JP7096458B2 - 抗vwf d’d3単一ドメイン抗体及びそれを含むポリペプチド - Google Patents
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Description
本発明は免疫療法の分野にある。特に、本発明は、フォン・ヴィルブランド因子(VWF)D’D3ドメインに対する単離単一ドメイン抗体(sdAb)及びそれを含むポリペプチド(例えば血液凝固因子など)ならびに治療におけるそれらの使用(例えば止血障害の防止及び処置など)に関する。
治療用タンパク質のインビボ半減期を延長し、それによりそれらの効率を増強することは医薬分野における主要な関心事である。多くの戦略がこの目的のために用いられてきた(タンパク質安定性及び溶解性を改善し、タンパク質分解を防止し、血流からのクリアランス速度を低下させる、PEG化を通じた又はFc融合タンパク質など共有結合修飾を含む)。そのようなアプローチは、異なる治療用タンパク質に、及び異なる障害、例えば血友病A(凝固VIII因子(FVIII)をコードする遺伝子中の欠損により起こされ、出生男児10,000名中1~2名に罹患する出血性疾患)などについて適用されてきた。血友病Aに罹患した患者は、精製血漿由来又は組換え産生FVIIIの注入で処置することができる。全ての市販のFVIII産物は、しかし、数時間(7~21時間、Van Dijk et al., Haematologica 2005 92:494-498)の短い半減期を有することが知られており、患者への頻繁な静脈内投与が要求される。このように、多くのアプローチがFVIII半減期を延長するために試みられてきた。例えば、凝固因子の半減期を延長するための開発におけるアプローチには、FVIII分子の化学的(PEG化)1又は遺伝子改変(Fc融合)2が含まれる。使用されているタンパク質工学にもかかわらず、しかし、現在開発中の長時間作用型FVIII産物は、限られた半減期を有すると報告されており、前臨床動物モデルにおいてわずか約1.5~2時間である。一貫した結果がヒトにおいて実証されており、例えば、rFVIIIFcによって、ADVATE(登録商標)と比較し、血友病A患者における半減期が1.7倍まで改善すると報告された。
本発明は、フォン・ヴィルブランド因子(VWF)D’D3ドメインに対する単離単一ドメイン抗体(sdAb)及びそれを含むポリペプチド(例えば血液凝固因子など)ならびに治療におけるそれらの使用(例えば止血障害の防止及び処置など)に関する。特に、本発明は特許請求の範囲により定義する。
本発明は、フォン・ビルブラント因子(VWF)D’D3ドメインに対する単離単一ドメイン抗体(sdAb)を治療用ペプチドに導入することにより、有意に増加した半減期を伴うポリペプチドが得られるとの発見に依存する。実際に、本発明に従ったキメラポリペプチドは、VWFからの解離低下を示し、より安定な複合体形成に導く。これによりクリアランス率の低下、及び、このように半減期の延長がもたらされる。例えば、本発明者らは、VWF D’D3ドメイン(FVIII-KB013bv)に対する2つの単離sdAbを挿入し、それによりBドメインを置換するキメラFVIIIポリペプチドが、野生型Bドメインレス FVIIIとの比較で、延長した半減期を示し(野生型FVIIIについてのT1/2は1.10時間(95%信頼区間:0.88~1.48時間))、FVIII-KB-013bvについてのT1/2は、血友病マウスにおいて測定した場合、2.11時間である(95%CI:1.66~2.92時間)。半減期延長は、このように、2.11/1.10=1.9倍である。VWF D’D3ドメインに対するsdAbも、本来であればVWFに結合しないタンパク質との複合体形成を誘導するために使用することができる。例えば、融合タンパク質FVII-KB013bv(FVII及びFVIIのC末端での2つの単離sdAbからなる)(しかし、FVIIではない)は、VWFと複合体を形成することが見出された。さらに、本発明者らは、その半減期をさらに改善するために、そのようなキメラFVIIIポリペプチドがVWFバリアントと複合体化しうることも実証した(例、FVIII-KB013bv/D’D3-Fc)。従って、本発明者らは初めて、このような構造を用いた半減期の増加を実証した。
