ES2371335T3 - Identificación y modificación de epítopos inmunodominantes en polipéptidos. - Google Patents

Abstract

Método de modificación de un polipéptido terapéutico, que comprende: (a) identificar por lo menos un epítopo inmunodominante en el polipéptido utilizando un anticuerpo o población de anticuerpos obtenidos de un humano sin tratar o animal sin tratar o una población de los mismos, donde el polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a la secuencia nativa de un homólogo de polipéptido endógeno en el mismo humano o la misma especie de animal o un fragmento biológicamente activo del polipéptido endógeno, donde el anticuerpo o anticuerpos no inhiben sustancialmente una actividad terapéutica del polipéptido; y el epítopo inmunodominante no se localiza en una región del polipéptido que proporciona una actividad terapéutica del polipéptido; y (b) modificar el epítopo inmunodominante para reducir una respuesta inmune al polipéptido a la vez que mantiene una actividad terapéutica sustancial del polipéptido.

Description

Identificación y modificación de epítopos inmunodominantes en polipéptidos

Antecedentes de la invención

[0001] Para tratar enfermedades en humanos se utiliza un conjunto de polipéptidos de diferentes orígenes. Si el polipéptido deriva de una fuente heteróloga o no propia, los pacientes desarrollan fácilmente una respuesta inmune al polipéptido. De hecho, en muchos casos, una respuesta inmune al polipéptido es un resultado terapéutico deseado. Sin embargo, existen situaciones en las que una respuesta inmune a un polipéptido destinado al uso terapéutico es indeseable y podría ser muy perjudicial. Por ejemplo, los polipéptidos destinados al uso terapéutico también incluyen polipéptidos que tienen homólogos endógenos o “propios”. Se cree en general que una respuesta inmune no se genera para polipéptidos propios o endógenos, a excepción del caso de enfermedades autoinmunes. Si se generara una respuesta inmune después de la administración de dichos polipéptidos, podrían resultar en consecuencias adversas incluyendo el desarrollo de una respuesta autoinmune.

[0002] Muchos factores contribuyen a respuestas inmune a polipéptidos. La presencia de epítopos inmunodominantes en un polipéptido es uno de los factores claves en las respuestas a anticuerpos. Un epítopo inmunodominante es un epítopo que provoca y une más frecuentemente a anticuerpos en una población humana o animal cuando se compara con otros epítopos. Los epítopos inmunodominantes en polipéptidos se identifican habitualmente después de la administración del polipéptido al humano o animal.

[0003] Los epítopos inmunodominantes se han localizado en proteínas utilizando anticuerpos de animales tratados. Por ejemplo, la estafiloquinasa es un polipéptido bacteriano derivado de Staphylococcus aureus y se utiliza para tratar el infarto de miocardio. Dado que la estafiloquinasa es un polipéptido heterólogo o no propio cuando se administra humanos, los pacientes tratados desarrollan fácilmente una respuesta inmune a este polipéptido. Esta respuesta inmune puede dar lugar a reacciones adversas a un tratamiento terapéutico posterior con el polipéptido. Tal como se ha descrito en la Patente de Estados Unidos No. 5,951,980, los epítopos inmunodominantes identificados utilizando anticuerpos de pacientes tratados se pueden modificar para reducir la inmunogenicidad del polipéptido.

[0004] En algunos casos, los epítopos inmunodominantes en polipéptidos heterólogos se han enmascarado o modificado para desplazar la respuesta inmune a otros epítopos en el polipéptido. Tal como se ha descrito en la PCT 99/38978, los pacientes que muestran respuestas de anticuerpo a los epítopos IgO e IgE en alérgenos de orígenes heterólogos, tales como cacahuetes, látex y proteínas de los alimentos. Una vez se identifica un epítopo IgE utilizando los anticuerpos del paciente, el epítopo IgE se puede modificar o enmascarar para desplazar la respuesta inmune del epítopo IgE a otros epítopos en el alérgeno. De manera similar, la respuesta inmune a los epítopos inmunodominantes en patógenos, tales como VIH, se puede desplazar a otros epítopos en los patógenos mediante la modificación o enmascaramiento de los epítopos tal como se describe en la Patente de Estados Unidos No. 5,853,724. Una respuesta inmune a estos polipéptidos es aún un resultado deseado.

[0005] Los epítopos inmunodominantes también se han identificado en algunas proteínas endógenas o propias asociadas con una enfermedad autoinmune. La tiroide peroxidasa es una molécula endógena asociada con una enfermedad autoinmune de tiroides. Para una revisión, véase, McIntosh, R.S. et al, Thyroid 7:471 (1997). Se han localizado las regiones inmunodominantes en la tiroide peroxidada utilizando anticuerpos de pacientes con una enfermedad autoinmune. Véase, Hobby, P. et al, Endocrinology 141:2018 (2000) y Nishikawa, et al, Endocrinology 137:1000 (1996). Se ha utilizado la localización de estos epítopos para estudiar los factores que podrían contribuir al desarrollo de una enfermedad autoinmune. Véase, Jaume, J.C. et al, J. Clinical Endocrinology 84: 1424 (1999). Los factores que hace que los propios polipéptidos o los endógenos sean inmunogénicos en una enfermedad autoinmune son complejos y no están bien entendidos. Lubin et al. (1997) J. Biol. Chem 272 (48): 30191-5 describe un análisis del epítopo del inhibidor A2 del factor VIII humano mediante mutagénesis de rastreo con alanina.

[0006] Un ejemplo de un polipéptido recombinante humano utilizado terapéuticamente es la trombopoyetina humana (TPO). Una TPO recombinante tiene una secuencia que es idéntica a una trombopoyetina humana y es producida en células CHO. La TPO es un factor de crecimiento hematopoyético endógeno que estimula la proliferación y maduración de megacariocitos y la producción de plaquetas. Una TPO humana recombinante está formada de 332 aminoácidos unidos en una única cadena de polipéptido. Aproximadamente en la mitad de la molécula, existe un sitio dibásico de arginina 153 y arginina 154 que dividen la molécula en un epítopo n-terminal y c-terminal. El epítopo n-terminal se denomina el epítopo de EPO por su similitud con la eritropoyetina o también se denomina TPO truncada. El epítopo n-terminal contiene sitios de unión a receptor y representa la parte biológicamente activa de la molécula. El epítopo c-terminal está ampliamente glicosilado.

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[0007] Las causas principales de la trombocitopenia en pacientes son la producción alterada de plaquetas por la médula ósea, el secuestro de plaquetas en el bazo y la destrucción de plaquetas por las respuestas autoinmunes. La TPO recombinante estimula la producción de plaquetas y está destinada al tratamiento de la trombocitopenia en pacientes que están bajo quimioterapia. Se sabe que los ciclos repetidos de radiación y quimioterapia dan lugar a la mielosupresión que limita la intensidad de la dosis de agentes quimioterapéuticos. La administración de trombopoyetina, especialmente trombopoyetina recombinante, ha dado lugar a una tolerancia mejorada de los pacientes a la quimioterapia, tal como se describe en WO 98/52598.

[0008] Sin embargo, si la administración de TPO recombinantes u otros polipéptidos terapéuticos puede dar lugar a una respuesta inmune, los pacientes pueden ser resistentes al tratamiento o pueden desarrollar otras consecuencias adversas. De este modo, existe la necesidad de identificar epítopos inmunodominantes en polipéptidos destinados al uso terapéutico antes de la administración a pacientes y modificar los polipéptidos para reducir la respuesta inmune al polipéptido.

Descripción resumida de la invención

[0009] Un objetivo de la presente invención es desarrollar métodos de cribado de polipéptidos destinados al uso terapéutico para identificar epítopos inmunodominantes a efectos de reducir la posibilidad de desarrollar una respuesta inmune al polipéptido.

[0010] Otro objeto de la invención es diseñar dichos polipéptidos para modificar los epítopos inmunodominantes a efectos de reducir la respuesta inmune a dichos polipéptidos a la vez que se mantiene una actividad terapéutica sustancial cuando se administran in vivo.

[0011] Estos y otros objetivos serán evidentes en la descripción en las realizaciones de la invención proporcionadas aquí.

[0012] La presente invención se basa en el hallazgo inesperado y sorprendente de que los humanos y animales sin tratar pueden tener anticuerpos preexistentes a un polipéptido destinado al uso terapéutico, tales como polipéptidos recombinantes humanos. También fue sorprendente que los pacientes desarrollan una respuesta de anticuerpo después de la dosificación o administración de estos polipéptidos ya que se creía en general que no se formaría una respuesta inmune a un polipéptido que tenía una secuencia idéntica a la de la proteína endógena o a la propia proteína. Estos hallazgos indicaron la necesidad de cribar polipéptidos destinados al uso terapéutico para identificar epítopos inmunodominantes antes de la administración a pacientes. En un aspecto de la invención, los anticuerpos de pacientes sin tratar con anticuerpos preexistentes al polipéptido se pueden utilizar ventajosamente para identificar epítopos inmunodominantes en polipéptidos antes de administrarse a pacientes. La identificación de epítopos inmunodominantes antes de la aplicación clínica del polipéptido se puede utilizar en el diseño de moléculas menos inmunogénicas.

[0013] La presente invención proporciona métodos tal como se define en las reivindicaciones de modificación de un polipéptido para reducir una respuesta inmune al polipéptido, a la vez que se mantiene una actividad terapéutica sustancial. El método implica identificar por lo menos un epítopo inmunodominante en un polipéptido mediante la utilización de un anticuerpo o población de anticuerpos de una población humana o animal sin tratar y opcionalmente un anticuerpo o población de anticuerpos de una población humana o animal dosificada, y modificar el epítopo para reducir la respuesta inmune al polipéptido, a la vez que se mantiene la actividad terapéutica sustancial. Los polipéptidos modificados son terapéuticamente útiles. Los métodos incluyen un método de fabricación de un polipéptido modificado de manera recombinante mediante la modificación de una secuencia de ácido nucleico para codificar un polipéptido modificado, donde el polipéptido modificado tiene por lo menos un cambio en un epítopo inmunodominante para reducir la respuesta inmune al polipéptido, a la vez que se mantiene una actividad terapéutica sustancial. Se describen composiciones útiles para fabricar polipéptidos modificados incluyendo ácidos nucleicos modificados y células huésped que comprenden los ácidos nucleicos modificados.

[0014] Los epítopos inmunodominantes son aquellos epítopos que se unen más frecuentemente a o son reconocidos por anticuerpos o una población de anticuerpos en una población de humanos o animales cuando se comparan con otros epítopos en el polipéptido. El polipéptido es un polipéptido recombinante destinado al uso terapéutico con una secuencia idéntica a todas o una parte de la secuencia nativa de un polipéptido endógeno. El animal es preferiblemente humano.

[0015] Los epítopos inmunodominantes también se identifican mediante la utilización de métodos de predicción de epítopos en polipéptidos a través de la utilización, por ejemplo, de algoritmos. La predicción de epítopos en

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polipéptidos reduce la cantidad de tiempo y recursos necesarios para identificar epítopos inmunodominantes. Por consiguiente, una realización de la invención implica además proporcionar un grupo de datos del polipéptido, analizar el grupo de datos con un algoritmo para identificar por lo menos un epítopo predicho en el polipéptido y determinar si el epítopo predicho es en realidad un epítopo inmunodominante.

