KR101687060B1

KR101687060B1 - 모에신 조절제 및 그의 용도

Info

Publication number: KR101687060B1
Application number: KR1020137011795A
Authority: KR
Inventors: 웨 장; 쥔 바오; 후아 마오; 지난 셔우; 웨이나 시투
Original assignee: 상하이 켁신 바이오테크 씨오., 엘티디.
Priority date: 2010-10-08
Filing date: 2011-10-08
Publication date: 2016-12-15
Also published as: EP2624854A4; CA2814024C; JP2015221810A; US20150246120A1; JP2014501696A; US20130266537A1; KR20130132429A; CA2814024A1; EP2624854A1; JP6080763B2; EP2624854B1; WO2012045274A1; US9345764B2

Abstract

본 출원은 모에신 활성화와 관련된 질환 및 장애를 치료 및 진단하는 데 유용한 조성물 및 방법을 제공한다.

Description

모에신 조절제 및 그의 용도{MOESIN MODULATORS AND USES THEREOF}

본 출원은 일반적으로 분자 생물학 및 의학 분야에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 출원은 모에신 활성 및 관련된 병증을 조절하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다.

막-조직화 연장 스파이크 단백질을 의미하는 모에신은 처음에는 소의 자궁에서 확인되었고, 헤파린에 대한 수용체로서의 가능성을 지닌 것으로 특징화된 것인 막 결합 세포내 단백질이다 (문헌 [Lankes et al., Biochem J. 251:831-42 (1988)]). 전장의 천연 인간 모에신은 577개의 아미노산을 가지며, 그의 분자량은 약 75 kD이다. 이는 마우스 모에신과 약 98.3%의 서열 동일성을 공유한다 (문헌 [Sato et al., J. Cell Sci. 103:131-143 (1992)]).

추가 연구를 통해 모에신이 에즈린-라딕신-모에신 (ERM) 단백질 패밀리의 구성원인 것으로서 특징화되었다. 이는 주로 세포질에서 발현되며, 액틴이 풍부한 세포-표면 구조에 집중되어 있는 단백질이다. ERM 단백질의 서열 및 구조 분석을 통해 상기 단백질은 종간 및 분자간에 고도의 상동성을 공유하는 것으로 밝혀졌다. ERM 단백질은, 밴드 4.1 단백질과 상동성이기 때문에 FERM 도메인 (밴드 4.1, 에즈린, 라딕신, 모에신 상동성 도메인)으로 불리는 N-말단 도메인, 중심 나선형 도메인 및 C-말단 테일 도메인인, 3개의 도메인을 가진다. C-말단 테일 도메인은 F-액틴에 결합하는 반면, N-말단 FERM 도메인은 형질막 중 부착 분자에의 결합을 담당한다 (문헌 [Louvet-Vallee (2000)]).

ERM 단백질의 기능은 N-말단 FERM 도메인과 C-말단 테일 도메인 사이의 분자내 상호작용에 의해 조절된다 (문헌 [Pearson et al., Cell 101:259-70 (2000)]; [Louvet-Vallee (2000)]). ERM 단백질은 활성면에 있어서 2가지 상태: 휴면 상태 및 활성 상태로 존재한다. 활성 형태는 세포내 상호작용에 관여하고, 휴면 형태는 세포질에 존재한다. 상기 두 상태 사이의 차이는 단백질의 입체형태에 따라 달라진다. 휴면 형태에서는 FERM 도메인이 테일 도메인에 밀착 결합됨으로써 각 도메인 상의 다른 분자에 대한 결합 부위를 상호간에 차폐시킨다. 중앙 나선형 도메인은 두 말단 도메인이 접근하여 결합할 수 있도록 하는 가요성 벤드로서의 역할을 한다. 휴면 모에신은 밀착 결합 구조가 가능해졌을 때에 활성화되는데, 여기서, FERM 도메인은 특이적인 막 단백질에 결합함으로써 막에 부착되고, C-말단 테일 도메인의 마지막 34개의 잔기는 액틴 필라멘트에 결합한다.

테일 도메인내 모에신의 558번 위치 (라딕신의 경우 564번 및 에즈린의 경우 567번)에 트레오닌 잔기 (Thr 558)가 존재하는데, 그의 인산화가 ERM 단백질의 활성화에서 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다 (문헌 [Pearson et al. (2000)]). Thr 558의 인산화는 FERM/테일 상호작용을 약화시키고, 인지질의 존재하에서는 상대 도메인 상의 막 단백질 및 F-액틴 결합부를 노출시킨다. 또한, 활성화된 FERM 도메인은 Rho 신호전달 경로에도 참여한다 (문헌 [Takahashi et al., J. Biol . Chem . 272:23371-5 (1997)]). 모에신에서 Thr 558은 rho 관련 꼬인 코일 형성 단백질 키나제 (ROCK)에 의해 인산화되는 것으로 여겨진다 (문헌 [Oshiro et al. J. Biol . Chem . 273:34663-6 (1998)]). Thr 558 인산화를 일으키는 것으로 알려진 다른 단백질 키나제로는 PKC, PIP5KIa, P38 및 Slik를 포함하나, 이에 한정되지 않는다 (문헌 [Hipfner et al., Genes Dev . 18:2243-8 (2004)]).

모에신 및 다른 ERM 단백질의 존재 및 기능은 많은 생리학적인 것 뿐만 아니라, 병리학적 병증에도 연루되어 있다. 이는 형질막과 액틴 세포골격 사이의 구조적 링커로서 작용하며, 미세융모 형성, 세포-세포 부착, 세포 형상 유지, 세포 이동 및 막 수송에서 중요한 역할을 한다. 이는 또한 Rho 경로, PI3-키나제/Akt 경로 및 CD14 경로를 비롯한 많은 신호전달 경로에도 관여하는 것으로 이후 연구에서 밝혀졌다 (문헌 [Louvet-Vallee, Biol . Cell 92:305-16 (2000)], [Thome et al., Infect. Immun. 67:3215 (1999)]). 모에신은 특정 암의 성장 및 전이에서 중요한 역할을 하는 것으로 제안되었다.

모에신은 또한 자가면역 질환과도 관련이 있었다. 와가츠마(Wagatsuma) 등은 류머티스 관절염 (RA) 환자에서 항-ERM 자가항체의 검출을 보고한 바 있다 (문헌 [Wagatsuma et al., Mol . Immunol. 33: 1171-6 (1996)]). 시험된 71개의 환자의 혈청 중 24개의 샘플 (33.8%)은 재조합 ERM 항원 중 1 이상과 반응하였고, 10개의 샘플 (14%)은 오직 재조합 모에신과 반응하였다. 그러나, 상기 연구를 통해서는 항-ERM 항체와, 임상 소견, 예컨대, 유병 기간 또는 단계 사이의 유의적인 상관관계가 발견되지 못했다. 또한, 다른 자가면역 질환, 예컨대, 원발성 쇼그렌 증후군 (PSS) 및 전신 홍반 루푸스 (SLE)를 앓는 환자로부터 유래된 혈청은 3개의 ERM 단백질에 대해 어떤 반응성도 보이지 않았다.

다카마쓰(Takamatsu) 등은 후천성 재생불량 빈혈 (AA) 환자의 혈청 중 모에신에 대한 특이적인 항체의 검출을 보고한 바 있다 (문헌 [Takamatsu et al., Blood 109:2514-20 (2007)]). ELISA를 사용하였을 때, 67명의 AA 환자 중 25명 (37%)에서 항-모에신 항체가 고역가로 나타났다. 추가의 시험관내 연구를 통해 AA 환자로부터의 항-모에신 항체가 염증성 시토카인, 예컨대, TNF-α 및 IFN-γ를 유도하였다는 것이 나타났고, 이는 그의 역할이 상기 질환의 병리생리에 연루되어 있음을 시사한다 (문헌 [Espinoza et al., Intl . Immu. 21:913-23 (2009)]; [Takamatsu et al., J. Immunol . 182:703 (2009)]).

다중의 생리학적 및 병리학적 환경하에서 인간 모에신 단백질의 복합적이고 중요한 기능을 고려해 볼 때, 모에신 활성을 조절할 수 있는, 임상적으로 관련이 있는 분자 엔티티 뿐만 아니라, 상기를 제조하고 사용하는 방법을 탐구하는 것이 바람직할 수 있다. 본원에 기술된 본 출원은 상기 및 다른 이점을 제공한다.

특허 출원 및 공개문헌을 비롯한, 본원에서 인용된 모든 참조 문헌은 그 전문이 본원에서 참고로 포함된다.

본 출원은 시험관내 또는 생체내에서 모에신 활성을 조절하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 모에신 기능은 모에신 활성화의 억제를 통해 조절된다. 모에신 조절제는 모에신의 비정상적인 활성화와 관련된 장애 및 병리학적 병증, 예컨대, 암, 섬유증, 및 호흡기 장애를 치료하기 위해 치료학적으로 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 모에신 조절제는 인간 모에신의 C-말단 테일 도메인에 결합하는 단리된 항체이다. 한 실시양태에서, 항체의 모에신 테일 도메인에의 결합이 테일 도메인내 Thr 558의 인산화를 방해 또는 차단시킴으로써 모에신이 활성화되지 못하도록 차단시킨다.

한 측면에서, 모에신 조절제는 인간 모에신의 C-말단 테일 도메인 (서열 번호 1)의 10개 이상의 연속적인 아미노산 잔기를 가지는 절단된 모에신 단편을 포함한다. 상기 단편은 Thr 558 인산화를 위한 천연 모에신과 그의 단백질 키나제의 상호작용을 경쟁적 결합에 의해 방해함으로써 천연 모에신이 활성화되지 못하도록 차단시킬 수 있다.

인간 모에신의 C-말단 테일 도메인의 아미노산 서열은 하기와 같다:

(서열 번호 1).

한 실시양태에서, 모에신 단편 조절제는 Thr558 부위 주변의 잔기, 예컨대, 서열 GRDKYKTLRQIRQ (서열 번호 2)를 포함한다.

한 측면에서, 모에신 조절제는 인간 모에신의 Thr 558의 인산화를 방해할 수 있는 소형 분자 화합물을 포함한다. 그러한 소형 분자 억제제는 Thr 558 부위에 직접 결합하여 그를 차단시킬 수 있거나, 또는 입체형태 변화 또는 장애를 일으켜 Thr 558 부위가 단백질 키나제에 결합하지 못하도록 차단시키는 모에신 상의 위치에 결합할 수 있다.

한 실시양태에서, 본 출원의 모에신 조절제는 모에신과 그의 결합 파트너 (예컨대, 구조 단백질 또는 모에신 기질)와의 상호작용을 방해함으로써 세포골격 또는 그의 신호전달 경로에서의 모에신의 구조적 역할을 파괴시킨다.

한 측면에서, 본 출원의 모에신 조절제는 독소, 예컨대, 세포독성제에 연결된다. 이러한 분자/기질은 첨가제/증진제, 예컨대, 방사선 및/또는 화학요법제와 함께 조합하여 제제화되거나 투여될 수 있다.

본 출원은 또한 모에신의 비정상적인 활성화와 관련된 질환 또는 병리학적 병증을 조절하는 데 유용한 방법을 제공한다. 따라서, 한 측면에서, 본 출원은 대상체에게 Thr 558의 인산화를 억제하는 본 출원의 조절제 분자를 투여하여 모에신 활성화를 조절하는 단계를 포함하는, 대상체에서 모에신 활성화를 조절하는 방법을 제공한다.

모에신은 예컨대, 세포 증식, 세포 생존, 세포 이동, 세포 형태형성 및 세포 아폽토시스를 비롯한, 다수의 생물학적 및 생리학적 기능에 중요한 다중의 세포 구조 및 신호전달 경로에 관여한다. 따라서, 또 다른 측면에서, 본 출원은 세포 또는 조직을 본 출원의 모에신 조절제와 접촉시켜 모에신 활성화와 관련된 세포 증식을 억제시키는 것인 단계를 포함하는, 모에신 활성화된 세포 성장 (예컨대, 증식 및/또는 생존)을 억제시키는 방법을 제공한다. 추가의 또 다른 측면에서, 본 출원은 세포 또는 조직을 유효량의 본 출원의 조절제 분자와 접촉시켜 모에신 활성화와 관련된 세포 증식을 억제시키는 것인 단계를 포함하는, 모에신 활성화된 세포 증식을 억제시키는 방법을 제공한다.

한 실시양태에서, 본 출원은 표적 세포 또는 조직을 유효량의 본 출원의 조절제 분자와 접촉시켜 세포 또는 조직의 아폽토시스를 유도 또는 촉진시키는 것인 단계를 포함하는, 세포 또는 조직에서 아폽토시스를 유도 또는 촉진시키는 방법을 제공한다. 표적 세포 또는 조직은 암성 세포/조직, 상피 세포/조직, 또는 내피 세포/조직일 수 있다.

한 측면에서, 본 출원은 대상체에게 유효량의 본 출원의 조절제 분자를 투여하여 비정상적인 모에신 활성화와 관련된 병리학적 병증을 치료하는 것인 단계를 포함하는, 대상체에서 비정상적인 모에신 활성화와 관련된 병리학적 병증을 치료하는 방법을 제공한다.

한 측면에서, 본 출원은 모에신이 비정상적으로 활성화된 것인 세포를 포함하는 암성 종양을 앓는 포유동물에게 유효량의 본 출원의 조절제 분자를 투여하여 상기 포유동물을 효과적으로 치료하는 것인 단계를 포함하는, 모에신이 비정상적으로 활성화된 것인 세포를 포함하는 암성 종양을 앓는 포유동물을 치료학적으로 치료하는 방법을 제공한다.

한 측면에서, 본 출원은 모에신의 비정상적인 활성화와 관련된 세포 증식성 장애에 관한 치료를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 본 출원의 조절제 분자를 투여하여 상기 세포 증식성 장애를 효과적으로 치료 또는 예방하는 것인 단계를 포함하는, 모에신의 비정상적인 활성화와 관련된 세포 증식성 장애를 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 증식성 장애는 암이다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 상기 증식성 장애는 기관 섬유증, 예컨대, 폐 섬유증, 낭성 섬유증, 경화증, 심내막 섬유증, 골수섬유증, 후복막 섬유증, 크론병, 켈로이드, 전신 경화증 또는 진행성 괴상 섬유증이다.

한 실시양태에서, 본 출원의 방법에서 표적화되는 세포는 암 세포이다. 예를 들어, 암 세포는 유방암 세포, 결장직장암 세포, 폐암 세포, 유두 암종 세포 (예컨대, 유두 갑상샘 암종 세포), 결장암 세포, 췌장암 세포, 난소암 세포, 자궁경부암 세포, 중추신경계 암 세포, 골육종 세포, 신장 암종 세포, 간세포 암종 세포, 방광암 세포, 전립샘암 세포, 위 암종 세포, 두부경부 편평세포 암종 세포, 흑색종 세포 및 백혈병 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포일 수 있다. 한 실시양태에서, 본 출원의 방법에서 표적화되는 세포는 과증식성 및/또는 과다형성 세포이다. 한 실시양태에서, 본 출원의 방법에서 표적화되는 세포는 이형성 세포이다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 본 출원의 방법에서 표적화되는 세포는 전이성 세포이다.

본 출원의 조성물은 추가의 치료제와 함께 조합하여 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 출원의 조성물은 하나 이상의 시토카인, 예컨대, 염증유발 시토카인과 함께 조합하여 사용될 수 있다. 본 출원의 조성물과의 조합에 유용한 염증유발 시토카인의 예로는 TNF (TNF-알파 및 TNF-베타), IL-1 및 IL-6을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 한 실시양태에서, 본 출원의 치료 방법은 표적화되는 세포 및/또는 조직 (예컨대, 암 세포)을 방사선 치료, 화학요법제, 또는 다른 세포독성제에 노출시키는 단계를 추가로 포함한다.

