PT98113B - Processo para a preparacao de proteinas de fusao com uma fraccao de imunoglobulina - Google Patents

Processo para a preparacao de proteinas de fusao com uma fraccao de imunoglobulina Download PDF

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Description

Descrição referente à patente de invenção de Behringwerke Aktiengesellschaft, alemã, industrial e comercial, com sede em D-3550 Marburg, República Federal Alemã e The General Hospital Corporation,norte-americano ,comercial , estabelecido em Fruit Street, Boston, MA 02114, Estados Unidos da América, (inventores: Dr.Gerd Zettlmeissl, Dr.Leander Lauffer, Dr. Patricia Oquendo, residentes na República Federal Alemã e Dr. BrianSeed, residente nos Estados Unidos da América), para, PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE PROTEÍNAS DE FUSÃO COM UMA FRACÇÃO DE IMUNOGLOBULINA».
DESCRIÇÃO
A presente invenção refere-se a uma proteína de fusão solúvel obtida por manipulação genética formada por proteínas humanas que não pertencem à família das imunoglobulinas • ou a partes destas e por diferentes fracções das regiões constan1 ί*;Κ ««WWWWKtWÍ** tes de moléculas de imunoglobulinas. As propriedades funcionais das duas fracções fundidas são surpreendentemente mantidas na proteína de fusão.
Conhecem-se proteínas de fusão formadas por diferentes dominios da protéina CD4 da membrana das células T humanas e por fracções da IgGl humana a partir das publicações de pedidos de Patentes EP-A 0325 262 e EP-A 0314 317. Algumas destas proteínas de fusão ligam-se com igual afinidade à glicoproteína gpl20 do vírus da imunodeficiência humana e à molécula CD4 ligada à célula. A molécula CD4 pertence à familia das imunoglobulinas e possui por conseguinte devido à sua estrutura terciã ria uma conformação muito semelhante à das moléculas das imunoglo bulinas. 0 mesmo se pode afirmar da cadeia do receptor de antigénio das células T, para o qual foram igualmente descritas proteínas de fusão semelhantes (Gascoigne et al., Pro. Natl. Acad. Sei. USA, Vol. 84 (1987), 2937-2940). Em virtude da analogia da estrutura dos dominios era de esperar neste caso a conservação da actividade biológica das duas fracções da proteína de fusão.
As proteínas humanas da presente invenção acopladas à imunoglobulina de preferência por meio da extremidade aminoterminal da região constante não pertencem à familia das imunoglobulinas e estão classificadas nas seguintes classes: (i) proteínas que ocorrem na membrana, cujos dominios extracelulares são incorporados na proteína de fusão em parte ou integralmente. Estas são especialmente a tromboplastina e receptores de citoquinas e de factores de crescimento, como por exemplo os receptores celulares da interleuquina-4, da interleuquina-7, do factor de necrose de tumores, do GM-CSF, do G-CSF e da eritropoeitina; (ii) proteínas solúveis que não ocorrem na membrana, as quais são integradas na proteína de fusão em parte ou integralmente. São especialmente preferidas de entre as referidas as proteínas de interesse terapêutico, como por exemplo, a eritropoietina e outras citoquinas e factores de crescimento.
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As proteínas de fusão podem ser preparadas em sistemas de expressão procarióticos e eucarióticos conhecidos, de preferência em células de mamíferos (por exemplo, células CHO, COS ou BHK).
As proteínas de fusão da presente invenção sao fáceis de purificar por cromatografia de afinidade em virtude da sua fracção de imunoglobulina e apresentam in vivo propriedades farmacocinéticas melhoradas.
Em muitos casos a fracção Fc na proteína de fusão apresenta vantagens nítidas na utilização em terapia e diagnóstico e possui deste modo, por exemplo, propriedades farmacocinéticas melhoradas (EP-A 0232 262). Por outro lado era desejável para muitas aplicações a possibilidade de eliminar a fracção Fc após se ter dado a expressão da proteína de fusão do modo mais vantajoso, a comprovação e a purificação. Este é o caso quando a fracção Fc se mostra indesejável para a utilização em terapia e em diagnóstico, por exemplo, quando a proteína de fusão pode actuar como antigénio para imunização.