Breve descripción de los dibujos

[0016]

10 La figura 1 muestra la estructura de la TPO humana recombinante de longitud completa (TPO FL) y TPO truncada (TPO TR); los sitios de glicosilación se muestran en la C terminal.

La figura 2 muestra el efecto de la administración de trombopoyetina de rhesus sobre los niveles de plaquetas en monos rhesus normales. Las respuestas de los anticuerpos a TPO de rh también se midieron con el tiempo.

15 La figura 3 muestra el efecto en el recuento de plaquetas de la transferencia pasiva de anticuerpos anti-TPO a ratones CD-1 en el recuento de plaquetas.

La figura 4 muestra la correlación de los niveles de plaquetas después del tratamiento en rhesus con niveles de

20 anticuerpos medidos en los 4 ensayos diferentes. La figura 4A muestra la correlación del recuento de plaquetas en presencia de anticuerpos para TPO de longitud completa; la figura 4B muestra la correlación del recuento de plaquetas con la presencia de anticuerpos para la TPO truncada; la figura 4C muestra la correlación del recuento de plaquetas con la presencia de anticuerpos que bloquean la unión de TPO a su receptor (cmpl); y la figura 4D muestra la correlación del recuento de plaquetas con la presencia de anticuerpos que inhiben la proliferación de

25 células HU3 megacariocíticas.

La figura 5 muestra la unión competitiva del anti-péptido TPO #19 de conejo en presencia de los péptidos de TPO #15, #16, #19, #24 y #28.

30 La figura 6 muestra la unión competitiva de anticuerpos anti-TPO humanos en presencia de concentraciones crecientes de anticuerpos anti-péptido 15 de conejo.

Las figuras 7A y 7B muestran una secuencia de aminoácidos y una secuencia de ácidos nucleicos de TPO humana recombinante publicadas en WO 95/18858. Los residuos de aminoácidos se enumeran por encima de la secuencia

35 partiendo en Ser 1 de la secuencia de la proteína madura.

Descripción detalla da de la realización preferida

Definiciones

40 [0017] Un “epítopo” significa un parte o un sitio en un antígeno, tal como un polipéptido, con la capacidad o potencial de obtener y combinar con un anticuerpo. Los polipéptidos incluyen a menudo más de un epítopo. Para el objetivo de la descripción, un polipéptido epítopo incluirá habitualmente por lo menos 3 aminoácidos, preferiblemente 8 a 50 aminoácidos, y más preferiblemente entre aproximadamente 10-20 aminoácidos en el péptido. No existe un límite

45 superior crítico en la longitud del péptido que podría comprender casi la longitud completa de la secuencia del polipéptido. Los epítopos pueden ser epítopos lineales o conformacionales. Un epítopo lineal está comprendido de un único segmento de una secuencia primaria de una cadena polipeptídica. Los epítopos lineales pueden ser contiguos o solapantes. Los epítopos conformacionales están comprendidos de aminoácidos que se juntan mediante el plegamiento del polipéptido para formar una estructura terciaria y los aminoácidos no están necesariamente

50 adyacentes entre sí en la secuencia lineal.

[0018] "Epítopo inmunodominante" significa un epítopo de un polipéptido que se obtiene o une más frecuentemente a anticuerpos en una población humana o animal en comparación otros epítopos en el polipéptido. Un polipéptido puede tener uno o más epítopos inmunodominantes.

55 [0019] "Específico o especificidad de epítopo" significa la asociación única entre un anticuerpo y su epítopo. La especificidad de epítopo se determina habitualmente utilizando ensayos de unión competitiva, de manera que se detecta la unión mejorada entre un anticuerpo y su epítopo específico en comparación con la menor unión del anticuerpo a otros epítopos.

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[0020] "Respuesta inmune" es el desarrollo en un organismo de una respuesta inmune celular y/o mediada por anticuerpo a un antígeno, tal como un polipéptido. Habitualmente, dicha respuesta incluye, pero sin limitación, una o más de las siguientes: producción de anticuerpos, células B, células T auxiliares, células T supresoras y/o células T citotóxicas. Una respuesta inmune se puede detectar utilizando cualquiera de los diversos ensayos conocidos por los expertos en la materia. “Reducir la respuesta inmune" significa que disminuye la respuesta inmune al polipéptido

o polipéptido modificado. Una respuesta inmune reducida se puede determinar midiendo la capacidad del polipéptido modificado de unirse a un anticuerpo para el polipéptido de un humano o animal o una población de los mismos medida en un test estándar de unión a anticuerpo, tal como ELISA. Si el polipéptido modificado se une al anticuerpo con una afinidad menor (preferiblemente, un descenso de aproximadamente 100 a 1000 veces), se reduce la respuesta inmune al polipéptido. La respuesta inmune reducida también se puede medir mediante otros métodos, tales como determinando si se forma una respuesta de anticuerpo con una afinidad sustancialmente menor al polipéptido modificado tras la administración a un animal.

[0021] "Inmunogenicidad" es la capacidad de un antígeno para estimular una respuesta inmune.

[0022] "Sin tratar", cuando se utiliza conjuntamente con humano o animal o población de los mismos, significa un humano o animal o una población de los mismos a los que no se ha realizado una administración o tratamiento previo conocidos con el polipéptido.

[0023] "Terapéutico", cuando se utiliza conjuntamente con un polipéptido, significa un polipéptido destinado al uso terapéutico, incluyendo la prevención (profilaxis), tratamiento, moderación, reducción y curado de síntomas de una enfermedad o condición, “Terapéutico”, cuando se utiliza conjuntamente con actividad, significa una actividad biológica de un polipéptido, preferiblemente una actividad biológica que se correlaciona con una actividad terapéutica. La actividad terapéutica, cuando se utiliza conjuntamente con trombopoyetina, significa tener una función efectora in vivo que incluye la unión a c-mpl, la actividad de unión a portador, la transducción de una señal proliferativa, incluyendo la replicación, la función reguladora del ADN, la modulación de la actividad biológica de otras citoquinas, activación o regulación del receptor, y el crecimiento o diferenciación celular.

[0024] "No sustancialmente inhibido", cuando se utiliza conjuntamente con actividad terapéutica, significa que una actividad biológica del polipéptido medida en un ensayo in vitro o in vivo es inhibida preferiblemente en no más de aproximadamente el 40 por ciento, o más preferiblemente, no más de aproximadamente el 10 por ciento cuando se compara con la actividad del control. La inhibición de una actividad biológica de trombopoyetina se puede medir determinando si un anticuerpo a un epítopo inmunodominante inhibe la proliferación de la línea celular de megacariocitos HU3 en presencia de trombopoyetina humana. Preferiblemente, una inhibición de no más del 40 por ciento, más preferiblemente no más del 10 por ciento significa que la actividad no está sustancialmente inhibida.

[0025] "Mantener una actividad terapéutica sustancial", cuando se utiliza conjuntamente con un polipéptido modificado significa que el polipéptido modificado tiene por lo menos una actividad biológica y que la actividad biológica de un polipéptido modificado es preferiblemente aproximadamente del 60% ó más que la del polipéptido no modificado, más preferiblemente aproximadamente el 90% o más que la del polipéptido no modificado cuando se mide en el mismo ensayo. Esta frase también comprende la situación en la que se aumenta la actividad biológica de un polipéptido modificado sobre la del polipéptido de secuencia nativa o no modificado.

[0026] "Endógeno o propio" significa un polipéptido que es natural en un organismo.

[0027] Un polipéptido de “secuencia nativa" significa un polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos del polipéptido derivado de la naturaleza y comprende todas las formas naturales del polipéptido, tales como formas truncadas, formas secretadas, formas variantes y variantes alélicas naturales. Un polipéptido de secuencia nativa se puede obtener de la naturaleza o se puede producir mediante medios recombinantes o sintéticos. En WO 95/18858 se proporciona una secuencia de aminoácidos nativa para trombopoyetina humana.

[0028] "Polipéptido recombinante" significa un polipéptido producido mediante la utilización de técnicas de ADN recombinante. Los polipéptidos recombinantes incluyen aquellos polipéptidos que tienen un homólogo endógeno y están producidos, preferiblemente, en una fuente no humana. Los polipéptidos recombinantes con un homólogo endógeno tienen preferiblemente una secuencia de aminoácidos idéntica a toda o parte de la secuencia nativa. La trombopoyetina (TPO) humana es un polipéptido endógeno de 332 aminoácidos con un peso molecular de aproximadamente 70-80 kd (medido por SDS-PAGE). La trombopoyetina es un compuesto que tiene actividad trombopoyética o es capaz de incrementar el recuento de plaquetas en suero en un animal. La TPO es capaz preferiblemente de incrementar el recuento de plaquetas endógeno en por lo menos un 10% y preferiblemente en un 50%. Una TPO recombinante tiene una secuencia descrita en WO 98/52598 y WO 95/18858 y se puede producir según el método de WO98/5259 en células CHO.

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[0029] "Aislado", cuando se utiliza en combinación con ácido nucleico es una molécula de ácido nucleico que se identifica y separa de por lo menos una molécula de ácido nucleico contaminada con la que se asocia en la fuente natural. En WO 98/52598 se describe una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una secuencia nativa de trombopoyetina humana.

[0030] "Modificado" significa por lo menos un cambio en un epítopo inmunodominante en un polipéptido y/o un ácido nucleico que codifica dicho polipéptido. El cambio en el epítopo inmunodominante reduce una respuesta inmune al polipéptido, especialmente la respuesta del anticuerpo, a la vez que se mantiene una actividad terapéutica sustancial. Los cambios pueden incluir una o más deleciones, adiciones, sustituciones en un epítopo, así como modificaciones químicas en los aminoácidos en un epítopo, tal como glicosilación y pegilación de los aminoácidos.

[0031] "Grupo de datos", cuando se utilizan aquí, significa datos de entrada que caracterizan el polipéptido en un formato útil en un método implementado por ordenador para predecir epítopos en el polipéptido. Se puede obtener un grupo de datos del polipéptido a partir de un conjunto de fuentes, incluyendo la información de la secuencia lineal de todo o una parte del polipéptido y/o los mapas conformacionales de todo o parte del polipéptido. La información de la secuencia lineal del polipéptido está disponible a partir de una base de datos, tal como Genbank, Protein Identification Resource Database, Swissprot y muchas otras. Los epítopos conformacionales se pueden identificar determinando la conformación espacial de aminoácidos mediante por ejemplo, cristalografía de rayos X y resonancia magnética nuclear en 2 dimensiones. La información sobre la estructura secundaria de polipéptidos también está disponible en muchas bases de datos, tales como las bases de datos de Protein Identification Resource y otros. Un grupo de datos del polipéptido puede estar en un número de formatos, incluyendo un formato legible por ordenador y/o en un formato para la propagación de una señal transmisible.

