BR112020018908A2 - moléculas de agonistas de sinalização de wnt - Google Patents

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Abstract

“moléculas de agonistas de sinalização de wnt". o presente pedido se refere a novos agentes terapêuticos, particularmente a agentes capazes de ativar sinalização de wnt mediada por (gpr)124/reck/frizzled/proteína relacionada ao receptor de lipoproteína (lrp), em que os referidos agentes não ativam a sinalização de wnt mediada por frizzled/lrp na ausência de reck e/ou gpr124. os presentes agentes são particularmente úteis para a(o) prevenção ou tratamento de distúrbios neurovasculares ou distúrbios do sistema nervoso central (snc) que compreendem disfunção neurovascular.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para: “MOLÉCULAS DE AGONISTAS DE SINALIZAÇÃO DE WNT”
CAMPO
[001] A invenção está amplamente no campo médico e, mais precisamente, se refere a tratamentos de doenças neurovasculares ou doenças do sistema nervoso central (SNC) que compreendem disfunção neurovascular. A invenção fornece novas moléculas agonistas de sinalização de Wnt úteis em terapia, e particularmente úteis no tratamento de distúrbios neurovasculares ou distúrbios do SNC que compreendem disfunção neurovascular, e produtos, métodos e usos relacionados.
FUNDAMENTOS
[002] As proteínas Wnt constituem uma grande família de proteínas modificadas por lipídios, secretadas e altamente conservadas, que medeiam as comunicações intercelulares durante o desenvolvimento animal e a homeostase do tecido adulto. Eles exercem funções pleiotrópicas regulando a proliferação, diferenciação, migração, apoptose, polaridade e estabilidade genética das células. Os níveis de sinalização de Wnt desreguladas estão associados a um grande espectro de patologias humanas, incluindo câncer e distúrbios do SNC, como neurodegeneração.
[003] Os dez membros da família Frizzled (Fz) são proteínas transmembranares de sete passagens que servem como receptores para proteínas Wnt. Contribuindo muito para a complexidade da sinalização de Wnt, as relações de ligação Wnt/Fz são promíscuas, com várias Wnts competindo pela ligação a Fzs individuais e vários Fzs capazes de responder a uma determinada Wnt. Estudos cristalográficos recentes confirmaram que a química de interação Wnt/Fz é incompatível com o emparelhamento Wnt e Fz inequívoco, com ambos os locais de contato entre Wnt e Fz sendo dominados por resíduos estritamente ou quimicamente conservados (Janda et al. Science 2012, vol. 337, 59 –64). Essas observações levantam a questão de como as células interpretam os padrões de expressão misturados de entradas de sinalização simultâneas e às vezes conflitantes de vários ligantes de Wnt. Em algumas configurações biológicas, as células podem integrar todas as entradas de sinal de forma não discriminatória e desencadear respostas apropriadas, considerando seu saldo líquido total, bem como sua interpretação coordenada por cascatas de sinalização intracelular funcionalmente entrelaçadas. No entanto, outros processos biológicos exibem seletividade de ligante de Wnt surpreendentemente estrita, apesar de paisagens de expressão Wnt/Fz complexas.
[004] O desenvolvimento cerebrovascular do prosencéfalo e da medula espinhal ventral dos mamíferos opera sob o controle exclusivo de Wnt7a e Wnt7b e, portanto, serve como um paradigma para processos responsivos de Wnt altamente seletivos. A fim de responder à Wnt7 derivada do progenitor neural e ativar a sinalização de Wnt/β-catenina, as células endoteliais cerebrais devem expressar Gpr124, um membro órfão da classe de adesão de receptores acoplados à proteína G, bem como a glicoproteína Reck ancorada por GPI (Vanhollebeke et al. Elife 2015, vol.
4, 1-25). Além disso, quando expresso em células de cultura, Gpr124 e Reck interagem fisicamente e estimulam sinergicamente respostas específicas de Wnt7 (ibid.).
[005] É importante ressaltar que a sinalização endotelial de Wnt/β-catenina é um importante regulador da fisiologia da barreira hematoencefálica (BBB), controlando a expansão e maturação da rede vascular do SNC durante a embriogênese e contribuindo para a manutenção da BBB em adultos. Embora a disfunção de BBB tenha sido implicada em vários distúrbios neurológicos, evidências recentes sugerem que a estimulação pura da sinalização de Wnt/β-catenina na BBB disfuncional é suficiente para melhorar significativamente o acidente vascular cerebral isquêmico e o câncer cerebral em camundongos. Consequentemente, as terapias capazes de estimular a sinalização de Wnt/β- catenina em células endoteliais cerebrais, substancialmente sem reatividade cruzada com outras vias Frizzled, seriam altamente vantajosas para o tratamento de vários distúrbios neurológicos.
SUMÁRIO
[006] A presente invenção é, pelo menos em parte, baseada na descoberta e caracterização do primeiro "módulo de decodificação de Wnt" usado pelas células para responder seletivamente aos ligantes Wnt7. Em particular, no módulo de decodificação de Wnt aqui caracterizado, a seletividade é conferida por RECK, que medeia a ligação específica de Wnt7 de uma maneira independente de Frizzled. A disponibilidade de Wnt7 para a sinalização Frizzled depende de GPR124, um parceiro de ligação RECK que atua como uma amarração transmembranar deficiente em sinalização entre Wnt7 ligada a RECK e andaimes desgrenhados intracelulares (Dvl). Ao criar uma ponte entre Frizzled e GPR124, os polímeros Dvl montam sinalossomos RECK/Gpr124/Frizzled/LRP específicos para ligantes. Os presentes inventores propõem, assim, um modelo no qual complexos RECK/GPR124/Frizzled/receptor LRP de ordem superior se formam em sinalossomos de Wnt específicos de ligante através da ligação simultânea de Frizzled e GPR124 por polímeros Dvl e a ligação específica de Wnt7 a RECK.
[007] Tendo descoberto este novo mecanismo, investigações adicionais revelaram inesperadamente que novos agonistas poderiam ser projetados capazes de ativar a sinalização de Wnt seletivamente em células que expressam RECK e GPR124, tais agonistas sendo úteis como terapêuticos, tais como particularmente para o tratamento de distúrbios do SNC com implicações neurovasculares, incluindo inter alia acidente vascular cerebral, esclerose múltipla, câncer cerebral, epilepsia e distúrbios neurodegenerativos.
[008] Por conseguinte, um aspecto fornece um agente capaz de ativar a sinalização de Wnt mediada por GPR124/RECK/Frizzled/LRP, em que o referido agente não ativa a sinalização de Wnt mediada por Frizzled/LRP na ausência de RECK e/ou GPR124.
[009] Em certas modalidades, o referido agente pode ser uma proteína, polipeptídeo ou um peptídeo.
Consequentemente, outro aspecto fornece um ácido nucleico que codifica o referido agente, em que o referido agente é uma proteína, polipeptídeo ou um peptídeo.
[0010] Um outro aspecto fornece um cassete de expressão de ácido nucleico que compreende o referido ácido nucleico operacionalmente ligado a um promotor e/ou sinais reguladores da transcrição e tradução. Também é fornecido um vetor que compreende o referido ácido nucleico ou cassete de expressão de ácido nucleico.
[0011] Outro aspecto fornece uma composição farmacêutica compreendendo o referido agente, o referido ácido nucleico ou cassete de expressão de ácido nucleico ou o referido vetor e um carreador farmaceuticamente aceitável.
[0012] Um outro aspecto fornece o referido agente, o referido ácido nucleico ou cassete de expressão de ácido nucleico, o referido vetor ou a referida composição farmacêutica, para uso como um medicamento.
[0013] Também é fornecido o referido agente, o referido ácido nucleico ou cassete de expressão de ácido nucleico, o referido vetor ou a referida composição farmacêutica, para uso na prevenção ou tratamento de um distúrbio neurovascular ou um distúrbio do sistema nervoso central (SNC) compreendendo disfunção neurovascular.
[0014] Outro aspecto fornece um método in vitro para identificar um agente útil como um agente terapêutico, tal como, em particular, útil para a prevenção ou tratamento de um distúrbio neurovascular ou um distúrbio do SNC compreendendo disfunção neurovascular, o referido método compreendendo determinar se um agente de teste ativa sinalização de Wnt mediada por GPR124/RECK/Frizzled/LRP, mas não sinalização de Wnt mediada por Frizzled/LRP na ausência de RECK e/ou GPR124.
[0015] Estes e outros aspectos e modalidades preferidas da invenção são descritos nas secções seguintes e nas reivindicações anexas. A matéria das reivindicações anexas é aqui especificamente incorporada neste relatório descritivo.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0016] A Fig. 1 ilustra (A) imunocoloração anti-V5 de Wnt7a-V5 ou Wnt3a-V5 expresso transitoriamente em WT não permeabilizado, FZ1-10-/-, LRP5-/-; LRP6-/- e GPR124-/-; Células RECK-/-. (B) O mesmo que (A) em GPR124-/-; células RECK-/- que coexpressam transitoriamente Wnt7a-V5 e os (co)receptores indicados. (C) Ensaio de captura de ligante em coculturas triplas (1:1:1). Atividades de super top-flash luciferase (STF) de células repórter HEK293-STF transfectadas com Fz5 e estimuladas de forma parácrina por cocultura Wnt7a ou Wnt3a que emitem células na presença de células FZ1-10-/- HEK293T concorrentes transfectadas com vários (co)receptores conforme indicado. (D) Quantificação de sinais de PLA de PLA in situ usando anticorpos primários anti-V5 e anti-HA direcionados a Wnt7a-V5 e HA-Reck ou suas variantes coexpressas em células GPR124-/-; RECK-/-. (E) Quantificação de sinais de PLA de PLA in situ usando anticorpos primários anti-V5 e anti-HA direcionados contra Wnt7a-V5 e os (co)receptores marcados com HA indicados coexpressos em células GPR124-/-; RECK-/-. Barra de escala: 10 µm. (F) Quantificação dos sinais de PLA anti-V5/anti-HA de GPR124-/-; células RECK-/- cotransfectadas com Wnt7a-V5 ou Wnt3a-V5 e as variantes de Reck marcadas com HA indicadas com (eixo y) ou sem Gpr124 (eixo x). (G) Esquemas de Reck e seus motivos de ligação Gpr124 e Wnt7. *p<0,05, ***P<0,001; os dados representam a média ± DP.
[0017] A Fig. 2 ilustra (A) representação esquemática de Wnt7a, as variantes Wnt7a marcadas com V5 e parálogos examinados nas PLAs quantificadas em (B) usando anticorpos primários anti-V5 e anti-HA em células GPR124-/-; RECK-/- coexpressando HA-Reck. (C) Atividades de luciferase STF relativas dependentes de Gpr124/Reck em células HEK293- STF de sinalização de 101 variantes de resíduo único diferentes de Wnt7a e sua posição na estrutura de Wnt7a (eixo x e modelos de estrutura abaixo). As atividades relativas da luciferase são normalizadas para os valores WT Wnt7a. Todos os resíduos Wnt7a são mutados para alanina, espere resíduos de alanina que são alterados para arginina.
(D) Alinhamento do domínio de ligação Wnt7 através do clado de vertebrados. Mm, Mus musculus; Gg, Gallus gallus; Xl, Xenopus laevis; Dr, Danio rerio. As oito variantes de Wnt7a (caindo na região de aminoácidos pWnt7a 238-266), que reduziram a sinalização dependente de Gpr124/Reck para menos de 10%, estão sublinhadas. As atividades das variantes de resíduo único correspondentes e sua classe de atividade são determinadas em (C). As sequências das regiões de ligação Mm Wnt3a e quádrupla Wnt7a variante (Wnt74A) aparecem abaixo. (E) PLAs anti-V5/HA entre Wnt7a-
V5 ou Wnt7a4A-V5 e HA-Reck. A secreção do ligante foi avaliada por meio de análise semiquantitativa dot blot anti-V5 do sobrenadante celular diluído em série. A coloração Ponceau S foi usada como controle de carregamento. Barras de escala, 10 µm. *p<0,05, ***P<0,001; os dados representam a média ± DP (F) Sondagem da interação entre Reck-CK-Fc recombinante purificado e o peptídeo pWnt7a sintético usando calorimetria de titulação isotérmica (ITC). ITC de pWnt7a, pWnt7a4A e pWnt3a em Reck- CK-Fc recombinante (painéis superiores). ITC de Reck-CK-Fc, Reck-CKΔCK1-Fc, Reck-CKΔCK2-Fc, Reck-CKΔCK3-Fc, Reck-CKΔCK4-Fc e Reck-CKΔCK5-Fc para pWnt7b (painéis do meio e inferior). (G) Sondagem da interação Reck-CK-Fc/pWnt7b pelo uso de SMFS. É mostrado o princípio da microscopia de força atômica baseada em curva de distância de força (AFM baseada em FD).
Uma ponta AFM funcionalizada com um espaçador de polietilenoglicol (PEG) fundido ao peptídeo pWnt7b é abordada e retraída de uma superfície revestida com Reck- CK-Fc.
[0018] A Fig. 3 mostra (A) a ilustração esquemática do local do motivo adjacente do protoespaçador (PAM) CRISPR/Cas9 em Lrp5/6 (painel esquerdo) e atividades de luciferase em células WT HEK293T ou LRP5-/-, LRP6-/- ou duplo mutante LRP5-/-; LRP6-/- clones de células HEK293T 48 h após a transfecção com plasmídeos repórter STF e as combinações indicadas de plasmídeos estimulando a sinalização de Wnt7a dependente de Reck/Gpr124 ou a sinalização de Wnt1 independente de Gpr124/Reck. (B) Atividade de STF da sinalização dependente e independente de Gpr124/Reck em células WT HEK293T na presença ou ausência de Dkk-1 coexpresso. (C) Atividades de luciferase em células WT HEK293T ou clones de células HEK293T mutantes FZ 48 h após a transfecção com plasmídeos repórter STF e as combinações indicadas de plasmídeos de expressão, estimulando a sinalização Wnt7a dependente de Reck/Gpr124 ou sinalização Wnt1 independente de Gpr124/Reck. (D) Representação esquemática do local CRISPR/Cas9 PAM no Fz CRD. (E) Atividade de STF de sinalização dependente de Gpr124/Reck em FZ1-10-/- HEK293T após cotransfecção com a variante Fz ou Fz CRD indicada. *p<0,05, **p<0,01, ***P<0,001; os dados representam a média ± DP.
[0019] A Fig. 4 mostra (A) uma representação esquemática de Gpr124 e suas variantes de domínio. (B) Diagramas de fios 3D representativos das cerebrovasculaturas de 60 hpf de embriões mutantes WT e gpr124 injetados com 100 pg do RNA indicado. Os vasos negros representam os CtAs intracerebrais dependentes de Gpr124/Reck que brotam dos canais perineurais primordiais do cérebro posterior (PHBC) (C) artérias centrais do cérebro posterior (CtAs) de embriões morfantes de 60 hpf gpr124 injetados no estágio de uma célula com 100 pg de mRNA indicado. (D) Atividade relativa da luciferase de células HEK293-STF cotransfectadas com Reck, Fz1, Wnt7a e as variantes indicadas de Gpr124. ***P<0,001; os dados representam a média ± DP. (E) CtAs do cérebro posterior de 60 embriões morfantes hpf gpr124 injetados no estágio de uma célula com 100 pg dos mRNAs indicados. ***P<0,001; os dados representam a média ± DP.
[0020] A Fig. 5 ilustra (A) ensaios de coimunoprecipitação Anti-FLAG em lisados totais de células que coexpressam Dvl-GFP e versões marcadas com FLAG N- terminal de Gpr124 ou suas variantes de ICD. (B) Imunoblot de DVL2 e p-DVL2 (T224) em lisados de células inteiras de células FZ1-10-/- e WT HEK293T transfectadas com a combinação indicada de plasmídeos. DVL2 fosforilado (T224) pode ser detectado como uma banda de migração lenta com anticorpos anti-DVL2 (ponta de seta) ou por um anticorpo fosfospecífico que reconhece fosfotreonina 224 (p-DVL2) em extratos de células inteiras obtidos após 48 h pós- transfecção com as diferentes combinações de construtos conforme indicado. (C) Distribuição intracelular de Fz4-GFP e Gpr124-tagRFP expressa individualmente ou na presença de Dvl em células da camada profunda de blástula de peixe- zebra (DEL) (D) Distribuição intracelular de Dvl-GFP coexpresso com Fz4 ou Gpr124 em células DEL de blástula de peixe-zebra. (E) Distribuição intracelular de Fz4-GFP e Gpr124-tagRFP coexpressos na ausência ou presença de Dvl em células DEL de blástula de peixe-zebra. As células anotadas com um asterisco são ampliadas nos painéis direitos e a intensidade de pixels dos canais verde e vermelho ao longo de um caminho virtual no sentido horário seguindo o córtex celular de a até b é plotada abaixo. (F) igual a (E) em células EVL. (G) Sinais BiFC em células DEL de peixe-zebra que expressam Gpr124-VN155 (I152L) e Fz1-VC155 na presença ou ausência de superexpressão Dvl. ***P<0,001; os dados representam a média ± DP.
[0021] A Fig. 6 representa um modelo integrado exemplar para sinalização Fz dependente de Gpr124/Reck, específica de Wnt7.
[0022] A Fig. 7 mostra (A) a atividade relativa da luciferase em células HEK293-STF de vias dependentes de Fz5 (cinza claro, transfecção de Fz5) ou vias dependentes de Gpr124/Reck (transfecção de preto, Gpr124, RECK e Fz1) estimuladas com diferentes variantes de Wnt7. (B) Atividades de luciferase STF dependentes de Gpr124/Reck e Fzd5 relativas em células HEK293-STF de sinalização de 101 variantes de resíduo único diferentes de Wnt7a e sua posição na estrutura Wnt7a. As atividades relativas da luciferase são normalizadas para os valores WT Wnt7a. 42 variantes de resíduo único diferentes de Wnt7a ativam a sinalização Wnt mediada por Gpr124/Reck/Fz/LRP por pelo menos 35% da atividade de sinalização Wnt mediada por Gpr124/Reck/Fz/LRP do Wnt7a de tipo selvagem (caixa retangular). (C) Atividades de luciferase STF relativas a Gpr124/Reck e Fzd5 em células HEK293-STF de sinalização de 42 variantes de resíduo único diferentes de Wnt7a mostrando ativação seletiva da via Gpr124/Reck (D) Atividade de luciferase relativa em HEK-STF após cotransfecção de Wnt7a ou Wnt7a1-278 ou Wnt7aK190A com todos os 10 genes Fz. (E) Vistas laterais de larvas de 3 dpf injetadas no estágio de uma célula com mRNA Wnt7a ou Wnt7a1-278 ou Wnt7aK190A nas doses indicadas. (F) Pontuação fenotípica das larvas de 3 dpf de (D). (G) Vista dorsal de embriões de Xenopus laevis em estágio 36 injetados em um blastômero ventral do embrião de 4 células com 15 pg do mRNA indicado. A fração da formação do eixo secundário (ponta de seta) é indicada para cada condição. (H) Tronco DRG de larvas de 72 hpf wnt7aa morfantes injetadas no estágio de uma célula com o mRNA indicado. Imagens representativas de Tg(neurog1: GFP) DRG são mostradas à direita. ***P<0,001; os dados representam a média ± DP.
[0023] A Fig. 8 mostra as sequências de aminoácidos das variantes de Wnt7a humano como aqui ensinadas. As substituições de aminoácidos versus o domínio Wnt7a NTD de tipo selvagem ou Wnt7a de comprimento total estão em negrito e fonte sublinhada.
[0024] A Fig. 9 mostra que a expressão endotelial transgênica de Wnt7aK190A e Wnt7a1-278 desencadeia a angiogênese do cérebro dependente de GPR124/RECK e restaura a barreira sangue-cérebro em Wnt7aa-/- de peixe-zebra. (A) Vistas dorsais das vasculaturas cerebrais de embriões de 60 hpf WT ou Wnt7aa-/- Tg(kdrl:EGFP). Em Wnt7a-/- mutantes, os CtAs intracerebrais estão ausentes. Wnt7, Wnt7aK190A ou Wnt7a1-278 foram transitoriamente expressos no endotélio de embriões Wnt7aa-/- sob o controle de um promotor kdrl específico do endotélio (receptor do fator de crescimento endotelial vascular semelhante a kdr). Os ligantes Wnt7 foram expressos como om construto biscistrônico com BFP (Proteína Fluorescente Azul) usado como marcador de transgênese. Em contraste com embriões não injetados, Wnt7, Wnt7aK190A ou Wnt7a1-278 restauram a formação de CtAs do rombencéfalo em mutantes Wnt7aa-/- conforme quantificado em (B). (C) Coloração anti-GLUT1 dos CtAs após a expressão transgênica de Wnt7, Wnt7aK190A e Wnt7a1-278 em embriões Wnt7aa-/- de 60 hpf. A expressão transgênica foi alcançada como em (A). Juntos, esses dados demonstram que os agonistas Wnt7aK190A ou Wnt7a1-278 descobertos são ativos in vivo em processos dependentes de Gpr124/Reck.
[0025] A Fig. 10 representa a terapia gênica baseada em GPR124/RECK em um modelo de AVC em camundongo.
Os vírus AVV-PHP.eB foram usados para entregar Wnt7aK190A ou um controle AAV vazio correspondente (Ctrl) aos cérebros de camundongos de 8 semanas de idade. (A) um GFP que codifica AAV-PHP.eB (AAV-PHP.eB-CAG-EGFP) foi usado para demonstrar a expressão transgênica generalizada nos cérebros de camundongos (camundongos de 8 semanas de idade, 2 semanas após a injeção). O promotor CAG é um forte promotor sintético usado em vetores de expressão de mamíferos.
Painel esquerdo, vista dorsal em um cérebro isolado intacto, corte sagital do painel direito. A seção foi corada com anti-CD31 para marcar a vasculatura. (B) A injeção intravenosa de partículas virais 1.1011 AAV-PHP.eB- CAG-Wnt7aK190A-p2A-EGFP duas semanas antes de tMCAO (oclusão transitória da artéria cerebral média, modelo de acidente vascular cerebral) reduziu o volume de acidente vascular cerebral (mm3), demonstrando que os agonistas melhoraram o AVC em modelos pré-clínicos. Os vírus AAV-PHP.eB-CAG-EGFP foram usados como controle.
DESCRIÇÃO DE MODALIDADES
[0026] Conforme usadas aqui, as formas singulares "um", "uma" e "o/a" incluem referentes singulares e plurais, a menos que o contexto dite claramente o contrário.
[0027] Os termos "compreendendo", "compreende" e "compreendido de", conforme usados aqui, são sinônimos de
"incluindo", "inclui" ou "contendo", "contém" e são inclusivos ou abertos e não excluem membros, elementos ou etapas de método não citados adicionais. Os termos também abrangem "consistindo em" e "consistindo essencialmente em", que têm significados bem estabelecidos na terminologia de patentes.
[0028] A recitação de intervalos numéricos por pontos finais inclui todos os números e frações incluídos nos respectivos intervalos, bem como os pontos finais recitados.
[0029] Os termos "cerca de" ou "aproximadamente", conforme usados aqui, quando se referem a um valor mensurável, como um parâmetro, uma quantidade, uma duração temporal e semelhantes, destinam-se a abranger variações de e a partir do valor especificado, como variações de +/- 10% ou menos, de preferência +/- 5% ou menos, mais preferencialmente +/- 1% ou menos, e ainda mais preferencialmente +/- 0,1% ou menos de e a partir do valor especificado, na medida em que tais variações sejam apropriadas para executar na invenção divulgada. Deve ser entendido que o valor ao qual o modificador "cerca de" se refere também é especificamente, e de preferência, divulgado.
[0030] Considerando que os termos "um ou mais" ou "pelo menos um", como um ou mais membros ou pelo menos um membro de um grupo de membros, são claros per se, por meio de exemplificação adicional, o termo abrange, inter alia, uma referência a qualquer um dos referidos membros, ou a quaisquer dois ou mais dos referidos membros, tais como, por exemplo, qualquer ≥3, ≥4, ≥5, ≥6 ou ≥7 etc. dos referidos membros, e até todos os referidos membros. Em outro exemplo, "um ou mais" ou "pelo menos um" pode se referir a 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou mais.
[0031] A discussão dos antecedentes da invenção aqui é incluída para explicar o contexto da invenção. Isso não deve ser interpretado como uma admissão de que qualquer material referido foi publicado, conhecido ou parte do conhecimento geral comum em qualquer país na data de prioridade de qualquer uma das reivindicações.
[0032] Ao longo desta divulgação, várias publicações, patentes e especificações de patentes publicadas são referenciadas por uma citação de identificação. Todos os documentos citados na presente especificação são incorporados aqui por referência em sua totalidade. Em particular, os ensinamentos ou seções de tais documentos aqui especificamente referidos são incorporados por referência.
[0033] A menos que definido de outra forma, todos os termos usados na divulgação da invenção, incluindo termos técnicos e científicos, têm o significado como comumente entendido por alguém versado na técnica à qual esta invenção pertence. Por meio de orientação adicional, definições de termos são incluídas para melhor apreciar os ensinamentos da invenção. Quando termos específicos são definidos em conexão com um aspecto particular da invenção ou uma modalidade particular da invenção, tal conotação se destina a ser aplicada ao longo desta especificação, isto é, também no contexto de outros aspectos ou modalidades da invenção, a menos que definido de outra forma.
[0034] Nas seguintes passagens, diferentes aspectos ou modalidades da invenção são definidos em mais detalhes.
Cada aspecto ou modalidade assim definido pode ser combinado com qualquer outro aspecto (s) ou modalidade (s) a menos que seja claramente indicado o contrário. Em particular, qualquer característica indicada como sendo preferida ou vantajosa pode ser combinada com qualquer outra característica ou características indicadas como sendo preferida ou vantajosa.
[0035] Referência ao longo deste relatório descritivo a "uma modalidade", "uma modalidade" significa que um determinado recurso, estrutura ou característica descrita em conexão com a modalidade está incluída em pelo menos uma modalidade da presente invenção. Assim, o aparecimento das frases "em uma modalidade" ou "em uma modalidade" em vários lugares ao longo deste relatório descritivo não se refere necessariamente à mesma modalidade, mas pode. Além disso, os recursos, estruturas ou características particulares podem ser combinados de qualquer maneira adequada, como seria aparente para um especialista na técnica a partir desta divulgação, em uma ou mais modalidades. Além disso, embora algumas modalidades aqui descritas incluam algumas, mas não outras características incluídas em outras modalidades, as combinações de características de diferentes modalidades devem estar dentro do escopo da invenção e formar diferentes modalidades, como seria entendido por aqueles na técnica. Por exemplo, nas reivindicações anexas, qualquer uma das modalidades reivindicadas pode ser usada em qualquer combinação.
[0036] Os presentes inventores caracterizaram o primeiro "módulo de decodificação Wnt" capaz de discriminar ligantes Wnt que são amplamente sinônimos em sua capacidade de ligar Frizzled, ajudando assim as células a interpretar a complexidade das entradas de sinalização Wnt a fim de orquestrar o desenvolvimento do tecido e a homeostase. No módulo de decodificação Wnt aqui caracterizado, a seletividade é conferida por RECK, que medeia a ligação específica de Wnt7 de uma maneira independente de Frizzled.
O receptor acoplado à proteína G GPR124, um parceiro de ligação de RECK, atua como uma proteína transmembranar com deficiência de sinalização que é capaz de recrutar desgrenhado intracelular (Dvl). Os scaffolds Dvl ligam GPR124 e Frizzled, montando assim os sinalossomos de RECK/GPR124/Frizzled/proteína relacionada ao receptor de lipoproteína (LRP) específicos do ligante Wnt7.
[0037] Os inventores demonstraram ainda de forma inesperada a concepção de novos agonistas capazes de ativar a sinalização Wnt seletivamente em células que expressam RECK e GPR124, tais agonistas sendo úteis como terapêuticos, tais como particularmente para o tratamento de distúrbios neurovasculares ou distúrbios do sistema nervoso central (SNC) compreendendo disfunção neurovascular, incluindo, inter alia, acidente vascular cerebral, esclerose múltipla e câncer cerebral. Assim, a invenção permite fornecer inter alia novos agonistas capazes de estimular a sinalização Wnt/β-catenina em células endoteliais cerebrais substancialmente sem reatividade cruzada com outras vias Frizzled e úteis como terapêuticos, particularmente para distúrbios neurovasculares ou sistema nervoso central (SNC) distúrbios que compreendem disfunção neurovascular.
[0038] Consequentemente, um aspecto fornece um agente capaz de ativar a sinalização Wnt mediada pelo complexo receptor GPR124/RECK/Frizzled/LRP, em que o referido agente não ativa a sinalização Wnt mediada pelo complexo receptor Frizzled/LRP na ausência de RECK e/ou GPR124.
[0039] Referências a quaisquer peptídeos, polipeptídeos, proteínas ou ácidos nucléicos denotam os respectivos peptídeos, polipeptídeos, proteínas ou ácidos nucléicos como comumente conhecidos sob as respectivas designações na técnica. Mais particularmente, as referências a "receptor acoplado à proteína G 124" (GPR124), "Proteína rica em cisteína indutora de reversão com motivos Kazal" (RECK), "Frizzled" (FZD) ou "proteína relacionada ao receptor de lipoproteína" (LRP) denotam os respectivos peptídeos, polipeptídeos, proteínas ou ácidos nucleicos, como aparente a partir do contexto, como comumente conhecido sob as referidas designações na técnica.
[0040] Os termos abrangem os peptídeos, polipeptídeos, proteínas ou ácidos nucleicos quando formam uma parte de um organismo vivo, órgão, tecido ou célula, quando formam uma parte de uma amostra biológica, bem como quando pelo menos parcialmente isolado de tais fontes. Os termos também abrangem os peptídeos, polipeptídeos, proteínas ou ácidos nucleicos quando produzidos por meios recombinantes ou sintéticos.
[0041] A menos que de outra forma aparente a partir do contexto, a referência aqui a qualquer peptídeo,
polipeptídeo, proteína ou ácido nucleico também engloba formas modificadas do referido peptídeo, polipeptídeo, proteína ou ácido nucleico, tais como formas com modificações pós-expressão incluindo, por exemplo, fosforilação, glicosilação, lipidação, metilação, cisteinilação, sulfonação, glutationilação, acetilação, oxidação de metionina a sulfóxido de metionina ou sulfona de metionina e semelhantes.
[0042] Por meio de orientação adicional, o receptor acoplado à proteína G 124 é também conhecido na técnica como receptor A2 acoplado à proteína G de adesão (ADGRA2) ou Marcador endotelial tumoral 5 (TEM5). Por meio de um exemplo, o gene GPR124 humano está anotado no NCBI Genbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) Gene ID 25960. O mRNA de GPR124 humano está anotado sob o número de acesso NCBI Genbank NM_032777.9. Os nucleotídeos 387 (códon de início) a 4403 (códon de parada) de NM_032777.9 constituem a sequência de codificação GPR124. A sequência da proteína GPR124 humana é anotada sob o número de acesso NP_116166.9 do Genbank no NCBI e número de acesso Q96PE1-1 Uniprot (www.uniprot.org) e é reproduzida posteriormente (SEQ ID NO: 1):
[0043] > Precursor do receptor A2 acoplado à proteína G de adesão NP_116166.9 [Homo sapiens]
MGAGGRRMRGAPARLLLPLLPWLLLLLAPEARGAPGCPLSIRSCKCSGERPKGLSGGVP GPARRRVVCSGGDLPEPPEPGLLPNGTVTLLLSNNKITGLRNGSFLGLSLLEKLDLRNN IISTVQPGAFLGLGELKRLDLSNNRIGCLTSETFQGLPRLLRLNISGNIFSSLQPGVFD ELPALKVVDLGTEFLTCDCHLRWLLPWAQNRSLQLSEHTLCAYPSALHAQALGSLQEAQ LCCEGALELHTHHLIPSLRQVVFQGDRLPFQCSASYLGNDTRIRWYHNRAPVEGDEQAG ILLAESLIHDCTFITSELTLSHIGVWASGEWECTVSMAQGNASKKVEIVVLETSASYCP AERVANNRGDFRWPRTLAGITAYQSCLQYPFTSVPLGGGAPGTRASRRCDRAGRWEPGD YSHCLYTNDITRVLYTFVLMPINASNALTLAHQLRVYTAEAASFSDMMDVVYVAQMIQK FLGYVDQIKELVEVMVDMASNLMLVDEHLLWLAQREDKACSRIVGALERIGGAALSPHA QHISVNARNVALEAYLIKPHSYVGLTCTAFQRREGGVPGTRPGSPGQNPPPEPEPPADQ QLRFRCTTGRPNVSLSSFHIKNSVALASIQLPPSLFSSLPAALAPPVPPDCTLQLLVFR NGRLFHSHSNTSRPGAAGPGKRRGVATPVIFAGTSGCGVGNLTEPVAVSLRHWAEGAEP VAAWWSQEGPGEAGGWTSEGCQLRSSQPNVSALHCQHLGNVAVLMELSAFPREVGGAGA GLHPVVYPCTALLLLCLFATIITYILNHSSIRVSRKGWHMLLNLCFHIAMTSAVFAGGI TLTNYQMVCQAVGITLHYSSLSTLLWMGVKARVLHKELTWRAPPPQEGDPALPTPSPML RFYLIAGGIPLIICGITAAVNIHNYRDHSPYCWLVWRPSLGAFYIPVALILLITWIYFL CAGLRLRGPLAQNPKAGNSRASLEAGEELRGSTRLRGSGPLLSDSGSLLATGSARVGTP GPPEDGDSLYSPGVQLGALVTTHFLYLAMWACGALAVSQRWLPRVVCSCLYGVAASALG LFVFTHHCARRRDVRASWRACCPPASPAAPHAPPRALPAAAEDGSPVFGEGPPSLKSSP SGSSGHPLALGPCKLTNLQLAQSQVCEAGAAAGGEGEPEPAGTRGNLAHRHPNNVHHGR RAHKSRAKGHRAGEACGKNRLKALRGGAAGALELLSSESGSLHNSPTDSYLGSSRNSPG AGLQLEGEPMLTPSEGSDTSAAPLSEAGRAGQRRSASRDSLKGGGALEKESHRRSYPLN AASLNGAPKGGKYDDVTLMGAEVASGGCMKTGLWKSETTV
[0044] Por meio de orientação adicional, RECK (proteína rica em cisteína indutora de reversão com motivos Kazal) também é conhecida na técnica como proteína supressora de tumorigenicidade 15 (ST15). Por meio de um exemplo, o gene RECK humano é anotado no NCBI Genbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) Gene ID 8434. O mRNA humano RECK (variante 1 do transcrito) é anotado sob o número de acesso NCBI Genbank NM_021111 .2. Os nucleotídeos 87 (códon de início) a 3002 (códon de parada) de NM_021111.2 constituem a sequência de codificação de RECK. A sequência da proteína RECK humana é anotada sob o número de acesso NP_066934.1 do Genbank no NCBI e número de acesso Uniprot O95980-1, e é posteriormente reproduzida abaixo (SEQ ID NO: 2):
[0045] > NP_066934.1 proteína rica em cisteína indutora de reversão com motivos Kazal, precursor da isoforma 1 [Homo sapiens]
MATVRASLRGALLLLLAVAGVAEVAGGLAPGSAGALCCNHSKDNQMCRDVCEQIFSSKS ESRLKHLLQRAPDYCPETMVEIWNCMNSSLPGVFKKSDGWVGLGCCELAIALECRQACK QASSKNDISKVCRKEYENALFSCISRNEMGSVCCSYAGHHTNCREYCQAIFRTDSSPGP SQIKAVENYCASISPQLIHCVNNYTQSYPMRNPTDSLYCCDRAEDHACQNACKRILMSK KTEMEIVDGLIEGCKTQPLPQDPLWQCFLESSQSVHPGVTVHPPPSTGLDGAKLHCCSK ANTSTCRELCTKLYSMSWGNTQSWQEFDRFCEYNPVEVSMLTCLADVREPCQLGCRNLT YCTNFNNRPTELFRSCNAQSDQGAMNDMKLWEKGSIKMPFINIPVLDIKKCQPEMWKAI ACSLQIKPCHSKSRGSIICKSDCVEILKKCGDQNKFPEDHTAESICELLSPTDDLKNCI PLDTYLRPSTLGNIVEEVTHPCNPNPCPANELCEVNRKGCPSGDPCLPYFCVQGCKLGE ASDFIVRQGTLIQVPSSAGEVGCYKICSCGQSGLLENCMEMHCIDLQKSCIVGGKRKSH GTSFSIDCNVCSCFAGNLVCSTRLCLSEHSSEDDRRTFTGLPCNCADQFVPVCGQNGRT YPSACIARCVGLQDHQFEFGSCMSKDPCNPNPCQKNQRCIPKPQVCLTTFDKFGCSQYE CVPRQLACDQVQDPVCDTDHMEHNNLCTLYQRGKSLSYKGPCQPFCRATEPVCGHNGET YSSVCAAYSDRVAVDYYGDCQAVGVLSEHSSVAECASVKCPSLLAAGCKPIIPPGACCP LCAGMLRVLFDKEKLDTIAKVTNKKPITVLEILQKIRMHVSVPQCDVFGYFSIESEIVI LIIPVDHYPKALQIEACNKEAEKIESLINSDSPTLASHVPLSALIISQVQVSSSVPSAG VRARPSCHSLLLPLSLGLALHLLWTYN
[0046] O termo “Frizzled” ou “FZD” ou “FZ” abrange todo e qualquer membro da família Frizzled. Por meio de orientação adicional, a Tabela 1 apresenta 10 membros da família humana Frizzled conhecidos, conforme anotado no NCBI Genbank e Uniprot.
Tabela 1 Bancos de Gene NCBI Uniprot ID do Códon de mRNA Proteína Proteína Gene Início/Partida FZD1 8321 NM_003505.1 414-2357 NP_003496.1 Q9UP38-1 FZD2 2535 NM_001466.3 246-1943 NP_001457.1 Q14332-1 NM_017412.3 530-2530 NP_059108.1 FZD3 7976 Q9NPG1-1 NM_145866.1 484-2484 NP_665873.1 FZD4 8322 NM_012193.3 314-1927 NP_036325.2 Q9ULV1-1 FZD5 7855 NM_003468.3 411-2168 NP_003459.2 Q13467-1 NM_001164615.1 291-2411 NP_001158087.1 NM_001164616.1 299-2323 NP_001158088.1 O60353-1 FZD6 8323 NM_001317796.1 463-1668 NP_001304725.1 O60353-2 NM_003506.3 318-2438 NP_003497.2 FZD7 8324 NM_003507.1 62-1786 NP_003498.1 O75084-1 FZD8 8325 NM_031866.2 6-2090 NP_114072.1 Q9H461-1 FZD9 8326 NM_003508.2 230-2005 NP_003499.1 O00144-1 FZD10 11211 NM_007197.3 485-2230 NP_009128.1 Q9ULW2-1
[0047] O termo "proteína relacionada ao receptor de lipoproteína" ou "LRP" abrange todas e quaisquer proteínas relacionadas ao receptor de lipoproteína, também conhecidas na técnica como proteínas relacionadas ao receptor de lipoproteína de baixa densidade ou proteínas relacionadas ao receptor de lipoproteína de densidade prolífica e, particularmente, denotam LPR proteínas envolvidas na sinalização Wnt. Em certas modalidades particularmente preferidas, os termos denotam LRP5 (GeneID: 4041), LRP6 (GeneID: 4040) ou LRP5 e LRP6 (LRP5/6).
[0048] Assim, também é divulgado um agente capaz de ativar a sinalização Wnt mediada por GPR124/RECK/Frizzled/LRP5/6, em que o referido agente não ativa a sinalização Wnt mediada por Frizzled/LRP5/6 na ausência de RECK e/ou GPR124.
[0049] É ainda divulgado um método in vitro para identificar um agente útil como um agente terapêutico, tal como em particular útil para a prevenção ou tratamento de um distúrbio neurovascular ou um distúrbio do SNC compreendendo disfunção neurovascular, o referido método compreendendo determinar se um agente de teste ativa GPR124/RECK/Frizzled/sinalização Wnt mediada por LRP5/6, mas não sinalização Wnt mediada por Frizzled/LRP5/6 na ausência de RECK e/ou GPR124.
[0050] Por meio de orientação adicional, o mRNA de LRP5 humano é anotado sob os números de acesso do Genbank
NCBI NM_002335.3 (variante 1 do transcrito; nucleotídeos 107 (códon de início) a 4954 (códon de parada) de NM_002335.3 constituem a sequência de codificação de LRP5) ou NM_001291902.1 (variante 2 do transcrito; nucleotídeos 1872 (códon de início) a 4976 (códon de parada) de NM_001291902.1 constituem a sequência de codificação de LRP5). A sequência da proteína LRP5 humana é anotada sob os números de acesso do NCBI Genbank NP_002326.2 (precursor da isoforma 1) ou NP_001278831.1 (isoforma 2), e o número de acesso Uniprot O75197-1, a sequência da proteína LRP5 anotada como NP_002326.2 sendo reproduzida abaixo (SEQ ID NO: 3): > NP_002326.2 Precursor da isoforma 1 da proteína 5 relacionada ao receptor de lipoproteína de baixa densidade [Homo sapiens]
MEAAPPGPPWPLLLLLLLLLALCGCPAPAAASPLLLFANRRDVRLVDAGGVKLESTIVV SGLEDAAAVDFQFSKGAVYWTDVSEEAIKQTYLNQTGAAVQNVVISGLVSPDGLACDWV GKKLYWTDSETNRIEVANLNGTSRKVLFWQDLDQPRAIALDPAHGYMYWTDWGETPRIE RAGMDGSTRKIIVDSDIYWPNGLTIDLEEQKLYWADAKLSFIHRANLDGSFRQKVVEGS LTHPFALTLSGDTLYWTDWQTRSIHACNKRTGGKRKEILSALYSPMDIQVLSQERQPFF HTRCEEDNGGCSHLCLLSPSEPFYTCACPTGVQLQDNGRTCKAGAEEVLLLARRTDLRR ISLDTPDFTDIVLQVDDIRHAIAIDYDPLEGYVYWTDDEVRAIRRAYLDGSGAQTLVNT EINDPDGIAVDWVARNLYWTDTGTDRIEVTRLNGTSRKILVSEDLDEPRAIALHPVMGL MYWTDWGENPKIECANLDGQERRVLVNASLGWPNGLALDLQEGKLYWGDAKTDKIEVIN VDGTKRRTLLEDKLPHIFGFTLLGDFIYWTDWQRRSIERVHKVKASRDVIIDQLPDLMG LKAVNVAKVVGTNPCADRNGGCSHLCFFTPHATRCGCPIGLELLSDMKTCIVPEAFLVF TSRAAIHRISLETNNNDVAIPLTGVKEASALDFDVSNNHIYWTDVSLKTISRAFMNGSS VEHVVEFGLDYPEGMAVDWMGKNLYWADTGTNRIEVARLDGQFRQVLVWRDLDNPRSLA LDPTKGYIYWTEWGGKPRIVRAFMDGTNCMTLVDKVGRANDLTIDYADQRLYWTDLDTN MIESSNMLGQERVVIADDLPHPFGLTQYSDYIYWTDWNLHSIERADKTSGRNRTLIQGH LDFVMDILVFHSSRQDGLNDCMHNNGQCGQLCLAIPGGHRCGCASHYTLDPSSRNCSPP TTFLLFSQKSAISRMIPDDQHSPDLILPLHGLRNVKAIDYDPLDKFIYWVDGRQNIKRA KDDGTQPFVLTSLSQGQNPDRQPHDLSIDIYSRTLFWTCEATNTINVHRLSGEAMGVVL RGDRDKPRAIVVNAERGYLYFTNMQDRAAKIERAALDGTEREVLFTTGLIRPVALVVDN TLGKLFWVDADLKRIESCDLSGANRLTLEDANIVQPLGLTILGKHLYWIDRQQQMIERV EKTTGDKRTRIQGRVAHLTGIHAVEEVSLEEFSAHPCARDNGGCSHICIAKGDGTPRCS CPVHLVLLQNLLTCGEPPTCSPDQFACATGEIDCIPGAWRCDGFPECDDQSDEEGCPVC SAAQFPCARGQCVDLRLRCDGEADCQDRSDEADCDAICLPNQFRCASGQCVLIKQQCDS FPDCIDGSDELMCEITKPPSDDSPAHSSAIGPVIGIILSLFVMGGVYFVCQRVVCQRYA GANGPFPHEYVSGTPHVPLNFIAPGGSQHGPFTGIACGKSMMSSVSLMGGRGGVPLYDR NHVTGASSSSSSSTKATLYPPILNPPPSPATDPSLYNMDMFYSSNIPATARPYRPYIIR GMAPPTTPCSTDVCDSDYSASRWKASKYYLDLNSDSDPYPPPPTPHSQYLSAEDSCPPS PATERSYFHLFPPPPSPCTDSS
[0051] Por meio de orientação adicional, o mRNA de LRP6 humano é anotado sob o número de acesso do NCBI Genbank NM_002336.2. Os nucleotídeos 143 (códon de início) a 4984 (códon de parada) de NM_002336.2 constituem a sequência de codificação de LRP6. A sequência da proteína LRP6 humana é anotada sob o número de acesso NP_002327.2 do Genbank do NCBI e número de acesso Uniprot O75581-1, e é reproduzida posteriormente (SEQ ID NO: 4): > NP_002327.2 precursores da proteína 6 relacionada ao receptor de lipoproteína de baixa densidade [Homo sapiens]
MGAVLRSLLACSFCVLLRAAPLLLYANRRDLRLVDATNGKENATIVVGGLEDAAAVDFV FSHGLIYWSDVSEEAIKRTEFNKTESVQNVVVSGLLSPDGLACDWLGEKLYWTDSETNR IEVSNLDGSLRKVLFWQELDQPRAIALDPSSGFMYWTDWGEVPKIERAGMDGSSRFIII NSEIYWPNGLTLDYEEQKLYWADAKLNFIHKSNLDGTNRQAVVKGSLPHPFALTLFEDI LYWTDWSTHSILACNKYTGEGLREIHSDIFSPMDIHAFSQQRQPNATNPCGIDNGGCSH LCLMSPVKPFYQCACPTGVKLLENGKTCKDGATELLLLARRTDLRRISLDTPDFTDIVL QLEDIRHAIAIDYDPVEGYIYWTDDEVRAIRRSFIDGSGSQFVVTAQIAHPDGIAVDWV ARNLYWTDTGTDRIEVTRLNGTMRKILISEDLEEPRAIVLDPMVGYMYWTDWGEIPKIE RAALDGSDRVVLVNTSLGWPNGLALDYDEGKIYWGDAKTDKIEVMNTDGTGRRVLVEDK IPHIFGFTLLGDYVYWTDWQRRSIERVHKRSAEREVIIDQLPDLMGLKATNVHRVIGSN PCAEENGGCSHLCLYRPQGLRCACPIGFELISDMKTCIVPEAFLLFSRRADIRRISLET NNNNVAIPLTGVKEASALDFDVTDNRIYWTDISLKTISRAFMNGSALEHVVEFGLDYPE GMAVDWLGKNLYWADTGTNRIEVSKLDGQHRQVLVWKDLDSPRALALDPAEGFMYWTEW GGKPKIDRAAMDGSERTTLVPNVGRANGLTIDYAKRRLYWTDLDTNLIESSNMLGLNRE VIADDLPHPFGLTQYQDYIYWTDWSRRSIERANKTSGQNRTIIQGHLDYVMDILVFHSS RQSGWNECASSNGHCSHLCLAVPVGGFVCGCPAHYSLNADNRTCSAPTTFLLFSQKSAI NRMVIDEQQSPDIILPIHSLRNVRAIDYDPLDKQLYWIDSRQNMIRKAQEDGSQGFTVV VSSVPSQNLEIQPYDLSIDIYSRYIYWTCEATNVINVTRLDGRSVGVVLKGEQDRPRAV VVNPEKGYMYFTNLQERSPKIERAALDGTEREVLFFSGLSKPIALALDSRLGKLFWADS DLRRIESSDLSGANRIVLEDSNILQPVGLTVFENWLYWIDKQQQMIEKIDMTGREGRTK VQARIAQLSDIHAVKELNLQEYRQHPCAQDNGGCSHICLVKGDGTTRCSCPMHLVLLQD ELSCGEPPTCSPQQFTCFTGEIDCIPVAWRCDGFTECEDHSDELNCPVCSESQFQCASG QCIDGALRCNGDANCQDKSDEKNCEVLCLIDQFRCANGQCIGKHKKCDHNVDCSDKSDE LDCYPTEEPAPQATNTVGSVIGVIVTIFVSGTVYFICQRMLCPRMKGDGETMTNDYVVH GPASVPLGYVPHPSSLSGSLPGMSRGKSMISSLSIMGGSSGPPYDRAHVTGASSSSSSS TKGTYFPAILNPPPSPATERSHYTMEFGYSSNSPSTHRSYSYRPYSYRHFAPPTTPCST DVCDSDYAPSRRMTSVATAKGYTSDLNYDSEPVPPPPTPRSQYLSAEENYESCPPSPYT ERSYSHHLYPPPPSPCTDSS
[0052] Um especialista pode apreciar que quaisquer sequências representadas nas bases de dados de sequências ou na presente especificação podem ser precursores dos respectivos peptídeos, polipeptídeos, proteínas ou ácidos nucleicos e podem incluir partes que são processadas a partir de moléculas maduras.
