ES2068791T5 - Metodos y acido desoxirribonucleico para la preparacion de la proteina del factor tisular. - Google Patents

Metodos y acido desoxirribonucleico para la preparacion de la proteina del factor tisular.

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Abstract

AISLADOS DE DNA QUE CODIFICAN PARA PROTEINA FACTOR DE TEJIDOS Y SUS DERIVADOS, Y METODOS PARA OBTENER TAL DNA Y PRODUCIR PROTEINA FACTOR DE TEJIDOS Y SUS DERIVADOS UTILIZANDO SISTEMAS DE EXPRESION RECOMBINANTES PARA USO EN COMPOSICIONES TERAPEUTICAS PARA EL TRATAMIENTO DE DESORDENES DE COAGULACION.

Description

Métodos y ácido desoxirribonucléico para la preparación de la proteína del factor tisular.
Esta invención se refiere a la preparación de ácido desoxirribonucléico (ADN) aislado que codifica para la producción de la proteína del factor tisular, a los métodos para obtener moléculas de ADN que codifican para la proteína del factor tisular, a la expresión de la proteína del factor tisular humano utilizando dicho ADN, así como a compuestos novedosos, incluyendo ácidos nucléicos novedosos que codifican para la proteína del factor tisular o fragmentos de la misma. Esta invención está asimismo dirigida a derivados de la proteína del factor tisular, concretamente a los derivados que carecen de la porción C-terminal próxima citoplásmica y/o hidrofóbica de la proteína, y a su producción mediante técnicas de recombinación de ADN.
El sangrado es una de las más serias y significativas manifestaciones de enfermedad. Este puede tener lugar en un sitio local o puede ser generalizado. La hemostasis primaria consta principalmente de dos componentes: vasoconstricción y formación del tapón de plaquetas. La formación del tapón de plaquetas puede ser dividida en varias fases: adherencia de las plaquetas a las superficies subendoteliales expuestas por el trauma; reacción de liberación de activación de las plaquetas; agregación de las plaquetas, que da como resultado el secuestro de plaquetas adicionales en el sitio, y la unión del fibrinógeno y las proteínas de coagulación a la superficie que da como resultado la formación de trombina; y, la fusión que es la coalescencia de la fibrina y las plaquetas fusionadas para formar un tapón hemostático estable.
La coagulación de la sangre realiza dos funciones: la producción de trombina que induce la agregación de las plaquetas y la formación de fibrina que vuelve estable el tapón de plaquetas. En el procedimiento de coagulación participan un número discreto de proenzimas y profactores, referidos como "factores de coagulación". El procedimiento consta de numerosas fases y termina con la formación de fibrina. El fibrinógeno es convertido en fibrina mediante la acción de la trombina. La trombina se forma mediante la proteolisis limitada de una proenzima, la protrombina. Esta proteolisis es efectuada por el factor X activado (referido como factor X_{a}) que se une a la superficie de las plaquetas activadas y, en presencia del factor V_{a} y de calcio iónico, escinde la protrombina.
La activación del factor X puede tener lugar mediante cualquiera de dos rutas separadas, la extrínseca o la intrínseca (Figura 1). La cascada intrínseca consta de una serie de reacciones en las que un precursor protéico es escindido para formar una proteasa activa. En cada etapa, la proteasa recién formada catalizará la activación de la proteasa precursora en la siguiente etapa de la cascada. Una deficiencia en cualquiera de las proteínas de la ruta bloquea el procedimiento de activación en esa etapa, evitando de ese modo la formación del coágulo y da lugar típicamente a una tendencia a la hemorragia. Las deficiencias en el factor VIII o IX, por ejemplo, causan los síndromes de sangrado graves de la hemofilia A y B, respectivamente. En la ruta extrínseca de la coagulación de la sangre, el factor tisular, también referido como tromboplastina tisular, es liberado de las células dañadas y activa el factor X en presencia del factor VII y calcio. Aunque se creía que la activación del factor X era la única reacción catalizada por el factor tisular y el factor VII, se sabe ahora que existe un bucle de amplificación entre el factor X, el factor VII, y el factor IX (Osterud, B., y S.I. Rapaport, Proc. Natl. Acad. Sci. [USA] 74:5260-5264 [1977]; Zur, M. et al., Blood 52: 198 [1978]). Cada una de las serina proteasas de este esquema es capaz de convertir mediante proteolisis las otras dos en la forma activada, amplificando de ese modo la señal en esta fase del procedimiento de coagulación (Figura 1). Se cree ahora que la ruta extrínseca puede ser en realidad la ruta fisiológica principal de la coagulación de la sangre (Haemostasis 13:150-155 [1983]). Puesto que el factor tisular no se encuentra normalmente en la sangre, el sistema no coagula continuamente; el desencadenante de la coagulación sería por lo tanto la liberación del factor tisular del tejido dañado.
Se cree que el factor tisular es una glicoproteína integrante de la membrana que, como se ha discutido antes, puede desencadenar la coagulación de la sangre vía la ruta extrínseca (Bach, R. et al., J. Biol. Chem. 256[16]: 8324-8331 [1981]). El factor tisular consta de un componente proteico (previamente definido como factor tisular apoproteína-III) y un fosfolípido. Osterud, B. y Rapaport, S.I., Proc. Natl. Acad. Sci. 74, 5260-5264 (1977). El complejo ha sido descubierto en las membranas de los monocitos y diferentes células de la pared de los vasos sanguíneos (Osterud, B., Scand. J. Haematol. 32: 337-345 [1984]). Se ha informado que el factor tisular de diversos órganos y especies tiene una masa molecular relativa de 42.000 a 53.000. Se ha descrito que la tromboplastina tisular humana consta de una proteína del factor tisular insertada en una bicapa de fosfolípidos en una proporción óptima de proteína del factor tisular:fosfolípido de aproximadamente 1:80 (Lyberg, T. and Prydz, H., Nouv. Rev. Fr. Hematol. 25(5): 291-293 [1983]). Se ha informado sobre la purificación del factor tisular a partir de diferentes tejidos tales como,: cerebro humano (Guha, A. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 83: 299-302 [1986] and Broze, G.H. et al., J. Biol. Chem. 260[20]: 10917-10920 [1985]); cerebro bovino (Bach, R. et al., J. Biol. Chem. 256: 8324-8331 [1981]): placenta humana (Bom, V.J.J. et al., Thrombosis Res. 42:635-643 [1986]; y, Andoh, K. et al., Thrombosis Res. 43:275-286 [1986]); cerebro ovino (Carlssen E. et al., Thromb. Haemostas. 48[3], 315-319 [1982]); y, pulmón (Glas, P. and Astrup, T., Am. J. Physiol. 219, 1140-1146 [1970]). Se ha demostrado que la tromboplastina tisular bovina y humana son idénticas en tamaño y función (ver Broze, G.H. et al., J. Biol. Chem. 260[20], 10917-10920 [1985]). Es ampliamente aceptado que si bien existen diferencias en la estructura de la proteína del factor tisular entre especies no existen diferencias funcionales medidas mediante análisis de coagulación in vitro (Guha et al. supra). Además, el factor tisular aislado de diferentes tejidos de un animal, v.g. cerebro, pulmón, arterias y venas de perro era similar en ciertos aspectos tales como, el coeficiente de extinción, el contenido en nitrógeno y fósforo y la proporción óptima de fosfolípidos a lípidos pero difería ligeramente en el tamaño molecular, el contenido en aminoácidos, la reactividad con anticuerpos y la vida media en el plasma (Gonmori, H. and Takeda, Y., J. Physiol. 299[3], 618-626 [1975]). Todos los factores tisulares de los diferentes órganos de perro mostraban actividad coagulante en presencia de lípidos. Idem. Es ampliamente aceptado que para mostrar actividad biológica, el factor tisular debe estar asociado a fosfolípidos in vitro (Pitlick, F.A., and Nemerson, Y., Biochemistry 9: 5105-5111 [1970] and Bach, R. et al. supra. en 8324). Se ha demostrado que la eliminación del componente fosfolipídico del factor tisular, por ejemplo mediante la utilización de una fosfolipasa, da como resultado una pérdida de su actividad biológica in vitro (Nemerson, Y., J.C.I. 47: 72-80 [1968]). La relipidación puede restaurar la actividad del factor tisular (Pitlick, F.A. and Nemerson, Y., supra y Freyssinet, J.M. et al., Thrombosis and Haemostasis 55: 112-118 [1986]). Han sido determinadas las secuencias amino terminales del factor tisular (Bach, R. et al., Am. Heart Assoc. [Nov., 1986], Morrisey, J.H. et al., Am. Heart Assoc. [Nov., 1986] y un fragmento peptídico CNBr (Bach, R. et al. supra).
Durante mucho tiempo se creyó que la infusión de factor tisular comprometía la hemostasis normal. En 1834 el médico Francés de Blainville estableció primero que el factor tisular contribuía directamente a la coagulación sanguínea (de Blainville, H. Gazette Medicale Paris, Series 2, 524 [1834]). Asimismo, de Blainville observó que la infusión intravenosa de una suspensión de tejido cerebral causaba la muerte inmediata que él observó se correspondía con un estado hipercoagulativo que daba origen a coágulos de sangre diseminados extensivamente encontrados en la autopsia. En la actualidad es bien aceptado que la infusión intravenosa de tromboplastina tisular induce la coagulación intravascular y puede causar la muerte en varios animales (Perros: Lewis, J. and Szeto I.F., J. Lab. Clin. Med. 60: 261-273 [1962]; conejos: Fedder, G. et al., Thromb. Diath. Haemorrh. 27: 365-376 [1972]; ratas: Giercksky, K.E. et al., Scand. J. Haematol. 17: 305-311 [1976]; y, ovejas: Carlsen, E. et al., Thromb. Haemostas. 48: 315-319 [1982]).
Aunque el aislamiento del factor tisular ha sido descrito en la literatura como se ha mostrado antes, la estructura precisa de la proteína del factor tisular no ha sido previamente establecida. Si bien ciertas cantidades de proteína del factor tisular "purificado" han estado disponibles puesto que se obtienen de diferentes tejidos, la baja concentración de proteína del factor tisular en la sangre y los tejidos y el elevado coste, tanto económico como de esfuerzo, de purificar la proteína de los tejidos hacen de esta una sustancia poco frecuente. Un objeto de la presente invención es aislar el ADN que codifica para la proteína del factor tisular y producir cantidades útiles de proteína del factor tisular humano utilizando técnicas de recombinación. Un objeto adicional es preparar formas novedosas de la proteína del factor tisular. Este y otros objetos de esta invención se harán evidentes a partir de la memoria como conjunto.
Los objetos de esta invención pueden ser completados mediante un método que comprende: identificar y clonar el ADNc que codifica para la proteína del factor tisular humano; incorporar ese ADNc a un vector de ADN recombinante; transformar un huésped apropiado con el vector que incluye ese ADN; expresar el ADN de la proteína del factor tisular humano en dicho huésped; y recuperar la proteína del factor tisular humano que se produce. De un modo similar, la presente invención hace posible producir la proteína del factor tisular humano y/o derivados de la misma mediante técnicas de recombinación, así como proporcionar productos y métodos afines a dicha producción de la proteína del factor tisular humano. El aislamiento y la identificación y la secuenciación del ADN de la proteína del factor tisular eran problemáticos. El ARNm era relativamente raro y hasta ahora no se conocía la secuencia de aminoácidos de la proteína del factor tisular.
La presente invención está dirigida a las composiciones y métodos para producir la proteína del factor tisular humano a través de técnicas de recombinación de ADN, incluyendo: 1) el aislamiento y la identificación de la secuencia de ADN completa de la proteína y la región 5' y 3' limítrofe de la misma; 2) la construcción de vehículos de clonación y expresión que comprenden dicha secuencia de ADN, permitiendo la expresión de la proteína del factor tisular humano, así como los conjugados con metionina, de fusión o señal del extremo N de los mismos; y 3) los cultivos celulares viables, alterados genéticamente en virtud de que contienen tales vehículos y capaces de producir la proteína del factor tisular humano. Esta invención está dirigida adicionalmente a composiciones de ADN y métodos para producir el ADN que codifica para la producción celular de la proteína del factor tisular humano. Otro aspecto más de esta invención son los nuevos compuestos, incluyendo las secuencias de ADN que se utilizan en la obtención de clones que codifican para la proteína del factor tisular. Esta invención está adicionalmente dirigida a derivados novedosos de la proteína del factor tisular, en concreto los derivados que carecen de la secuencia señal y la porción hidrofóbica de la proteína próxima al extremo C-terminal de la proteína que comprende la secuencia de aminoácidos que constituye el dominio de unión transmembrana o membrana de la proteína del factor tisular.
La utilidad de la proteína del factor tisular humano y los derivados de la misma de esta invención se basa en parte en la novedosa e inesperada observación de que la infusión en perros hemofílicos de la proteína del factor tisular, esto es la porción de proteína del factor tisular que carece de fosfolípidos de origen natural, que había sido previamente referida como apoproteína III del factor tisular y que se creía previamente que era inactiva, corregía la deficiencia hemostática. Por primera vez se descubrió que la proteína del factor tisular corregía la diatesis hemorrágica, es decir una tendencia a la hemorragia, asociada con la deficiencia en el factor VIII in vivo. Se podría esperar que la infusión de la proteína del factor tisular fuera ineficaz a la luz de las publicaciones de la técnica anterior que describen que el factor tisular tiene un requerimiento absoluto de fosfolípidos. En contraste con el trabajo de de Blainville y los posteriores investigadores en los siguientes ciento cincuenta y dos (152) años, también se descubrió que la proteína del factor tisular no era tóxica para los perros cuando era infundida intravenosamente.
La proteína del factor tisular humano y los derivados de la misma de esta invención son útiles en el tratamiento de diferentes alteraciones de sangrado crónicas, caracterizadas por una tendencia a la hemorragia, tanto heredada como adquirida. Entre los ejemplos de tales alteraciones del sangrado crónicas se encuentran las deficiencias en los factores VIII, IX, u XI. Entre los ejemplos de las alteraciones adquiridas se incluyen: los inhibidores adquiridos de los factores de coagulación de la sangre v.g. el factor VIII, el factor de von Willebrand, los factores IX, V, XI, XII y XIII; las alteraciones hemostáticas como consecuencia de una enfermedad del hígado que incluye el descenso de la síntesis de factores de coagulación y DIC; la tendencia a la hemorragia asociada a la enfermedad renal aguda y crónica que incluye deficiencias en el factor de coagulación y DIC; la hemostasis después de trauma o cirugía; pacientes con malignidad diseminada que se manifiesta en DIC con aumentos en los factores VIII, factor de von Willebrand y fibrinógeno; y hemostasis durante la cirugía cardiopulmonar y la transfusión sanguínea masiva. La proteína del factor tisular humano y los derivados de la misma de esta invención también pueden ser utilizados para inducir la coagulación en los problemas de sangrado agudos en pacientes normales y en aquellos con alteraciones de sangrado crónicas. Otros usos de la proteína del factor tisular se harán evidentes para los expertos en la técnica.