[0032] En el tratamiento de diversas enfermedades se utiliza un número creciente de polipéptido. Algunos de estos polipéptidos son polipéptidos recombinantes con homólogos endógenos, tales como trombopoyetina recombinante humana y hormona de crecimiento recombinante humana. Dado que estos polipéptidos recombinantes presentan a menudo secuencias idénticas a toda o parte de una secuencia nativa de los homólogos endógenos, fue sorprendente hallar que se pueden obtener anticuerpos en pacientes tratados con el polipéptido. En general, se cree que una respuesta inmune no se genera habitualmente para proteínas propias o endógenas. También fue sorprendente hallar que algunos individuos que no presentan una administración o tratamiento previo conocido con el polipéptido presentan anticuerpos preexistentes al polipéptido recombinante. Estos anticuerpos preexistentes se pueden utilizar de manera ventajosa según los métodos de la invención, tal como se definen en las reivindicaciones, para identificar epítopos inmunodominantes en polipéptidos antes de ser administrados a pacientes. Las respuestas inmunes a polipéptidos, especialmente polipéptidos terapéuticos, pueden provocar efectos adversos tras la administración de polipéptidos, tales como respuestas alérgicas, una efectividad terapéutica disminuida del polipéptido y potencial enfermedad autoinmune.

[0033] En un aspecto de la invención, tal como se define en las reivindicaciones, se criban los polipéptidos destinados al uso terapéutico para identificar epítopos inmunodominantes antes de ser administrados a pacientes. Una vez se identifican los epítopos inmunodominantes, se modifican para reducir la respuesta inmune al polipéptido, mientras a la vez se mantiene la actividad terapéutica del polipéptido.

[0034] En una realización de la invención, tal como se define en las reivindicaciones, se identifican epítopos inmunodominantes en polipéptidos utilizando un anticuerpo o población de anticuerpos de una población humana o animal sin tratar y un anticuerpo o población de anticuerpos de una población humana o animal dosificada con el polipéptido. Los epítopos inmunodominantes identificados utilizando ambas fuentes de anticuerpos se seleccionan para la modificación.

1. Métodos de identificación de epítopos inmunodominantes en un polipéptido.

[0035] Los métodos la invención, tal como se definen en las reivindicaciones, incluyen la etapa de identificar epítopos inmunodominantes en un polipéptido, de manera que el epítopo se puede modificar para reducir la respuesta inmune al polipéptido cuando se administra in vivo. Un método implica identificar por lo menos un epítopo inmunodominante en un polipéptido mediante la utilización de un anticuerpo o población de anticuerpos de una población humana o animal sin tratar. Otro método implica identificar un epítopo inmunodominante utilizando un anticuerpo o población de una población humana o animal sin tratar y/o un anticuerpo o población de anticuerpos de una población humana o animal dosificada.

A. Polipéptidos.

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[0036] Los polipéptidos útiles en la invención son aquellos polipéptidos que están destinados al uso terapéutico. Los polipéptidos incluyen polipéptidos heterólogos de una fuente diferente de la especie animal diana destinados al uso terapéutico, y polipéptidos con homólogos endógenos en la misma especie reconocida para el uso terapéutico. Los polipéptidos, ya sean heterólogos o con un homólogo endógeno, se producen preferiblemente en o se obtienen de una célula no humana.

[0037] Los polipéptidos recombinantes se pueden producir en un conjunto de células huésped no humanas, incluyendo células procariotas, de levadura y eucariotas superiores que no son humanas. En la presente invención se describe un conjunto de tipos de células huésped diferentes. Los ejemplos específicos incluyen E. coli, células CHO, y Sacchromyces cerevisiae.

[0038] Los polipéptidos preferidos son polipéptidos recombinantes que tienen un homólogo endógeno en un humano, tal como trombopoyetina recombinante humana. Los polipéptidos preferiblemente tienen una secuencia homóloga a, o preferiblemente idéntica a toda o una parte de una secuencia nativa del polipéptido endógeno. Un polipéptido que tiene una secuencia que es homóloga a toda o una parte de una secuencia nativa es un polipéptido biológicamente activo que preferiblemente tiene por lo menos aproximadamente un 80% de identidad en la secuencia, más preferiblemente por lo menos aproximadamente un 95% de identidad en la secuencia de aminoácidos, más preferiblemente por lo menos aproximadamente un 96% de identidad en la secuencia de aminoácidos, más preferiblemente por lo menos aproximadamente un 97% de identidad en la secuencia de aminoácidos, más preferiblemente por lo menos aproximadamente un 98% de identidad en la secuencia de aminoácidos, y lo más preferiblemente por lo menos aproximadamente un 99% de identidad en la secuencia de aminoácidos con un polipéptido de secuencia nativa de longitud completa, un polipéptido de secuencia nativa que carece de un péptido señal, un dominio extracelular del polipéptido o cualquier otro fragmento de la secuencia nativa de longitud completa.

[0039] Los polipéptidos son preferiblemente aquellos destinados para el uso en el tratamiento del cáncer y/o en pacientes que están bajo quimioterapia o tratamiento por radiación, en el tratamiento de infecciones virales, trastornos metabólicos y trastornos del crecimiento. Los polipéptidos útiles en dichos tratamientos incluyen citoquinas, anticuerpos (incluyendo anticuerpos humanos y anticuerpos humanizados), receptores incluyendo fragmentos de receptores solubles, enzimas y factores de crecimiento.

[0040] Entre las citoquinas y factores de crecimiento se incluyen la hormona del crecimiento, hormona del crecimiento bovina, factores de crecimiento de tipo insulina, hormona del crecimiento humano que incluye hormona del crecimiento humano con n-metionilo, hormona paratiroide, tiroxina, insulina, proinsulina, amilina, relaxina, prorelaxina, hormonas de glicoproteínas, tales como hormona estimulante de folículos (FSH), hormona leutinizante (LH), factor de crecimiento hematopoyético, factor de crecimiento de fibroblastos, prolactina, lactógeno de placenta, factores de necrosis tumoral, sustancia inhibidora muleriana, polipéptido asociado a gonadotropina de ratón, inhibina, activina, factores de crecimiento endotelial vascular, integrina, factores de crecimiento nervioso, tales como NGF-beta, factor de crecimiento I y II de tipo insulina, eritropoyetina, factores osteoinductivos, interferones, factores estimulantes de colonias, interleuquinas, proteínas morfogenéticas óseas, LIF,SCF,ligando FLT-3 y kit-ligando.

[0041] Los anticuerpos quiméricos son aquellos anticuerpos que tienen por lo menos una parte de cadenas pesada y ligera de la molécula de anticuerpo derivada de diferentes fuentes o especies. Los anticuerpos humanizados son anticuerpos que presentan las regiones variables o determinantes de complementariedad (CDR) derivadas de otra especie animal, tal como ratón, combinadas con la región estructural (“framework”) de la molécula de anticuerpo de un humano. Los anticuerpos o partes de anticuerpos se pueden aislar y/o derivar de expresiones de fagémidos preparados a partir de diferentes especies, tal como se describe en las Patentes de Estados Unidos Nos. 5. 821,047; 5, 969,108, y 5,872,215. Otros anticuerpos incluyen anticuerpos humanos preparados utilizando ratones modificados genéticamente, tales como ratones producidos por Abgenix, Inc. y Medarex, Inc. Los anticuerpos incluyen anticuerpos de longitud completa, anticuerpos de cadena única, anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos, y fragmentos de anticuerpos, tales como fragmentos Fab, F(ab)2. y Fv. Ejemplos de anticuerpos humanizados son anticuerpos humanizados recombinantes que se unen a antígenos, tales como CD11a, HER2, CD 20, VEGF, IgE, IL-9, PSCA, PSMA, y MadCAM. El antígeno CD-11a se halla en células T y el anticuerpo humanizado está destinado para el tratamiento de la psoriasis.

[0042] Los polipéptidos se utilizan terapéuticamente en un conjunto de especies animales, incluyendo humanos, primates, ganado, cerdos, aves de corral y ratones. La especie preferida es humana.

B. Identificación de por lo menos un epítopo inmunodominante en un polipéptido.

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[0043] Habitualmente, los epítopos inmunodominantes se localizan en polipéptidos después de que el polipéptido se haya administrado al animal. En un aspecto de la invención, es deseable identificar epítopos inmunodominantes antes de que el polipéptido se administre al animal. Dichos epítopos se pueden identificar analizando la especificidad de anticuerpo de anticuerpos obtenidos de humanos o animales sin tratar que no han recibido administración o tratamiento conocido con el polipéptido. Los epítopos inmunodominantes identificados en polipéptidos mediante la unión con anticuerpos de humanos o animales sin tratar son predictivos de la respuesta inmune a los polipéptidos después de la dosificación o administración del polipéptido.

[0044] De acuerdo con un método de la invención, se identifica por lo menos un epítopo en el polipéptido caracterizando la especificidad de anticuerpos para el polipéptido que se obtienen de una de una población humana

o animal sin tratar utilizando métodos estándar, tales como ensayos ELISA directos e indirectos, ensayos de unión competitiva, radioinmunoensayos, ensayos de unión de base celular, y/o ensayos de bioactividad, tal como se describe en Current Protocols in Immunulogy, John Wiley and Sons, 2000.

[0045] Los anticuerpos se obtienen preferiblemente de una población humana o animal dependiendo del objetivo para el uso terapéutico pretendido. Por ejemplo, una trombopoyetina recombinante humana tiene una secuencia idéntica a la trompoyetina humana. A continuación, los sujetos humanos sin tratar se criban por los anticuerpos preexistentes o preformados que se unen a la trombopoyetina recombinante humana. Los anticuerpos que se unen al polipéptido pueden derivar de humanos o animales individuales en la población o agrupados de una población de sujetos. La población seleccionada puede incluir pacientes con necesidad de o que están bajo el tratamiento con un polipéptido terapéutico, así como la población de humanos que no necesitan del tratamiento con el polipéptido terapéutico.

[0046] Los anticuerpos también se criban opcionalmente para determinar si los anticuerpos inhiben una actividad terapéutica del polipéptido. Los ensayos de bioactividad se pueden realizar in vivo o in vitro. El tipo de ensayo seleccionado dependerá del polipéptido y sus actividades terapéuticas. Dichos ensayos son conocidos por los expertos en la materia y se pueden identificar y seleccionar fácilmente. Los anticuerpos que no inhiben sustancialmente una actividad terapéutica del polipéptido son aquellos anticuerpos que preferiblemente no inhiben una actividad terapéutica del polipéptido en no más de aproximadamente del 40% y más preferiblemente en no más de aproximadamente el 10%. Alternativamente, si la información sobre las regiones del polipéptido que proporcionan las actividades terapéuticas del polipéptido es conocida, entonces los epítopos inmunodominantes no localizados en estas regiones se pueden seleccionar opcionalmente para la modificación. Las regiones o dominios que proporcionan una función terapéutica de algunos polipéptidos son conocidas por los expertos en la materia.

[0047] La especificidad de epítopo de los anticuerpos se determina utilizando métodos estándar que incluyen métodos de localización de epítopos, tales como se describe en Epitope Mapping Protocols in Molecular Biology, vol. 66 (Glenn E. Morris, ed., 1996) Humana Press Totowa, New Jersey.

[0048] Uno de dichos métodos implica generar un conjunto de anticuerpos que son específicos para epítopos lineales. Los epítopos lineales tienen preferiblemente aproximadamente de 3 a 20 aminoácidos de largo, más preferiblemente aproximadamente de 8 a 20 aminoácidos de largo y tienen una secuencia que es idéntica a la secuencia lineal del polipéptido. Los anticuerpos se generan para estos epítopos conocidos utilizando métodos estándar e incluyen anticuerpos policlonales, monoclonales, fragmentos de anticuerpos, tales como F(ab) o F(ab)2, y anticuerpos que son reconocidos o derivados para una detección fácil. La especificidad de cada uno de los anticuerpos será para un epítopo lineal conocido.

