JP2006517789A - 治療用ポリペプチド、その相同物、その断片、および血小板媒介凝集の調節での使用 - Google Patents
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Abstract
Description
血管が損傷を受けると、内皮下構造体が露出し、それによってフォンウィルブランド因子(vWF)との相互作用により血小板の接着が媒介される。vWFは、損傷を受けた血管壁内のコラーゲンおよび血小板受容体糖タンパク質Ib(gpIb)との間に架橋を形成するが、この相互作用は高ずり応力条件下では特に重要であり、これにより止血栓が形成され過剰な出血が防止される(Bennett S, Thromb Haemost (2001) Mar; 85(3): 395-400(非特許文献1))。正常な止血中は、こうしたプロセスによって損傷を受けた血管壁は創傷治癒される。しかし、病的状態では、過剰な血小板機能によって血栓が形成される可能性がある。vWFサブユニットは、いくつかの相同ドメインから構成されそれぞれが異なる機能を司る。vWFは、そのA3ドメインによって繊維状コラーゲンと相互作用し、そのA1ドメインによって血小板受容体gpIbと相互作用する。通常の条件下では、血小板とvWFは相互に作用しない。しかし、高ずり速度でvWFがコラーゲンに結合した場合には、高次構造が変化を受けて血小板受容体gpIbとの結合が可能になると考えられている。この可逆的接着によって血小板は損傷を受けた領域を転がるようになり、続いて血小板上のコラーゲン受容体(gpIa/IIa、gpVI、gpIV、p65、TIIICBP)によって強固に接着し、その結果血小板が活性化される。それによって、gpIIb/IIIa受容体の活性化、フィブリノーゲン結合、最後に血小板凝集が生じる。
Thromb Haemost (2001) Mar; 85(3): 395-400 Journal of Vascular Surgery, 2001, 34: 724-729、 Vasc Endovascular Surg. 2003 Jul-Aug; 37(4): 259-69 Eur J Pharmacol. 2002 May 17; 443(1-3): 143-9 Thromb Res., 2001 Mar 1; 101(5): 395-404 Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2000 Oct; 20(10): 2303-8 Hemostasis, thrombosis and vascular biology, 2002, 99: 3623-3628 Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular biology, 2000, 20: 1347 Blood, 1994, 83: 3218-3224、 Blood, 1989, 74: 690-694 Thromb. Haemost. 1999 , 82: 528a要約
本発明の目的は、血小板媒介凝集を調節する必要がある状態の治療であって、従来技術の問題を克服する治療のために、vWF、vWF A1ドメイン、活性化vWFのA1ドメイン、vWF A3ドメイン、gpIbおよび/またはコラーゲンに対する1以上の単一ドメイン抗体を含むポリペプチド、このポリペプチドの相同物、および/またはこのポリペプチドの機能部分を提供することである。さらに、前記ポリペプチドの生産方法、そのようなポリペプチドで器具をコートし医療操作(たとえば、PCTA、ステント術)で使用する方法、血小板媒介凝集を調節する作用薬をスクリーニングするための方法およびキット、ならびに血小板媒介凝集に関係付けられる疾患の診断キットを提供することを目的とする。
血小板凝集の第1およびその後のステップに関与する標的分子を特異的に認識する単一ドメイン抗体が作製された。これによって有効で安全な抗血栓薬が得られる。
(a) 上記のポリペプチドをコードし得る核酸を含む宿主細胞を、ポリペプチドの発現を可能にする条件下で培養すること、および
(b) 前記培養物から産生したポリペプチドを回収すること
を含む上記のポリペプチドの生産方法である。
(a) 上記のポリペプチド構築体をその標的に対応するポリペプチドまたはその断片に、これらポリペプチド間の結合を可能にする条件下で候補モジュレータの存在下および非存在下に接触させること、および
(b) ステップ(a)のポリペプチド間の結合を測定し、この候補モジュレータの存在下での結合がこの候補モジュレータの非存在下での結合に比較して減少した場合には、この候補モジュレータは血小板媒介凝集を調節する作用薬であるとして同定されること、を含む。
(a) 上記のポリペプチド構築体に試料を接触させること、
(b) このポリペプチド構築体のこの試料への結合を検出すること、および
(c) ステップ(b)で検出された結合を基準の結合と比較し、
この試料に比較して結合に差があれば、血小板媒介凝集の機能異常を特徴とする疾病または疾患であると診断するステップ、を含む。
本発明は、それぞれが標的に対する1以上の単一ドメイン抗体を含むポリペプチド構築体、およびこの構築体が血小板媒介凝集に対して調節効果を有するという知見に関する。
本発明によれば、標的は、vWF、vWF A1ドメイン、活性化vWFのA1ドメイン、vWF A3ドメイン、gpIb、またはコラーゲンのいずれかである。前記標的は、哺乳動物のものであり、ウサギ、ヤギ、マウス、ラット、ウシ、子ウシ、ラクダ、ラマ、サル、ロバ、モルモット、ニワトリ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマなどの種に由来し、ヒトが好ましい。ヒトvWF配列を表30、配列番号48に示す。
単一ドメイン抗体は、その相補性決定領域が単一ドメインポリペプチドの一部である抗体である。その例には、重鎖抗体、本質的に軽鎖を欠く抗体、従来の4本鎖抗体に由来する単一ドメイン抗体、設計された抗体、抗体に由来するもの以外の単一ドメイン骨格が含まれるが、これらに限定されない。単一ドメイン抗体は、従来技術のどれでも、またはどんな将来の単一ドメイン抗体でもよい。単一ドメイン抗体は、どんな種からも派生させることもでき、例えばマウス、ヒト、ラクダ、ラマ、ヤギ、ウサギ、ウシが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の一態様によれば、本明細書で使用される単一ドメイン抗体は、軽鎖を欠く重鎖抗体として知られている天然に存在する単一ドメイン抗体である。そのような単一ドメイン抗体は、たとえば、国際公開第9404678号に開示されている。明瞭にするために、本質的に軽鎖を欠く重鎖抗体に由来するこの可変ドメインを本明細書ではVHHまたはナノボディーとして記載し、これを4本鎖免疫グロブリンの従来型VHと区別する。そのようなVHH分子は、ラクダ科種、たとえば、ラクダ、ラマ、ヒトコブラクダ、アルパカ、グアナコから生じた抗体から得ることができる。ラクダ科に加え、他の種も、本質的に軽鎖を欠く重鎖抗体を産生することができ、そのようなVHHも本発明の範囲に属する。
本発明は、さらに、ポリペプチド構築体に関し、その場合、単一ドメイン抗体は本明細書に記載した標的に対するVHHであり、その場合、VHHはヒト様配列を含むクラスに属する。VHHが、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、メチオニン、セリン、トレオニン、アスパラギン、またはグルタミンからなる群からのアミノ酸を位置45に、たとえば、カバット(Kabat)の番号付けによるL45に有することがこのクラスの特徴である。vWFに結合する配列番号1および配列番号3によって表されるVHH配列は、VHHポリペプチドのこのヒト様クラスに属する。そのようなものとして、このクラスに属するペプチドは、ヒトVHフレームワーク領域のアミノ酸配列に高い相同性があるので、このペプチドをヒトに直接投与しても、望ましくない免疫応答が生じる懸念もなく、さらにヒト化する負担もない。
