターには 細菌等の原核生物宿主の中で所期のタンパクを複製し発現するベクター、あるい は、酵母、昆虫の細胞、動物やヒトの細胞等真核生物宿主の中で複製するベクタ ーがある。適当な原核生物ベクターにはプラスミド、コスミッド及びバクテリオ ファージが含まれる。但し、これらのものに限定されない。適当な真核生物ベク ターには、なかんづく、ワクチニア・ウィルス、ウシの乳頭腫ウィルス、シミア ンウィルス４０　（ＳＶ４０）及びバキュロウィルスを含む。当業者にとっては 、本発明の実施において広範囲のクローニング・ベクターと宿主を利用できるこ とは自ら明らかであろう。

特に重要なのは、タンパク質のカルボキシ末端疎水膜に達する部分を欠く組織因 子タンパクの端を切り取った、可溶性のものを作る場合にも上記のベクターを利 用できることである。これらのベクターは、とりわけ、成熟したヒトの組織因子 のアポ蛋白の細胞外ドメイン又は近似的Ｎ末端２１９／２２２アミノ酸を含む可 溶性の活性組織因子の形質を発現させる。このような、切取った、可溶性のヒト の組織因子タンパク並びに、その機能的な部分、即ち、ヒトの組織因子の細胞外 ドメインから取ったペプチドは、特に診断試薬や血液凝固阻止剤として有用であ る。

図面の簡単な説明 今後は詳細説明、実施例及び図面を参照しながら本発明を説明する。

図１に示すのは成熟したヒトの組織因子アポ蛋白のアミノ酸配列とそのヒトロバ シープロットである。

第２図はクローン化された胎盤のｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングに用い るヒトの組織因子に特異的なオリゴヌクレオチド・プローブのヌクレオチド°配 列を示す。

図３は、ヒトの組織因子アポ蛋白についてのコード化（暗号）を行う２１４７ｂ ｐｃＤＮＡの略図解とそのヌクレオチド配列を得るのに用いられる方法を示す。

第４図は、組換えプラスミドｐＫｓ−２Ｂと組換えファージｍ１３／ＬＢ２ＴＦ を示す。

第５図は、２１４７ｂｐｃＤＮＡの組織因子用コーティング（暗号化）の一部と ヒトの胎盤のゲノムＤＮＡのハイブリダイゼーション（核酸雑種分子形成）を示 すサザン法によるプロットである。

第６Ａ図は、組換えプラスミドｐＬＢ４７Ｆの構造を示す。

第６Ｂ図はＭ１３／ＴＬ１３１Ｐの構造を示す。

第６Ｃ図は座位特異的突然変異誘発に用いられるオリゴヌクレオチドＴＦＡＤと Ｇ８ＰＳＴの配列を示したものである。

第７図はヒトの組織因子形質発現プラスミドｐＴＬ８ＦＱの構造を示す。

第８図は大腸菌７１−１８／ｐＴＬ８ＦＱ形質転換体によって産生されたヒトの 組織因子をウェスターン法によってプロットしたものである。

第９図は哺乳動物の細胞中にあるヒトの組織因子を発現させるためのｐＭＡＭ／ ＴＦシャトルベクターを表したものである。

第１０図はプラスミドｐＬＢ５ＴＦの構造の略図解である。

第１１図は可溶性組織因子表現ベクターｐＬＢ６ＴＦの構造を略図で示したもの である。

第１２Ａ図は、大腸菌７１−１８／Ｉ）ＬＢ６７Ｆ形質転換体によって産生じた ヒトの可溶性組織因子をウェスターン法によってプロットしたものである。

第１２Ｂ図は単クローン抗ヒト組織因子性特異的抗体吸着体（免疫吸着体）カラ ムの免疫アフィニティクロマトグラフィ−（親和性）によって精製したヒトの可 溶性組織因子をウェスターン法によってプロットしたものである。

本発明の説明 本発明は、ヒトの組織因子アポタンパク全体又はその機能的部分をコード化（暗 号化）し、且つまた、適当な宿主の中でその形質を発現させるような配列をもっ た、クローン化したｃＤＮＡ挿入物（インサート）を含むところの、レプリカ培 養（複製）の可能な組換えベクターを提供するものである。この組換えベクター は、適当な宿主の中で複製できるクローニングベクターに挿入されたクローン化 したヒトの胎盤ｃＤＮＡライブラリー中のヒトの組織因子についてのＤＮＡ塩基 配列暗号（コーディング）をスクリーニングして得たものである。ヒトのｃＤＮ Ａライブラリーをクローン化するための好ましいベクターの中に含まれるものと しては、プラスミド・バクテリオファージその他の細菌中で複製できるベクター 、また、酵母、昆虫の細胞、ヒトの細胞等の真核生物宿主の中で複製できるベク ターがある。原核生物に含まれるものとしては、なかんづく、プラスミド・コス ミッド及びバクテリオファージがある。真核生物ベクターに含まれるものとして は、なかんずくワクチニア・ウィルス、ウシの乳頭腫ウィルス、５ｖ４０、酵母 のベクター、並びにバキュロウィルスがある。好ましいクローニングベクターと してはバクテリオファージλｇ　ｔ　ＩＬ即ち、ヤング及びデーヴイス、科学２ ２２　：　７７８〜７８２゜１９８３によって記述された形質表現ベクターがあ る。

好ましい宿主生物は、λｇｔｌｌの宿主として既知のヒトの組織因子のアポタン パク全体を暗号化（コード化）する２１４７ｂｐＤＮＡ断片は、λｇｔｌｌ内に クローン化したヒトの胎盤のｃＤＮＡライブラリーから単離した。ヒトの組織因 子の暗号配列は、特定のオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション・プロー ブと雑種形成（ハイブリッド）したＤＮＡをもつ組換えバクテリオファージをス クリーニングすることにより、クローン化された胎盤のｃＤＮＡライブラリーに おいて同定した。このハイブリダイゼーション・プローブのＤＮＡ塩基配列は、 （ｉ）アミノ端、（ｉｉ）カルボキシ端、及び（ｉ　ｉ　ｉ）組織因子のポリペ プチド鎖の内部からの短ペプチド断片のアミノ酸配列に対応し、且つこれらアミ ノ酸配列についての暗号化を行う。

また、本発明は、特に、ファージλｇｔｌｌ内でクローン化した胎盤ｃＤＮＡラ イブラリーから得た組換えバクテリオファージλ１０，３であって、胎盤ｃＤＮ Ａライブラリーから得たヒトの組織因子アポタンパク全体についての暗号化を行 うクローン化された２１４７ｂｐｃＤＮＡを含むものを提供する。同じく本発明 に含まれるものとして、同じようにλｇｔｌｌから得た、組織因子暗号配列を含 む第２のバクテリオファージ、λ３，４がある。ファージ、λ３，４はヒトの胎 盤のｂｐｃＤＮＡライブラリーからのクローン化された１６１６ｂｐｃＤＮＡ挿 入物を含むが、そのヌクレオチド配列は、ファージλ１０，３の２１４７ｂｐｃ ＤＮＡ挿入物（インサート）の３′部位に一致し、且つ、組織因子アポタンパク のカルボキシ端部位についての暗号化を行う。

また、本発明はヒトの組織因子アポタンパク全体に対するクローン化された２１ ４７ｂｐｃＤＮＡ暗号を提供する。式Ｉにその配列を提供する。ＤＮＡ塩基配列 の特徴とするところは、ヌクレオチド１１２〜１１４におけるＡＴＧ開始コドン から２９５アミノ酸のポリペプチド単鎖をコード化する、ヌクレオチド９９７〜 ９９９におけるＴＡＡ終結へと延びる単一の読み取り枠であって、上記ポリペプ チド単鎖は３２アミノ酸のリーダー配列を含む組織因子前駆体タンパクである。

この成熟した組織因子のアポタンパクは、５ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａ ｓｈのアミノ端配列をもつ２６３アミノ酸の単一ポリペプチドである。

同じく式１（残基−３２で始まる）に配列を示した上記の前駆体タンパク質は、 翻訳後に、式１の＋１で示すアミノ残基で開始する配列をもつ成熟した組織因子 アポタンパクに変換される。この成熟組織因子アポタンパク（炭水化物を含まず ）の分子量は計算の結果およそ２９，６００となった。

また、本発明は、組織因子用２１４７ｃＤＮＡ挿入物（インサート）暗号プラス 組織因子ｃＤＮＡ挿入物（インサート）の各端末の両側にくる約１０００ｂｐの λＤＮＡを含む約４．１５ｋｂのＤＮＡ断片をｐＵｃ１９のラクトースオペロン Ｚ′に挿入することにより、大腸菌のクローニング・ベクターｐＵｃ１９から得 られる組換えプラスミドｐＫｓ−２Ｂを提供する。ｐＫｓ−２Ｂは、ｐＵｃ１９ の既知の宿主である大腸菌株７１−１８を変換するのに用いられてきたち体は、 ヒトの組織因子用２１４７ｂｐｃＤＮＡ断片暗号化のソース（種）として好まし いものである。

組織因子用のクローン化された２１４７ｂｐｃＤＮＡ暗号の利用可能性により、 タンパク質についての暗号化を行うヒトのゲノム遺伝子を特徴づけることが可能 になっている。読取り枠を含み、且つ、５′−及び３′−のフランキング・シー ケンスを含む、式１に示したヌクレオチド９０−１３４０にまたがる１、２５ｋ ｂＤＮＡ断片は、プラスミドｐＫＳ−２Ｂの制御酵素消化作用によって得られた 。この１．２５ｋｂ断片を、消化されたヒトの胎盤のゲノムＤＮＡの９．５ｋｂ ＤＮＡ断片と雑種形成（ハイブリッド）した。この９．５ｋｂゲノムＤＮＡ断片 は、組織因子用配列暗号内に少なくとも３つのイントロン（介在配列）を含むも のとされている。この組織因子遺伝子はヒトの染色体１にすでにマツピングされ ているが、これまでのところ、特定のゲノムＤＮＡ断片に対する遺伝子の位置は 割り出されていない。また、１．２５ｋｂ断片は、適当な宿主細胞内に、ヒトの 組織因子のアポタンパク全体及び可溶性のヒトの組織因子のための形質発現ベク ターを作る場合にも使用されている。