[0049] La especificidad de epítopo del anticuerpo obtenido a partir de un sujeto humano se puede determinar en ensayos de inhibición competitiva. Un anticuerpo que puede inhibir competitivamente de forma completa la unión de un anticuerpo a su epítopo conocido también es específico para ese epítopo.

[0050] Alternativamente, los epítopos conformacionales se pueden localizar utilizando técnicas de modelación molecular. Se puede desarrollar una estructura tridimensional del polipéptido a partir de cristalografía de rayos X o RMN bidimensional o mediante comparación con otros polipéptidos homólogos. Los péptidos que se localizan en la superficie en la estructura tridimensional se pueden sintetizar y analizar por la reactividad con anticuerpos de un sujeto humano o animal.

[0051] Una vez se identifica por lo menos un epítopo que se une a un anticuerpo de un sujeto humano o animal sin tratar o una población de los mismos, entonces se identifica un epítopo inmunodominante. Se identifica un epítopo inmunodominante determinando si el epítopo se une más frecuentemente a un anticuerpo o una población de anticuerpos en una población humana o animal cuando se compara con otros epítopos. Un epítopo

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inmunodominante puede ser el único epítopo que se encuentra que se une a los anticuerpos de una población humana o animal o un polipéptido puede tener más de un epítopo inmunodominante.

[0052] Preferiblemente, un epítopo inmunodominante en el polipéptido reconocido por anticuerpos de una población humana o animal sin tratar también es reconocido por anticuerpos formados en una población humana o animal después de la dosificación con el polipéptido. La dosificación significa la administración o tratamiento de un humano

o animal con el polipéptido. Los epítopos inmunodominantes que incluyen epítopos reconocidos tanto por anticuerpos de una población humana o animal sin tratar como de una población humana o animal dosificada se seleccionan para la modificación. Los epítopos inmunodominantes que se identifican mediante la unión a anticuerpos sin tratar son predictivos de los anticuerpos formados en respuesta a la dosificación o administración del polipéptido. Los polipéptidos se han administrado terapéuticamente y se ha desarrollado una respuesta inmune a ese polipéptido. El análisis de la especificidad de epítopo de los anticuerpos desarrollados en humanos o animales que se han tratado con el polipéptido confirma la predicción de epítopos inmunodominantes identificados en el polipéptido utilizando anticuerpos de animales sin tratar o utilizando algoritmos. Preferiblemente, el epítopo inmunodominante seleccionado para modificarse es un epítopo inmunodominante reconocido por anticuerpos de ambas fuentes.

C.

Epítopo inmunodominante de trombopoyetina humana

[0053] Se identificó un epítopo inmunodominante en la trombopoyetina humana utilizando el método descrito en la presente invención. Los pacientes humanos sin dosificación o administración previa conocida de trombopoyetina recombinante humana se cribaron por anticuerpos para trombopoyetina humana de longitud completa y truncada en un ensayo ELISA tal como se describe en el ejemplo 2. Los anticuerpos positivos para la unión a trombopoyetina humana en el ensayo ELISA se cribaron a continuación en los ensayos de bioactividad para la capacidad de bloquear la unión de trombopoyetina humana al receptor c-mpl o inhibir la proliferación de la línea celular de megacariocitos HU3 tal como se describe en el ejemplo 2. Se seleccionaron los anticuerpos que no inhibían sustancialmente una actividad terapéutica de la trombopoyetina humana.

[0054] La especificidad de epítopo del anticuerpo se determinó utilizando técnicas estándar de localización de epítopos lineales. El epítopo se identificó como un epítopo inmunodominante mediante la utilización de anticuerpos para trombopoyetina humana obtenidos de sujetos humanos a los que no se había tratado previamente con trombopoyetina humana. Los anticuerpos de sujetos humanos tratados con trombopoyetina recombinante humana también se unieron al mismo epítopo.

[0055] Un epítopo inmunodominante de trombopoyetina humana incluye los aminoácidos 318 a 332 y tiene la siguiente secuencia (representada en el código de letras individuales):

LNTSYTHSQNLSQEG.

D. Métodos de predicción de epítopos inmunodominantes.

[0056] También es útil predecir epítopos inmunodominantes en un polipéptido, de manera que el polipéptido se puede modificar antes de ser administrado in vivo. Si se predicen los epítopos inmunodominantes del polipéptido, la cantidad de trabajo necesario para identificar los epítopos inmunodominantes reales en el polipéptido se pueden reducir sustancialmente. Un método para predecir un epítopo incluye proporcionar un grupo de datos del polipéptido, analizar el grupo de datos con un algoritmo para proporciona epítopos predichos y determinar si el epítopo predicho es un epítopo inmunodominante real en un humano o animal o población de los mismos.

[0057] Un grupo de datos del polipéptido se puede obtener de una serie de fuentes e incluye la información de secuencia lineal de toda o una parte del polipéptido y/o los mapas conformacionales de todo o parte del polipéptido. La información de la secuencia lineal del polipéptido puede estar disponible a partir de una base de datos, tal como Genbank, Protein Identification Resource Database, Swissprot y muchas otras. Los epítopos conformacionales se pueden identificar determinando la conformación espacial de aminoácidos mediante por ejemplo, cristalografía de rayos X y resonancia magnética nuclear en 2 dimensiones. La información sobre la estructura secundaria de polipéptidos también está disponible en muchas bases de datos, tales como las bases de datos de Protein Identification Resource y otros. Un grupo de datos del polipéptido recombinante puede estar en un número de formatos, incluyendo un formato legible por ordenador y/o en un formato para la propagación de una señal transmisible.

[0058] Se puede analizar un grupo de datos del polipéptido utilizando diferentes algoritmos conocidos por los expertos en la materia y/o disponibles comercialmente para proporciona epítopos predichos en polipéptidos. En la

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Patente de Estados Unidos No. 5,940,307 se describen programas informáticos que están disponibles para evaluar la estructura secundaria de polipéptidos. Por ejemplo, también se pueden utilizar algoritmos informáticos que formulan escalas de hidropatía a partir de la secuencia de aminoácidos de la proteína utilizando las propiedades hidrofóbicas e hidrofílicas de los aminoácidos según el método de Kyte y Doolittle. Véase Kyte y Doolittle, J. Mol. Biol.157:105 (1982). Los puntos de promedio local de hidrofilicidades más elevados son indicativos de epítopos del polipéptido. Los polipéptidos también se pueden analizar para predecir epítopos inmunodominantes utilizando servicios disponibles comercialmente, tales como los provistos por Epivax. Inc. of Providence, Rhode Island. Los algoritmos preferidos son aquellos que predicen los epítopos que se unen a moléculas MHC de clase II.

[0059] El análisis de un grupo de datos del polipéptido con dichos algoritmos proporciona epítopos predichos. Los epítopos predichos se utilizan para fabricar péptidos preparados mediante métodos estándar de síntesis automatizada de péptidos o técnicas de ADN recombinante.

[0060] Se analizan los péptidos con una secuencia de los epítopos predichos para determinar si uno o más de estos epítopos son un epítopo inmunodominante. Un método para determinar si dicho epítopo predicho es también un epítopo inmunodependiente es comparar la secuencia de aminoácidos del epítopo predicho con la secuencia de aminoácidos de epítopos conocidos (si esa información está disponible) en el polipéptido utilizando métodos estándar para determinar el porcentaje de identidad entre las dos secuencias. Si el epítopo predicho tiene un porcentaje de identidad de secuencia de aproximadamente el 50 % o más, preferiblemente aproximadamente el 75% o más con un epítopo conocido del polipéptido, entonces se selecciona este epítopo para un posterior análisis y/o modificación.

[0061] Alternativamente, el epítopo predicho se identifica como un epítopo inmunodominante real determinando si un péptido con la secuencia del epítopo predicho se une a un anticuerpo o población de anticuerpos de una población humana o animal sin tratar y/o un anticuerpo o población de anticuerpos de una población humana o animal dosificada utilizando métodos estándar, tales como un ELISA o ensayo de unión competitiva. Si un péptido con la secuencia del epítopo predicho se une a un anticuerpo para el polipéptido de un sujeto humano o animal, entonces es un epítopo real. Se puede determinar si el epítopo predicho es un epítopo inmunodominante si se halla que ese epítopo se une más frecuentemente a anticuerpos en una población humana o animal cuando se compara con otros epítopos en el polipéptido.

[0062] Opcionalmente, los epítopos predichos también se criban posteriormente por aquellos epítopos que se unen a anticuerpos que no inhiben sustancialmente una actividad terapéutica del polipéptido. Si un péptido con la secuencia de un epítopo predicho se une a un anticuerpo para el polipéptido obtenido de un sujeto humano o un animal, entonces se puede medir la capacidad de ese anticuerpo de inhibir una actividad terapéutica del polipéptido endógeno. Opcionalmente se pueden seleccionar los epítopos que se unen a o son reconocidos por anticuerpos que no inhiben sustancialmente una actividad terapéutica del polipéptido.

[0063] Alternativamente, si la información sobre las regiones o dominios del polipéptido que proporcionan las actividades biológicas del polipéptido es conocida, entonces los epítopos inmunodominantes predichos no localizados en estas regiones pueden seleccionarse opcionalmente para un análisis posterior.

[0064] Una vez se han predicho o identificado los epítopos inmunodominantes utilizando un algoritmo, tal como el provisto por Epivax, Inc., los epítopo predichos opcionalmente también se valoran por la probabilidad de unirse a los alelos HLA DR y DQ. Esta información proporciona una indicación de la extensión del reconocimiento de este epítopo inmunodominante en la población. Opcionalmente, se seleccionan para la modificación los epítopos inmunodominantes que son reconocidos a lo largo de un conjunto de tipos de HLA cuando se comparan con otros epítopos identificados en el polipéptido. La información de la valoración proporcionada a partir de Epivax se puede utilizar para identificar la probabilidad de la unión a alelos HLA y se puede determinar la frecuencia de estos alelos en la población mediante la referencia a la información disponible de los bancos de sangre, registros de donantes de médula ósea o el grupo de trabajo internacional de histocompatibilidad.

[0065] El análisis de la secuencia de aminoácidos de trombopoyetina humana dio lugar a la identificación de un epítopo inmunodominante predicho utilizando el servicio proporcionado por Epivax, Inc. Catorce de los 15 residuos de aminoácidos del péptido inmunodominante identificados utilizando anticuerpos de pacientes sin tratar mostraron una homología del 100% con los 14 residuos en el extremo C-terminal de la región de 20 aminoácidos predicho por EpiVax. La secuencia del epítopo inmunodominante predicho tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a los residuos de aminoácidos 312 a 331:

TPTSPLLNTSYTHSQNLSQE

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[0066] Se observó que el epítopo o sitio identificado anteriormente incluyen un motivo que probablemente se une a 11 alelos HLA DR y DQ. Estos alelos se hallan en el 42,2% de americanos nativos, 37,3% de caucásicos, 26,6% de afroamericanos y 23,7% de americanos asiáticos.