Existem diferentes proteases cuja utilização para este fim ê em princípio possível. A papaína ou a tripsina são por exemplo utilizadas para a obtenção de fragmentos F(ab) de imunoglobulinas (Immunology, Selecção Roitt, I. et al., Gower Medicai Publishing, London (1989)), mas estas proteínas não são cindidas de modo suficientemente específico. 0 factor de coagulação sanguínea Xa pelo contrário reconhece numa proteína a sequência tetrapeptídica relativamente singular Ile-Glu-Gly-Arg e provoca uma cisão hidrolítica da proteína após o resíduo de arginina por meio de sequências de cisão que contêm o tetrapeptídeo acima descrito e que foram em primeiro lugar introduzidos por Nagai e Thogersen numa proteína híbrida por via de manipulação genética (Nagai, K. e Thogersen, H.C., Nature, Vol. 309 (1984), 810-812).
Estes autores mostraram que proteínas expressas em E. coli são de facto cindidas a partir do factor Xa de modo específico. Não é no entanto conhecido da literatura qualquer exemplo de que estas proteínas possam ser expressas também em células eurocarióticas e sobretudo em células animais e que possam ser cindidas do factor Xa após a sua purificação. A expressão das proteínas da presente invenção em células animais representa portanto um avanço uma vez que apenas num sistema celular deste tipo é de esperar a secreção de por exemplo receptores de membrana normalmente como componentes de proteínas de fusão com conservação da sua estrutura nativa e por conseguinte da sua actividade biológica. A secreção para o sobrenadante da cultura celular facilita a subsequente purificação simples da proteína de fusão. A presente invenção refere-se por conseguinte à obtenção por técnicas de manipulação genética de proteínas de fusão constituídas por proteínas humanas que não pertencem à familia das imunoglobulinas ou partes destas e diferentes fracções das regiões constantes de cadeias pesadas ou ligeiras de imunoglobulinas de diferentes subclasses (IgG, IgM, IgA e IgE). As imunoglobulinas preferidas são constituídas pela parte constante da cadeia pesada da IgG humana, sendo especialmente preferida a IgGl, em que a fusão se segue ao domínio da articulação (hinge). Numa forma de concretização especialmente preferida a fraeção Fc pode ser separada de forma fácil por meio de uma sequência de cisão integrada cindível por meio do factor Xa.
Para além disso, a presente invenção referese a um processo para a preparação por manipulação genética destas proteínas de fusão bem como da sua utilização para o diagnóstico e para a terapia.
Os exemplos que se seguem destinam-se a elucidar mais completamente a presente invenção;
Exemplo 1: Proteína de fusão com a tromboplastina
A coagulação sanguínea é um processo de importância primordial no organismo humano. A cascata de coagulação constitui um processo de regulação delicada para o qual contribuem numerosos factores celulares e proteínas plasmãticas. Em geral estas proteínas (e os seus cofactores) sao designadas por factores de coagulação sanguinea. Os produtos finais da cascata de coagulação são a trombina, que induz a agregação de plaquetas sanguíneas, e a fibrina, que estabiliza o trombo de plaquetas. A trombina catalisa a formação da fibrina a partir do fibrinogénio e ela própria é formada por meio de proteólise limitada da protombina. Para esta fase é responsável o factor X (factor Xa), o qual na presença do factor Va e de iões de cálcio se liga à membrana das plaquetas e cinde a protrombina.
Existem duas vias (pathways) para a activação do factor X, a via extrínseca e a via intrínseca. Na via intrínse ca é activada uma série de factores por proteólise a fim de em cada caso formar as próprias proteases activas. Na via extrínseca é sintetizada a tromboplastina reforçada (tissue factor) pelas células feridas e ê activado o factor X, juntamente com o factor Vila e iões de cálcio. Anteriormente pensava-se que a actividade da tromboplastina se limitava a esta reacção. No entanto o comple xo tromboplastina/factor Vila tem igualmente um efeito de activação ao nível do factor IX na via intrínseca. 0 complexo tromboplastina/factor Vila ê deste modo um dos activadores fisiológicos mais importantes da coagulação sanguinea.