タンパクをコード（暗号）化し、且つ、タンパクの約７０％のアミノ酸配列解析 によって確認されるλ１０．３のｃＤＮＡ挿入物（インサート）の配列から予測 されるヒトの組織因子アポタンパク全体のアミノ酸配列に基づき、この内在性膜 結合タンパク質についてのドメイン構造を提案する。タンパクのドメインは、タ ンパク質の独立に折りたたまれた機能的部位、と定義できる。本発明の提供する ヒトの組織因子アポタンパクのドメインのひとつひとつは、次のような独自の構 造上、機能上の特徴を備えている。即ち、（ｉ）翻訳後、前駆体タンパク質から 成熟した活性組織因子への転換と同時に除去される３２アミノ酸のシグナルペプ チド又はリーダー配列；（２）アミノ端末的２１９のアミノ酸を含む、細胞外の 、一般的に疎水性のＮ−グリコジル化反応したドメイン、（３）タンパク質の細 胞膜にまたがる部分と考えられているアミノ酸約２２０乃至２４２を含む、主と して疎水性のアミノ酸から成る約２３のアミノ酸ストレッチ（延長）；及び（４ ）細胞内の細胞膜ドメインとされている、アミノ酸残基約２４３乃至２６３を含 む約２１のカルボキシ端アミノ酸。

第１図に示すのは、式１に記するようなアミノ酸配列を有する、本発明による実 質的に純粋な成熟したヒトの組織因子アポタンパク（これから３２アミノ酸シグ ナルペプチドを除去する）のドメイン構造と考えられているものである。組織因 子のドメイン構造として提示したもの（１−４）のいくつかの際立った特徴を第 １図から読み取ることができる。

分子には４つの潜在Ｎ一連鎖炭水化物組込み位置（Ａｓ　ｎ−Ｘ−８ｅ　ｒ／　 Ｔｈ　ｒ）が見出される。これらの位置の一つはカルボキシ末端の細胞膜ドメイ ンに在り、従って、おそらくはグリコジル化していない。

細胞外ドメインにある三つの位置のそれぞれは、第１図の（◇）印によって示さ れているが、このうちの二つの位置は、アミノ酸配列解析法によって炭化水素を もっているものと同定されている。実施例１に述べたように、ｃＤＮＡ塩基配列 からアスパラギンと予測されたアミノ酸１１及び１３７（Ｉ式）においては、Ｐ ＴＨアミノ酸は一つも同定することができなかった。

これらのＡｓｎの残基のおのおのは、炭水化物組込み位置の初めの方を占める。

一般に炭水化物は、組織因子のような膜結合糖タンパクの細胞外タンパク質にの み見られるものであり、従って、炭水化物は細胞外ドメインにのみ見出されるも のと期待されよう。

なお、同じく第１図及び式１から明らかなように、ヒトの組織因子には全部で５ つの半シスチン残基が含まれ（第１図の丸で囲んだ個所）、そのうちの４つは細 胞外のドメインに在り、従って、おそらくはジスルフィド結合をなしている。ジ スルフィド架橋の存在は、すテニ以前バッハ他、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｂｅｍ、　２ ５６　：　８３２４−８３３１．１９８１による観察によって暗示されていたと ころである。こ・れは、ウシの組織因子についての所見で、ＳＤＳの存在の下で ２−メルカプトエタノールを用いて還元したところ、組織因子の凝固促進活動が 失われるにいたったが、ＳＤＳで処理した時にはそうはならなかった、という内 容のものである。ヒトの組織因子の位置２４５におけるＣｙｓは、分子間のジス ルフィド結合の形成には与からないとされる。細胞質ドメインで分離される、と 思われるからである。

単−のメチオニン残基Ｍｅｔ”０におけるＣＮＢｒの切断により、ジスルフィド 結合還元なしに精製した組織からカルボキシ端ペプチドが遊離する、という観察 により、ヒトの組織因子のＣｙＳ２４５は分子間ジスルフィド結合の形成に関わ らない、といういまひとつの確認が得られた。ＣｙＳ２４５は、バッハ他、生物 学２５：４００７−４０２０．１９８５によって記述されているように、おそら くは、組織因子の自家会合をモジュレートしながら、あるいは、精製中にタンパ ク質ないし脂肪酸のような他の物質と相互に作用することによって、分子間のジ スフィルド結合を形成するとも考えられる。

また、第１図には、カイト及びトウーリットル、Ｊ。

Ｍｏ１ｅｃ、　Ｂｉｏｌ、１５７　：１０５−１３２．１９８２の方法によるヒ トロバシープロットを示す。これは、組織因子の膜ドメインの疎水特性をグラフ に描いたものである。多値は２１アミノ酸の配列の平均ヒトロバシー指数として 計算し、これを各配列の中間残基にプロットした。タンパク質のカルボキシ端末 部位における２３非極性アミノ酸の連続的ストレッチ（延び）は、細胞の形質膜 の脂質二重層にまたがる内在性膜タンパク質のドメインに特有のものである。更 に、正の負荷をもつ４つのアミノ酸（第１図で（＋）印を付したもの）が、疎水 部位のカルボキシ側のすぐ近くに観察されるが、これは多数の膜内在性タンパク の膜と細胞質ドメインの間の界面に見られる特徴である。（例えば、サバチニ他 、Ｊ、Ｃｅ１ｌ、Ｂｉｏｌ、　９２　：　１〜２１．　１９８２を艷照）。更に 、組織因子の細胞質ドメインと思われるところには、低密度のりボタンバク受容 体とトロンボモジュリン（ｊｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ）に共通の特徴がある 。

即ち、この部位につき３つのタンパク質すべてを比較したところ、細胞質ドメイ ンは短く、且つ、単一のＣｙｓ残基を含むことが分った。（例えば、ジャックマ ン他、Ｐｒｏｅ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　８３　：　８８３４〜８ ８３８．１９８６及び山本他、細胞３９：２７〜３８．１９８４を参照）。

１式に示すような実質上純粋なヒトの組織因子及びその明らかなドメイン構造に つき配置を決定することにより、可溶性組織因子の形質を発現する形質発現ベク ターを含む形質転換宿主の外へ出すことのできるタンパク又はその部分の細胞外 ドメインを含むヒトの可溶性組織因子を産生ずることが可能になった。この配列 は、また、ヒトの組織因子の機能的部分、即ち、ヒトの組織因子から取ったペプ チドの産生をも可能にすもので、このペプチドは診断試薬として、また、因子■ が組織因子と結合することを防ぐ目的で使用することができる。無処理組織因子 は膜結合の疎水性タンパクである故、通常、ヒトの組織因子全体の形質発現のた めのベクターを含む形質転換宿主からこのタンパクを分離することは容易ではな い。しかしながら、可溶性の組織因子を多量に使用できることから天然のタンパ クを産生ずることは可能である。ヒトの組織因子の膜に広がるドメインと細胞質 ドメインは、適当な技術、無処理のヒトの組織因子アポタンパクは、ＤＮＡ組換 え技術その他の方法によって産生じた可溶性のヒトの組織因子を、フラグメント 縮合等のタンパク合成方法又はタンパク半合成技術を経由させるペプチド合成技 術によって生成した膜／細胞質ドメインとの共有結合により再構成できる。

本発明による可溶性の組織因子には疎水性の膜スパニング（ｓｐａｎｎｉｎｇ） 　と細胞質ドメインを欠いている。

しかし、驚くべきことに、これまで産生されたことがないこのような可溶性組織 因子は、因子■の活性化、及び標準２段階の血液凝固検定における、これに続く 因子■とＸの切断によって測定されるような最小限程度の凝固促進活性を備えて いる。因子■と効果的に結合するこの可溶性組織因子は、未変性のヒトの組織因 子の凝固促進活性に対する阻害剤としての有用性ももっている。従って、可溶性 組織因子は一種の診断試薬として、また、臨床用の潜在的抗凝固剤として強力且 つ、重要な力を内在する。

ヒトの組織因子及びプラスミドｐＫｓ−２Ｂ用のクローン化２１４７ｂｐｃＤＮ Ａ暗号により、形質転換した宿主の中で臨床用、診断用また実験研究用のヒトの 組織因子アポタンパク質及び可溶性のヒトの組織因子を産生ずる組換え形質発現 ベクターを構成することが可能になった。このような形質発現ベクターの中には 、細菌等の原核生物中で複製し発現するもの、あるいは、酵母、昆虫の細胞及び 動物ないしヒトの細胞のような真核宿主内で複製するものが含まれる。適当な原 核生物ベクターにはプラスミド、コスミッド及びバクテリオファージが含まれる 。但し、これらに限定されるものではない。また、適当な真核生物ベクター形質 には、なかんづく、ワクチニア、ウィルス、ウシの乳頭腫ウィルス、シミアンウ ィルス４０　（ＳＶ４０）、酵母ベクトル及びバキュロウィルスが含まれる。当 業者にとっては、本発明の実施において、広範囲のクローニング・ベクターと宿 主を利用できることは自ら明瞭であろう。

特に、はぼ１−２１９／２２０のアミノ酸にまたがる可溶性組織因子、即ち、成 熟したアポタンパク質の細胞外ドメインをＤＮＡクローン化技術によって調整し た。可溶性の活性組織因子のＤＮＡ暗号化は、１式に記す組織因子のタンパク配 列順序のアミノ酸２１９／２２０についてのヌクレオチド暗号化のすぐ後に、こ の組織因子の遺伝子の中に停止コドンを挿入することによって行った。その結果 、ヒトの組織因子のうち、疎水性の膜にまたがる部位（ドメイン３）並びに細胞 質（ドメイン４）が欠失した（第１図参照）。

また、上記の代りになるものとして、部位特異的突然変異を含む他の技術により 、シグナルペプチドを伴う、ないしは伴わない細胞外ドメインを含む可溶性組織 因子を産生じて切断された可溶性タンパクを生成するか、もしくは、成熟したタ ンパクの２１０における独自のメチオニン（Ｍｅｔ）残基においてタンパク質を 切断するＣＮＢｒによりλ１０，１１への２１４７ｂｐｃＤＮＡ挿入（インサー ト）によってコード（暗号）化される成熟タンパク（シグナルペプチドなし）を 切断してこれと同じ結果を得ることができる。このような可溶性組織因子のタン パクは凝固阻止剤及び血液凝固障害の診断用薬として用いることができる。更に 、可溶性タンパク質から得たペプチドに対応する可溶性タンパクの機能的部分を 凝固阻止剤及び診断試薬として使用することも可能である。