ラマ、ヒトコブラクダ、およびラクダで天然に存在する単一ドメイン抗体が発見されたことによって、モノクローナル抗体の利点、たとえば、特異性や低毒性と、小分子の利点、たとえば、組織透過性や安定性を併せ持つ新規なクラスの治療用分子が明らかになった。遺憾ながら、これらのタンパク質に基づく適切な治療用産生物の開発は、ラクダ科由来であり、したがって、ヒト由来ではないという欠点がある。非ヒトタンパク質は、ヒト患者に注入した場合、免疫原性を有する恐れがあるアミノ酸残基を含む。研究では、ラクダ科由来VHHはマウスに注入した場合免疫原性を持たないことが示されているが、ラクダ科残基をヒト残基に置換することが好ましい。これらのヒト化ポリペプチドは、ヒトで実質的に非免疫原性であるが、野生型ポリペプチドの親和性および活性は保持しているはずである。
(a) 以下の残基のいずれかを単独でまたは組み合わせて置換するステップを含む:
FR1の位置1、5、28および30、
FR2の位置37、44、45、および47にあるホールマーク(hallmark)のアミノ酸、
FR3の残基74、75、76、83、84、93、および94、および
FR4の位置103、104、108、および111
番号付けはKabatの番号付けによる。
SerをSer、Thr、Gly、およびAsnによって置換;
ArgをArg、His、Gln、Lys、およびGluの1つによって置換;
LeuをLeu、Ile、Phe、Tyr、Met、およびValの1つによって置換;
ProをPro、Gly、Ala、およびThrの1つによって置換;
ThrをThr、Pro、Ser、Ala、Gly、His、およびGlnの1つによって置換;
AlaをAla、Gly、Thr、およびProの1つによって置換;
ValをVal、Met、Tyr、Phe、Ile、およびLeuの1つによって置換;
GlyをGly、Ala、Thr、Pro、およびSerの1つによって置換;
IleをIle、Met、Tyr、Phe、Val、およびLeuの1つによって置換;
PheをPhe、Trp、Met、Tyr、Ile、Val、およびLeuの1つによって置換;
TyrをTyr、Trp、Met、Phe、Ile、Val、およびLeuの1つによって置換;
HisをHis、Glu、Lys、Gln、Thr、およびArgの1つによって置換;
GlnをGln、Glu、Lys、Asn、His、Thr、およびArgの1つによって置換;
AsnをAsn、Glu、Asp、Gln、およびSerの1つによって置換;
LysをLys、Glu、Gln、His、およびArgの1つによって置換;
AspをAsp、Glu、およびAsnの1つによって置換;
GluをGlu、Asp、Lys、Asn、Gln、His、およびArgの1つによって置換;
MetをMet、Phe、Ile、Val、Leu、およびTyrの1つによって置換。
本発明にしたがって有用な細胞は、細菌細胞たとえば大腸菌など、酵母細胞たとえばS.セレビシエやP.パストリスなど、昆虫細胞、または哺乳動物細胞からなる群から選択することが好ましい。
本発明によるハイスループットスクリーニングキットは、血小板媒介凝集を調節する作用薬の検出を実施するために必要な手段および媒体をすべて含み、本発明の標的、たとえば、vWFやその断片などに、ポリペプチド(たとえば、配列番号1〜15、20〜34、38〜45、62〜65によって表されるポリペプチド、またはポリペプチド構築体)の好ましくは1μM〜1mMの濃度範囲での存在下に、相互作用させることによって検出する。キットは、以下を含む。vWFをコードするヌクレオチド配列またはその断片を含み発現する本発明の組換え細胞であって、キットにしたがってマイクロタイタープレートなどの固体支持体で、より好ましくは、96穴マイクロタイタープレート上で、当業者に周知の方法、特に国際公開第00/02045号に記載されている方法にしたがって増殖する細胞。あるいは、vWFまたはその断片が、たとえば、当業者が96穴マイクロタイタープレート上に固定するために精製形で提供される。あるいは、vWFまたはその断片は、たとえば、96穴マイクロタイタープレート上に予め固定されてキットに提供される。あるいは、スクリーニングすべき巨大分子が、gpIb、gpIa/IIa、またはコラーゲンである場合、上記実施形態は、vWFの代わりに、それぞれ、gpIb、gpIa/IIa、またはコラーゲンのポリペプチドまたはポリ核酸を含むことになる。キットには、1種を超える巨大分子(例えばvWF、gpIb、コラーゲン巨大分子、および/またはポリ核酸)を含めてもよい。本発明によるモジュレータ作用薬は、適切な濃度のポリペプチド構築体の存在下、濃度約1μM〜1mM以上で所定のウェルに加える。前記ポリペプチドの前記濃度は、1μM〜1mMの範囲が好ましい。キットには、1種を超えるポリペプチドを含めてもよい。
本発明は、血小板媒介凝集モジュレータのスクリーニングに有用なキット、および調節不全血小板媒介凝集を特徴とする疾病または疾患の診断に有用なキットを準備する。本発明にしたがって有用なキットには、単離したvWFまたはその断片を含めてもよい。あるいは、またはさらに、キットには、vWFまたはその断片を発現させるために形質転換した細胞を含めてよい。別の実施形態では、本発明によるキットにはvWFをコードするポリヌクレオチドまたはその断片を含めてよい。さらに別の実施形態では、本発明によるキットには、vWFまたはその断片の増幅に有用な特異的プライマーを含めてよい。あるいは、スクリーニングすべき巨大分子がgpIbまたはコラーゲンである場合、上記実施形態は、vWFの代わりに、それぞれ、gpIb、gpIa/IIa、コラーゲンのポリペプチド、またはポリ核酸、あるいはそれらの断片を含むことになる。キットには、1種を超える巨大分子(たとえば、vWF、gpIb、コラーゲンの巨大分子、またはポリ核酸、あるいはそれらの断片)を含めてもよい。本発明にしたがって使用可能なキットには、単離した、配列番号1〜15、20〜47、または62〜65のいずれかによって表されるポリペプチド、その相同物、またはその機能部分、あるいは本発明によるポリペプチド構築体を含めてよい。本発明によるキットには、前記ポリペプチドを発現させるために形質転換した細胞を含めてよい。キットには、1種を超えるポリペプチドを含めてもよい。別の実施形態では、本発明によるキットには、巨大分子、たとえば、vWF、gpIb、コラーゲン、またはその断片をコードするポリヌクレオチドを含めてよい。さらに別の実施形態では、本発明によるキットには、たとえば、vWF、gpIb、コラーゲン、またはその断片などの巨大分子の増幅に有用な特異的プライマーを含めてよい。したがって、本発明によるキットはすべて、記載した項目もしくは項目の組合せ、およびパッケージング材を含む。キットは、使用説明書も含む。
本発明は、本発明のポリペプチド構築体または本発明のスクリーニング法から得られた作用薬でコートした侵襲性医療器具も、それを必要とする器具で使用するために提供する。器具の例には、外科用チューブ、閉塞用器具、補綴用器具が含まれるが、これらに限定されない。前記器具の用途には、侵襲部位周囲の血小板媒介凝集の調節を必要とする外科操作が含まれる。
実施例1.ラマ002の免疫化
実施例2.レパートリークローニング
実施例3.ライブラリのレスキュー、ファージの調製
実施例4.第1巡および第2巡のパニングによる、コラーゲンとの相互作用を阻害するvWF結合物質の選択
実施例5.vWF結合物質の機能特徴付け。VHHによるvWFとコラーゲンの結合の阻害
実施例6.VHHの発現および精製
実施例7.vWFへのELISA結合
実施例8.VHHの特異性
実施例9.精製VHHを用いた阻害ELISA
実施例10.クローンの配列決定
実施例11.エピトープマッピング
実施例12.二価かつ二重特異性VHHの発現および精製
実施例13.ELISAでのvWFへの結合
実施例14.精製VHHを用いた阻害ELISA
実施例15.ヒト血漿中二価または二重特異性構築体の安定性
実施例16.高ずり応力下でのVHHによる阻害を評価
実施例17.パニングによる、血小板との相互作用を阻害するvWF結合物質の選択