Pode-se imaginar que a tromboplastina, abstraindo da sua utilização em diagnóstico (ver acima), pode ser também utilizada como componente terapêutico para o tratamento das deficiências da coagulação sanguinea inatas ou adquiridas. Por exemplo, as hemofilias crónicas são causadas por uma deficiência dos factores VIII, IX ou XI ou também por perturbação aguda da coagulação sanguinea em virtude de por exemplo afecçoes do figado ou dos rins. Também é de admitir a utilização de uma tera5
pia semelhante após intervenções cirúrgicas.
A tromboplastina é uma proteína de membrana integral que nao pertence à familia das imunoglobulinas. As sequências de ADNc da tromboplastina foram no total publicadas em quatro grupos (Fisher et al., Thromb. Res., Vol. 48 (1987), 8999; Morrisey et al., Cell, Vol. 50 (1987), 129-135; Scarpati et al. , Biochemistry, Vol. 26 (1987), 5234-5238; Spicer et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, Vol. 84 (1987), 5148-5152). O ADNc da tromboplastina abrange um quadro de leitura livre que codifica para um polipeptídeo de 295 resíduos de ácidos aminados, dos quais os 32 ácidos aminados N-terminais funcionam como peptídeo de sinal. A tromboplastina madura é formada por 263 ácidos aminados e compreende três domínios estruturais: i) o domínio extracelular aminoterminal (219 resíduos de ácidos aminados); ii) a região transmembranal (23 resíduos de ácidos aminados); iii) e o dominio citoplasmático (extremidade carboxiterminal; 21 resíduos de ácidos aminados). No dominio extracelular existem três locais potenciais de N-glicosilação (Asn-X-Thr). A tromboplastina encontra-se normalmente glicosilada, mas a glicosilação não parece ser essencial para a actividade da proteína (Paborsky et al., Biochemistry, Vol. 28 (1989), 8072-8077),
A tromboplastina é necessária como aditivo para as amostras de plasma no diagnóstico da função de coagulação. Por meio da determinação numa única fase do tempo de coagulação pelo protrombina (por exemplo no Quick-Test) é possível avaliar o estado da função de coagulação do paciente em exame. A tromboplastina necessária para o diagnóstico é actualmente obtida a partir de tecidos humanos, mas o processo de preparação ê pouco normalizado, os rendimentos são baixos e é necessário dispor de quantidades importantes da matéria prima de origem humana (placentas). Por outro lado é de esperar que também a preparação por técnicas de manipulação genética de tromboplastina nativa ligada à membrana, limitada por processos complexos de purificação, seja problemática. Estes problemas podem ser ultrapassados por meio da fusão a uma fracção de imunoglobulina da presente invenção.
As proteínas de fusão de tromplastina da presente invenção são libertadas para o meio de cultura pelas células de mamífero (por exemplo células CHO, BHK ou COS), são purificadas por meio de cromatografia de afinidade em Sepharoseproteía A e apresentam uma actividade surpreendentemente elevada na determinação numa única fase do tempo de coagulação por protrombina.
Clonagem de ADNc de tromboplastina
Para clonar o ADNc da tromboplastina utilizou-se a sequência publicada por Scarpati et al., Biochemistry, Vol. 26 (1987), 5234-5238. A partir desta sequência derivaramse duas moléculas oligonucleótidas (ver Figura 1). Com estas duas moléculas sonda procedeu-se a uma busca num banco de ADNc de placenta humana (Grundmann et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, Vol. 83 (1986), 8024-8028).