凝固促進活性をもつような無傷のヒトの組織因子アポタンパク質は、組織因子の 疎水性ドメインと細胞質ドメインを含むアミノ酸を添加することにより、可溶性 組織因子から再構成できる。この疎水性ドメイン及び細胞質ドメインは、フラグ メント縮合やタンパク質半合成等周知のタンパク化学の技術により、可溶性組織 因子タンパクに添加することができる。

また、本発明は、ヒトの組織因子及びタンパクの各部を暗号化するＤＮＡ塩基配 列のうち、ドメイン（１）〜（４）の構造、機能上の特徴をもつような部分を提 供する。

更に、本発明は、これまで産生されることのなかった、実質的に精製された可溶 性組織因子をも提供する。

プラスミドｐＫＳ−２Ｂを担う大腸菌株７１−１８は、ＡＴＣＣ（米代表徴生物 種保存機関）に登録、受、け入れ番号６７４２６を付与されている。

以下に本発明を具体的に説明する実施例をいくつか掲げるが、これらは本発明を 限定することを目的とするものではない。

についてのアミノ酸配列分析 組織因子についてのクローン化されたｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ暗号化を行うに先立ち、タ ンパク質配列順序決定技術により、ヒトの胎盤の組織因子につき約６７％のアミ ノ酸配置順序を得た。アミノ酸の配列順序を知ることにより、クローン化された 胎盤ｃＤＮＡライブラリー中の組織因子を暗号化するＤＮＡ塩基配列についての スクリーニングをするために使用する、実施例２に示す特定のオリゴヌクレオチ ド雑種形成（ハイブリッド）プローブを設計することができた。タンパク質の配 列順序は次のようにして決定した。即ち、グハ他。

１９８６、Ｐｒｏｃ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、３３　：２９９ 〜３０２によって記述されているような因子■の親和性カラムを用いて精製した ヒトの脳の組織因子に対する単クローン製免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）。

ＨＴＦＩ−７Ｂ８をカーソン他、血液７０：４９０−４９３．１９８７によって 調製した。この抗体は、コロラド州立大学保健科学センターのスティーヴンＤ。

カーサン博士とシナイ山医学校のロナルド・バッハ博士から得たもので、ヒトの 組織因子の免疫親和性単離のための免疫吸着カラムを調製する目的で使用した。

組織因子は界面活性剤オクチルフェノキシ・ポリエトキシ（１０）エタノール（ トリトン’　Ｘ−１００）を用いてヒトの脳ないし胎盤組織のアセトン粉末から 抽出、次いで免疫親和カラムに吸着させた。トリトン８×−１００を含むｐＨ７ ，５の緩衝液で洗浄した後、ｐＨ２，５で単質をカラムからま溶離した。次いで これを濃縮した後、トリトン’　Ｘ−１００に入れたウルトラゲルＡｃＡ３４で 更に精製、組織因子をともに溶出した少量の混在物質から分離し、実質的に均質 なタンパク標本を得た。各標本の純度は５ＤＳ−ＰＡＧＥ（ラエムリ）、「ネイ チャーＪ　２２７　：　６８０〜６８５．１９７０）で評定した。バッハ他、Ｊ 、　Ｂｉｏｌ。

Ｃｂｅｍ、２５６　：　８３２４〜８３３１．１９８１に記述されているような リン脂質小胞内に界面活性剤可溶化タンパクを再構成した後、標準２段階凝固検 定法により標本中の組織因子凝固促進活性を測定して精製をモニターした。

各組織因子標本のアミノ酸組成及びタンパク濃度をアミノ酸分析によって決定し た。即ち、０．１ＭのＮａＣ１中に入れた１０Ｍｇのヒトの組織因子アポタンパ ク、０．０５Ｍのトリス（ｐＨ７，５）及び０．１％のトリトン’Ｘ−１００に １０％のトリクロロ酢酸（Ｔ　ＣＡ）を添加して沈殿させた。１５分間氷冷した 後、５．ＯＯＯＸｇで３０分間の遠心分離してタンパク質をペレット化した。界 面活性材とＴＣＡの残留物はアセトン抽出（３×）によって取り除いた。

ペレットは真空中で乾燥させ、１１５℃で６時間、０．２％のフェノールを含有 する６ＮのＨＣｌ中で加水分解した。加水分解物はベックマン１２１Ｍアミノ酸 分析装置で分析した。

アプライド・バイオシステム社（カリフォルニア州フォスター市）の気相シーク エネーターを用いて無傷の組織因子とこれから生成したペプチド断片のアミノ酸 配列分析を行った。配列決定の各サイクルで遊離したフェニルチオヒダントイン （ＰＴＨ）誘導体をメリル他、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５９　＋　１０８５ ０−１０８５６゜１９８４が記述した方法で同定した。各タンパク質１００〜２ ００μｇを用いて無傷なヒトの脳と胎盤の組織因子のアミノ酸配列順序を決定し た。タンパクは上記のようにして沈殿させた後、１００％のトリフルオロ酢酸（ Ｔ　Ｆ　Ａ）に溶解しＧＦ／Ｃガラス濾過器のディスクに塗布して気相配列決定 を行った。ＴＣＡの沈殿とアセトン抽出の後、塩酸グアニジン０．８ｍ１６Ｍ、 ＮａＨＣＯ３５０ｍＭにｐＨ８，０で溶解した。

タンパクのアミノ端末は、１ｍｇの固体無水コハク酸（ピアスケミカル社）を３ 回連続して添加するスクシニル化によって遮断した。添加のたびごとにＩＮのＮ ａＯＨでサンプルのｐＨを８．０に調整してから３０分間攪拌した。その後、こ れにトリトン８×−１００を加えて最終濃度を０．１％とし、こうしてできた混 合物を２５℃で一晩中透析した。無傷のタンパクをスクシニル化し、且つ、タン パク中の単一メチオニン残基Ｍｅｔ２１°においてＣＮＢｒを用いて切断した時 に気相配列分析法によってカルボキシ末端ＣＮＢｒペプチド（残基２１１乃至２ ６３）のうち残基２１１乃至２４４にまたがる一部のアミノ酸配列順次を得た。

このカルボキシ端ＣＮＢ　ｒペプチドは約６０μｇの胎盤アポタンパクから調整 した。

ＴＣＡで沈殿させた胎盤の組織因子（１２０μｇ）からトリプシンペプチドをも 調整した。ＨＰＬＣで単離した後、このペプチドの配列を決定することにより更 に配列情報を得た。ＴＣＡ沈殿タンパク質のペレットは５０μｍ（Ｚ８Ｍ尿素で 可溶化し、この溶液を１５０μｌ、５０ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ，で希釈した。

次いで、Ｎ−トシル−Ｌ−フェニルアラニンクロロメチルケトン（Ｔ　Ｐ　ＣＫ 、　クーパーバイオロジカル社）で処理したトリプシンを重量比１：２５０リプ シン：組織因子）の比率で添加した。２４時間、３７℃で消化させ、０．０５％ のＴＦＡで平衡させたヴイダックＲＣ−１８ＨＰＬＣカラム（０，４５Ｘ２５ｃ ｍ）に注入し、毎分１　ｍ　ｌの流量で流した。ペプチドは直線濃度勾配の緩衝 液Ｂ　（０，０５％ＴＦＡ、８０％アセトニトリル）で次のようにして希釈した 。すなわち、０〜６３分（２％〜３７．５％Ｂ）、６３〜９５分（３７，５％〜 ７５％Ｂ）、及び９５〜１０５分（７５％〜９８％Ｂ）。溶出プロフィルは２１ ０ｎｍと２８０ｎｍにおける吸光度でモニターした。無傷のタンパクについて上 記のようにして単離トリプシンペプチドの配列を決定した。

ヒトの組織因子についての２１４７ｂｐｃＤＮＡインサ一ト暗号を含むファージ λ１０，３を、ヒトの組織因子の暗号配列のため形質発現ベクターのファージλ ｇｔｌｌ内にクローン化されたヒトの胎盤のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニ ングすることによって単離した。約１．２Ｘ１０６の独立した胎盤ｃＤＮＡを含 む組換え型を有する上記ライブラリーはクローンチック社（カリフォルニア州パ ロアルト市）から購入した。λｇｔｌｌは、β−ガラクトシダーゼ用の大腸菌１ ａｃＺ遺伝子暗号を含む周知のクローニングベクターである（ヤング及びデーヴ イス、サイエンス２２２：１８０〜１８２．１９８３）。

クローン化した胎盤ｃＤＮＡライブラリーの中から組織因子暗号配列をスクリー ニングするため、３つのオリゴヌクレオチド雑種形成（ハイブリッド）プローブ を合成した。第２図に示すこれらのプローブは、実施例１で決定した組織因子の ポリペプチド鎖の種々の部位（アミノ端末、カルボキシ端末及び内部）からの類 ペプチドのアミノ酸配列順序に対応し、且つこれについての暗号化を行うＤＮＡ と雑種形成（ハイブリッド）させた。オリゴヌクレオチド・プローブは、アプラ イド・バイオシステム社の３８０ＡＤＮＡシンセサイザーを用いたホスホラミダ イト法によって合成した。

プローブはＨＰＬＣによりヌクレオーゲンＤＥＡＥ６０−７カラム（マケリ＝ナ ゲル社）で精製し、またこれらの５′端において３２ＰＡＴＰ　（アマージャム 社）とＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ファルマシア社）を用いて約１ｘｌＯ” 　ｃｐｍ／μｇの比活性まで放射ラベルをつけた。

実施例１に示すようなヒトの組織因子のアミノ酸部分配列の決定により、オリゴ ヌクレオチドの雑種形成（ハイブリッド）プローブを構成できた。第２図を参照 することにより、組織因子タンパクの３つの部位についてのＤＮＡ暗号にこれら のプローブが対応しているのが分る。すなわち、プローブ＃１はアミノ酸２４〜 ２９（タンパクのアミノ端部位）の配列暗号に対応しプローブ＃３はアミノ酸２ １０〜２１５（タンパクのカルボキシ端部位）の配列暗号に対応、またプローブ ＃２はアミノ酸１４５〜１４９（ポリペプチド鎖の内部部位）の配列暗号に対応 する。プローブ＃１と＃３は二つと共に３２オリゴヌクレオチド、長さは各１７ 塩基で、各ペプチドについての可能的暗号配列のすべてに対し相補性をもってい た。プローブ＃２は、ヒトの組織因子の内部トリプシンペプチドについての最適 なりＮＡ配列暗号に対応する単一の４５基デオキシオリゴヌクレオチド（４５ｍ ｅｒ）であった。４５ｍｅｒプローブの場合の最適暗号配列は、レーダ、Ｊ。

