KR20140035337A - Ｗｎｔ 조성물 및 이의 사용 방법 - Google Patents

Abstract

Wnt 조성물 및 이의 사용 방법이 제공된다. 본 발명의 조성물은 목적하는 생물학적 활성을 갖는 wnt 폴리펩티드의 단편을 포함하고, 이 단편은 본원에서 "미니-wnt"로서 지칭된다. 이들 조성물 및 방법은 Wnt 수용체에 대한 결합을 측정하고; Wnt 수용체를 발현하는 세포에서 Wnt 신호전달을 억제시키고, Wnt 수용체를 발현하는 세포로 작용성 모이어티를 전달하고; Wnt-특이적 항체를 생산하기 위한 면역원으로서 특정한 용도를 갖는다.

Description

ＷＮＴ 조성물 및 이의 사용 방법{WNT COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF}

Wnt 단백질은 배발생(embryogenesis) 동안 세포-대-세포 상호작용을 조절하는 고도로 보존된 분비 신호전달 분자의 부류를 형성한다. Wnt 유전자 및 Wnt 신호전달은 또한 암과 관련되어 있다. Wnt 당단백질은 몇몇 원시 세포 유형에서 활성적인 췌장 또는 오토크린 신호로서 작용하는 것으로 생각된다.

Wnt 성장 인자 부류는 마우스 및 인간에서 동정된 19개 이상의 유전자를 포함한다. Wnt-1 프로토-종양유전자(int-1)는 바이러스 DNA 서열의 삽입에 기인하여 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV)에 의해 유도된 유방 종양으로부터 처음 확인되었다[참조: Nusse and Varmus (1982) Cell 31:99-109]. Wnt 단백질의 발현은, 예를 들면, 배 및 태아 조직에서 달라지지만, 발달 과정과 종종 관련되어 있다. Wnt는 국소 세포 신호전달에서 중요한 역할을 담당할 수 있다. 생화학적 연구는 다량의 분비된 Wnt 단백질이, 배지에서 자유롭게 확산가능한 것이 아니라, 세포 표면 또는 세포외 매트릭스와 결합된 상태로 발견될 수 있음을 보여주었다.

Wnt 작용의 메카니즘에 대한 통찰은 몇몇 시스템: 드로소필라(Drosophila) 및 카에노르하브디티스 엘레강스(Caenorhabditis elegans)에서의 유전학; 제노푸스(Xenopus) 배에서 세포 배양 및 이소성 유전자 발현에서의 생화학으로부터 출현되었다. 마우스에서 다수의 Wnt 유전자는 돌연변이되었고, 이는 매우 특이적 발달 결함을 유도한다. 현재 알려진 바와 같이, Wnt 단백질은 세포 표면 상의 프리즐(Frizzled) 부류의 수용체, ROR 부류의 수용체, 및 LRP5 수용체, LRP6 수용체 및 FRL1 수용체에 결합한다. 일반적인 Wnt/β-카테닌 신호전달 경로에서, 프리즐 수용체에 대한 Wnt 결합은 β-카테닌의 핵 국지화를 일으키고, 이어서 FCF와 복합체화되어 Wnt 표적 유전자의 전사를 활성화시킨다.

Wnt 유전자 중의 돌연변이에 대한 연구는 성장 조절 및 조직 패터닝(patterning)에서 Wnt에 대한 역할을 나타냈다. 드로소필라에서, 날개 없는 것(wg)은 Wnt 유전자를 코딩하고, wg 돌연변이는 배 외배엽, 신경발생 및 성충 디스크 성장의 패턴을 변경시킨다. 카에노르하브디티스 엘레강스에서, lin-44는 Wnt를 코딩하고, 이는 비대칭 세포 분화에 요구된다. 마우스에서 녹-아웃 돌연변이는 Wnt가 뇌 발달, 및 신장, 꼬리 아상(bud) 및 사지 아상을 위한 배 원시세포의 성장에 필수적인 것으로 밝혀졌다. 유선에서 Wnt의 과발현은 유방 비후 및 조숙 폐포 발달을 일으킬 수 있다. 따라서, Wnt 신호전달은 간세포의 증식 및 신경관의 명세(specificatio)를 포함하는 동물 발달에서 다수의 사건과 연관되어 있다. 따라서, Wnt 단백질은 특정 세포 유형의 확장 및 생체내에서 증상의 치료에서 잠재적으로 중요한 반응물이다.

데이터는, 이의 천연 형태에서, 생물학적 활성 Wnt는 단백질이 보존된 시스테인 상에서 팔미토일화되는 것을 필요로 함을 나타낸다[참조: Willert et al. (2003) Nature 423:448-452; and Nusse (2005) Cell Research 15:28-32]. 이들 지질 그룹은 Wnt 단백질의 수용해도(water solubility)를 저하시킨다. 따라서, 현재까지, 활성 천연 및 재조합 Wnt의 생물학적으로 효과적인 농축물을 분리하는 방법은 세정제 또는 리포좀의 사용을 필요로 한다[참조: Willert et al ., supra, Zhao et al . (2009) Methods Enzymol. 465:331-347; and Morrell et al. (2008) PLoS One 3(8):e2930]. Wnt의 용해도에 대한 이들 화학 제제의 요건은 이들 화학물질을 동물 내로 주입하는 문제에 기인하여 이의 약제학적 활용을 제한한다. 따라서, 수용성인 약제학적 활성 Wnt 조성물의 개발이 매우 흥미롭다.

문헌

날개 없는 가용성 단백질의 생물학적 활성은 문헌[참조: van Leeuwen et al. (1994) Nature 24:368(6469):342-4]에 기재되어 있다. 가용성의 생물학적 활성 척추동물 Wnt 단백질을 사용하는 Wnt-프리즐 상호작용에 대한 생화학적 특성화는 문헌[참조: Hsieh et al. (1999) Proc Natl Acad Sci U S A 96(7):3546-51]에 기재되어 있다. 문헌[참조: Bradley et al. (1995) Mol Cell Biol 15(8):4616-22]은 미토겐 활성을 갖는 가용성 형태의 wnt 단백질을 기재한다. 문헌[참조: Hoppler et al. (1996) Genes and Dev. 10:2805-2817]은 절단된 Wnt(절단된 Xwnt-8 및 절단된 마우스 Wnt-1)인 우성 네가티브 Wnt 폴리펩티드를 기재한다. 문헌[참조: Couso and Martinez-Arias (1994) Cell 79(2):259-72]은 반전상 대립인자(antimorphic) 효과를 갖는 실질적 카복시-말단 결실을 갖는 분비된 단백질을 코딩하는 Dwnt-1의 돌연변이 대립인자를 기재한다. 기타 우성 네가티브 Wnt 폴리펩티드 및 이들의 사용 방법은 국제공개공보 제WO 2010/078458호에 기재되어 있다.

문헌[참조: Willert et al. (2003) Nature 423:448-452]은 세정제를 사용하여 Wnt 단백질을 정제하는 방법을 기재한다. 문헌[참조: Morrell et al. (2008) PLoS One 3(8):e2930]은 리포좀 내로 Wnt 단백질의 제형화, 및 리포좀 내에 팩키징된 Wnt가 생체내에서 생물학적 활성을 유지하는 방법을 기재한다. 특허 공개문헌은 미국 특허 제7,335,643호 및 제7,153,832호; 및 미국 특허출원 제20080226707호를 포함한다.

Wnt 조성물 및 이의 사용 방법이 제공되어 있다. 본 발명의 조성물은 목적하는 생물학적 활성을 갖는 wnt 폴리펩티드의 단편을 포함하고, 여기서 단편은 본원에서 "미니-wnt"로서 지칭된다. 목적하는 미니-wnt 폴리펩티드는 천연 wnt 단백질의 단편 및 이의 유도체, 예를 들면, 목적하는 특성, 예를 들면, 용해도, 표적 수용체에 대한 친화성 또는 특이성을 향상시키는 천연 서열과 비교하여 하나 이상의 아미노산 변화를 포함하는 유사체를 포함한다. 단편, 특히 Wnt C-말단의 것들은 수용해성일 수 있다. 목적하는 조성물은, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 약제학적으로 허용되는 부형제에 유효량의 미니-wnt 폴리펩티드를 포함한다. 조성물은 추가의 제제, 예를 들면, 애쥬번트 등을 포함할 수 있다. 미니-wnt 폴리펩티드는 합성에 의해; 본 기술분야에 공지된 바와 같은 각종 적합한 재조합 방법 등에 의해 생산할 수 있다.

이들 조성물 및 방법은, 예를 들면, 비정상 세포 증식을 억제시키기 위해 Wnt 수용체를 발현시키는 세포에서 Wnt 신호전달을 억제하고, 작용성 모이어티(moiety), 예를 들면, 치료학적 또는 영상화 모이어티를, Wnt 수용체를 발현시키는 세포로 전달하고, Wnt-특이적 항체를 생산하기 위한 면역원으로서 특정한 용도를 갖는다. 통상적으로, 미니-wnt는 Wnt 공-수용체(co-receptor) 쌍 중의 하나(둘 다가 아님)에 결합한다.

일부 실시양태에서, 미니-wnt는 C-말단 또는 "Cterm" 미니-wnt이고, 여기서 Cterm 미니-wnt는 wnt 폴리펩티드의 카복시 말단 도메인을 포함하거나 이들로 이루어지며 아미노 말단 도메인의 아미노산 잔기를 포함하지 않는 폴리펩티드이다. 카복시 말단 도메인의 서술은, 예를 들면, 도 6에 제시된 바와 같이, 복수의 인간 Wnt 단백질로 본원에서 예시된다. Wnt 카복시 말단 도메인은 또한 본원에서 제공된 서열과의 정렬에 의해 경험적으로 동정될 수 있다. 한 가지 예에서, Cterm 미니-wnt 아미노산 서열은 인간 Wnt1의 위치 298 내지 370을 갖는 보존된 잔기에 의해 정렬하며, 인간 Wnt1의 잔기 1 내지 257과 함께 정렬하는 아미노산 서열을 결실한다. Cterm 미니-wnt는 일반적으로 수용성이다.

다른 실시양태에서, 미니-wnt는 N-말단 또는 "Nterm" 미니-wnt이고, 여기서 Nterm 미니-wnt는 wnt 폴리펩티드의 아미노 말단 도메인을 포함하거나 이들로 이루어지고 카복시 말단 도메인의 아미노산 잔기를 포함하지 않는 폴리펩티드이다. 아미노 말단 도메인의 서술은, 예를 들면, 도 8에 제시된 바와 같이, 복수의 인간 Wnt 단백질로 본원에서 예시된다. Wnt 아미노 말단 도메인은 또한 본원에서 제공된 서열과의 정렬에 의해 경험적으로 동정될 수 있다. 한 가지 예에서, Nterm 미니-wnt 아미노산 서열은 인간 Wnt1의 위치 34 내지 247을 갖는 보존된 잔기에 의해 정렬하며, 인간 Wnt1의 잔기 288 내지 370에 상응하는 잔기와 함께 정렬하는 아미노산 서열을 결실한다. Nterm 미니-wnt는 수용성이거나 지용성일 수 있다.

일부 실시양태에서, 미니-wnt 폴리펩티드는, 치료학적 모이어티(예: 세포독성 모이어티) 또는 ADCC- 또는 CDC-지시된 세포사를 위한 세포를 표적화하는 모이어티일 수 있는 작용성 모이어티와 융합되거나 접합된다. 목적하는 치료학적 모이어티는 세포의 활성을 변경하는 것들을 포함한다. 일부 실시양태에서, 작용성 모이어티는 영상화 모이어티, 예를 들면, 형광단, 발광단, 방사선 동위원소 등이다. 일부 실시양태에서, 작용성 모이어티는, 예를 들면, 지퍼 또는 Fc 폴리펩티드, 또는 기타 결합활성-증강 화학적 또는 단백질 제제를 사용하여, 호모-이량체, -삼량체 또는 그 이상, 또는 헤테로-이량체, -삼량체 또는 그 이상으로 미니-wnt의 올리고머화를 유도하는 올리고머화 모이어티이다. 일부 실시양태에서, 작용성 모이어티는 반감기를 연장하고/하거나 미니-wnt 폴리펩티드의 크기를 증가시키는 단백질 또는 화학적 모이어티이다.

본 발명의 몇몇 국면에서, Wnt 수용체를 발현하는 목적하는 세포를 목적하는 작용성 모이어티를 포함하는 미니-wnt와 접촉시킴을 포함하는, 작용성 모이어티를 세포에 전달하는 방법이 제공된다. 다른 실시양태에서, 세포에서 Wnt 신호전달을 억제시키는 방법이 제공된다. 이러한 방법에서, Wnt 수용체를 발현하는 세포는, 미니-wnt의 부재하의 신호전달과 비교하여, 신호전달을 억제시키는데 효과적인, 예를 들면, 신호전달을 25%, 50%, 75%, 90%, 95% 또는 그 이상까지 감소시키는데 효과적인 농도의 미니-wnt 폴리펩티드와 접촉된다. 이러한 신호전달 억제는 표적 세포의 증식을 억제시킬 수 있거나, 달리는 표적 세포에서 활성적인 Wnt-신호전달 경로를 간섭할 수 있다.

본 발명의 방법에서, Wnt 수용체는 Fz 단백질, ROR 단백질 또는 Ryk 단백질이고, 미니-wnt 폴리펩티드는 일반적으로 Cterm 미니-wnt이다. Wnt 수용체가 LRP5, LRP6 또는 FRL1/크립토인 경우, 통상적으로 미니-wnt 폴리펩티드는 Nterm 미니-wnt이다. 일부 방법에서, 수용체 발현 세포는 시험관내에서 접촉된다. 다른 실시양태에서, 수용체 발현 세포는 생체내에서 접촉된다. 목적 세포는 본 기술분야에 공지된 바와 같이 다양한 Wnt-수용체 발현 세포를 포함한다.

애쥬번트와 함께 임의로 제형화된 유효량의 Cterm 또는 Nterm 미니-wnt 폴리펩티드로 동물을 면역화시킴을 포함하는, Wnt-특이적 항체를 제조하는 방법이 제공된다. 재조합에 의해 생산된 항체 등을 생성하기 위한 폴리뉴클레오티드의 공급원으로서는 폴리클로날 항체가 혈청으로부터 수득될 수 있거나, 동물로부터의 세포가 모노클로날 항체의 생산에 사용될 수 있다.

후보 Wnt 수용체 또는 이의 단편을 목적하는 Wnt 단백질에 상응하는 미니-wnt 폴리펩티드와 접촉시키는 단계 및 후보 수용체에 대한 미니-wnt의 결합을 측정하는 단계로서, 여기서, 특이적 결합의 존재는 Wnt 단백질이 후보 수용체에 대한 리간드임을 나타내는 것인 단계를 포함하는, Wnt 단백질에 대한 동족 수용체를 측정하는 방법이 제공된다. 목적 수용체는 Cterm 미니-wnt와 접촉될 수 있는 Fz 단백질, ROR 단백질 또는 Ryk 단백질; 및 Nterm 미니-wnt와 접촉될 수 있는 LRP5, LRP6 또는 FRL1/크립토를 포함한다. 다양한 결합 분석은, 예를 들면, 후보 수용체를 발현하는 세포를 이용하는데 사용하고, 이로써 한정되는 것은 아니지만, Fz-CRD 폴리펩티드 및 수용성 Cterm 미니-wnt 폴리펩티드 사이의 상호작용을 포함하여, 용액에서 수행될 수 있는, 예를 들면, 결합 수용체의 가용성 단편을 이용하는 분석이 특히 흥미롭다.

본 발명의 조성물 및 방법의 이점은 표적화의 특이성이고, 여기서 미니-wnt는 이들이 유도되는 천연 wnt 단백질과 동일한 세포를 표적화한다. 예를 들면, 미니-wnt는 Wnt 모 단백질에 반응성인 세포에서 Wnt 신호전달을 선택적으로 억제한다. 본 기술분야에 공지된 Wnt 신호전달의 억제제, 예를 들면, 특이적 Wnt 수용체에 결합하는 항체는 Wnt 모체에 의해 표적화된 모든 Wnt 수용체에 결합하지 않지만, 이들이 특이성을 갖는 Wnt 수용체(들)에만 결합할 것이다. 또한, 수용성 형태의 미니-wnt의 이점은 이들의 치료학적 용도를 제한할 수 있는 제형화 첨가제에 대한 필요가 없다는 것이다.