II. Métodos de modificación de un polipéptido

[0067] Los métodos de la invención, tal como se define en las reivindicaciones, también incluyen la etapa de modificar un polipéptido para reducir la respuesta inmune al polipéptido cuando se administra in vivo a la vez que se mantiene la actividad terapéutica del polipéptido. El polipéptido se modifica preferiblemente antes de administrarse in vivo.

[0068] Un método de modificación de polipéptidos implica identificar por lo menos un epítopo inmunodominante en el polipéptido utilizando los métodos tal como se describen en la presente invención, y modificar el epítopo inmunodominante para disminuir la respuesta inmune a los polipéptidos a la vez que se mantiene la actividad terapéutica sustancial del polipéptido.

A. Modificaciones en los epítopos inmunodominantes

[0069] Las modificaciones en un epítopo inmunodominante se llevan a cabo realizando por lo menos un cambio en los aminoácidos en el epítopo inmunodominante. Las modificaciones en los aminoácidos incluyen la eliminación de toda o una parte del epítopo, la sustitución de por lo menos uno o más aminoácidos en el epítopo, y la inserción de aminoácidos en el epítopo. Además, también se pueden modificar uno o más aminoácidos del epítopo para enmascarar el epítopo mediante modificaciones en los aminoácidos, tales como N-glicosilación, pegilación y similares. Se pueden realizar múltiples modificaciones en un único epítopo inmunodominante. Las modificaciones se realizan preferiblemente en todos los epítopos inmunodominantes si más de un epítopo inmunodominante está presente en el polipéptido.

[0070] Las modificaciones se seleccionan para cambiar uno o más aminoácidos en el epítopo inmunodominante para reducir la inmunogenicidad de ese epítopo. Las modificaciones son preferiblemente aquellas que no alteran significativamente la estructura terciaria global del polipéptido. Entre los ejemplos de las modificaciones preferidas se incluyen modificaciones que se pueden realizar para cambiar la capacidad del epítopo de unirse a moléculas MHC de Clase II. Las modificaciones conocidas por los expertos en la materia para cambiar la unión de un epítopo a una molécula MHC de clase II incluyen el cambio de un residuo del anclaje hidrofóbico C-terminal en un residuo que es hidrofílico y/o cambiar un residuo de aminoácidos cargado negativamente en el extremo N-terminal del epítopo en uno que es neutro o está cargado positivamente. Alternativamente, se pueden realizar sustituciones para reducir la hidrofilicidad local promedio determinada utilizando el método de Kyte y Doolittle descrito anteriormente. Es sabido por los expertos en la materia que un valor de hidrofilicidad local promedio elevado es una característica identificativa de un antígeno o un epítopo. También se pueden realizar otros cambios que afectarán a la capacidad del epítopo de unirse a una molécula MHC de clase II. Los cambios incluyen deleciones, sustituciones e inserciones de en el epítopo.

[0071] Los polipéptidos modificados se preparan introduciendo cambios apropiados de nucleótidos en el ADN que codifica el polipéptido y/o mediante la síntesis del polipéptido deseado. Preferiblemente, el polipéptido tiene una secuencia idéntica a toda o una parte de la secuencia nativa de aminoácidos de un polipéptido endógeno. Las secuencias de aminoácidos de polipéptidos se pueden obtener en las bases de datos de secuencias de proteínas, tales como Genbank, base de datos Protein Identification Resource y otras. Los expertos en la materia entenderán que los cambios de aminoácidos pueden alterar procesos posteriores a la traducción del polipéptido, tales como el cambio del número posición de los sitios de glicosilación o la alteración de las características de anclaje a membrana.

[0072] Las modificaciones en la secuencia del polipéptido o en varios epítopos del polipéptido descrito en la presente invención, se pueden realizar, por ejemplo, utilizando cualquiera de las técnicas y directrices para mutaciones conservativas y no conservativas establecidas, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos No. 5,364,934. Las modificaciones pueden ser una sustitución, deleción o inserción de uno o más codones que codifican el polipéptido que da lugar a un cambio en la secuencia de aminoácidos del polipéptido.

[0073] Opcionalmente, la variación es mediante la sustitución de por lo menos un aminoácidos por cualquier otro aminoácido en uno o más de los epítopos del polipéptido. Las directrices en determinar qué residuo de aminoácido se puede insertar, sustituir o eliminar sin afectar de manera adversa a la actividad biológica deseada se pueden hallar mediante 1) la identificación de regiones de la molécula que son conocidas por estar asociadas con una actividad biológica/terapéutica del polipéptido y la selección de los cambios que probablemente no afectan a la

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región funcional y/o 2) la identificación de cambios que alterarán, preferiblemente disminuirán, la unión de epítopos inmunodominantes a moléculas MHC de clase II o anticuerpos de una población humana o animal positiva al anticuerpo.

[0074] Las sustituciones de aminoácidos pueden ser el resultado de la sustitución de un aminoácido por otro aminoácido que tiene una estructura y/o propiedades químicas similares, tales como la sustitución de una leucina por una serina, es decir, sustituciones conservativas de aminoácidos. Las inserciones o eliminaciones pueden estar opcionalmente en el intervalo de aproximadamente 1 a 5 aminoácidos. La modificación permitida o deseada se puede determinar realizando inserciones, eliminaciones o sustituciones de aminoácidos en la secuencia de forma sistemática y analizando en los polipéptidos modificados resultantes la actividad en comparación con la mostrada por el polipéptido de secuencia nativa o longitud completa, incluyendo la actividad terapéutica y la unión a un anticuerpo específico para el polipéptido.

[0075] En la presente invención se proporcionan fragmentos o partes versiones truncadas del polipéptido. Dichos fragmentos se pueden truncar en el extremo N-terminal o C-terminal, o pueden carecer de residuos internos, por ejemplo, cuando se comparan con un polipéptido de longitud completa. Preferiblemente, los fragmentos carecen de residuos de aminoácidos que no son esenciales para una actividad biológica deseada del polipéptido, pero carecen de uno o más aminoácidos en epítopos inmunodominantes.

[0076] Los fragmentos del polipéptido se pueden preparar mediante cualquiera de un conjunto de técnicas convencionales. Los fragmentos de péptido deseados se pueden sintetizar químicamente. Un enfoque alternativo implica la generación de fragmentos de polipéptido mediante digestión enzimática, por ejemplo, tratando la proteína con una enzima conocida para dividir proteínas en los sitios definidos por residuos de aminoácidos concretos o mediante la digestión del ADN con enzimas de restricción adecuadas y el aislamiento del fragmento deseado. Otra técnica adecuada implica el aislamiento y la amplificación de un fragmento de ADN que codifica un fragmento de polipéptido deseado mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Los oligonucleótidos que definen los extremos deseados del fragmento de ADN se utilizan en los cebadores de los extremos 5’ y 3’ en la PCR. Preferiblemente, los fragmentos de polipéptido comparten por lo menos una actividad biológica con el polipéptido PRO.

[0077] En realizaciones particulares, las sustituciones conservativas de interés se muestran en la Tabla 1 bajo el encabezamiento de sustituciones preferidas. Si dichas sustituciones dan lugar a una reducción de la unión del polipéptido a un anticuerpo de un ser humano o animal sin tratar o una población de los mismos, entonces se introducen cambios más sustanciales denominados sustituciones de ejemplo en la Tabla 1 o, tal como se describe posteriormente en referencia a clases de aminoácidos, y se criban los productos por la unión para anticuerpos al polipéptido y por la actividad terapéutica.

Tabla 3

Residuo original

Sustituciones de ejemplo Sustituciones preferidas

Ala (A)

val; leu; ile val

Arg (R)

lys; gln; asn lys

Asn (N)

gln; his; lys; arg gln

Asp (D)

glu glu

Cys (C)

ser ser

Gln (Q)

asn asn

Glu (E)

asp asp

Gly (G)

pro; ala ala

His (H)

asn; gln; lys; arg arg

Ile (I)

leu; val; met; ala; phe; norleucina leu

Leu (L)

norleucina; ile; val; met; ala; phe ile

Lys (K)

arg; gln; asn arg

Met (M)

leu; phe; ile leu

Phe (F)

leu; val; ile, ala; tyr leu

Pro (P)

ala ala

Ser (S)

thr thr

Thr (T)

ser ser

Trp (W)

tyr; phe tyr

Tyr (Y)

trp; phe; thr; ser phe

Val (V)

ile; leu; met; phe; ala; norleucina leu

[0078] Las modificaciones sustanciales en la identidad inmunológica del polipéptido se pueden llevar a cabo

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mediante la selección de las sustituciones que difieren significativamente en su efecto de mantener (a) la estructura del esqueleto del polipéptido en el área de la sustitución, por ejemplo, como conformación de lámina o hélice, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el epítopo inmunodominante, o (c) el volumen de la cadena lateral. Los residuos naturales se dividen en grupos en base a las propiedades comunes de la cadena lateral:

(1)

hidrofóbica: norleucina, met, ala, val, leu, ile;

(2)

hidrofílica neutra: cys, ser, thr;

(3)

ácida: asp, glu;

(4) básica: asn, gln, his, lys, arg; 10 (5) residuos que influyen en la orientación de la cadena: gly, pro; y

(6) aromática: trp, tyr, phe.

[0079] Las sustituciones no conservativas comprenderán el intercambio de un miembro de una de estas clases por otra clase. Dichos residuos sustituidos también se pueden introducir en sitios de sustitución conservativa o, más

15 preferiblemente, en los sitios restantes (no conservados).

[0080] Las modificaciones se pueden realizar utilizando procedimientos conocidos en la técnica tales como la mutagénesis mediada por oligonucleótidos (dirigida de sitio), el rastreo de alanina, y mutágenesis por PCR. Para producir el ADN que codifica un polipéptido modificado se puede llevar a cabo sobre el ADN clonado una

20 mutagénesis dirigida de sitio [Carter et al., Nucl. Acids. Res., 13: 4331 (1986); Zoller et al., Nucl. Acids. Res., 10: 6487 (1987)], mutagénesis de cassette [Wells et al., Gene, 34 315 (1985)], mutagénesis de selección por restricción [Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317:415 (1986)] u otras técnicas conocidas.

[0081] El análisis de aminoácidos por rastreo también se puede realizar para identificar uno o más aminoácidos a lo

25 largo de una secuencia contigua. Entre los aminoácidos de rastreo preferidos están los aminoácidos pequeños y neutros. Entre dichos aminoácidos se incluyen alanina, glicina, serina y cisteína. La alanina es habitualmente un aminoácido de rastreo preferido de este grupo ya que elimina la cadena lateral más allá del carbono beta y es menos probable que altere la conformación de la cadena principal de la variante [Cunninghan y Wells, Science, 244:1081-1085 (1989)]. La alanina es también habitualmente preferida ya que es el aminoácido más habitual.

30 Además, se encuentra frecuentemente tanto en posiciones escondidas como expuestas [Creighton, The Proteins,

(W.H. Freeman and Co., N.Y.), Chothia, J. Mol. Biol., 150:1 (1976)]. Si la sustitución de alanina no produce cantidades adecuadas de polipéptido modificado, se puede utilizar un aminoácido isotérico.