[0053] O termo "proteína", conforme usado ao longo deste relatório descritivo, geralmente abrange macromoléculas que compreendem uma ou mais cadeias polipeptídicas, isto é, cadeias poliméricas de resíduos de aminoácidos ligados por ligações peptídicas. O termo pode abranger proteínas produzidas naturalmente, de forma recombinante, semi-sintética ou sintética. O termo também abrange proteínas que carregam uma ou mais modificações do tipo co ou pós-expressão da (s) cadeia (s) polipeptídica (s), tais como, sem limitação, glicosilação, acetilação, fosforilação, sulfonação, metilação, ubiquitinação, remoção de peptídeo sinal, N - Remoção de Met terminal, conversão de pró-enzimas ou pré-hormônios em formas ativas, etc. O termo também inclui variantes de proteínas ou mutantes que carregam variações de sequência de aminoácidos em relação a proteínas nativas correspondentes, tais como, por exemplo, deleções, adições e/ou substituições de aminoácidos. O termo contempla proteínas de comprimento total e partes ou fragmentos de proteínas, por exemplo, partes de proteínas de ocorrência natural que resultam do processamento de tais proteínas de comprimento total.
[0054] O termo "polipeptídeo", conforme usado ao longo desta especificação, geralmente abrange cadeias poliméricas de resíduos de aminoácidos ligados por ligações peptídicas. Portanto, especialmente quando uma proteína é composta apenas por uma única cadeia polipeptídica, os termos "proteína" e "polipeptídeo" podem ser usados aqui indistintamente para denotar tal proteína. O termo não está limitado a qualquer comprimento mínimo da cadeia polipeptídica. O termo pode abranger polipeptídeos produzidos de forma natural, recombinante, semi-sintética ou sintética. O termo também abrange polipeptídeos que carregam uma ou mais modificações do tipo co ou pós- expressão da cadeia polipeptídica, tais como, sem limitação, glicosilação, acetilação, fosforilação, sulfonação, metilação, ubiquitinação, remoção de peptídeo de sinal, Met N-terminal remoção, conversão de pró-enzimas ou pré-hormônios em formas ativas, etc. O termo também inclui variantes de polipeptídeo ou mutantes que carregam variações de sequência de aminoácidos vis-à-vis um polipeptídeo nativo correspondente, tais como, por exemplo, deleções de aminoácidos, adições e/ou substituições. O termo contempla polipeptídeos de comprimento total e partes ou fragmentos de polipeptídeos, por exemplo, partes de polipeptídeos de ocorrência natural que resultam do processamento de tais polipeptídeos de comprimento total.
[0055] O termo "peptídeo", conforme usado ao longo deste relatório descritivo, se refere preferencialmente a um polipeptídeo, tal como aqui utilizado, consistindo essencialmente em 50 aminoácidos ou menos, por exemplo, 45 aminoácidos ou menos, de preferência 40 aminoácidos ou menos, por exemplo, 35 aminoácidos ou menos, mais preferencialmente 30 aminoácidos ou menos, por exemplo, 25 ou menos, 20 ou menos, 15 ou menos, 10 ou menos ou 5 ou menos aminoácidos.
[0056] Um peptídeo, polipeptídeo ou proteína pode ser de ocorrência natural, por exemplo, presente ou isolado da natureza, por exemplo, produzido ou expresso nativamente ou endogenamente por uma célula ou tecido e opcionalmente isolado dos mesmos. Um peptídeo, polipeptídeo ou proteína pode ser recombinante, ou seja, produzido por tecnologia de DNA recombinante e/ou pode ser, parcial ou totalmente, sintetizado química ou bioquimicamente. Sem limitação, um peptídeo, polipeptídeo ou proteína pode ser produzido de forma recombinante por um sistema de expressão de célula hospedeira ou hospedeiro adequado e opcionalmente isolado a partir dele (por exemplo, um hospedeiro adequado de bactéria, levedura, fungo, planta ou animal ou sistema de expressão de célula hospedeira), ou produzido recombinantemente por tradução livre de células ou transcrição e tradução livre de células, ou peptídeo não biológico, polipeptídeo ou síntese de proteína.
[0057] O termo "ácido nucleico", conforme usado ao longo desta especificação, normalmente se refere a um polímero (de preferência um polímero linear) de qualquer comprimento composto essencialmente por unidades de nucleosídeo. Uma unidade de nucleosídeo geralmente inclui uma base heterocíclica e um grupo de açúcar. As bases heterocíclicas podem incluir, inter alia, bases de purina e pirimidina, tais como adenina (A), guanina (G), citosina (C), timina (T) e uracila (U) que são difundidas em ácidos nucleicos de ocorrência natural, outros de ocorrência natural bases (por exemplo, xantina, inosina, hipoxantina), bem como bases quimicamente ou bioquimicamente modificadas (por exemplo, metiladas), bases não naturais ou derivatizadas. Nucleobases modificadas exemplares incluem, sem limitação, pirimidinas 5-substituídas, 6-azapirimidinas e purinas N-2, N-6 e O-6 substituídas, incluindo 2-
aminopropiladenina, 5-propiniluracil e 5-propinilcitosina.
Em particular, as substituições de 5-metilcitosina mostraram aumentar a estabilidade do duplex de ácido nucleico e podem ser substituições de base preferidas em, por exemplo, agentes anti-sentido, ainda mais particularmente quando combinadas com modificações de açúcar 2'-O-metoxietil. Grupos de açúcar podem incluir, inter alia, grupos de pentose (pentofuranose), tais como preferencialmente ribose e/ou 2-desoxirribose comum em ácidos nucleicos de ocorrência natural, ou arabinose, grupos de açúcar 2-desoxiarabinose, treose ou hexose, bem como grupos de açúcar modificados ou substituídos (tal como, sem limitação, 2'-O-alquilado, por exemplo, açúcares 2'-O-metilados ou 2'-O-etilados, como a ribose; 2'-O- alquiloxialquilado, por exemplo, açúcares 2'-O- metoxietilados, tais como ribose; ou 2'-O, 4'-C-alquileno ligado, por exemplo, 2'-O, 4'-C-metileno-ligado ou 2'-O, 4'-C-açúcares ligados ao etileno, como a ribose ; 2'- fluoro-arabinose, etc.). As moléculas de ácido nucleico compreendendo pelo menos uma unidade ribonucleosídica podem ser tipicamente referidas como ácidos ribonucleicos ou RNA.
Tal (s) unidade (s) de ribonucleosídeo compreendem uma fração 2'-OH, em que -H pode ser substituído como conhecido na técnica por ribonucleosídeos (por exemplo, por um metil, etil, alquil ou alquiloxialquil). De preferência, os ácidos ribonucleicos ou RNA podem ser compostos principalmente de unidades ribonucleosídicas, por exemplo, ≥ 80%, ≥ 85%, ≥
90%, ≥ 95%, ≥ 96%, ≥ 97%, ≥ 98%, ≥ 99% ou mesmo 100% (em número) das unidades de nucleosídeo que constituem a molécula de ácido nucleico podem ser unidades de ribonucleosídeo.
As moléculas de ácido nucleico compreendendo pelo menos uma unidade de desoxirribonucleosídeo podem ser tipicamente referidas como ácidos desoxirribonucleicos ou DNA.
Essa (s) unidade (s) de desoxirribonucleosídeo compreende (m) 2'-H.
De preferência,
os ácidos desoxirribonucleicos ou DNA podem ser compostos principalmente de unidades de desoxirribonucleosídeos, por exemplo, ≥ 80%, ≥ 85%, ≥ 90%, ≥ 95%, ≥ 96%, ≥ 97%, ≥ 98%, ≥
99% ou mesmo 100% (em número) das unidades de nucleosídeo que constituem a molécula de ácido nucleico podem ser unidades de desoxirribonucleosídeo.
As unidades nucleosídicas podem ser ligadas umas às outras por qualquer uma das numerosas ligações inter-nucleosídicas conhecidas,
incluindo, inter alia, ligações fosfodiéster comuns em ácidos nucleicos de ocorrência natural e ligações à base de fosfato ou fosfonato modificadas, como fosforotioato,
alquilfosforotioato, como fosforotioato de metilo,
fosforoditioato, alquilfosfonato tal como metilfosfonato,
alquilfosfonotioato, fosfotriéster tal como alquilfosfotriéster, fosforamidato, fosforopiperazidato,
fosforomorfolidato, fosforamidato em ponte, fosforotriéster de metileno em ponte, fosforotriéster em ponte; e ainda ligações internucleosídicas de siloxano, carbonato,
sulfamato, carboalcoxi, acetamidato, carbamato, tal como
3’-N-carbamato, morfolino, borano, tioéter, 3’-tioacetal e sulfona.
De preferência, as ligações entre nucleosídeos podem ser ligações à base de fosfato, incluindo ligações à base de fosfato modificadas, tais como, mais preferencialmente, ligações de fosfodiéster, fosforotioato ou fosforoditioato ou suas combinações.
O termo "ácido nucleico" também abrange qualquer outra nucleobase contendo polímeros, como miméticos de ácido nucleico, incluindo, sem limitação, ácidos nucleicos peptídicos (PNA), ácidos nucleicos peptídicos com grupos fosfato (PHONA), ácidos nucleicos bloqueados (LNA), morfolino fosforodiamidato -
ácidos nucleicos da estrutura (PMO), ácidos nucleicos do ciclohexeno (CeNA), triciclo-DNA (tcDNA) e ácidos nucleicos com seções da estrutura principal com ligantes alquil ou amino ligantes (ver, por exemplo, Kurreck 2003 (Eur J
Biochem 270: 1628-1644 )). "Alquil", tal como aqui utilizado, abrange particularmente porções de hidrocarboneto inferior, por exemplo, hidrocarboneto C1-C4 linear ou ramificado, saturado ou insaturado, tal como metil, etil, etenil, propil, 1-propenil, 2-propenil e isopropil.
Os ácidos nucleicos, conforme pretendido neste documento, podem incluir nucleosídeos de ocorrência natural, nucleosídeos modificados ou suas misturas. Um nucleosídeo modificado pode incluir uma base heterocíclica modificada, uma fração de açúcar modificada, uma ligação inter-nucleosídeo modificada ou uma combinação dos mesmos.
[0058] O termo "ácido nucleico" abrange ainda preferencialmente moléculas híbridas de DNA, RNA e DNA/RNA, especificamente incluindo hnRNA, pré-mRNA, mRNA, cDNA, DNA genômico, produtos de amplificação, oligonucleotídeos e DNA sintético (por exemplo, sintetizado quimicamente), RNA ou híbridos de DNA/RNA. O RNA inclui RNAi (RNA inibitório), dsRNA (RNA de fita dupla), siRNA (pequeno RNA interferente), mRNA (RNA mensageiro), miRNA (micro-RNA), tRNA (RNA de transferência, carregado ou descarregado com um correspondente acilado aminoácido) e cRNA (RNA complementar). Um ácido nucleico pode ser de ocorrência natural, por exemplo, presente ou isolado da natureza, por exemplo, produzido nativamente ou endogenamente por uma célula ou um tecido e opcionalmente isolado dos mesmos. Um ácido nucleico pode ser recombinante, isto é, produzido por tecnologia de DNA recombinante e/ou pode ser, parcial ou totalmente, sintetizado química ou bioquimicamente. Sem limitação, um ácido nucleico pode ser produzido de forma recombinante por um sistema de expressão de célula hospedeira ou hospedeiro adequado e opcionalmente isolado a partir dele (por exemplo, uma bactéria, levedura, fungo, planta ou animal hospedeiro adequado ou sistema de expressão de célula hospedeira), ou produzido de forma recombinante por célula -transcrição livre ou síntese não biológica de ácido nucleico. Um ácido nucleico pode ser de fita dupla, parcialmente de fita dupla ou de fita simples.
Quando de fita simples, o ácido nucleico pode ser a fita sentido ou a fita anti-sentido. Além disso, o ácido nucleico pode ser circular ou linear.
[0059] A referência a quaisquer peptídeos, polipeptídeos, proteínas ou ácidos nucleicos abrange tais peptídeos, polipeptídeos, proteínas ou ácidos nucleicos de qualquer organismo onde encontrados, e particularmente de animais, preferencialmente animais de sangue quente, mais preferencialmente vertebrados, ainda mais preferencialmente mamíferos, incluindo humanos e mamíferos não humanos, ainda mais preferencialmente de humanos.
[0060] Assim, em certas modalidades, um ou mais e de preferência todos os GPR124, RECK, FZD e LRP como aqui empregados são ou são de origem animal, de preferência de origem animal de sangue quente, mais preferencialmente de origem de vertebrado, ainda mais preferencialmente de origem de mamífero, incluindo humano origem e origem de mamífero não humano, ainda mais preferencialmente origem humana.
[0061] A referência a quaisquer peptídeos, polipeptídeos, proteínas ou ácidos nucleicos pode abranger particularmente tais peptídeos, polipeptídeos, proteínas ou ácidos nucleicos com uma sequência nativa, ou seja, aqueles em que a sequência primária é a mesma dos peptídeos, polipeptídeos, proteínas ou ácidos nucléicos encontrados ou derivados da natureza. Um especialista entende que as sequências nativas podem diferir entre diferentes espécies devido à divergência genética entre essas espécies. Além disso, as sequências nativas podem diferir entre ou dentro de diferentes indivíduos da mesma espécie devido à diversidade genética normal (variação) dentro de uma determinada espécie. Além disso, as sequências nativas podem diferir entre ou mesmo dentro de diferentes indivíduos da mesma espécie devido a mutações somáticas ou modificações pós-transcricionais ou pós-tradução. Quaisquer dessas variantes ou isoformas de peptídeos, polipeptídeos, proteínas ou ácidos nucleicos são pretendidos aqui. Por conseguinte, todas as sequências de peptídeos, polipeptídeos, proteínas ou ácidos nucleicos encontrados ou derivados da natureza são considerados "nativos".
[0062] Em certas modalidades, os peptídeos, polipeptídeos, proteínas ou ácidos nucleicos podem ser humanos, ou seja, sua sequência primária pode ser a mesma que uma sequência primária correspondente ou presente em peptídeos, polipeptídeos, proteínas ou ácidos nucleicos humanos de ocorrência natural. Em certas modalidades, o qualificador "humano" se refere à sequência primária dos respectivos peptídeos, polipeptídeos, proteínas ou ácidos nucleicos, em vez de sua origem ou fonte. Por exemplo, tais peptídeos, polipeptídeos, proteínas ou ácidos nucleicos podem estar presentes ou isolados de amostras de sujeitos humanos ou podem ser obtidos por outros meios (por exemplo, por expressão recombinante, transcrição ou tradução livre de células ou ácido nucleico não biológico ou síntese de peptídeo).
[0063] Em certas modalidades, os peptídeos, polipeptídeos, proteínas ou ácidos nucleicos podem ser do tipo selvagem. Embora a maioria dos peptídeos, polipeptídeos, proteínas ou ácidos nucleicos nativos possam ser considerados de tipo selvagem, aqueles que transportam mutações de ocorrência natural que levam à perda parcial ou completa da função, que podem contribuir para ou ser causadores de um fenótipo de doença, são geralmente excluídos do âmbito do termo “tipo selvagem”.
[0064] A referência a quaisquer péptidos, polipeptídeos, proteínas ou ácidos nucleicos pode também abranger variantes ou fragmentos de tais péptidos, polipeptídeos, proteínas ou ácidos nucleicos, em particular das suas formas de ocorrência natural, nativas ou de tipo selvagem.
[0065] O termo "fragmento", conforme usado ao longo deste relatório descritivo com referência a um peptídeo, polipeptídeo ou proteína geralmente denota uma porção do peptídeo, polipeptídeo ou proteína, tal como tipicamente uma forma truncada no terminal N e/ou C do peptídeo, polipeptídeo ou proteína. De preferência, um fragmento pode compreender pelo menos cerca de 30%, por exemplo, pelo menos cerca de 50% ou pelo menos cerca de 70%, de preferência pelo menos cerca de 80%, por exemplo, pelo menos cerca de 85%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 90%, e ainda mais preferencialmente pelo menos cerca de 95% ou mesmo cerca de 99% do comprimento da sequência de aminoácidos do referido peptídeo, polipeptídeo ou proteína.
Por exemplo, desde que não exceda o comprimento do peptídeo, polipeptídeo ou proteína de comprimento total, um fragmento pode incluir uma sequência de ≥ 5 aminoácidos consecutivos ou ≥ 10 aminoácidos consecutivos ou ≥ 20 aminoácidos consecutivos ou ≥ 30 aminoácidos consecutivos, por exemplo, ≥ 40 aminoácidos consecutivos, como por exemplo ≥ 50 aminoácidos consecutivos, por exemplo, ≥ 60, ≥ 70, ≥ 80, ≥ 90, ≥ 100, ≥ 200, ≥300, ≥400, ≥ 500 , ≥ 600, ≥ 700, ≥ 800, ≥ 900 ou ≥ 1000 aminoácidos consecutivos do peptídeo, polipeptídeo ou proteína de comprimento total correspondente.
[0066] O termo "fragmento" com referência a um ácido nucleico (polinucleotídeo) geralmente denota uma forma truncada 5 'e/ou 3' de um ácido nucleico. De preferência, um fragmento pode compreender pelo menos cerca de 30%, por exemplo, pelo menos cerca de 50% ou pelo menos cerca de 70%, de preferência pelo menos cerca de 80%, por exemplo, pelo menos cerca de 85%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 90%, e ainda mais preferencialmente pelo menos cerca de 95% ou mesmo cerca de 99% do comprimento da sequência de ácido nucleico do referido ácido nucleico. Por exemplo, desde que não exceda o comprimento do ácido nucleico de comprimento total, um fragmento pode incluir uma sequência de ≥ 5 nucleotídeos consecutivos ou ≥ 10 nucleotídeos consecutivos ou ≥ 20 nucleotídeos consecutivos ou ≥ 30 nucleotídeos consecutivos, por exemplo, ≥ 40 nucleotídeos consecutivos, como por exemplo ≥ 50 nucleotídeos consecutivos, por exemplo, ≥ 60, ≥ 70, ≥ 80, ≥ 90, ≥ 100, ≥ 200, ≥ 300, ≥ 400, ≥ 500, ≥ 600, ≥ 700, ≥ 800, ≥ 900, ≥ 1000, ≥ 1500, ≥ 2000, ≥ 2500, ≥ 3000, ≥ 3500 ou ≥ 4000 nucleotídeos consecutivos do ácido nucleico de comprimento total correspondente.
[0067] Os termos abrangem fragmentos decorrentes de qualquer mecanismo, in vivo e/ou in vitro, tal como, sem limitação, por transcrição ou tradução alternativa, exo e/ou endo-proteólise, exo e/ou endo-nucleólise ou degradação de o péptido, polipeptídeo, proteína ou ácido nucleico, tal como, por exemplo, por proteólise ou nucleólise física, química e/ou enzimática.
[0068] O termo "variante" de uma proteína, polipeptídeo, peptídeo ou ácido nucleico geralmente se refere a proteínas, polipeptídeos ou peptídeos cuja sequência de aminoácidos, ou ácidos nucleicos cuja sequência de nucleotídeos é substancialmente idêntica (isto é, amplamente, mas não totalmente idêntica ) à sequência da proteína, polipeptídeo, peptídeo ou ácido nucleico, por exemplo, pelo menos cerca de 80% idêntica ou pelo menos cerca de 85% idêntica, por exemplo, de preferência pelo menos cerca de 90% idêntica, por exemplo, pelo menos 91% idêntica, 92% idênticos, mais preferencialmente pelo menos cerca de 93% idênticos, por exemplo, pelo menos 94% idênticos, ainda mais preferencialmente pelo menos cerca de 95% idênticos, por exemplo, pelo menos 96% idênticos, ainda mais preferencialmente pelo menos cerca de 97% idênticos, por exemplo , pelo menos 98% idêntica, e mais preferencialmente pelo menos 99% idêntica à sequência da proteína, polipeptídeo, peptídeo ou ácido nucleico recitado. De preferência, uma variante pode exibir tais graus de identidade para uma proteína recitada, polipeptídeo, peptídeo ou ácido nucleico quando toda a sequência da proteína, polipeptídeo, peptídeo ou ácido nucleico recitado é questionada no alinhamento de sequência (isto é, identidade de sequência geral). A identidade de sequência pode ser determinada usando algoritmos adequados para realizar alinhamentos de sequência e determinação de identidade de sequência como conhecido per se. Algoritmos exemplificativos, mas não limitativos, incluem aqueles baseados na Ferramenta de Pesquisa de Alinhamento Local Básico (BLAST) originalmente descrita por Altschul et al.
1990 (J Mol Biol 215: 403-10), como o algoritmo de "sequências Blast 2" descrito por Tatusova e Madden 1999 (FEMS Microbiol Lett 174: 247-250), por exemplo, usando as configurações padrão publicadas ou outras configurações adequadas ( como, por exemplo, para o algoritmo BLASTN: custo para abrir uma lacuna = 5, custo para estender uma lacuna = 2, penalidade por uma incompatibilidade = -2, recompensa por uma correspondência = 1, lacuna x_dropoff = 50, valor esperado = 10,0 , tamanho da palavra = 28; ou para o algoritmo BLASTP: matriz = Blosum62 (Henikoff et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci., 89: 10915-10919), custo para abrir uma lacuna = 11, custo para estender uma lacuna = 1, valor esperado = 10,0, tamanho da palavra = 3).
[0069] Um procedimento de exemplo para determinar a porcentagem de identidade entre uma sequência de aminoácidos particular e a sequência de aminoácidos de um polipeptídeo de consulta implicará no alinhamento das duas sequências de aminoácidos usando o algoritmo de sequências
Blast 2 (Bl2seq), disponível como um aplicativo da web ou como um autônomo programa executável (BLAST versão 2.2.31+)
no site do NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov), usando parâmetros de algoritmo adequados.
Um exemplo de parâmetros de algoritmo adequados inclui: matriz = Blosum62, custo para abrir uma lacuna = 11, custo para estender uma lacuna = 1,
valor esperado = 10,0, tamanho da palavra = 3). Se as duas sequências comparadas compartilham homologia, a saída apresentará essas regiões de homologia como sequências alinhadas.
Se as duas sequências comparadas não compartilham homologia, a saída não apresentará sequências alinhadas.
Uma vez alinhado, o número de correspondências será determinado contando o número de posições onde um resíduo de aminoácido idêntico é apresentado em ambas as sequências.
A percentagem de identidade é determinada dividindo o número de correspondências pelo comprimento do polipeptídeo de consulta, seguido pela multiplicação do valor resultante por 100. O valor percentual de identidade pode, mas não precisa, ser arredondado para o décimo mais próximo.
Por exemplo, 78,11, 78,12, 78,13 e 78,14 podem ser arredondados para 78,1, enquanto 78,15, 78,16, 78,17, 78,18 e 78,19 podem ser arredondados para 78,2. É ainda notado que a visão detalhada para cada segmento de alinhamento conforme produzido por Bl2seq já inclui convenientemente a porcentagem de identidades.
[0070] Uma variante de uma proteína, polipeptídeo, peptídeo ou ácido nucleico pode ser um homólogo (por exemplo, ortólogo ou parálogo) da referida proteína, polipeptídeo, peptídeo ou ácido nucleico. Conforme usado neste documento, o termo "homologia" geralmente denota similaridade estrutural entre duas macromoléculas de táxons iguais ou diferentes, em que a referida similaridade é devida à ancestralidade compartilhada.
[0071] Uma variante de uma proteína, polipeptídeo ou peptídeo pode compreender uma ou mais adições, deleções ou substituições de aminoácidos em relação à (ou seja, em comparação com) a proteína ou polipeptídeo correspondente.
Por exemplo, uma variante (variante de substituição) de uma proteína, polipeptídeo ou peptídeo pode compreender até 70 (por exemplo, não mais do que um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60 ou 70) substituições conservativas de aminoácidos em relação a (isto é, em comparação com) a proteína ou polipeptídeo correspondente; e/ou uma variante (variante de substituição) de uma proteína, polipeptídeo ou peptídeo pode compreender até 20 (por exemplo, não mais do que um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 ou 19) substituições de aminoácidos não conservativas em relação a (isto é, em comparação com) a proteína ou polipeptídeo correspondente.
[0072] Uma substituição conservativa de aminoácidos é uma substituição de um aminoácido por outro com características similares. Substituições conservativas de aminoácidos incluem substituições dentro dos seguintes grupos: valina, alanina e glicina; leucina, valina e isoleucina; ácido aspártico e ácido glutâmico; asparagina e glutamina; serina, cisteína e treonina; lisina e arginina; e fenilalanina e tirosina. Os aminoácidos hidrofóbicos apolares incluem alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptofano e metionina. Os aminoácidos neutros polares incluem glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina e glutamina. Os aminoácidos positivamente carregados (ou seja, básicos) incluem arginina, lisina e histidina. Os aminoácidos negativamente carregados (ou seja, ácidos) incluem ácido aspártico e ácido glutâmico. Qualquer substituição de um membro dos grupos polares, básicos ou ácidos mencionados acima por outro membro do mesmo grupo pode ser considerada uma substituição conservativa. Em contraste, uma substituição não conservativa é uma substituição de um aminoácido por outro com características dissimilares.
[0073] Alternativamente ou adicionalmente, por exemplo, uma variante (variante de deleção) de uma proteína, polipeptídeo ou peptídeo pode carecer de 20 segmentos de aminoácidos (por exemplo, um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 segmentos) em relação a (ou seja, em comparação com) a proteína ou polipeptídeo correspondente. O(s) segmento(s) de deleção pode(m), cada um, independentemente consistir em um aminoácido, dois aminoácidos contíguos ou três aminoácidos contíguos. Os segmentos de deleção podem ser não contíguos, ou dois ou mais ou todos os segmentos de deleção podem ser contíguos.
[0074] Uma variante de um ácido nucleico pode compreender uma ou mais adições, deleções ou substituições de nucleotídeos relativas a (isto é, em comparação com) o ácido nucleico correspondente.
[0075] Referência ao “fragmento ou variante” ou “variante ou fragmento” de qualquer peptídeo, polipeptídeo, proteína ou ácido nucleico, também abrange fragmentos de variantes desse peptídeo, polipeptídeo, proteína ou ácido nucleico, e variantes de fragmentos desse peptídeo, polipeptídeo, proteína ou ácido nucleico.
[0076] São particularmente considerados fragmentos biologicamente ativos e/ou variantes dos peptídeos, polipeptídeos ou proteínas citadas. O termo "biologicamente ativo" é intercambiável com termos tais como “funcionalmente ativo” ou “funcional”, denotando que o fragmento e/ou variante retém, pelo menos parcialmente, a atividade biológica ou funcionalidade pretendida do respectivo peptídeo, polipeptídeo ou proteína correspondente. Referência à “atividade” de um peptídeo, polipeptídeo ou proteína pode geralmente abranger qualquer um ou mais aspectos da atividade biológica do peptídeo, polipeptídeo ou proteína, tal como, sem limitação, qualquer um ou mais aspectos de sua atividade bioquímica, atividade enzimática, atividade de sinalização, atividade de interação, atividade de ligante e/ou atividade estrutural, por exemplo, dentro de uma célula, tecido, órgão ou um organismo.
[0077] De preferência, um fragmento ou variante funcionalmente ativo pode reter pelo menos cerca de 20%, por exemplo, pelo menos cerca de 25%, ou pelo menos 30%, ou pelo menos cerca de 40%, ou pelo menos cerca de 50%, por exemplo, pelo menos 60%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 70%, por exemplo, pelo menos 80%, ainda mais preferencialmente pelo menos cerca de 85%, ainda mais preferencialmente pelo menos cerca de 90%, e mais preferencialmente pelo menos cerca de 95% ou mesmo cerca de 100% da atividade biológica pretendida ou funcionalidade comparada com o peptídeo, polipeptídeo ou proteína correspondente. Em certas modalidades, um fragmento ou variante funcionalmente ativo pode mesmo exibir maior atividade biológica ou funcionalidade comparada com o peptídeo, polipeptídeo ou proteína correspondente, por exemplo, pode exibir pelo menos cerca de 100%, ou pelo menos cerca de 150%, ou pelo menos cerca de 200%, ou pelo menos cerca de 300%, ou pelo menos cerca de 400%, ou pelo menos cerca de 500% da atividade biológica pretendida ou funcionalidade comparada com o peptídeo, polipeptídeo ou proteína correspondente. Por meio de um exemplo, onde a atividade de um determinado peptídeo, polipeptídeo ou proteína pode ser facilmente medido em um ensaio com uma saída quantitativa, por exemplo, um ensaio enzimático ou um ensaio de sinalização ou um ensaio de ligação que produz um sinal quantificável, um fragmento ou variante funcionalmente ativo do peptídeo, polipeptídeo ou proteína pode produzir um sinal que é pelo menos cerca de 20%, ou pelo menos cerca de 25%, ou pelo menos 30%, ou pelo menos cerca de 40%, ou pelo menos cerca de 50%, ou pelo menos 60%, mais preferivelmente pelo menos cerca de 70%, ou pelo menos 80%, ou pelo menos cerca de 85%, ou pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 95%, ou pelo menos cerca de 100%, ou pelo menos cerca de 150%, ou pelo menos cerca de 200%, ou pelo menos cerca de 300%, ou pelo menos cerca de 400%, ou pelo menos cerca de 500% do sinal produzido pelo peptídeo, polipeptídeo ou proteína correspondente.
[0078] Por meio de um exemplo e não de limitação,
um fragmento biologicamente ativo ou variante de polipeptídeo ou proteína GPR124, RECK, FZD ou LRP irá pelo menos parcialmente reter um ou mais aspectos da atividade biológica do polipeptídeo ou proteína GPR124, RECK, FZD ou LRP correspondente natural ou tipo selvagem, respectivamente. Por exemplo, referência à atividade biológica do polipeptídeo ou proteína GPR124, RECK, FZD ou LRP pode especificamente denotar a capacidade de participar em um complexo GPR124/RECK/FZD/LRP, por exemplo, a capacidade de se ligar a um ou mais outros componente(s) do referido complexo, e/ou a capacidade de mediar a sinalização de Wnt como parte do complexo GPR124/RECK/FZD/LRP.
[0079] Portanto, o relatório descritivo em particular divulga um agente capaz de ativar a sinalização de Wnt mediada por GPR124/RECK/FZD/LRP, em que o referido agente não ativa a sinalização de Wnt mediada por FZD/LRP na ausência de RECK e/ou GPR124, em que um ou mais ou de preferência todos os GPR124, RECK, FZD ou LRP é ou são GPR124, RECK, FZD ou LRP nativos ou de tipo selvagem.
[0080] O relatório descritivo divulga ainda em particular um agente capaz de ativar a sinalização Wnt mediada por GPR124/RECK/FZD/LRP, em que o referido agente não ativa a sinalização de Wnt mediada por FZD/LRP na ausência de RECK e/ou GPR124, em que um ou mais ou de preferência todos os GPR124, RECK, FZD ou LRP é ou são GPR124, RECK, FZD ou LRP humano nativo ou de tipo selvagem.
[0081] O relatório descritivo divulga ainda em particular um agente capaz de ativar a sinalização de Wnt mediada por GPR124/RECK/FZD/LRP, em que o referido agente não ativa a sinalização de Wnt mediada por FZD/LRP na ausência de RECK e/ou GPR124, em que um ou mais ou de preferência todos os GPR124, RECK, FZD ou LRP é ou são GPR124, RECK, FZD ou LRP humano nativo ou de tipo selvagem conforme anotado nas entradas Genbank ou Uniprot apresentadas em qualquer parte deste relatório descritivo.
O leitor é lembrado de que, onde as entradas Genbank ou Uniprot fornecem a sequência de polipeptídeos ou proteínas precursoras, seria de esperar que as formas maduras correspondentes participassem do complexo GPR124/RECK/FZD/LRP.
[0082] O relatório descritivo divulga ainda em particular um agente capaz de ativar a sinalização de Wnt mediada por GPR124/RECK/FZD1/LRP5 ou LRP6, em que o referido agente não ativa a sinalização de Wnt mediada por FZD5/LRP5 ou LRP6 na ausência de RECK e/ou GPR124, em que um ou mais ou de preferência todos os GPR124, RECK , FZD1, FZD5, LRP5 ou LRP6 é ou são GPR124, RECK, FZD1, FZD5, LRP5 ou LRP6 humano nativo ou de tipo selvagem conforme anotado nas entradas Genbank ou Uniprot apresentadas em qualquer outro lugar neste relatório descritivo.
[0083] O relatório descritivo divulga ainda em particular um agente capaz de ativar a sinalização de Wnt mediada por GPR124/RECK/FZD/LRP, em que o referido agente não ativa a sinalização de Wnt mediada por FZD/LRP na ausência de RECK e/ou GPR124, em que um ou mais de GPR124, RECK, FZD ou LRP é ou são um fragmento biologicamente ativo ou variante de GPR124, RECK, FZD ou LRP nativo ou de tipo selvagem.
[0084] O relatório descritivo divulga ainda em particular um agente capaz de ativar a sinalização de Wnt mediada por GPR124/RECK/FZD/LRP, em que o referido agente não ativa a sinalização de Wnt mediada por FZD/LRP na ausência de RECK e/ou GPR124, em que um ou mais de GPR124, RECK, FZD ou LRP é ou são um fragmento biologicamente ativo ou variante de GPR124, RECK, FZD ou LRP humano nativo ou de tipo selvagem.
[0085] Os termos "complexo", "complexo de proteína" ou “complexo de polipeptídeo” são bem conhecidos na técnica. Por meio de orientação adicional e sem limitação, os termos denotam amplamente um agrupamento compreendendo duas ou mais proteínas ou polipeptídeos. O agrupamento pode ser estabilizado por ligações não covalentes, mais particularmente interações proteína-proteína não covalentes, em que toda ou apenas parte dos polipeptídeos presentes dentro do agrupamento interagem fisicamente. Um complexo de proteína pode ser compreendido inteiramente de peptídeos, polipeptídeos ou proteínas, ou pode incluir outras moléculas ou macromoléculas, tais como carboidratos, lipídeos, glicolipídeos, ácidos nucleicos, oligonucleotídeos, nucleoproteínas, nucleosídeos, fosfatos de nucleosídeo, cofatores enzimáticos, porfirinas, íons metálicos e similares. Os termos abrangem, sem limitação, complexos de proteína que podem ser obrigatórios ou não obrigatórios, transitórios ou permanentes e/ou homomultiméricos ou heteromultiméricos. Os termos abrangem, sem limitação, complexos de proteína que podem estar localizados na membrana celular (membrana plasmática), extracelularmente, dentro do citoplasma, dentro de organelas celulares ou em membranas de organelas celulares.
Complexos localizados na membrana celular contêm tipicamente pelo menos uma proteína transmembranar ou ancorada na membrana. Os termos também abrangem microdomínios de membrana e estruturas semelhantes a organelas macromoleculares associadas a membrana, conhecidas como "sinalossomo", que compartimentam uma dada via de sinalização. Tais complexos de proteína de ordem superior podem ser pelo menos parcialmente estabilizados por andaimes intracelulares. Os termos também podem também denotar situações em que certas proteínas ou polipeptídeos são localmente concentradas ou acumuladas em um dado sítio de uma membrana celular, tal como para permitir transdução de sinal através da membrana celular no referido sítio mediado pelas referidas proteínas ou polipeptídeos.
[0086] Um complexo receptor GPR124/RECK/FZD/LRP denota amplamente um complexo de proteína, particularmente um complexo de proteína associado à membrana, mais particularmente um complexo de proteína associada à membrana plasmática compreendendo pelo menos um polipeptídeo GPR124, pelo menos um polipeptídeo RECK, pelo menos um polipeptídeo FZD e pelo menos um polipeptídeo LRP.
Um complexo receptor GPR124/RECK/FZD/LRP, quando localizado na membrana plasmática de uma célula contendo os membros a jusante da via de sinalização de Wnt/β-catenina (por exemplo, desgrenhado (Dvl)), é capaz de ativar a sinalização de Wnt/β-catenina na referida célula, em resposta ao ligante Wnt7 fornecido extracelularmente.
[0087] Um complexo receptor de FZD/LRP denota amplamente um complexo de proteína, particularmente um complexo de proteína associado à membrana, mais particularmente um complexo de proteína associada à membrana plasmática compreendendo pelo menos um polipeptídeo FZD e pelo menos um polipeptídeo LRP. Um complexo receptor de FZD/LRP, quando localizado na membrana plasmática de uma célula contendo os membros a jusante da via de sinalização de Wnt/β-catenina (por exemplo, Dvl), é capaz de ativar a sinalização de Wnt/β-catenina na referida célula em resposta a um ligante Wnt fornecido extracelularmente, tal como, mas não limitado a, ligante Wnt7.
[0088] O termo "sinalização de Wnt", conforme aqui utilizado, se refere ao mecanismo pelo qual um ligante Wnt biologicamente ativo exerce seu efeito sobre uma célula para modular a atividade e/ou ações da referida célula.
Ligantes Wnt biologicamente ativos modulam a atividade celular e/ou a ação por ligação ao(s) receptor(es) de Wnt, tal como o complexo receptor de FZD/LRP. Uma vez ativada pela ligação do ligante Wnt, o(s) receptor(es) de Wnt ativará(ão) uma ou mais vias de sinalização intracelular.
Três vias de sinalização de Wnt são classicamente reconhecidas: a via de Wnt canônica (isto é, mediado pela ativação de β-catenina como um coativador transcricional), a via de polaridade celular planar não canônica e a via de Wnt/cálcio não canônica. Todas as três vias são tipicamente ativadas por ligação de um ligante Wnt a um receptor FZD.
Entretanto, o recrutamento do receptor de LRP parece ser um pré-requisito para indução da sinalização de Wnt canônica (ou β-catenina dependente). Como conhecido no estado da técnica, na ausência de um complexo Wnt/FZD/LRP (“sinalização de Wnt canônica inativa”), β-catenina é fosforilada no citoplasma por caseína quinase e glicogênio sintase quinase-3 (GSK-3). A interação entre estas quinase e β-catenina é facilitada pelas proteínas andaimes, Axina e polipose adenomatosa coli (APC). Juntas, estas proteínas formam um "complexo de degradação", que permite que a β-
catenina fosforilada seja reconhecida por proteína contendo repetição de beta-transducina (β-TrCP), dirigida para ubiquitinação e degradada pelo proteassoma.
Sinalização de
Wnt canônica ativa (ou β-catenina dependente) envolve a ligação de ligantes Wnt a um complexo receptor de FZD e LRP na superfície celular.
Durante a sinalização, FZD coopera com LRP de tal maneira que a ligação da proteína Wnt leva à dimerização dos dois receptores.
E é teorizado que esta dimerização leva a uma mudança conformacional dos receptores de FZD e LRP.
Como consequência, a cauda citoplasmática do LRP recruta e se liga à proteína de andaime Axina de uma maneira dependente da fosforilação e leva à formação de um complexo envolvendo DVL, Axina e
GSK3. Multímeros de DVL ligados ao receptor e moléculas de
Axina podem suportar a formação do dímero LRP-FZD.
Como resultado do recrutamento de GSK para a membrana celular,
fosforilação de β-catenina é inibida, liberando β-catenina do complexo de degradação e permitindo que β-catenina se acumule no citoplasma.
O acúmulo de β-catenina no citoplasma permite que a β-catenina entre no núcleo e interaja com fatores de transcrição TCF/LEF.
[0089] Os presentes inventores identificaram a sinalização mediada por RECK/GPR124/Frizzled/LRP específica para Wnt7, em que Wnt7 se liga especificamente a Reck de uma maneira independente de FZD e GPR124, um parceiro de ligação RECK, transpõe Wnt7 ligada a RECK para o complexo FZD/LRP através de andaimes DVL intracelulares, montando assim os sinalossomos RECK/GPR124/FZD/LRP específicos do ligante Wnt7 e ativando a sinalização de Wnt canônica.
[0090] Em vista do acima, a pessoa versada entenderá que, como é tipicamente o caso para sinalização de Wnt mediada pelos polipeptídeos FZD e LRP, um complexo FZD/LRP pode não ser formado na membrana da célula na ausência de ou independentemente de um agente extracelular capaz de ativar a sinalização de Wnt através do referido complexo FZD/LRP.Em outras palavras, o agente pode desempenhar um papel ativo na montagem ou organização dos polipeptídeos FZD e LRP no complexo FZD/LRP, tal como por meio de interações proteína-proteína entre o agente e cada um de FZD e LRP. Isto resulta na formação do complexo FZD/LRP e ativação da sinalização de Wnt mediada pelo complexo.
[0091] Similarmente, um complexo receptor GPR124/RECK/FZD/LRP pode não ser formado na membrana da célula na ausência de ou independentemente de um agente extracelular capaz de ativar a sinalização de Wnt através do referido complexo GPR124/RECK/FZD/LRP. Em outras palavras, o agente pode desempenhar um papel ativo na montagem ou organização de dois ou mais polipeptídeos GPR124, RECK, FZD e LRP no complexo GPR124/RECK/FZD/LRP, tal como por meio de interações proteína-proteína entre o agente e cada um dos referidos dois ou mais de GPR124, RECK, FZD e LRP. Isto resulta na formação do complexo GPR124/RECK/FZD/LRP e a ativação da sinalização de Wnt mediada pelo complexo.
[0092] Consequentemente, a frase “um agente capaz de ativar a sinalização de Wnt mediada por Gpr124/Reck/Frizzled/LRP” se refere à capacidade do agente de induzir a sinalização de Wnt através dos polipeptídeos Gpr124, Reck, Frizzled e LRP. A frase “um agente capaz de ativar a sinalização de Wnt mediada por Gpr124/Reck/Frizzled/LRP” não implica necessariamente a existência de um complexo receptor Gpr124/Reck/Frizzled/LRP anterior ao contato de uma célula que expressa Gpr124, Reck, Frizzled e LRP com o agente. Por exemplo e sem limitação, o agente pode contribuir para ou facilitar a formação ou montagem de um complexo de sinalização Gpr124/Reck/Frizzled/LRP, ativando assim a sinalização de Wnt mediada pelo referido complexo. Similarmente, uma frase “um agente capaz de ativar a sinalização de Wnt mediada por
Frizzled/LRP” se refere à capacidade do agente de induzir a sinalização de Wnt através dos polipeptídeos Frizzled e LRP. A frase “um agente capaz de ativar a sinalização de Wnt mediada por Frizzled/LRP” não implica necessariamente a existência de um complexo receptor Frizzled/LRP anterior ao contato de uma célula que expressa Frizzled e LRP com tal agente. Por exemplo e sem limitação, tal agente pode contribuir para ou facilitar a formação ou montagem de um complexo de sinalização Frizzled/LRP, ativando assim a sinalização de Wnt mediada pelo referido complexo. A frase “referido agente não ativa a sinalização de Wnt mediada por Frizzled/LRP na ausência de Reck e/ou Gpr124” não implica necessariamente a existência de um complexo receptor Frizzled/LRP em uma célula que expressa Frizzled e LRP mas não Reck e/ou Gpr124. Por exemplo e sem limitação, o agente pode falhar em contribuir para ou facilitar a formação ou montagem de um complexo de sinalização Frizzled/LRP em tal célula, assim falhando para ativar a sinalização de Wnt mediada pelo referido complexo.
[0093] A pessoa versada deve apreciar ainda que um complexo receptor GPR124/RECK/FZD/LRP, como contemplado aqui, pode incluir outro(s) componente(s), que podem ou não precisam modular funcionalmente o complexo. Por exemplo, o complexo pode incluir Desgrenhado (Dvl), formando andaimes intracelulares capazes de transpor GPR124 e Frizzled.
[0094] Em modalidades particulares, a célula que expressa polipeptídeos GPR124, RECK, FZD e LRP em sua membrana plasmática e contendo os membros a jusante da via de sinalização de Wnt/β-catenina é uma célula que expressa naturalmente todos os polipeptídeos GPR124, RECK, FZD e LRP na superfície celular, tal como uma célula endotelial cerebral. Em outras modalidades, a célula que expressa os polipeptídeos GPR124, RECK, FZD e LRP em sua membrana plasmática e contendo os membros a jusante da via de sinalização de Wnt/β-catenina é uma célula modificada (por exemplo, geneticamente manipuladas) de tal maneira que expressa todos os polipeptídeos GPR124, RECK, FZD e LRP em sua superfície. Por exemplo, a célula pode ser uma célula cultivada que expressa naturalmente FZD e LRP, mas que não expressa naturalmente GPR124 e RECK, e geneticamente manipuladas para expressar os polipeptídeos GPR124 e RECK (por exemplo, transfectados estavelmente ou transitoriamente com ácido(s) nucleico(s) expressível(is) que codificam os referidos polipeptídeos GPR124 e RECK.
Preferencialmente, a célula é uma célula mamífera, mais preferencialmente uma célula humana.
[0095] Em modalidades particulares, a capacidade do agente para ativar a sinalização de Wnt mediada por GPR124/RECK/Frizzled/LRP, mas não ativar a sinalização de Wnt mediada por Frizzled/LRP na ausência de RECK e/ou
GPR124, denota a capacidade do agente para ativar a sinalização de Wnt canônica na presença de RECK e GPR124,
mas não na ausência de RECK e/ou GPR124. A frase “a presença de RECK e GPR124” se refere à ocorrência dos polipeptídeos RECK e GPR124 em ou próximos à membrana celular, preferencialmente em estreita proximidade mútua com os polipeptídeos Frizzled e LRP.
A proximidade mútua estreita pode facilitar a formação do complexo receptor
GPR124/RECK/Frizzled/LRP sob condições que conduzem a este,
tal como quando um agente, conforme aqui ensinado, é suprido externamente a uma célula.
Por outro lado, a frase
“a ausência de RECK e/ou GPR124” se refere à falta ou ausência dos polipeptídeos RECK e/ou GPR124 na membrana celular.
A ausência de RECK e/ou GPR124 em ou perto da membrana celular pode ocorrer quando uma célula não expressa, traduz ou transloca corretamente RECK e/ou
GPR124. A ausência de RECK e/ou GPR124 não precisa denotar a completa ausência do polipeptídeo RECK e/ou GPR124 na membrana celular, mas pode, por exemplo, referir-se a uma quantidade de polipeptídeo RECK e/ou GPR124 que não é detectável por, ou cai abaixo da faixa de sensibilidade dos ensaios convencionais de detecção ou quantificação de proteínas conhecidos pelos versados na técnica, tais como,
por exemplo, imunoblotting, imunocitoquímica ou imunofluorescência.
[0096] Em modalidades particulares, a capacidade do agente para ativar a sinalização de Wnt mediada por GPR124/RECK/Frizzled/LRP, mas não ativar a sinalização de Wnt mediada por Frizzled/LRP na ausência de RECK e/ou GPR124, denota a capacidade do agente para ativar a sinalização de Wnt em células capazes de mediar a sinalização de Wnt pelo complexo receptor GPR124/RECK/Frizzled/LRP, mas não em células capazes de sinalização de Wnt mediada por Frizzled/LRP, que não expressam GPR124 e/ou RECK.
[0097] Células capazes de mediar a sinalização de Wnt pelo complexo receptor GPRl24/RECK/Frizzled/LRP também podem ser células que expressam naturalmente todos os componentes celulares requeridos para a sinalização de Wnt mediada por GPRl24/RECK/Frizzled/LRP, tais como células endoteliais cerebrais ou linhagens celulares. Células capazes de mediar a sinalização de Wnt pelo complexo receptor GPR124/RECK/Frizzled/LRP também podem ser células que expressam naturalmente nenhum ou nem todos os componentes celulares requeridos para a sinalização de Wnt mediada por GPR124/RECK/Frizzled/LRP, que pode ser modificada tal como geneticamente manipuladas a fim de compensar os componentes celulares faltantes requeridos para a sinalização de Wnt mediada por GPR124/RECK/Frizzled/LRP. Tais modificações são conhecidas na técnica e são descritas em outro lugar neste relatório descritivo.
[0098] Células capazes de mediar a sinalização de Wnt pelo complexo receptor GPR124/RECK/Frizzled/LRP podem ser células de vertebrados ou linhagens celulares. Exemplos não limitantes incluem rim embrionário humano 293 T (HEK239T), células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC), células endoteliais microvasculares dérmicas humanas (HDMVEC), células endoteliais da artéria coronária humana (HCAEC), células endoteliais da aorta humanas (HAEC), células endoteliais microvasculares cerebrais humanas (HBMECs), células Bend3, células Bend5 ou células hCMEC/D3. Células HEK293T podem ser obtidas a partir de coleções públicas mantidas, por exemplo, pela American Type Culture Collection (ATCC) (10801 University Blvd. Manassas, Virginia 20110-2209, USA), incluindo, sem limitação, HEK293T com ATCC acc. Nº CRL-3216.
[0099] Em modalidades particulares, a capacidade do agente para ativar a sinalização de Wnt mediada por GPR124/RECK/Frizzled/LRP, mas não ativar a sinalização de Wnt mediada por Frizzled/LRP na ausência de RECK e/ou GPR124, denota a capacidade do agente para ativar a sinalização de Wnt em células que expressam GPR124, RECK, FZ e LRP, mas não em células que expressam FZ e LRP mas que não expressam GPR124 e/ou RECK, em que as células que expressam GPR124, RECK, FZ e LRP e as células que expressam FZ e LRP, mas que não expressam GPR124 e/ou RECK são de outra forma substancialmente idênticas.
[00100] Em modalidades particulares, a capacidade do agente para ativar a sinalização de Wnt mediada por GPR124/RECK/Frizzled/LRP, mas não ativar a sinalização de Wnt mediada por Frizzled/LRP na ausência de RECK e/ou GPR124, denota a capacidade do agente para ativar a sinalização de Wnt em linhagens celulares ou células endoteliais vasculares do cérebro humano ou de camundongo, enquanto não ativando a sinalização de Wnt em linhagens celulares ou células endoteliais vasculares do cérebro humano ou de camundongo nas quais o gene RECK e/ou GPR124 é interrompido. A determinação da ativação da sinalização de Wnt é conhecida na técnica e pode ser realizada conforme descrito neste relatório descritivo. Células endoteliais adequadas incluem, por exemplo, células endoteliais microvasculares cerebrais humanas (HBMECs), células Bend3, células Bend5 ou células hCMEC/D3. HBMECs podem ser obtidos a partir de coleções públicas mantidas, por exemplo, por ATCC, incluindo sem limitação, HBEC-5i com ATCC acc. Nº CRL-3245. Células Bend3 podem ser obtidas a partir de coleções públicas mantidas, por exemplo, por ATCC, incluindo sem limitação, bEnd.3 com ATCC acc. Nº CRL-2299.