実施例18.vWFのA1ドメインへの結合のスクリーニング
実施例19.MATCHMを用いた、血小板との相互作用を阻害するvWFの結合物質の選択
実施例20.精製VHHのvWFへのELISA結合
実施例21.精製VHHを用いた阻害ELISA
実施例22.クローンの配列決定
実施例23.高ずり応力下でのVHHによる阻害を評価
実施例24.二価VHHの発現および精製
実施例25.高ずり応力下でのVHHによる阻害を評価
実施例26.二重特異性構築体の構築および配列
実施例27.二重特異性構築体の発現および精製
実施例28.vWFへの結合
実施例29.一価VHHと比較した二重特異性構築体によるvWFとコラーゲンの結合の阻害
実施例30.高ずり応力下でのVHHによる阻害を評価
実施例31.コラーゲンI型への結合物質の選択
実施例32.VHHのコラーゲンI型およびIII型への結合についてELISAで試験
実施例33.クローンの配列決定
実施例34.精製VHHとコラーゲンI型およびIII型の結合
実施例35.vWFとの相互作用を阻害するコラーゲンI型結合物質の選択
実施例36.VHHのコラーゲンI型およびIII型への結合についてELISAで試験
実施例37.クローンの配列決定
実施例38.精製VHHとコラーゲンI型およびIII型の結合
実施例39.コラーゲン特異的VHHによるvWFとコラーゲンの結合の阻害をELISAで試験
実施例40.低および高ずり応力下でコラーゲン特異的VHHによる血小板凝集阻害を試験
実施例41.ラマの免疫化
実施例42.レパートリークローニング
実施例43.ライブラリのレスキュー、ファージの調製
実施例44.ファージELISA
実施例45.選択第1巡および第2巡のバイオパニング
実施例46.バイオパニング後の個々のクローンのスクリーニング
実施例47.HinfIパターンおよび配列決定
実施例48.異なる種のアルブミンを用いて交差反応性を試験
実施例49.発現および精製
実施例50.精製ナノボディーのMSAに対するELISA
実施例51.二重特異性構築体の構築および配列
実施例52.二重特異性構築体の発現および精製
実施例53.二重特異性構築体の両VHHの機能性
実施例54.一価VHHと比較した二重特異性構築体によるvWFとコラーゲンの結合の阻害
実施例55.rgpIb結合物質の選択
実施例56.ELISAでの結合物質のスクリーニング
実施例57.精製VHHとrgpIbの結合
実施例58.クローンの配列決定
実施例59.gpIbに特異的なVHHの阻害特性を試験
実施例60.高ずり応力下でのVHHによる阻害を評価
実施例61.VHHの安定性
実施例62.ポリマー中に固定したVHH
実施例63.C37とDP-47の配列比較
実施例64.C37の変異誘発
実施例65.vWF-C37のVHH-CDR3断片の発現
実施例66.組換えA1(rA1)に対する第1巡および第2巡のバイオパニングによる選択
実施例67.バイオパニング後の個々のクローンのスクリーニング
実施例68.HinfIパターンおよび配列決定
実施例69.阻害ELISA
実施例1:ラマの免疫化002
1頭のラマをvWF、ならびにコラーゲンI型およびIII型のカクテルで免疫化した。これらの抗原はすべて、血小板凝集をもたらす第1の相互作用に関与する(図1)。免疫化スキームを表1にまとめる。
末梢血リンパ球(PBL)を密度勾配遠心法によって単離した(Ficoll-Paque Plus Amersham Biosciences)。PBLを使用して全RNAを抽出した(ChomczynskiおよびSacchi 1987)。cDNAは、100μgの全RNAを基にMMLV逆転写酵素(GibcoBRL)によりオリゴd(T)オリゴヌクレオチドを使用し調製した。cDNAをフェノール/クロロホルム抽出によって精製後、エタノール沈殿させ、続いて鋳型として使用してVHHレパートリーを増幅した。
ライブラリは、2%ブドウ糖および100μg/mlのアンピシリンを含むTY培地の2倍希釈液10ml中にOD600nmが0.5に達するまで37℃で増殖させた。M13KO7ファージ(1012)を加え、混合物を37℃で30分間ずつ、1回目は振盪せずに、次いで100rpmで振盪しながら2回培養した。細胞は、室温、4500rpmで10分間遠心分離した。細菌ペレットは、100μg/mlのアンピシリンおよび25μg/mlのカナマイシンを含むTY培地の2倍希釈液50ml中に再懸濁し、終夜37℃、250rpmで勢いよく攪拌しながら培養した。一夜明けた培養物を4℃、10000rpmで15分間遠心分離した。ファージをPEG沈殿(20%ポリエチレン-グリコールおよび1.5MのNaCl)させ、10000rpmで30分間遠心分離した。ペレットを20mlのPBS中に再懸濁した。ファージを再度PEG沈殿させ、4℃、20000rpmで30分間遠心分離した。ペレットを5mlのPBS-カゼイン1%溶液に溶解した。OD600nm=0.5でTG1細胞を感染させることによってファージを滴定し、100μg/mlのアンピシリンおよび2%ブドウ糖を含むLB寒天プレート上に播種した。形質転換体数は、ファージ数(=pfu)を示す。ファージを-80℃で15%グリセロールと共に貯蔵した。
実施例4:コラーゲンとの相互作用を阻害するvWF結合物質の選択:第1巡および第2巡のパニング
マイクロタイタープレートのウェルを2μg/mlのvWF、またはカゼイン1%含有PBSでコートした。終夜4℃で培養後、ウェルをカゼイン1%含有PBSにより室温で3時間ブロックした。200μlのファージをウェルに加えた。室温で2時間培養後、ウェルをPBS-Tweenで10回およびPBSで10回洗浄した。ファージは、100μg/mlのコラーゲンIII型100μlで特異的に溶出した。溶出は、終夜室温で実施した。溶出したファージは、放置して指数関数的に増殖しているTG1細胞に感染させ、次いで100μg/mlのアンピシリンおよび2%ブドウ糖を含むLB寒天プレート上に播種した。この実験を上記と同じ条件下で第2巡のパニング用に繰り返した。パニングの結果を表2に示す。
マイクロタイタープレートを、終夜4℃でコラーゲンIII型が25μg/mlで含まれるPBSによりコートした。プレートをPBS-Tweenで5回洗浄し、カゼイン1%含有PBSにより室温で2時間ブロックした。プレートをPBS-Tweenで5回洗浄した。マイクロタイタープレートのウェルで、2μg/mlのvWF(vWFは37℃で15分間予備培養)100μlを(実施例6に記載の)VHH抗体を含むペリプラズム抽出液20μlと混合し、室温で90分間培養した。プレートをPBS-Tweenで5回洗浄した。抗vWF-HRPモノクローナル抗体(DAKO)をPBSで3,000倍に希釈し、1時間培養した。プレートをPBS-Tweenで5回洗浄し、vWF-結合をABTS/H2O2で検出した。30分後にシグナルを405nmで測定した。第1巡および第2巡のパニング後に阻害物質が得られたことを示す結果を表3に示す。
コラーゲンIII型との相互作用を阻害するvWF結合物質用にプラスミドを調製し、WK6電気適応細胞に形質転換した。単一コロニーを使用して2%ブドウ糖および100μg/mlのアンピシリンを含むLBで終夜培養を開始した。この終夜培養を100μg/mlのアンピシリンを含むTB培地300mlで100倍に希釈し、OD600nm=0.5になるまで37℃で培養した。1mMのIPTGを加え、培養物を37℃でさらに3時間または28℃で終夜培養した。
マイクロタイタープレートを2μg/mlのvWFにより終夜4℃でコートした。プレートをカゼイン1%含有PBS溶液300μlにより室温で2時間ブロックした。プレートをPBS-Tweenで3回洗浄した。すべての精製試料の希釈系列を室温で2時間培養した。プレートをPBS-Tweenで6回洗浄し、その後、マウス抗myc mABを1/2000で含むPBSにより室温で1時間、続いて抗マウス-HRP共役体を1/1000で含むPBSによっても室温で1時間培養することによってVHHの結合を検出した。基質ABTS/H2O2を用いて染色を行い、30分後にシグナルを405nmで測定した。精製VHH濃度の関数としての結合を図3に示す。