본 발명은 첨부 도면과 관련하여 읽을 때 하기 상세한 설명으로부터 가장 잘 이해된다. 특허 또는 출원 파일은 칼라로 실행된 하나 이상의 도면을 포함한다. 칼라 도면(들)과 함께 이러한 특허 또는 특허출원 공보의 사본은 필요한 수수료의 지불 및 요청시에 특허청에 의해 제공될 것이다. 통상의 실시에 따라, 도면의 다양한 특징은 일정한 비율로 축소되지 않음이 강조된다. 이에 반하여, 다양한 특징들의 치수는 명료화를 위해 임의로 확대 또는 감소된다. 하기 도가 도면에 포함되어 있다.
도 1은 가용성 제노푸스 Wnt8("Xwnt8")의 발달을 나타낸다. 패널 A(좌측)은, 효모인 경우, 표면 상에 발현된 Wnt 분자의 삽화를 도시한다. Wnt 분자는 분자의 수용해도를 초래하는 몇몇 돌연변이(성상)를 함유한다. Wnt의 C-말단에 연결된 것은 Myc에 대한 항체를 사용하여 발현된 Wnt를 검출하는 실험에서 사용되는 "Myc" 태그이다. 또한, 패널 A에서 (우측)은 Wnt 수용체 프리즐(이 경우 Fz5)의 Wnt-결합 도메인의 삽화 개략도이다. 이러한 도메인은 "CRD"로서 불리운다. CRD의 삽화는 가시화를 위해 형광 염료에 결합되는 4가 스트렙트아비딘 분자(삽화를 가로지르는 중심)에 결합된 상태로 정렬된 4개 CRD를 나타낸다. 패널 B에서, Fz5 CRD는 스트렙트아비딘에 결합할 수 있도록 이의 C-말단에 부가된 비오틴을 함유하는 것으로 나타났다. 이는 Fz5 CRD가 겔에서 스트렙트아비딘에 결합하기 위해 상향으로 "이동"하는 SDS-PAGE 겔에서 제시되어 있다. 이러한 "이동"은 비오틴이 Fz5 및 Fz8 CRD 상에 존재함을 나타낸다. 패널 C는 Nterm(자주색 음영) 미니-Wnt, 링커(녹색 음영) 및 C-말단 미니-Wnt(적색 음영)로 세분된 전장 제노푸스 Wnt8의 서열을 나타낸다. 막힌 적색 화살표로 나타낸 B7, A12, B2 및 A3은 미니-wnt의 상이한 서열 경계를 나타낸다. 각 미니-Wnt에 대한 실제 경계는 가변적이고(도 6 참조), 몇몇 잔기를 링커까지 연장시킬 수 있다.
도 2는 개개 A 클론의 확인을 나타낸다. 각 클론에 있어서, 도 1에 제시된 Wnt C-말단 에피토프에 대한 항-myc 항체 결합 및 효모 표시 XWnt8에 대한 Fz5 및 Fz8CRD 결합은 상부 FACS 패널에 제시되어 있다. 동반 패널에서 갈색 블록 화살표에 의해 연결된 하부는 항-Myc 및 Fz5/Fz8-CRD 결합이, Wnt가 효모를 3C 프로테아제로 절단되는 경우에, 소실됨을 나타낸다. 효모 표시 Wnt는 Wnt 및 효모 사이에 3C 프로테아제 절단 부위를 함유하기 때문에, Myc 및 Fz-CRD에 대한 결합 소실은, 비특이적 방식으로 효모와의 상호작용이 아니라, 표시 Wnt와의 특이적 상호작용을 나타낸다. 이러한 방식에서, 절단시의 결합 소실은 매우 엄격한 결합 특이성 시험이다. (A) 클론 wnt A3의 확인. 작제물 AGA2 - 링커 -3C 부위 -GS - AWSAPDYCLKNISLGLQGTEGRECLQSGKNLSQWERRSCKRLCTDCGLRVEEKKTEIISSCNCKFHWCCTVKCEQCKQVVIEHFCAGSSGGEQKLISEEDLLEI**이 사용되었다. (B) 클론 wnt A12의 확인. 작제물 AGA2 - 링커 - 3C 부위 - GS - AWSVNNFLEDSPDHCLKNISLGLQGTEGRECLQSGKNLSQWERRSCKRLCTDCGLRVEEKKTEIISSCNCKFHWCCTVKCEQCKQVVIKYFCAGSSGGEQKLISEEDLLEI**이 사용되었다.
도 3은 개개 B 클론의 확인을 나타낸다. 각 클론에 있어서, 도 1에 제시된 Wnt C-말단 에피토프에 대한 항-myc 항체 결합 및 효모 표시 XWnt8에 대한 Fz5 및 Fz8CRD 결합은 상부 FACS 패널에 제시되어 있다. 동반 패널에서 갈색 블록 화살표에 의해 결합된 하부는 항-Myc 및 Fz5/Fz8-CRD 결합이, Wnt가 효모를 3C 프로테아제로 절단되는 경우, 소실됨을 나타낸다. 효모 표시 Wnt는 Wnt와 효모 사이에 3C 프로테아제 절단 부위를 함유하기 때문에, Mcy 및 Fz-CRD에 대한 결합 소실은, 비특이적 방식으로 효모와 상호작용이 아니라, 표시 Wnt와의 특이적 상호작용을 나타낸다. 이러한 방식에서, 절단시의 결합 소실은 매우 엄격한 결합 특이성 시험이다. (A) 클론 wnt B2의 확인. 작제물 AGA2 - 링커 - 3C 부위 - GS -NGKAMQGVFEYYKSVTFVSNCGSHPSTTSKGSPINTQYVFKDNSSTIEGRYPYDVPDYALQASGGGGSVLEDLPDYCLKNISLGLQGTEGRECLQSGKNLSQWERRSCKRLCTDCGLHVEEKKIEIISSCNCKFHWCCTVKCEQCKQVVVKHFCAGSSGGEQKLISEEDLLEI**가 사용되었다. (B) 클론 wnt B7의 확인. 작제물 AGA2 - 링커 - 3C 부위 - GS - AWSVNNELIFLEDSPDYCLKNISLGLQGTEGRECLQSGKNLSQWERRSCKRLCTDCGLRVEERKTEIISSCNCKFHWCCTVKCEQCKQVVIKHFCAGSSGGEQKLISEEDLLEI**가 사용되었다.
도 4는 바쿨로바이러스 감염된 곤충 세포로부터 재조합 수용성 C-말단 미니-Wnt8 도메인의 생성, 및 Fz5 CRD와의 상호작용 증명을 나타낸다. 단계 1에서, 미니-Xwnt8의 B7 경계 버젼은 C-말단 헥사히스티딘 태그(상부, 보다 좌측 삽화)를 갖는 곤충 세포로부터 발현된다. 제2 단계에서, 이 단백질은 수퍼덱스-75 겔 여과 크로마토그래피(및 코마시에 블루로 염색된 동반 SDS-GEL)에 의해 정되되고, 여기서 정확한 MW의 적절하게 중첩된 단백질을 미니-Wnt로서 나타내는 위치에서 컬럼으로부터 용출하는 것으로 밝혀졌다. 단계 3에서, 이 미니-Wnt8은 Fz5-CRD-Fc 융합에 부가되고, 단계 4에서 겔 여과에 대해 재분석된다. 수퍼덱스 75 컬럼 상에서 혼합물의 분획 및 이어서 비-환원 폴리아크릴아미드 겔 상에서의 전기영동은 동일한 분획에서 Cterm 미니-wnt8 및 Fz5CRD-Fc 융합의 존재를 증명했고, 이때 Cterm 미니-wnt8은 Fz5CRD-Fc의 부재하보다 더욱 조기에 분획에서 용출한다. 단계 5에서, 단백질 A와의 Fz5CRD-Fc 융합의 Fz 면역침전은 또한 Cterm 미니-wnt8 단백질을 침전시켰다. 따라서, 미니-XWnt8과 Fz5-CRD 사이의 특이적 결합 상호작용의 형성은 2가지 방식으로 입증되었다: 단계 4 - 겔 여과를 사용한 공-용출 및 단계 5- 공-면역침전.
도 5는 표면 플라스몬 공명(Biacore)에 의한 mFz8/5-CRD의 미니-XWnt8(아미노산 잔기 248 내지 338)의 결합 친화성 측정을 나타낸다. Fz8-CRD 또는 mFz5 CRD는 C-말단 비오틴을 통해 스트렙트아비딘-피복된 CM4 비아코어 칩에 결속된다. 데이터는 정제된 곤충 발현된 미니-XWnt8 C-term 단편과 Fz5 CRD 및 Fz8 CRD 둘 다와의 직접 상호작용을 입증한다. 본 도면의 하부에는 열 곡선 적합 데이터 및 결과가 제시되어 있다.
도 6은 제노푸스 라에비스(NM_001088168)로부터의 Wnt8 및 드로소필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster)로부터의 Wnt5("Drome")의 C-말단 도메인을 갖는 인간 Wnt의 C-말단 도메인의 정렬을 나타낸다.
도 7은 XWnt8 및 이의 돌연변이의 LRP6 세포외 도메인과 N-말단 미니-Wnt 사이의 상호작용을 나타낸다. (a)는 XWnt8과 LRP6의 야생형 Nterm 미니-wnt 사이의 상호작용이다. (b)는 에러 경향이 있는 효모 라이브러리 및 LRP6로부터 XWnt8의 Nterm 미니-wnt의 클론 사이의 상호작용이다. 클론은 표면 표시를 입증하기 위한 항-c-myc(히스토그램; c-myc 항체: 1:250 1차, 1:100 2차)를 사용하고, 도메인이 LRP6에 결합하는 것을 입증하기 위해 LRP6(E1E2)-Fc(도트 플롯; LRP6(E1E2)-Fc: 2μM, 1:25 2차)를 사용하여 FACS에 의해 분석했다. 히스토그램의 게이트 도메인 중의 피크는 c-myc에 대한 포지티브 신호, 따라서 Nterm 미니-wnt-8의 존재를 나타낸다. 도트 플롯의 하부 우측 사분면 중의 모집단은 LRP6에 대한 포지티브 신호를 나타낸다. (b) 중의 클론 모두가 (a) 중의 것에 필적하는 FACS 플롯을 갖고, 이는 야생형 N-term 미니-wnt로부터 생성되었음에 주목한다. 일부 클론에서, Cys55Ala 또는 Ser187Ala 돌연변이는 라이브러리를 작성하기 전에 모 XWnt8 cDNA 내로 도입되어, 이 폴리펩티드가 팔미테이트 지질 그룹의 부가에 의해 변형되지 않도록 했다. 이들 돌연변이 부위는 팔미토일화 부위로서 Wnt3A에서 55 및 187의 유사한 위치를 지정하는 공개된 문헌에 기초하여 선택되었다[참조: Willert et al. (2003) supra.]. XWnt8 N-term 도메인의 비돌연변이 야생형 염색이 또한 제공되고, 이는 Lrp6에 대한 실질적인 결합을 입증한다. 따라서, 이들 데이터는 LRP6에 대한 수용성 Nterm 미니-Wnt 결합을 입증한다.
도 8은 제노푸스 라에비스 Wnt8 및 드로소필라 멜라노가스터 Wnt5("Drome")의 N-말단 도메인을 갖는 인간 Wnt의 N-말단 도메인의 정렬을 나타낸다.

본 발명의 방법 및 조성물을 기재하기 전에, 본 발명은, 자체로서 물론 달라질 수 있기 때문에, 기재된 특정의 방법 또는 조성물로 한정되지 않는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 본원에서 사용된 용어는 단지 특정의 실시 양태를 기재하기 위한 것이며, 본 발명의 범위가 첨부된 특허청구범위에 의해서만 제한될 것이기 때문에, 한정하는 것을 의도하지 않는 것으로 이해되어야 한다.

소정 범위의 값이 제공되는 경우, 본 명세서가 달리 명백히 지시하지 않는 한, 당해 범위의 상한치 및 하한치 사이의, 하한치 단위의 1/10까지의 각 중간 값이 또한 구체적으로 개시되어 있는 것으로 이해된다. 언급된 범위 내의 임의의 언급된 값 또는 중간 값 및 당해 언급된 범위 내의 임의의 기타 언급된 또는 중간 값 사이의 각각의 보다 작은 범위는 본 발명 내에 포함된다. 이들보다 작은 범위의 상한치 및 하한치는 당해 범위 내에 독립적으로 포함되거나 배제될 수 있고, 당해 한계치 중 어느 것도 보다 작은 범위에 포함되지 않거나 둘 다가 포함되는 각 범위는 본 발명의 범위 내에 또한 포함되며, 언급된 범위내의 임의의 구체적으로 배제된 한계치에 적용된다. 언급된 범위가 당해 한계치 중의 하나 또는 둘 다를 포함하는 경우, 이들 중의 어느 하나 또는 둘 다를 제외한 범위도 또한 본 발명에 포함된다.

달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 기술자가 일반적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것들과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있으나, 몇몇 가능한 및 바람직한 방법 및 재료가 이제 기재된다. 본원에 언급된 모든 문헌은 당해 문헌이 인용되는 것과 관련하여 당해 방법 및/또는 재료를 개시 및 기재하기 위해 참조로서 본원에 도입된다. 본 발명의 개시는 도입된 문헌의 임의의 개시를 부정하는 정도까지 대신하는 것으로 이해된다.

본원 및 첨부된 특허청구범위에 사용된 바와 같이, 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는, 당해 문장이 명백히 달리 지시하지 않는 한, 복수 관계를 포함한다. 따라서, 예를 들면, "세포"에 대한 관계는 복수의 이러한 세포들을 포함하고, "펩티드"에 대한 관계는 하나 이상의 펩티드 및 이의 등가물, 예를 들면, 본 기술분야에서 통상의 기술자에게 공지된 폴리펩티드 등에 대한 관계를 포함한다.

본원에 언급된 문헌은 본원의 출원일 전에 이들의 개시를 위해서만 제공된다. 본원의 어떠한 것도 본 발명이 선행 발명에 비추어 이러한 문헌보다 선행하는 권한이 없는 것으로 해석되어야 한다. 추가로, 제공된 문헌의 일자는 독립적으로 확인하는데 필요할 수 있는 실제 공개 일자와 상이할 수 있다.

정의

미니-wnt 조성물 및 이의 사용 방법이 제공된다. 이들 조성물 및 방법은 Wnt 수용체를 발현하는 세포에서 Wnt 신호전달을 억제하는데, 예를 들면, 비정상 세포 증식을 억제하기 위해; Wnt 수용체를 발현하는 세포로 치료학적 모이어티를 전달하는데; Wnt 수용체를 발현하는 세포로 영상화 모이어티를 전달하는데 및 Wnt-특이적 항체를 생산하는데 특히 사용된다. 본 발명의 이들 및 기타 목적, 이점 및 특징은 하기의 보다 충분히 기재된 바와 같은 조성물 및 방법의 상세를 읽음으로써 본 기술분야에서 통상의 기술자에게 명백해질 것이다.

"Wnt 단백질"은 배발생 및 성숙 조직 둘 다에서 중요한 역할을 담당하는 고도로 보존된 분비 신호전달 분자 부류의 구성원이다. 용어 "Wnt" 또는 "Wnt 유전자 생성물" 또는 "Wnt 폴리펩티드"는, 본원에서 사용되는 경우, 천연 서열 Wnt 폴리펩티드, Wnt 폴리펩티드 변이체, Wnt 폴리펩티드 단편 및 키메라 Wnt 폴리펩티드를 포함한다. "미니-Wnt 폴리펩티드"는 하나 이상의 Wnt 수용체에 특이적으로 결합하도록 유도된 전장 Wnt 단백질의 능력을 보유하는 전장 Wnt 단백질의 단편인 폴리펩티드이다. Wnt 수용체에 대한 미니-wnt의 결합은 Wnt 수용체로부터의 신호전달이 억제되는 점에서 우성 네가티브 효과를 가질 수 있다.

용어 "천연 서열 Wnt 폴리펩티드"는 자연에서 발견되는 서열을 포함하는 Wnt 폴리펩티드를 지칭한다. 예를 들면, 본원에서 목적하는 인간 천연 서열 Wnt 단백질은 하기를 포함한다: Wnt-1 (GenBank Accession No. NM_005430); Wnt-2 (GenBank Accession No. NM_003391); Wnt-2B (Wnt-13) (GenBank Accession No. NM_004185 (이소형 1), NM_024494.2 (이소형 2)), Wnt-3 (RefSeq.: NM_030753), Wnt3a (GenBank Accession No. NM_033131), Wnt-4 (GenBank Accession No. NM_030761), Wnt-5A (GenBank Accession No. NM_003392), Wnt-5B (GenBank Accession No. NM_032642), Wnt-6 (GenBank Accession No. NM_006522), Wnt-7A (GenBank Accession No. NM_004625), Wnt-7B (GenBank Accession No. NM_058238), Wnt-8A (GenBank Accession No. NM_058244), Wnt-8B (GenBank Accession No. NM_003393), Wnt-9A (Wnt-14) (GenBank Accession No. NM_003395), Wnt-9B (Wnt-15) (GenBank Accession No. NM_003396), Wnt-10A (GenBank Accession No. NM_025216), Wnt-10B (GenBank Accession No. NM_003394), Wnt-11 (GenBank Accession No. NM_004626), Wnt-16 (GenBank Accession No. NM_016087)). 각각의 구성원은 당해 부류와 상이한 정도의 서열 동일성을 갖지만, 모두는, 공간이 고도로 보존된 23-24개 보존된 시스테인 잔기를 함유하는 작은(즉, 39-46 kD), 아실화, 팔미토일화, 분비된 당단백질을 코딩한다[참조: McMahon, A P et al., Trends Genet. 1992; 8: 236-242; Miller, J R. Genome Biol. 2002; 3(1): 3001.1-3001.15]. 본 발명에서 목적하는 기타 천연 서열 Wnt 폴리펩티드는, 가축 및 농장 동물, 및 동물원, 실험 또는 애완 동물, 예를 들면, 개, 고양이, 소, 말, 양, 돼지, 양, 토끼, 랫트, 마우스, 개구리, 제브라피쉬, 초파리, 벌레 등을 포함하여, 임의의 포유동물의 상기의 오솔로그를 포함한다.

"천연 서열" 미니-wnt 폴리펩티드는 서열 Wnt 폴리펩티드의 아미노산 서열의 단편이다. 이러한 천연 서열 폴리펩티드는 내인성 Wnt 단백질을 생성하는 세포로부터 분리될 수 있거나, 재조합 또는 합성 수단에 의해 생성될 수 있다. 따라서, 천연 서열 미니-wnt 폴리펩티드는, 예를 들면, 천연 발생 인간 Wnt 폴리펩티드, 쥐 Wnt 폴리펩티드, 임의의 기타 포유동물 종 또는 비포유동물 종, 예를 들면, 드로소필라, 씨, 엘레강스(C. elegans) 등으로부터의 폴리펩티드에 의해 구성된 아미노산 서열을 가질 것이다.

"변이체" 미니-wnt 폴리펩티드는 당해 단편의 길이에 걸쳐 천연 Wnt 서열과 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 하기 정의된 바와 같은 생물학적 활성 폴리펩티드를 의미한다. 이러한 변이체는 하나 이상의 아미노산 잔기가 천연 서열의 N- 또는 C-말단에 부가되고; 약 1 내지 40개 아미노산 잔기가 결실되고, 하나 이상의 아미노산 잔기에 의해 임의로 치환되는 폴리펩티드; 및 생성물이 비천연 발생 아미노산을 갖도록 아미노산 잔기가 공류 변형된 상기 폴리펩티드의 유도체를 포함한다. 임의로, 생물학적 활성 변이체는 천연 서열 폴리펩티드와 적어도 약 75% 서열 동일성, 약 80% 서열 동일성, 약 85% 아미노산 서열 동일성, 약 90% 아미노산 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 약 95%, 보다 바람직하게는 적어도 약 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가질 것이다. 본 기술분야에 공지된 다양한 방법이 이러한 변이체 폴리펩티드의 개발에 이용될 수 있다.

"키메라" 미니-wnt 폴리펩티드는 이종성 폴리펩티드에 융합되거나 접합된 미니-wnt 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드이다. 키메라 미니-wnt 폴리펩티드는 일반적으로 적어도 하나의 생물학적 특성을 초기 미니-wnt 폴리펩티드와 공유한다. 키메라 폴리펩티드의 예는 치료학적 모이어티, 영상화 모이어티, 에피토프 태그 등의 하나 이상의 작용성 모이어티에 융합된 미니-wnt 폴리펩티드를 포함한다. 통상적으로, 작용성 모이어티가 폴리펩티드 잔기인 경우, 당해 모이어티는 작용성, 예를 들면, 다량체화 촉진, 세포사 촉진, 세포 기능, 형광 신호, 에피토프 서열 등의 변경을 제공하기에 충분하지만 미니-wnt 폴리펩티드의 생물학적 활성을 간섭하지 않도록 하기에 충분히 짧은 잔기를 갖는다. 에피토프로서 사용하기에 적합한 태그 폴리펩티드는 일반적으로 적어도 6개 아미노산 잔기 및 일반적으로 약 6 내지 250개 아미노산 잔기를 갖는다.

"수용성"이란, 세정제의 부재하에 수성 완충제에 가용성인, 통상 생물학적 유효량의 폴리펩티드를 제공하는 농도에서 가용성인 조성물을 의미한다. 수용성인 조성물은 실질적으로 균질한 조성물을 형성하고, 이는 정제되는 출발 물질의 적어도 약 5%, 통상적으로 출발 물질의 적어도 약 10%, 20% 또는 30%, 보다 통상적으로 출발 물질의 약 40%, 50% 또는 60%인 특이 활성을 갖고 약 50%, 약 90% 또는 그 이상일 수 있다. 본 발명의 미니-wnt 조성물은 통상적으로 적어도 약 25 μM 이상, 예를 들면, 적어도 25 μM, 40 μM 또는 50 μM, 통상적으로 적어도 60 μM, 70 μM, 80 μM 또는 90 μM, 종종 100 μM, 120 μM 또는 150 μM의 농도에서 실질적으로 균질한 용액을 형성한다. 달리 말하면, 본 발명의 미니-wnt 조성물은 통상적으로 약 0.1 mg/ml, 약 0.5 mg/ml, 약 1 mg/ml 또는 그 이상의 농도에서 실질적으로 균질한 용액을 형성한다.

"Wnt 단백질 신호전달" 또는 "Wnt 신호전달"은 생물학적 활성 Wnt가 세포에 대해 이의 효과를 나타내어 세포의 활성을 조절하는 메카니즘을 지칭하기 위해 본원에서 사용된다. Wnt 단백질은 프리즐(Fz) 부류의 단백질로부터의 단백질, ROR 부류의 단백질로부터의 단백질, LRP 부류의 단백질로부터 단백질 LRP5, LRP6, 단백질 FRL1/크립토 및 단백질 Derailed/Ryck을 포함하여 Wnt 수용체에 결합함으로써 세포 활성을 조절한다. Wnt 결합에 의해 활성화되면, Wnt 수용체(들)는 하나 이상의 세포내 신호전달 캐스케이드를 활성화시킬 것이다. 이들은 정규 Wnt 신호전달 경로; Wnt/평면 세포 극성(Wnt/PCP) 경로; Wnt-칼슘(Wnt/Ca^{2 +}) 경로[참조: Giles, RH et al. (2003) Biochim Biophys Acta 1653, 1-24; Peifer, M. et al. (1994) Development 120: 369-380; Papkoff, J. et al (1996) Mol. Cell Biol. 16: 2128-2134; Veeman, M. T. et al. (2003) Dev. Cell 5: 367-377]; 및 본 기술분야에 공지된 바와 같은 기타 Wnt 신호전달 경로를 포함한다. 예를 들면, 정규 Wnt 신호전달 경로의 활성화는 세포내 단백질 β-카테닌의 포스포릴화의 억제를 일으키고, 이는 사이토졸 내에 β-카테닌의 축적, 및 전사 인자(예: TCF/LEF)와 상호작용하여 표적 유전자를 활성화시키는 핵에 대한 이의 후속적 전좌를 유도한다. Wnt/PCP 경로의 활성화는 RhoA, c-Jun N-말단 키나제(JNK) 및 네모형 키나제(NLK) 신호전달 캐스케이드를 활성화시켜 조직 극성 및 세포 이등 등의 생물학적 과정을 조절한다. 예를 들면, Wnt-4, Wnt-5A 또는 Wnt-11의 결합에 의한 Wnt/Ca2+의 활성화는 칼슘 이온의 세포내 방출을 유도하고, 이는 단백질 키나제 C(PKC), 칼슘-칼모듈린 의존성 키나제 II(CamKII) 또는 칼시뉴린(CaCN) 등의 칼슘 감수성 효소를 활성화시킨다. 상기 신호전달 경로의 활성을 분석함으로써, Wnt 조성물의 생물학적 활성을 용이하게 측정할 수 있다. "생물학적 활성 미니-wnt"는, 세포를 시험관내 또는 생체내에 제공하는 경우, 즉 동물(예: 포유동물)에게 투여되는 경우, Wnt 수용체에 특이적으로 결합하고 Wnt 신호전달을 조절할 수 있는 미니-wnt 조성물이다. 종종, 미니-wnt 폴리펩티드는 wnt 신호전달의 우성 네가티브 또는 경쟁적 억제제이다.