Obtiveram-se clones de ADNc de diferentes comprimentos. Um clone, 2b-Apr5, que foi usado para o prosseguimento do processo, codificava para a uma sequência de ácidos aminados igual à do ADNc descrito por Scarpati et al.. Na Figura 2 apresenta-se a sequência integral do clone 2b-Apr5 com a sequen cia de ácidos aminados da romboplastina derivada daquela.
Construção de um plasmídeo híbrido pTFIFc que codifica para a proteína de fusão de tromboplastina plasmídeo pCD4E gama 1 (EP 0 325 262 A; depositado na ATCC sob o número N2 67610) provoca a expressão de uma proteína de fusão entre o receptor humano CD4 e IgGl humana. A sequência de ADN que codifica para o domínio extracelular de CD foi retirada deste plasmídeo com as enzimas de restrição HindIII e BamHI. Nesta operação com a enzima HindIII apenas se deve efectuar uma cisão parcial afim de cortar apenas num dos dois locais HindIII existentes no plasmídeo pCD4E (posição 2198) . Obtém-se então um vector aberto no qual uma sequência de regulação de transcrição eucariótica (promotor) ê seguida do local HindIII aberto. 0 local BamHI aberto estã situado no início da região de codificação para um ligando pentapeptídico, seguido dos domínios de charneira e CH2 e CH3 da IgGl humana. 0 quadro de leitura na sequência de reconhecimento de BamHI GGATCC ê tal que o tripleto GAT é traduzido como ácido aspãrtico. A amplificação do ADN com polimerase de ADN termoestável possibilita que uma dada sequência possa ser alterada de tal modo que se acrescentam quaisquer sequências numa ou nas duas extremidades. Sintetizamse dois oligonucleótidos que podem hibridar com sequências na região não traduzida 5' (A: 5' GATCGATTAAGCTTCGGAACCCGCTCGATCTCGCCGCC 3') ou na região de codificação (B: 5' GCATATCTGGATCCCCGTAGAATATTTCTCTGAATTCCCC 3') do ADNc da tromboplastina. 0 oligonucleotido A ê parcialmente homólogo da sequência da cadeia de codificação e o oligonucleotido B é parcialmente homólogo da cadeia não codificante; ver Figura 3.
Após amplificação subsequente obtém-se deste modo um fragmento de ADN (827 pb) que (em relação à cadeia de codificação) contém na extremidade 5' antes do início da cadeia
de codificação um local HindIII e na extremidade 3' depois dos codões para os três primeiros resíduos de ácidos aminados da região transmembrana um local BamHI. 0 quadro de leitura no local de corte BamHI é tal que após ligação com o local BamHI no plasmí deo pCD4E gama 1 se obtêm um gene de fusão com um quadro de leitura contínuo desde o codão de início do ADNc da tromboplastina até ao codão de paragem da cadeia pesada da IgGl. 0 fragmento pretendido foi separado e após tratamento com HindIII e BamHI foi ligado no vector pCD4E gama 1 acima descrito cortado com HindIII (parcialmente) e BamHI. 0 plasmídeo resultante recebeu o nome de plasmídeo pTFIFc (Fig.4).
Transfecção do plasmídeo pTFIFc em células de mamífero
A proteína de fusão codificada pelo plasmídeo pTFIFc é em seguida designada por proteína pTFIFc. A proteína pTFIFc foi expressa em células COS de modo transiente. Para este fim transfectaram-se células COS com o auxilio de DEAE-dextrano com o plasmídeo pTFIFc (EP A 0325 262). Por meio de ensaios de imunofluorescência indirecta determinou-se cerca de 25% como frac ção das células transfectadas. 24 horas após a transfecção passaram-se as células para meio isento de soro. Concentrou-se o sobre nadante destas células após três dias.