分子生物学１８３　：　１〜１２．１９８５が記述しているヒトの構造遺伝子に おける優先コドンに基づいて選択した。

また第２図にはｃＤＮＡ断片部位における、１式に示すようなヒトの組織因子に 対するｃＤＮＡ暗号の配列部分のうちプローブ＃２と雑種形成（ハイブリッド） したものを示す。星印（＊）はプローブ＃２と実施例３に定めたような、実際の 組織因子ｃＤＮＡ暗号配列との間の不適性塩基対を示している。プローブ＃２と 組織因子のｃＤＮＡ暗号との間の全相同性は７５％であった。当初はＡｒｇと同 定していた残基１４８は後にＴｒｐと同定された。

胎盤ｃＤＮＡのライブラリーのスクリーニングは、寒天平板に培養した大腸菌ｋ １０８８細胞の菌叢に組換えファージを平板分離する方法で行った。λｇｔ１１ の宿主である大腸菌ｋ１０８８はアンピシリン抵グ及びデーヴイス、サイエンス ２２２　：　７７８〜７８２．１９８３を参照。スクリーニングは、主として、 組換えλｇｔｌｌのプラークを寒天平板からニトロセルロースフィルターに移し 、且つ、固定ファージＤＮＡを（３２，’）−オリゴヌクレオチド・プローブと 市コールドスプリング、コールドスプリング港ラボラトリ−，１９８２のプロト コルに従って行った。

大腸菌ｋ１０８８の上に平板分離したプレート８５〔につき約３〜５Ｘ１０’の ファージを、プローブまで複製フィルタでリフトして（コロニー／プラーク・ス クリーン、ニューイングランドニュクリアー）スクリーニングした。プラークは 先ず、６ｘＳＳＣ（ＩＸＳＳＣ＝０．１５Ｍ　ＮａＣ１，０，０１５クエン酸ナ トリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ））においてＴｍ−２５℃ でプローブ＃２と雑種形成（ハイブリッド）させることによってスクリーニング した。次いで２ＸＳＳＣ中、Ｔｍ−８℃で上記のフィルタを洗浄、強力スクリー ン（デュポン・ライトニング・プラス）を用いて１６〜４０時間、−７０℃でオ ートラジオグラフィーにかけた。プローブ＃２に対して陽性シグナルを示したフ ァージは主としてプラーク精製してから、ベントン及びテーヴイス、サイエンス １９６：１８０−１８２．１９７７に記述するプローブ＃と＃３にハとブリッド 形成させることによって再スクリーニングを行い、擬似陽性を取り除いた。

胎盤ｃＤＮＡ挿入物インサートを含む約２．５×１０６の組換えλｇｔｌｌファ ージをプローブ＃２でスクリーニングした。このライブラリーから３６の潜在陽 性プラークを分離、精製し、さらに、プローブ＃１及び＃３とのハイブリッド形 成によってスクリーニングした。いづれの場合でも、プローブ＃２はプローブ＃ １ないし＃３よりも有意的に強いハイブリッド形成シグナルを示した。当初３６ あった単離された組換え型λファージの中僅かに２つが第２のプローブに反応し た。組換えファージλ１０，３はプローブ＃１及び＃３に対し陽性を示したが、 組換えファージλ３゜４は、プローブ＃３とのみハイブリッド形成した。従って 、ヒトの組織因子にかかわるｃＤＮＡ暗号を含む組換えファージ・クローンの数 は、２．５Ｘ１０６の組換え体につき２〜３４と推定された。このようにして、 胎盤ｃＤＮＡ中に比較的多い組織因子配列は、７Ｘ１０’〜Ｉ　Ｘ　１０’　ｃ 　ＤＮＡにつき１つのヒト組織因子ｃＤＮＡの割合であると推定された。

組換えファージλ１０．３とλ３，４は、その宿主生物である大腸菌に１０８８ の中で守備よ（繁殖した。

これにより、ヒトの組織因子のためのＤＮＡ挿入物暗号を含む組換えファージλ １０，３とλ３，４を大量に産生することが可能になった。

制限（酵素）分析の結果λ１０，３には２１４７ｂｐＤＮＡインサートが含まれ るのに対し、λ３，４には１６１６ｂｐインサートが含まれることが示された。

λ１０，３とλ３，４の制限酵素断片ＥｃｏＲＩ。

５ａｕ３Ａ及びＨｉｎｄＩＩＩをファージのクローニング・ベクターＭｌ　３ｍ ｐ　１８とＭｌ　３ｍｐ　１９の中にクローン化しくメッシング、Ｍｅｔｂ、Ｅ ｎＢｍｏｌ、１０１　：２０〜７８．１９８３）、これによってヌクレオチドの 配列分析をしやすいようにした。２つの組換えファージの各々におけるｃＤＮＡ インサートの配列順序は、（３５Ｓ）−デオキシアデノシン５′−（α−チオ） 三リン酸（アマ−ジャム；５００ｍＣ１／ｍモル）を用い、サンガー他、Ｐｒｏ ｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、７４　：　５４６３〜５４６７．１９７７による チェインターミネータ−法によって決定した。配列決定反応は、オートラジオグ ラフィーに先立って一晩中乾燥させた６％ポリアクリルアミド−７Ｍ尿素ゲルで 分析した。鎖長反応は、ＥｃｏＲＩ位置に関係する位置−２０と−４０に対し相 補的な１７のＭ１３ヌクレオチドプライマーを用いてプライマー合成したにュー イングランド・バイオラブズ；プライマー＃１２１１及び＃１２１２）。さらに 、ヒトりの組織因子ｃＤＮＡの暗号配列に対して相補的な１８の異なるオリゴヌ クレオチド１８ｍｅｒを実施例２に記述したようにして合成し、Ｍｌ３中の大型 インサート内に配列決定反応を開始するために使用した。

第３図に示したのは、λ１０，３に挿入したヒトの組織因子用クローン化２１４ ７ｂｐｃＤＮＡ暗号全体の制限酵素地図並びにλ３，４への対応する切断１６１ ６ｂｐＤＮＡインサート（挿入物）である。これらｃＤＮＡの双方ともに２つの ＥｃｏＲ１内部位置を含み、且つλ３，４の小さい方のｃＤＮＡがλ１０，３の 大きな方のＤＮＡインサートにすっぽり覆いかぶさって重複していることが分っ た。

第３図について見ると、Ｍ１３サブクローンを形成するのに用いる制限酵素位置 は図の上部に示しである（ＲＩ＝ＥｃｏＲＩ　；　５＝Ｓａｕ３Ａ；Ｈ３＝Ｈｉ ｎｄｍ）。中空の細長い部分と黒く塗りつぶした横線部は、各、シグナルペプチ ドと成熟タンパクの暗号部位を表わしている。同じく第３図の２番目と３番目の ラインは、λ３，４とλ１０，３への組織因子ｃＤＮＡインサートの相対的大き さと位置をそれぞれ示している。波線部はＭ１３サブクローンから決定したＤＮ Ａ塩基配列の長さと方向を示す。丸で示したのは、配列決定反応を開始させるた め合成プライマーを用いた個所である。

これらのプライマーは、ヌクレオチド２８３−２６７゜３２６〜３３９，５３９ 〜５２７，８２１〜８３８゜１０７５〜１０３９．１３１０〜１２９３．１８７ ５〜１８５７及び１８７５における２１４７ｂｐｃＤＮＡの配列順序に対応して いる。ヌクレオチドの配列は、ＤＮＡの両ストランドにつき、成熟組織因子アポ タンパク質のｃＤＮＡ配列は１００％、ｃＤＮＡ配列全体は約８０％として決定 した。

ヒトの組織因子用のλ１０，３暗号からの２１４７ｂｐｃＤＮＡ全体のヌクレオ チド配列を１式に示す。

式Ｉにおいて、２１４７ｂｐｃＤＮＡは、ヌクレオチド１１２〜１１４における ＡＴＧ開始コドンからヌクレオチド９９７〜９９９におけるＴＡＡ停止コドンに 延びる約８８５ｂｐの単一な、長い読取り枠を含んでいる。２６３アミノ酸のヒ トの成熟組織因子アポタンパク質の前駆体である２９５アミノ酸の前駆動体タン パクに対しこの読取り枠が暗号化を行う。また、同じく式１１．：ＤＮＡ塩基配 列から導いた前駆動体タンパク質の配列全体を示す。実施例１で決定したような ヒトの成熟組織因子（Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ）のアミノ端未 配列との比較に基づき、この前駆動体タンパクには３２アミノ酸リーダー配列ま たはシグナルペプチドが含まれることが分った。

１式に見る通り、２１４７ｂｐｃＤＮＡに対応するｍＲＮＡの５′不翻訳部位は 、他の多（の真核生物シグナルペプチド部位の場合と同じ＜ＧＣがきわめて豊富 （Ｇ＋Ｃで７２％）である（例えば、大野能、ネイチャー３２５：１６１〜１６ ６．１９８７参照）。暗号化部分につづ＜１１４７ヌクレオチドの３′不翻訳配 列は僅かにＡＴが高かった（Ａ＋Ｔで６３％）。ヌクレオチド２１２１〜２１２ ６における配列ＡＡＴＡＡＡはその後のヌクレオチド２１４２〜２１４７で６つ のＡ残基が並んでいるので、明らかにｍＲＮＡのポリアデニル化である。

式■に揚げる１織因子のＤＮＡ塩基配列順序暗号化の精度は、組織因子用ｃＤＮ Ａ暗号化の読取り枠から予想されるタンパクのアミノ酸配列と、ヒトの脳と胎盤 から精製し、式Ｉに記すタンパクの配列順序決定技術によって配列を定めた無傷 の組織因子とそのトリプシン消化物のアミノ酸配列とを比較して評定した。