Breve descripción de las figuras
Fig. 1 Diagrama que muestra la activación de la coagulación sanguínea vía la ruta intrínseca.
Fig. 2 Secuencia de nucleótidos y aminoácidos de la proteína del factor tisular humano. La secuencia de nucleótidos de la proteína del factor tisular humano fue determinada a partir del análisis de la secuencia de ADN de un clon adiposo y en parte confirmada por otros clones de secuenciación. Los aminoácidos predichos de la proteína del factor tisular se muestran debajo de la secuencia de ADN y se numeran desde el primer residuo del extremo N-terminal de la secuencia de la proteína. Los números negativos de los aminoácidos hacen referencia a la secuencia señal líder supuesta o a la preproteína, mientras los números positivos hacen referencia a la proteína madura.
Figs. 3a-3c (Referidas colectivamente aquí como Fig. 3). ADNc de la proteína del factor tisular humano y sitios de la enzima de restricción.
Fig. 4 Construcción de un vector de expresión pCISTF que codifica la proteína del factor tisular en toda su longitud para la utilización en células de un huésped mamífero.
Fig. 4a Ilustra parte de la construcción de los vectores de la serie pCIS2.8c utilizados aquí.
Fig. 5 Perfil hidropático del factor tisular. La secuencia de ADN traducido del factor tisular humano fue trazada utilizando el algoritmo de Kyte and Doolittle, J. Mol. Biol., 157: 105 (1982). La abcisa muestra la secuencia de aminoácidos comenzando por el extremo amino maduro. Los puntos positivos de la ordenada indican regiones hidrofóbicas de la proteína; cada punto representa la hidropatía media de 6 aminoácidos sucesivos. En la parte inferior, N marca la localización de los sitios de glicosilación unidos a asparragina pronosticados y O marca el nicho de restos serina y treonina en los aminoácidos 160-172. El dominio que se extiende sobre la membrana hidrofóbica predicho abarca los restos 220-243 y se indica mediante una barra rellena.
Fig. 6 Construcción de un vector de expresión pTF 2A12 que codifica la proteína del factor tisular en toda su longitud.
Figs. 7a-c Las Figs. 7a-c son referidas aquí colectivamente como Fig. 7. Construcción de un mutante de la proteína del factor tisular que ttien una serina sustituida por una cisteína en la posición 245.
Figs. 8a-b Las Figs. 8a-b son referidas colectivamente aquí como Figura 8. Construcción de un vector de expresión para la proteína de fusión del factor tisular humano.
Fig. 9 Análisis cromogénico que resulta de la expresión transitoria de la proteína del factor tisular en células Cos.
Fig. 10 Construcción de un vector de expresión para la proteína del factor tisular con el dominio citoplásmico suprimido.
Descripción detallada
El término "proteína del factor tisular" utilizado aquí hace referencia a una proteína capaz de corregir diversas alteraciones del sangrado v.g. induciendo la coagulación, concretamente aquellas alteraciones asociadas con deficiencias en los factores de coagulación. La proteína del factor tisular es distinta del factor tisular o la tromboplastina tisular de la técnica anterior ya que carece de la porción lipídica de origen natural de la molécula. La proteína del factor tisular también incluye la proteína del factor tisular asociada con fosfolípidos cuyo lípido es distinto del lípido de origen natural asociado con la tromboplastina tisular y presenta la capacidad inductora de la coagulación sin la toxicidad concomitante observada con la proteína con los lípidos. La infusión de la proteína del factor tisular, definida aquí, no produce la coagulación intravascular diseminada. La capacidad de la proteína del factor tisular para corregir las diferentes alteraciones del sangrado es fácilmente determinada utilizando diferentes modelos de sangrado in vivo v.g. iniciación de la coagulación en perros hemofílicos utilizando la determinación del tiempo de sangrado de la cutícula (CBT) (Giles, A.R. et al., Blood 60:727-730 [1982]).
La secuencia de aminoácidos de la figura 2 es la de una proteína del factor pre-tisular. La proteína del factor pre-tisular puede ser expresada, por ejemplo, en procariotas, que no procesan ni secretan la proteína madura, transformando con un vector de expresión que comprende el ADN que codifica para la proteína del factor pre-tisular. Es preferible transformar células huésped capaces de completar dicho tratamiento con el fin de obtener la proteína del factor tisular madura en el medio de cultivo o periplasma de la célula huésped. Típicamente, las células huésped eucariotas superiores tales como las células de mamíferos son capaces de procesar la proteína del factor pre-tisular y de secretar la proteína del factor tisular madura durante la transformación con el ADN que codifica para la proteína del factor pre-tisular.
Alternativamente, la proteína del factor tisular madura secretada puede ser obtenida ligando el extremo 5' del ADN que codifica para la proteína del factor tisular madura al extremo 3' del ADN que codifica para una secuencia señal reconocida por la célula huésped. Para transformar células huésped se utiliza un vector de expresión que comprende las secuencias de ADN ligadas. La célula huésped tratará la fusión expresada escindiendo proteolíticamente el enlace peptídico entre la secuencia señal y el primer aminoácido de la proteína del factor tisular y secretando la proteína del factor tisular madura al periplasma de la célula huésped o al medio, dependiendo de la célula huésped en cuestión. Por ejemplo, al construir un vector de expresión procariota el líder secretor de la proteína del factor tisular humano, es decir los aminoácidos -32 a -1, es reemplazado por los líderes de la fosfatasa alcalina bacteriana o de la enterotoxina II térmicamente estable, y para la levadura el líder de la proteína del factor tisular es reemplazado por los líderes de la invertasa de la levadura, del factor alfa o de la fosfatasa ácida. Los organismos gram negativos transformados con una fusión de la proteína del factor tisular-señal homóloga secretarán la proteína del factor tisular madura al periplasma de la célula, mientras la levadura o Bacillus sp. secretarán la proteína del factor tisular madura al medio de cultivo.
En el alcance de la presente invención están incluidos los derivados desglicosilados o no glicosilados de tales proteínas del factor tisular, y las secuencias de aminoácidos biológicamente activas variantes de la proteína del factor tisular, incluyendo los alelos, y los derivados covalentes generados in vitro de las proteínas del factor tisular que muestran la actividad de la proteína del factor tisular.
Las variantes de la secuencia de aminoácidos de la proteína del factor tisular caen dentro de una o más de tres clases: variantes por sustitución, inserción o deleción. Entre las inserciones se incluyen las fusiones amino y/o carboxilo terminales así como las inserciones intrasecuencia de uno o múltiples restos aminoácido. Entre las proteínas de fusión del factor tisular se incluyen, por ejemplo, los híbridos de la proteína del factor tisular madura con polipéptidos que sean homólogos a la proteína del factor tisular, por ejemplo, en el caso de la proteína del factor tisular humano, los líderes secretores de otras proteínas humanas secretadas. Entre las proteínas de fusión del factor tisular también se incluyen los híbridos de la proteína del factor tisular con polipéptidos homólogos a la célula huésped pero no a la proteína del factor tisular, así como también, los polipéptidos heterólogos tanto a la célula huésped como a la proteína del factor tisular. Un ejemplo de tal proteína de fusión del factor tisular es la secuencia señal gD del herpes con la proteína del factor tisular madura. Las fusiones preferidas en el alcance de esta invención son las fusiones amino terminales o bien con péptidos procariotas o bien con péptidos señal de secuencias señal procariotas, de levadura, víricas o de la célula huésped. No es esencial que la secuencia señal esté desprovista de cualquier secuencia madura residual de la proteína cuya secreción dirige normalmente, pero esto es preferible para evitar la secreción de una fusión de proteínas del factor tisular.
También se pueden introducir inserciones en la secuencia codificadora madura de la proteína del factor tisular. Estas, sin embargo, serán normalmente inserciones más pequeñas que las de fusiones amino o carboxilo terminales, del orden de 1 a 4 restos. Un ejemplo representativo es la proteína del factor tisular [Arg_{135}Arg_{136}\rightarrowArg_{135}ProArg_{137}], una variante seleccionada por su resistencia a la hidrólisis con tripsina en el resto Arg_{135}. A menos que se afirme lo contrario, las variaciones de la proteína del factor tisular específicas aquí descritas son variaciones de la secuencia de la proteína del factor tisular madura; no son variantes de la proteína del factor pre-tisular.
Las variantes de la secuencia de aminoácidos por inserción de las proteínas del factor tisular son aquellas en las que se introducen uno o más restos aminoácido en un lugar predeterminado en la proteína del factor tisular diana. Muy comúnmente, las variantes por inserción son fusiones de proteínas o polipéptidos heterólogos al extremo amino o carboxilo de la proteína del factor tisular. Los derivados de la proteína del factor tisular inmunogénicos se elaboran fusionando un polipéptido suficientemente grande para conferir inmunogenicidad a la secuencia diana mediante entrecruzamiento in vitro o mediante recombinación de un cultivo celular transformado con el ADN que codifica la fusión. Tales polipéptidos inmunogénicos pueden ser polipéptidos bacterianos tales como trpLE, beta-galactosidasa y similares.
Las variantes por deleción se caracterizan por la eliminación de uno o más restos aminoácido de la secuencia de la proteína del factor tisular. Característicamente, se suprimen no más de aproximadamente 2 a 6 restos en cualquier sitio de la molécula de la proteína del factor tisular, si bien se emprenderá la deleción de los restos -31 a -1 inclusive para obtener la proteína del factor tisular-met, una variante adaptada a la expresión directa intracelular de la proteína del factor tisular-met madura. Otra variante por deleción es la del dominio transmembrana localizado a aproximadamente 220 a 242 restos de la molécula de la proteína del factor tisular.
Estas variantes generalmente se preparan mediante mutagénesis de sitio específico de los nucleótidos del ADN que codifica para la proteína del factor tisular, por lo que se produce el ADN que codifica para la variante, y después se expresa el ADN en el cultivo celular recombinante. No obstante, los fragmentos de la proteína del factor tisular variante que tienen hasta aproximadamente 100-150 restos pueden ser convenientemente preparados mediante síntesis in vitro. Las variantes muestran típicamente la misma actividad biológica cualitativa que el análogo de origen natural, aunque las variantes también se seleccionan con el fin de modificar las características de la proteína del factor tisular como se describirá mas completamente más abajo.
Si bien el sitio para introducir una variación en a secuencia de aminoácidos está predeterminado, la mutación per se no necesita ser predeterminada. Por ejemplo, con el fin de optimizar el funcionamiento de una mutación en un sitio dado, se puede realizar la mutagénesis al azar en el codon o la región diana y seleccionar la combinación óptima de actividad deseada de las variantes de la proteína del factor tisular expresadas. Las técnicas para realizar mutaciones por sustitución en sitios predeterminados del ADN que tiene una secuencia conocida son bien conocidas, por ejemplo la mutagénesis del cebador M13.
Las sustituciones de aminoácidos son típicamente de restos individuales; las inserciones serán normalmente del orden de aproximadamente 1 a 10 restos aminoácido; y las deleciones oscilarán de aproximadamente 1 a 30 restos. Las deleciones o inserciones se realizan preferiblemente en pares adyacentes, es decir una deleción de 2 restos o una inserción de 2 restos. Las sustituciones, deleciones, inserciones o cualquier combinación de las mismas pueden ser asociadas para llegar a un constructo final. Obviamente, las mutaciones que se realizarán en el ADN que codifica para la proteína del factor tisular variante no deben colocar la secuencia fuera del marco de lectura y preferiblemente no crearán egiones complementarias que puedan producir una estructura de ARNm secundaria (EP 75.444A).
Las variantes por sustitución son aquellas en las que al menos un resto de la secuencia de la Fig. 2 ha sido eliminado y en su lugar se ha insertado un resto diferente. Tales sustituciones se realizan generalmente conforme a la siguiente Tabla 1 cuando se desea modular finamente las características de la proteína del factor tisular.
TABLA 1
Resto original Sustituciones ejemplares
Ala ser
Arg lys
Asn gln; his
Asp glu
Cys ser
Gln asn
Glu asp
Gly pro
His asn; gln
Ile leu; val
Leu ile; val
Lys arg; gln; glu
Met leu; ile
Phe met; leu; tyr
Ser thr
Thr ser
Trp tyr
Tyr trp; phe
Val ile; leu
Se realizan cambios sustanciales en la función o la identidad inmunológica seleccionando sustituciones que son menos conservativas que las de la Tabla 1, es decir, seleccionando restos que difieran mas significativamente en su efecto sobre el mantenimiento (a) de la estructura del esqueleto polipeptídico en el área de la sustitución, por ejemplo como una conformación en lámina o helicoidal, (b) de la carga o la hidrofobicidad de la molécula en el sitio diana o (c) de la masa del cadena lateral. Las sustituciones que en general se espera que produzcan los cambios más grandes en las propiedades de la proteína del factor tisular serán aquellas en las que (a) un resto hidrofílico, v.g., serilo o treonilo, es sustituido por (o mediante) un resto hidrofóbico, v.g., leucilo, isoleucilo, fenilalanilo, valilo o alanilo; (b) una cisteína o prolina es sustituida por (o mediante) cualquier otro resto; (c) un resto que tenga una cadena lateral electropositiva, v.g., lisilo, arginilo, o histidilo, es sustituido por (o mediante) un resto electronegativo, v.g., glutamilo o aspartilo; o (d) un resto que tenga una cadena lateral voluminosa, v.g., fenilalanina, es sustituido por (o mediante) uno que no tenga cadena lateral, v.g., glicina.
Una clase principal de variantes por sustitución o deleción son aquellas que implican la región transmembrana, es decir, hidrofóbica o lipofílica, de la proteína del factor tisular. La región transmembrana de la proteína del factor tisular está localizada a aproximadamente 220 a 242 restos de la proteína codificada por el ADN de tejidos adiposos humanos. Esta región es un dominio altamente hidrofóbico o lipofílico que tiene el tamaño apropiado para abarcar la bicapa lipídica de la membrana celular. Se cree que ancla la proteína del factor tisular a la membrana celular.