[00101] Em modalidades particulares, a capacidade do agente para ativar a sinalização de Wnt mediada por GPR124/RECK/Frizzled/LRP, mas não ativar a sinalização de Wnt mediada por Frizzled/LRP na ausência de RECK e/ou GPR124, denota a capacidade do agente de restaurar a vasculatura cerebral e/ou a barreira hematoencefálica em Wnt7aa-/- de peixe-zebra (Danio rerio) quando sendo transgenicamente expresso no endotélio do referido peixe- zebra, enquanto a microinjeção de mRNA que codifica o agente em um embrião de peixe-zebra do tipo selvagem não induz um fenótipo de posteriorização, preferencialmente em que o mRNA é injetado em uma dose de 1 pg a 100 pg, ou enquanto a microinjeção de mRNA que codifica o agente em um embrião de Xenopus do tipo selvagem não induz a duplicação do eixo.
[00102] A capacidade do agente de restaurar a vasculatura cerebral e/ou a barreira hematoencefálica em Wnt7aa-/- de peixe-zebra quando sendo transgenicamente expresso no endotélio do referido peixe-zebra pode ser determinada por qualquer método conhecido na técnica. Por exemplo, a restauração da vasculatura cerebral e/ou a barreira hematoencefálica pode ser avaliada determinando-se a quantidade das artérias centrais do rombencéfalo (CtAs), o comprimento capilar cerebral agregado, o tamanho médio do vaso e/ou os ramos capilares médios. A determinação da expressão de GLUT1 na região cerebral do Wnt7aa-/- de peixe-
zebra que expressa transgenicamente o agente, conforme aqui ensinado, (por exemplo, usando-se a hibridização in situ ou imuno-histoquímica) pode ser usada para visualizar a vasculatura cerebral no referido peixe-zebra.
Subsequentemente, o padrão de expressão GLUT1 na região cerebral do Wnt7aa-/- de peixe-zebra expressando transgenicamente o agente, conforme aqui ensinado, pode ser comparado com o padrão de expressão GLUT1 na região cerebral de um controle, tal como um tipo selvagem, peixe- zebra.
[00103] Em modalidades particulares, a vasculatura cerebral e a barreira hematoencefálica do Wnt7aa-/- de peixe-zebra que expressa transgenicamente o agente, conforme ensinado aqui, são consideradas como sendo restauradas se a quantidade de CtAs do rombencéfalo em Wnt7aa-/- de peixe-zebra que expressa transgenicamente o agente, conforme aqui ensinado, é de pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 99% da quantidade de CtAs do rombencéfalo em um tipo selvagem de peixe-zebra.
[00104] Métodos para geração de Wnt7aa-/- de peixe- zebra e que expressam transgenicamente um agente no endotélio de um peixe-zebra são bem conhecidos na técnica, por exemplo, utilizando-se a edição de gene dirigida por
CRISPR/Cas, tal como descrito em Shankaran et al., CRISPR/Cas9-directed gene editing for the generation of loss-of-function mutants in high-throughput zebrafish F0 screens, Curr Protoc Mol Biol.,119:31.9.1-31.9.22 (2017).
[00105] Microinjeção de mRNA em um embrião de peixe- zebra, preferencialmente um embrião de peixe-zebra em estágio de uma a quatro células, bem como a avaliação da ocorrência ou ausência de um fenótipo em peixe-zebra são bem conhecidos na técnica, por exemplo, ver Rosen et al., Microinjection of zebrafish embryos to analyse gene function, J Vis Exp. (25): 1115 (2009). O fenótipo de posteriorização no peixe-zebra inclui a posteriorização do neuroectoderma anterior durante a gastrulação, perda do prosencéfalo e perda da estrutura do olho em peixe-zebra (van de Water et al., Ectopic Wnt signal determines the eyeless phenotype of zebrafish masterblind mutant.
Development. 128(20):3877-3888 (2001)).
[00106] A avalição da ocorrência ou ausência de duplicação do eixo após injeção de um agente em um embrião de Xenopus é bem conhecida na técnica, por exemplo, ver Kühl et al., Dorsal axis duplication as a functional readout for Wnt activity. Methods Mol Biol. 469:467-476 (2008).
[00107] Conforme aqui utilizado, o termo "agente" se refere amplamente a qualquer substância química (por exemplo, inorgânica ou orgânica), bioquímica ou biológica, molécula ou macromolécula (por exemplo, macromolécula biológica), uma combinação ou mistura dos mesmos, uma amostra de composição não determinada ou um extrato feito a partir de materiais biológicos tais como bactérias, fungos, plantas ou células animais ou tecidos. Os "agentes" preferidos, embora não limitantes, incluem ácidos nucleicos, oligonucleotídeos, ribozimas, peptídeos, polipeptídeos, proteínas, peptidomiméticos, anticorpos, fragmentos de anticorpos, andaimes de proteínas semelhantes a anticorpos, aptâmeros, fotoaptâmeros, spiegelmers, substâncias químicas, preferencialmente moléculas orgânicas, mais preferencialmente pequenas moléculas orgânicas, lipídios, carboidratos, polissacarídeos, etc., e quaisquer combinações dos mesmos. Dependendo do contexto, o termo "agente" pode denotar um “agente terapêutico” ou “fármaco”, útil para ou utilizado no tratamento, cura, prevenção ou diagnóstico de uma doença.
[00108] Em modalidades particulares, o agente, conforme aqui divulgado, compreende ou é selecionado de um grupo que consiste em uma substância química, um anticorpo, um fragmento de anticorpo, um andaime de proteína semelhante a anticorpo, uma proteína ou polipeptídeo, um peptídeo, um peptidomimético, um aptâmero, um fotoaptâmero, um spiegelmer e um ácido nucleico, de preferência, em que o referido agente compreende uma proteína ou polipeptídeo.
[00109] O agente, conforme divulgado aqui, pode compreender uma combinação de duas ou mais de uma substância química, um anticorpo, um fragmento de anticorpo, um andaime de proteína semelhante a anticorpo, uma proteína ou polipeptídeo, um peptídeo, um peptidomimético, um aptâmero, um fotoaptâmero, um spiegelmer e um ácido nucleico. Por exemplo, o agente, conforme divulgado aqui, pode compreender uma combinação de uma ou mais regiões polipeptídicas e uma ou mais regiões não polipeptídicas.
[00110] Em modalidades particulares, o agente, conforme aqui divulgado, compreende ou é selecionado a partir de um grupo que consiste em uma proteína, polipeptídeo ou um peptídeo.
[00111] Conforme aqui utilizado, o termo "substância química" é utilizado em seu sentido mais amplo e geralmente se refere a qualquer substância substancialmente pura que tem uma composição química constante e propriedades características. A substância química pode ser uma molécula orgânica, preferencialmente uma molécula orgânica pequena.
O termo "molécula pequena" se refere a compostos, preferencialmente compostos orgânicos, com um tamanho comparável àquelas moléculas orgânicas geralmente utilizadas em produtos farmacêuticos. O termo exclui macromoléculas biológicas (por exemplo, proteínas, peptídeos, ácidos nucleicos, etc). Moléculas orgânicas pequenas preferidas variam em tamanho até cerca de 5000 Da, por exemplo, até cerca de 4000, preferencialmente até 3000 Da, mais preferencialmente até 2000 Da, ainda mais preferencialmente até cerca de 1000 Da, por exemplo, até cerca de 900, 800, 700, 600 ou até cerca de 500 Da.
[00112] O termo "anticorpo" é aqui utilizado em seu sentido mais amplo e geralmente se refere a qualquer agente de ligação imunológico, tal como um anticorpo inteiro, incluindo, sem limitação, um anticorpo quimérico, humanizado, humano, recombinante, transgênico, enxertado e de cadeia única, e os semelhantes ou quaisquer proteínas de fusão, conjugados, fragmentos ou derivados dos mesmos que contêm um ou mais domínios que se ligam seletivamente a um antígeno de interesse. O termo anticorpo inclui, desse modo, uma molécula de imunoglobulina inteira, um anticorpo monoclonal, um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado, um anticorpo humano ou um fragmento imunologicamente eficaz de qualquer um destes. O termo, portanto, abrange especificamente anticorpos monoclonais intactos, anticorpos policlonais, anticorpos multivalentes (por exemplo, 2-, 3-ou mais-valentes) e/ou multiespecíficos (por exemplo, anticorpos bi- ou mais específicos) formados a partir de pelo menos dois anticorpos intactos, e fragmentos de anticorpos na medida em que eles exibem a atividade biológica desejada (particularmente, a capacidade de se ligar especificamente a um antígeno de interesse), bem como compósitos multivalentes e/ou multiespecíficos de tais fragmentos. O termo "anticorpo" não é apenas inclusivo de anticorpos gerados por métodos compreendendo imunização, mas também inclui qualquer polipeptídeo, por exemplo, um polipeptídeo expresso de forma recombinante, que é feito para abranger pelo menos uma região determinante de complementariedade (CDR) capaz de se ligar especificamente a um epítopo em um antígeno de interesse. Portanto, o termo se aplica a tais moléculas, independentemente delas serem produzidas in vitro, em cultura celular ou in vivo.
[00113] O termo "sequência de imunoglobulina" - se aqui utilizado para se referir a um anticorpo de cadeia pesada ou a um anticorpo convencional de 4 cadeias - é utilizado como um termo geral para incluir tanto o anticorpo de tamanho real como as cadeias individuais do mesmo, bem como todas as partes, domínios ou seus fragmentos (incluindo, mas não limitado a, domínios ou fragmentos de ligação de antígeno tais como domínios VHH ou domínios VH/VL, respectivamente). Além disso, o termo "sequência" conforme aqui utilizado (por exemplo, em termos como “sequência de imunoglobulina”, "sequência de anticorpo", "sequência de domínio variável", "sequência de
VHH" ou "sequência de proteína"), deve ser geralmente compreendido como incluindo tanto a sequência de aminoácidos relevante, assim como as sequências de ácido nucleico ou sequências de nucleotídeos que codificam a mesma, a menos que o contexto exija uma interpretação mais limitada.
[00114] O termo "epítopo" inclui qualquer determinante de polipeptídeo capaz de se ligar especificamente a um receptor de imunoglobulina ou célula T. Determinantes de epítopo podem incluir agrupamentos de moléculas de superfície quimicamente ativos, tais como aminoácidos, cadeias laterais de açúcar, fosforila ou sulfonil, e podem ter características estruturais tridimensionais específicas e/ou características de carga específicas. Um epítopo é uma região de um antígeno que é ligada por um anticorpo. Diz-se que um anticorpo se liga especificamente a um antígeno quando ele preferencialmente reconhece seu antígeno alvo em uma mistura complexa de proteínas e/ou macromoléculas.
[00115] Os termos "região de ligação", "sítio de ligação" ou "sítio de interação" devem aqui ter o significado de um determinado sítio, parte, domínio ou extensão de resíduos de aminoácidos que é responsável pela ligação a um antígeno de interesse. Tal região de ligação consiste essencialmente em resíduos específicos de aminoácidos dos anticorpos descritos aqui, cujos resíduos estão em contato com a molécula alvo.
[00116] O termo "especificidade" se refere ao número de tipos diferentes de antígenos ou determinantes antigênicos aos quais uma molécula de ligação de antígeno particular ou molécula de proteína de ligação de antígeno (tal como um anticorpo) pode se ligar. A especificidade de uma proteína de ligação de antígeno pode ser determinada com base em afinidade e/ou avidez. A afinidade, representada pela constante de equilíbrio para dissociação de um antígeno com uma proteína de ligação de antígeno (KD), é uma medida para a força de ligação entre um determinante antigênico e um sítio de ligação de antígeno na proteína de ligação de antígeno: quanto menor o valor do KD, mais forte a força de ligação entre um determinante antigênico e a molécula de ligação de antígeno (alternativamente, a afinidade também pode ser expressa como a constante de afinidade (KA), que é 1/KD). Como ficará claro para a pessoa versada, afinidade pode ser determinada de uma maneira conhecida per se, dependendo do antígeno específico de interesse. Avidez é a medida da força de ligação entre uma molécula de ligação de antígeno (tal como um anticorpo) e o antígeno pertinente. Avidez está relacionada à afinidade entre um determinante antigênico e seu sítio de ligação de antígeno sobre a molécula de ligação de antígeno e o número de sítios de ligação pertinentes presentes na molécula de ligação de antígeno. Tipicamente, proteínas de ligação de antígeno (tais como anticorpos) se ligarão com uma constante de dissociação (KD) de 10-5 a 10-12 moles/litro (M) ou menos, e preferencialmente 10-7 a 10-12 moles/litro (M) ou menos e mais preferencialmente 10-8 a 10-12 moles/litro, e/ou com uma constante de associação (KA) de pelo menos 107 M-1, preferencialmente pelo menos 108 M-1, mais preferencialmente pelo menos 109 M-1, tal como pelo menos 1012 M-1. Qualquer valor de KD maior que 10-4 M é geralmente considerado para indicar ligação não específica. De preferência, um anticorpo se ligará ao antígeno desejado com um KD menor que 500 nM, preferencialmente menor que 200 nM, mais preferencialmente menor que 10 nM, tal como menos que 500 pM. Ligação específica de uma proteína de ligação de antígeno a um antígeno ou determinante antigênico pode ser determinada de qualquer maneira adequada conhecida per se, incluindo, por exemplo, análise de Scatchard e/ou ensaios de ligação competitiva, tais como radioimunoensaios (RIA), imunoensaios enzimáticos (EIA) e ensaios de competição em sanduíche e as diferentes variantes da mesma conhecidas per se no estado da técnica.
[00117] Um anticorpo de comprimento total, tal como existe naturalmente, é uma molécula de imunoglobulina compreendendo 2 cadeias pesadas (H) e 2 cadeias leves (L) interconectadas por ligações dissulfeto. A porção do amino- terminal de cada cadeia inclui uma região variável de cerca de 100-110 aminoácidos responsável principalmente pelo reconhecimento de antígeno através das regiões determinantes de complementariedade (CDRs) contidas no mesmo. A porção do do amino-terminal de cada cadeia define uma região constante responsável principalmente pela função efetora.
[00118] As CDRs são entremeadas com regiões que são mais conservadas, denominadas regiões de arcabouço (FR).
Cada região variável de cadeia leve (LCVR) e região variável de cadeia pesada (HCVR) é composta de 3 CDRs e 4 FRs, dispostas do amino-terminal para o carbóxi-terminal na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. As 3 CDRs da cadeia leve são referidas como “LCDR1, LCDR2 e LCDR3” e as 3 CDRs da cadeia pesada são referidas como “HCDR1, HCDR2 e HCDR3.” As CDRs contêm a maioria dos resíduos que formam interações específicas com o antígeno.
A numeração e posicionamento dos resíduos de aminoácidos CDR dentro das regiões LCVR e HCVR estão de acordo com a conhecida convenção de numeração de Kabat, que se refere a um sistema de numeração de resíduos de aminoácidos que são mais variáveis (isto é, hipervariáveis) do que outros resíduos de aminoácidos nas regiões de cadeia pesada e leve de um anticorpo (Kabat, et al., Ann. NYAcad. Sci. 190:382- 93 (1971); Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 (1991)). O posicionamento das CDRs na região variável de um anticorpo segue a numeração Kabat ou simplesmente, “Kabat”.
[00119] Cadeias leves são classificadas como kappa ou lambda e são caracterizadas por uma região constante particular conforme conhecida na técnica. Cadeias pesadas são classificadas como gama, mu, alpha, delta ou epsilon, e definem o isótipo de um anticorpo como IgG, IgM, IgA, IgD ou IgE, respectivamente. Anticorpos IgG podem ser adicionalmente divididos em subclasses, por exemplo, IgGl, IgG2, IgG3, lgG4. Cada tipo de cadeia pesada é caracterizado por uma região constante particular com uma sequência bem conhecida na técnica.
[00120] Em certas modalidades, um anticorpo pode ser de qualquer uma das classes IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, e preferencialmente anticorpo da classe IgG.
[00121] Em certas modalidades, o anticorpo pode ser um anticorpo policlonal, por exemplo, um antissoro ou imunoglobulinas purificadas a partir dele (por exemplo, purificada por afinidade).
[00122] Em outras modalidades, o anticorpo pode ser um anticorpo monoclonal ou uma mistura de anticorpos monoclonais. Anticorpos monoclonais podem direcionar um antígeno particular ou um epítopo particular dentro de um antígeno com maior seletividade e reprodutibilidade.
[00123] Conforme aqui utilizado, o termo "anticorpo monoclonal" se refere a um anticorpo que é derivado de uma única cópia ou clone incluindo, por exemplo, qualquer clone eucariótico, procariótico ou fago, e não o método pelo qual é produzido. Anticorpos monoclonais existem preferencialmente em uma população homogênea ou substancialmente homogênea. Anticorpos monoclonais e fragmentos de ligação de antígenos da presente invenção podem ser produzidos, por exemplo, por tecnologias recombinantes, tecnologias de exibição de fagos, tecnologias sintéticas, por exemplo, enxerto de CDR, ou combinações de tais tecnologias ou outras tecnologias conhecidas na técnica.
[00124] Por meio de exemplo e não de limitação, anticorpos monoclonais podem ser produzidos pelo método de hibridoma primeiro descrito por Kohler et al. 1975 (Nature 256: 495), ou podem ser produzidos por métodos de DNA recombinante (por exemplo, como em US 4.816.567).
Anticorpos monoclonais também podem ser produzidos usando bibliotecas de anticorpos de fagos usando técnicas descritas por Clackson et al. 1991 (Nature 352: 624-628) e Marks et al. 1991 (J Mol Biol 222: 581-597).
[00125] Estas últimas técnicas são baseadas na tecnologia de exibição de fagos conforme descrito inter alia em US5837500, US5571698, US5223409, US7118879, US7208293 e US7413537. Resumidamente, moléculas candidatas terapêuticas, por exemplo, fragmentos de anticorpos humanos (por exemplo, Fabs), peptídeos e proteínas pequenas, são exibidas na superfície de um pequeno vírus bacteriano chamado bacteriófago (ou fago). Uma coleção de moléculas exibidas é conhecida como uma biblioteca. Exibição de fagos permite a pesquisa através destas bibliotecas para identificar moléculas que se ligam, preferencialmente, com alta especificidade e/ou afinidade, a alvos de interesse, por exemplo, alvos terapêuticos. Exemplos não limitantes de bibliotecas de anticorpos de fagos incluem HuCALÒ (Human Combinatorial Antibody Library, Morphosys), YlanthiaÒ (Morphosys), as bibliotecas de fragmentos de Fab humanos descritas no WO200070023, e a biblioteca de anticorpos de macaco como descrito em WO 1996040878. A Biblioteca de Anticorpos Combinatórios Humanos (Morphosys) foi preparado conforme descrito em WO 199708320 utilizando sequências de consenso sintéticas que cobrem o repertório estrutural de anticorpos codificados no genoma humano.
[00126] O termo "fragmento de anticorpo" ou “porção de ligação de antígeno” compreende uma porção ou região de um anticorpo de comprimento total, geralmente a ligação de antígeno ou seu domínio variável. Exemplos de fragmentos de anticorpos incluem fragmentos Fab, Fab', F(ab)2, Fv, scFv, (sd)Fv de domínio único, tais como domínios VH, domínios VL e domínios VHH, diacorpos, anticorpos lineares, moléculas de anticorpo de cadeia única, em particular anticorpos de cadeia pesada; e anticorpos multivalentes e/ou multiespecíficos formados a partir de fragmento(s) de anticorpo(s), por exemplo, dicorpos, tricorpos e multicorpos. As designações acima Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv, etc, destinam-se a ter seu significado estabelecido na técnica.
[00127] O termo "porção de ligação de antígeno" ou "região de ligação de antígeno" se refere a um ou mais fragmentos de um anticorpo que retêm a capacidade de se ligar especificamente a um antígeno. Foi mostrado que a função de ligação de antígeno de um anticorpo pode ser realizada por fragmentos de um anticorpo de comprimento total. Estes também podem ser formatos biespecíficos, específicos duplos ou multiespecíficos; especificamente ligados a dois ou mais antígenos diferentes. Exemplos de fragmentos de ligação abrangidos dentro do termo "porção de ligação de antígeno" de um anticorpo incluem (i) um fragmento Fab, um fragmento monovalente consistindo dos domínios VL, VH, CL e CHI; (ii) um fragmento F(ab')2, um fragmento bivalente compreendendo dois fragmentos Fab ligados por uma ponte de dissulfeto na região de dobradiça; (iii) um fragmento Fd consistindo dos domínios VH e CHI; (iv) um fragmento Fv consistindo dos domínios VL e VH de um único braço de um anticorpo, (v) um fragmento dAb (Ward et al., Nature, 341 : 544-546 (1989); publicação do PCT WO 90/05144), que compreende um único domínio variável; e (vi) uma região de determinação de complementaridade (CDR) isolada. Além disso, embora os dois domínios do fragmento Fv, VL e VH sejam codificados por genes separados, eles podem ser unidos, utilizando métodos recombinantes, por um ligante sintético que permite que eles sejam produzidos como uma cadeia de proteína única na qual as regiões VL e VH se juntam para formar moléculas monovalentes (conhecidas como Fv de cadeia única (scFv) (Bird et al., Science, 242: 423-426 (1988); and Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 85: 5879-5883 (1988)). Tais anticorpos de cadeia única são também destinados a serem abrangidos no termo "porção de ligação de antígeno" de um anticorpo. Outras formas de anticorpos de cadeia única, tais como diacorpos também são abrangidas.
[00128] Diacorpos são anticorpos bivalentes, biespecíficos nos quais domínios VH e VL são expressos em uma cadeia de polipeptídeo única, mas utilizando um ligante que é muito curto para permitir emparelhamento entre os dois domínios na mesma cadeia, desse modo forçando os domínios a se emparelhar com os domínios complementares de outra cadeia e criando dois sítios de ligação de antígeno (Holliger, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 90: 6444-6448 (1993); Poljak, et al., Structure 2: 1121-1123 (1994)).
Tais porções de ligação de anticorpos são conhecidas na técnica (Kontermann and Dubel eds., Antibody Engineering (2001) Springer- Verlag. New York. pp. 790 (ISBN 3-540- 41354-5).
[00129] Além disso, um anticorpo ou porção de ligação de antígeno do mesmo pode ser parte de uma molécula de imunoadesão maior, formada por associação covalente ou não covalente do anticorpo ou porção de anticorpo com uma ou mais outras proteínas ou peptídeos. Exemplos de tais moléculas de imunoadesão incluem a utilização da região central de estreptavidina para produzir uma molécula de scFv tetramérica (Kipriyanov, S.M., et al., Human Antibodies and Hybridomas, 6: 93-101 (1995)) e utilização de um resíduo de cisteína, um peptídeo marcador e uma etiqueta de poli-histidina C-terminal para produzir moléculas scFv bivalentes e biotiniladas (Kipriyanov, et al., Mol. Immunol., 31: 1047-1058 (1994)). Porções de anticorpos, tais como fragmentos Fab e F(ab')2, podem ser preparadas a partir de anticorpos inteiros utilizando técnicas convencionais, tais como digestão com papaína ou pepsina, respectivamente, de anticorpos inteiros. Além disso, anticorpos, porções de anticorpos e moléculas de imunoadesão podem ser obtidos utilizando técnicas de DNA recombinante padrão.
[00130] Em certas modalidades, o fragmento de anticorpo pode ser um Nanobody®. Os termos “Nanobody®” e “Nanobodies®” são marcas comerciais de Ablynx NV (Bélgica).
O termo " Nanobody" é bem conhecido na técnica e conforme aqui utilizado no seu sentido mais amplo abrange um agente de ligação imunológico obtido (1) pelo isolamento do domínio VHH de um anticorpo de cadeia pesada de ocorrência natural, preferencialmente um anticorpo de cadeia pesada derivado de camelídeos; (2) pela expressão de uma sequência de nucleotídeos que codifica um domínio VHH de ocorrência natural; (3) pela "humanização" de um domínio VHH de ocorrência natural ou pela expressão de um ácido nucleico que codifica um tal domínio VHH humanizado; (4) por "camelização" de um domínio VH de ocorrência natural a partir de qualquer espécie animal e, em particular, de uma espécie mamífera, tal como a partir de um ser humano, ou por expressão de um ácido nucleico que codifica tal domínio VH camelizado; (5) pela "camelização" de um "anticorpo de domínio" ou "dAb", conforme descrito na técnica, ou pela expressão de um ácido nucleico que codifica tal dAb camelizado; (6) pela utilização de técnicas sintéticas ou semi-sintéticas para preparar proteínas, polipeptídeos ou outras sequências de aminoácidos conhecidas per se; (7) pela preparação de um ácido nucleico que codifica um Nanobody utilizando técnicas para síntese de ácido nucleico conhecidas per se, seguido pela expressão do ácido nucleico assim obtido; e/ou (8) por qualquer combinação de um ou mais dos precedentes. "Camelídeos", conforme aqui utilizado, compreendem os camelídeos do velho mundo (Camelus bactrianus e Camelus dromedarius) e camelídeos do novo mundo (por exemplo, Vicugna pacos, Lama glama ou Vicugna vicugna).
[00131] A sequência de aminoácidos e estrutura de um Nanobody podem ser consideradas - sem, no entanto, estar limitado a isso - a serem compreendidas de quatro regiões de arcabouço ou “FR’s”, que são referidas na técnica e aqui como "Região de arcabouço 1" ou "FR1"; como "Região de arcabouço 2" ou "FR2"; como "Região de arcabouço 3" ou "FR3"; e como "Região de arcabouço 4" ou "FR4", respectivamente; cujas regiões de arcabouço são interrompidas por três regiões determinante de complementariedade ou "CDR's", que são referidos na técnica como "Região Determinante de Complementariedade 1" ou "CDR1"; como "Região Determinante de Complementariedade 2" ou "CDR2"; e como "Região Determinante de Complementariedade 3" ou "CDR3", respectivamente. O número total de resíduos de aminoácidos em um Nanobody pode estar na região de 110-120, e preferencialmente 112-115. Deve, no entanto, ser notado que partes, fragmentos, análogos ou derivados de um Nanobody não são particularmente limitados quanto ao seu comprimento e/ou tamanho, desde que tais partes, fragmentos, análogos ou derivados atendam aos requisitos adicionais aqui descritos e sejam preferencialmente adequados para os fins aqui descritos.
[00132] Para uma descrição geral de anticorpos de cadeia pesada e seus domínios variáveis, é feita referência inter alia às seguintes referências, que são mencionadas como técnica antecedente geral: WO 94/04678, WO 95/04079 e WO 96/34103 da Vrije Universiteit Brussel; WO 94/25591, WO 99/37681, WO 00/40968, WO 00/43507, WO 00/65057, WO 01/40310, WO 01/44301, EP 1134231 e WO 02/48193 da Unilever; WO 97/49805, WO 01/21817, WO 03/035694, WO 03/054016 e WO 03/055527 da Vlaams Instituut Voor Biotechnologie (VIB); WO 03/050531 da Algonomics NV e requerente; WO 01/90190 pelo National Research Council of Canada; WO 03/025020 (= EP 1 433 793) pelo Institute of Antibodies; bem como WO 04/041867, WO 04/041862, WO 04/041865, WO 04/041863, WO 04/062551 pelo requerente e os outros pedidos de patente publicados pelo requerente; Hamers-Casterman et al., Nature de 3 de Junho de 1993; 363 (6428): 446-8; Davies e Riechmann, FEBS Lett. de 21 de
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[00133] De acordo com a terminologia usada nas referências acima, os domínios variáveis presentes em anticorpos de cadeia pesada de ocorrência natural também serão referidos como “domínios VHH”, de modo a distingui- los dos domínios variáveis de cadeia pesada que estão presentes em anticorpo convencional de 4 cadeias (que serão referidos aqui como “domínios VH”) e dos domínios variáveis de cadeia leve que estão presentes em anticorpo convencional de 4 cadeias (que serão referidos aqui como “domínios VL”). Como mencionado na técnica anterior referida acima, domínios VHH possuem diversas características estruturais e propriedades funcionais únicas que tornam domínios VHH isolados (bem como Nanobody baseados nos mesmos, que compartilham estas características estruturais e propriedades funcionais com os domínios VHH de ocorrência natural) e proteínas contendo as mesmas altamente vantajosas para uso como domínios ou proteínas de ligação de antígeno funcionais. Em particular, e sem ser limitado a eles, domínios VHH (que foram “projetados” por natureza para se ligar funcionalmente a um antígeno sem a presença de, e sem qualquer interação com, um domínio variável de cadeia leve) e Nanobodies podem funcionar como uma única, relativamente pequena unidade, domínio ou proteína estrutural de ligação de antígeno funcional. Isto distingue os domínios VHH dos domínios VH e VL dos anticorpos convencionais de 4 cadeias, que por si só geralmente não são adequados para aplicação prática como proteínas ou domínios de ligação de antígeno único, mas necessitam ser combinados em alguma forma ou outra para fornecer uma unidade de ligação de antígeno funcional (como, por exemplo, fragmentos de anticorpos convencionais tais como fragmentos de Fab; em fragmentos de ScFv, que consistem em um domínio VH covalentemente ligado a um domínio VL).
[00134] Em certas modalidades, o fragmento de anticorpo pode ser um anticorpo de domínio (dAb). Para o termo "dAb", é feita referência, por exemplo, a Ward et al.
(Nature de 12 de Outubro de 1989; 341 (6242): 544-6), para Holt et al., Trends Biotechnol. 2003, 21(11):484-490; assim como, por exemplo, WO 06/030220, WO 06/003388 e outros pedidos de patente publicados de Domantis Ltd. Anticorpos de domínio único ou domínios variáveis únicos podem ser derivados de certas espécies de tubarão (por exemplo, os assim chamados "domínios IgNAR", veja, por exemplo, WO 05/18629).
[00135] Em outras modalidades, o anticorpo ou fragmento de anticorpo pode ser multiespecífico (tal como um anticorpo biespecífico, triespecífico, etc.) compreendendo pelo menos dois (tais como dois, três, etc.) sítios de ligação cada um direcionado contra um antígeno diferente ou determinante antigênico.
[00136] Em algumas modalidades, o agente terapêutico pode ser uma imunoglobulina de domínio variável dual (DVD- Ig™).
[00137] O termo anticorpo inclui anticorpos que se originam de ou que compreendem uma ou mais porções derivadas de qualquer espécie animal, preferencialmente espécies vertebradas, incluindo, por exemplo, pássaros e mamíferos. Sem limitação, os anticorpos podem ser galinha, peru, ganso, pato, galinha-d'angola, codorna ou faisão.
Também sem limitação, os anticorpos podem ser humanos, murino (por exemplo, camundongo, rato, etc.), suíno, burro, coelho, cabra, ovelha, porquinho-da-índia, macaco (por exemplo, Macaco cynomologus), camelo (por exemplo, Camelus bactrianus e Camelus dromedarius) também incluindo anticorpos de cadeia pesada de camelos, lhama (por exemplo,
Vicugna pacos, Lama glama ou Vicugna vicugna) também incluindo anticorpos de cadeia pesada de lhama, ou cavalo.
[00138] O termo anticorpo conforme aqui utilizado também abrange “anticorpos quiméricos” que se originam de pelo menos duas espécies animais. Mais especificamente, o termo "anticorpo quimérico" ou “anticorpos quiméricos" se refere a anticorpos que compreendem sequências de região variável de cadeia pesada e leve de uma espécie e sequências de região constante de outra espécie, tal como, por exemplo, anticorpos tendo regiões variáveis de cadeia pesada e leve de murino ligadas a regiões constantes de seres humanos, primatas não humanos, caninos, equinos ou felinos. Anticorpos quiméricos compreendem uma porção da cadeia pesada e/ou leve que é idêntica ou homóloga às sequências correspondentes de anticorpos derivados de uma espécie particular ou pertencente a uma classe ou subclasse de anticorpo particular, enquanto que o restante da(s) cadeia(s) é idêntico ou homólogo com sequências correspondentes em anticorpos de outra espécie ou pertencentes a outra classe ou subclasse de anticorpo, bem como fragmentos de tais anticorpos, exibindo a atividade biológica desejada (Ver, por exemplo, Patente U.S. Nº
4.816.567; e Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81 :6851-6855 (1984)). Anticorpos quiméricos são produzidos através da fusão de DNA que codifica uma porção, tal como a região Fv, de um anticorpo monoclonal de uma espécie, por exemplo, camundongo ou macaco, com o DNA que produz anticorpos de outra espécie, por exemplo, humano.
[00139] Em certas modalidades, o agente terapêutico pode ser um “anticorpo completamente humano”. Conforme aqui utilizado, o termo "anticorpo completamente humano" se refere a um anticorpo do qual a informação genética codificada é de origem humana. Consequentemente, o termo "anticorpo completamente humano" se refere a anticorpos que têm regiões variáveis e constantes derivadas apenas de sequências de imunoglobulinas da linha germinativa humana.
O termo "anticorpo completamente humano", portanto, não deve incluir anticorpos nos quais as sequências de CDR derivadas da linha germinativa de outras espécies de mamíferos, tais como um camundongo, foram enxertadas em sequências de arcabouço humanas. Anticorpos completamente humanos podem ser derivados de bibliotecas de anticorpos humanos de fagos, como descrito acima, ou eles podem ser obtidos através de imunização de camundongos transgênicos que foram manipulados para substituir a região de codificação de imunoglobulina de murino como descrito em Lonberg e Husznar 1995 (Int. Rev.Immunol. 13 (1): 65-93).
Anticorpos completamente humanos que são feitos utilizando exibição de fago são preferencialmente produzidos por expressão recombinante em uma linhagem de células humanas resultando em anticorpos com um padrão de glicosilação humano. Exemplos não limitantes de anticorpos completamente humanos são anticorpos HuCAL® (Morphosys). A informação genética para construir um anticorpo HuCAL® é extraída da biblioteca de anticorpo HuCAL® (Morphosys) e introduzida em células PER.C6® humanas na forma de um vetor (isto é, transfecção). As células transfectadas traduzem a informação genética em proteína. A proteína é adicionalmente modificada por glicosilação e a molécula de anticorpo resultante é finalmente secretada pelas células no meio de cultura.
[00140] O termo anticorpo conforme aqui utilizado também abrange “anticorpos humanizados”, que são anticorpos derivados de espécies não humanas cuja sequência de proteína foi modificada de modo a aumentar sua similaridade com anticorpos produzidos naturalmente em seres humanos.
Mais particularmente, o termo "anticorpo humanizado" se refere a anticorpos que compreendem sequências de região variável de cadeia pesada e leve de uma espécie não humana (por exemplo, um camundongo), mas em que pelo menos uma porção da sequência VH e/ou VL foi alterada para ser mais “semelhante ao humano”, isto é, mais similar as sequências variáveis da linha germinativa humana. Um tipo de anticorpo humanizado é um anticorpo enxertado com CDR, no qual as sequências de CDR não humanas são introduzidas em sequências VH e VL humanas para substituir as sequências de CDR humanas correspondentes.
[00141] O anticorpo humanizado é um anticorpo ou um variante, derivado, análogo ou fragmento do mesmo que se liga imunoespecificamente a um antígeno de interesse e que compreende uma região de arcabouço (FR) tendo substancialmente a sequência de aminoácidos de um anticorpo humano e uma região determinante de complementariedade (CDR) tendo substancialmente a sequência de aminoácidos de um anticorpo não humano. Um anticorpo humanizado compreende substancialmente todos, ou pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis (Fab, Fab', F(ab') 2, FabC, Fv) em que todas ou substancialmente todas as regiões CDR correspondem àquelas de uma imunoglobulina não humana (isto é, anticorpo doador) e todas ou substancialmente todas as regiões de arcabouço são aquelas de uma sequência de consenso de imunoglobulina humana. Um anticorpo humanizado também compreende pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente a de uma imunoglobulina humana. Um anticorpo humanizado pode conter tanto a cadeia leve, bem como pelo menos o domínio variável de uma cadeia pesada. O anticorpo também pode incluir as regiões CHI, dobradiça, CH2, CH3 e CH4 da cadeia pesada.
Alternativamente, um anticorpo humanizado pode conter apenas uma cadeia leve humanizada, ou uma cadeia pesada humanizada. Um anticorpo humanizado exemplar contém um domínio variável humanizado de cadeia leve e um domínio variável humanizado de uma cadeia pesada.
[00142] Também, por exemplo, anticorpos humanizados podem ser derivados de anticorpos convencionais (isto é, uma molécula de imunoglobulina compreendendo 2 cadeias pesadas (H) e 2 cadeias leves (L) interconectadas por ligações dissulfeto) da família Camelidae, em particular da lhama (por exemplo, Vicugna pacos, Lama glama ou Vicugna vicugna), cujos domínios variáveis exibem um alto grau de identidade de sequência de aminoácidos com os domínios variáveis de anticorpos humanos. Uma plataforma adequada para a produção de tais anticorpos humanizados é a Plataforma SIMPLE Antibody™ (ArGEN-X) conforme descrito em WO 2011080350.
[00143] Uma pessoa versada entenderá que um anticorpo pode incluir uma ou mais deleções, adições e/ou substituições de aminoácidos (por exemplo, substituições conservativas), na medida em que tais alterações preservam sua ligação ao respectivo antígeno. Por exemplo, mutações podem ser introduzidas no anticorpo, em particular na região Fc, para prolongar a meia-vida in vivo sem comprometer a imunogenicidade conforme descrito na patente US 8.323.962.
[00144] Um anticorpo também pode incluir uma ou mais modificações nativas ou artificiais de seus resíduos de aminoácidos constituintes (por exemplo, glicosilação, etc.).
[00145] Métodos de produção de anticorpos policlonais e monoclonais assim como fragmentos dos mesmos são bem conhecidos na técnica, como são métodos para produzir anticorpos recombinantes ou seus fragmentos (veja, por exemplo, Harlow e Lane, “Antibodies: A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbour Laboratory, New York, 1988; Harlow e Lane, “Using Antibodies: A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbour Laboratory, New York, 1999, ISBN 0879695447; “Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques”, por Zola, ed., CRC Press 1987, ISBN 0849364760; “Monoclonal Antibodies: A Practical Approach”, by Dean & Shepherd, eds., Oxford University Press 2000, ISBN 0199637229; Methods in Molecular Biology, vol. 248: “Antibody Engineering: Methods and Protocols”, Lo, ed., Humana Press 2004, ISBN 1588290921).
[00146] Métodos para imunização de animais, por exemplo, animais não humanos, tais como animais de laboratório ou fazenda, utilizando antígenos imunizantes opcionalmente fundidos a ou ligados covalentemente ou não covalentemente, ligados ou adsorvidos a um carreador de apresentação, e preparação de reagentes de anticorpos ou células a partir de soros imunes são bem conhecidos per se e descritos em documentos referidos em outro lugar neste relatório descritivo. Os animais a serem imunizados podem incluir qualquer espécie animal, preferivelmente espécies de sangue quente, mais preferivelmente espécies de vertebrados, incluindo, por exemplo, pássaros e mamíferos.
Sem limitação, os anticorpos podem ser galinha, peru, ganso, pato, galinha-d'angola, codorna ou faisão. Também sem limitação, os anticorpos podem ser humanos, murino (por exemplo, camundongo, rato, etc.), suíno, burro, coelho, cabra, ovelha, porquinho-da-índia, camelo, lhama ou cavalo.
O termo "carreador de apresentação" ou "carreador" geralmente denota uma molécula imunogênica que, quando ligada a uma segunda molécula, aumenta as respostas imunes ao último, usualmente através da provisão de epítopos de células T adicionais. O carreador de apresentação pode ser uma estrutura (poli)peptídica ou uma estrutura não peptídica, tal como, inter alia, glicanos, polietileno glicóis, miméticos de peptídicos, polímeros sintéticos, etc. Carreadores não limitantes exemplares incluem proteína do núcleo do vírus da Hepatite B humana, domínios C3d múltiplos, fragmento C da toxina do tétano ou partículas Ty de leveduras. Após a imunização, as células produtoras de anticorpos dos animais podem ser isoladas e utilizadas para gerar células de hibridoma produtoras de anticorpos monoclonais utilizando técnicas bem conhecidas na técnica.
[00147] Métodos para produção de anticorpos recombinantes ou seus fragmentos necessitam de um organismo ou célula hospedeira.
Os termos "célula hospedeira" e
“organismo hospedeiro" podem se referir adequadamente a células ou organismos que abrangem tanto procariotas, tais como bactérias, e eucariotos, tais como leveduras, fungos,
protozoários, plantas e animais.
Contemplados como organismos ou células hospedeiras para a produção de anticorpos incluem, inter alia, organismos unicelulares,
tais como bactérias (por exemplo, E. coli) e células animais (cultivadas) (por exemplo, células de mamíferos ou células humanas). As vantagens de produzir anticorpos em bactérias estão, entre outras, o manuseio relativamente seguro e direto de células bacterianas e os ciclos de replicação rápidos de microrganismos.
Bactérias são particularmente adequadas para a produção de fragmentos de anticorpos com uma estrutura simples.
Para a produção de imunoglobulinas de comprimento total ou fragmentos de anticorpos mais complexos em células procarióticas, as células bacterianas podem ser transformadas com pelo menos dois ácidos nucleicos, cada um codificando uma porção diferente do fragmento de anticorpo ou da imunoglobulina,
por exemplo, a cadeia pesada ou a cadeia leve, conforme descrito em WO 2009021548 para imunoglobulinas de comprimento total.
Na célula bacteriana, a informação genética que codifica o anticorpo é lida e traduzida em uma proteína. Os anticorpos resultantes se acumulam no espaço periplásmico e podem ser coletados mediante lise das células bacterianas. Uma outra etapa de separação pode ser realizada para purificar os anticorpos. WO 2009021548 descreve um sistema de secreção baseado em E. Coli, em que as bactérias liberam os anticorpos no meio de cultura circundante devido à introdução de uma sequência de sinal na construção de codificação de anticorpos. Isto permite a purificação fácil e conveniente dos anticorpos a partir do meio de cultura celular. Uma linhagem celular de mamíferos exemplar que pode ser utilizada para a produção de anticorpos é a linhagem celular do ovário do hamster Chinês (CHO). Uma linhagem celular humana exemplar adequada para a produção de anticorpos inclui a linhagem celular PER.C6® como depositada sob ECAC no. 96022940 e descrita em WO 2000063403 ou um derivado do mesmo. Linhagens celulares humanas são particularmente adequadas para a produção de anticorpos completamente humanos porque elas produzem anticorpos com um padrão de glicosilação humana.
[00148] A menos que indicado de outra forma, todos os métodos, etapas, técnicas e manipulações que não são especificamente descritas em detalhes podem ser realizados e foram realizados de uma maneira conhecida per se, como ficará claro para a pessoa versada. Referência é feita, por exemplo, novamente a manuais padrões bem como à técnica antecedente geral referida aqui e às outras referências citadas aqui.
[00149] A capacidade de ativar sinalização de Wnt se refere à capacidade do agente, conforme aqui divulgado, para imitar, reproduzir ou aproximar o efeito de transdução de sinal e/ou atividade de um ligante Wnt natural que se liga a FZD e LRP, tal como a um complexo FZD/LRP.
[00150] Ativação da sinalização de Wnt pode ser adequadamente determinada e/ou quantificada pela medição da expressão de um ou mais genes alvos de Wnt, expressão do gene repórter TCF, estabilização da beta-catenina, fosforilação do LRP e/ou translocação da Axina do citoplasma para membrana celular, conforme conhecido na técnica. Por exemplo, ativação da sinalização de Wnt pode ser adequadamente determinada e/ou quantificada pela medição da expressão do gene TCF (por exemplo, por RT-PCR ou qualquer outro método de detecção de transcrição), uma saída primária de sinalização de Wnt (Nature, 1997, vol 385(6619), 829-33). Por exemplo, um ensaio de repórter de TCF (também conhecido como TOP/FOP ou TOPflash) pode ser usado para avaliar mudanças na transcrição de genes controlados de TCF/LEF. O ensaio de repórter de TCF pode ser um ensaio de repórter de luciferase. Adicionalmente, por exemplo, ativação da sinalização de Wnt pode ser adequadamente determinada e/ou quantificada pela medição da expressão de c-myc (He et al., 1998, Science, 281(5382), 1509-12), n-myc (Ten Berge et al., 2008, Development, 135(19), 3247-57), LEF1 (Hovanes et al., 2001, Nat Genet, 28(1), 53-7; Filali et al., 2002, J Biol Chem, 277(36), 33398-410) ou c-jun (Mann et al., 1999, Proc Natl Acad Sei U S A, 96(4), 1603-8).
[00151] Alternativamente, ativação da sinalização de Wnt pode ser determinada medindo a localização, nível e/ou estado de fosforilação da β-catenina. Um exemplo não limitante de tal ensaio é o "Ensaio de Redistribuição de β- Catenina" (Thermo Scientific) que fornece células U20S recombinantes que expressam estavelmente β-catenina humana fundida ao C-terminal de proteína fluorescente verde intensificada (EGFP). O ensaio permite a visualização e o monitoramento da translocação de uma proteína de fusão de GFP-β-catenina da membrana para o núcleo. Outro modo de determinar a ativação da sinalização de Wnt é a visualização da translocação de Axina, por exemplo, com uma proteína de fusão GFP-Axina.
[00152] Em modalidades particulares, o agente aqui divulgado pode ser considerado capaz de ativar (canônica) a sinalização de Wnt se o agente aumentar a sinalização de Wnt/β-catenina pelo menos 10 vezes mais, pelo menos 20 vezes mais, pelo menos 30 vezes mais, pelo menos 40 vezes mais, pelo menos 50 vezes mais, pelo menos 100 vezes mais, pelo menos 250 vezes mais, pelo menos 500 vezes mais, pelo menos 750 vezes mais, pelo menos 1000 vezes mais, pelo menos 1 x 104 vezes maisou pelo menos 1 x 105 vezes mais em comparação com a linha de base de sinalização de Wnt/β- catenina ou fundo induzido por uma substância neutra ou controle negativo, por exemplo, conforme medido em um ensaio como descrito neste relatório descritivo.
[00153] Em modalidades particulares, o agente aqui divulgado pode ser considerado para não ativar a sinalização de Wnt (canônica) se o agente aumentar a sinalização de Wnt/β-catenina menos de 10 vezes mais, tal como particularmente no máximo 5 vezes mais ou no máximo 2,5 vezes mais, ou se o agente não aumentar ou mesmo reduzir (por exemplo, 2 vezes menos ou 5 vezes menos ou 10 vezes menos) a sinalização de Wnt/β-catenina em comparação com a linha de base de sinalização de Wnt/β-catenina ou fundo induzido por uma substância neutra ou controle negativo, por exemplo, conforme medido em um ensaio como descrito neste relatório descritivo.
[00154] Em modalidades particulares, o agente conforme aqui descrito, pode ser considerado para ativar a sinalização de Wnt mediada por GPR124/RECK/Frizzled/LRP, mas não ativar o Wnt mediado por Frizzled/LRP na ausência de RECK e/ou GPR124, se atividade de sinalização de Wnt mediada por GPR124/RECK/Frizzled/LRP induzida pelo referido agente é de pelo menos 3,5 vezes mais, pelo menos 5 vezes mais, pelo menos 10 vezes mais, pelo menos 15 vezes mais, pelo menos 20 vezes mais, pelo menos 25 vezes mais, pelo menos 50 vezes mais, pelo menos 100 vezes mais, pelo menos 500 vezes mais, pelo menos 1000 vezes mais, pelo menos 1 x 104 vezes mais, ou pelo menos 1 x 105 vezes mais, preferivelmente pelo menos 50 vezes mais, do que a atividade de sinalização de Wnt mediada por Frizzled/LRP induzida pelo referido agente, na ausência de RECK e/ou GPR124. Antes da comparação a atividade de sinalização de Wnt mediada por GPR124/RECK/Frizzled/LRP (denotada como “atividade 1” neste parágrafo) e a atividade de sinalização de Wnt mediada por Frizzled/LRP na ausência de RECK e/ou GPR124 (denotada como “atividade 2” neste parágrafo), atividade 1 e atividade 2 induzidas pelo agente podem ser normalizadas para atividade 1 e atividade 2 induzidas por Wnt7a do tipo selvagem, respectivamente, o último, por exemplo, ajustado para representar 100% de atividade.
[00155] Por meio de um exemplo, em um sistema de ensaio de células in vitro ou in vivo compreendendo 1) células que expressam GPR124, RECK, FZ e LRP e separadamente 2) células que expressam FZ e LRP, mas não expressam GPR124 e/ou RECK, em que as células sob 1) e 2) são, de outra forma, substancialmente idênticas, o agente pode ser considerado para ativar a sinalização de Wnt mediada por GPR124/RECK/Frizzled/LRP, mas não ativar a sinalização de Wnt mediada por Frizzled/LRP na ausência de RECK e/ou GPR124,quando a atividade de sinalização de Wnt induzida pela mesma quantidade do referido agente sob condições substancialmente idênticas é de pelo menos 3,5 vezes mais, 5 vezes mais, pelo menos 10 vezes mais, pelo menos 15 vezes mais, pelo menos 20 vezes mais, pelo menos 25 vezes mais, pelo menos 50 vezes mais, pelo menos 100 vezes mais, pelo menos 500 vezes mais, pelo menos 1000 vezes mais, pelo menos 1 x 104 vezes mais, ou pelo menos 1 x 105 vezes mais em células sob 1) que em células sob 2).
Por exemplo, as células sob 1 e 2) podem ser da mesma fonte de célula primária, ou podem ser da mesma linhagem celular e podem ser manipulada geneticamente para diferir em expressão de GPR124 e/ou RECK.
[00156] Ativação da via de sinalização de Wnt pode ocorrer promovendo a associação próxima ou proximidade mútua dos polipeptídeos Frizzled e LRP na membrana celular, desse modo formando hetero-oligômeros associados à membrana compreendendo os polipeptídeos Frizzled e LRP. Após a formação conduzida por ligante do hetero-oligômero Frizzled-LRP, a porção intracelular do polipeptídeo LRP torna-se acessível para fosforilação, por exemplo, por CK1 e GSK-3, o que aumenta muito sua afinidade para Axina.