マイクロタイタープレートを、2μg/mlのvWF、および血小板凝集に関与しないが、同様にラマ002で免疫化した3種の他の抗原によりコートした。実施例7に記載したように、670、67、および6.7nMのVHHでELISAを実施した。結果を表5にまとめる。結果は、阻害VHHがvWFに特異的であることを示している。
阻害ELISAを実施例5に記載したように実施したが、精製vWFまたはヒト未希釈血漿を用いる代わりに、VHHの濃度を減少しながら1/60の希釈のヒト血漿で実施した。結果を図4に示す。50%阻害(IC50)をもたらすVHHの濃度を表6に示す。
クローンをユニバーサルリバースプライマーであるM13により配列決定した。アミノ酸配列を表30(配列番号1、3、4、5、6、および7)に示す。
pBAD-OprI-ssでvWFのA3ドメインをクローニング
pBAD-OprI-strep-specベクターを使用して、UT5600大腸菌の細胞表面上にOprIとの融合体としてVWF A3ドメインを提示させた(F-ara-14 leuB6 azi-6 lacY1 proC14 tsx-67 entA403 trpE38 rfbD1 rpsL109 xyl-5 mtl-1 thi1 DompT fepC266)(Cote-Sierraら、1998, Gene, 221: 25-34)。vWF(201aa)のA3ドメインをコードする遺伝子は、A3前およびA3逆PCRプライマーを使用しPCRによって増幅した。
A3前:CTG GTG CTG CAG AGG TGA AGC TTC GGA GAG GGG CTG CAG ATC
A3逆:ATC CAT GCA AAT CCT CTA GAA TCC AGA GCA CAG TTT GTG GAG
大腸菌産生ベクターpAX11を設計した(図6)。これにより二価または二重特異性VHHの2段階クローニングが可能になる。
実施例7に記載したように、ELISAでvWFへの結合を試験し、一価VHHの結合と比較した。結果を図7に示す。一価VHHと比較した場合、二価かつ二重特異性VHHがvWFに強力な結合を示すことは結果から明らかである。
実施例5に記載したように、vWFとコラーゲンの結合の阻害を、二価VHHと比較して一価について試験した。精製vWFを使用する代わりに、1/60の希釈のヒト、ヒヒ、およびブタ血漿を並行使用した。IC50値を表9にまとめる。
二価構築体の安定性をヒト血漿中37℃で培養することによって試験した。AM-4-15-3/AM2-75をヒト血漿中38μg/mlの濃度にて37℃で培養した。培養1、2、3、6、および24時間後に試料を取り出した。試料を10倍に希釈し、ウェスタンブロットによって分析した。結果を図8にまとめる。二価構築体が、ヒト血漿中、37℃で少なくとも24時間安定していることが示されている。
カバーガラス(18×18mm、Menzel Glaeser)をクロモ硫酸(chromosulfuric acid)(2%三酸化クロム(chromium trioxide))溶液によって終夜洗浄し、蒸留水ですすいだ後、噴霧した。単量体のコラーゲンIII型を50mmol/L酢酸に溶解し、レタッチングエアブラシ(Badger model 100、Badger Brush Co)によりカバーガラスに密度30μg/cm2で噴霧した。噴霧操作後、コラーゲン表面を1%ヒトアルブミンのPBS溶液(10mmol/Lのリン酸緩衝液、pH7.4、および0.15mol/LのNaCl)で1時間ブロックして、続く灌流中の非特異的タンパク質の結合を防止した。コラーゲンIII型についての灌流研究を、カバーガラスを収容し、詳細に明らかにされた流体力学特性を有する、特に工夫した小型並列プレート灌流チャンバで実施した。静脈穿刺によって志願者から全血を得た。Harvard注入ポンプ(ポンプ22、モデル2400-004、Harvard、米国マサチューセッツ州Natick)によって灌流チャンバを通して血液を引いた。灌流時間は、5分であった。三つ組のカバーガラスをチャンバに挿入した。5mlの全血に、VHHを添加し、または添加せずに、事前に37℃で5分間あたため、次いでチャンバ内を壁ずり速度300s-1または1600s-1で5分間再循環させた。カバーガラスを取り出し、すすぎ、0.05%グルタルアルデヒド(glutaraldehyde)で固定し、メタノールで脱水し、May-Grueunwald/Giemsaで染色した。血小板の接着性をコンピュータ化画像解析装置(AMS40-10、Saffron Walden、UK)に接続した光学顕微鏡(1,000×倍率)で定量した。血小板の接着性を血小板で覆われた表面の百分比として示した。結果を表10および11にまとめる。
実施例17:血小板との相互作用を阻害するvWF結合物質の選択:パニング
イムノチューブを2μg/mlのvWF、またはカゼイン1%含有PBSでコートした。終夜4℃で培養後、チューブをカゼイン1%含有PBSにより室温で3時間ブロックした。200μlのファージをイムノチューブに加えPBSで終容量2mlにした。室温で2時間培養後、イムノチューブをPBS-Tweenで10回およびPBSで10回洗浄した。結合ファージを0.2Mのグリシン緩衝液2ml、pH=2.4で溶出した。溶出は、室温で20分間実施した。溶出したファージは、放置して指数関数的に増殖しているTG1細胞に感染させ、次いで100μg/mlのアンピシリンおよび2%ブドウ糖を含むLB寒天プレート上に播種した。パニングの結果を表12に示す。
pBAD-OprI-strep-specベクターを使用して、UT5600大腸菌の細胞表面上にOprIとの融合体としてVWF A1ドメインを提示させた(F-ara-14 leuB6 azi-6 lacY1 proC14 tsx-67 entA403 trpE38 rfbD1 rpsL109 xyl-5 mtl-1 thi1 DompT fepC266)(Cote-Sierraら、1998, Gene, 221: 25-34)。vWF(219aa)のA1ドメインをコードする遺伝子をA1前およびA1逆PCRプライマーを使用しPCRによって増幅した。
A1前:CCG GTG AGC CCC ACC ACT CTA AGC TTG GAG GAC ATC TCG GAA CCG
A1逆:CCC CAG GGT CGA AAC CCT CTA GAG CCC CGG GCC CAC AGT GAC
vWFのA1ドメインを発現している大腸菌細胞(実施例18)をMATCHM実験に使用した:pBAD-OprI-A1で形質転換したUT5600細胞を増殖し、0.2%アラビノースで誘発した。細胞を洗浄し、ファージと共に室温で1時間培養した。この混合物をPBS-Tweenで7回洗浄し、ファージを指数関数的に増殖しているTG1細胞で溶出した。本発明者らは、第1巡および第2巡の選択を実施した。結果を表14にまとめる。
実施例6に記載したように、vWFのA1ドメインに特異的なVHHを発現させ、精製した。実施例7に記載したように、ELISAでvWFへの結合を測定した。結果を図11に示す。
マイクロタイタープレートを、血小板受容体gpIbに特異な抗体がPBSに5μg/ml含まれる溶液により終夜4℃でコートした。プレートをPBS-Tweenで5回洗浄し、カゼイン1%含有PBS溶液300μlにより室温で2時間ブロックした。プレートをPBS-Tweenで3回洗浄した。血小板受容体gpIb(gpIb)をマイクロタイタープレートのウェルに濃度1μg/mlで加え、室温で2時間放置して結合させた。プレートをPBS-Tweenで5回洗浄した。VHH(A38(負の対照)およびA50(vWF A1結合物質))を減少濃度で加えた。vWFを含む血漿を1/128に希釈して37℃で5分間予備培養した。Ristoを終濃度760μg/mlで加え、VHHに加えた。この混合物を室温で30分間培養した。次いで、この混合物の100μlをマイクロタイタープレートのウェルに加え、室温で90分間培養した。プレートをPBS-Tweenで5回洗浄した。抗vWF-HRPモノクローナル抗体をPBSで3.000倍に希釈し、1時間培養した。プレートをPBS-Tweenで5回洗浄し、vWF結合をABTS/H2O2で検出した。30分後にシグナルを405nmで測定した。結果を図12にまとめる。