上述のようなアミノ酸配列によって確認した組織用ｃＤＮＡ暗号化の読取り枠の 配列から予想される組織因子アポタンパク質のアミノ酸配列部分を式■のアング ラインを施した個所で示す。成熟タンパクの暗号化部位の合計７１．５％をアミ ノ酸配列分析によって確認し、ペプチド配列はすべて予想したペプチドと合致し た。λ１０，３とλ３，４双方のｃＤＮＡインサートのＤＮＡ塩基配列からグル タミン酸であり、且つまた残基２０２〜２１５にまたがるペプチドの気相配列決 定に基づいてグリシンであると予想された残基２０８を除き、タンパクまたはペ プチドの配列決定によって決定された残り２６２のアミノ酸残基は、すべて、組 織因子用ｃＤＮＡ暗号化の配列から予測した、１式に示すタンパク質配列と一致 した。以前はヒトの組織因子のアミノ酸配列の全貌は知られていなかった。この ようにして、ヒトノ組織因子用２１４７ｂｐｃＤＮＡ断片の暗号化により、１式 に示すようにアミノ酸配列をもつ実質的に純粋なヒトの組織因子を合成すること が可能になった。

実施例４ 脳と胎盤から精製したアポタンパクにつき実施例１に示したようにしてヒトの組 織因子のアミノ産配列を決定した。これら２つの精製物の配列は互いに等しく、 また２１４７ｂｐｃＤＮＡ断面のｃＤＮＡ配列から予測したアミノ酸配列とも一 致した。脳の組織因子のアミノ酸残基１〜２２と胎盤タンパク質の残基１〜３８ は１式に示す組織因子の予測配列と同一であった。無傷のタンパクのアミノ酸配 列の多環は、残基２基分だけ相からづれた重複配列のある２つのＰＴＨアミノ酸 を与えた。この解読内容はｃＤＮＡ配列から導いた一次構造と一致している（１ 式）。従って、脳と胎盤組織から単離した組織因子アポタンパクの約半分に最初 の２つのアミノ酸が欠けていたことになる。位置１１にはＰＴＨアミノ酸は全く 見られなかった。これは、この共通のＮ一連鎖グリコセル化位置（Ａｓｎ−Ｘ− ８ｅｒ／においてＡｓｎ残基がグリコセル化したためと思われる（例えば、マー シャル、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｓｏｃ。

Ｓｙｍｐ、４０　：１７〜２６．１９７４を参照）。

１式に示す成熟組織因子のアミノ酸配列の全体は、実質的に純粋な組織因子アポ タンパク質の分子量を約２９．６００とするが、これは以前、ヒトの組織につい てブロンズ他、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２６０　：　１０９１７〜１０９２ ０．１９８５；グハ他、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、８３：２９９〜３０２，１９８６．が５ＤＳ−ＰＡＧＥで評定した４４ ，０００ないし４６，０００の分子量に比べて小さい。この差異を調べるため、 脳及び／または胎盤から精製した組織因子を酵素的、化学的に脱グリコジル化し 、その結果得たアポタンパクのＭｒを決定した。

胎盤組織因子（５μｇ）は、トリフルオロメタンスルホン酸（ＴＦＭＳ）を用い 、エツジ他、Ａｎａｌ。

Ｂｌｏｃｂｅｍ、１１８　：　１３１〜１３７．１９８１の方法により化学的に 脱グリコジル化した。タンパクはアセントン５ｖｏ１．で沈殿させ、５０００Ｘ ｇで３０分ペレット化した後、真空乾燥した。次いでアニソール２０μｍとＴＦ ＭＳ４０μｌをこれに加えた。試験管は３０秒間チッ素でフラッシングし、密栓 した上３時間これを氷冷した。次いで、タンノくりの沈澱を早めるために５μｍ のピリジンを添加、３ｍｌのエーテル：ヘキサン（９：　１）で３度にわたって サンプル抽出を行った。最後にこれによって生成したペレットをアセントを用い て一回限り抽出した。

組織因子からストイブ他、生化学２４　：　３５８７〜３５９２．１９８５が記 述しているようなエンドグリコシダーゼを用いた消化作用によりアスパラギン連 鎖炭水化物を酵素によって切り離した。またヒトの胎盤組織（５μｇ）を上述し たようにしてアセトンで沈降させた。次いで、タンパク質ペレットを０．５％β −オクチル−Ｄ−グルコピラノシド、２０ｍＭのＥＤＴＡから成る緩衝液４０μ ｌ中に溶解し、これにＰＨ６，１の酢酸ナトリウム５０ｍＭ、及びエンドグリコ シダーゼＦ（０，１ユニツト、ベーリンガーマンハイム、グレード■）を添加し た。３７℃で１６時間静置した後、アセトンが沈降して反応が終息した。この後 、化学的、酵素的脱グリコジル化の生成物をスワンク及びムンクレス、Ａｎａｌ 、Ｂｉｏｌｃｈｅｍ、３９　：　４６２〜４７７．１９７１の５ＤＳ−尿素ゲル システムによりＰＡＧＥで分析した。

未処理の組織因子を見掛けＭｒ４２，０００でスワンク及びマンフリーズのＳＤ Ｓ／尿素ＰＡＧＥシステム内に移動させた。この値はラエムリの５ＤＳ−ＰＡＧ Ｅシステムで観察された見掛けＭｒ４６，０００とは優位的に差があり、従って 界面活性剤の結合が異常ではないかと考えられた。ＴＦＭＳにより脱グリコジル 化したタンパクの場合スワンク及びマンフリーズのシステム内では見掛けＭｒが ３４．５００であったのに対し、酵素によって脱グリコジル化した原料の値は３ ３．５００であった。従って炭水化物は組織因子の見掛けＭｒに対し約７，５０ ０〜８．５００ダルトンの寄与をしていることになる。化学的消化と酵素による 消化の結果は本質的には同じものであったのでこの炭水化物はすべて（Ａｓｎ＾ ）Ｎ一連鎖しているものと考えられる。

また、１式におけるヒトの組織因子の配列順序全体につき、ワシントンＤＣ，国 立生物化学研究所（ＮＢＲＦ）のタンパク質配列データベースの中の４６６８の 配列との相同性を調べた。リップマン他、サイエンス２２７：１４３５〜１４１ １．１９８５のＦＡＳＴＰプログラムを用いて相同性を調べたが、ヒトの組織因 子とデータベース中のどのタンパク質との間にも有意なアミノ酸配列の相同性は 一切見られなかった。特に、１式に示す、Ｍｌ因子の配列と他の凝固タンパク、 例えば、トロンボモジュリン、因子■、因子Ｖの周知のアミノ酸配列との間には １次アミノ酸配列の類似はまったく見られなかった。

ファージλ１０，３のＤＮＡを制限酵素Ｋｐｎｌと５ｓｔＩで消化したところ組 織因子の２１４７ｂｐｃＤＮＡインサートの暗号全体及びインサートの両側から の約１０００ｂｐのλフアージＤＮＡを含むＤＮＡフラグメントが得られた。こ のよにして得た約４．１５ｋｂのＫ　ｐ　ｎ　１　／　Ｓ　ｓ　ｔ　Ｉのフラグ メントをあらかじめＫｐｎｌと５ｓｔｌ　（ママ）で消化しておいたプラスミド ｐＵｃ１９の１ａｃＺ遺伝子（ノランダー他、遺伝子２６：１０１，１９８３． ヤニッシューペロン他遺伝子３３：１０３，１９８５）内にクローン化した。そ の後、この組織因子遺伝子を含む組換えプラスミドｐＫＳ−２Ｂを得、これを用 いて、ｐＵＣ１９の宿主である大腸菌７１−１８への転換を行った。大腸菌７１ −１８／ｐＫｓ−２Ｂの形質変換体はその後の研究及びヒトの成熟した組織因子 アポタンパク（実施例７）とヒトの可溶性組織因子（実施例８）を産生ずるため の形質発現ベクターの構成、並びにヒトのゲノム組織因子遺伝子（実施例６）の 局在化と特徴づけのためのこの上ない組織因子遺伝子源を提供することになった 。

サザン式プロット分析によるハイブリダイゼーション技法により、組織因子の暗 号化配列を約９．５ｋｂフラグメントのゲノムＤＮＡに局在化した。適当な膜に 対して電気泳動を行った後のアガロースゲルからのＤＮＡ制限酵素フラグメント のトランスファー、これに続く特定のプローブを用いてのハイブリダイゼーショ ンを含むこの過程を多くの研究に利用しゲノムの組織と機能を分析した。

プラスミドｐＫＳ−２Ｂから、２１４７ｂｐの組織因子ｃＤＮＡのヌクレオチド ９０〜１３４０を含む１．２５ｋｂのＳ　ａ　ｕ　３Ａ／Ｈｉ　ｎ　ｄＩ［ｌＤ ＮＡフラグメントを得た。ヒトの組織因子全体の読取り枠（ＯＲＦ）を含むこの １．２５ｋｂフラグメント及び１１０ｂｐの５′−非翻訳配列と３４３ｂｐの３ ′−非翻訳配列を用いてヒトのゲノムＤＮＡにおける組織因子の暗号化配列を探 った。

ヒトの胎盤のゲノムＤＮＡ全体を１パネルの制限酵素で消化させた。各消化物３ μｇを１０％のアゲロースゲルで電気泳動させてから１５分間０．２５ＭのＨＣ ｌで処理した。電気泳動に続いてこのような短時間の酸処理を行うことによりＤ ＮＡは部分的に脱プリン化され、ＤＮＡは膜に向って移動しやすい細片に分割さ れた。長さが５ｋｂを越えるＤＮＡフラグメントの定量的移動にはこの酸処理の 段階が特に重要であった。

酸処理の後、上記のゲルを蒸留水で水洗いしその上にナイロン製のトランスファ ーメンブレン（膜）（ゼータプローブ１、バイオラッド）をかぶせた。制限酵素 の膜へのトランスファー（移動）は、０．４ＮのＮａＯＨ溶液の存在化で一晩静 置して行った。このようにして転移したＤＮＡは膜との共有結合をするに至った 。