Segundo, quando presente em um hetero-oligômero com o polipeptídeo LRP, a porção intracelular do polipeptídeo Frizzled é capaz de induzir a fosforilação e recrutamento de DVL. O conjunto resultante de um complexo de LRP-FZD- DVL-Axina ativado leva indiretamente à dissociação do complexo de destruição da beta-catenina, desse modo permitindo que a beta-catenina se acumule no citoplasma e se transloque para o núcleo da célula onde a beta-catenina pode induzir a transcrição do gene.
[00157] Consequentemente, em modalidades particulares, o agente, conforme aqui descrito, é capaz de induzir a heteromerização (tal como, preferencialmente, heterodimerização) de polipeptídeos Frizzled e LRP em uma membrana celular na presença de RECK e GPR124, mas não na ausência de RECK e/ou GPR124.
[00158] A fim de alcançar a heteromerização ou associação próxima dos polipeptídeos Frizzled e LRP na membrana celular, um agente que é capaz de se ligar simultaneamente ao polipeptídeo Frizzled e o LRP, por exemplo ligando as porções extracelulares de ambos os polipeptídeos Frizzled e LRP, pode ser usado.
[00159] Heteromerização dos polipeptídeos Frizzled e LRP na membrana celular pode ser determinada por qualquer método conhecido na técnica para determinar a heteromerização de proteínas de membrana, tais como a visualização da heteromerização de proteínas de membrana fluorescentemente marcadas por coloração imunofluorescente, transferência de energia de ressonância por fluorescência (FRET) ou determinação da ocorrência de eventos a jusante de heteromerização de polipeptídeos de Frizzled e LRP, tais como detecção da presença e fosforilação de Dvl.
[00160] Consequentemente, em modalidades particulares, o agente, conforme aqui descrito, é capaz de se ligar simultaneamente a polipeptídeode Frizzled e LRP em uma membrana celular, na presença de RECK e GPR124, mas não na ausência de RECK e/ou GPR124.
[00161] Os termos "ligar", "interagir", "ligar especificamente" ou "interagir especificamente", conforme utilizados ao longo deste relatório descritivo, significam que um agente se liga a ou influencia uma ou mais moléculas ou analitos desejados substancialmente para a exclusão de outras moléculas que são aleatórias ou não relacionada e, opcionalmente, substancialmente com a exclusão de outras moléculas que estão estruturalmente relacionadas. Os termos não requerem necessariamente que um agente se ligue exclusivamente a seu(s) alvo(s) pretendido (s). Por exemplo, pode-se dizer que um agente se ligará especificamente ao(s) alvo(s) de interesse se sua afinidade para tal(is) alvo(s) pretendido(s) sob as condições de ligação é pelo menos cerca de 2 vezes maior,
preferivelmente pelo menos cerca de 5 vezes maior, mais preferivelmente pelo menos cerca de 10 vezes maior, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 25 vezes maior, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 50 vezes maior, e ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 100 vezes ou mais, tal como, por exemplo, pelo menos cerca de 1000 vezes ou mais, pelo menos cerca de 1 x 104 vezes ou mais, ou pelo menos cerca de 1 x 105 vezes ou mais, do que sua afinidade por uma molécula não alvo.
[00162] A ligação ou interação entre o agente e seu(s) alvo(s) pretendido(s) pode ser covalente (isto é, mediada por uma ou mais ligações químicas que envolvem o compartilhamento de pares de elétrons entre átomos) ou, mais tipicamente, não covalente (isto é, mediada por forças não covalentes, tais como, por exemplo, pontes de hidrogénio, interações dipolares, interações de van der Waals e semelhantes). Preferencialmente, o agente pode se ligar ou interagir com seu(s) alvo(s) pretendido(s) com constante de afinidade (KA) de tal ligação KA > 1 x 106 M-1, mais preferivelmente KA > 1 x 107 M-1, ainda mais preferivelmente KA > 1 x 108 M-1, ainda mais preferivelmente KA > 1 x 109 M-1, e ainda mais preferivelmente KA > 1 x 1010 M-1 ou KA > 1 x 1011 M-1, em que KA = [A_T]/[A][T], A denota o agente, T denota o alvo pretendido. Determinação de KA pode ser realizada por métodos conhecidos na técnica, tais como, por exemplo, utilizando diálise de equilíbrio e análise de gráfico de Scatchard.
[00163] A ligação de um agente como descrito aqui a um alvo e a afinidade e especificidade da referida ligação podem ser determinadas por quaisquer métodos conhecidos na técnica. Exemplos não limitantes dos mesmos incluem coimunoprecipitação, complementação de fluorescência bimolecular, eletroforese por afinidade, transferência de marcador, exibição de fagos, ensaio de ligação de proximidade (PLA), purificação de afinidade em Tandem (TAP), acoplamento in-silico e cálculo da energia de ligação de Gibbs prevista e ensaios de ligação de competição.
[00164] Em modalidades particulares, o agente, conforme aqui divulgado, é capaz de se ligar a um ou mais polipeptídeos Frizzled diferentes, tais como um ou mais polipeptídeos Frizzled selecionados do grupo consistindo em Fzd1, Fzd2, Fzd3, Fzd4, Fzd5, Fzd6, Fzd7, Fzd8, Fzd9 e Fzd10. Preferencialmente, o agente, conforme aqui divulgado, pode ser capaz de se ligar especificamente a pelo menos Fzd4 e, opcionalmente, a um ou mais outros Fzd; ou pode ser capaz de se ligar especificamente a Fzd4 substancialmente com a exclusão de outro Fzd. Acredita-se que Fzd4 seja o membro da família Fzd dominante em células endoteliais do sistema nervoso central. Mais preferivelmente, o agente, conforme aqui divulgado, é capaz de se ligar especificamente a Fzd4 humano. O agente, conforme descrito aqui, pode ser seletivo para um ou mais polipetídeos Frizzled preferidos, por exemplo, tendo uma especificidade para um ou mais polipetídeos Frizzled preferidos de pelo menos 5 vezes, pelo menos 10 vezes, pelo menos 25 vezes, pelo menos 50 vezes, pelo menos 100 vezes, pelo menos 1000 vezes, pelo menos 1 x 104 vezes, ou pelo menos 1 x 105 vezes, comparado com outros polipeptídeos Frizzled não preferidos.
[00165] Em modalidades particulares, o agente aqui divulgado é capaz de se ligar a um ou mais polipeptídeos LRP diferentes envolvidos na sinalização de Wnt.
Preferivelmente, o agente, conforme aqui divulgado, é capaz de se ligar a LRP5 e/ou LRP6, por exemplo, qualquer um ou cada um de LRP5 e LRP6. Mais preferivelmente, o agente, conforme aqui divulgado, é capaz de se ligar a LRP5 e/ou LRP6 humano, por exemplo, qualquer um ou cada um de LRP5 humano e LRP6 humano. O agente, conforme aqui divulgado, pode ser seletivo para um ou mais polipeptídeos LRP preferidos, por exemplo, tendo uma especificidade para um ou mais polipeptídeos LRP preferidos de pelo menos 5 vezes, pelo menos 10 vezes, pelo menos 25 vezes, pelo menos 50 vezes, pelo menos 100 vezes, pelo menos 1000 vezes, pelo menos 1 x 104 vezes, ou pelo menos 1 x 105 vezes, comparado com outros polipeptídeos LRP não preferidos.
[00166] Em modalidades particulares, o agente conforme aqui divulgado é capaz de se ligar ao polipeptídeo GPR124 e/ou RECK.
[00167] Em modalidades particulares, o agente, conforme aqui divulgado, é capaz de se ligar simultaneamente a polipeptídeos Frizzled e LRP, e além do polipeptídeo GPR124 e/ou RECK.
[00168] Em modalidades particulares, o agente, conforme aqui divulgado, é capaz de se ligar ao polipeptídeo RECK.
[00169] Em formas de realização particulares, o agente, conforme aqui divulgado, é capaz de se ligar simultaneamente a polipeptídeos Frizzled, LRP e RECK.
[00170] RECK é composto de cinco motivos ou regiões de nó de cisteína N-terminal (CK) (isto é, CK1, CK2, CK3, CK4 e CK5), um domínio rico em cisteína (CRD) e três motivos Kazal precedendo um sítio de ancoragem de Glicosilfosfatidilinositol (GPI). Os motivos CK, o CRD e os motivos Kazal estão localizados extracelularmente.
Consequentemente, o agente capaz de se ligar ao polipeptídeo RECK, conforme aqui divulgado, pode ligar ao motivo CK1, motivo CK2, motivo CK3, motivo CK4, motivo CK5, CRD e/ou um ou mais dos motivos Kazal do polipeptídeo RECK.
[00171] Presentes inventores descobriram que especialmente a ligação do agente capaz de se ligar ao polipeptídeo RECK, conforme aqui divulgado, nas regiões CK4 e/ou CK5 do polipeptídeo RECK, parece importante para estabelecer a ativação da sinalização de Wnt mediada pelo complexo receptor GPR124/RECK/Frizled/LRP.
[00172] Consequentemente, em modalidades particulares, o agente, conforme aqui divulgado, é capaz de se ligar às regiões CK4 e/ou CK5 do polipeptídeo RECK.
[00173] O motivo CK4 se estende a partir do aminoácido C216 a C263, e o motivo CK5 se estende a partir do aminoácido C292 a C338 da sequência de aminoácidos da proteína RECK humana anotado sob o número de acesso do NCBI Genbank NP_066934.1, conforme divulgado neste relatório descritivo. Consequentemente, o motivo CK4 de RECK humana compreende, consiste essencialmente em ou consiste na sequência de aminoácidos CCDRAEDHACQNACKRILMSKKTEMEIVDGLIEGCKTQPLPQDPLWQC (SEQ ID NO: 5) e o motivo CK5 de RECK humana compreende, consiste essencialmente em ou consiste na sequência de aminoácidos CCSKANTSTCRELCTKLYSMSWGNTQSWQEFDRFCEYNPVEVSMLTC (SEQ ID NO: 6).
[00174] Em modalidades particulares, o agente, conforme aqui divulgado, é capaz de se ligar à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e/ou a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.
[00175] O receptor Frizzled é uma proteína receptora acoplada a proteína G e varia em comprimento de cerca de 500 a cerca de 700 aminoácidos. O N-terminal é previsto como sendo extracelular e compreende um domínio rico em cisteína (CRD) de aproximadamente 120 aminoácidos seguido por uma região ligante hidrofílica de aproximadamente 40 a 100 aminoácidos. O receptor Frizzled também compreende sete domínios hidrofóbicos que são previstos para formar alfa- hélices transmembranares. O domínio C-terminal intracelular tem um comprimento variável e, embora o domínio intracelular não seja em geral bem conservado entre diferentes membros familiares, ele compreende um motivo de aminoácido KTXXXW proximal (SEQ ID NO: 7), em que X pode ser qualquer aminoácido, que é altamente conservado em polipeptídeos Frizzled e que é necessário para sinalização de Wnt canônica.
[00176] O domínio CRD Frizzled compreende um motivo de 10 cisteínas invariantemente espaçadas e é largamente conservado entre os membros da família Frizzled conhecidos, mas também em várias outras proteínas, tais como RECK, proteínas relacionadas ao Frizzled secretadas (SFRPs), tirosinas quinases receptoras (RTKs) e colágeno α1 XVIII. O domínio CRD é importante para ligante (por exemplo, Wnt) ligado ao polipeptídeo Frizzled, por exemplo, por reconhecimento e/ou ligação de grupos acila graxos cis-
insaturados presentes no sítio de contato do ligante 1 ou os resíduos localizados no sítio de contato "índice" do ligante Wnt 2.
[00177] Em modalidades particulares, o agente, conforme aqui divulgado, é capaz de se ligar ao domínio rico em cisteína (CRD) do polipeptídeo Frizzled. Em certas modalidades, o agente, conforme aqui divulgado, é capaz de se ligar ao domínio de ligação do grupo acila graxo cis- insaturado localizado dentro do domínio CRD do polipeptídeo Frizzled ou do sítio de contato "índice" dentro do CRD.
[00178] O domínio extracelular N-terminal de LRP é composto de quatro domínios de repetição YWTD (SEQ ID NO: 8) (ou domínios beta propulsor), quatro domínios semelhantes ao fator de crescimento epidérmico (EGF) e um domínio semelhante a LDLR (LDLRLD). Um único domínio de repetição YWTD compreende seis sequências YWTD em tandem.
Os dois primeiros, a maioria dos domínios de repetição YWPD N-terminal são previstos para se ligar aos ligantes de Wnt, e os dois segundos conjuntos de domínios de repetição YWPD são previstos para se ligar a Dickkopf (DKK). O domínio extracelular de N-terminal é seguido por um único segmento de abrangência de membrana e uma cauda citoplásmica abrigando entre um e três motivos NPXY (SEQ ID NO: 9), em que X pode ser qualquer aminoácido (por exemplo, em LRP1, LRP2, LRP4, APOER2, LDLR, LRP9), ou entre um e cinco motivos PPPSP (SEQ ID NO: 10) (por exemplo, em LRP5 e LRP6).
[00179] O termo "Dickkopf" ou “DKK" abrange qualquer e todos os membros da família de DKK, tal como, sem limitação, as proteínas DKK humanas conhecidas incluindo DKK1 (Proteína RefSeq: NP_036374.1; GenelD: 22943), DKK2 (Proteína RefSeq: NP_055236.1; GenelD: 27123), DKK3 (Proteína RefSeq: NP_001317149.1; GeneID: 27122) e DKK4 (Proteína RefSeq: NP_055235.1; GenelD: 27121). Em certas modalidades, os termos podem especificamente denotar DKK1.
[00180] Em modalidades particulares, o agente, conforme aqui divulgado, é capaz de se ligar ao domínio extracelular do polipeptídeo LRP.
[00181] Em modalidades particulares, o agente, conforme aqui divulgado, é capaz de se ligar ao sítio de ligação de DKK do polipeptídeo LRP. Em modalidades mais particulares, o agente, conforme aqui divulgado, é capaz de se ligar ao sítio de ligação de DKK1 do polipeptídeo LRP5 e/ou LRP6.
[00182] Em modalidades particulares, o agente, conforme aqui divulgado, é capaz de se ligar ao sítio de ligação de Wnt do polipeptídeo LRP. Em modalidades mais particulares, o agente, conforme aqui divulgado, é capaz de se ligar ao sítio de ligação de Wnt do polipeptídeo LRP5 e/ou LRP6.
[00183] Em outras modalidades particulares, o agente, conforme aqui divulgado, é capaz de se ligar ao sítio de ligação de DKK e ao sítio de ligação de Wnt do polipeptídeo de LRP.
[00184] Em modalidades particulares, o agente, conforme aqui divulgado, é capaz de se ligar a domínios 1 e 2 semelhantes a β-propulsor-EGF (P1E1P2E2) e/ou domínios 3 e 4 semelhantes a β-propulsor-EGF (P3E3P4E4) do polipeptídeo LRP.
[00185] Em modalidades particulares, o agente, conforme aqui divulgado, compreende um domínio de ligação de RECK e um domínio de ligação de Frizzled e, opcionalmente, um domínio de ligação de LRP. Em modalidades mais particulares, o agente, conforme aqui divulgado, compreende um domínio de ligação de RECK, um domínio de ligação de Frizzled e um domínio de ligação de LRP.
[00186] O domínio de ligação de RECK do agente, conforme aqui divulgado, pode ser qualquer domínio que é capaz de se ligar a um polipeptídeo RECK em alta afinidade; tal como a ligação a um polipeptídeo RECK com uma constante de dissociação (KD) de pelo menos cerca de 1 x 10-6 M, 1 x 10-7 M, pelo menos 1 x 10-8 M, pelo menos 1 x 10-9 M, pelo menos 1 x 10-10 M, pelo menos 1 x 10-11 M, ou pelo menos 1 x 10-12 M. Por exemplo, KD de pelo menos cerca de 5 x 10-6 M.
[00187] Em modalidades particulares, o referido domínio de ligação de RECK compreende um anticorpo específico RECK ou compreende a região de ligação de RECK, preferivelmente a sequência de região variável ou CDRs, de um ou mais anticorpos ou anticorpos específicos de RECK.
Preferencialmente, o anticorpo específico de RECK é direcionado para a porção extracelular do polipeptídeo RECK, tal como dirigido para a(s) região(ões) CK4 e/ou CK5 do polipeptídeo RECK. Exemplos não limitantes de anticorpos RECK incluem anticorpos que são conhecidos na técnica e comercialmente disponíveis, tais como de Abcam (por exemplo, ab88249 e ab89915 específicos para RECK de comprimento total humano), Cell Signaling Technology (por exemplo, #3433 específico para RECK (D8C7) de humano, camundongo, rato, macaco), Santa Cruz (por exemplo, sc- 373929 específico para o C-Terminal de RECK humano).
[00188] Em modalidades particulares, o domínio de ligação de RECK compreende pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco ou pelo menos seis CDR(s), cada um independentemente tendo pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou pelo menos 99%, preferivelmente 100%, identidade de sequência com a(s) respectiva(s) CDR(s) de um anticorpo específico de RECK.
[00189] Em modalidades particulares, o domínio de ligação de RECK é um scFv específico de RECK, tal como scFv compreendendo uma ou mais CDR(s) (preferivelmente todas as 6) de um anticorpo específico de RECK.
[00190] Em modalidades particulares, o domínio de ligação de RECK é um VHH específico de RECK, tal como VHH compreendendo uma ou mais CDR(s) (preferivelmente todas as 3) de um anticorpo de cadeia pesada específico de RECK.
[00191] Em modalidades particulares, o domínio de ligação de RECK do agente, conforme divulgado aqui, pode compreender duas ou mais CDR(s) cada uma independentemente tendo pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou pelo menos 99%, preferivelmente 100%, identidade de sequência com a(s) respectiva(s) CDR(s) de dois ou mais anticorpos específicos de RECK diferentes.
[00192] Em modalidades particulares, o referido domínio de ligação de RECK do agente, conforme aqui divulgado, compreende, consiste essencialmente em, consiste em ou é derivado de (por exemplo, é um fragmento biologicamente ativo e/ou variante de) um polipeptídeo de ligação de RECK, tal como um ligante Wnt ou um polipeptídeo Wnt. Preferencialmente, o domínio de ligação de RECK é derivado de um polipeptídeo Wnt7 (por exemplo, Wnt7a ou Wnt7b) conforme descrito neste relatório descritivo, mais preferivelmente de um polipeptídeo Wnt7 humano ou murino, ainda mais preferivelmente de um polipeptídeo Wnt7 humano
(por exemplo, Wnt7a humano ou Wnt7b humano). Por exemplo, em certas modalidades, o domínio de ligação de RECK pode compreender, consistir essencialmente em ou consistir em um fragmento de ligação de RECK de Wnt7 (por exemplo, Wnt7a ou Wnt7b), preferivelmente de Wnt7 humano ou camundongo, mais preferivelmente de Wnt7 humano (por exemplo, Wnt7a humano ou Wnt7b humano) ou suas variantes. Em um exemplo adicional, em certas modalidades, o domínio de ligação de RECK pode compreender, consistir essencialmente em ou consistir em uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou pelo menos 99%, preferivelmente 100%, identidade de sequência para a sequência de aminoácidos VEPVRASRNKRPTFLKIKKPLSYRKPMDT (SEQ ID NO: 18) ou VEVVRASRLRQPTFLRIKQLRSYQKPMET (SEQ ID NO: 19).
[00193] O termo "Wnt", "ligante Wnt" ou "polipeptídeo Wnt" abrange qualquer e todos os membros da família de Wnt. Por meio de orientação adicional, a Tabela 2 apresenta 19 membros de família de Wnt humanos conhecidos, conforme anotado no NCBI Genbank e Uniprot.
Tabela 2 Banco de Genes NCBI Uniprot
ID de mRNA Proteína Proteína Gene WNT1 7471 NM_005430.3 NP_005421.1 P04628.1 WNT2 7472 NM_003391.2 NP_003382.1 P095544.1 WNT2B 7482 NM_004185.4 NP_004176.2 Q93097.2 WNT3 7473 NM_030753.4 NP_110380.1 P56703.2 WNT3A 89780 NM_033131.3 NP_149122.1 P56704.1 WNT4 54361 NM_030761.4 NP_110388.2 P56705 WNT5A 7474 NM_003392.4 NP_003383.2 P41221.1 WNT5B 81029 NM_030775.2 NP_110402.2 Q9H1J7.2 WNT6 7475 NM_006522.3 NP_006513.1 Q9Y6F9 WNT7A 7476 NM_004625.3 NP_004616.2 O00755.2 WNT7B 7477 NM_058238.2 NP_478679.1 P56706.2 WNT8A 7478 NM_001300939.1 NP_001287868.1 Q9H1J5.1 WNT8B 7479 NM_003393.3 NP_003384.2 Q93098.3 WNT9A 7483 NM_003395.2 NP_003386.1 O14904.2 WNT9B 7484 NM_001320458.1 NP_001307387.1 E7EPC3 WNT10A 80326 NM_025216.2 NP_079492.2 Q9GZT5.1 WNT10B 7480 NM_003394.3 NP_003385.2 O00744.2 WNT11 7481 NM_004626.2 NP_004617.2 O96014.2 WNT16 51384 NM_016087.2 NP_057171.2 Q9UBV4.1
[00194] Em certas modalidades, o polipeptídeo Wnt, conforme empregado aqui, é de origem animal, preferivelmente de origem animal de sangue quente, mais preferivelmente de origem vertebrado, ainda mais preferivelmente de origem mamífera, incluindo origem humana e origem mamífera não humana, ainda mais preferivelmente de origem humana.
[00195] O domínio de ligação de Frizzled do agente, conforme aqui divulgado, pode ser qualquer domínio que seja capaz de se ligar a um ou mais polipeptídeos Frizzled. Sem ser limitado a qualquer mecanismo ou teoria, a afinidade do domínio de ligação de Frizzled do agente pode ser suficientemente alta para ativar a sinalização de Wnt mediada por GPR124/RECK/Frizzled/LRP (isto é, quando a ligação do agente a RECK, de RECK a GPR124 e de GPR124 a Frizzled através de rede DVL garante a proximidade ou apresentação do agente e mais particularmente seu domínio de ligação de Frizzled a Frizzled), mas suficientemente baixa para evitar a ativação (por exemplo, falta de ativação ou no máximo ativação mínima, tal como grau ou extensão de ativação fisiologicamente inconsequente) sinalização de Wnt mediada por Frizzled/LRP na ausência de RECK e/ou GPR124. Sem limitação, em certas modalidades, o domínio de ligação de Frizzled pode ser capaz de se ligar a um ou mais polipeptídeos Frizzled com uma KD menor que cerca de 1 x 10-9 M, menor do que cerca de 1 x 10-8 M, ou menor que cerca de 1 x 10-7 M, ou menor que cerca de 1 x 10-6 M, tal como, por exemplo, entre cerca de 1 x 10-6 M e cerca de 1 x 10-7 M ou entre cerca de 1 x 10-6 M e cerca de 5 x 10-6 M.
[00196] Em modalidades particulares, o domínio de ligação de Frizzled compreende um anticorpo específico de Frizzled ou compreende a região de ligação de Frizzled, preferivelmente a sequência de região variável ou CDR, de um ou mais anticorpos ou anticorpos específicos de Frizzled. Preferencialmente, o anticorpo específico de Frizzled é direcionado para a porção extracelular do receptor de Frizzled, tal como direcionado para o CRD do receptor Frizzled. Exemplos não limitantes de anticorpos Frizzled incluem anticorpos que são conhecidos na técnica e comercialmente disponíveis, tais como a partir de Biolegend (por exemplo, clone CH3A4a7 específico para Frizzled 4 humano, clone W3C4E11 específico para Frizzled 9 humano) e anticorpos disponíveis na Abcam (por exemplo, ab64636 específico para Frizzled 7, ab83042 específico para Frizzled 4 humano, ab77379 específico para Frizzled 7 humano, ab75235 específico para Frizzled 8 humano, ab102956 específico para Frizzled 9 humano). Por exemplo, o domínio de ligação de Frizzled pode compreender as seis regiões CDR do anticorpo frizzled específico de Pan OMP-18R5 (vantictumabe).
[00197] Em modalidades particulares, o domínio de ligação de Frizzled compreende pelo menos uma, pelo menos duas, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco ou pelo menos seis CDR(s), cada uma independentemente tendo pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou pelo menos 99%, preferivelmente 100%, identidade de sequência com a(s) respectiva(s) CDR(s) de um anticorpo específico de Frizzled.
[00198] Em modalidades particulares, o domínio de ligação de Frizzled é scFv específico de Frizzled, tal como scFv que compreende uma ou mais CDR(s) (preferencialmente todas as 6) de um anticorpo específico de Frizzled.
[00199] Em modalidades particulares, o domínio de ligação de Frizzled é um VHH específico de Frizzled, tal como VHH que compreende uma ou mais CDR(s) (preferencialmente todas as 3) de um anticorpo de cadeia pesada específico de Frizzled.
[00200] Em modalidades particulares, o domínio de ligação de Frizzled pode compreender dois ou mais CDR(s) cada um independentemente tendo pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou pelo menos 99%, preferivelmente 100%, identidade de sequência com a respectiva CDR(s) de dois ou mais anticorpos específicos Frizzled diferentes.
[00201] Em modalidades particulares, o domínio de ligação de Frizzled do agente conforme aqui divulgado compreende, consiste essencialmente em, consiste em ou é derivado de (por exemplo, um fragmento biologicamente ativo e/ou variante de) um polipeptídeo de ligação de Frizzled, tal como um ligante Wnt ou um polipeptídeo Wnt.
Preferivelmente, o domínio de ligação de Frizzled é derivado de um polipeptídeo Wnt7 (por exemplo, Wnt7a ou Wnt7b) como descrito neste relatório descritivo, mais preferivelmente de um polipeptídeo Wnt7 humano (por exemplo, Wnt7a humano ou Wnt7b humano).
[00202] A região de ligação Frizzled de um polipeptídeo Wnt, pode ser determinada modelando-se uma estrutura tridimensional do polipeptídeo Wnt com base em uma análise cristalográfica de Xenopus Wnt8a (C. Y. Janda, D. Waghray, A. M. Levin, C. Thomas, K. C. Garcia, Science.
337, 59–64 (2012)).
[00203] XWnt8 foi mostrado para ligar Frizzled a dois sítios descontinuados. Um é denominado polegar (sítio 1) e o outro, o índice (sítio2). Resíduos críticos do polegar XWnt8 parecem ser K182, I186, S187, G188 e W196.
S187 abriga um ácido palmitoléico que é crítico para ligação no sítio 1. Contatos do sítio 2 parecem ser dominados por F317, W319, C321, T322 e V323. Além disso, XWnt8 poderia formar multímeros Wnt/Fz de ordem superior através do pseudo sítio 3 composto de: P34, Y37, L38, S41, A42, A45, V46, T70, L71, A74, F147, G150, L151 e T153.
Parece que resíduos de aminoácidos críticos no sítio 1 (especialmente K182, S187, G188 e W196) e sítio 2 (especialmente W319, C321 e V323) são altamente conservados entre os diferentes polipeptídeos Wnt, enquanto resíduos do pseudo sítio 3 são mais divergentes. Em vista da mesma, o versado na técnica entenderá que a região de ligação Frizzled de um polipeptídeo Wnt pode ser determinada utilizando o alinhamento de sequência com XWnt8.
[00204] Em modalidades particulares, o domínio de ligação a Frizzled do agente conforme aqui divulgado compreende, consiste essencialmente em ou consiste no "polegar" (sítio 1) de um ligante Wnt, preferencialmente, o domínio de ligação de Frizzled compreende uma sequência de aminoácidos XKXXXXSGXXXXXXXW (SEQ ID NO: 11 ), em que X pode ser qualquer aminoácido, preferivelmente em que a referida sequência de aminoácidos mostre pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou pelo menos 99%, preferivelmente 100%, identidade de sequência a CKCHGVSGSCTTKTCW (SEQ ID NO: 12).
[00205] Em modalidades preferidas, a serina na posição de aminoácido 7 de SEQ ID NO: 11 ou SEQ ID NO: 12 é ligada a um resíduo de ácido graxo, preferivelmente, em que a referida serina na posição de aminoácido 7 de SEQ ID NO: 11 ou SEQ ID NO: 12 é palmitoilada.
[00206] Em modalidades preferidas, o domínio de ligação de Frizzled do agente, conforme aqui divulgado, não compreende o "índice” (sítio 2) de um ligante Wnt. Mais particularmente, o domínio de ligação de Frizzled do agente, conforme aqui divulgado, preferencialmente, não compreende uma sequência de aminoácidos WXCXV (SEQ ID NO: 13), em que X pode ser qualquer aminoácido.
[00207] Domínio de ligação de LRP do agente,
conforme aqui divulgado, pode ser qualquer domínio que seja capaz de se ligar a um ou mais polipeptídeos LRP. Sem ser limitado a qualquer mecanismo ou teoria, a afinidade do domínio de ligação de LRP do agente pode ser suficientemente alta para ativar a sinalização de Wnt mediada por GPR124/RECK/Frizzled/LRP (isto é, quando a ligação do agente a RECK, de RECK a GPR124 e de GPR124 a Frizzled via rede DVL garante a proximidade ou apresentação do agente e mais particularmente seu domínio de ligação de LRP a LRP), mas suficientemente baixa para evitar a ativação (por exemplo, falta de ativação ou no máximo ativação mínima, tal como grau ou extensão de ativação fisiologicamente inconsequente) sinalização de Wnt mediada por Frizzled/LRP na ausência de RECK e/ou GPR124. Sem limitação, em certas modalidades, o domínio de ligação de LRP pode ser capaz de se ligar a um ou mais polipeptídeos LRP com um KD inferior a cerca de 1 x 10-9 M, ou inferior a cerca de 1 x 10-8 M, ou inferior a cerca de 1 x 10-7 M, tal como, por exemplo, entre cerca de 1 x 10-3 M e cerca de 1 x 10-9 M, ou entre cerca de 1 x 10-3 M e cerca de 1 x 10-8 M, ou entre cerca de 1 x 10-3 M e cerca de 1 x 10-7 M.
[00208] Em modalidades particulares, o referido domínio de ligação de LRP compreende um anticorpo específico de LRP ou a região de ligação de LRP, preferivelmente a sequência de região variável ou CDR, de um ou mais anticorpos ou anticorpo específico de LRP.
Preferencialmente, os anticorpos específicos de LRP são anticorpos específicos de LRP5 e/ou LRP6.
Preferencialmente, o anticorpo específico de LRP é direcionado para a porção extracelular do polipeptídeo de LRP, tal como direcionado ao domínio de ligação de DKK de LRP5 e/ou LRP6. Exemplos não limitantes de anticorpos específicos de LRP5 incluem anticorpos que são conhecidos na técnica e comercialmente disponíveis, como de Abcam (por exemplo, ab36121 específico para coelho e LRP5 Humano) ou Santa Cruz (por exemplo, SC-21390 específico para LRP5 humano). Exemplos não limitantes de anticorpos específicos de LRP6 incluem anticorpos disponíveis de Abcam (por exemplo, ab134146 específicos para camundongo, rato e LRP6 Humano), ou Santa Cruz (por exemplo, sc-25317 específico para LRP6 humano).
[00209] Em modalidades particulares, o domínio de ligação de LRP compreende pelo menos uma, pelo menos duas, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco ou pelo menos seis CDR(s), cada uma independentemente tendo pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou pelo menos 99%, preferivelmente 100%, identidade de sequência com a(s) respectiva(s) CDR(s) de um anticorpo específico de LRP, preferivelmente um anticorpo específico de LRP5 ou LRP6.
[00210] Em modalidades particulares, o domínio de ligação de LRP é scFv específico de LRP5 ou LRP6, tal como scFv compreendendo uma ou mais CDR(s) (preferivelmente todas as 6) de um anticorpo específico de LRP5 ou LRP6.
[00211] Em modalidades particulares, o domínio de ligação de LPR é VHH específico de LRP5 ou LRP6, tal como VHH que compreende uma ou mais CDR(s) (preferencialmente todas as 3) de um anticorpo de cadeia pesada específico de LRP5 ou LRP6.
[00212] Em modalidades particulares, o domínio de ligação de LRP do agente conforme aqui divulgado pode compreender duas ou mais CDR(s) cada uma independentemente tendo pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou pelo menos 99%, preferivelmente 100%, identidade de sequência com a(s) respectiva(s) CDR(s) de dois ou mais anticorpos específicos de LRP diferentes, preferivelmente anticorpos específicos de LRP5 ou LRP6.
[00213] Em modalidades particulares, o referido domínio de ligação de LRP do agente, conforme aqui divulgado, compreende, consiste essencialmente em, consiste em ou é derivado de (por exemplo, é um fragmento biologicamente ativo e/ou variante de) um polipeptídeo de ligação de LRP, tal como um ligante Wnt ou polipeptídeo Wnt (por exemplo, Wnt7a ou Wnt7b), um polipeptídeo de DKK (por exemplo, DKK1, DKK2, DKK3 ou DKK4), esclerostina (ou SOST), ou Wise (ou SOSTDC1) ou uma variante do mesmo.
[00214] Por meio de um exemplo, gene SOST humano é anotado sob NCBI Genbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) Gene ID 50964. O mRNA de SOST humano é anotado sob o número de acesso NCBI Genbank NM_025237.2. Nucleotídeos 48 (códon de início) a 689 (códon de parada) de NM_025237.2 constituem a sequência de codificação de SOST. Sequência de proteína SOST humana é anotada sob o número de acesso do NCBI Genbank NP_079513.1, e Uniprot (www.uniprot.org) número de acesso Q9BQB4.1.
[00215] Por meio de um exemplo, gene WISE humano (ou domínio esclerostina contendo 1 (SOSTDC1)) é anotado sob o NCBI Genbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) Gene ID 25928.
O mRNA WISE humano é anotado sob o número de acesso do NCBI Genbank NM_015464.2. Nucleotídeos 182 (códon de início) a 802 (códon de parada) de NM_015464.2 constituem a sequência de codificação WISE. Sequência de proteína WISE humana é anotada sob o número de acesso do NCBI Genbank NP_056279.1, e Uniprot (www.uniprot.org) número de acesso Q6X4U4.2.
[00216] Preferivelmente, o domínio de ligação de LRP do agente, conforme aqui divulgado, é derivado de um polipeptídeo Wnt7 (por exemplo, Wnt7a ou Wnt7b), mais preferivelmente de um polipeptídeo Wnt7 humano (por exemplo, Wnt7a humano ou Wnt7b Humano) ou uma variante do mesmo.
[00217] Em modalidades particulares, o referido domínio de ligação de LRP do agente, conforme aqui divulgado, compreende, consiste essencialmente em, consiste em ou é derivado de um polipeptídeo de DKK, preferivelmente um polipeptídeo de DKK1 ou um polipeptídeo Wnt, preferivelmente um polipeptídeo Wnt7. Em modalidades preferidas, o referido domínio de ligação de LRP do agente, conforme aqui divulgado, é derivado de um polipeptídeo Wnt7.
[00218] Ahn V.E. et al. (Ahn V.E. et al., Dev Cell.
de 15 de Novembro de 2011;21(5):862-873) revela que a região C-terminal de DKK1 é responsável pela ligação a LRP6. Consequentemente, em modalidades particulares, o referido domínio de ligação de LRP do agente, conforme aqui divulgado, compreende, consiste essencialmente em, consiste em ou é derivado do domínio C-terminal de DKK1. Por exemplo, o domínio C-terminal de DKK1 humano (DKK1 humano é anotado sob o número de acesso NCBI Genbank NP_036374.1 e número de acesso Uniprot O94907.1) compreende a sequência de aminoácidos
MYHTKGQEGSVCLRSSDCASGLCCARHFWSKICKPVLKEGQVCTKHRRKGSHGLEIFQR CYCGEGLSCRIQKDHHQASNSSRLHTCQRH (SEQ ID NO: 14).
[00219] Por outro lado, Bourhis E. et al. (Bourhis, Eric et al., Structure, Volume 19, Edição 10 , 1433 – 1442)
identificou um motivo de interação LRP5/6 NXI/V, em que X pode ser qualquer aminoácido, na extremidade N-terminal de DKK1, mas também em DKK2, DKK4, WISE E SOST. Em vista disso, o domínio de ligação de LRP pode compreender NXI ou NXV, em que X pode ser qualquer aminoácido.
[00220] Sem ser limitado a qualquer mecanismo ou teoria, a afinidade do domínio de ligação de Frizzled e do domínio de ligação de LRP do agente pode ser coletivamente suficientemente alta para ativar a sinalização de Wnt mediada por GPR124/RECK/Frizzled/LRP (isto é, quando a ligação do agente a RECK, de RECK a GPR124 e de GPR124 a Frizzled via rede DVL garante a proximidade ou apresentação do agente e, mais particularmente, seu domínio de ligação de LRP a LRP), mas coletivamente suficientemente baixa para evitar a ativação (por exemplo, falta de ativação ou no máximo ativação mínima, tal como grau ou extensão de ativação fisiologicamente inconsequente) sinalização de Wnt mediada por Frizzled/LRP na ausência de RECK e/ou GPR124.
[00221] Em modalidades particulares, o agente, conforme aqui divulgado, é uma proteína conjugada.
[00222] Os termos "proteína de fusão" ou "polipeptídeo de fusão" e “proteína conjugada” ou “polipeptídeo conjugado” denotam moléculas híbridas ou quiméricas compreendendo pelo menos duas proteínas ou polipeptídeos ligados, conectados ou unidos entre si de uma maneira não normalmente encontrada na natureza. As moléculas podem ser adequadamente denotadas como compostos à base de aminoácidos, isto é, como substâncias ou moléculas como incluindo principalmente, mas não necessariamente, resíduos de aminoácidos. Quaisquer fusões ou conjugados produzidos recombinantemente, semi- sinteticamente ou sinteticamente são abrangidas. As fusões ou conjugados podem ser, se desejado, modificadas por glicosilação, fosforilação, sulfonação, metilação, acetilação, lipidação, peguilação ou similares.
[00223] Mais particularmente, os termos "proteína de fusão" ou "polipeptídeo de fusão" denotam fusões genéticas, em que duas ou mais proteínas, polipeptídeos ou variantes ou seus fragmentos são unidas por uma ligação covalente, colinear através de suas cadeias principais de polipeptídeos individuais, através da expressão genética de uma única molécula de polinucleotídeo contígua que codifica o produto de fusão. Tipicamente, para produzir a molécula de polinucleotídeo contígua que codifica o produto de fusão, dois ou mais quadros abertos de leitura (ORFs), cada um codificando um dado segmento de polipeptídeo, são unidos para formar uma ORF mais longa contínua de uma maneira que mantém o quadro de leitura correto para cada ORF original.
No polipeptídeo de fusão recombinante resultante, os dois ou mais segmentos de polipeptídeo codificados pelos ORFs originais são unidos na mesma molécula de polipeptídeo, enquanto eles não são normalmente unidos na natureza.
Embora o quadro de leitura seja assim tornado contínuo ao longo dos segmentos genéticos fundidos, os segmentos polipeptídicos assim fundidos podem ser fisicamente ou espacialmente separados por, por exemplo, um polipeptídeo no quadro ou ligante de peptídeo.
[00224] Mais particularmente, os termos "proteína conjugada" ou "polipeptídeo conjugado" denotam substâncias ou moléculas nas quais duas ou mais proteínas, polipeptídeos ou variantes ou seus fragmentos são unidos por meios não genéticos, enquanto eles não são normalmente unidos na natureza. Os segmentos de polipeptídeo podem ser unidos através de suas cadeias principais de polipeptídeos individuais ou através de uma ou mais de suas respectivas cadeias laterais de aminoácidos, ou um segmento de proteína pode ser unido através de sua cadeia principal de polipeptídeo a uma cadeia lateral de aminoácido de outro segmento de polipeptídeo.
[00225] Em modalidades particulares, o domínio de ligação de RECK, o domínio de ligação de Frizzled e/ou o domínio de ligação de LRP do agente, conforme aqui divulgado, pode ser acoplado por um ou mais ligantes. No contexto da presente invenção, o termo "acoplado", conforme aqui utilizado, é sinônimo de "conectado", "ligado",
"fundido", "unido" e se refere a uma ligação física entre pelo menos dois elementos ou componentes.
[00226] Conforme aqui utilizado, o termo "ligante" se refere a um elemento de conexão que serve para ligar outros elementos. O ligante pode ser um ligante rígido ou um ligante flexível. Em modalidades particulares, o ligante é um ligante covalente, obtendo uma ligação covalente. Os termos "covalente" ou "ligação covalente" se referem a uma ligação química que envolve o compartilhamento de um ou mais pares de elétrons entre dois átomos. Para muitas moléculas, o compartilhamento de elétrons permite que cada átomo alcance o equivalente a uma camada externa completa de elétrons, correspondendo a uma configuração eletrônica estável. Ligações covalentes incluem diferentes tipos de interações, incluindo σ-ligações, π-ligações, ligações metal-metal, interações agósticas, ligações dobradas e ligações de dois elétrons de três centros.
[00227] Em modalidades particulares, o ligante é um ligante de (poli)peptídeo ou um ligante não peptídico, tal como um polímero não peptídico, tal como um polímero não biológico. Preferencialmente, a(s) ligação(ões) entre o domínio de ligação de RECK, o domínio de ligação de Frizzled e/ou o domínio de ligação de LRP pode(m) ser ligação(ões) hidroliticamente estável(is), isto é, substancialmente estável em água em valores de pH úteis,
incluindo, em particular, sob condições fisiológicas, por um período de tempo prolongado, por exemplo, durante dias.
Em modalidades particulares, o ligante é um ligante peptídico de um ou mais aminoácidos. Em modalidades particulares, o ligante é um ligante peptídico de um ou mais aminoácidos.
[00228] O termo "aminoácido" abrange aminoácidos de ocorrência natural, aminoácidos naturalmente codificados, aminoácidos codificados não naturalmente, aminoácidos de ocorrência não natural, análogos de aminoácidos e miméticos de aminoácidos que funcionam de uma maneira semelhante aos aminoácidos de ocorrência natural, todos em seus estereoisômeros D e L, desde que sua estrutura permita tais formas estereoisoméricas. Aminoácidos são referidos aqui por seu nome, seus símbolos de três letras comumente conhecidos ou pelos símbolos de uma letra recomendados pela IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission. O termo "ocorrência natural" se refere geralmente a materiais que são encontrados na natureza e não são manipulados pelo homem. Os termos “ocorrência não natural”, “não natural” e similares geralmente se referem a um material que não é encontrado na natureza ou que foi estruturalmente modificado, semi-sintetizado ou sintetizado por homem. Um "aminoácido codificado naturalmente" se refere a um aminoácido que é um dos 20 aminoácidos comuns ou pirrolisina, pirrolina-carboxi-lisina ou selenocisteína.
Os
20 aminoácidos comuns são: Alanina (A ou Ala), Cisteína (C ou Cys), Ácido aspártico (D ou Asp), Ácido glutâmico (E ou
Glu), Fenilalanina (F ou Phe), Glicina (G ou Gly),
Histidina (H ou His), Isoleucina (I ou He), Lisina (K ou
Lys), Leucina (L ou Leu), Metionina (M ou Met), Asparagina
(N ou Asn), Prolina (P ou Pro), Glutamina (Q ou Gin),
Arginina (R ou Arg), Serina (S ou Ser), Treonina (T ou
Thr), Valina (V ou Val), Triptofano (W ou Trp) e Tirosina
(Y ou Tyr). Um "aminoácido codificado não naturalmente" se refere a um aminoácido que não é um dos 20 aminoácidos comuns ou pirrolisina, pirrolina-carboxi-lisina ou selenocisteína.
O termo inclui, sem limitação, aminoácidos que ocorrem por uma modificação (tal como uma modificação pós-traducional) de um aminoácido naturalmente codificado,
mas não são eles próprios naturalmente incorporados em uma cadeia de polipeptídeo crescente pelo complexo de tradução,
como exemplificado, sem limitação, por N-
acetilglucosaminil-L-serina, N-acetilglucosaminil-L-
treonina e O-fosfotirosina.
Exemplos adicionais de aminoácidos não codificados naturalmente, não naturais ou modificados incluem ácido 2-Aminoadípico, ácido 3-
Aminoadípico, beta-Alanina, ácido beta-Aminopropiônico,
ácido 2-Aminobutírico, ácido 4-Aminobutírico, ácido piperidínico, ácido 6-Aminocapróico, ácido 2-
Aminoheptanóico, ácido 2-Aminoisobutírico, ácido 3- Aminoisobutírico, ácido 2-Aminopimélico, Ácido 2,4- Diaminobutírico, Desmosina, ácido 2,2'-Diaminopimélico, ácido 2,3-Diaminopropiônico, N-Etilglicina, N- Etilasparagina, homosserina, homocisteína, Hidroxilisina, alo-Hidroxilisina, 3-Hidroxiprolina, 4-Hidroxiprolina, Isodesmosina, alo-Isoleucina, N-Metilglicina, N- Metilisoleucina, 6-N-Metil-lisina, N-Metilvalina, Norvalina, Norleucina ou Ornitina. Também estão incluídos análogos de aminoácidos, em que um ou mais átomos individuais foram substituídos ou com um átomo diferente, um isótopo do mesmo átomo ou com um grupo funcional diferente. Também estão incluídos aminoácidos não naturais e análogos de aminoácidos descritos em Ellman et al.
Methods Enzymol. 1991, vol. 202, 301-36. A incorporação de aminoácidos não naturais em proteínas ou polipeptídeos pode ser vantajosa em um número de maneiras diferentes. Por exemplo, os polipeptídeos contendo D-aminoácidos exibem estabilidade aumentada in vitro ou in vivo comparado com contrapartes contendo L-aminoácidos. Mais especificamente, polipeptídeos contendo D-aminoácidos podem ser mais resistentes a peptidases endógenas e proteases, provendo assim biodisponibilidade melhorada do agente e vida útil prolongada in vivo.
[00229] Mais particularmente, o ligante peptídico pode ser de 1 a 50 aminoácidos de comprimento ou 2 a 50 aminoácidos de comprimento ou 1 a 45 aminoácidos de comprimento ou 2 a 45 aminoácidos de comprimento, preferencialmente 1 a 40 aminoácidos de comprimento ou 2 a 40 aminoácidos de comprimento ou 1 a 35 aminoácidos de comprimento ou 2 a 35 aminoácidos de comprimento, mais preferencialmente 1 a 30 aminoácidos de comprimento ou 2 a 30 aminoácidos de comprimento. Ainda preferencialmente, o ligante pode ser de 5 a 25 aminoácidos de comprimento ou 5 a 20 aminoácidos de comprimento. Particularmente preferencialmente, o ligante pode ser de 5 a 15 aminoácidos de comprimento ou 7 a 15 aminoácidos de comprimento.
Portanto, em certas modalidades, o ligante pode ser de 1, 2, 3 ou 4 aminoácidos de comprimento. Em outras modalidades, o ligante pode ser de 5, 6, 7, 8 ou 9 aminoácidos de comprimento. Em outras modalidades, o ligante pode ser de 10, 11, 12, 13 ou 14 aminoácidos de comprimento. Ainda em outras modalidades, o ligante pode ser de 15, 16, 17, 18 ou 19 aminoácidos de comprimento. Em outras modalidades, o ligante pode ser de 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 aminoácidos de comprimento. Em certas modalidades, o ligante é 4-10 ou 5-9 ou 6-8 ou 7 aminoácidos de comprimento. Em outras modalidades, o ligante é 12-18 ou 13-17 ou 14-16 ou 15 aminoácidos de comprimento.
[00230] A natureza dos aminoácidos que constituem o ligante não é de relevância particular desde que a atividade biológica dos segmentos polipeptídicos ligados desse modo não seja substancialmente prejudicada e o ligante forneça a separação espacial pretendida do domínio de ligação de RECK, do domínio de ligação de Frizzled e/ou do domínio de ligação de LRP do agente. Ligantes preferidos são essencialmente não imunogênicos e/ou não propensos à clivagem proteolítica.
[00231] Em certas modalidades preferidas, o ligante peptídico pode compreender, consistir essencialmente em ou consistir em aminoácidos selecionados do grupo consistindo em Glicina, Serina, Alanina, Treonina e suas combinações.
Em modalidades ainda mais preferidas, o ligante pode compreender, consistir essencialmente em ou consistir em aminoácidos selecionados do grupo consistindo em Glicina, Serina e suas combinações. Tais ligantes proporcionam uma flexibilidade particularmente boa. Em certas modalidades, o ligante pode consistir em somente resíduos de Glicina. Em certas modalidades, o ligante pode consistir em somente resíduos de Serina.
[00232] Em modalidades particulares, o ligante é um ligante não peptídico. Em modalidades preferidas, o ligante não peptídico pode compreender, consistir essencialmente em ou consistir em um polímero não peptídico. O termo "polímero não peptídico", conforme aqui utilizado, se refere a um polímero biocompatível que inclui duas ou mais unidades de repetição ligadas entre si por uma ligação covalente excluindo a ligação peptídica. Por exemplo, o polímero não peptídeo pode ser de 2 a 200 unidades de comprimento ou 2 a 100 unidades de comprimento ou 2 a 50 unidades de comprimento ou 2 a 45 unidades de comprimento ou 2 a 40 unidades de comprimento ou 2 a 35 unidades de comprimento ou 2 a 30 unidades de comprimento ou 5 a 25 unidades de comprimento ou 5 a 20 unidades de comprimento ou 5 a 15 unidades de comprimento. O polímero não peptídico pode ser selecionado do grupo consistindo em polietileno glicol, polipropileno glicol, copolímeros de etileno glicol e propileno glicol, polióis polioxietilados, álcool polivinílico, polissacarídeos, dextrano, éter polivinil etílico, polímeros biodegradáveis tais como PLA (poli(ácido láctico) e PLGA (ácido poliláticoglicólico), polímeros lipídicos, quitinas, ácido hialuronico e suas combinações.
