JP2869920B2 - 組織因子タンパク質を製造するためのデオキシリボ核酸 - Google Patents
組織因子タンパク質を製造するためのデオキシリボ核酸Info
- Publication number
- JP2869920B2 JP2869920B2 JP63031693A JP3169388A JP2869920B2 JP 2869920 B2 JP2869920 B2 JP 2869920B2 JP 63031693 A JP63031693 A JP 63031693A JP 3169388 A JP3169388 A JP 3169388A JP 2869920 B2 JP2869920 B2 JP 2869920B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- tissue factor
- factor protein
- protein
- amino acid
- sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6429—Thrombin (3.4.21.5)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12Y304/21005—Thrombin (3.4.21.5)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/32—Fusion polypeptide fusions with soluble part of a cell surface receptor, "decoy receptors"
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/16011—Herpesviridae
- C12N2710/16611—Simplexvirus, e.g. human herpesvirus 1, 2
- C12N2710/16622—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/10—Plasmid DNA
- C12N2800/108—Plasmid DNA episomal vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/42—Vector systems having a special element relevant for transcription being an intron or intervening sequence for splicing and/or stability of RNA
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
- C12N2840/44—Vectors comprising a special translation-regulating system being a specific part of the splice mechanism, e.g. donor, acceptor
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Public Health (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Virology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は組織因子タンパク質に関する。また、本発明
は、それらの新規形態および組成物、および特に組織因
子タンパク質を治療学的に有意な量で均質に製造するた
めの手段および方法に関する。さらに、本発明は、組織
因子タンパク質の産生をコードしている単離されたデオ
キシリボ核酸（DNA）の製造、組織因子タンパク質をコ
ードしているDNA分子を得る方法、該DNAを用いるヒト組
織因子タンパク質の発現、ならびに組織因子タンパク質
またはそのフラグメントをコードしている新規核酸を含
む新規化合物に関する。さらにまた、本発明は、組織因
子タンパク質誘導体、特に該タンパク質のＣ−末端近傍
の細胞質性および／または疎水性部分を欠いている誘導
体、およびこれらの組換えDNA法による製造に関する。
は、それらの新規形態および組成物、および特に組織因
子タンパク質を治療学的に有意な量で均質に製造するた
めの手段および方法に関する。さらに、本発明は、組織
因子タンパク質の産生をコードしている単離されたデオ
キシリボ核酸（DNA）の製造、組織因子タンパク質をコ
ードしているDNA分子を得る方法、該DNAを用いるヒト組
織因子タンパク質の発現、ならびに組織因子タンパク質
またはそのフラグメントをコードしている新規核酸を含
む新規化合物に関する。さらにまた、本発明は、組織因
子タンパク質誘導体、特に該タンパク質のＣ−末端近傍
の細胞質性および／または疎水性部分を欠いている誘導
体、およびこれらの組換えDNA法による製造に関する。
従来技術 出血は、疾患の最も重大かつゆゆしい徴候の１つであ
る。これは局所的に起こることもあるし、また全体的で
あることもある。一次止血は、主として２種類の要素、
すなわち血管収縮および血小板栓子生成からなる。血小
板栓子生成はいくつかの段階に分けることができる。す
なわち、損傷を受けた内皮下表面への血小板の粘着；血
小板活性の放出反応；血小板凝集（結果として、その部
位における付加的な血小板が除去され、フィブリノーゲ
ンおよび凝固タンパク質がトロンビン生成を含む血小板
表面に結合する）；および融合（フィブリンと溶融血小
板が癒着して安定な止血栓子を生成すること）である。
る。これは局所的に起こることもあるし、また全体的で
あることもある。一次止血は、主として２種類の要素、
すなわち血管収縮および血小板栓子生成からなる。血小
板栓子生成はいくつかの段階に分けることができる。す
なわち、損傷を受けた内皮下表面への血小板の粘着；血
小板活性の放出反応；血小板凝集（結果として、その部
位における付加的な血小板が除去され、フィブリノーゲ
ンおよび凝固タンパク質がトロンビン生成を含む血小板
表面に結合する）；および融合（フィブリンと溶融血小
板が癒着して安定な止血栓子を生成すること）である。
血液凝固には、血小板凝集を誘起するトロンビンの生
成および血小板栓子を安定なものにするフィブリンの生
成という２種類の機能が発揮される。「凝固因子類」と
呼ばれる、多数の独立したプロ酵素群およびプロ補助因
子群が凝固過程に関与している。この過程はいくつかの
段階からなり、フィブリンの生成で終結する。トロンビ
ンの作用によってフィブリノーゲンがフィブリンに変換
される。トロンビンは、プロ酵素であるプロトロンビン
のタンパク質加水分解的な切断によって生成する。この
タンパク質加水分解は、活性化された因子Ｘ（因子X a
と呼ばれる；活性化された血小板の表面に結合し、V a
およびカルシウムイオンの存在下でプロトロンビンを切
断する）によって行なわれる。
成および血小板栓子を安定なものにするフィブリンの生
成という２種類の機能が発揮される。「凝固因子類」と
呼ばれる、多数の独立したプロ酵素群およびプロ補助因
子群が凝固過程に関与している。この過程はいくつかの
段階からなり、フィブリンの生成で終結する。トロンビ
ンの作用によってフィブリノーゲンがフィブリンに変換
される。トロンビンは、プロ酵素であるプロトロンビン
のタンパク質加水分解的な切断によって生成する。この
タンパク質加水分解は、活性化された因子Ｘ（因子X a
と呼ばれる；活性化された血小板の表面に結合し、V a
およびカルシウムイオンの存在下でプロトロンビンを切
断する）によって行なわれる。
因子Ｘの活性化は２種類の別個の経路、すなわち外因
性または内因性のどちらかによって起こりうる（第１
図）。内因性のカスケードは一連の反応からなり、ここ
でタンパク質前駆体から切断されて活性なプロテアーゼ
が生成する。それぞれの段階で新しく生成したプロテア
ーゼは、カスケードの次の段階で前駆体プロテアーゼの
活性化を触媒する。この経路においていずれかのタンパ
ク質を欠くと、その段階で活性化過程が遮断され、これ
により血餅の生成が妨げられ、代表的には出血傾向を生
じる。たとえば、因子VIIIまたは因子IXの欠損は、重篤
な出血症候群、血友病ＡおよびＢをそれぞれ引き起こ
す。外因性経路の血液凝固では、組織因子（組織トロン
ボプラスチンとも呼ばれる）が損傷を受けた細胞から放
出され、因子VIIおよびカルシウムの存在下で因子Ｘを
活性化する。因子Ｘの活性化は組織因子および因子VII
によって触媒されるただ１つの反応であると始めは考え
られていたが、現在では、因子Ｘ、因子VIIおよび因子I
Xの間に増幅ループが存在していることが知られている
［オステラッドおよびラパポート（Osterud,B.,and S.
I.Rapaport,Proc.Natl,Acad.Sci.USA,74:5260−5264（1
977））；ツアー等（Zur,M.et al.,Blood,52:198（197
8））］。この図式におけるセリンプロテアーゼのそれ
ぞれは、他の２つのタンパク質加水分解によって、活性
化された形に変換することができ、これによって凝固過
程のこの段階でのシグナルを増幅する（第１図）。現在
では、この外因性の経路が、実際の正常な血液凝固の主
な生理学的経路ではないかと考えられている［Haemosta
sis,13:150−155（1983）］。組織因子は通常血液中に
見い出されないので、このシステムは継続して凝固させ
ることはない。従って、凝固の引き金は損傷を受けた組
織からの組織因子の放出であろう。
性または内因性のどちらかによって起こりうる（第１
図）。内因性のカスケードは一連の反応からなり、ここ
でタンパク質前駆体から切断されて活性なプロテアーゼ
が生成する。それぞれの段階で新しく生成したプロテア
ーゼは、カスケードの次の段階で前駆体プロテアーゼの
活性化を触媒する。この経路においていずれかのタンパ
ク質を欠くと、その段階で活性化過程が遮断され、これ
により血餅の生成が妨げられ、代表的には出血傾向を生
じる。たとえば、因子VIIIまたは因子IXの欠損は、重篤
な出血症候群、血友病ＡおよびＢをそれぞれ引き起こ
す。外因性経路の血液凝固では、組織因子（組織トロン
ボプラスチンとも呼ばれる）が損傷を受けた細胞から放
出され、因子VIIおよびカルシウムの存在下で因子Ｘを
活性化する。因子Ｘの活性化は組織因子および因子VII
によって触媒されるただ１つの反応であると始めは考え
られていたが、現在では、因子Ｘ、因子VIIおよび因子I
Xの間に増幅ループが存在していることが知られている
［オステラッドおよびラパポート（Osterud,B.,and S.
I.Rapaport,Proc.Natl,Acad.Sci.USA,74:5260−5264（1
977））；ツアー等（Zur,M.et al.,Blood,52:198（197
8））］。この図式におけるセリンプロテアーゼのそれ
ぞれは、他の２つのタンパク質加水分解によって、活性
化された形に変換することができ、これによって凝固過
程のこの段階でのシグナルを増幅する（第１図）。現在
では、この外因性の経路が、実際の正常な血液凝固の主
な生理学的経路ではないかと考えられている［Haemosta
sis,13:150−155（1983）］。組織因子は通常血液中に
見い出されないので、このシステムは継続して凝固させ
ることはない。従って、凝固の引き金は損傷を受けた組
織からの組織因子の放出であろう。
組織因子は、上記のように、外因性経路による血液凝
固の引き金となるうる必須の膜・糖タンパク質である
［バッハ等（Bach,R.et al.,J.Biol.Chem.,256（16）,8
324−8331（1981））］。組織因子は、タンパク質部分
（以前は組織因子アポタンパク質−IIIと呼ばれてい
た）とリン脂質からなる［オステラッドおよびラパポー
ト（Osterud,B.,and Rapaport,S.I.,PNAS,74:5260−526
4（1977））］。この複合体は、単球および血管壁の種
々細胞の膜に見い出されている［オステラッド（Osteru
d,B.,Scand.J.Haematol.,32,337−345（1984））］。種
々の器官および種由来の組織因子は、42,000〜53,000の
相対分子量を有すると報告されている。ヒト組織トロン
ボプラスチンは、組織因子タンパク質：リン脂質が約1:
80の最適比で、リン脂質２重層に挿入された組織因子タ
ンパク質からなると記載されている［リーバーグおよび
プリーズ（Lyberg,T.and Prydz,H.,Nouv.Rev.Fr.Hemato
l,25（５）,291−293（1983））］。種々の組織からの
組織因子の精製が報告されている：ヒト脳［グーハ等
（Guha,A.et al.,PNAS,83,299−302（1986））およびブ
ローズ等（Broze,G.H.et al.,J.Biol.Chem.,260（20）,
10917−10920（1985））］；ウシ脳［バッハ等（Bach,
R.et al.,J.Biol.Chem.,256,8324−8331（1981））］；
ヒト胎盤［ボム等（Bom,V.J.J.et al.,Thrombosis Re
s.,42,635−643（1986））およびアンドー等（Andoh,K.
et al.,Thrombosis Res.,43,275−286（1986））］；ヒ
ツジ脳［カールセン等（Carlsen,E.et al.,Thromb.Haem
ostas.,48（３）,315−319（1982））］；および肺［グ
ラスおよびアストラップ（Glas,P.and Astrup,T.,Am.J.
Physiol.,219,1140−1146（1970））］。ウシおよびヒ
ト組織トロンボプラスチンがその大きさおよび機能にお
いて同一であることがわかった［たとえば、ブローズ等
（Broze,G.H.et al.,J.Biol.Chem.,260（20）,10917−1
0920（1985））を参照］。組織因子タンパク質の構造に
おいては種間で差異が存在しているが、インビトロ凝固
検定で測定すると機能的な差異は存在しないことが広く
認められている（グーハ等、上記）。さらに、動物の種
々の組織（たとえば、イヌの脳、肺、動脈および静脈）
から単離した組織因子は、消衰係数、窒素およびリン含
量および脂質に対する最適リン脂質比などのいくつかの
点で類似しており、分子の大きさ、アミノ酸含量、抗体
との反応性および血漿半減期においてわずかに異なって
いる［ゴンモリおよびタケダ（Gonmori,H.and Takeda,
Y.,J.Physiol.,229（３）,618−626（1975））］。種々
のイヌ器官由来の組織因子のすべては、脂質の存在下で
凝固活性を示した（同上）。生物学的な活性を示すため
には、組織因子がリン脂質と結合しなければならないこ
とが広く認められている［ピトリックおよびネマーソン
（Pitlick,F.A.and Nemerson,Y.,Biochemistry,９,5105
−5111（1970））、およびバッハ等（上記、8324
頁）］。たとえばホスホリパーゼを用いて組織因子のリ
ン脂質成分を除去すると、その生物学的な活性が失われ
ることがわかった［ネマーソン（Nemerson,Y.,J.C.I.,4
7,72−80（1968））］。もう一度脂質処理すると、イン
ビトロでの組織因子活性を回復させることができる［ピ
トリックおよびネマーソン（Pitlick,F.A.and Nemerso
n,Y.,Biochemistry,９,5105−5113（1970））、および
フレイシネット等（Freyssinet,J.M.et al.,Thrombosis
and Haemostasis,55,112−118（1986））］。組織因子
のアミノ末端配列［バッハ等（Bach,R.et al.,Am.Heart
Assoc.（Nov.,1986））、モリッセイ等（Morrissey,J.
H.et al.,Am.Heart Assoc.（Nov.,1986））］およびCNB
rペプチドフラグメント［バッハ等、上記］が決定され
ていた。
固の引き金となるうる必須の膜・糖タンパク質である
［バッハ等（Bach,R.et al.,J.Biol.Chem.,256（16）,8
324−8331（1981））］。組織因子は、タンパク質部分
（以前は組織因子アポタンパク質−IIIと呼ばれてい
た）とリン脂質からなる［オステラッドおよびラパポー
ト（Osterud,B.,and Rapaport,S.I.,PNAS,74:5260−526
4（1977））］。この複合体は、単球および血管壁の種
々細胞の膜に見い出されている［オステラッド（Osteru
d,B.,Scand.J.Haematol.,32,337−345（1984））］。種
々の器官および種由来の組織因子は、42,000〜53,000の
相対分子量を有すると報告されている。ヒト組織トロン
ボプラスチンは、組織因子タンパク質：リン脂質が約1:
80の最適比で、リン脂質２重層に挿入された組織因子タ
ンパク質からなると記載されている［リーバーグおよび
プリーズ（Lyberg,T.and Prydz,H.,Nouv.Rev.Fr.Hemato
l,25（５）,291−293（1983））］。種々の組織からの
組織因子の精製が報告されている：ヒト脳［グーハ等
（Guha,A.et al.,PNAS,83,299−302（1986））およびブ
ローズ等（Broze,G.H.et al.,J.Biol.Chem.,260（20）,
10917−10920（1985））］；ウシ脳［バッハ等（Bach,
R.et al.,J.Biol.Chem.,256,8324−8331（1981））］；
ヒト胎盤［ボム等（Bom,V.J.J.et al.,Thrombosis Re
s.,42,635−643（1986））およびアンドー等（Andoh,K.
et al.,Thrombosis Res.,43,275−286（1986））］；ヒ
ツジ脳［カールセン等（Carlsen,E.et al.,Thromb.Haem
ostas.,48（３）,315−319（1982））］；および肺［グ
ラスおよびアストラップ（Glas,P.and Astrup,T.,Am.J.
Physiol.,219,1140−1146（1970））］。ウシおよびヒ
ト組織トロンボプラスチンがその大きさおよび機能にお
いて同一であることがわかった［たとえば、ブローズ等
（Broze,G.H.et al.,J.Biol.Chem.,260（20）,10917−1
0920（1985））を参照］。組織因子タンパク質の構造に
おいては種間で差異が存在しているが、インビトロ凝固
検定で測定すると機能的な差異は存在しないことが広く
認められている（グーハ等、上記）。さらに、動物の種
々の組織（たとえば、イヌの脳、肺、動脈および静脈）
から単離した組織因子は、消衰係数、窒素およびリン含
量および脂質に対する最適リン脂質比などのいくつかの
点で類似しており、分子の大きさ、アミノ酸含量、抗体
との反応性および血漿半減期においてわずかに異なって
いる［ゴンモリおよびタケダ（Gonmori,H.and Takeda,
Y.,J.Physiol.,229（３）,618−626（1975））］。種々
のイヌ器官由来の組織因子のすべては、脂質の存在下で
凝固活性を示した（同上）。生物学的な活性を示すため
には、組織因子がリン脂質と結合しなければならないこ
とが広く認められている［ピトリックおよびネマーソン
（Pitlick,F.A.and Nemerson,Y.,Biochemistry,９,5105
−5111（1970））、およびバッハ等（上記、8324
頁）］。たとえばホスホリパーゼを用いて組織因子のリ
ン脂質成分を除去すると、その生物学的な活性が失われ
ることがわかった［ネマーソン（Nemerson,Y.,J.C.I.,4
7,72−80（1968））］。もう一度脂質処理すると、イン
ビトロでの組織因子活性を回復させることができる［ピ
トリックおよびネマーソン（Pitlick,F.A.and Nemerso
n,Y.,Biochemistry,９,5105−5113（1970））、および
フレイシネット等（Freyssinet,J.M.et al.,Thrombosis
and Haemostasis,55,112−118（1986））］。組織因子
のアミノ末端配列［バッハ等（Bach,R.et al.,Am.Heart
Assoc.（Nov.,1986））、モリッセイ等（Morrissey,J.
H.et al.,Am.Heart Assoc.（Nov.,1986））］およびCNB
rペプチドフラグメント［バッハ等、上記］が決定され
ていた。
組織因子を注入すると正常な止血を損なうものと長い
間考えられていた。1834年にフランスの生理学者ブラン
ヴィルが初めて、組織因子が血液凝固に直接的に寄与し
ていることを証明した［ブランヴィル（de Blainville,
H.Cazette Medicale Paris,Series2,524（1834））］。
また、ブランヴィルは、脳組織懸濁液を静脈内注入する
と直ちに死を引き起こすことも観察した（この死は、剖
検で認められた広範囲の播種性血餅を生じる高凝固状態
と関係していた）。現在では、組織トロンボプラスチン
を静脈内注入すると、血管内凝固を引き起こし、種々の
動物を死に至らしめることもあることがよく認められて
いる［イヌ：レビスおよびゼト（Lewis,J.and Szeto,I.
F.,J.Lab.Clin.Med.,60,261−273（1962））；ウサギ：
フェダー等（Fedder,G.et al.,Thromb.Diath.Haemorr
h.,27,365−376（1972））；ラット：ギエルクスキー等
（Giercksky,K.E.et al.,Scand.J.Haematol.,17,305−3
11（1976））；およびヒツジ：カールセン等（Carlsen,
E.et al.,Thromb.Haemostas.,48,315−319（198
2））］。
間考えられていた。1834年にフランスの生理学者ブラン
ヴィルが初めて、組織因子が血液凝固に直接的に寄与し
ていることを証明した［ブランヴィル（de Blainville,
H.Cazette Medicale Paris,Series2,524（1834））］。
また、ブランヴィルは、脳組織懸濁液を静脈内注入する
と直ちに死を引き起こすことも観察した（この死は、剖
検で認められた広範囲の播種性血餅を生じる高凝固状態
と関係していた）。現在では、組織トロンボプラスチン
を静脈内注入すると、血管内凝固を引き起こし、種々の
動物を死に至らしめることもあることがよく認められて
いる［イヌ：レビスおよびゼト（Lewis,J.and Szeto,I.
F.,J.Lab.Clin.Med.,60,261−273（1962））；ウサギ：
フェダー等（Fedder,G.et al.,Thromb.Diath.Haemorr
h.,27,365−376（1972））；ラット：ギエルクスキー等
（Giercksky,K.E.et al.,Scand.J.Haematol.,17,305−3
11（1976））；およびヒツジ：カールセン等（Carlsen,
E.et al.,Thromb.Haemostas.,48,315−319（198
2））］。
上記のように組織因子の単離については文献に記載さ
れていたが、組織因子タンパク質の正確な構造について
はこれまで示されていなかった。ある程度の量の「精製
された」組織因子タンパク質は種々の組織から得られ、
利用可能であるが、組織因子タンパク質の血液および組
織中での濃度が低いこと、および組織からタンパク質を
精製するのが経済的および労力的に高コストであるた
め、この物質を多量に得ることを困難にしている。本発
明の目的は、組織因子タンパク質をコードしているDNA
を単離すること、および組換え法を用いて有用な量のヒ
ト組織因子タンパク質を製造することである。さらに別
の目的は、新規形態の組織因子タンパク質を製造するこ
とである。本発明のこの目的およびその他の目的は本明
細書全体から明らかとなるであろう。
れていたが、組織因子タンパク質の正確な構造について
はこれまで示されていなかった。ある程度の量の「精製
された」組織因子タンパク質は種々の組織から得られ、
利用可能であるが、組織因子タンパク質の血液および組
織中での濃度が低いこと、および組織からタンパク質を
精製するのが経済的および労力的に高コストであるた
め、この物質を多量に得ることを困難にしている。本発
明の目的は、組織因子タンパク質をコードしているDNA
を単離すること、および組換え法を用いて有用な量のヒ
ト組織因子タンパク質を製造することである。さらに別
の目的は、新規形態の組織因子タンパク質を製造するこ
とである。本発明のこの目的およびその他の目的は本明
細書全体から明らかとなるであろう。
発明の要約 本発明の目的は以下の操作からなる方法によって達成
することができる：ヒト組織因子タンパク質をコードし
ているcDNAを単離し、クローニングすること；該cDNAを
組換えDNAベクターに導入すること；該DNAを含んでいる
ベクターで適当な宿主を形質転換すること；該宿主中で
ヒト組織因子タンパク質DNAを発現させること；および
産生したヒト組織因子タンパク質を回収すること。同様
に、本発明は、組換え法によってヒト組織因子タンパク
質および／またはその誘導体を製造すること、ならびに
そのようなヒト組織因子タンパク質の製造に関連する方
法および産物を提供することを可能にするものである。
組織因子タンパク質DNAの単離、同定、および配列決定
は問題の多いところであった。そのmRNAは相対的にわず
かしか存在せず、これまで組織因子タンパク質の完全な
アミノ酸配列は全く知られていなかった。
することができる：ヒト組織因子タンパク質をコードし
ているcDNAを単離し、クローニングすること；該cDNAを
組換えDNAベクターに導入すること；該DNAを含んでいる
ベクターで適当な宿主を形質転換すること；該宿主中で
ヒト組織因子タンパク質DNAを発現させること；および
産生したヒト組織因子タンパク質を回収すること。同様
に、本発明は、組換え法によってヒト組織因子タンパク
質および／またはその誘導体を製造すること、ならびに
そのようなヒト組織因子タンパク質の製造に関連する方
法および産物を提供することを可能にするものである。
組織因子タンパク質DNAの単離、同定、および配列決定
は問題の多いところであった。そのmRNAは相対的にわず
かしか存在せず、これまで組織因子タンパク質の完全な
アミノ酸配列は全く知られていなかった。
本発明は、以下の操作を含む組換えDNA法によってヒ
ト組織因子タンパク質を製造する方法および組成物に関
する:1）タンパク質の完全なDNA配列ならびにその５′
および３′−境界領域を単離し、同定すること;2）該DN
A配列を含有するクローニングおよび発現媒体を構築し
て、ヒト組織因子タンパク質、ならびにそのメチオニ
ン、融合またはシグナルＮ−末端コンジュゲートの発現
を可能にすること；および３）そのような媒体を含有す
ることによって遺伝的に変化し、ヒト組織因子タンパク
質を産生することができるようになった生細胞を培養す
ること。また、本発明は、ヒト組織因子タンパク質の細
胞内産生をコードしているDNAを製造する方法およびDNA
組成物に関する。さらに、本発明は、組織因子タンパク
質をコードしているクローンを得るのに用いられるDNA
配列を含む新規化合物に関する。さらにまた、本発明
は、あらゆる天然物質（通常、組織因子タンパク質はこ
れらとともに血液および／または組織中に見い出され
る）を実質的に含まない組織因子タンパク質に関する；
すなわち、組換え法で製造した組織因子タンパク質は、
そのタンパク質をインビボの生理学的環境から単離した
ときには通常伴っているこれらの不純物を含まないであ
ろう。注目すべき可能性ある不純物の１つは、後天性免
疫欠損症候群（AIDS）の原因物質であり、これは絶え間
なく増加しつつある多数の個体の血液中に見い出されつ
つある。製造方法によっては、この組織因子タンパク質
が、そのインビボの生理学的環境、すなわち血液および
／または組織から得られる物質と比較して、より大きい
か、またはより小さい関連のグリコシル化を含んでいる
こともある。さらに加えて、本発明は、新規組織因子タ
ンパク質誘導体、詳しくは組織因子タンパク質トランス
メンブランまたはメンブラン結合領域を構成するアミノ
酸配列からなるタンパク質のＣ−末端近くのタンパク質
の疎水性部分およびシグナル配列を欠いている誘導体に
関する。
ト組織因子タンパク質を製造する方法および組成物に関
する:1）タンパク質の完全なDNA配列ならびにその５′
および３′−境界領域を単離し、同定すること;2）該DN
A配列を含有するクローニングおよび発現媒体を構築し
て、ヒト組織因子タンパク質、ならびにそのメチオニ
ン、融合またはシグナルＮ−末端コンジュゲートの発現
を可能にすること；および３）そのような媒体を含有す
ることによって遺伝的に変化し、ヒト組織因子タンパク
質を産生することができるようになった生細胞を培養す
ること。また、本発明は、ヒト組織因子タンパク質の細
胞内産生をコードしているDNAを製造する方法およびDNA