本発明の第2の態様は、ポリペプチド及び本発明のVWFに対する少なくとも1つの単一ドメイン抗体を含むキメラポリペプチドに関する。
別の態様では、本発明はキメラポリペプチド/VWF複合体に関し、そこでは、キメラポリペプチドは上記の本発明のキメラポリペプチドであり、延長された半減期を伴うVWFポリペプチドである。
別の態様では、本発明は、薬物としての使用のための、フォン・ビルブラント因子(VWF)D’D3ドメインに対する単離単一ドメイン抗体(sdAb)に関する。
治療用ポリペプチドのポリペプチド配列に、VWF D’D3ドメインに対する少なくとも1つの単一ドメイン抗体を加える工程を含む治療用ポリペプチドの半減期を延長又は増加させる方法も開示する。
一部の実施形態では、本発明のsdAbは、同種抗体の形成を低下させるのに適切である。特定の実施形態では、VWFに対する少なくとも1つの単一ドメイン抗体は、上記のようにVIII因子のBドメイン内に挿入されて、同種抗体の形成を低下させる。
実施例A:VWFのタンパク質ドメイン構造
VWFのcDNA配列及びタンパク質配列のバイオインフォマティクス分析によって、タンパク質構造によって異なる型のドメイン構造が区別されることが明らかになった。本来、このドメイン構造は、以下の順序で配置された、シグナルペプチド(SP)、Aドメイン、Bドメイン、Cドメイン、Dドメイン、及びCKドメインからなる:SP-D1-D2-D’-D3-A1-A2-A3-D4-B1-B2-B3-C1-C2-CK(Verweij CL et al., (1986) EMBO Journal, vol. 5, pp. 1839-1847)。最近では、更新されたドメイン構成が提案されており、そこでは、ドメインが以下の順序で配置されている:SP-D1-D2-D’-D3-A1-A2-A3-D4-C1-C2-C3-C4-C5-C6-CK(Zhou YF et al., (2012) Blood, vol 120, pp. 449-458)。異なるドメインの境界は、出版物から別の出版物で変動しうるため、本発明者らは、本願では、Lenting PJ et al., (2015) Blood, vol 125, pp. 2019-2028の図1中で定義される境界を使用する。
sdAbs KB-VWF-008、011、及び013を、ハーフウェルマイクロタイタープレート(Greiner Bio-One、フランス、レ・ジュリス)中での50mMの容量の10mM NaHCO3、50mM Na2CO3(pH9.5)中に4℃で16時間にわたり固定化した(5μg/mL)。陽性対照として、ポリクローナルウサギ抗VWF抗体(Dako、デンマーク、グロストルプ)も同様の様式で固定化した。陰性対照として、抗体は固定化しなかった。0.1%Tween-20(TBS-T)を添加したTris緩衝生理食塩水(pH 7.6)(75μl/ウェル)を使用してウェルを3回洗浄した後、ウェルを、3%ウシ血清アルブミン(BSA)を添加したTBS-T(75μl/ウェル)を用いて30分間にわたり37℃でブロックした。ウェルを上に記載するように洗浄し、その後、以下のVWF調製物(3%BSAを添加したTris緩衝化生理食塩水(pH7.6)で希釈、全て2μg/ml、50μl/ウェル、37℃で2時間)を、固定化sdAb及び両方の型の対照ウェルの各々に加えた:
-精製組換えヒトVWF(rhVWF)、
-精製組換えマウスVWF(rmVWF)、
-VWFフラグメントSpII(VWFの残基2129~2813を包含する、黄色ブドウ球菌V8プロテアーゼとのインキュベーション後の血漿由来の(pd)-VWFのタンパク質分解フラグメント;Denis C et al., (1993) Arteriosclerosis Thrombosis, vol 13, pp. 398-406)、
-VWFフラグメントSpIII(VWFの残基764-2128を包含する、黄色ブドウ球菌V8-プロテアーゼとのインキュベーション後のpd-VWFのタンパク質分解フラグメント;Kalafatis M et al., (1987) Blood, vol 70, pp. 1577-1583)、