Particularmente preferido é o poli(etilenoglicol) (PEG). O peso molecular do polímero não peptídico, preferencialmente, pode variar de 1 a 100 kDa e, preferencialmente, de 1 a 20 kDa. O polímero não peptídico pode ser um polímero ou uma combinação de diferentes tipos de polímeros. O polímero não peptídico tem grupos reativos capazes de se ligar ao domínio de ligação de RECK, ao domínio de ligação de Frizzled e/ou ao domínio de ligação de LRP que são para formar o conjugado. Preferencialmente, o polímero não peptídico tem um grupo reativo em cada extremidade. Preferencialmente, o grupo reativo é selecionado do grupo que consiste em um grupo aldeído reativo, um grupo aldeído propiona, um grupo aldeído butílico, um grupo maleimida e um derivado succinimida. O derivado de succinimida pode ser propionato de succinimidila, hidróxi succinimidila, carboximetil de succinimidila ou carbonato de succinimidila. Os grupos reativos em ambas extremidades do polímero não peptídico podem ser iguais ou diferentes. Em certas moddalidades, o polímero não peptídico tem um grupo aldeído reativo em ambas as extremidades. Por exemplo, o polímero não peptídico pode possuir um grupo maleimida em uma extremidade e, na outra extremidade, um grupo aldeído, um grupo aldeído propiônico ou um grupo aldeído butílico.
Quando um polietilenoglicol (PEG) tendo um grupo hidróxi reativo em ambas as suas extremidades é utilizado como o polímero não peptídico, o grupo hidróxi pode ser ativado para vários grupos reativos por reações químicas conhecidas, ou um PEG tendo um grupo reativo modificado disponível comercialmente pode ser utilizado de modo a preparar o conjugado de proteína.
[00233] A inclusão de um ou mais ligantes aumenta a separação espacial entre o domínio de ligação de RECK, o domínio de ligação de Frizzled e/ou o domínio de ligação de LRP do agente, que pode afetar vantajosamente a atividade de sinalização de Wnt do agente.
[00234] Em modalidades particulares, o agente, conforme aqui divulgado, é fornecido como uma única cadeia ou um multímero. Para se obter formas multiméricas, domínio de ligação de RECK, domínio de ligação de Frizzled e/ou domínio de ligação de LRP pode ser ligado a um andaime ou cadeia principal composta de, por exemplo, dendrímeros, anticorpos ou poli-L-lisina.
[00235] Em modalidades particulares, o agente conforme aqui divulgado compreende um domínio de ligação de RECK, um domínio de ligação de Frizzled e um domínio de ligação de LRP, em que o referido domínio de ligação de RECK, o referido domínio de ligação de Frizzled e o referido domínio de ligação de LRP são derivados de um polipeptídeo Wnt7, tal como de um polipeptídeo Wnt7a ou Wnt7b, preferivelmente o polipeptídeo Wnt humano, tal como do polipeptídeo Wnt7a ou Wnt7b humano.
[00236] Em modalidades particulares, o agente conforme aqui divulgado compreende um domínio de ligação de RECK, um domínio de ligação de Frizzled e um domínio de ligação de LRP, em que pelo menos um, pelo menos dois ou todos os três domínios de ligação são derivados de um polipeptídeo Wnt7, tal como de um polipeptídeo Wnt7a ou
Wnt7b, preferivelmente o polipeptídeo Wnt humano, tal como do polipeptídeo Wnt7a ou Wnt7b humano.
[00237] Por meio de um exemplo, gene WNT7A humano é anotado sob NCBI Genbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) Gene ID 7476. O mRNA WNT7A humano (variante 1 do transcrito) é anotado sob número de acesso do NCBI Genbank NM_004625.3. Nucleotídeos 306 (códon de início) a 1355 (códon de parada) de NM_004625.3 constituem a sequência de codificação de WNT7A. Sequência de proteína WNT7A humana é anotada sob número de acesso do NCBI Genbank NP_004616.2, e número de acesso Uniprot O00755.2 e é adicionalmente reproduzida abaixo (SEQ ID NO: 15): > NP_004616.2 precursor da proteína Wnt-7a [Homo sapiens]
MNRKARRCLGHLFLSLGMVYLRIGGFSSVVALGASIICNKIPGLAPRQRAICQSRPDAI IVIGEGSQMGLDECQFQFRNGRWNCSALGERTVFGKELKVGSREAAFTYAIIAAGVAHA ITAACTQGNLSDCGCDKEKQGQYHRDEGWKWGGCSADIRYGIGFAKVFVDAREIKQNAR TLMNLHNNEAGRKILEENMKLECKCHGVSGSCTTKTCWTTLPQFRELGYVLKDKYNEAV HVEPVRASRNKRPTFLKIKKPLSYRKPMDTDLVYIEKSPNYCEEDPVTGSVGTQGRACN KTAPQASGCDLMCCGRGYNTHQYARVWQCNCKFHWCCYVKCNTCSERTEMYTCK.
[00238] Por meio de um exemplo, a forma madura da proteína Wnt7a humana (não compreendendo o peptídeo de sinal) compreende uma sequência de aminoácidos conforme subsequentemente reproduzida abaixo (SEQ ID NO: 51):
LGASIICNKIPGLAPRQRAICQSRPDAIIVIGEGSQMGLDECQFQFRNGRWNCSALGER TVFGKELKVGSREAAFTYAIIAAGVAHAITAACTQGNLSDCGCDKEKQGQYHRDEGWKW GGCSADIRYGIGFAKVFVDAREIKQNARTLMNLHNNEAGRKILEENMKLECKCHGVSGS CTTKTCWTTLPQFRELGYVLKDKYNEAVHVEPVRASRNKRPTFLKIKKPLSYRKPMDTD LVYIEKSPNYCEEDPVTGSVGTQGRACNKTAPQASGCDLMCCGRGYNTHQYARVWQCNC KFHWCCYVKCNTCSERTEMYTCK.
[00239] Por meio de um exemplo, gene WNT7B humano é anotado sob NCBI Genbank Gene ID 7477. O mRNA WNT7B humano (variante 1 de transcrito) é anotado sob número de acesso do NCBI Genbank NM_058238.2. Nucleotídeos 375 (códon de início) a 1424 (códon de parada) de NM_058238.2 constituem a sequência de codificação de WNT7B. Sequência de proteína WNT7B humana é anotada sob o número de acesso NCBI Genbank NP_478679.1, e número de acesso Uniprot P56706.2 e é adicionalmente reproduzida abaixo (SEQ ID NO: 16): > NP_478679.1 precursor da proteína Wnt-7b [Homo sapiens]
MHRNFRKWIFYVFLCFGVLYVKLGALSSVVALGANIICNKIPGLAPRQRAICQSRPDAI IVIGEGAQMGINECQYQFRFGRWNCSALGEKTVFGQELRVGSREAAFTYAITAAGVAHA VTAACSQGNLSNCGCDREKQGYYNQAEGWKWGGCSADVRYGIDFSRRFVDAREIKKNAR RLMNLHNNEAGRKVLEDRMQLECKCHGVSGSCTTKTCWTTLPKFREVGHLLKEKYNAAV QVEVVRASRLRQPTFLRIKQLRSYQKPMETDLVYIEKSPNYCEEDAATGSVGTQGRLCN RTSPGADGCDTMCCGRGYNTHQYTKVWQCNCKFHWCCFVKCNTCSERTEVFTCK.
[00240] Em modalidades particulares, o referido domínio de ligação de RECK compreende, consiste essencialmente em ou consiste em uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em HVEPVRASRNKRPTFLKIKKPLSYRKPMDTDLVYIEKSPNYC (SEQ ID NO: 17),
VEPVRASRNKRPTFLKIKKPLSYRKPMDT (SEQ ID NO: 18) ou VEVVRASRLRQPTFLRIKQLRSYQKPMET (SEQ ID NO: 19), ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou pelo menos 99% de identidade de sequência para a sequência de aminoácido SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18; ou SEQ ID NO: 19. Em modalidades particulares, o referido domínio de ligação de RECK derivado de um polipeptídeo Wnt7 compreende, consiste essencialmente em ou consiste na sequência de aminoácido SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18; ou SEQ ID NO: 19.
[00241] Em modalidades particulares, o referido domínio de ligação de RECK compreende, consiste essencialmente em ou consiste na sequência de aminoácidos XXXVXAXRXXXXXFLXIXXXXXYXKXXXX (SEQ ID NO: 20), VXAXRXXXXXFLXIXXXXXYXK (SEQ ID NO: 21), XXXVXAXRXXXXXFLXXXXXXXXXKXXXX (SEQ ID NO: 22) ou VXAXRXXXXXFLXXXXXXXXXK (SEQ ID NO: 23), em que X é qualquer aminoácido, preferencialmente, em que a sequência de aminoácidos mostra pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou pelo menos 99%, preferivelmente 100%, identidade de sequência a qualquer uma das SEQ ID NO: 18 ou SEQ ID NO: 19.
[00242] Em modalidades particulares, o referido domínio de ligação de RECK é derivado de um polipeptídeo Wnt7, e o domínio de ligação de Frizzled e domínio de ligação de LRP não são derivados de um polipeptídeo Wnt7.
[00243] Em modalidades particulares, o referido domínio de ligação de RECK é derivado de um polipeptídeo Wnt7, e o domínio de ligação de Frizzled e domínio de ligação de LRP são derivados de um polipeptídeo Wnt selecionado da lista consistindo em Wntl, Wnt2, Wnt2b, Wnt3, Wnt3a, Wnt4, Wnt5a Wnt5b, Wnt6, Wnt8a, Wnt8b, Wnt9a, Wnt9b, Wnt10a, Wnt10b, Wnt 11 e Wnt16.
[00244] Em modalidades particulares, o agente, conforme aqui descrito, é ou consiste essencialmente em um fragmento de um polipeptídeo Wnt7, tal como um fragmento de um polipeptídeo Wnt7a ou Wnt7b, preferivelmente um fragmento de um polipeptídeo Wnt7 humano, tal como um fragmento de um polipeptídeo Wnt7a humano ou Wnt7b humano.
[00245] Em modalidades particulares, o fragmento do polipeptídeo Wnt7 tem pelo menos 30% e, preferivelmente, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 99%, preferivelmente 100%, da atividade de sinalização de Wnt Mediada por GPR124/RECK/Frizzled/LRP do polipeptídeo Wnt7 de comprimento total.
[00246] Em modalidades particulares, o fragmento do polipeptídeo Wnt7 tem uma atividade de sinalização de Wnt mediada por GPR124/RECK/Frizzled/LRP que é maior (por exemplo, 1,1 vezes, 1 2 vezes, 1,3 vezes, 1,4 vezes, 1,5 vezes, 1,6 vezes, 1,7 vezes, 1,8 vezes, 1,9 vezes ou 2 vezes mais alta ou mesmo maior) do que a atividade de sinalização de Wnt mediada por GPR124/RECK/Frizzled/LRP do polipeptídeo Wnt7 de comprimento total.
[00247] Presentes inventores demonstraram que o domínio N-terminal de Wnt7a é capaz de ligar a RECK e ativar a sinalização de Wnt mediada pelo complexo receptor GPR124/RECK/Frizzled/LRP, enquanto não ativando a sinalização de Wnt mediada pelo complexo receptor Frizzled/LRP na ausência de RECK e/ou GPR124.
[00248] Assim, em modalidades particulares, o fragmento do polipeptídeo Wnt7 tem atividade de sinalização de Wnt mediada por Frizzled/LRP na ausência de RECK e/ou GPR124 que é pelo menos 10 vezes menor, ou pelo menos 100 vezes menor, ou pelo menos 1000 vezes menor, ou pelo menos 1 x 104 vezes menor, ou pelo menos 1 x 105 vezes menor, ou pelo menos 1 x 106 vezes menor que a atividade de sinalização de Wnt mediada por Frizzled/LRP do polipeptídeo Wnt7 de comprimento total na ausência de RECK e/ou GPR124.
[00249] Em modalidades particulares, o referido fragmento do polipeptídeo Wnt7 é ou consiste essencialmente no domínio N-terminal (NTD) do polipeptídeo Wnt7, tal como o NTD de um polipeptídeo Wnt7a ou Wnt7b, preferivelmente o NTD de polipeptídeo Wnt7 humano, tal como Wnt7a ou Wnt7b humano. O domínio N-terminal do polipeptídeo Wnt7a ou Wnt7b humano tipicamente varia do resíduo de Leucina (L) na posição correspondente à posição 1 na SEQ ID NO: 24 (Wnt7a) ou SEQ ID NO: 25 (Wnt7b) ao resíduo cisteína (C) na posição correspondente à posição 247 na SEQ ID NO: 24 (Wnt7a) ou SEQ ID NO: 25 (Wnt7b).
[00250] Em modalidades particulares, o referido fragmento do polipeptídeo Wnt7 compreende pelo menos o NTD do polipeptídeo Wnt7 e não compreende o domínio C-terminal (CTD) do polipeptídeo Wnt7.
[00251] Em modalidades particulares, o agente, conforme aqui divulgado, compreende, consiste essencialmente em, ou consiste em pelo menos 50, pelo menos 75, pelo menos 100, pelo menos 125, pelo menos 150, pelo menos 175, pelo menos 200, pelo menos 225, aminoácidos contíguos do NTD de polipeptídeo Wnt7a humano, mais particularmente, o agente conforme aqui divulgado compreende, consiste essencialmente em ou consiste em pelo menos 50, pelo menos 75, pelo menos 100, pelo menos 125, pelo menos 150, pelo menos 175, pelo menos 200, pelo menos
225, aminoácidos contíguos da sequência de aminoácidos
LGASIICNKIPGLAPRQRAICQSRPDAIIVIGEGSQMGLDECQFQFRNGRWNCSALGER TVFGKELKVGSREAAFTYAIIAAGVAHAITAACTQGNLSDCGCDKEKQGQYHRDEGWKW GGCSADIRYGIGFAKVFVDAREIKQNARTLMNLHNNEAGRKILEENMKLECKCHGVSGS
CTTKTCWTTLPQFRELGYVLKDKYNEAVHVEPVRASRNKRPTFLKIKKPLSYRKPMDTD LVYIEKSPNYC (SEQ ID NO: 24) ou
LGANIICNKIPGLAPRQRAICQSRPDAIIVIGEGAQMGINECQYQFRFGRWNCSALGEK TVFGQELRVGSREAAFTYAITAAGVAHAVTAACSQGNLSNCGCDREKQGYYNQAEGWKW GGCSADVRYGIDFSRRFVDAREIKKNARRLMNLHNNEAGRKVLEDRMQLECKCHGVSGS
CTTKTCWTTLPKFREVGHLLKEKYNAAVQVEVVRASRLRQPTFLRIKQLRSYQKPMETD LVYIEKSPNYC (SEQ ID NO: 25), preferivelmente SEQ ID NO: 24.
[00252] Em modalidades particulares, o agente, conforme aqui divulgado, compreende, consiste essencialmente em, ou consiste de uma sequência de aminoácidos conforme apresentado em SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 25, preferivelmente SEQ ID NO: 24, ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou pelo menos 99%, identidade de sequência para a sequência de aminoácido SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 25, preferivelmente SEQ ID NO: 24.
[00253] A pessoa versada entenderá que se for considerado para expressar e secretar o agente, conforme aqui ensinado, por uma célula hospedeira, o ácido nucleico que codifica o agente, conforme ensinado aqui, preferencialmente codifica uma forma precursora do agente incluindo uma sequência de peptídeo de sinal N-terminal.
Consequentemente, o ácido nucleico pode codificar um fragmento do polipeptídeo precursor de Wnt7 (isto é, incluindo o peptídeo de sinal), tal como o polipeptídeo precursor de Wnt7a ou Wnt7b humano. Em modalidades particulares, o ácido nucleico codifica um agente que compreende, consiste essencialmente em, ou consiste em uma sequência de aminoácidos conforme apresentado em SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 25 ou uma sequência de aminoácidos tendo tendo pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou pelo menos 99% de identidade de sequência à SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 25, em que a referida sequência de aminoácidos é precedida N-terminalmente por um peptídeo de sinal tendo uma sequência de aminoácidos MNRKARRCLGHLFLSLGMVYLRIGGFSSVVA (SEQ ID NO: 26) ou MHRNFRKWIFYVFLCFGVLYVKLGALSSVVA (SEQ ID NO: 27), respectivamente. Alternativamente, o ácido nucleico que codifica o agente, conforme ensinado aqui, pode ser compreendido dentro de um vetor que fornece um peptídeo de sinal. O peptídeo de sinal pode ser um peptídeo de sinal homólogo ou heterólogo, dependendo da célula hospedeira utilizada para produção do agente conforme aqui ensinado.
Além disso, para expressão procariótica do agente, conforme aqui ensinado, um motivo de sítio de clivagem de protease pode estar presente C-terminalmente do referido peptídeo de sinal e N-terminalmente do agente conforme aqui ensinado.
[00254] Presentes inventores demonstraram que certas variantes do polipeptídeo Wnt7a humano ou murino são tão eficazes ou mais eficazes na ativação de sinalização de Wnt mediada pelo complexo receptor GPR124/RECK/Frizzled/LRP, enquanto não ativando a sinalização de Wnt mediada pelo complexo receptor de Frizzled/LRP na ausência de RECK e/ou GPR124, em comparação com o polipeptídeo Wnt7a humano ou murino do tipo selvagem, respectivamente.
[00255] Consequentemente, em modalidades particulares, o agente, conforme aqui divulgado, é uma variante de um polipeptídeo Wnt7, tal como uma variante de um polipeptídeo Wnt7a ou Wnt7b. Em outras modalidades particulares, o agente, conforme aqui divulgado, é uma variante do NTD de um polipeptídeo Wnt7a ou Wnt7b.
[00256] Em certas modalidades, em tal variante, o resíduo de glutamina (Q) na posição correspondente à posição 17 na SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 51; o resíduo de isoleucina (I) na posição correspondente à posição 20 na
SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 51; o resíduo de prolina (P) na posição correspondente à posição 25 na SEQ ID NO: 24 ou SEQ
ID NO: 51; o resíduo de alanina (A) na posição correspondente à posição 27 na SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO:
51; o resíduo de isoleucina (I) na posição correspondente à posição 28 na SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 51; o resíduo de glutamato (E) na posição correspondente à posição 33 na SEQ
ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 51; o resíduo de metionina (M) na posição correspondente à posição 37 na SEQ ID NO: 24 ou SEQ
ID NO: 51; o resíduo de leucina (L) na posição correspondente à posição 39 na SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO:
51; o resíduo de glutamato (E) na posição correspondente à posição 41 Na SEQ ID NO: 24 Ou SEQ ID NO: 51; o resíduo de fenilalanina (F) na posição correspondente à posição 44 na
SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 51; o resíduo de arginina (R)
na posição correspondente à posição 50 na SEQ ID NO: 24 ou
SEQ ID NO: 51; o resíduo de asparagina (N) na posição correspondente à posição 52 na SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO:
51; o resíduo de valina (V) na posição correspondente à posição 68 na SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 51; o resíduo de isoleucina (I) na posição correspondente à posição 129 na
SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 51; o resíduo de fenilalanina
(F) na posição correspondente à posição 131 na SEQ ID NO:
24 ou SEQ ID NO: 51; o resíduo de lisina (K) na posição correspondente à posição 133 na SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO:
51; o resíduo de fenilalanina (F) na posição correspondente à posição 135 na SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 51; o resíduo de isoleucina (I) na posição correspondente à posição 141 na SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 51; o resíduo de arginina
(R) na posição correspondente à posição 146 na SEQ ID NO:
24 ou SEQ ID NO: 51; o resíduo de arginina (R) na posição correspondente à posição 158 na SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO:
51; o resíduo de lisina (K) na posição correspondente à posição 159 na SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 51; o resíduo de lisina (K) na posição correspondente à posição 181 na SEQ
ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 51; o resíduo de arginina (R) na posição correspondente à posição 191 na SEQ ID NO: 24 ou
SEQ ID NO: 51; o resíduo de lisina (K) na posição correspondente à posição 198 na SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO:
51; o resíduo de lisina (K) na posição correspondente à posição 200 na SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 51; o resíduo de valina (V) na posição correspondente à posição 205 na SEQ
ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 51; o resíduo de glutamato (E) na posição correspondente à posição 208 na SEQ ID NO: 24 ou
SEQ ID NO: 51; o resíduo de glutamato (E) na posição correspondente à posição 208 na SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO:
51; o resíduo de arginina (R) na posição correspondente à posição 214 na SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 51; o resíduo de lisina (K) na posição correspondente à posição 216 na SEQ
ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 51; o resíduo de prolina (P) na posição correspondente à posição 218 na SEQ ID NO: 24 ou
SEQ ID NO: 51; o resíduo de lisina (K) na posição correspondente à posição 222 na SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO:
51; o resíduo de isoleucina (I) na posição correspondente à posição 223 na SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 51; o resíduo de tirosina (Y) na posição correspondente à posição 229 na SEQ
ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 51; o resíduo de prolina (P) na posição correspondente à posição 232 na SEQ ID NO: 24 ou
SEQ ID NO: 51; o resíduo de treonina (T) na posição correspondente à posição 235 na SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO:
51; o resíduo de glutamato (E) na posição correspondente à posição 248 na SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 51; o resíduo de arginina (R) na posição correspondente à posição 289 na SEQ
ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 51; o resíduo de triptofano (W) na posição correspondente à posição 291 na SEQ ID NO: 24 ou
SEQ ID NO: 51; o resíduo de treonina (T) na posição correspondente à posição 307 na SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO:
51; e/ou o resíduo de lisina (K) na posição correspondente à posição 318 na SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 51, é substituído por um ou mais (preferivelmente não mais que três, preferivelmente não mais que dois, mais preferivelmente um) outro resíduo de aminoácido, tal como preferivelmente mas sem limitação por um resíduo de alanina
(A), um resíduo de arginina (R) ou um resíduo de glutamina
(Q), mais preferivelmente por um resíduo de alanina (A). Em certas modalidades, em tal variante, o resíduo glutamina
(Q) na posição correspondente à posição 17 na SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 51; o resíduo de isoleucina (I) na posição correspondente à posição 20 na SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO:
51; o resíduo de prolina (P) na posição correspondente à posição 25 na SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 51; o resíduo de isoleucina (I) na posição correspondente à posição 28 na
SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 51; o resíduo de glutamato (E)
na posição correspondente à posição 33 na SEQ ID NO: 24 ou
SEQ ID NO: 51; o resíduo de metionina (M) na posição correspondente à posição 37 na SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO:
51; o resíduo de leucina (L) na posição correspondente à posição 39 na SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 51; o resíduo de glutamato (E) na posição correspondente à posição 41 na SEQ
ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 51; o resíduo de fenilalanina (F)
na posição correspondente à posição 44 na SEQ ID NO: 24 ou
SEQ ID NO: 51; o resíduo de arginina (R) na posição correspondente à posição 50 na SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO:
51; o resíduo de valina (V) na posição correspondente à posição 68 na SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 51; o resíduo de isoleucina (I) na posição correspondente à posição 129 na
SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 51; o resíduo de fenilalanina
(F) na posição correspondente à posição 131 na SEQ ID NO:
24 ou SEQ ID NO: 51; o resíduo de lisina (K) na posição correspondente à posição 133 na SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO:
51; o resíduo de fenilalanina (F) na posição correspondente à posição 135 na SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 51; o resíduo de isoleucina (I) na posição correspondente à posição 141 na SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 51; o resíduo de arginina
(R) na posição correspondente à posição 146 na SEQ ID NO:
24 ou SEQ ID NO: 51; o resíduo de arginina (R) na posição correspondente à posição 158 na SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO:
51; o resíduo de lisina (K) na posição correspondente à posição 181 na SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 51; o resíduo de arginina (R) na posição correspondente à posição 191 na SEQ
ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 51; o resíduo lisina (K) na posição correspondente à posição 198 na SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO:
51; o resíduo de lisina (K) na posição correspondente à posição 200 na SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 51; o resíduo de valina (V) na posição correspondente à posição 205 na SEQ
ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 51; o resíduo de glutamato (E) na posição correspondente à posição 208 na SEQ ID NO: 24 ou
SEQ ID NO: 51; o resíduo de glutamato (E) na posição correspondente à posição 208 na SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO:
51; o resíduo de arginina (R) na posição correspondente à posição 214 na SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 51; o resíduo de lisina (K) na posição correspondente à posição 216 na SEQ
ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 51; o resíduo de prolina (P) na posição correspondente à posição 218 na SEQ ID NO: 24 ou
SEQ ID NO: 51; o resíduo de lisina (K) na posição correspondente à posição 222 na SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO:
51; o resíduo de isoleucina (I) na posição correspondente à posição 223 na SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 51; o resíduo de tirosina (Y) na posição correspondente à posição 229 na SEQ
ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 51; o resíduo de prolina (P) na posição correspondente à posição 232 na SEQ ID NO: 24 ou
SEQ ID NO: 51; o resíduo de treonina (T) na posição correspondente à posição 235 na SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO:
51; o resíduo de glutamato (E) na posição correspondente à posição 248 na SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 51; o resíduo de arginina (R) na posição correspondente à posição 289 na SEQ
ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 51; o resíduo de triptofano (W) na posição correspondente à posição 291 Em SEQ ID NO: 24 ou
SEQ ID NO: 51; o resíduo de treonina (T) na posição correspondente à posição 307 na SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO:
51; e/ou o resíduo de lisina (K) na posição correspondente à Posição 318 na SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 51, é substituído por um resíduo de alanina (A); e/ou o resíduo de alanina (A) na posição correspondente à posição 27 na
SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 51 é substituído por um resíduo de arginina (R); e/ou o resíduo de asparagina (N) na posição correspondente à posição 52 na SEQ ID NO: 24 ou SEQ
ID NO: 51 é substituído por um resíduo de glutamina (Q);
e/ou o resíduo de lisina (K) na posição correspondente à posição 159 na SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 51 é substituído por um resíduo de alanina (A), um de serina (S) ou um resíduo leucina (L).
[00257] Em certas modalidades, a variante do polipeptídeo Wnt7 compreende dois ou mais (por exemplo, preferivelmente dois, preferivelmente três, mais preferivelmente quatro) das substituições de aminoácidos listadas acima.
[00258] Em modalidades mais particulares, o NTD do polipeptídeo Wnt7a ou Wnt7b compreende dois ou mais (por exemplo, preferivelmente dois, preferivelmente três, mais preferivelmente quatro) das substituições de aminoácidos listadas acima.
[00259] Assim, em modalidades particulares, o agente conforme aqui divulgado compreende, consiste essencialmente em ou consiste em uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou pelo menos 99% identidade de sequência para a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 51, em que o resíduo na posição 17 não é glutamina, o resíduo na posição 20 não é isoleucina, o resíduo na posição 25 não é prolina, o resíduo na posição 27 não é alanina, o resíduo na posição 28 não é isoleucina, o resíduo na posição 33 não é glutamato, o resíduo na posição 37 não é metionina, o resíduo na posição 39 não é leucina, o resíduo na posição
41 não é glutamato, o resíduo na posição 44 não é fenilalanina, o resíduo na posição 50 não é arginina, o resíduo na posição 52 não é asparagina, o resíduo na posição 68 não é valina, o resíduo na posição 129 não é isoleucina, o resíduo na posição 131 não é fenilalanina, o resíduo na posição 133 não é lisina, o resíduo na posição
135 não é fenilalanina, o resíduo na posição 141 não é isoleucina, o resíduo na posição 146 não é arginina, o resíduo na posição 158 não é arginina, o resíduo na posição
159 não é lisina, o resíduo na posição 181 não é lisina, o resíduo na posição 191 não é arginina, o resíduo na posição
198 não é lisina, o resíduo na posição 200 não é lisina, o resíduo na posição 205 não é valina, o resíduo na posição
208 não é glutamato, o resíduo na posição 214 não é arginina, o resíduo na posição 216 não é lisina, o resíduo na posição 218 não é prolina, o resíduo na posição 222 não é lisina, o resíduo na posição 223 não é isoleucina, o resíduo na posição 229 não é tirosina, o resíduo na posição
232 não é prolina, o resíduo na posição 235 não é treonina,
o resíduo na posição 248 não é glutamato, o resíduo na posição 289 não é arginina, o resíduo na posição 291 não é triptofano, o resíduo na posição 307 não é treonina, e/ou o resíduo na posição 318 não é lisina; preferivelmente em que o resíduo na posição 27 é arginina, o resíduo na posição 28 é alanina, o resíduo na posição 33 é alanina, o resíduo na posição 41 é alanina, o resíduo na posição 44 é alanina, o resíduo na posição 50 é alanina, o resíduo na posição 52 é glutamina, o resíduo na posição 68 é alanina, o resíduo na posição 129 é alanina, o resíduo na posição 131 é alanina, o resíduo na posição 133 é alanina, o resíduo na posição 135 é alanina, o resíduo na posição 141 é alanina, o resíduo na posição 146 é alanina, o resíduo na posição 158 é alanina, o resíduo na posição 159 é alanina, o resíduo na posição 181 é alanina, o resíduo na posição 191 é alanina, o resíduo na posição 198 é alanina, o resíduo na posição 200 é alanina, o resíduo na posição 205 é alanina, o resíduo na posição 208 é alanina, , o resíduo na posição 214 é alanina, o resíduo na posição 216 é alanina, o resíduo na posição 218 é alanina, o resíduo na posição 222 é alanina, o resíduo na posição 223 é alanina, o resíduo na posição 229 é alanina, o resíduo na posição 232 é alanina, o resíduo na posição 235 é alanina, o resíduo na posição 248 é alanina, o resíduo na posição 289 é alanina, o resíduo na posição 291 é alanina, o resíduo na posição 307 é alanina, e/ou o resíduo na posição 318 é alanina.
[00260] Em modalidades preferidas, o agente conforme aqui divulgado é uma variante do NTD de Wnt7a humana compreendendo, consistindo essencialmente em ou consistindo em uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 50%,
pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos
70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou pelo menos 99% de identidade de sequência para a sequência de aminoácido apresentada na
SEQ ID NO: 24, em que o resíduo na posição 17 não é glutamina, o resíduo na posição 20 não é isoleucina, o resíduo na posição 25 não é prolina, o resíduo na posição
27 não é alanina, o resíduo na posição 28 não é isoleucina,
o resíduo na posição 33 não é glutamato, o resíduo na posição 37 não é metionina, o resíduo na posição 39 não é leucina, o resíduo na posição 41 não é glutamato, o resíduo na posição 44 não é fenilalanina, o resíduo na posição 50 não é arginina, o resíduo na posição 52 não é asparagina, o resíduo na posição 68 não é valina, o resíduo na posição
129 não é isoleucina, o resíduo na posição 131 não é fenilalanina, o resíduo na posição 133 não é lisina, o resíduo na posição 135 não é fenilalanina, o resíduo na posição 141 não é isoleucina, o resíduo na posição 146 não é arginina, o resíduo na posição 158 não é arginina, o resíduo na posição 159 não é lisina, o resíduo na posição
181 não é lisina, o resíduo na posição 191 não é arginina,
o resíduo na posição 198 não é lisina, o resíduo na posição
200 não é lisina, o resíduo na posição 205 não é valina, o resíduo na posição 208 não é glutamato, o resíduo na posição 214 não é arginina, o resíduo na posição 216 não é lisina, o resíduo na posição 218 não é prolina, o resíduo na posição 222 não é lisina, o resíduo na posição 223 não é isoleucina, o resíduo na posição 229 não é tirosina, o resíduo na posição 232 não é prolina, e/ou o resíduo na posição 235 não é treonina.
[00261] Em modalidades particulares, o agente conforme aqui divulgado compreende, consiste essencialmente em ou consiste em uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 52, 53, 54, 68, 69, 70, 71, 72, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, ou, 121 preferivelmente SEQ ID NO: 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 47, 48, 49, 53, 54, 68, 69, 70, 71, 72, 74, 76, 80, 81, 83, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 114, 118, 119 ou 121, mais preferivelmente SEQ ID NO: 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 47, 48, 49, 53, 54, 68, 69, 70, 71 72, 74, 76, 80, 81 ou 83 (Figura 8).
[00262] Em modalidades preferidas, em tal variante, o resíduo de lisina (K) na posição correspondente à posição 159 na SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 51 é substituído por um ou mais (preferivelmente não mais que três, preferivelmente não mais que dois, mais preferivelmente um) outro resíduo de aminoácido, tal como preferivelmente, mas sem limitação por um resíduo de alanina (A), um resíduo de serina (S) ou leucina (L). Em modalidades mais preferidas, o agente conforme aqui divulgado compreende, consiste essencialmente em ou consiste em uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 28, 80, 81, 85, 118 ou 119, preferivelmente SEQ ID NO: 28 ou 85, mais preferivelmente SEQ ID NO: 28.
[00263] Em modalidades particulares, a variante do polipeptídeo Wnt7 tem pelo menos 35%, de preferência pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95 %, pelo menos 99%, de preferência 100%, da atividade de sinalização Wnt mediada por GPR124/RECK/Frizzled/LRP do polipeptídeo Wnt7 de tipo selvagem de comprimento total. Em modalidades preferidas, a variante do polipeptídeo Wnt7 tem pelo menos 70% da atividade de sinalização Wnt mediada por GPR124/RECK/Frizzled/LRP do polipeptídeo Wnt7 de tipo selvagem de comprimento total. Em modalidades particulares, a variante do polipeptídeo Wnt7 tem uma atividade de sinalização Wnt mediada por GPR124/RECK/Frizzled/LRP que é maior (por exemplo, 1.1 vezes, 1.2 vezes, 1.3 vezes, 1.4 vezes, 1.5 vezes, 1.6 dobrada, 1.7 vezes, 1.8 vezes, 1.9 vezes, 2 vezes maior ou até mesmo maior) do que a atividade de sinalização Wnt mediada por GPR124/RECK/Frizzled/LRP do polipeptídeo Wnt7 de tipo selvagem de comprimento total.
[00264] Em modalidades particulares, o agente aqui divulgado é solúvel em água. Por exemplo, a solubilidade do agente pode ser aumentada usando um anticorpo específico para Frizzled ou seu fragmento, em vez de um domínio de ligação Frizzled palmitoilado de um polipeptídeo Wnt.
[00265] Um outro aspecto se refere a um ácido nucleico que codifica o agente conforme divulgado neste documento, em que o agente é uma proteína, polipeptídeo ou um peptídeo.
[00266] Por "codificação" entende-se que uma sequência de ácido nucleico ou parte(s) da mesma corresponde, em virtude do código genético de um organismo em questão a uma sequência de aminoácidos particular, por exemplo, a sequência de aminoácidos de uma ou mais proteínas desejadas ou polipeptídeos, ou para outra sequência de ácido nucleico em uma relação molde-produto de transcrição (por exemplo, RNA ou análogo de RNA).
[00267] Para permitir a expressão do ácido nucleico que codifica o agente conforme divulgado neste documento, em que o agente é uma proteína, polipeptídeo ou um peptídeo, o ácido nucleico pode ser inserido em um cassete de expressão de ácido nucleico e/ou vetor, como é bem conhecido na técnica.
[00268] Adequadamente, um outro aspecto se refere a um cassete de expressão de ácido nucleico compreendendo o ácido nucleico que codifica o agente como aqui divulgado, operacionalmente ligado a um promotor e/ou sinais reguladores da transcrição e tradução.
[00269] O termo "cassetes de expressão de ácido nucleico", tal como aqui utilizado, se refere a moléculas de ácido nucleico, tipicamente DNA, para as quais fragmentos de ácido nucleico, de preferência a molécula de ácido nucleico recombinante como aqui definido, podem ser inseridos para serem expressos, em que as referidas moléculas de ácido nucleico compreendem um ou mais sequências de ácido nucleico controlando a expressão dos fragmentos de ácido nucleico. Exemplos não limitativos de tais mais sequências de ácido nucleico que controlam a expressão dos fragmentos de ácido nucleico incluem sequências promotoras, quadros de leitura abertos e terminadores de transcrição.
[00270] Uma "ligação operável" é uma ligação em que as sequências regulatórias e as sequências que buscam ser expressas são conectadas de forma a permitir a referida expressão. Por exemplo, sequências, tais como, por exemplo, um promotor e um ORF, podem ser ditas operativamente ligadas se a natureza da ligação entre as referidas sequências não: (1) resultar na introdução de uma mutação por mudança da matriz de leitura, (2) interferir com a capacidade do promotor de dirigir a transcrição da ORF, (3) interferir na capacidade da ORF de ser transcrita a partir da sequência do promotor. Portanto, "operacionalmente ligado" pode significar incorporado em um construto genético de modo que as sequências de controle de expressão, como um promotor, controlem efetivamente a transcrição/expressão de uma sequência de interesse.
[00271] A natureza precisa das sequências regulatórias da transcrição e da tradução ou elementos necessários para a expressão pode variar entre os ambientes de expressão, mas normalmente incluem um terminador de transcrição e, opcionalmente, um intensificador.
[00272] A referência a um "promotor" deve ser tomada em seu contexto mais amplo e inclui sequências regulatórias da transcrição necessárias para o início da transcrição precisa e, quando aplicável, controle espacial e/ou temporal preciso da expressão do gene ou sua resposta, por exemplo, interno ou externo (por exemplo, estímulos exógenos). Mais particularmente, "promotor" pode representar uma região em uma molécula de ácido nucleico, de preferência uma molécula de DNA, à qual uma RNA polimerase se liga e inicia a transcrição. Um promotor está de preferência, mas não necessariamente, posicionado a montante, isto é, 5', da sequência cuja transcrição controla. Tipicamente, em procariotos, uma região promotora pode conter tanto o promotor per se quanto sequências que, quando transcritas em RNA, sinalizarão o início da síntese de proteínas (por exemplo, sequência de Shine-Dalgarno).
Uma sequência promotora também pode incluir "regiões potenciadoras", que são uma ou mais regiões do DNA que podem ser ligadas a proteínas (nomeadamente os fatores de ação trans) para aumentar os níveis de transcrição de genes em um agrupamento de genes. O intensificador, embora tipicamente na extremidade 5' de uma região codificadora, também pode ser separado de uma sequência promotora, por exemplo, pode estar dentro de uma região intrônica de um gene ou 3' para a região codificante do gene.
[00273] Em modalidades, os promotores contemplados neste documento podem ser constitutivos ou indutíveis. Um promotor constitutivo é entendido como um promotor cuja expressão é constante nas condições de cultura padrão.
Promotores induzíveis são promotores que respondem a uma ou mais pistas de indução. Por exemplo, um promotor indutível pode ser regulado quimicamente (por exemplo, um promotor cuja atividade transcricional é regulada pela presença ou ausência de um agente indutor químico, como um álcool, tetraciclina, um esteróide, um metal ou outra molécula pequena) ou fisicamente regulado (por exemplo, um promotor cuja atividade transcricional é regulada pela presença ou ausência de um indutor físico, como luz ou altas ou baixas temperaturas). Um promotor induzível também pode ser regulado indiretamente por um ou mais fatores de transcrição que são regulados diretamente por pistas químicas ou físicas. Exemplos não limitantes de promotores incluem T7, U6, H1, promotor LTR do vírus do sarcoma de Rous retroviral (RSV), o promotor do citomegalovírus (CMV), o promotor do SV40, o promotor da diidrofolato redutase, o promotor da β-actina, a fosfoglicerol quinase (PGK ), e o promotor EF1α.
[00274] Os termos "terminador" ou "terminador de transcrição" se referem geralmente a um elemento de sequência no final de uma unidade de transcrição que sinaliza a terminação da transcrição. Por exemplo, um terminador é geralmente posicionado a jusante de, isto é, 3' de ORF(s) que codificam um polipeptídeo de interesse.
Por exemplo, onde um ácido nucleico recombinante contém duas ou mais ORFs, por exemplo, sucessivamente ordenadas e formando juntas uma unidade de transcrição multicistrônica, um terminador de transcrição pode ser vantajosamente posicionado 3' para a ORF mais a jusante. Em modalidades particulares, o cassete de expressão de ácido nucleico compreende o ácido nucleico que codifica o agente como aqui divulgado, operacionalmente ligado a um ou mais promotores,
potencializadores, ORFs e/ou terminadores de transcrição.
[00275] Outro aspecto se refere ao vetor que compreende o ácido nucleico que codifica o agente conforme divulgado neste documento, ou o cassete de expressão de ácido nucleico conforme divulgado neste documento, tal como um vetor viral.
[00276] Os termos "vetor de expressão" ou "vetor", tal como aqui utilizados, se referem a moléculas de ácido nucleico, tipicamente DNA, para as quais fragmentos de ácido nucleico, de preferência a molécula de ácido nucleico recombinante como aqui definido, podem ser inseridos e clonados, isto é, propagados. Portanto, um vetor conterá tipicamente um ou mais locais de restrição únicos e pode ser capaz de replicação autônoma em uma célula definida ou organismo veículo de modo que a sequência clonada seja reproduzível. Um vetor também pode conter preferencialmente um marcador de seleção, tal como, por exemplo, um gene de resistência a antibióticos, para permitir a seleção de células receptoras que contêm o vetor. Os vetores podem incluir, sem limitação, plasmídeos, fagemídeos, bacteriófagos, vetores derivados de bacteriófagos, PAC, BAC, ácidos nucleicos lineares, por exemplo, DNA linear, transposons, vetores virais, etc., conforme apropriado (ver, por exemplo, Sambrook et al. , 1989; Ausubel 1992).
Os vetores virais podem incluir, inter alia, vetores retrovirais, vetores lentivirais, vetores adenovirais ou vetores virais adeno-associados, por exemplo, vetores baseados em HIV, SV40, EBV, HSV ou BPV. Os vetores de expressão são geralmente configurados para permitir e/ou efetuar a expressão de ácidos nucleicos ou quadros de leitura abertos introduzidos nos mesmos em um sistema de expressão desejado, por exemplo, in vitro, em uma célula, órgão e/ou organismo. Por exemplo, os vetores de expressão podem compreender vantajosamente sequências regulatórias adequadas.
[00277] Fatores de importância na seleção de um vetor particular incluem inter alia: escolha da célula receptora, facilidade com que as células receptoras que contêm o vetor podem ser reconhecidas e selecionadas das células receptoras que não contêm o vetor; o número de cópias do vetor que são desejadas em células receptoras particulares; se é desejado que o vetor se integre no cromossomo ou permaneça extra-cromossômico nas células receptoras; e se é desejável ser capaz de “transportar” o vetor entre células receptoras de espécies diferentes.
[00278] Os vetores de expressão podem ser autônomos ou integrativos. Um ácido nucleico pode ser introduzido em uma célula na forma de um vetor de expressão, como um plasmídeo, fago, transposon, cosmídeo ou partícula de vírus. O ácido nucleico recombinante pode ser mantido extracromossomicamente ou pode ser integrado no DNA cromossômico da célula. Os vetores de expressão podem conter genes marcadores de seleção que codificam proteínas necessárias para a viabilidade celular sob condições selecionadas (por exemplo, URA3, que codifica uma enzima necessária para a biossíntese de uracila, ou LEU2, que codifica uma enzima necessária para a biossíntese de leucina, ou TRP1, que codifica uma enzima necessária para a biossíntese de triptofano) para permitir a detecção e/ou seleção dessas células transformadas com os ácidos nucleicos desejados. Os vetores de expressão também podem incluir uma sequência de replicação autônoma (ARS). O ARS pode compreender um centrômero (CEN) e uma origem de replicação (ORI). Por exemplo, o ARS pode ser ARS18 ou ARS68.
[00279] Os vetores integrativos geralmente incluem uma sequência arranjada em série de pelo menos um primeiro fragmento de DNA inserível, um gene marcador selecionável e um segundo fragmento de DNA inserível. O primeiro e o segundo fragmentos de DNA inseríveis têm cerca de 200 (por exemplo, cerca de 250, cerca de 300, cerca de 350, cerca de 400, cerca de 450, cerca de 500 ou cerca de 1000 ou mais) nucleotídeos de comprimento e têm sequências de nucleotídeos que são homólogas às porções do DNA genômico da espécie celular a ser transformada. Uma sequência de nucleotídeos contendo um ácido nucleico de interesse para expressão é inserida neste vetor entre o primeiro e o segundo fragmentos de DNA inseríveis, seja antes ou depois do gene marcador. Os vetores integrativos podem ser linearizados antes da transformação para facilitar a integração da sequência de nucleotídeos de interesse no genoma da célula.
[00280] Antes de introduzir os vetores em uma célula de interesse, os vetores podem ser cultivados (por exemplo, amplificados) em células bacterianas, como Escherichia coli (E. coli). O DNA do vetor pode ser isolado de células bacterianas por qualquer um dos métodos conhecidos na técnica, que resultam na purificação do DNA do vetor do meio bacteriano. O DNA do vetor purificado pode ser extraído extensivamente com fenol, clorofórmio e éter, para garantir que nenhuma proteína de E. coli esteja presente na preparação do DNA do plasmídeo, uma vez que essas proteínas podem ser tóxicas para células de mamíferos.
[00281] Conforme observado neste relatório descritivo, um agente pode compreender uma proteína, polipeptídeo ou peptídeo. Tal pode ser obtido adequadamente através da expressão por células hospedeiras ou organismos hospedeiros, transformados com uma construção de expressão que codifica e configurada para a expressão da referida proteína, polipeptídeo ou peptídeo nas referidas células hospedeiras ou organismos hospedeiros, seguido pela purificação da proteína, polipeptídeo ou peptídeo.
[00282] Portanto, um outro aspecto fornece uma célula hospedeira compreendendo o ácido nucleico, cassete de expressão de ácido nucleico ou vetor como ensinado neste documento.
[00283] Em certas modalidades, a célula hospedeira pode ser uma célula bacteriana, uma célula de levedura, uma célula animal ou uma célula de mamífero.
[00284] Os termos "célula hospedeira" e "organismo hospedeiro" podem referir-se adequadamente a células ou organismos que abrangem tanto procariotos, como bactérias, e eucariotos, como leveduras, fungos, protozoários, plantas e animais. Contemplados como células hospedeiras são inter alia organismos unicelulares, tais como bactérias (por exemplo, E. coli, Salmonella tymphimurium, Serratia marcescens ou Bacillus subtilis), levedura (por exemplo, Saccharomyces cerevisiae ou Pichia pastoris), células vegetais (cultivadas) (por exemplo, de Arabidopsis thaliana ou Nicotiana tobaccum) e (cultivadas) células de animais (por exemplo, células de animais vertebrados, células de mamíferos, células de primatas, células humanas ou células de insetos). Contemplados como organismos hospedeiros estão inter alia, organismos multicelulares, tais como plantas e animais, preferencialmente animais, mais preferencialmente animais de sangue quente, ainda mais preferencialmente animais vertebrados, ainda mais preferencialmente mamíferos, ainda mais preferencialmente primatas; particularmente contemplados são os animais e as categorias de animais que não são humanos.
[00285] Tal proteína, polipeptídeo ou peptídeo pode ser isolado adequadamente. O termo "isolado" com referência a um componente específico (tal como, por exemplo, um ácido nucleico, proteína, polipeptídeo ou peptídeo) geralmente denota que tal componente existe em separação de - por exemplo, foi separado de ou preparado e/ou mantido em separação de - um ou mais outros componentes de seu ambiente natural. Por exemplo, uma proteína ou complexo humano ou animal isolado pode existir em separação de um corpo humano ou animal onde ocorre naturalmente. O termo "isolado", conforme usado aqui, pode preferencialmente também abranger o qualificador "purificado". Conforme usado aqui, o termo "purificado" com referência a peptídeos, polipeptídeos, proteínas ou ácidos nucleicos não requer pureza absoluta. Em vez disso, denota que tais peptídeos, polipeptídeos, proteínas ou ácidos nucleicos estão em um ambiente discreto em que sua abundância (convenientemente expressa em termos de massa ou peso ou concentração) em relação a outros analitos é maior do que na composição ou amostra de partida. Um ambiente discreto denota um único meio, como por exemplo uma única solução, gel, precipitado,
liofilizado, etc.
Ácidos nucleicos purificados, proteínas,
polipeptídeos ou peptídeos podem ser obtidos por métodos conhecidos incluindo, por exemplo, síntese laboratorial ou recombinante, cromatografia, eletroforese preparativa,
centrifugação, precipitação, purificação por afinidade,
etc.
Peptídeos, polipeptídeos ou proteínas purificados podem preferencialmente constituir em peso ³ 10%, mais preferencialmente ³ 50%, tal como ³ 60%, ainda mais preferencialmente ³ 70%, tal como ³ 80%, e ainda mais preferencialmente ³ 90%, tal como ³ 95%, ³ 96%, ³ 97%, ³
98%, ³ 99% ou mesmo 100% do conteúdo de proteína do ambiente discreto.
O teor de proteína pode ser determinado,
por exemplo, pelo método de Lowry (Lowry et al. 1951. J
Biol Chem 193: 265), opcionalmente como descrito por
Hartree 1972 (Anal Biochem 48: 422-427). A pureza dos peptídeos, polipeptídeos ou proteínas pode ser determinada por SDS-PAGE sob condições redutoras ou não redutoras usando azul de Coomassie ou, de preferência, coloração com prata.
A quantidade de ácidos nucléicos pode ser determinada medindo a absorbância A260. A pureza dos ácidos nucleicos pode ser determinada medindo a absorvância
A260/A280 ou por eletroforese em gel de agarose ou poliacrilamida e brometo de etídio ou coloração semelhante.
[00286] Além disso, existem vários outros métodos bem conhecidos de introdução de ácidos nucleicos em células animais, qualquer um dos quais pode ser usado aqui.
Na forma mais simples, o ácido nucleico pode ser injetado diretamente na célula alvo/tecido alvo.
Outros métodos incluem a fusão da célula receptora com protoplastos bacterianos contendo o ácido nucleico, o uso de composições como cloreto de cálcio, cloreto de rubídio, cloreto de lítio, fosfato de cálcio, DEAE dextrano, lipídios catiônicos ou lipossomas ou métodos como endocitose mediada por receptor, bombardeamento de partículas biolísticas
(método de "arma genética"), infecção com vetores virais
(isto é, derivados de lentivírus, vírus adeno-associados
(AAV), adenovírus, retrovírus ou antivírus), eletroporação e semelhantes.