한 측면에서, 본 출원은 본 출원의 하나 이상의 조절제 분자 및 담체를 포함하는 조성물을 제공한다. 한 실시양태에서, 담체는 제약상 허용되는 것이다.

도 1a은 전장의 인간 모에신 단백질의 아미노산 서열 (서열 번호 3)을 나타낸 것이다.
도 1b는 전장의 인간 모에신 단백질의 cDNA 서열 (서열 번호 4)을 나타낸 것이다 (여기서, 밑줄로 표시된 부분은 C-말단 테일 도메인 근처의 것을 코딩하는 핵산 서열을 나타내는 것이다).
도 2는 pET32a(+) 및 pET28a(+)의 제한 및 클로닝 지도이다.
도 3은 TNF-알파 (1군), 전장의 모에신에 대한 항체 (2군), 모에신 단백질의 C-말단 테일 도메인에 대한 항체 (3군), TNF-알파 및 전장의 모에신에 대한 항체 (4군), TNF-알파 및 모에신 단백질의 C-말단 테일 도메인에 대한 항체 (5군), 및 PBS 용액 (6군)으로 처리한 후, HPMEC 세포의 증식률을 도시한 그래프이다.
도 4a는 1-6군으로 처리한 후, HPMEC 세포의 조기 아폽토시스를 도시한 그래프이다.
도 4b는 1-6군으로 처리한 후, 후기 아폽토시스 및 사멸 HPMEC 세포를 도시한 그래프이다.
도 5a는 36시간 동안 인큐베이션시킨 HPMEC 대조군 세포의 전자 현미경 사진 (x6,000)이다.
도 5b는 36시간 동안 TNF-알파 단독으로 처리된 HPMEC 세포의 전자 현미경 사진 (x6,000)이다.
도 5c는 36시간 동안 TNF-알파 및 전장의 모에신에 대한 항체 로 처리된 HPMEC 세포의 전자 현미경 사진 (x6,000)이다.

본 발명을 수행하기 위한 모드

달리 명시되지 않는 한, 본 출원의 실시는 당업계의 기술 내에 포함되는, 종래의 (재조합 기법을 비롯한) 분자생물학, 미생물학, 세포 생물학, 생화학 및 면역학 기법을 이용할 것이다. 상기 기법은 문헌, 예컨대, 문헌 ["Molecular Cloning: A Laboratory Manual", second edition (Sambrook et al., 1989)]; ["Oligonucleotide Synthesis" (M. J. Gait, ed., 1984)]; ["Animal Cell Culture" (R. I. Freshney, ed., 1987)]; ["Methods in Enzymology" series (Academic Press, Inc.)]; ["Current Protocols in Molecular Biology" (F. M. Ausubel et al., eds., 1987, 및 정기 간행물의 최신판)]; ["PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis et al., eds., 1994)]에 상세하게 설명되어 있다. 본 출원에서 사용되는 프라이머, 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드는 당업계에 공지된 표준 기법을 사용하여 생성될 수 있다.

달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 숙련가가 통상적으로 이해하는 것과 같은 의미를 지닌다. 문헌 [Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed., J. Wiley & Sons (New York, N.Y. 1994)], 및 [March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 4th ed., John Wiley & Sons (New York, N.Y. 1992)]는 당업자에게 본 출원에서 사용되는 다수의 용어에 대한 일반적인 가이드를 제공한다.

정의

"모에신"이라는 용어는 문헌 [Lankes and Furthmayr (1991) Proc. Natl. Acad. Sci., 88:8297-8301]에 기술되어 있는 바와 같이, 막-조직화 연장 스파이크 단백질(membrane-organizing extension spike protein)을 나타낸다. 전장의 인간 모에신 단백질은 서열 번호 3으로서 제시되어 있는 아미노산 서열 (도 1)을 가지는, 577개의 아미노산으로 된 폴리펩티드이다. 모에신 단백질은 하기에 추가로 정의되는 바와 같이, N-말단 FERM 도메인, 나선형 도메인, 및 C-말단 테일 도메인인 3개의 도메인으로 이루어진다. 이는 ERM (에즈린-라딕신-모에신) 패밀리에 속한다. 주로 형질막 바로 밑의 세포질에서 발현되는 3개의 ERM 단백질은 고도의 서열 상동성을 공유하며, 형질막과 액틴 세포골격 사이의 연결 단백질로서 작용한다. 추가로, 인간 모에신 단백질은 다른 종으로부터의 모에신, 예컨대, 마우스 및 소 모에신과 고도의 서열 상동성을 공유한다 (문헌 [Sato et al. (1992) J. Cell Sci. 103:131-143].

"절단된 모에신 단편"이라는 용어는 전장의 야생형 모에신 단백질보다 짧은 모에신 폴리펩티드의 일부를 의미한다. 특히, 상기 용어는 모에신의 특정 도메인 (하기에 추가로 정의되는 바와 같은, N-말단 FERM 도메인, 나선형 도메인 또는 C-말단 테일 도메인) 내의 아미노산 서열을 가지는 10개 이상의 아미노산으로 이루어진 폴리펩티드를 포함한다. 도메인-특이 항-모에신 자가항체에 결합할 수 있는 상기와 같은 모에신 단편이 본 출원에서 유용하다.

인간 모에신 단백질의 "N-말단 FERM 도메인"이란 구조상 상기 단백질의 아미노-말단에 가장 가깝게 위치하고 있으며, 기능적으로는 단백질을 형질막으로 국소화시키는 것, 및 부착 분자와 상호작용하는 것을 담당하는 야생형 인간 모에신 단백질의 구형 부분을 의미한다. 밴드 4.1 단백질과 상동성이라는 이유에서 밴드 4.1 단백질, 에즈린, 라딕신, 모에신 상동성 도메인이라는 것을 나타내는 것인 FERM 도메인은, 세포 골격 단백질, 예컨대, 적혈구 밴드 4.1, 탈린, 및 에즈린-라딕신-모에신 (ERM) 단백질 패밀리 뿐만 아니라, 수개의 티로신 키나제 및 포스파타제 및 종양 억제 단백질인 멀린을 포함하는 것인 밴드 4.1 수퍼패밀리의 구성원을 의미한다. 구체적으로, 상기 용어는 성숙한 형태의 인간 모에신 단백질의 처음 약 297개의 아미노산 잔기 (예컨대, 아미노산 잔기 1-297)를 의미한다. 특정 문헌에서는 동일의 도메인이 N-ERM 관련 도메인 (N-ERMAD)으로도 또한 알려져 있는데, 이는 본원의 정의에 포함된다 (문헌 [Bretscher et al. (1995) Biochem. 34, 16830-7]).

인간 모에신 단백질의 "C-말단 테일 도메인"이란 구조상 상기 단백질의 카르복시-말단에 가장 가깝게 위치하고 있으며, 기능적으로는 액틴 필라멘트에 결합하여 그와 상호작용하는 것을 담당하는 야생형 인간 모에신 단백질의 일부를 의미한다. 모에신의 테일 도메인은 양전하를 띠고, 연장된 만곡형(meandering) 구조를 취한다. 구체적으로, 상기 용어는 인간 모에신 단백질의 마지막 약 107개의 아미노산 잔기 (예컨대, 아미노산 잔기 471-577)를 의미한다. 특정 문헌에서는 동일의 도메인이 C-ERM 관련 도메인 (C-ERMAD)으로도 알려져 있는데, 이는 본원의 정의에 포함된다 (문헌 [Bretscher et al. (1995)]). C-말단 테일 도메인의 마지막 34개의 아미노산 잔기는 ERM 단백질 중에서 고도로 보존적이며, F-액틴에의 결합을 위한 영역을 형성한다. F-액틴 결합 영역 내에는 단백질의 활성화 동안에 인산화되는 것인 트레오닌 잔기 (야생형 인간 모에신에서 Thr558)가 존재한다.

인간 모에신 단백질의 "나선형 도메인"은 N-말단 FERM 도메인과 C-말단 테일 도메인 사이에 있는 야생형 인간 모에신의 중심 부분을 의미한다. 이는 상기 두 말단 도메인 사이의 링커로서의 역할을 하며, 연장된 알파-나선형 구조를 취한다. 구체적으로, 상기 용어는 대략적으로 인간 모에신 단백질의 아미노산 잔기 298-470을 포함하는 영역을 의미한다.

펩티드 또는 폴리펩티드와 관련하여 "아미노산 서열 동일성(%)"은 서열들을 정렬하고, 필요할 경우, 서열 동일성(%)이 최대가 되도록 하기 위해 갭을 도입한 후, 임의의 보존적 아미노산 치환을 서열 동일성의 일부로서 간주하지 않으면서, 특정 펩티드 또는 폴리펩티드 서열 중의 아미노산 잔기와 동일한, 후보 서열 중 아미노산 잔기의 백분율(%)로서 정의된다. 아미노산 서열 동일성(%) 측정을 목적으로 하는 정렬은 당업계에 포함되어 있는 다양한 방식으로, 예를 들어, 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어 예컨대, BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 멕얼라인(Megalign) (DNASTAR) 소프트웨어를 이용함으로써 달성될 수 있다. 당업자는 비교되는 전장의 서열 전반에 걸쳐 최대로 정렬될 수 있도록 하는 데 필요한 임의의 알고리즘을 비롯한, 정렬을 측정하는 데 적절한 파라미터를 결정할 수 있다.

"비정상적인 모에신 활성화와 관련된 장애 또는 병리학적 병증"이란 대상체에서 모에신의 비정상적인 활성화에 의해 유발되거나 촉진되는 장애 또는 병증을 의미한다. 적어도 부분적으로는 모에신 단백질의 C-말단 테일 도메인내 Thr 558의 인산화에 기인하는 것인 모에신의 비정상적인 활성화는 비정상적인 상피 또는 내피 세포를 포함하는 질환 진행 과정 및 병증에 연루되어 있다. 비정상적인 모에신 활성화와 관련된 병리학적 병증의 예로는 종양 성장 및 전이, 기관 및 조직의 섬유증, 폐 동맥 고혈압 및 염증을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본원에서 사용되는 바, "종양"이란 양성 또는 악성이든, 및 모든 전암성 및 암성 세포이든 상관없이, 모든 신생물 세포 성장 및 증식을 의미한다. 본원에서 언급되는 바와 같이, "암," "암성," "세포 증식성 장애," "증식성 장애" 및 "종양"이라는 용어는 상호 배타적인 것은 아니다.

"암" 및 "암성"이라는 용어는 전형적으로 조절되지 않는 세포 성장/증식을 특징으로 하는, 포유동물에서의 생리학적 병증을 의미하거나, 기술한다. 암의 예로는 암종, 림프종, 아세포종, 육종, 및 백혈병을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 암에 관한 더욱 특정의 예로는 편평세포암, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 폐 샘암종, 폐 편평세포 암종, 복막암, 간세포암, 위장관암, 췌장암, 아교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간암(hepatoma), 유방암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막 암종 또는 자궁 암종, 타액선 암종, 신장암, 간암, 전립샘암, 외음부암, 갑상샘암, 간 암종 및 각종 유형의 두부경부암을 포함한다.

본원에서 "자가면역 장애" 또는 "자가면역 질환"은 면역 반응로부터 개체 자신의 물질 및 조직에 대해서 유발된 질환 또는 장애이다. 자가면역 질환 또는 장애의 예로는 염증성 반응, 예컨대, 건선 및 피부염 (예컨대, 아토피 피부염)을 비롯한 염증성 피부 질환; 전신성 경피증 및 경화증; 염증성 장 질환 관련 반응 (예컨대, 크론병 및 궤양성 대장염); 호흡 곤란 증후군 (성인 호흡 곤란 증후군; ARDS 포함); 피부염; 수막염; 뇌염; 포도막염; 결장염; 사구체신염; 알레르기성 병증, 예컨대, 습진 및 천식 및 T 세포 침윤 및 만성 염증성 반응을 비롯한 다른 병증; 죽상동맥경화증; 백혈구 부착 결핍증; 류마티스 관절염; 전신 홍반 루푸스 (SLE) (루푸스 신장염, 피부 루푸스를 포함하나, 이에 한정되지 않음); 당뇨병 (예컨대, I형 당뇨병 또는 인슐린 의존 당뇨병); 다발 경화증; 레이노 증후군; 자가면역성 갑상샘염; 하시모토 갑상샘염; 알레르기성 뇌척수염; 쇼그렌 증후군; 소아 발병형 당뇨병; 및 전형적으로는 결핵, 사르코이드증, 다발근육염, 육아종증 및 혈관염에서 발견되는 시토카인 및 T-림프구에 의해 매개되는 급성 및 지연성 과민증과 관련된 면역 반응; 악성 빈혈 (애디슨병); 백혈구 누출을 포함하는 질환; 중추 신경계 (CNS) 염증성 장애; 다발성 기관 손상 증후군; 용혈 빈혈 (크라이오글로빈 혈증 또는 쿰즈(Coombs) 양성 빈혈을 포함하나, 이에 한정되지 않음); 중증 근육무력증; 항원-항체 복합체 매개 질환; 항-사구체 기저막 질환; 항인지질 증후군; 알레르기성 신경염; 그레이브스병; 람버트-이튼 근무력증 증후군(Lambert-Eaton myasthenic syndrome); 수포성 유천포창; 천포창; 자가면역성 다발 내분비장애; 라이터병; 강직 증후군; 베체트병; 거세포 동맥염; 면역 복합체 신장염; IgA 신장병증; IgM 다발 신경병증; 면역성 혈소판 감소 자반증 (YIP) 또는 자가면역성 혈소판 감소증 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본원에서 사용되는 바, "치료"란 치료되는 개체 또는 세포의 자연적 과정을 변경시키고자 하는 시도에서의 임상적 중재를 의미하는 것으로, 이는 예방을 위해, 또는 임상적인 병적 과정 동안에 수행될 수 있다. 치료의 바람직한 효과로는 질환의 발병 또는 재발 예방, 증상 경감, 질환의 임의의 직접적인 또는 간접적인 병리학적 결과의 감소, 전이 예방, 질환 진행 속도 감소, 질환 상태 호전 또는 완화, 및 차도 또는 개선된 예후를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 출원의 항체는 질환 또는 장애의 발생을 지연시키는 데 사용된다.

"유효량"은 필요한 투여량 및 기간 동안 원하는 치료학적 또는 예방학적 결과를 달성하는 데 효과적인 양을 의미한다.

본 출원의 물질/분자, 효능제 또는 길항제의 "치료학상 유효량"은 인자, 예컨대, 개체의 질환 상태, 연령, 성별, 및 체중, 및 개체에서 원하는 반응을 유도할 수 있는 물질/분자, 효능제 또는 길항제의 능력에 따라 달라질 수 있다. 치료학상 유효량은 또한 치료학상 도움이 되는 효과가 물질/분자, 효능제 또는 길항제의 임의의 독성 또는 해로운 효과를 능가하는 것인 양이다. "예방학상 유효량"이란 필요한 투여량 및 기간 동안 원하는 예방학적 결과를 달성하는 데 효과적인 양을 의미한다. 전형적으로는 예방학적 용량이 질환의 보다 조기 단계 이전에 또는 그 단계에서 대상체에서 사용되기는 하지만, 반드시 그러한 것은 아니기 때문에, 예방학상 유효량은 치료학상 유효량보다 적을 것이다.

본원에서 사용되는 바, "제약상 허용되는"이라는 용어는 임의 성분 (예컨대, 염수, 용매, 분산 매질, 코팅제, 항박테리아제 및 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제)이 제약상 투여와 상용성인 것을 의미한다.