-D’D3-HPC4フラグメント(抗体HPC4についての認識部位を表すアミノ酸配列EDQVDPRLIDGK(配列番号15)に融合されたヒトVWF残基764~1247)、
-A1-A2-A3-HPC4フラグメント(アミノ酸配列EDQVDPRLIDGKに融合されたヒトVWF残基1260~1874)、
-hD1-D2-HPC4フラグメント(アミノ酸配列EDQVDPRLIDGKに融合されたヒトVWF残基23~762)、
-mD1-D2-HPC4フラグメント(アミノ酸配列EDQVDPRLIDGKに融合されたマウスVWF残基23~762)
- :陰性結合を、OD≦0.5であると定義する;
+:中程度の陽性結合を、OD> 0.5- <1.0であると定義する;
++:強陽性結合を、≧1.0であると定義する。
VWFとsdAbの間での相互作用を、Octet-QK機器(Fortebio、米国カリフォルニア州メルドパーク)を使用したバイオレイヤー干渉法を介して分析した。この目的のために、sdAbs KB-VWF-008、011、及び013を、EDC/NHS活性化アミン反応性バイオセンサー(Fortebio、米国カリフォルニア州メルドパーク)へのカップリングのために、10μg/mlの濃度まで0.1M Mes(pH5.0)中で希釈した。センサーを0.2mlの0.1M MES、pH5.0中で300秒間にわたり再水和させた。センサーを次に、0.1mlの0.2M EDC/0.095M NHS混合物との300秒間にわたるインキュベーションにより活性化し、その後0.1mlのsdAb溶液と600秒間にわたりインキュベートした。非占有アミン反応部位を、1Mエタノールアミンとの180秒間にわたりインキュベートすることによりクエンチし、センサーを、0.1%Tween-20(PBS-T)を添加したリン酸緩衝生理食塩水との300秒間にわたるインキュベーションを介して、安定したベースラインレベルに到達させた。sdAbでコーティングされたセンサーを次に、種々の濃度の精製血漿由来VWF(KB-VWF-008及び011についてのPBS-T中の2.5、25、及び250μg/ ml対KB-VWF-013についての25及び250μg/ml)を含むウェルに移し、固定化sdAbへのVWFの会合を視覚化するために、600秒間にわたりインキュベートした。この会合段階の後、センサーをPBS-Tを含むウェルに移し、900秒間にわたりインキュベートし、VWF-sdAb複合体の解離を可能にした。
ポリクローナルウサギ抗VWF抗体(Dako、デンマーク、グロストルプ)を、50mM Na2CO3(pH9.5)中の5μg/mlで、一晩4℃で50μlの容量でマイクロタイターウェル上に固定化した。0.1%Tween-20(TBS-T)を添加したTris緩衝生理食塩水で3回洗浄後、ウェルをTBS-T中の3%BSAで飽和させた。次に、rVWF(0.03~1.0μg/ml;50μl/ウェル)をウェルに加えて、4℃で一晩インキュベートした。TBS-T中での洗浄後、ウェルを75μlの0.35M CaCl2を用いて2回、37℃で10分間にわたりインキュベートし、TBTS-T(75μl/ウェル)を用いた6回の洗浄が続いた。次に、1.5U/mlの濃度に希釈したrFVIII(Kogenate-FS、Bayer Healthcare)を、20μg/mlのsdAb KB-VWF-008、-11、又は-013の存在下又は非存在において50μlの全容量で加えた。対照として、FVIIIを、VWFへのFVIIIの結合をブロックするマウスモノクローナル抗VWF抗体Mab418の存在において加えた(Takahashi Y et al., (1987) Blood vol 70, pp 1679-1682)。37℃で2時間及びTBS-T(75μl/ウェル)で3回洗浄後、結合したFVIIIを、ペルオキシダーゼ標識ポリクローナルヒツジ抗FVIII抗体(Stago BNL、オランダ、ライデン)を使用してプローブし、3,3’,5,5’テトラメチルベンジジンのペルオキシダーゼ媒介性加水分解を測定することにより検出した。