クローンをM13ユニバーサルリバースプライマーにより配列決定した。アミノ酸配列を表30(配列番号23、24、25、26、27、28、29、30、および31)に示す。
実施例16に記載したように、ずり応力実験(shear experiment)を実施した。血小板の接着性を血小板で覆われた表面の百分比として示した。結果を表15および16にまとめる。
実施例12に記載したように、二価分子を構築した。配列を表30(配列番号32、33、および34)に示す。
実施例16に記載したように、ずり応力実験を実施した。血小板の接着性を血小板で覆われた表面の百分比として示した。結果を表17および18にまとめる。
実施例26:二重特異性構築体の構築および配列
実施例12に記載したように、vWFに特異的でありコラーゲンとの相互作用を阻害する1つのVHH、および同様にvWFに特異的であるが、血小板受容体gpIbとの相互作用を阻害する第2のVHHによって構築体を作製した。配列を表30(配列番号20、21、および22)に示す。
実施例6に記載したように、タンパク質を発現させ精製した。いくらかの一価の分解産生物(5〜10%)を除去するために、superdex 75で追加の精製ステップを行う必要があった。大腸菌中の二重特異性タンパク質の1リットル発現および精製のために得られた収量を表19にまとめる。
実施例7に記載したように、ELISAでvWFへの結合を試験した。結果を図14に示す。
実施例5に記載したように、vWFとコラーゲンの結合の阻害を二重特異性構築体と比較して一価について試験した。IC50値を表20にまとめる。
実施例16に記載したように、ずり応力実験を実施した。血小板の接着性を血小板で覆われた表面の百分比として示した。結果を表21および22にまとめる。
実施例31:コラーゲンI型の結合物質の選択
マイクロタイタープレートを25μg/mlのコラーゲンI型によりコートした。ファージを実施例3に記載したように、調製し、2時間ブロックしたマイクロタイタープレートのウェルに放置して結合させた。洗浄後、ファージを0.1Mのグリシン緩衝液、pH=4.5で溶出した。結果を表23にまとめる。
実施例7に記載したように、クローンの結合をELISAで試験したが、次いでPBS中25μg/mlでウェルにコートしたコラーゲンI型またはIII型について試験した。結果を表24にまとめる。
クローンをM13ユニバーサルリバースプライマーにより配列決定した。アミノ酸配列を表30(配列番号35、36、および37)に示す。
実施例6に記載したように、VHHを発現させ精製した。マイクロタイタープレートを、25μg/mlのコラーゲンI型またはIII型によりコートしブロックした。結合物質をジュプロ(duplo)希釈液に加え結合を実施例7に記載のように検出した。結果を図16にまとめる。
マイクロタイタープレートを、25μg/mlのコラーゲンI型によりコートした。実施例3に記載したように、ファージを調製し、2時間ブロックしたマイクロタイタープレートのウェルに放置して結合させた。洗浄後、ファージを300μg/mlのvWFで溶出した。第2巡および第3巡の選択を同じ方式で実施した。
実施例34に記載したように、クローンのコラーゲンI型およびIII型への結合をELISAで試験した。
クローンをM13ユニバーサルリバースプライマーにより配列決定した。
実施例6に記載したように、VHHを発現させ精製した。マイクロタイタープレートを、25μg/mlのコラーゲンI型またはIII型によりコートしブロックした。実施例34に記載したように、結合物質をin duplo希釈に加え結合を検出した。
実施例5に記載したように、阻害を試験した。
実施例16に記載したように、ずり応力実験を実施した。血小板の接着性を血小板で覆われた表面の百分比として示した。
実施例41:ラマの免疫化
1頭のラマをヒト血清アルブミン(HSA)で免疫化した。免疫化スキームを表25にまとめる。
実施例2に記載したように、ライブラリを調製した。ライブラリの大きさは、2×107cfuであり、クローンにはすべて、正確な大きさの挿入物が含まれていた。
実施例3に記載したように、ファージを調製した。
マイクロタイタープレート(Maxisorp)を、カゼイン1%含有PBS溶液、または5μg/mlのHSA(ヒト血清アルブミン)により終夜4℃でコートした。プレートを、PBS-Tween(0.05%のTween20)で3回洗浄し、カゼイン1%含有PBS溶液200μlにより室温で2時間ブロックした。プレートをPBS-Tweenで5回洗浄した。ファージを上記のように調製し、連続2倍希釈でウェルに加えた。プレートをPBS-Tweenで5回洗浄した。結合ファージを、PBSにより1/2000に希釈したホースラディシュペルオキシダーゼ(HRP)と共役させたマウスモノクローナル抗体、抗M13で検出した。プレートをPBS-Tweenで5回洗浄した。ABTS/H2O2を用いて染色を行い、30分後にシグナルを405nmで測定した。結果を図17に示すが、これにはライブラリ中にHSA特異的ナノボディーが存在することが示されている。
マイクロタイタープレートのウェルを、10μg/mlのマウス血清アルブミン(MSA)、またはカゼイン1%含有PBSによりコートした。終夜4℃で培養後、ウェルをカゼイン1%含有PBSにより室温で3時間ブロックした。200μlのファージをウェルに加えた。室温で2時間培養後、ウェルをPBS-Tweenで10回およびPBSで10回洗浄した。結合ファージを0.2Mのグリシン緩衝液100μl、pH=2.4で溶出した。溶出は、室温で20分間実施した。溶出したファージは、指数関数的に増殖している大腸菌TG1細胞に放置して感染させ、次いで100μg/mlのアンピシリンおよび2%ブドウ糖を含むLB寒天プレート上に播種した。上記と同じ条件で第2巡を実施した。結果を表26にまとめる。
ELISA:ヒト血清アルブミン(HSA)およびマウス血清アルブミン(MSA)への結合
実施例6に記載したように、ペリプラズム抽出液を調製した。
第2巡のパニング後、ベクター中の配列に結合している1組のプライマーによって、PCRを陽性のクローンで実施した。PCR産生物を制限酵素HinfIで消化し、アガロースゲルに載せた。異なるHinfIパターンを有する4個のクローンをさらに評価するために選択した。それらのクローンを配列決定し、結果を表30(配列番号16、17、18、および19)にまとめる。
異なる種(ヒヒ、ブタ、ハムスター、ヒト、ラット、マウス、およびウサギ)の血漿(1/10希釈)についてSDS-PAGEを実施し、ニトロセルロース膜にブロットした。ファージをクローンMSA21、MSA24、MSA210、MSA212、および不適切なナノボディーのために実施例3に記載したように調製した。ファージをニトロセルロースにブロットした血清アルブミンに放置して結合させ、未結合ファージを洗い流した。結合をHRPに結合した抗M13ポリクローナル抗体によって検出した。DAPは、検出用基質として使用した。結果を図18に示す。
実施例6に記載したように、タンパク質を発現させ精製した。
マイクロタイタープレートを、終夜4Cで5μg/mlのMSAによりコートした。洗浄後、プレートをカゼイン1%含有PBS溶液により室温で2時間ブロックした。試料は、2組を適用し1/3希釈の2500nMの濃度で出発し、室温で2時間放置して結合させた。1/1000(K208)のポリクローナルウサギ抗ナノボディー血清を室温で1時間加えた。検出は、1/1000で抗ウサギアルカリホスファターゼ共役で行い、PNPPで染色した。結果を図20に示す。
アルブミン(MSA21)に特異的な第1のVHH、およびvWFに特異的な第2のVHHを備えた二重特異性構築体を調製した(図21)。実施例12に記載したように、構築体を作製した。配列を表30(配列番号13、14、および15)に示す。