[0082] Las modificaciones covalentes del polipéptido, preferiblemente aquellas que enmascaran un epítopo

35 inmunodominante, están incluidas dentro del alcance de la invención. Un tipo de modificación covalente del polipéptido incluido en el alcance de la presente invención comprende la alteración del patrón de glicosilación nativo del polipéptido. Por “alteración del patrón de glicosilación nativo” para los objetivos de la presente invención se pretende indicar la eliminación de uno o más grupos carbohidratos hallados en polipéptidos de secuencia nativa (mediante la eliminación del sitio de glicosilación subyacente o mediante la eliminación de la glicosilación por medios

40 químicos y/o enzimáticos), y/o la adición de uno o más sitios de glicosilación que no están presentes en el polipéptido de secuencia nativa. Además, la expresión incluye cambios cualitativos en la glicosilación de las proteínas nativas, implicando un cambio en la naturaleza y proporciones de los diversos grupos de carbohidrato presentes.

45 [0083] La adición de sitios de glicosilación al polipéptido se puede realizar alterando la secuencia de aminoácidos. La alteración se puede realizar, por ejemplo, mediante la adición de, o la sustitución por, uno o más residuos de serina o treonina al polipéptido de secuencia nativa (para sitios de glicosilación unidos a O). La secuencia de aminoácidos del polipéptido puede alterarse opcionalmente a través de los cambios a nivel de ADN, particularmente mediante la mutación del ADN que codifica el polipéptido en bases preseleccionadas, de manera que los codones

50 que se generan se traducirán en los aminoácidos deseados.

[0084] Otros medios para aumentar el número de grupos carbohidrato en el polipéptido es mediante acoplamiento químico o enzimático de glicósidos al polipéptido. Dichos procedimientos están descritos en la técnica, por ejemplo, en WO 87/05330 publicada el 11 de septiembre de 1987, y en Aplin y Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., 259-306

55 (1981).

[0085] La eliminación de grupos carbohidrato presentes en el polipéptido se puede realizar química o enzimáticamente o mediante sustitución mutacional de codones que codifican los residuos de aminoácidos que actúan como dianas para la glicosilación. Las técnicas de desglicosilación químicas son conocidas en la técnica y 60 están descritas, por ejemplo, por Hakimuddin, et. al. Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987) y por Edge, et al. Anal. Biochem., 118:131 (1981). La división enzimática de grupos carbohidrato en los polipéptidos se puede conseguir

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mediante la utilización de un conjunto de endo- y exoglicosidasas tal y como se describe en Thotakura et al. Meth. Enzymol., 138:350 (1987).

[0086] Otro tipo de modificación covalente de polipéptidos comprende la unión del polipéptido a uno del conjunto de polímeros no proteináceos, por ejemplo, polietilenglicol (PEG), polipropilenglicol o polioxialquilenos, de la forma establecida en las Patentes de Estados Unidos Nos: 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192 ó

4.179.337.

[0087] Otras modificaciones incluyen la desamidación de residuos glutaminilo y asparaginilo a los correspondientes residuos glutamilo y aspartilo, respectivamente, la hidroxilación de prolina y lisina, fosforilación de grupos hidroxilo de residuos de serilo o treonilo, metilación de los grupos α-amino de las cadenas laterales de lisina, arginina e histidina

[T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, páginas 79-86 (1983)], acetilación de la amina N-terminal, y la amidación de cualquier grupo carboxilo C-terminal.

[0088] El polipéptido modificado de la presente invención también puede estar en forma de una molécula quimérica que comprende el polipéptido fusionado a otro polipéptido o secuencia de aminoácidos heterólogo.

[0089] Una vez se selecciona una modificación particular en un epítopo inmunodominante, los polipéptidos modificados se preparan mediante métodos estándar incluyendo tecnología de ADN recombinante, tal como se describen en la presente invención. Los polipéptidos modificados se producen y se criban para determinar si dicho polipéptido tendrá una inmunogenicidad reducida. Existen un conjunto de métodos para determinar si cualquier modificación realizada al polipéptido da lugar a una respuesta inmune reducida. Un método para realizar dicha determinación es determinar si el polipéptido modificado presenta una unión reducida a los anticuerpos para el polipéptido, preferiblemente un anticuerpo de una población humana o animal sin tratar y/o a anticuerpos de una población humana o animal dosificada con el polipéptido. Si el polipéptido modificado presenta una unión reducida, preferiblemente aproximadamente una disminución en la afinidad de 100 a 1000 veces, a anticuerpos para el polipéptido de dicha población humana o animal, entonces es un polipéptido que tiene inmunogenicidad reducida.

[0090] Otro método para determinar si el polipéptido modificado presenta inmunogenicidad reducida es administrar el polipéptido modificado a un animal para ver si se desarrolla alguna respuesta inmune al polipéptido modificado. Los modelos de animales incluyen animales SCID/Hu que tienen toda o una parte del sistema inmune humano injertado en un animal inmunodeficiente. La administración del polipéptido modificado a dicho modelo animal indica si se genera una respuesta inmune al polipéptido modificado. Alternativamente, si existe una población de humanos

o animales tratados o tratados, se utilizan anticuerpos formados para el polipéptido para determinar si el polipéptido modificado se unirá a estos anticuerpos. Los polipéptidos modificados que no inducen ninguna respuesta del anticuerpo, inducen anticuerpos con una menor afinidad, preferiblemente una afinidad aproximadamente 100 a 1000 veces inferior (cuando se comparan con los anticuerpos para el polipéptido modificado) o presentan una unión reducida a anticuerpos de animales sin tratar o tratados, presentan inmunogenicidad reducida. Se pueden utilizar cualquiera o todos los métodos anteriores para cribar cualquiera de los polipéptidos modificados para determinar si dicho péptido tiene inmunogenicidad reducida.

[0091] El polipéptido modificado también se criba para determinar si la modificación afecta a la actividad biológica o terapéutica del polipéptido. El polipéptido modificado mantiene sustancialmente la misma actividad terapéutica del polipéptido no modificado, preferiblemente aproximadamente el 60% o más y más preferiblemente aproximadamente el 90 % o más de la actividad del polipéptido no modificado. El polipéptido modificado también puede tener una actividad biológica aumentada en comparación con un polipéptido no modificado o de secuencia nativa. El polipéptido modificado se puede analizar por la actividad biológica, preferiblemente una actividad biológica que se correlaciona con una actividad terapéutica. El ensayo seleccionado dependerá del polipéptido y el uso terapéutico deseado. Los ensayos de actividad terapéutica son conocidos por los expertos en la materia.

B. Métodos de fabricación de un polipéptido modificado

[0092] Los métodos de fabricación de polipéptidos modificados son conocidos por los expertos en la materia e incluyen técnicas de ADN recombinante. Se han producido un conjunto de polipéptidos mediante técnicas de ADN recombinante y, por tanto, son conocidos tanto la secuencia de ácidos nucleicos como la secuencia de aminoácidos para estos polipéptidos. Se hace referencia a Genbank y otras bases de datos para la información de tanto la secuencia de ácidos nucleicos como la secuencia de aminoácidos. Los métodos para aislar la secuencia de ácidos nucleicos que codifica polipéptidos son estándar y se describen en muchas referencias, incluyendo Sambrook et al, Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York (1989).

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[0093] Las modificaciones en la secuencia de aminoácidos se pueden realizar modificando una secuencia de ácidos nucleicos que codifica el polipéptido para codificar un polipéptido modificado. Se puede seleccionar una modificación particular en la secuencia de aminoácidos tal como se describe en la presente invención para formar un polipéptido modificado que tiene una respuesta inmune reducida a la vez que se mantiene una actividad funcional.

[0094] La siguiente descripción se refiere principalmente a la producción de un polipéptido modificado mediante el cultivo de células transformadas o transfectadas con un vector que contiene un ácido nucleico. Naturalmente, se prevé que se puedan utilizar procedimientos alternativos, que se conocen bien en la técnica, para preparar el polipéptido modificado. Por ejemplo, la secuencia del polipéptido modificado, o partes de la misma, se pueden producir mediante síntesis directa de péptidos utilizando técnicas de fase sólida [véase, por ejemplo, Stewart et al., Solid-Ptienee Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85: 2149-2154 (1963)]. La síntesis de proteínas in vitro se puede realizar utilizando técnicas manuales o mediante automatización. La síntesis automatizada se puede realizar, por ejemplo, utilizando un Applied Biosystems Peptide Synthesizer (Foster City, CA) utilizando las instrucciones del fabricante. Se pueden sintetizar químicamente varias partes del polipéptido modificado de forma separada y combinarse utilizando procedimientos químicos o enzimáticos para producir el polipéptido modificado de longitud completa.

1. Aislamiento del ADN que codifica un polipéptido

[0095] El ADN que codifica una secuencia nativa del polipéptido se puede obtener a partir de una biblioteca de ADNc preparada a partir de tejido que se cree que posee el ARNm del polipéptido y expresarlo a un nivel detectable. Por consiguiente, el ADN del polipéptido humano se puede obtener convenientemente a partir de una biblioteca de ADNc preparada a partir de tejido humano. El gen que codifica una secuencia nativa del polipéptido también se puede obtener a partir de una biblioteca genómica o mediante procedimientos sintéticos conocidos (por ejemplo, síntesis automatizada de ácidos nucleicos).

[0096] Las bibliotecas se pueden cribar con sondas (tales como anticuerpos para la secuencia nativa del polipéptido u oligonucleótidos de por lo menos aproximadamente 20-80 bases) diseñados para identificar el gen de interés o la proteína codificada por el mismo. El cribado del ADNc o biblioteca genómica con la sonda seleccionada se puede realizar utilizando procedimientos estándar, tal como se describe en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Un medio alternativo para aislar el gen que codifica una secuencia nativa del polipéptido es utilizar la metodología de PCR [Sambrook et al., supra; Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)].

[0097] Una biblioteca de ADNc se puede cribar de la siguiente manera. Las secuencias de oligonucleótidos seleccionadas como sondas deberían ser de longitud suficiente y suficiente inequívoca para minimizar los falsos positivos. El oligonucleótido está preferiblemente marcado de manera que se puede detectar tras la hibridación a ADN en la biblioteca que se criba. Los procedimientos de marcado son bien conocidos en la técnica, e incluyen la utilización de radiomarcadores como ATP marcado con 32P, biotinilación o marcaje enzimático. Las condiciones de hibridación, incluyendo la rigurosidad moderada y la rigurosidad elevada, se proporcionan en Sambrook et al., supra.

[0098] Las secuencias identificadas en dichos procedimientos de cribado de bibliotecas se pueden comparar y alinear con otras secuencias conocidas depositadas y disponibles en bases de datos públicos, tales como el Banco de Genes u otras bases de datos privadas de secuencias. La identidad de secuencia (a nivel de aminoácido o nucleótido) en las regiones definidas de la molécula o a lo largo de la secuencia nativa de longitud completa se puede determinar utilizando procedimientos conocidos en la técnica y tal y como se describen en la presente invención.

[0099] El ácido nucleico que tiene la secuencia de codificación de la proteína se puede obtener mediante el cribado del ADNc seleccionado o las bibliotecas genómicas utilizando una secuencia de aminoácidos deducida o conocida, y, si es necesario, utilizando procedimientos convencionales de extensión con cebadores tal y como se describe en Sambrook et al., supra, para detectar precursores e intermedios de procesamiento de ARNm que no se han transcrito de forma inversa en ADNc.