La eliminación o sustitución de los dominios transmembrana facilitarán la recuperación y proporcionarán una forma soluble de la proteína del factor tisular recombinante reduciendo su afinidad celular o de los lípidos de la membrana y mejorando su solubilidad en agua de manera que no se requieran detergentes para mantener la proteína de factor tisular en solución acuosa. Preferiblemente, el dominio transmembrana es suprimido, en lugar de sustituido para evitar la introducción de epitopos potencialmente inmunogénicos. Una ventaja de la supresión del transmembrana de la proteína del factor tisular es que resulta más fácilmente secretada al medio de cultivo. Esta variante es soluble en agua y no tiene una afinidad apreciable por los lípidos de la membrana celular, simplificando de ese modo considerablemente su recuperación a partir del cultivo celular recombinante.
Las mutagénesis por sustitución o eliminación pueden ser empleadas para eliminar los sitios de glicosilación unidos a N o O (v.g. por eliminación o sustitución de restos asparraginilo en los sitios de glicosilación Asn-X-Thr), mejorar la expresión de la proteína del factor tisular o alterar la vida media de la proteína. Alternativamente, se puede producir una proteína del factor tisular no glicosilada en un cultivo celular procariota recombinante. Asimismo pueden ser deseables las deleciones o sustituciones de cisteína u otros restos lábiles, por ejemplo aumentando la estabilidad oxidativa o seleccionando la disposición del enlace disulfuro preferida de la proteína del factor tisular. Uno de tales ejemplos de sustitución de cisteína es la sustitución de una serina por la cisteína de la posición 245. Las eliminaciones o sustituciones de sitios de proteolisis potenciales, v.g. Arg Arg, se completa por ejemplo suprimiendo uno de los restos básicos o sustituyendo uno por restos glutaminilo o histidilo.
Se entiende que un producto aislado de ADN representa ADN, ADNc o ADN genómico sintetizado químicamente con o sin regiones 3' y/o 5' limítrofes. El ADN que codifica para la proteína del factor tisular se obtiene a partir de fuentes distintas de la humana a) obteniendo una genoteca de ADNc de la placenta, tejidos adiposos u otros que contengan ARNm de la proteína del factor tisular, tal como cerebro, del animal concreto, b) llevando a cabo el análisis de hibridación con ADN marcado que codifique para la proteína del factor tisular humano o fragmentos de la misma (normalmente, mayor de 100 pb) con el fin de detectar clones de la genoteca de ADNc que contengan secuencias homólogas, y c) analizando los clones mediante análisis con enzimas de restricción y secuenciación de ácidos nucléicos para identificar los clones en toda su longitud. Si en la genoteca no se encuentran presentes los clones en toda su longitud, se pueden recuperar fragmentos apropiados a partir de los diferentes clones utilizando la secuencia de ácido nucleico descrita por primera vez en la presente invención y ligar en los sitios de restricción comunes a los clones para ensamblar un clon en toda su longitud que codifique para la proteína del factor tisular.
Las modificaciones covalentes de la molécula de la proteína del factor tisular están incluidas en el alcance de la invención. Tales modificaciones se realizan haciendo reaccionar restos aminoácido diana de la proteína recuperada con un agente de derivación orgánica que sea capaz de reaccionar con las cadenas laterales o los restos terminales seleccionados. Alternativamente, se puede utilizar la modificación post-traduccional de las células huésped recombinantes seleccionadas para modificar la proteína. Los derivados covalentes resultantes son útiles como inmunógenos o para identificar restos importantes para la actividad biológica así como para alterar las características farmacológicas de la molécula, tales como la vida media, la afinidad de unión y similares, como sabría un artesano normalmente experto.
Ciertas derivaciones post-traduccionales son el resultado de la acción de células huésped recombinantes sobre el polipéptido expresado. Los restos glutaminilo y asparraginilo son frecuentemente desaminados post-traduccionalmente hasta los correspondientes restos glutamilo y aspartilo. Alternativamente, estos restos son desaminados en condiciones débilmente ácidas. Cualquiera de las formas de estos restos caen dentro del alcance de esta invención.
Entre otras modificaciones post-traduccionales se incluyen la hidroxilación de la prolina y la lisina, la fosforilación de los grupos hidroxilo de los restos serilo o treonilo, la metilación de los grupos \alpha-amino de las cadenas laterales de la lisina, la arginina y la histidina (T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco págs 79-86 [1983]), la acetilación del amino N-terminal y, en algunos casos, la amidación del carboxilo C-terminal.
Cuando se utiliza "forma esencialmente libre" o "esencialmente pura" para describir el estado de la proteína del factor tisular producido por la invención significa libre de proteína u otras sustancias normalmente asociadas con la proteína del factor tisular en su medio fisiológico in vivo como por ejemplo cuando se obtiene la proteína del factor tisular a partir de sangre y/o tejidos por extracción y purificación. Entre otras sustancias se incluyen los organismos infecciosos tales como, por ejemplo, el agente causante del síndrome de inmuno-deficiencia adquirida (SIDA). La proteína del factor tisular producida mediante el método de la presente invención tiene una pureza del 95% o mas.
En general, se utilizan procariotas para la clonación de secuencias de ADN en la construcción de los vectores útiles en la invención. Por ejemplo, es particularmente útil E. coli K12 cepa 294 (ATCC Núm. 31446). Entre otras cepas microbianas que se pueden utilizar se incluyen E. coli B y E. coli X1776 (ATCC Núm. 31537). Estos ejemplos son ilustrativos más que limitantes.
También se pueden utilizar procariotas para la expresión. También se pueden utilizar las cepas anteriormente mencionadas, así como E. coli W3110 (F^{-}, prototrófica, ATTC Núm. 27325), bacilos tales como Bacillus subtilis, y otras especies enterobacteriáceas tales como Salmonella typhimurium o Serratia marcescens, y diferentes especies de pseudomonas.
En general, se utilizan con estos huéspedes vectores plasmídicos que contienen promotores y secuencias de control que derivan de especies compatibles con la célula huésped. Generalmente el vector porta un sitio de replicación así como una o más secuencias marcadoras que son capaces de proporcionar la selección fenotípica en las células transformadas. Por ejemplo, E. coli es generalmente transformada utilizando un derivado de pBR322 que es un plásmido derivado de una especie de E. coli (Bolivar, et al., Gene 2: 95 [1977]). pBR322 contiene genes para la resistencia a la ampicilina y la tetraciclina y de ese modo proporciona medios fáciles para identificar las células transformadas. El plásmido pBR322, u otro plásmido microbiano también debe contener o ser modificado para contener promotores y otros elementos de control comúnmente utilizados en la construcción de ADN recombinante.
Entre los promotores adecuados para su utilización con huéspedes procariotas se incluyen ilustrativamente los sistemas promotores de la \beta-lactamasa y de la lactosa (Chang et al., "Nature", 275: 615 [1978]; y Goeddel et al., "Nature" 281: 544 [1079]), de la fosfatasa alcalina, el sistema promotor del triptófano (Goeddel "Nucleic Acids Res." 8: 4057 [1980] y Publicación de la Solicitud EPO Núm. 36.776) y los promotores híbridos tales como el promotor tac (H. de Boer et al., "Proc. Natl. Acad. Sci. USA" 80: 21-25 [1983]). No obstante, son adecuados otros promotores bacterianos funcionales. Sus secuencias de nucleótidos son generalmente conocidas, permitiendo así al experto en la técnica ligarlas operablemente al ADN que codifica para la proteína del factor tisular utilizando ligadores o adaptadores para suministrar cualquiera de los sitios de restricción requeridos (Sienbelist et al., "Cell" 20: 269 [1980]). Los promotores para utilizar en sistemas bacterianos también contendrán una secuencia Shine-Dalgarno (S.D.) operablemente unida al ADN que codifica para la proteína del factor tisular.
Además de procariotas, también se pueden utilizar microbios eucariotas tales como cultivos de levadura. El microorganismo eucariota más utilizado es Saccharomyces cerevisiae, o la levadura panadera común, aunque se encuentran comúnmente disponibles otras numerosas cepas. Para la expresión en Saccharomyces, se utiliza comúnmente el plásmido YRp7, por ejemplo, (Stinchcomb, et al., Nature 282: 39 [1979]; Kingsman et al., Gene 7: 141 [1979]; Tschemper et al., Gene 10: 157 [1980]). Este plásmido ya contiene el gen trp1 que proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura que carece de la capacidad para crecer en triptófano, por ejemplo ATCC núm. 44076 o PEP4-1 (Jones, Genetics 85: 12 [1977]). La presencia de lesión trp1 como característica del genoma de la célula huésped de levadura proporciona en ese caso un medio eficaz de selección mediante crecimiento en ausencia de triptófano.
Entre las secuencias promotoras adecuadas para su utilización con huéspedes de levadura se incluyen los promotores de la 3-fosfoglicerato quinasa (Hitzeman et al., "J. Biol. Chem." 225: 2073 [1980]) u otras enzimas glicolíticas (Hess et al., "J. Adv. Enzyme Reg." 7: 149 [1968[); y Holland, "Biochemistry" 17: 4900 [1978]), tales como la enolasa, la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, la hexoquinasa, la piruvato descarboxilasa, la fosfofructoquinasa, la glucosa-6-fosfato isomerasa, la 3-fosfoglicerato mutasa, la piruvato quinasa, la triosafosfato isomerasa, la fosfoglucosa isomerasa, y la glucoquinasa.
Otros promotores de la levadura, que son promotores inducibles que tienen la ventaja adicional de la transcripción controlada por las condiciones de crecimiento, son las regiones promotoras de la alcohol deshidrogenasa 2, el isocitocromo C, la fosfatasa ácida, las enzimas degradantes asociadas con el metabolismo del nitrógeno, la metalotioneína, la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, y las enzimas responsables de la utilización de maltosa y galactosa. Los vectores y promotores adecuados para su utilización en la expresión de la levadura se describen adicionalmente en R. Hitzeman et al., Publicación de la Patente Europea Núm. 73.657A. Los intensificadores de levadura también son ventajosamente utilizados con los promotores de la levadura.
Los promotores preferidos que controlan la transcripción de los vectores en células huésped de mamíferos pueden ser obtenidos a partir de diferentes fuentes, por ejemplo, los genomas de virus tales como: polioma, Virus 40 de Simios (SV40), adenovirus, retrovirus, virus de la hepatitis-B y la mayoría de los citomegalovirus, o a partir de promotores de mamíferos heterólogos, v.g. el promotor de la beta actina. Los promotores tempranos y tardíos del virus SV40 son convenientemente obtenidos como un fragmento de restricción de SV40 que también contiene el origen de replicación viral de SV40. Fiers et al., Nature, 273: 113 (1978). El promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano es convenientemente obtenido como un fragmento de restricción HindIII E. Greenaway, P.J. et al., Gene 18: 355-360 (1982). Por supuesto, los promotores de la célula huésped o especies afines también son útiles aquí.
La transcripción de un ADN que codifique para la proteína del factor tisular por eucariotas superiores es incrementada insertando una secuencia intensificadora en el vector. Los intensificadores son elementos de ADN que actúan en configuración cis, normalmente de 10 a 300pb, que actúan sobre un promotor para incrementar su capacidad de iniciación de la transcripción. Los intensificadores son relativamente independientes de la orientación y la posición habiéndose encontrado 5' (Laimins, L. et al., Proc, Natl. Acad. Sci. 78: 993 [1981]) y 3' (Lusky, M.L., et al., Mol. Cell Bio. 3: 1108 [1983]) con respecto a la unidad de transcripción, dentro de un intrón (Banerji, J.L. et al., Cell 33: 729 [1983]) así como también dentro de la propia secuencia codificadora (Osborne, T.F., et al., Mol. Cell Bio. 4: 1293 [1984]). En la actualidad se conocen muchas secuencias intensificadoras de genes de mamíferos (globina, elastasa, albúmina, \alpha-fetoproteína e insulina). No obstante, típicamente, se utilizará un intensificador de un virus de una célula eucariota. Entre los ejemplos se incluyen el intensificador de SV40 en el lado tardío del origen de replicación (100-270pb), el intensificador del promotor temprano de citomegalovirus, el iintensificador de polioma del lado tardío del origen de replicación, y los intensificadores de adenovirus.
Los vectores de expresión utilizados en células huésped eucariotas (células nucleadas de levadura, hongos, insectos, plantas, animales o humanos) también pueden contener secuencias necesarias para la terminación de la transcripción que pueden afectar la expresión del ARNm. Estas regiones son transcritas como segmentos poliadenilados en la porción no traducida del ARNm que codifica para la proteína del factor tisular. En las regiones 3' no traducidas también se incluyen los sitios de terminación de la transcripción.
Los vectores de expresión pueden contener un gen de selección, también denominado un marcador seleccionable. Entre los ejemplos de los marcadores seleccionables adecuados para células de mamíferos se encuentran la dihidrofolato reductasa (DHFR), la timidina quinasa o la neomicina. Cuando tales marcadores seleccionables son transferidos con éxito a una célula huésped de mamífero, la célula huésped de mamífero transformada puede sobrevivir si se coloca a presión selectiva. Existen dos categorías distintas ampliamente utilizadas de regímenes selectivos. La primera categoría se basa en el metabolismo de la célula y la utilización de una línea celular mutante que carece de la capacidad para crecer independientemente de un medio suplementado. Dos ejemplos son: las células CHO DHFR^{-} y las células LTK^{-} de ratón. Estas células carecen de capacidad para crecer sin la adición de nutrientes tales como la timidina o la hipoxantina. Debido a que estas células carecen de ciertos genes necesarios para una ruta de síntesis de nucleótidos completa, no pueden sobrevivir a menos que los nucleótidos ausentes sean suministrados en un medio suplementado. Una alternativa al medio suplementado es introducir un gen DHFR o TK intacto en las células carentes de los genes respectivos, alterando de ese modo sus requerimientos de crecimiento. Las células individuales que no fueron transformadas con el gen DHFR o TK no serán capaces de sobrevivir en medios no suplementados.