Outras técnicas ou métodos que são adequados para a entrega de moléculas de ácido nucleico para células alvo incluem a entrega contínua de uma molécula de NA a partir de microesferas poliméricas poli (ácido lácticocoglicólico) ou a injeção direta de molécula(s) NA protegida (estabilizada) em microbombas entregando o produto.
Outra possibilidade é o uso de microesferas biodegradáveis de liberação de fármaco implantáveis.
Também é considerada a encapsulação de NA em vários tipos de lipossomas (imunolipossomas, PEGuilados (imuno)
lipossomas), lipídios catiônicos e polímeros,
nanopartículas ou dendrímeros, poli (ácido lácticocoglicólico) microesferas poliméricas, microesferas biodegradáveis de liberação de drogas implantáveis, etc. .; e coinjeção de NA com agente protetor como o ácido aurintricarboxílico inibidor de nuclease. Deve ficar claro que também pode ser usada uma combinação de diferentes modos ou métodos de entrega mencionados acima.
[00287] Em modalidades particulares, o vetor que compreende o ácido nucleico conforme descrito aqui é um vetor viral, de preferência um vetor viral direcionado especificamente para o sistema nervoso central e/ou periférico (por exemplo, um vetor viral específico para o cérebro). Em outras modalidades particulares, o vetor viral é um mutante do serótipo 9 (AAV9) do vírus adeno-associado específico do neurônio do sistema nervoso central (CNS).
Por exemplo, o vetor viral é o vetor viral AAV-PHP.B ou AAV-PHP.eB específico da célula CNS exibindo o peptídeo SAQTLAVPFKA (SEQ ID NO: 55) ou SDGTLAVPFKA (SEQ ID NO: 56), conforme descrito em Deverman et al. (Deverman et al., Nat Biotechnol, 34: 204-209 (2016) e Chan et al. (Chan et al., Nat Neurosci, 20 (8): 1172-1179 (2017)).
[00288] Em modalidades preferidas, o vetor viral é um vetor viral específico para células endoteliais da barreira hematoencefálica. Em outras modalidades preferidas, o vetor viral é um mutante do vírus adeno-
associado do capsídeo da barreira hematoencefálica específico da célula endotelial. Por exemplo, o vetor viral é o vetor viral AAV-BR1 específico para células endoteliais da barreira hematoencefálica exibindo o peptídeo NRGTEWD (SEQ ID NO: 57) conforme descrito em Körbelin et al.
(Körbelin et al., EMBO Molecular Medicine, 8, 609-625 (2016)).
[00289] Um outro aspecto se refere a uma composição farmacêutica compreendendo o agente como aqui divulgado, o ácido nucleico que codifica o agente como aqui divulgado, o cassete de expressão de ácido nucleico como aqui divulgado ou o vetor como aqui divulgado e um transportador farmaceuticamente aceitável. Essas formulações ou composições farmacêuticas podem ser compreendidas em um kit de partes.
[00290] O termo "farmaceuticamente aceitável", conforme usado aqui, é consistente com a técnica e significa compatível com os outros ingredientes de uma composição farmacêutica e não prejudicial para o receptor.
[00291] Como usados aqui, "transportador" ou "excipiente" inclui todos e quaisquer solventes, diluentes, tampões (tais como, por exemplo, solução salina tamponada neutra ou solução salina tamponada com fosfato), solubilizantes, coloides, meios de dispersão, veículos, cargas, agentes quelantes como, por exemplo, EDTA ou glutationa), aminoácidos (como, por exemplo, glicina), proteínas, desintegrantes, aglutinantes, lubrificantes, agentes umectantes, emulsificantes, adoçantes, corantes, aromatizantes, aromatizantes, espessantes, agentes para alcançar um efeito de depósito, revestimentos, agentes antifúngicos, conservantes, antioxidantes, agentes de controle de tonicidade, agentes de retardamento da absorção e semelhantes. O uso de tais meios e agentes para substâncias farmacêuticas ativas é bem conhecido na técnica. Exceto na medida em que qualquer meio ou agente convencional seja incompatível com a substância ativa, seu uso nas composições terapêuticas pode ser contemplado.
[00292] Os carreadores ilustrativos e não limitativos para uso na formulação das composições farmacêuticas incluem, por exemplo, emulsões óleo-em-água ou água-em-óleo, composições aquosas com ou sem inclusão de cosolventes orgânicos adequados para uso intravenoso (IV), lipossomas ou vesículas contendo surfactante, microesferas, microesferas e microssomas, pós, comprimidos, cápsulas, supositórios, suspensões aquosas, aerossóis e outros transportadores evidentes para um especialista na técnica.
[00293] As composições farmacêuticas, conforme pretendidas neste documento, podem ser formuladas para essencialmente qualquer via de administração, tal como, sem limitação, administração oral (como, por exemplo, ingestão oral ou inalação), administração intranasal (como, por exemplo, inalação intranasal ou aplicação na mucosa intranasal), administração parenteral (como, por exemplo, subcutânea, intravenosa (IV), intramuscular, intraperitoneal ou intrasternal injeção ou infusão), transdérmica ou transmucosa (como, por exemplo, oral, sublingual, intranasal) administração, administração tópica, retal, vaginal ou intra -instilação traqueal e semelhantes. Desta forma, os efeitos terapêuticos atingíveis pelos métodos e composições podem ser, por exemplo, sistêmicos, locais, específicos do tecido, etc., dependendo das necessidades específicas de uma dada aplicação.
[00294] Por exemplo, para administração oral, as composições farmacêuticas podem ser formuladas na forma de pílulas, comprimidos, comprimidos lacados, comprimidos revestidos (por exemplo, revestidos com açúcar), grânulos, cápsulas de gelatina dura e mole, soluções aquosas, alcoólicas ou oleosas, xaropes, emulsões ou suspensões. Em um exemplo, sem limitação, a preparação de formas de dosagem oral pode ser adequadamente realizada misturando uniforme e intimamente uma quantidade adequada do agente, conforme divulgado neste documento na forma de um pó, opcionalmente incluindo também finamente dividido um ou mais transportadores sólidos, e formular a mistura em uma pílula, comprimido ou cápsula. Carreadores sólidos exemplificativos, mas não limitantes, incluem fosfato de cálcio, estearato de magnésio, talco, açúcares (como, por exemplo, glicose, manose, lactose ou sacarose), álcoois de açúcar (como, por exemplo, manitol), dextrina, amido, gelatina, celulose , polivinilpirrolidina, ceras de baixo ponto de fusão e resinas de troca iônica. Os comprimidos comprimidos contendo a composição farmacêutica podem ser preparados misturando uniforme e intimamente o agente, conforme divulgado neste documento, com um transportador sólido, tal como descrito acima para fornecer uma mistura com as propriedades de compressão necessárias e, em seguida, compactando a mistura em uma máquina adequada para a forma e tamanho desejado. Os comprimidos moldados podem ser feitos por moldagem em uma máquina adequada, uma mistura de composto em pó umedecido com um diluente líquido inerte. Os veículos adequados para cápsulas de gelatina mole e supositórios são, por exemplo, gorduras, ceras, polióis semi-sólidos e líquidos, óleos naturais ou endurecidos, etc.
[00295] Por exemplo, para aerossol oral ou nasal ou administração por inalação, as composições farmacêuticas podem ser formuladas com transportadores ilustrativos, tais como, por exemplo, como em solução com solução salina, polietilenoglicol ou glicóis, DPPC, metilcelulose ou em mistura com agentes dispersantes em pó, ainda empregando álcool benzílico ou outros conservantes adequados, promotores de absorção para aumentar a biodisponibilidade, fluorocarbonos e/ou outros agentes de solubilização ou dispersão conhecidos na técnica. As formulações farmacêuticas adequadas para administração na forma de aerossóis ou sprays são, por exemplo, soluções, suspensões ou emulsões dos agentes como aqui ensinados ou seus sais fisiologicamente toleráveis em um solvente farmaceuticamente aceitável, como etanol ou água, ou uma mistura de tais solventes. Se necessário, a formulação também pode conter outros auxiliares farmacêuticos, como surfactantes, emulsificantes e estabilizantes, bem como um propulsor. Ilustrativamente, a entrega pode ser por meio da utilização de um dispositivo de entrega de uso único, um nebulizador de névoa, um inalador de pó ativado pela respiração, um inalador dosimetrado de aerossol (MDI) ou qualquer outro dos numerosos dispositivos de entrega de nebulizador disponíveis na técnica. Além disso, tendas de nebulização ou administração direta por meio de tubos endotraqueais também podem ser usadas.
[00296] Exemplos de carreadores para administração via superfícies mucosas dependem da via particular, por exemplo, oral, sublingual, intranasal, etc. Quando administrados por via oral, exemplos ilustrativos incluem graus farmacêuticos de manitol, amido, lactose, estearato de magnésio, sacarídeo de sódio, celulose, carbonato de magnésio e semelhantes, sendo o manitol preferido. Quando administrados por via intranasal, os exemplos ilustrativos incluem polietilenoglicol, fosfolipídios, glicóis e glicolipídios, sacarose e/ou metilcelulose, suspensões em pó com ou sem agentes de volume como lactose e conservantes como cloreto de benzalcônio, EDTA. Em uma modalidade particularmente ilustrativa, o fosfolipídeo 1,2 dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC) é usado como um transportador aquoso isotônico em cerca de 0,01-0,2% para administração intranasal do composto da invenção em questão a uma concentração de cerca de 0,1 a 3,0 mg/ml.
[00297] Por exemplo, para administração parenteral, as composições farmacêuticas podem ser vantajosamente formuladas como soluções, suspensões ou emulsões com solventes, diluentes, solubilizantes ou emulsificantes adequados, etc. Os solventes adequados são, sem limitação, água, solução salina fisiológica ou álcoois, por exemplo, etanol, propanol, glicerol, além de também soluções de açúcar, como glicose, açúcar invertido, soluções de sacarose ou manitol, ou alternativamente misturas dos vários solventes mencionados. As soluções ou suspensões injetáveis podem ser formuladas de acordo com a técnica conhecida, usando diluentes ou solventes adequados não tóxicos parentericamente aceitáveis, tais como manitol,
1,3-butanodiol, água, solução de Ringer ou solução isotônica de cloreto de sódio, ou dispersante adequado ou agentes molhantes e de suspensão, tais como óleos fixos estéreis, brandos, incluindo mono- ou diglicerídeos sintéticos, e ácidos graxos, incluindo ácido oleico.
Os agentes e seus sais farmaceuticamente aceitáveis da invenção também podem ser liofilizados e os liofilizados obtidos usados, por exemplo, para a produção de preparações para injeção ou infusão.
Por exemplo, um exemplo ilustrativo de um transportador para uso intravenoso inclui uma mistura de 10% USP etanol, 40% USP propilenoglicol ou polietilenoglicol 600 e o restante USP Água para Injeção
(WFI). Outros transportadores ilustrativos para uso intravenoso incluem etanol USP a 10% e WFI USP; 0,01-0,1%
de trietanolamina em USP WFI; ou 0,01-0,2% de dipalmitoil difosfatidilcolina em USP WFI; e 1-10% de esqualeno ou emulsão parentérica de óleo vegetal em água.
Exemplos ilustrativos de transportadores para uso subcutâneo ou intramuscular incluem solução salina tamponada com fosfato
(PBS), 5% de dextrose em WFI e 0,01-0,1% de trietanolamina em 5% de dextrose ou 0,9% de cloreto de sódio em USP WFI,
ou 1 a 2 ou 1 a 4 mistura de 10% de etanol USP, 40% de propilenoglicol e o restante de uma solução isotônica aceitável, como 5% de dextrose ou 0,9% de cloreto de sódio;
ou 0,01-0,2% de dipalmitoil difosfatidilcolina em USP WFI e 1 a 10% de esqualeno ou emulsões parentéricas de óleo vegetal em água.
[00298] Onde as formulações aquosas são preferidas, tais podem compreender um ou mais surfactantes. Por exemplo, a composição pode estar na forma de uma dispersão micelar compreendendo pelo menos um surfactante adequado, por exemplo, um surfactante fosfolipídico. Exemplos ilustrativos de fosfolipídios incluem diacil fosfatidil gliceróis, tais como dimiristoil fosfatidil glicerol (DPMG), dipalmitoil fosfatidil glicerol (DPPG) e diestearoil fosfatidil glicerol (DSPC), diacil-fosfatidil glicerol (DPMG), dipalmitoil fosfatidil glicerol (DPPG) e diestearoil fosfatidil glicerol (DSPC), diacil- fosfatidilglicerol (DPMG), dipalmitoil fosfatidil glicerol (DPPG) e diestearoil fosfatidil glicerol (DSPC), diacil- fosfatidil fosfatidil colinas (DPPG) e diestearoilfosfatidilcolina (DSPC); ácidos diacilfosfatídicos, tais como ácido dimiristoil fosfatídico (DPMA), ácido dipahnitoil fosfatídico (DPPA) e ácido diestearoil fosfatídico (DSPA); e diacilfosfatidiletanolaminas, tais como dimiristoilfosfatidil etanolamina (DPME), dipalmitoilfosfatidil etanolamina (DPPE) e diestearoilfosfatidil etanolamina (DSPE). Normalmente, uma razão molar surfactante: substância ativa em uma formulação aquosa será de cerca de 10:1 a cerca de 1:10, mais tipicamente de cerca de 5:1 a cerca de 1:5, no entanto, qualquer quantidade eficaz de surfactante pode ser usada em um formulação aquosa para melhor atender aos objetivos específicos de interesse.
[00299] Quando administrados por via retal na forma de supositórios, essas formulações podem ser preparadas misturando os compostos de acordo com a invenção com um excipiente não irritante adequado, como manteiga de cacau, ésteres de glicerídeo sintético ou polietilenoglicóis, que são sólidos em temperaturas comuns, mas liquidificar e/ou dissolver na cavidade retal para liberar o medicamento.
[00300] Veículos adequados para microcápsulas, implantes ou bastonetes são, por exemplo, copolímeros de ácido glicólico e ácido láctico.
[00301] Um especialista nesta técnica reconhecerá que a descrição acima é ilustrativa e não exaustiva. Na verdade, muitas técnicas de formulações adicionais e excipientes farmaceuticamente aceitáveis e soluções transportadoras são bem conhecidos por técnicos no assunto, como é o desenvolvimento de dosagens adequadas e regimes de tratamento para usar as composições particulares aqui descritas em uma variedade de regimes de tratamento.
[00302] Em modalidades preferidas, o agente, o ácido nucleico que codifica o agente, o cassete de expressão de ácido nucleico que compreende o ácido nucleico, o vetor que compreende o ácido nucleico ou o cassete de expressão de ácido nucleico, a célula hospedeira ou a composição farmacêutica como aqui ensinado é administrado parenteralmente. Mais preferencialmente, o agente, o ácido nucleico que codifica o agente, o cassete de expressão de ácido nucleico que compreende o ácido nucleico ou o vetor que compreende o ácido nucleico, o cassete de expressão de ácido nucleico, a célula hospedeira ou a composição farmacêutica como aqui ensinado é administrado por via intravenosa, por exemplo, por infusão.
[00303] Em modalidades particulares, o agente, o ácido nucleico que codifica o agente ou o cassete de expressão de ácido nucleico compreendendo o ácido nucleico como ensinado neste documento é usado em terapia gênica. Em outras modalidades particulares, o agente, o ácido nucleico que codifica o agente ou o cassete de expressão de ácido nucleico compreendendo o ácido nucleico como aqui ensinado é usado em terapia gênica dirigida ao sistema nervoso central e/ou periférico, tal como terapia gênica dirigida ao cérebro, mais particularmente terapia genética dirigida por células endoteliais de barreira hematoencefálica.
[00304] Adequadamente, também é fornecido neste documento um método para terapia gênica, em particular terapia gênica dirigida ao sistema nervoso central e/ou periférico, em um sujeito com necessidade da referida terapia gênica, compreendendo: introdução no sujeito, em particular no centro e/ou sistema nervoso periférico do sujeito, uma cassete de expressão de ácido nucleico ou um vetor como aqui descrito; e expressar uma quantidade terapeuticamente eficaz do agente codificado pelo ácido nucleico como aqui ensinado no sujeito, em particular o sistema nervoso central e/ou periférico do sujeito.
[00305] O termo "terapia gênica", tal como aqui utilizado, se refere à introdução de um polinucleotídeo exógeno em uma célula hospedeira para fins terapêuticos ou profiláticos, independentemente do método usado para a introdução. Tais métodos incluem uma variedade de técnicas bem conhecidas, tais como transferência de genes mediada por vetor (por exemplo, infecção/transfecção viral ou vários outros complexos de entrega de genes baseados em proteínas ou lipídios) como descrito neste relatório descritivo. O polinucleotídeo introduzido pode ser estável ou transitoriamente mantido na célula hospedeira. A manutenção estável normalmente requer que o polinucleotídeo introduzido contenha uma origem de replicação compatível com a célula hospedeira ou se integre em um replicon da célula hospedeira, como um replicon extracromossômico (por exemplo, um plasmídeo) ou um cromossomo nuclear ou mitocondrial. Vários vetores são conhecidos por serem capazes de mediar a transferência de genes para células de mamíferos, como é conhecido na técnica. Por exemplo, a transferência de gene mediada por vetor do agente, o ácido nucleico que codifica o agente, o cassete de expressão de ácido nucleico compreendendo o ácido nucleico, como ensinado neste documento, pode ser realizado usando um vetor viral especificamente direcionado para o sistema nervoso central e/ou periférico (por exemplo, vetor viral AAV-PHP.B e AAV-PHP.eB) ou um vetor viral específico para células endoteliais da barreira hematoencefálica (por exemplo, vetor viral AAV-BR1) como descrito neste relatório descritivo.
[00306] Em modalidades particulares, o ácido nucleico que codifica o agente, o cassete de expressão de ácido nucleico que compreende o ácido nucleico, o vetor que compreende o ácido nucleico ou o cassete de expressão de ácido nucleico ou a composição farmacêutica como aqui ensinado é administrado ao sujeito pela injeção (por exemplo, por via intravenosa) ou transplante de células alogênicas transformadas com o vetor que compreende o ácido nucleico ou o cassete de expressão de ácido nucleico como aqui ensinado. Quando administradas, as células alogênicas injetadas ou transplantadas irão transcrever e traduzir o ácido nucleico que codifica o agente como ensinado neste documento in vivo. A dosagem ou quantidade do agente como aqui ensinado, opcionalmente em combinação com um ou mais outros compostos ativos a serem administrados, depende do caso individual e é, como é habitual, para ser adaptado às circunstâncias individuais para atingir um efeito ótimo.
Assim, a dose unitária e o regime dependem da natureza e da gravidade do distúrbio a ser tratado, e também de fatores como a espécie do sujeito, o sexo, idade, peso corporal, saúde geral, dieta, modo e tempo de administração, estado imunológico e capacidade de resposta individual do humano ou animal a ser tratado, eficácia, estabilidade metabólica e duração da ação dos compostos usados, se a terapia é aguda ou crônica ou profilática, ou se outros compostos ativos são administrados em além do agente da invenção. A fim de otimizar a eficácia terapêutica, o agente como aqui ensinado pode ser administrado primeiro em diferentes regimes de dosagem. Normalmente, os níveis do agente em um tecido podem ser monitorados usando ensaios de triagem apropriados como parte de um procedimento de teste clínico, por exemplo, para determinar a eficácia de um determinado regime de tratamento. A frequência de dosagem está dentro das habilidades e julgamento clínico dos médicos (por exemplo, médicos, veterinários ou enfermeiras).
Normalmente, o regime de administração é estabelecido por ensaios clínicos que podem estabelecer parâmetros de administração ideais. No entanto, o médico pode variar esses regimes de administração de acordo com um ou mais dos fatores acima mencionados, por exemplo, idade, saúde, peso, sexo e estado médico do sujeito. A frequência da dosagem pode variar dependendo se o tratamento é profilático ou terapêutico.
[00307] A toxicidade e a eficácia terapêutica do agente como aqui descrito ou composições farmacêuticas compreendendo o mesmo podem ser determinadas por procedimentos farmacêuticos conhecidos em, por exemplo, culturas de células ou animais experimentais. Estes procedimentos podem ser usados, por exemplo, para determinar o LD50 (a dose letal para 50% da população) e o ED50 (a dose terapeuticamente eficaz em 50% da população).
A proporção da dose entre os efeitos tóxicos e terapêuticos é o índice terapêutico e pode ser expressa como a proporção LD50/ED50. As composições farmacêuticas que exibem altos índices terapêuticos são preferidas. Embora as composições farmacêuticas que exibem efeitos colaterais tóxicos possam ser usadas, deve-se tomar cuidado para projetar um sistema de entrega que direcione tais compostos para o local do tecido afetado, a fim de minimizar o dano potencial às células normais (por exemplo, células não alvo) e, assim, reduza os efeitos colaterais.
[00308] Os dados obtidos a partir dos ensaios de cultura de células e estudos em animais podem ser usados na formulação de uma gama de dosagem para uso em indivíduos apropriados. A dosagem de tais composições farmacêuticas encontra-se geralmente dentro de uma faixa de concentrações circulantes que incluem o ED50 com pouca ou nenhuma toxicidade. A dosagem pode variar dentro deste intervalo dependendo da forma de dosagem empregue e da via de administração utilizada. Para uma composição farmacêutica usada como aqui descrito, a dose terapeuticamente eficaz pode ser estimada inicialmente a partir de ensaios de cultura de células. Uma dose pode ser formulada em modelos animais para atingir uma faixa de concentração plasmática circulante que inclui o IC50 (isto é, a concentração da composição farmacêutica que atinge metade da inibição máxima dos sintomas) conforme determinado em cultura de células. Essas informações podem ser usadas para determinar com mais precisão as doses úteis em humanos. Os níveis no plasma podem ser medidos, por exemplo, por cromatografia líquida de alta eficiência.
[00309] Sem limitação, dependendo do tipo e gravidade da doença, uma dosagem típica (por exemplo, uma dosagem diária típica ou uma dosagem intermitente típica, por exemplo, uma dosagem típica para cada dois dias, a cada três dias, a cada quatro dias, a cada cinco dias , a cada seis dias, a cada semana, a cada 1,5 semanas, a cada duas semanas, a cada três semanas, a cada mês ou outro) do agente como ensinado neste documento pode variar de cerca de 10 µg/kg a cerca de 500 µg/kg de peso corporal do sujeito, por dose, dependendo dos fatores mencionados acima, por exemplo, como 20-400 µg/kg ou 20-200 µg/kg ou 20-100 µg/kg ou 40-80 µg/kg de peso corporal do sujeito.
[00310] Por meio de exemplo e sem limitação, o agente como ensinado neste documento pode ser administrado a cerca de 5 µg/kg, ou a cerca de 10 µg/kg, ou a cerca de 15 µg/kg, ou a cerca de 20 µg/kg, ou a cerca de 25 µg/kg, ou cerca de 30 µg/kg, ou cerca de 35 µg/kg, ou cerca de 40 µg/kg, ou cerca de 45 µg/kg, ou cerca de 50 mg/kg, ou cerca de 60 µg/kg, ou a cerca de 70 µg/kg, ou a cerca de 80 µg/kg, ou a cerca de 90 µg/kg, ou a cerca de 100 µg/kg, ou a cerca de 200 µg/kg, ou a cerca de 300 µg/kg , ou a cerca de 400 µg/kg, ou a cerca de 500 µg/kg por dose.
[00311] Em modalidades particulares, o agente como ensinado neste documento é administrado usando um sistema de entrega sustentada, tal como um sistema de entrega sustentada (parcialmente) implantado. Uma pessoa qualificada compreenderá que tal sistema de entrega sustentada pode compreender um reservatório para conter o agente como ensinado neste documento, uma bomba e meios de infusão (por exemplo, um sistema de tubulação). Por exemplo, o sistema de entrega sustentada pode ser um sistema de bomba mini-osmótica implantado no cérebro.
[00312] Em uma modalidade particular, o agente conforme divulgado neste documento é o principal ou único ingrediente ativo da composição farmacêutica.
[00313] Um outro aspecto se refere ao agente como aqui divulgado, o ácido nucleico que codifica o agente como aqui divulgado, a cassete de expressão de ácido nucleico como aqui divulgado, o vetor como aqui divulgado ou a composição farmacêutica como aqui divulgada, para uso como um medicamento.
[00314] Um outro aspecto se refere ao agente como aqui divulgado, o ácido nucleico que codifica o agente como aqui divulgado, o cassete de expressão de ácido nucleico como aqui divulgado, o vetor como aqui divulgado ou a composição farmacêutica como aqui divulgada, para uso na prevenção ou tratamento de um distúrbio neurovascular ou um distúrbio do sistema nervoso central (SNC) que compreende disfunção neurovascular.
[00315] Os termos "tratar" ou "tratamento" abrangem tanto o tratamento terapêutico de uma doença ou condição já desenvolvida, como a terapia de um distúrbio neurovascular já desenvolvido ou um distúrbio do sistema nervoso central (SNC) compreendendo disfunção neurovascular, bem como profilático ou medidas preventivas, em que o objetivo é prevenir ou diminuir as chances de incidência de uma afecção indesejada, como prevenir a ocorrência, desenvolvimento e progressão de um distúrbio neurovascular ou um distúrbio do SNC que inclua disfunção neurovascular.
Os resultados clínicos benéficos ou desejados podem incluir, sem limitação, o alívio de um ou mais sintomas ou um ou mais marcadores biológicos, diminuição da extensão da doença, estado estabilizado (ou seja, sem agravamento) da doença, retardo ou desaceleração da progressão da doença, melhoria ou paliação do estado de doença e semelhantes.
“Tratamento” também pode significar prolongar a sobrevida em comparação com a sobrevida esperada se não receber tratamento.
[00316] Os termos "distúrbio neurovascular" ou "doença neurovascular", conforme usados aqui, se referem a uma doença ou alteração ou condição patológica que afeta o sistema vascular cerebral e/ou o sistema vascular que fornece a medula espinhal. Os termos abrangem qualquer anormalidade dos vasos sanguíneos dentro ou que irrigam o cérebro e/ou coluna vertebral. As anormalidades podem ser sem limitação (i) estreitamento das artérias que reduz o fluxo sanguíneo para o cérebro que pode levar a hipóxia, isquemia ou acidente vascular cerebral e/ou (ii) enfraquecimento das artérias que pode levar a aneurismas cerebrais e aumentar o risco de sangramento intracraniano.
Exemplos não limitativos de doenças neurovasculares são acidente vascular cerebral isquêmico, acidente vascular cerebral hemorrágico, lesão de isquemia/reperfusão, aneurismas cerebrais, malformações arteriovenosas (MAVs), malformações cavernosas, vasculite, hemorragia cerebral, hemorragia subaracnóide, malformações vasculares espinhais, estenose da artéria carótida, doença de Moyamoya, aterosclerose intracraniana.
[00317] As frases "distúrbio do sistema nervoso central (SNC) compreendendo disfunção neurovascular" ou "doença do SNC compreendendo disfunção neurovascular", como aqui utilizadas, se referem a um grupo de distúrbios neurológicos que afetam a estrutura e/ou função do cérebro e/ou medula espinhal, que coletivamente formam o SNC, que são causados por, contribuem para ou tipificados por disfunção neurovascular, ou que levam a uma anormalidade da estrutura e/ou função dos vasos sanguíneos dentro ou que irrigam o cérebro e/ou coluna vertebral. Exemplos não limitantes de doenças do sistema nervoso central (SNC) que compreendem disfunção neurovascular são esclerose múltipla, acidente vascular cerebral isquêmico, câncer cerebral, epilepsia, demência, demência vascular, demência associada ao HIV-1, doença de Alzheimer, doença de Parkinson, doença de Huntington, amiotrófico lateral esclerose, doenças infecciosas do cérebro, lesões cerebrais traumáticas, enxaqueca e encefalopatia traumática crônica.
[00318] Exceto quando indicado, os termos "sujeito" ou "paciente" podem ser usados indistintamente e se referem a animais, de preferência animais de sangue quente, mais preferencialmente vertebrados, ainda mais preferencialmente mamíferos, ainda mais preferencialmente primatas, e incluem especificamente pacientes humanos e não mamíferos e primatas humanos. Os sujeitos preferidos são os humanos. Os termos "sujeito" ou "paciente" incluem sujeitos com necessidade de tratamento, mais particularmente sujeitos que se beneficiariam do tratamento de uma determinada condição, particularmente um distúrbio neurovascular ou um distúrbio do sistema nervoso central (SNC) que compreende disfunção neurovascular. Tais sujeitos podem incluir, sem limitação, aqueles que foram diagnosticados com a referida condição, aqueles propensos a desenvolver a referida condição e/ou aqueles em que a referida condição deve ser evitada.
[00319] Os produtos e métodos aqui ensinados permitem administrar uma quantidade terapeuticamente e/ou profilaticamente eficaz de um agente como aqui ensinado, um ácido nucleico que codifica o agente como aqui divulgado, um cassete de expressão de ácido nucleico como aqui divulgado, um vetor como aqui divulgado ou uma composição farmacêutica como aqui divulgada, em indivíduos com um distúrbio neurovascular ou um distúrbio do SNC que se beneficiarão de tal tratamento. O termo "quantidade terapeuticamente eficaz", tal como aqui utilizado, se refere a uma quantidade de composto ativo ou agente farmacêutico que provoca a resposta biológica ou medicinal em um sujeito que está sendo procurado por um cirurgião, pesquisador, veterinário, médico ou outro clínico, que pode incluir, inter alia, o alívio dos sintomas da doença ou condição a ser tratada. O termo "quantidade profilaticamente eficaz" se refere a uma quantidade de um composto ativo ou agente farmacêutico que inibe ou retarda em um sujeito o início de um distúrbio conforme procurado por um pesquisador, veterinário, médico ou outro clínico.
Os métodos são conhecidos na técnica para determinar doses terapeuticamente e/ou profilaticamente eficazes de um agente, um ácido nucleico que codifica o agente, um cassete de expressão de ácido nucleico ou uma composição farmacêutica, como ensinado neste documento.
[00320] O termo "dose terapeuticamente eficaz", como aqui utilizado, se refere a uma quantidade de um agente, um ácido nucleico que codifica o agente, um cassete de expressão de ácido nucleico ou uma composição farmacêutica, como ensinado neste documento, que quando administrado traz uma resposta terapêutica positiva com no que diz respeito ao tratamento de um paciente com um distúrbio neurovascular ou um distúrbio do SNC.
[00321] Doses terapeuticamente eficazes apropriadas de um agente, um ácido nucleico que codifica o agente, um cassete de expressão de ácido nucleico ou uma composição farmacêutica, como aqui ensinado, podem ser determinadas por um médico qualificado com a devida consideração à natureza da condição e gravidade da doença, e a idade, tamanho e condição do paciente.
[00322] Um outro aspecto fornece um método de tratamento de um distúrbio neurovascular ou um distúrbio do SNC compreendendo disfunção neurovascular em um sujeito em necessidade de tal tratamento, compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente como aqui divulgado, o ácido nucleico que codifica o agente como aqui divulgado , o cassete de expressão de ácido nucleico como aqui divulgado, o vetor como aqui divulgado ou a composição farmacêutica como aqui divulgada, para o sujeito.
[00323] Um outro aspecto fornece o uso de um agente como aqui divulgado, o ácido nucleico que codifica o agente como aqui divulgado, o cassete de expressão de ácido nucleico como aqui divulgado, o vetor como aqui divulgado ou a composição farmacêutica como aqui divulgada, para a fabricação de um medicamento para o tratamento de um distúrbio neurovascular ou um distúrbio do SNC compreendendo disfunção neurovascular.
[00324] Em modalidades particulares, o referido distúrbio neurovascular é selecionado a partir do grupo que consiste em acidente vascular cerebral isquêmico, acidente vascular cerebral hemorrágico, lesão de isquemia/reperfusão, aneurismas cerebrais, malformações arteriovenosas (MAVs), malformações cavernosas, vasculite, hemorragia cerebral, hemorragia subaracnoide, malformações vasculares espinhais, carótidas estenose da artéria, doença de Moyamoya e aterosclerose intracraniana e suas combinações.
[00325] Em modalidades particulares, o referido distúrbio do SNC que compreende disfunção neurovascular é selecionado do grupo que consiste em esclerose múltipla, acidente vascular cerebral isquêmico, câncer cerebral, epilepsia, demência, demência vascular, demência associada ao HIV-1, doença de Alzheimer, doença de Parkinson, doença de Huntington, amiotrófico esclerose lateral, doenças cerebrais infecciosas, lesões cerebrais traumáticas, enxaqueca, encefalopatia traumática crônica e suas combinações.
[00326] Um outro aspecto se refere a um método in vitro para identificar um agente útil como um terapêutico, tal como útil para a prevenção ou tratamento de um distúrbio neurovascular ou um distúrbio do SNC compreendendo disfunção neurovascular, o referido método compreendendo determinar se um agente de teste ativa a sinalização Wnt mediada pelo complexo receptor GPR124/RECK/Frizzled/LRP, mas não pela sinalização Wnt mediada pelo complexo receptor Frizzled/LRP na ausência de RECK e/ou GPR124. O termo "in vitro" geralmente denota fora ou externamente a um corpo, por exemplo, um animal ou corpo humano. O termo também abrange “ex vivo”. Um exemplo de "in vitro" é em cultura de células de tecido.
[00327] O termo "agente de teste", tal como aqui utilizado, se refere a qualquer substância química (por exemplo, inorgânica ou orgânica), substância bioquímica ou biológica, molécula ou macromolécula (por exemplo, macromolécula biológica), uma combinação ou mistura dos mesmos, uma amostra de composição indeterminada ou um extrato feito de materiais biológicos, como bactérias, fungos, plantas ou células animais ou tecidos dos quais se deseja determinar se ativa a sinalização Wnt mediada por GPR124/RECK/Frizzled/LRP, mas não a sinalização Wnt mediada por Frizzled/LRP no ausência de RECK e/ou GPR124.
[00328] A determinação da ativação ou falta de ativação da sinalização Wnt mediada pelo complexo receptor GPR124/RECK/Frizzled/LRP e a sinalização Wnt mediada pelo complexo receptor Frizzled/LRP pode ser determinada como descrito neste relatório descritivo. Por exemplo, as células transfectadas transitoriamente com um plasmídeo
Super TOPFlash (por exemplo, plasmídeo Super 8x TOPFlash, plasmídeo Addgene#12456) ou uma linha celular repórter Super TOPFlash transfectada de forma estável (por exemplo, linha de células HEK293 STF) podem ser (co) transfectadas com plasmídeos que codificam Frizzled, LRP, GPR124 e/ou polipeptídeos Reck, e ser usado para determinar a atividade de luciferase das células em resposta à adição do agente de teste como uma indicação da atividade de sinalização Wnt nas ditas células.
[00329] Em modalidades particulares, o método in vitro para identificar um agente útil como terapêutico, conforme divulgado neste documento, compreende o contato do agente de teste com uma célula capaz de sinalização Wnt mediada pelo complexo receptor GPR124/RECK/Frizzled/LRP e medição da referida sinalização Wnt, e contatar o agente de teste com uma célula capaz de sinalização Wnt mediada pelo complexo Frizzled/receptor LRP, mas não pelo complexo GPR124/RECK/Frizzled/receptor LRP, e medir a referida sinalização Wnt.
[00330] O termo "contato" ou "contato", conforme usado neste documento, significa trazer um ou mais primeiros componentes (como uma ou mais moléculas, entidades biológicas, células ou materiais) junto com um ou mais segundos componentes (como uma ou mais moléculas, entidades biológicas, células ou materiais) de tal maneira que o(s) primeiro(s) componente(s) podem -se capazes disso- ligar ou modular o(s) segundo(s) componente(s) ou que o(s) segundo(s) componente(s) podem -se capazes disso- ligar ou modular o(s) primeiro(s) componente(s). Tal modulação pode ocorrer diretamente, isto é, por meio de interação direta entre o primeiro e o segundo componente(s); ou indiretamente, por exemplo, quando o(s) primeiro(s) componente(s) interagem ou modulam um ou mais componentes adicionais, um ou mais dos quais, por sua vez, interagem com ou modulam o(s) segundo(s) componente(s), ou vice- versa. O termo "contactar" pode, dependendo do contexto, ser sinônimo de "expor", "incubar", "misturar", "reagir", "tratar" ou semelhantes.
[00331] Em modalidades particulares, o agente de teste pode ser contatado com a célula capaz de sinalização Wnt mediada por GPR124/RECK/Frizzled/LRP e/ou com a célula capaz de sinalização Wnt mediada por Frizzled/LRP, mas não GPR124/RECK/Frizzled/LRP - sinalização Wnt mediada por transfecção da referida célula com um ácido nucleico que codifica o agente, um cassete de expressão de ácido nucleico compreendendo o ácido nucleico ou um vetor compreendendo o ácido nucleico ou o cassete de expressão de ácido nucleico como ensinado neste relatório descritivo.
Medir a sinalização Wnt tipicamente denota a determinação da ativação da sinalização Wnt, de preferência a ativação da sinalização Wnt canônica ou dependente de β-catenina como descrito neste relatório descritivo, por exemplo, pela detecção de um aumento em genes responsivos a Wnt ou a localização nuclear de β-catenina. Outra maneira de determinar a ativação da sinalização Wnt mediada por Frizzled/LRP é estudar o estabelecimento da duplicação do eixo dorsal durante o desenvolvimento embrionário em Xenopus após microinjeção do agente de teste em um blastômero ventral do embrião em estágio de quatro células, como conhecido na técnica. Ainda outra maneira de determinar a ativação da sinalização Wnt mediada por Frizzled/LRP é estudar o estabelecimento das estruturas do prosencéfalo e do olho durante o desenvolvimento embrionário no peixe-zebra (Danio rerio) após microinjeção do agente de teste no embrião em estágio de uma a quatro células como conhecido na técnica. O nível de atividade de sinalização Wnt pode ser comparado a um valor de linha de base. O valor da linha de base pode ser um valor para uma amostra de controle (por exemplo, uma amostra de uma população de células não estimuladas ou uma população de células em contato com um agente de controle).
[00332] As células capazes de sinalização Wnt mediada pelo complexo receptor GPR124/RECK/Frizzled/LRP são tipicamente células que compreendem GPR124, RECK, Frizzled e LRP em sua membrana plasmática e contendo os membros a jusante da via de sinalização Wnt/β-catenina. As células capazes de sinalizar Wnt mediada pelo complexo de receptor Frizzled/LRP, mas não pelo complexo de receptor GPR124/RECK/Frizzled/LRP, são tipicamente células que compreendem Frizzled e LRP em sua membrana plasmática e contendo os membros a jusante do Wnt/β- via de sinalização da catenina, mas não compreendendo um polipeptídeo GPR124 e/ou um polipeptídeo RECK em sua membrana plasmática.
[00333] As células capazes de mediar a sinalização Wnt pelo complexo receptor GPR124/RECK/Frizzled/LRP podem ser células que expressam naturalmente todos os componentes celulares necessários para a sinalização Wnt mediada por GPR124/RECK/Frizzled/LRP, como células endoteliais cerebrais ou linhas celulares. As células capazes de mediar a sinalização Wnt pelo complexo receptor GPR124/RECK/Frizzled/LRP também podem ser células que expressam naturalmente nenhum ou todos os componentes celulares necessários para a sinalização Wnt mediada por GPR124/RECK/Frizzled/LRP, que pode ser modificada tal como geneticamente modificado para compensar os componentes celulares ausentes necessários para a sinalização Wnt mediada por GPR124/RECK/Frizzled/LRP, como células de rim embrionário humano 293 (HEK293). Tais modificações são conhecidas na técnica e incluem a transfecção das células com ácidos nucleicos que codificam para, por exemplo, o polipeptídeo GPR124 e/ou RECK.
[00334] Conforme descrito neste relatório descritivo, a ausência de, ou não compreendendo ou contendo de, um polipeptídeo receptor, neste contexto, não se refere per se à ausência completa do referido polipeptídeo receptor na membrana celular, mas pode se referir a uma quantidade do receptor polipeptídeo que não é detectável por, ou que cai abaixo da faixa de sensibilidade de, ensaios de proteínas conhecidos pelo técnico no assunto.
[00335] Os rastreios preliminares podem ser realizados rastreando o agente de teste quanto à sua capacidade de ligação a um polipeptídeo RECK, um polipeptídeo Frizzled e/ou um polipeptídeo LRP.
[00336] Em modalidades particulares, o método in vitro para identificar um agente útil como terapêutico, conforme divulgado neste documento, compreende determinar se o agente de teste é capaz de se ligar ao polipeptídeo RECK e, opcionalmente, determinar se o agente de teste é capaz de se ligar ao polipeptídeo Frizzled e/ou um polipeptídeo LRP.
[00337] O ensaio de ligação pode envolver o contato de um polipeptídeo RECK, um polipeptídeo Frizzled e/ou um polipeptídeo LRP com o agente de teste e permitir tempo suficiente para o agente de teste e o polipeptídeo RECK, o polipeptídeo Frizzled e/ou o polipeptídeo LRP para partir de um complexo de ligação. A formação de um complexo de ligação pode ser detectada usando qualquer técnica analítica estabelecida para determinar a ligação proteína- proteína como descrito neste relatório descritivo, como coimunoprecipitação, complementação de fluorescência bimolecular, transferência de marcador, purificação de afinidade em tandem, reticulação química e transferência de energia de ressonância de fluorescência. Os ensaios de ligação de proteínas podem ser realizados em um sistema livre de células ou em um lisado celular ou em células isoladas ou cultivadas ou em um tecido isolado ou cultivado, como descrito em neste relatório descritivo.
[00338] Em um ensaio de ligação, um ou mais agentes, polipeptídeo RECK, polipeptídeo Frizzled e/ou polipeptídeo LRP podem ser unidos a um marcador, onde o marcador pode fornecer direta ou indiretamente um sinal detectável.
Exemplos não limitativos de tais marcadores ou sinais incluem radioisótopos, marcadores ou sinais fluorescentes, marcadores ou sinais quimioluminescentes, enzimas, moléculas de ligação específicas ou partículas (por exemplo, partículas magnéticas).
[00339] Em modalidades particulares, o método in vitro para identificar um agente útil como terapêutico, conforme divulgado neste documento, pode compreender ainda o uso de um ou mais reagentes que melhoram a eficiência do ensaio, facilitam a ligação ótima de proteína-proteína e/ou reduzem a não específica ou interações de fundo. Exemplos não limitativos de tais reagentes são sais, proteínas neutras (por exemplo, albumina), detergentes, inibidores de protease, inibidores de nuclease e agentes antimicrobianos.
[00340] Em modalidades particulares, o método in vitro para identificar um agente útil como terapêutico, conforme divulgado neste documento, compreende o contato do agente de teste com uma célula de 1 hora a 48 horas, de 6 horas a 36 horas, de 12 horas a 24 horas, de 0.5 a 120 minutos, de 1 a 90 minutos, de 5 a 60 minutos, ou de 10 a 30 minutos.
[00341] Em modalidades particulares, o método in vitro para identificar um agente útil como terapêutico, conforme divulgado neste documento, compreende o contato do agente de teste com uma célula a uma temperatura de 4° C a 40° C. Em certas modalidades, o contato pode ser realizado em células isoladas ou cultivadas ou em um tecido isolado ou cultivado. O termo "isolado", conforme usado ao longo desta especificação com referência a um componente particular, geralmente denota que tal componente existe em separação de - por exemplo, foi separado de ou preparado e/ou mantido em separação de - um ou mais outros componentes de seu ambiente natural. Mais particularmente, o termo "isolado", tal como aqui utilizado em relação a células ou tecidos, denota que tais células ou tecidos não fazem parte de um corpo animal ou humano. As células ou tecidos isolados podem ser adequadamente cultivados ou cultivados in vitro. Os termos "cultura" ou "cultura de células" são comuns na técnica e se referem amplamente à manutenção das células e potencialmente à expansão (proliferação, propagação) das células in vitro.
Normalmente, células animais, como células de mamíferos, como células humanas, são cultivadas por exposição a (ou seja, contato com) um meio de cultura de células adequado em um recipiente ou recipiente adequado para o propósito (por exemplo, um 96-, 24 -, ou placa de 6 poços, um frasco T-25, T-75, T-150 ou T-225, ou uma fábrica de células), em condições conhecidas na técnica favoráveis à cultura de células in vitro, como temperatura de 37° C, 5% v/v CO2 e> 95% de umidade. O termo "meio", tal como aqui utilizado, abrange amplamente qualquer meio de cultura de células que conduza à manutenção das células, de preferência que conduz à proliferação de células. Normalmente, o meio será um meio de cultura líquido, o que facilita a manipulação fácil (por exemplo, decantação, pipetagem, centrifugação, filtração e outros) do mesmo.
[00342] Normalmente, o meio compreenderá uma formulação de meio basal como é conhecido na técnica.
Muitas formulações de mídia basal (disponíveis, por exemplo, da American Type Culture Collection, ATCC; ou da Invitrogen, Carlsbad, Califórnia) podem ser usadas, incluindo, mas não se limitando a Eagle's Minimum Essential Medium (MEM), Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), Meio essencial mínimo alfa modificado (alfa-MEM), Meio basal essencial (BME), meio de Dulbecco modificado por Iscove (IMDM), meio BGJb, mistura de nutrientes F-12 (Ham), Liebovitz L-15, DMEM/F-12, Meio de Eagle modificado essencial (EMEM), RPMI-1640, meio 199, meio MB 752/1 da Waymouth ou meio E de Williams e modificações e/ou combinações dos mesmos. As composições de meios basais são geralmente conhecidas na técnica e está dentro da habilidade do técnico de, modificar ou modular as concentrações de mídia e/ou suplementos de mídia conforme necessário para as células cultivadas.
[00343] Essas formulações de meio básico contêm ingredientes necessários para o desenvolvimento de células de mamíferos, que são conhecidos per se. Por meio de ilustração e não de limitação, esses ingredientes podem incluir sais inorgânicos (em particular sais contendo Na, K, Mg, Ca, Cl, P e possivelmente Cu, Fe, Se e Zn), tampões fisiológicos (por exemplo, HEPES, bicarbonato) , nucleotídeos, nucleosídeos e/ou bases de ácido nucleico, ribose, desoxirribose, aminoácidos, vitaminas, antioxidantes (por exemplo, glutationa) e fontes de carbono
(por exemplo, glicose, piruvato de sódio, acetato de sódio), etc.
[00344] Para uso em cultura, os meios basais podem ser fornecidos com um ou mais componentes adicionais. Por exemplo, suplementos adicionais podem ser usados para fornecer às células os oligoelementos e substâncias necessárias para um crescimento e expansão ideais. Além disso, podem ser adicionados suplementos antioxidantes, por exemplo, β-mercaptoetanol. Embora muitos meios basais já contenham aminoácidos, alguns aminoácidos podem ser suplementados posteriormente, por exemplo, L-glutamina, que é conhecida por ser menos estável quando em solução. Um meio pode ainda ser fornecido com compostos antibióticos e/ou antimicóticos, tais como, tipicamente, misturas de penicilina e estreptomicina e/ou outros compostos, exemplificados, mas não limitados a, anfotericina, ampicilina, gentamicina, bleomicina, higromicina, canamicina, mitomicina, ácido micofenólico, ácido nalidíxico, neomicina, nistatina, paromomicina, polimixina, puromicina, rifampicina, espectinomicina, tetraciclina, tilosina e zeocina.
[00345] Lipídios e transportadores de lipídios também podem ser usados para suplementar os meios de cultura de células. Esses lipídios e transportadores podem incluir, mas não estão limitados a ciclodextrina,
colesterol, ácido linoléico conjugado com albumina, ácido linoléico e ácido oleico conjugado com albumina, ácido linoléico não conjugado, ácido linoléicooleicoaraquidônico conjugado com albumina, ácido oleico não conjugado e conjugado à albumina, entre outros. A albumina também pode ser usada em formulações sem ácidos graxos.
[00346] Também é contemplada a suplementação de meios de cultura de células com plasma ou soro de mamífero.
Plasma ou soro geralmente contêm fatores celulares e componentes que facilitam a viabilidade e expansão celular.
Opcionalmente, o plasma ou soro pode ser inativado pelo calor. A inativação por calor é usada na técnica principalmente para remover o complemento. A inativação por calor envolve tipicamente a incubação do plasma ou soro a 56°C por 30 a 60 min, por exemplo, 30 min, com mistura constante, após o que o plasma ou soro é deixado resfriar gradualmente até a temperatura ambiente. Um técnico estará ciente de quaisquer modificações e requisitos comuns do procedimento acima. Opcionalmente, o plasma ou soro pode ser esterilizado antes do armazenamento ou uso. Os meios usuais de esterilização podem envolver, por exemplo, filtração através de um ou mais filtros com tamanho de poro menor que 1 µm, de preferência menor que 0,5 µm, por exemplo, menor que 0,45 µm, 0,40 µm, 0,35 µm, 0,30 µm ou 0,25 µm, mais preferencialmente 0,2 µm ou menor, por exemplo, 0,15 µm ou menor, 0,10 µm ou menor. Soros ou plasmas adequados para uso em meios como ensinado aqui podem incluir soro ou plasma humano, ou soro ou plasma de animais não humanos, de preferência mamíferos não humanos, tais como, por exemplo, primatas não humanos (por exemplo, lêmures e macacos), bovino fetal ou adulto, cavalo, porcino, cordeiro, cabra, cão, coelho, camundongo ou soro ou plasma de rato, etc., ou qualquer combinação destes. Em certas modalidades preferidas, um meio como ensinado aqui pode compreender soro ou plasma bovino, de preferência soro ou plasma fetal bovino (bezerro), mais preferencialmente soro fetal bovino (bezerro) (FCS ou FBS). Ao cultivar células humanas, os meios podem preferencialmente compreender soro ou plasma humano, como soro ou plasma humano autólogo ou alogênico, de preferência soro humano, como soro humano autólogo ou alogênico, mais preferencialmente soro ou plasma humano autólogo, ainda mais preferencialmente soro humano autólogo.