組成物に関する。さらに、本発明は、組織因子タンパク
質をコードしているクローンを得るのに用いられるDNA
配列を含む新規化合物に関する。さらにまた、本発明
は、あらゆる天然物質（通常、組織因子タンパク質はこ
れらとともに血液および／または組織中に見い出され
る）を実質的に含まない組織因子タンパク質に関する；
すなわち、組換え法で製造した組織因子タンパク質は、
そのタンパク質をインビボの生理学的環境から単離した
ときには通常伴っているこれらの不純物を含まないであ
ろう。注目すべき可能性ある不純物の１つは、後天性免
疫欠損症候群（AIDS）の原因物質であり、これは絶え間
なく増加しつつある多数の個体の血液中に見い出されつ
つある。製造方法によっては、この組織因子タンパク質
が、そのインビボの生理学的環境、すなわち血液および
／または組織から得られる物質と比較して、より大きい
か、またはより小さい関連のグリコシル化を含んでいる
こともある。さらに加えて、本発明は、新規組織因子タ
ンパク質誘導体、詳しくは組織因子タンパク質トランス
メンブランまたはメンブラン結合領域を構成するアミノ
酸配列からなるタンパク質のＣ−末端近くのタンパク質
の疎水性部分およびシグナル配列を欠いている誘導体に
関する。
本発明のヒト組織因子タンパク質およびその誘導体の
有用性は、一部には、血友病のイヌに組織因子タンパク
質を注入すると止血欠損が正常化されるという新規かつ
予想外の観察に基づいている。組織因子タンパク質は、
天然のリン脂質を欠いた組織因子のタンパク質部分であ
り、以前は組織因子アポタンパク質IIIと呼ばれていた
ものであり、かつ以前は不活性であると考えられていた
ものである。組織因子タンパク質が、因子VIII欠損に関
係した出血素因（すなわち、出血への傾向）をインビボ
で正常化することを初めて見い出した。組織因子がリン
脂質を絶対的に必要としていると記載されている先行文
献に照らして、組織因子タンパク質の注入は効果的では
ないと予想されることもあろう。しかし、ブランヴィル
およびそれに続く過去152年間の研究者の仕事とは対照
的に、組織因子タンパク質はイヌに静脈内注入したとき
非毒性であることがわかった。
有用性は、一部には、血友病のイヌに組織因子タンパク
質を注入すると止血欠損が正常化されるという新規かつ
予想外の観察に基づいている。組織因子タンパク質は、
天然のリン脂質を欠いた組織因子のタンパク質部分であ
り、以前は組織因子アポタンパク質IIIと呼ばれていた
ものであり、かつ以前は不活性であると考えられていた
ものである。組織因子タンパク質が、因子VIII欠損に関
係した出血素因（すなわち、出血への傾向）をインビボ
で正常化することを初めて見い出した。組織因子がリン
脂質を絶対的に必要としていると記載されている先行文
献に照らして、組織因子タンパク質の注入は効果的では
ないと予想されることもあろう。しかし、ブランヴィル
およびそれに続く過去152年間の研究者の仕事とは対照
的に、組織因子タンパク質はイヌに静脈内注入したとき
非毒性であることがわかった。
本発明のヒト組織因子タンパク質およびその誘導体
は、遺伝的なおよび後天的な出血傾向を特徴とする各種
慢性出血疾患の治療に有用ある。このような慢性出血疾
患の例は、因子VIII、IXまたはXIの欠損である。後天的
な疾患の例には以下に挙げるものが含まれる：血液凝固
因子（たとえば、因子VIII、ヴィレブランド因子、因子
IX、Ｖ、XI、XIIおよびXIII）の後天的な阻害;DICおよ
び凝固因子合成の減少を含む肝臓病の結果としての止血
疾患;DICおよび凝固因子欠損を含む急性および慢性の腎
臓病と関係した出血傾向；外傷または手術後の止血；因
子VIII、ヴィレブランド因子およびフィブリノーゲンの
増加をともなってDICに現れる、播種性の悪性疾患患
者；ならびに心肺の手術および大量の輸血の間の止血。
また、本発明のヒト組織因子タンパク質およびその誘導
体は、正常な患者および慢性出血疾患を有する患者の急
性出血症状において血液凝固を誘導するのに用いること
もできる。その他の用途は当業者には容易に理解される
ところであろう。
は、遺伝的なおよび後天的な出血傾向を特徴とする各種
慢性出血疾患の治療に有用ある。このような慢性出血疾
患の例は、因子VIII、IXまたはXIの欠損である。後天的
な疾患の例には以下に挙げるものが含まれる：血液凝固
因子（たとえば、因子VIII、ヴィレブランド因子、因子
IX、Ｖ、XI、XIIおよびXIII）の後天的な阻害;DICおよ
び凝固因子合成の減少を含む肝臓病の結果としての止血
疾患;DICおよび凝固因子欠損を含む急性および慢性の腎
臓病と関係した出血傾向；外傷または手術後の止血；因
子VIII、ヴィレブランド因子およびフィブリノーゲンの
増加をともなってDICに現れる、播種性の悪性疾患患
者；ならびに心肺の手術および大量の輸血の間の止血。
また、本発明のヒト組織因子タンパク質およびその誘導
体は、正常な患者および慢性出血疾患を有する患者の急
性出血症状において血液凝固を誘導するのに用いること
もできる。その他の用途は当業者には容易に理解される
ところであろう。
図面の説明 第１図は、内生経路による血液凝固の活性化を示す模
式図である。
式図である。
第２図は、ヒト組織因子タンパク質のヌクレオチドお
よびアミノ酸の配列図である。ヒト組織因子タンパク質
のヌクレオチド配列は、ある脂肪クローンのDNA配列分
析によって決定し、その一部は他のクローンの配列決定
によって確認したものである。組織因子タンパク質の予
想されるアミノ酸をDNA配列の下に示し、このタンパク
質配列のＮ−末端の最初の残基から数を付した。負のア
ミノ酸数は推定のリーダー・シグナル配列またはプレタ
ンパク質を表し、一方、正の数は完全なタンパク質を表
す。
よびアミノ酸の配列図である。ヒト組織因子タンパク質
のヌクレオチド配列は、ある脂肪クローンのDNA配列分
析によって決定し、その一部は他のクローンの配列決定
によって確認したものである。組織因子タンパク質の予
想されるアミノ酸をDNA配列の下に示し、このタンパク
質配列のＮ−末端の最初の残基から数を付した。負のア
ミノ酸数は推定のリーダー・シグナル配列またはプレタ
ンパク質を表し、一方、正の数は完全なタンパク質を表
す。
第3a〜3c図は、ヒト組織因子タンパク質のcDNAおよび
制限酵素部位を示す配列図である。本明細書中ではこれ
らをひとまとめにして第３図と称する。
制限酵素部位を示す配列図である。本明細書中ではこれ
らをひとまとめにして第３図と称する。
第４図は、哺乳動物宿主細胞中で用いる、完全な長さ
の組織因子タンパク質をコードしている発現ベクターpC
ISTFの構築を示す工程図である。
の組織因子タンパク質をコードしている発現ベクターpC
ISTFの構築を示す工程図である。
第4a図は、本発明で用いるpCIS2.8cシリーズのベクタ
ーの構築の一部を示す工程図である。
ーの構築の一部を示す工程図である。
第５図は、組織因子のヒドロパシー（hydropathy）の
プロファイルである。翻訳されたヒト組織因子のDNA配
列がカイトおよびドーリトル［Kyte and Doolittle,J.M
ol.Biol.157:105（1982）］のアルゴリズムを用いてプ
ロットされている。横座標は完全なアミノ末端で始まる
アミノ酸配列を示している。縦座標の正のポイントはタ
ンパク質の疎水性領域を表し、それぞれのポイントは６
連続アミノ酸の平均ヒドロパシーを示している。最下部
のＮは、予想されるアスパラギン結合したグリコシル化
部位の位置を示し、Ｏはアミノ酸160〜172のセリンおよ
びトレオニン残基の群を示している。予想される疎水性
メンブランの全領域は残基220〜243に囲まれており、黒
棒で示されている。
プロファイルである。翻訳されたヒト組織因子のDNA配
列がカイトおよびドーリトル［Kyte and Doolittle,J.M
ol.Biol.157:105（1982）］のアルゴリズムを用いてプ
ロットされている。横座標は完全なアミノ末端で始まる
アミノ酸配列を示している。縦座標の正のポイントはタ
ンパク質の疎水性領域を表し、それぞれのポイントは６
連続アミノ酸の平均ヒドロパシーを示している。最下部
のＮは、予想されるアスパラギン結合したグリコシル化
部位の位置を示し、Ｏはアミノ酸160〜172のセリンおよ
びトレオニン残基の群を示している。予想される疎水性
メンブランの全領域は残基220〜243に囲まれており、黒
棒で示されている。
第６図は、完全な長さの組織因子タンパク質をコード
している発現ベクターpTF2A12の構築を示す工程図であ
る。
している発現ベクターpTF2A12の構築を示す工程図であ
る。
第7a〜7c図は、位置245にシステインの代わりに置か
れたセリンを有する組織因子タンパク質突然変異体の構
築を示す工程図である。本明細書中ではこれらをひとま
とめにして第７図と称する。
れたセリンを有する組織因子タンパク質突然変異体の構
築を示す工程図である。本明細書中ではこれらをひとま
とめにして第７図と称する。
第8a〜8b図は、ヒト組織因子融合タンパク質の発現ベ
クターの構築を示す工程図である。本明細書中ではこれ
らをひとまとめにして第８図と称する。
クターの構築を示す工程図である。本明細書中ではこれ
らをひとまとめにして第８図と称する。
第９図は、Cos細胞における組織因子タンパク質の一
時的な発現の色素検定結果を示すものである。
時的な発現の色素検定結果を示すものである。
第10図は、細胞質領域を削除した組織因子タンパク質
の発現ベクターの構築を示す工程図である。
の発現ベクターの構築を示す工程図である。
詳細な説明 本明細書中で用いる「組織因子タンパク質」なる語句
は、たとえば凝固を誘導することによって、種々の出血
疾患、特に凝固因子の欠損に関係した疾患を正常化しう
るタンパク質を指す。この組織因子タンパク質は、天然
の脂質部分を分子中に欠いており、以前の組織因子また
は組織トロンボプラスチンとは別異のものである。ま
た、この組織因子タンパク質には、リン脂質と結合した
組織因子タンパク質（脂質が組織トロンボプラスチンと
結合している天然の脂質とは別異のものであり、かつ脂
質化したタンパク質で観察される付随の毒性を示さずに
凝固誘導能力を示す）が含まれる。ここに定義した組織
因子タンパク質を注入しても播種性の血管内凝固は起こ
らない。組織因子タンパク質の各種出血疾患を正常化す
る能力は、種々のインビボ出血モデル［たとえば、表皮
出血時間（CBT）測定による血友病のイヌでの凝固開
始；ギルズ等（Giles,A.R.et al.,Blood,60,727−730
（1982））］を用いて容易に測定することができる。
は、たとえば凝固を誘導することによって、種々の出血
疾患、特に凝固因子の欠損に関係した疾患を正常化しう
るタンパク質を指す。この組織因子タンパク質は、天然
の脂質部分を分子中に欠いており、以前の組織因子また
は組織トロンボプラスチンとは別異のものである。ま
た、この組織因子タンパク質には、リン脂質と結合した
組織因子タンパク質（脂質が組織トロンボプラスチンと
結合している天然の脂質とは別異のものであり、かつ脂
質化したタンパク質で観察される付随の毒性を示さずに
凝固誘導能力を示す）が含まれる。ここに定義した組織
因子タンパク質を注入しても播種性の血管内凝固は起こ
らない。組織因子タンパク質の各種出血疾患を正常化す
る能力は、種々のインビボ出血モデル［たとえば、表皮
出血時間（CBT）測定による血友病のイヌでの凝固開
始；ギルズ等（Giles,A.R.et al.,Blood,60,727−730
（1982））］を用いて容易に測定することができる。
第２図に示すアミノ酸配列は、プレ−組織因子タンパ
ク質のアミノ酸配列である。プレ−組織因子タンパク質
は、例えば、プレ−組織因子タンパク質をコードしてい
るDNAを含有する発現ベクターで形質転換することによ
って、成熟タンパク質をプロセッシングおよび分泌しな
い原核生物に於いて発現させることができる。培養培地
中または宿主の周縁質に成熟した組織因子タンパク質を
得るためには、上記のプロセッシングを行うことのでき
る宿主を形質転換することが好ましい。プレ−組織因子
タンパク質をコードしているDNAによる形質転換に於い
ては、通常、哺乳動物細胞のような高等な真核生物の宿
主細胞がプレ−組織因子タンパク質をプロセッシングで
き、成熟した組織因子タンパク質を分泌することができ
る。
ク質のアミノ酸配列である。プレ−組織因子タンパク質
は、例えば、プレ−組織因子タンパク質をコードしてい
るDNAを含有する発現ベクターで形質転換することによ
って、成熟タンパク質をプロセッシングおよび分泌しな
い原核生物に於いて発現させることができる。培養培地
中または宿主の周縁質に成熟した組織因子タンパク質を
得るためには、上記のプロセッシングを行うことのでき
る宿主を形質転換することが好ましい。プレ−組織因子
タンパク質をコードしているDNAによる形質転換に於い
ては、通常、哺乳動物細胞のような高等な真核生物の宿
主細胞がプレ−組織因子タンパク質をプロセッシングで
き、成熟した組織因子タンパク質を分泌することができ
る。
あるいは、成熟組織因子タンパク質を分泌させるに
は、成熟組織因子タンパク質をコードしているDNAの
５′末端を、宿主に認識されるシグナル配列をコードし
ているDNAの３′末端にライゲートすることによって行
うことができる。このライゲートしたDNA配列を含有す
る発現ベクターを使用して宿主を形質転換する。この宿
主細胞は、発現された融合物を、プロセッシングによ
り、シグナル配列と組織因子タンパク質の最初のアミノ
酸との間のペプチド結合をタンパク質分解的に切断し、
成熟した組織因子タンパク質を、その宿主細胞に応じて
宿主細胞の周縁質または培地に分泌する。例えば、原核
生物用の発現ベクターを組み立てる場合には、ヒト組織
因子タンパク質の分泌リーダー即ちアミノ酸−32から−
１を、細菌性アルカリホスファターゼまたは熱安定性エ
ンテロトキシンIIのリーダーと置き換え、酵母用の場合
には、組織因子タンパク質のリーダーを酵母インベルタ
ーゼ、α−因子または酸ホスファターゼのリーダーと置
き換える。ホモローガスなシグナル−組織因子タンパク
質の融合物で形質転換したグラム陰性微生物は、成熟し
た組織因子タンパク質をその細胞の周縁質に分泌し、一
方酵母またはバシルスsp.（bacillus sp.）は、成熟し
た組織因子タンパク質を培養培地中に分泌する。
は、成熟組織因子タンパク質をコードしているDNAの
５′末端を、宿主に認識されるシグナル配列をコードし
ているDNAの３′末端にライゲートすることによって行
うことができる。このライゲートしたDNA配列を含有す
る発現ベクターを使用して宿主を形質転換する。この宿
主細胞は、発現された融合物を、プロセッシングによ
り、シグナル配列と組織因子タンパク質の最初のアミノ
酸との間のペプチド結合をタンパク質分解的に切断し、
成熟した組織因子タンパク質を、その宿主細胞に応じて
宿主細胞の周縁質または培地に分泌する。例えば、原核
生物用の発現ベクターを組み立てる場合には、ヒト組織
因子タンパク質の分泌リーダー即ちアミノ酸−32から−
１を、細菌性アルカリホスファターゼまたは熱安定性エ
ンテロトキシンIIのリーダーと置き換え、酵母用の場合
には、組織因子タンパク質のリーダーを酵母インベルタ
ーゼ、α−因子または酸ホスファターゼのリーダーと置
き換える。ホモローガスなシグナル−組織因子タンパク
質の融合物で形質転換したグラム陰性微生物は、成熟し
た組織因子タンパク質をその細胞の周縁質に分泌し、一
方酵母またはバシルスsp.（bacillus sp.）は、成熟し
た組織因子タンパク質を培養培地中に分泌する。
本発明の範囲内に属するものには、以下のものがあ
る：天然のグリコシル化を伴い第２図に示すアミノ酸配
列を有する組織因子タンパク質、他の動物種例えばウ
シ、ブタおよびヒツジなど由来の類似組織因子タンパク
質、このような組織因子タンパク質の脱グリコシル化ま
たは非グリコシル化誘導体、およびアレルを包含する組
織因子タンパク質の生物学的に活性なアミノ酸配列変異
体、並びに組織因子タンパク質活性を示すインビトロで
生成させた組織因子タンパク質の共有結合誘導体。
る：天然のグリコシル化を伴い第２図に示すアミノ酸配
列を有する組織因子タンパク質、他の動物種例えばウ
シ、ブタおよびヒツジなど由来の類似組織因子タンパク
質、このような組織因子タンパク質の脱グリコシル化ま
たは非グリコシル化誘導体、およびアレルを包含する組
織因子タンパク質の生物学的に活性なアミノ酸配列変異
体、並びに組織因子タンパク質活性を示すインビトロで
生成させた組織因子タンパク質の共有結合誘導体。
組織因子タンパク質のアミノ酸配列変異体は、置換型
変異体、挿入型変異体または欠損型変異体の３つの種類
のうちの１つまたはそれ以上に分類される。挿入型に
は、アミノおよび／またはカルボキシ末端融合物、並び
にシグナルまたは多数のアミノ酸残基の配列内挿入型が
包含される。組織因子融合タンパク質には、例えば、組
織因子タンパク質と相同なポリペプチド例えばヒト組織
因子タンパク質の場合、他の分泌されたヒトタンパク質
由来の分泌リーダーとの成熟組織因子タンパク質のハイ
ブリッドなどが包含される。組織因子融合タンパク質に
は、更に、組織因子タンパク質ではなく宿主細胞と相同
なポリペプチドと組織因子タンパク質とのハイブリッ
ド、並びに宿主細胞および組織因子タンパク質の両方と
相同なポリペプチドとのハイブリッドも包含される。こ
のような組織因子融合タンパク質の例としては、ヘルペ
ス−gDシグナル配列を伴う成熟した組織因子タンパク質
が挙げられる。本発明の範囲内に属する好ましい融合物
には、原核生物ペプチド、または原核生物、酵母、ウィ
ルスまたは宿主細胞のシグナル配列のシグナルペプチド
のいずれかを有するアミノ末端融合物がある。シグナル
配列には、それが関与している分泌タンパク質由来の成
熟配列の残りが含まれていないということは必須ではな
いが、組織因子タンパク質融合物の分泌を避けるため
に、その方が好ましい。
変異体、挿入型変異体または欠損型変異体の３つの種類
のうちの１つまたはそれ以上に分類される。挿入型に
は、アミノおよび／またはカルボキシ末端融合物、並び
にシグナルまたは多数のアミノ酸残基の配列内挿入型が
包含される。組織因子融合タンパク質には、例えば、組
織因子タンパク質と相同なポリペプチド例えばヒト組織
因子タンパク質の場合、他の分泌されたヒトタンパク質
由来の分泌リーダーとの成熟組織因子タンパク質のハイ
ブリッドなどが包含される。組織因子融合タンパク質に
は、更に、組織因子タンパク質ではなく宿主細胞と相同
なポリペプチドと組織因子タンパク質とのハイブリッ
ド、並びに宿主細胞および組織因子タンパク質の両方と
相同なポリペプチドとのハイブリッドも包含される。こ
のような組織因子融合タンパク質の例としては、ヘルペ
ス−gDシグナル配列を伴う成熟した組織因子タンパク質
が挙げられる。本発明の範囲内に属する好ましい融合物
には、原核生物ペプチド、または原核生物、酵母、ウィ
ルスまたは宿主細胞のシグナル配列のシグナルペプチド
のいずれかを有するアミノ末端融合物がある。シグナル
配列には、それが関与している分泌タンパク質由来の成
熟配列の残りが含まれていないということは必須ではな
いが、組織因子タンパク質融合物の分泌を避けるため
に、その方が好ましい。
挿入は、組織因子タンパク質の完全なコード化配列内
に導入することもできる。しかし、これは通常、アミノ
またはカルボキシ末端の融合物よりも小さい挿入であ
り、大体１から４個の残基の挿入である。代表的な例に
は、Arg135残基に於いてトリプシン加水分解に対する耐
性に関して選別される変異体である［Arg135Arg136→Ar
g135ProArg137］組織因子タンパク質がある。本明細書
中に於いて記載している特徴的な組織因子タンパク質の
バリエーションは、特に明記しない限り、成熟組織因子
タンパク質の配列に於けるバリエーションであり、これ
らはプレ−組織因子タンパク質の変異体ではない。
に導入することもできる。しかし、これは通常、アミノ
またはカルボキシ末端の融合物よりも小さい挿入であ
り、大体１から４個の残基の挿入である。代表的な例に
は、Arg135残基に於いてトリプシン加水分解に対する耐
性に関して選別される変異体である［Arg135Arg136→Ar
g135ProArg137］組織因子タンパク質がある。本明細書
中に於いて記載している特徴的な組織因子タンパク質の
バリエーションは、特に明記しない限り、成熟組織因子
タンパク質の配列に於けるバリエーションであり、これ
らはプレ−組織因子タンパク質の変異体ではない。
組織因子タンパク質の挿入型アミノ酸配列変異体は、
標的組織因子タンパク質内のあらかじめ決めた部位に１
つまたはそれ以上アミノ酸残基を導入したものである。
通常、挿入型変異体は、組織因子タンパク質のアミノま
たはカルボキシ末端に異種タンパク質またはポリペプチ
ドが結合した融合物である。免疫原性を有する組織因子
タンパク質誘導体は、イン・ビトロ交叉連結法、または
融合物をコードしているDNAで形質転換した組換え細胞
の培養法によって、免疫原性を標的配列に付与するのに
十分な大きさのポリペプチドを融合させて調製する。こ
のような免疫原性を有するポリペプチドとしては、細菌
性ポリペプチド類、例えばtrpLE、β−ガラクトシダー
ゼなどを挙げることができる。
標的組織因子タンパク質内のあらかじめ決めた部位に１
つまたはそれ以上アミノ酸残基を導入したものである。
通常、挿入型変異体は、組織因子タンパク質のアミノま
たはカルボキシ末端に異種タンパク質またはポリペプチ
ドが結合した融合物である。免疫原性を有する組織因子
タンパク質誘導体は、イン・ビトロ交叉連結法、または
融合物をコードしているDNAで形質転換した組換え細胞
の培養法によって、免疫原性を標的配列に付与するのに
十分な大きさのポリペプチドを融合させて調製する。こ
のような免疫原性を有するポリペプチドとしては、細菌
性ポリペプチド類、例えばtrpLE、β−ガラクトシダー
ゼなどを挙げることができる。
欠損型変異体は、１つまたはそれ以上のアミノ酸残基
が組織因子タンパク質配列から除かれていることを特徴
とする。通常は、組織因子タンパク質分子内の１カ所に
於いて僅かに２から６個のアミノ酸残基しか欠損してい
ないが、残基−31から−１までを欠損させれば、met−
組織因子タンパク質が得られるであろう。この変異体は
met−成熟組織因子タンパク質を細胞内に直接発現させ
るのに適している。他の欠損型変異体には、組織因子タ
ンパク質分子の約220から242残基に位置するトランスメ
ンブラン領域の中が欠損しているものがある。
が組織因子タンパク質配列から除かれていることを特徴
とする。通常は、組織因子タンパク質分子内の１カ所に
於いて僅かに２から６個のアミノ酸残基しか欠損してい
ないが、残基−31から−１までを欠損させれば、met−
組織因子タンパク質が得られるであろう。この変異体は
met−成熟組織因子タンパク質を細胞内に直接発現させ
るのに適している。他の欠損型変異体には、組織因子タ
ンパク質分子の約220から242残基に位置するトランスメ
ンブラン領域の中が欠損しているものがある。
これらの変異体は、通常、組織因子タンパク質をコー
ドしているDNA内のヌクレオチドを部位特異的に突然変
異させ、これにより変異体をコードしているDNAを調製
し、次いで組換え細胞培養物に於いてこのDNAを発現さ
せて調製される。しかし、約100−150個の残基までしか
有しない変異組織因子タンパク質フラグメントはイン・
ビトロ合成によって好適に調製することができる。通
常、これらの変異体は、天然に存在する類似体と質的に
同じ生物学的活性を示すが、以下に詳細に説明するよう
に、組織因子タンパク質の特性を改良するために変異体
を選別することもある。
ドしているDNA内のヌクレオチドを部位特異的に突然変
異させ、これにより変異体をコードしているDNAを調製
し、次いで組換え細胞培養物に於いてこのDNAを発現さ
せて調製される。しかし、約100−150個の残基までしか
有しない変異組織因子タンパク質フラグメントはイン・
ビトロ合成によって好適に調製することができる。通
常、これらの変異体は、天然に存在する類似体と質的に
同じ生物学的活性を示すが、以下に詳細に説明するよう
に、組織因子タンパク質の特性を改良するために変異体
を選別することもある。
アミノ酸配列バイエーションを導入させる部位は、あ
らかじめ決めておくが、突然変異自体をあらかじめ決め
ておく必要はない。例えば、その部位に於いて突然変異
の誘発を最適に起こすには、標的コドンまたは領域で無
作為に突然変異誘発させ、発現させた組織因子タンパク
質変異体を所望の活性の最適な組合わせをスクリーニン
グすればよい。既知の配列を有するDNA内のあらかじめ
決めておいた部位で突然変異を誘発させる方法は周知の
ものであり、例えばM13プライマー突然変異誘発が挙げ
られる。
らかじめ決めておくが、突然変異自体をあらかじめ決め
ておく必要はない。例えば、その部位に於いて突然変異
の誘発を最適に起こすには、標的コドンまたは領域で無
作為に突然変異誘発させ、発現させた組織因子タンパク
質変異体を所望の活性の最適な組合わせをスクリーニン
グすればよい。既知の配列を有するDNA内のあらかじめ
決めておいた部位で突然変異を誘発させる方法は周知の
ものであり、例えばM13プライマー突然変異誘発が挙げ
られる。
アミノ酸置換は通常１個の残基で行い、挿入は通常約
１から10個のアミノ酸残基ぐらいであり、欠損は１から
30個の範囲の残基数であろう。欠損または挿入は、隣接
した対即ち２残基の欠損または２残基の挿入として行う
のが好ましい。置換、欠損、挿入またはこれらのあらゆ
る組合わせを組合わせることで最終的な組立て物とする
ことができる。言うまでもなく、変異組織因子タンパク
質をコードしているDNA内で起こさせる突然変異は、そ
の配列を解読フレーム外に置くようなものであってはな
らず、mRNAに二次構造をとらせるような相補的な領域を
作成しないことが好ましい（EP75,444A）。
１から10個のアミノ酸残基ぐらいであり、欠損は１から
30個の範囲の残基数であろう。欠損または挿入は、隣接
した対即ち２残基の欠損または２残基の挿入として行う
のが好ましい。置換、欠損、挿入またはこれらのあらゆ
る組合わせを組合わせることで最終的な組立て物とする
ことができる。言うまでもなく、変異組織因子タンパク
質をコードしているDNA内で起こさせる突然変異は、そ
の配列を解読フレーム外に置くようなものであってはな
らず、mRNAに二次構造をとらせるような相補的な領域を
作成しないことが好ましい（EP75,444A）。
置換変異体は、第２図に示す配列内の少なくとも１つ
が除去されており、その場所に別の残基が挿入されてい
る。このような置換は、一般に、組織因子タンパク質の
特性に微妙な調節を加えたい場合に、以下の第１表に従
って行う。
が除去されており、その場所に別の残基が挿入されてい
る。このような置換は、一般に、組織因子タンパク質の
特性に微妙な調節を加えたい場合に、以下の第１表に従
って行う。
第１表に挙げたものより保守性が少ない置換を選択す
ることによって、すなわち、（ａ）置換領域のポリペプ
チドの主骨格構造（たとえば、シート状またはらせん状
の立体配置）、（ｂ）標的部位の分子の電荷または疎水
性、または（ｃ）側鎖の大きさ、を保持する作用がもっ
と有意に異なっている残基を選択することによって、免
疫学的な同一性または機能が実質的に変えられる。組織
因子タンパク質の性質に最大の変化を与えると一般的に
予想される置換は、次のようなものであろう：（ａ）親
水性残基（たとえば、セリルあるいはトレオニル）を疎
水性残基（たとえば、ロイシル、イソロイシル、フェニ
ルアラニル、バリルあるいはアラニル）に（で）置換す
ること；（ｂ）システインあるいはプロリンを他のいず
れかの残基に（で）置換すること；（ｃ）電気的に正の
側鎖を有する残基（たとえば、リジル、アルギニルある
いはヒスチジル）を電気的に負の残基（たとえば、グル
タミルあるいはアスパルチル）に（で）置換すること；
または（ｄ）大きな側鎖を有する残基（たとえば、フェ
ニルアラニン）を側鎖を有さない残基（たとえば、グリ
シン）に（で）置換すること。
ることによって、すなわち、（ａ）置換領域のポリペプ
チドの主骨格構造（たとえば、シート状またはらせん状
の立体配置）、（ｂ）標的部位の分子の電荷または疎水
性、または（ｃ）側鎖の大きさ、を保持する作用がもっ
と有意に異なっている残基を選択することによって、免
疫学的な同一性または機能が実質的に変えられる。組織
因子タンパク質の性質に最大の変化を与えると一般的に
予想される置換は、次のようなものであろう：（ａ）親
水性残基（たとえば、セリルあるいはトレオニル）を疎
水性残基（たとえば、ロイシル、イソロイシル、フェニ
ルアラニル、バリルあるいはアラニル）に（で）置換す
ること；（ｂ）システインあるいはプロリンを他のいず
れかの残基に（で）置換すること；（ｃ）電気的に正の
側鎖を有する残基（たとえば、リジル、アルギニルある
いはヒスチジル）を電気的に負の残基（たとえば、グル
タミルあるいはアスパルチル）に（で）置換すること；
または（ｄ）大きな側鎖を有する残基（たとえば、フェ
ニルアラニン）を側鎖を有さない残基（たとえば、グリ
シン）に（で）置換すること。
置換型あるいは削除型の変異の主なものは、トランス