La segunda categoría es la selección dominante que hace referencia a un esquema de selección utilizado en cualquier tipo de célula y no requiere la utilización de una línea celular mutante. Estos esquemas utilizan típicamente un fármaco para atajar el crecimiento de una célula huésped. Aquellas células que tienen un gen novedoso expresarían una proteína que transmitiría resistencia al fármaco y subsistiría a la selección. Los ejemplos de dicha selección dominante utilizan los fármacos neomicina, Southern P. and Berg, P., J. Molec. Appl. Genet. 1: 327 (1982), ácido micofenólico, Mulligan, R.C. and Berg, P. Science 209: 1422 (1980) o higromicina, Sugden, B. et al., Mol. Cell. Biol. 5: 410-413 (1985). Los tres ejemplos dados antes emplean genes bacterianos bajo control eucariota para transmitir resistencia al fármaco apropiado G418 o neomicina (geneticina), xgpt (ácido micofenólico) o higromicina, respectivamente.
La "amplificación" hace referencia al incremento o replicación de una región aislada dentro del ADN cromosómico de la célula. La amplificación se consigue utilizando un agente de selección v.g. metotrexato (MTX) que inactiva la DHFR. La amplificación o la realización de sucesivas copias del gen DHFR da como resultado mayores cantidades de DHFR produciéndose en presencia de mayores cantidades de MTX. La presión de amplificación es aplicada a pesar de la presencia de DHFR endógena, añadiendo cantidades siempre mayores de MTX al medio. La amplificación de un gen deseado puede ser lograda mediante cotransfección de una célula huésped de mamífero con un plásmido que tenga un ADN que codifique para una proteína deseada y el gen de la DHFR o de la amplificación que permita la cointegración. Se asegura que la célula requiere más DHFR, cuyo requerimiento es satisfecho mediante la replicación del gen selectivo, seleccionando solamente las células que puedan crecer en presencia de una concentración de MTX siempre mayor. Con tal que el gen que codifica para la proteína heteróloga deseada tenga cointegrado el gen de selección la replicación de este gen da lugar a la replicación del gen que codifica para la proteína deseada. El resultado es que el aumento de copias del gen, es decir un gen amplificado, que codifica para la proteína heteróloga deseada expresa más que la proteína heteróloga deseada.
Entre las células huésped adecuadas preferidas para expresar los vectores de esta invención que codifican para la proteína del factor tisular en eucariotas superiores se incluyen: la línea CV1 de riñón de mono transformada con SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); la línea de riñón embrionario humano (293, Graham, F.L. et al. J. Gen Virol. 36: 59 [1977]); células de riñón de cría de hámster (BHK, ATCC CCL 10); células de ovario de hámster chino-DHFR (CHO, Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 77: 4216, [1980]); células de sertoli de ratón (TM4, Mather, J.P., Biol. Reprod. 23: 243-251 [1980]); células de riñón de mono (CV1 ATCC CCL 70); células de riñón de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); células de riñón canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de hígado de rata búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); células de hígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51); y, células TRI(Mather, J.P. et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383: 44-68[1982]).
La "transformación" representa introducir ADN en un organismo de manera que el ADN sea replicable, o bien como elemento extracromosómico o bien mediante integración cromosómica. A menos que se indique lo contrario, el método utilizado aquí para la transformación de las células huésped es el método de Graham, F. y van der Eb, A., Virology 52: 456-457 (1978). No obstante, también se pueden utilizar otros métodos para introducir ADN en las células tales como mediante inyección nuclear o mediante fusión de protoplastos. Si se utilizan células procariotas o células que contienen construcciones de pared celular sustanciales, el método preferido de transfección es el tratamiento con calcio utilizando cloruro de calcio como describen Cohen, F.N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 69: 2110 (1972).
En la construcción de vectores adecuados que contengan las secuencias codificadoras y de control deseadas se emplean técnicas de ligadura normalizadas. Los plásmidos aislados o los fragmentos de ADN son escindidos, adaptados, y religados en la forma deseada para formar los plásmidos requeridos.
Para el análisis para confirmar las secuencias correctas en los plásmidos construidos, se utilizan mezclas de ligadura para transformar E. coli K12 cepa 294 (ATCC 31446) y se seleccionan los transformantes con éxito mediante resistencia a la ampicilina o tetraciclina cuando resulta apropiado. Se preparan plásmidos a partir de los transformantes, se analizan mediante restricción y/o se secuencian mediante el método de Messing et al., Nucleic Acids Res. 9: 309 (1981) o mediante el método de Maxam et al., Methods in Enzymology 65: 499 (1980).
Las células huésped pueden ser transformadas con los vectores de expresión de esta invención y cultivadas en medios nutrientes convencionales modificados según sea necesario para inducir promotores, seleccionar transformantes o amplificar genes. Las condiciones de cultivo, tales como la temperatura, el pH y similares, son las utilizadas previamente con la célula huésped seleccionada para la expresión, y serán evidentes para el artesano normalmente experto.
La "transfección" hace referencia a la absorción de un vector por una célula huésped sean expresadas de hecho secuencias codificadoras cualesquiera. Numerosos métodos de transfección son conocidos por el artesano normalmente experto, por ejemplo, CaPO_{4} y la electroporación. La transfección fructuosa es reconocida generalmente cuando cualquier indicación de la operación de este vector tiene lugar dentro de la célula huésped.
Con el fin de facilitar la comprensión de los siguientes ejemplos se describirán ciertos métodos y/o términos que ocurren con frecuencia.
Los "plásmidos" son designados mediante una p minúscula precedida y/o seguida de letras mayúsculas y/o números. Aquí los plásmidos de partida o bien son asequibles comercialmente, asequibles públicamente en una base no restringida, o bien pueden ser construidos a partir de plásmidos asequibles conforme a procedimientos publicados. Además, se conocen en la técnica plásmidos equivalentes a los descritos y serán evidentes para el artesano normalmente experto.
La "digestión" del ADN hace referencia a la escisión catalítica del ADN con una enzima de restricción que actúa solamente en ciertas secuencias del ADN. Las diferentes enzimas de restricción utilizadas aquí son asequibles comercialmente y sus condiciones de reacción, cofactores y otros requerimientos fueron utilizados a discreción del artesano normalmente experto. Con fines analíticos, se utiliza típicamente 1 \mug de plásmido o fragmento de ADN con aproximadamente 2 unidades de enzima en aproximadamente 20 \mul de solución tampón. Con el fin de aislar los fragmentos de ADN para la construcción del plásmido, se digieren característicamente de 5 a 50 \mug de ADN con 20 a 250 unidades de enzima en un volumen mayor. Los tampones y las cantidades de sustrato apropiados para las enzimas de restricción concretas son especificados por el fabricante. Normalmente se utilizan tiempos de incubación de aproximadamente 1 hora a 37ºC, pero pueden variar conforme a las instrucciones del proveedor. Tras la digestión la reacción es sometida a electroforesis directamente sobre gel de poliacrilamida para aislar el fragmento deseado.
La "recuperación" o el "aislamiento" de un fragmento de ADN dado de un producto digerido con enzimas de restricción representa la separación del producto digerido sobre gel de poliacrilamida o agarosa mediante electroforesis, la identificación del fragmento de interés por comparación de su movilidad frente a la de los fragmentos de ADN marcadores de peso molecular conocido, la eliminación de la sección del gel que contiene el fragmento deseado, y la separación del gel del ADN. Este procedimiento es generalmente conocido (Lawn, R. et al., Nucleic Acids Res. 9: 6103-6114 [1981], y Goeddel, et al., Nucleic Acids Res. 8: 4057 [1980]).
La "desfosforilación" hace referencia a la eliminación de los fosfatos 5' terminales mediante tratamiento con fosfatasa alcalina bacteriana (FAB). Este procedimiento evita la "circularización" de los dos extremos escindidos mediante la restricción de un fragmento de ADN o la formación de un bucle cerrado que impediría la inserción de otro fragmento de ADN en el sitio de restricción. Los procedimientos y reactivos para la desfosforilación son los convencionales (Maniatis, T. et al., Molecular Cloning, 133-134 Cold Sprin Harbor, [1982]). Las reacciones que utilizan FAB se llevan a cabo en Tris 50 mM a 68ºC para suprimir la actividad de cualquiera de las exonucleasas que puedan estar presentes en las preparaciones de la enzima. Las reacciones se hicieron funcionar durante 1 hora. Después de la reacción el fragmento de ADN es purificado en gel.
La "ligadura" hace referencia al procedimiento de formación de enlaces fosfodiéster entre dos fragmentos de ácido nucleico de doble hebra (Maniatis, T. et al., Id. en 146). A menos que se estipule lo contrario, la ligadura puede ser completada utilizando tampones y condiciones conocidos con 10 unidades de ADN ligasa de T4 ("ligasa") por 0,5 \mug de cantidades aproximadamente equimolares de los fragmentos de ADN que van a ser ligados.
El "rellenado" o "enromamiento" hace referencia a los procedimientos por los cuales el extremo de una hebra del extremo cohesivo de un ácido nucleico escindido por una enzima de restricción es convertido en una doble hebra. Esto elimina el extremo cohesivo y forma un extremo romo. Este procedimiento es una herramienta versátil para convertir un extremo de corte por restricción que puede ser cohesivo con los extremos creados por una sola u otras varias enzimas de restricción en un extremo compatible con cualquier endonucleasa de restricción de corte romo u otro extremo cohesivo rellenado. Típicamente, el enromamiento se completa incubando 2-15 \mug del ADN diana en MgCl_{2} 10mM, ditiotreitol 1 mM, NaCl 50 mM, tampón Tris 10 mM (pH 7,5) a aproximadamente 37ºC en presencia de 8 unidades del fragmento de Klenow de la ADN polimerasa I y 250 \muM de cada uno de los cuatro desoxinucleósidos trifosfato. La incubación termina generalmente al cabo de 30 minutos de extracción con fenol y cloroformo y precipitación en etanol.
La proteína del factor tisular humano y su producto de expresión recombinante se obtienen conforme al siguiente protocolo:
1.
Se sintetizaron químicamente sondas de oligonucleótidos que representaban un único codon de elección para cada aminoácido correspondiente a la porción amino terminal de la proteína del factor tisular, y el fragmento peptídico CNBr.
2.
Se sintetizaron dos desoxioligonucleótidos complementarios a los codones de las secuencias de aminoácidos de la proteína del factor tisular, descritas más abajo, y se marcaron radiactivamente con ATP-P- ^{32}.
180
3.
Se construyeron genotecas de ADNc cebado con oligo (dT) en gt10.
4.
Se rastreó una genoteca de ADNc de placenta humana utilizando las sondas de oligonucleótidos sintetizadas químicamente. No se obtuvieron placas positivas utilizando la sonda de 60 meros (a). Se obtuvieron veintidós (22) placas positivas utilizando la sonda de 81 meros (b), la mitad de las cuales eran muy débilmente positivas. Las once (11) mejores fueron elegidas para volver a rastrear para la purificación de la placa. Se obtuvieron cinco placas positivas en el segundo rastreo. Se preparó el ADN para cada una de estas.
5.
Se aislaron clones que tenían un ADNc total de aproximadamente 2.800 pb del inserto de ADN. Se emprendieron la secuenciación y la caracterización de los clones placentarios. Puesto que el tamaño del ARNm sobre una mancha de Northern era de aproximadamente 2,35 Kb estos clones pueden tener contenidos intrones no separados por escisión. Por lo tanto se rastreó una genoteca adiposa humana.
6.
Se rastreó una genoteca adiposa humana cebada con oligo (dT) utilizando un fragmento EcoRI de 1.400 pb a partir de uno de los clones placentarios.
7.
Se aislaron clones que tenían un ADNc total de aproximadamente 2.350 pb (incluyendo 150 a 200 pb para la cola poliA) y 1.800 pb del ADN insertado. Se secuenciaron aquellos clones que contenían 2.350 pb y que se suponía que contenían todo el ARNm del factor tisular.
8.
Se construye el ADNc en toda su longitud que codifica para la proteína del factor tisular humano en un plásmido. Se deberá apreciar que el conocimiento de la secuencia del ADN completa de la Fig. 2 permite preparar sondas extremadamente largas que tienen una homología perfecta con el ADNc de la proteína del factor tisular humano, simplificando por lo tanto considerablemente y aumentando la eficacia del sondeo de genotecas de ADNc o genómicas de otras especies, y haciendo posible prescindir de la purificación de la proteína del factor tisular, de la secuenciación y de la preparación de reservas de sondas.
9.
Después se construye el ADNc que codifica para la proteína del factor tisular humano en un vehículo de expresión que se utiliza para transformar una célula huésped apropiada, que después se hace crecer en un cultivo para producir la proteína del factor tisular deseada.
10.
La proteína del factor tisular biológicamente activa que se produce según el procedimiento anterior tiene 263 aminoácidos.
Los siguientes ejemplos ilustran meramente el mejor modo contemplado en la actualidad para poner en práctica la invención, pero no deberá ser considerado limitante de la invención.
Ejemplo I Clonación del ADNc
El ADN que codifica para la proteína del factor tisular puede ser obtenido mediante síntesis química cuando se conoce la secuencia de ADN completa, rastreando los transcritos inversos de ARNm de diferentes tejidos, o rastreando genotecas genómicas de cualquier célula. Puesto que ni la secuencia completa de aminoácidos ni la de ADN de la proteína del factor tisular eran conocidas en el momento de esta invención, no era posible la síntesis química de la secuencia de ADN completa que codifica para la proteína del factor tisular.
Se preparó una genoteca de ADNc placentario humano como se ha descrito previamente (Ullrich, A. et al., Nature 309: 418-425 [1984]). Se preparó un ADNc de doble hebra a partir de ARN adiposo humano utilizando la transcriptasa inversa de un modo conocido y, tras tratamiento con ARNasa H de E. coli se utilizó ADN polimerasa I para sintetizar la segunda hebra y después se ligó a oligonucleótidos sintéticos que contenían sitios de restricción para SalI, SstI, XhoI y un extremo sobresaliente EcoRI, como se ha descrito previamente (Gubles, U. and Hoffman, B.J., Gene 25: 263 [1983]). Este ADN se insertó en el sitio EcoRI de gt10 (Huynh, T. et al., DNA Cloning Techniques [ed. Grover, D.][1984]).
Se diseñaron dos sondas de oligonucleótidos que representaban una posible elección de codon para cada aminoácido de la secuencia de aminoácidos N-terminal (60 nucleótidos) y la secuencia de aminoácidos interna próxima al C-terminal (81 nucleótidos) y se sintetizaron en base a las siguientes secuencias de aminoácidos presentadas en una reunión de la American Heart Association como se ha citado antes:
Amino terminal
19
Próximo al C-terminal
20
se obtuvieron clones de ADNc de la proteína del factor tisular utilizando las sondas de ADN primero para rastrear una genoteca de ADNc placentario humano. Se utilizó un fragmento EcoRI de 1.400 pb de un clon placentario para rastrear una genoteca de ADNc adiposo humano.