용어 "특이적 결합"은 효소/기질, 수용체/리간드, 항체/항원 및 렉틴/탄수화물 등과 같은 쌍을 이룬 종 사이에서 발생하는 결합을 지칭하고, 이는 공유 또는 비공유 상호작용 또는 공유 및 비공유 상호작용의 조합에 의해 매개될 수 있다. 2개 종의 상호작용이 비공유 결합된 복합체를 형성하는 경우, 발생하는 결합은 통상 정전기적, 수소-결합 또는 친지성 상호작용의 결과이다. 따라서, "특이적 결합"은 항체/항원 또는 리간드/수용체 상호작용의 특징을 갖는 결합된 복합체를 생성하는 2개 사이의 상호작용인 쌍을 이룬 종 사이에서 발생한다. 활성 수준을 생체내 투여 후에 작용성 분석으로 측정함으로써, 예를 들면, 골 재생의 감속, 간세포 증식의 하향조절 등을 측정하고, 비작용성 분석(예: 면역염색, ELISA, 코마시에 또는 은 염색된 겔 상에서의 정량화 등)으로 존재하는 미니-wnt 단백질의 양을 정량화하고, 생체내 생물학적 활성 미니-wnt 대 전체 미니-wnt의 비율을 측정함으로써 조성물에서 미니-wnt 단백질의 생물학적 활성을 측정할 수 있다. 생물학적으로 활성적인 미니-wnt 조성물은 Wnt 단백질의 활성을 적어도 약 40%, 약 60%, 보다 통상적으로 약 70%, 75% 또는 80%, 종종 약 85%, 90% 또는 95%, 종종 100%, 즉 Wnt 신호전달의 완전 폐기까지 조절하는 것이다.

용어 "Wnt 길항제", "Wnt 억제제" 및 "Wnt 신호전달의 억제제"는 세포 활성의 Wnt 조절을 길항시키거나 억제시키거나 음으로 조절하는 제제를 의미하는 것으로 본원에서 상호교대로 사용된다. 마찬가지로, 문구 "Wnt 신호전달을 길항시키는" 및 "Wnt 신호전달을 억제하는"은 세포 활성의 Wnt 조절을 길항시키거나 억제하거나 달리는 음으로 조절하는 것을 의미하는 것으로 본원에서 상호교대로 사용된다.

"Fz", "Fz 단백질" 및 "Fz 수용체"는 프리즐 수용체 부류의 단백질을 지칭하는 것으로 본원에서 사용된다. 이들 단백질은 CRD 도메인을 포함하는 7개-통과 막관통 단백질이다[참조: Ingham, P. W. (1996) Trends Genet. 12: 382-384; Yang-Snyder, J. et al. (1996) Curr. Biol. 6: 1302-1306; Bhanot, P. et al. (1996) Nature 382: 225-230]. Fz 부류(Fz1 내지 Fz10)의 10개 공지된 막이 존재하고, 일부는 Wnt의 수용체로서 사용될 수 있다. Fz 수용체는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 시냅스 형성의 조절을 포함하여, 다수의 Wnt 생물학적 활성을 매개한다.

"LRP", "LRP 단백질" 및 "LRP 수용체"는 저밀도 지단백질 수용체 관련 단백질 부류의 단백질을 지칭하는 것으로 본원에서 사용된다. 이들 수용체는 수용체-매개된 내포작용의 과정에서 리간드를 결합시키고 국지화시키는 단일-통과 막관통 단백질이다. LRP 단백질 LRP5 (GenBank Accession No. NM_002335.2) 및 LRP6 (GenBank Accession No. NM_002336.2)은 Wnt 수용체 복합체에 포함된다.

Ryk (탈선된 드로소필라 유사체)는 활성화 및 뉴클레오티드 결합 도메인 중의 다수의 보존된 잔기에서 다른 구성원과 상이한 성장 인자 수용체 단백질 티로신 키나제 부류의 비전형 구성원이다. Ryk의 단백질 서열은 GenBank Accession No. NM_001005861 (이소형 1) 및 NM_002958.3 (이소형 2)에서 발견할 수 있다. Ryk는 Wnt 단백질에 대한 수용체로서, 통상적으로 Fz의 공수용체로서 작용하고, 신경근 접합부에서 운동뉴런 표적 선택 및 돌촉발생을 포함하여, 골아세포 분화, 세포 이주, 세포-수명 결정, 액손 유도 및 신경돌기 성장의 조절 등과 같은 Wnt 생물학적 활성을 매개한다. 손상에 의한 Wnt/Ryk 경로의 활성화는 액손 재생을 억제한다.

"ROR", "ROR 단백질" 및 "ROR 수용체"는 수용체 티로신 키나제형 오르판 수용체 부류의 ROR1 및 ROR2 단백질을 지칭하는 것으로 본원에서 사용된다. ROR1에 대한 단백질 서열은 GenBank Accession No. NM_005012.2 (이소형 1) 및 NM_001083592.1 (이소형 2)에서 발견할 수 있다. ROR2에 대한 단백질 서열은 GenBank Accession No. NM_004560.3에서 발견할 수 있다. ROR1 및 ROR2는 Wnt 단백질의 수용체, 통상적으로 Fz의 공수용체로서 작용한다.

"EGF-CFC 단백질" 및 "EGF-CFC 수용체"는 상피 성장 인자(EGF)-크립토, FRL-1, 미소 부류에 의해 코딩된 단백질을 지칭하는 것으로 본원에서 사용된다. 이들 단백질은 크립토(또한 "CR-1" 및 "Tdgf1"으로서 불리워짐, 기형암종 유도된 성장 1의 경우, GenBank Accession No. NM_003212.3 (이소형 1) 및 NM_001174136.1 (이소형 2)) 및 크립틱(또한 "CFC1"으로 불리워짐, GenBank Accession No. NM_032545.2)을 포함한다. EGF-CFC 단백질은 변이체 EGF형 모티브, 보존된 시스테인-풍부 도메인 및 C-말단 소수성 영역을 공유한다. 이들 단백질은 Wnt 수용체이고, 척추동물 배발달 및 종양 성장 동안 세포내 신호전달 경로에서 중요한 역할을 담당한다.

"포함하는"이란, 인용된 요소들이 조성물/방법/키트에 요구되지만 다른 요소들은 특허청구의 범위 내에서 조성물/방법/키트 등을 형성하기 위해 포함될 수 있음을 의미한다. 예를 들면, 미니-wnt 폴리펩티드를 포함하는 조성물은, 임의의 네가티브 조건에 의해 포함되는 요소를 제외하고 본 기술분야에서 용이하게 이해되는 바와 같이, 미니-wnt 폴리펩티드(들) 이외의 다른 요소, 예를 들면, 작용성 모이어티, 예를 들면, 폴리펩티드, 소분자 또는 미니-wnt 폴리펩티드에 결합된(예: 공유 결합된) 핵산; 미니-wnt 조성물의 안정성을 촉진시키는 제제, 미니-wnt 조성물의 용해도를 촉진시키는 제제, 애쥬번트 등을 포함할 수 있는 조성물이다. 또 다른 예로서, 예를 들면, 인간 Wnt의 잔기 298 내지 370 또는 잔기 34 내지 247에 상응하는 Wnt 아미노산 서열을 포함하는 미니-wnt 폴리펩티드는 네가티브 조건에 의해 인용된 임의의 서열을 제외하고 당해 서열 이외에 Wnt 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

"실질적으로 이루어진"이란, 기재된 조성물 또는 방법의 범위를, 본 발명의 기본 및 신규 특성(들)에 실질적으로 영향을 미치지 않는 특정한 재료 또는 단계로 제한하는 것을 의미한다. 예를 들면, 기재된 서열로 "실질적으로 이루어진" 미니-wnt 폴리펩티드는 이들이 유도되는 전장 모 Wnt 서열에 기초하여 당해 서열의 경계에서 기재된 서열의 아미노산 서열 ± 약 5개 아미노산 잔기, 예를 들면, 인용된 결합 아미노산 잔기 이외의 약 5개 잔기, 4개 잔기, 3개 잔기, 2개 잔기 또는 약 1개 잔기, 또는 인용된 결합 아미노산 잔기 이외의 약 1개 잔기, 2개 잔기, 3개 잔기, 4개 잔기 또는 5개 잔기를 갖는다.

"이루어진"이란, 특허청구범위에 명시되지 않은 임의 요소, 단계 또는 성분을 본 조성물, 방법 또는 키트로부터 배제한다는 것을 의미한다. 예를 들면, 기재된 서열로 "이루어진" 미니-wnt 폴리펩티드는 기재된 아미노산 서열만으로 이루어진다.

"작용성 모이어티" 또는 "FM"이란, 조성물에 작용성 활성을 부여하는 폴리펩티드, 소분자 또는 핵산 조성물을 의미한다. 작용성 모이어티의 예는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 치료학적 모이어티, 결합 모이어티 및 영상화 모이어티를 포함한다.

"치료학적 모이어티" 또는 "TM"이란, 조성물에 치료학적 활성을 부여하는 폴리펩티드, 소분자 또는 핵산 조성물을 의미한다. 치료학적 모이어티의 예는 세포에 본질적으로 유해한 세포독소, 예를 들면, 소분자 화합물, 단백질 독소 및 방사성감작화 모이어티, 즉 방사성 핵종 등; 세포의 활성을 변경하는 제제, 예를 들면, 소분자, 펩티드 유사체, 사이토킨, 케모킨; 및 ADCC 또는 CDC-의존성 사멸에 대해 세포를 표적화하는 모이어티, 예를 들면, 면역그로불린의 Fc 성분을 포함한다.

"영상화 모이어티" 또는 "IM"이란, 세포, 예를 들면, 본 출원의 조성물에 의해 표적화된 세포를 국지화 및 임의로 시각화하는데 사용될 수 있는 비-세포독성 제제를 의미한다.

올리고머화 잔기는, 예를 들면, 본 기술분야에 공지된 바와 같은 지퍼, 또는 Fc 폴리펩티드, 비오틴 또는 아비딘/스트렙트아비딘, 또는 기타 친화성-향상 화학적 또는 단백질 제제를 사용함으로써 호모-이량체, -삼량체, -사량체 또는 그 이상, 또는 헤테로-이량체, -삼량체 또는 그 이상으로 미니-wnt의 올리고머화를 유도하는 포리펩티드, 소분자 또는 핵산 조성물이다.

문구 "Wnt-매개된 증상" 및 "Wnt-매개된 질환"은 비정상 또는 바람직하지 않은 Wnt 신호전달을 특징으로 하는 증상, 질환 또는 질병 상태를 기재하기 위해 본원에서 상호교대로 사용된다. 특정한 국면에서, 비정상 Wnt 신호전달은 유사한 비-발병 세포 또는 조직에서의 Wnt 신호전달 수준을 초과하는 발병 의심이 되는 세포 또는 조직에서의 Wnt 신호전달 수준이다. Wnt 매개된 질환의 예는 비정상 혈관형성(예: 망막증)과 관련된 것들, 및 비정상 증식(예: 암)과 관련된 것들을 포함한다.

용어 "치료", "치료하는" 등은 목적하는 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 수득하는 것을 일반적으로 의미하기 위해 본원에서 사용된다. 당해 효과는 이의 질환 또는 증상의 완전 또는 부분 예방의 측면에서 예방학적일 수 있고/있거나 소정 질환 및/또는 당해 질환에 기인하는 부작용에 대한 부분 또는 완전 치유의 측면에서 치료학적일 수 있다. 본원에 사용된 "치료"는 포유동물에서 소정 질환의 임의의 치료를 포괄하고, (a) 당해 질환에 걸리기 쉽지만 아직 당해 질병을 갖는 것으로 진단되지 않은 대상체에서 당해 질환이 발생하는 것을 예방하는 것; (b) 당해 질환을 억제, 즉 이의 발달을 정지시키는 것; 또는 (c) 당해 질환을 완화, 즉 당해 질환의 퇴화를 유발하는 것을 포함한다. 치료학적 제제는 질환 또는 손상의 개시 전, 동안 또는 후에 투여될 수 있다. 당해 치료가 환자의 바람직하지 않은 임상적 징후를 안정화시키거나 감소시키는 진행성 질환의 치료가 특히 중요하다. 이러한 치료는 바람직하게는 발병된 조직에서 완전한 기능 소실 전에 수행된다. 당해 치료는 바람직하게는 당해 질환의 징후 단계 동안 및 일부 경우에 당해 질환의 징후 단계 후에 투여될 수 있다.

용어 "개체", "대상체", "숙주" 및 "환자"는 본원에서 상호교대로 사용되고, 진단, 치료 또는 처치가 요구되는 임의의 포유동물 대상체, 특히 인간을 지칭한다.

분자 및 세포 생화학에서의 일반 방법은 문헌[참조: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed. (Sambrook et al., CSH Laboratory Press 2001); Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed. (Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons 1999); Protein Methods (Bollag et al., John Wiley & Sons 1996); Nonviral Vectors for Gene Therapy (Wagner et al. eds., Academic Press 1999); Viral Vectors (Kaplift & Loewy eds., Academic Press 1995); Immunology Methods Manual (I. Lefkovits ed., Academic Press 1997); and Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures in Biotechnology (Doyle & Griffiths, John Wiley & Sons 1998)]에서 발견할 수 있고, 이들의 내용은 참조로서 본원에 도입된다. 본 명세서에서 지칭되는 유전자 조작을 위한 시약, 클로닝 벡터 및 키트는 바이오라드(BioRad), 스트라타겐(Stratagene), 인비트로겐(Invitrogen), 시그마-알드리히(Sigma-Aldrich) 및 클론테크(ClonTech) 등의 상업적 공급처로부터 입수가능하다.

조성물

미니-wnt 조성물 및 이의 사용 방법이 제공된다. 미니-wnt 조성물은 미니-wnt 폴리펩티드를 포함하는 조성물이다. 상기 언급한 바와 같이, 미니-wnt 폴리펩티드는, 적어도 하나의 Wnt 수용체에 특이적으로 결합하도록 유도된 전장 Wnt 단백질의 능력을 보유하는 전장 Wnt 단백질의 단편인 폴리펩티드이다. 2개의 독특한 공-수용체에 동시에 결합할 수 있는 전장 Wnt 단백질과 달리, 미니-wnt는 전형적으로 단지 하나의 공-수용체에 결합한다. 미니-wnt 폴리펩티드는 통상적으로 적어도 약 40개 아미노산 길이, 통상적으로 적어도 약 50개 아미노산 길이 및 약 120개 이하의 아미노산 길이, 통상적으로 약 100개 이하의 아미노산 길이, 및 일부 실시양태에서 약 80 내지 약 100개 아미노산 길이이다.

일부 실시양태에서, 미니-wnt 폴리펩티드는 본원에서 "C-말단 미니-wnt" 또는 "Cterm 미니-wnt"로서 지칭되는 C-말단 미니-wnt 폴리펩티드이다. Cterm 미니-wnt는 Fz, ROR 및/또는 Ryk Wnt 수용체에 결합하는 Wnt 단백질의 C 말단 도메인으로부터 유도된, 즉 이의 서열로 구성되는 폴리펩티드 조성물이다. 일부 실시양태에서, Cterm 미니-wnt는 수용성이다.

Cterm 미니-wnt는 wnt 폴리펩티드의 카복시 말단 도메인을 포함하거나 이들로 구성되고, 아미노 말단 도메인의 아미노산 잔기를 포함하지 않는다. 카복시 말단 도메인의 서술은, 예를 들면, 도 6에 도시된 바와 같이, 복수의 인간 Wnt 단백질로 본원에서 예시되어 있고, 서술된 도메인에 기재된 실질적으로 모든 아미노산 잔기로 구성될 수 있거나, 서술된 도메인의 아미노 또는 카복시 말단에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 아미노산 잔기에 의해 절단될 수 있다. Cterm 미니-wnt는 또한 본원에 제공된 서열과의 정렬에 의해 경험적으로 동정될 수 있다. 한 가지 예에서, Cterm 미니-wnt 아미노산 서열은 인간 Wnt1의 위치 298 내지 370을 갖는 보존된 잔기에 의해 정렬하고 인간 Wnt1의 잔기 1 내지 257과 함께 정렬하는 아미노산 서열을 결실하거나, 상기 기재된 바와 같이 절단될 수 있다. 일부 실시양태에서, Cterm 미니-wnt는 상기 정의한 바와 같이 변이체 또는 유사체이다. 일부 실시양태에서, 변이 또는 돌연변이는 이의 동족 수용체에 대한 친화성; 용해도; 및/또는 이의 동족 수용체에 대한 특이성을 변경한다.

일부 실시양태에서, 미니-wnt 폴리펩티드는, 본원에서 "N-말단 미니-wnt" 또는 "Nterm 미니-wnt"로서 지칭되는 N-말단 미니-wnt 폴리펩티드이다. Nterm 미니-wnt는, LRP5, LRP6 및/또는 크립토에 결합하는 Wnt 단백질의 N 말단 도메인으로부터 유도된, 즉 이의 서열로 구성되는 폴리펩티드 조성물이다. 일부 실시양태에서, Nterm 미니-wnt는 수용성이고, 다른 실시양태에서 Nterm 미니-wnt는 지용성이다.

일부 실시양태에서, N-말단 미니-wnt 폴리펩티드는 wnt 폴리펩티드의 아미노 말단 도메인을 포함하거나 이들로 구성되고 카복시 말단 도메인의 아미노산 잔기를 포함하지 않는 폴리펩티드이다. 아미노 말단 도메인의 서술은, 예를 들면, 도 8에 도시된 바와 같이, 복수의 인간 Wnt 단백질로 본원에서 예시되고, 서술된 도메인에 기재된 실질적으로 모든 아미노산 잔기로 구성될 수 있거나, 서술된 도메인의 아미노 또는 카복시 말단에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 아미노산 잔기에 의해 절단될 수 있다. Nterm 미니-wnt는 또한 본원에 제공된 서열과의 정렬에 의해 경험적으로 동정될 수 있다. 한 가지 예에서, Nterm 미니-wnt 아미노산 서열은 인간 Wnt1의 위치 34 내지 247을 갖는 보존된 잔기에 의해 정렬하고 인간 Wnt1의 잔기 288 내지 370에 상응하는 잔기와 정렬하는 아미노산 서열을 결실하거나, 상기한 바와 같이 절단될 수 있다. Nterm 미니-wnt는 수용성일 수 있거나, 지용성일 수 있다. 일부 실시양태에서, Cterm 미니-wnt는 상기 정의한 바와 같이 변이체 또는 유사체이다. 일부 실시양태에서, 변이 또는 돌연변이는 이의 동족 수용체에 대한 친화성; 용해도; 및/또는 이의 동족 수용체에 대한 특이성을 변경한다. 일부 이러한 실시양태에서, 아미노산 치환은, 인간 Wnt1의 잔기 Cys⁵⁵ 및/또는 Ser¹⁸⁷에 상응하는 잔기가 알라닌이도록, 인간 Wnt1의 잔기 93 및/또는 224에 정렬되는 잔기에서 이루어진다.

Cterm 미니-wnt는 임의의 생물체 종, 예를 들면, 마우스, 랫트, 고양이, 닭, 초파리, 개구리, 제브라 피쉬, 개, 벌레 등의 Wnt 단백질에 상응하는 Cterm 미니-wnt 폴리펩티드 및 Nterm 미니-wnt 폴리펩티드는 본 조성물에서 사용된다. 이러한 미니-wnt에 대한 폴리펩티드 서열은, NCBI BLAST, ClustalW와 같은 정렬 소프트웨어 또는 본 기술분야에 공지된 기타 소프트웨어를 사용하여, 도 6 및 8에 도시된 제공된 Wnt 서열과 함께 목적하는 유사체 또는 오솔로그의 정렬를 수행함으로써 용이하게 측정할 수 있다. 미니-wnt 폴리펩티드를 포함하는 조성물은, 인용된 미니-wnt 폴리펩티드로부터 배제된 바와 같이 본원에서 구체적으로 기재되는 이들 요소를 제외한 다양한 요소를 포함할 수 있고, 예를 들면, 미니-wnt는 외인성 폴리펩티드와 융합될 수 있다. 융합이 이루어지는 부위는 당해 폴리펩티드의 생물학적 활성, 분비 또는 결합 특성을 최적화하도록 선택될 수 있다. 최적 부위는 통상의 실험에 의해 결정될 것이다.

예를 들면, 미니-wnt 폴리펩티드를 포함하는 조성물은 이들의 용해도를 추가로 증가시키기 위해 미니-wnt 폴리펩티드와 융합된 폴리펩티드를 임의로 포함한다. 당해 도메인은 소정의 프로테아제 절단 부위를 통해 당해 폴리펩티드, 예를 들면, TEV 프로테아제에 의해 절단되는 TEV 서열에 연결될 수 있다. 링커는 또한 하나 이상의 가요성 서열, 예를 들면, 1 내지 10개의 글리신 잔기를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질의 절단은 당해 생성물의 용해도를 유지하는 완충제, 예를 들면, 0.5 내지 2M 우레아의 존재하에, 용해도 등을 증가시키는 폴리펩티드 및/또는 폴리뉴클레오티드의 존재하에 수행된다. 목적하는 도메인은 엔도소몰리틱 도메인, 예를 들면, 인플루엔자 HA 도메인; 및 생성을 보조하는 기타 폴리펩티드, 예를 들면, IF2 도메인, GST 도메인, GRPE 도메인 등을 포함한다.