メンブラン、あるいは組織因子タンパク質の疎水性ある
いは親油性領域が関与するものである。組織因子タンパ
ク質のトランスメンブラン領域は、ヒト脂肪組織由来の
DNAがコードしているタンパク質の残基約220〜242のと
ころに位置している。この領域は、疎水性あるいは親油
性が高い領域であり、細胞膜の脂質二重層をまたぐに適
当な大きさである。組織因子タンパク質を細胞膜に固定
するものと考えられる。
メンブラン、あるいは組織因子タンパク質の疎水性ある
いは親油性領域が関与するものである。組織因子タンパ
ク質のトランスメンブラン領域は、ヒト脂肪組織由来の
DNAがコードしているタンパク質の残基約220〜242のと
ころに位置している。この領域は、疎水性あるいは親油
性が高い領域であり、細胞膜の脂質二重層をまたぐに適
当な大きさである。組織因子タンパク質を細胞膜に固定
するものと考えられる。
トランスメンブラン領域の削除または置換は、水溶液
中に組織因子タンパク質を維持するのに清浄剤を必要と
することがないようにその水溶性を改善し、その細胞ま
たは膜脂質親和性を減少させることによって、可溶性の
組換え組織因子タンパク質を与え、回収を容易にするで
あろう。潜在的に免疫原性であるエピトープの導入を避
けるため、トランスメンブラン領域を置換するよりむし
ろ削除するのが好ましい。トランスメンブランを削除し
た組織因子タンパク質の利点の１つは、それがさらに容
易に培養培地に分泌されることである。この変異体は水
溶性であり、細胞膜脂質に対してそれほど親和性を有し
ていないので、組換え細胞培養物からの回収をかなり簡
単なものにする。
中に組織因子タンパク質を維持するのに清浄剤を必要と
することがないようにその水溶性を改善し、その細胞ま
たは膜脂質親和性を減少させることによって、可溶性の
組換え組織因子タンパク質を与え、回収を容易にするで
あろう。潜在的に免疫原性であるエピトープの導入を避
けるため、トランスメンブラン領域を置換するよりむし
ろ削除するのが好ましい。トランスメンブランを削除し
た組織因子タンパク質の利点の１つは、それがさらに容
易に培養培地に分泌されることである。この変異体は水
溶性であり、細胞膜脂質に対してそれほど親和性を有し
ていないので、組換え細胞培養物からの回収をかなり簡
単なものにする。
置換型または削除型の突然変異誘発を用いて、Ｎ−ま
たはＯ−結合のグリコシル化部位を除去し（たとえば、
Asn−Ｘ−Thrグリコシル化部位のアスパラギニル残基の
削除または置換によって）、組織因子タンパク質の発現
を改善するか、またはこのタンパク質の半減期を変える
ことができる。別法では、グリコシル化されていない組
織因子タンパク質を組換え原核生物細胞培養物中で製造
することができる。システインまたはその他の不安定な
残基の削除または置換も、たとえば酸化安定性の増加、
または組織因子タンパク質のジスルフィド結合の好まし
い転移の選択に望ましい。このようなシステイン置換の
例の１つは、位置245のシステインに代えてセリンを置
くことである。タンパク質加水分解の可能性のある部位
（たとえば、Arg Arg）の削除または置換は、たとえば
塩基性残基の１つを除去するか、または１つをグルタミ
ニルまたはヒスチジル残基で置換することによって行わ
れる。
たはＯ−結合のグリコシル化部位を除去し（たとえば、
Asn−Ｘ−Thrグリコシル化部位のアスパラギニル残基の
削除または置換によって）、組織因子タンパク質の発現
を改善するか、またはこのタンパク質の半減期を変える
ことができる。別法では、グリコシル化されていない組
織因子タンパク質を組換え原核生物細胞培養物中で製造
することができる。システインまたはその他の不安定な
残基の削除または置換も、たとえば酸化安定性の増加、
または組織因子タンパク質のジスルフィド結合の好まし
い転移の選択に望ましい。このようなシステイン置換の
例の１つは、位置245のシステインに代えてセリンを置
くことである。タンパク質加水分解の可能性のある部位
（たとえば、Arg Arg）の削除または置換は、たとえば
塩基性残基の１つを除去するか、または１つをグルタミ
ニルまたはヒスチジル残基で置換することによって行わ
れる。
DNA単離体とは、３′および／または５′境界領域を
含むか、または含まない、化学的に合成したDNA、cDNA
またはゲノムDNAを意味するものと理解される。組織因
子タンパク質をコードしているDNAは、ａ）特定の動物
の組織因子タンパク質mRNAを含んでいる胎盤、脂肪また
はその他の組織（たとえば、脳）からcDNAライブラリー
を得、ｂ）ヒト組織因子タンパク質またはそのフラグメ
ント（通常、100bpより大きい）をコードしているラベ
ルされたDNAでハイブリダイゼーション分析を行って、
相同配列を含んでいるcDNAライブラリー中のクローンを
検出し、そしてｃ）制限酵素分析および核酸の配列決定
によってクローンを分析して完全な長さのクローンを同
定することによって、ヒト以外の他の供給源から得られ
る。完全な長さのクローンがこのライブラリー中に存在
しないときには、本発明で初めて開示された核酸配列を
用いて種々のクローンから適当なフラグメントを回収
し、これらクローンに共通する制限部位でライゲートし
て組織因子タンパク質をコードしている完全な長さのク
ローンを組み立ててもよい。
含むか、または含まない、化学的に合成したDNA、cDNA
またはゲノムDNAを意味するものと理解される。組織因
子タンパク質をコードしているDNAは、ａ）特定の動物
の組織因子タンパク質mRNAを含んでいる胎盤、脂肪また
はその他の組織（たとえば、脳）からcDNAライブラリー
を得、ｂ）ヒト組織因子タンパク質またはそのフラグメ
ント（通常、100bpより大きい）をコードしているラベ
ルされたDNAでハイブリダイゼーション分析を行って、
相同配列を含んでいるcDNAライブラリー中のクローンを
検出し、そしてｃ）制限酵素分析および核酸の配列決定
によってクローンを分析して完全な長さのクローンを同
定することによって、ヒト以外の他の供給源から得られ
る。完全な長さのクローンがこのライブラリー中に存在
しないときには、本発明で初めて開示された核酸配列を
用いて種々のクローンから適当なフラグメントを回収
し、これらクローンに共通する制限部位でライゲートし
て組織因子タンパク質をコードしている完全な長さのク
ローンを組み立ててもよい。
本発明の範囲内に含まれる、凝固を誘導しない組織因
子タンパク質誘導体には、組織因子タンパク質と実質的
に相同、または相同ではないポリペプチドが含まれる。
この組織因子タンパク質誘導体は、上記定義のような凝
固誘導活性をもはや示さないように無傷の組織因子タン
パク質中にアミノ酸配列変異を導入することによって、
または組織因子タンパク質フラグメントの組換えあるい
は有機合成によって製造される。
子タンパク質誘導体には、組織因子タンパク質と実質的
に相同、または相同ではないポリペプチドが含まれる。
この組織因子タンパク質誘導体は、上記定義のような凝
固誘導活性をもはや示さないように無傷の組織因子タン
パク質中にアミノ酸配列変異を導入することによって、
または組織因子タンパク質フラグメントの組換えあるい
は有機合成によって製造される。
上記の凝固を誘導しない組織因子タンパク質誘導体
は、凝固誘導組織因子タンパク質に対する抗体を生成さ
せるための免疫原として有用である。このような組織因
子タンパク質誘導体（「組織因子タンパク質アンタゴニ
スト」と呼ばれる）を用いて、組織因子タンパク質の凝
固誘導活性を中和することもできる。このような組織因
子タンパク質アンタゴニストは、因子VIIあるいはVII a
に結合するか、または因子VIIあるいはVII aと複合した
ときには因子IXあるいはＸのタンパク質加水分解を阻害
することもある。組織因子タンパク質アンタゴニスト
は、ヘパリンなどの他の抗凝固剤に代えて、またはこれ
らと組み合わせて、種々の凝固疾患「たとえば、外傷あ
るいは手術後、重篤な感染および敗血症の間に発生する
播種性の血管内凝固（DIC）］を治療するのに有用であ
る。
は、凝固誘導組織因子タンパク質に対する抗体を生成さ
せるための免疫原として有用である。このような組織因
子タンパク質誘導体（「組織因子タンパク質アンタゴニ
スト」と呼ばれる）を用いて、組織因子タンパク質の凝
固誘導活性を中和することもできる。このような組織因
子タンパク質アンタゴニストは、因子VIIあるいはVII a
に結合するか、または因子VIIあるいはVII aと複合した
ときには因子IXあるいはＸのタンパク質加水分解を阻害
することもある。組織因子タンパク質アンタゴニスト
は、ヘパリンなどの他の抗凝固剤に代えて、またはこれ
らと組み合わせて、種々の凝固疾患「たとえば、外傷あ
るいは手術後、重篤な感染および敗血症の間に発生する
播種性の血管内凝固（DIC）］を治療するのに有用であ
る。
組織因子タンパク質分子の共有結合による修飾体は本
発明の範囲内に含まれる。このような修飾は、回収した
タンパク質の標的アミノ酸残基を、選択した側鎖あるい
は末端残基と反応しうる有機誘導体化剤と反応させるこ
とによって行われる。別法では、選択した組換え宿主細
胞中での翻訳後修飾を用いてタンパク質を修飾してもよ
い。当業者には既知であろうが、この得られた共有結合
誘導体は、免疫原として、または生物学的活性に重要な
残基を同定するのに、ならびに分子の薬理学的な性質
（たとえば、半減期、結合親和性など）を変えるのに有
用である。
発明の範囲内に含まれる。このような修飾は、回収した
タンパク質の標的アミノ酸残基を、選択した側鎖あるい
は末端残基と反応しうる有機誘導体化剤と反応させるこ
とによって行われる。別法では、選択した組換え宿主細
胞中での翻訳後修飾を用いてタンパク質を修飾してもよ
い。当業者には既知であろうが、この得られた共有結合
誘導体は、免疫原として、または生物学的活性に重要な
残基を同定するのに、ならびに分子の薬理学的な性質
（たとえば、半減期、結合親和性など）を変えるのに有
用である。
ある種の翻訳後の誘導体化は、発現したポリペプチド
に及ぼす組換え宿主細胞の作用の結果である。グルタミ
ニルおよびアスパラギニル残基は、翻訳後に、対応する
グルタミルおよびアスパルチル残基に脱アミド化される
ことが多い。別法では、これらの残基を穏やかな酸性条
件下で脱アミド化する。これら残基のいずれの形態も本
発明の範囲内に含まれる。
に及ぼす組換え宿主細胞の作用の結果である。グルタミ
ニルおよびアスパラギニル残基は、翻訳後に、対応する
グルタミルおよびアスパルチル残基に脱アミド化される
ことが多い。別法では、これらの残基を穏やかな酸性条
件下で脱アミド化する。これら残基のいずれの形態も本
発明の範囲内に含まれる。
その他の翻訳後の修飾には、プロリンおよびリジンの
ヒドロキシル化、セリルあるいはトレオニル残基のヒド
ロキシル基のホスホリル化、リジン、アルギニンおよび
ヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化［クレイトン
（T.E.Creighton）；Proteins:Structure and Molecula
r Properties.W.H.Freeman ＆ Co.,San Francisco pp79
−86（1983）］、Ｎ−末端アミンのアセチル化、および
ある場合にはＣ−末端カルボキシルのアミド化が含まれ
る。
ヒドロキシル化、セリルあるいはトレオニル残基のヒド
ロキシル基のホスホリル化、リジン、アルギニンおよび
ヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化［クレイトン
（T.E.Creighton）；Proteins:Structure and Molecula
r Properties.W.H.Freeman ＆ Co.,San Francisco pp79
−86（1983）］、Ｎ−末端アミンのアセチル化、および
ある場合にはＣ−末端カルボキシルのアミド化が含まれ
る。
本発明によって製造される組織因子タンパク質の状態
を表すのに用いられる「実質的に含まない」または「実
質的に純粋な」は、たとえば抽出および精製によって血
液および／または組織から組織因子タンパク質を得ると
きのような、インビボの生理学的環境において、通常組
織因子タンパク質に伴っているタンパク質またはその他
の物質を含まないことを意味する。その他の物質には、
たとえば後天性免疫欠損症候群（AIDS）の原因物質など
の感染性微生物が含まれる。本発明の方法によって製造
した組織因子タンパク質の純度は90％またはそれ以上で
ある。
を表すのに用いられる「実質的に含まない」または「実
質的に純粋な」は、たとえば抽出および精製によって血
液および／または組織から組織因子タンパク質を得ると
きのような、インビボの生理学的環境において、通常組
織因子タンパク質に伴っているタンパク質またはその他
の物質を含まないことを意味する。その他の物質には、
たとえば後天性免疫欠損症候群（AIDS）の原因物質など
の感染性微生物が含まれる。本発明の方法によって製造
した組織因子タンパク質の純度は90％またはそれ以上で
ある。
本発明で有用なベクターを構築する際のDNA配列のク
ローニングには、通常、原核生物細胞が用いられる。た
とえば、大腸菌（E.coli）K12株294（ATCC No.31446）
が特に有用である。使用可能なその他の微生物株には、
大腸菌Ｂおよび大腸菌X1776（ATCC No.31537）が含まれ
る。これらは限定のためではなく説明のために例示した
ものである。
ローニングには、通常、原核生物細胞が用いられる。た
とえば、大腸菌（E.coli）K12株294（ATCC No.31446）
が特に有用である。使用可能なその他の微生物株には、
大腸菌Ｂおよび大腸菌X1776（ATCC No.31537）が含まれ
る。これらは限定のためではなく説明のために例示した
ものである。
また、原核生物は発現用に用いることもできる。上記
の株、ならびに大腸菌W3110（F-、λ−、プロトトロー
フ性、ATCC No.27325）、バシルス・サブチルス（Bacil
lus subtilus）などの桿菌、サルモネラ・チフィムリウ
ム（Salmonella typhimurium）あるいはセラッチア・マ
ルセスカンス（Serratia marcescans）などのその他の
腸内細菌、および種々のシュードモナス種を用いること
ができる。
の株、ならびに大腸菌W3110（F-、λ−、プロトトロー
フ性、ATCC No.27325）、バシルス・サブチルス（Bacil
lus subtilus）などの桿菌、サルモネラ・チフィムリウ
ム（Salmonella typhimurium）あるいはセラッチア・マ
ルセスカンス（Serratia marcescans）などのその他の
腸内細菌、および種々のシュードモナス種を用いること
ができる。
通常、宿主細胞と共存できる種由来のプロモーターお
よびコントロール配列を含有するプラスミドベクターを
これら宿主とともに用いる。通常、このベクターは、複
製部位、ならびに形質転換細胞の表現型選択を可能にす
る１またはそれ以上のマーカー配列を有している。たと
えば、大腸菌は、大腸菌種由来のプラスミドであるpBR3
22［ボリバー等（Bolivar,et al.,Gene２:95（197
7））］の誘導体を用いて形質転換されるのが普通であ
る。pBR322はアンピシリンおよびテトラサイクリン耐性
の遺伝子を含有しているので、形質転換細胞を同定する
ための容易な手段を与える。また、pBR322プラスミドま
たはその他の微生物プラスミドは、組換えDNA構築に通
常用いられるプロモーターおよびその他のコントロール
要素を含んでいるか、または含むように修飾されなけれ
ばならない。
よびコントロール配列を含有するプラスミドベクターを
これら宿主とともに用いる。通常、このベクターは、複
製部位、ならびに形質転換細胞の表現型選択を可能にす
る１またはそれ以上のマーカー配列を有している。たと
えば、大腸菌は、大腸菌種由来のプラスミドであるpBR3
22［ボリバー等（Bolivar,et al.,Gene２:95（197
7））］の誘導体を用いて形質転換されるのが普通であ
る。pBR322はアンピシリンおよびテトラサイクリン耐性
の遺伝子を含有しているので、形質転換細胞を同定する
ための容易な手段を与える。また、pBR322プラスミドま
たはその他の微生物プラスミドは、組換えDNA構築に通
常用いられるプロモーターおよびその他のコントロール
要素を含んでいるか、または含むように修飾されなけれ
ばならない。
原核生物性宿主とともに用いるのに適しているプロモ
ーターを例示すると、β−ラクタマーゼおよびラクトー
スプロモーター系［チャン等（Chang et al.,Nature,27
5:615（1978））；およびゲーデル等（Goeddel et al.,
Nature,281:544（1979））］、アルカリホスファター
ゼ、トリプトファン（trp）プロモーター系［ゲーデル
（Goeddel,Nucleic Acids Res.,８:4057（1980））およ
びEPO出願公開No.36,776］、およびtacプロモーター
［ボアー等（H.de Boer et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.US
A,80:21−25（1983））］などのハイブリッドプロモー
ターが含まれる。しかし、その他の機能的な細菌性プロ
モーターも適している。これらのヌクレオチド配列は通
常知られているので、あらゆる必要な制限部位を供給す
るためのリンガーまたはアダプターを用いて、組織因子
タンパク質をコードしているDNAにプロモーターを機能
的にライゲートすることができる。また、細菌系に用い
るためのプロモーターは、組織因子タンパク質をコード
しているDNAに機能的に結合したシャイン−ダルガルノ
（Shine−Dalgarno;S.D.）配列を含んでいるであろう。
ーターを例示すると、β−ラクタマーゼおよびラクトー
スプロモーター系［チャン等（Chang et al.,Nature,27
5:615（1978））；およびゲーデル等（Goeddel et al.,
Nature,281:544（1979））］、アルカリホスファター
ゼ、トリプトファン（trp）プロモーター系［ゲーデル
（Goeddel,Nucleic Acids Res.,８:4057（1980））およ
びEPO出願公開No.36,776］、およびtacプロモーター
［ボアー等（H.de Boer et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.US
A,80:21−25（1983））］などのハイブリッドプロモー
ターが含まれる。しかし、その他の機能的な細菌性プロ
モーターも適している。これらのヌクレオチド配列は通
常知られているので、あらゆる必要な制限部位を供給す
るためのリンガーまたはアダプターを用いて、組織因子
タンパク質をコードしているDNAにプロモーターを機能
的にライゲートすることができる。また、細菌系に用い
るためのプロモーターは、組織因子タンパク質をコード
しているDNAに機能的に結合したシャイン−ダルガルノ
（Shine−Dalgarno;S.D.）配列を含んでいるであろう。
原核生物に加えて、酵母培養物などの真核微生物を用
いることもできる。サッカロマイセス・セレビジエ（Sa
ccharomyces cerevisiae）または通常のパン酵母が最も
普通に用いられる真核生物性微生物であるが、その他の
多数の菌株も同じように用いることができる。サッカロ
マイセスの発現用には、たとえばプラスミドYRp7［ステ
ィンクコンブ等（Stinchcomb,et al.,Nature282:39（19
79））；キングスマン等（Kingsman et al.,Gene７:141
（1979））；チェンパー等（Tschemper et al.,Gene10:
157（1980））］が普通に用いられる。このプラスミド
は、トリプトファン中で増殖する能力を欠いている酵母
の突然変異株、たとえばATCC No.44076またはPEP4−１
［ジョンズ（Jones,Genetics85:12（1977））］に選択
マーカーを付与するtrp1遺伝子を既に含んでいる。酵母
宿主細胞ゲノムの性質としてtrp1欠損が存在すること
は、トリプトファンの非存在下で増殖させることによる
有効な選択手段を与える。
いることもできる。サッカロマイセス・セレビジエ（Sa
ccharomyces cerevisiae）または通常のパン酵母が最も
普通に用いられる真核生物性微生物であるが、その他の
多数の菌株も同じように用いることができる。サッカロ
マイセスの発現用には、たとえばプラスミドYRp7［ステ
ィンクコンブ等（Stinchcomb,et al.,Nature282:39（19
79））；キングスマン等（Kingsman et al.,Gene７:141
（1979））；チェンパー等（Tschemper et al.,Gene10:
157（1980））］が普通に用いられる。このプラスミド
は、トリプトファン中で増殖する能力を欠いている酵母
の突然変異株、たとえばATCC No.44076またはPEP4−１
［ジョンズ（Jones,Genetics85:12（1977））］に選択
マーカーを付与するtrp1遺伝子を既に含んでいる。酵母
宿主細胞ゲノムの性質としてtrp1欠損が存在すること
は、トリプトファンの非存在下で増殖させることによる
有効な選択手段を与える。
酵母宿主とともに用いる適当なプロモーター配列に
は、３−ホスホグリセレートキナーゼ［ヒッツェマン等
（Hitzeman et al.,J.Biol.Chem.255:2073（1980））］
またはその他のグルコース分解酵素［ヘス等（Hess et
al.,J.Adv.Enzyme Reg.７:149（1968））；およびホー
ランド（Holland,Biochemistry17:4900（1978））］、
たとえばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフ
ェート デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルベー
ト デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グ
ルコース−６−ホスフェート イソメラーゼ、３−ホス
ホグリセレート ムターゼ、ピルベート キナーゼ、ト
リオセホスフェート イソメラーゼ、ホスホグルコース
イソメラーゼおよびグルコキナーゼのためのプロモー
ターが含まれる。
は、３−ホスホグリセレートキナーゼ［ヒッツェマン等
（Hitzeman et al.,J.Biol.Chem.255:2073（1980））］
またはその他のグルコース分解酵素［ヘス等（Hess et
al.,J.Adv.Enzyme Reg.７:149（1968））；およびホー
ランド（Holland,Biochemistry17:4900（1978））］、
たとえばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフ
ェート デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルベー
ト デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グ
ルコース−６−ホスフェート イソメラーゼ、３−ホス
ホグリセレート ムターゼ、ピルベート キナーゼ、ト
リオセホスフェート イソメラーゼ、ホスホグルコース
イソメラーゼおよびグルコキナーゼのためのプロモー
ターが含まれる。
増殖条件によってコントロールされる転写の利点をさ
らに有している誘導可能なプロモーターであるその他の
酵母プロモーターは、アルコール デヒドロゲナーゼ
２、イソチトクロムＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝に
関連する分解酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデ
ヒド−３−ホスフェート デヒドロゲナーゼ、およびマ
ルトースおよびガラクトース利用に応答しうる酵素であ
る。酵母発現で用いるのに適しているベクターおよびプ
ロモーターはヒッツェマン等［Hitzeman et al.;欧州特
許公開No.73,657A］がさらに開示している。また、酵母
エンハンサーを酵母プロモーターとともに用いるのがよ
い。
らに有している誘導可能なプロモーターであるその他の
酵母プロモーターは、アルコール デヒドロゲナーゼ
２、イソチトクロムＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝に
関連する分解酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデ
ヒド−３−ホスフェート デヒドロゲナーゼ、およびマ
ルトースおよびガラクトース利用に応答しうる酵素であ
る。酵母発現で用いるのに適しているベクターおよびプ
ロモーターはヒッツェマン等［Hitzeman et al.;欧州特
許公開No.73,657A］がさらに開示している。また、酵母
エンハンサーを酵母プロモーターとともに用いるのがよ
い。
哺乳動物宿主細胞中のベクターからの転写をコントロ
ールする好ましいプロモーターは、種々の供給源、たと
えばウィルス［たとえば、ポリオーマ、サルウィルス40
（SV40）、アデノウィルス、レトロウィルス、肝炎−Ｂ
ウィルス、最も好ましくはサイトメガロウィルス］のゲ
ノムまたは異種哺乳動物のプロモーター（たとえば、β
アクチンプロモーター）から得ることができる。SV40ウ
ィルスの初期および後期プロモーターは、SV40ウィルス
の複製起源をも含有するSV40制限フラグメントとして都
合よく得られる［フィアーズ等（Fiers et al.,Nature,
273,113（1978））］。ヒトサイトメガロウィルスの即
時型プロモーターは、Hind III E制限フラグメントとし
て都合よく得られる［グリーンアウェイ等（Greenaway,
P.J.et al.,Gene,18,355−360（1982））］。もちろ
ん、宿主細胞あるいは関連の種からのプロモーターも本
発明に有用である。
ールする好ましいプロモーターは、種々の供給源、たと
えばウィルス［たとえば、ポリオーマ、サルウィルス40
（SV40）、アデノウィルス、レトロウィルス、肝炎−Ｂ
ウィルス、最も好ましくはサイトメガロウィルス］のゲ
ノムまたは異種哺乳動物のプロモーター（たとえば、β
アクチンプロモーター）から得ることができる。SV40ウ
ィルスの初期および後期プロモーターは、SV40ウィルス
の複製起源をも含有するSV40制限フラグメントとして都
合よく得られる［フィアーズ等（Fiers et al.,Nature,
273,113（1978））］。ヒトサイトメガロウィルスの即
時型プロモーターは、Hind III E制限フラグメントとし
て都合よく得られる［グリーンアウェイ等（Greenaway,
P.J.et al.,Gene,18,355−360（1982））］。もちろ
ん、宿主細胞あるいは関連の種からのプロモーターも本
発明に有用である。
高等真核生物による組織因子タンパク質をコードして
いるDNAの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿
入することによって増加する。エンハンサーは、シス作
用性のDNA要素であり、通常約10〜300bpであり、プロモ
ーターに作用してその転写開始能力を増加させる。この
エンハンサーは、比較的配向および位置に依存せず、転
写単位の５′［ライミンズ等（Laimins,L.et al.,PNAS,
78,993（1981））］および３′［ラスキー等（Lusky,M.
L.et al.,Mol.Cell Bio.,３,1108（1983））］、イント
ロン内［バネルジ等（Banerji,J.L.et al.,Cell,33,729
（1983））］、ならびにコード化配列それ自身内［オス
ボーン等（Osborne,T.F.et al.,Mol.Cell Bio.,４,1293
（1984））］に見い出されていた。現在では、哺乳動物
遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フ
ェトタンパク質およびインスリン）由来の多数のエンハ
ンサー配列が知られている。しかし、通常は真核生物細
胞ウィルスからのエンハンサーが用いられる。これらの
例には、複製起源の後期側のSV40エンハンサー（bp100
〜270）、サイトメガロウィルスの初期プロモーターエ
ンハンサー、複製起源の後期側のポリオーマエンハンサ
ー、およびアデノウィルスエンハンサーが含まれる。
いるDNAの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿
入することによって増加する。エンハンサーは、シス作
用性のDNA要素であり、通常約10〜300bpであり、プロモ
ーターに作用してその転写開始能力を増加させる。この
エンハンサーは、比較的配向および位置に依存せず、転
写単位の５′［ライミンズ等（Laimins,L.et al.,PNAS,
78,993（1981））］および３′［ラスキー等（Lusky,M.