2. Modificación de una secuencia de ADN para codificar un polipéptido modificado

[0100] Una vez se aísla una secuencia de ADN que codifica una secuencia nativa del polipéptido, se puede modificar para codificar un polipéptido modificado con por lo menos un cambio en un epítopo inmunodominante del polipéptido. Los cambios se realizan en la secuencia de ácido nucleico para alterar los codones que codifican los aminoácidos del epítopo inmunodominante. Las modificaciones en la secuencia de ácidos nucleicos para realizar estos cambios se pueden realizar utilizando procedimientos conocidos en la técnica tales como la mutagénesis

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mediada por oligonucleótidos (dirigida de sitio), el rastreo de alanina, y mutágenesis por PCR. Para producir el ADN que codifica un polipéptido modificado se puede llevar a cabo sobre el ADN clonado una mutagénesis dirigida de sitio [Carter et al., Nucl. Acids. Res., 13: 4331 (1986); Zoller et al., Nucl. Acids. Res., 10: 6487 (1987)], mutagénesis de cassette [Wells et al., Gene, 34 315 (1985)], mutagénesis de selección por restricción [Wells et al., Philos. Trans.

R. Soc. London SerA, 317:415 (1986)] u otras técnicas conocidas.

3. Selección y transformación de células huésped

[0101] Las células huésped se transfectan o transforman con vectores de expresión o clonación descritos en la presente invención para la producción de los polipéptidos modificados y se cultivan en medios nutrientes convencionales modificados para que sean adecuados para inducir promotores, seleccionar transformantes, o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas. Las condiciones de cultivo, tales como el medio, la temperatura, el pH y similares, se pueden seleccionar por un experto en la materia sin una experimentación excesiva. En general, los principios, protocolos y técnicas prácticas para maximizar la productividad de cultivos celulares se pueden encontrar en Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991) y Sambrook et al., supra.

[0102] Los procedimientos de transfección de células eucariotas y transformación de células procariotas son conocidos por el experto en la materia, por ejemplo, CaCl2, CaPO4, mediados por liposomas y electroporación. Dependiendo de la célula huésped utilizada, la transformación se realiza utilizando técnicas estándar adecuadas a dichas células. El tratamiento con calcio que utiliza cloruro cálcico, tal y como se describe en Sambrook et al., supra,

o la electroporación se utilizan generalmente para procariotas. La infección con Agrobacterium tumefaciens se utiliza para la transformación de ciertas células vegetales, tal como describe Shaw et al., Gene, 23:315 (1983) y WO 89/05859 publicada el 29 de junio de 1989. Para las células de mamíferos sin dichas paredes celulares, se puede utilizar el procedimiento de precipitación con fosfato cálcico de Graham y van der Eb, Virology, 52: 456-457 (1978). En la Patente de Estados Unidos No. 4.399.216 se han descrito aspectos generales de transfecciones de sistemas de células huésped de mamíferos. Las transformaciones en levadura se llevan a cabo habitualmente según el procedimiento de Van Solingen et al., J. Bact., 130: 946 (1977) y Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76: 3829 (1979). Sin embargo, también se pueden utilizar otros procedimientos para introducir ADN en células, tales como mediante microinyección nuclear, electroporación, fusión de protoplastos bacterianos con células intactas, o policationes, por ejemplo, polibreno, poliornitina. Para varias técnicas para transformar células de mamífero, ver Keown et al., Methods in enzymology, 185:527-537 (1990) y Manssur et al., Nature, 336. 348-352 (1988).

[0103] Entre las células huésped adecuadas para la clonación o expresión del ADN en los vectores de la presente invención se incluyen células procariotas, levadura, o eucariotas superiores. Entre las procariotas adecuadas se incluyen, pero no se limitan a, eubacterias, tales como organismos Gram-negativo o Gram-positivo, por ejemplo, Enterobacteriaceae, tal como E. coli. Varias cepas de E. coli están disponibles públicamente, tales como la cepa de

E. coli K12 MM294 (ATCC 31.446); E. coli X1776 (ATCC 31.537); cepa de E. coli W3110 (ATCC 27.325) y cepa de

E. coli K5772 (ATCC 53.635). Entre otras células huésped procariotas adecuadas se incluyen Enterobacteriaceae, tales como Escherichia, por ejemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por ejemplo, Salmonella typhimurium, Serratia, por ejemplo, Serratia marcescans, y Shigella, así como Bacilli, tal como B. subtilis y B. licheniformis (por ejemplo, B. licheniformis 41P descrito en DD 266.710 publicada el 12 de abril de 1989), Pseudomonas, tal como P. aeruginosa, y Streptomyces. Estos ejemplos son más ilustrativos que limitantes. La cepa W3110 es un huésped o huésped parental particularmente preferible ya que es una cepa de huésped habitual para fermentaciones de productos de ADN recombinante. Preferiblemente, la célula huésped secreta cantidades mínimas de enzimas proteolíticos. Por ejemplo, la cepa W3110 se puede modificar para realizar una mutación genética en los genes que codifican proteínas endógenas al huésped, con ejemplos de dichos huéspedes incluyendo la cepa de E. coli W3110 1A2, que tiene el genotipo completo tonA; la cepa de E. coli W3110 9E4, que tiene el genotipo completo tonA ptr3; la cepa de E. coli W3110 27C7 (ATCC 55.244), que tiene el genotipo completo tonA ptr3 phoA E15 (argFlac) 169 degP ompT kanr; la cepa de E. coli W3110 37D6, que tiene el genotipo completo tonA ptr3 phoA E15 (argFlac) 169 degP ompT rbs7 ilvG kanr; la cepa de E. coli W3110 40B4, que es una cepa 37D6 con una mutación de eliminación degP no resistente a kanamicina; y una cepa de E. coli que tiene proteasa periplásmica mutante descrita en la Patente de Estados Unidos No. 4.946.783 concedida el 7 de agosto de 1990. Alternativamente, son adecuados procedimientos de clonación in vitro, por ejemplo, PCR u otras reacciones de ácido nucleico polimerasa.

[0104] Además de los procariotas, los microbios eucariotas, tales como hongos filamentosos o levaduras, son huéspedes de clonación o expresión adecuados para vectores que codifican un polipéptido modificado. El Saccharomyces cerevisiae es un microorganismo huésped eucariótico inferior utilizado habitualmente. Otros incluyen Schizosaccharomyces pombe (Beach and Nurse, Nature, 290: 140 [1981]; EP 139.383 publicada el 2 de mayo de 1985); huéspedes Kluyveromyces (Patente de Estados Unidos No. 4.943.529; Fleer et al., Bio/Technology, 9:968-975 (1991)) tal como, por ejemplo, K. lactis (MW98-8C, CBS683, CBS574; Louvencourt et al. J. Bacteriol., 737

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[1983]), K. fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045), K. wickeramii (ATCC 24.178), K. waltii (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906; Van den Berg et al., Bio/Technology, 8:135(1990)), K. thermotolerans y K. marxianus; yarrowia (EP 402.226); Pichia pastoris (EP 183.070; Sreekrishna et al., J. Basic. Microbiol. 28:265-278 [1988]); Candida; Trichoderma reesia (EP 244.234); Neurospora crassa (Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:5259-5263 [1979]); Schwanniomyces, tales como Schwanniomyces occidentalis (EP 394.538, publicada el 31 de octubre de 1990); y hongos filamentosos, tales como, por ejemplo, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (WO 91/00357 publicada el 10 de enero de 1991), y huéspedes Aspergillus, tales como A. nidulans (Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 112:284-289 [1983]; Tilburn et al., Gene, 26:205-221 [1983]; Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1470-1474 [1984]) y A. Niger (Kelly y Hynes, EMBO J., 4:475-479 [1985]). Las levaduras metilotrópicas son adecuadas en la presente invención e incluyen, pero no se limitan a, levadura capaz del crecimiento en metanol seleccionada del género que consiste en Hansenula, Candida, Kloeckera, Pichia, Saccharomyces, Torulopsis, y Rhodotorula. Una lista de especies específicas que son ejemplos de esta clase de levaduras se puede encontrar en C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982).

[0105] Las células huésped adecuadas para la expresión de polipéptido modificado glicosilado se derivan de organismos multicelulares. Entre los ejemplos de células de invertebrados se incluyen células de insectos, tales como Drosophila S2 y Spodoptera Sf9, así como células vegetales. Entre los ejemplos de líneas celulares huésped de mamíferos útiles se incluyen células de ovario de hámster chino (CHO) y COS. Algunos ejemplos más específicos incluyen la línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); células de ovario de hámster chino/-DHFR (CHO), Urlaub y Ctienein, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)); células de sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)); y tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51). La selección de la célula huésped apropiada se estima que está dentro de la técnica.

4. Selección y utilización de un vector replicable

[0106] El ácido nucleico (por ejemplo, ADNc o ADN genómico), que codifica un polipéptido modificado según la presente invención se puede insertar en un vector replicable para la clonación (amplificación del ADN) o para la expresión. Existen varios vectores disponibles públicamente. El vector puede estar, por ejemplo, en forma de plásmido, cósmido, partícula viral, o fago. La secuencia de ácidos nucleicos apropiada se puede insertar en el vector mediante una serie de procedimientos. En general, el ADN se inserta en un sitio o sitios de endonucleasa de restricción apropiados utilizando técnicas conocidas en el sector. Los componentes de los vectores incluyen generalmente, pero no se limitan a, una o más secuencias señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor y una secuencia de terminación de la transcripción. La construcción de vectores adecuados que contienen uno o más de estos componentes utiliza técnicas de unión estándar que son conocidas por un experto en la materia.

[0107] El polipéptido modificado se puede producir recombinantemente no sólo directamente, sino también como un polipéptido de fusión con un polipéptido heterólogo, que puede ser una secuencia señal u otro polipéptido que tiene un sitio de división específico en el extremo N-terminal de la proteína o polipéptido maduro. En general, la secuencia señal puede ser un componente del vector, o puede ser una parte del ADN que codifica el polipéptido modificado que se inserta en el vector. La secuencia señal puede ser una secuencia señal procariota seleccionada, por ejemplo, del grupo de secuencias líderes de la fosfatasa alcalina, penicilinasa, Ipp o enterotoxina II estable térmicamente. Para la secreción en levaduras, la secuencia señal puede ser, por ejemplo, la secuencia líder de invertasa de levadura, la secuencia líder del factor alfa (incluyendo las secuencias líder del factor α de Saccharomyces y Kluyveromyces, la última descrita en la Patente de Estados Unidos No. 5.010.182), o la secuencia líder de fosfatasa ácida, la secuencia líder de glucoamilasa de C. Albicans (EP 362.179 publicada el 4 de abril de 1990) o la señal descrita en WO 90/13646, publicada el 15 de noviembre de 1990. En la expresión de células de mamíferos, las secuencias señal de mamíferos se pueden utilizar para dirigir la secreción de la proteína, tales como secuencias señal de polipéptidos secretados de la misma especie o especies relacionadas, así como secuencias líderes secretoras virales.