ｐＫｓ−２Ｂからの１．２５ｋｂＳａｕ３Ａ／ＨｉｎｄＩＩ［フラグメントを用 いて組織因子暗号配列のための消化ゲノムＤＮＡを探った。ハイブリダイゼーシ ョンに先立ち、ファインバーブ及びフォーゲルシュタイン、Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃ ｈｅｍ、１３２　：　６．　１９８３　；Ａｎｘｔ、Ｂｉｏｃｈｅｍｌ　３７　 ：　２６６．　１９８４に記述されているランダム・プライミング法を用いて上 記フラグメントを約５ｘｌＯ８ｃｐｍ／μｇという極めて高い非活性まで放射能 でラベルした。パイラッド公報１２３４に記載の技術に従って、膜と結合したゲ ノム制限酵素断片へのラベルした１、２５ｋｂ断片のサザン法によるプロッティ ング（雑種分子形成）を行った。

ハイブリダイゼーションに先出し５０％ホルムアミド、４ＸＳＳＰＥ　（２０Ｘ ＳＳＰＥ＝３．６Ｍ　Ｎａｃｌ。

０．２Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７，０，０，２ＭＥＤＴＡ）　、１％ＳＤＳ、 ０．５％プロット（Ｂｌｏｔｔｏ）及び０．５ｍｇ／ｍｌの担体ＤＮＡ　（サケ の精子）を用いて上記の膜を４７℃で処理した。１０％のプロットは、１００　 ｍ　ｌの電離防除を施した無菌水の中に脱脂粉乳（ディプロマ）１０ｇを懸濁さ せ、これにアジ化ナトリウムを加え全体の濃度を０．２％として調製した。非特 異的ハイブリダイゼーションを最小限に抑えるため、ハイブリダイゼーション前 の段階で担体ＤＮＡを使用した。

４７％ホルムアミド、１０％デキストラン硫酸、３ｘｓｓＰＥ、１％ＳＤＳ及び ０．５％のプロット中に放射能でラベルした１、２５ｋｇの組織因子ＤＮＡプロ ーブを含むハイブリダイゼーション・カクテルを使用してハイブリッド形成を行 った。またハイブリッド形成の直前にプローブを０．２ＭのＮａＯＨ中に放射能 でラベルした１、２５ｋｂフラグメントを溶解することによって断片化し変性さ せた。担体ＤＮＡを余分に加え、こうしてできた混合物を短時間攪拌し遠心分離 した。混合物はハイブリダイゼーションカクテルに添加する前に約５分間１００ ℃で加熱した。

消化されたヒトのゲノムＤＮＡを含む膜はプローブ／ハイブリダイゼーションカ クテルと共に４７℃（Ｔｍ−１１℃）で−晩装置した。次いで２ＸＳＳＣ１０， １％ＳＤＳを用い室温で１５分間洗浄した。さらに０．１％ＳＤＳを用い１４分 間にわたり５０℃（Ｔｍ−５℃）でこのプロットを洗浄した後、増感スクリーン １枚を用い一７０℃で一晩Ｘ線フィルム（ＸＡＲＸ−オーマット、コダック社） に露光した。

第５図に示したのは、組織因子暗号配列を含む１．２５ＤＮＡフラグメントを胎 盤のゲノムＤＮＡの種々の制限酵素消化物とハイブリッド形成させた結果である 。レーン１とレーン８は対照消化物、即ち、ＨａｃｆｆｌＯｘ／Ｈｉｎｄｕで消 化されたファージλＤＮＡである。レーン２は凹球で消化されたヒトのＤＮＡ、 レーン３はＥｃｏＲＩ消化物、レーン４はＨｉｎｄｕ消化物、レーン５はＰｓｔ ｌ消化物、レーン６は５ａｕ３Ａ消化物、レーン７はＳｓｐ　１消化物である。

第４図の右側に示したのは所定の長さくｋｂ）のＤＮＡの電気泳動移動度である 。

第５図において、１．２５ｋｂの組織因子プローブが各７．０ｋｂと２．５４６ ｋｂの二つのＨｉｎｄＩＩ［フラグメント、各４．　２．　３．　０．　１．５ ．　０．７ｋｂの４つのＰｓｔｌフラグメント、各４．５゜３、　８．　０．９ ８．　０．　３５の４つの５ｓｐｌフラグメントとそれぞれハイブリットを形成 しているのが分る。この情報に基づき、組織因子のＤＮＡ暗号にまたがる染色体 遺伝子の大きさは約９．５ｋｂと決定した。

実施例７ くつかの宿主系を選択した。例えば、大腸菌、ＣＨＯ細胞や昆虫の細胞である。

周知の技術を用いてこれらの宿主系の中で形質を発現させ、選択された宿主内に 組織因子を発現させるための形質発現ベクターを構成することができる。例えば 、大腸菌に対してはＭ１３／μＵＣベクター、ＣＨＯ細胞に対しては哺乳動物の シャトルベクター、ＣＹＣＩ、ＹＣｐＣＹＣｌ、ＹＲｐＣＹＣｌ、ｄＹｅＣＥＮ ３を用いて酵母細胞内で行うことが可能である。

（ａ）生物学的に活性のヒトの組織因子を大腸菌内に発現させる場合 （１）プラスミドｐＴＬ８ＦＱの構造 プラスミドｐＴＬ８ＦＱは、適当な宿主、例えば大腸菌７１−１８の中でヒトの 組織因子のアポタンパク質の形質を発現させるが、これは次のようにして構成し た。

第４図において、実施例６で得たようなｐＫＳ−２Ｂからの１．２５　ｋ　ｂＬ ：ｖＳ　ａ　ｎｍＡ／Ｈｉ　ｎ　ｄＩＩＩフラグメントをクローニングベクター Ｍｌ　３ｍｐ１９のＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩ［Ｉで消化されたＤＮＡと連結反応 させてベクターＭ１３／ＬＢ２ＴＦを産生した。

第６Ｃ図に示したＴＦＡＤオリゴヌクレオチド配列を利用し、座位特異的突然変 異誘発により、Ｍ１３／ＬＢ２ＴＦから１重複鎖ＤＮＡ内組織因子暗号部位のヌ クレオチド２０１と２０２の間に６つの塩基を挿入し、遺伝子内にＰｓｔＩ切断 座位を形成した。その構造はＭ１３／ＬＢ３ＴＦと呼ばれているが（第６Ａ図） 、これをＰｓｔＩとＨｉｎｄｎＩで消化させ、ＰｓｔＩ／Ｈｉｎｄｕで消化した ｐＵＣ１９ＤＮＡと連結反応させることにより第６Ａ図に配列のすぐ下流のバク テリオファージｔｇ１３１（多種クローニング部位を含むファージＭ１３の誘導 体）から部位特異的突然変異誘発により、１重鎖ＤＮＡの中にＰｓｔＩ部位を挿 入し、これによりＭ１３／ＴＬ１３１Ｐ（第６Ｂ図）を形成した。次いでＭ１３ ／ＴＬ１３１Ｐからの１００ｂｐ　５ｎａＢＩ／ＰｓｔＩフラグメントをプラス ミドｐＬＢ４ＴＦのＰｓｔＩ／ＳｍａＩ部位に挿入してプラスミドｐＴＬ８ＴＦ を産生じたが、このプラスミド、ｐＴＬ８７Ｆには、Ｍ１３遺伝子■リーダー配 列用ＤＮＡ暗号とヒトの組織因子用の構造遺伝子がともに含まれていた（第７図 ）。次いでプラスミドｐＴＬ８ＴＦを５ｓｔＩとＨｉｎｄＩＩ［で消化させて遺 伝子■リーダーと組織因子構造ＤＮＡの配列を含む１２５２ｂｐの制御酵素フラ グメントを産生じた。

その後このフラグメントをアガロースゲル電気泳動によって単離し、５ｓｔＩと ＨｉｎｄＩ［Ｉで直鎖状にしてあったプラスミドｐＴＬ１３１Ｑの中ヘクローン 化した（第７図）。

プラスミドｐＴＬ１３１Ｑは、ｔｇ１３１ＤＮＡをプラスミドｐｔａｃ−１２の 唯一のＰｕｖＩＩ坐位にｔｇ１３１のＤＮＡを挿入して予め形成させておいたも ので、プラスミドｐｔａｃ−１２はジョン・ブロシウス博士から入手していたも のである。プラスミドｐｔａｃ−１２はｐＢＲ３２２誘導体の一種で、アマン他 、遺伝子２５　：１６７〜１７８．１９８３によって開示されたようなハイブリ ッドの“ｔａｃ”″　（ｔｒｐ／Ｉａｃ）プロモータ遺伝子を含んでいる。ファ ージｔｇ１３１のＤＮＡはＢｇｌ■で切断され、ＥｃｏＲＩは、大腸菌のＤＮＡ ポリメラーゼエのフレノウフラグメントを用いてプラントエンドに転換された。

このＤＮＡをｐｔａｃ−１２のＰｖｕＩＩ部位に挿入したところＢｇｌＩＩの部 位は破壊されたが組換えｐＴＬ１３１Ｑ中のＥｃ。

ＲＩ部位は復活した。今度はプラスミドｐＴＬ１３１Ｑにｔａｃプロモーター遺 伝子が含まれていた。

これは、イソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）で誘導できる。

１２５２ｂｌ）フラグメントをｐＴＬ８ＴＦからｐＴＬ１３１Ｑに挿入したとこ ろ組換え形質発現ベクターｐＴＬ８ＦＱ　（第７図）を結果したが、これは、大 腸菌７１−１８のような適当な宿主の中ではヒトの組織因子アポタンパク質の形 質を発現させる。

した後、実施例１のような２段階血液凝固検定法を用い、細胞の音波処理をして 組織因子活性を検定した。形質転換細胞の抽出物は、約６Ｘ１０’ユニツ）　／ 　ｍ　ｇタンパクの組織因子の比活性を示した。このタンパク質は、培養菌１ｍ ｌにつきｌｎＨのヒトの組織因子に対応する。比較の標準として実施例１で調整 したようなヒトの精製組織因子タンパクを使用した。

第８図に示すように、坑ヒト組織因子単りローン性抗体を用いてウェスターン法 によるプロッティング（吸収転移）分析をしたところ、単りローン性抗組織因子 抗体と特異的に反応すタンパク質の存在が、立証された。レーン１には分子量標 準液を通した。

レーン２は全大腸菌７１−１８／ｐＴＬ８ＦＱ形質転換細胞抽出物、レーン３は 、音波処理した大腸菌７ｌ−１８ｐＴＬ８ＦＱ形質転換細胞の遠心分離の結果得 られた上清、レーン４は、大腸菌７１−１８／　ｐ　Ｔ　Ｌ　８　Ｆ　Ｑ形質転 換細胞の遠心分離の結果得られたペレット。２つのバンドの近似的分子量は各３ ５．０００と３３，０００であった。３５に対３３にの比は約５＝１であった。