본원에서 사용되는 바, "세포독성제"라는 용어는 세포의 기능을 억제 또는 방해하고/거나, 세포를 파괴시키는 물질을 의미한다. 상기 용어는 방사성 동위원소 (예컨대, At²¹¹, I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Sm¹⁵³, Bi²¹², P³² 및 Lu의 방사성 동위원소), 화학요법제, 예컨대, 메토트렉세이트, 아드리아미신, 빈카 알카로이드 (빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포시드), 독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 C, 클로람부실, 다우노루비신 또는 다른 인터칼레이팅제, 효소 및 그의 단편, 예컨대, 뉴클레오티드 분해 효소, 항생제, 및 독소, 예컨대, 소형 분자 독소 또는 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소상 활성인 독소 (그의 단편 및/또는 변이체 포함), 및 하기 개시되는 각종 항종양제 또는 항암제도 포함하는 것으로 의도된다. 다른 세포독성제를 하기에 기술한다. 종양 살상제는 종양 세포를 파괴시킨다.

"화학요법제"는 암 치료에 유용한 화학적 화합물이다. 화학요법제의 예로는 알킬화제, 예컨대, 티오테파 및 시톡산(CYTOXAN)등록상표 시클로포스파미드; 알킬 술포네이트, 예컨대, 부술판, 임프로술판 및 피포술판; 아지리딘, 예컨대, 벤조도파, 칼보쿠온, 메투레도파, 및 우레도파; 에틸렌이민 및 메틸라멜라민 (알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스포르아미드 및 트리메티롤멜라민 포함); 아세토게닌 (특히, 불라타신 및 불라타시온); 델타-9-테트라히드로카나비놀 (드로나비놀, 마리놀(MARINOL)등록상표); 베타-라파콘; 라파콜; 콜히친; 베툴린산; 캄프토테신 (합성 유사체 토포테칸 (히캄틴(HYCAMTIN)등록상표), CPT-11 (이리노테칸, (캄프토사르(CAMPTOSAR)등록상표), 아세틸캄프토테신, 스코폴렉틴, 및 9-아미노캄프토테신 포함); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065 (그의 아도젤레신, 카르젤레신 및 비젤레신 합성 유사체 포함); 포도필로톡신; 포도필린산; 테니포시드; 크립토피신 (특히, 크립토피신 1 및 크립토피신 8); 돌라스타틴; 듀오카르마이신 (합성 유사체, KW-2189 및 CB1-TM1 포함); 엘레우테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕티인; 스폰기스타틴; 질소 머스타드, 예컨대, 클로람부실, 클로르나파진, 시클로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로에타민, 메클로에타민 옥시드 히드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비킨, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드; 니트로스우레아, 예컨대, 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 및 라니무스틴; 항생제, 예컨대, 엔다이인 항생제 (예컨대, 칼리키아미신, 특히, 칼리키아미신 감마1I 및 칼리키아미신 오메가I1 (예컨대, 문헌 [Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)] 참조); 디네미신 (디네미신 A 포함); 에스페라미신; 뿐만 아니라, 네오카르지노스타틴 크로모포르 및 관련된 크로모단백질 엔다이인 항생제 크로모포르), 아클라시노마이신, 악티노마이신, 안트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카루비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신 (아드리아마이신(ADRIAMYCIN)등록상표, 모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신, 독소루비신 HCl 리포솜 주사액 (독실(DOXIL)등록상표) 및 데옥시독소루비신 포함), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 예컨대, 미토마이신 C, 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포르피로마이신, 퓨로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 튜베르시딘, 유베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항-대사산물, 예컨대, 메토트렉세이트, 겜시타빈 (겜자르(GEMZAR)등록상표), 테가푸르 (우프토랄(UFTORAL)등록상표), 카페시타빈 (젤로다(XELODA)등록상표), 에포틸론, 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 엽산 유사체, 예컨대, 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예컨대, 플루다라빈, 6-머캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예컨대, 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 칼모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록스우리딘; 안드로겐, 예컨대, 칼루스테론, 드로모스타노론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤; 항-아드레날, 예컨대, 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄; 엽산 보충제, 예컨대, 폴린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 에닐우라실; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트렉세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지퀀; 에플로르니틴; 엘립티늄 아세테이트; 에토글루시드; 갈륨 니트레이트; 히드록시우레아; 레티난; 로니다민; 메이탄시노이드, 예컨대, 메이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미토크산트론; 모피단몰; 니트라크린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로소크산트론; 2-에틸히드라지드; 프로카르바진; PSK등록상표 다당류 복합체 (JHS 내추럴 프로덕츠(JHS Natural Products: 미국 오레곤주 유진)); 라족산; 리족신; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아진산; 트리아지퀴온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센 (특히, T-2 독소, 베루카린 A, 로리딘 A 및 안구이딘); 우레탄; 빈데신 (엘디신(ELDISINE)등록상표, 필데신(FILDESIN)등록상표); 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드 ("Ara-C"); 티오테파; 탁소이드, 예컨대, 파클리탁셀 (탁솔(TAXOL)등록상표), 파클리탁셀의 알부민-조작된 나노입자 제제 (아브락산(ABRAXANE)™), 및 도세탁셀 (탁소테레(TAXOTERE)등록상표); 클로람부실; 6-티오구아닌; 머캅토퓨린; 메토트렉세이트; 백금 유사체, 예컨대, 시스플라틴 및 카르보플라틴; 빈블라스틴 (벨반(VELBAN)등록상표); 백금; 에토포시드 (VP-16); 이포스파미드; 미토크산트론; 빈크리스틴 (온코빈(ONCOVIN)등록상표); 옥살리플라틴; 류코보린; 비노렐빈 (나벨빈(NAVELBINE)등록상표); 노반트론; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 이반드로네이트; 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노이드, 예컨대, 레티놀산; 상기 중 임의 것의 제약상 허용되는 염, 산, 또는 유도체; 뿐만 아니라, 상기 중 2가지 이상의 조합물, 예컨대, CHOP (병용 요법용의 시클로포스파키드, 독소루비신, 빈크리스틴, 및 프레드니솔론에 대한 약어), 및 FOLFOX (5-FU 및 류코보린이 조합된 옥살리플라틴 (엘록사틴(ELOXATIN)™)을 사용하는 치료 요법용의 것에 대한 약어)를 포함한다.

암의 성장을 촉진시킬 수 있는 호르몬의 효과를 조절, 감소, 차단, 또는 억제시키는 작용을 하며, 대개는 전신, 또는 신체 전체 치료를 위한 형태인, 항-호르몬제 또한 본 정의에 포함된다. 이는 호르몬 그 자체일 수 있다. 예로는 항-에스트로겐 및 선택적 에스트로겐 수용체 조절제 (SERM) (예를 들어, 타목시펜 (놀바덱스(NOLVADEX)등록상표 타목시펜 포함), 랄록시펜 (에비스타(EVISTA)등록상표), 드롤록시펜, 4-히드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤, 및 토레미펜 (파레스톤(FARESTON)등록상표) 포함); 항-프로게스테론; 에스트로겐 수용체 하향-조절인자 (ERD); 에스트로겐 수용체 길항제, 예컨대, 풀베스트란트 (파슬로덱스(FASLODEX)등록상표); 난소를 억제시키거나, 폐쇄시키는 기능을 하는 작용제, 예를 들어, 루틴화 호르몬-방출 호르몬 (LHRH) 효능제, 예컨대, 류프롤리드 아세테이트(루프론(LUPRON)등록상표 및 엘리가드(ELIGARD)등록상표), 고세렐린 아세테이트, 부세렐린 아세테이트 및 트립테렐린; 다른 항-안드로겐, 예컨대, 플로타미드, 닐루타미드 및 비칼루타미드; 및 부신에서의 에스트로겐 생산을 조절하는 것인, 효소 아로마타제를 억제시키는 아로마타제 억제제, 예컨대, 4(5)-이미다졸, 아미노글루테티미드, 메게스트롤 아세테이트 (메가제(MEGASE)등록상표), 엑스메스탄 (아로마신(AROMASIN)등록상표), 포르메스탄, 파드로졸, 보로졸 (리비소르(RIVISOR)등록상표), 레트로졸 (페마라(FEMARA)등록상표), 및 아나스트로졸 (아리미덱스(ARIMIDEX)등록상표)을 포함한다. 또한, 상기와 같이 정의되는 화학요법제로는 비스포스포네이트, 예컨대, 클로드로네이트 (예를 들어, 보네포스(BONEFOS)등록상표 또는 오스탁(OSTAC)등록상표), 에티드로네이트 (디드로칼(DIDROCAL)등록상표), NE-58095, 졸레드론산/졸레드로네이트 (조메타(ZOMETA)등록상표), 알렌드로네이트 (포사맥스(FOSAMAX)등록상표), 파미드로네이트 (아레디아(AREDIA)등록상표), 틸루드로네이트 (스키리드(SKELID)등록상표), 또는 리세드로네이트 (악토넬(ACTONEL)등록상표); 뿐만 아니라, 트록사시타빈 (1,3-디옥솔란 뉴클레오시드 시토신 유사체); 안티센스 올리고뉴클레오티드, 특히, 예를 들어, PKC-알파, Raf, H-Ras 및 상피 성장 인자 수용체 (EGF-R)와 같은, 이상 세포 증식에 연루된 신호전달 경로에서의 유전자의 발현을 억제시키는 것; 백신, 예컨대, 테라토프(THERATOPE)등록상표 백신 및 유전자 요법 백신, 예를 들어, 아로백틴(ALLOVECTIN)등록상표 백신, 류벡틴(LEUVECTIN)등록상표 백신, 및 백시드(VAXID)등록상표 백신; 토포이소머라제 1 억제제 (예컨대, 루르토테칸(LURTOTECAN)등록상표); rmRH (예컨대, 아바렐릭스(ABARELIX)등록상표); 라파티닙 디토실레이트 (GW572016으로도 알려져 있는, ErbB-2 및 EGFR 이중 티로신 키나제 소형 분자 억제제); COX-2 억제제, 예컨대, 셀레콕시브 (세레브렉스(CELEBREX)등록상표; 4-(5-(4-메틸페닐)-3-(트리플루오로메틸)-1H-피라졸-1-일) 벤젠술폰아미드; 및 상기 중 어느 것의 제약상 허용되는 염, 산, 또는 유도체를 포함한다.

"시토카인"이라는 용어는 세포내 매개인자로서 또 다른 세포에 대해 작용하는, 한 세포 집단에 의해 방출된 단백질에 대한 총칭이다. 그러한 시토카인의 예는 림포카인, 모노카인, 및 전통적인 폴리펩티드 호르몬이다. 시토카인 중에는 성장 호르몬, 예컨대, 인간 성장 호르몬, N-메티오닐 인간 성장 호르몬, 및 소 성장 호르몬; 부갑상샘 호르몬; 티록신; 인슐린; 프로인슐린; 릴랙신; 프로릴랙신; 당단백질 호르몬, 예컨대, 여포 자극 호르몬 (FSH), 갑상샘 자극 호르몬 (TSH), 및 황체 형성 호르몬 (LH); 간 성장 인자; 섬유아세포 성장 인자; 프로락틴; 태반성 락토겐; 종양 괴사 인자-알파 및-베타; 물러관-억제 물질; 마우스 생식샘 자극 호르몬-관련 펩티드; 인히빈; 액티빈; 혈관 내피 성장 인자; 인테그린; 트롬보포이에틴 (TPO); 신경 성장 인자, 예컨대, NGF-베타; 혈소판-성장 인자; 형질전환 성장 인자 (TGF), 예컨대, TGF-알파, 및 TGF-베타; 인슐린-유사 성장 인자-I 및 -II; 에리트로포이에틴 (EPO); 골유도성 인자; 인터페론, 예컨대, 인터페론-알파, -베타, 및 -감마; 콜로니 자극 인자 (CSFs), 예컨대, 대식세포-CSF (M-CSF); 과립구-대식세포-CSF (GM-CSF); 및 과립구-CSF (G-CSF); 인터루킨 (IL), 예컨대, IL-1, IL-1a, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, IL-15; 종양 괴사 인자, 예컨대, TNF-알파, 또는 TNF-베타; 및 LIF 및 키트 리간드 (KL)를 비롯한 다른 폴리펩티드 인자가 포함된다. 본원에서 사용되는 바, 시토카인이라는 용어는 천연 공급원으로부터 또는 재조합 세포 배양물로부터의 단백질, 및 천연 서열 시토카인의 생물학상 활성인 등가물을 포함한다. 시토카인의 서브세트로서, "염증유발 시토카인"이란, 염증 반응을 유도 또는 촉진시키는 시토카인을 의미한다. 염증유발 시토카인의 예로는 TNF-알파, TNF-베타, IL-1 및 IL-6을 포함한다.

"단리된" 폴리펩티드는 그의 천연 환경의 오염 성분으로부터 확인되고, 분리 및/또는 회수된 것이다. 그의 천연 환경의 오염 성분은 폴리펩티드에 대한 진단 또는 치료학적 용도를 방해하는 물질이며, 이는 효소, 호르몬, 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 (1) 로우리(Lowry) 법에 의해 측정되는 바, 95중량% 초과의 폴리펩티드로, 또는 99중량% 초과로, (2) 방사 컵 배열 결정 장치의 사용에 의해 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 15개 이상의 잔기를 수득하는 데 충분한 정도로, 또는 (3) 쿠마시 블루(Coomassie blue), 또는 은 염색을 사용하여 환원 또는 비환원 조건하에서 SDS-PAGE에 의해 균질하게 정제될 것이다. 단리된 폴리펩티드는 폴리펩티드의 천연 환경의 1종 이상의 오염 성분도 존재하지 않는 바, 재조합 세포내 계내에서 폴리펩티드를 포함한다. 그러나, 보통 단리된 폴리펩티드는 1 이상의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.

"항체"라는 용어는 가장 광범위한 의미로 사용되고, 이는 구체적으로는 원하는 생물학적 활성을 보이는 한, 모노클로날 항체 (전장의 또는 무손상 모노클로날 항체 포함), 폴리클로날 항체, 다가 항체, 2가지 이상의 무손상 항체로부터 형성된 다중특이성 항체 (예컨대, 이중특이성 항체), 및 항체 단편 (하기 참조)을 포함한다.

본원에서 사용되는 바, "모노클로날 항체"라는 용어는 실질적으로 균질성인 항체들의 집단으로부터 수득된 항체를 의미하며, 즉, 최소량으로 존재할 수 있는, 가능성을 지닌 돌연변이, 예컨대, 천연적으로 발생된 돌연변이를 제외하면, 집단에 포함된 개별 항체들은 동일하다는 것을 의미한다. 따라서, "모노클로날"이라는 수식어는 항체가 별개의 항체들로 이루어진 혼합물이 아니다라는 특징을 나타낸다. 모노클로날 항체는 고도로 특이적이며, 단일의 항원에 대하여 유도되는 것이다. 특정 실시양태에서, 모노클로날 항체는 전형적으로, 표적 결합 폴리펩티드 서열은 복수 개의 폴리펩티드 서열로부터의 단일 표적 결합 폴리펩티드 서열 선별을 포함하는 공정에 의해 수득된 것인, 표적에 결합하는 폴리펩티드 서열을 포함하는 항체를 포함한다. 예를 들어, 선별 공정은 복수 개의 클론, 예컨대, 하이브리도마 클론 풀, 파지 클론, 또는 재조합 DNA 클론으로부터 독특한 클론을 선별하는 것일 수 있다. 선별된 표적 결합 서열은 예를 들어, 표적에 대한 친화성을 개선시키기 위해, 표적 결합 서열을 인간화시키기 위해, 세포 배양물 중에서의 그의 생산을 개선시키기 위해, 생체내에서의 그의 면역원성을 감소시키기 위해, 다중특이성 항체 제조를 위해 추가로 변경될 수 있으며, 변경된 표적 결합 서열을 포함하는 항체 또한 본 출원의 모노클로날 항체라는 것을 이해하여야 한다. 전형적으로 상이한 결정기 (에피토프)에 대한 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 시료와는 대조적으로, 각각의 모노클로날 항체는 항원상의 단일의 결정기에 대하여 유도된다. 그의 특이성 이외에도, 모노클로날 항체 시료는 전형적으로 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않았다는 점에서 이롭다.