Se desarrollaron aproximadamente 1 millón de fagos a partir de la genoteca de ADNc placentario humano cebado con oligo(dT) en gt10 sobre veinticinco (25) placas de Petri de 15 cm a partir de los cuales se recogieron filtros de nitrocelulosa por triplicado. Los filtros fueron hibridados con cada una de las sondas de oligonucleótidos marcadas con el extremo marcado con P^{32} en NaCl 0,75 M, citrato trisódico 75 mM, fosfato de sodio 50 mM (pH 6,8), solución de Denhardt 5X, formamida al 20 por ciento, sulfato de dextrano al 10 por ciento y 0,2 g de ADN de esperma de salmón hervido, sometido a sonicación a 42ºC durante la noche y lavado durante 2 horas en NaCl 0,30 M, citrato trisódico 30 mM, NaDodSO_{4} a 42ºC. Se observaron veintidós (22) positivos duplicados de hibridación con los filtros hibridados con la sonda C-terminal próxima a la proteína del factor tisular. Se escogieron los once (11) mejores para la purificación en placa. La sonda amino terminal de la proteína del factor tisular no se hibridaba. En la purificación en placa cinco clones resultaron positivos. Se preparó ADN a partir de cada uno de estos y después se analizó mediante digestión con EcoRI. Un clon era más corto y parecía ser un clon parcial. Cuatro clones que resultaron ser idénticos en base a un producto digerido con EcoRI eran los mejores candidatos a clones con el ADNc en toda su longitud. Los fragmentos EcoRI de tres de los clones, el clon parcial y dos de los supuestos clones en toda su longitud, fueron subclonados en vectores del fago M13 para la secuenciación del ADN mediante la terminación de la cadena didesoxi (Messing, J. et al., Nucleic Acids Res. 9: 309-321 [1981]).
Se hibridó un fragmento EcoRI de 1.400 pb de un clon de ADNc placentario a una mancha de Northern a la que se había unido ARNm. Se determinó que el tamaño del ARNm de la proteína del factor tisular era de aproximadamente 2,35 kb en las muestras placentarias que resultaban positivas en el ensayo. Los clones de ADNc placentario tenían una longitud de aproximadamente 2.800 pb incluyendo los nucleótidos correspondientes a la cola poliA del ARNm. Estos clones eran aproximadamente 450 pb más largos que la longitud del ARNm observado sobre la mancha de Northern. Se observaron codones de terminación y codones de metionina en los tres marcos de lectura inmediatamente aguas arriba del ADN que codifica para el extremo amino de la proteína, sugiriendo la ausencia de una secuencia señal. La carencia de una secuencia señal inmediata a 5' de la secuencia que representa el extremo NH_{2} de la proteína madura en los clones placentarios fue confirmada mediante comparación con los clones adiposos descritos más abajo. Asimismo se determinó mediante comparación de las secuencias placentaria y adiposa que los clones placentarios contenían una secuencia interrumpida o intrón no presente en el clon adiposo. La presencia del intrón en el clon placentario sugiere un pobre mecanismo de empalme en la placenta haciendo del aislamiento y la clonación del ADN de la proteína del factor pre-tisular una tarea muy difícil.
Debido a la discrepancia de longitud entre los clones placentarios aislados y el ARNm determinado en el manchado de Northern, también se aisló el ADNc de la proteína del factor tisular a partir de una genoteca adiposa. Se eligió una genoteca de ADNc adiposo construida en gt10 debido a que el tejido adiposo tiene cantidades de ARNm del factor tisular comparables al tejido placentario. La genoteca fue rastreada utilizando un fragmento EcoRI de 1.400 pb de un clon placentario marcado radiactivamente con ATP-P- ^{32} en condiciones más rigurosas que las utilizadas para rastrear la genoteca placentaria. (Las condiciones anteriores fueron modificadas para utilizar formamida al 50% en la hibridación; y en el lavado NaCl 0,03 M, citrato trisódico 3mM, NaDodSO_{4} al 0,1 por ciento, a 60ºC). Se obtuvieron catorce dobles positivos de intensidades variables. Doce fueron elegidos para la purificación en placa. Al rastrear de nuevo para la purificación en placa, se obtuvieron 8 dobles positivos fuertes. Se preparó ADN a partir de cada uno de estos positivos. Cuatro de estos, que eran idénticos tras la digestión con EcoRI, eran los mejores candidatos para los clones con ADNc en toda su longitud. Uno de estos fue elegido para el análisis mediante secuenciación del ADN y marcado TF14. El tamaño de estos clones era de aproximadamente 2.350 pb, incluyendo la longitud de la cola poliA. Este era el mismo tamaño observado en la mancha de Northern descrita antes. Un quinto clon era más corto que los clones de 2.350 pb descritos antes.
Dos de los clones de ADNc adiposo eran más cortos que el ARNm en toda su longitud (aproximadamente 1.800 pb) y tenían patrones de digestión con EcoRI que eran claramente diferentes de los supuestos clones en toda su longitud. El análisis de estos clones indica que son clones parciales ya que incluyen el ADN correspondiente a una porción del ARNm de la proteína del factor tisular. El octavo clon tenía solo aproximadamente 850 pb y no fue elegido para su análisis adicional.
Ejemplo 2 Secuencia de ADN del ADNc de la proteína del factor tisular
La secuencia de nucleótidos del ADNc de la proteína del factor tisular se muestra en la Fig. 2. De los cuatro clones adiposos que tenían un patrón de digestión por EcoRI idéntico, uno fue secuenciado completamente y correspondía a la secuencia mostrada en la Figura 2. El clon TF14 contiene aproximadamente 2.217 pb de inserto, que incluye aproximadamente 90 nucleótidos de la cola poli(A) (que no está en la Fig. 2). La secuencia de ADNc contiene 99 pb de la secuencia 5' no traducida. El patrón de digestión por EcoRI del supuesto clon en toda su longitud comprendía tres fragmentos de aproximadamente 900, 750 y 650 pb. Un quinto clon parecía diferir en el patrón de digestión con EcoRI en el fragmento del extremo 5'. Dos de los clones adiposos tenían un patrón de digestión por EcoRI que indicaba que eran más cortos que los clones en toda su longitud pero todavía contenían un fragmento EcoRI más largo que cualquier fragmento de los clones en toda su longitud. Esto puede ser debido a un polimorfismo EcoRI o a la presencia de un intrón. El clon más largo fue secuenciado por completo. La integridad de la secuencia codificadora fue evaluada a partir de la presencia de un largo marco de lectura abierto que comenzaba con un codon de partida, ATG. Después del codon iniciador ATG están los codones para el líder hidrofóbico o la secuencia señal.
El extremo 5' del ADNc contiene un codon de iniciación ATG, para el aminoácido metionina, seguido de un marco de lectura abierto continuo que codifica para un polipéptido de 295 aminoácidos. Los primeros 32 restos aminoácido son en su mayor parte aminoácidos hidrofóbicos y probablemente representan un péptido señal amino-terminal. La secuencia amino-terminal que sigue corresponde a la secuencia de la proteína del factor tisular purificada del tejido. La secuencia de ADNc pronostica que la proteína del factor tisular madura contiene 263 aminoácidos con un peso molecular calculado de aproximadamente 29.500. Se sabe que la proteína del factor tisular es una glicoproteína de membrana con una masa molecular relativa de 42.000 a 53.000 en geles de poliacrilamida-DSS. La secuencia de ADN traducida pronostica cuatro (4) asparraginas unidas a los sitios de glicosilación. El perfil hidropático de la proteína (Fig. 5) revela que los tres primeros de estos sitios están localizados en regiones hidrofílicas, aumentando la probabilidad de que estén en la superficie de la proteína y en efecto glicosilados. Del mismo modo, un nicho de 7 de 13 restos (aminoácidos 160-172) que son o bien serina o bien treonina, indicando posibles sitios de glicosilación unida a O, asimismo yace en una región de carácter hidrofílico pronosticado. El perfil hidropático también revela un nicho desnudo de restos hidrofóbicos cerca del extremo carboxi (Fig. 5). Esta región, que abarca los aminoácidos 220-243, comprende probablemente el dominio de anclaje de la membrana del factor tisular. La búsqueda de las bases de datos de secuencias no revelaron una homología significativa del factor tisular con las secuencias disponibles. Notablemente, no había una homología marcada con el factor VIII, un cofactor de la proteína del factor IX de la proteasa de la coagulación. Esto resulta inesperado debido a que los complejos tanto de factor VIII-factor IX, como de factor tisular-factor VII catalizan la activación del factor X, y las proteasas de cada complejo (factor IX y VII) son altamente homólogas (F.S. Hagen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:2412 [1986] y Yoshitake et al., Biochemistry 24:3736 [1985]). Ahora se puede observar que estas interacciones no están reflejadas en una similitud de la secuencia de la proteína primaria de los dos cofactores.
La secuencia de ADNc implica que el factor tisular maduro es liberado por escisión con la peptidasa señal de un prepéptido sin tratamiento del propéptido adicional. Los 32 aminoácidos desde la metionina inicial al extremo amino maduro comienzan con una región cargada seguida de una secuencia "núcleo" hidrofóbica de 14 restos. El prepéptido termina en ala-gly-ala; ala-X-ala es la secuencia más frecuente que precede la escisión con la peptidasa señal (O. Perlman et al., Mol. Biol. 167:391 [1983]).
Se supone que el codon de la metionina en el nucleótido 100-102 (Figura 2) inicia la traducción de la proteína del factor pre-tisular. Los cinco nucleótidos precedentes y el que sigue a este ATG son elecciones comunes para los nucleótidos que circundan los sitios de iniciación de la traducción en el ARNm eucariota, aunque no se encuentran en completa identidad con el concensus descrito por Kozak, M., Nucl. Acids Res. 12:857 [1984]. Los clones de ADNc caracterizados parecen contener virtualmente la región 5' no traducida completa del mensaje.
El ADNc contiene una región 3' no traducida de 1.139 nucleótidos en la que la señal de poliadenilación común AATAAA precede a la cola poli(A) en 23 nucleótidos. Una característica de la región no traducida digna de notarse es la presencia de una secuencia repetida de la familia Alu de 300 pb. Existen aproximadamente 300.000 copias de la repetición Alu en el genoma humano, y numerosos ejemplos de su presencia en los intrones de los genes, donde son separados por empalme durante la maduración del ARNm (C.W. Schmid et al., Science 216:1065 [1982] y P.A. Sharp, Nature 301:471 [1983]). Aunque el ARNm poli(A)^{+} citoplásmico también contiene secuencias Alu, ha habido solamente dos informes específicos previos sobre secuencias similares a Alu en la secuencia 3' no traducida de los ARNm: en los antígenos de histocompatibilidad de clase 1 de ratón y rata, y en el receptor de la lipoproteína de baja densidad humano (L. Hood et al., Ann. Rev. Immunol. 1:529 [1983]; B. Majello et al., Nature 314:457 [1985] y T. Yamamoto et al., Cell 39:27 [1984]). Las secuencias Alu a menudo están flanqueadas por repeticiones directas cortas, como una consecuencia probable de su inserción en el genoma en las mellas de doble hebra alternadas. La secuencia Alu de la región 3' del ADNc del factor tisular está flanqueada por una repetición directa de 11 nucleótidos, como se indica mediante flechas en la Fig. 2.
Ejemplo 3 Expresión de la proteína del factor tisular humano huésped eucariota
El ADNc de la proteína del factor tisular humano en toda su longitud estaba contenido en el clon TF14 de ADNc. El ADNc en toda su longitud fue insertado en un plásmido de expresión que comprendía el intensificador y el promotor del citomegalovirus, el sitio donador del empalme y el intron de citomegalovirus, el intron de la región variable y el sitio aceptor del empalme de Ig, el sitio de poliadenilación y el sitio de terminación de la transcripción de SV40. La construcción del vector de expresión, mostrado en la Fig. 4, se emprendió como sigue.
El vector básico referido como pCIS2.8c26D utilizado aquí se basa en pF8CIS descrito en la Solicitud Europea Núm. 87308060.0 (Solicitud Estadounidense Núm. 07/071.674, presentada el 9 de Julio de 1987 y 06/907.185, presentada el 12 de Septiembre de 1986, Docket Núm. 373P1.
Como se muestra en la Figura 4a, un único nucleótido que precedía al sitio ClaI de pF8CIS fue cambiado de guanosina a timidina de manera que no se necesitara una cepa dam^{-} de E. coli para el corte en el sitio ClaI.
Se llevó a cabo una ligadura en tres partes que comprendía los siguientes fragmentos: a) el fragmento ClaI-SstII de 12.617 pb de pF8CIS (aislado a partir de una cepa dam^{-} y tratada con FAB); el fragmento SstII-PstI de 216 pb de pF8CIS; y c) un oligonucleótido sintético PstI-ClaI corto que se había tratado con quinasa (ver la Figura 4a, un asterisco indica el nucleótido cambiado). Esta ligadura en tres partes genera el vector de expresión pCIS2.8c24D que es idéntico al pCIS2.8c6D y pCIS2.8c28D en las porciones utilizadas para expresar el factor tisular.
Este vector fue modificado para separar la secuencia que codifica para el factor VIII mediante un producto digerido con ClaI-HpaI. La región fue sustituida por un poliligador para permitir sitios de clonación adicionales. La secuencia del poliligador utilizado se da más abajo.
21
Los sitios ClaI y HpaI del vector original son regenerados y se añadieron los sitios para las enzimas XbaI, XhoI, NotI. Este vector es denominado pCIS2.CXXNH. La región codificadora para el factor tisular fue subclonada a partir de TF14 utilizando el sitio SalI presente en la conexión 5' del vector y el ADNc y un sitio NcoI localizado 3' de la región codificadora en la porción no codificadora del ADNc. Se creó primero un extremo romo 3' mediante digestión con NcoI seguido de una reacción de rellenado que contenía la ADN polimerasa del fragmento de Klenow y los 4 dNTP. Cuando el ADN de TF14 era posteriormente cortado con SalI se creaba un fragmento de aproximadamente 1.232 pb con la secuencia sobresaliente TCGA en el extremo 5' y un extremo 3' romo que contenía la región codificadora del factor tisular. Este fue ligado en el vector pCIS2.CXXNH que había sido cortado con XhoI (rindiendo un saliente TCGA) y HpaI (romo). El nuevo vector fue marcado como pCIS.TF o alternativamente referido como pCISTF1.