各々のVWF濃度について、sdAb又はMab418の存在におけるFVIII結合を、sdAb又はMab418の非存在におけるFVIII結合と比べて算出し、結合パーセンテージ(%)で表した(図2)。Mab418の存在によって、VWFへのFVIIIの結合が72±5%(平均値±標準偏差;n=6;対照と比較してp<0.001)だけ低下したのに対し、各々のsdAbの存在によって、いずれの抗体の非存在と同様のFVIII結合が残った(複数比較を用いた一方向ANOVAを使用してテストした場合、p>0.05)。これは、sdAbs KB-VWF-008、-011、及び-013がVWFへのFVIIIの結合に干渉しないことを示す。
野生型BドメインレスFVIII(WT-FVIII-SQ)、1680位のTyrからPheへの置換を含むBドメインレスFVIII(FVIII-SQ/p.Y1680F)及び1680位のTyrからPheへの置換を含むFVIII-KB013bv(FVIII-KB013bv/p.Y1680F)をコードするcDNA構築物をpLIVE-プラスミド(Mirus Bio、米国ウィスコンシン州マディソン)にクローニングした。1680位のチロシンは、WT-FVIII-SQ中で硫酸化されており(フォン・ビルブラント因子(VWF)への結合の必要条件)、Pheへのp.Tyr1680の変異は、VWF結合の喪失と関連付けられる(Leyte A et al., (1991) J Biol Chem vol 266, pp 740-746)。プラスミド(100μg/マウス)を、流体力学的遺伝子導入を介してVIII因子欠損マウス中に注射した:プラスミドは、動物の体重の10%(即ち、20グラムのマウスについては2ml)に相当する容量を用いて、0.9%生理食塩水中に希釈した。溶液を5秒以内に尾静脈に注入する。遺伝子導入の4日後、血液を、イソフルラン麻酔マウスから眼窩後穿刺を介して採取し、血漿を遠心分離(22℃で20分間にわたり1500g)により調製した。血漿を次に使用し、マウスの血漿中に形成されたVWF-FVIII複合体を測定した。複合体は以下のように決定した:マイクロタイターウェルを、実施例Dに記載するように、ポリクローナルウサギ抗VWF抗体(5μg/ml)を用いてコーティングした。0.1%Tween-20(TBS-T)を添加したTris緩衝生理食塩水で3回洗浄後、ウェルをTBS-T中の3%BSAを用いて飽和させた。次に、マウス血漿サンプル(TBS-Tで10倍に希釈)をウェルに加え、37℃で2時間にわたりインキュベートした。TBS-T(75μl/ウェル)での3回洗浄後、結合したFVIIIを、ペルオキシダーゼ標識ポリクローナルヒツジ抗FVIII抗体(Stago BNL、オランダ、ライデン)を使用してプローブし、3,3’,5,5’テトラメチルベンジジンのペルオキシダーゼ媒介性加水分解を測定することにより検出した。変異体FVIII-SQ/p.Y1680F及びFVIII-KB013bv/p.Y1680FについてのVWF複合体の量は、任意に100%として設定した、WT-FVIII-SQの量と関連していた。予測された通り、VWFとの複合体形成は、変異体FVIII-SQ/p.Y1680Fについては強く低下した(WT-FVIII-SQについての100%と比較して8%;図3を参照のこと)。対照的に、結合は、VWF結合性sdAbを含むバリアントFVIII-KB013bv/p.Y1680Fについては2.4倍(238%)増加した。p.Y1680F変異は自然のVWF結合を無効にするため、これらのデータは、VIII因子タンパク質中に組み込まれながら、sdAb KB-VWF-013はVWFへの結合を救済することができることを示す。このように、融合タンパク質との関連において、sdAb KB-VWF-013は、VWF結合に寄与する。