Purificação da proteína de fusão pTFIFc a partir do sobrenadante da cultura celular
Carregaram-se 170 ml do sobrenadante de células COS transfectadas transientes de um dia para o outro num processo descontinuo a 42C com 0,8 ml de Sepharose-proteína A numa coluna, lavou-se com 10 volumes de tampão de lavagem (Tampão de Tris 50mM de pH 8,6 NaCl 150 mM) e eluiu-se em fracções de 0,5 ml com tampão de eluição (ácido cítrico lOOmM: citrato de sódio
100 mM 93:7). Reuniram-se as primeiras 9 fracções após neutralização imediata com 0,1 ml para cada fracção de tampão de tris 2 M de pH 8,6 e transferiu-se a proteína obtida por meio de três ciclos de concentração/diluição num microconcentrador Amicon (Centricon 30) para tampão de TNE (tampão de tris 50 mM de pH 7,4 NaCl 50 mM e EDTA 1 mM). A proteína pTFIFc deste modo obtida é electroforeticamente pura em SDS-PAGE (U.K. Lammli, Nature 227 (1970) 680-685). Na ausência de redutores comporta-se na SDSPAGE como um dimero (cerca de 165 kDa).
Actividade biológica de proteína TFIFc purificada na determinação do tempo de coagulação por protrombina
A proteína de fusão TFIFc ê activa em baixas concentrações > 50 ng/ml) na determinação do tempo de coagulação por protrombina numa única fase (Vinazzer, H. Gerinnungsphysiologie und Methoden im Blutgerinnungslabor (1979), Fisher Verlag, Estugarda). Os tempos de coagulação obtidos são comparáveis aos tempos de coagulação que são obtidos com tromboplastina que foi isolada a partir da placenta humana.
Exemplo 2: Proteína de fusão interleuquina-4-receptor
A interleuquina 4 (IL-4) é sintetizada pelas células T e foi originalmente designada factor de crescimento das células B, uma vez que pode estimular a proliferação das células B. Provoca numerosos efeitos sobre estas células. Especialmente a IL-4 é o factor desencadeante da síntese de moléculas da classe das imunoglobulinas IgGl e IgE na activação das células B (Coffmann et al., Immunol. Rev., Vol. 102 (1988) 5). Para além disso, a IL-4 regula também a proliferação e a diferenciação das células T e de outras células hematopoiéticas. Contribui deste modo para a regulação de reacções alérgicas e de outras reacções imunológi10
cas. A IL-4 liga-se com elevada afinidade num receptor específico. 0 ADNc que codifica para o receptor humano da IL-4 foi isolado (Idzerda et al., J. Exp. Med. Vol. 171 (1990) 861-873. A partir da análise da sequência de ácidos aminados derivada da sequência de ADNc verifica-se que o receptor da IL-4 é constituído no total por 825 ácidos aminados, dos quais os 25 ácidos amina dos N-terminais funcionam como peptídeo de sinal. 0 receptor maduro humano da IL-4 é constituído por 800 ácidos aminados e apresenta como a tromboplastina uma estrutura com três domínios:
i) o dominio extracelular aminoterminal (207 ácidos aminados);
ii) a região transmembrana (24 ácidos aminados) e iii) o dominio citoplasmático (569 ácidos aminados). No dominio extracelular existem seis locais potenciais para N-glicosilação (Asn-X-Thr-/ Ser). 0 receptor da IL-4 apresenta homologias com o receptor humano da IL-6, com a subunidade do receptor humano da IL-2, com o receptor da eritropoietina do rato e com o receptor da prolactina na ratazana (Idzerda et al., ver acima). A IL-4 nao é por tanto como a tromboplastina um membro da familia das imunoglobulinas, mas sim forma com as proteínas homólogas referidas uma nova familia dos receptores de hematopoietina. Os membros desta familia têm em comum 4 resíduos de cisteína e uma sequência conservada (Trp-Ser-X-Trp-Ser) que se encontra nas proximidades da região transmembrana no dominio extracelular.
Com base na função descrita do sistema IL4/receptor de IL-4 é possível uma utilização terapêutica de uma forma recombinante do receptor da IL-4 para reduzir as reacçSes imunitárias mediadas pela IL-4 (por exemplo, reacçSes de rejeição de transplantaçSes, doenças autoimunes, reacçSes alérgicas, etc).