지정된 항체의 "생물학적 특징"을 가지는 항체는 동일 항원에 결합하는 다른 항체로부터 그를 구별 짓게 하는 항체의 생물학적 특징들 중 하나 이상을 가지는 것이다.

관심의 대상이 되는 항체에 의해 결합되는 항원 상의 에피토프에 결합하는 항체를 스크리닝하기 위해, 통상의 교차-차단 검정법, 예컨대, 문헌 [Antibodies , A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)]에 기술된 것을 수행할 수 있다.

본 출원의 폴리펩티드와 관련하여 "생물학적 활성" 및 "생물학상 활성인"이라는 용어는 특이적으로 그에 결합하여 세포 반응, 예컨대, 증식, 이동 등을 조절할 수 있는 분자의 능력을 의미한다. 세포 반응은 또한 이동, 및/또는 증식을 포함하나, 이에 한정되지 않는 것인, 수용체를 통해 매개되는 것을 포함한다. 이와 관련하여, "조절하다"라는 용어는 촉진 및 억제 둘 모두를 포함한다.

환자의 반응성은 제한없이, (1) 질환 진행의 저속화 및 완전한 정지를 비롯한, 어느 정도까지의 질환 진행 억제; (2) 질환 에피소드 및/또는 증상 수의 감소; (3) 병변 크기 감소; (4) 질환 세포의 인접한 주변 기관 및/또는 조직으로의 침윤 억제 (즉, 감소, 저속화 또는 완전한 중단); (5) 질환 확산 억제 (즉, 감소, 저속화 또는 완전한 중단); (6) 장애와 관련된 하나 이상의 증상의 어느 정도까지의 완화; (7) 치료 후 무병 제시 기간의 연장; (8) 예컨대, 무진행 생존과 같이, 질환 병변의 퇴행 또는 절제를 초래할 수는 있지만, 그러할 필요는 없는, 자가면역 반응 감소; (9) 전체적인 생존 기간 연장; (10) 반응 속도 증가; 및/또는 (11) 치료 후 주어진 시점에서의 사망율 감소를 비롯한, 환자에게의 이익을 시사하는 임의의 종점을 사용함으로써 평가할 수 있다.

"이익"이라는 용어는 가장 광범위한 의미로 사용되며, 이는 임의의 바람직한 효과를 의미한다.

본 출원은 모에신 활성을 조절하기 위한, 및 상피 세포의 기능이상과 관련된 장애를 치료하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 본 출원을 수행하는 데 당업자에게 공지된 종래의 방법이 사용될 수 있다.

모에신 활성 조절제

모에신 활성 조절제는 모에신의 하나 이상의 생물학적 활성을 모사하거나 증진시키는 것 (효능제), 및 모에신의 효과를 막거나 방해하는 것 (길항제 또는 억제제)을 포함한다. 한 측면에서, 본원에 기술된 모에신 조절제는 모에신 억제제이다. 모에신 활성을 파괴시키는 임의의 분자는 후보 억제제일 수 있다. 당업자에게 주지되어 있는 스크리닝 기법을 통해 상기와 같은 분자를 확인할 수 있다. 모에신을 억제시키는 한 방법은 휴면 형태의 인산화를 차단시킴으로써, 또는 활성 형태를 탈인산화시킴으로써 그가 활성화되지 못하도록 방해하는 것이다. 한 실시양태에서, 상기와 같은 모에신 인산화의 파괴는 C-말단 테일 도메인내 Thr 558 부위에서 달성된다. "모에신 인산화 억제제"는 모에신 상의 인산화 부위(들)를 부분적으로 또는 전체적으로 차단, 억제, 또는 방해하는 임의의 분자를 포함한다. 상기와 같은 억제제의 예로는 (1) 소형 유기 및 무기 화합물, (2) 소형 펩티드, (3) 항체 및 유도체, (4) 모에신 또는 다른 ERM 패밀리 단백질과 밀접한 관계가 있는 펩티드, 및 (5) 핵산 압타머를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

1. 소형 분자 조절제

소형 분자는 유용한 모에신 활성 조절제일 수 있다. 소형 분자 조절제의 예로는 소형 펩티드, 펩티드-유사 분자, 및 합성, 비-펩티딜 유기 또는 무기 화합물을 포함한다. 한 측면에서, 본 출원의 소형 분자 조절제는 가용성이다. "소형 분자"란 그의 분자량이 약 5 kD 미만, 또는 약 0.6 kD 미만인 것인 조성물을 의미한다. 소형 분자는 핵산, 펩티드, 폴리펩티드, 펩티도미메틱, 탄수화물, 지질 또는 다른 유기 또는 무기 분자일 수 있다. 화학적 및/또는 생물학적 혼합물, 예컨대, 진균, 박테리아, 또는 조류 추출물의 라이브러리는 당업계에 공지되어 있으며, 이는 검정법들 중 어느 것을 이용함으로써 스크리닝될 수 있다. 분자 라이브러리를 합성하는 방법의 예는 문헌 [Carell et al., Angewandte Chemie International Edition. 33:2059-2061 (1994)]; [Carell et al., Angewandte Chemie International Edition. 33:2061-2064 (1994)]; [Cho et al., Science. 261: 1303-5 (1993)]; [DeWitt et al., Proc Natl Acad Sci USA. 90:6909-13 (1993)]; [Gallop et al., J Med. Chem. 37: 1233-51 (1994)]; [Zuckermann et al., J Med. Chem. 37:2678-85 (1994)]에 기술되어 있다.

2. 폴리펩티드/항체 조절제

한 실시양태에서, 본원에서 제공되는 모에신 조절제는 폴리펩티드 조성물일 수 있다. 모에신 활성화를 억제시키는 폴리펩티드는 잠재적으로 유용한 억제제이다. 한 실시양태에서, 폴리펩티드 모에신 억제제는 모에신 단백질의 C-말단 테일 도메인에 특이적인 항-모에신 항체이다. 이는 테일 도메인의 Thr 558에서 인산화 부위를 차단시킴으로써 모에신이 활성화되지 못하도록 막을 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 폴리펩티드 모에신 억제제는 Thr 558 인산화 부위를 포함하는 C-말단 테일 도메인의 절단된, 비-기능성 단편이다. 상기 단편은 Thr 558에서의 인산화에 대하여 모에신 분자와 경쟁함으로써 그가 활성화되지 못하도록 막거나, 이를 감소시킬 수 있다. 한 측면에서, 폴리펩티드 모에신 억제제는 Thr 558 부위 주변의 영역으로부터 10개 이상의 연속적인 아미노산 잔기를 포함한다. 예를 들어, 폴리펩티드는 GRDKYKTLRQIRQ (서열 번호 2)의 부분 또는 완전한 서열을 포함할 수 있다.

한 실시양태에서, 폴리펩티드 조절제는 표준 단백질 정제 기법을 사용하여 적절한 정제 방식에 의해 세포 또는 조직 공급원으로부터 단리될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 조절제는 재조합 DNA 기법에 의해 제조된다. 재조합 발현에 대한 대안으로, 조절제는 표준 펩티드 합성 기법을 사용하여 화학적으로 합성될 수 있다.

폴리펩티드 모에신 조절제는 돌연변이체 또는 변이체 단백질을 포함하는 데, 그 중 어느 것의 잔기는 조절 활성을 유지하는 폴리펩티드를 여전히 코딩하면서, 이들 펩티드의 상응하는 잔기로부터 변이될 수 있다. 한 실시양태에서, 참조 폴리펩티드의 변이체는 참조 폴리펩티드의 서열과 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 가진다. 일반적으로, 변이체는 당업계에서 용인된 결합 검정 정량화 유니트/매트릭스에 기초하여, 참조 폴리펩티드와 실질적으로 동일하거나, 그보다 큰 결합 친화도, 예컨대, 참조 폴리펩티드의 결합 친화도의 0.75x, 0.8x, 0.9x, 1.0x, 1.25x 또는 1.5x배 이상인 결합 친화도를 보인다.

모에신의 생물학적 특성을 조절하는, 인간 및 비-인간 폴리클로날 항체 모노클로날 항체 (인간화된 형태의 비-인간 모노클로날 항체 포함)가 본 출원에서 주시된다. 이는 항체의 아미노산 서열 변이체, 당화 변이체 및 단편을 포함한다. 항체 조절제 또는 그의 변이체는 당업계에 공지되어 있고, 본원에 간략하게 기술되어 있는 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 항체 변이체에는 상이한 잔기로 치환된 항체 분자 중 1 이상의 아미노산 잔기가 존재할 수 있다. 항체의 경우, 치환 돌연변이유발을 위해 가장 큰 관심의 대상이 되는 부위는 일반적으로 과가변 영역을 포함하지만, 프레임워크 영역 (FR) 변경 또한 주시된다.

항체의 경우, 한 유형의 치환 변이체는 모체 항체 (예컨대, 인간화된 항체 또는 인간 항체)의 하나 이상의 과가변 영역 잔기 치환을 포함한다. 일반적으로, 추가 개발을 위해 선택된 생성된 변이체(들)는 그의 생성의 기원이 된 모체 항체에 비하여 개선된 생물학적 특성을 가질 것이다. 상기와 같은 치환 변이체를 생성하는 편리한 방법은 파지 디스플레이를 이용하는 친화도 성숙을 포함한다. 간략하면, 수개의 과가변 영역 부위 (예컨대, 6-7개의 부위)를 돌연변이화시켜 각 부위에서 가능한 모든 아미노산 치환을 생성한다. 그러한 생성된 항체는 각 입자내 패킹된 M13의 유전자 III 생성물에의 융합물로서 사상 파지 입자로부터 디스플레이된다. 이어서, 본원에 기술된 바와 같이, 파지 디스플레이된 변이체를 그의 생물학적 활성 (예컨대, 결합 친화성)에 대해 스크리닝한다. 변형을 위한 후보 과가변 영역 부위를 확인하기 위해, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발법을 수행함으로써 항원 결합에 대해 유의적으로 기여하는 과가변 영역 잔기를 확인할 수 있다. 별법으로, 또는 추가로, 항원-항체 복합체의 결정 구조를 분석함으로써 항체와 항원 사이의 접촉 지점을 확인하는 것이 이익이 될 수 있다. 그러한 접촉 잔기 및 주변 잔기는 본원에서 상술된 기법에 따른 치환을 위한 후보물질이 된다. 일단 상기와 같은 변이체가 생성되고 나면, 본원에 기술되어 있는 바와 같이 변이체 패널을 스크리닝하고, 추가 개발을 위해 하나 이상의 관련 검정에서 우수한 특성을 가진 항체를 선택할 수 있다.

항체의 아미노산 서열 변이체를 코딩하는 핵산 분자는 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 제조된다. 이러한 방법은 (천연적으로 발생된 아미노산 서열 변이체인 경우) 천연 공급원으로부터의 단리, 또는 항체의 앞서 제조된 변이체 또는 비-변이체 버전의 올리고뉴클레오티드-매개 (또는 부위-지정) 돌연변이유발법, PCR 돌연변이유발법, 및 카세트 돌연변이유발법에 의한 제조를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본 출원의 항체는 당업계에 공지되어 있고, 쉽게 이용될 수 있는 추가의 비단백질성 모이어티를 포함하도록 추가로 변형될 수 있다. 바람직하게, 항체의 유도체화에 적합한 모이어티는 수용성 중합체이다. 수용성 중합체에 관한 비-제한적인 예로는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카르복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산 (동종중합체 또는 랜덤 공중합체), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 동종중합체, 폴리프로필렌 옥시드/에틸렌 옥시드 공중합체, 폴리옥시에틸화된 폴리올 (예컨대, 글리세롤), 폴리비닐 알콜, 및 그의 혼합물을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드는 물 중에서 안정하기 때문에 제조시 이로울 수 있다. 중합체는 임의 분자량을 가질 수 있고, 분지형 또는 비분지형일 수 있다. 다양한 개수의 중합체가 항체에 부착될 수 있으며, 1개 초과의 중합체가 부착되는 경우, 이들은 동일하거나 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 유도체화를 위해 사용되는 중합체의 개수 및/또는 유형은 개선시키고자 하는 항체의 특정의 특성 또는 기능, 항체 유도체가 정의된 병증하의 요법에서 사용될 수 있는지 여부 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는 고려 사항에 기초하여 결정될 수 있다.

한 실시양태에서, 모에신 억제제는, 모에신의 그의 결합제 (예컨대, 항-모에신 항체 또는 모에신의 인산화 부위에 대해 작용하는 키나제)에의 결합과 경쟁할 수 있는 후보 화합물의 능력을 측정하는 고처리량 경쟁 검정법에 의해 스크리닝되고 확인된다. 무세포 검정법은 모에신 또는 절단된 모에신 단편을 공지된 결합제 화합물과 접촉시켜 검정 혼합물을 형성하고, 검정 혼합물을 시험 화합물과 접촉시키고, 모에신 또는 결합제 화합물과 상호작용할 수 있는 시험 화합물의 능력을 측정하는 데, 여기서, 모에신 또는 결합제 화합물과 상호작용할 수 있는 시험 화합물의 능력을 측정하는 것은 모에신/결합제 복합체의 검출가능한 특징이 조절되는지 여부를 측정하는 것인 단계를 포함한다. 예를 들어, 단백질의 인산화 정도에 의해 측정되는 바와 같이, 모에신 및 단백질 키나제의 결합 상호작용은 시험 화합물이 모에신과 키나제 화합물 사이의 상호작용을 조절할 수 있는지 여부를 나타낼 수 있다. 복합체의 양은 당업계에 공지된 방법, 예를 들어, ELISA (경쟁적 결합 ELISA), 효모 2-하이브리드 및 근접 (예컨대, 형광 공명 에너지 전이, 효소-기질) 검정법에 의해 평가될 수 있다.

펩티드 또는 폴리펩티드의 재조합적 제조

본 출원의 폴리펩티드는 쉽게 수득할 수 있는 기법 및 물질을 사용함으로써 재조합적으로 제조될 수 있다. 본 출원의 폴리펩티드의 재조합적 제조를 위해, 그를 코딩하는 핵산을 단리시키고, 추가의 클로닝 (DNA 증폭) 또는 발현을 위해 복제가능한 벡터 내로 삽입한다. 본 출원의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA는 종래 방법을 사용함으로써 쉽게 단리시키고, 서열 분석할 수 있다. 예를 들어, 인간 모에신 단백질을 코딩하는 DNA는 예컨대, 상기 단백질을 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써 단리시키고, 서열 분석한다. 많은 벡터들이 이용가능하다. 벡터 성분으로는 일반적으로 하기: 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 선별 유전자, 인핸서 요소, 프로모터, 및 전사 종결 서열 중 하나 이상을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본 출원의 폴리펩티드는 직접적으로 뿐만 아니라, 전형적으로는 신호 서열이거나, 또는 성숙 단백질 또는 폴리펩티드의 N-말단에 특이 절단 부위를 가진 다른 폴리펩티드인 이종성 폴리펩티드와의 융합 폴리펩티드로서 재조합적으로 제조될 수 있다. 선택된 이종성 신호 서열은 전형적으로 숙주 세포에 의해 인식되고 프로세싱되는 (즉, 신호 펩티다제에 의해 절단되는) 것이다. 원핵 숙주 세포의 경우, 신호 서열은 예를 들어, 알칼리성 포스파타제, 페니실리나제, lpp, 또는 열 안정성 내독소 II 리더로 이루어진 군으로부터 선택되는 원핵 신호 서열일 수 있다. 효모 분비를 위해, 천연 신호 서열은 예컨대, 효모 인버타제 리더, α 인자 리더 (사카로마이세스(Saccharomyces) 및 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) α-인자 리더 포함), 또는 산성 포스파타제 리더, C. 알비칸스(C. albicans) 글루코아밀라제 리더, 또는 WO 90/13646에 기술되어 있는 신호일 수 있다. 포유동물 세포 발현에서, 포유동물 신호 서열 뿐만 아니라, 바이러스성 분비 리더, 예를 들어, 헤르페스 심플렉스(herpes simplex) gD 신호가 이용가능하다.