大きな方のタンパクは、Ｍ１３遺伝子■のリーダー配列を有するタンパクと思わ れる。

大腸菌やＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞などの哺乳動物の形質を転 換できるシャトルベクター、ｐＭＡＭ　（クローンチック、ｃａｔ・＃６１００ −１より得たもの）を選択し、適当な哺乳動物宿主の細胞、例えばＣＨＯ細胞中 にヒトの組織因子を発現する哺乳動物ベクターの構成を試みた。

このｐ　Ｍ　Ａ　Ｍベクターにはマウスの乳房腫瘍ウィルス（ＭＭＴＶ）のプロ モーター遺伝子などの目的に適合する若干の重要な特徴を備えている。ＭＭＴＶ は転写及びＭＭＴＶプロモータ遺伝子に隣接する多数のクローニング部位のデキ サメタシン調節を可能にし、また、大腸菌のグアニン、フォスフォリボシルトラ ンスフエラーゼ用の遺伝子を許容する。このトランスフェラーゼは、選択的遺伝 標識の暗号化を行って哺乳動物の細胞の形質転換を標準したり、同じく一種の遺 伝標識であるアンピシリン耐性の暗号化を行って、大腸菌形質転換細胞中のプラ スミドを検出することを可能にする。また、ｐＭＡＭには、哺乳動物の細胞内で タンパクの合成を可能にするＳＶ４０のポリアデニル化部位が含まれている。

第９図は哺乳動物の細胞内でヒトの組織因子の形質を発現させるのに使用できる ｐ　Ｍ　Ａ　Ｍ　／　Ｔ　Ｆベクターを示したものである。このベクターは、実 施例６に示したｐＫＳ−２Ｂの５ａｕ３Ａ／Ｈｉｎｄｌ［［フラグメントを次の ようにしてｐＭＡＭ内にクローン化することによって構成した。即ち、まずｐＫ Ｓ−２ＢのＤＮＡをＨｉｎｄＩｆｆで消化させ、次いでＨｉｎｄＩ［Ｉ切断部位 にＸｈｏＩリンカ−を加えた。

その後５ｓｔＩでＤＮＡを消化させ、５ｓｔＩの切断部位にＸｂａＩリンカ−を 添加した。こうして得たフラグメントを、ｐＭＡＭ／ＴＦを産生ずるためにＮｈ ｅＩとＸｈｏ　Ｉによる切断であらかじめ直鎖状にしてあったｐＭＡＭＤＮＡ内 にクローン化した（第９図）。

大腸菌ＸＬ−１青色（ブルー）細胞（ストラタジーン社から得たもの）をｐ　Ｍ 　Ａ　Ｍ　／　Ｔ　Ｆで形質転換する。ヒトの組織因子遺伝子の有無を調べるた め、アンピシリン耐性ＸＬ−１／ｐＭＡＭ／ＴＦ形質転換細胞をスクリーニング する。組織因子の暗号配列をもつＸＬ−１の青色（ブルー）形質転換細胞を選択 し、プラスアミドを増幅、獲得して適当なＣＨＯ宿主細胞の形質を転換する（こ れにはグアニン・フオスフオリボシルトランスフエラーゼの遺伝子暗号がない） 。機能的グアニンフォスフォリボシルトランスフエラーゼを獲得した細胞だけが 増殖できるような培地、例えばＨＡＴ培地中にＣＨＯ／ｐＭＡＭ／ＴＦ形質転換 細胞を選抜する。次いで、選択培地に増殖した形質転換細胞をテストしてヒトの 組織因子ＤＮＡ塩基配列の有無、及びヒトの組織因子タンパク産生の有無を調べ る。

実施例８ 可溶性のヒトの組織因子タンパクの形質発現第１０図において、実施例６に記述 した全組織因子読取り枠（ＯＲＦ）を含む５ａｕ３ａ／ＨｉｎｄＩ［Ｉの１．２ ５ｋｂＤＮＡフラグメントをＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ消化したｐＵｃ１９に 連結した。こうして得たプラスミドを、まずＨｆｎｄＩＩＩで消化、次いで５ｓ ｐＩで部分消化させたところ、アポタンパク質配列のアミノ酸に近似的に対応す る部位の組織因子ＯＲＦ内に切断を生じた（Ｎ端末からの読み取り）。消化され たＤＮＡをアガロースゲルで電気泳動した後、成熟アポタンパクの細胞外ドメイ ン（近似的にアミノ酸１−２１９／２２０）のＤＮＡ塩基配列暗号をもった３゜ ４４７ｂｐ断片か得られた。断片の陥入（凹）端は、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ エのフレノウ断片を用いて埋めた。３つの読取り枠内のナンセンス（終結）コド ンを含むＸｂａＩリンカ−にューイングランド、バイオラブ、Ｃａｔ、＃１０６ ２から得たもの）をこの断片に連結した。次いで、この断片をＸｂａＩで消化さ せた後、再び連結してプラスミドｐＬＢ５ＴＦを産出した（第１０図）。

切断した組織因子のＯＲＦの３′側に接するＸｂａニリンカーが、組織因子細胞 外ドメインＣ端末のＤＮＡ暗号のすぐ下流のプラスミド中に停止コドンを誘導す る。このようにしてプラスミドＰＬＢ５ＴＦは細胞外ドメインを含むヒトの切断 した可溶性組織因子の暗号化を行う。切断した組織因子の暗号配列を増幅するた め、プラスミドｐＬＢ５ＴＦを大腸菌７１−１８細胞に挿入し、この細胞による 複製を行った。しかしながら、プラスミドｐＬＢ５７Ｆは形質発現ベクターでは なく、また大腸菌７１−１８／ｐＬＢ５ＴＦの形質転換細胞は、可溶性組織因子 を産生しながった。

形質転換宿主の中で細胞外ドメインを含むヒトの可溶性組織因子の形質を発現さ せた形質発現ベクターｐＬＢ６ＴＦは以下のようにして産生じた（第１１図参照 ）。

実施例７に記述したプラスミドｐＴＬ８ＦＱをＥｃｏ０１０９とＡｃｃｌで消化 して電気泳動にかけた。バクテリオファージＭ１３遺伝子■生成物のリーダー配 列のＤＮＡ塩基配列暗号をもっ５００ｂｐの断片、ヒトの成熟組織因子アポタン パクのＮ端末アミノ酸１−３４　（プラス、Ｎ一端末にａｌａ−ａｓｐ（アラニ ン−アスパラギン酸）を添加、ｔａｃプロモーター遺伝子領域及びベクターＤＮ Ａの一部を電気泳動にかけた後アガロースゲルから単離し、あらかじめＥｃｏ０ １０９とＡｃｃＩで消化させておいたｐＬＢ５ＴＦのＤＮＡ断片に連結させた。

このようにして得たプラスミドｐＬＢ６ＴＦはｔａｃプロモーター遺伝子を含ん でいた。また、遺伝子■リーダーのＤＮＡ塩基配列暗号は、ヒトの成熟組織因子 の細胞外ドメインのＤＮＡ配列暗号と結合していた。ＰＬＢ６７Ｆは、一種の形 質発現ベクターであり、大腸菌のような適当な宿主の中では、ヒトの成熟組織因 子アポタンパクの細胞外ドメインを含む可溶性因子アポタンパクの細胞外ドメイ ンを含む可溶性の活性ヒト組織因子を産生じた。

切断された可溶性組織因子の形質発現はｔａｃプロモータ遺伝子に左右されるの で、ヒトの可溶性組織因子の形質発現を最大限にするためＩ　ＰＴＧを用いて大 腸菌７１−１８／ｐＬＢ６７Ｆ形質転換細胞誘導した。

形質転換細胞は対数増殖器の後半で回収し、標準技法を用いてスフェロプラスト と、周辺質タンパクを含む上清フラクションに転換した。スフェロプラスト内、 また、大腸菌７１−１８　／　ｐ　Ｌ　Ｂ　６７　Ｆ形質転換体の周辺質タンパ ク（ペリプラズムフラクション）を含む上清フランジョン内の組織因子活性をバ ッハ他、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５６：８３２４−８３３１．１９８１（ 実施例１で記述したもの）による２段階クロッティング検定法を用いて検定した 。

スフェロプラスト、周辺質フラクションの両者に低い組織因子凝固促進活性が検 出できた。スフェロプラストの活性は、周辺質（ペリプラズム）フラクションの 活性の約１００倍であった。ペリプラズムフラクションの可溶性組織因子の活性 を高めるため、ペリプラズムフラクション９００ｍ１に混合層脂質（１０ｍｇ／ ｍ　１）　１００ｍ　ｌと０，２５％のデオキシコール酸塩１００ｍ　ｌを添加 し、この混合物を５０ｍＭのトリス−ＨＣ１ｐＨ７，５，１００ｍＭのＮａＣｌ ２５０ｍ１で一晩中透析した。２段階のクロッティング検定法を用い組織因子の 活性を調べるため分割量（アリコート）を分析した。

ペリプラズム・フラクションへのレリピデーション（脂質強化）の結果、組織因 子の活性は、スフェロプラスト断片（フラクション）のレベルに近いところまで 増大した。

実施例１に記述した単クローン抗ヒト組織因子抗体を用いて調製した免疫吸着カ ラムで免疫親和性クロマトグラフィを行うことにより可溶性組織因子を精製する ことができた。０．１Ｍのグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２，１を用いカラムから可溶 性組織因子を溶離した。

スフェロプラストとペリプラズマ・フラクション中の可溶性のヒトの組織因子及 び抗体精製可溶性組織因子についても、ヒトの組織因子に対する単クローン抗体 を用い、ウェスターン法によるプロット分析によって分析した。第１２Ａ図に示 すように、ペリプラズム・フラクションには抗体と結合して分子量約３０．００ ０の単タンパクが含まれていたのに対し、スフェロプラストには、分子量が約３ ２．５００゜３０．０００ダルトンの２つのタンパクが認められた。