実施例6に記載したように、タンパク質を発現させ精製した。いくらかの一価の分解産生物(5〜10%)を除去するために、superdex 75で追加の精製ステップを行う必要があった。
マイクロタイタープレートを、5μg/mlのマウス血清アルブミンにより4℃で終夜でコートした。プレートを洗浄後、ウェルをカゼイン1%含有PBS溶液により2時間ブロックした。二重特異性タンパク質を室温で2時間放置してウェルに結合させた。洗浄後、ヒト、イヌ、およびブタ血漿を異なる希釈で加え、室温で2時間放置して結合させた。vWFの結合を1/3000希釈でDAKO社製抗vWF-HRPにより検出した。ABTS/H2O2を用いて染色を行った。結果を図22に示す。両VHHの機能性が、二重特異性構築体に保持されていることを示している。
実施例5に記載したように、vWFとコラーゲンの結合の阻害を二重特異性構築体と比較して一価について試験した。IC50値を表28にまとめる。結果は、VHHの阻害特性が二重特異性構築体に保持されていることを示している。
免疫化、レパートリークローニング、およびファージの調製を実施例1、2、3に記載したように実施した。
マイクロタイタープレートをrgpIbに対するマウスmAbでコートした。プレートをブロックし、rgpIbを5μg/mlで室温で2時間放置して結合させた。プレートを洗浄した。ファージを上記のように調製し、マイクロタイタープレートのウェルに放置して結合させた。洗浄後、ファージを0.1Mのグリシン緩衝液、pH=4.5で溶出した。第2巡のパニングを同じ方式で実施した。
実施例6に記載したように、ペリプラズム抽出液を調製した。
実施例6に記載したように、ペリプラズム画分を調製した。VHHを含む上清をNi-NTAに投入し、精製して均質にした。VHHの収量を吸光係数によって算出した。実施例55に記載したように、ELISAを実施した。
クローンをM13ユニバーサルリバースプライマーにより配列決定した。
実施例21に記載したように、VHHの阻害についてELISAで試験した。
実施例16に記載したように、ずり応力実験を実施した。血小板の接着性を血小板で覆われた表面の百分比として示した。
実施例61:VHHの安定性
実施例7に記載したように、VHH C37を37℃で培養し、vWFとコラーゲンの結合の阻害をELISAにより異なる時点で測定した。結果を-20℃で貯蔵したVHHと比較した。その結果を図24に示す。比較から分かることは、B3抗原に対するscFvの活性であり(Reiterら、Protein Engineering, 1994, 7: 697-704)、前記scFvは、その安定性を強化する(dsFv)ために、フレームワーク残基44と残基105の間にジスルフィド結合を導入することによって改変されている。37℃で60時間培養後、dsFvは、その活性の40%を消失した。C37を37℃で1年間培養後、その阻害特性について冷凍庫で貯蔵したC37と比較して分析した。実施例5に記載したように、ELISAをヒト血漿により最終希釈1/200で実施した。結果を図25に示す。機能性が完全に保持されていることが示されている(C37を37℃と-20℃で貯蔵した場合に、IC50値は0.085μg/mそれぞれとl0.1μg/ml)。したがって、VHHの貯蔵寿命は長期であると推定される。
30%アクリルアミド0.5ml;1MのトリスpH=7.5 1ml;H2O 3.5ml;10%APS 35μl;TEMED 3.5μlの混合物を調製した。いくつかのウェルに、終濃度10μg/mlのVHH C37を加えた。混合物を96穴プレートのウェル中で室温で3時間放置して重合させた。未希釈血漿で出発してヒト血漿を異なる希釈で加えた。室温で1時間培養後、プレートを洗浄し、抗vWF-HRP(DAKO)を1/2000で室温で1時間加えた。プレートを洗浄後、基質(ABTS/H2O2)を加え、OD405nmを測定した。結果を図26に示す。結果は、VHHがポリマー中で固定後も機能性を保持していることを示している。
実施例63:C37とDP-47の配列比較
図27に示されるように、C37ナノボディー(配列番号1)およびヒトVH3生殖系列(DP-47)の配列比較によって高度の相同性が判明した。
FR1の位置1、5、28、および30において4個のAA変化
FR3の位置74、75、84、および94において4個のAA変化
FR4の位置104、108、および111において3個のAA変化
C37を非PCRを基にした部位特異的変異導入法の使用によって変異させた。この方法は、ChenおよびRuffner(Chenand Ruffner, Amplification of closed circular DNA in vitro, Nucleic Acids Research, 1998, 1126-1127)が記載し、Stratagene(Quickchange部位特異的変異導入)により商品化されている。
実施例65:vWF-C37のVHH-CDR3断片の発現
C37のCDR3領域を、フレームワーク4領域に位置するセンスプライマー(フォワード:CCCCTGGTCCCAGTTCCCTC)、およびフレームワーク3領域(リバース:TGTGCTCGCGGGGCCGGTAC)に位置するアンチセンスプライマーを使用することによって増幅した。
リバースプライマーSfi1:
GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCTGTGCTCGCGGGGCCGGTAC
フォワードプライマーNot1:
GTCCTCGCAACTGCGCGGCCGCCCCCTGGTCCCAGTTCCCTC
実施例66:組換えA1(rA1)に対する第1巡および第2巡のバイオパニングによる選択
マイクロタイタープレートのウェルを5μg/mlのvWFの組換えA1ドメイン(rA1)、またはカゼイン1%含有PBSによってコートした。終夜4℃で培養後、ウェルをカゼイン1%含有PBSにより室温で3時間ブロックした。200μlのファージをウェルに加えた。室温で2時間培養後、ウェルをPBS-Tweenで10回およびPBSで10回洗浄した。結合ファージを0.2Mのグリシン緩衝液100μl、pH2.4で溶出した。溶出は、室温で20分間実施した。溶出したファージは、指数関数的に増殖している大腸菌TG1細胞に放置して感染させ、次いで100μg/mlのアンピシリンおよび2%ブドウ糖を含むLB寒天プレート上に播種した。上記と同じ条件で第2巡を実施したが、ファージは10μg/mlのvWFに再懸濁した。マイクロタイタープレートのウェルを10μg/mlのvWFで30分間かけて7回洗浄した。結果を表31にまとめる。
ELISA:rA1およびvWFへの結合
単一コロニーを使用して2%ブドウ糖および100μg/mlのアンピシリンを含むLBで終夜培養を開始した。この終夜培養物を100μg/mlのアンピシリンを含むTB培地で100倍に希釈し、OD600nm=0.5になるまで37℃で培養した。1mMのIPTGを加え、培養物を37℃でさらに3時間、または28℃で終夜培養した。培養物を4℃、10,000rpmで20分間遠心分離した。ペレットを終夜または-20℃で1時間凍結させた。次に、ペレットを室温で40分間解凍し、PBSに再懸濁し氷上で1時間振盪した。ペリプラズム画分を4℃、20.000rpm20分間遠心分離することによって単離した。VHHを含む上清をさらに分析するために使用した。
第2巡のパニング後、ベクター中の配列に結合している1組のプライマーによって、rA1陽性クローンおよびvWF陰性クローンのPCRを実施した。PCR産生物を制限酵素HinfIで消化し、アガロースゲルに載せた。さらに評価するために、30個のクローンを異なるHinfIパターンで選択した。実施例67に記載したように、これらのクローンをELISAによってさらに詳細に試験した。30個のクローンのうち、4個のクローンがvWFよりもrA1に非常に高い親和性を有することが明瞭に示された。データを図29(rA1に結合)および図30(vWFに結合)に示す。これらのクローンを配列決定し、結果を表30(配列番号62〜65)にまとめる。