상기 전구체 영역에 대한 DNA를 리딩 프레임 내에서 본 출원의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA에 결찰시킨다. 발현 및 클로닝 벡터 둘 모두 벡터가 하나 이상의 선택된 숙주 세포에서 복제될 수 있도록 하는 핵산 서열을 포함한다. 일반적으로, 클로닝 벡터에서 상기 서열은 벡터가 숙주 염색체 DNA와는 상관없이 독립적으로 복제될 수 있도록 하는 핵산 서열이며, 이는 복제 기점 또는 자율 복제 서열을 포함한다. 상기와 같은 서열은 다양한 박테리아, 효모, 및 바이러스에 대한 것으로 주지되어 있다. 플라스미드 pBR322로부터의 복제 기점은 대부분의 그람-음성 박테리아에 대해 적합하고, 2μ 플라스미드 기점은 효모에 대해 적합하며, 각종 바이러스 기점 (SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, VSV 또는 BPV)은 포유동물 세포에서의 클로닝 벡터에 유용하다. 일반적으로, 복제 기점 성분은 포유동물 발현 벡터에 대해서는 필요하지 않다 (전형적으로 SV40 기점은 단지 그가 조기 프로모터를 함유하고 있다는 이유 때문에 사용될 수 있다).

발현 및 클로닝 벡터는, 선별가능한 마커로도 불리는 선별 유전자를 포함할 수 있다. 전형적인 선별 유전자는 (a) 항생제 또는 다른 독소, 예컨대, 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트, 또는 테트라시클린에 대한 내성을 부여하거나, (b) 영양요구성 결핍을 보완하거나, 또는 (c) 복합 매질로부터는 이용불가능한 중요한 영양소, 예컨대, 바실리(Bacilli)에 대한 D-알라닌 라세마제를 코딩하는 유전자를 공급하는 단백질을 코딩한다.

선별 방식에 대한 일례는 숙주 세포의 성장을 정지시키는 약물을 이용한다. 이종성 유전자로 성공적으로 형질전환된 상기 세포는 약물 내성을 부여하는 단백질을 생산하게 되고, 따라서, 선별 요법으로부터 생존하게 된다. 그러한 우성 선별의 예는 약물인 네오마이신, 미코페놀산 및 히그로마이신을 이용한다.

포유동물 세포에 대하여 적합한 선별가능한 마커의 또 다른 일례로는 세포 성분의 확인을 통해 항체 핵산이 소비될 수 있도록 하는 것, 예컨대, DHFR, 티미딘 키나제, 메탈로티오네인-I 및 -II, 전형적으로 영장류 메탈로티오네인 유전자, 아데노신 데아미나제, 오르니틴 데카르복실라제 등이 있다.

예를 들어, 먼저, DHFR의 경쟁적 길항제인 메토트렉세이트 (Mtx)를 포함하는 배양 배지 중에서 형질전환체 모두를 배양함으로써 DHFR 선별 유전자로 형질전환된 세포를 확인한다. 야생형 DHFR이 사용될 때, 적절한 숙주 세포는 DHFR 활성에 결함이 있는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포주이다.

별법으로, 본 출원의 폴리펩티드, 야생형 DHFR 단백질, 및 또 다른 선별가능한 마커, 예컨대, 아미노글리코시드 3'-포스포트랜스퍼라제 (APH)를 코딩하는 DNA 서열로 형질전환 또는 공-형질전환된 숙주 세포 (특히, 내인성 DHFR을 포함하는 야생형 숙주)는 선별가능한 마커에 대한 선별 제제, 예컨대, 아미노글리코시드 항생제, 예컨대, 카나마이신, 네오마이신, 또는 G418을 함유하는 배지 중에서의 세포 성장에 의해 선별될 수 있다. 미국 특허 번호 4,965,199를 참조할 수 있다.

효모에서 사용하기에 적합한 선별 유전자는 효모 플라스미드 Yrp7에 존재하는 trp1 유전자이다 (문헌 [Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979)]). trp1 유전자는 예를 들어, ATCC No. 44076 또는 PEP4-1과 같이, 트립토판에서 성장할 수 있는 능력이 부족한 돌연변이체 효모 균주에 대한 선별 마커를 제공한다 (문헌 [Jones, Genetics, 85: 12 (1977)]). 이어서, 효모 숙주 세포 게놈 중 trp1 병변의 존재는 트립토판 부재하에서의 성장에 의해 형질전환을 검출할 수 있도록 하는 데 효과적인 환경을 제공한다. 유사하게, Leu2-결핍 효모 균주 (ATCC 20,622 또는 38,626)는 Leu2 유전자를 보유하는 공지된 플라스미드에 의해 보완된다.

또한, 1.6 ㎛ 환형 플라스미드 pKD1로부터 유도된 벡터가 클루이베로마이세스 효모의 형질전환을 위해 사용될 수 있다. 별법으로, 재조합 소 키모신의 대규모 제조를 위한 발현 시스템으로 K. 락티스(K. lactis)가 보고된 바 있다 (문헌 [Van den Berg, Bio / Technology, 8: 135 (1990)]). 산업상 클루이베로마이세스 균주에 의한 성숙한 재조합 인간 혈청 알부민의 분비에 대해 안정한 다중 카피 발현 벡터 또한 개시된 바 있다 (문헌 [Fleer et al., Bio / Technology, 9:968-975 (1991)]).

발현 및 클로닝 벡터는 보통 숙주 유기체에 의해 인식되고, 본 출원의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함한다. 원핵 숙주에서 사용하기에 적합한 프로모터로는 phoA 프로모터, β-락타마제 및 락토스 프로모터 시스템, 알칼리성 포스파타제, 트립토판 (trp) 프로모터 시스템, 및 하이브리드 프로모터, 예컨대, tac 프로모터를 포함한다. 그러나, 다른 공지된 박테리아 프로모터도 적합하다. 박테리아 시스템에서 사용하기 위한 프로모터는 또한 본 출원의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA에 작동가능하게 연결된 샤인-달가르노(Shine-Dalgarno: S.D.) 서열을 포함할 것이다.

프로모터 서열은 진핵생물에 대해서도 알려져 있다. 실제로, 모든 진핵 유전자에는 전사가 개시되는 부위로부터 상류쪽으로 대략 25 내지 30개의 염기만큼의 위치에 AT가 풍부한 영역이 존재한다. 많은 유전자의 전사 출발점으로부터 상류쪽으로 70 내지 80개의 염기만큼의 위치에서 발견되는 또 다른 서열은 CNCAAT 영역 (여기서, N은 임의의 뉴클레오티드일 수 있다)이다. 대부분의 진핵 유전자의 3' 말단에는 폴리 A 테일의, 코딩 서열의 3' 말단에의 부가를 위한 신호일 수 있는 AATAAA 서열이 존재한다. 이들 서열은 모두 진핵 발현 벡터 내로 적합하게 삽입된다.

효모 숙주에서 사용하기에 적합한 프로모팅 서열의 예로는 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 해당 효소, 예컨대, 에놀라제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 헥소키나제, 피루베이트 데카르복실라제, 포스포프럭토키나제, 글루코스-6-포스페이트 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 뮤타제, 피루베이트 키나제, 트리오스포스페이트 이소머라제, 포스포글루코스 이소머라제, 및 글루코키나제에 대한 프로모터를 포함한다.

전사가 성장 조건에 의해 제어되는 추가의 이점을 가지고 있는 유도성 프로모터인 다른 효모 프로모터로는 알콜 데히드로게나제 2, 이소시토크롬 C, 산성 포스파타제, 질소 대사와 관련된 분해 효소, 메탈로티오네인, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 및 말토스 및 갈락토스 이용을 담당하는 효소에 대한 프로모터 영역이 있다. 효모 발현에 사용하기에 적합한 벡터 및 프로모터는 EP 73,657에 추가로 기술되어 있다. 또한 효모 인핸서가 효모 프로모터와 함께 사용되는 것이 이롭다.

포유동물 숙주 세포에서 벡터로부터의 본 출원의 폴리펩티드의 전사는, 본 프로모터가 숙주 세포 시스템과 상용성이라면, 예를 들어, 바이러스, 예컨대, 폴리오마 바이러스, 계두 바이러스, 아데노바이러스 (예컨대, 아데노바이러스 2), 소 유두종 바이러스, 조류 육종 바이러스, 시토메갈로바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스 및 전형적으로 원숭이 바이러스 40 (SV40)의 게놈으로부터, 이종성 포유동물 프로모터, 예컨대, 액틴 프로모터 또는 면역글로불린 프로모터로부터, 열-쇼크 프로모터로부터 수득되는 프로모터에 의해 제어된다.

SV40 바이러스에 대한 조기 및 후기 프로모터는 SV40 바이러스 복제 기점 또한 포함하는 SV40 제한 단편으로서 알맞게 수득된다. 인간 시토메갈로바이러스의 즉시 초기 프로모터는 HindIII E 제한 단편으로서 알맞게 수득된다. 벡터로서, 소 유두종 바이러스를 사용하여 포유동물 숙주에서 DNA를 발현시키기 위한 시스템은 미국 특허 번호 4,419,446에 개시되어 있다. 상기 시스템의 변형은 미국 특허 번호 4,601,978에 기술되어 있다. 또한, 헤르페스 심플렉스 바이러스로부터의 티미딘 키나제 프로모터의 제어하의 마우스 세포에서의 인간 β-인터페론 cDNA의 발현에 관해서는 문헌 [Reyes et al., Nature 297:598-601 (1982)]을 참조할 수 있다. 별법으로, 라우스 육종 바이러스 긴 말단 반복부가 프로모터로서 사용될 수 있다.

고등 진핵생물에 의한 본 출원의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA의 전사는 대개인핸서 서열을 벡터 내로 삽입함으로써 증가된다. 현재 포유동물 유전자로부터의 것인 많은 인핸서 서열이 알려져 있다 (글로빈, 엘라스타제, 알부민, α-펙토단백질, 및 인슐린). 전형적으로, 진핵 세포 바이러스로부터의 인핸서를 사용할 것이다. 그 예로는 복제 기점의 후반부 측 (bp 100-270) 상의 SV40 인핸서, 시토메갈로바이러스 조기 프로모터 인핸서, 복제 기점의 후반부 측 상의 폴리오마 인핸서, 및 아데노바이러스 인핸서를 포함한다. 진핵 프로모터의 활성화를 위한 인핸싱 요소에 대해서는 문헌 [Yaniv, Nature 297:17-18 (1982)]를 참조할 수 있다. 인핸서는 폴리펩티드 코딩 서열에 대해 5' 또는 3' 위치에 벡터 내로 스플라이싱될 수 있지만, 전형적으로는 프로모터로부터 5' 부위에 위치한다.

진핵 숙주 세포 (효모, 진균, 곤충, 식물, 동물, 인간, 다른 다세포 유기체로부터의 유핵 세포)에서 사용되는 발현 벡터는 또한 전사를 종결시키는 데, 및 mRNA를 안정화시키는 데 필요한 서열을 포함할 것이다. 그러한 서열은 보통 진핵 또는 바이러스 DNA 또는 cDNA의 5' 및 때때로 3' 비번역 영역으로부터 이용가능하다. 이러한 영역은 본 출원의 폴리펩티드를 코딩하는 mRNA의 비번역부 중 폴리아데닐화된 단편으로서 전사되는 뉴클레오티드 세그먼트를 포함한다. 유용한 전사 종결 성분은 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 영역이다. WO94/11026 및 그에 개시된 발현 벡터를 참조할 수 있다.

본원의 벡터에서 본 출원의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 클로닝 또는 발현시키는 데 적합한 숙주 세포는 상기 기술된 원핵생물, 효모, 또는 고등 진핵 세포이다. 본 목적에 적합한 원핵생물로는 유박테리아, 예컨대, 그람-음성 또는 그람-양성 유기체, 예를 들어, 엔테로박테리아세아에(Enterobacteriaceae), 예컨대, 에스케리키아(Escherichia), 예컨대, E. 콜라이(E. coli), 엔테로박터(Enterobacter), 에르위니아(Erwinia), 클렙시엘라(Klebsiella), 프로테우스(Proteus), 살모넬라(Salmonella), 예컨대, 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 세라티아(Serratia), 예컨대, 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens), 및 시겔라(Shigella) 뿐만 아니라, 바실리, 예컨대, B. 섭틸리스(B. subtilis) 및 B. 리케니포르미스(B. licheniformis) (예컨대, 1989년 4월 12일 공개된 DD 266,710에 개시되어 있는 B. 리케니포르미스 41P), 슈도모나스(Pseudomonas), 예컨대, P. 아에루기노사(P. aeruginosa), 및 스트렙토마이세스(Streptomyces)를 포함한다. 비록 다른 균주, 예컨대, E. 콜라이 B, E. 콜라이 BL21 (DE3), E. 콜라이 X1776 (ATCC 31,537), 및 E. 콜라이 W3110 (ATCC 27,325)도 적합하기는 하지만, 전형적으로, E. 콜라이 클로닝 숙주는 E. 콜라이 294 (ATCC 31,446)이다. 이러한 예들은 제한적이라기보다는 예시적인 것이다.

원핵생물 이외에도, 진핵 미생물, 예컨대, 사상 진균 또는 효모가 본 출원의 폴리펩티드를 코딩하는 벡터에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 하등 진핵 숙주 미생물 중 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae), 또는 일반 제빵 효모가 가장 보편적으로 사용된다. 그러나, 예컨대, 쉬조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe); 클루이베로마이세스 숙주, 예컨대, K. 락티스, K. 프라길리스(K. fragilis) (ATCC 12,424), K. 불가리쿠스(K. bulgaricus) (ATCC 16,045), K. 위커하미(K. wickerhamii) (ATCC 24,178), K. 왈티(K. waltii) (ATCC 56,500), K. 드로소필라룸(K. drosophilarum) (ATCC 36,906), K. 써모톨레란스(K. thermotolerans), 및 K. 마르시아누스(K. marxianus); 야로위아(yarrowia) (EP 402,226); 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) (EP 183,070); 칸디다(Candida); 트리코데르마 리제이(Trichoderma reesia) (EP 244,234); 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa); 슈완니오마이세스(Schwanniomyces), 예컨대, 슈완니오마이세스 옥시덴탈리스(Schwanniomyces occidentalis); 및 사상 진균, 예컨대, 뉴로스포라(Neurospora), 페니실리움(Penicillium), 톨리포클라디움(Tolypocladium), 및 아스퍼질러스(Aspergillus) 숙주, 예컨대, A. 니둘란스(A. nidulans) 및 A. 니거(A. niger)와 같은 다수의 다른 속, 종, 및 균주가 일반적으로 이용가능하며, 본원에서 유용하다.

본 출원의 폴리펩티드의 발현을 위해 적합한 숙주 세포는 다세포 유기체로부터 유래될 수 있다. 무척추동물 세포의 예로는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 다수의 배큘로바이러스 균주 및 변이체, 및 숙주, 예컨대, 스포돕프테라 푸르기페다(Spodoptera frugiperda) (캐터필라), 아에데스 아에기프티(Aedes aegypti) (모기), 아에데스 알보피크투스(Aedes albopictus) (모기), 드로소필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster) (초파리), 및 봄빅스 모리(Bombyx mori)로부터의 상응하는 허용 곤충 숙주 세포가 확인되어 있다. 형질감염용으로서 다양한 바이러스 균주가 공개적으로 이용가능하며, 그 예로는 오토그래파 캘리포니카(Autographa californica) NPV의 L-1 변이체, 및 봄빅스 모리 NPV의 Bm-5 균주가 있으며, 상기 바이러스는 본원에서 본 출원에 따른 바이러스로서, 특히, 스포돕프테라 푸르기페다 세포의 형질감염을 위한 것으로서 사용될 수 있다. 목화, 옥수수, 감자, 대두, 페투니아, 토마토, 및 담배의 식물 세포 배양물 또한 숙주로서 사용될 수 있다.