ベビーハムスター腎臓(BHK)細胞を、pcDNA3.1/Hygro中にクローン化されたFVIII-KB013bvをコードするcDNAを用いてトランスフェクトし、ハイグロマイシンを用いた選択を介して安定な細胞株を得た。1つのクローンをFVIII-KB013bvの産生のために選択した。FVIII-KB013bvを、製造者(GE Healthcare、フランス、ヴェリジー=ヴィラクブレー)が指示する通り、VIIISelect-マトリックスを使用した親和性クロマトグラフィーを介して培地から精製した。精製したFVIII-KB013bvを活性及び抗原についてテストした。5つのトップフラクションを選択し、発色2段階活性(Biophen FVIII:C;Hyphen Biomed、フランス、ヌーヴィル=シュル=オワーズ)及びVIII因子抗原レベル(Girma JP et al., (1998) Haemophilia vol 4 pp 98-103)を決定した。平均活性は188±42U/ml(平均値±標準偏差;n=5連続溶出画分)であることが見出され、抗原は176±28U/mlであると算出された。平均活性/抗原比は1.1±0.3であり、FVIII-KB013bvが発色2段階活性アッセイにおいて完全な活性を呈することを示した。
精製したWT-FVIII-SQ又はFVIII-kb013bv(両方ともBHK-M細胞において産生され、VIII選択親和性クロマトグラフィーを使用して精製した)をFVIII欠損マウスに静脈内(250-500U/kg)投与した。注射後の異なる時間点(WT-FVIII-SQについては3分、30分、1時間、2時間、8時間、及び24時間、ならびにFVIII-KB013bvについては3分、4時間、9時間、21時間、29時間、及び48時間)に、血液サンプルをイソフルラン麻酔マウスからの眼窩後穿刺を介して得て、血漿を遠心分離(22℃で20分間にわたり1500g)により調製した。残留FVIII活性を、製造者(Biophen FVIII:C;Hyphen Biomed、フランス、ヌーヴィル=シュル=オワーズ)により指示された通りに、発色2段階アッセイを使用して測定した。注射後3分目での活性と比べた残留FVIII活性を、注射後の時間に対してプロットした(図5)。このアプローチによって、FVIII-KB013bvについての活性が、後の時間点でより高いWT-FVIII-SQのままであることが明らかになった。例えば、24時間でのWT-FVIIIについての相対的残留FVIII活性は0.72±0.23%(n=3)であったのに対し、FVIII-KB013bvについては、29時間での相対残留活性は3倍以上であった(2.62±0.25%;n=3;スチューデントt検定においてp=0.0007)。データを、単一の指数関数的減衰(Graph Prism 5 for Mac OSX、GraphPad Software、米国カリフォルニア州ラホーヤ)を記載する等式を使用して分析した場合、WT-FVIII-SQについて算出された半減期は1.1時間であった(95%信頼区間0.9~1.5時間)。FVIII-KB013bvについては、半減期は2.1時間と算出し(95%信頼区間1.7~2.9時間;WT-FVIII-SQと比較してp=0.0032)、WT-FVIII-SQについての半減期より2倍長い。これらの結果は、2つのコピーのsdAb KB-VWF-013の存在が、FVIIIの生存に対して有意な有益な効果を有することを示す。
8~12週齢の血友病マウスに、静脈内尾注入を介して500U/kgの用量でWT-FVIII-SQ(Xyntha)又はFVIII-KB013bvを与えた。注射から24時間後、尾部の末端3mmをケタミン/キシラジン麻酔マウスから切断した。切断した尾部を、切断直後に、温かい生理食塩水で満たした50mlチューブ中に浸漬した。血液を37℃で30分間にわたり採取した。30分後、血液と生理食塩水の混合物を1500gで遠心分離した。赤血球ペレットを次にH2O中に溶解し、ヘモグロビンの量を、416nmで吸光度を読み取ることにより得た。各々のサンプル中の喪失した血液の容量を、上に記載するようにヘモグロビンを抽出するために、H2O中のマウス血液の一定量(20μl、40μl、60μl、80μl、及び100μl)を溶解することにより得られた標準曲線から算出した。各々のマウスについての血液喪失量を図6中に提示する。FVIII-KB013bvを注射したマウスについては、平均血液喪失量は13±3μl(平均値±標準偏差;n=3マウス)と算出された。WT-FVIII-SQを投与したマウスについては、平均血液喪失量は194±146μL(平均値±標準偏差;n=5マウス)であり、それは、FVIII-KB013bvを注射したマウスと比較して有意に高かった(p=0.0043、マン・ホイットニー検定を使用して決定)。このように、FVIII-KB013bvは、WT-FVIII-SQよりも長い期間にわたり止血活性を呈する。