ナノボディーによるvWFとgpIbの結合の阻害をELISAによって定量した。マイクロタイタープレートを、血小板受容体gpIbに特異な抗体をPBS中に5μg/ml含む溶液により終夜4℃でコートした。プレートをPBS-Tweenで5回洗浄し、カゼイン1%含有PBS溶液300μlにより室温で2時間ブロックした。プレートをPBS-Tweenで3回洗浄した。血漿をマイクロタイタープレートのウェルに1/2希釈で加え37℃で1.5時間放置して結合させた。プレートをPBS-Tweenで5回洗浄した。VHHを減少濃度で加えた。vWFを含む血漿を1/50の希釈で37℃で5分間予備培養した。終濃度1mg/mlのリストセチンを加えて、VHHに加えた。この混合物を37℃1時間培養した。次いで、この混合物の50μlをマイクロタイタープレートのウェルに加え、37℃で90分間培養した。プレートをPBS-Tweenで5回洗浄した。抗vWF-HRPモノクローナル抗体をPBSで3,000倍に希釈し、1時間培養した。プレートをPBS-Tweenで5回洗浄し、vWF-結合をABTS/H2O2で検出した。30分後にシグナルを405nmで測定した。
図1 小板凝集第1諸段階に関与する相互作用。
図2 血小板凝集第1諸段階に関与する相互作用。VHHがvWFとコラーゲンの間の相互作用を阻害していることを示す。
図3 実施例7に記載した、ELISAによって定量した、精製VHHによるvWFへの結合を。
図4 実施例9に記載した、VHHによるvWFとコラーゲンの結合阻害を試験するためのELISA。
図5 実施例11に記載した、大腸菌表面上のOprIとの融合体としてvWFのA3ドメインの発現を示すウェスタンブロット。
図6 二価または二重特異性ナノボディーを構築するためのPAX011のマルチクローニング部位の制限マップ。
図7 実施例13に記載した、一価VHH対二価かつ二重特異性VHHの精製vWFへのELISAでの結合。
図8 実施例15に記載した、37℃で24時間までの培養直後のヒト血漿中の二重特異性VHHの安定性。
図9 血小板凝集第1諸段階に関与する相互作用。VHHがvWFと血小板の間の相互作用を阻害していることを示す。
図10 実施例18に記載した、大腸菌表面上のOprIとの融合体としてvWFのA1ドメインの発現を示すウェスタンブロット。
図11 実施例20に記載した、ELISAによって定量した、精製VHHによるvWFへの結合。
図12 実施例21に記載した、A50およびA38(負の対照)によるgpIbとVWFの結合の阻害。
図13 血小板凝集第1諸段階に関与する相互作用。vWFに特異的であり、vWFとコラーゲンの間の相互作用を阻害する1個のVHH、およびvWFに特異的であるが、vWFと血小板の間の相互作用を阻害する第2のVHHを備えた二重特異性構築体を示す。
図14 実施例28に記載した、ELISAでのvWFへの結合。
図15 血小板凝集第1諸段階に関与する相互作用。コラーゲンに特異であり、vWFとコラーゲンの間の相互作用を阻害しているVHHを示す。
図16 実施例34に記載した、ELISAでの精製VHHと、コラーゲンI型およびIII型の結合。
図17 実施例44に記載した、ライブラリにHSA特異的ナノボディーが存在することを示すファージELISA。
図18 実施例48に記載した、ニトロセルロース上にブロットされた、アルブミン結合物質を発現するファージと血漿の結合。
図19 実施例48に記載した、SDS-PAGEでの血漿試料のクーマシー染色。
図20 実施例50に記載した、ELISAによって定量した精製ナノボディーとマウスアルブミンの結合。
図21 実施例51に記載した、半減期を改善するための、アルブミンに結合する1つのVHHと、vWFに結合する第2のVHHを備えた二重特異性構築体。
図22 実施例53に記載した、二重特異性構築体の両VHHの機能性を示すサンドウィッチELISA。
図23 血小板凝集第1諸段階に関与する相互作用。VHHが、gpIbに特異的であり、vWFと血小板の間の相互作用を阻害していることを示す。
図24 37℃で194時間までで培養したC37と比較した、-20℃で貯蔵したC37の残存活性。実施例61に記載したように、C37の安定性を、B3抗原に特異的なscFvおよび(2個のジスルフィド結合により安定化させた)安定形dsFvの安定性と比較する。
図25 実施例61に記載した、37℃で1年間培養したC37と比較した、-20℃で貯蔵したC37の阻害活性。
図26 実施例62に記載した、ヒト血漿由来vWFとアクリルアミドに固定したC37の結合。
図27 実施例63に記載した、ヒト生殖系列の配列DP-47とC37のアミノ酸の配列比較。
図28 実施例64に記載した、ELISAによって定量した、C37およびC37humのvWFとコラーゲンの結合の阻害。
図29 ELISAで測定したA11、A12、A13、A14、A15、およびA16クローンとrA1の結合。
図30 ELISAで測定したA11、A12、A13、A14、A15、およびA16クローンとvWFの結合。
表
表1:実施例1による、ラマ002に使用した免疫化スキーム。
表2:実施例4に記載した、PBS-カゼインと比較したvWFでの1巡または2巡のパニング後のプラーク形成単位(pfu)。(特異的結合性)pfuカゼインにより割ったpfu vWF(抗原)=濃縮。
表3:実施例5に記載した、第1巡および第2巡のパニング後の阻害物質数/試験クローン数。
表4:実施例6に記載した、WK6大腸菌細胞中で増殖したVHHの発現および精製後の収量(mg/l培養物)。
表5:実施例8による、vWF、および同様にラマ002で免疫化した3種の抗原に対するVHHのELISAでの結合のOD405nm。
表6:実施例9に記載した、vWFとコラーゲンの結合を50%(IC50)阻害するために必要なVHH濃度(nM)。
表7:実施例11に記載した、vWFと結合し、コラーゲンとの相互作用を阻害するVHHのエピトープマッピング。
表8:実施例12に記載した、二価かつ二重特異性VHHについて培養物1L当たりの精製タンパク質(mg)の収量。
表9:二価かつ二重特異性VHHと比較した一価のIC50値。実施例14に記載したように、阻害はヒト、ブタ、およびヒヒの血漿で試験した。
表10:実施例16に記載した、高ずり応力(1600s-1)下での血小板凝集の阻害。
表11:実施例16に記載した、低ずり応力(300s-1)下での血小板凝集の阻害。
表12:実施例17に記載した、vWFでの1巡のパニング後のプラーク形成単位(pfu)。pfuカゼイン(a-特異的結合)により割ったpfu vWF(抗原)=濃縮。
表13:実施例18に記載した、vWFおよびvWFのA1ドメインに結合した個々のコロニーのELISAでのスクリーニングの結果。
表14:実施例19に記載した、pBAD-OprI-A1細胞での1巡のMATCHM後の結果。
表15:実施例23に記載した、高ずり応力(1600s-1)下での血小板凝集の阻害。
表16:実施例23に記載した、低ずり応力(300s-1)下での血小板凝集の阻害。
表17:実施例25に記載した、高ずり応力(1600s-1)下での血小板凝集の阻害。
表18:実施例25に記載した、低ずり応力(300s-1)下での血小板凝集の阻害。
表19:実施例27に記載した、二重特異性構築体の発現および精製後の収量。
表20:実施例29に記載した、vWFのA1およびA3ドメイン用二重特異性ナノボディーのIC50値。
表21:実施例30に記載した、高ずり応力(1600s-1)下での血小板凝集の阻害。
表22:実施例30に記載した、低ずり応力(300s-1)下での血小板凝集の阻害。
表23:実施例31に記載した、コラーゲンI型での1巡のパニング後のプラーク形成単位(pfu)。pfuカゼイン(a-特異的結合)によって割ったpfu vWF(抗原)=濃縮。
表24:実施例32に記載した、1巡の選択後にコラーゲンI型およびIII型に結合したクローン数。
表25:実施例41によるヒト血清アルブミン用免疫化スキーム。
表26:実施例45に記載した、マウス血清アルブミンでの第1巡および第2巡のパニング後の結果。
表27:第1巡および第2巡の選択後にクローンを選択し、ペリプラズム抽出液を調製した。実施例46に記載したように、これらのクローンは、ヒトおよびマウスアルブミンへの結合についてELISAで分析した。