그러나, 척추동물 세포가 더 큰 관심의 대상이 되어 왔으며, 배양물 (조직 배양물) 중에서의 척추동물 세포의 증식이 통상적인 방법이 되어 왔다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 예로는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주 (COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 세포주 (현탁 배양물 중에서의 성장을 위해 서브클로닝된 293 또는 293 세포, 문헌 [Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)]); 새끼 햄스터 신장 세포 (BHK, ATCC CCL 10); 차이니즈 햄스터 난소 세포/-DHFR (CHO, 문헌 [Urlaub et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 77:4216 (1980)]); 마우스 세르톨리 세포 (TM4, 문헌 [Mather, Biol . Reprod . 23:243-251 (1980)]); 원숭이 신장 세포 (CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 자궁경부 암종 세포 (HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간 세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포 (Hep G2, HB 8065); 마우스 유방 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포 (문헌 [Mather et al., Annals N.Y. Acad . Sci. 383:44-68 (1982)]); MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간암 세포주 (Hep G2)가 있다.

숙주 세포는 본 출원의 폴리펩티드의 제조를 위해 상기 기술된 발현 또는 클로닝 벡터로 형질전환되고, 프로모터를 유도하거나, 형질전환체를 선별하거나, 또는 원하는 서열을 코딩하는 유전자를 증폭시키는 데 적절하게 변형된 종래 영양 배지 중에서 배양된다.

본 출원의 폴리펩티드를 제조하는 데 사용되는 숙주 세포를 다양한 배지 중에서 배양할 수 있다. 상업적으로 이용가능한 배지, 예컨대, 햄즈 F10(Ham's F10) (시그마(Sigma)), 최소 필수 배지 (MEM, 시그마), RPMI-1640 (시그마), 및 둘베코스 변형 이글스 배지 (DMEM, 시그마)가 숙주 세포를 배양하는 데 적합하다. 추가로, 문헌 [Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979)], [Barnes et al., Anal. Biochem. 102:255 (1980)], 미국 특허 번호 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; 또는 5,122,469; WO 90/03430; WO 87/00195; 또는 미국 특허 Re. 30,985에 기술된 배지 중의 임의 배지가 숙주 세포용 배양 배지로서 사용될 수 있다. 상기 배지 중 임의의 것으로 필요에 따라 호르몬 및/또는 다른 성장 인자 (예컨대, 인슐린, 트랜스페린, 또는 표피 성장 인자), 염 (예컨대, 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘, 및 포스페이트), 완충제 (예컨대, HEPES), 뉴클레오티드 (예컨대, 아데노신 및 티미딘), 항생제 (예컨대, 겐타마이신(GENTAMYCIN)™ 약물), (일반적으로 마이크로몰 범위의 최종 농도로 존재하는 유기 화합물로서 정의되는) 미량 원소, 및 글루코스 또는 등가의 에너지 공급원으로 보충될 수 있다. 임의의 다른 필요한 보충물 또한 당업자에게 공지된 적절한 농도로 포함될 수 있다. 배양 조건, 예컨대, 온도, pH 등은 발현을 위해 선택되는 숙주 세포와 함께 앞서 사용된 것이며, 이는 당업계의 숙련가에게 자명할 것이다.

펩티드 또는 폴리펩티드의 화학적 합성

본 출원의 펩티드는 또한 화학적 합성법, 예를 들어, 문헌 [Merrifield in J.A.C.S. 85: 2149-2154 (1963)]에 기술되어 있는 고체상 합성 방법, 또는 문헌 ["Peptide Synthesis" by Bodanszky, et al., second edition, John Wiley and Sons, 1976]에 기술되어 있는 표준 용액 합성 방법에 의해 제조될 수 있다. 상기 서적은 그 전문이 본원에서 참고로 포함된다.

고체상 펩티드 합성 방법의 일반적인 방법은 먼저 펩티드의 보호된 C-말단 아미노산을 수지에 부착시키는 단계를 포함한다. 부착 후, 수지를 여과하고, 세척하고, C-말단 아미노산의 알파 아미노기 상의 보호기 (예컨대, t-부틸옥시카르보닐)를 제거한다. 상기 보호기 제거는 물론 아미노산과 수지 사이의 결합을 파괴시키지 않으면서 일어나야 한다. 이어서, 생성된 수지 펩티드에, 말단에서 두 번째 위치에 있는 C-말단 보호된 아미노산을 커플링시킨다. 상기 커플링은 제2 아미노산의 유리 카르복시기와, 수지에 부착된 제1 아미노산의 아미노기 사이의 아미드 결합 형성에 의해 이루어진다. 상기와 같은 순서의 이벤트는 연속된 아미노산을 통해 펩티드의 아미노산 모두가 수지에 부착될 때까지 반복된다. 마지막으로, 보호된 펩티드는 수지로부터 절단되고, 보호기는 제거됨으로써 원하는 펩티드가 수득된다. 펩티드를 수지로부터 분리하고, 보호기를 제거하는 데 사용되는 절단 기법은 수지 및 보호기 선택에 따라 달라지며, 이는 펩티드 합성 분야의 당업자에게 공지되어 있다.

상기 언급된 수지는 임의의 적합한 중합체일 수 있고, 이는 제1 보호된 아미노산이 공유 결합에 의해 그에 견고하게 연결될 수 있는 작용기를 포함하여야 한다. 본 목적을 위해 다양한 중합체, 예컨대, 셀룰로스, 폴리비닐 알콜, 폴리메틸메타크릴레이트, 및 폴리스티렌이 적합하다. 고체상 합성법에서 사용될 수 있는 적절한 보호기로는 t-부틸옥시카르보닐 (BOC), 벤질 (BZL), t-아밀옥시카르보닐 (AOC), 토실 (TOS), o-브로모페닐메톡시카르보닐 (BrZ), 2,6-디클로로벤질 (BZLCl₂), 및 페닐메톡시카르보닐 (Z 또는 CBZ)을 포함한다. 추가의 보호기는 또한 문헌 [J. F. W. McOmie, "Protective Groups in Organic Chemistry", Plenum Press, New York, 1973]에 기술되어 있다. 상기 서적은 그 전문이 본원에서 참고로 포함된다.

표준 용액 합성 방법은 아미드 결합 형성의 화학적 또는 효소적 방법을 사용하여 아미노산 또는 펩티드 단편의 단계식 또는 블록 커플링에 의해 수행될 수 있다. 이러한 용액 합성 방법은 당업계에 주지되어 있다.

폴리펩티드 정제

본 출원의 폴리펩티드 또는 단백질은 대상체로부터 회수될 수 있다. 재조합 기법을 사용하였을 때, 본 출원의 폴리펩티드를 세포내에서, 주변세포질 공간에서 제조할 수 있거나, 또는 배지 내로 직접 분비시킬 수 있다. 본 출원의 폴리펩티드는 배양 배지로부터 또는 숙주 세포 용해물로부터 회수될 수 있다. 막에 결합되어 있을 경우, 적합한 세제 용액 (예컨대, 트리톤-X 100)을 사용하여, 또는 효소적 절단에 의해 막으로부터 방출시킬 수 있다. 본 출원의 폴리펩티드의 발현에 사용되는 세포는 다양한 물리적 또는 화학적 수단에 의해, 예컨대, 냉동-해동 사이클링, 초음파 처리, 기계적 파괴, 또는 세포 용해제에 의해 파괴될 수 있다.

펩티드가 화학적으로 합성되는 경우, 본 출원의 펩티드는 배지 중 다른 성분으로부터 원하는 펩티드를 분리해 낼 수 있는 임의의 적합한 기법에 의해 반응 매질로부터 회수될 수 있다. 고체상 합성 방법의 경우, 먼저 적합한 절단 용액을 사용하여 보호된 펩티드를 수지로부터 절단해 낸다. 절단 용액 선택은 수지, 및 그에 결합하는 아미노산의 특성에 따라 달라진다 (예컨대, FMOC 방법의 경우, 트리플루오로아세트산). 절단은 일반적으로 산성 조건하에서 수행된다. 절단 종료시, 이어서, 해리성 펩티드를 수득하고, 임의의 적합한 기법 (예컨대, 하기 기술되는 방법)을 사용하여 추가로 정제한다.

하기 방법은 적합한 단백질 정제 방법의 일례이다: 이온-교환 칼럼 상에서의 분별; 에탄올 침전; 역상 HPLC; 실리카 상에서의 크로마토그래피, 헤파린 세파로스(SEPHAROSE)™ 상에서의 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지 (예컨대, 폴리아스파르트산 칼럼, DEAE 등) 상에서의 크로마토그래피; 크로마토포커싱; SDS-PAGE; 황산암모늄 침전; 예를 들어, 세파덱스(Sephadex) G-75를 이용한 겔 여과; 오염 물질, 예컨대, IgG를 제거하는 단백질 A 세파로스 칼럼; 및 에피토프 태깅된 형태의 본 출원의 폴리펩티드에 결합하는 금속 킬레이팅 칼럼에 의한 것. 다양한 단백질 정제 방법이 사용될 수 있고, 그러한 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 이는 예를 들어, 문헌 [Deutscher, Methods in Enzymology , 182 (1990)]; [Scopes, Protein Purification : Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982)]에 기술되어 있다. 선택된 정제 단계(들)는 예를 들어, 사용되는 제조 공정 및 제조되는 본 출원의 특정 폴리펩티드의 성질에 따라 달라질 것이다.

치료학적/ 예방학적 적용

본 출원의 모에신 조절제는 시험관내 또는 생체내에서 세포 활성을 조절하기 위해 치료학적으로 사용될 수 있다. 한 측면에서, 모에신 억제제는 모에신이 활성화되지 못하도록 차단함으로써 모에신의 비정상적인 활성화와 관련된 장애를 치료하는 데 사용될 수 있다.

한 측면에서, 본 출원은 모에신의 비정상적인 활성화와 관련된 장애를 앓는 대상체에서 비정상적인 상피 또는 내피 세포의 증식을 억제시키는 방법을 제공한다. 또 다른 측면에서, 본 출원은 모에신의 비정상적인 활성화와 관련된 장애를 앓는 대상체에서 비정상적인 상피 또는 내피 세포의 아폽토시스를 유도 또는 촉진시키는 방법을 제공한다.

본 출원의 조성물이 포유동물을 치료하는 데 사용될 수 있다는 것이 주시된다. 한 실시양태에서, 예를 들어, 임상전 데이터를 수득하기 목적으로 본 출원의 조성물을 비인간 포유동물에게 투여한다. 치료하고자 하는 비인간 포유동물의 예로는 비인간 영장류, 개, 고양이, 설치류 및 임상전 연구가 수행되는 다른 포유동물을 포함한다. 상기와 같은 포유동물은 본 조성물을 이용하여 치료하고자 하는 질환에 대하여 확립된 동물 모델일 수 있거나, 또는 관심의 대상이 되는 본 조성물의 독성을 연구하는 데 사용될 수 있다. 각각의 이들 실시양태에서, 포유동물에서 용량 점증 연구가 수행될 수 있다.

추가로, 또는 별법으로, 조성물은 인간, 예컨대, 본 조성물의 투여로부터 이익을 얻을 수 있는 질환 또는 장애를 앓고 있는 환자를 치료하는 데 사용된다.

한 실시양태에서, 본 출원은 비정상적인 모에신 활성화와 관련된 증식성 장애 치료법을 포함한다. 비정상적인 세포 증식은 원발성 종양 성장 및 전이 둘 모두에 관여하기 때문에, 본 출원에 의해 제공되는 치료법은 원발성 부위에서의 종양의 신생물 성장을 억제시킬 수 있을 뿐만 아니라, 속발성 부위에서의 종양 전이를 예방할 수 있고, 이로써, 다른 치료제에 의한 종양 공격을 허용한다. 본원에서 치료하고자 하는 암의 예로는 암종, 림프종, 아세포종, 육종, 및 백혈병을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 암에 관한 더욱 특정의 예로는 편평세포암, 폐암 (소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 폐 샘암종, 및 폐 편평세포 암종 포함), 복막암, 간세포암, 위암(gastric cancer) 또는 위암(stomach cancer) (위장관암 포함), 췌장암, 아교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간암, 유방암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막 암종 또는 자궁 암종, 타액선 암종, 신장암(kidney cancer) 또는 신장암(renal cancer), 간암, 전립샘암, 외음부암, 갑상샘암, 간암종 및 각종 유형의 두부경부암 뿐만 아니라, B-세포 림프종 (저등급/여포성 비-호지킨 림프종 (NHL); 소림프구 (SL) NHL; 중등급/여포성 NHL; 중등급 미만성 NHL; 고등급 면역아세포 NHL; 고등급 림프아세포성 NHL; 고등급 소 비-분할 세포 NHL; 치료하기 어려운 질환(bulky disease) NHL; 외투층 세포 림프종; AIDS-관련 림프종; 및 발덴스트롬 마크로글로불린혈증(Waldenstrom's Macroglobulinemia) 포함); 만성 림프구 백혈병 (CLL); 급성 림프아세포성 백혈병 (ALL); 모발상 세포 백혈병; 만성 골수아세포성 백혈병; 및 이식후 림프구증식성 장애 (PTLD) 뿐만 아니라, 모반증과 관련된 비정상적인 혈관 증식, 부종 (예컨대, 뇌종양과 관련된 부종), 및 메이그 증후군(Meigs' syndrome)을 포함한다. 더욱 특히, 본 출원의 항체에 의해 잘 치료될 수 있는 암으로는 유방암, 결장직장암, 직장암, 비-소세포 폐암, 비-호지킨 림프종 (NHL), 신장 세포 암, 전립샘암, 간암, 췌장암, 연조직 육종, 카포시 육종, 카르시노이드 암종, 두부경부암, 흑색종, 난소암, 중피종, 및 다발 골수종을 포함한다.

제약 제제

다양한 물질 또는 분자 (펩티드 등 포함)가 치료제로서 사용될 수 있다. 이러한 물질 또는 분자는 그의 제품이 제약상 허용되는 담체 비히클과 함께 혼합되어 조합되는, 제약상 유용한 조성물을 제조하는 공지의 방법에 따라 제제화될 수 있다. 보관을 위해 임의적 생리학상 허용되는 담체, 부형제 또는 안정제와 함께, 원하는 순도를 가지는 활성 성분을 혼합함으로써 동결건조된 제제 또는 수용액 형태로 치료학적 제제를 제조한다 (문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]). 허용되는 담체, 부형제 또는 안정제는 사용되는 투여량 및 농도에서 수혜자에게 비독성이며, 이는 완충제, 예컨대, 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기산; 아스코르브산을 비롯한 항산화제; 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대, 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대, 폴리비닐피롤리돈, 아미노산, 예컨대, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 리신; 단당류, 이당류 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 비롯한 다른 탄수화물; 킬레이팅제, 예컨대, EDTA; 당 알콜, 예컨대, 만닛톨 또는 소르비톨; 염 형성 카운터이온, 예컨대, 나트륨; 및/또는 비이온성 계면활성제, 예컨대, 트윈(TWEEN)™, 플루로닉스(PLURONICS)™ 또는 PEG를 포함한다.

생체내 투여용으로서 사용하고자 하는 제제는 멸균성이어야 하다. 이는 동결건조 및 재구성 이전에 또는 그 이후에 멸균 여과막을 통해 여과시킴으로써 쉽게 달성된다.

본원의 치료학적 조성물은 일반적으로 멸균 접근 포트가 있는 용기, 예를 들어, 정맥내 투여용 용액 백 또는 피하 주사용 바늘에 의해 관통이 가능한 마개가 있는 바이알 안에 놓여 있다.