L.et al.,Mol.Cell Bio.,３,1108（1983））］、イント
ロン内［バネルジ等（Banerji,J.L.et al.,Cell,33,729
（1983））］、ならびにコード化配列それ自身内［オス
ボーン等（Osborne,T.F.et al.,Mol.Cell Bio.,４,1293
（1984））］に見い出されていた。現在では、哺乳動物
遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フ
ェトタンパク質およびインスリン）由来の多数のエンハ
ンサー配列が知られている。しかし、通常は真核生物細
胞ウィルスからのエンハンサーが用いられる。これらの
例には、複製起源の後期側のSV40エンハンサー（bp100
〜270）、サイトメガロウィルスの初期プロモーターエ
ンハンサー、複製起源の後期側のポリオーマエンハンサ
ー、およびアデノウィルスエンハンサーが含まれる。
また、真核生物宿主細胞（酵母、菌類、昆虫、植物、
動物、ヒト、または有核細胞）中で用いられる発現ベク
ターは、転写の終止に必要な配列（mRNAの発現に影響す
ることもある）を含有しているであろう。これらの領域
は、組織因子タンパク質をコードしているmRNAの非翻訳
化部分中のポリアデニル化セグメントとして転写され
る。また、この３′非翻訳化領域は転写終止部位をも含
有している。
動物、ヒト、または有核細胞）中で用いられる発現ベク
ターは、転写の終止に必要な配列（mRNAの発現に影響す
ることもある）を含有しているであろう。これらの領域
は、組織因子タンパク質をコードしているmRNAの非翻訳
化部分中のポリアデニル化セグメントとして転写され
る。また、この３′非翻訳化領域は転写終止部位をも含
有している。
発現ベクターは、選択遺伝子（選択マーカーとも呼ば
れる）を含有していてもよい。哺乳動物細胞に適する選
択マーカーの例は、ジヒドロ葉酸還元酵素（DHFR）、チ
ミジンキナーゼまたはネオマイシンである。このような
選択マーカーを哺乳動物宿主細胞中にうまく転移させる
と、形質転換された哺乳動物宿主細胞は選択圧下に置か
れたときに生存することができる。広く用いられている
選択処方には、２つの別個のカテゴリーがある。第１の
カテゴリーのものは、細胞の代謝に基づくものであり、
追加培地とは無関係に成長する能力を欠いている突然変
異セルラインを使用するものである。例を２つ挙げる
と、これらはCHO DHFR-細胞およびマウスLTK-細胞であ
る。これらの細胞は、チミジンあるいはヒポキサンチン
などの栄養素の追加がないところで成長する能力を欠い
ている。これらの細胞は、完全なヌクレオチド合成経路
に必要なある種の遺伝子を欠いているので、失われたヌ
クレオチドが追加培地に与えられなければ生存すること
ができない。培地に追加を行うことの代わりは、無傷の
DHFRあるいはTK遺伝子を、それぞれの遺伝子を欠いてい
る細胞中に導入することであり、こうしてそれらの成長
要求を変えることである。DHFRあるいはTK遺伝子で形質
転換されていない個々の細胞は、追加が為されていない
培地中で生存することができないであろう。
れる）を含有していてもよい。哺乳動物細胞に適する選
択マーカーの例は、ジヒドロ葉酸還元酵素（DHFR）、チ
ミジンキナーゼまたはネオマイシンである。このような
選択マーカーを哺乳動物宿主細胞中にうまく転移させる
と、形質転換された哺乳動物宿主細胞は選択圧下に置か
れたときに生存することができる。広く用いられている
選択処方には、２つの別個のカテゴリーがある。第１の
カテゴリーのものは、細胞の代謝に基づくものであり、
追加培地とは無関係に成長する能力を欠いている突然変
異セルラインを使用するものである。例を２つ挙げる
と、これらはCHO DHFR-細胞およびマウスLTK-細胞であ
る。これらの細胞は、チミジンあるいはヒポキサンチン
などの栄養素の追加がないところで成長する能力を欠い
ている。これらの細胞は、完全なヌクレオチド合成経路
に必要なある種の遺伝子を欠いているので、失われたヌ
クレオチドが追加培地に与えられなければ生存すること
ができない。培地に追加を行うことの代わりは、無傷の
DHFRあるいはTK遺伝子を、それぞれの遺伝子を欠いてい
る細胞中に導入することであり、こうしてそれらの成長
要求を変えることである。DHFRあるいはTK遺伝子で形質
転換されていない個々の細胞は、追加が為されていない
培地中で生存することができないであろう。
第２のカテゴリーのものは、すべての細胞種で用いら
れる選択法である優性選択であり、突然変異セルライン
の使用を必要としない。この方法は通常薬物を用いて宿
主細胞の成長を抑制する。新規遺伝子を有するこれらの
細胞は、薬物耐性を伝達するタンパク質を発現し、選択
体を生存させるであろう。このような優性選択に用いら
れる薬物の例は、ネオマイシン［サザーンおよびベルグ
（Southern P.and Berg,P.,J.Molec.Appl.Genet.,１,32
7（1982））］、マイコフェノール酸［ムリガンおよび
ベルグ（Mulligan,R.C.Berg,P.,Science,209,1422（198
0））］またはハイグロマイシン［サジェン等（Sugden,
B.et al.,Mol.Cell.Biol.,５,410−413（1985））］で
ある。上に挙げた３つの例は、真核生物性コントロール
下の細菌性遺伝子を用いて、適当な薬物G418［ネオマイ
シンあるいはジェネチシン（geneticin）］、xgpt（マ
イコフェノール酸）またはハイグロマイシンへの耐性を
それぞれ伝達するものである。
れる選択法である優性選択であり、突然変異セルライン
の使用を必要としない。この方法は通常薬物を用いて宿
主細胞の成長を抑制する。新規遺伝子を有するこれらの
細胞は、薬物耐性を伝達するタンパク質を発現し、選択
体を生存させるであろう。このような優性選択に用いら
れる薬物の例は、ネオマイシン［サザーンおよびベルグ
（Southern P.and Berg,P.,J.Molec.Appl.Genet.,１,32
7（1982））］、マイコフェノール酸［ムリガンおよび
ベルグ（Mulligan,R.C.Berg,P.,Science,209,1422（198
0））］またはハイグロマイシン［サジェン等（Sugden,
B.et al.,Mol.Cell.Biol.,５,410−413（1985））］で
ある。上に挙げた３つの例は、真核生物性コントロール
下の細菌性遺伝子を用いて、適当な薬物G418［ネオマイ
シンあるいはジェネチシン（geneticin）］、xgpt（マ
イコフェノール酸）またはハイグロマイシンへの耐性を
それぞれ伝達するものである。
「増幅」とは、細胞の染色体DNA内のある隔離した領
域の増加または複製を指す。増幅は、選択剤［たとえ
ば、DHFRを不活性化するメトトレキセイト（MTX）］を
用いて行う。増幅、すなわちDHFR遺伝子の連続コピーの
生成により、MTX量が多くなればなるほどさらに大量のD
HFRが産生されることになる。さらに多量のMTXを培地に
加えることによって、内生DHFRが存在するにもかかわら
ず増幅圧がかけられる。同時組込みを可能にするDHFRま
たは増幅遺伝子、および所望のタンパク質をコードして
いるDNAを有するプラスミドで哺乳動物宿主細胞を同時
トランスフェクションすることによって、所望の遺伝子
の増幅を達成することができる。順次連続的に高くして
いったMTX濃度中で成長することができる細胞だけを選
択することによって、細胞がさらに多量DHFRを要求する
のを確実なものにする（この要求は選択遺伝子の複製に
よって満たされる）。所望の異種タンパク質をコードし
ている遺伝子が選択遺伝子と同時組込みする限り、この
遺伝子の複製によって所望のタンパク質をコードしてい
る遺伝子の複製が得られる。この結果、所望の異種タン
パク質をコードしている遺伝子のコピー数の増加、すな
わち遺伝子の増幅により、さらに多量の所望の異種タン
パク質が発現されることになる。
域の増加または複製を指す。増幅は、選択剤［たとえ
ば、DHFRを不活性化するメトトレキセイト（MTX）］を
用いて行う。増幅、すなわちDHFR遺伝子の連続コピーの
生成により、MTX量が多くなればなるほどさらに大量のD
HFRが産生されることになる。さらに多量のMTXを培地に
加えることによって、内生DHFRが存在するにもかかわら
ず増幅圧がかけられる。同時組込みを可能にするDHFRま
たは増幅遺伝子、および所望のタンパク質をコードして
いるDNAを有するプラスミドで哺乳動物宿主細胞を同時
トランスフェクションすることによって、所望の遺伝子
の増幅を達成することができる。順次連続的に高くして
いったMTX濃度中で成長することができる細胞だけを選
択することによって、細胞がさらに多量DHFRを要求する
のを確実なものにする（この要求は選択遺伝子の複製に
よって満たされる）。所望の異種タンパク質をコードし
ている遺伝子が選択遺伝子と同時組込みする限り、この
遺伝子の複製によって所望のタンパク質をコードしてい
る遺伝子の複製が得られる。この結果、所望の異種タン
パク質をコードしている遺伝子のコピー数の増加、すな
わち遺伝子の増幅により、さらに多量の所望の異種タン
パク質が発現されることになる。
組織因子タンパク質をコードしている本発明のベクタ
ーを高等真核生物中で発現させるのに適した宿主細胞に
は、SV40で形質転換したサル腎CVIセルライン（COS−
７、ATCC CRL1651）；ヒト胚腎セルライン［293、グラ
ハム等（Graham,F.L.et al.,J.Gen Virol.,36,59（197
7））］；ハムスター新生児腎細胞（BHK、ATCC CCL 1
0）；チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞−DHFR［ウル
ラウブおよびチャージン（Urlaub and Chasin,PNAS（US
A），77,4216（1980））］；マウス・セルトリー細胞
［TM4、マザー（Mather,J.P.,Biol.Reprod.,23,243−25
1（1980））］；サル腎細胞（CVI ATCC CCL 70）；アフ
リカミドリザル腎細胞（VERO−76、ATCC CRL−1587）；
ヒト頸管ガン細胞（HELA、ATCC CCL 2）；イヌ腎細胞
（MDCK、ATCC CCL 34）；バッファロー・ラット肝細胞
（BRL 3A、ATCC CRL 1442）；ヒト肺細胞（W138、ATCC
CCL 75）；ヒト肝細胞（Hep G2、HB8065）；マウス乳腫
瘍（MMT 060562、ATCC CCL 51）；ラット肝腫瘍細胞［H
TC、M1.54、バウマン等（Baumann,H.et al.,J.Cell Bio
l.,85,1−８（1980））］；およびTRI細胞［マザー等
（Mather,J.P.et al.,Annals N.Y.Acad.Sci.,383,44−6
8（1982）］が含まれる。
ーを高等真核生物中で発現させるのに適した宿主細胞に
は、SV40で形質転換したサル腎CVIセルライン（COS−
７、ATCC CRL1651）；ヒト胚腎セルライン［293、グラ
ハム等（Graham,F.L.et al.,J.Gen Virol.,36,59（197
7））］；ハムスター新生児腎細胞（BHK、ATCC CCL 1
0）；チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞−DHFR［ウル
ラウブおよびチャージン（Urlaub and Chasin,PNAS（US
A），77,4216（1980））］；マウス・セルトリー細胞
［TM4、マザー（Mather,J.P.,Biol.Reprod.,23,243−25
1（1980））］；サル腎細胞（CVI ATCC CCL 70）；アフ
リカミドリザル腎細胞（VERO−76、ATCC CRL−1587）；
ヒト頸管ガン細胞（HELA、ATCC CCL 2）；イヌ腎細胞
（MDCK、ATCC CCL 34）；バッファロー・ラット肝細胞
（BRL 3A、ATCC CRL 1442）；ヒト肺細胞（W138、ATCC
CCL 75）；ヒト肝細胞（Hep G2、HB8065）；マウス乳腫
瘍（MMT 060562、ATCC CCL 51）；ラット肝腫瘍細胞［H
TC、M1.54、バウマン等（Baumann,H.et al.,J.Cell Bio
l.,85,1−８（1980））］；およびTRI細胞［マザー等
（Mather,J.P.et al.,Annals N.Y.Acad.Sci.,383,44−6
8（1982）］が含まれる。
「形質転換」とは、染色体外成分として、または染色
体に組込むことによって、DNAの複製が可能なように生
物中にDNAを導入することを意味する。他に記載がなけ
れば、本明細書中で用いる、宿主細胞の形質転換法はグ
ラハムおよびイブ［Graham,F.and van der Eb,A.,Virol
ogy,52,456−457（1973）］の方法である。しかし、た
とえば核注入またはプロトプラスト融合によって細胞中
にDNAを導入するその他の方法も用いることができる。
実質的な細胞壁構造を含んでいる原核細胞または細胞群
を用いるときには、好ましいトランスフェクション法
は、コーエン等［Cohen,F.N.et al.,Proc.Natl.Acad.Sc
i.（USA），69:2110（1972）］が記載しているような塩
化カルシウムを用いるカルシウム処理である。
体に組込むことによって、DNAの複製が可能なように生
物中にDNAを導入することを意味する。他に記載がなけ
れば、本明細書中で用いる、宿主細胞の形質転換法はグ
ラハムおよびイブ［Graham,F.and van der Eb,A.,Virol
ogy,52,456−457（1973）］の方法である。しかし、た
とえば核注入またはプロトプラスト融合によって細胞中
にDNAを導入するその他の方法も用いることができる。
実質的な細胞壁構造を含んでいる原核細胞または細胞群
を用いるときには、好ましいトランスフェクション法
は、コーエン等［Cohen,F.N.et al.,Proc.Natl.Acad.Sc
i.（USA），69:2110（1972）］が記載しているような塩
化カルシウムを用いるカルシウム処理である。
所望のコード化およびコントロール配列を含んでいる
適当なベクターの構築には通常のライゲート法を用い
る。単離したプラスミドまたはDNAフラグメントを切断
し、加工し、そして所望のプラスミドを作成するのに望
ましい形態に再ライゲートする。
適当なベクターの構築には通常のライゲート法を用い
る。単離したプラスミドまたはDNAフラグメントを切断
し、加工し、そして所望のプラスミドを作成するのに望
ましい形態に再ライゲートする。
構築したプラスミド中の配列が正しいことを確認する
ための分析用に、ライゲート混合物を用いて大腸菌K12
株294（ATCC 31446）を形質転換し、適当なところで、
成功裏に形質転換したものをアンピシリンまたはテトラ
サイクリン耐性によって選択する。形質転換体からプラ
スミドを調製し、制限によって分析し、そして／または
メシング等［Messing et al.,Nucleic Acids Res.９:30
9（1981）］の方法あるいはマクサム等［Maxam et al.,
Methods in Enzymology65:499（1980）］の方法によっ
て配列決定する。
ための分析用に、ライゲート混合物を用いて大腸菌K12
株294（ATCC 31446）を形質転換し、適当なところで、
成功裏に形質転換したものをアンピシリンまたはテトラ
サイクリン耐性によって選択する。形質転換体からプラ
スミドを調製し、制限によって分析し、そして／または
メシング等［Messing et al.,Nucleic Acids Res.９:30
9（1981）］の方法あるいはマクサム等［Maxam et al.,
Methods in Enzymology65:499（1980）］の方法によっ
て配列決定する。
宿主細胞を、本発明の発現ベクターで形質転換し、プ
ロモーターの誘導、形質転換体の選択、または遺伝子の
増幅に適しているように修飾した通常の栄養培地で培養
することができる。pH、温度などの培養条件は、発現用
に選択した宿主細胞に以前から用いられていた条件であ
り、当分野では明白であろう。
ロモーターの誘導、形質転換体の選択、または遺伝子の
増幅に適しているように修飾した通常の栄養培地で培養
することができる。pH、温度などの培養条件は、発現用
に選択した宿主細胞に以前から用いられていた条件であ
り、当分野では明白であろう。
「トランスフェクション」とは、コード化配列が実際
に発現されようとされまいと、宿主細胞による発現ベク
ターの取り込みを指す。多数のトランスフェクション
法、たとえばCaPO4法およびエレクトロポレーション（e
lectroporation）法が当分野で知られている。成功裏の
トランスフェクションは、通常、このベクターの作用の
指標が宿主細胞内に現れたときに認定される。
に発現されようとされまいと、宿主細胞による発現ベク
ターの取り込みを指す。多数のトランスフェクション
法、たとえばCaPO4法およびエレクトロポレーション（e
lectroporation）法が当分野で知られている。成功裏の
トランスフェクションは、通常、このベクターの作用の
指標が宿主細胞内に現れたときに認定される。
後記実施例を簡略化するため、頻繁に出てくる方法お
よび／または語句のいくつかを以下に説明する。
よび／または語句のいくつかを以下に説明する。
「プラスミド」は、小文字ｐを前にし、そして／また
は大文字および／または数字をこれに続けて表す。本発
明で用いる出発プラスミドは、市販品あるいは制限され
ていない供給源から一般的に入手可能であるか、または
公表されている方法に従って利用可能なプラスミドから
構築することができる。さらに、本明細書中に記載した
プラスミドの等価物が当分野で知られているが、これら
は当業者には明白であろう。
は大文字および／または数字をこれに続けて表す。本発
明で用いる出発プラスミドは、市販品あるいは制限され
ていない供給源から一般的に入手可能であるか、または
公表されている方法に従って利用可能なプラスミドから
構築することができる。さらに、本明細書中に記載した
プラスミドの等価物が当分野で知られているが、これら
は当業者には明白であろう。
DNAの「消化」とは、DNA中のある配列にだけ作用する
制限酵素によってDNAを触媒的に切断することを指す。
本発明で用いる種々の制限酵素は市販品から入手可能で
あり、その反応条件、補助因子およびその他必要なもの
は、当分野で知られているものを用いた。分析用には、
通常、プラスミドまたはDNAフラグメント１μｇを、緩
衝溶液約20μ中、酵素約２単位とともに用いる。プラ
スミド構築用のDNAフラグメントを単離するためには、
通常、DNA5〜50μｇを、より大きな容量中、酵素20〜25
0単位で消化する。特定の制限酵素用の適切な緩衝液お
よび基質量は製造元によって指定されている。通常、イ
ンキュベート時間は37℃で約１時間を用いたが、これは
供給元の指示に従って変えてもよい。消化の後、反応物
を直接ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、所望の
フラグメントを単離する。
制限酵素によってDNAを触媒的に切断することを指す。
本発明で用いる種々の制限酵素は市販品から入手可能で
あり、その反応条件、補助因子およびその他必要なもの
は、当分野で知られているものを用いた。分析用には、
通常、プラスミドまたはDNAフラグメント１μｇを、緩
衝溶液約20μ中、酵素約２単位とともに用いる。プラ
スミド構築用のDNAフラグメントを単離するためには、
通常、DNA5〜50μｇを、より大きな容量中、酵素20〜25
0単位で消化する。特定の制限酵素用の適切な緩衝液お
よび基質量は製造元によって指定されている。通常、イ
ンキュベート時間は37℃で約１時間を用いたが、これは
供給元の指示に従って変えてもよい。消化の後、反応物
を直接ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、所望の
フラグメントを単離する。
あるDNAフラグメントの制限消化物からの「回収」ま
たは「単離」とは、消化物を電気泳動によってポリアク
リルアミドあるいはアガロースゲルで分離し、その移動
度を既知の分子量のマーカーDNAフラグメントのものと
比較することによって所望のフラグメントを同定し、所
望のフラグメントを含んでいるゲル部分を取り出し、そ
してDNAとゲルを分離することを意味する。この方法は
一般的に知られている「ロウン等（Lawn,R.et al.,Nucl
eic Acids Res.９:6103−6114（1981））、およびゲー
デル等（Goeddel,D.et al.,Nucleic Acids Res.８:4057
（1980））］。
たは「単離」とは、消化物を電気泳動によってポリアク
リルアミドあるいはアガロースゲルで分離し、その移動
度を既知の分子量のマーカーDNAフラグメントのものと
比較することによって所望のフラグメントを同定し、所
望のフラグメントを含んでいるゲル部分を取り出し、そ
してDNAとゲルを分離することを意味する。この方法は
一般的に知られている「ロウン等（Lawn,R.et al.,Nucl
eic Acids Res.９:6103−6114（1981））、およびゲー
デル等（Goeddel,D.et al.,Nucleic Acids Res.８:4057
（1980））］。
「脱ホスホリル化」とは、細菌性アルカリホスファタ
ーゼ（BAP）で処理することによって末端部の５′リン
酸を除去することを指す。この操作によって、制限切断
されたDNAフラグメントの末端２つが「環化」、すなわ
ち制限部位における別のDNAフラグメントの挿入を妨げ
る閉じた環を生成すること、が防止される。脱ホスホリ
ル化のための方法および試薬は通常のものである［マニ
アティス等（Maniatis,T.et al.,Molecular Cloning,13
3−134（1982））］。BAPを用いる反応を50mMトリス
中、68℃で行って、酵素調製物中に存在するであろうす
べてのエキソヌクレアーゼの活性を抑制する。反応は１
時間行う。反応後にDNAフラグメントをゲル精製する。
ーゼ（BAP）で処理することによって末端部の５′リン
酸を除去することを指す。この操作によって、制限切断
されたDNAフラグメントの末端２つが「環化」、すなわ
ち制限部位における別のDNAフラグメントの挿入を妨げ
る閉じた環を生成すること、が防止される。脱ホスホリ
ル化のための方法および試薬は通常のものである［マニ
アティス等（Maniatis,T.et al.,Molecular Cloning,13
3−134（1982））］。BAPを用いる反応を50mMトリス
中、68℃で行って、酵素調製物中に存在するであろうす
べてのエキソヌクレアーゼの活性を抑制する。反応は１
時間行う。反応後にDNAフラグメントをゲル精製する。
「ライゲート」とは、２つの２本鎖核酸フラグメント
の間でホスホジエステル結合が生成する過程をいう（マ
ニアティス等、上記、146頁）。他に記載がなければ、
既知の緩衝液および条件を用い、ほぼ等モル量のライゲ
ートしようとするDNAフラグメント0.5μｇあたりT4 DNA
リガーゼ（「リガーゼ」）10単位を用いてライゲートを
行う。
の間でホスホジエステル結合が生成する過程をいう（マ
ニアティス等、上記、146頁）。他に記載がなければ、
既知の緩衝液および条件を用い、ほぼ等モル量のライゲ
ートしようとするDNAフラグメント0.5μｇあたりT4 DNA
リガーゼ（「リガーゼ」）10単位を用いてライゲートを
行う。
「充填」または「平滑化」とは、制限酵素で切断され
た核酸の接着性末端にある１本鎖末端を２本鎖に変換す
る過程をいう。これによって接着性末端が除去され、平
滑末端が生成する。この過程は、１つだけあるいはいく
つかの他の制限酵素によって創製された末端と接着性で
ある制限切断末端を、平滑に切断するいずれかの制限エ
ンドヌクレアーゼによる末端、あるいはその他の充填さ
れた接着性末端と適合しうる末端に変換するための万能
の手段である。通常、標的DNA2〜15μｇを、10mM MgC
l2、1mMジチオトレイトール、50mM NaCl、10mMトリス
（pH7.5）緩衝液中、DNAポリメラーゼＩのクレノウフラ
グメント８単位および４つのデオキシヌクレオシド ト
リホスフェートそれぞれ250μＭの存在下、約37℃でイ
ンキュベートすることによって平滑化を行う。通常、こ
のインキュベートは30分後のフェノールおよびクロロホ
ルム抽出、ならびにエタノール沈澱で停止させる。
た核酸の接着性末端にある１本鎖末端を２本鎖に変換す
る過程をいう。これによって接着性末端が除去され、平
滑末端が生成する。この過程は、１つだけあるいはいく
つかの他の制限酵素によって創製された末端と接着性で
ある制限切断末端を、平滑に切断するいずれかの制限エ
ンドヌクレアーゼによる末端、あるいはその他の充填さ
れた接着性末端と適合しうる末端に変換するための万能
の手段である。通常、標的DNA2〜15μｇを、10mM MgC
l2、1mMジチオトレイトール、50mM NaCl、10mMトリス
（pH7.5）緩衝液中、DNAポリメラーゼＩのクレノウフラ
グメント８単位および４つのデオキシヌクレオシド ト
リホスフェートそれぞれ250μＭの存在下、約37℃でイ
ンキュベートすることによって平滑化を行う。通常、こ
のインキュベートは30分後のフェノールおよびクロロホ
ルム抽出、ならびにエタノール沈澱で停止させる。
ヒト組織因子タンパク質およびその組換え発現産物
は、以下のプロトコールに従って得られる： 1.組織因子タンパク質のアミノ末端部分に対応する各ア
ミノ酸に対する単一のコドン選択であるオリゴヌクレオ
チドプローブ、およびCNBrペプチドフラグメントを化学
的に合成した。
は、以下のプロトコールに従って得られる： 1.組織因子タンパク質のアミノ末端部分に対応する各ア
ミノ酸に対する単一のコドン選択であるオリゴヌクレオ
チドプローブ、およびCNBrペプチドフラグメントを化学
的に合成した。
2.以下の、組織因子タンパク質のアミノ酸配列のコドン
に相補性である２種類のデオキシオリゴヌクレオチドを
合成し、γ32P−ATPでラベルした： 3.オリゴ（dT）プライマー処理したcDNAライブラリーを
λgt10において作成した。
に相補性である２種類のデオキシオリゴヌクレオチドを
合成し、γ32P−ATPでラベルした： 3.オリゴ（dT）プライマー処理したcDNAライブラリーを
λgt10において作成した。
4.化学的に合成したオリゴヌクレオチドプローブを用い
てヒト胎盤cDNAライブラリーをスクリーニングした。60
merのプローブ（ａ）を用いると陽性のプラークは得ら
れなかった。81merのプローブ（ｂ）を用いると22個の
陽性プラークが得られ、その半分は極めて弱い陽性であ
った。11個のよいものを選び、プラーク精製物について
再スクリーニングした。この第２のスクリーニングによ
って５個の陽性プラークが得られた。これらのそれぞれ
からDNAを調製した。
てヒト胎盤cDNAライブラリーをスクリーニングした。60
merのプローブ（ａ）を用いると陽性のプラークは得ら
れなかった。81merのプローブ（ｂ）を用いると22個の
陽性プラークが得られ、その半分は極めて弱い陽性であ
った。11個のよいものを選び、プラーク精製物について
再スクリーニングした。この第２のスクリーニングによ
って５個の陽性プラークが得られた。これらのそれぞれ
からDNAを調製した。
5.約2800bpの挿入DNAの全cDNAを有しているクローンを
単離した。この胎盤クローンの配列決定を行ない、その
特徴を調べた。ノーザンブロットでのmRNAの大きさは約
2.35Kbであったので、これらのクローンは切除されてい
ないイントロンを含有しているのかもしれなかった。従
って、ヒト脂肪ライブラリーをスクリーニングした。
単離した。この胎盤クローンの配列決定を行ない、その
特徴を調べた。ノーザンブロットでのmRNAの大きさは約
2.35Kbであったので、これらのクローンは切除されてい
ないイントロンを含有しているのかもしれなかった。従
って、ヒト脂肪ライブラリーをスクリーニングした。
6.胎盤クローンの１つ由来の1400bp EcoR Iフラグメン
トを用いて、オリゴ（dT）プライマー処理したヒト脂肪
ライブラリーをスクリーニングした。
トを用いて、オリゴ（dT）プライマー処理したヒト脂肪
ライブラリーをスクリーニングした。
7.約2350bp（ポリＡ尾部の150〜200bpを含んでいる）お
よび1800bpの挿入DNAの全cDNAを有しているクローンを
単離した。2350bpを含有し、組織因子mRNAのすべてを含
有していると推定されるクローンを配列決定した。
よび1800bpの挿入DNAの全cDNAを有しているクローンを
単離した。2350bpを含有し、組織因子mRNAのすべてを含
有していると推定されるクローンを配列決定した。
8.ヒト組織因子タンパク質をコードしている完全な長さ
のcDNAをプラスミドに構築した。第２図の完全なDNA配
列の知見がヒト組織因子タンパク質cDNAに完全に相同な
極めて長いプローブを調製することを可能にし、これに
よってかなり他の種由来のゲノムライブラリーあるいは
プローブcDNAの効率を増加させ、単純化し、そして組織
因子タンパク質の精製、配列決定およびプローブのプー
ルの調製を不要なものにすることを理解すべきである。
のcDNAをプラスミドに構築した。第２図の完全なDNA配
列の知見がヒト組織因子タンパク質cDNAに完全に相同な
極めて長いプローブを調製することを可能にし、これに
よってかなり他の種由来のゲノムライブラリーあるいは
プローブcDNAの効率を増加させ、単純化し、そして組織
因子タンパク質の精製、配列決定およびプローブのプー
ルの調製を不要なものにすることを理解すべきである。
9.次いで、ヒト組織因子タンパク質をコードしているcD
NAを発現媒体に構築し、これを用いて適当な宿主細胞を
形質転換し、次いでこれを培養して増殖させて所望の組
織因子タンパク質を産生させる。
NAを発現媒体に構築し、これを用いて適当な宿主細胞を
形質転換し、次いでこれを培養して増殖させて所望の組
織因子タンパク質を産生させる。
10.上記の方法に従って製造した生物学的に活性な組織
因子タンパク質は263アミノ酸を有している。
因子タンパク質は263アミノ酸を有している。
以下に実施例を挙げて、現在本発明を実施しようとす
る際の最良の態様を説明するが、これらは単に例示のた
めだけに挙げたものであって、本発明を限定しようとす
るものではない。本明細書中で引用している文献はすべ
て参考のために入れたものである。
る際の最良の態様を説明するが、これらは単に例示のた
めだけに挙げたものであって、本発明を限定しようとす
るものではない。本明細書中で引用している文献はすべ
て参考のために入れたものである。
実施例１ cDNAのクローニング 組織因子タンパク質をコードしているDNAは、完全にD
NA配列が合っている場合には化学合成して得ることがで
き、また、様々な組織から得られるmRNAの逆転写物をス
クリーニングし、あるいはいずれかの細胞由来のゲノム
ライブラリーをスクリーニングすることによって得るこ
とができる。本発明の時点では、組織因子タンパク質の
完全なアミノ酸配列も、完全なDNA配列も知られていな
かったので、組織因子タンパク質をコードしている完全
なDNA配列の化学合成は不可能であった。
NA配列が合っている場合には化学合成して得ることがで
き、また、様々な組織から得られるmRNAの逆転写物をス
クリーニングし、あるいはいずれかの細胞由来のゲノム
ライブラリーをスクリーニングすることによって得るこ
とができる。本発明の時点では、組織因子タンパク質の
完全なアミノ酸配列も、完全なDNA配列も知られていな
かったので、組織因子タンパク質をコードしている完全
なDNA配列の化学合成は不可能であった。
ヒト胎盤のcDNAライブラリーを既述の如くにして調製
した［ウールリッヒら（Ullrich,A.）、ネイチャー（Na
ture）309:418〜425（1984）］。既知の方法で逆転写物
酵素を用い、大腸菌RNaseH処理の後、DNAポリメラーゼ
を用いて第２の鎖を合成し、次いで、Sal I、Sst I、Xh
o IおよびEcoR I突出末端のための制限部位を有する合
成オリゴヌクレオチドとライゲートすることにより、既
述の如くに二本鎖cDNAをヒト脂肪RNAから調製した［ガ
ブラー（Gubler,U.）およびホッフマン（Hoffman,B.