VWF及びFVIIIは複合体として血漿中を循環するが、同種抗体がこれらのタンパク質の治療的適用後に発生する程度に顕著な差がある。補充療法に応答したVWFへの同種抗体の発生は、重度フォン・ビルブラント疾患を伴う患者の5~10%を含むと推定されている(James et al., (2013) Blood vol 122, pp 636-640)。対照的に、阻害性同種抗体は、以前に未処置の血友病A患者の27%までにおいて発生する(Iorio et al., (2010) JTH vol 8, pp 1256-1265)。
VWFを認識するsdAbがVWFへのFVIII以外のタンパク質の結合を媒介することができるか否かを決定するために、KB-VWF-013の2つのコピーに融合したヒト凝固VII因子(FVII)の配列をコードするcDNAを構築した。FVII及びKB-VWF-013をコードする配列を、トロンビン切断部位をコードするリンカー配列により分離した。このcDNA及び対応するタンパク質の全配列をFVII-KB13-bvとして言及する。FVII-KB-13-bv及びWT-FVIIをpLIVE-プラスミド(Mirus Bio、米国ウィスコンシン州マディソン)中にクローニングした。プラスミドを、流体力学的遺伝子導入を介して野生型C57B16-マウス中に注射した(100μg/マウス):プラスミドを、動物の体重の10%(即ち、20gマウスについて2ml)に相当する容量で0.9%生理食塩水中に希釈した。溶液を5秒以内に尾静脈に注射する。遺伝子導入の4日後、血液を、イソフルラン麻酔マウスから眼窩後穿刺により採取し、血漿を遠心分離(22℃で20分間にわたり1500g)により調製した。血漿を次に使用し、マウスの血漿中に形成されたVWFとFVII又はFVII-KB13-bvの間の複合体を測定した。複合体は以下のように決定した:マイクロタイターウェルを、50μlの炭酸緩衝液(0.07M NaHCO3、0.03M Na2HCO3、pH 9.6)中2.5μg/mlの濃度でポリクローナルヒツジ抗ヒトFVII抗体(Affinity Biologicals、カナダオンタリオ州アンカスター)で、4℃で一晩コーティングした。ウェルを、0.1%Tween-20(TBS-T)を添加したTris緩衝生理食塩水で3回洗浄し、次にTBS-T中の5%BSA、1%ポリビニルピロリドン(PVP)を用いて37℃で2時間にわたり飽和させ、再びTBS-Tで5回洗浄する。次に、マウス血漿サンプル(1%BSAを含む50μlのTBS-T中で10倍に希釈)をウェルに加え、37℃で2時間にわたりインキュベートした。TBS-T(75μl/ウェル)で5回洗浄後、結合したFVII又はFVII-KB13-bvを、ペルオキシダーゼ標識ポリクローナルウサギ抗VWF抗体(Dako)を使用してプローブし、3,3’,5,5’-テトラメチルベンジジンのペルオキシダーゼ媒介加水分解を測定することにより検出した。FVIIを発現するマウスについては、バックグラウンドを超えるシグナルは検出されず(OD450nm=-0.038±0.033;平均値±標準偏差;n=4マウス)、VWFとFVIIの間に複合体が存在しないことを示唆する。対照的に、明確なシグナルが、FVII-KB13-bvを発現する各々のマウスからの血漿について観察された(OD450nm=0.684±0.554;n=4;p=0.029、マン・ホイットニー検定を用いて分析)。これによって、sdAb KB-VWF-013へのFvIIの融合により、循環VWFへのタンパク質の会合が誘導されることが実証される。
Claims (16)