또 다른 예로서, 미니-wnt 폴리펩티드를 포함하는 조성물은 안정성을 증가시키기 위해 미니-wnt 폴리펩티드에 대한 변형을 임의로 포함할 수 있다. 예를 들면, 폴리펩티드는 PEG화될 수 있고, 여기서 당해 폴리에틸렌옥시 그룹은 혈류에서 향상된 수명을 제공한다. 당해 폴리펩티드는 생체내 안정성을 증가시키기 위해 또 다른 폴리펩티드와 융합될 수 있다. 일반적으로, 이러한 융합 파트너는 안정한 혈장 단백질이고, 이는, 예를 들면, 융합으로서 존재하는 경우, 특히 이러한 안정한 혈장 단백질이 면역글로불린 불변 도메인인 당해 폴리펩티드의 생체내 혈장 반감기를 연장시킬 수 있다. 안정한 혈장 단백질이 다량체 형태, 예를 들면, 동일하거나 상이한 폴리펩티드 쇄가 통상 디설파이드 및/또는 비공유 결합하여 조립된 멀티쇄 폴리펩티드를 형성하는 면역글로불린 또는 지단백질로 통상 발견되는 대부분의 경우에, 당해 폴리펩티드를 함유하는 본 발명의 융합체가 또한 생성될 수 있고, 안정한 혈장 단백질 전구체와 동일한 구조를 실질적으로 갖는 다량체로서 사용될 수 있다. 이들 다량체는 이들 포함하는 폴리펩티드 제제에 대해 균질성일 수 있거나, 하나 이상의 폴리펩티드 제제를 함유할 수 있다.

안정한 혈장 단백질은 이들의 천연 환경에서 순환시에 연장된 반감기, 즉 약 20시간 이상의 반감기를 통상 나타내는 단백질이다. 적합한 안정한 혈장 단백질의 예는 면역글로불린, 알부민, 지단백질, 아포지단백질 및 트랜스페린이다. 폴리펩티드 제제는 연장된 반감기를 폴리펩티드에 부여할 수 있는 혈장 단백질 또는 이의 단편의 N-말단에서 통상적으로 혈장 단백질(예: IgG)와 융합된다. 당해 폴리펩티드의 혈장 반감기에 대한 약 100% 초과의 증가가 충분하다. 통상적으로, 당해 폴리펩티드는 C-말단에서 이의 가변 영역(들) 대신에 면역글로불린의 불변 영역의 N-말단과 융합되지만, N-말단 융합이 또한 사용될 수 있다. 전형적으로, 이러한 융합은 면역글로불린 중쇄의 불변 영역의 작용적 활성 힌지, CH2 및 CH3 도메인(여기서, 중쇄는 IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgG4, IgA, IgM, IgE 및 IgD를 포함할 수 있다), 통상적으로 IgG 부류 중의 하나 이상의 단백질 조합물을 적어도 포함한다. 융합은 또한 불변 도메인의 Fc 부분의 C-말단, 또는 중쇄의 CH1에 대한 즉시 N-말단 또는 경쇄의 상응하는 영역에 대해 이루어진다. 이는 통상적으로 적절한 DNA 서열을 작제하고 이를 재조합 세포 배지에서 발현시킴으로써 달성된다. 또는, 당해 폴리펩티드는 공지된 방법에 따라 합성될 수 있다.

일부 실시양태에서, 미니-wnt는 이의 서열의 변경 없이 변형된다. 주요 서열을 변경하지 않는 목적하는 변형은 폴리펩티드의 화학적 유도체화, 예를 들면, 아실화, 아세틸화, 카복실화, 아미드화 등을 포함한다. 또한, 글리코실화의 변형, 예를 들면, 이의 합성 및 처리 또는 추가의 처리 단계 동안 폴리펩티드의 글리코실화 패턴을 변형시킴으로써 이루어진 것들: 예를 들면, 당해 폴리펩티드를 글리코실화에 영향을 미치는 효소, 예를 들면, 포유동물 글리코실화 또는 탈글리코실화 효소에 노출시킴으로써 이루어진 것들이 포함된다. 또한, 포스포릴화 아미노산 잔기, 예를 들면, 포스포티로신, 포스포세린 또는 포스포트레오닌을 갖는 서열이 포함된다.

본 발명의 조성물 및 방법에서 사용하기 위한 미니-wnt 폴리펩티드는, 단백질 분해에 대한 이들의 내성을 개선시키거나 용해도 특성을 최적화시키거나 이들을 치료제로서 보다 적합하게 되도록 하기 위해, 통상의 분자 생물학 기술 및 합성 화학을 사용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 폴리펩티드의 유사체는 천연 발생 L-아미노산 이외의 잔기를 함유하는 것들, 예를 들면, D-아미노산 또는 비천연 발생 합성 아미노산을 포함한다. D-아미노산은 아미노산 잔기의 일부 또는 전부를 대체할 수 있다.

미니-wnt 폴리펩티드는 본 기술분야에 공지된 통상의 방법을 사용하여 시험관내 합성에 의해 제조될 수 있다. 다양한 상업적 합성 장치, 예를 들면, 어플라이드 바이오시스템스, 인코포레이티드(Applied Biosystems, Inc.), 벡크만(Beckman) 등에 의한 자동화 합성기가 이용가능하다. 합성기를 사용함으로써, 천연 발생 아미노산은 비천연 아미노산으로 대체될 수 있다. 특정 서열 및 제조 방식은 편의성, 경제성, 요구되는 순도 등에 의해 결정될 것이다. 경우에 따라, 다양한 그룹이 합성 동안 또는 발현 동안 당해 펩티드 내로 도입될 수 있고, 이는 다른 분자 또는 표면에 대한 결합을 허용한다. 따라서, 시스테인을 사용하여, 티오에테르, 금속 이온 복합체에 결합시키기 위한 히스티딘, 아미드 또는 에스테를 형성하기 위한 카복실 그룹, 아미드를 형성하기 위한 아미노 그룹 등을 제조할 수 있다.

대안적으로, 미니-wnt 폴리펩티드는 본 기술분야에 공지된 다수의 시스템 중의 어느 하나를 사용하여 세포 또는 세포-유리 폴리펩티드 합성 시스템에서 재조합 DNA 기술에 의해 제조할 수 있다. 하나 이상의 상술한 성분들을 함유하는 적합한 벡터의 작제는 표준 결찰 기술을 사용한다. 분리된 플라스미드 또는 DNA 단편은 목적하는 형태로 절단, 재단 및 재결찰되어 요구되는 플라스미드를 형성한다. 작제된 플라스미드에서 정확한 서열을 확인하는 분석을 위해, 결찰 혼합물을 사용하여 숙주 세포를 형질전환시키고, 성공적인 형질전환체를, 적절한 경우, 앰피실린 또는 테트라사이클린 내성에 의해 선별한다. 형질전환체로부터의 플라스미드를 제조하고, 제한 엔도뉴클레아제 소화에 의해 분석하고/하거나 서열분석한다.

본원에서 벡터 중의 DNA를 클로닝 또는 발현시키는데 적합한 숙주 세포는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 식물, 포유동물, 곤충 등의 세포를 포함하여, 원핵생물, 효모 또는 보다 고등 진핵생물이다. 이러한 목적에 적합한 원핵생물은 진정세균, 예를 들면, 그람-음성 또는 그람-양성 생물체, 예를 들면, 엔테로박테리아세애(Enterobacteriaceae), 예를 들면, 에스케리아(Escherichia), 예를 들면, 이. 콜라이(E. coli), 엔테로박터(Enterobacter), 에르위니아(Erwinia), 클레브시엘라(Klebsiella), 프로테우스(Proteus), 살모넬라(Salmonella), 예를 들면, 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 세라티아(Serratia), 예를 들면, 세라티아 마르세스칸스(Serratia marcescans) 및 시겔라(Shigella), 및 바실리(Bacilli), 예를 들면, 비. 서브틸리스(B. subtilis) 및 비. 리케니포르미스(B. licheniformis), 슈도모나스(Pseudomonas), 예를 들면, 피. 아에루기노사(P. aeruginosa) 및 스트렙토마이세스(Streptomyces)를 포함한다. 이들 예는 한정하는 것이 아니라 예시적인 것이다.

원핵생물 이외에, 진핵생물 미생물, 섬유상 진규 또는 효모가 적합한 발현 숙주이다. 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 또는 통상의 빵 효모가 하등 진핵생물 숙주 미생물 중에서 가장 통상적으로 사용된다. 그러나, 다른 속, 종 및 균주, 예를 들면, 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe); 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 숙주, 예를 들면, 케이. 락티스(K. lactis), 케이. 프라질리스(K. fragilis) 등; 피키아 파스토리스(Pichia pastoris); 캔디다(Candida); 뉴로스포라 크라싸(Neurospora crassa); 슈와니오마이세스(Schwanniomyces), 예를 들면, 슈아니오마이세스 오씨덴탈리스(Schwanniomyces occidentalis); 및 섬유상 진균, 예를 들면, 페니실리움(Penicillium), 톨리포클라디움(Tolypocladium) 및 아스퍼길루스(Aspergillus) 숙주, 예를 들면, 에이. 니둘란(A. nidulan) 및 에이. 니거(A. niger)가 통상 입수가능하고 본원에서 유용하다.

적합한 숙주 세포는 또한 다세포 생물체로부터 유도될 수 있다. 이러한 숙주 세포는 복합체 처리 및 글리코실화 활성을 가능하게 한다. 원칙적으로, 임의의 보다 고등 진핵생물 세포 배양물, 척추동물 또는 무척추동물 배양물이 실행가능하다. 무척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 숙주, 예를 들면, 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) (모충), 아데데스 아에깁티(Aedes aegypti) (모기), 아에데스 알보픽투스(Aedes albopictus) (모기), 드로소필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster) (초파리) 및 봄빅스 모리(Bombyx mori)로부터 다수의 바쿨로바이러스 균주 및 변이체 및 상응하는 허용 곤충 숙주 세포가 동정되었다. 형질감염을 위한 다양한 바이러스 균주, 예를 들면, 오토그라파 캘리포르니아(Autographa california) NPV의 L-1 변이체 및 봄빅스 모리(Bombyx mori) NPV의 Bm-5 균주는 공개적으로 입수가능하고, 이러한 바이러스는 특히 스포도프테라 프루기페르다 세포의 형질감염을 위해 본 발명에 따라 본원에서 바이러스로서 사용될 수 있다.

목면, 옥수수, 감자, 대두, 페튜니아, 토마토 및 담배의 식물 세포 배양물을 숙주로서 사용할 수 있다. 통상적으로, 식물 세포는 박테리움 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 특정 균주와 함께 배양하여 형질감염시킨다. 식물 세포 배양물의 이러한 배양 동안, DNA 코딩 서열은 형질감염되도록 식물 숙주 세포로 이동하고, 적절한 조건하에 DNA를 발현시킬 것이다. 또한, 식물 세포와 상용성인 조절 및 신호 서열, 예를 들면, 노팔린 신타제 프로모터 및 폴리아데닐화 신호 서열이 이용가능하다.

재조합 합성에 의해 제조된 미니-wnt 폴리펩티드는 전형적으로 통상의 재조합 합성 기술에 따라 분리 및 정제된다. 용해물은 발현 숙주로 제조되고, HPLC, 배제 크로마토그래피, 겔 전기영동, 친화성 크로마토그래피 또는 기타 정제 기술을 사용하여 정제될 수 있다. 대부분의 경우, 사용되는 조성물은, 생성물의 제조 방법 및 이의 정제와 관련된 오염물과 관련하여, 적어도 20중량%의 목적 생성물, 보다 통상적으로 적어도 약 75중량%, 바람직하게는 적어도 약 95중량%, 및 치료학적 목적의 경우, 통상 적어도 약 99.5중량%의 목적 생성물을 포함할 것이다. 통상적으로, 퍼센트는 전체 단백질을 기준으로 할 것이다.

본 발명의 미니-wnt 폴리펩티드는 동족 Wnt 수용체에 대한 결합에 있어서 통상 생물학적으로 활성적이다. 이러한 경우에, 미니-wnt는 Wnt 수용체에 특이적으로 결합하고, 당해 수용체를 발현하는 세포와 접촉하고 통상 Wnt 공-수용체 쌍 중의 하나(둘 다가 아님)에 결합하는 경우, Wnt 신호전달을 억제한다. 작용성 분석, 예를 들면, β-카테닌의 탈안정화, 간세포 등의 성장 억제 등으로 미니-wnt에 의해 억제되는 Wnt 활성의 양을 측정하고, 비작용성 분석, 예를 들면, 면역염색, ELISA, 코마시에 또는 은 염색된 겔 상에서의 정량화 등에 의해 존재하는 미니-wnt 폴리펩티드의 양을 정량화하고, 생물학적 활성 미니-wnt 대 전체 미니-wnt의 비율을 측정함으로써 조성물 중의 미니-wnt 폴리펩티드의 생물학적 활성을 측정할 수 있다. 미니-wnt 폴리펩티드 특이 활성에 대한 예시적 분석은, 세포를 β-카테닌의 안정화에 충분한 시간, 통상적으로 적어도 약 1시간 동안 Wnt-포함 조성물, 예를 들면, Wnt 단백질을 발현하는 세포의 배양 배지와 접촉시킴을 수반한다. 이어서, 미니-wnt 조성물을 세포에 제공하고, 세포를 통상적으로 적어도 약 1시간 배양하여, 미니-wnt 폴리펩티드가 Wnt 단백질을 경쟁적으로 대체하도록 한다. 이어서, 당해 세포를 용해시키고, 세포 용해물을 SDS PAGE에 의해 분해한 다음, 니트로셀룰로즈로 옮기고, β-카테닌에 특이적인 항체로 탐침한다. 다른 분석은 제노푸스 동물 캡 분석에서 표적 유전자의 C57MG 형질전환 및 유도를 포함한다. 미니-wnt 폴리펩티드의 유효량 및 농도는, 예를 들면, 핵 β-카테틴의 존재에 의해 입증되는 바와 같이, 미니-wnt의 부재하의 신호전달과 비교하여, 신호전달을 25%, 50%, 75%, 90%, 95% 또는 그 이상 감소시킬 수 있는 것이다.

미니-wnt의 결합 활성의 국면은 미니-wnt가 유도되는 전장 Wnt 단백질의 수용체 특이성을 측정하는 능력이다. 전형적으로, 이러한 방법에 사용된 미니-wnt는 상응하는 전장 Wnt 단백질과 실질적 서열 동일성을 가질 것이고, 여기서 미니-wnt는 통상적으로 적어도 50, 60, 70, 80, 90 또는 그 이상의 연속 아미노산 스트레치에 걸쳐 상응하는 전장 Wnt 단백질과 동일하다. Wnt-Fz 상호작용을 확인하는 것에 대한 주요 장애는 프리즐 수용체에 대한 이들의 결합을 측정하기 위해 Wnt를 발현시키지 못하는 능력이다[참조: Kikuchi A, Yamet al. (2007) Cell Signal 19: 659-71; Logan and Nusse (2004) Annu Rev Cell Dev Biol 20: 781-810; and Wang et al. (2005) Mol Cell Biol 25: 5022-30]. 재조합에 의해 용이하게 발현되고 Fz-CRD에 결합하는 mini-Wnt의 경우, 결합 시약으로서 미니-Wnt를 사용하여 Fz 수용체를 Wnt와 매칭시키는 유망한 방법이 가능할 수 있다. 이러한 방식으로 Wnt-Fz 상호작용을 탈고립화시키는 것은 재생 생물학 및 약물 설계 뿐만 아니라 개발을 위해 변형된다.

Wnt 단백질에 대한 동족 수용체를 측정하는 방법에서, 후보 Wnt 수용체 또는 이의 단편은 천연 Wnt 단백질일 수 있는 목적하는 전장 Wnt 단백질에 상응하는 미니-wnt 폴리펩티드와 접촉시키고, 후보 수용체에 대한 미니-wnt의 결합을 측정하며, 이때 특이적 결합의 존재는 전장 Wnt 단백질이 후보 수용체에 대한 리간드임을 나타낸다. 목적하는 수용체는 Cterm 미니-wnt와 접촉될 수 있는 Fz 단백질, ROR 단백질 또는 Ryk 단백질; 및 Nterm 미니-wnt와 접촉될 수 있는 LRP5, LRP6 또는 FRL1/크립토를 포함한다. 다양한 결합 분석, 예를 들면, 후보 수용체를 발현시키는 세포를 이용하는 것이 사용되지만, 용액에서 수행될 수 있는 분석, 예를 들면, 이로써 한정되는 것은 아니지만, Fz-CRD 폴리펩티드 및 수용성 Cterm 미니-wnt 사이의 상호작용을 포함하여 수용체의 가용성 단편을 결합에 사용하는 것이 사용된다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 미니-wnt 폴리펩티드는 폴리펩티드, 약물, 방사성 핵종 또는 독소 등의 다양한 작용성 모이어티에 접합된다. 달리 말하면, 본 발명의 조성물은 미니-wnt 폴리펩티드에 접합된 작용성 모이어티를 포함한다[참조: PCT 공개공보 제WO 92/08495호; 제WO 91/14438호; 제WO 89/12624호; 미국 특허 제5,314,995호; 및 유럽 특허 제396,387호].

미니-wnt 폴리펩티드와 접합될 수 있는 작용성 모이어티의 한 가지 예는 치료학적 모이어티이다. 치료학적 모이어티는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 세포사를 촉진시키는 모이어티 및 세포 활성을 변경시키는 모이어티를 포함한다.

세포사를 촉진시키는 모이어티의 예는 세포독성제, 즉 세포독소, 예를 들면, 세포분열억제 또는 세포사멸 소분자, 폴리펩티드 제제 또는 방사활성 금속 이온을 포함한다. 세포독소 또는 세포독성제는 세포에 유해한 임의의 제제를 포함한다. 예는 파클리탁솔, 사이토칼라신 B, 그라미시딘 D, 에티디움 브로마이드, 에메틴, 미토마이신, 에토포사이드, 테노포사이드, 빈크리스틴, 콜히친, 독소루비신, 다우노루비신, 디하이드록시 안트라세네디온, 미토크산트론, 미트라마이신, 액티노마이신 D, 1-데하이드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤 및 푸로마이신 및 이들의 유사체 또는 동족체를 포함한다. 세포독성제는 또한 세포옥성 생물학적 활성을 보유하는 단백질, 펩티드 또는 폴리펩티드, 예를 들면, 독소, 예를 들면, 아브린, 리신 A, 슈도모나스 외독소, 콜레라 독소 및 디프테리아 독소를 포함한다. 세포독성제는 또한 방사활성 금속 이온, 방사선 핵종, 예를 들면, 알파-방사체(예: 비스무트-213, 라듐-226, 납-212, 액티늄-225 및 아스타틴-211) 및 β-방사체(예: 요오드-131, 이트륨-90, 레늄-188, 루테튬-177, 구리-67 및 구리-64) 및 폴리펩티드에 대한 방사선 금속 이온의 접합에 유용한 마크로사이클릭 킬레이트제(예: ¹³¹In, ¹³¹L, ¹³¹Y, ¹³¹Ho, ¹³¹Sm) 또는 상기 수록된 임의의 것들을 포함한다. 마크로사이클릭 킬레이트제는 각각의 전체가 본원에서 참조로서 도입된 문헌[참조: Denardo et al., 1998, Clin Cancer Res. 4(10):2483-90; Peterson et al., 1999, Bioconjug. Chem. 10(4):553-7; and Zimmerman et al., 1999, Nucl. Med. Biol. 26(8):943-50]에 기재된 바와 같이 링커 분자를 통해 항체에 부착될 수 있다.