J.）、ジーン（Gene）25:263（1983）］。このDNAをλg
t10のEcoR I部位に挿入した［ヒュン（Huynth,T.）ら、
DNAクローニング法（グローバー（Grober,D.）編（198
4）］。
した［ウールリッヒら（Ullrich,A.）、ネイチャー（Na
ture）309:418〜425（1984）］。既知の方法で逆転写物
酵素を用い、大腸菌RNaseH処理の後、DNAポリメラーゼ
を用いて第２の鎖を合成し、次いで、Sal I、Sst I、Xh
o IおよびEcoR I突出末端のための制限部位を有する合
成オリゴヌクレオチドとライゲートすることにより、既
述の如くに二本鎖cDNAをヒト脂肪RNAから調製した［ガ
ブラー（Gubler,U.）およびホッフマン（Hoffman,B.
J.）、ジーン（Gene）25:263（1983）］。このDNAをλg
t10のEcoR I部位に挿入した［ヒュン（Huynth,T.）ら、
DNAクローニング法（グローバー（Grober,D.）編（198
4）］。
Ｎ末端アミノ酸配列（60ヌクレオチド）およびＣ末端
付近の内部のアミノ酸配列（81ヌクレオチド）の各アミ
ノ酸について選択し得るコドンによって表わされる２個
のオリゴヌクレオチドプローブを、前記のアメリカ心臓
学会（American Heart Association）の会合で提示され
たアミノ酸配列に従って考案し、合成した。
付近の内部のアミノ酸配列（81ヌクレオチド）の各アミ
ノ酸について選択し得るコドンによって表わされる２個
のオリゴヌクレオチドプローブを、前記のアメリカ心臓
学会（American Heart Association）の会合で提示され
たアミノ酸配列に従って考案し、合成した。
ヒト組織因子タンパク質のcDNAクローンは、まず、DN
Aプローブを用いてヒト胎盤cDNAライブラリーをスクリ
ーニングすることにより、得られた。胎盤クローン由来
の1400bpEcoR Iフラグメントを用いてヒト脂肪cDNAライ
ブラリーをスクリーニングした。
Aプローブを用いてヒト胎盤cDNAライブラリーをスクリ
ーニングすることにより、得られた。胎盤クローン由来
の1400bpEcoR Iフラグメントを用いてヒト脂肪cDNAライ
ブラリーをスクリーニングした。
λgt10中のオリゴ（dT）でプライムされたヒト胎盤cD
NAライブラリーから得た約100万のファージを25個の15c
mのペトリ皿で増殖させ、それから、トリプリケート
（三重複製）ニトロセルロースフィルターを得た。この
フィルターを、0.75M NaCl、75mMクエン酸ナトリウム、
50mMリン酸ナトリウム（pH6.8）、5Xデンハーツ（Denha
rdt's）溶液、20％ホルムアミド、10％硫酸デキストラ
ン、および0.2g/の煮沸、音波処理した鮭精子DNAの混
合物中、42℃で一夜、32P−末端標識オリゴヌクレオチ
ドプローブの各々とハイブリダイズさせ、0.30M NaCl、
30mMクエン酸ナトリウム、0.1％NaDodSO4中、42℃で２
時間洗浄した。Ｃ末端付近の組織因子タンパク質のプロ
ーブとハイブリダイズしたフィルターに、22のハイブリ
ダイズする陽性の複製が認められた。プラークの精製の
ために最良の11を選択した。組織因子タンパク質のアミ
ノ末端プローブはハイブリダイズしかなかった。プラー
ク精製において５個のクローンが陽性であった。これら
各々からDNAを調製した後、EcoR I消化によって分析し
た。１個のクローンは他より短く、クローンの一部分と
思われた。EcoR I消化に基づいて同一である４つのクロ
ーンは完全長さのcDNAクローンの最も良い候補者であっ
た。ジデオキシ鎖末端決定法［メッシングら（Messing,
J.）、ニュークレイック・アシッズ・リサーチ（Nuclei
c Acids Res.）９:309〜321（1981）］によるDNA配列決
定のために３つのクローンから得たEcoR Iフラグメン
ト、部分的なクローンおよび完全長さのクローンと推測
される２個のクローンをM13ファージベクターにサブク
ーロンした。
NAライブラリーから得た約100万のファージを25個の15c
mのペトリ皿で増殖させ、それから、トリプリケート
（三重複製）ニトロセルロースフィルターを得た。この
フィルターを、0.75M NaCl、75mMクエン酸ナトリウム、
50mMリン酸ナトリウム（pH6.8）、5Xデンハーツ（Denha
rdt's）溶液、20％ホルムアミド、10％硫酸デキストラ
ン、および0.2g/の煮沸、音波処理した鮭精子DNAの混
合物中、42℃で一夜、32P−末端標識オリゴヌクレオチ
ドプローブの各々とハイブリダイズさせ、0.30M NaCl、
30mMクエン酸ナトリウム、0.1％NaDodSO4中、42℃で２
時間洗浄した。Ｃ末端付近の組織因子タンパク質のプロ
ーブとハイブリダイズしたフィルターに、22のハイブリ
ダイズする陽性の複製が認められた。プラークの精製の
ために最良の11を選択した。組織因子タンパク質のアミ
ノ末端プローブはハイブリダイズしかなかった。プラー
ク精製において５個のクローンが陽性であった。これら
各々からDNAを調製した後、EcoR I消化によって分析し
た。１個のクローンは他より短く、クローンの一部分と
思われた。EcoR I消化に基づいて同一である４つのクロ
ーンは完全長さのcDNAクローンの最も良い候補者であっ
た。ジデオキシ鎖末端決定法［メッシングら（Messing,
J.）、ニュークレイック・アシッズ・リサーチ（Nuclei
c Acids Res.）９:309〜321（1981）］によるDNA配列決
定のために３つのクローンから得たEcoR Iフラグメン
ト、部分的なクローンおよび完全長さのクローンと推測
される２個のクローンをM13ファージベクターにサブク
ーロンした。
胎盤cDNAクローンから得た1400bpのEcoR Iフラグメン
トをノザンブロットとハイブリダイズ（ハイブリッド形
成）させ、それにmRNAを結合させた。試験結果が陽性で
あった胎盤試料中で、組織因子タンパク質のmRNAのサイ
ズは約2.35kbであると決定された。胎盤cDNAクローンの
大きさは、mRNAのポリＡティルに対応するヌクレオチド
をも含めてほぼ2800bpであった。これらのクローンは、
ノザンブロット上のmRNAに関する観測値より、約450bp
長かった。これら３つの全てのリーディングフレーム内
の終止コドンおよびメチオニンコドンはタンパク質のア
ミノ末端をコードしているDNAのすぐ上流に認められ、
このことは、シグナル配列の不在を示唆するものといえ
る。胎盤クローン中の、成熟タンパク質のNH2末端を表
わす配列の５′側にシグナル配列が存在しないことを、
下記の脂肪クローンとの比較によって確認した。また、
胎盤性配列と脂肪性配列の比較により、胎盤配列が、脂
肪クローンには含有されていない介在配列またはイント
ロンを含有していることをも確認した。胎盤クローン内
にイントロンが存在していることは、胎盤でのスプライ
シング機構の貧弱さが、プレー組織因子タンパク質DNA
の単離およびクローニング作業を極めて困難にしてい
る。ということを示唆するものである。
トをノザンブロットとハイブリダイズ（ハイブリッド形
成）させ、それにmRNAを結合させた。試験結果が陽性で
あった胎盤試料中で、組織因子タンパク質のmRNAのサイ
ズは約2.35kbであると決定された。胎盤cDNAクローンの
大きさは、mRNAのポリＡティルに対応するヌクレオチド
をも含めてほぼ2800bpであった。これらのクローンは、
ノザンブロット上のmRNAに関する観測値より、約450bp
長かった。これら３つの全てのリーディングフレーム内
の終止コドンおよびメチオニンコドンはタンパク質のア
ミノ末端をコードしているDNAのすぐ上流に認められ、
このことは、シグナル配列の不在を示唆するものといえ
る。胎盤クローン中の、成熟タンパク質のNH2末端を表
わす配列の５′側にシグナル配列が存在しないことを、
下記の脂肪クローンとの比較によって確認した。また、
胎盤性配列と脂肪性配列の比較により、胎盤配列が、脂
肪クローンには含有されていない介在配列またはイント
ロンを含有していることをも確認した。胎盤クローン内
にイントロンが存在していることは、胎盤でのスプライ
シング機構の貧弱さが、プレー組織因子タンパク質DNA
の単離およびクローニング作業を極めて困難にしてい
る。ということを示唆するものである。
単離した胎盤クローニングとノザンブロッティング法
で決定したmRNAの長さが一致しないことから、脂肪ライ
ブラリーからも組織因子タンパク質cDNAを単離した。脂
肪組織には、胎盤組織と匹敵し得る量のmRNAが存在する
ので、λgt10内で組立てられた脂肪cDNAライブラリーを
選択した。このライブラリーを、γ32−Ｐ−ATPで放射
性にラベルした、胎盤クローニングのEcoR Iフラグメン
トを用い、胎盤ライブラリーのスクリーニングにおける
よりも厳重な条件下でスクリーニングした（上記の条件
を、ハイブリダイゼーションに50％ホルムアミドを用
い、洗浄を0.03M NaCl、3mMクエン酸ナトリウム、0.1％
NaDodSO4中、60℃で行うことにより、修飾した）。種々
の強度の二重陽性体が14個得られた。プラーク精製のた
めに12個を選択した。プラーク精製のために再度スクリ
ーニングすることにより、８個の強力な二重陽性体を得
た。これら陽性体各々からDNAを調製した。EcoR I消化
において同一であったその内の４個が、完全な長さのcD
NAクローンのための最良の候補であった。その内の１つ
をDNA配列決定のために選択し、λTF14で標識した。こ
れらのクローンの大きさは、ポリＡティルの長さを含め
て約2350bpであった。これは、上記の如くノザンブロッ
トで観察されたサイズと同じであった。第５番目のクロ
ーンは上記の2350bpクローンよりも短かった。
で決定したmRNAの長さが一致しないことから、脂肪ライ
ブラリーからも組織因子タンパク質cDNAを単離した。脂
肪組織には、胎盤組織と匹敵し得る量のmRNAが存在する
ので、λgt10内で組立てられた脂肪cDNAライブラリーを
選択した。このライブラリーを、γ32−Ｐ−ATPで放射
性にラベルした、胎盤クローニングのEcoR Iフラグメン
トを用い、胎盤ライブラリーのスクリーニングにおける
よりも厳重な条件下でスクリーニングした（上記の条件
を、ハイブリダイゼーションに50％ホルムアミドを用
い、洗浄を0.03M NaCl、3mMクエン酸ナトリウム、0.1％
NaDodSO4中、60℃で行うことにより、修飾した）。種々
の強度の二重陽性体が14個得られた。プラーク精製のた
めに12個を選択した。プラーク精製のために再度スクリ
ーニングすることにより、８個の強力な二重陽性体を得
た。これら陽性体各々からDNAを調製した。EcoR I消化
において同一であったその内の４個が、完全な長さのcD
NAクローンのための最良の候補であった。その内の１つ
をDNA配列決定のために選択し、λTF14で標識した。こ
れらのクローンの大きさは、ポリＡティルの長さを含め
て約2350bpであった。これは、上記の如くノザンブロッ
トで観察されたサイズと同じであった。第５番目のクロ
ーンは上記の2350bpクローンよりも短かった。
脂肪cDNAクローンの内、２個は完全な長さのmRNA（約
1800bp）よりも短く、推定の完全長さのクローンとは明
らかに異なるEcoR I消化パターンを有していた。これら
のクローンを分析することにより、それらは、組織因子
タンパク質のmRNAの一部分に対応するDNAを含んだ部分
的なクローンであることが示された。第８番目のクロー
ンは約850bpにすぎず、これは以後の分析のために選択
されなかった。
1800bp）よりも短く、推定の完全長さのクローンとは明
らかに異なるEcoR I消化パターンを有していた。これら
のクローンを分析することにより、それらは、組織因子
タンパク質のmRNAの一部分に対応するDNAを含んだ部分
的なクローンであることが示された。第８番目のクロー
ンは約850bpにすぎず、これは以後の分析のために選択
されなかった。
実施例２ 組織因子タンパク質のDNA配列 組織因子タンパク質cDNAのヌクレオチド配列を第２図
に示す。EcoR I消化パターンが同一である４つの脂肪ク
ローンの内、１つについて完全な配列決定を行い、それ
が第２図の配列に相当する。クローンλTF14は約2217bp
の挿入体を含有しており、それは、ポリ（Ａ）ティルの
約90ヌクレオチドをも含んでいる（第２図には記載され
ていない）。cDNA配列は99bpの５′非翻訳配列を含んで
いる。推定の完全長さのクローンのEcoR I消化パターン
には、約900、750および650bpの３フラグメントが含ま
れていた。第５クローンのEcoR I消化パターンは、５′
末端のフラグメントにおいて相違するようであった。脂
肪クローンの内の２つのEcoR I消化パターンは、それが
完全な長さのクローンよりも短かいが、該完全長さのク
ローン中のどのフラグメントよりも長いEcoR Iフラグメ
ントを含有していることを示唆していた。これはEcoR I
の多形性、またはイントロンの存在によるのかもしれな
い。完全を期して、最長クローンの配列決定を行った。
暗号配列の完璧さは、開始コドンATGから始まる長いオ
ープンリーディングフレームの存在により評価した。AT
G開始コドンに続いて、疎水性のリーダー配列またはシ
グナル配列のコドンが存在する。
に示す。EcoR I消化パターンが同一である４つの脂肪ク
ローンの内、１つについて完全な配列決定を行い、それ
が第２図の配列に相当する。クローンλTF14は約2217bp
の挿入体を含有しており、それは、ポリ（Ａ）ティルの
約90ヌクレオチドをも含んでいる（第２図には記載され
ていない）。cDNA配列は99bpの５′非翻訳配列を含んで
いる。推定の完全長さのクローンのEcoR I消化パターン
には、約900、750および650bpの３フラグメントが含ま
れていた。第５クローンのEcoR I消化パターンは、５′
末端のフラグメントにおいて相違するようであった。脂
肪クローンの内の２つのEcoR I消化パターンは、それが
完全な長さのクローンよりも短かいが、該完全長さのク
ローン中のどのフラグメントよりも長いEcoR Iフラグメ
ントを含有していることを示唆していた。これはEcoR I
の多形性、またはイントロンの存在によるのかもしれな
い。完全を期して、最長クローンの配列決定を行った。
暗号配列の完璧さは、開始コドンATGから始まる長いオ
ープンリーディングフレームの存在により評価した。AT
G開始コドンに続いて、疎水性のリーダー配列またはシ
グナル配列のコドンが存在する。
cDNAの５′末端には、アミノ酸メチニオンをコードす
るATG開始コドンが存在し、次いで、295アミノ酸のポリ
ペプチドをコードする連続的なオープンリーディングフ
レームが存在する。最初の32アミノ酸残基は最も疎水性
の高いアミノ酸であり、おそらく、アミノ末端のシグナ
ルペプチドを表わしているのであろう。続くアミノ末端
配列は、組織から精製された組織因子タンパク質の該配
列と対応している。cDNA配列から、成熟組織因子タンパ
ク質は263アミノ酸を含有しており、分子量の計算値は
約29,500と予測される。組織因子タンパク質は、SDSポ
リアクリルアミドゲルに基づき、相対分子量42,000〜5
3,000の膜糖タンパクであることが分かっている。翻訳
されたDNA配列から、４個（４）のアスパラギンと結合
したグリコシル化部位があることが予測される。タンパ
ク質のヒドロパシー像（第５図）から、これらの部位の
内、最初の３つは親水性領域に位置しており、それらが
タンパク質表面に露出し、実際にグリコシル化されてい
る可能性はより大きいと思われる。同様に、セリンまた
はスレオニンである13残基（アミノ酸160〜172）の内７
残基のクラスターは、Ｏ−結合グリコシル化部位である
可能性が示されており、予測し得る親水性領域の１つで
ある。ハイドロパシー像から、カルボキシ末端付近に疎
水性の衝撃的なクラスターが存在することが分かった
（第５図）。アミノ酸220〜243にわたるこの領域はおそ
らく組織因子の膜固定（アンカー）領域を含んでいると
思われる。配列のデーターベースの検索によって、組織
因子と、入手可能なタンパク配列との有意なホモロジー
は明らかにされなかった。注目される点は、凝固プロテ
アーゼ因子IXのコフアクタータンパク質である因子VIII
とのホモロジーが目立つほどでなかったことである。こ
のことは、因子VIIIと因子IX、並びに組織因子と因子VI
I、の両コンプレックスがいずれも因子Ｘの活性化を触
媒すること、および各コンプレックスのプロテアーゼ
（因子IXおよび因子VII）が高度にホモローガスである
［ハゲンら（F.S.Hagen）、プロシーディングス・オブ
・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンスUSA
83:2412（1986）］およびヨシタケら（S.Yoshitak
e）、バイオケミストリー24:3736（1985）］ことから、
予想外である。現在では、これらの相互作用が２個のコ
フアクターの一次タンパク質配列の類似性を反映してい
るものでないことが分かる。
るATG開始コドンが存在し、次いで、295アミノ酸のポリ
ペプチドをコードする連続的なオープンリーディングフ
レームが存在する。最初の32アミノ酸残基は最も疎水性
の高いアミノ酸であり、おそらく、アミノ末端のシグナ
ルペプチドを表わしているのであろう。続くアミノ末端
配列は、組織から精製された組織因子タンパク質の該配
列と対応している。cDNA配列から、成熟組織因子タンパ
ク質は263アミノ酸を含有しており、分子量の計算値は
約29,500と予測される。組織因子タンパク質は、SDSポ
リアクリルアミドゲルに基づき、相対分子量42,000〜5
3,000の膜糖タンパクであることが分かっている。翻訳
されたDNA配列から、４個（４）のアスパラギンと結合
したグリコシル化部位があることが予測される。タンパ
ク質のヒドロパシー像（第５図）から、これらの部位の
内、最初の３つは親水性領域に位置しており、それらが
タンパク質表面に露出し、実際にグリコシル化されてい
る可能性はより大きいと思われる。同様に、セリンまた
はスレオニンである13残基（アミノ酸160〜172）の内７
残基のクラスターは、Ｏ−結合グリコシル化部位である
可能性が示されており、予測し得る親水性領域の１つで
ある。ハイドロパシー像から、カルボキシ末端付近に疎
水性の衝撃的なクラスターが存在することが分かった
（第５図）。アミノ酸220〜243にわたるこの領域はおそ
らく組織因子の膜固定（アンカー）領域を含んでいると
思われる。配列のデーターベースの検索によって、組織
因子と、入手可能なタンパク配列との有意なホモロジー
は明らかにされなかった。注目される点は、凝固プロテ
アーゼ因子IXのコフアクタータンパク質である因子VIII
とのホモロジーが目立つほどでなかったことである。こ
のことは、因子VIIIと因子IX、並びに組織因子と因子VI
I、の両コンプレックスがいずれも因子Ｘの活性化を触
媒すること、および各コンプレックスのプロテアーゼ
（因子IXおよび因子VII）が高度にホモローガスである
［ハゲンら（F.S.Hagen）、プロシーディングス・オブ
・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンスUSA
83:2412（1986）］およびヨシタケら（S.Yoshitak
e）、バイオケミストリー24:3736（1985）］ことから、
予想外である。現在では、これらの相互作用が２個のコ
フアクターの一次タンパク質配列の類似性を反映してい
るものでないことが分かる。
cDNA配列は、成熟組織因子が、余分のプロペプチドの
プロセッシングなしに、プレペプチドのシグナルペプチ
ダーゼによる開裂によって放出されることを示してい
る。最初のメチオニンから成熟アミノ末端までの32アミ
ノ酸は電荷を帯びた領域で始まり、14残基からなる疎水
性の「コア（芯）」配列が後続している。プレペプチド
はala−gly−alaで終わっているが、シグナルペペプチ
ダーゼ開裂部位に先行する配列として最も頻繁にみられ
るはala−Ｘ−alaである［パールマンら（O.Parlma
n）、モレキュラー・バイオロジー167:391（1983）］。
プロセッシングなしに、プレペプチドのシグナルペプチ
ダーゼによる開裂によって放出されることを示してい
る。最初のメチオニンから成熟アミノ末端までの32アミ
ノ酸は電荷を帯びた領域で始まり、14残基からなる疎水
性の「コア（芯）」配列が後続している。プレペプチド
はala−gly−alaで終わっているが、シグナルペペプチ
ダーゼ開裂部位に先行する配列として最も頻繁にみられ
るはala−Ｘ−alaである［パールマンら（O.Parlma
n）、モレキュラー・バイオロジー167:391（1983）］。
ヌクレオチド100〜102のメチオニンコドン（第２図）
は、プレ−組織因子タンパク質の翻訳開始部位と推測さ
れる。このATGに先行する５ヌクレオチドおよびその後
方の１ヌクレオチドは、コダック［Kozak,M.、ヌクレイ
ック・アシッズ・リサーチ、12:857（1984）］らが記載
した一致した意見と、完全に同一ではないが、真核性mR
NAの翻訳開始部位周辺のヌクレオチドに共通した選択に
よっている。特性化されたcDNAクローンは、事実上、メ
ッセッージの全５′非翻訳領域を含有しているように思
われる。
は、プレ−組織因子タンパク質の翻訳開始部位と推測さ
れる。このATGに先行する５ヌクレオチドおよびその後
方の１ヌクレオチドは、コダック［Kozak,M.、ヌクレイ
ック・アシッズ・リサーチ、12:857（1984）］らが記載
した一致した意見と、完全に同一ではないが、真核性mR
NAの翻訳開始部位周辺のヌクレオチドに共通した選択に
よっている。特性化されたcDNAクローンは、事実上、メ
ッセッージの全５′非翻訳領域を含有しているように思
われる。
cDNAは1139ヌクレオチドからなる非翻訳領域を含有し
ており、そこでは、ポリ（Ａ）ティルの23ヌクレオチド
前方に通常のポリアデニル化シグナルAATAAAが位置して
いる。非翻訳領域の注目される特徴は、300bpのAluにと
んだ、反復配列が存在している点である。ヒトゲノムに
は約300,000コピーのAlu反復があり、その様な反復が遺
伝子のイントロンに存在するという例は多数みられる、
それらはmRNAの成熟過程でスプライシングの結果除去さ
れる［シミットら（C.W.Schmid）、サイエンス（Scienc
e）216:1065（1982）およびシャープ（P.A.Sharp）、ネ
イチャー、301:471（1983）］。細胞質のポリ（Ａ）+mR
NAもAlu配列を含んでいるが、mRNAの３′非翻訳領域にA
lu様配列が存在するという特別の報告はこれまで２件し
かない。即ち、マウスおよびラットのクラス１組織適合
抗原、並びにヒトの低密度リポタンパク質リセプター内
である［フッドら（L.Hood）、Ann.Rev.Immunol.１:529
（1983）、マジェロら（B.Majello）、ネイチャー314:4
57（1985）およびヤマモトら（T.Yamamoto）セル39:27
（1984）］。Alu配列は、ゲノムの付着化二本鎖ニツク
に挿入されたと結果であるかのように、短い直接的な反
復とその側面を接している。組織因子cDNAの３′領域の
Alu配列は、第２図で矢印によって示されているよう
に、11ヌクレオチドからなる直接的な反復と側面を接し
ている。
ており、そこでは、ポリ（Ａ）ティルの23ヌクレオチド
前方に通常のポリアデニル化シグナルAATAAAが位置して
いる。非翻訳領域の注目される特徴は、300bpのAluにと
んだ、反復配列が存在している点である。ヒトゲノムに
は約300,000コピーのAlu反復があり、その様な反復が遺
伝子のイントロンに存在するという例は多数みられる、
それらはmRNAの成熟過程でスプライシングの結果除去さ
れる［シミットら（C.W.Schmid）、サイエンス（Scienc
e）216:1065（1982）およびシャープ（P.A.Sharp）、ネ
イチャー、301:471（1983）］。細胞質のポリ（Ａ）+mR
NAもAlu配列を含んでいるが、mRNAの３′非翻訳領域にA
lu様配列が存在するという特別の報告はこれまで２件し
かない。即ち、マウスおよびラットのクラス１組織適合
抗原、並びにヒトの低密度リポタンパク質リセプター内
である［フッドら（L.Hood）、Ann.Rev.Immunol.１:529
（1983）、マジェロら（B.Majello）、ネイチャー314:4
57（1985）およびヤマモトら（T.Yamamoto）セル39:27
（1984）］。Alu配列は、ゲノムの付着化二本鎖ニツク
に挿入されたと結果であるかのように、短い直接的な反
復とその側面を接している。組織因子cDNAの３′領域の
Alu配列は、第２図で矢印によって示されているよう
に、11ヌクレオチドからなる直接的な反復と側面を接し
ている。
実施例３ ヒト組織因子タンパク質の真核性宿主での発
現 完全な長さのヒト組織因子タンパク質cDNAはcDNAクロ
ーンλTF14内に含有されていた。この完全長さのcDNA
を、サイトメガロウィルスのエンハンサーおよびプロモ
ーター、サイトメガロウィルスのスプライス供与部位お
よびイントロン、Igの可変領域イントロンおよびスプラ
イス受容部位、SV40のポリアデニル化および転写終止部
位を含有する発現プラスミドに挿入した。発現ベクター
の組立ては、第４図に示されており、下記の如くに行わ
れた。
現 完全な長さのヒト組織因子タンパク質cDNAはcDNAクロ
ーンλTF14内に含有されていた。この完全長さのcDNA
を、サイトメガロウィルスのエンハンサーおよびプロモ
ーター、サイトメガロウィルスのスプライス供与部位お
よびイントロン、Igの可変領域イントロンおよびスプラ
イス受容部位、SV40のポリアデニル化および転写終止部
位を含有する発現プラスミドに挿入した。発現ベクター
の組立ては、第４図に示されており、下記の如くに行わ
れた。
この基本的なベクターpCIS2.8c26Dは、欧州特許出願N
o.87308060.0（米国特許出願No.07/071,674、1987年７
月９日出願、および06/907,185、1986年９月12日出願）
に記載されている。
o.87308060.0（米国特許出願No.07/071,674、1987年７
月９日出願、および06/907,185、1986年９月12日出願）
に記載されている。
第4a図に示されているように、pF8CISにおいて、Cla
I部位に先行する１つのヌクレオチドがグアノシンから
チミジンに変換され、その結果、大腸菌dam-株はCla I
部位を切断することを必要とされないことになる。
I部位に先行する１つのヌクレオチドがグアノシンから
チミジンに変換され、その結果、大腸菌dam-株はCla I
部位を切断することを必要とされないことになる。
以下のフラグメントからなる成分ライゲーションを行
った。ａ）pF8CISの12617bp Cla I−Sat IIフラグメン
ト（dam-株から単離し、BAP処理したもの）、ｂ）pF8CI
Sの216bp Sst II−Pst Iフラグメント、およびｃ）キナ
ーゼ処理された短いPst I−Cla I合成オリゴヌクレオチ
ド（第4a図参照、図中、変換されたヌクレオチドを星印
で示した）。この３成分ライゲーションによって、組織
因子の発現に用いられる部分がpCIS2.8c26DおよびpCIS
2.8c28Dと同じである発現ベクターpCIS2.8c24Dが生成さ
れた。
った。ａ）pF8CISの12617bp Cla I−Sat IIフラグメン
ト（dam-株から単離し、BAP処理したもの）、ｂ）pF8CI
Sの216bp Sst II−Pst Iフラグメント、およびｃ）キナ
ーゼ処理された短いPst I−Cla I合成オリゴヌクレオチ
ド（第4a図参照、図中、変換されたヌクレオチドを星印
で示した）。この３成分ライゲーションによって、組織
因子の発現に用いられる部分がpCIS2.8c26DおよびpCIS
2.8c28Dと同じである発現ベクターpCIS2.8c24Dが生成さ
れた。
次いで、このベクターをCla I−Hpa I消化に付して修
飾し、因子VIIIをコードしている領域を除いた。この領
域にポリリンカーを置換挿入し、付加的なクローニング
部位を与えた。用いたポリリンカーの配列を以下に示
す。
飾し、因子VIIIをコードしている領域を除いた。この領
域にポリリンカーを置換挿入し、付加的なクローニング
部位を与えた。用いたポリリンカーの配列を以下に示
す。
元のベクターのCla I部位とHpa I部位が復活し、酵素
Xba I、Xho I、およびNot Iのための部位が付加され
た。このベクターをpCIS2.CXXNHと命名した。λベクタ
ーおよびcDNAの５′ジャンクション（連結部）に存在す
るSal I部位並びにcDNAの非暗号部分にある、暗号領域
の３′に位置するNco I部分を用いて組織因子の暗号領
域をλTF14からサブクローニングした。まず、Nco Iで
消化した後、クレノウフラグメントDNAポリメラーゼと
４種のdNTPの存在下で充填（fill−in）反応を行うこと
により、３′平滑末端を作製した。次いでλTF14をSal
Iで消化すると、５′末端にTCGA突出と３′平滑末端を
有し、組織因子暗号領域を含有する約1232bpのフラグメ
ントが得られた。このフラグメントを、Xho I（TCGA突
出を与える）およびHpa I（平滑末端を与える）で消化
しておいたpCIS2.CXXNHベクターにライゲートさせた。