- フォン・ビルブラント因子(VWF)D’D3ドメインに対する単離された単一ドメイン抗体(sdAb)であって、前記sdAbが、配列番号1として示す配列を有するCDR1、配列番号2として示す配列を有するCDR2、及び配列番号3として示す配列を有するCDR3か、配列番号5として示す配列を有するCDR1、配列番号6として示す配列を有するCDR2、及び配列番号7として示す配列を有するCDR3か、又は配列番号9として示す配列を有するCDR1、配列番号10として示す配列を有するCDR2、及び配列番号11として示す配列を有するCDR3、を含む、単離された単一ドメイン抗体。
- 前記sdAbが、KB-VWF-013(配列番号4)、KB-VWF-008(配列番号8)、又はKB-VWF-011(配列番号12)である、請求項1記載の単離された単一ドメイン抗体。
- ポリペプチド及び請求項1又は2記載のVWFに対する少なくとも1つのsdAbを含むキメラポリペプチド。
- 前記キメラポリペプチドが、野生型ポリペプチドとの比較で、VWFについての増加した親和性及び/又は低下した解離速度定数を有する、請求項3記載のキメラポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、FVII、FVIII、プロテインC、及びプロテインSからなる群より選択される凝固因子である、請求項3又は4記載のキメラポリペプチド。
- 前記sdAbが、少なくとも1つの請求項1又は2に記載の単一ドメイン抗体を含み、単一ドメイン抗体が、治療用ポリペプチドのN末端に、C末端に、若しくはN末端及びC末端の両方に融合されるか、又は治療用ポリペプチドの配列内に挿入される、請求項3記載のキメラポリペプチド。
- VWFに対する2つ、3つ、4つ、又は5つのsdAbを含む、請求項3~6のいずれか一項記載のキメラポリペプチド。
- VWFに対する2つのsdAbが、i)VIII因子のBドメインのC末端部分を置換している(FVIII-KB13-bv)(配列番号13;配列番号16;若しくは配列番号17);ii)FVIIIのC末端に融合されている(配列番号18;若しくは配列番号19);iii)同時に、VIII因子のBドメインのC末端部分を置換し、VIII因子のC末端に融合されている(配列番号20;配列番号21;配列番号22;若しくは配列番号23);又はiv)VII因子のC末端に挿入されている(配列番号14)、請求項3~7のいずれか一項記載のキメラポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、第1の抗原に対する少なくとも1つの単一ドメイン抗体及び第2の抗原に対する少なくとも1つのさらなる結合部位を含む、請求項3~8のいずれか一項記載のキメラポリペプチド。
- キメラポリペプチドが、請求項3~9のいずれか一項記載のキメラポリペプチドであり、VWFが、延長された半減期を伴うVWFポリペプチドである、キメラポリペプチド/VWF複合体。
- 請求項3~9のいずれか一項記載のキメラポリペプチド又は請求項10記載のキメラポリペプチド/VWF複合体を含む、医薬組成物。
- 請求項1又は2記載のVWF D’D3ドメインに対する単離されたsdAb、請求項4~9のいずれか一項記載のキメラポリペプチド、又は請求項10記載のキメラポリペプチド/VWF複合体を含む、医薬。
- 請求項1又は2記載のVWF D’D3ドメインに対する単離されたsdAb、請求項4~9のいずれか一項記載のキメラポリペプチド、又は請求項10記載のキメラポリペプチド/VWF複合体を含む、出血障害を予防又は治療するための医薬組成物。
- 請求項4~9のいずれか一項記載のキメラポリペプチド又は請求項10記載のキメラポリペプチド/VWF複合体を含む、出血障害を予防又は治療するための医薬組成物。
- 前記出血障害が、血友病A又は血友病Bである、請求項14記載の医薬組成物。
- 治療用ポリペプチドのポリペプチド配列に、請求項1に記載のVWF D’D3ドメインに対する少なくとも1つのsdAbをエキソビボで加える工程を含む、該治療用ポリペプチドの半減期を延長又は増加させる方法。
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