表28:実施例54に記載した、アルブミンおよびvWFに対する二重特異性ナノボディーのIC50値。
表29:実施例64に記載した、C37のヒト化に使用したプライマー配列。
表30:本発明のペプチドおよびヒトフォンウィルブランド因子(vWF)のアミノ酸配列表。ヒトvWF配列は、それぞれ、太字のA1およびA3ドメインを示す。
表31:実施例66に記載した、vWFのrA1ドメインでの2巡のパニング後の結果。
表32:実施例67に記載した、rA1およびvWFに結合させるために選択したクローンのELISA分析。
Claims (32)
- vWF、vWF A1ドメイン、活性化vWFのA1ドメイン、vWF A3ドメイン、gpIb、またはコラーゲンのいずれかに対する少なくとも1個の単一ドメイン抗体を含むポリペプチド構築体。
- 1以上の血清タンパク質に対する少なくとも1個の単一ドメイン抗体をさらに含む、請求項1に記載のポリペプチド構築体。
- 前記少なくとも1の血清タンパク質が、血清アルブミン、血清免疫グロブリン、チロキシン結合タンパク質、トランスフェリング、またはフィブリノーゲン、あるいはそれらの断片のいずれかである、請求項2に記載のポリペプチド構築体。
- 1以上の血清タンパク質に対する少なくとも1個の単一ドメイン抗体が、配列番号16〜19および49〜61のいずれかによって表される配列に対応する、請求項2および3に記載のポリペプチド構築体。
- 配列番号13〜15および42〜45のいずれかによって表される配列に対応する、請求項2〜4のいずれかに記載のポリペプチド構築体。
- 少なくとも1個の単一ドメイン抗体が、ヒト化配列である、請求項1〜5に記載のポリペプチド構築体。
- 少なくとも1個の単一ドメイン抗体が、配列番号38〜41および42〜45のいずれかによって表される配列に対応する、請求項6に記載のポリペプチド構築体。
- 配列番号8〜12、20〜22、32〜34、および46〜47のいずれかによって表される配列に対応する、請求項1に記載のポリペプチド構築体。
- 少なくとも1個の単一ドメイン抗体が、ラクダ科VHH抗体である、請求項1〜8のいずれかに記載のポリペプチド構築体。
- 少なくとも1個の単一ドメイン抗体が、配列番号1〜7、23〜31、35〜37、および62〜65のいずれかによって表される配列に対応する、請求項1〜9のいずれかに記載のポリペプチド構築体。
- 前記単一ドメイン抗体が、完全長単一ドメイン抗体の相同配列、機能部分、または相同配列の機能部分である、請求項1〜10のいずれかに記載のポリペプチド構築体。
- 前記ポリペプチド構築体が、前記ポリペプチド構築体の相同配列、その機能部分、またはその機能部分の相同配列である、請求項1〜11のいずれかに記載のポリペプチド構築体。
- 請求項1〜12のいずれかに記載のポリペプチド構築体をコードする核酸。
- 対象に同時、分別、または逐次投与するための、請求項1〜12のいずれかに記載のポリペプチド構築体、および少なくとも1種の血栓溶解剤を含む組成物。
- 前記血栓溶解剤が、スタフィロキナーゼ、組織プラスミノゲンアクチベータ、ストレプトキナーゼ、単鎖ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、およびアシルプラスミノゲン-ストレプトキナーゼ複合体のいずれかである、請求項14に記載の組成物。
- 血小板媒介凝集またはその機能異常に関連する疾患の治療、予防、および/または緩和に使用するための、請求項1〜12のいずれかに記載のポリペプチド構築体、請求項13に記載の核酸、あるいは請求項14および15に記載の組成物。
- 血小板媒介凝集またはその機能異常に関連付けられる疾患を治療し、予防し、かつ/または緩和するための薬剤の調製のための、請求項1〜12のいずれかに記載のポリペプチド構築体、請求項13に記載の核酸、あるいは請求項14および15に記載の組成物の使用。
- 前記疾患が、一過性脳虚血発作、不安定または安定アンギナ、狭心症、脳梗塞、心筋梗塞、末梢動脈閉塞性疾患、再狭窄、冠動脈バイパス術、冠動脈弁置換術、および冠血管処置、例えば血管形成術、ステント術、頚動脈の動脈内膜切除や粥腫切除から生じるいずれかである、請求項16に記載のポリペプチド構築体、核酸、または組成物、あるいは請求項17に記載のポリペプチド構築体、核酸、または組成物の使用。
- 前記疾患が、非閉塞性血栓の形成、閉塞性血栓の形成、動脈での血栓形成、急性冠血管閉塞、再狭窄、PCTAまたはステント術後の再狭窄、狭窄動脈での血栓形成;血管形成術、粥腫切除または動脈ステント術後の過形成、脈管系での閉塞性症候群、あるいは疾患動脈の開存性不足のいずれかである、請求項16に記載のポリペプチド構築体、核酸、または組成物、あるいは請求項17に記載のポリペプチド構築体、核酸、または組成物の使用。
- 前記疾患が、過酷な環境でのプラーク形成または血栓形成である、請求項16に記載のポリペプチド構築体、核酸、または組成物、あるいは請求項17に記載のポリペプチド構築体、核酸、または組成物の使用。
- 前記ポリペプチド構築体が、経静脈、経皮下、経口、経舌下、経局所、経鼻、経膣、経直腸的に、または吸入によって投与される、請求項16、18〜20のいずれかに記載のポリペプチド構築体、核酸または組成物、あるいは請求項17〜20に記載のポリペプチド構築体の使用。
- 請求項1〜12、16、18〜21のいずれかに記載のポリペプチド構築体もしくは前記ポリペプチド構築体をコードする核酸、または請求項14および15に記載の組成物、および医薬的に許容されるビヒクルを含む組成物。
- (a) 請求項1〜12、16、18〜21のいずれかに記載のポリペプチドをコードし得る核酸を含む宿主細胞を、前記ポリペプチドの発現を可能にする条件下で培養すること、および
(b) 前記培養物から産生したポリペプチドを回収すること
を含む、請求項1〜12、16、18〜21のいずれかに記載のポリペプチドの製造方法。 - 前記宿主細胞が、細菌または酵母である、請求項23に記載の方法。
- 侵襲部位周囲での血小板媒介凝集を防止するための侵襲性医療器具の処理方法であって、前記器具を請求項1〜12に記載のポリペプチド構築体でコーティングするステップを含む方法。
- 侵襲部位周囲の血小板媒介凝集を包囲するための侵襲性医療器具であって、前記器具が請求項1〜12に記載のポリペプチド構築体でコートされることを特徴とする器具。
- 血小板媒介凝集を調節する作用薬を同定する方法であって、
(a) 請求項1〜12に記載のポリペプチド構築体をその標的に対応するポリペプチドまたはその断片に、これらポリペプチド間の結合を可能にする条件下で候補モジュレータの存在下および非存在下に接触させること、および
(b) ステップ(a)のポリペプチド間の結合を測定し、前記候補モジュレータの存在下での結合が前記候補モジュレータの非存在下での結合に比較して減少した場合には、前記候補モジュレータは血小板媒介凝集を調節する作用薬であるとして同定されること、を含む方法。 - 請求項27に記載の方法による、血小板媒介凝集を調節する作用薬のスクリーニングキット。
- 請求項27に記載の方法によって同定した、血小板媒介凝集を調節する非公知の作用薬。
- 血小板媒介凝集機能異常を特徴とする疾病または疾患の診断方法であって:
(a) 請求項1〜12に記載のポリペプチド構築体に試料を接触させること、
(b) 前記ポリペプチド構築体の前記試料への結合を検出すること、および
(c) ステップ(b)で検出された結合を基準の結合と比較し、
前記試料に比較して結合に差があれば、血小板媒介凝集機能異常を特徴とする疾病または疾患であると診断すること、
の諸ステップを含む方法。 - 請求項30に記載の方法による血小板媒介凝集機能異常を特徴とする疾病または疾患を診断するためのスクリーニングキット。
- 請求項1〜12のいずれかに記載のポリペプチド構築体を含む、請求項28または31に記載のキット。
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