新しいベクターを、pCIS.TFと表わすか、あるいは、pCI
STF1と称する。
Xba I、Xho I、およびNot Iのための部位が付加され
た。このベクターをpCIS2.CXXNHと命名した。λベクタ
ーおよびcDNAの５′ジャンクション（連結部）に存在す
るSal I部位並びにcDNAの非暗号部分にある、暗号領域
の３′に位置するNco I部分を用いて組織因子の暗号領
域をλTF14からサブクローニングした。まず、Nco Iで
消化した後、クレノウフラグメントDNAポリメラーゼと
４種のdNTPの存在下で充填（fill−in）反応を行うこと
により、３′平滑末端を作製した。次いでλTF14をSal
Iで消化すると、５′末端にTCGA突出と３′平滑末端を
有し、組織因子暗号領域を含有する約1232bpのフラグメ
ントが得られた。このフラグメントを、Xho I（TCGA突
出を与える）およびHpa I（平滑末端を与える）で消化
しておいたpCIS2.CXXNHベクターにライゲートさせた。
新しいベクターを、pCIS.TFと表わすか、あるいは、pCI
STF1と称する。
組織因子タンパク質を含有する発現ベクターpCIS.TF
で、ヒト胎児腎細胞（293細胞）およびサル腎細胞（Cos
細胞）をトランスフェクトした。トランスフェクション
の48時間後に細胞を収穫し、後述の色素検定法で組織因
子タンパク質活性を調べた。細胞を、0.15M NaClを含有
する0.01Mリン酸ナトリウムバッファー、pH7.0（1ml）
に懸濁することにより100mmプレートから除いた。プレ
ート上の様々な細胞密度を調節するために、550nmにお
ける吸収を0.750に調整した。細胞を１分間音波処理し
た後、終濃度が0.1％になるようにTriton X−100を加え
た。試料を室温で90分間回転させた後、10,000xgで遠心
して細胞片を除去した。試料２μを0.1M NaCl、0.1％
ウシ血清アルブミンを含有する0.05M Tris−HCl、pH7.5
（TBSバッファー）0.8mlで希釈することにより、界面活
性剤で可溶化された抽出物を再脂質化した。0.25％デオ
キシコール酸中、ホスホチジルコリン（リシチン）0.5m
g/ml溶液50μおよびCdCl225μを加え、得られた溶
液を37℃で30分間インキュベートした。
で、ヒト胎児腎細胞（293細胞）およびサル腎細胞（Cos
細胞）をトランスフェクトした。トランスフェクション
の48時間後に細胞を収穫し、後述の色素検定法で組織因
子タンパク質活性を調べた。細胞を、0.15M NaClを含有
する0.01Mリン酸ナトリウムバッファー、pH7.0（1ml）
に懸濁することにより100mmプレートから除いた。プレ
ート上の様々な細胞密度を調節するために、550nmにお
ける吸収を0.750に調整した。細胞を１分間音波処理し
た後、終濃度が0.1％になるようにTriton X−100を加え
た。試料を室温で90分間回転させた後、10,000xgで遠心
して細胞片を除去した。試料２μを0.1M NaCl、0.1％
ウシ血清アルブミンを含有する0.05M Tris−HCl、pH7.5
（TBSバッファー）0.8mlで希釈することにより、界面活
性剤で可溶化された抽出物を再脂質化した。0.25％デオ
キシコール酸中、ホスホチジルコリン（リシチン）0.5m
g/ml溶液50μおよびCdCl225μを加え、得られた溶
液を37℃で30分間インキュベートした。
組換え組織因子タンパク質の機能的な能力を、特異的
色素検定法で試験した。結果を第９図に示す。予測され
るように、様々な濃度のウサギ脳トロンボプラスチン
（粗組織因子）がこの検定において反応することが分か
った。対照のCOS−７細胞（組織因子cDNAを含有してい
ない親発現ベクターを有する）は、検定ブランク（再脂
質化混合物のみを加えて得られた）より僅かに高い活性
を有していた（第９図）。これに対して、組織因子発現
プラスミドでトランスフェクトされた細胞はこの検定に
おいて強い陽性反応を呈し、cDNAが組織因子をコードし
ていることを証明した。
色素検定法で試験した。結果を第９図に示す。予測され
るように、様々な濃度のウサギ脳トロンボプラスチン
（粗組織因子）がこの検定において反応することが分か
った。対照のCOS−７細胞（組織因子cDNAを含有してい
ない親発現ベクターを有する）は、検定ブランク（再脂
質化混合物のみを加えて得られた）より僅かに高い活性
を有していた（第９図）。これに対して、組織因子発現
プラスミドでトランスフェクトされた細胞はこの検定に
おいて強い陽性反応を呈し、cDNAが組織因子をコードし
ていることを証明した。
実施例４ 原核性宿主での組織因子タンパク質の発現 プラスミドpTF2A12は、アルカリホスファターゼのプ
ロモーターとST IIリーダー配列（米国特許4,680,262）
を用いて大腸菌内で成熟組織因子タンパク質を発現する
よう企画されている。このプラスミドは、第６図に示す
ように４つのDNAフラグメントのライゲーションによっ
て組立てられた。その第１は式： で示される合成の二本鎖DNAである。
ロモーターとST IIリーダー配列（米国特許4,680,262）
を用いて大腸菌内で成熟組織因子タンパク質を発現する
よう企画されている。このプラスミドは、第６図に示す
ように４つのDNAフラグメントのライゲーションによっ
て組立てられた。その第１は式： で示される合成の二本鎖DNAである。
上記のフラグメントは成熟組織因子タンパク質の最初
の12アミノ酸をコードしている。第２は上記のpCISTFか
ら得た、624bpのBbv I−EcoR I制限フラグメントであっ
て、アミノ酸13〜216をコードするものである。第３はp
CISTFの518bpEcoR I−BamH Iフラグメントであって、組
織因子タンパク質の最後の47アミノ酸をコードするもの
である。プラスミドpAPST II HGH−１（米国特許4,680,
262）を930bp Nsi I BamH Iで消化することにより１個
のフラグメントを得た。
の12アミノ酸をコードしている。第２は上記のpCISTFか
ら得た、624bpのBbv I−EcoR I制限フラグメントであっ
て、アミノ酸13〜216をコードするものである。第３はp
CISTFの518bpEcoR I−BamH Iフラグメントであって、組
織因子タンパク質の最後の47アミノ酸をコードするもの
である。プラスミドpAPST II HGH−１（米国特許4,680,
262）を930bp Nsi I BamH Iで消化することにより１個
のフラグメントを得た。
これら４フラグメントを一緒にライゲートしてプラス
ミドpTF2A12を組立て（第６図）、大腸菌K12株294細胞
の形質転換に用いた。アンピシリン耐性に基づいて形質
転換体を選択し、制限分析とジデオキシ配列決定法によ
ってプラスミドpTF2A12を選択した。
ミドpTF2A12を組立て（第６図）、大腸菌K12株294細胞
の形質転換に用いた。アンピシリン耐性に基づいて形質
転換体を選択し、制限分析とジデオキシ配列決定法によ
ってプラスミドpTF2A12を選択した。
発現ベクターを含有する大腸菌K12株294細胞を、カル
ベニシリン50μg/mlを含んだ低リン酸塩培地中、29℃で
一夜培養した。600nMにおける吸光度が１である培養物1
mlから得た細胞ペレットを、50mM Tris−HCl、pH7.5、
150mM NaCl、１％ Triton X−100、1mg/mlリゾチーム
の混合物200μに懸濁した。この懸濁物をパルス音波
処理に付した後、10,000xgで遠心し、細胞片を除去し
た。試料10μを、0.1M NaCl、0.1％ウシ血清アルブ
ミンを含んだ0.05M Tris−HCl、pH7.5（TBSバッファ
ー）（0.8ml）で希釈することにより、界面活性剤で可
溶化した抽出物を再脂質化した。0.25％デオキシコール
酸中、ホスホチジルコリン5mg/ml溶液50μとCdCl225
μとを加え、得られた溶液を37℃で30分間インキュベ
ートした。
ベニシリン50μg/mlを含んだ低リン酸塩培地中、29℃で
一夜培養した。600nMにおける吸光度が１である培養物1
mlから得た細胞ペレットを、50mM Tris−HCl、pH7.5、
150mM NaCl、１％ Triton X−100、1mg/mlリゾチーム
の混合物200μに懸濁した。この懸濁物をパルス音波
処理に付した後、10,000xgで遠心し、細胞片を除去し
た。試料10μを、0.1M NaCl、0.1％ウシ血清アルブ
ミンを含んだ0.05M Tris−HCl、pH7.5（TBSバッファ
ー）（0.8ml）で希釈することにより、界面活性剤で可
溶化した抽出物を再脂質化した。0.25％デオキシコール
酸中、ホスホチジルコリン5mg/ml溶液50μとCdCl225
μとを加え、得られた溶液を37℃で30分間インキュベ
ートした。
後述の如くにして、色素検定法により組織因子活性を
検出した。
検出した。
実施例５ ヒト組織因子タンパク質突然変異体の発現 プラスミドpTF IIIは、成熟した突然変異形の組織因
子タンパク質を大腸菌内で発現させるよう企画されてい
る。この突然変異は、成熟組織因子タンパク質の245位
にあるシスティンがセリンに変換されたことによる。発
現をコントロールする要素、アルカリホスファターゼプ
ロモーターおよびST IIリーダー配列は、プラスミドpTF
2A12の組立てに用いられたものと同じである。
子タンパク質を大腸菌内で発現させるよう企画されてい
る。この突然変異は、成熟組織因子タンパク質の245位
にあるシスティンがセリンに変換されたことによる。発
現をコントロールする要素、アルカリホスファターゼプ
ロモーターおよびST IIリーダー配列は、プラスミドpTF
2A12の組立てに用いられたものと同じである。
プラスミドpTF IIIは３段階で組立てられ、その内、
最初の２段階で遺伝子のカルボキシ末端が再構築され
た。この、最初の２段階においてプラスミドpTF100−１
およびpTR80−３が得られた。
最初の２段階で遺伝子のカルボキシ末端が再構築され
た。この、最初の２段階においてプラスミドpTF100−１
およびpTR80−３が得られた。
プラスミドpTF100−１は３個のDNAフラグメントから
組立てられた（第7a図参照）。第１はクローニングベク
ターpTrp14（米国特許No.4,663,283）であり、その非必
須のEcoR I−Xba Iフラグメントを切り出した（第７
図）。第２は成熟組織因子タンパク質のアミノ酸217か
ら228までをコードしている32bpEcoR I−Fok Iフラグメ
ントである。アミノ酸229〜245をコードしている第３の
フラグメントは化学合成された二本鎖DNAであって、245
位のコドンがTGTからTCT（下線）に変換されている。
組立てられた（第7a図参照）。第１はクローニングベク
ターpTrp14（米国特許No.4,663,283）であり、その非必
須のEcoR I−Xba Iフラグメントを切り出した（第７
図）。第２は成熟組織因子タンパク質のアミノ酸217か
ら228までをコードしている32bpEcoR I−Fok Iフラグメ
ントである。アミノ酸229〜245をコードしている第３の
フラグメントは化学合成された二本鎖DNAであって、245
位のコドンがTGTからTCT（下線）に変換されている。
３フラグメントを一緒にライゲーション反応に付して
プラスミドpTF100−１を組立て、大腸菌K12株294に導入
した。アンピシリン耐性に基づいて形質転換体を選択
し、制限分析をジデオキシ配列決定法によりプラスミド
pTF100−１を選択した。
プラスミドpTF100−１を組立て、大腸菌K12株294に導入
した。アンピシリン耐性に基づいて形質転換体を選択
し、制限分析をジデオキシ配列決定法によりプラスミド
pTF100−１を選択した。
プラスミドpTF80−３は２つのDNAフラグメントから組
立てられた（第7b図）。第１はプラスミドベクターpHGH
207（米国特許No.4,663,283）であり、その930bpXba I
−BamH Iフラグメントを切り出した。第２は化学合成し
た68マーの二本鎖DNAであって、式： で示される。
立てられた（第7b図）。第１はプラスミドベクターpHGH
207（米国特許No.4,663,283）であり、その930bpXba I
−BamH Iフラグメントを切り出した。第２は化学合成し
た68マーの二本鎖DNAであって、式： で示される。
これらの２フラグメントを一緒にライゲーション反応
に付してプラスミドpTF80−３を組立て、大腸菌K12株29
4に導入した。アンピシリン耐性に基づいて形質転換体
を選択し、制限分析と配列決定によりプラスミドpTF80
−３を選択した。
に付してプラスミドpTF80−３を組立て、大腸菌K12株29
4に導入した。アンピシリン耐性に基づいて形質転換体
を選択し、制限分析と配列決定によりプラスミドpTF80
−３を選択した。
プラスミドpTF IIIは４つのDNAフラグメントから組立
てられた（第7c図）。第１はベクターpAPST II HGH（米
国特許No.4,680,262）であり、その930bpNsi I−BamH I
フラグメントを切り出した。第２は成熟組織因子タンパ
ク質のアミノ酸１〜217をコードしている、pTF2A12（上
記実施例４参照）の650bp Nis I−EcoR I制限フラグメ
ントである。第３は突然変異した、成熟組織因子タンパ
ク質のアミノ酸218〜245をコードしている、pTF100−１
の80bp EcoR I−Xba Iフラグメントである。第４は最後
の18アミノ酸をコードしている、pTF80−３の60bp Xba
I−BamH Iフラグメントである。これら４フラグメント
を一緒にライゲーション反応に付し、大腸菌K12株294に
導入した。形質転換体をアンピシリン耐性に基づいて選
択し、制限分析によってプラスミドpTF IIIを選択し
た。
てられた（第7c図）。第１はベクターpAPST II HGH（米
国特許No.4,680,262）であり、その930bpNsi I−BamH I
フラグメントを切り出した。第２は成熟組織因子タンパ
ク質のアミノ酸１〜217をコードしている、pTF2A12（上
記実施例４参照）の650bp Nis I−EcoR I制限フラグメ
ントである。第３は突然変異した、成熟組織因子タンパ
ク質のアミノ酸218〜245をコードしている、pTF100−１
の80bp EcoR I−Xba Iフラグメントである。第４は最後
の18アミノ酸をコードしている、pTF80−３の60bp Xba
I−BamH Iフラグメントである。これら４フラグメント
を一緒にライゲーション反応に付し、大腸菌K12株294に
導入した。形質転換体をアンピシリン耐性に基づいて選
択し、制限分析によってプラスミドpTF IIIを選択し
た。
実施例６ ヒト組織因子融合タンパク質の発現 ヘルペスgDシグナル配列（欧州特許公開No.0139416、
1985年５月２日公開）とヒト組織因子cDNAの成熟部分と
の融合物を、ベクターpRK7のコントロール要素を用いて
組立てた。pRK7およびpRK5（後述）の組立てを以下に示
す。
1985年５月２日公開）とヒト組織因子cDNAの成熟部分と
の融合物を、ベクターpRK7のコントロール要素を用いて
組立てた。pRK7およびpRK5（後述）の組立てを以下に示
す。
pRK5およびpRK7の組立て 出発プラスミドは上記の如くpCIS2.8c28Dである。パ
ラグラフ１から６の塩基番号はpCIS2.8c28Dを表わして
おり、そのEcoR I部位の１つの塩基、最初のＴがCMVプ
ロモーターに先行している。サイトメガロウィルスの初
期プロモーターおよびイントロン並びにSV40の複製起源
およびpolyAシグナルは、分離可能なプラスミドに含ま
れていた。
ラグラフ１から６の塩基番号はpCIS2.8c28Dを表わして
おり、そのEcoR I部位の１つの塩基、最初のＴがCMVプ
ロモーターに先行している。サイトメガロウィルスの初
期プロモーターおよびイントロン並びにSV40の複製起源
およびpolyAシグナルは、分離可能なプラスミドに含ま
れていた。
1.サイトメガロウィルスの初期プロモーターをEcoR Iフ
ラグメントとして、pCIS2.8c28D（9999−12−１）からp
UC118のEcoR I部位にクローニングした（ヤニッシュ・
ペロンら、ジーン33:103（1985）］。12個のコロニーを
とり、pUC118から作られた一本鎖DNAの方向性が、1201
位のEcoR I部位から9999位のEcoR I部位までの配列決定
が可能であるようなクローンをスクリーニングした。こ
のクローンをpCMVE/Pと命名した。
ラグメントとして、pCIS2.8c28D（9999−12−１）からp
UC118のEcoR I部位にクローニングした（ヤニッシュ・
ペロンら、ジーン33:103（1985）］。12個のコロニーを
とり、pUC118から作られた一本鎖DNAの方向性が、1201
位のEcoR I部位から9999位のEcoR I部位までの配列決定
が可能であるようなクローンをスクリーニングした。こ
のクローンをpCMVE/Pと命名した。
2.部位特異的突然変異誘発によってSP6［グリーンら（G
reen M.R.）セル32:681〜694（1983）］プロモーターを
挿入するために、pCMVE/Pから一本鎖DNAを調製した。SP
6プロモーター［ヌクレイック・アシッズ・リサーチ12:
7041（1984）第１図参照］を含有する合成110マーとSP6
プロモーターの−69から＋５までの配列を、オリゴマー
のいずれか一方の末端がCMUE/P配列と対応している18bp
フラグメントと一緒に用いた。標準的な手法で突然変異
誘発を行い、高ストリンジェンシィーおよび低ストリン
ジェンシィーにおいて、ラベルした110マーを用いてス
クリーニングした。６個の強いクローンをとり、配列決
定した。１つの陽性体を同定し、pCMVE/PSP6と表示し
た。
reen M.R.）セル32:681〜694（1983）］プロモーターを
挿入するために、pCMVE/Pから一本鎖DNAを調製した。SP
6プロモーター［ヌクレイック・アシッズ・リサーチ12:
7041（1984）第１図参照］を含有する合成110マーとSP6
プロモーターの−69から＋５までの配列を、オリゴマー
のいずれか一方の末端がCMUE/P配列と対応している18bp
フラグメントと一緒に用いた。標準的な手法で突然変異
誘発を行い、高ストリンジェンシィーおよび低ストリン
ジェンシィーにおいて、ラベルした110マーを用いてス
クリーニングした。６個の強いクローンをとり、配列決
定した。１つの陽性体を同定し、pCMVE/PSP6と表示し
た。
3.SP6RNAポリメラーゼを加え、RNAが適当なサイズであ
ることをチェックすることにより、SP6プロモーターを
チェックし、活性であることが示された。
ることをチェックすることにより、SP6プロモーターを
チェックし、活性であることが示された。
4.pCMVE/P（第１段階）およびpCMVE/PSP6（第２段階）
中の、pUC118のCl I部位（912）からSma I部位に挿入す
るために、Cla−Not I−Smaアダプターを調製した。こ
のアダプターをpUC118のCla I−Sma I部位にライゲート
し、正しいクローンをスクリーニングした。両者のリン
カーを配列決定し、クローンを、pCMVE/PSP6−Ｌおよび
pCMVE/P−Ｌと表示した。
中の、pUC118のCl I部位（912）からSma I部位に挿入す
るために、Cla−Not I−Smaアダプターを調製した。こ
のアダプターをpUC118のCla I−Sma I部位にライゲート
し、正しいクローンをスクリーニングした。両者のリン
カーを配列決定し、クローンを、pCMVE/PSP6−Ｌおよび
pCMVE/P−Ｌと表示した。
5.pCMVE/PSP6−Ｌを、Sma I（リンカー/pUC118連結部）
およびHind III（pUC118中）で切断した。pSVORAAΔRI1
1（下記）由来のHpa I（5573）〜Hind III（6136）フラ
グメントをpCMVE/PSP6−ＬのSma I−Hind IIIに挿入し
た。このライゲーション混合物をスクリーニングし、１
つのクローンを単離してpCMVE/PSP6−Ｌ−SVORAAΔRIと
命名した。
およびHind III（pUC118中）で切断した。pSVORAAΔRI1
1（下記）由来のHpa I（5573）〜Hind III（6136）フラ
グメントをpCMVE/PSP6−ＬのSma I−Hind IIIに挿入し
た。このライゲーション混合物をスクリーニングし、１
つのクローンを単離してpCMVE/PSP6−Ｌ−SVORAAΔRIと
命名した。
ａ） SV40複製起源およびpolyAシグナルを、pCIS2.8c2
8DからXmn I（5475）−Hind III（6136）フラグメント
として単離し、pUC119のHind III−Sma I部位にクロー
ンした。これをpSVORAAと命名した。
8DからXmn I（5475）−Hind III（6136）フラグメント
として単離し、pUC119のHind III−Sma I部位にクロー
ンした。これをpSVORAAと命名した。
ｂ） EcoR Iで部分消化し、クレノウ（Klenow）で充填
することにより、5716位のEcoR I部位を除去した。充填
後、自己ライゲーションさせて得られたコロニーをスク
リーニングし、適正なクローンを単離してpSVORAAΔRI1
1と命名した。配列決定によってEcoR I部位の欠失をチ
ェックし、適正であることが分かった。
することにより、5716位のEcoR I部位を除去した。充填
後、自己ライゲーションさせて得られたコロニーをスク
リーニングし、適正なクローンを単離してpSVORAAΔRI1
1と命名した。配列決定によってEcoR I部位の欠失をチ
ェックし、適正であることが分かった。
ｃ） pSVORAAΔRI11のHpa I（5573）〜Hind III（613
6）フラグメントを単離し、pCMVE/PSP6−Ｌに挿入した
（４を参照）。
6）フラグメントを単離し、pCMVE/PSP6−Ｌに挿入した
（４を参照）。
6.pCMVE/PSP6−LSVOrAAΔRI（第５段階）をEcoR I（999
9位）で切断して平滑末端化し、自己ライゲーションに
付した。EcoR I部位を有しないクローンを同定し、pRK
と命名した。
9位）で切断して平滑末端化し、自己ライゲーションに
付した。EcoR I部位を有しないクローンを同定し、pRK
と命名した。
7.pRKをSma IおよびBamH Iで切断した。これをクレノウ
で充填し、再ライゲートさせた。コロニーをスクリーニ
ングした。陽性体を同定し、pRKΔBam/Sma3と命名し
た。
で充填し、再ライゲートさせた。コロニーをスクリーニ
ングした。陽性体を同定し、pRKΔBam/Sma3と命名し
た。
8.コンバーターを用いてHind III部位をHpa I部位な変
換した。コンバーターとは、ある制限部位を他の制限部
位に変換するために用いられるDNA片である。この場
合、一方の末端はHind III粘着末端と相補的であって、
他の末端はHpa I認識部位を有するものである。陽性体
を同定し、pRKΔBam/Sma、H III−Hpa I1と命名した。
換した。コンバーターとは、ある制限部位を他の制限部
位に変換するために用いられるDNA片である。この場
合、一方の末端はHind III粘着末端と相補的であって、
他の末端はHpa I認識部位を有するものである。陽性体
を同定し、pRKΔBam/Sma、H III−Hpa I1と命名した。
9.pRKΔBam/Sma、H III−Hpa I1を、Pst IおよびNot I
で消化し、R I−H IIIリンカーおよびH III R Iリンカ
ーをライゲートさせて挿入した。各リンカーについて、
クローンが見出された。しかしながら、あまりにも多く
のHpa Iコンバーターが入っていることが分かった（２
またはそれ以上のコンバーターはPvu II部位を形成して
いた）。従って、これらのクローンは、Hpa Iで切断
し、自己ライゲーションさせる必要があった。
で消化し、R I−H IIIリンカーおよびH III R Iリンカ
ーをライゲートさせて挿入した。各リンカーについて、
クローンが見出された。しかしながら、あまりにも多く
のHpa Iコンバーターが入っていることが分かった（２
またはそれ以上のコンバーターはPvu II部位を形成して
いた）。従って、これらのクローンは、Hpa Iで切断
し、自己ライゲーションさせる必要があった。
10.R I−H IIIクローン３およびH III−R Iクローン５
をHpa Iで切断し、希釈し、自己ライゲーションさせ
た。陽性体を同定した。R I−IIIクローンをpRK5と命名
した。H III−R IクローンをHpa Iで切断し、希釈し、
自己ライゲーションさせた。スクリーニングの後、陽性
体を同定し、pRK7と命名した。ベクターpRK7は、CMVの
プロモーターおよびエンハンサー、およびスプライス供
与体、IgGのイントロンとスプライス受容体、SP6プロモ
ーター、SV40ポリＡシグナル、並びにSV40の複製起源を
含有しているがDHFR遺伝子は含まない。組織因子タンパ
ク質の発現ベクターは以下の如くにして組立てられた。
λTF14から得た組織因子タンパク質のcDNAをpSP64のSal
I部位にクローンし、pSP64TFと表示した（プロメガコ
ーポレーション、1987）。組織因子cDNAを含有するpSP6
4をNco Iで切断した。キナーゼ処理に付されていない18
マーのコンバーターをNco I末端にライゲートさせ、Nco
I部位をXba Iに変換した。用いたリンカーを以下に示
す。
をHpa Iで切断し、希釈し、自己ライゲーションさせ
た。陽性体を同定した。R I−IIIクローンをpRK5と命名
した。H III−R IクローンをHpa Iで切断し、希釈し、
自己ライゲーションさせた。スクリーニングの後、陽性
体を同定し、pRK7と命名した。ベクターpRK7は、CMVの
プロモーターおよびエンハンサー、およびスプライス供
与体、IgGのイントロンとスプライス受容体、SP6プロモ
ーター、SV40ポリＡシグナル、並びにSV40の複製起源を
含有しているがDHFR遺伝子は含まない。組織因子タンパ
ク質の発現ベクターは以下の如くにして組立てられた。
λTF14から得た組織因子タンパク質のcDNAをpSP64のSal
I部位にクローンし、pSP64TFと表示した（プロメガコ
ーポレーション、1987）。組織因子cDNAを含有するpSP6
4をNco Iで切断した。キナーゼ処理に付されていない18
マーのコンバーターをNco I末端にライゲートさせ、Nco
I部位をXba Iに変換した。用いたリンカーを以下に示
す。
次いで、pSP64をBbv Iで消化して1030bpフラグメント
をゲル単離した。キナーゼ処理されていない約100bpのP
vu II−Bbv I二本鎖DNAは因子VIII内の最初のトロンビ
ン活性化部位と成熟ヒト組織因子タンパク質の最初の12
アミノ酸との配列を含有している。約100bpのこの配列
を以下に示す。
をゲル単離した。キナーゼ処理されていない約100bpのP
vu II−Bbv I二本鎖DNAは因子VIII内の最初のトロンビ
ン活性化部位と成熟ヒト組織因子タンパク質の最初の12
アミノ酸との配列を含有している。約100bpのこの配列
を以下に示す。
Pvu II−Bbv Iフラグメントを約1030bpのフラグメン
トにライゲートした。約1130bpのフラグメントをゲル単
離した。次いで、このPvu II−Xba IフラグメントをpSP
64ベクターにライゲートしてpSP64ThTFと表示した。１
つのクローンを得、合成100マーを含有する領域の配列
決定を行った。大量の挿入体を得る目的でこのプラスミ
ドをPvu IIおよびXba Iによって消化した。しかしなが
ら、Xba I部位は消化されなかった。そこで、Pvu IIお
よびSal Iで切断することにより挿入体をゲル単離し
た。Sal I部位はpSP64ポリリンカーの残余部分に存在
し、Xba I部位の次に位置している。ヘルペスgDシグナ
ル配列と幾らかの５′非翻訳領域とを含有する第２のフ
ラグメントは、pgD−DHFR（欧州特許公開013417、1985
年５月２日公開）から得られた275bpフラグメント（Pst
I−Sac IIで消化された）と、下記の配列を有する103b
pのSac II−Pvu II合成フラグメントとを含有してい
る。
トにライゲートした。約1130bpのフラグメントをゲル単
離した。次いで、このPvu II−Xba IフラグメントをpSP
64ベクターにライゲートしてpSP64ThTFと表示した。１
つのクローンを得、合成100マーを含有する領域の配列
決定を行った。大量の挿入体を得る目的でこのプラスミ
ドをPvu IIおよびXba Iによって消化した。しかしなが
ら、Xba I部位は消化されなかった。そこで、Pvu IIお
よびSal Iで切断することにより挿入体をゲル単離し
た。Sal I部位はpSP64ポリリンカーの残余部分に存在
し、Xba I部位の次に位置している。ヘルペスgDシグナ
ル配列と幾らかの５′非翻訳領域とを含有する第２のフ
ラグメントは、pgD−DHFR（欧州特許公開013417、1985
年５月２日公開）から得られた275bpフラグメント（Pst
I−Sac IIで消化された）と、下記の配列を有する103b
pのSac II−Pvu II合成フラグメントとを含有してい
る。
第３セグメントは、pRK7をPst I−Sal I消化に付し、