Células de riñón embrionario humano (células 293) y células de riñón de mono (células Cos) fueron transfectadas con el vector de expresión pCIS.TF que contenía el ADNc de la proteína del factor tisular. A las 48 horas de la transfección las células fueron cosechadas y sometidas a ensayo para la actividad de la proteína del factor tisular mediante el análisis cromogénico descrito más abajo. Las células fueron separadas de las placas de 100 mm mediante suspensión en 1 ml de tampón fosfato de sodio 0,01 M, pH 7,0, que contenía NaCl 0,15 M. La absorbancia a 500 nM fue ajustada a 0,750 con el fin de ajustar la densidad celular diferencial sobre las placas. Las células fueron sometidas a sonicación durante 1 minuto y se añadió Triton X-100 hasta una concentración final del 0,1 por ciento. Las muestras fueron sometidas a rotación a la temperatura ambiente durante 90 minutos y los restos celulares separados por filtración a 10.000 x g. Se relipidaron los extractos solubilizados con detergente diluyendo 2 \mul de la muestra en 0,8 ml de Tris-HCl 0,05 M, pH 7,5, que contenía NaCl 0,1 M, seralbúmina bovina al 0,1 por ciento (tampón TBS). Se añadieron cincuenta \mul de una solución de 5 mg/ml de fosfatidilcolina (lecitina) en ácido desoxicólico al 0,25 por ciento y 25 \mul de CdCl_{2} y la solución se incubó durante 30 minutos a 37ºC.
Se sometió a ensayo la capacidad de la proteína del factor tisular recombinante para funcionar en un análisis cromogénico específico. Los resultados se muestran en la Fig. 9. Como se esperaba, se encontró que diversas concentraciones de tromboplastina de cerebro de conejo (factor tisular bruto) reaccionaban en el análisis. Las células de control Cos-7 (que contenían el vector de expresión de origen sin ADNc del factor tisular) tenía una actividad sólo ligeramente superior al blanco del análisis (con la adición de la mezcla relipidada sola) (Fig. 9). Las células transfectadas con el plásmido de expresión del factor tisular, en contraste, mostraban una fuerte reacción positiva en el análisis, demostrando por lo tanto, que el ADNc codifica para el factor tisular.
Ejemplo 4 Expresión de la proteína del factor tisular humano huésped procariota
El plásmido pTF2A12 fue diseñado para expresar la proteína del factor tisular madura en E. coli utilizando el promotor de la fosfatasa alcalina y la secuencia líder STII (Patente Estadounidense 4.680.262). Este plásmido fue construido como se muestra en la Figura 6, mediante la ligadura de cuatro fragmentos de ADN, el primero de los cuales era el dúplex del ADN sintético:
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El fragmento anterior codifica para los primeros 12 aminoácidos de la proteína del factor tisular madura. El segundo era un fragmento de restricción BbvI-EcoRI de 624 pares de bases de pCISTF, descrito antes, que codifica para los aminoácidos 13 a 216. El tercero era un fragmento EcoRI-BamHI de 518 pares de bases de pCISTF que codifica para los últimos 47 aminoácidos de la proteína del factor tisular. El plásmido pAPSTII HGH-1 (Patente Estadounidense 4.680.262) era digerido con NsiI BamHI de 930 pb para producir un fragmento.
Los cuatro fragmentos eran ligados entre sí para formar el plásmido pTF2A12, como se muestra en la Figura 6, y utilizados para transformar células de E. coli K12 cepa 294. Los transformantes fueron seleccionados mediante análisis de restricción y secuenciación didesoxi.
Las células de E. coli K12 cepa 294 que contenían los vectores de expresión fueron desarrolladas durante la noche a 29ºC en medios con bajo contenido en fosfato que contenían 50 \mug/ml de carbenicilina. Los sedimentos celulares de 1 ml de cultivo con una absorbancia de 1 a 600 nM fueron resuspendidos en 200 \mul de Tris-HCl 50 mM pH 7,5, NaCl 150 mM, Triton X-100 al 1%, 1 mg/ml de lisozima. Las suspensiones fueron sometidas a sonicación mediante pulsos durante 1 minuto seguido de centrifugación a 10.000 x g para separar los restos celulares. Se relipidaron los extractos solubilizados con detergente fueron diluyendo 10 \mul de la muestra en 8 ml de Tris-HCl 0,05 M pH 7,5 que contenía NaCl 0,1 M, seralbúmina bovina al 0,1% (tampón TBS). Se añadieron 50 \mul de una solución de 5 mg/ml de fosfatidilcolina en ácido desoxicólico al 0,25% y 25 \mul de CdCl_{2} y la solución se incubó durante 30 minutos a 37ºC.
La actividad del factor tisular fue detectada mediante análisis cromogénico como se describe más abajo.
Ejemplo 5 Expresión de un mutante de la proteína del factor tisular humano
El plásmido pTFII es diseñado para expresar una forma mutante madura de la proteína del factor tisular en E. coli. Esta mutación convierte la cisteína de la posición 245 de la proteína del factor tisular madura en serina. Los elementos de control de la expresión, el promotor de la fosfatasa alcalina y la secuencia líder STII son idénticos a los utilizados en la construcción del plásmido pTF2A12.
El plásmido TFIII se elaboró en tres etapas, las dos primeras de las cuales reconstruían el extremo carboxilo del gen. Los plásmidos pTF100-1 y pTR80-3 son los resultados de las dos primeras etapas.
El plásmido pTF100-1 fue construido a partir de tres fragmentos de ADN (ver la Fig. 7a). El primero es el vector de clonación pTrp14 (Patente Estadounidense Núm. 4.663.283) en el que se separa un fragmento EcoRI-XbaI no esencial (Figura 7). El segundo era un fragmento EcoRI-FokI de 32 pares de bases que codificaba para los aminoácidos 217 a 228 de la proteína del factor tisular madura. El tercer fragmento que codificaba para los aminoácidos 229-245 era un dúplex de ADN sintetizado químicamente en el que el codon TGT de la posición 245 se cambiaba por TCT (subrayado):
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Los tres fragmentos fueron ligados entre sí formando el plásmido pTF100-1 y transformados en E. coli K12 cepa 294. Los transformantes fueron seleccionados en cuanto a la resistencia a la ampicilina y el plásmido pTF100-1 fue seleccionado mediante análisis de restricción y secuenciación didesoxi.
El plásmido pTF80-3 fue construido a partir de dos fragmentos de ADN (Figura 7b). El primero era un vector plasmídico pHGH207 (Patente Estadounidense Núm. 4.663.283) en el que se había separado el fragmento XbaI-BamI de 930 pares de bases. El segundo era el dúplex de ADN de 68 meros sintetizado químicamente:
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Los dos fragmentos fueron ligados entre sí formando el plásmido pTF80-3 y transfectados en E. coli K12 cepa 294. Los transformantes fueron seleccionados en cuanto a la resistencia a la ampicilina y el plásmido pTF80-3 fue seleccionado mediante análisis de restricción y secuenciación didesoxi.
El plásmido pTFIII fue construido a partir de cuatro fragmentos de ADN (Figura 7c). El primero era el vector pAPSTIIHGH (Patente Estadounidense Núm. 4.680.262) en el que se había separado el fragmento NsiI-BamHI de 930 pares de bases. El segundo era un fragmento de restricción NsiI-EcoRI de 650 pares de bases de pTF2A12 (ver el Ejemplo 4 anterior) que codificaba para los aminoácidos 1 a 217 de la proteína del factor tisular madura. El tercero era un fragmento EcoRI-XbaI de 80 pares de bases de pTF100-1 que codificaba para los aminoácidos 218 a 245 de la proteína del factor tisular madura mutante. El cuarto era un fragmento XbaI-BamHI de 60 pares de bases de pTF80-3 que codificaba para los últimos 18 aminoácidos. Los cuatro fragmentos fueron ligados entre sí y transformados en E. coli K12 cepa 294. Los transformantes fueron seleccionados mediante su resistencia a la ampicilina y el plásmido pTFIII fue seleccionado mediante análisis de restricción.
Ejemplo 6 Expresión de una proteína de fusión del factor tisular humano
Se construyó una fusión con la secuencia señal del herpes gD (Publicación de la Patente Europea Núm. 0139416, publicada el 2 de Mayo, 1985) y la porción madura del ADNc del factor tisular humano utilizando los elementos de control del vector pRK7. pRK7 y pRK5 (ver más abajo) fueron construidos como sigue.
Construcción de pKR5 y pKR7
El plásmido de partida fue pCIS2.8c28D descrito antes. Los números base de los párrafos 1 a 6 hacen referencia a pCIS2.8c28D precediendo la base uno de la primera T del sitio EcoRI al promotor del CMV. El promotor temprano y el intron del citomegalovirus y el origen y la señal poliA de SV40 fueron colocados en plásmidos separados.
1. El promotor temprano de citomegalovirus fue clonado como un fragmento EcoRI de pCIS2.8c28D (9999-12-1) en el sitio EcoRI de pUC118 (Yanish-Perron et al. Gene 33:103 [1985]). Se eligieron doce colonias y se rastreó la orientación en la cual el ADN de hebra sencilla elaborado a partir de pUC118 permitiría la secuenciación desde el sitio EcoRI en 1.201 hasta el sitio EcoRI en 9999. Este clon fue denominado pCMVE/P.
2. Se elaboró un ADN de hebra sencilla a partir de pCMVE/P con el fin de insertar un promotor SP6 (Green M.R. et al., Cell 32:681-694 [1983]) mediante mutagénesis dirigida al sitio. Se utilizaron las secuencias de un 110 mero sintético que contenía el promotor SP6 (Ver Nucleic Acids Res. 12:7041 [1984] figura 1); del promotor SP6-69 a +5 junto con fragmentos de 18 pb de cualquier extremo del oligómero correspondiente a las secuencias de CMVE/P. La mutagénesis se realizó mediante técnicas normalizadas y se rastreó utilizando un 110 mero marcado con más o menos rigor. Se eligieron seis clones potenciales y se secuenciaron. Uno fue identificado como positivo y marcado pCMVE/PSP6.
3. El promotor SP6 fue examinado y demostró ser activo, por ejemplo, añadiendo ARN polimerasa de SP6 y examinando un ARN del tamaño apropiado.
4. Se elaboró un adaptador Cla-NotI-Sma para insertarlo desde el sitio ClI (912) al sitio SmaI de pUC118 en pCMVE/P (etapa 1) y pCMVE/PSP6 (etapa 2). Este adaptador fue ligado en el sitio ClaI-SmaI de pUC118 y se escogieron los clones correctos. El ligador fue secuenciado tanto en los clones marcados pCMVE/PSP6 como en los pCMVE/P-L.
5. Se cortó pCMVE/PSP6-L con SmaI (en la conexión ligador/pUC118) y HindIII (en pUC118). Se insertó un fragmento HpaI (5.573) a HindIII (6.136) de pSVORAA RI 11, descrito más abajo, en SmaI-HindIII de pCMVE/PSP6-L. Esta ligadura fue rastreada y se aisló un clon y se denominó pCMVE/PSP6-L-SVORAA RI.
a)
Se aisló el origen y la señal poliA de SV40 como un fragmento XmnI (5.475) - HindIII (6.136) de pCIS2.8c28D y se clonó en los sitios HindIII a SmaI de pUC119. Esto se denominó pSVORAA.
b)
El sitio EcoRI de 5.716 fue separado mediante digestión parcial con EcoRI y rellenado con Klenow. Las colonias obtenidas de la auto-ligadura tras el rellenado fueron rastreadas y el clon correcto fue aislado y denominado pSVORAA RI 11. El sitio EcoRI suprimido fue examinado mediante secuenciación y demostró ser correcto.
c)
Se aisló el fragmento HpaI (5.573) a HindIII (6.136) de psVORAA RI 11 y se insertó en pCMVE/PSP6-L (ver 4 anterior).
6. Se cortó pCMVE/PSP6-L-SVOrAA RI (etapa 5) con EcoRI en 9.999, se enromó y se auto-ligó. Se identificó un clon sin sitio EcoRI y se denominó pRK.
7. Se cortó pRK con SmaI y BamHI. Este se rellenó con Klenow y se religó. Las colonias fueron rastreadas. Se identificó una positiva y se denominó pRK Bam/Sma 3.
8. Se convirtió el sitio HindIII en un sitio HpaI utilizando un convertidor. (Un convertidor es un trozo de ADN utilizado para cambiar un sitio de restricción por otro. En este caso un extremo sería complementario a un extremo cohesivo HindIII y el otro extremo tendría un sitio de reconocimiento para HpaI.) Se identificó un positivo y se denominó pRK Bam/Sma, HIII-HpaI 1.
9. Se cortó pRK Bam/Sma, HIII-HpaI 1 con PstI y NotI y se ligaron allí un ligador RI-HIII y un ligador HIII-RI. Se encontraron clones para cada ligador. No obstante, también se determinó que habían entrado demasiados convertidores HpaI (dos o más convertidores generan un sitio PvuII). Por lo tanto, estos clones tenían que ser cortados con HpaI y auto-ligados.
10. Se cortaron el clon 3 RI-HIII y el clon 5 HIII-RI con HpaI, se diluyeron, y se auto-ligaron. Se identificaron los clones positivos. El clon RI-HIII fue denominado pRK5. Se cortó un clon HIII-RI con HpaI, se diluyó y se auto-ligó. Después de rastrear, se identificó un clon positivo y se denominó pRK7.