As quantidades de substâncias necessárias para uma terapia tornam conveniente a preparação por manipulação genética destas moléculas. De acordo com a presente invenção a síntese de formas solúveis do receptor IL-4 sob a forma de uma proteína de fusão com imunoglobulinas é especialmente vantajosa «tin
em virtude da facilidade de purificação por meio da crornatografia de afinidade e das propriedades farmacocinéticas melhoradas.
As proteínas de fusão com o receptor IL-4 são segregadas pelas células de mamíferos (por exemplo, células CHO, BHK e COS) para o meio de cultura, são purificadas por cromatografia de afinidade em Sepharose-proteína A e apresentam propriedades funcionais surpreendentemente idênticas às do dominio extracelular da molécula de receptores IL-4 ligadas à membrana intactas.
Construção de um plasmídeo híbrido pIL-4RFc que codifica para uma proteína de fusão do receptor IL-4
Quando se corta o plasmídeo pCD4 gama 1 com Xhol e BamHI, obtém-se um vector aberto no qual o local Xhol a jusante se situa antes da sequência do promotor. 0 local BamHI aberto situa-se no início da região que codifica para um ligante pentapeptídico, seguido dos domínios de charneira e CH2 e CH3 da IgGl humana. 0 quadro de leitura na sequência de reconhecimento BamHI GGATCC é de modo a que o tripleto GAT ê traduzido como ácido aspártico. A amplificação da ADN com polimerase de ADN termoestável possibilita a alteração de uma dada sequência de modo a que se adicionam sequências num ou nos dois extremos. Foram sintetizados dois oligonucleotidos que podem hibridar com sequências na região 5' não traduzida (A: 5' GATCCAGTACTCGAGAGAGAAGCCGGGCGTGGTGGCTCATGC 3') ou na região de codificação (B: 5' CTATGACATGGÂTCCTGCTCGAAGGGCTCCCTGTAGGAGTTGTG 3')doADNc do receptor IL-4, que é clonado no vector pDC302/T22-8 (Idzerda et al., entre outros). 0 oligonucleótido A é neste caso parcialmente homólogo da sequência de codificação e o oligonucleótido
B ê parcialmente homólogo da cadeia não codificante; ver Fig. 5. Após amplificação subsequente por meio de polimerase de ADN termoestável obtém-se um fragmento de ADN (836 pb) que contém na extremidade 5' um local Xhol com referência à cadeia de codificação antes do início da sequência de codificação e na extremidade 3' antes do último codão do dominio extracelular um local BamHI. 0 quadro de leitura no local de corte BamHI é tal que após a ligação com o local BamHI em pCD4E gama 1 se obtém uma fusão genética com um quadro de leitura continuo desde o codão de início do ADNc do reeeptor IL-4 até ao codão de paragem da cadeia pesada da IgGl. 0 fragmento pretendido foi obtido e após tratamento com Xhol e BamHI foi ligado no vector pCD4E gama 1 acima descrito cortado com Xhol/BamHI. 0 plasmídeo resultante recebeu o nome de pIL4RFc (Fig.6).
Transfecção de pIL4RFc em células de mamífero
A proteína de fusão codificada pelo plasmídeo pIL4RFc é designada em seguida por proteína pIL4RFc. Expressouse a proteína pIL,4Rfc de modo transiente em células COS. Para este fim transfectaram-se células COS com o plasmídeo pIL4RFc com o auxilio de DEAE-dextrano (EP A 0325 262). Por análise de imunofluorescência indirecta verificou-se que a fraeção das células transfectadas era de 25%.. 24 horas após a transfecção transferiram-se as células para meio isento de soro. Após 3 dias colheramse os sobrenadantes destas células.