約4700bpフラグメントをゲル単離することにより得られ
た。最終的な３成分ライゲーションは、ａ）組織因子タ
ンパク質をコードするcDNAの５′側の第１のトロンビン
活性化部位を含有するPvu II−Sal Iフラグメント、
ｂ）ヘルペスgDシグナル配列を含有するPst I−Pvu II
フラグメント、およびｃ）コントロール要素を含有する
pRKフラグメントを用いて行われた。上記の３つのフラ
グメントとクローンを得、制限酵素消化および配列決定
によって正しいことを確認した。
約4700bpフラグメントをゲル単離することにより得られ
た。最終的な３成分ライゲーションは、ａ）組織因子タ
ンパク質をコードするcDNAの５′側の第１のトロンビン
活性化部位を含有するPvu II−Sal Iフラグメント、
ｂ）ヘルペスgDシグナル配列を含有するPst I−Pvu II
フラグメント、およびｃ）コントロール要素を含有する
pRKフラグメントを用いて行われた。上記の３つのフラ
グメントとクローンを得、制限酵素消化および配列決定
によって正しいことを確認した。
ヒト胎児腎細胞（293S）を組織因子−ヘルペスgD融合
タンパク質を含有する発現ベクターでトランスフェクト
した。一時的なトランスフェクションの15時間後にヒト
293細胞を収穫した。培養培地を除き、抽出バッファー
（5mM Tris HCl）;0.1％Triton X−100を含有する150
mM NaCl:pH7.5［TBS］を100mmの組織培養プレートあた
り2mlづつ加えた。細胞を懸濁させ、４℃で45〜60分間
回転させた（エンド・オーバー・エンド）。抽出物を80
00xgで20分間遠心した後、直接、流速0.8ml/分でモノク
ローナル抗体カラム（CNBr活性化セファロース3.5mg 5B
6/ml）にかけた。ヘルペスgDに対する抗体の調製は欧州
特許公開No.1,139,416（1985年５月２日公開）に記載さ
れている。抗体カラムを抽出バッファー10mlで洗浄して
吸収（280nm）をベースラインに戻した。次いで、カラ
ムを50mM Tris HCl、1M NaCl、0.1％ Triton X−100、p
H7.5で洗浄し、0.1Mグリシン、150mM NaCl、0.1％ Trit
on X−100、pH2で溶離した。1M Tris HCl、pH8.5でpHを
中性に調節した。
タンパク質を含有する発現ベクターでトランスフェクト
した。一時的なトランスフェクションの15時間後にヒト
293細胞を収穫した。培養培地を除き、抽出バッファー
（5mM Tris HCl）;0.1％Triton X−100を含有する150
mM NaCl:pH7.5［TBS］を100mmの組織培養プレートあた
り2mlづつ加えた。細胞を懸濁させ、４℃で45〜60分間
回転させた（エンド・オーバー・エンド）。抽出物を80
00xgで20分間遠心した後、直接、流速0.8ml/分でモノク
ローナル抗体カラム（CNBr活性化セファロース3.5mg 5B
6/ml）にかけた。ヘルペスgDに対する抗体の調製は欧州
特許公開No.1,139,416（1985年５月２日公開）に記載さ
れている。抗体カラムを抽出バッファー10mlで洗浄して
吸収（280nm）をベースラインに戻した。次いで、カラ
ムを50mM Tris HCl、1M NaCl、0.1％ Triton X−100、p
H7.5で洗浄し、0.1Mグリシン、150mM NaCl、0.1％ Trit
on X−100、pH2で溶離した。1M Tris HCl、pH8.5でpHを
中性に調節した。
トロンビンを用い、融合タンパク質から、gD−組織因
子融合タンパク質のgD部分を切断した。業者の指示に従
って、トロンビン1110単位（タンパク質0.33mg）をCNBr
で活性化したセファロース0.5mlに共有結合的に結合さ
せた。gDTF融合タンパク質5000単位とトロンビンやセフ
ァロース150μとを37℃で90分間インキュベートした
（エンド・オーバー・エンド・ローテーション）。次い
で、トロンビン−セファロースを遠心分離して除いた。
子融合タンパク質のgD部分を切断した。業者の指示に従
って、トロンビン1110単位（タンパク質0.33mg）をCNBr
で活性化したセファロース0.5mlに共有結合的に結合さ
せた。gDTF融合タンパク質5000単位とトロンビンやセフ
ァロース150μとを37℃で90分間インキュベートした
（エンド・オーバー・エンド・ローテーション）。次い
で、トロンビン−セファロースを遠心分離して除いた。
後述の如くにして、色素検定法により組織因子の活性
を検出した。
を検出した。
実施例７ 細胞質領域を欠失した組織因子タンパク質の
発現 ベクターpRKTFΔ244は、第10図に記載の如く、細胞質
領域（アミノ酸244〜263）を欠失した組織因子タンパク
質を発現させるために組立てられた、このベクターは、
３成分ライゲーションによって組立てられた。第１部分
はpCISTF1をEcoR IおよびCla Iで消化して得られた859b
pのフラグメントである。この859bpをゲル単離した。第
２部分はpRK5（前記）を、Cla I−BamH I消化、ゲル単
離に付すことにより得られた。第３部分は化学合成され
たEcoR I−BamH I87マーであって、以下の配列で示され
る。
発現 ベクターpRKTFΔ244は、第10図に記載の如く、細胞質
領域（アミノ酸244〜263）を欠失した組織因子タンパク
質を発現させるために組立てられた、このベクターは、
３成分ライゲーションによって組立てられた。第１部分
はpCISTF1をEcoR IおよびCla Iで消化して得られた859b
pのフラグメントである。この859bpをゲル単離した。第
２部分はpRK5（前記）を、Cla I−BamH I消化、ゲル単
離に付すことにより得られた。第３部分は化学合成され
たEcoR I−BamH I87マーであって、以下の配列で示され
る。
３成分ライゲーションには、ａ）アミノ酸１−216を
コードしている859bpフラグメント、ｂ）pRK5由来の470
0bpフラグメント、ｃ）アミノ酸217−243をコードして
いる87マーを用いた。この新規なベクターをpRKTFΔ244
と表示した（第10図）。
コードしている859bpフラグメント、ｂ）pRK5由来の470
0bpフラグメント、ｃ）アミノ酸217−243をコードして
いる87マーを用いた。この新規なベクターをpRKTFΔ244
と表示した（第10図）。
発現ベクターpRKTFΔ244でヒト腎細胞（293）をトラ
ンスフェクトした。３日後、細胞質領域を欠失した組織
因子タンパク質を前記の如く精製し、後述の色素検定法
で分析した。この検定において、細胞質領域を欠失した
組織因子は強い陽性反応を示し、細胞質領域欠失組織因
子タンパク質のインビトロでの凝固分析における有効性
が証明された。
ンスフェクトした。３日後、細胞質領域を欠失した組織
因子タンパク質を前記の如く精製し、後述の色素検定法
で分析した。この検定において、細胞質領域を欠失した
組織因子は強い陽性反応を示し、細胞質領域欠失組織因
子タンパク質のインビトロでの凝固分析における有効性
が証明された。
実施例８ 組織因子タンパク質の精製 ヒト組織因子タンパク質と結合するIgGモノクローナ
ル抗体を用い、イムノアフィニティー精製法によって組
織因子タンパク質を精製した。
ル抗体を用い、イムノアフィニティー精製法によって組
織因子タンパク質を精製した。
上記の如く、組換え培養によってヒト組織因子タンパ
ク質を合成した。下記のスケージュールに従い、以下の
如く免疫原をBALB/cマウス（29.1.C.）に注入した：組
換えヒト組織因子タンパク質（rTF）（0.07mg/ml、比活
性17040U/mgを有する）；トロンビンで開裂された結
果、アミノ末端のヘルペス−gD配列が失なわれた、組織
因子−gD融合物由来の組換え組織因子タンパク質（rTF:
gDThr）（0.02mg/ml、比活性4687U/mgを有する）；およ
び組換え組織因子−ヘルペスgD融合物（rTF:gD）（約15
0,000U/mg）。これらを表に示したスケジュールで用い
た。
ク質を合成した。下記のスケージュールに従い、以下の
如く免疫原をBALB/cマウス（29.1.C.）に注入した：組
換えヒト組織因子タンパク質（rTF）（0.07mg/ml、比活
性17040U/mgを有する）；トロンビンで開裂された結
果、アミノ末端のヘルペス−gD配列が失なわれた、組織
因子−gD融合物由来の組換え組織因子タンパク質（rTF:
gDThr）（0.02mg/ml、比活性4687U/mgを有する）；およ
び組換え組織因子−ヘルペスgD融合物（rTF:gD）（約15
0,000U/mg）。これらを表に示したスケジュールで用い
た。
放射性免疫沈澱法（RIP）によって測定した抗TF力価
およびELISAは85日目までの免疫期間を通して徐々に増
加した。
およびELISAは85日目までの免疫期間を通して徐々に増
加した。
RIP検定にはPBSTA（0.5％ウシ血清アルブミン［BSA］
と0.1％Triton X−100を含有するPBS）0.495mlで希釈し
た、免疫されたまたは免疫されていないマウスの血清0.
005mlを用いた。125I−rTF50,000cpmを加え、混合物を
室温で２時間インキュベートした。SPAビーズ0.05mlと
一緒に室温で１時間インキュベートすることにより、抗
体とコンプレックスを形成した125I−rTFを沈澱させ
た。SPAビーズは、ウサギの抗マウスIgDとプレインキュ
ベートし、50mM Tris pH8、10mM MgCl2、0.1％BSAお
よび0.02％NaN3中で保存しておいたセファロースCL−4B
ビーズにスタフィロコッカスのプロティンＡを結合させ
ることにより得られるものである。ビーズをペレット化
し、PBSTAで３回洗浄した後、ガンマカウンターで計数
した。
と0.1％Triton X−100を含有するPBS）0.495mlで希釈し
た、免疫されたまたは免疫されていないマウスの血清0.
005mlを用いた。125I−rTF50,000cpmを加え、混合物を
室温で２時間インキュベートした。SPAビーズ0.05mlと
一緒に室温で１時間インキュベートすることにより、抗
体とコンプレックスを形成した125I−rTFを沈澱させ
た。SPAビーズは、ウサギの抗マウスIgDとプレインキュ
ベートし、50mM Tris pH8、10mM MgCl2、0.1％BSAお
よび0.02％NaN3中で保存しておいたセファロースCL−4B
ビーズにスタフィロコッカスのプロティンＡを結合させ
ることにより得られるものである。ビーズをペレット化
し、PBSTAで３回洗浄した後、ガンマカウンターで計数
した。
ELISAは、炭酸塩バッファー（pH9.6）に入れたrTF
（0.5μg/ml）を、37℃で２時間、マイクロタイタープ
レートのウェルに吸着させて行った。RBSA（５％BSAを
含有するPBS）と共に37℃で１時間インキュベートする
ことにより、以後の非特異的な吸着を阻害した。PBST
（0.1％Tween80を含有するPBS）で３回洗浄し、PBSで希
釈した血清試料を加え、４℃で一夜インキュベートし
た。ウェルをPBSTで３回洗浄した。各ウェルに、ホース
ラディッシュのペルオキシダーゼとコンジュゲートした
ヤギの抗マウスイムノグロブリン0.1mlを加え、室温で
１時間インキュベートした。再度ウェルを洗浄し、基質
としてＯ−フェニレンジアミンを加え、室温で25分間イ
ンキュベートした。2.5M H2SO4で反応を止め、各ウェ
ルの吸光度を492minで読みとった。
（0.5μg/ml）を、37℃で２時間、マイクロタイタープ
レートのウェルに吸着させて行った。RBSA（５％BSAを
含有するPBS）と共に37℃で１時間インキュベートする
ことにより、以後の非特異的な吸着を阻害した。PBST
（0.1％Tween80を含有するPBS）で３回洗浄し、PBSで希
釈した血清試料を加え、４℃で一夜インキュベートし
た。ウェルをPBSTで３回洗浄した。各ウェルに、ホース
ラディッシュのペルオキシダーゼとコンジュゲートした
ヤギの抗マウスイムノグロブリン0.1mlを加え、室温で
１時間インキュベートした。再度ウェルを洗浄し、基質
としてＯ−フェニレンジアミンを加え、室温で25分間イ
ンキュベートした。2.5M H2SO4で反応を止め、各ウェ
ルの吸光度を492minで読みとった。
89日目にマウス29.1.C.から脾臓を収穫して破壊し、
S.Fazakas de st.Grothら（J.Immun.Meth.、35:1−21
（1980））のPEG融合法を用い、P3X63−Ag8.653（ATCC
CRL1580）（非分泌性のマウス骨髄腫細胞）と融合させ
た。融合物の培養をそれぞれ96個のウェルを有する４つ
のプレートに播種し、HAT（ヒポキサンチン、アミノプ
リテンおよびチミジン）培地中、常法［ミッシェルおよ
びシージ（Mishell ＆ Shiigi）、セレクテッド・メソ
ッズ・イン・セルラー・イムノロジー（Selected Metho
ds in Cellular Immunology）、フリーマン（W.H.Freem
an）＆ Co.サンフランシスコ、pp357〜363（1980）］に
従って培養した。ELISAおよびRIPによって培養上清の抗
−TF活性を測定した。22が陽性を示し、抗−TF活性を有
することが分かった。これらの内、12の安定な、抗−TF
を分泌する融合物を増殖させ、公開された方法［オイお
よびヘルゼンベルグ（Oi,V.J.T.＆ Herzenberg,L.
A.）、イムノグロブリン産生性ハイブリッドセルライン
（Selected Methods in Cellular Immunologg、p351〜3
72、ミッシェルおよびシージ編、フリーマン＆Co（198
0）中）］を用い、制限希釈によってクローニングし
た。単一クローンの肉眼観察、ELISAおよびRIPに基づい
てクローンを選択した。抗体を、Zymedイソタイピング
キットを用い、添付のプロトコールに従って抗体のイソ
タイプ化を行った（Zymed Corp.）。クローニングした
ハイブリドーマ細胞をプリスタンで感作したマウスに注
射して腹水腫を発現させることにより、大量の特異的モ
ノクローナル抗体を製造した。次いで、腹水を採取し、
フロティンＡセファロースカラムを用いて精製した。
S.Fazakas de st.Grothら（J.Immun.Meth.、35:1−21
（1980））のPEG融合法を用い、P3X63−Ag8.653（ATCC
CRL1580）（非分泌性のマウス骨髄腫細胞）と融合させ
た。融合物の培養をそれぞれ96個のウェルを有する４つ
のプレートに播種し、HAT（ヒポキサンチン、アミノプ
リテンおよびチミジン）培地中、常法［ミッシェルおよ
びシージ（Mishell ＆ Shiigi）、セレクテッド・メソ
ッズ・イン・セルラー・イムノロジー（Selected Metho
ds in Cellular Immunology）、フリーマン（W.H.Freem
an）＆ Co.サンフランシスコ、pp357〜363（1980）］に
従って培養した。ELISAおよびRIPによって培養上清の抗
−TF活性を測定した。22が陽性を示し、抗−TF活性を有
することが分かった。これらの内、12の安定な、抗−TF
を分泌する融合物を増殖させ、公開された方法［オイお
よびヘルゼンベルグ（Oi,V.J.T.＆ Herzenberg,L.
A.）、イムノグロブリン産生性ハイブリッドセルライン
（Selected Methods in Cellular Immunologg、p351〜3
72、ミッシェルおよびシージ編、フリーマン＆Co（198
0）中）］を用い、制限希釈によってクローニングし
た。単一クローンの肉眼観察、ELISAおよびRIPに基づい
てクローンを選択した。抗体を、Zymedイソタイピング
キットを用い、添付のプロトコールに従って抗体のイソ
タイプ化を行った（Zymed Corp.）。クローニングした
ハイブリドーマ細胞をプリスタンで感作したマウスに注
射して腹水腫を発現させることにより、大量の特異的モ
ノクローナル抗体を製造した。次いで、腹水を採取し、
フロティンＡセファロースカラムを用いて精製した。
腹水約5mlを、Sorvall600中、４℃で10分間、3000rpm
で遠心した。パスツールピペットを用いて澄明なプリス
タン層と脂質層とを採取した。腹水液を50mlの遠心管に
移した。腹水を0.45Mフィルターで滅菌濾過した。この
腹水にKCl1.11gを加え、終濃度を3MKClとした。
で遠心した。パスツールピペットを用いて澄明なプリス
タン層と脂質層とを採取した。腹水液を50mlの遠心管に
移した。腹水を0.45Mフィルターで滅菌濾過した。この
腹水にKCl1.11gを加え、終濃度を3MKClとした。
腹水をSPAセファロース（Fermentech）を含有する10m
lカラムにかけた。カラムを3MKClで洗浄した。３〜４カ
ラム容量の0.15MNaCl中0.1M酢酸（pH2.8）でマウスIgG
を溶離した。
lカラムにかけた。カラムを3MKClで洗浄した。３〜４カ
ラム容量の0.15MNaCl中0.1M酢酸（pH2.8）でマウスIgG
を溶離した。
抗体D3を、業者の教示に従い、セファロース1mlあた
りIgG3mgの割合でCNBrセファロースに結合（カップリン
グ）させた（Pharmacia Co.の取扱い説明書参照）。ト
ランスフェクトした293S細胞を、HamのＦ−12（W/Oグリ
シン、ヒポキサンチンおよびチミジン）とDMEM（W/Oグ
リシン）との1:1混合物中で増殖させた。基礎培地に対
する添加物は、透析または濾過（デイアフィルター）さ
れたウシ胎児血清、50nMメタトレキセート、2.0mM L−
グルタミンおよび10mM HEPESバッファーである。
りIgG3mgの割合でCNBrセファロースに結合（カップリン
グ）させた（Pharmacia Co.の取扱い説明書参照）。ト
ランスフェクトした293S細胞を、HamのＦ−12（W/Oグリ
シン、ヒポキサンチンおよびチミジン）とDMEM（W/Oグ
リシン）との1:1混合物中で増殖させた。基礎培地に対
する添加物は、透析または濾過（デイアフィルター）さ
れたウシ胎児血清、50nMメタトレキセート、2.0mM L−
グルタミンおよび10mM HEPESバッファーである。
293S（63/2S CISTF）を凍結したビンを既述の培地を
含有する組織培養フラスコ中で解凍した。全面培養に達
した時点でトリプシン−EDTA混合物を用いてトリプシン
処理し、細胞集団の少量をより大きいフラスコに接種し
た。培養物を毎日、位相差顕微鏡で観察した増殖（全面
生長に対する割合）、形態および全般的な健康状態を調
べた。ローラーボトル培養が全面生長に達した時点（通
常５〜７日間）で細胞をトリプシン処理し、計数した。
トリパンブルー排除法によって細胞を計数し、その生存
性を調べた。全面生長した850cm2のローラーボトルにお
ける細胞数は、通常、１〜４×108細胞であった。細胞
を0.01Mリン酸ナトリウム（0.15M NaCl）に懸濁した。
細胞を、5000rpmで遠心して採取した。細胞を、フラス
コあたり、１％Triton Xを含有するTBS50mlの入ったフ
ラスコに再懸濁した。培養物を室温で１時間インキュベ
ートした後、8000xgで20分間遠心した。上清を、上記の
D3−セファロースカラムにかけた。カラムを洗浄し、0.
1M酢酸、150mM NaClおよび0.05％Tween80で溶離した。
含有する組織培養フラスコ中で解凍した。全面培養に達
した時点でトリプシン−EDTA混合物を用いてトリプシン
処理し、細胞集団の少量をより大きいフラスコに接種し
た。培養物を毎日、位相差顕微鏡で観察した増殖（全面
生長に対する割合）、形態および全般的な健康状態を調
べた。ローラーボトル培養が全面生長に達した時点（通
常５〜７日間）で細胞をトリプシン処理し、計数した。
トリパンブルー排除法によって細胞を計数し、その生存
性を調べた。全面生長した850cm2のローラーボトルにお
ける細胞数は、通常、１〜４×108細胞であった。細胞
を0.01Mリン酸ナトリウム（0.15M NaCl）に懸濁した。
細胞を、5000rpmで遠心して採取した。細胞を、フラス
コあたり、１％Triton Xを含有するTBS50mlの入ったフ
ラスコに再懸濁した。培養物を室温で１時間インキュベ
ートした後、8000xgで20分間遠心した。上清を、上記の
D3−セファロースカラムにかけた。カラムを洗浄し、0.
1M酢酸、150mM NaClおよび0.05％Tween80で溶離した。
実施例９ 組織因子タンパク質の検定 1.色素による組織因子検定 培養培地から抽出した全試料を検定に先立って再脂質
化した。前述のように、組織因子は、インビトロ検定シ
ステムで活性を示すためにはリン脂質を絶対的に必要と
している［ピトリックおよびネマーソン（上記）］。0.
25％デオキシコール酸ナトリウムを含有するトリス0.05
M、0.1M NaCl、pH7.4（TBS）中でレシチン顆粒をホモジ
ナイズし、1mg/mlの濃度にした。この溶液（PC/DOC）を
用い、以下のようにして組織因子を再脂質化した。組織
因子タンパク質を、0.1％ウシ血清アルブミンを含有す
るTBS（TBSA）で希釈した。50μを12×75mmのポリス
チレン試験管に入れ、PC/DOC溶液50μを加えた。次い
で、TBSA（350μ）を100mMのCdCl2（25μ）ととも
に加えた。この再脂質化混合物を37℃で30分間インキュ
ベートした。
化した。前述のように、組織因子は、インビトロ検定シ
ステムで活性を示すためにはリン脂質を絶対的に必要と
している［ピトリックおよびネマーソン（上記）］。0.
25％デオキシコール酸ナトリウムを含有するトリス0.05
M、0.1M NaCl、pH7.4（TBS）中でレシチン顆粒をホモジ
ナイズし、1mg/mlの濃度にした。この溶液（PC/DOC）を
用い、以下のようにして組織因子を再脂質化した。組織
因子タンパク質を、0.1％ウシ血清アルブミンを含有す
るTBS（TBSA）で希釈した。50μを12×75mmのポリス
チレン試験管に入れ、PC/DOC溶液50μを加えた。次い
で、TBSA（350μ）を100mMのCdCl2（25μ）ととも
に加えた。この再脂質化混合物を37℃で30分間インキュ
ベートした。
色素検定用に、再脂質化した組織因子タンパク質試料
をTBSAで希釈した。その10μを、因子IX a/因子Ｘ試
薬50μおよび精製した因子VIIの溶液（30単位/ml）２
μとともに試験管に入れた。この試験管を37℃まで暖
め、25mMのCaCl2を100μ加えた。この試料を37℃で５
分間インキュベートし、合成トロンビン阻害剤I2581を
含有する色素基質S2222（50μ）を加えた。反応を10
分間行ない、50％氷酢酸溶液100μを加えて停止させ
た。吸収を405nMで検知した。ウサギ脳トロンボプラス
チン［シグマ（Sigma,St.Louis,MO）からの市販品を利
用できる；カタログ＃TO263］を用いて標準曲線を作成
した（この試薬が100組織因子単位/mlであるとして）。
希釈は1:10から1:1000まで行なった。片対数グラフ用紙
の縦軸に希釈の尺度をプロットし、横軸に吸収をプロッ
トした。
をTBSAで希釈した。その10μを、因子IX a/因子Ｘ試
薬50μおよび精製した因子VIIの溶液（30単位/ml）２
μとともに試験管に入れた。この試験管を37℃まで暖
め、25mMのCaCl2を100μ加えた。この試料を37℃で５
分間インキュベートし、合成トロンビン阻害剤I2581を
含有する色素基質S2222（50μ）を加えた。反応を10
分間行ない、50％氷酢酸溶液100μを加えて停止させ
た。吸収を405nMで検知した。ウサギ脳トロンボプラス
チン［シグマ（Sigma,St.Louis,MO）からの市販品を利
用できる；カタログ＃TO263］を用いて標準曲線を作成
した（この試薬が100組織因子単位/mlであるとして）。
希釈は1:10から1:1000まで行なった。片対数グラフ用紙
の縦軸に希釈の尺度をプロットし、横軸に吸収をプロッ
トした。
2.組織因子活性の１段階検定 接触相の凝固による非特異的な活性化を防ぐため、血
友病の血漿100μを、シリコン処理したガラス試験管
中の再脂質化した組織因子、脂質を含まない組織因子ま
たは対照としてのTBSA10μに加えた。この反応混合物
を37℃まで暖め、25mMのCaCl2を100μ加え、血餅の生
成時間を測定した［バータムおよびプリーズ（Hvatum,
Y.and Prydz,H.,Thromb.Diath.Haemorrh.,21,217−222
（1969））］。
友病の血漿100μを、シリコン処理したガラス試験管
中の再脂質化した組織因子、脂質を含まない組織因子ま
たは対照としてのTBSA10μに加えた。この反応混合物
を37℃まで暖め、25mMのCaCl2を100μ加え、血餅の生
成時間を測定した［バータムおよびプリーズ（Hvatum,
Y.and Prydz,H.,Thromb.Diath.Haemorrh.,21,217−222
（1969））］。
実施例10 イヌの血友病モデルでの組織因子タンパク質
の効力および毒性の欠如 ギルズ等［Giles,A.R.et al.,Blood,60,727−730（19
82）］の方法を用いて組織因子タンパク質を血友病のイ
ヌに注入した。
の効力および毒性の欠如 ギルズ等［Giles,A.R.et al.,Blood,60,727−730（19
82）］の方法を用いて組織因子タンパク質を血友病のイ
ヌに注入した。
始めに、50組織因子タンパク質U/kgおよび250組織因
子タンパク質U/kgの用量でボーラス注入した正常なイヌ
で組織因子タンパク質の毒性の欠如を測定した。注入前
およびそれぞれの注入の30分後に表皮出血時間（CBT）
の測定を行なった［ギルズ（上記）］。実験中の種々の
時間に血液を採取し、凝固検定用に抗凝固処理した。組
織因子タンパク質のインビボでの因子VIII迂回活性を確
かめるため、血友病のイヌを用いて実験を行なった。断
食させた動物を麻酔し、注入前にCBT測定を行なった。
次いで、ボーラス注入によって組織因子タンパク質を投
与し、注入して90分までの種々の時間にCBT測定を行な
った。数種類の用量の組織因子タンパク質を投与した。
各実験期間中に血液試料を採取し、因子Ｖ、プロトロン
ビンおよび部分的なトロンボプラスチン時間を検定し
た。12分より大きいCBTを大ざっぱにみて異常であると
みなした。これらの爪を焼灼して過度の血液流失を防止
した。
子タンパク質U/kgの用量でボーラス注入した正常なイヌ
で組織因子タンパク質の毒性の欠如を測定した。注入前
およびそれぞれの注入の30分後に表皮出血時間（CBT）
の測定を行なった［ギルズ（上記）］。実験中の種々の
時間に血液を採取し、凝固検定用に抗凝固処理した。組
織因子タンパク質のインビボでの因子VIII迂回活性を確
かめるため、血友病のイヌを用いて実験を行なった。断
食させた動物を麻酔し、注入前にCBT測定を行なった。
次いで、ボーラス注入によって組織因子タンパク質を投
与し、注入して90分までの種々の時間にCBT測定を行な
った。数種類の用量の組織因子タンパク質を投与した。
各実験期間中に血液試料を採取し、因子Ｖ、プロトロン
ビンおよび部分的なトロンボプラスチン時間を検定し
た。12分より大きいCBTを大ざっぱにみて異常であると
みなした。これらの爪を焼灼して過度の血液流失を防止
した。
色素検定で再脂質化したときの組織因子タンパク質が
100U/kgである量の組織因子タンパク質を、麻酔した正
常なイヌに投与した。この動物でのCBT測定は注入の約
３分前に行なった。５分後にWBCTがやや減少したが15分
後には正常に復した。因子Ｖのレベルは、それぞれの注
入の30分後には正常であった。プロトロンビンおよび部
分的なトロンボプラスチン時間は実験の終わりの時点で
変化しておらず、またCBTも正常の範囲内であった。す
なわち、組織因子タンパク質の注入は正常なイヌにおい
て許容性が高く、播種性の血管内凝固を示すものは全く
見い出されなかった。
100U/kgである量の組織因子タンパク質を、麻酔した正
常なイヌに投与した。この動物でのCBT測定は注入の約
３分前に行なった。５分後にWBCTがやや減少したが15分
後には正常に復した。因子Ｖのレベルは、それぞれの注
入の30分後には正常であった。プロトロンビンおよび部
分的なトロンボプラスチン時間は実験の終わりの時点で
変化しておらず、またCBTも正常の範囲内であった。す
なわち、組織因子タンパク質の注入は正常なイヌにおい
て許容性が高く、播種性の血管内凝固を示すものは全く
見い出されなかった。
血友病Ａの長いCBTを特徴とする血友病のイヌに、組
織因子タンパク質100U/kgを投与した。CBTは注入の５分
および20分後に正常であった。組織因子タンパク質100U
/kgを用いた第２の実験ではCGRは20分後に正常となり、
CBTは90分後に幾分短くなった。90分の時点ではCBT効果
が再び遅延されており、プロ凝固作用は90分後までは維
持されない。
織因子タンパク質100U/kgを投与した。CBTは注入の５分
および20分後に正常であった。組織因子タンパク質100U
/kgを用いた第２の実験ではCGRは20分後に正常となり、
CBTは90分後に幾分短くなった。90分の時点ではCBT効果
が再び遅延されており、プロ凝固作用は90分後までは維
持されない。
医薬組成物 本発明の組織因子タンパク質産物と薬学的に許容し得
る担体ビヒクルとを混合することにより、本発明化合物
を既知の方法で有用な医薬組成物に製剤化することがで
きる。適当なビヒクルおよびその製剤は、レミントン
（Rmington）のファーマシューティカルサイエンス、E.