El vector pRK7 contiene el promotor y el intensificador de CMV y un donador de empalme, el intrón y el aceptor de empalme de Ig, el promotor de SP6, la señal poliA de SV40 y el origen de replicación de SV40; no tiene gen de la DHFR. La construcción del vector de expresión para la proteína del factor tisular se acometió como sigue: se clonó el ADNc de la proteína del factor tisular de TF14 en el sitio SalI de pSP64 y se marcó como pSP64TF (Promega Corporation, 1987). Se cortó pSP64 que contenía el ADNc del factor tisular con NcoI. Se ligó un convertidor de 18 meros que no había sido sometido a tratamiento con quinasa al extremo NcoI para cambiar el sitio NcoI a un sitio XbaI. La secuencia de los ligadores utilizados fue:
Ligador NcoI - XbaI 18 meros
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Después pSP64 fue digerido con BbvI y se aisló en gel un fragmento de 1.030 pb. Un ADN dúplex PvuII-BbvI de aproximadamente 100 pb que no había sido tratado con quinasa, contenía las secuencias del primer sitio de activación de la trombina del factor VIII y los primeros 12 aminoácidos de la proteína del factor tisular humano madura. La secuencia de los aproximadamente 100 pb era la siguiente:
Fusión factor tisular/trombina
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El fragmento PvuII-BbvI fue ligado al fragmento de aproximadamente 1.030 pb. Se aisló en gel un fragmento de aproximadamente 1.130 pb. Este fragmento PvuII-XbaI fue ligado después en un vector pSP64 marcado como pSP64ThTF. Se obtuvo un clon que se había secuenciado sobre el área que comprende el 100 mero sintético. Este plásmido fue digerido con PvuII y XbaI en un intento de aislar una gran cantidad del inserto. No obstante, el sitio XbaI no fue digerido. Por lo tanto, el inserto fue aislado en gel cortando con PvuII y SalI. El sitio SalI se encuentra en la parte restante del poliligador de pSP64 y localizado próximo al sitio XbaI. El segundo fragmento contenía la secuencia señal del herpes gD más algo de la región 5' no traducida que comprendía un fragmento de 275 pb obtenido a partir de pgD-DHFR (Publicación de la Patente Europea 0139417, publicada el 2 de Mayo de 1985), que es digerido con PstI-SacII y un fragmento sintético SacII-PvuII de 103 pb que tenía la siguiente secuencia:
Fragmento sintético SacII-PvuII (Líder HSVgD)
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El tercer segmento se obtuvo sometiendo a digestión pRK7 con PstI-SalI y aislando en gel un fragmento de aproximadamente 4.700 pb. En la ligadura final de las tres partes se utilizó: a) el fragmento PvuII-SalI que contenía el primer sitio de activación de la trombina 5' con respecto al ADNc que codificaba para la proteína del factor tisular; b) el fragmento PstI-PvuII que contenía la secuencia señal del herpes gD; y c) el fragmento pRK que contenía los elementos de control. Se obtuvieron los tres trozos descritos antes y los clones y se determinó que eran correctos mediante digestión con enzimas de restricción y secuenciación.
Células de riñón embrionarias humanas (293S) fueron transfectadas con el vector de expresión que contenía la proteína de fusión del factor tisular-herpes gD. A las 15 horas de la transfección transitoria se cosecharon células 293 humanas. El medio de cultivo se separa y se añaden 2 ml de tampón de extracción (Tris-HCl 5 mM); NaCl 150 mM:pH 7,5 [TBS] que contenía Triton X-100 al 0,1%) por placa de cultivo de tejidos de 100 mm. Las células son suspendidas y se hacen rotar (extremo sobre extremo) durante 45-60 minutos a 4ºC. El extracto es centrifugado a 8.000 x g durante 20 minutos y después directamente cargado sobre la columna de anticuerpo monoclonal (3,5 mg 5B6/ml de Sepharose activada con CNBr) a un ritmo de flujo de 0,8 ml/minuto. La preparación de un anticuerpo para el herpes-gD se describe en la Publicación de la Patente Europea Núm. 1.139.416, publicada el 2 de Mayo de 1985. La columna de anticuerpo se lava con 10 ml de tampón de extracción hasta hacer volver la Absorbancia (280 nm) a la línea base. Después la columna se lava con Tris-HCl 50 mM; NaCl 1 M; Triton X-100 al 0,1%, pH 7,5 y se hace eluir con glicina 0,1 M; NaCl 150 mM; Triton X-100 al 0,1%, pH 2. El pH se ajusta a neutralidad con Tris HCl 1 M, pH 8,5.
La porción gD de la proteína de fusión gD-factor tisular fue escindida de la proteína de fusión utilizando trombina. Se anclaron covalentemente 1.110 unidades de trombina (0,33 mg de proteína) a 0,5 ml de Sepharose activada con CNBr según las instrucciones del fabricante. Se incuban 5.000 unidades de la proteína de fusión gDTF con aproximadamente 150 \mul de trombina-Sepharose durante 90 minutos a 37ºC (rotados extremo sobre extremo). Después la trombina-Sepharose es separada por centrifugación.
La actividad del factor tisular fue detectada mediante análisis cromogénico como se describe más abajo.
Ejemplo 7 Expresión de la proteína del factor tisular con el dominio citoplásmico suprimido
Se construyó el vector pRKTF 244, como se muestra en la Figura 10, para expresar una proteína del factor tisular que carecía de dominio citoplásmico, aminoácidos 244 a 263. El vector fue construido mediante una ligadura de tres partes. La primera parte era un fragmento de 859 pb obtenido mediante digestión de pCISTF1 con EcoRI y ClaI. Los 859 pb fueron aislados en gel. La segunda porción fue aislada en gel después de la digestión con ClaI-BamHI de pRK5 como se ha descrito antes. La tercera parte era un 87 mero sintetizado químicamente EcoRI-BamHI que tenía la siguiente secuencia:
87 mero
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En la ligadura de las tres partes se utilizan: a) el fragmento de 859 pb que codifica para los aminoácidos 1-216; b) el fragmento de 4.700 pb de pRK5; y, c) el 87 mero que codifica para los aminoácidos 217-243. Este nuevo vector fue marcado como pRKTF 244 (ver la Figura 10).
Células de riñón embrionarias humanas (293) fueron transfectadas con el vector de expresión pRKTF 244. Al cabo de tres días, se purificó la proteína del factor tisular con el dominio citoplásmico suprimido como se describe y analiza en el análisis cromogénico descrito más abajo. El factor tisular con el dominio citoplásmico suprimido mostraba una fuerte reacción positiva en el análisis demostrando que la proteína del factor tisular con el dominio citoplásmico suprimido era eficaz en este análisis de coagulación in vitro.
Ejemplo 8 Purificación de la proteína del factor tisular
La proteína del factor tisular fue purificada utilizando la purificación por inmunoafinidad empleando un anticuerpo monoclonal IgG que se une a la proteína del factor tisular humano.
La proteína del factor tisular humano fue sintetizada en un cultivo recombinante como se ha descrito antes. Los siguientes inmunógenos fueron inyectados en un ratón BALB/c (29.1.C) según el programa descrito más abajo: proteína del factor tisular humano recombinante (rTF) (0,07 mg/ml con una actividad específica de 17.040 U/mg); proteína del factor tisular recombinante obtenida a partir de la fusión factor tisular-gD escindida mediante trombina para separar las secuencias herpes-gD del extremo amino terminal (rTF:gDThr) (0,72 mg/ml con una actividad específica de 4.687 U/mg) y la fusión factor tisular recombinante-herpes gD (rTF-gD) (aproximadamente 150.000 U/mg) con el siguiente programa de inmunización:
Día Ruta de administración Inmunógeno
1. subcutáneo (sc) 0,25 ml de r-TF en coadyuvante completo de Freund
14. mitad sc y mitad intraperitoneal (ip) 0,25 ml de r-TF:gD en coadyuvante completo de Freund
28. I.P. 0,25 ml de r-TF:gD en PBS
42. I.P. 0,25 ml de r-TF:gD en PBS
62. I.P. 0,25 ml de r-TF:gD en PBS
75. I.P. 0,25 ml de r-TF:gD en PBS
85. Intraesplénico 0,1 ml de r-TF:gDThr en PBS**
** 10-40 \mug/ml
El título anti-TF analizado mediante radio-inmuno-precipitación (RIP) y ELISA aumentaban gradualmente durante toda la inmunización hasta el día 85.
En el análisis de RIP se utilizaron 0,005 ml de sueros de ratones inmunizados y no inmunizados diluidos con 0,495 ml de PBSTA (PBS que contenía seralbúmina bovina al 0,5% [BSA] y Triton X-100 al 0,1%). Se añadieron 50.000 cpm de rTF-I^{125} y la mezcla se incubó durante 2 horas a la temperatura ambiente. El rTF-I^{125} que había formado complejo con el anticuerpo se hizo precipitar incubando durante 1 hora a la temperatura ambiente con 0,05 ml de bolitas de SPA. Las bolitas de SPA constaban de proteína A estafilocócica unida a bolitas de CL-4B de sefarosa que habían sido previamente incubadas con IgG anti-ratón de conejo y almacenadas en Tris 50 mM pH 8, MgCl_{2} 10 mM, BSA al 0,1% y NaN_{3} al 0,02%. Las bolitas fueron nodulizadas, lavadas tres veces con PBSTA y contadas en un contador gamma.
El ELISA constaba de 0,1 ml de rTF (0,5 \mug/ml) en tampón carbonato pH 9,6 adsorbido en pocillos de microtitulación durante 2 horas a 37ºC. La adsorción no específica adicional a los pocillos fue bloqueada durante 1 hora a 37ºC con PBSA (PBS que contenía BSA al 5%). Los pocillos fueron lavados 3 veces con PBST (PBS que contenía Tween 80 al 0,1%) y se añadieron las muestras de suero diluidas en PBS y se incubaron durante la noche a 4ºC. Los pocillos fueron lavados 3 veces con PBST. A cada pocillo se añadieron 0,1 ml de inmunoglobulina anti-ratón de cabra conjugada con peroxidasa de rábano picante y se incubó durante 1 hora a la temperatura ambiente. Los pocillos fueron lavados de nuevo y se añadió O-fenilendiamina como sustrato y se incubó durante 25 minutos a la temperatura ambiente. La reacción se detuvo con H_{2}SO_{4} 2,5 M y se leyó la absorbancia de cada pocillo a los 492 min.
El día 89 se recogió el bazo de un ratón 29.1.C., se rompió y las células del bazo se fusionaron con células de mieloma de ratón no secretoras P3 X63-Ag8.653 (ATCC CRL 1580) utilizando el procedimiento de fusión con PEG de S. Fazakas de St. Groth et al., J. Immun. Meth., 35:1-21 (1980). El cultivo fusionado fue sembrado en 4 placas que contenían cada una 96 pocillos de microtitulación y cultivado en medio HAT (hipoxantina, aminopterina y timidina) mediante técnicas convencionales (Mishell and Shiigi, Selected Methods in Cellular inmunology, W.H. Freeman & Co., San Francisco, págs. 357-363 [1980]). Se determinó la actividad anti-TF de los sobrenadantes de cultivo mediante ELISA y RIP. Se encontró que veinte positivos tenían actividad anti-TF. De estos, 12 fusiones estables que secretaban anti-TF fueron expandidas y clonadas mediante dilución limitante utilizando los procedimientos publicados (Oi, V.J.T. & Herzenberg, L.A., "Immunoglobulin Producing Hybrid Cell Lines" en Selected Methods in Cellular Immunology, pág. 351-372, Mishell, B.B. and Shiigi, S.M. [eds], W.H. Freeman & Co. [1980]). La selección de los clones se basó en: observación macroscópica de los clones individuales, ELISA y RIP: Se formó un isotipo del anticuerpo utilizando un estuche reactivo para la formación de isotipos de Zymed según el protocolo adjunto. (Zymed Corp.) Se produjeron grandes cantidades de anticuerpos monoclonales específicos mediante inyección de células de hibridoma clonadas en ratones cebados con pristano para producir tumores ascíticos. Las ascitis fueron después recogidas y purificadas sobre una columna de proteína A-Sepharose.
Se centrifugaron aproximadamente 5 ml de fluido de ascitis a 3.000 rpm en un Sorvall 6000 a 4ºC durante 10 minutos. La capa clara de pristano y la capa de lípidos se separaron con una pipeta pasteur. El fluido de ascitis fue transferido a un tubo de centrífuga de 50 ml. El fluido de ascitis se hizo pasar a través de un filtro estéril 0,45 M. Se añadieron 1,11 g de KCl a las ascitis hasta rendir una concentración final de KCl 3M.
La ascitis fue cargada en una columna de 10 ml que contenía SPA Sepharose (Fermentech). La columna se lavó con KCl 3M. La IgG de ratón se hizo eluir con 3 a 4 veces el volumen de la columna de ácido acético 0,1 M en NaCl 0,15 M pH 2,8.
El anticuerpo D3 fue acoplado a CNBr Sepharose según las instrucciones del fabricante a 3 mg de IgG por ml de Sepharose. (Ver el manual de instrucciones de Pharmacia Co.). Las células 293S transfectadas se hicieron crecer en una mezcla 1:1 de F-12 de Ham (w/o glicina, hipoxantina y timidina) y MEMD (w/o glicina). Las adiciones al medio basal incluyen: suero vacuno fetal sometido a diálisis o a diafiltración al 10%, metotrexato 50 nM, L-glutamina 2,0 mM y tampón HEPES 10 mM.
Un vial congelado de 293S (63/2S CISTF) es derretido en un matraz para el cultivo de tejidos que contenía el medio descrito. Cuando el cultivo alcanza la confluencia es tripsinizado con una mezcla de tripsina-EDTA y una pequeña porción de la población celular fue utilizada para inocular matraces mayores. Los cultivos fueron controlados diariamente mediante microscopía de fases para determinar el crecimiento (porcentaje de confluencia), morfología y salud general. Cuando los cultivos en botellas con cilindros fueron confluentes (normalmente en 5-7 días), las células fueron tripsinizadas y contadas. Las células fueron enumeradas y sus viabilidades determinadas mediante la técnica de exclusión con azul de trípano. Los números típicos de células de una botella de cilindros de 850 cm^{2} confluente estaban entre 1 y 4 x 10^{8} células. Las células fueron suspendidas en fosfato de sodio 0,01 M, NaCl 0,15 M. Las células fueron recogidas mediante centrifugación a 5.000 rpm. Las células fueron resuspendidas en 50 ml de TBS que contenía Triton X al 1% por matraz. Los cultivos fueron incubados una hora a la temperatura ambiente y después centrifugados a 8.000 x g durante 20 minutos. El sobrenadante fue cargado en la columna de D3-Sepharose descrita antes. La columna se lavó y se hizo eluir con ácido acético 0,1 M, NaCl 150 mM y Tween 80 al 0,05%.