각종 질환, 예컨대, 종양을 치료하는 데 사용될 때, 본 출원의 조절제는 동일 또는 유사 질환에 적합한 다른 치료제와 함께 병용될 수 있다는 것이 주시된다. 암 치료를 위해 사용될 때, 본 출원의 조절제는 종래의 암 요법, 예컨대, 수술, 방사선 요법, 화학요법 또는 그의 조합과 함께 병용하여 사용될 수 있다.

일부 다른 측면에서, 본 출원의 모에신 길항제와 함께 병용 종양 요법에 유용한 다른 치료제로는 종양 성장에 관여하는 다른 인자, 예컨대, EGFR, ErbB2 (Her2로도 공지되어 있음), ErbB3, ErbB4, 또는 TNF의 길항제를 포함한다. 바람직하게, 본 출원의 항-NRP1 항체는 하나 이상의 티로신 키나제 수용체, 예컨대, VEGF 수용체, FGF 수용체, EGF 수용체 및 PDGF 수용체를 표적화하는 소형 분자 수용체 티로신 키나제 억제제 (RTKI)와 함께 조합되어 사용될 수 있다. 바탈라닙 (PTK787), 에를로티닙 (타세바(TARCEVA)등록상표), OSI-7904, ZD6474 (작티마(ZACTIMA)등록상표), ZD6126 (ANG453), ZD1839, 수니티닙 (수텐트(SUTENT)등록상표), 세막사닙 (SU5416), AMG706, AG013736, 이마티닙 (글리벡(GLEEVEC)등록상표), MLN-518, CEP-701, PKC-412, 라파티닙 (GSK572016), 벨카데(VELCADE)등록상표, AZD2171, 소라페닙 (넥사바르(NEXAVAR)등록상표), XL880, 및 CHIR-265을 포함하지만, 이에 한정되지 않는, 다수의 치료학적 소형 분자 RTKI가 당업계에 공지되어 있다.

단독의 또는 제2 치료제와 함께 조합된 본 출원의 모에신 조절제는 추가로 하나 이상의 화학요법제와 함께 조합되어 사용될 수 있다. 다양한 화학요법제가 본 출원의 병용 치료 방법에 사용될 수 있다. 주시되는 화학요법제에 관한 예시적이며 비제한적인 목록은 본원 "정의"하에 제공되어 있다.

투여 경로는 예컨대, 정맥내, 복강내, 뇌내, 근육내, 안내, 동맥내, 또는 병변내 경로에 의해 주사 또는 주입, 국소 투여, 또는 지속 방출형 시스템에 의한 것과 같이, 공지된 방법과 일치한다.

본 출원의 제약 조성물의 투여량 및 원하는 약물 농도는 구상되는 특정 용도에 따라 달라질 수 있다. 적절한 투여량 또는 투여 경로에 관한 결정은 일반의의 기술 범위 내에 주지되어 있다. 동물 실험은 인간 요법을 위한 유효 용량 결정에 대해 신뢰할 수 있는 가이던스를 제공한다. 문헌 [J. and Chappell, W. "The use of interspecies scaling in toxicokinetics" In Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi et al., Eds., Pergamon Press, New York 1989, pp. 42-96]에 규정되어 있는 원리에 따라 유효 용량에 관한 종간 크기 조정을 수행할 수 있다.

본 출원의 물질 또는 분자의 생체내 투여를 사용할 경우, 보통 투여량은 투여 경로에 따라, 1일당 약 10 ng/kg 내지 최대 100 mg/kg (포유동물 체중) 이상, 바람직하게는, 약 1 mg/kg/일 내지 10 mg/kg/일로 달라질 수 있다. 특정 투여량 및 전달 방법에 관한 가이던스는 문헌에 제공되어 있다; 예를 들어, 미국 특허 번호 4,657,760; 5,206,344; 또는 5,225,212를 참조할 수 있다. 상이한 치료 화합물과 상이한 장애에 대해서는 상이한 제제가 유효할 것이며, 예를 들어, 한 기관 또는 조직을 표적화하여 투여하고자 하는 경우에는 또 다른 기관 또는 조직에 대한 것과는 상이한 방식으로 전달되어야 할 가능성이 있는 것으로 예상된다.

물질 또는 분자의 투여를 필요로 하는 임의의 질환 또는 장애를 치료하는 데 적합한 방출 특징을 가진 제제로 물질 또는 분자를 지속 방출형으로 투여하는 것이 바람직한 경우, 물질 또는 분자를 마이크로캡슐화하는 것이 주시된다. 지속 방출형인 것을 위해 재조합 단백질을 마이크로캡슐화하는 것은 인간 성장 호르몬 (rhGH), 인터페론- (rhIFN-), 인터루킨-2, 및 MN rgp120을 사용하여 성공적으로 수행되었다 (문헌 [Johnson et al., Nat. Med., 2:795-799 (1996)]; [Yasuda, Biomed. Ther., 27: 1221-1223 (1993)]; [Hora et al., Bio/Technology, 8:755-758 (1990)]; [Cleland, "Design and Production of Single Immunization Vaccines Using Polylactide Polyglycolide Microsphere Systems," in Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach, Powell and Newman, eds, (Plenum Press: New York, 1995), pp. 439462]; WO 97/03692, WO 96/40072, WO 96/07399; 및 미국 특허 번호 5,654,010).

생체적합성 및 매우 광범위한 생체분해성 특성에 기인하여 폴리-락틱-코글리콜산 (PLGA) 중합체를 사용함으로써 지속 방출형 제제를 개발할 수 있다. PLGA의 분해 생성물인 락트산 및 글리콜산을 인체로부터 신속하게 제거할 수 있다. 또한, 상기 중합체의 분해성은 그의 분자량 및 조성에 따라 수개월에서부터 수년으로 조정될 수 있다 (문헌 [Lewis, "Controlled release of bioactive agents from lactide/glycolide polymer," in: M. Chasin and R. Langer (Eds.), Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems (Marcel Dekker: New York, 1990), pp. 1-41].

조성물 (예컨대, 제약 조성물)을 투여 설명서와 함께 키트, 용기, 팩, 또는 분배기에 포함시킬 수 있다. 키트로서 공급될 경우, 조성물의 상이한 성분이 별개의 용기에 패킹될 수 있고, 사용 직전에 혼합될 수 있다. 상기와 같이 성분들을 따로따로 패킹함에 따라 활성 성분의 기능 상실 없이 장기간 보관이 가능하다. 키트는 또한 특정 검사, 예컨대, 진단 검사 또는 조직형 검사가 용이하게 수행될 수 있도록 하는 시약을 별개의 용기에 포함할 수 있다.

키트에 포함된 시약은, 상이한 성분의 수명이 보존되고, 그 성분이 용기 물질에 의해 흡수되거나, 변경되지 않도록 하기 위해 임의 종류의 용기 안에 담긴 채로 공급될 수 있다. 예를 들어, 밀봉된 유리 앰플은 중성, 비-반응 기체, 예컨대, 질소하에 패킹된 동결건조된 조절제 물질/분자 및/또는 완충제를 함유할 수 있다. 앰플은 임의의 적합한 물질, 예컨대, 유리, 유기 중합체, 예컨대, 폴리카르보네이트, 폴리스티렌 등, 세라믹, 금속 또는 전형적으로 시약을 수용하는 데 사용되는 임의의 다른 물질로 구성될 수 있다. 적합한 용기에 관한 다른 예로는 앰플과 같은 유사 물질로부터 제작될 수 있는 간이 병, 및 예컨대, 알루미늄 또는 합금같이 호일로 라이닝된 내부로 구성될 수 있는 인벨럽을 포함한다. 다른 용기로는 시험관, 바이알, 플라스크, 병, 시린지 등을 포함한다. 예컨대, 피하 주사용 바늘에 의해 관통될 수 있는 마개가 있는 병과 같이, 용기는 멸균 접근 포트를 가질 수 있다. 다른 용기는, 제거시 성분들이 혼합될 수 있도록 하는 것인, 쉽게 제거가능한 막에 의해 분리되어 있는 2개의 구획을 가질 수 있다. 제거가능한 막은 유리, 플라스틱, 고무 등일 수 있다.

키트는 또한 설명서와 함께 공급될 수 있다. 설명서는 종이 또는 다른 기판 상에 프린팅될 수 있고/거나, 전자-판독형 매체, 예컨대, 플로피 디스크, CD-ROM, DVD-ROM, 집 디스크, 비디오 테이프, 레이저 디스크, 오디오 테이프 등으로서 공급될 수 있다. 상세한 설명이 키트와 물리적으로 관련이 없을 수도 있다; 대신, 사용자는 키트 제조사 또는 배급처에 의해 명시된 인터넷 웹으로 안내될 수 있거나, 또는 전자 메일로서 공급받을 수 있다.

본 출원의 또 다른 실시양태에서, 상기 기술된 장애를 치료하는 데 유용한 물질을 함유하는 제조물품을 제공한다. 제조물품은 용기 및 라벨을 포함한다. 적합한 용기는 예를 들어, 병, 바이알, 시린지, 및 시험관을 포함한다. 용기는 다양한 물질, 예컨대, 유리 또는 플라스틱으로부터 형성될 수 있다. 용기는 상기 병증을 치료하는 데 효과적인 조성물을 수용하고, 멸균 접근 포트를 가질 수 있다 (예를 들어, 용기는 정맥내 투여용 용액 백 또는 피하 주사용 바늘에 의해 관통이 가능한 마개가 있는 바이알일 수 있다). 조성물 중 활성제는 항체이다. 용기상의, 또는 용기에 결합되어 있는 라벨은 조성물이 선택되는 병증을 치료하는 데 사용된다고 명시한다. 제조물품은 제약상 허용되는 완충제, 예컨대, 포스페이트 완충처리된 염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2 용기를 추가로 포함할 수 있다. 이는 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘, 시린지를 비롯한, 상업적 관점 및 사용자 견지에서 바람직할 수 있는 물질, 및 사용 설명서를 포함하는 패키지 인서트를 추가로 포함할 수 있다.

하기 실시예는 본 출원의 바람직한 실시양태를 입증하고자 포함하는 것이다. 하기 본 실시예에 개시된 기법은 본 출원을 실시하는 데 기능을 잘 발휘하는 것으로서 본 발명자들에 의해 발견된 기법을 나타내며, 따라서, 이는 본 출원의 실시를 위해 바람직한 모드를 구성하는 것으로 간주될 수 있다는 것을 당업자는 이해하여야 한다. 그러나, 당업자는 본 개시내용을 고려하여, 개시된 구체적인 실시양태는 다수 변형될 수 있고, 이를 통해서도 여전히 본 출원의 정신 및 범주로부터 벗어나지 않는 비슷하거나 유사한 결과를 수득할 수 있다는 것을 이해하여야 한다.

실시예

실시예 1. 항- 모에신 항체의 제조

종래의 하이브리도마 방법을 사용하여 모에신의 C-말단 테일 도메인에 대한 모노클로날 항체를 제조하였다. 서열 번호 1의 서열을 가지는 C-말단 도메인을 생성하기 위해, PCR을 사용하여 상기 기술된 바와 같이 C-말단 테일 도메인에 상응하는 cDNA 단편 (도 1에 제시되어 있는 서열 번호 4 참조, 여기서, 밑줄로 표시된 부분은 C-말단 테일 도메인의 cDNA 서열이다)을 증폭시켰다.

PCR-증폭된 모에신 cDNA 단편을 pET32a(+) 및 pET28a(+)로부터 선택된 발현 벡터로 클로닝하였다. 이어서, 배양 및 발현을 위해 구축된 벡터를 사용하여 E. 콜라이 숙주 세포주 BL21(DE3)을 형질전환시켰다. pET32a(+) 및 pET28a(+)의 제한 및 클로닝 지도는 각각 도 2a 및 2b에 제시되어 있다. 제한 효소 분해를 이용하여 C-말단 도메인에 대한 구축된 발현 시스템을 확인한 후, 서열 분석함으로써 C-말단 도메인의 발현을 위해 올바른 리딩 프레임을 확인하였다.

충분히 배양시킨 후, C-말단 도메인의 수집 및 정제를 위해 발현된 C-말단 도메인을 가진 숙주 세포를 표준 단백질 발현 프로토콜에 따라 수거하였다. SDS-PAGE로 생성된 단백질 단편을 검정하여 그의 아이덴티티 및 순도를 확인하였다.

이어서, BALB/C 마우스를 사용하여 하이브리도마 방법에 따라, 발현된 C-말단 도메인을 사용하여 모에신의 C-말단 테일 도메인에 대한 모노클로날 항체를 제조하였다.

하이브리도마 방법은 최초로 문헌 [Kohler and Milstein, Nature, 256:495 (1975)] (상기 문헌은 그 전문이 본 출원에 참고로 포함된다)에 기술되었다. 전형적인 하이브리도마 방법에서, 마우스 (예컨대, BALB/C 마우스)를 항원 (예컨대 C-말단 도메인)으로 면역화시킨 후, 면역화된 마우스로부터의 비장 세포를 골수종 세포와 융합시켰다. 하이브리도마의 성장을 선택적으로 허용하는 배지 중에서 융합된 세포를 수거하고, 생존가능한 하이브리도마 콜로니를 성장시켰다. 충분한 시간이 경과한 후, ELISA 검사 및 항원 (예컨대, C-말단 도메인)을 사용한 면역조직화학적 검정법에 의해 상청액을 스크리닝하였다. 추가의 서브클로닝을 위해 양성 세포를 선별하였다. 선별된 클론을 제한 희석법에 의해 서브클로닝시켰다. 모든 클론이 ELISA-양성이 될 때까지 서브클로닝을 수행하였다. 이어서, 양성 클론을 선별함으로써 항원에 대한 모노클로날 항체를 생성하는 하이브리도마를 수득하였다.

전장의 모에신 단백질에 대한 항체를 벡톤 디킨슨 앤드 컴퍼니(Becton, Dickinson and Company)로부터 상업적으로 입수하였는데, 이는 또한 C-말단 도메인 대신 전장의 모에신 단백질을 사용함으로써 상기 기술된 바와 같은 하이브리도마 방법에 따라 제조될 수도 있다.

실시예 2. 세포 증식을 억제시킬 수 있는 모에신 억제제의 능력에 관한 평가

본 실험을 사용하여 세포 증식을 억제 또는 감소시킬 수 있는 모에신 억제제의 능력에 관하여 평가하였다.

인간 폐 미세혈관 내피 세포주 (HPMEC)를 사용하여 세포 증식 검정법을 수행하였다. 세포를 10⁶개의 세포/㎠로 6웰 플레이트 상의 각 웰에 플레이팅시키고, 하기 기술하는 다양한 시험 시약 및 대조군 시약의 존재하에 실온에서 배양하였다. 결정된 기간 동안 배양한 후, 세포를 수집하고, 유세포 측정 분석법을 위해 표지하였다. 시험군으로부터의 평균 OD₅₇₀ 값을, 세포 배양 시작시에 시험군과 동일한 개수의 개수를 가지는 군으로부터의 평균 OD₅₇₀ 값으로 나누어 2 hrs, 24 hrs 및 36 hrs째의 증식률을 측정하였다.

시험군 및 대조군은 하기와 같았다:

1) TNF-알파 단독;

2) 전장의 모에신 단백질에 대한 항체 (항-모에신);

3) 오직 C-말단 테일 도메인에만 대한 항체 (항-M3);

4) TNF-알파 + 항-모에신;

5) TNF-알파 + 항-M3;

6) PBS 용액 (음성 대조군)

배양 후 얻은 생성된 세포 및 상청액에 대해 세포 형태 분석, 웨스턴 블롯 뿐만 아니라, 유세포 분석법 및 면역형광 검정법을 수행하였다. 다양한 작용제, 특히, 항-M3의 효과를 조사하고, 그의 특징을 규명하였다. 결과는 도 3에 제시되어 있다. 세포의 증식률은 세포 배양 후 약 24시간째부터 하락하기 시작하였다. 음성 대조군 (6군)과 비교하였을 때, 항-모에신 및 항-M3 처리는 세포 증식률을 감소시켰고, TNF-알파와 조합하여 항-모에신 및 항-M3으로 처리하였을 때에는 한층 더 실질적으로 세포 증식률을 감소시켰다. TNF-알파만으로 처리하였을 때에는 세포 증식률을 감소시키기는 하였지만, 항-모에신 또는 항-M3과 함께 조합하였을 때 만큼은 아니었다. 본 결과는 항-모에신 및 항-M3이 세포 증식을 억제시킬 수 있다는 것을 시사한다.