세포사를 촉진시키는 모이어티는 또한 세포를 항체-의존성 세포 매개된 세포독성(ADCC), 항체 의존성 세포 매개된 식세포작용(ADCP) 또는 상보체 의존성 세포독성(CDC, 또한 보체 매개된 세포용해 또는 CMC로서 공지됨)에 대해 표적화하는 모이어티, 예를 들면, 면역글로붙린의 Fc 성분을 포함한다[참조: Raghavan et al., 1996, Annu Rev Cell Dev Biol 12:181-220; Ghetie et al., 2000, Annu Rev Immunol 18:739-766; Ravetch et al., 2001, Annu Rev Immunol 19:275-290]. 목적하는 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위해, 시험관내 ADCC 분석을 수행할 수 있다. 이러한 분석에 유용한 효과기 세포는 말초혈 단핵 세포(PBMC) 및 천연 킬러(NK) 세포를 포함한다. 대안적으로 또는 추가적으로, 목적하는 분자의 ADCC 활성은 생체내, 예를 들면, 문헌[참조: Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998)]에 기재된 바와 같은 동물 모델에서 평가될 수 있다. 모든 FcγR은 Cγ2 도메인 및 선행 힌지의 N-말단에서 Fc 상의 동일한 영역을 결합하고, 이러한 영역은 본 발명의 목적을 위한 작용성 모이어티로서 사용될 수 있다. Fc 상의 중첩하지만 분리된 부위는 상보체 단백질 C1q에 대한 접속부로서 사용된다. Fc/RcγR 결합이 ADCC 및 ADCP를 매개하는 것과 동일한 방식으로, Fc/C1q 결합은 상보체 의존성 세포독성(CDC)를 매개한다. Cγ2 및 Cγ3 도메인 사이의 Fc 상의 부위는 신생 수용체 FcRn과의 상호작용을 매개하고, 이의 결합은 엔도솜으로부터의 세포내이입 항체를 혈류로 재순환시킨다.

본원에 사용된 바와 같이, Fc 융합은 본 기술분야에 사용되는 바와 같이 용어 "면역부착", "Ig 융합", "ig 키메라" 및 "수용체 글로불린"과 동의어이다[참조: Chamow et al., 1996, Trends Biotechnol 14:52-60; Ashkenazi et al., 1997, Curr Opin Immunol 9:195-200]. Fc 융합은 면역글로불린의 Fc 영역을 Cterm 또는 Nterm 미니-wnt와 조합시킨다[참조: 미국 특허 제5,766,883호 및 제5,876,969호, 둘 다 참조서로 명확하게 도입됨].

세포사를 촉진시키는 것 이외의 치료학적 모이어티는 세포의 활성을 변경시키는 제제를 포함한다. 이러한 치료제는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 사이토킨, 케모킨, 항대사물질(예: 메토트렉세이트, 6-머캅토퓨린, 6-티오구아닌, 시타라빈, 5-플루오로우라실 데카르바진), 알킬화제(예: 메클로레타민, 티오테파 클로람부실, 멜팔란, 카르무스틴(BSNU) 및 로무스틴(CCNU), 사이클로포스파미드, 부술판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 미토마이신 C 및 시스-디클로로디아민 백금(II)(DDP) 시스프라틴), 안트라사이클린(예: 다우노루비신(이전명칭 다우노마이신) 및 독소루비신), 항생제(예: 닥티노마이신(이전명칭 액티노마이신), 블레오마이신,미트라마이신 및 안트라마이신(AMC)) 및 항-유사분열 제제(예: 빈크리스틴 및 빈블라스틴)을 포함한다.

본원의 당해 미니-wnt와의 접합에 적합한 기타 작용성 모이어티는 영상화 모이어티를 포함한다. 상기 언급한 바와 같이, 영상화 모이어티는 세포, 예를 들면, 본원 출원의 조성물에 의해 표적화되는 세포를 국지화 및 임의로 가시화시키는데 사용될 수 있는 비-세포독성제이다. 예를 들면, 형광 염료가 영상화 모이어티로서 사용될 수 있다. 또 다른 예에서, 비-세포독성제인 방사활성제가 영상화 모이어티일 수도 있다. 영상화 모이어티는 검출용 기질, 예를 들면, 호세라디쉬 퍼옥시다제(HRP), β-갈락토시다제, 루시퍼라제 등의 부가를 필요로 할 수 있다. 대안적으로, 영상화 모이어티는 검출용 기질, 예를 들면, 형광단 또는 염색단 염료, 예를 들면, 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 488^® 또는 알렉사 플루오르 647^®, 또는 형광단 또는 염색단을 포함하는 단백질(예: GFP, RFP, dsRED, phiYFP 등) 및 이의 돌연변이체의 부가를 필요로 하지 않는 검출가능한 신호를 제공할 수 있다.

본 기술분야에 공지된 바와 같은, 고친화성을 갖는 결합 염기쌍, 예를 들면, 비오틴 및 아비딘/스트렙트아비딘, 펩티드 서열, 예를 들면, 지퍼 도메인 등을 포함하여, 2개 이상의 미니-wnt의 다량체를 포함하는 작용성 모이어티가 또한 중요하다.

작용성 모이어티를 폴리펩티드에 접합시키는 기술은 본 기술분야에 공지되어 있다[참조: Amon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), and Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev. 62:119-58 (1982)].

작용성 모이어티는 통상적으로 공유 상호작용에 의해 당해 조성물의 미니-wnt 폴리펩티드에 결합된다. 일부 실시양태에서, 미니-wnt 폴리펩티드를 작용성 모이어티에 연결시키는데 사용될 수 있는 임의의 모이어티일 수 있는 링커가 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 링커는 절단가능한 링커이다. 절단가능한 링커의 사용은, 세포에 의해 흡수되고 세포 마디로 이송되면, 미니-wnt 폴리펩티드로부터 방출되는 미니-wnt 폴리펩티드에 당해 모이어티를 결합시킬 수 있다. 절단가능한 링커는 화학적 제제, 효소, pH 변화 또는 에너지에 대한 노출에 의해 절단가능하다. 사용될 수 있는 에너지 형태의 예는 광, 마이크로파, 초음파 및 고주파를 포함한다.

특정한 적용에 있어서, 작용성 모이어티를 방출시키는 것이 바람직하며, 특히 당해 모이어티가가 치료학적 모이어티인 경우, 당해 화합물이 세포로 도입되면, 당해 모이어티의 방출을 생기게 하는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 한 가지 변형예에서, 링커 L은 절단가능한 링커이다. 이는 모이어티 M을 세포에서 당해 화합물로부터 방출시킬 수 있게 한다. 이는, 예를 들면, 작용성 모이어티가, 미니-wnt 폴리펩티드로부터 분리될 때에 보다 큰 치료 효과를 갖는 치료학적 모이어티인 경우에 바람직할 수 있다. 예를 들면, 치료학적 모이어티는, 미니-wnt 폴리펩티드로부터 분리될 때에 당해 세포의 세포내 성분에 의해 흡수되는 보다 우수한 능력을 가질 수 있다. 따라서, 치료학적 모이어티가 세포내 구획에 도입될 수 있도록 미니-wnt 폴리펩티드로부터 치료학적 모이어티를 분리하는 것이 필요하거나 바람직할 수 있다.

방법

본 발명의 방법에서, 미니-wnt를 포함하는 조성물의 유효량을, 예를 들면, 세포를 그 조성물의 유효량과 접촉시킴으로써 세포에 제공하여 목적하는 효과, 예를 들면, Wnt 신호전달을 억제하고, 증식 또는 비정상적 신생 혈관 형성을 억제하고, 치료학적 또는 영상화 모이어티를 전달하고, 항체를 생성하는 등을 달성한다.

본 발명의 일부 방법에서, 당해 조성물의 유효량을 제공하여 세포에서 Wnt 신호전달을 억제한다. 생화학적으로 말하면, Wnt 억제제의 유효량 또는 유효 투여량은 세포에서 Wnt 신호전달을 미니-wnt 부재시의 신호전달에 비해 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 100% 감소시키거나 약화시키는 억제제의 양이다. 즉, 미니-wnt 조성물의 유효량 또는 유효 투여량과 접촉되는 세포의 Wnt 신호전달에 대한 반응성은 미니-wnt 조성물의 유효량/유효 투여량과 접촉되지 않은 세포의 관찰된 Wnt 신호전달에 대한 반응 강도에 대해 약 70% 또는 미만, 약 60% 또는 미만, 약 50% 또는 미만, 약 40% 또는 미만, 약 30% 또는 미만, 약 20% 또는 미만, 약 10% 또는 미만, 약 5% 또는 미만이거나, 약 0%, 즉 무시할 수 있을 정도다. Wnt에 의한 세포 활성의 조정량, 즉 Wnt 신호전달에 대한 세포의 반응성은 Wnt 생물학 분야의 기술자에게 공지된 다수의 방법으로 측정될 수 있다. 예를 들면, 세포 중의 포스포릴화 β-카테닌의 양을 측정할 수 있고, 세포 중의 사이토졸 β-카테닌의 양을 측정할 수 있고, 또는 Wnt 신호전달에 의해 정상적으로 활성화된 전사인자, 예를 들면, TCF/LEF의 활성량을, 예를 들면, TCF/LEF의 전사 표적인 유전자의 RNA 또는 단백질 수준을 측정하거나, 세포를 수용체 단백질, 예를 들면, 루시퍼라제(TOPFlash), EGFP (TOP-EGFP) 등에 작동가능하게 결합된 TCF 결합 부위(TOP)를 포함하는 핵산 벡터로 형질감염시키고/감염시키고, 생성된 수용체 단백질의 양을 정성적으로 또는 정량적으로 측정함으로써 측정될 수 있다. 이러한 방식으로, 제제의 길항 효과가 확인될 수 있다.

임상적 의미에서, 미니-wnt 조성물의 유효량은, 적합한 기간 동안, 일반적으로 적어도 약 1주, 아마도 약 2주 또는 그 이상, 약 4주, 8주 또는 더 이상의 기간까지 투여될 경우, 목적하지 않은 Wnt 신호전달과 관련된 증상의 변화를 증명하는 용량이다. 예를 들면, 유효량은 적어도 약 1주, 아마도 약 2주 또는 그 이상, 약 4주, 8주 또는 더 이상의 기간까지 투여될 경우, 암 환자의 종양 성장 또는 당뇨병성 망막증 환자의 눈에서 혈관신생을 늦추거나 심지어 정지시키는 용량이다. 일부 실시양태에서, 유효량은 질환 상태의 진행을 늦추거나 정지시킬 뿐만 아니라 상태의 역전을 유도할 수도 있다. 본 기술분야의 기술자는 초기 용량을 상기 기간 동안 투여한 다음, 일부 경우에 감소된 용량인 용량을 유지시킬 수 있음을 이해한다.

일부 실시양태에서, 당해 조성물의 유효량을 제공하여 작용성 모이어티, 예를 들면, 치료학적 모이어티 또는 영상화 모이어티를 세포에 전달한다. 이러한 실시양태에서, 유효량은 작용성 모이어티에 의한 치료학적 또는 영상화 효능을 달성하는데 필요한 양이다.

예를 들면, 일부 실시양태에서, 작용성 모이어티는 세포독성인 치료학적 모이어티이다. 세포독성 잔기를 포함하는 조성물의 유효량은 세포독성 모이어티가 융합된 미니-wnt 조성물에 의해 표적화된 세포 중에서 선택적으로 세포사를 촉진시키기에 충분한 양이다. 일부 예에서, 작용성 모이어티의 유효량은 익히 공지되어 있고, 예를 들면, 방사성핵종은 통상적으로 방사성 동위원소의 반감기에 따르는 섭생 10-30 cGy/h 범위로 전달된다. 기타 예에서, 유효량은 당해 분야의 기술자가 세포사를 분석하기 위한 당해 분야에 공지된 임의의 편리한 방법, 예를 들면, TUNEL 염색, 아넥신(Annexin) 염색, 프로피듐 요오디드 흡수 등을 사용하여 용이하게 결정할 수 있다. 당해 분야의 기술자는 초기 용량을 상기 기간 동안 투여한 다음, 일부 경우에 감소된 용량인 용량을 유지시킬 수 있음을 이해한다.

또 다른 예로서, 일부 실시양태에서, 작용성 모이어티는 ADCC 또는 CDC에 대해 세포를 표적화하는 치료학적 모이어티이다. ADCC 또는 CDC에 대해 세포를 표적화하는 모이어티를 포함하는 조성물의 유효량은 세포독성 모이어티가 융합된 미니-wnt 조성물에 의해 표적화된 세포 중에서 ADCC 또는 CDC를 선택적으로 촉진시키기에 충분한 양이다. 유효량은 본 기술분야의 기술자가 ADCC 및 CDC를 분석하기 위한 당해 분야에 공지된 임의의 편리한 방법을 사용하여 용이하게 결정할 수 있다.

또 다른 예로서, 일부 실시양태에서, 작용성 모이어티는 영상화 모이어티이다. 영상화 모이어티를 포함하는 당해 조성물의 유효량은 세포독성 잔기가 융합된 미니-wnt 조성물에 의해 표적화된 세포를 선택적으로 표지화하기에 충분한 양이다. 유효량은 본 기술분야의 기술자가 영상화 모이어티를 시각화하기 위한 당해 분야에 공지된 임의의 편리한 방법, 예를 들면, 현미경 검사, 예를 들면, 형광 또는 광학 현미경 검사를 사용하여 용이하게 결정할 수 있다.

투여될 미니-wnt 조성물의 유효량 또는 유효 투여량의 계산은 본 기술분야의 기술자의 기술 범위 내이고, 본 기술분야의 기술자에게는 통상적이다. 말할 필요도 없이, 투여되는 최종량은 투여 경로 및 치료될 장애 또는 상태의 특성에 좌우된다.

당해 방법에 사용하기에 적합한 세포는 하나 이상의 Wnt 수용체를 포함하는 세포이다. 상기 논의된 바와 같이, Wnt 수용체는 Fz 단백질, ROR 단백질, Ryk, LRP5, LRP6 및 EGF-CFC 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포는 CRD 도메인 또는 WIF 도메인을 포함하는 Wnt 수용체를 발현시키는 세포이다. 이러한 실시양태에서, 당해 방법에 사용된 조성물은 Cterm 미니-wnt인 미니-wnt 폴리펩티드를 포함한다. CRD 도메인을 포함하는 Wnt 수용체의 예는 Fz 단백질 및 ROR 막관통 키나제를 포함한다. WIF 도메인을 포함하는 Wnt 수용체의 예는 Derailed/Ryk를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포는 LRP5, LRP6 또는 크립토인 Wnt 수용체를 발현시키는 세포이다. 이러한 실시양태에서, 당해 방법에 사용된 조성물은 Nterm 미니-wnt인 미니-wnt 폴리펩티드를 포함한다.

접촉될 세포는 시험관내, 즉 배양액에 존재할 수 있거나, 이들은 생체내, 즉 대상체 내에 존재할 수 있다. 세포는 유기체로부터/유기체 내에 존재할 수 있지만, 바람직하게는 인간, 가축 동물 및 농장 동물, 및 동물원, 실험실 또는 애완 동물, 예를 들면, 개, 고양이, 소, 말, 양, 돼지, 염소, 토끼, 랫트, 마우스, 개구리, 제브라다니오, 초파리, 벌레 등을 포함하는 포유동물로부터 존재할 수 있다. 바람직하게는, 포유동물은 인간이다. 세포는 임의의 조직으로부터 존재할 수 있다. 세포는 냉동될수 있거나, 이들은 새로운 것일 수 있다. 이들은 1차 세포일 수 있거나, 이들은 세포주일 수 있다. 더욱 일반적으로, 이들은 생체내 1차 세포이다.

특별히 흥미로운 세포는, 특히 이들이 이하 기술되는 Wnt-매개 질환 상태에 관련이 있을 때, Wnt 신호전달에 반응하고, 바람직하지 않거나 또는 비정상적인 세포 증식, 예를 들면, 종양 형성, 신생 혈관 생성 등과 관련되는 것들이다. 일례로서, 흥미로운 세포는 혈관 내면을 정렬시키는 세포이고, 비정상적으로 활성일 때, 비정상적 신생 혈관 형성과 관련될 수 있는 내피 세포를 포함한다. 또 다른 예로서, 흥미로운 세포는 정상 간세포의 특성, 즉 특별한 암 샘플에서 발견된 모든 세포 형태를 발생시키는 능력을 포함하는 암 세포의 한 형태인 암 세포, 예를 들면, 종양 세포, 예를 들면, 암 간세포를 포함한다.

접촉될 시험관내 세포는 본 기술분야에서 익히 공지된 다수의 방법에 의해 미니-WNT 폴리펩티드를 포함하는 조성물과 접촉시킬 수 있다. 예를 들면, 당해 조성물을 대상 세포가 배양되는 배지 중의 세포에 제공할 수 있다. 미니-WNT 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 대상 세포에 또는 이들의 흡수를 촉진시키기 위해 본 기술분야에 익히 공지된 조건하, 예를 들면, 전기천공, 염화칼슘 형질감염 및 리포펙션하의 백터상 대상체 세포와 공배양된 세포에 제공할 수 있다. 또는, Wnt 억제제를 코딩하는 핵산을 대상 세포에 또는 바이러스를 통해 대상체 세포와 공배양된 세포에 제공할 수 있다. 즉, 세포를 미니-wnt 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 바이러스 입자와 접촉시킨다. 레트로바이러스, 예를 들면, 렌티바이러스가 본 발명의 방법에 특히 적합한데, 이들이 비-분열 세포를 형질감염시키는데 사용될 수 있기 때문이다[참조: Uchida et al . (1998) P.N.A.S. 95(20):11939-44]. 통상 사용되는 레트로바이러스 벡터는 "불완전하고", 즉 생산적인 감염에 필요한 바이러스성 단백질을 생성할 수 없다. 오히려, 벡터의 복제는 패키지 세포주에서 성장을 필요로 한다.

또한, 생체내 세포는 펩티드 또는 핵산을 대상에게 투여하기 위해 본 기술분야에 익히 공지된 다수의 방법에 의해 대상 미니-wnt 조성물과 접촉시킬 수 있다. 미니-wnt 조성물을 전장 Wnt 단백질의 제형화에 대해 기술된 바와 같이, 일부 실시양태에서 및 특히 Cterm 미니-wnt를 위해, 세정제, 리포좀의 부재하에 제형화되는 각종 제형에 도입할 수 있다. 보다 특히, 본 발명의 화합물은 약제학적으로 허용되는 적합한 담체 또는 희석제와 배합하여 약제학적 조성물로 제형화될 수 있고, 고체, 반-고체, 액체 또는 기체 형태의 제제, 예를 들면, 정제, 캡슐, 산제, 과립, 연고, 용액, 좌제, 주사액, 흡입제, 겔, 미소구 및 에어로졸로 제형화될 수 있다. 그 자체로서, 미니-wnt 조성물의 투여는 경구, 구강, 직장, 비경구, 복강내, 피내, 경피, 도관내 투여 등을 포함하는 각종 방식으로 달성될 수 있다. 활성제는 투여 후 전신성일 수 있거나, 국부 투여, 벽내 투여의 사용 또는 이식 부위에서 활성 투여량을 유지시키는 작용을 하는 임플란트의 사용에 의해 편재될 수 있다. 활성제가 즉시 활성을 위해 제형화될 수 있거나, 이는 서방출을 위해 제형화될 수 있다.

일부 상태, 특히 중추신경계 상태를 위해, 제제를 혈관 뇌 관문(BBB)을 교차하여 제형화할 필요가 있다. 혈관 뇌 관문(BBB)을 통해 약물 전달하기 위한 하나의 전략은 만니톨 또는 뉴코트리엔과 같은 삼투성 수단에 의해 또는 혈관활동성 물질, 예를 들면, 브라디키닌의 사용에 의해 생화학적으로 BBB의 파열을 수반한다. 뇌 종양에서 특정 제제를 표적화하기 위해 BBB 개구부를 사용할 가능성도 또한 옵션이다. BBB 파열제는 조성물이 혈관내 주사로 투여될 때 본 발명의 치료학적 조성물과 공투여될 수 있다. BBB를 관통하는 기타 전략들은 caveoil-1 매개된 세포통과(transcytosis), 글루코스 및 아미노산 담체와 같은 담체 매개 수송자, 인슐린 또는 트렌스페린을 위한 수용체 매개 세포통과, 및 p-당단백질과 같은 활성 유출 수송자를 포함하는 내인성 수송 시스템의 사용을 수반할 수 있다. 활성 수송 잔기를 또한 본 발명에 사용하기 위한 치료학적 화합물에 접합시켜 혈관 내피 벽을 교차하는 수송을 촉진시킬 수 있다. 또는, BBB 뒤로 치료제의 약물 전달, 예를 들면, 옴마야 리저버(Ommaya reservoir)를 통한 척추강내 전달[참조: 본원에 참조로 인용된 미국 특허 제5,222,982호 및 제5,385,582호]; 예를 들면, 주사기에 의한 구강 주사, 예를 들면, 유리체내 또는 두개내; 연속 주입에 의해, 예를 들면, 대류에 의한 캐뉼라 삽입에 의해[참조: 본원에 참조로 인용된 미국 출원 제20070254842호]; 또는 제제가 가역적으로 첨부된 장치를 이식함으로써[참조: 본원에 참조로 인용된 미국 출원 제20080081064호 및 제20090196903호] 국소 전달일 수 있다.

치료학적 용도

상기 언급한 바와 같이, 본 발명의 미니-wnt 조성물은 Wnt 신호전달에 반응하는 세포에서 Wnt 신호전달을 억제하는 데 사용된다. Wnt에 대한 세포의 반응성은 본 기술분야에 익히 공지되어 있고 본원에 제시된 방법에 의해 본 기술분야의 기술자에 의해 쉽게 측정될 수 있다. 생물학적 활성 미니-wnt 조성물은 세포 중 Wnt 신호전달을 억제한다. 즉, 길항시키거나 막는다. 다른 방식으로는, 생물학적 활성 미니-wnt 조성물은 Wnt 신호전달의 우성 네가티브 조절제이다.