Ejemplo 9 Análisis para la proteína del factor tisular 1. Análisis para el factor tisular cromogénico
Se relípidaron todas las muestras extraídas del medio de cultivo antes del análisis. Como se ha discutido antes el factor tisular tiene un requerimiento absoluto de fosfolípidos para mostrar actividad en sistemas de análisis in vitro (Pitlick and Nemerson, Supra). Se homogeneizaron gránulos de lecitina en Tris 0,05 M, NaCl 0,1 M pH 7,4 (TBS) que contenía desoxicolato de sodio al 0,25% a una concentración de 1 mg/ml. Esta solución (PC/DOC) fue utilizada para relipidar el factor tisular como sigue. La proteína del factor tisular se diluyó en TBS que contenía seralbúmina bovina al 0,1% (TBSA). Se colocaron cincuenta microlitros en un tubo de ensayo de poliestireno de 12x75 mm y se añadieron 50 \mul de solución PC/DOC. Después se añadieron trescientos cincuenta (350) microlitros de TBSA junto con 25 \mul de CdCl_{2}. Esta mezcla de relipidación se dejó incubar a 37ºC durante 30 minutos.
Para el análisis cromogénico, las muestras de proteína del factor tisular relipidado fueron diluidas en TBSA. Se colocaron diez microlitros en un tubo de ensayo con 50 \mul del reactivo factor IX_{a}/factor X y 2 \mul de una solución de factor VII purificado, 30 unidades/ml. Los tubos fueron templados a 37ºC y se añadieron 100 \mul de CaCl_{2} 25 mM. Las muestras fueron incubadas durante 5 minutos a 37ºC antes de la adición de 50 \mul de sustrato cromogénico específico para el factor Xa, S2222, que también contenía el inhibidor de la trombina sintético I2581. La reacción se dejó continuar durante 10 minutos y se detuvo mediante la adición de 100 \mul de una solución de ácido acético glacial al 50%. Se detectó absorbancia a 405 nM. Se construyó una curva patrón utilizando tromboplastina de cerebro de conejo (asequible comercialmente de Sigma, St. Louis, MO. catálogo #TO263) asignando arbitrariamente a este reactivo 100 unidades de factor tisular/ml. Se realizaron diluciones a partir de 1:10 a 1:1.000. La absorbancia se trazó en la abcisa en papel para gráficos semilog con la dilución del patrón trazada en la ordenada.
2. Análisis de una fase para la actividad del factor tisular
Se añadieron 100 \mul de plasma hemofílico a 10 \mul de proteína de factor tisular relipidado o sin lípidos o TBSA como control en un tubo de vidrio sometido a tratamiento por absorción de silicio para evitar la activación no específica a través de la fase de contacto en la coagulación. Los reactivos fueron calentados a 37ºC y se añadieron 100 \mul de CaCl_{2} 25 mM y se cronometró la formación de coágulos (Hvatum, Y. and Pyrdz, H., Thromb. Diath. Haemorrh. 21, 217-222 [1969]).
Ejemplo 10 Eficacia y carencia de toxicidad de la proteína del factor tisular en un modelo de hemofilia canino
La proteína del factor tisular fue infundida en perros hemofílicos utilizando el procedimiento de Giles, A.R. et al., Blood 60, 727-730 (1982).
La carencia de toxicidad de la proteína del factor tisular fue determinada primero en un perro normal por inyección al bolo de dosis de aproximadamente 50 U de proteína del factor tisular/kg y 100 U de proteína de factor tisular/kg. Se determinó el tiempo de sangrado de la cutícula (CBT) (Giles supra) antes de la infusión y 30 minutos después de cada inyección. La sangre fue retirada y anticoagulada durante los análisis de coagulación a diferentes punto de tiempo durante el experimento. Con el fin de demostrar la actividad de doble flujo in vivo del factor VIII de la proteína del factor tisular, se realizaron experimentos utilizando perros hemofílicos. Los animales en ayunas fueron anestesiados y se realizó un CBT antes de cualquier infusión. Después se administró la proteína del factor tisular mediante inyección al bolo y se realizaron CBT en diferentes momentos en el tiempo hasta 90 minutos después de la infusión. Se administraron varias dosis de la proteína del factor tisular. Se separaron las muestras de sangre a lo largo de toda la duración de cada experimento y se analizaron el factor V, y los tiempos de la protrombina y la tromboplastina parcial. Los CBT mayores de 12 min fueron considerados groseramente anormales. Esas uñas fueron cauterizadas para evitar una pérdida excesiva de sangre.
Se administraron dosis de proteína del factor tisular que representaban 100 U/kg de proteína del factor tisular en la relipidación en el análisis cromogénico a un perro anestesiado normal. El CBT en este animal era de aproximadamente 3 min antes de cualquier infusión. Había una cierta reducción en WBCT a los 5 minutos aunque volvía a ser normal a los 15 minutos. Los niveles del factor V eran normales 30 minutos después de cada infusión. Los tiempos de la protrombina y la tromboplastina parcial permanecían inalterados al final del experimento y asimismo los CBT estaban en el intervalo normal. De ese modo la infusión de la proteína del factor tisular era bien tolerada en perros normales y no se encontró evidencia de coagulación intravascular diseminada.
Se administraron 100 U/kg de proteína del factor tisular a un perro hemofílico con un CBT prolongado característico de hemofilia A. El CBT se normalizó a los 5 minutos y 20 minutos después de esta infusión. Un segundo experimento utilizando 100 U/kg de proteína del factor tisular dio un CGR normal a los 20 minutos y un cierto acortamiento de CBT a los 90 minutos. El efecto procoagulante no se mantenía 90 minutos después de la infusión ya que el efecto del CBT que de nuevo se prolongaba en este momento.
Composiciones farmacéuticas
Los compuestos de la presente invención pueden ser formulados según los métodos conocidos para preparar composiciones farmacéuticamente útiles, con lo que la proteína del factor tisular producto de estos se combina en una mezcla con un vehículo portador farmacéuticamente aceptable. Los vehículos adecuados y su formulación, incluso de otras proteínas humanas, v.g. seralbúmina humana, se describen por ejemplo en Remington's Pharmaceutical Sciences por E.W. Martin, que se incorpora aquí como referencia. Tales composiciones contendrán una cantidad eficaz de la proteína de aquí junto con una cantidad adecuada de vehículo con el fin de preparar composiciones farmacéuticamente aceptables adecuadas para la administración eficaz al huésped. Tales composiciones deberán ser estables durante períodos de tiempo apropiados, deben ser aceptables para la administración a humanos, y deben ser fácilmente fabricables. Un ejemplo de tal composición sería una solución diseñada para la administración parenteral. Aunque las formulaciones en solución farmacéutica se proporcionan en forma de líquido apropiado para su uso inmediato, tales formulaciones parenterales también pueden ser proporcionadas en forma congelada o liofilizada. En el primer caso, la composición debe ser derretida antes de su uso. La última forma es a menudo utilizada para intensificar la estabilidad del agente medicinal contenido en la composición en una amplia gama de condiciones de almacenamiento. Tales preparaciones liofilizadas son reconstituidas antes de su uso mediante la adición de uno o varios diluyentes farmacéuticamente aceptables adecuados, tales como agua estéril o solución salina fisiológica estéril. La proteína del factor tisular de esta invención se administra para proporcionar una composición terapéutica inductora de la coagulación para diferentes alteraciones del sangrado crónicas, caracterizadas por la tendencia a la hemorragia, tanto heredada como adquirida. Los ejemplos de tales alteraciones del sangrado crónicas son las deficiencias en los factores VIII, IX, u XI. Entre los ejemplos de las alteraciones adquiridas se incluyen: inhibidores adquiridos de los factores de coagulación de la sangre v.g. el factor VIII, el factor de von Willebrand, los factores IX, V, XI, XII y XIII; alteraciones hemostáticas como consecuencia de enfermedades del hígado que incluyen la disminución de la síntesis de los factores de coagulación y la DIC; tendencia al sangrado asociada con enfermedades renales agudas y crónicas que incluyen deficiencias en el factor de coagulación y DIC; hemostasis después de trauma o cirugía; pacientes con malignidad diseminada que se manifiesta en DIC con aumentos en los factores VIII, de von Willebrand y fibrinógeno; y hemostasis durante cirugía cardiopulmonar y transfusión sanguínea masiva.

Claims (26)

1. Un polinucleótido que codifica para una proteína del factor tisular biológicamente activa cuya secuencia se facilita en la figura 2 o una variante o fragmento biológicamente activo de dicha proteína del factor tisular que induce coagulación donde al menos un aminoácido ha sido insertado, suprimido o sustituido selectivamente.
2. Un polinucleótido según la Reivindicación 1, que codifica o bien para una proteína del factor tisular biológicamente activa que induce coagulación o bien para un fragmento biológicamente activo de dicha proteína del factor tisular que induce coagulación.
3. Un polinucleótido según la Reivindicación 1 ó 2 libre de intrones.
4. Un método para producir una proteína del factor tisular o una variante o fragmento biológicamente activo de dicha proteína del factor tisular que induce coagulación, donde dicha proteína del factor tisular o variante o fragmento carece de glicosilación, o la glicosilación que tiene no es de mamífero que comprende las etapas de (a) introducir el polinucleótido de la Reivindicación 1 en un huésped no mamífero, (b) expresar dicho polinucleótido y (c) aislar dicha proteína del factor tisular o variante o fragmento de la misma del huésped.
5. Un método según la Reivindicación 4, donde el huésped no mamífero es uno cualquiera de un procariota, una levadura, un hongo, una célula de insecto o una célula vegetal.
6. Un método para producir una variante o fragmento biológicamente activo de la proteína del factor tisular que induce coagulación, que comprende las etapas de (a) introducir el polinucleótido de la Reivindicación 2 en un huésped, (b) expresar dicho polinucleótido y (c) aislar dicha variante o fragmento de la proteína del factor tisular de dicha proteína del factor tisular.
7. Un método según la Reivindicación 6, donde el huésped es uno cualquiera de un procariota, una levadura, un hongo, una célula de insecto, una célula vegetal o una célula humana.
8. Un método según la Reivindicación 4 ó 6, donde comparada con la proteína del factor tisular nativa, un aminoácido seleccionado es reemplazado de manera que en la variante de la proteína del factor tisular biológicamente activa (a) un resto hidrofílico es reemplazado por un resto hidrofóbico, o (b) una cisteína o prolina es reemplazada por otro aminoácido o (c) un resto que tenga una cadena lateral electropositiva es reemplazado por un resto electronegativo o (d) un resto que tenga una cadena lateral voluminosa es reemplazado por un resto que tenga una cadena lateral pequeña o glicina.
9. Una proteína del factor tisular biológicamente activa o una variante o fragmento biológicamente activo de dicha proteína del factor tisular que induce coagulación obtenible mediante el método de la Reivindicación 4.
10. Una variante o fragmento biológicamente activo de la proteína del factor tisular que induce coagulación obtenible mediante el método de la Reivindicación 6.
11. Una proteína del factor tisular biológicamente activa susceptible de ser codificada por un polinucleótido como se ha definido en la Reivindicación 1 o una variante o fragmento biológicamente activo de dicha proteína del factor tisular que induce coagulación o bien carece de glicosilación, o la glicosilación que tiene no es de mamífero.
12. Una variante de la proteína del factor tisular biológicamente activa que induce coagulación susceptible de ser codificada por un polinucleótido como se ha definido en la Reivindicación 1, donde el dominio transmembrana de la proteína del factor tisular nativa no se encuentra presente.
13. Una variante de la proteína del factor tisular biológicamente activa que induce coagulación susceptible de ser codificada por un polinucleótido como se ha definido en la Reivindicación 1, donde un sitio seleccionado que es un sitio de proteolisis potencial en la proteína del factor tisular nativa es resistente a la proteolisis.
14. Una variante de la proteína del factor tisular biológicamente activa según la Reivindicación 13, donde un sitio de proteolisis potencial en la proteína del factor tisular nativa que comprende una arginina es reemplazado por otro aminoácido o no está presente.
15. Una variante de la proteína del factor tisular biológicamente activa según la Reivindicación 14, donde la arginina es reemplazada por glutamina o histidina.
16. Una variante de la proteína del factor tisular humano biológicamente activa que induce coagulación susceptible de ser codificada por un polinucleótido como se ha definido en la Reivindicación 1, donde un resto cisteína de la proteína del factor tisular humano nativa es reemplazado por otro resto aminoácido.
17. Un polipéptido de fusión biológicamente activo susceptible de ser codificado por un polinucleótido como se ha definido en la Reivindicación 1, que comprende la proteína del factor tisular o una variante o fragmento de la misma que induce coagulación y otro polipéptido unido a ella.
18. Una variante de la proteína del factor tisular humano biológicamente activa que induce coagulación susceptible de ser codificada por un polinucleótido como se ha definido en la Reivindicación 1, donde no se encuentra presente un sitio de glicosilación enlazado a N o enlazado a O de la proteína del factor tisular humano nativa.
19. Una variante de la proteína del factor tisular humano biológicamente activa según la Reivindicación 16, donde dicho resto cisteína es la cisteína 245 y el otro resto aminoácido es serina.
20. Una secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína del factor tisular biológicamente activa o una variante o fragmento como se ha definido en una cualquiera de las Reivindicaciones 11 a 17.
21. Un vector de expresión recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos según una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 3 ó 20.
22. Una célula transformada con el vector de expresión de la Reivindicación 21.
23. Una célula según la Reivindicación 22 que es una célula de mamífero.
24. Una célula según la Reivindicación 22 que es una célula procariota.
25. Un procedimiento para producir el factor tisular que comprende cultivar una célula transformada según una cualquiera de las Reivindicaciones 22 a 24.
26. Un método para obtener un polinucleótido que codifica para una proteína del factor tisular biológicamente activa que comprende las etapas de:
(1)
construir una genoteca de ADNc adiposo en gt 10;
(2)
rastrear una genoteca de placas con una sonda extremadamente larga, preparada a partir de la secuencia de ADN completa de la Figura 2, hibridando el ADN en dichas placas con la mencionada sonda en NaCl 0,75 M, citrato trisódico 75 mM, fosfato de sodio 50 mM (pH 6,8), 5X solución de Denhart, formamida al 50 por ciento y 0,2 g/l de ADN de esperma de salmón hervido sometido a sonicación, a 42ºC durante la noche y lavando en NaCl 0,03 M, citrato trisódico 3 mM, NaDodSO_{4} al 0,1 por ciento, a 60ºC;
(3)
purificar las placas hibridadas;
(4)
preparar ADN a partir de las placas hibridadas; y
(5)
seleccionar un ADNc de aproximadamente 2.350 pb.
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