Purificação da proteína de fusão-IL4RFc a partir de sobrenadantes de culturas celulares
Carregaram-se 500 ml do sobrenadante de células COS transfectadas de modo transiente de um dia para o outro por um processo descontinuo a 42C com 1,6 ml de proteína A-Sepha13
rose numa coluna, lavou-se com 10 volumes de tampão de lavagem (tampão de tris 50 ml de pH 8,6, NaCl 150 mM) e eluiu-se com tampão de eluição (ãcido cítrico 100 mM: citrato de sódio 100 mM 93:7) em fracções de 0,5 ml. Reuniram-se as primeiras 9 fracções após neutralização cuidadosa com 0,1 ml em cada de tampão de tris 2 M de pH 8,6 e transferiu-se a proteína obtida por meio de três ciclos de concentração/diluição num mícroconcentrador Amicon (centricom 30) para tampão TNE (tampão de tris 50 mM de pH 7,4, NaCl 50 mM, EDTA 1 mM), A IL4RFc assim obtida é electroforeticamente pura por SDS-PAGE (U.K. Lammli, Nature 227 (1970) 680-685). Na ausência de agentes redutores comporta-se em SDS-PAGE como um dimero (de cerca de 150 kDa).
Actividade biológica da IL4RFc purificada
A proteína IL4RFc liga-se a IL-4 marcada radioactivamente com 125j Como uma afinidade idêntica à do receptor intacto de IL-4 ligado à membrana (KD=0,5 nM). Esta proteína inibe a proliferação da linha de células dependentes de IL-4 CTLLHuIL-4RI clone D (Idzerda et al. , ver acima) em concentrações de 10 a 10000 ng/ml. Em consequência esta proteína é perfeitamente apropriada para o desenvolvimento de ensaios de ligação a IL4, uma vez que pode ligar-se através do seu apêndice Fc com placas de microtitulação revestidas por exemplo com IgG de coelho anti-humana e desta forma os seus ligandos ligam-se igualmente com alta afinidade.
Exemplo 3: Proteína de fusão com eritropoietina
A eritropoietina madura (EPO) é uma glicoproteína constituída por 166 ácidos aminados que é essencial para o desenvolvimento dos eritrócitos. Esta glicoproteína estimula a maturação e a diferenciação terminal das células precursoras
eritroides. Clonou-se o ADNc de EPO humana (EPA-0267 678) que codifica para os 166 ácidos aminados da EPO madura e para um peptídeo de sinal de 22 ácidos aminados essencial para a secreção. Com o auxilio do ADNc é possível preparar EPO recombinante funcional em células de mamífero manipuladas geneticamente, a qual pode ser utilizada em clínica para a terapia de afecções anémicas de diferentes etiologias (por exemplo, em insuficiência renal aguda).
De acordo com a presente invenção a sintese de EPO sob a forma de proteínas de fusão com imunoglobulinas é especialmente vantajosa em virtude da fácil purificação e das propriedades farmacocinéticas melhoradas.
Construção de um plasmídeo híbrido pEPOFc que codifica para uma proteína de fusão-eritropoietina
Esta construção é feita de modo análogo ao descrito no Exemplo 2 (Capítulo: Construção de um plasmídeo híbrido pIL-4RFc que codifica para uma proteína de fusão-receptor de IL-4). Sintetizaram-se dois oligonucleótidos que podem hibridar com sequências na proximidade do codão de início (A: 5' GATCGATCTCGAGATGGGGGTGCACGAATGTCCTGCCTGGCTGTGG 3') ou do codão de paragem (B: 5' CTGGAATCGGATCCCCTGTCCTGCAGGCCTCCCCTGTGTACAGC 3') do ADNc da EPO clonado no vector pCES (EP A 0267 678). 0 oligonucleótido A neste caso ê parcialmente homólogo da sequência da cadeia de codificação e o oligonucleótido B ê parcialmente homólogo da cadeia não codificante; ver Fig.7. Após subsequente amplificação resulta um fragmento de ADN por meio de polimerase de ADN termoestável (598 pb), o qual contém na extremidade 5' antes do codão de início em relação à cadeia de codificação um local Xhol e no
da extremidade 3' o codão para o penúltimo ãcido aminado C-terminal da EPO (Asp) numa sequência de reconhecimento BamHI. 0 quadro de leitura no local de corte BamHI é tal que após ligação com o local BamHI no plasmídeo pCD4E gama 1 resulta um gene de fusão com um quadro de leitura continuo desde o codão de início do ADNc da EPO até ao codão de paragem da cadeia pesada da IgGl. Obtevese o fragmento pretendido e após tratamento com Xhol e BamHI ligou-se no vector pCD4E gama 1 anteriormente descrito cortado com Xhol/BamHI. 0 plasmídeo resultante recebeu o nome de pEPOFc (Fig.8).