Wnt 신호전달의 우성 네가티브 조절제, 예를 들면, 본 발명의 미니-wnt 조성물은 Wnt-매개 질환 상태, 예를 들면, Wnt와 관련된 각종 암을 포함하여 비정상적 세포 증식 또는 비정상적 신생 혈관 형성과 관련된 질환을 앓고 있는 포유동물, 예를 들면, 인간 환자를 치료하는데 있어서 용도를 확인한다. 이러한 상태를 특징으로 하는 질환으로 고통받고 있는 환자들은 계류중인 특허청구된 발명의 치료 프로토콜에 의해 크게 이익을 얻는다.

용어 "암"은 통상적으로 비조절된 세포 성장/증식을 특징으로 하는 포유동물의 생리학적 상태를 의미한다. 암의 예는, 이로써 제한되지는 않지만, 암종, 림프종, 아세포종 및 백혈병을 포함한다. 보다 특별한 암의 예는 결장직장암, 만성 림프구성 백혈병(CLL), 비소세포를 포함하는 폐(NSCLC), 유방, 난소, 경부, 자궁내, 전립선, 결장직장, 장 카시노이드, 방광, 위, 췌장, 간(간세포), 간아종, 식도, 폐 선암, 중피종, 활액 육종, 골육종, 두경부 편평상피 세포 암종, 청소년 비인두 혈관섬유종, 지방육종, 갑상선, 흑색종, 기저 세포암종(BCC), 골수아세포종 및 유건종을 포함하지만, 이로써 제한되지 않는다. 본 방법에 의해 치료하기 위한 특히 흥미로운 암은 신경교종, 골수아세포종, 결장암, 결장직장암, 흑색종, 유방암, 폐암, 간암 및 위암을 포함한다.

종양 성장을 억제하는 미니-wnt 폴리펩티드를 포함하는 조성물은 시험관내 암 세포의 증식률의 측정가능한 감소 또는 생체내 종양의 성장 억제를 유도하는 것이다. 예를 들면, 바람직한 성장 억제성 Wnt 길항제는 종양 성장을 적합한 대조군과 비교하여 약 5% 이상, 약 10% 이상, 약 20% 이상, 바람직하게는 약 20 내지 약 50%, 더욱 더 바람직하게는 50% 초과(약 50 내지 약 100%)까지 억제하고, 대조군은 통상적으로 시험될 Wnt 길항제 분자로 처리되지 않은 암 세포이다. Wnt 길항제는, 약 1㎍/kg 내지 약 100mg/kg 체중의 Wnt 길항제 투여가 제1 투여로부터 약 5일 내지 3개월 내에, 바람직하게는 약 5 내지 30일 내에 종양 크기 또는 세포 증식의 감소를 유도한다면, 생체내 성장 억제성이다.

또 다른 예로서, 본 발명의 조성물 및 방법은 CNS 세포에서 비정상적 신생 혈관 형성을 억제하는데 사용된다. 용어 "신생 혈관 형성"을 사용하여 신생 혈관이 이미 존재하는 혈관으로부터 성장하거나 급속히 성장하는 생물학적 과정을 기술한다. 신생 혈관 형성은 배발생 동안 및 성숙 유기체에서, 예를 들면, 상처 치유 둘 다에서 혈관의 합성에서 중요한 역할을 담당한다. 그러나, 지속적으로 비조절된 또는 부적합하게 조절된 신생 혈관 형성에 의해 구동되는 많은 질환 상태가 존재한다. 이러한 질환 상태에서, 이러한 비정상적인 신생 혈관 형성은 특별한 질환을 유도할 수 있거나 존재하는 병리학적 상태를 악화시킬 수 있다. 예를 들면, 눈의 맥락막 혈관신생(CNV) 및 후속적인 망막증이 무분별함의 가장 통상적인 원인으로서 연관되고, 다수의 안과 질환, 가장 현저하게는 당뇨병성 망박증 및 연령 관련 황반 변성(AMD, ARMD), 특히 젖은/삼출성 연령 관련 황반 변성의 병리학에 기초한다. Wnt 신호전달은 개발 동안 CNS 및 망막에서 신생 혈관 형성을 촉진시키는데 연관된다. 따라서, Wnt 억제제는 비정상적 신생 혈관 형성이 기여 인자인 CNS 질환 상태를 치료하는데 - 즉, 전개 또는 진행을 저지하는데 - 사용된다.

CNS에서 비정상적 신생 혈관 형성을 억제하거나, CNS에서 혈관신생을 억제하는 미니-wnt 조성물은 배양물 중의 내피 세포에 의해 새로운 맥관구조, 예를 들면, 관 형성 또는 대상체에게서 혈관 형성 발생의 측정가능한 억제를 유도하는 것이다. 바람직한 Wnt 길항제는 새로운 맥관구조 발생률을 적합한 대조군에 비해 약 10% 이상, 약 20% 이상, 바람직하게는 약 20% 내지 약 50%, 더욱 더 바람직하게는 50% 초과(예: 약 50% 내지 약 100%)로 억제하고, 대조군은 통상적으로 시험될 Wnt 길항제 분자로 처리되지 않는다. Wnt 길항제는, 약 1㎍/kg 내지 약 100mg/kg 체중의 Wnt 길항제의 투여가 최초 투여 후 약 5일 내지 6개월 내에, 바람직하게는 약 5일 내지 약 2개월 내에 혈관신생 발생의 서행 또는 중지를 유도할 경우, 생체내 억제성이다. 혈관신생 발생은 본 기술분야에 익히 공지되고 통상의 기술자에게 명백한 다수의 방법에 의해 관찰될 수 있다. 예를 들면, 맥락막 혈관신생의 억제는 안저촬영에 의해 직접 또는 시력 검사에서 향상된 점수를 분석하여 간접적으로 용이하게 관찰될 수 있다.

추가로, 기타 장애는 비정상적인 Wnt 신호전달과 관련되고, 골다공증, 골관절염, 다낭성 신장 질환, 당뇨병, 정신분열증, 혈관 질환, 심장 질환, 비-종양 증식성 질환 및 신경변성 질환, 예를 들면, 알츠하이머병을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

Wnt 신호전달을 억제하는 대안으로서 또는 억제 이외에, 미니-wnt 조성물을 사용하여 상기한 질환을 치료하기 위해 이미 논의된 바와 같이 치료학적 모이어티를 전달할 수 있다. 예를 들면, 미니-wnt 조성물을 사용하여 세포독성 잔기를 발암성 세포에 전달하거나 세포를 ADCC 또는 CDC-매개된 세포사에 대해 표적화하는 Fc 모이어티를 갖는 발암성 세포를 태그할 수 있다. 또 다른 예로서, 미니-wnt 조성물을 사용하여 신경변성 상태의 뉴런에서 시냅스 형성 또는 CNS 손상 부위에서 축색 돌기 과성장을 촉진시키는 사이토킨을 전달할 수 있다. 당해 미니-wnt 조성물에 대한 이러한 및 기타 치료학적 적용은 당해 분야의 기술자에게 용이하게 자명하다.

약물에 포함시키기 위해, 미니-wnt 폴리펩티드는 일반적으로 허용된 제조방법을 사용하여 수득될 수 있다. 일반적인 제안으로서, 1개의 복용량당 비경구적으로 투여된 Wnt 화합물의 전체 약제학적으로 유효한 양은 용량 반응 곡선에 의해 측정될 수 있는 범위내이다.

약제학적 조성물은, 목적하는 제형에 따라, 동물 또는 인간 투여용 약제학적 조성물을 제형화하는데 통상 사용되는 비히클로서 정의된 희석제인 약제학적으로 허용되는 무독성 담체를 포함할 수 있다. 희석제는 배합물의 생물학적 활성에 영향을 미치지 않도록 선택된다. 이러한 희석제의 예는 증류수, 완충수, 생리 식염수, PBS, 링거액, 덱스트로스 용액 및 행크 용액이다. 또한, 약제학적 조성물 또는 제형은 기타 담체, 애쥬번트 또는 무독성, 비치료적, 비면역원성 안정화제, 부형제 등을 포함할 수 있다. 당해 조성물은 또한 생리학적 조건에 근접하기 위해 추가의 물질, 예를 들면, pH 조정제 및 완충제, 독성 조정제, 습윤제 및 세정제를 포함할 수 있다.

당해 조성물은 또한 임의의 각종 안정화제, 예를 들면, 산화방지제를 포함할 수 있다. 약제학적 조성물이 폴리펩티드를 포함할 경우, 폴리펩티드는 폴리펩티드의 생체내 안정성을 향상시키고, 또는 달리는 이의 약리학적 특성을 향상시키는(예: 폴리펩티드의 반감기를 증가시키고, 이의 독성을 감소시키고, 용해도 또는 흡수성을 향상시키는) 각종 공지된 화합물과 복합체를 형성할 수 있다. 이러한 변형 또는 착물화제의 예는 설페이트, 글루코네이트, 시트레이트 및 포스페이트를 포함한다. 조성물의 폴리펩티드는 또한 이들의 생체내 특성을 향상시키는 분자와 복합체를 형성할 수 있다. 이러한 분자들은, 예를 들면, 탄수화물, 폴리아민, 아미노산, 기타 펩티드, 이온(예: 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 망간) 및 지질을 포함한다.

각종 형태의 투여에 적합한 제형에 대한 추가의 가이드라인은 문헌[참조: Remington's Pharmaceutical Sciences, Mace Publishing Company, Philadelphia, Pa., 17th ed. (1985)]에서 찾을 수 있다. 약물 전달 방법의 간단한 개요는 문헌[참조: Langer, Science 249:1527-1533 (1990)]을 참조한다.

약제학적 조성물은 예방적 및/또는 치료학적 치료용으로 투여될 수 있다. 활성 성분의 독성 및 치료학적 효능은 세포 배양물 및/또는 실험 동물에서, 예를 들면, LD₅₀(집단의 50% 치사량) 및 ED₅₀(집단의 50%에 치료학적으로 효과적인 투여량)을 측정함을 포함하는 표준 약제학적 절차에 따라 측정할 수 있다. 독성 및 치료학적 효과 사이의 투여량 비는 치료 지수이고, 이는 비 LD₅₀/ED₅₀.으로서 표현될 수 있다. 큰 치료 지수를 나타내는 화합물이 바람직하다.

세포 배양 및/또는 동물 연구로부터 수득된 데이터를 인간을 위한 용량 범위를 제형화하는데 사용할 수 있다. 활성 성분의 용량은 통상적으로 저독성과 함께 ED₅₀을 포함하는 순환 농도 범위 내에 정렬된다. 용량은 사용된 투여 형태 및 사용된 투여 경로에 따라 이 범위 내에서 가변적일 수 있다.

약제학적 조성물을 제형화하는데 사용된 성분은 바람직하게는 고순도이고, 실질적으로 잠재적으로 해로운 오염물(예: 최소 국가 식품(NF) 등급, 일반적으로 최소 분석 등급, 보다 통상적으로 최소 약제학적 등급)을 함유하지 않는다. 또한, 생체내 사용을 위해 의도된 조성물은 일반적으로 멸균성이다. 소정의 화합물이 사용 직전에 합성되어야 하는 정도로, 생성되는 생성물은 통상적으로 합성 또는 정제 공정 동안 존재할 수 있는 임의의 잠재적 독성 제제, 특히 임의의 내독소를 실질적으로 함유하지 않는다. 비경구 투여용 조성물은 또한 멸균성이고, 실질적으로 등장성이고, GMP 조건하에 제조된다.

본 발명의 방법은 또한 병용 요법에서의 용도를 확인한다. 예를 들면, 다수의 제제, 예를 들면, 안지오스타틴, 엔도스타틴, VEGF 억제제 등이 비정상적 신생 혈관 형성의 치료에 유용할 수 있다. 또한, 다수의 제제, 예를 들면, 화학치료제, 방사선요법제 등이 암 치료에 유용할 수 있다. 본 발명의 미니-wnt와 이들 기타 제제의 병용 사용은 개별 약물에 필요한 용량이 낮고, 상이한 약물 효과가 상보적이라는 이점을 가질 수 있다.

영상화 모이어티의 전달

상기 언급된 바와 같이, 본 발명의 미니-wnt 조성물은 또한 영상화 모이어티를 Wnt 수용체를 발현시키는 세포로 전달하는데 사용된다. 예를 들면, 형광 잔기에 접합된 미니-wnt 조성물을, 예를 들면, 연구 목적을 위해, 시험관내 및 생체내에서 세포를 표지화하고 추적할 수 있다.

항체 생성

본 발명의 미니-wnt 조성물을 또한 항체를 생성하는데 사용할 수 있다. 항체는 본 기술분야에 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 생성될 수 있다. 이들은 1가, 2가 또는 다가일 수 있다. 이들은 단편, 예를 들면, F(ab) 단편일 수 있다. 항체를 제조하는 방법은 당해 분야의 기술자에게 공지되어 있다[참조: Harlow, et al., Antibodies: a Laboratory Manual, (Cold spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. (1988), 전문이 본원에 참조로 인용됨].

본 발명의 항체를 생성하는데 있어서, 미니-wnt 폴리펩티드를 포함하는 본 조성물은, 예를 들면, 애쥬번트와 함께 주입용으로 제형화되고, 생성되는 면역원을 사용하여 동물을 면역화한다. 면역원 조성물의 미니-wnt 폴리펩티드가, 유리할 때, 미니-wnt 폴리펩티드가 융합 단편에 부착된 융합 단백질로서 생성될 수 있다. 융합 단편은 흔히, 예를 들면, 융합 단백질이 분리되어 친화성 크로마토그래피로 정제되도록 함으로써 단백질 정제를 돕는다. 융합 단백질은 단백질의 카복실 및/또는 아미노 말단에 부착된 융합 단편을 포함하는 단백질을 코딩하는 융합 핵산 서열로 형질전환된 재조합 세포를 배양함으로써 생성될 수 있다. 융합 단편은 면역글로불린 Fc 영역, 글루타티온-S-트랜스퍼라제, β-갈락토시다제, 2가 금속 이온에 결합할 수 있는 폴리-히스티딘 단편 및 말토스 결합 단백질을 포함할 수 있지만, 이로써 제한되지 않는다.

폴리클로날 항체를 생성하기 위해, 상기한 면역원을 토끼, 마우스, 랫트 등을 포함하지만, 이로써 제한되지 않는 각종 숙주 동물에게 투여하여 항원에 특이적인 폴리클로날 항체를 함유하는 혈청(sera)의 생성을 유도할 수 있다. 면역원의 투여는 면역화제 및, 경우에 따라, 애쥬번트의 하나 이상의 주입액을 수반할 수 있다. 각종 애쥬번트를 사용하여, 숙주 종에 따라, 면역학적 반응을 증가시킬 수 있고, 프로인트(완전 및 불완전), 미네랄 젤, 예를 들면, 수산화알루미늄, 표면 활성 물질, 예를 들면, 리소레시틴, 플루로닉 폴리올, 폴리음이온, 펩티드, 오일 에멀젼, 키홀 림페트 헤모시아닌, 디니트로페놀, 및 잠재적으로 유용한 인간 애쥬번트, 예를 들면, BCG(bacille Calmette-Guerin) 및 코르니에박테리움 파붐(Corynebacterium parvum.)을 포함하지만, 이로써 제한되지 않는다. 사용될 수 있는 추가의 애쥬번트의 예는 MPL-TDM 애쥬번트(모노포스포릴 지질 A, 합성 트레할로스 디코르니노마이콜레이트)를 포함한다. 면역화 프로토콜은 본 기술분야에 익히 공지되어 있고, 선택된 동물 숙주에서 면역 반응을 도출하는 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다. 애쥬번트는 또한 본 기술분야에서 익히 공지되어 있다.

통상적으로, 면역원(애쥬번트 존재 또는 부재)을 다수의 피하 또는 복강내 주사, 또는 근육내로 또는 IV를 통해 포유동물에게 주사한다. 면역원은 IL13 폴리펩티드, 융합 단백질 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다. 폴리펩티드의 특성(즉, 소수성 퍼센트, 친수성 퍼센트, 안정성, 순수 전하, 등전점 등)에 따라, 면역원을 면역화되는 포유동물에서 면역원성인 것으로 공지된 단백질에 접합시키는 것이 유용할 수 있다. 이러한 접합은 활성 화학적 작용성 그룹을 면역원 및 공유 결합이 형성되도록 접합되는 면역원성 단백질 둘 다에서 유도체화하여 화학적 접합, 또는 융합 단백질계 방법론, 또는 기술자에게 알려진 기타 방법을 포함한다. 이러한 면역원성 단백질의 예는 키홀 림페트 헤모시아닌, 난백알부민, 혈청 알부민, 소 티로글로불린, 대두 트립신 억제제 및 복합 T 헬퍼 펩티드를 포함하지만, 이로써 한정되지 않는다. 각종 애쥬번트를 사용하여 상기한 면역학적 반응을 증가시킬 수 있다.

모노클로날 항체는 하이브리도마 기술, 예를 들면, 문헌[참조: Kohler and Milstein, Nature, 256:495 (1975) 및 미국 특허 제4,376,110호, by Harlow, et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold spring Harbor Laboratory Press, 2.sup.nd ed. (1988), by Hammerling, et al., Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas (Elsevier, N.Y., (1981))]에 기술된 것들 또는 기술자에게 공지된 기타 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 모노클로날 항체를 제조하는데 사용될 수 있는 기타 방법의 예는 인간 B-세포 하이브리도마 기술[참조: Kosbor et al., 1983, Immunology Today 4:72; Cole et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2026-2030], 및 EBV-하이브리도마 기술[참조: Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96]을 포함하지만, 이로써 한정되지 않는다. 이러한 항체는 IgG, IgM, IgE, IgA, IgD를 포함하는 임의의 면역글로불린 부류 및 이의 임의의 아부류일 수 있다. 본 발명의 mAb를 생성하는 하이브리도마는 시험관내 또는 생체내에서 배양될 수 있다.

모노클로날 항체를 제조하기 위한 다양한 방법이 본 기술분야에 존재하고, 따라서 본 발명은 하이브리도마 중 이들의 유일한 생산으로 제한되지 않는다. 예를 들면, 모노클로날 항체는 재조합 DNA 방법, 예를 들면, 미국 특허 제4,816,567호에 기술된 것들에 의해 제조될 수 있다. 이러한 맥락에서, 용어 "모노클로날 항체"는 단일 진핵생물, 파지 또는 원핵생물 클론으로부터 유도된 항체를 의미한다. 본 발명의 모노클로날 항체를 코딩하는 DNA는 통상적인 절차를 사용하여(예: 쥐 항체의 중쇄 및 경쇄, 또는 인간, 인간화된 공급원 또는 기타 공급원으로부터의 상기 쇄를 코딩하는 유전자에 구체적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여) 용이하게 분리되어 서열분석할 수 있다. 본 발명의 하이브리도마 세포는 이러한 DNA의 바람직한 공급원으로서 작용한다. 분리되면, DNA는 발현 벡터에 위치시킬 수 있고, 이후 숙주 세포, 예를 들면, NS0 세포, 심미안 COS 세포, 챠이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, 또는 면역글로불린 단백질을 생성하지 않는 골수종 세포로 형질전환되어 재조합 숙주 세포 중에서 모노클로날 항체의 합성을 수득한다. DNA는 또한, 예를 들면, 코딩 서열을 상동성 쥐 서열(미국 특허 제4,816,567호; Morrison et al, 상기) 대신 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인으로 치환하거나, 비-면역글로불린 폴리펩티드를 위한 코딩 서열의 모두 또는 일부를 면역글로불린 코딩 서열에 공유 결합시킴으로써 변형시킬 수 있다. 이러한 비-면역글로불린 폴리펩티드는 본 발명의 항체의 불변 도메인을 대체할 수 있거나, 본 발명의 항체의 항원 결합 부위의 가변 도메인을 대체하여 키메라 2가 항체를 생성할 수 있다.

항체는 1가 항체일 수 있다. 1가 항체를 제조하는 방법은 본 기술분야에 익히 공지되어 있다. 예를 들면, 한 방법은 면역글로불린 경쇄 및 변형된 중쇄의 재조합 발현을 포함한다. 중쇄는 일반적으로 중쇄 가교결합을 방지하기 위해 Fc 영역 중의 어느 지점에서든 절단된다. 대안적으로, 관련 시스테인 잔기는 또 다른 아미노산 잔기로 대체되거나 가교결합을 방지하기 위해 삭제된다.