W.Martinに記載の如く、他のヒトタンパク質、例えばヒ
ト血清アルブミンを包含する。そのような組成物は、宿
主に効果的に投与するのに適した、薬学的に許容し得る
組成物を得るために、有効量の本発明化合物と適量のビ
ヒクルとを含有しているであろう。そのような組成物は
適当な期間中安定であり、ヒトへの投与に適合し得ると
ともに、製造が容易であることを要する。そのような組
成物の一例は、非経口投与のための溶液剤である。溶液
状の医薬製剤は直接の使用に適した液体形で提供される
が、そのような製剤はまた、凍結または凍結乾燥品の形
で提供され得る。前者の場合、組成物を使用前に解凍し
なければならない。後者の形は、広範な保存条件下での
組成物中の医薬成分の安定性を促進するために用いられ
る。そのような凍結乾燥製品は、使用前に適当な薬学的
に許容し得る希釈剤、例えば滅菌水または滅菌した生理
食塩水等を加えて再構成される。本発明の組織因子タン
パク質は、遺伝的または後天的に出血し易いことを特徴
とする種々の慢性出血性疾患のための凝固誘導性の治療
剤を得るために用いられる。そのような慢性出血性疾患
には、例えば、因子VIII、IX、またはXIの欠損症であ
る。後天的な異常の例として、血液凝固因子、即ち因子
VIII（von Willebrand因子）、IX、Ｖ、XI、XIIおよびX
IIIの阻害物質の獲得、凝固因子およびDICの合成低下を
もたらす肝疾患に起因する凝血異常、凝固因子の欠損お
よびDICをもたらす急性および慢性腎疾患に起因する出
血傾向、外傷または術後の出血、因子VIII（von Willeb
rand因子）およびフィブリノーゲンの増加を伴ったDIC
を発現する播種性悪性腫瘍の患者、および心肺手術中お
よび大量の輸血を受けている患者が含まれる。
る担体ビヒクルとを混合することにより、本発明化合物
を既知の方法で有用な医薬組成物に製剤化することがで
きる。適当なビヒクルおよびその製剤は、レミントン
（Rmington）のファーマシューティカルサイエンス、E.
W.Martinに記載の如く、他のヒトタンパク質、例えばヒ
ト血清アルブミンを包含する。そのような組成物は、宿
主に効果的に投与するのに適した、薬学的に許容し得る
組成物を得るために、有効量の本発明化合物と適量のビ
ヒクルとを含有しているであろう。そのような組成物は
適当な期間中安定であり、ヒトへの投与に適合し得ると
ともに、製造が容易であることを要する。そのような組
成物の一例は、非経口投与のための溶液剤である。溶液
状の医薬製剤は直接の使用に適した液体形で提供される
が、そのような製剤はまた、凍結または凍結乾燥品の形
で提供され得る。前者の場合、組成物を使用前に解凍し
なければならない。後者の形は、広範な保存条件下での
組成物中の医薬成分の安定性を促進するために用いられ
る。そのような凍結乾燥製品は、使用前に適当な薬学的
に許容し得る希釈剤、例えば滅菌水または滅菌した生理
食塩水等を加えて再構成される。本発明の組織因子タン
パク質は、遺伝的または後天的に出血し易いことを特徴
とする種々の慢性出血性疾患のための凝固誘導性の治療
剤を得るために用いられる。そのような慢性出血性疾患
には、例えば、因子VIII、IX、またはXIの欠損症であ
る。後天的な異常の例として、血液凝固因子、即ち因子
VIII（von Willebrand因子）、IX、Ｖ、XI、XIIおよびX
IIIの阻害物質の獲得、凝固因子およびDICの合成低下を
もたらす肝疾患に起因する凝血異常、凝固因子の欠損お
よびDICをもたらす急性および慢性腎疾患に起因する出
血傾向、外傷または術後の出血、因子VIII（von Willeb
rand因子）およびフィブリノーゲンの増加を伴ったDIC
を発現する播種性悪性腫瘍の患者、および心肺手術中お
よび大量の輸血を受けている患者が含まれる。
第１図は、内生経路による血液凝固の活性化を示す模式
図であり、第２図は、ヒト組織因子タンパク質のヌクレ
オチドおよびアミノ酸の配列図であり、第３図は、ヒト
組織因子タンパク質のcDNAおよび制限酵素部位を示すヌ
クレオチド配列の模式図であり、第４図は、哺乳動物宿
主細胞中で用いる完全な長さの組織因子タンパク質をコ
ードしている発現ベクターpCISTFの構築を示す工程図で
あり、第4a図は、pCIS2.8cシリーズのベクター構築の一
部を示す工程図であり、第５図は、組織因子のヒドロパ
シー（hydropathy）の模式図であり、第６図は、完全な
長さの組織因子タンパク質をコードしている発現ベクタ
ーpTF2A12の構築を示す工程図であり、第7a〜7c図は、
位置245にシステインの代わりに置換されたセリンを有
する組織因子タンパク質突然変異体の構築を示す工程図
であり、第8a〜8b図は、ヒト組織因子融合タンパク質の
発現ベクターの構築を示す工程図であり、第９図は、Co
s細胞における組織因子タンパク質の一時的な発現の色
素検定結果を示すグラフであり、第10図は、細胞質領域
を削除した組織因子タンパク質の発現ベクターの構築を
示す工程図である。
図であり、第２図は、ヒト組織因子タンパク質のヌクレ
オチドおよびアミノ酸の配列図であり、第３図は、ヒト
組織因子タンパク質のcDNAおよび制限酵素部位を示すヌ
クレオチド配列の模式図であり、第４図は、哺乳動物宿
主細胞中で用いる完全な長さの組織因子タンパク質をコ
ードしている発現ベクターpCISTFの構築を示す工程図で
あり、第4a図は、pCIS2.8cシリーズのベクター構築の一
部を示す工程図であり、第５図は、組織因子のヒドロパ
シー（hydropathy）の模式図であり、第６図は、完全な
長さの組織因子タンパク質をコードしている発現ベクタ
ーpTF2A12の構築を示す工程図であり、第7a〜7c図は、
位置245にシステインの代わりに置換されたセリンを有
する組織因子タンパク質突然変異体の構築を示す工程図
であり、第8a〜8b図は、ヒト組織因子融合タンパク質の
発現ベクターの構築を示す工程図であり、第９図は、Co
s細胞における組織因子タンパク質の一時的な発現の色
素検定結果を示すグラフであり、第10図は、細胞質領域
を削除した組織因子タンパク質の発現ベクターの構築を
示す工程図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ // Ａ６１Ｋ 38/00 ＡＣＡ Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＣＡ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 カレン・リン・ワイオン アメリカ合衆国カリフォルニア94030、 ミルブレイ、サンタ・バーバラ・アベニ ュー 663番 (56)参考文献 Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．260（20) ｐ．10917−10920（1985) Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．83（２）ｐ．299−302 （1986) Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ Ｒｅｓ．43 ｐ．275−286（1986）, Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ Ｒｅｓ．42 ｐ．635−643（1986）, (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 15/12 - 15/28 C12P 21/02 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (18)
- 【請求項１】以下の（ａ）および（ｂ）から選ばれる組
換え組織因子タンパク質： （ａ）以下のアミノ酸配列： で示されるタンパク質、 （ｂ）上記アミノ酸配列に１または数個のアミノ酸の置
換、削除、または挿入を施して得られるタンパク質であ
って、血液凝固を誘導し得るタンパク質。 - 【請求項２】以下の（ａ）および（ｂ）から選ばれる組
換え成熟組織因子タンパク質： （ａ）以下のアミノ酸配列： で示されるタンパク質、 （ｂ）上記アミノ酸配列に１または数個のアミノ酸の置
換、削除、または挿入を施して得られるタンパク質であ
って、血液凝固を誘導し得るタンパク質。 - 【請求項３】親水性アミノ酸残基で疎水性アミノ酸残基
が置換された組織因子タンパク質、システイン又はプロ
リンが他のいずれかのアミノ酸残基で置換された組織因
子タンパク質、電気的に正の側鎖を有する残基で電気的
に負の残基が置換された組織因子タンパク質、及び大き
な側鎖を有する残基で側鎖を有さない残基が置換された
組織因子タンパク質、からなる群から選ばれる請求項２
の組織因子タンパク質。 - 【請求項４】トランスメンブラン領域が欠失している請
求項２の組織因子タンパク質。 - 【請求項５】請求項２に記載のアミノ酸配列に於いて、
アミノ酸残基１〜219を有する請求項２の組織因子タン
パク質。 - 【請求項６】請求項２の（ａ）に記載のアミノ酸配列に
１または数個のアミノ酸の置換、削除、または挿入を施
して得られる請求項４または５のタンパク質であって、
血液凝固を誘導し得るタンパク質。 - 【請求項７】グリコシル化されていない請求項２の組織
因子タンパク質。 - 【請求項８】システイン残基が他のアミノ酸で置換され
ている請求項２の組織因子タンパク質。 - 【請求項９】タンパク質加水分解の可能性のある部位
が、そのアミノ酸をグルタミニル又はヒスチジル残基で
置換するか又はその塩基性残基の１つを削除することに
より削除されている、請求項２の組織因子タンパク質。 - 【請求項１０】以下の（ａ）および（ｂ）から選ばれる
組換え組織因子タンパク質をコードする核酸： （ａ）以下のアミノ酸配列： で示されるタンパク質、 （ｂ）上記アミノ酸配列に１または数個のアミノ酸の置
換、削除、または挿入を施して得られるタンパク質であ
って、血液凝固を誘導し得るタンパク質。 - 【請求項１１】以下の（ａ）および（ｂ）から選ばれる
組換え成熟組織因子タンパク質をコードする核酸： （ａ）以下のアミノ酸配列： で示されるタンパク質、 （ｂ）上記アミノ酸配列に１または数個のアミノ酸の置
換、削除、または挿入を施して得られるタンパク質であ
って、血液凝固を誘導し得るタンパク質。 - 【請求項１２】以下の核酸配列を有する請求項10の核
酸： - 【請求項１３】組織因子タンパク質が、トランスメンブ
ラン領域が欠失しているものである請求項12の核酸。 - 【請求項１４】組織因子タンパク質が、本質的にアミノ
酸残基１〜219のアミノ酸残基からなる請求項13の核
酸。 - 【請求項１５】組織因子タンパク質が、アミノ酸１〜21
9と263の間のアミノ酸までの配列を有するものである請
求項11の核酸。 - 【請求項１６】請求項10、11、または12の核酸を含んで
なる組換え発現ベクター。 - 【請求項１７】請求項16の組換え発現ベクターで形質転
換された細胞。 - 【請求項１８】哺乳動物である請求項17の細胞。
Applications Claiming Priority (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US1374387A | 1987-02-12 | 1987-02-12 | |
| US013743 | 1987-02-12 | ||
| US3540987A | 1987-04-07 | 1987-04-07 | |
| US035409 | 1987-04-07 | ||
| US15269888A | 1988-02-05 | 1988-02-05 | |
| US152698 | 1988-02-05 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63301797A JPS63301797A (ja) | 1988-12-08 |
| JP2869920B2 true JP2869920B2 (ja) | 1999-03-10 |
Family
ID=27359940
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63031693A Expired - Lifetime JP2869920B2 (ja) | 1987-02-12 | 1988-02-12 | 組織因子タンパク質を製造するためのデオキシリボ核酸 |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (2) | EP0787802B1 (ja) |
| JP (1) | JP2869920B2 (ja) |
| AT (2) | ATE298800T1 (ja) |
| AU (1) | AU617302B2 (ja) |
| DE (3) | DE3856580T2 (ja) |
| ES (2) | ES2068791T5 (ja) |
| GR (1) | GR3024263T3 (ja) |
| IE (1) | IE81149B1 (ja) |
| IL (1) | IL85411A (ja) |
| NZ (1) | NZ223506A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008504033A (ja) * | 2004-06-25 | 2008-02-14 | アルター・バイオサイエンス・コーポレーション | 植物に於ける組織因子の産生 |
Families Citing this family (37)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7084251B1 (en) | 1987-02-12 | 2006-08-01 | Genentech, Inc. | Methods and Deoxyribonucleic acid for the preparation of tissue factor protein |
| US6994988B1 (en) | 1987-02-12 | 2006-02-07 | Genetech, Inc. | Methods and deoxyribonucleic acid for the preparation of tissue factor protein |
| US5110730A (en) * | 1987-03-31 | 1992-05-05 | The Scripps Research Institute | Human tissue factor related DNA segments |
| US5223427A (en) * | 1987-03-31 | 1993-06-29 | The Scripps Research Institute | Hybridomas producing monoclonal antibodies reactive with human tissue-factor glycoprotein heavy chain |
| JPH02501263A (ja) * | 1987-06-12 | 1990-05-10 | マウント サイナイ スクール オブ メディシン オブ ザ シティー ユニバーシティー オブ ニューヨーク | ヒトの組織因子のクローニングと形質発現 |
| IL87172A (en) * | 1987-07-23 | 1994-12-29 | Univ Washington | A method of inhibiting the isolation of a purer tissue factor |
| US5336603A (en) * | 1987-10-02 | 1994-08-09 | Genentech, Inc. | CD4 adheson variants |
| US6710169B2 (en) | 1987-10-02 | 2004-03-23 | Genentech, Inc. | Adheson variants |
| NO892506L (no) * | 1988-06-17 | 1989-12-18 | Sinai School Medicine | Kloning og ekspresjon av human vevsfaktor. |
| ES2176174T3 (es) * | 1988-12-22 | 2002-12-01 | Genentech Inc | Procedimiento de preparacion de polipeptidos solubles en agua. |
| US5298599A (en) * | 1988-12-30 | 1994-03-29 | Oklahoma Medical Research Foundation | Expression and purification of recombinant soluble tissue factor |
| US5472850A (en) * | 1991-04-10 | 1995-12-05 | Oklahoma Medical Research Foundation | Quantitative clotting assay for activated factor VII |
| WO1990008956A1 (fr) * | 1989-02-02 | 1990-08-09 | Teijin Limited | Detection d'activateur de facteur tissulaire humain |
| US5314695A (en) † | 1990-11-13 | 1994-05-24 | Corvas International, Inc. | Tissue factor based prothrombin time reagent |
| US5374617A (en) * | 1992-05-13 | 1994-12-20 | Oklahoma Medical Research Foundation | Treatment of bleeding with modified tissue factor in combination with FVIIa |
| US5504064A (en) * | 1991-04-10 | 1996-04-02 | Oklahoma Medical Research Foundation | Treatment of bleeding with modified tissue factor in combination with an activator of FVII |
| US6749853B1 (en) | 1992-03-05 | 2004-06-15 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Combined methods and compositions for coagulation and tumor treatment |
| DE4240103A1 (de) * | 1992-05-26 | 1993-12-02 | Behringwerke Ag | Verfahren zur Inaktivierung von Viren in Präparationen von Proteinen |
| ATE202633T1 (de) * | 1994-04-28 | 2001-07-15 | Dade Behring Inc | Kalibrator für prothrombin-zeit-assays |
| US5696086A (en) * | 1994-11-03 | 1997-12-09 | Genentech, Inc. | Methods and kits using macrophage stimulating protein |
| CA2249206A1 (en) | 1996-04-01 | 1997-10-09 | Genentech, Inc. | Apo-2li and apo-3 apoptosis polypeptides |
| US6462176B1 (en) | 1996-09-23 | 2002-10-08 | Genentech, Inc. | Apo-3 polypeptide |
| CN100333796C (zh) | 1997-01-22 | 2007-08-29 | 德克萨斯州立大学董事会 | 凝血和肿瘤治疗的组织因子及其组合物 |
| US6342369B1 (en) | 1997-05-15 | 2002-01-29 | Genentech, Inc. | Apo-2-receptor |
| US6642433B1 (en) | 1997-05-15 | 2003-11-04 | Trillium Therapeutics Inc. | Fgl-2 knockout mice |
| EP0975361B1 (en) * | 1997-05-15 | 2006-09-20 | Trillium Therapeutics Inc. | Methods of modulating immune coagulation |
| DE19749259A1 (de) | 1997-11-07 | 1999-05-12 | Dade Behring Marburg Gmbh | Verfahren zur Herstellung von funktionalem rekombinantem Gewebsfaktor |
| CA2331789C (en) | 1998-07-13 | 2013-09-10 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Cancer treatment methods using therapeutic conjugates that bind to aminophospholipids |
| US6818213B1 (en) | 1998-07-13 | 2004-11-16 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Cancer treatment compositions comprising therapeutic conjugates that bind to aminophospholipids |
| DK1222854T3 (da) | 1999-10-01 | 2011-03-14 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Forebyggelse og behandling af sygdomme forbundet med blodkoagulering |
| DE60030323T2 (de) | 1999-12-24 | 2007-10-11 | Genentech, Inc., South San Francisco | Verfahren und verbindungen zur verlängerung der halbwertzeiten bei der ausscheidung von biowirksamen verbindungen |
| EP1757701A1 (en) | 1999-12-24 | 2007-02-28 | Genentech, Inc. | Methods and compositions for prolonging elimination half-times of bioactive compounds |
| US6703494B2 (en) | 2000-03-16 | 2004-03-09 | Genentech, Inc. | Anti-tissue factor antibodies with enhanced anticoagulant potency |
| US7087726B2 (en) | 2001-02-22 | 2006-08-08 | Genentech, Inc. | Anti-interferon-α antibodies |
| EP1409713B1 (en) | 2001-07-03 | 2013-03-20 | Oklahoma Medical Research Foundation | Assay for measuring factor viia-antithrombin complexes |
| US7164002B2 (en) | 2002-02-06 | 2007-01-16 | Genentech, Inc. | FVIIa antagonists |
| WO2008033890A2 (en) | 2006-09-12 | 2008-03-20 | Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. | Compositions containing alpha-1-antitrypsin and methods for use |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4663283A (en) | 1980-03-24 | 1987-05-05 | Genentech, Inc. | Method of altering double-stranded DNA |
| NZ201705A (en) | 1981-08-31 | 1986-03-14 | Genentech Inc | Recombinant dna method for production of hepatitis b surface antigen in yeast |
| NZ201918A (en) | 1981-09-18 | 1987-04-30 | Genentech Inc | N-terminal methionyl analogues of bovine growth hormone |
| NZ209307A (en) * | 1983-08-30 | 1990-07-26 | Genentech Inc | Diagnostic product: antigenic peptide produced by recombinant dna techniques |
| NZ209308A (en) | 1983-08-30 | 1991-08-27 | Genentech Inc | Vaccine against hsv involving a truncated membrane-free derivative of a membrane-bound protein |
| US4680262A (en) | 1984-10-05 | 1987-07-14 | Genentech, Inc. | Periplasmic protein recovery |
| JPH02501263A (ja) * | 1987-06-12 | 1990-05-10 | マウント サイナイ スクール オブ メディシン オブ ザ シティー ユニバーシティー オブ ニューヨーク | ヒトの組織因子のクローニングと形質発現 |
| DE10124940A1 (de) | 2001-05-21 | 2002-11-28 | Philips Corp Intellectual Pty | Netzwerk mit logischen Kanälen und Transportkanälen |
-
1988
- 1988-02-11 IE IE38088A patent/IE81149B1/en not_active IP Right Cessation
- 1988-02-12 ES ES88301190T patent/ES2068791T5/es not_active Expired - Lifetime
- 1988-02-12 EP EP97200009A patent/EP0787802B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-02-12 NZ NZ223506A patent/NZ223506A/xx unknown
- 1988-02-12 AT AT97200009T patent/ATE298800T1/de not_active IP Right Cessation
- 1988-02-12 AU AU11705/88A patent/AU617302B2/en not_active Expired
- 1988-02-12 EP EP88301190A patent/EP0278776B2/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-02-12 DE DE3856580T patent/DE3856580T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1988-02-12 JP JP63031693A patent/JP2869920B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1988-02-12 DE DE3855921T patent/DE3855921T3/de not_active Expired - Lifetime
- 1988-02-12 AT AT88301190T patent/ATE153696T1/de not_active IP Right Cessation
- 1988-02-12 IL IL8541188A patent/IL85411A/en not_active IP Right Cessation
- 1988-02-12 DE DE0278776T patent/DE278776T1/de active Pending
- 1988-02-12 ES ES97200009T patent/ES2244989T3/es not_active Expired - Lifetime
-
1997
- 1997-07-30 GR GR970401911T patent/GR3024263T3/el unknown
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０（２０）ｐ．１０９１７−１０９２０（１９８５） |
| Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８３（２）ｐ．２９９−３０２（１９８６） |
| Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ Ｒｅｓ．４２ ｐ．６３５−６４３（１９８６）， |
| Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ Ｒｅｓ．４３ ｐ．２７５−２８６（１９８６）， |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008504033A (ja) * | 2004-06-25 | 2008-02-14 | アルター・バイオサイエンス・コーポレーション | 植物に於ける組織因子の産生 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0787802B1 (en) | 2005-06-29 |
| GR3024263T3 (en) | 1997-10-31 |
| ES2068791T3 (es) | 1997-10-01 |
| IL85411A0 (en) | 1988-07-31 |
| EP0278776B2 (en) | 2004-04-14 |
| IL85411A (en) | 1994-07-31 |
| DE3855921T2 (de) | 1998-01-15 |
| EP0787802A2 (en) | 1997-08-06 |
| ATE153696T1 (de) | 1997-06-15 |
| ATE298800T1 (de) | 2005-07-15 |
| EP0278776A3 (en) | 1989-09-13 |
| AU1170588A (en) | 1988-08-18 |
| DE3855921D1 (de) | 1997-07-03 |
| DE3856580T2 (de) | 2006-05-24 |
| ES2244989T3 (es) | 2005-12-16 |
| AU617302B2 (en) | 1991-11-28 |
| IE81149B1 (en) | 2000-05-03 |
| DE278776T1 (de) | 1995-06-29 |
| EP0278776A2 (en) | 1988-08-17 |
| ES2068791T1 (es) | 1995-05-01 |
| EP0278776B1 (en) | 1997-05-28 |
| IE880380L (en) | 1988-08-12 |
| ES2068791T5 (es) | 2004-12-16 |
| EP0787802A3 (ja) | 1997-08-27 |
| JPS63301797A (ja) | 1988-12-08 |
| DE3856580D1 (de) | 2005-08-04 |
| DE3855921T3 (de) | 2005-03-10 |
| NZ223506A (en) | 1991-09-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2869920B2 (ja) | 組織因子タンパク質を製造するためのデオキシリボ核酸 | |
| Paborsky et al. | Purification of recombinant human tissue factor | |
| US5212071A (en) | Nucleic acids encoding a human C3b/C4b receptor (CR1) | |
| AU616672B2 (en) | Growth hormone receptor | |
| KR970002915B1 (ko) | 제ⅷ인자 활성을 가지는 신규한 단백질 : 유전공학-제조 세포를 사용하는 그의 제조방법 및 그것을 함유하는 의약 조성물 | |
| CA2067744C (en) | The human c3b/c4b receptor (cr1) | |
| CA1340866C (en) | Human c3b/c4b receptor (cr1) | |
| US5981481A (en) | Human C3b/C4b receptor (CR1) | |
| JPS63503275A (ja) | ファクター８：ｃの製造方法 | |
| JP3450844B2 (ja) | 第ＸＩＩＩａ因子及びその製造方法 | |
| EP0290516A1 (en) | Pulmonary hydrophobic surfactant-associated proteins | |
| EP0690126B1 (en) | Novel proteins with factor VIII activitiy: process for their preparation using genetically-engineered cells and pharmaceutical compositions containing them | |
| JP2757987B2 (ja) | ヒト抗‐炎症ホスホリパーゼ阻害蛋白 | |
| JP2004194664A (ja) | 新規ｐ−セレクチンリガンド蛋白 | |
| JPH0813839B2 (ja) | 組換え肺胞界面活性タンパク | |
| AU612572B2 (en) | Nucleic acid and methods for the synthesis of novel DAF compositions | |
| EP0307513A2 (en) | Pulmonary hydrophobic surfactant-associated proteins | |
| US7084251B1 (en) | Methods and Deoxyribonucleic acid for the preparation of tissue factor protein | |
| EP0196921A2 (en) | Recombinant human renin | |
| US6994988B1 (en) | Methods and deoxyribonucleic acid for the preparation of tissue factor protein | |
| US7049131B1 (en) | Methods and deoxyribonucleic acid for the preparation of tissue factor protein | |
| CA1341589C (en) | Methods and deoxyribonucleic acid for the preparation of tissue factor protein | |
| JP4256497B2 (ja) | 血管炎治療剤 | |
| JPH02142475A (ja) | ヒトの組織因子のクローニングと形質発現 | |
| WO1988009818A1 (en) | Growth hormone receptor |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080108 Year of fee payment: 9 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090108 Year of fee payment: 10 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term | ||
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090108 Year of fee payment: 10 |