これらのサンプルを次のようなゲルに加えた。即ち、レーン１はＭＷ標準物、レ ーン２はスフエロプラズムフラクション、レーン３はペリプラズム・ファンクシ ョン、レーン４〜６は、免疫吸着カラムからのブレークスルー、フラクション、 レート８はグリシン−ＨＣｌを用いて免疫吸着カラムから溶離したヒトの可溶性 組織因子。上記の中、大型のタンパクは、Ｍ１３遺伝子■リーダー配列を含む前 駆体タンパク質と思われるが、これは、結果として、タンパクが放出されて細胞 周辺腔に入ると共にヒトの可溶性組織因子から除去される。抗原性の物質はスフ ェロプラストにもペリプラズム・フラクションにも等しく分布しているように思 われた。更に、ヒトの可溶性組織因子タンパクは免疫吸着カラムで簡単に離脱で きた。

第１２Ｂ図に示したのは、大腸菌７１−１８／ｐＬＢ６７Ｆ形質転換体精製物の 第２のウェスターン法によるプロットである。レーン１には分子量標準物質を含 み、レーン２と３は精製した可溶性組織因子を含む。

生成物の凝固促進活性はタンパク１　ｍ　ｇにつき約１．９Ｘ１０’ユニツトと 決定された。従って可溶性組織因子は、無処理のアポタンパク質に較べはるかに 活性の低い凝固促進剤である。しかしながら、可溶性タンパクは因子■と結合す るのであり、従って無処理のアポタンパク質と因子■が結合するのを阻害できる 。

浄書（内容に変更なし） ＦＩＧ、　１ 浄書（内容に変更なし） 浄書（内容に変更なし） 浄書（内容に変更なし） 浄書（内容に変更なし） ＋２３　４　５　６７８ ＦＩＧ、５ 浄書（内容に変更なし） 浄書（内容に変更なし） 浄書（内容に変更なし） ＦＩＧ、８ 浄書（内容に変更なし） ＦＩＧ、９ ・袴書く内容に変更なし） 浄書（内容に変更なし） 浄書（内容に変更なし） ＦｆＧ、１２Ａ 浄書（内容に変更なし） ＦＪＧ、ｌ２Ｂ −５夕元２ｐＰ肚ミら１３緑Ｉ眠２酊≦貢Ｆｏｒｍｕｌａ　Ｘ 手続補正書（方式） １、事件の表示 ＰＣＴ／ＵＳ８８１０１９１５ ２、発明の名称 ヒトの組織因子のクローニングと形質発現３、補正をする者 名　称　マウント　サイナイ　スクール　オブメディシン　オブ　ザ　シティ− ユニバーシティ−オブ　ニューヨーク 代表者　マクドナルド　ミツ、チェル　ジー。

国　籍　アメリカ合衆国　（他１名） ５、補正命令の日付　平成元年１１月７日（発送日）６、補正の対象 （１）特許法第１８４条の５第１項の規定による書面の発明の名称及び特許出願 人の各欄 （２）明細書の翻訳文 （３）図面の翻訳文 （４）出願人が法人であることを証明する書面（翻訳文を含む） （５）委任状（翻訳文を含む） ７、補正の内容 （１）特許法第１８４条の５第１項の規定による書面の発明の名称及び特許出願 人の各欄を別紙の通り訂正する。

（２）明細書の翻訳文の第１頁を浄書する（内容に変更なし） （３）図面の翻訳文を浄書する（内容に変更なし）。

（４）法人国籍代表者資格証明書及びその翻訳文を別紙の通り補正する。

（５）委任状及びその翻訳文を別紙の通り補正する。

１ｍｘｗｎａ−＾帥耐−＋ｍ−鴫、ＰＣＴ／ＵＳ　８Ｂ１０１９１５国際調査報 告

Claims (38)

【特許請求の範囲】
1. １．ヒトの組織因子またはその一部についての暗号となるような配列順序を有す るＤＮＡインサートを含む宿主中で複製できる組換えクローニングベクター。
2. ２．複製可能な組換えクローニングベクターを含む宿主生物であって、当該ベク ターがヒトの組織因子またはその一部の暗号となるような配列順序のＤＮＡイン サートを含むもの。
3. ３．クレイム１による組換えクローニングベクターであって、プラスミド、コス ミッド、バクテリオファージからなるグループ、その他細菌内で複製できる複数 ベクター、及び真核生物中で複製できる複数ベクターから選択可能なベクター。
4. ４．クレイム３による組換えクローニングベクターであって、真核生物宿主内で 複製できるベクターをワクチニアウィルス、ウシの乳頭腫ウィルス、シミアンウ イルス４０、酵母ベクター及びバキュロウィルスのグループから選択できるもの 。
5. ５．クレイム２による宿主生物であって、細菌、酵母、昆虫細胞、及びヒトの細 胞のグループから選択されるもの。
6. ６．クレイム１による組換えクローニングベクターであって、ファージλ１０， ３、ファージλ３，４及びプラスミドｐＫＳ−２Ｂのグループから選択されるも の。
7. ７．クレイム１による組換えクローニングベクターでファージλ１０，３である もの。
8. ８．クレイム１による組換えクローニングベクターでプラスミドｐＫＳ−２Ｂで あるもの。
9. ９．クレイム２による宿主生物で大腸菌株ｋ１０８８であるもの。
10. １０．クレイム２による宿主生物で大腸菌株７１−１８であるもの。
11. １１．クレイム９による宿主生物で組換えクローニングベクターがファージλ１ ０，３であるもの。
12. １２．クレイム９による宿主生物でファージλ３，４を組換えクローニングベク ターとするもの。
13. １３．プラスミドｐＫＳ−２Ｂを組換えクローニングベクターとするようなクレ イム１０による宿主生物。
14. １４．ヒトの組織因子用の２１４７塩基対ｃＤＮＡ断片暗号であって、１式のよ うなヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチド１１２〜１１４でのＡＴＧ開始コド ンからヌクレオチド９９７〜９９９でのＴＡＡ停止コドンまでのびる読取り枠を 有し、当該読取り枠がポリペプチド単鎖であり、且つ２９５アミノ酸配列をもつ ヒトの組織因子の前駆体タンパク質の暗号となり、且つ当該前駆体タンパクが１ 式のような２６３アミノのアミノ酸配列をもつポリペプチド単鎖である実質的に 純粋な成熟組織に翻訳後切断されるもの。
15. １５．１式のようなアミノ酸配列を有する実質的に純粋なヒトの組織因子のアポ タンパク質またはその機能的部分。
16. １６．ヒトの組織因子用ＤＮＡ暗号を同定するためのオリゴヌクレオチド・プロ ーブであって、そのヌクレオチド配列が、１式ようなアミノ酸配列をもつ実質的 に純粋なヒトの組織因子のアミノ酸２４から２９までのＤＮＡ暗号の配列に対応 するもの。
17. １７．ヒトの組織因子用ＤＮＡ暗号を同定するためのオリゴヌクレオチド・プロ ーブであって、そのヌクレオチド配列が１式のようなアミノ酸配列をもつ実質的 に純粋なヒトの組織因子のアミノ酸１４５から１５９までのＤＮＡ暗号の配列に 対応するもの。
18. １８．ヒトの組織因子使用ＤＮＡ暗号を同定するためのオリゴヌクレオチド・プ ローブであって、そのヌクレオチド配列が１式のようなアミノ酸配列をもつ実質 的に純粋なヒトの組織因子のアミノ酸２１０から２１５までのＤＮＡ暗号の配列 に対応するもの。
19. １９．適当な宿主の中で、ヒトの組織因子またはその機能的部分の遺伝子暗号を 発現するような組換えクローニング・ベクター。
20. ２０．ヒトの組織因子アポタンパク質またはその機能的部分を産生する宿主生物 であって、ヒトの組織因子またはその機能的部分の暗号となるＤＮＡインサート を含む組換えクローニング・ベクターによって形質転換されるもの。
21. ２１．クレイム１９による組換えベクターであって、プラスミド、コスミッド、 バクテリオファージ、細菌内で複製できる他のベクター及び真核生物内で複製で きるベクターの中から選択されるもの。
22. ２２．クレイム２２（ママ）による組長えベクターであって、真核生物宿主内で 複製できるベクターがワクチニアウィルス、ウシの乳頭腫ウィルス、シミアンウ イルス４０、酵母ベクタ−及びバキュロウィルスのグループから選択されるもの 。
23. ２３．クレイム２０による宿主生物であって、細菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞 及びヒトの細胞のグループから選択されるもの。
24. ２４．クレイム１９による組換えベクターをｐＴＬ８ＦＱとするもの。
25. ２５．クレイム１９による組換えベクターをｐＭＡＭ／ＴＦとするもの。
26. ２６．クレイム２０による宿主生物を大腸菌株７１−１８とするもの。
27. ２７．クレイム２０による宿主生物を大腸菌ＸＬ−１．ブルーとするもの。
28. ２８．クレイム２０による宿主生物をＣＨＯ細胞とするもの。
29. ２９．ヒトの可溶性組織因子またはその機能的部分の形質を発現させるためのク レイム１９による組換えクローニング・ベクター。
30. ３０．クレイム２９による組換えクローニング・ベクターであって、ヒトの可溶 性組織因子にヒトの成熟組織因子アポタンパク質のアミノ端末細胞外ドメインが 含まれるもの。
31. ３１．ヒトノ可溶性組織因子の中に、１式のような配列順序をもつヒトの成熟組 織因子のＮ端末アミノ酸１〜２１９／２２０を含むようなクレイム２９による組 換えクローニング・ベター。
32. ３２．組換えベクターをｐＬＢ６ＴＦとするようなクレイム３１による組換えク ローニングベクター。
33. ３３．ヒトの可溶性組織因子を産生するようなクレイム２０による宿主生物。
34. ３４．ヒトの成熟組織因子アポタンパク質またはその機能的部分の細胞外ドメイ ンが可溶性の組織因子に含まれるようなクレイム３３による宿主生物。
35. ３５．可溶性組織因子の中に１式のようなヒトの成熟組織因子のＮ端末アミノ酸 １〜２１０／２２０を含むようなクレイム３３による宿主生物。
36. ３６．大腸菌株７１−１８が宿主であるようなクレイム３５による宿主生物。
37. ３７．実質的に純粋なヒトの可溶性組織因子であって、１式のような配列順序を もつヒトの成熟組織因子またはその機能的部分の細胞外ドメインを含むもの。
38. ３８．クレイム３７によるヒトの可溶性組織因子であって、１式のような配列順 序の、ヒトの成熟組織因子のＮ端末アミノ酸１〜２１９／２２０を含むもの。