특정 에피토프를 인지하는 항체 단편은 공지된 기술에 의해 생성될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 Fab 및 F(ab')₂ 단편은 효소, 예를 들면, 파파인(Fab 단편을 생성하기 위해) 또는 펩신(F(ab')₂ 단편을 생성하기 위해)을 사용하여 면역글로불린 분자의 단백질 분해 개열에 의해 생성될 수 있다. F(ab')₂ 단편은 가변 영역, 경쇄 불변 영역 및 중쇄의 CH1 도메인을 함유한다.

인간 항체의 생체내 사용 및 시험관내 검출 검정을 포함하는 몇몇 용도를 위해, 키메라, 인간화된 또는 인간 항체를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 키메라 항체는 항체의 상이한 부분이 상이한 동물 종으로부터 유도된 분자, 예를 들면, 쥐 모노클로날 항체로부터 유도된 가변 영역 및 인간 면역글로불린 불변 영역을 갖는 항체이다. 키메라 항체를 생성하는 방법은 본 기술분야에 공지되어 있다. 전문이 본원에 참조로 인용된 문헌[참조: Morrison, Science 229:1202 (1985); Oi et al., BioTechniques 4:214 (1986); Gillies et al., (1989) J. Immunol. Methods 125:191-202; 미국 특허 제5,807,715호; 제4,816,567호; 및 제4,816,397호]을 참조한다.

인간화된 항체는 비-인간 종으로부터의 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR) 및 인간 면역글로불린 분자로부터의 골격(FR) 영역을 갖는 목적하는 항원을 결여하는 비-인간 종에서 생성된 항체 분자이다. 흔히, 인간 골격 영역 중의 골격 잔기는 항원 결합을 변경하는, 바람직하게는 향상시키는 CDR 공유체 항체로부터의 상응하는 잔기로 대체된다. 이러한 골격 치환은 본 기술분야에 익히 공지된 방법에 의해, 예를 들면, 항원 결합에 중요한 골격 잔기를 동정하기 위한 CDR 및 골격 잔기의 상호작용 및 특별한 위치에서 비범한 골격 잔기를 동정하기 위한 서열 비교를 모델링함으로써 동정된다[참조: Queen et al., 미국 특허 제5,585,089호; Riechmann et al., Nature 332:323 (1988), 전문이 본원에 참조로 인용됨]. 항체는, 예를 들면, CDR-그래프팅(EP 제239,400호; PCT 공보 제WO 91/09967호; 미국 특허 제5,225,539호; 제5,530,101호; 및 제5,585,089호), 베니어링 또는 재포장(EP 제592,106호; EP 제519,596호; Padlan, Molecular Immunology 28(4/5):489-498 (1991); Studnicka et al., Protein Engineering 7(6):805-814 (1994); Roguska et al., PNAS 91:969-973 (1994)), 및 쇄 혼합(미국 특허 제5,565,332호)을 포함하여 본 기술분야에 공지된 각종 기술을 사용하여 인간화된다.

완전 인간 항체는 인간 환자의 치료학적 치료용으로 특히 바람직하다. 인간 항체는 인간 면역글로불린 서열로부터 유도된 항체 라이브러리를 사용하여 상기한 파지 표시 방법을 포함하는 본 기술분야에 공지된 각종 방법에 의해 제조할 수 있다. 전문이 본원에 참조로 인용된 미국 특허 제4,444,887호 및 제4,716,111호; 및 PCT 공보 제WO 98/46645호, 제WO 98/50433호, 제WO 98/24893호, 제WO 98/16654호, 제WO 96/34096호, 제WO 96/33735호 및 제WO 91/10741호를 또한 참조한다. 콜 등(Cole et al.) 및 보에르더 등(Boerder et al.)의 기술도 또한 인간 모노클로날 항체 제조용으로 이용가능하다[참조: Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Riss, (1985); and Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95, (1991)]. 인간 항체는 또한 작용성 내인성 면역글로불린을 발현시킬 수 없지만 인간 면역글로불린 유전자를 발현시킬 수 있는 유전자 이식 마우스를 사용하여 생성할 수 있다.

후보 미니-wnt 항체를 효소 연쇄된 면역흡착제 분석(ELISA), 웨스턴 면역블롯팅 또는 기타 면역화학적 기술에 의해 시험하여 표적 Wnt에 대한 이들의 친화성 및 특이성을 확인할 수 있다. 개별적 항체를 특성화하기 위해 실행된 분석은 (1) 암 간세포의 Wnt-오토크린 증식의 억제; 및 (2) Wnt-유도된 TCF-LEF-유도 유전자 발현의 억제를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 항체는 또한 이들의 가교 반응성과 관련하여 기술되거나 구체화될 수 있다. 인간 Wnt에 대해 적어도 95%, 적어도 90%, 적어도 85%, 적어도 80%, 적어도 75%, 적어도 70%, 적어도 65%, 적어도 60%, 적어도 55%, 및 적어도 50%의 동일성(본 기술분야에 공지되고 본원에서 기술된 방법을 사용하여 계산됨)을 갖는, 미니-wnt 폴리펩티드를 결합하는 항체도 또한 본 발명에 포함된다. 따라서, 본 발명의 항체는 미니-wnt가 유도되는 천연 모 Wnt 단백질의 Wnt 도메인에 결합하고, 당해 Wnt에 의해 통상적으로 결합된 수용체 복합체의 활성화를 억제한다.

바람직한 결합 친화성은 평형 해리 상수 또는 10^-8 내지 10^-15M의 K_D를 갖는 것들을 포함한다. 본 발명은 또한 경쟁적 결합을 측정하기 위한 본 기술분야에 공지된 임의의 방법, 예를 들면, 본원에서 기술된 면역분석에 의해 측정된 바와 같이 본 발명의 에피토프에 대한 항체의 결합을 경쟁적으로 억제하는 항체를 제공한다. 바람직한 실시양태에서, 항체는 에피토프에 대한 결합을 경쟁적으로 적어도 95%, 적어도 90%, 적어도 85%, 적어도 80%, 적어도 75%, 적어도 70%, 적어도 60% 또는 적어도 50%로 억제한다.

실시예

다음 실시예는 본 기술분야에서 통상의 기술자에게 본 발명의 제조 방법 및 사용 방법에 대한 완전한 개시 및 기술을 제공하기 위해 제시되는 것이며, 본 발명자들이 본 발명으로서 간주하는 범위를 제한하고자 의도하지 않으며 또한 이하 실험이 전부이거나 단지 하나의 실험이 수행되었음을 나타내고자 하는 것은 아니다. 사용된 수(예: 양, 온도 등)에 대한 정확성을 보장하기 위한 노력이 이루어졌지만, 일부 실험적 오차 및 편차가 고려되어야 한다. 달리 기술되지 않는 한, 부는 중량부이고, 분자량은 중량 평균 분자량이고, 온도는 섭씨 온도이고, 압력은 대기압 또는 대기압 부근이다.

본 발명자들은 시험관내 발달 방법을 사용하여 생물학적 활성을 유지시킨 Wnt 또는 Wnt 단편의 수용성 변형을 동정하고자 한다. 이들이 이들의 용해도 및 재조합적으로 발현되는 능력을 크게 감소시키는 지질 그룹에 의해 변형되는 야생형 Wnt에 의해 부과된 어려움을 감안하여, 본 발명자들은 수용체 결합 활성이 유지된 수용성 Wnt 또는 Wnt 단편이 길항제 또는 효능제로서 Wnt 약물의 설계에 대해 생화학적, 작용적 및 해독적인 모든 수준에서의 Wnt 연구에 대해 변형적일 것이다고 추론했다.

이 목적을 위해, 시험관내 발달을 사용하여 a) 수용체 프리즐(Frizzled)을 결합하는데 활성이고, b) 수용성인 Wnt의 형태를 발견했다. 효모 표면 표시를 사용하여 이러한 기준을 충족시키는 것들에 대한 Wnt 변이체를 선별했다. 효모가 지질 그룹을 Wnt에 부착하기 위한 필요한 효소를 포함하지 않기 때문에, 효모 표면 표시 시스템은 이 목적에 독특하게 적합하고; Fz에 대한 결합 친화성을 갖는 것으로 동정된 임의의 돌연변이 Wnt는, 스크리닝 중의 효모에 의해 발현되기 때문에, 지질 그룹이 결여되어야 하고, 따라서 수용성이어야 한다. 개념의 증거로서, Fz-CRD 작제물에 대한 어떤 결합도 효모 상에서 제노푸스 XWnt8의 야생형 서열의 발현후 관찰되지 않았다.

효모에 의해 발현될 수 있고, Fz-CRD에 정확하게 결합할 수 있는 XWnt8의 돌연변이 또는 변이체 형태를 동정하기 위해, 돌연변이된 XWnt8 유전자의 거대 라이브러리를 에러 경향이 있는 PCR을 사용하여 생성하였고, 이는 유전자당 3 내지 4개의 기준을 도입한다. 이어서, 이러한 변이체를 효모 Aga2 단백질에 융합시키고, 융합 작제물을 효모로 형질전환시킨다. Wnt 변이체의 라이브러리(효모당 약 50,000 카피)를 Fz-CRD가 스트렙트아비딘에 접합된 Fz-CRD(이 경우에, Fz5-CRD) 조성물을 사용하여 선별하여 스트렙-Fz-CRD "사량체"(도 1)를 형성했다. 스트렙트아비딘에 대한 접합은 Fz-CRD의 친화력, 또는 다량체성 특성을 상승시키고, 이에 의해 시약의 민감도를 향상시킨다. 예를 들면, 도 1b에서 입증된 바와 같이, Fz5 및 Fz8 CRD는 완전히 비오티닐화되는데, 스트렙트아비딘의 부가가 CRD(현재 스트렙트아비딘에 의해 결합된, "+" 레인 참조)가 훨씬 높은 분자량에서 작동하도록 강제하기 때문이다. 따라서, 스트렙-Fz-CRD "사량체"는 효모 라이브러리 선택용으로 사용하기에 매우 효율적인 시약이다.

유전자를 코딩하는 컬러 및 명칭 및 N- 말단 도메인, 링커 및 C-말단 도메인은 지나고 나서 보니 후속 도면에서 제시된 실험에 기초하는 이 도면에서 수행되었다. 선택 실험 이전에, Wnt 유전자를 이들 영역으로 다시 나누었다는 것은 공지되지 않았고, 이는 단지 이러한 경계가 Wnt 유전자 상에서 도출될 수 있다는 시험관내 발달 실험 결과를 고려한 것이다. 도 1C 중의 유전자 상의 적색 화살표는 미니-Wnt가 전장 유전자를 어떤 비율로 포함하는지를 나타내기 위해 절단된 미니-Wnt C-말단 단편을 위한 다수의 경계를 지정한다.

Fz5 및 Fz8-CRD 사량체 상에서 XWnt8 에러 경향이 있는 라이브러리를 선택하는 다수의 순환 후, 특이적이고 반응성으로 나타난 개별 효모 클론을 분리했다. Fz-CRD 사량체에 대한 개별 효모 클론의 특이성은 FACS 분석으로 확인했다. 요약하면, 각 융합 작제물은 효모와 XWnt8 사이의 링커에 프로테아제 부위를, 효모 상의 XWnt8의 말단에 C-말단 Myc 태그를 포함하도록 설계되었다. 효모를 프로테아제의 부재 및 존재하에 Fz-CRD 사량체 또는 Myc-특이적 항체로 착색시킴으로써, 사량체가 실제로 특이적으로 Wnt와 반응하였는지 또는 상호작용이 단지 효모에 대한 비특이적 결합이었는지가 강하게 결정되었다. 도 2 및 3에 도시된 바와 같이, Fz-CRD 사량체에 의한 FACS 착색은 프로테아제 내부 부가시 손실되어 Fz-CRD에 대한 효모 클론의 반응성이 사실 당해 효모 클론에 의해 표시된 Wnt 변이체에 기인한 것이지 효모에 대한 Fz-CRD의 비특이적 친화성에 기인하지 않았다는 것을 지시한다. 유사하게, 프로테아제의 존재하에, Myc 반응성이 손실된다. 따라서, 특이적 결합 상호작용은 동정된 효모 클론과 FzCRD 사이에서 확인되었다.

Fz-CRD에 대한 특이적 결합 활성이 입증된 XWnt8 변이체를 발현하는 효모 클론을 가용성 재조합 형태로 발현시켰다(도 4). 일례로서, XWnt8 변이체 B7은 곤충 세포 중에서 발현시키고, 겔 여과법으로 정제하고, 이는 세정제의 부재하에 충분히 중첩된 수용성 단백질임을 보여준다(도 4, 상부). 이 정제된 B7 변이체에 부가된 Fz5-CRD는 겔 여과법에 의한 복합체로서 B7 변이체와 공용출하여 Fz5-CRD가 "쇠약해지거나" 당해 재조합 수용성 XWnt8 변이체에 특이적으로 결합한다는 것을 입증한다. 따라서, XWnt8 변이체 B7은 수용성이고, Wnt의 수용체 결합 변형이다.

상기한 추가의 XWnt8 변이체의 분석은 수용성이고 Fz-CRD에 결합된 변이체 모두가 전장 XWnt8의 작고 절단된 변형임을 나타낸다. 이러한 서열은 단지 Wnt의 C-말단 약 100개 아미노산 등을 포함하고, 따라서 "미니-Wnt"로서 칭명되었다. 미니-Wnt의 정확한 경계는 주변 영역(도 1에서 핑크)이 포함되는 한 가변적일 수 있고(도 1에 도시된 바와 같음), 이러한 미니-wnt는 Fz 결합 활성을 유지한다. 이 영역이 종을 교차하는 모든 Wnt에서 매우 보존되기 때문에, 이러한 미니-wnt는 모든 종을 교차하는 Wnt의 보존된 Fz 결합 단편을 나타낸다.

Fz-CRD에 대한 미니-wnt 변이체의 결합 친화성을 정확하게 정량하기 위해, 표면 플라스몬 공명(SPR)을 수행했다. MiniXWnt8을 발현시키고, 바클로바이러스로부터 정제했다. 비오티닐화 Fz5- 및 Fz8-CRD를 바쿨로바이러스 발현된 미니-Xwnt8이 유동된 SPR 칩에 커플링시켰다. 수학적 모델에 적합한 결합 곡선을 생성하기 위해, 다수의 미니-Wnt 농도를 칩에 주사하였고, 결합 정도를 반응 유닛(RU)으로 기록했다. 이 데이터로부터, 본 발명자들은 결합 곡선을 적합하게 하고, 약 1 내지 2μmol의 친화성 상수(KD)를 계산할 수 있었다. 따라서, 이 실험은 정제 시스템에서 미니-XWnt8이 수성 완충제 결여 세정제 중에서 생리학적 친화성을 갖는 Fz-CRD에 결합한다는 것을 입증한다.

기타 Wnt에 대한 미니-XWnt8의 발견의 관련성은 매우 명백하다. 도 6은 Wnt의 미니-Wnt 영역, Wnt의 대략 최종 110개 잔기를 포함하는 XWnt8과 함께 모든 인간 Wnt의 서열 정렬을 보여준다. 서열은 매우 보존되어 C-말단 미니-Wnt 도메인 중의 모든 포유동물, 척추동물 및 무척추동물의 Fz 결합 도메인이 따라서 서술된다는 것을 기술한다. 이 도메인은 임의의 지질 부가 부위를 함유하지 않고, 수용성이고, 따라서 Wnt 신호전달을 조정하는 Wnt 폴리펩티드를 생성하기 위한 이상적인 플랫폼을 제공한다.

Fz 수용체를 통한 대부분의 Wnt 신호전달은 Fz 및 공수용체, 예를 들면, LRP5/6 둘 다에 대한 Wnt 결합을 필요로 한다는 것이 공지되었다. 그러나, 당해 공수용체 상호작용에 필요한 Wnt의 도메인에 대해서는 어떤 것도 공지되지 않았다. 미니-Wnt C-말단 도메인이 Fz에 결합한다는 본 발견에 기초하여, 본 발명자들은 N-말단 도메인(도 1에 도시됨)이 Lrp6에 결합한다고 추론했다. Wnt의 N-말단 도메인이 Lrp6과 상호작용하는지를 측정하기 위해, 효모 표시를 사용하는 유사한 실험을 상기와 같이 수행했다. 먼저, 야생형 XWnt8 N-말단 도메인을 발현하는 효모 클론을 Myc 항체로 착색되는 것으로 제시되어 N-말단 미니-Wnt가 효모의 표면에서 발현된다(도 7a, 좌측 패널)는 것을 입증한다. 이어서, 효모 상에서 야생형 XWnt8에 대한 LRP6의 결합을 입증하여 미니-Wnt의 N-말단 도메인이 Lrp6 결합 도메인임을 명백하게 입증한다(도 7a, 우측 패널).

이어서, 본 발명자들은 XWnt8 N-말단 도메인의 에러 경향이 있는 라이브러리를 수득하고, Cterm 미니-wnt에 대한 유사한 접근에 LRP6을 사용하는 클론을 선택했다. 도 7b는 구체적으로 myc 항체 및 Lrp6 수용체로 착색하는 당해 에러 경향이 있는 라이브러리로부터 효모 클론의 범위를 나타낸다. 이러한 클론 중 다수는 야생형 N-말단 도메인보다 훨씬 더 강하게 착색시키고, 따라서 더욱 안정할 수 있거나 높은 친화성으로 결합할 수 있다. 따라서, 도 7은 생물학적 활성인 미니 N-말단 Wnt의 생성에 대한 증거를 제공한다. 도 8에서, 본 발명자들은 인간 Wnt의 N-말단 영역이 또한 매우 보호되고, 이러한 Wnt의 형태가 N-말단 도메인을 사용하여 Lrp6에 결합한다는 것을 보여준다. 따라서, 본 연구가 제노푸스 Wnt8을 사용하는 반면, 결과는 강한 서열 보존성이 제공된 기타 종을 추정한다.

총체적으로, 이러한 실험들은 Wnt가 N-말단 Lrp5/6 결합 도메인 및 수용성 C-말단 미니-Wnt Fz 결합 도메인으로 분리된다는 것을 입증한다. 두 도메인은 진단제로서 또는 Wnt 신호전달을 조절하기 위한 치료학적 제제로서 작용하는 Lrp5/6 또는 Fz 결합 분자를 생성하기 위한 플랫폼으로서 사용될 수 있다.

전술된 것은 단지 본 발명의 원리를 예시한다. 본 기술분야의 기술자들은, 본원에서 명백하게 기술되거나 제시되지 않았지만, 본 발명의 원리를 구현하고, 이의 취지 및 범위 내에 포함되는 각종 배열을 설계할 수 있다. 또한, 본원에서 인용된 모든 실시예 및 잠정적인 언어는 주로 독자가 본 발명의 원리 및 본 기술분야를 촉진시키기 위해 본 발명자에 의해 공헌된 개념을 이해하는 것을 돕고자 하고, 제한 없이 상기 구체적으로 인용된 실시예 및 상태에 제한되지 않는 것으로 해석되어야 한다. 또한, 본 발명의 원리, 국면 및 양태 뿐만 아니라 이의 구체적인 예를 열거하는 본원에서의 모든 기술은 이의 구조적 및 작용성 등가물을 모두 포함하는 것으로 의도된다. 추가로, 이러한 등가물은 현재 공지된 등가물 및 미래에 개발될 등가물, 즉 구조와 무관하게 동일한 기능을 수행하는 개발된 임의의 원소를 포함한다. 본 발명의 범위는, 따라서, 본원에서 제시되고 기술된 예시적 양태로 제한하고자 하는 것은 아니다. 오히려, 본 발명의 범위 및 취지는 첨부된 특허청구범위에 의해 구현된다.