실시예 3. 모에신의 세포내 발현 및 아폽토시스 분석

실시예 1에 기술된 바와 같이 항-모에신 항체의 존재하에서 세포 배양물에 대해 아폽토시스 검정법 뿐만 아니라, 표면 항원 검정법을 수행함으로써 항체가 내피 세포 아폽토시스를 촉진시키는 것에 관한 효과 및 (활성 형태의 단백질을 나타내는) 모에신의 세포내 발현에 미치는 효과를 평가하였다.

아넥신 V 검정법을 사용하여 아폽토시스에 관해 연구하였다. 수집된 세포를 PBS로 세척하고, 원심분리하고, 순차적으로 70% 에탄올, RNA (200 mg/ℓ) 및 PI (20 mg/ℓ)를 첨가하였다. 이어서, 생존가능한 세포는 FITC 및 PI 둘 모두에 대해 음성인 반면, 조기 아폽토시스에 있는 세포는 FITC에 대해서는 양성이지만, PI에 대해서는 음성이고, 후기 아폽토시스에 있거나, 이미 사멸 상태인 세포는 FITC 및 PI 둘 모두에 대해 양성이기 때문에, FITC 및 PI의 이중 염색을 위해 아넥신-V FITC/PI 키트를 이용하여 세포를 염색시켰다. 유세포 분석기를 이용하여 염색된 세포를 이형 시험 작용제의 존재하의 아폽토시스성 세포의 양에 관하여 분석하였다. 시험군 및 대조군으로 처리한 이후의, 조기 아폽토시스에 있는 세포의 비율(%) 및 후기 아폽토시스에 있거나, 이미 사멸 상태인 세포의 비율(%)을 측정하였고, 그 결과는 각각 도 4a 및 도 4b에 제시되어 있다. 그 결과, 항-모에신으로 처리하였을 때에는 조기 아폽토시스에 있는 세포의 비율(%) 및 후기 아폽토시스에 있거나, 이미 사멸 상태인 세포의 비율(%)이 약간 증가한 것으로 나타났다. TNF-알파는 항-모에신 및 항-M3의 아폽토시스-유도 효과를 실질적으로 증진시킬 수 있었다. TNF-알파 단독으로는 세포 아폽토시스를 유도할 수는 있었지만, 그 효과는 항-모에신 또는 항-M3과 함께 조합하였을 때 만큼은 아니었다.

면역형광 검정법을 사용하여 모에신의 세포 표면 발현을 검출하였다. HPMEC 세포를 0.05% 트립신/0.02% EDTA로 처리한 후, 항-모에신 항체를 첨가하고, 형광-표지된 2차 항체를 첨가하기 전에 세포를 배양하였다. 형광 현미경하에서 세포 표면 상의 모에신 존재에 관하여 세포를 연구하였다. 항-모에신 항체가 없는 세포 배양물은 음성 대조군으로서 사용하였다.

상기 검정법의 결과를 통해, 항-모에신 항체가 없을 때에는 어떤 세포 표면 모에신도 검출될 수 없는 것으로 나타났다. 웨스턴 블롯시, 어느 상청액에서도 모에신은 전혀 검출되지 않았다. 항-모에신 항체는 존재하지만, 자극 인자 TNF-알파가 없을 때에는, 세포골격에 대해서는 어떤 뚜렷한 변화도 없었고, 아폽토시스에 있어서도 어떤 유의적인 증가도 없었다. 그러나, TNF-알파 첨가 후, 대조군과 비교하였을 때, 아폽토시스 및 세포 표면 모에신 둘 모두 증가하였다.

실시예 4. 모에신 억제제가 세포의 형태학적 변화에 미치는 영향에 관한 관찰

실시예 1에 기술된 바와 같은 다양한 시험 작용제의 존재하에 세포를 형태학적 변화에 관하여 현미경하에서 연구하였다.

세포골격 형태:

대조군인 6군에서, 정의된 세포 가장자리는 규칙적인 패턴을 띠고, 핵 크기는 정상적인 것과 같이, 세포골격 구조는 정상적으로 나타났다.

반면, 오직 항-모에신 항체만 (2군: 항-모에신만, 및 3군: 항-M3만)을 첨가한 군에서, 세포는 처음에는 정상적으로 나타났지만, 단지 36시간의 인큐베이션 이후에는 부분적으로 파괴된 F-액틴 구조 및 불규칙적인 가장자리가 관찰되었다. 핵에는 어떤 뚜렷한 변화는 없었다.

2군과 유사하게, 오직 TNF-알파만의 군 (1군)에서도 36 hrs째까지는 구조상의 어떤 뚜렷한 변화도 없었지만, 36 hrs째에는 F-액틴 구조의 부분적인 파괴가 관찰되었다. 핵에는 어떤 뚜렷한 변화는 없었다.

그러나, TNF-알파 및 항-모에신 항체 둘 모두로 처리된 군에서는 24시간 후 세포골격이 붕괴되었고, F-액틴이 세포질 전역에 확산됨으로써 비-극성 액틴 필라멘트로 이루어진 섬유 다발이 형성되었다. 36시간째, 핵 응축을 관찰할 수 있었는데, 이는 아폽토시스 과정을 나타내는 것이다.

미세융모 형태

정상적인 HPMEC는 도 5a에 제시되어 있는 바와 같이, 표면 상에 활면의, 실린더 형상의, 규칙적으로 패턴화된 미세융모를 가진다. TNF-알파 (1군)로 처리한 후 36시간이 경과하였을 때, 도 5b에 제시되어 있는 바와 같이, 상기 미세융모의 크기는 더 작아지고, 조밀도는 더 낮아진 것으로 나타났다. TNF-알파 + 항-모에신 항체 (4군 및 5군)로 처리한 후 36시간이 경과하였을 때, 도 5c에 제시되어 있는 바와 같이, HPMEC 표면 상의 미세융모는 유의적으로 감소하였거나, 심지어는 완전하게 소실된 것으로 나타났다.

본 발명자들의 결과를 통해, 모에신 억제제로서의 항-모에신 항체는 세포 구조를 파괴시킬 수 있고, 심지어는 세포를 사멸시킬 수 있다는 것이 제안되었다. 그러나, 이러한 효과는 염증성 인자, 예컨대, TNF-알파의 부재하에서는 제한적인 것으로 나타났다. 그러나, TNF-알파의 존재하에서 세포에 대한 상기와 같은 손상 효과는 유의적으로 증강된 것으로 나타났다.

SEQUENCE LISTING <110> Shanghai Kexin Biotech Co. Ltd. <120> MOESIN MODULATORS AND USES THEREOF <130> 034569-8002WO02 <160> 4 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> C-terminal tail domain of human moesin <400> 1 His Val Ala Glu Pro Ala Glu Asn Glu Gln Asp Glu Gln Asp Glu Asn 1 5 10 15 Gly Ala Glu Ala Ser Ala Asp Leu Arg Ala Asp Ala Met Ala Lys Asp 20 25 30 Arg Ser Glu Glu Glu Arg Thr Thr Glu Ala Glu Lys Asn Glu Arg Val 35 40 45 Gln Lys His Leu Lys Ala Leu Thr Ser Glu Leu Ala Asn Ala Arg Asp 50 55 60 Glu Ser Lys Lys Thr Ala Asn Asp Met Ile His Ala Glu Asn Met Arg 65 70 75 80 Leu Gly Arg Asp Lys Tyr Lys Thr Leu Arg Gln Ile Arg Gln Gly Asn 85 90 95 Thr Lys Gln Arg Ile Asp Glu Phe Glu Ser Met 100 105 <210> 2 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Amino acid residues surrounding the Thr558 site <400> 2 Gly Arg Asp Lys Tyr Lys Thr Leu Arg Gln Ile Arg Gln 1 5 10 <210> 3 <211> 577 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> The full length human moesin protein <400> 3 Met Pro Lys Thr Ile Ser Val Arg Val Thr Thr Met Asp Ala Glu Leu 1 5 10 15 Glu Phe Ala Ile Gln Pro Asn Thr Thr Gly Lys Gln Leu Phe Asp Gln 20 25 30 Val Val Lys Thr Ile Gly Leu Arg Glu Val Trp Phe Phe Gly Leu Gln 35 40 45 Tyr Gln Asp Thr Lys Gly Phe Ser Thr Trp Leu Lys Leu Asn Lys Lys 50 55 60 Val Thr Ala Gln Asp Val Arg Lys Glu Ser Pro Leu Leu Phe Lys Phe 65 70 75 80 Arg Ala Lys Phe Tyr Pro Glu Asp Val Ser Glu Glu Leu Ile Gln Asp 85 90 95 Ile Thr Gln Arg Leu Phe Phe Leu Gln Val Lys Glu Gly Ile Leu Asn 100 105 110 Asp Asp Ile Tyr Cys Pro Pro Glu Thr Ala Val Leu Leu Ala Ser Tyr 115 120 125 Ala Val Gln Ser Lys Tyr Gly Asp Phe Asn Lys Glu Val His Lys Ser 130 135 140 Gly Tyr Leu Ala Gly Asp Lys Leu Leu Pro Gln Arg Val Leu Glu Gln 145 150 155 160 His Lys Leu Asn Lys Asp Gln Trp Glu Glu Arg Ile Gln Val Trp His 165 170 175 Glu Glu His Arg Gly Met Leu Arg Glu Asp Ala Val Leu Glu Tyr Leu 180 185 190 Lys Ile Ala Gln Asp Leu Glu Met Tyr Gly Val Asn Tyr Phe Ser Ile 195 200 205 Lys Asn Lys Lys Gly Ser Glu Leu Trp Leu Gly Val Asp Ala Leu Gly 210 215 220 Leu Asn Ile Tyr Glu Gln Asn Asp Arg Leu Thr Pro Lys Ile Gly Phe 225 230 235 240 Pro Trp Ser Glu Ile Arg Asn Ile Ser Phe Asn Asp Lys Lys Phe Val 245 250 255 Ile Lys Pro Ile Asp Lys Lys Ala Pro Asp Phe Val Phe Tyr Ala Pro 260 265 270 Arg Leu Arg Ile Asn Lys Arg Ile Leu Ala Leu Cys Met Gly Asn His 275 280 285 Glu Leu Tyr Met Arg Arg Arg Lys Pro Asp Thr Ile Glu Val Gln Gln 290 295 300 Met Lys Ala Gln Ala Arg Glu Glu Lys His Gln Lys Gln Met Glu Arg 305 310 315 320 Ala Met Leu Glu Asn Glu Lys Lys Lys Arg Glu Met Ala Glu Lys Glu 325 330 335 Lys Glu Lys Ile Glu Arg Glu Lys Glu Glu Leu Met Glu Arg Leu Lys 340 345 350 Gln Ile Glu Glu Gln Thr Lys Lys Ala Gln Gln Glu Leu Glu Glu Gln 355 360 365 Thr Arg Arg Ala Leu Glu Leu Glu Gln Glu Arg Lys Arg Ala Gln Ser 370 375 380 Glu Ala Glu Lys Leu Ala Lys Glu Arg Gln Glu Ala Glu Glu Ala Lys 385 390 395 400 Glu Ala Leu Leu Gln Ala Ser Arg Asp Gln Lys Lys Thr Gln Glu Gln 405 410 415 Leu Ala Leu Glu Met Ala Glu Leu Thr Ala Arg Ile Ser Gln Leu Glu 420 425 430 Met Ala Arg Gln Lys Lys Glu Ser Glu Ala Val Glu Trp Gln Gln Lys 435 440 445 Ala Gln Met Val Gln Glu Asp Leu Glu Lys Thr Arg Ala Glu Leu Lys 450 455 460 Thr Ala Met Ser Thr Pro His Val Ala Glu Pro Ala Glu Asn Glu Gln 465 470 475 480 Asp Glu Gln Asp Glu Asn Gly Ala Glu Ala Ser Ala Asp Leu Arg Ala 485 490 495 Asp Ala Met Ala Lys Asp Arg Ser Glu Glu Glu Arg Thr Thr Glu Ala 500 505 510 Glu Lys Asn Glu Arg Val Gln Lys His Leu Lys Ala Leu Thr Ser Glu 515 520 525 Leu Ala Asn Ala Arg Asp Glu Ser Lys Lys Thr Ala Asn Asp Met Ile 530 535 540 His Ala Glu Asn Met Arg Leu Gly Arg Asp Lys Tyr Lys Thr Leu Arg 545 550 555 560 Gln Ile Arg Gln Gly Asn Thr Lys Gln Arg Ile Asp Glu Phe Glu Ser 565 570 575 Met <210> 4 <211> 1734 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> cDNA Sequence encoding for the Full Length Human Moesin Protein <400> 4 atgcccaaaa cgatcagtgt gcgtgtgacc accatggatg cagagctgga gtttgccatc 60 cagcccaaca ccaccgggaa gcagctattt gaccaggtgg tgaaaactat tggcttgagg 120 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aaaatgagaa gaagaagcgt gaaatggcag agaaggagaa agagaagatt 1020 gaacgggaga aggaggagct gatggagagg ctgaagcaga tcgaggaaca gactaagaag 1080 gctcagcaag aactggaaga acagacccgt agggctctgg aacttgagca ggaacggaag 1140 cgtgcccaga gcgaggctga aaagctggcc aaggagcgtc aagaagctga agaggccaag 1200 gaggccttgc tgcaggcctc ccgggaccag aaaaagactc aggaacagct ggccttggaa 1260 atggcagagc tgacagctcg aatctcccag ctggagatgg cccgacagaa gaaggagagt 1320 gaggctgtgg agtggcagca gaaggcccag atggtacagg aagacttgga gaagacccgt 1380 gctgagctga agactgccat gagtacacct catgtggcag agcctgctga gaatgagcag 1440 gatgagcagg atgagaatgg ggcagaggct agtgctgacc tacgggctga tgctatggcc 1500 aaggaccgca gtgaggagga acgtaccact gaggcagaga agaatgagcg tgtgcagaag 1560 cacctgaagg ccctcacttc ggagctggcc aatgccagag atgagtccaa gaagactgcc 1620 aatgacatga tccatgctga gaacatgcga ctgggccgag acaaatacaa gaccctgcgc 1680 cagatccggc agggcaacac caagcagcgc attgacgaat ttgagtctat gtaa 1734

Claims

인간 모에신의 활성화를 억제시킬 수 있는 모에신 억제제 및 제2 치료제를 포함하며, 여기서 상기 모에신 억제제는 서열 번호 1의 서열을 갖는 인간 모에신의 C-말단 테일 도메인에 결합하는 단리된 항체이며, 제2 치료제는 TNF-알파인, 대상체에서 암, 세포 증식으로 인한 폐 동맥 고혈압 또는 기관의 섬유증인 모에신의 비정상적인 활성화와 관련된 장애 또는 병리학적 병증을 치료하기 위한 제약 조성물.
제1항에 있어서, 기관의 섬유증이 폐 섬유증, 낭성 섬유증, 경화증, 심내막 섬유증, 골수섬유증, 후복막 섬유증, 크론병, 켈로이드, 전신 경화증 또는 진행성 괴상 섬유증인 제약 조성물.
제1항에 있어서, 모에신 억제제가 상피 또는 내피 세포의 증식을 억제시키는 것인 제약 조성물.
제1항에 있어서, 모에신 억제제가 상피 또는 내피 세포의 아폽토시스를 촉진시키는 것인 제약 조성물.
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