Claims (1)

  1. Processo para a preparação de proteínas de fusão solúveis constituídas por proteínas humanas que não pertencem à família das imunoglobulinas ou por partes destas proteínas e por diferentes fracções de moléculas de imunoglobulinas de todas as subclasses, caracterizado por se introduzir o ADN que codifica para estas construções num sistema de expressão procariótico ou eucariótíco, de preferência em células de mamífero, e após a expressão purificar a proteína de fusão formada por meio de cromatografia de afinidade para a fracção de imunoglobulina.
    -2-Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a fracção de imunoglobulina ser fracção constante da cadeia pesada da IgG humana.
    - 3a Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a fracção de imunoglobulina ser fracção constante da cadeia pesada da IgG humana ou um seu fragmento que se liga à proteína A.
    _ 4a Processo de acordo com qualquer das reivindicações 2 ou 3 caracterizado por a fusão se dar na região hinge.
    Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4 caracterizado por a proteína que se funde à imunoglobulina ser a fracção extracelular de uma proteína de membrana ou uma sua fracção.
    Processo de acordo com qualquer das reivindi17 cações 1 a 4 caracterizado por a proteína que se funde à imunoglobulina ser a fracção extracelular da tromboplastina ou uma sua fracção.
    - 7a Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4 caracterizado por a proteína que se funde à imunoglobulina ser a fracção extracelular de uma citoquina ou de um factor de crescimento ou uma sua fracção.
    - 8a Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por a proteína que se funde à imunoglobulina ser a fracção extracelular do receptor da IL-4 ou uma sua fracção.
    - 9a Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por a proteína que se funde à imunoglobulina ser a fracção extracelular do receptor da IL-7 ou uma sua fracção.
    - 10a Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por a proteína que se funde à imunoglobulina ser a fracção extracelular do receptor do factor de necrose de tumores ou uma sua fracção.
    - 115 Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por a proteína que se funde à imunoglobulina ser a fraeção extracelular do receptor de G-CSF ou uma sua fraeção.
    - 12â Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por a proteína que se funde à imunoglobulina ser a fraeção extracelular do receptor de GM-CSF ou uma sua fraeção.
    - 13- Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por a proteína que se funde à imunoglobulina ser a fraeção extracelular do receptor da eritropoietina ou uma sua fraeção.
    - 14â Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4 caracterizado por a proteína que se funde à imunoglobulina ser uma proteína solúvel não de membrana ou uma sua fraeção.
    V
    - 15* Processo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por a proteína que se funde à imunoglobulina ser uma citoquina ou um factor de crescimento ou uma sua fracção.
    - 16* Processo de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por a proteína que se funde à imunoglobulina ser a eritropoietina ou uma sua fracção.
    - 17* Processo de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por a proteína que se funde à imunoglobulina ser GM-CSF ou G-CSF ou uma fracção duma destas proteínas.
    18* Processo de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por a proteína que se funde à imunoglobulina ser uma interleuquina da IL-1 à IL-8 ou uma fracção duma destas proteínas.
    Processo de acordo com qualquer das reivindi20 cações 1 a 18 anteriores caracterizado por se inserir adicionalmente um local de corte do factor Xa entre a fracção da imunoglobulina e a fracção não imunoglobulina.
    As requerentes reivindicam a prioridade do pedido alemão apresentado em 28 de Junho de 1990, sob o n2 P 40 20 607.6.
    Lisboa, 27 de Junho de 1991
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