<110> THE BOARD OF TRUSTEES OF THE LELAND STANFORD JUNIOR UNIVERSITY <120> WNT Compositions and Methods of Use Thereof <130> IPA130733 <150> US 61/462,130 <151> 2011-01-28 <160> 46 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 316 <212> PRT <213> Xenopus laevis <400> 1 Ala Trp Ser Val Asn Asn Phe Leu Met Thr Gly Pro Lys Ala Tyr Leu 1 5 10 15 Thr Tyr Ser Ala Ser Val Ala Val Gly Ala Gln Asn Gly Ile Glu Glu 20 25 30 Cys Lys Tyr Gln Phe Ala Trp Glu Arg Trp Asn Cys Pro Glu Ser Thr 35 40 45 Leu Gln Leu Ala Thr His Asn Gly Leu Arg Ser Ala Thr Arg Glu Thr 50 55 60 Ser Phe Val His Ala Ile Ser Ser Ala Gly Val Met Tyr Thr Leu Thr 65 70 75 80 Arg Asn Cys Ser Met Gly Asp Phe Asp Asn Cys Gly Cys Asp Asp Ser 85 90 95 Arg Asn Gly Arg Ile Gly Gly Arg Gly Trp Val Trp Gly Gly Cys Ser 100 105 110 Asp Asn Ala Glu Phe Gly Glu Arg Ile Ser Lys Leu Phe Val Asp Gly 115 120 125 Leu Glu Thr Gly Gln Asp Ala Arg Ala Leu Met Asn Leu His Asn Asn 130 135 140 Glu Ala Gly Arg Leu Ala Val Lys Glu Thr Met Lys Arg Thr Cys Lys 145 150 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Arg Ser Ala Asn Arg Glu Thr Ala Phe 50 55 60 Val His Ala Ile Ser Ser Ala Gly Val Met Tyr Thr Leu Thr Arg Asn 65 70 75 80 Cys Ser Leu Gly Asp Phe Asp Asn Cys Gly Cys Asp Asp Ser Arg Asn 85 90 95 Gly Gln Leu Gly Gly Gln Gly Trp Leu Trp Gly Gly Cys Ser Asp Asn 100 105 110 Val Gly Phe Gly Glu Ala Ile Ser Lys Gln Phe Val Asp Ala Leu Glu 115 120 125 Thr Gly Gln Asp Ala Arg Ala Ala Met Asn Leu His Asn Asn Glu Ala 130 135 140 Gly Arg Lys Ala Val Lys Gly Thr Met Lys Arg Thr Cys Lys Cys His 145 150 155 160 Gly Val Ser Gly Ser Cys Thr Thr Gln Thr Cys Trp Leu Gln Leu Pro 165 170 175 Glu Phe Arg Glu Val Gly Ala His Leu Lys Glu Lys Tyr His Ala 180 185 190 <210> 39 <211> 220 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 39 Tyr Phe Gly Leu Thr Gly Ser Glu Pro Leu Thr Ile Leu Pro Leu Thr 1 5 10 15 Leu Glu Pro Glu Ala Ala Ala Gln Ala His Tyr Lys Ala Cys Asp Arg 20 25 30 Leu Lys Leu Glu Arg Lys Gln Arg Arg Met Cys Arg Arg Asp Pro Gly 35 40 45 Val Ala Glu Thr Leu Val Glu Ala Val Ser Met Ser Ala Leu Glu Cys 50 55 60 Gln Phe Gln Phe Arg Phe Glu Arg Trp Asn Cys Thr Leu Glu Gly Arg 65 70 75 80 Tyr Arg Ala Ser Leu Leu Lys Arg Gly Phe Lys Glu Thr Ala Phe Leu 85 90 95 Tyr Ala Ile Ser Ser Ala Gly Leu Thr His Ala Leu Ala Lys Ala Cys 100 105 110 Ser Ala Gly Arg Met Glu Arg Cys Thr Cys Asp Glu Ala Pro Asp Leu 115 120 125 Glu Asn Arg Glu Ala Trp Gln Trp Gly Gly Cys Gly Asp Asn Leu Lys 130 135 140 Tyr Ser Ser Lys Phe Val Lys Glu Phe Leu Gly Arg Arg Ser Ser Lys 145 150 155 160 Asp Leu Arg Ala Arg Val Asp Phe His Asn Asn Leu Val Gly Val Lys 165 170 175 Val Ile Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Cys Lys Cys His Gly Val Ser 180 185 190 Gly Ser Cys Thr Val Arg Thr Cys Trp Arg Gln Leu Ala Pro Phe His 195 200 205 Glu Val Gly Lys His Leu Lys His Lys Tyr Glu Thr 210 215 220 <210> 40 <211> 223 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 40 Ala Ser Tyr Phe Gly Leu Thr Gly Arg Glu Val Leu Thr Pro Phe Pro 1 5 10 15 Gly Leu Gly Thr Ala Ala Ala Pro Ala Gln Gly Gly Ala His Leu Lys 20 25 30 Gln Cys Asp Leu Leu Lys Leu Ser Arg Arg Gln Lys Gln Leu Cys Arg 35 40 45 Arg Glu Pro Gly Leu Ala Glu Thr Leu Arg Asp Ala Ala His Leu Gly 50 55 60 Leu Leu Glu Cys Gln Phe Gln Phe Arg His Glu Arg Trp Asn Cys Ser 65 70 75 80 Leu Glu Gly Arg Met Gly Leu Leu Lys Arg Gly Phe Lys Glu Thr Ala 85 90 95 Phe Leu Tyr Ala Val Ser Ser Ala Ala Leu Thr His Thr Leu Ala Arg 100 105 110 Ala Cys Ser Ala Gly Arg Met Glu Arg Cys Thr Cys Asp Asp Ser Pro 115 120 125 Gly Leu Glu Ser Arg Gln Ala Trp Gln Trp Gly Val Cys Gly Asp Asn 130 135 140 Leu Lys Tyr Ser Thr Lys Phe Leu Ser Asn Phe Leu Gly Ser Lys Arg 145 150 155 160 Gly Asn Lys Asp Leu Arg Ala Arg Ala Asp Ala His Asn Thr His Val 165 170 175 Gly Ile Lys Ala Val Lys Ser Gly Leu Arg Thr Thr Cys Lys Cys His 180 185 190 Gly Val Ser Gly Ser Cys Ala Val Arg Thr Cys Trp Lys Gln Leu Ser 195 200 205 Pro Phe Arg Glu Thr Gly Gln Val Leu Lys Leu Arg Tyr Asp Ser 210 215 220 <210> 41 <211> 260 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 41 Pro Arg Ser Ala Pro Asn Asp Ile Leu Asp Leu Arg Leu Pro Pro Glu 1 5 10 15 Pro Val Leu Asn Ala Asn Thr Val Cys Leu Thr Leu Pro Gly Leu Ser 20 25 30 Arg Arg Gln Met Glu Val Cys Val Arg His Pro Asp Val Ala Ala Ser 35 40 45 Ala Ile Gln Gly Ile Gln Ile Ala Ile His Glu Cys Gln His Gln Phe 50 55 60 Arg Asp Gln Arg Trp Asn Cys Ser Ser Leu Glu Thr Arg Asn Lys Ile 65 70 75 80 Pro Tyr Glu Ser Pro Ile Phe Ser Arg Gly Phe Arg Glu Ser Ala Phe 85 90 95 Ala Tyr Ala Ile Ala Ala Ala Gly Val Val His Ala Val Ser Asn Ala 100 105 110 Cys Ala Leu Gly Lys Leu Lys Ala Cys Gly Cys Asp Ala Ser Arg Arg 115 120 125 Gly Asp Glu Glu Ala Phe Arg Arg Lys Leu His Arg Leu Gln Leu Asp 130 135 140 Ala Leu Gln Arg Gly Lys Gly Leu Ser His Gly Val Pro Glu His Pro 145 150 155 160 Ala Leu Pro Thr Ala Ser Pro Gly Leu Gln Asp Ser Trp Glu Trp Gly 165 170 175 Gly Cys Ser Pro Asp Met Gly Phe Gly Glu Arg Phe Ser Lys Asp Phe 180 185 190 Leu Asp Ser Arg Glu Pro His Arg Asp Ile His Ala Arg Met Arg Leu 195 200 205 His Asn Asn Arg Val Gly Arg Gln Ala Val Met Glu Asn Met Arg Arg 210 215 220 Lys Cys Lys Cys His Gly Thr Ser Gly Ser Cys Gln Leu Lys Thr Cys 225 230 235 240 Trp Gln Val Thr Pro Glu Phe Arg Thr Val Gly Ala Leu Leu Arg Ser 245 250 255 Arg Phe His Arg 260 <210> 42 <211> 253 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 42 Asn Glu Ile Leu Gly Leu Lys Leu Pro Gly Glu Pro Pro Leu Thr Ala 1 5 10 15 Asn Thr Val Cys Leu Thr Leu Ser Gly Leu Ser Lys Arg Gln Leu Gly 20 25 30 Leu Cys Leu Arg Asn Pro Asp Val Thr Ala Ser Ala Leu Gln Gly Leu 35 40 45 His Ile Ala Val His Glu Cys Gln His Gln Leu Arg Asp Gln Arg Trp 50 55 60 Asn Cys Ser Ala Leu Glu Gly Gly Gly Arg Leu Pro His His Ser Ala 65 70 75 80 Ile Leu Lys Arg Gly Phe Arg Glu Ser Ala Phe Ser Phe Ser Met Leu 85 90 95 Ala Ala Gly Val Met His Ala Val Ala Thr Ala Cys Ser Leu Gly Lys 100 105 110 Leu Val Ser Cys Gly Cys Gly Trp Lys Gly Ser Gly Glu Gln Asp Arg 115 120 125 Leu Arg Ala Lys Leu Leu Gln Leu Gln Ala Leu Ser Arg Gly Lys Ser 130 135 140 Phe Pro His Ser Leu Pro Ser Pro Gly Pro Gly Ser Ser Pro Ser Pro 145 150 155 160 Gly Pro Gln Asp Thr Trp Glu Trp Gly Gly Cys Asn His Asp Met Asp 165 170 175 Phe Gly Glu Lys Phe Ser Arg Asp Phe Leu Asp Ser Arg Glu Ala Pro 180 185 190 Arg Asp Ile Gln Ala Arg Met Arg Ile His Asn Asn Arg Val Gly Arg 195 200 205 Gln Val Val Thr Glu Asn Leu Lys Arg Lys Cys Lys Cys His Gly Thr 210 215 220 Ser Gly Ser Cys Gln Phe Lys Thr Cys Trp Arg Ala Ala Pro Glu Phe 225 230 235 240 Arg Ala Val Gly Ala Ala Leu Arg Glu Arg Leu Gly Arg 245 250 <210> 43 <211> 219 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 43 Ile Lys Trp Leu Ala Leu Ser Lys Thr Pro Ser Ala Leu Ala Leu Asn 1 5 10 15 Gln Thr Gln His Cys Lys Gln Leu Glu Gly Leu Val Ser Ala Gln Val 20 25 30 Gln Leu Cys Arg Ser Asn Leu Glu Leu Met His Thr Val Val His Ala 35 40 45 Ala Arg Glu Val Met Lys Ala Cys Arg Arg Ala Phe Ala Asp Met Arg 50 55 60 Trp Asn Cys Ser Ser Ile Glu Leu Ala Pro Asn Tyr Leu Leu Asp Leu 65 70 75 80 Glu Arg Gly Thr Arg Glu Ser Ala Phe Val Tyr Ala Leu Ser Ala Ala 85 90 95 Ala Ile Ser His Ala Ile Ala Arg Ala Cys Thr Ser Gly Asp Leu Pro 100 105 110 Gly Cys Ser Cys Gly Pro Val Pro Gly Glu Pro Pro Gly Pro Gly Asn 115 120 125 Arg Trp Gly Gly Cys Ala Asp Asn Leu Ser Tyr Gly Leu Leu Met Gly 130 135 140 Ala Lys Phe Ser Asp Ala Pro Met Lys Val Lys Lys Thr Gly Ser Gln 145 150 155 160 Ala Asn Lys Leu Met Arg Leu His Asn Ser Glu Val Gly Arg Gln Ala 165 170 175 Leu Arg Ala Ser Leu Glu Met Lys Cys Lys Cys His Gly Val Ser Gly 180 185 190 Ser Cys Ser Ile Arg Thr Cys Trp Lys Gly Leu Gln Glu Leu Gln Asp 195 200 205 Val Ala Ala Asp Leu Lys Thr Arg Tyr Leu Ser 210 215 <210> 44 <211> 233 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 44 Asn Trp Met Trp Leu Gly Cys Ala Asn Leu Pro Leu Asn Ser Arg Gln 1 5 10 15 Lys Glu Leu Cys Lys Arg Lys Pro Tyr Leu Leu Pro Ser Ile Arg Glu 20 25 30 Gly Ala Arg Leu Gly Ile Gln Glu Cys Gly Ser Gln Phe Arg His Glu 35 40 45 Arg Trp Asn Cys Met Ile Thr Ala Ala Ala Thr Thr Ala Pro Met Gly 50 55 60 Ala Ser Pro Leu Phe Gly Tyr Glu Leu Ser Ser Gly Thr Lys Glu Thr 65 70 75 80 Ala Phe Ile Tyr Ala Val Met Ala Ala Gly Leu Val His Ser Val Thr 85 90 95 Arg Ser Cys Ser Ala Gly Asn Met Thr Glu Cys Ser Cys Asp Thr Thr 100 105 110 Leu Gln Asn Gly Gly Ser Ala Ser Glu Gly Trp His Trp Gly Gly Cys 115 120 125 Ser Asp Asp Val Gln Tyr Gly Met Trp Phe Ser Arg Lys Phe Leu Asp 130 135 140 Phe Pro Ile Gly Asn Thr Thr Gly Lys Glu Asn Lys Val Leu Leu Ala 145 150 155 160 Met Asn Leu His Asn Asn Glu Ala Gly Arg Gln Ala Val Ala Lys Leu 165 170 175 Met Ser Val Asp Cys Arg Cys His Gly Val Ser Gly Ser Cys Ala Val 180 185 190 Lys Thr Cys Trp Lys Thr Met Ser Ser Phe Glu Lys Ile Gly His Leu 195 200 205 Leu Lys Asp Lys Tyr Glu Asn Ser Ile Gln Ile Ser Asp Lys Thr Lys 210 215 220 Arg Lys Met Arg Arg Arg Glu Lys Asp 225 230 <210> 45 <211> 213 <212> PRT <213> Xenopus laevis <400> 45 Trp Ser Val Asn Asn Phe Leu Met Thr Gly Pro Lys Ala Tyr Leu Thr 1 5 10 15 Tyr Ser Ala Ser Val Ala Val Gly Ala Gln Asn Gly Ile Glu Glu Cys 20 25 30 Lys Tyr Gln Phe Ala Trp Glu Arg Trp Asn Cys Pro Glu Ser Thr Leu 35 40 45 Gln Leu Ala Thr His Asn Gly Leu Arg Ser Ala Thr Arg Glu Thr Ser 50 55 60 Phe Val His Ala Ile Ser Ser Ala Gly Val Met Tyr Thr Leu Thr Arg 65 70 75 80 Asn Cys Ser Met Gly Asp Phe Asp Asn Cys Gly Cys Asp Asp Ser Arg 85 90 95 Asn Gly Arg Ile Gly Gly Arg Gly Trp Val Trp Gly Gly Cys Ser Asp 100 105 110 Asn Ala Glu Phe Gly Glu Arg Ile Ser Lys Leu Phe Val Asp Gly Leu 115 120 125 Glu Thr Gly Gln Asp Ala Arg Ala Leu Met Asn Leu His Asn Asn Glu 130 135 140 Ala Gly Arg Leu Ala Val Lys Glu Thr Met Lys Arg Thr Cys Lys Cys 145 150 155 160 His Gly Ile Ser Gly Ser Cys Ser Ile Gln Thr Cys Trp Leu Gln Leu 165 170 175 Ala Glu Phe Arg Asp Ile Gly Asn His Leu Lys Ile Lys His Asp Gln 180 185 190 Ala Leu Lys Leu Glu Met Asp Lys Arg Lys Met Arg Ser Gly Asn Ser 195 200 205 Ala Asp Asn Arg Gly 210 <210> 46 <211> 290 <212> PRT <213> Drosophila sp. <400> 46 Gln Val Glu Gly Lys Gln Lys Ser Gly Arg Gly Arg Gly Ser Met Trp 1 5 10 15 Trp Gly Ile Ala Lys Val Gly Glu Pro Asn Asn Ile Thr Pro Ile Met 20 25 30 Tyr Met Asp Pro Ala Ile His Ser Thr Leu Arg Arg Lys Gln Arg Arg 35 40 45 Leu Val Arg Asp Asn Pro Gly Val Leu Gly Ala Leu Val Lys Gly Ala 50 55 60 Asn Leu Ala Ile Ser Glu Cys Gln His Gln Phe Arg Asn Arg Arg Trp 65 70 75 80 Asn Cys Ser Thr Arg Asn Phe Ser Arg Gly Lys Asn Leu Phe Gly Lys 85 90 95 Ile Val Asp Arg Gly Cys Arg Glu Thr Ser Phe Ile Tyr Ala Ile Thr 100 105 110 Ser Ala Ala Val Thr His Ser Ile Ala Arg Ala Cys Ser Glu Gly Thr 115 120 125 Ile Glu Ser Cys Thr Cys Asp Tyr Ser His Gln Ser Arg Ser Pro Gln 130 135 140 Ala Asn His Gln Ala Gly Ser Val Ala Gly Val Arg Asp Trp Glu Trp 145 150 155 160 Gly Gly Cys Ser Asp Asn Ile Gly Phe Gly Phe Lys Phe Ser Arg Glu 165 170 175 Phe Val Asp Thr Gly Glu Arg Gly Arg Asn Leu Arg Glu Lys Met Asn 180 185 190 Leu His Asn Asn Glu Ala Gly Arg Ala His Val Gln Ala Glu Met Arg 195 200 205 Gln Glu Cys Lys Cys His Gly Met Ser Gly Ser Cys Thr Val Lys Thr 210 215 220 Cys Trp Met Arg Leu Ala Asn Phe Arg Val Ile Gly Asp Asn Leu Lys 225 230 235 240 Ala Arg Phe Asp Gly Ala Thr Arg Val Gln Val Thr Asn Ser Leu Arg 245 250 255 Ala Thr Asn Ala Leu Ala Pro Val Ser Pro Asn Ala Ala Gly Ser Asn 260 265 270 Ser Val Gly Ser Asn Gly Leu Ile Ile Pro Gln Ser Gly Leu Val Tyr 275 280 285 Gly Glu 290

Claims (21)

1. Cterm 미니-wnt 또는 Nterm 미니-wnt인 미니-wnt 폴리펩티드를 포함하는 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 미니-wnt 폴리펩티드가 Fz 단백질, ROR 단백질 또는 Ryk 단백질에 결합하고, 상응하는 Wnt 공-수용체(co-receptor)에 결합하지 않는 Cterm 미니-wnt인, 조성물.
3. 제2항에 있어서, 상기 Cterm 미니-wnt가 도 6에 기재된 Cterm 미니-wnt 아미노산 서열 또는 이의 변이체로 이루어진 폴리펩티드인, 조성물.
4. 제2항에 있어서, 상기 Cterm 미니-wnt가 인간 Wnt1의 위치 298 내지 370를 갖는 보존된 잔기에 의해 정렬하고, 인간 Wnt1의 잔기 1 내지 257과 함께 정렬하는 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 결실하는, 조성물.
5. 제1항에 있어서, 상기 미니-wnt 폴리펩티드가, LRP5, LRP6 또는 FRL1/크립토 단백질에 결합하고, 상응하는 Wnt 공-수용체에 결합하지 않는 Nterm 미니-wnt인, 조성물.
6. 제5항에 있어서, 상기 Nterm 미니-wnt가 도 8에 기재된 Wnt 아미노산 서열 또는 이의 변이체로 이루어진 폴리펩티드인, 조성물.
7. 제5항에 있어서, 상기 Nterm 미니-wnt가 인간 Wnt1의 위치 34 내지 247을 갖는 보존된 잔기에 의해 정렬하고, 인간 Wnt1의 잔기 288 내지 370에 상응하는 잔기와 함께 정렬하는 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 결실하는, 조성물.
8. 제2항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 변이체가 절단된 형태인, 조성물.
9. 제2항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 변이체가 하나 이상의 아미노산 결실 또는 치환을 포함하는 조성물.
10. 제1항 내지 제9항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 미니-wnt 폴리펩티드가 수용성인, 조성물.
11. 제1항 내지 제10항 중의 어느 한 항에 있어서, 융합된 또는 접합된 작용성 모이어티(moiety)를 추가로 포함하는, 조성물.
12. 제11항에 있어서, 상기 작용성 모이어티가 치료학적 모이어티 또는 영상화 모이어티인, 조성물.
13. 제1항 내지 제12항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 애쥬번트와 함께 제형화되는, 조성물.
14. 제1항 내지 제12항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 약제학적 투여를 위해 제형화되는, 조성물.
15. Wnt 수용체를 발현하는 세포를, 제1항 내지 제14항 중의 어느 한 항에 기재된 조성물의 유효량과 접촉시켜 Wnt 신호전달을 억제시킴을 포함하는, 세포에서 Wnt 신호전달을 억제시키는 방법.
16. 제15항에 있어서, 세포의 증식이 억제되는, 방법.
17. 제16항에 있어서, 상기 세포가 암 세포인, 방법.
18. 제15항에 있어서, 상기 세포가 시험관 내에 존재하는, 방법.
19. 제15항에 있어서, 상기 세포가 생체내에 존재하는, 방법.
20. Wnt 수용체를 발현하는 세포를, 제11항 또는 제12항에 기재된 조성물과 접촉시킴을 포함하는, 작용성 모이어티를 세포에 전달하는 방법.
21. 후보 Wnt 수용체 또는 이의 단편을 목적하는 Wnt 단백질에 상응하는 미니-wnt 폴리펩티드와 접촉시키는 단계; 및
    후보 수용체에 대한 미니-wnt 폴리펩티드의 결합을 측정하는 단계로서, 여기서, 특이적 결합의 존재는 Wnt 단백질이 후보 수용체에 대한 리간드임을 나타내는 것인 단계를 포함하는, Wnt 단백질에 대한 동족 수용체를 측정하는 방법.

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