[00347] Em certas modalidades preferidas, o soro ou plasma pode ser substituído no meio por substituições de soro, de modo a fornecer meios sem soro (isto é, meios quimicamente definidos). O fornecimento de meios isentos de soro pode ser vantajoso particularmente com vista à administração do meio ou fração(ões) dos mesmos a sujeitos, especialmente a sujeitos humanos (por exemplo,
biossegurança melhorada). Pelo termo "substituição de soro" entende-se amplamente qualquer uma composição que pode ser usada para substituir as funções (por exemplo, manutenção celular e função de suporte ao crescimento) do soro animal em um meio de cultura celular. Uma substituição de soro convencional pode compreender tipicamente vitaminas, albumina, lipídios, aminoácidos, transferrina, antioxidantes, insulina e oligoelementos. Muitos aditivos de substituição de soro comercializados, tais como KnockOut Serum Replacement (KOSR), N2, B27, suplemento de insulina- transferrina-selênio (ITS) e G5 são bem conhecidos e estão prontamente disponíveis para técnicos no assunto.
[00348] Plasma ou soro ou substituição de soro podem ser compreendidos em meios como ensinado aqui em uma proporção (volume de plasma ou soro ou substituição de soro/volume de meio) entre cerca de 0,5% v/v e cerca de 40,0% v/v, de preferência entre cerca de 5,0 % v/v e cerca de 20,0% v/v, por exemplo, entre cerca de 5,0% v/v e cerca de 15,0% v/v, mais preferencialmente entre cerca de 8,0% v/v e cerca de 12,0% v/v, por exemplo, cerca de 10,0 % v/v.
[00349] As células isoladas ou em cultura adequadas podem ser, sem limitação, células bacterianas, células fúngicas, incluindo células de levedura, células vegetais, células animais, células de mamíferos, células humanas ou células de mamíferos não humanos. As células animais, tais como células de mamíferos, células humanas ou células de mamíferos não humanos são preferidas. As células podem incluir células primárias, células secundárias, terciárias, etc., ou podem incluir linhas celulares imortalizadas, incluindo linhas celulares clonais. Exemplos não limitativos de células bacterianas incluem Escherichia coli, Yersinia enterocolitica, Brucella sp., Salmonella tymphimurium, Serratia marcescens ou Bacillus subtilis.
Exemplos não limitativos de células fúngicas incluem Yarrowia lipolytica, Arxula adeninivorans, Pichia pastoris, Hansenula polymorpha, Saccharomyces cerevisiae ou Schizosaccharomyces pombe. Exemplos não limitativos de células de inseto incluem células derivadas de Drosophila melanogaster, como células Schneider 2, linhas celulares derivadas da lagarta militar Spodoptera frugiperda, como células Sf9 e Sf21, ou células derivadas da lagarta plusia Trichoplusia ni, como células High-five. Exemplos não limitativos de células humanas incluem a linha celular humana HeLa (câncer cervical). Outras linhas de células humanas comuns na prática de cultura de tecidos incluem, entre outras, células embrionárias de rim humano 293 (células HEK), DU145 (câncer de próstata), Lncap (câncer de próstata), MCF-7 (câncer de mama), MDA-MB-438 (câncer de mama), PC3 (câncer de próstata), T47D (câncer de mama), THP-1 (leucemia mieloide aguda), U87 (glioblastoma), SHSY5Y
(neuroblastoma) ou células Saos-2 (câncer ósseo). Um exemplo não limitativo de células de primatas são células Vero (linha de células epiteliais de rim de Chlorocebus de macaco verde africano) e células COS. Exemplos não limitativos de células de roedor são GH3 de rato (tumor pituitário), CHO (ovário de hamster chinês), linhas celulares PC12 (feocromocitoma) ou linha celular MC3T3 de rato (calvário embrionário). Essas células podem ser obtidas a partir de uma variedade de fontes comerciais e instalações de recursos de pesquisa, como, por exemplo, a American Type Culture Collection (Rockville, MD).
[00350] Em certas modalidades, as células podem ter uma membrana celular intacta. Em outras modalidades, a membrana celular pode ser permeabilizada (transitoriamente ou permanentemente) para permitir a difusão de componentes através da membrana celular que não são transportados ou são transportados de forma menos eficaz através de uma membrana celular intacta. Detergentes adequados para a permeabilização da membrana celular incluem, sem limitação, saponinas (por exemplo, digitonina), TritonTM X-100 ou Polissorbato 20. As células podem ser vivas ou viáveis, ou podem ser não viáveis.
[00351] Métodos para a introdução de polipeptídeos e/ou ácidos nucleicos em células viáveis são conhecidos pelos técnicos no assunto e podem incluir coprecipitação de fosfato de cálcio, eletroporação, microinjeção, fusão de protoplastos, lipofecção, transfecção mediada por exossomo, transfecção empregando poliamina reagentes de transfecção, bombardeamento de células por microprojéteis de tungstênio revestidos com ácido nucleico, distribuição de partículas virais, etc. Tal introdução também pode ser referida como distribuição, transfecção ou transformação. Os peptídeos de penetração celular (CPPs) também podem ser empregados para a distribuição de polipeptídeos ou ácidos nucleicos nas células. A translocação de CPP pode ser classificada em três mecanismos principais de entrada: penetração direta na membrana, entrada mediada por endocitose e translocação por meio da formação de uma estrutura transitória. Os CPPs normalmente têm uma composição de aminoácidos que contém uma abundância relativa elevada de aminoácidos carregados positivamente, como lisina ou arginina, ou tem sequências que contêm um padrão alternado de aminoácidos polares/carregados e aminoácidos não polares hidrofóbicos.
Esses dois tipos de estruturas são denominados policatiônicos ou anfipáticos, respectivamente. Uma terceira classe de CPPs são os peptídeos hidrofóbicos, contendo apenas resíduos apolares, com carga líquida baixa ou com grupos de aminoácidos hidrofóbicos que são cruciais para a absorção celular. Um dos CPPs iniciais descobertos foi o ativador transcricional de transativação (Tat) do
Vírus da Imunodeficiência Humana 1 (HIV-1), que se verificou ser eficientemente absorvido da mídia circundante por vários tipos de células em cultura. Desde então, o número de CPPs conhecidos aumentou consideravelmente e foram gerados análogos sintéticos de pequenas moléculas com propriedades de transdução de proteínas mais eficazes. Os CPPs incluem, mas não estão limitados a Penetratina, Tat (48-60), Transportan e (R-AhX-R4) (Ahx = aminohexanoil). O documento US 8.372.951 fornece um CPP derivado de proteína catiônica eosinófila (ECP) que exibe alta eficiência de penetração celular e baixa toxicidade. Aspectos de entrega do CPP com sua carga em um animal vertebrado também são fornecidos. Outros aspectos dos CPPs e sua distribuição são descritos em US 8.575.305; US 8; 614.194 e US 8.044.019. Os CPPs podem ser conjugados ou complexos com a carga, conforme conhecido na técnica, por exemplo, através de uma ligação tioéter ou através da formação de partículas.
[00352] Moléculas de ácido nucleico expressáveis, como, por exemplo, cassetes de expressão ou vetores de expressão, polipeptídeos codificadores ou RNAs de interesse podem ser fornecidos como geralmente conhecido na técnica.
Uma molécula de ácido nucleico expressável pode compreender tipicamente uma molécula de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo de interesse e/ou uma molécula de ácido nucleico que codifica a molécula de RNA de interesse e um(s) promotor(es) operacionalmente ligado(s) à(s) referida(s) molécula(s) de ácido nucleico. O promotor pode ser selecionado ou configurado para efetuar a expressão do polipeptídeo e/ou RNA de interesse em uma célula de interesse, tal como uma célula bacteriana, célula fúngica, célula de levedura, célula vegetal, célula animal, célula de mamífero, célula humana ou célula de mamífero não humano.
[00353] As células podem ser postas em contato com o agente de teste adicionando o agente de teste ao meio de cultura no qual as células estão sendo cultivadas. Os ácidos nucleicos que codificam o agente de teste podem ser fornecidos às células compreendidas em um vetor sob condições conhecidas pelo técnico no assunto e conforme descrito neste relatório descritivo. Alternativamente, os ácidos nucleicos que codificam o agente de teste podem ser fornecidos às células por meio de um vetor viral, isto é, as células são colocadas em contato com partículas virais compreendendo ácidos nucleicos que codificam o agente de teste. Os vetores virais foram tipicamente modificados para não terem a capacidade de produzir proteínas virais necessárias para a infecção produtiva. Em modalidades particulares, o agente de teste pode ser identificado como um útil agente terapêutico, conforme divulgado neste documento, se o agente aumenta a sinalização Wnt/β-catenina mediada pelo complexo receptor GPR124/RECK/Frizzled/LRP pelo menos 10 vezes mais, pelo menos 20 vezes mais, pelo menos 30 vezes mais, pelo menos 40 vezes mais, pelo menos 50 vezes mais, pelo menos 100 vezes mais, pelo menos 250 vezes mais, pelo menos 500 vezes mais, pelo menos 750 vezes mais , pelo menos 1000 vezes mais, pelo menos 1x104 vezes mais, ou pelo menos 1x105 vezes mais em comparação com linha de base de sinalização de Wnt/β-catenina mediada por GPR124/RECK/Frizzled/LRP ou fundo induzido por uma substância neutra ou controle negativo , por exemplo, conforme medido em um ensaio conforme descrito neste relatório descritivo.
[00354] Em modalidades particulares, o agente de teste pode ser identificado como um agente útil como terapêutico, conforme divulgado neste documento se a atividade de sinalização Wnt mediada por GPR124/RECK/Frizzled/LRP induzida pelo referido agente for pelo menos 3,5 vezes mais, pelo menos 5 vezes mais, pelo menos 10 vezes mais, pelo menos 15 vezes mais, pelo menos 20 vezes mais, pelo menos 25 vezes mais, pelo menos 50 vezes mais, pelo menos 100 vezes mais, pelo menos 500 vezes mais, pelo menos 1000 vezes mais, pelo menos 1x104 vezes mais, ou pelo menos 1x105 vezes mais t do que a atividade de sinalização Wnt mediada por Frizzled/LRP induzida pelo referido agente, na ausência de RECK e/ou GPR124.
[00355] Os agentes de teste que são inicialmente identificados úteis como terapêuticos, conforme divulgado neste documento por qualquer um dos métodos de triagem anteriores, podem ser ainda testados para validar a atividade aparente in vitro, in vivo ou ex vivo, por modelos animais adequados para mimetizar distúrbios neurovasculares ou do sistema nervoso central distúrbios do sistema (SNC) compreendendo disfunção neurovascular em humanos.
[00356] O presente pedido também fornece aspectos e modalidades conforme estabelecido nas seguintes Declarações:
[00357] Declaração 1. Um agente capaz de ativar a sinalização Wnt mediada pelo receptor acoplado à proteína G (GPR) 124/RECK/Frizzled/proteína relacionada ao receptor de lipoproteína (LRP), em que o referido agente não ativa a sinalização Wnt mediada por Frizzled/LRP na ausência de RECK e/ou GPR124.
[00358] Declaração 2. Agente de acordo com a Declaração 1, em que o referido agente é capaz de induzir heteromerização de polipeptídeos Frizzled e LRP em uma membrana celular na presença de RECK e GPR124, mas não na ausência de RECK e/ou GPR124.
[00359] Declaração 3. O agente de acordo com a Declaração 2, em que o referido agente é capaz de se ligar simultaneamente a polipeptídeos Frizzled e LRP em uma membrana celular na presença de RECK e GPR124, mas não na ausência de RECK e/ou GPR124.
[00360] Declaração 4. O agente de acordo com qualquer uma das Declarações 1 a 3, em que o referido agente é capaz de se ligar ao GPR124 e/ou ao polipeptídeo RECK.
[00361] Declaração 5. O agente de acordo com qualquer uma das Declarações 1 a 4, em que o referido agente é capaz de se ligar ao polipeptídeo RECK.
[00362] Declaração 6. Agente de acordo com a Declaração 5, em que o referido agente é capaz de se ligar a região do nó de cisteína 4 (CK4), a região CK5 ou as regiões CK4 e CK5 do polipeptídeo RECK.
[00363] Declaração 7. Agente de acordo com qualquer uma das Declarações 1 a 6, em que o referido agente é capaz de se ligar ao domínio rico em cisteína (CRD) do polipeptídeo Frizzled.
[00364] Declaração 8. Agente de acordo com qualquer uma das Declarações 1 a 7, em que o referido agente é capaz de se ligar ao local de ligação DKK e/ou ao local de ligação Wnt do polipeptídeo LRP.
[00365] Declaração 9. Agente, de acordo com qualquer uma das Declarações 1 a 8, em que o agente compreende ou é selecionado a partir de um grupo que consiste em uma substância química, um anticorpo, um fragmento de anticorpo, um esqueleto de proteína semelhante a um anticorpo, uma proteína ou polipeptídeo, um peptídeo, um peptidomimético, um aptâmero, um fotoaptâmero, um spiegelmer e um ácido nucleico, de preferência em que o referido agente compreende é uma proteína ou polipeptídeo.
[00366] Declaração 10. O agente, de acordo com qualquer uma das Declarações 1 a 9, em que o referido agente compreende um domínio de ligação a RECK, um domínio de ligação a Frizzled e um domínio de ligação a LRP, em que o referido domínio de ligação a RECK, o referido domínio de ligação a Frizzled, e o referido domínio de ligação LRP é derivado de um polipeptídeo Wnt7, tal como de um polipeptídeo Wnt7a ou Wnt7b.
[00367] Declaração 11. O agente de acordo com a Declaração 10, em que o referido domínio de ligação RECK compreende: - uma sequência de aminoácidos com pelo menos 25% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos HVEPVRASRNKRPTFLKIKKPLSYRKPMDTDLVYIEKSPNYC (SEQ ID NO: 17); ou - uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 25% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos VEPVRASRNKRPTFLKIKKPLSYRKPMDT (SEQ ID NO: 18); ou – uma sequência de aminoácidos com pelo menos 25%
de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos VEVVRASRLRQPTFLRIKQLRSYQKPMET (SEQ ID NO: 19); ou - uma sequência de aminoácidos XXXVXAXRXXXXXFLXIXXXXXYXKXXXX (SEQ ID NO: 20), VXAXRXXXXXFLXIXXXXXYXK (SEQ ID NO: 21), XXXVXAXRXXXXXFLXXXXXXXXXKXXXX (SEQ ID NO: 22) ou VXAXRXXXXXFLXXXXXXXXXK (SEQ ID NO: 23), em que X é qualquer aminoácido, de preferência em que a sequência de aminoácidos mostra pelo menos 50% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NO: 18 ou SEQ ID NO:
19.
[00368] Declaração 12. Agente de acordo com qualquer uma das Declarações 1 a 11, em que o referido agente é ou consiste essencialmente em um fragmento de um polipeptídeo Wnt7, tal como um fragmento de um polipeptídeo Wnt7a ou Wnt7b.
[00369] Declaração 13. O agente de acordo com as Declarações 12, em que o referido fragmento é ou consiste essencialmente no domínio N-terminal (NTD) do polipeptídeo Wnt7.
[00370] Declaração 14. Agente, de acordo com qualquer uma das Declarações 1 a 13, em que o referido agente é uma variante de um polipeptídeo Wnt7, tal como uma variante de um polipeptídeo Wnt7a ou Wnt7b.
[00371] Declaração 15. O agente de acordo com a
Declaração 14, em que
- o resíduo de glutamina (Q) na posição correspondente à posição 17 na SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO:
51 é substituído por um ou mais resíduos de aminoácidos diferentes de glutamina (Q), de preferência por um resíduo de alanina (A);
- o resíduo de isoleucina (I) na posição correspondente à posição 20 na SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO:
51 é substituído por um ou mais resíduos de aminoácidos diferentes de isoleucina (I), de preferência por um resíduo de alanina (A);
- o resíduo de prolina (P) na posição correspondente à posição 25 na SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO:
51 é substituído por um ou mais resíduos de aminoácidos diferentes de prolina (P), de preferência por um resíduo de alanina (A);
- o resíduo de alanina (A) na posição correspondente à posição 27 na SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO:
51 é substituído por um ou mais resíduos de aminoácidos diferentes de alanina (A), de preferência por um resíduo de arginina (R);
- o resíduo de isoleucina (I) na posição correspondente à posição 28 na SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO:
51 é substituído por um ou mais resíduos de aminoácidos diferentes de isoleucina (I), de preferência por um resíduo de alanina (A);
- o resíduo de glutamato (E) na posição correspondente à posição 33 na SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO:
51 é substituído por um ou mais resíduos de aminoácidos diferentes de glutamato (E), de preferência por um resíduo de alanina (A);
- o resíduo de metionina (M) na posição correspondente à posição 37 na SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO:
51 é substituído por um ou mais resíduos de aminoácidos diferentes de glutamato (E), de preferência por um resíduo de alanina (A);
- o resíduo de leucina (L) na posição correspondente à posição 39 na SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO:
51 é substituído por um ou mais resíduos de aminoácidos diferentes de glutamato (E), de preferência por um resíduo de alanina (A);
- o resíduo de glutamato (E) na posição correspondente à posição 41 na SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO:
51 é substituído por um ou mais resíduos de aminoácidos diferentes de glutamato (E), de preferência por um resíduo de alanina (A);
- o resíduo de fenilalanina (F) na posição correspondente à posição 44 em SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO:
51 é substituído por um ou mais resíduos de aminoácidos diferentes de fenilalanina (F), de preferência por um resíduo de alanina (A);
- o resíduo de arginina (R) na posição correspondente à posição 50 na SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO:
51 é substituído por um ou mais resíduos de aminoácidos diferentes de arginina (R), de preferência por um resíduo de alanina (A);
- o resíduo de asparagina (N) na posição correspondente à posição 52 na SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO:
51 é substituído por um ou mais resíduos de aminoácidos diferentes de asparagina (N), de preferência por um resíduo de glutamina (Q);
- o resíduo de valina (V) na posição correspondente à posição 68 na SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 51 é substituído por um ou mais resíduos de aminoácidos diferentes de valina (V), de preferência por um resíduo de alanina (A);
- o resíduo de isoleucina (I) na posição correspondente à posição 129 na SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO:
51 é substituído por um ou mais resíduos de aminoácidos diferentes de isoleucina (I), de preferência por um resíduo de alanina (A);
- o resíduo de fenilalanina (F) na posição correspondente à posição 131 em SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO:
51 é substituído por um ou mais resíduos de aminoácidos diferentes de fenilalanina (F), de preferência por um resíduo de alanina (A);
- o resíduo de lisina (K) na posição correspondente à posição 133 em SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 51 é substituído por um ou mais resíduos de aminoácidos diferentes de lisina (K), de preferência por um resíduo de alanina (A)
- o resíduo de fenilalanina (F) na posição correspondente à posição 135 em SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO:
51 é substituído por um ou mais resíduos de aminoácidos diferentes de fenilalanina (F), de preferência por um resíduo de alanina (A);
- o resíduo de isoleucina (I) na posição correspondente à posição 141 na SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO:
51 é substituído por um ou mais resíduos de aminoácidos diferentes de isoleucina (I), de preferência por um resíduo de alanina (A);
- o resíduo de arginina (R) na posição correspondente à posição 146 em SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO:
51 é substituído por um ou mais resíduos de aminoácidos diferentes de arginina (R), de preferência por um resíduo de alanina (A);
- o resíduo de arginina (R) na posição correspondente à posição 158 em SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO:
51 é substituído por um ou mais resíduos de aminoácidos diferentes de arginina (R), de preferência por um resíduo de alanina (A);
- o resíduo de lisina (K) na posição correspondente à posição 159 na SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 51 é substituído por um ou mais resíduos de aminoácidos diferentes de lisina (K), de preferência por uma alanina
(A), resíduo de serina (S) ou leucina (L);
- o resíduo de lisina (K) na posição correspondente à posição 181 na SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 51 é substituído por um ou mais resíduos de aminoácidos diferentes de lisina (K), de preferência por um resíduo de alanina (A);
- o resíduo de arginina (R) na posição correspondente à posição 191 na SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO:
51 é substituído por um ou mais resíduos de aminoácidos diferentes de arginina (R), de preferência por um resíduo de alanina (A);
- o resíduo de lisina (K) na posição correspondente à posição 198 na SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 51 é substituído por um ou mais resíduos de aminoácidos diferentes de lisina (K), de preferência por um resíduo de alanina (A);
- o resíduo de lisina (K) na posição correspondente à posição 200 na SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 51 é substituído por um ou mais resíduos de aminoácidos diferentes de lisina (K), de preferência por um resíduo de alanina (A);
- o resíduo de valina (V) na posição correspondente à posição 205 em SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 51 é substituído por um ou mais resíduos de aminoácidos diferentes de valina (V), de preferência por um resíduo de alanina (A);
- o resíduo de glutamato (E) na posição correspondente à posição 208 na SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO:
51 é substituído por um ou mais resíduos de aminoácidos diferentes de glutamato (E), de preferência por um resíduo de alanina (A);
- o resíduo de arginina (R) na posição correspondente à posição 214 na SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO:
51 é substituído por um ou mais resíduos de aminoácidos diferentes de arginina (R), de preferência por um resíduo de alanina (A);
- o resíduo de lisina (K) na posição correspondente à posição 216 na SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 51 é substituído por um ou mais resíduos de aminoácidos diferentes de lisina (K), de preferência por um resíduo de alanina (A);
- o resíduo de prolina (P) na posição correspondente à posição 218 em SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO:
51 é substituído por um ou mais resíduos de aminoácidos diferentes de prolina (P), de preferência por um resíduo de alanina (A);
- o resíduo de lisina (K) na posição correspondente à posição 222 na SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 51 é substituído por um ou mais resíduos de aminoácidos diferentes de lisina (K), de preferência por um resíduo de alanina (A);
- o resíduo de isoleucina (I) na posição correspondente à posição 223 na SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO:
51 é substituído por um ou mais resíduos de aminoácidos diferentes de isoleucina (I), de preferência por um resíduo de alanina (A);
- o resíduo de tirosina (Y) na posição correspondente à posição 229 em SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO:
51 é substituído por um ou mais resíduos de aminoácidos diferentes de tirosina (Y), de preferência por um resíduo de alanina (A);
- o resíduo de prolina (P) na posição correspondente à posição 232 em SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO:
51 é substituído por um ou mais resíduos de aminoácidos diferentes de prolina (P), de preferência por um resíduo de alanina (A);
- o resíduo de treonina (T) na posição correspondente à posição 235 em SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO:
51 é substituído por um ou mais resíduos de aminoácidos diferentes de treonina (T), de preferência por um resíduo de alanina (A);
- o resíduo de glutamato (E) na posição correspondente à posição 248 na SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO:
51 é substituído por um ou mais resíduos de aminoácidos diferentes de glutamato (E), de preferência por um resíduo de alanina (A);
- o resíduo de arginina (R) na posição correspondente à posição 289 na SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO:
51 é substituído por um ou mais resíduos de aminoácidos diferentes de arginina (R), de preferência por um resíduo de alanina (A);
- o resíduo de triptofano (W) na posição correspondente à posição 291 na SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO:
51 é substituído por um ou mais resíduos de aminoácidos diferentes de triptofano (W), de preferência por um resíduo de alanina (A);
- o resíduo de treonina (T) na posição correspondente à posição 307 em SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO:
51 é substituído por um ou mais resíduos de aminoácidos diferentes de treonina (T), de preferência por um resíduo de alanina (A); e/ou
- o resíduo de lisina (K) na posição correspondente à posição 318 na SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 51 é substituído por um ou mais resíduos de aminoácidos diferentes de lisina (K), de preferência por um resíduo de alanina (A).
[00372] Declaração 16. Um ácido nucleico que codifica o agente de acordo com qualquer uma das Declarações 1 a 15, em que o referido agente é uma proteína, polipeptídeo ou um peptídeo.
[00373] Declaração 17. Um cassete de expressão de ácido nucleico compreendendo o ácido nucleico de acordo com a Declaração 16, operacionalmente ligado a um promotor e/ou sinais reguladores de transcrição e tradução.
[00374] Declaração 18. Um vetor que compreende o ácido nucleico de acordo com a Declaração 16 ou o cassete de expressão de ácido nucleico de acordo com a Declaração 17, como um vetor viral.
[00375] Declaração 19. Uma célula hospedeira que compreende o ácido nucleico de acordo com a Declaração 16, o cassete de expressão de ácido nucleico de acordo com a Declaração 17 ou o vetor de acordo com a Declaração 18.
[00376] Declaração 20. Uma composição farmacêutica que compreende o agente de acordo com qualquer uma das Declarações 1 a 15, o ácido nucleico de acordo com a Declaração 16, o cassete de expressão de ácido nucleico de acordo com a Declaração 17, o vetor de acordo com a Declaração 18 ou a célula hospedeira de acordo com Declaração 19 e um transportador farmaceuticamente aceitável.
[00377] Declaração 21. O agente de acordo com qualquer uma das Declarações 1 a 15, o ácido nucleico de acordo com a Declaração 16, o cassete de expressão de ácido nucleico de acordo com a Declaração 17, o vetor de acordo com a Declaração 18, a célula hospedeira de acordo com a Declaração 19, ou composição farmacêutica de acordo com a Declaração 20, para uso como medicamento.
[00378] Declaração 22. O agente de acordo com qualquer uma das Declarações 1 a 15, o ácido nucleico de acordo com a Declaração 16, o cassete de expressão de ácido nucleico de acordo com a Declaração 17, o vetor de acordo com a Declaração 18, a célula hospedeira de acordo com a Declaração 19, ou composição farmacêutica de acordo com a Declaração 20, para uso na prevenção ou tratamento de um distúrbio neurovascular ou um distúrbio do sistema nervoso central (SNC) compreendendo disfunção neurovascular.
[00379] Declaração 23. O agente para uso de acordo com a Declaração 22, em que o referido distúrbio neurovascular é selecionado do grupo que consiste em acidente vascular cerebral isquêmico, acidente vascular cerebral hemorrágico, lesão de isquemia/reperfusão, aneurismas cerebrais, malformações arteriovenosas (MAVs), malformações cavernosas, vasculite, hemorragia cerebral, hemorragia subaracnóide, malformações vasculares espinhais, estenose da artéria carótida, doença de Moyamoya e aterosclerose intracraniana e suas combinações, ou o referido distúrbio do SNC é selecionado a partir do grupo que consiste em esclerose múltipla, acidente vascular cerebral isquêmico, câncer cerebral, epilepsia, demência, demência vascular, HIV- Demência associada a 1, doença de Alzheimer, doença de Parkinson, doença de Huntington, esclerose lateral amiotrófica, doenças cerebrais infecciosas, lesões cerebrais traumáticas, enxaqueca e encefalopatia traumática crônica e suas combinações.
[00380] Declaração 24. Método in vitro para identificar um agente útil como terapêutico, tal como útil para a prevenção ou tratamento de um distúrbio neurovascular ou um distúrbio do SNC compreendendo disfunção neurovascular, o referido método compreendendo determinar se um agente de teste ativa GPR124/RECK/Frizzled/Sinalização Wnt mediada por LRP, mas não sinalização Wnt mediada por Frizzled/LRP na ausência de RECK e/ou GPR124.
[00381] Declaração 25. O método in vitro de acordo com a Declaração 24, compreendendo: - contactar o agente de teste com uma célula capaz de sinalização Wnt mediada por GPR124/RECK/Frizzled/LRP e medir a referida sinalização Wnt, e - contactar o agente de teste com uma célula capaz de sinalização Wnt mediada por Frizzled/LRP, mas não sinalização Wnt mediada por GPR124/RECK/Frizzled/LRP, e medir a referida sinalização Wnt.
[00382] Declaração 26. O método in vitro de acordo com a Declaração 24 ou 25, em que o método compreende ainda determinar se o agente de teste é capaz de se ligar ao polipeptídeo RECK.
[00383] Embora a invenção tenha sido descrita em conjunto com suas modalidades específicas, é evidente que muitas alternativas, modificações e variações serão evidentes para os técnicos no assunto à luz da descrição anterior. Consequentemente, pretende-se abranger todas as alternativas, modificações e variações como segue no espírito e amplo escopo das reivindicações anexas.
[00384] Os aspectos e modalidades da invenção aqui divulgados são adicionalmente suportados pelos seguintes exemplos não limitativos.
Exemplos Exemplo 1. Um mecanismo molecular para sinalização específica do ligante Wnt
1. Materiais e métodos
1.1. Linhas de peixe-zebra
[00385] Peixes-zebra (Danio rerio) foram mantidos a 28° C em um ciclo de 14 h de luz/10 h de escuridão. Os embriões foram obtidos e criados em condições padrão de acordo com as diretrizes de ética e bem-estar animal europeias e nacionais (número de aprovação do protocolo: CEBEA-IBMM-2017-22: 65). O estadiamento foi realizado de acordo com Kimmel et al. (C. B. Kimmel, W. W. Ballard, S.
R. Kimmel, B. Ullmann, T. F. Schilling, Dev. Dyn. 203, 253– 310 (1995)). As linhas transgênicas e mutantes caracterizadas Tg (kdrl: GFP) s843, Tg (kdrl: ras-mCherry) s896 e gpr124s984 (Danio rerio) foram usadas neste estudo (B. Vanhollebeke et al., Elife. 4, 1-25 (2015); S.-W. Jin, D. Beis, T. Mitchell, J.-N. Chen, DYR Stainier, Development. 132, 5199–209 (2005); NC Chi et al., Genes Dev. 22 , 734-739 (2008)).
1.2. Morfolinos, construções de RNA e microinjeção
[00386] Morfolinos bloqueadores de splice contra gpr124 (5'-ACTGATATTGATTTAACTCACCACA-3') (B. Vanhollebeke et al., Elife. 4, 1-25 (2015)) foram obtidos de Gene Tools (Eugene, OR) e injetados em um-estágio da célula a 2 ng. Os mRNAs sintéticos foram transcritos de plasmídeos pCS2 após digestão com NotI usando o kit mMessage mMachine SP6 (Ambion, Carlsbad, CA) e injetados em embrião de peixe- zebra em estágio de uma célula.
1.3. Construtos de expressão de plasmídeo
[00387] Todos os componentes de sinalização Wnt e outras construções foram expressas a partir do promotor CMV do vetor pCS2 após recombinação usando clonagem In-Fusion (Takara, Mountain View, CA), exceto para Fz1
(addgene#42253) e Fz5 (addgene#42267). Variantes de mutação de ponto único, deleções e quimeras foram geradas usando clonagem In-Fusion e produtos de PCR sobrepostos em tandem.
Todas as construções foram confirmadas por sequenciação de Sanger. As deleções de variantes de Reck correspondem aos seguintes aminoácidos: ReckΔCK1: 46-93; ReckΔCK2: 113-150; ReckΔCK3: 160-206; ReckΔCK4: 225-272; ReckΔCK5: 301-347; ReckΔCK1-5: 46-347; ReckΔCRD: 352-484 e ReckΔKAZAL: 636-
798. A etiqueta HA foi inserida após o resíduo 22 em Reck, resíduo 49 em Gpr124 e resíduo 22 em Fz5. A etiqueta FLAG foi inserida após o resíduo 49 em Gpr124.
1.4. Cultura de células e linhas celulares mutantes HEK293 (T)
[00388] As células HEK293T foram obtidas da ATCC (CRL-3216) e a linha de células HEK293 STF foi gentilmente cedida por Jeremy Nathans (John Hopkins). As células WT e mutantes foram cultivadas em meio DMEM/F12 (Lonza, Basel, Switzerland) suplementado com 10% de soro fetal bovino e mantidas em uma incubadora umidificada equilibrada com 5% de CO2. GPR124 e RECK foram geneticamente invalidados usando abordagens CRISPR/Cas9 em células HEK293 STF e LRP5, LRP6 e FZ foram invalidados de forma semelhante em células HEK293T. As sequências de guia CRISPR/Cas9 foram projetadas usando o site http://crispr.mit.edu/ e foram clonadas em pSpCas9 (BB) -2AGFP (FA Ran et al., Nat. Protoc. 8, 2281–
308(2013).) O 1% superior das células GFP + foi isolado por FACS (AriaIII, BD Biosciences, San Jose, CA) 48 h após a transfecção e distribuído em placas de 96 poços para expansão clonal. A fim de facilitar a caracterização genética das linhas de células mutantes, os clones que geram curvas de fusão derivadas de múltiplos picos em análises de fusão de alta resolução foram contra- selecionados. Para cada sítio alvo, as mutações foram identificadas por sequenciamento Sanger de ambos os produtos de PCR de ~ 1000 bp centrado no local do motivo adjacente do protoespaçador (PAM), bem como em pelo menos oito subclones do produto de PCR em pCRTM-Blunt II-TOPO® (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). As linhas celulares mutantes foram obtidas por meio de mutagênese mediada por CRISPR/Cas9 iterativa.
1.5. Ensaios de luciferase dupla STF
[00389] As células foram plaqueadas em placas de 96 poços e transfectadas após 24 horas em triplicado com Lipofectamine 2000 (Life Technologies, Carlsbad, CA). A quantidade de DNA de plasmídeo transfectado por poço foi otimizada para cada vetor de expressão: Renilla luciferase (0,5 ng) (foi gentilmente cedido por Jeremy Nathans (John Hopkins)), ligantes Wnt (20 ng), receptores Fz (5 ng), Lrp ( 2,5 ng), Gpr124 (10 ng), Reck (5 ng) e Dkk-1 (10 ng), a menos que indicado de outra forma. A quantidade total de
DNA foi ajustada para 100 ng por poço com o vetor pCS2 vazio. Os ensaios de luciferase dupla foram realizados usando a linha de células STF ou por cotransfecção de 20 ng de plasmídeo M50 Super 8x TOPFlash (plasmídeo Addgene#12456). As células foram colhidas em tampão de lise passivo (E1960, Promega, WI) e as atividades das luciferases Firefly e Renilla foram medidas sequencialmente usando o sistema Dual-Luciferase Reporter Assay (E1960, Promega, Madison, WI) 48 h pós-transfecção. Os ensaios de competição da Fig. 1C foram realizados plaqueando as células como uma mistura 1:1:1 em 90% de confluência em placas de 96 poços 24 h após a transfecção. A atividade da luciferase foi medida 24 horas após a cocultura.
1.6. Imunofluorescência e ensaio de ligação de proximidade
[00390] As células foram cultivadas em câmaras revestidas de vidro (IBIDI, Martinsried, Alemanha) e transfectadas após 24 h com Lipofectamine 2000 (Life Technologies, Carlsbad, CA). As células foram fixadas com paraformaldeído a 4% durante 10 minutos à temperatura ambiente (TA) 48 horas após a transfecção. Para a coloração de imunofluorescência (IF), as células foram bloqueadas em 1% BSA-PBS por 30 min antes de serem expostas aos anticorpos primários por 1 h em temperatura ambiente. Após três lavagens com PBS, as células foram incubadas com anticorpos secundários por 1 h em temperatura ambiente.
Para a coloração com anti-V5 de ligantes Wnt, as células foram adicionalmente lavadas por 10 min em PBS 0,1% Tween 20 antes da incubação com a solução de anticorpo secundário. Para o ensaio de ligação de proximidade (PLA) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), as células foram bloqueadas por 30 min a 37° C com a solução de bloqueio fornecida pelo fabricante antes de serem incubadas com os anticorpos primários por 1 h em temperatura ambiente. As células foram lavadas três vezes e incubadas com as sondas PLA anticoelho PLUS e anticamundongo MINUS durante 1 h a 37° C. Após duas lavagens com PBS, as células foram incubadas com a solução Duolink Ligation por 30 min a 37° C. Após duas lavagens com PBS, as células foram incubadas com a solução de amplificação Duolink durante 100 min a 37° C. Os seguintes anticorpos foram usados: anti-V5 monoclonal de camundongo (R96025, Life Technologies, Carlsbad, CA) a 1: 500 para IF e PLA, anti-HA policlonal de coelho purificado (H6908, St.
Louis, MO) a 1: 400 para IF e PLA e anticorpo secundário conjugado com Alexa488 anticamundongo (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) a 1: 5000. As células foram coradas por 2 min com Hoechst diluído para 10 µg ml−1 em PBS.
1.7. Western blotting, dotblot e coimunoprecipitação
[00391] Os seguintes anticorpos foram usados: coelho anti-DVL2 (1: 1000, 3216, Cell Signaling Technology, Leiden, Holanda), coelho anti-DVL2-fosfo T224 (1: 1000, ab124941, Abcam, Cambridge, Reino Unido) e anticamundongo β-actina (1: 50.000, A5441, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), anti-GFP de frango (1: 5000, GFP-1010, Aves, Tigard, OR) e anti-FLAG M2 monoclonal de camundongo (1: 1000, F1804, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). As análises de dot blot foram realizadas de acordo com os protocolos padrões com um aparelho BioDot SF (Bio-Rad, Munich, Germany). Diluições em série do sobrenadante foram colocadas em uma membrana de nitrocelulose (GE Healthcare, Little Chalfont, UK). Após secagem, a membrana foi incubada com os anticorpos como descrito acima para os Western blots. Para a coimunoprecipitação, as células HEK293T transfectadas de placas de 6 poços foram lavadas duas vezes e separadas da placa com PBS. As células foram sedimentadas por centrifugação e lisadas em tampão de lise (150 mM NaCl, 25 mM Tris (pH 7,5), 1% NP40) contendo inibidor de proteína (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) por 30 min a 4°C.
Após centrifugação, o sobrenadante foi incubado com gel de afinidade anti-FLAG M2 (A2220, Sigma, St. Louis, MO) durante 3 h a 4°C. As contas foram lavadas cinco vezes com o tampão de lise e fervidas em igual quantidade de tampão de amostra Laemmli 2x.
1.8. Microscopia e processamento de imagens
[00392] As células e embriões de peixe-zebra foram fotografados com um microscópio confocal LSM710 e as imagens foram processadas em ImageJ. Imagens de fenótipos de fusão ocular foram obtidas no Leica M165 FC. As representações da vasculatura cerebral foram geradas usando o software Imaris (BitPlane, Zurique, Suíça). A porcentagem de áreas PLA positivas (PLA +) e áreas DAPI positivas (DAPI +) foram calculadas usando ImageJ em imagens contendo cerca de 50 a 100 células. A área PLA + foi medida após a aplicação manual de um limite fixo. A área DAPI + foi medida após a aplicação do método de limiar "padrão" na Imagem J.
1.9. Modelagem estrutural
[00393] A estrutura de Xenopus Wnt8a (PDB ID: 4F0A) (C. Y. Janda, D. Waghray, A. M. Levin, C. Thomas, K. C.
Garcia, Science. 337, 59-64 (2012)) foi usada como um modelo inicial para Wnt7a. Os resíduos em falta e as substituições foram modelados usando o programa Modeller (B. Webb, A. Sali, Current Protocols in Bioinformatics (John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, NJ, EUA, 2016), vol. 54, p. 5.6.1 -5.6.37.). A estratégia de modelagem incluiu a contabilização das pontes dissulfeto existentes, conforme observado em Wnt8. Os melhores modelos iniciais foram submetidos a uma minimização de energia de gradiente conjugado no vácuo com o Cα restringido e então liberado em uma segunda etapa de minimização. Esses modelos foram então embutidos em uma caixa d'água e a neutralidade elétrica foi alcançada adicionando contra-íons Na+ a 150 mM. Todo o sistema foi novamente minimizado em energia em 3000 etapas.
A simulação da dinâmica molecular foi realizada por 0,5 ns com o programa NAMD 2.7 em temperatura constante (36,85° C) e pressão constante (1 atm), com limites periódicos e usando CHARMM36 como campo de força (JC Phillips et al., J.
Comput. Chem. 26, 1781-1802 (2005). Um intervalo de tempo de 2 fs foi usado para integrar as equações de movimento.
As interações de curto alcance foram cortadas em 12 Å e o método de Ewald de malha de partículas suaves para calcular as interações eletrostáticas Os átomos de hidrogênio foram restringidos usando o algoritmo SHAKE. O modelo resultante é uma representação média da simulação estável.
1.10. Proteínas recombinantes e peptídeos sintéticos
[00394] As proteínas de fusão Reck-CK-Fc foram recuperadas em meio sem soro FreeStyle 293 expression (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) do sobrenadante de culturas de células HEK293T 72h após a transfecção com Lipofectamine 2000 (Life Technologies, Carlsbad, CA). Após a coleta, os sobrenadantes foram concentrados 50 vezes por centrifugação (GE Healthcare, Little Chalfont, UK) ou submetidos à purificação por afinidade com Proteína G (Protein G Sepharose 4 Fast Flow, Sigma-Aldrich, St. Louis,
MO). A pureza da proteína foi avaliada usando coloração com azul de Coomassie após PAGE. Peptídeos de ligação Wnt sintéticos foram obtidos de Chinapeptide Co., Ltd com pureza acima de 90%.
1.11. Calorimetria de titulação isotérmica
[00395] As proteínas de fusão Reck-CK-Fc foram recuperadas em meio sem soro FreeStyle 293 expression (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) do sobrenadante de culturas de células HEK293T 72h após a transfecção com Lipofectamine 2000 (Life Technologies, Carlsbad, CA). Após a coleta, os sobrenadantes foram concentrados 50 vezes por centrifugação (GE Healthcare, Little Chalfont, UK) ou submetidos à purificação por afinidade com Proteína G (Protein G Sepharose 4 Fast Flow, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). A pureza da proteína foi avaliada usando coloração com azul de Coomassie após PAGE. Peptídeos de ligação Wnt sintéticos foram obtidos de Chinapeptide Co., Ltd com pureza acima de 90%.
1.12. Microscopia de força atômica
[00396] Lâminas de vidro revestidas com uma fina camada de ouro foram limpas em um limpador de radiação ultravioleta e ozônio (UV-O) (Jetlight) por 15 min e subsequentemente imersas durante a noite em uma solução de etanol contendo 1 mM de ácido 16-mercaptododecahexanóico e 1-mercapto-1- undecanol a uma reatio volumétrica de 1:99.
Os substratos foram então enxaguados com etanol, secos com N2 e adicionados a uma solução contendo volumes iguais de 20 mg ml-1 N-hidroxissuccinimida (NHS) e 50 mg ml-1 1-etil- 3-(3-dimetilaminopropil)-arbodiimida (EDC) por 30 min. As superfícies ativadas com NHS obtidas foram enxaguadas com água ultrapura e incubadas com 100 µl de uma solução de proteína G 10 µg ml-1 por 1 hora à temperatura ambiente. As amostras foram então lavadas com tampão de lavagem (3x 5 min) e posteriormente incubadas em 100 µl de tampão de bloqueio durante 1 hora à temperatura ambiente. Finalmente, 50 µl de uma solução de Reck-CK-Fc 0,2 µg ml-1 foram adicionados aos substratos durante 1 hora, enxaguados com tampão de lavagem e subsequentemente usados para experiências de AFM. As medições de espectrometria de força de molécula única (SMFS) foram realizadas em tampão PBS em temperatura ambiente usando um Nanoscope VIII Multimode AFM (Bruker). Foram utilizados cantiléveres triangulares AFM (MSCT, Bruker) com pontas de nitreto de silício e uma constante de mola nominal entre 0,01-0,06 N m-1.
Cantilevers foram calibrados no final de cada experimento usando o método de ruído térmico, conforme descrito em Butt et al. Calculation of thermal noise in atomic force microscopy. Nanotechnology 6, 1-7 (1995). Pontas funcionalizadas foram derivatizadas usando um ligante NHS- PEG27-Malemida, seguindo um protocolo como descrito em
Wildling et al., Probing binding pocket of serotonin transporter by single molecular force spectroscopy on living cells. J. Biol. Chem. 287, 105-113 (2012), para anexar covalentemente o Pep7b ligando o resíduo de cisteína adicionado no terminal C. Após a funcionalização, os cantilevers foram lavados com PBS (3 x 5 min) e armazenados em poços individuais de uma placa multifuncional contendo 2 ml de PBS por poço a 4° C até serem usados em experimentos de AFM. As curvas força-distância foram registradas como arranjos de 32x32 pixels em áreas de 1x 1 µm2, usando uma força aplicada de 250 pN, um tempo de contato de 0,25 se uma aproximação constante e velocidade de retração de 1 µm s-1. Para medições de espectroscopia de força dinâmica, a velocidade de retração do cantilever foi variada da seguinte forma: 20 nm s-1, 100 nm s-1, 200 nm s-1, 1 µm s- 1, 2 µm s-1, 10 µm s -1 e 20 µm s-1. Normalmente, pelo menos 2.000 curvas força-distância foram realizadas para cada cantilever em uma velocidade de retração particular.
Os dados coletados foram analisados usando o software Nanoscope Analysis (Bruker). O segmento de retração de cada curva foi analisado e os eventos de desvinculação foram considerados específicos se ocorressem a uma distância entre 5-50 nm do ponto de contato. A força de adesão mínima foi posteriormente usada para calcular as probabilidades de ligação e construir histogramas de distribuição de força.
Para reconstruir a paisagem de energia das interações medidas, as taxas de carregamento foram calculadas a partir da curva força vs tempo, como a inclinação do evento de adesão antes que o cantilever da ponta salte para a superfície. A dependência da força com a taxa de carregamento foi então plotada em gráficos de espectroscopia de força dinâmica.
1.13. Análise estatística
[00397] A análise estatística foi realizada com o software GraphPad. Os dados representam a média ± DP. Os valores P foram calculados pela ANOVA unilateral (teste post hoc de Dunnett) e teste t de Student para comparações múltiplas e únicas de dados normalmente distribuídos (ensaios STF e PLA) e pelo Kruskal-Wallis (teste post hoc de Dunn) para comparações múltiplas de dados não normalmente distribuídos (quantificações CtA); *p <0.05; **p <0.01; *** p <0.001.
2.Resultados
2.1. Reck é um receptor específico de Wnt7 independente de Frizzled
[00398] As relações de ligação Wnt/Fz são promíscuas, com vários Wnts competindo pela ligação a Fzs individuais e vários Fzs capazes de responder a um único Wnt. Estudos cristalográficos recentes confirmaram que a química da interação Wnt/Fz é incompatível com o emparelhamento inequívoco Wnt e Fz, com o contato Wnt/Fz sendo dominado por resíduos conservados ou modificações químicas idênticas (CY Janda, D. Waghray, AM Levin, C.
Thomas, KC Garcia, Science. 337, 59–64 (2012)). Essas observações levantam a questão de como as células interpretam os padrões de expressão espacialmente e temporariamente sobrepostos de vários ligantes Wnt que às vezes têm funções biológicas opostas.
[00399] Um exemplo pertinente é o controle exclusivo do prosencéfalo de mamíferos e do desenvolvimento vascular da medula espinhal ventral por Wnt7a e Wnt7b (JM Stenman et al., Science. 322, 1247–1250 (2008); R. Daneman et al., Proc. Natl. Acad . Sci. USA 106, 641-646 (2009); S. Liebner et al., J. Cell Biol. 183, 409-417 (2008)).
Especificamente, para responder a Wnt7 derivado de progenitor neural e ativar a sinalização Wnt/β-catenina, as células endoteliais cerebrais (ECs) devem expressar Gpr124, um membro órfão da classe de adesão de receptores acoplados à proteína G (M. Cullen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 108, 5759-5764 (2011); F. Kuhnert et al., Science. 330, 985-989 (2010); KD Anderson et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 108, 2807–2812 (2011); Y. Zhou, J. Nathans, Dev. Cell.
31, 248–256 (2014); E. Posokhova et al., Cell Rep. 10, 123– 130 (2015); B. Vanhollebeke et al., Elife. 4, 1-25 (2015)), bem como a glicoproteína Reck ancorada por GPI (B.
Vanhollebeke et al., 2015; F. Ulrich et al., Development.
143, 147–159 (2015)). Gpr124 e Reck interagem fisicamente e estimulam sinergicamente respostas específicas de Wnt7 (B.
Vanhollebeke et al., 2015; C. Cho, PM Smallwood, J.
Nathans, Neuron. 95, 1056-1073 (2017)), mas não se sabe como isso o módulo de sinalização pode discriminar Wnt7 de outros ligantes Wnt expressos localmente.
[00400] Foi determinado como Wnt7 é especificamente reconhecido dentro deste módulo de sinalização, uma questão inerentemente complicada pela expressão ubíqua de receptores Frizzled e seus coreceptores Lrp5 / 6 em células de vertebrados. Portanto, um primeiro conjunto de linhas celulares geneticamente esgotadas dos componentes do complexo receptor em nós definidos foi gerado direcionando (i) todos os dez genes FZ (FZ1-10 -/-), (ii) LRP5 e LRP6 (LRP5 -/-; LRP6 -/-) ou (iii) GPR124 e RECK (GPR124 -/-; RECK -/-), por meio de mutagênese multiplexada CRISPR/Cas9 em células HEK293. Para identificar os determinantes da ligação de Wnt7, ligantes de Wnt marcados com V5 foram expressos transitoriamente nessas linhas de células. Wnt7a- V5, mas não Wnt3a-V5, pode ser imunodetectado na membrana plasmática de WT, FZ1-10 -/- e células LRP5 -/-; LRP6 -/-, mas não nas células GPR124 -/-; RECK -/- células (Fig. 1A).
A restauração ectópica da expressão de Reck, sozinha ou em combinação com Gpr124, foi suficiente para restaurar especificamente a marcação de membrana Wnt7a-V5 nessas células, enquanto a expressão de Gpr124 sozinha não foi (Fig. 1B). Como esperado, Fz5 foi competente para a ligação Wnt7a-V5, refletindo a competência deste receptor Frizzled para mediar a sinalização Wnt7 de linha de base.
[00401] Usando experimentos de competição celular, foi descoberto que Reck recruta Wnt7a na ausência de Fz, pois a cocultura de células FZ1-10 -/- que expressam Reck ectopicamente, mas não Gpr124ΔICD, poderia reduzir drasticamente a sinalização de Wnt7a-Fz5 em células repórteres GPR124 -/-; RECK -/- Super Top Flash (STF) (Fig.
1C) vizinhas. Digno de nota, neste ensaio de captura de ligante, Gpr124 não tinha o seu domínio ICD C-terminal para restringir a análise às partes expostas à superfície do complexo Gpr124/Reck. Em seguida, o PLA foi usado para mapear os domínios de Reck necessários para a ligação Wnt7a. Reck é composto por cinco motivos de nó de cisteína N-terminal (CK), um domínio rico em cisteína (CRD) e três motivos Kazal intercalados com motivos semelhantes a EGF precedendo o local de âncora GPI. Uma coleção de variantes de deleção marcadas com epítopo HA foi gerada para cada domínio de sinais de Reck e PLA foram quantificados. Esta análise revelou que o domínio de nó de cisteína N-terminal, e mais particularmente CK4 e CK5 eram necessários para a ligação (Figura 1D). De acordo com esses resultados, a expressão de ReckΔCK4 também foi inativa em ensaios de competição (Fig. 1C).
[00402] Embora Reck pareça ser o determinante de ligação Wnt7 dominante, sua função na sinalização Wnt é conhecida por depender de sua capacidade de formar um complexo com Gpr124 por meio de seu domínio CK N-terminal (Y. Zhou, J. Nathans, Dev. Cell. 31 , 248-256 (2014); B.
Vanhollebeke et al., Elife. 4, 1-25 (2015)), um domínio que é mostrado aqui como adicionalmente implicado na ligação Wnt7a. Em contraste com HA-Reck e HA-Fz5, HA-Gpr124 não gera sinais de PLA quando expresso com Wnt7a-V5 (Fig. 1E).
No entanto, um aumento de 4 vezes nos sinais de PLAs Wnt7a- V5/HA-Reck foi detectado após a coexpressão de Gpr124 não marcado (Fig. 1F). Esta estimulação de ligação por Gpr124 era dependente de Reck CK1 e CK2, de acordo com o papel dos motivos CK1 N-terminal na formação do complexo Gpr124/Reck (C. Cho, PM Smallwood, J. Nathans, Neuron. 95, 1056–1073 (2017)). Em suma, com a suposição tácita de que os PLAs atuam como um proxy válido para a interação direta entre um ligante extracelular difusível e seu receptor de membrana, esses resultados sugerem que Reck constitui o primeiro receptor específico de ligante Wnt independente de Fz relatado, cuja ligação a Wnt7 é reforçado pela ligação proximal de Gpr124 dentro do domínio CK (Fig. 1G).
2.2. O reconhecimento Wnt7 envolve uma região ligante altamente divergente e intrinsecamente desordenada de ligantes Wnt
[00403] Os ligantes Wnt são notoriamente refratários à produção de alto nível de recombinação, impedindo estudos de interação bioquímica ou biofísica sem células entre Wnt7 recombinante de comprimento total e Reck. Os ligantes Wnt adotam uma estrutura de dois domínios que lembra uma mão humana beliscando o domínio globular Fz rico em cisteína (CRD) através do "polegar" palmitoilado do domínio N- terminal do ligante (NTD) e resíduos hidrofóbicos do "índice" C- domínio terminal (CTD). As estruturas envolvidas na ligação Fz estão localizadas principalmente nas extremidades do ‘polegar’ e ‘indicador’. Os dois domínios são conectados por meio de uma região de ligação inter-domínio flexível do NTD.
[00404] Foi gerada uma coleção de variantes Wnt7 deletadas para domínios ou resíduos específicos, ou que foram projetadas para transportar domínios selecionados de outros ligantes Wnt (Fig. 2A). Cada um desses ligantes quiméricos foi aplicado a PLAs, revelando que a ligação de Reck ocorre exclusivamente no NTD Wnt7a.
Surpreendentemente, o Wnt7aNTD sozinho se ligou a Reck tão potentemente quanto o Wnt7a de comprimento total, enquanto o Wnt7aCTD não (Fig. 2B). O ácido palmitoléico implicado na ligação de Fz não estava envolvido na interação de Reck,
pois o mutante Wnt7aS206A incapaz de ser palmitoilado na Serina 206 ligou-se a Reck de forma eficiente. O modo de reconhecimento NTD de Wnt7a por Reck foi confirmado por ligantes Wnt7a quiméricos nos quais CTDs foram trocados com domínios equivalentes de Xenopus Wnt8a (XWnt8a) e Wnt4 e Wnt16 murinos. Estes ensaios de ligação revelam que Reck discrimina entre ligantes Wnt, reconhecendo um motivo incorporado no NTD Wnt7a, em locais distintos daqueles envolvidos por Fz.
[00405] Variantes menores de NTD sem a região de ligação, Wnt7a1-212 e Wnt71-237, não se ligaram a Reck.
Esta análise mutacional combinada com a segregação espacial da região de ligação Wnt7a longe dos sítios de ligação Fz, sugere que Reck decodifica Wnt7a, pelo menos em parte, através deste motivo de ligação. A região de ligação, que é o motivo mais variável em toda a família de ligantes Wnt, exibe uma forte conservação evolutiva entre os ortólogos Wnt7 em todo o clado de vertebrados (Fig. 2D). Para mapear com precisão o local de interação, os presentes inventores analisaram a sinalização STF dependente de Gpr124/Reck de uma coleção de 101 variantes de resíduo único de Wnt7a (Fig. 2C). Os resíduos mutados correspondiam a resíduos NTD expostos à superfície estrita ou quimicamente conservados entre Wnt7a e Wnt7b, mas não encontrados em XWnt8a ou qualquer um dos outros ligantes a Wnt. Como mostrado na
Fig. 2C, enquanto ~80% das variantes examinadas eram tão ativas quanto WT Wnt7a, apenas oito variantes Wnt7a (sublinhadas) reduziram a sinalização dependente de Gpr124/Reck para menos de 10%. Todos menos um (I37) resíduo crítico agrupado na parte superior ou traseira da estrutura Wnt7a prevista, com seis mapeamentos adicionais para o domínio do ligador. Todos os resíduos críticos são estritamente conservados entre os ortólogos Wnt7 de humano para peixe e ausentes em qualquer outro Wnt, incluindo Wnt3a (Fig. 2D). Os presentes inventores investigaram ainda se a inatividade das variantes do ligante Wnt7 pode resultar de ligação defeituosa a LRP5/6, Reck ou ambos. Em linha com uma função na ligação de Reck, Wnt7a4A, uma variante de quatro resíduos de Wnt7a (V241A, F251A, L252A, K262A; em que as substituições indicam a posição do aminoácido no polipeptídeo precursor mWnt7a) dentro de uma região ligante, mostrou sinais Reck PLA reduzidos em comparação com o de WT Wnt7a. Esta atividade mais baixa ocorreu apesar das taxas de secreção ligeiramente melhoradas (Fig. 2E).
[00406] Ao todo, esses dados demonstram que Wnt7 é reconhecido por Reck, pelo menos em parte, por meio de seu motivo vinculador de "assinatura". No entanto, Wnt7 ligado a Reck deve ser funcionalmente integrado em maquinários de ativação e transdução de sinal eficientes para que as células exibam respostas celulares específicas de Wnt7 potenciadas.
2.3. Gpr124 não atua como um GPCR transdutor de sinal clássico durante a sinalização de Wnt7 e a angiogênese cerebral
[00407] A própria Reck, em virtude de seu modo de ancoragem de GPI ao único folheto externo da membrana plasmática, tem potencial limitado para transduzir sinais de Wnt7 através da bicamada da membrana e, portanto, a transdução de sinal deve depender de outros componentes do complexo receptor, ou seja, Gpr124 e/ou Fz/Lrp5/6.
[00408] Para descobrir esse mecanismo de transdução de sinal, a relação funcional entre os complexos Gpr124 e Fz/Lrp5/6 foi avaliada em células em cultura. Usando células "Fz-livre" e "Lrp5/6-livre", foi geneticamente estabelecido que a função de Gpr124/Reck depende estritamente da função Fz e Lrp5/6 (Fig. 3A-E). Foi ainda estabelecido que seus respectivos domínios de ligação ao ligante Wnt sensível a DKK1 e CRD são essenciais para a sinalização, o que implica que Wnt7 se liga e ativa Fz/Lrp5/6 de uma maneira clássica.
[00409] Foi demonstrado que o desenvolvimento da vasculatura do SNC do peixe-zebra depende estritamente na sinalização de Reck/Gpr124, em um processo de germinação angiogênica que pode ser prontamente quantificado.
Portanto, constitui um cenário privilegiado para realizar a análise estrutura-função in vivo em resposta aos níveis de entrada Wnt7 fisiológicos (B. Vanhollebeke et al., Elife.
4, 1-25 (2015); N. Bostaille, A. Gauquier, L. Twyffels, B.
Vanhollebeke, Biol. Open. 5, 1874–1881 (2016)). Usando injeções de mRNA sintético no estágio de uma célula WT ou embriões gpr124 -/-, os presentes inventores começaram avaliando a atividade de três variantes de Gpr124 (Fig. 4A) sem a parte extracelular N-terminal (Gpr124ΔECD a porção de sete intervalos (Gpr124ΔTM2-7) ou a extensão citoplasmática do terminal C (Gpr124ΔICD). Enquanto a expressão ectópica de Gpr124ΔECD e Gpr124ΔICD não restaurou a angiogênese cerebral em mutantes gpr124, a atividade de Gpr124ΔTM2-7 foi suficiente para desencadear a angiogênese cerebral in vivo (Fig. 4B, C) e a atividade de Wnt em ensaios in vitro STF (Fig. 4D).
[00410] Esta competência retida de Gpr124ΔTM2-7 não foi antecipada: Gpr124 é um GPCR, uma superfamília de receptor classicamente retransmitindo estímulos extracelulares dentro da célula por remodelação conformacional induzida por ligante dos sete intervalos transmembranares, que estão ausentes na proteína mutante Gpr124ΔTM2-7 modificada . Com base nesses resultados, parece que o Gpr124 pode não atuar como um GPCR clássico ao promover a sinalização Wnt7, uma vez que não requer transdução de sinal através da membrana. Em vez disso, Gpr124 aparentemente atua neste módulo como uma proteína transmembranar deficiente em sinalização cuja atividade depende do domínio extracelular de ligação de Reck (ECD) e do domínio intracelular conformacionalmente desacoplado (ICD). Os presentes inventores levantaram a hipótese de que o Gpr124 ICD pode operar por meio de Desgrenhado, o efetor crucial da sinalização Wnt interagindo com Fz. Esta 'hipótese Dvl' está enraizada nas descobertas de que Gpr125, um GPCR de adesão intimamente relacionado com Gpr124, Os presentes inventores levantaram a hipótese de que o Gpr124 ICD pode operar por meio de dishevelled, o efetor crucial da sinalização Wnt interagindo com Fz. Esta 'hipótese Dvl' está enraizada nas descobertas de que Gpr125, um GPCR de adesão intimamente relacionado com Gpr124, mostrou interagir fisicamente com Dvl por meio de seu domínio ICD C-terminal (X. Li et al., Development. 140, 3028–3039 (2013)) e que híbridos Gpr124/125 em que o ICD de Gpr124 é substituído pelo ICD de Gpr125 são capazes de promover a angiogênese cerebral em peixes-zebra (B.
Vanhollebeke et al., Elife. 4, 1-25 (2015)) (ver também Fig. 4E). Da mesma forma, os híbridos Gpr124/Fz2 (Gpr124ICDFz2) nos quais o Gpr124 ICD foi substituído pelo Fz2 ICD, conhecido por se ligar a Dvl, eram competentes. Em contraste, Fz2 completo não era. Notavelmente, a atividade de Gpr124ICDFz2 era dependente dos locais de ligação Dvl dos motivos KTxxW e ETTV dentro do ICD Fz2 (Fig. 4E).
2.4. Polímeros Dvl montam sinalossomos Wnt específicos de ligante ligando Fz e Gpr124
[00411] Experimentos de coimunoprecipitação realizados entre Gpr124 marcado com FLAG N-terminal e Dvl- GFP em células FZ1-10 -/- HEK293T confirmaram a interação entre Gpr124 e Dvl (Fig. 5A), mesmo na ausência de ETTV C- terminal. Ao contrário de Fz, Gpr124 não produziu um aumento detectável nos níveis de Dvl fosforilados, um indicador precoce de ativação de sinalização Wnt a montante da estabilização de β-catenina (SI Yanagawa, F. Van Leeuwen, A. Wodarz, J. Klingensmith, R. Nusse, Genes Dev.
9, 1087–1095 (1995); X. Huang et al., Science. 339, 1441– 1445 (2013)) (Fig. 5B). Esta ausência de ativação Dvl induzida por Gpr124 é consistente com os experimentos da Fig. 4 que identificou Gpr124 como uma proteína deficiente em sinalização. Tomados em conjunto, esses experimentos identificam Dvl como um parceiro de ligação constitutivo de Gpr124 que poderia mediar suas atividades de sinalização Wnt7.
[00412] Gpr124, Reck e Fz/Lrp5/6 foram propostos para formar complexos de receptor de ordem superior em células cultivadas (C. Cho, P. M. Smallwood, J. Nathans, Neuron. 95, 1056-1073 (2017)). Os presentes inventores argumentaram que o Gpr124 ICD pode montar este complexo via Dvl. As moléculas Dvl de fato montam sinalossomos por meio de polimerização dinâmica por meio de automontagens cabeça- a-cauda de seus domínios Dix N-terminais. Essas autoassociações permitem a concentração local de várias proteínas reguladoras de sinalização Wnt citoplasmáticas, incluindo quinases e componentes da maquinaria endocítica (M. Gammons, M. Bienz, Curr. Opin. Cell Biol. 51, 42-49 (2018), M . Bienz, Trends Biochem. Sci. 39, 487-495 (2014)). Como Dvl interage fisicamente com Gpr124 e Fz, Gpr124 e o Wnt7 ligado a Reck associado podem ficar presos em sinalossomos Wnt dinâmicos, aumentando assim a concentração local de ligantes Wnt7 disponíveis para sinalização de Fz.
[00413] Os sinalossomos Wnt são facilmente detectados por microscopia de luz como grandes estruturas pontilhadas enriquecidas em Dvl que se formam na ou abaixo da membrana plasmática (M. Bienz, Trends Biochem. Sci. 39, 487-495 (2014); J. Bilic et al., Science. 316, 1619–1622 (2007); MV Gammons, M. Renko, CM Johnson, TJ Rutherford, M.
Bienz, Mol. Cell. 64, 92–104 (2016)). Para determinar se Fz e Gpr124 codistribuem em sinalossomos Wnt de uma maneira dependente de Dvl, a localização de Fz-GFP e Gpr124-tagRFP expressos individualmente foi examinada primeiro em células de camada profunda de blástula (DEL). Fz4 decorou toda a periferia da membrana plasmática enquanto que, em vez disso, Gpr124-tagRFP se acumulou nos contatos celulares.
Esta localização diferencial da membrana foi mantida após a expressão de Dvl (Fig. 5C). Consistente com sua capacidade de ligação Dvl, ambos os receptores recrutaram Dvl para seu respectivo compartimento de membrana (Fig. 5D). No entanto, quando Gpr124-tagRFP e Fz4-GFP foram coexpressos, Gpr124- tagRFP permaneceu ancorado nas junções intercelulares, mas Fz4-GFP foi quantitativamente relocalizado para os subdomínios de membrana Gpr124 de uma maneira dependente de Dvl (Fig. 5E), onde as proteínas colocalizadas em estruturas pontilhadas reminiscentes de sinalossomo Wnt particularmente evidentes em membranas celulares EVL (Fig.
5F). Os presentes inventores usaram complementação de fluorescência bimolecular como um ensaio para testar a interação Fz/Gpr124 dependente de Dvl em células DEL. A coinjeção de Gpr124-VN155 (I152L) e Fz1-VC155 realmente gerou sinais de junção brilhante de uma maneira dependente de Dvl (Fig. 5G), demonstrando que Fz e Gpr124 interagem indiretamente através da proteína-andaime Dvl. Isso fornece um mecanismo molecular para o agrupamento espacial de Fz/Lrp5/6 e Gpr124 juntamente com o Wnt7 ligado a Reck associado em sinalossomos de Wnt dotados de potencial de discriminação de ligante Wnt, explicando assim as respostas específicas de Wnt7 de células Gpr124/Reck-positivas (ver modelo final, Fig. 6).
[00414] Em resumo, este trabalho lança os primeiros insights estruturais e mecanicistas sobre as capacidades de decodificação Wnt das células de vertebrados. Ele também demonstra que a estrutura Wnt limitada evolutivamente reteve diversidade e plasticidade intrínseca suficientes para permitir respostas celulares específicas do ligante, uma propriedade que até agora se pensava exigir ligantes Frizzled estruturalmente não relacionados como Norrin (MB Lai et al., Cell Rep. 19, 2809– 2822 (2017)). Esses insights estruturais sobre a evolução e função Wnt sugerem imediatamente que existem módulos de decodificação Wnt adicionais, permitindo o ajuste fino de comportamentos celulares em resposta a outros membros da família Wnt ou Fz.
Exemplo 2: O reconhecimento molecular de Wnt7 por Reck minimiza os requisitos de interação Wnt/Fz
1. Materiais e métodos
1.1. Linhas de peixe-zebra
[00415] O peixe-zebra (Danio rerio) foi criado e manuseado em condições normais de acordo com as regras do Estado da Bélgica (número de aprovação do protocolo: CEBEA- IBMM-2017-22: 65). Foi utilizada a seguinte linha: Tg (- 17,0neurog1: EGFP) w61 (McGraw et al., J. Neurosci 28 (47): 12558-69 (2008)).
1.2. Morfolinos, construções de RNA e microinjeção
[00416] O seguinte morfolino bloqueador de splice (MOs) (GeneTools, Eugene, OR) foram injetados em embriões no estágio de uma célula: wnt7aa (TTCCATTTGACCCTACTTACCCAAT, 6 ng). Os mRNAs sintéticos foram transcritos de plasmídeos pCS2 após digestão com NotI usando o kit mMessage mMachine SP6 (Ambion, Carlsbad, CA) e injetados em embrião de peixe-zebra em estágio de uma célula. Para a microinjeção de Xenopus laevis, 15 pg de wnt7a ou wnt7a K190A ou Wnt7a1-278 mRNA foram injetados em um blastômero ventral do embrião em estágio de quatro células.
1.3. Construtos de expressão de plasmídeo
[00417] Todos os componentes de sinalização Wnt e outras construções de expressão foram expressos a partir do promotor CMV do vetor pCS2 após recombinação usando clonagem In-Fusion (Takara, Mountain View, CA), exceto para Fz1 (addgene#42253) e Fz5 (addgene#42267). Variantes e deleções de mutação de ponto único foram geradas usando clonagem In-Fusion e produtos de PCR sobrepostos em tandem.
Todas as construções foram confirmadas por sequenciação.
1.4. Cultura de células e linhas de células mutantes HEK293
[00418] As células HEK293T foram obtidas da ATCC (CRL-3216) e a linha de células HEK293 STF foi gentilmente cedida por Jeremy Nathans (John Hopkins). As células foram cultivadas em meio DMEM/F12 (Lonza, Basel, Suíça) suplementado com 10% de soro fetal bovino e mantidas em uma incubadora umidificada equilibrada com 5% de CO2. 7B.
1.5. Ensaios de luciferase dupla STF
[00419] As células foram colocadas em placas de 96 poços e transfectadas após 24 h em triplicado com Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA). A quantidade de DNA de plasmídeo transfectado por poço foi otimizada para cada vetor de expressão: Renilla luciferase (0,5 ng), Wnt (20 ng), Fz (5 ng), LRP (2,5 ng), Gpr124 (10 ng), Reck (10 ng) a menos que indicado de outra forma. A quantidade total de DNA foi ajustada para 100 ng por poço com o vetor pCS2 vazio. As células foram colhidas em tampão de lise passivo (E1960, Promega, Wisconsin) e as atividades das luciferases Firefly e Renilla foram medidas sequencialmente usando o sistema Dual-Luciferase Reporter Assay (E1960, Promega, Madison, Wisconsin) 48 h pós-transfecção.
1.6. Microscopia e processamento de imagens
[00420] Embriões de peixe-zebra foram fotografados com um microscópio confocal LSM710 e as imagens foram processadas em ImageJ. Imagens de fenótipos de desenvolvimento do peixe-zebra foram obtidas no Leica M165 FC. As larvas de Xenopus foram fotografadas com um Olympus SZX16.
1.7. Análise estatística
[00421] A análise estatística foi realizada com o software GraphPad. Os dados representam a média ± DP. Os valores de p foram calculados pela ANOVA de uma via (teste post hoc de Dunnett) e teste t de Student para comparações múltiplas e únicas de dados normalmente distribuídos (ensaios STF) e pelo Kruskal-Wallis (teste post hoc de Dunn) para comparações múltiplas de dados não normalmente distribuídos (quantificações DRG); *p <0,05; **p <0,01; ***p <0,001.
2. Resultados
[00422] Os presentes inventores identificaram no experimento 1 que Reck discrimina entre ligantes Wnt ao reconhecer um ligante dentro do Wnt7a, em locais distintos daqueles envolvidos por Fz. O mecanismo de ligação parece, portanto, compatível com a formação de um complexo Wnt7/Reck/Gpr124/Fz/LRP5/6 de ordem superior mantido junto por andaimes intracelulares, em que Wnt7 é envolvido simultaneamente por Fz, Reck e LRP5/6. Os presentes inventores revelaram ainda que o domínio N-terminal de Wnt7a (Wnt7a1-278) ainda se liga a Reck.
[00423] Em seguida, a atividade de STF dessas variantes truncadas de Wnt7a para sinalização de Fz5 e Gpr124/Reck/Fz/LRP foi avaliada (Fig. 7A). A sinalização de Wnt por meio de Fz5 exigia a preservação de ambos os locais de contato Wnt/Fz e todas as variantes de Wnt7a sem um deles, por truncamento ou pela ausência de ácido palmitoléico, foram incapazes de estimular a sinalização de Fz5 (Fig. 7A). A sinalização Gpr124/Reck/Fz1 foi igualmente sensível a truncamentos ou mutações de Wnt7a, com uma exceção notável: o domínio único Wnt7a1-278 manteve a capacidade de sinalização de ~ 40% via Gpr124/Reck/Fz1 (Fig. 7A, seta). Os presentes inventores propuseram que dentro de um complexo formado por Wnt7, Fz, LRP5/6 e Reck, o ponto de contato adicional fornecido por Reck está compensando a falta de interação Wnt/Fz no índice de ligante.
[00424] Para diferenciar os resíduos que são essenciais dentro de Wnt7a para a sinalização Gpr124/Reck/Fz/LRP da sinalização Fz5, Gpr124/Reck/Fz/LRP ou sinalização STF dependente de Fz5 de uma coleção de variantes de resíduo único de Wnt7a foram analisados (Fig.
7B, 7C). Quarenta e duas variantes de mWnt7a de comprimento total (na caixa em 7B) foram identificadas e que são inativas para a sinalização Fz5, mas ainda ativam a sinalização Wnt mediada por Gpr124/Reck/Fz/LRP, mais particularmente ativam Gpr124/Reck/Fz/Wnt mediada por LRP sinalização por pelo menos 35% da atividade de sinalização Wnt mediada por Gpr124/Reck/Fz/LRP do Wnt7a de comprimento total maduro de tipo selvagem (Fig. 7B-7C, ver tabela 3).
Trinta e uma destas variantes, mais particularmente,
variantes Wnt7a Q48A (Q17A), I51A (I20A), P56A (P25A), A58R (A27R); I59A (I28A); E64A (E33A); M68A (M37A), L70A (L39A), E72A (E41A); F75A (F44A); V99A (V68A); I160A (I129A); F162A (F131A); K164A (K133A); I172A (I141A); R189A (R158A); K190A (K159A); K190L (K159L); K212A (K181A); R222A (R191A); K229A (K198A); K231A (K200A); V236A (V205A); E239A (E208A); P249A (P218A); Y260A (Y229A); P263A (P232A); T266A (T235A); W322A (W291A); T338A (T307A) e N83Q (N52Q) (em que as substituições indicam a posição do aminoácido no polipeptídeo precursor mWnt7a (e em que as substituições entre colchetes indicam a posição do aminoácido no polipeptídeo maduro mWnt7a, ver tabela 3) foram capazes de ativar a sinalização Wnt mediada por Gpr124/Reck/Fz/LRP por pelo menos 70% da atividade de sinalização Wnt mediada por Gpr124/Reck/Fz/LRP do Wnt7a de comprimento total maduro de tipo selvagem (Fig. 7 BC).
[00425] In vitro, Wnt7a1-278 e Wnt7aK190A (uma das trinta e uma variantes seletivas para sinalização Gpr124/Reck/Fz/LRP) falharam em sinalizar através de qualquer Fz na ausência de Gpr124/Reck (Fig. 7D).
Consequentemente, após a injeção de mRNA no zigoto do peixe-zebra, Wnt7a1-278 e Wnt7aK190A foram bem tolerados e não revelaram posteriorização ou alterações anatômicas grosseiras de até 1 ng e 100 pg, respectivamente (Fig. 7D- E). Por outro lado, 3 pg de wnt7a mRNA induziu a perda de estruturas do prosencéfalo e do olho por ativação ectópica de sinalização Wnt (Kim et al., Nature 407 (6806): 913-6 (2000)) e levou a embriões dismórficos em doses maiores do que 10 pg (Fig. 7E-F).
[00426] Da mesma forma, quando injetado em embriões de Xenopus, Wnt7a causou a duplicação do eixo, um resultado de sinalização Wnt/β-catenina clássico, enquanto Wnt7a1-278 e Wnt7aK190A não (Fig. 7G). A falta de quaisquer defeitos de desenvolvimento discerníveis induzidos por Wnt7A1-278 e Wnt7aK190A, permitiu resgates DRG significativos em wnt7aa morfantes após injeções de 100 pg mRNA, enquanto wnt7aa mRNA injetado em sua dose mais alta tolerada de 10 pg, revelou apenas restauração marginal de neurônios DRG ( Fig.
7H). Juntos, esses experimentos identificam Wnt7a1-278 e Wnt7aK190A como agonistas seletivos de Gpr124/Reck/Fz/LRP que provocam respostas dependentes de Gpr124/Reck/Fz/LRP in vivo sem demonstrar atividade fora do alvo em vias Fz alternativas, fornecendo assim uma prova de conceito de que as vias de sinalização de Fz específicas do ligante podem ser adaptadas para desenvolver novos agonistas de Wnt com seletividade drasticamente aumentada. As posições das substituições de aminoácidos nas variantes do polipeptídeo Wnt7a na seção experimental são indicadas em relação à sequência de aminoácidos do polipeptídeo precursor Wnt7a (ou seja, incluindo o peptídeo sinal). A Tabela 3 mostra a posição das substituições de aminoácidos na sequência de aminoácidos do polipeptídeo precursor Wnt7a e sua posição correspondente na sequência de aminoácidos do polipeptídeo Wnt7a maduro.
[00427] A expressão endotelial transgênica de Wnt7aK190A de camundongo ou Wnt7a1-278 desencadeou a angiogênese cerebral dependente de GPR124/RECK e restaurou a barreira hematoencefálica (conforme avaliado pela expressão de GLUT1) em Wnt7aa -/- peixe-zebra mutante (Figura 9 A-C). Ratinhos Wnt7, Wnt7aK190A e Wnt7a1-278 foram transitoriamente expressos no endotélio de embriões Wnt7aa -/- sob o controle de um promotor kdrl específico do endotélio (receptor do fator de crescimento endotelial vascular semelhante a kdr). Os ligantes Wnt7 foram expressos como uma construção biscistrônica com BFP (Blue Fluorescent Protein) como marcador de transgênese. Em contraste com embriões não injetados, todos os três ligantes restauram a formação de CtAs. A coloração de imunofluorescência anti-GLUT1 dos CtAs após a expressão transgênica de Wnt7, Wnt7aK190A e Wnt7a1-278 em embriões de 60 hpf Wnt7aa -/- revelou maturação da barreira hematoencefálica.
[00428] Em vista do acima, as variantes de Wnt7a são agonistas seletivos de GPR124/RECK que induzem respostas dependentes de GPR124/RECK in vivo sem demonstrar atividade fora do alvo em vias alternativas de Fz.
Tabela 3 Posição do aminoácido no Posição do aminoácido polipeptídeo precursor no polipeptídeo mWnt7a mWnt7a maduro Q48A Q17A I51A I20A P56A P25A A58R A27R I59A I28A E64A E33A M68A M37A L70A L39A E72A E41A F75A F44A V99A V68A R81A R50A N83Q N52Q I160A I129A F162A F131A K164A K133A F166A F135A I172A I141A R177A R146A R189A R158A K190A K159A K190L K159L K190S K159S K212A K181A R222A R191A K229A K198A K231A K200A V236A V205A E239A E208A R245A R214A K247A K216A P249A P218A K253A K222A I254A I223A Y260A Y229A P263A P232A T266A T235A E279A E248A R320A R289A W322A W291A
T338A T307A K349A K349A
[00429] É notado que as sequências de aminoácidos primários de Wnt7a maduro de comprimento total de camundongo e humano de tipo selvagem são idênticas.
Exemplo 3: Entrega de vetor viral de camundongo Wnt7aK190A em camundongos submetidos a um modelo de acidente vascular cerebral (Oclusão da Artéria Cerebral Média transitória (tMCAO))
1. Materiais e métodos
1.1. Geração de construtos de plasmídeo AAV (AAV- PHP.eB-CAG- mWnt7aK190A-p2A-EGFP)
[00430] A variante mWnt7aK190A de comprimento total foi clonada no vetor de transgene pAAV contendo sequências de ITRs flanqueadoras sob os elementos reguladores do promotor pCAG. A variante Wnt7 foi expressa como uma fusão a EGFP pelo intermediário do peptídeo p2A autoclavável. O vetor AAV foi produzido e purificado conforme descrito em Körbelin et al., 2016 por tripla cotransfecção de células HEK293 com os plasmídeos pAAV-transgene, o plasmídeo auxiliar (que codifica a variante do capsídeo AAV-PHP.eB + rep + sequências de inserção) e o plasmídeo auxiliar adenoviral.
[00431] Observa-se que K190A de "Wnt7aK190A" indica a posição do aminoácido no polipeptídeo precursor mWnt7a.
1.2. Estudos animais
[00432] Dez camundongos C57BL/6 foram injetados por via intravenosa na veia periorbital com 50 µl de vetores concentrados (1 × 1011 vg/camundongo) contendo o AAV- PHP.eB-CAG-mWnt7aK190A-p2A-EGFPor AAV-PHP.eB vetor de controle (1 × 1011 vg/camundongo). Duas semanas após a infecção, o sinal de EGFP foi avaliado em células endoteliais do SNC para confirmar a expressão do transgene.
[00433] Os camundongos foram submetidos a tMCAO por 1 hora e o tamanho do infarto foi medido por meio de coloração com TTC (cloreto de 2,3,5-trifeniltetrazólio) 5 dias após tMCAO. Os ensaios de vazamento no nível da barreira hematoencefálica (BBB) foram realizados 1 hora após a reperfusão, medindo o vazamento de proteína plasmática endógena (imunoglobulina e fibrinogênio). A sobrevivência dos ratos foi avaliada 5 dias após a perfusão após tMCAO.
2. Resultados
[00434] Uma construção de codificação de GFP foi usada para demonstrar a expressão transgênica generalizada no cérebro de camundongo (Figura 10 A).
[00435] Para avaliar o efeito de Wnt7aK190A de camundongo no acidente vascular cerebral in vivo, vetores adeno-associados específicos do cérebro foram gerados que expressam Wnt7aK190A de camundongo.
[00436] Todos os camundongos injetados com um vetor compreendendo Wnt7aK190A de camundongo mostraram volume de ataque reduzido (Figura 10 B).
Exemplo 4: Entrega de vetor viral de Wnt7aK190S ou Wnt7aK190L em camundongos submetidos a um modelo de acidente vascular cerebral (oclusão transitória da artéria cerebral média (tMCAO))
1. Materiais e métodos
1.1. Geração de construtos de plasmídeo AAV (AAV- PHP.eB-CAG-mWnt7aK190S-p2A-EGFP e AAV-PHP.eB-CAG- mWnt7aK190L -p2A-EGFP)
[00437] As construções de plasmídeo AAV são geradas conforme descrito no exemplo 3, seção 1.1.
[00438] Observa-se que K190S de “Wnt7aK190S” e em K190L “Wnt7aK190L” indicam a posição do aminoácido no polipeptídeo precursor mWnt7a.
1.2. Estudos animais
[00439] Os estudos em animais são realizados conforme descrito no exemplo 3, seção 1.1.
2. Resultados
[00440] A redução do volume do curso é medida em camundongos injetados com um vetor que compreende Wnt7aK190S ou Wnt7K190L de camundongo.
Exemplo 5: Entrega de vetor viral de agonistas variantes de Wnt7a em camundongos submetidos a um modelo de acidente vascular cerebral (oclusão transitória da artéria cerebral média (tMCAO))
1. Materiais e métodos
[00441] As construções de plasmídeo AAV são geradas conforme descrito no exemplo 3, seção 1.1 e os estudos em animais são realizados conforme descrito no exemplo 3, seção 1.1.
2. Resultados
[00442] redução de volume de curso é medida em ratinhos injectados com um vector compreendendo rato Wnt7aQ48A, Wnt7aI51A, Wnt7aP56A, Wnt7aA58R, Wnt7aI59A, Wnt7aE64A, Wnt7aM68A, Wnt7aL70A, Wnt7aE72A, Wnt7aF75A, Wnt7aR81A, Wnt7aN83Q, Wnt7aV99A, Wnt7aI160A, Wnt7aF162A, Wnt7aK164A, Wnt7aF166A, Wnt7aI172A, Wnt7aR177A, Wnt7aR189A, Wnt7aK212A, Wnt7aR222A, Wnt7aK229A, Wnt7aK231A, Wnt7aV236A, Wnt7aE239A, Wnt7aR245A, Wnt7aK247A, Wnt7aP249A, Wnt7aK253A, Wnt7aI254A, Wnt7aY260A, Wnt7aP263A, Wnt7aT266A, Wnt7aE279A, Wnt7aR320A, Wnt7aW322A, Wnt7aT338A ou Wnt7aK349A.
[00443] Como controle negativo, a redução do volume sistólico é medida em camundongos injetados com um vetor compreendendo camundongo Wnt7aR49A, Wnt7aE103A ou Wnt7aL192A.
[00444] Note-se que as substituições se referem à posição do aminoácido no polipeptídeo precursor mWnt7a.

Claims (25)

REIVINDICAÇÕES
1. Agente capaz de ativar a sinalização de Wnt mediada por proteína relacionada a receptor acoplado à proteína G (GPR)124/RECK/Frizzled/receptor de lipoproteína, caracterizado pelo fato de que o referido agente não ativa a sinalização de Wnt mediada por Frizzled/LRP na ausência de RECK e/ou GPR124.
2. Agente, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido agente é capaz de induzir heteromerização de polipeptídeos Frizzled e LRP em uma membrana celular na presença de RECK e GPR124, mas não na ausência de RECK e/ou GPR124.
3. Agente, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o referido agente é capaz de se ligar simultaneamente a polipeptídeos Frizzled e LRP em uma membrana celular na presença de RECK e GPR124, mas não na ausência de RECK e/ou GPR124.
4. Agente, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o referido agente é capaz de se ligar ao polipeptídeo GPR124 e/ou RECK.
5. Agente, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o referido agente é capaz de se ligar ao polipeptídeo RECK.
6. Agente, de acordo com a reivindicação 5,
caracterizado pelo fato de que o referido agente é capaz de se ligar à região de nó de cisteína 4 (CK4), à região CK5, ou às regiões CK4 e CK5, do polipeptídeo RECK.
7. Agente, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o referido agente é capaz de se ligar ao domínio rico em cisteína (CRD) do polipeptídeo Frizzled.
8. Agente, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o referido agente é capaz de se ligar ao sítio de ligação de DKK e/ou ao sítio de ligação de Wnt do polipeptídeo LRP.
9. Agente, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o agente compreende, ou é selecionado de, um grupo que consiste em uma substância química, um anticorpo, um fragmento de anticorpo, um andaime de proteína semelhante a anticorpo, um(a) proteína ou polipeptídeo, um peptídeo, um peptidomimético, um aptâmero, um fotoaptâmero, um spiegelmer e um ácido nucleico, de preferência, em que o referido agente compreende é um(a) proteína ou polipeptídeo.
10. Agente, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o referido agente compreende um domínio de ligação de RECK, um domínio de ligação de Frizzled e um domínio de ligação de LRP, em que o referido domínio de ligação de RECK, o referido domínio de ligação de Frizzled, e o referido domínio de ligação LRP é derivado de um polipeptídeo Wnt7, tal como de um polipeptídeo Wnt7a ou Wnt7b.
11. Agente, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o referido domínio de ligação de RECK compreende: - uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 25% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos HVEPVRASRNKRPTFLKIKKPLSYRKPMDTDLVYIEKSPNYC (SEQ ID NO: 17); ou - uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 25% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos VEPVRASRNKRPTFLKIKKPLSYRKPMDT (SEQ ID NO: 18); ou - uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 25% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos VEVVRASRLRQPTFLRIKQLRSYQKPMET (SEQ ID NO: 19); ou - uma sequência de aminoácidos XXXVXAXRXXXXXFLXIXXXXXYXKXXXX (SEQ ID NO: 20), VXAXRXXXXXFLXIXXXXXYXK (SEQ ID NO: 21), XXXVXAXRXXXXXFLXXXXXXXXXKXXXX (SEQ ID NO: 22) ou VXAXRXXXXXFLXXXXXXXXXK (SEQ ID NO: 23), em que X é qualquer aminoácido, de preferência em que a sequência de aminoácidos mostra pelo menos 50% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NO: 18 ou SEQ ID NO: 19.
12. Agente, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que o referido agente é, ou consiste essencialmente em, um fragmento de um polipeptídeo Wnt7, tal como um fragmento de um polipeptídeo Wnt7a ou Wnt7b.
13. Agente, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o referido fragmento é, ou consiste essencialmente no, domínio N-terminal (NTD) do polipeptídeo Wnt7.
14. Agente, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que o referido agente é uma variante de um polipeptídeo Wnt7, tal como uma variante de um polipeptídeo Wnt7a ou Wnt7b.
15. Agente, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que - o resíduo de glutamina (Q) na posição correspondente à posição 17 na SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 51 é substituído por um ou mais de resíduos de aminoácidos diferentes de glutamina (Q), de preferência por um resíduo de alanina (A); - o resíduo de isoleucina (I) na posição correspondente à posição 20 na SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 51 é substituído por um ou mais de resíduos de aminoácidos diferentes de isoleucina (I), de preferência por um resíduo de alanina (A); - o resíduo de prolina (P) na posição correspondente à posição 25 na SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 51 é substituído por um ou mais de resíduos de aminoácidos diferentes de prolina (P), de preferência por um resíduo de alanina (A);
- o resíduo de alanina (A) na posição correspondente à posição 27 na SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 51 é substituído por um ou mais de resíduos de aminoácidos diferentes de alanina (A), de preferência por um resíduo de arginina (R);
- o resíduo de isoleucina (I) na posição correspondente à posição 28 na SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 51 é substituído por um ou mais de resíduos de aminoácidos diferentes de isoleucina (I), de preferência por um resíduo de alanina
(A);
- o resíduo de glutamato (E) na posição correspondente à posição 33 na SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 51 é substituído por um ou mais de resíduos de aminoácidos diferentes de glutamato (E), de preferência por um resíduo de alanina (A);
- o resíduo de metionina (M) na posição correspondente à posição 37 na SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 51 é substituído por um ou mais de resíduos de aminoácidos diferentes de glutamato (M), de preferência por um resíduo de alanina (A);
- o resíduo de leucina (L) na posição correspondente à posição 39 na SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 51 é substituído por um ou mais de resíduos de aminoácidos diferentes de glutamato (L), de preferência por um resíduo de alanina (A);
- o resíduo de glutamato (E) na posição correspondente à posição 41 na SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 51 é substituído por um ou mais de resíduos de aminoácidos diferentes de glutamato (E), de preferência por um resíduo de alanina (A);
- o resíduo de fenilalanina (F) na posição correspondente à posição 44 na SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO:
51 é substituído por um ou mais de resíduos de aminoácidos diferentes de fenilalanina (F), de preferência por um resíduo de alanina (A);
- o resíduo de arginina (R) na posição correspondente à posição 50 na SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 51 é substituído por um ou mais de resíduos de aminoácidos diferentes de arginina (R), de preferência por um resíduo de alanina (A);
- o resíduo de asparagina (N) na posição correspondente à posição 52 na SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 51 é substituído por um ou mais de resíduos de aminoácidos diferentes de asparagina (N), de preferência por um resíduo de glutamina
(Q);
- o resíduo de valina (V) na posição correspondente à posição 68 na SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 51 é substituído por um ou mais de resíduos de aminoácidos diferentes de valina (V), de preferência por um resíduo de alanina (A);
- o resíduo de isoleucina (I) na posição correspondente à posição 129 na SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 51 é substituído por um ou mais de resíduos de aminoácidos diferentes de isoleucina (I), de preferência por um resíduo de alanina
(A);
- o resíduo de fenilalanina (F) na posição correspondente à posição 131 na SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO:
51 é substituído por um ou mais de resíduos de aminoácidos diferentes de fenilalanina (F), de preferência por um resíduo de alanina (A);
- o resíduo de lisina (K) na posição correspondente à posição 133 na SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 51 é substituído por um ou mais de resíduos de aminoácidos diferentes de lisina (K), de preferência por um resíduo de alanina (A);
- o resíduo de fenilalanina (F) na posição correspondente à posição 135 na SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO:
51 é substituído por um ou mais de resíduos de aminoácidos diferentes de fenilalanina (F), de preferência por um resíduo de alanina (A);
- o resíduo de isoleucina (I) na posição correspondente à posição 141 na SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 51 é substituído por um ou mais de resíduos de aminoácidos diferentes de isoleucina (I), de preferência por um resíduo de alanina
(A);
- o resíduo de arginina (R) na posição correspondente à posição 146 na SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 51 é substituído por um ou mais de resíduos de aminoácidos diferentes de arginina (R), de preferência por um resíduo de alanina (A);
- o resíduo de arginina (R) na posição correspondente à posição 158 na SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 51 é substituído por um ou mais de resíduos de aminoácidos diferentes de arginina (R), de preferência por um resíduo de alanina (A);
- o resíduo de lisina (K) na posição correspondente à posição 159 na SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 51 é substituído por um ou mais de resíduos de aminoácidos diferentes de lisina (K), de preferência por uma alanina (A), resíduo de serina (S) ou leucina (L);
- o resíduo de lisina (K) na posição correspondente à posição 181 na SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 51 é substituído por um ou mais de resíduos de aminoácidos diferentes de lisina (K), de preferência por um resíduo de alanina (A);
- o resíduo de arginina (R) na posição correspondente à posição 191 na SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 51 é substituído por um ou mais de resíduos de aminoácidos diferentes de arginina (R), de preferência por um resíduo de alanina (A);
- o resíduo de lisina (K) na posição correspondente à posição 198 na SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 51 é substituído por um ou mais de resíduos de aminoácidos diferentes de lisina (K), de preferência por um resíduo de alanina (A);
- o resíduo de lisina (K) na posição correspondente à posição 200 na SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 51 é substituído por um ou mais de resíduos de aminoácidos diferentes de lisina (K), de preferência por um resíduo de alanina (A);
- o resíduo de lisina (K) na posição correspondente à posição 205 na SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 51 é substituído por um ou mais de resíduos de aminoácidos diferentes de lisina (K), de preferência por um resíduo de alanina (A);
- o resíduo de valina (V) na posição correspondente à posição 205 na SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 51 é substituído por um ou mais de resíduos de aminoácidos diferentes de valina (V), de preferência por um resíduo de alanina (A);
- o resíduo de glutamato (E) na posição correspondente à posição 208 na SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 51 é substituído por um ou mais de resíduos de aminoácidos diferentes de glutamato (E), de preferência por um resíduo de alanina (A);
- o resíduo de arginina (R) na posição correspondente à posição 214 na SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 51 é substituído por um ou mais de resíduos de aminoácidos diferentes de arginina (R), de preferência por um resíduo de alanina (A);
- o resíduo de lisina (K) na posição correspondente à posição 216 na SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 51 é substituído por um ou mais de resíduos de aminoácidos diferentes de lisina (K), de preferência por um resíduo de alanina (A);
- o resíduo de prolina (P) na posição correspondente à posição 218 na SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 51 é substituído por um ou mais de resíduos de aminoácidos diferentes de prolina (P), de preferência por um resíduo de alanina (A);
- o resíduo de lisina (K) na posição correspondente à posição 222 na SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 51 é substituído por um ou mais de resíduos de aminoácidos diferentes de lisina (K), de preferência por um resíduo de alanina (A);
- o resíduo de isoleucina (I) na posição correspondente à posição 223 na SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 51 é substituído por um ou mais de resíduos de aminoácidos diferentes de isoleucina (I), de preferência por um resíduo de alanina
(A);
- o resíduo de tirosina (Y) na posição correspondente à posição 229 na SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 51 é substituído por um ou mais de resíduos de aminoácidos diferentes de tirosina (Y), de preferência por um resíduo de alanina (A);
- o resíduo de prolina (P) na posição correspondente à posição 232 na SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 51 é substituído por um ou mais de resíduos de aminoácidos diferentes de prolina (P), de preferência por um resíduo de alanina (A);
- o resíduo de treonina (T) na posição correspondente à posição 235 na SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 51 é substituído por um ou mais de resíduos de aminoácidos diferentes de treonina (T), de preferência por um resíduo de alanina (A);
- o resíduo de glutamato (E) na posição correspondente à posição 248 na SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 51 é substituído por um ou mais de resíduos de aminoácidos diferentes de glutamato (E), de preferência por um resíduo de alanina (A);
- o resíduo de arginina (R) na posição correspondente à posição 289 na SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 51 é substituído por um ou mais de resíduos de aminoácidos diferentes de arginina (R), de preferência por um resíduo de alanina (A); - o resíduo de triptofano (W) na posição correspondente à posição 291 na SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 51 é substituído por um ou mais de resíduos de aminoácidos diferentes de triptofano (W), de preferência por um resíduo de alanina (A); - o resíduo de treonina (T) na posição correspondente à posição 307 na SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 51 é substituído por um ou mais de resíduos de aminoácidos diferentes de treonina (T), de preferência por um resíduo de alanina (A); e/ou - o resíduo de lisina (K) na posição correspondente à posição 318 na SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 51 é substituído por um ou mais de resíduos de aminoácidos diferentes de lisina (K), de preferência por um resíduo de alanina (A).
16. Ácido nucleico que codifica o agente, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que o referido agente é um(a) proteína, polipeptídeo ou peptídeo.
17. Cassete de expressão de ácido nucleico, caracterizado pelo fato de que compreende o ácido nucleico, conforme definido na reivindicação 16, operacionalmente ligado a um promotor e/ou sinais reguladores da transcrição e tradução.
18. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende o ácido nucleico conforme definido na reivindicação 16 ou o cassete de expressão de ácido nucleico conforme definido na reivindicação 17, tal como um vetor viral.
19. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o agente conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 15, o ácido nucleico conforme definido na reivindicação 16, o cassete de expressão de ácido nucleico conforme definido na reivindicação 17 ou o vetor conforme definido na reivindicação 18, e um carreador farmaceuticamente aceitável.
20. Agente, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, ácido nucleico de acordo com a reivindicação 16, cassete de expressão de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 17, vetor de acordo com a reivindicação 18 ou composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 19, caracterizado(a) pelo fato de ser para uso como um medicamento.
21. Agente, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, ácido nucleico de acordo com a reivindicação 16, cassete de expressão de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 17, vetor de acordo com a reivindicação 18 ou composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 19, caracterizado(a) pelo fato de ser para uso na(o) prevenção ou tratamento de um distúrbio neurovascular ou um distúrbio do sistema nervoso central (SNC) que compreende disfunção neurovascular.
22. Agente para uso, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o referido distúrbio neurovascular é selecionado do grupo que consiste em acidente vascular cerebral isquêmico, acidente vascular cerebral hemorrágico, lesão de isquemia/reperfusão, aneurismas cerebrais, malformações arteriovenosas (MAVs), malformações cavernosas, vasculite, hemorragia cerebral, hemorragia subaracnoide, malformações vasculares espinhais, estenose da artéria carótida, doença de Moyamoya e aterosclerose intracraniana e combinações dos mesmos, ou o referido distúrbio do SNC é selecionado do grupo que consiste em esclerose múltipla, acidente vascular cerebral isquêmico, câncer cerebral, epilepsia, demência, demência vascular, demência associada a HIV-1, doença de Alzheimer, doença de Parkinson, doença de Huntington, esclerose lateral amiotrófica, doenças cerebrais infecciosas, lesões cerebrais traumáticas, enxaqueca e encefalopatia traumática crônica e combinações dos mesmos.
23. Método in vitro para identificar um agente útil como terapêutico, tal como útil para a(o) prevenção ou tratamento de um distúrbio neurovascular ou um distúrbio do SNC compreendendo disfunção neurovascular, o referido método caracterizado pelo fato de que compreende determinar se um agente de teste ativa sinalização de Wnt mediada por
GPR124/RECK/Frizzled/LRP, mas não sinalização de Wnt mediada por Frizzled/LRP na ausência de RECK e/ou GPR124.
24. Método in vitro, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que compreende: - contactar o agente de teste com uma célula capaz de sinalização de Wnt mediada por GPR124/RECK/Frizzled/LRP e medir a referida sinalização de Wnt, e - contatar o agente de teste com uma célula capaz de sinalização de Wnt mediada por Frizzled/LRP, mas não sinalização de Wnt mediada por GPR124/RECK/Frizzled/LRP, e medir a referida sinalização de Wnt.
25. Método in vitro, de acordo com a reivindicação 23 ou 24, caracterizado pelo fato de que o método compreende adicionalmente determinar se o agente de teste é capaz de se ligar ao polipeptídeo RECK.
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