[0108] Ambos vectores de expresión y clonación contienen una secuencia de ácidos nucleicos que permite la replicación del vector en una o más células huésped seleccionadas. Dichas secuencias son conocidas para un conjunto de bacterias, levadura, y virus. El origen de la replicación del plásmido pBR322 es adecuado para la mayoría de bacterias gram-negativas, el origen del plásmido 2μ es adecuado para la levadura, y orígenes virales varios (SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) son útiles para vectores de clonación en células de mamíferos.

[0109] Los vectores de clonación y expresión contendrán habitualmente un gen de selección, también denominado como marcador seleccionable. Los genes de selección habituales codifican proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina, (b) complementan las

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deficiencias auxotróficas, o (c) suministran nutrientes críticos no disponibles del medio complejo, por ejemplo, el gen que codifica D-alanina racemasa para Bacilli.

[0110] Un ejemplo de marcadores seleccionables adecuados para células de mamíferos son aquéllos que permiten la identificación de células competentes para captar el ácido nucleico que codifica un polipéptido modificado, tal como DHFR o timidina quinasa. Una célula huésped apropiada cuando se utiliza DHFR de tipo salvaje es la línea de células CHO deficiente en actividad de DHFR, preparada y propagada tal y como se describe por Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980). Un gen de selección adecuado para su utilización en la levadura es el gen trp1 presente en el plásmido de la levadura YRp7 [Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979); Kingsman et al., Gene,

7:141 (1979); Tschemper et al., Gene, 10:157 (1980)]. El gen trp1 proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura que carece de la capacidad de crecer en triptófano, por ejemplo, ATCC No. 44076 o PEP4-1 [Jones, Genetics, 85:12 (1977)].

[0111] Los vectores de clonación y expresión contienen habitualmente un promotor unido operativamente a la secuencia de ácidos nucleicos que codifica el polipéptido modificado para dirigir la síntesis de ARNm. Son conocidos promotores reconocidos por un conjunto de células huésped potenciales. Entre los promotores adecuados para utilizar con huéspedes procariotas se incluyen los sistemas de promotores de β-lactamasa y lactosa [Chang et al., Nature, 275:615 (1978); Goeddel et al., Nature, 281:544 (1979)], fosfatasa alcalina, un sistema de promotores de triptófano (trp) [Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); EP 36.776], y promotores híbridos, tales como el promotor tac [deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)]. Los promotores para utilizar en sistemas bacterianos también contendrán una secuencia de Shine-Dalgamo (S.D.) unida operativamente al ADN que codifica el polipéptido modificado.

[0112] Entre los ejemplos de secuencias promotoras adecuadas para su utilización con huéspedes de levadura se incluyen promotores para 3-fosfoglicerato quinasa [Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)] u otros enzimas glucolíticos [Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968); Holland, Biochemistry, 17:4900 (1978)], tal como enolasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructoquinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato quinasa, triosafosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucoquinasa.

[0113] Otros promotores de levaduras, que son promotores inducibles que tienen la ventaja adicional de una transcripción controlada por las condiciones de crecimiento, son las regiones promotoras para alcohol deshidrogenasa 2, isocitocromo C, fosfatasa ácida, enzimas degradativas asociadas con el metabolismo del nitrógeno, metalotioneína, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, y enzimas responsables de la utilización de maltosa y galactosa. Los vectores y promotores adecuados para la utilización en la expresión en levaduras se describen en detalle en EP 73.657.

[0114] La transcripción a partir de vectores en células huésped de mamíferos está controlada, por ejemplo, mediante promotores obtenidos de los genomas de virus, tales como virus del polioma, virus de la viruela aviar (Patente UK

2.211.504 publicada el 5 de julio de 1989), adenovirus (tal como el Adenovirus 2), el virus de papiloma bovino, virus del sarcoma aviar, citomegalovirus, un retrovirus, virus de la hepatitis-B y virus de simio 40 (SV40), a partir de promotores de mamíferos heterólogos, por ejemplo, el promotor de actina o un promotor de inmunoglobulina, y a partir de promotores de choque térmico, siempre y cuando dichos promotores sean compatibles con los sistemas de células huésped.

[0115] Se puede incrementar la transcripción de un ADN que codifica el polipéptido modificado por eucariotas superiores mediante la inserción de una secuencia de potenciador en el vector. Los potenciadores son elementos que actúan en cis de ADN, habitualmente aproximadamente de 10 a 300 pb, que actúan en un promotor para aumentar su transcripción. Actualmente se conocen muchas secuencias de potenciadores de genes de mamíferos (globina, elastasa, albúmina, α-fetoproteína e insulina). Habitualmente, sin embargo, se utilizará un potenciador de un virus de célula eucariota. Entre los ejemplos se incluyen el potenciador de SV40 en la cara tardía del origen de replicación (pb 100-270), el potenciador de promotor temprano de citomegalovirus, el potenciador de polioma en la cara tardía del origen de replicación, y los potenciadores de adenovirus. El potenciador se puede cortar y empalmar (“splice”) en el vector en una posición 5’ ó 3’ con respecto a la secuencia codificante del polipéptido modificado, pero se sitúa preferiblemente en un sitio 5’ con respecto al promotor.

[0116] Los vectores de expresión utilizados en células huéspedes eucariotas (levadura, hongos, insectos, plantas, animales, humanos, o células nucleadas de otros organismos multicelulares) también contendrán secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para la estabilización del ARNm. Dichas secuencias están disponibles habitualmente de las regiones no traducidas 5’ y, ocasionalmente 3’, de ADNs o ADNcs eucariotas o virales. Estas regiones contienen segmentos de nucleótidos transcritos como fragmentos poliadenilados en la parte

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no traducida del ARNm que codifica el polipéptido modificado.

[0117] En Gething et al., Nature, 293:620-625 (1981); Mantei et al., Nature, 281:40-46 (1979); EP 117.060 y EP

117.058 se describen adicionalmente otros procedimientos, vectores, y células huésped adecuados para la adaptación a la síntesis de un polipéptido recombinante modificado en cultivos de células de vertebrados.

5. Purificación de un polipéptido modificado

[0118] Las formas del polipéptido modificado se pueden recuperar del medio de cultivo o de los lisados de células huésped. Los métodos para la purificación de polipéptidos de secuencia nativa conocidos por los expertos en la materia se pueden utilizar preferiblemente para la purificación del polipéptido modificado. Si está unido a membrana, se puede liberar de la membrana utilizando una solución de detergente adecuada (por ejemplo, Triton X-100) o mediante división enzimática. Las células utilizadas en la expresión del polipéptido modificado se pueden romper mediante diversos medios físicos o químicos, tales como ciclos de congelación-descongelación, sonicación, destrucción mecánica, o agentes para lisar células.

[0119] Se puede desear purificar el polipéptido modificado a partir de proteínas o polipéptidos de células recombinantes. Los siguientes procedimientos son ejemplos de procedimientos de purificación adecuados: mediante fraccionamiento en una columna de intercambio iónico; precipitación con etanol; HPLC de fase inversa; cromatografía sobre sílice o en una resina de intercambio catiónico, tal como DEAE; “cromatofocusing”; SDS-PAGE; precipitación con sulfato amónico; filtración en gel utilizando, por ejemplo, Sephadex G-75; columnas de proteína A sefarosa para eliminar contaminantes, tales como IgG, y columnas quelantes de metales para unir formas etiquetadas con epítopo del polipéptido modificado. Se pueden utilizar varios métodos de purificación de proteínas y dichos métodos son conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, Nueva York (1982). La etapa o etapas de purificación seleccionadas dependerán, por ejemplo, de la naturaleza del proceso de producción utilizado y el polipéptido modificado concreto producido.

6. Trombopoyetina humana modificada

[0120] Un ejemplo específico de un polipéptido modificado es una trombopoyetina modificada que tiene inmunogenicidaid reducida a la vez que mantiene una actividad terapéutica sustancial. Un epítopo inmunodominante en la trombopoyetina humana de secuencia nativa es un péptido c-terminal que incluye los aminoácidos 318 a 332:

LNTSYTHSQNLSQEG

[0121] Se prepara una trombopoyetina modificada modificando los aminoácidos incluidos en ese epítopo. Los aminoácidos se pueden modificar mediante deleción, sustitución, inserción y/o modificación química. La trombopoyetina humana modificada incluye una trombopoyetina humana con los aminoácidos 1-317, así como una trombopoyetina humana con los aminoácidos 1-311.

[0122] Una trombopoyetina humana modificada se prepara preferiblemente modificando una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una trombopoyetina humana de secuencia nativa. Se puede obtener una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una trombopoyetina humana de secuencia nativa tal como se describe en WO98/52598 y WO 95/18858 y tal como se describe en el ejemplo 5 siguiente.

[0123] Una vez aislado, se modifica el ADN que codifica una secuencia nativa de trombopoyetina humana utilizando técnicas estándar, tales como mutagénesis específica de sitio, para codificar un polipéptido modificado tal como se describe en la presente invención. Se aísla un polipéptido modificado producido mediante métodos recombinantes tal como se describe anteriormente. Alternativamente, el polipéptido de secuencia nativa se puede modificar mediante métodos para modificaciones de polipéptidos tal como se describe previamente.

[0124] A continuación, la trombopoyetina humana modificada se analiza por la unión a anticuerpos para trombopoyetina humana de una población sin tratar o tratada y/o de una población humana o animal dosificada con trombopoyetina tal como se determina en los ensayos ELISA en el ejemplo 2. Se selecciona la trombopoyetina humana modificada que tiene unión reducida a los anticuerpos.

[0125] Una trombopoyetina modificada tiene una actividad sustancial medida en el ensayo de proliferación megacariocítica HU3 tal como se describe en el ejemplo 2. En WO98/52598 se describen otros ensayos para determinar la bioactividad de una trombopoyetina humana modificada.

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III. Administración del polipéptido modificado.

[0126] Los polipéptidos modificados se diseñan para tener una inmunogenicidaid reducida a la vez que mantienen efectos terapéuticos sustanciales tras la administración a un paciente. Una vez se ha identificado y modificado por lo menos un epítopo inmunodominante tal como se describe en la presente invención, se utiliza terapéuticamente el polipéptido modificado para tratar afecciones de una manera similar a la utilización del polipéptido de secuencia nativa o no modificado, si esta información es conocida. Las dosis apropiadas y medios de administración del polipéptido modificado se pueden determinar a partir de la información conocida sobre el polipéptido de secuencia nativa o no modificado.

[0127] Los polipéptidos modificados de la presente invención se formulan de acuerdo a los procedimientos conocidos para preparar composiciones farmacéuticamente útiles, donde el producto modificado de la invención se combina en una mezcla con un vehículo portador farmacéuticamente aceptable. Se preparan formulaciones terapéuticas para el almacenamiento, mezclando el principio activo que tiene el grado de pureza deseado con portadores, excipientes o estabilizadores opcionales fisiológicamente aceptables (Remington's Pharmaceutical Sciences 16 ª edición, Osol, A. ed. (1980)), en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Portadores, excipientes o estabilizadores aceptables no son tóxicos para los receptores en las dosis y concentraciones empleadas, e incluyen tampones como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen el ácido ascórbico, polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como la albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos como polivinilpirrolidona, aminoácidos como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos que incluyen glucosa, manosa, o dextrinas; agentes quelantes, como EDTA; alcoholes de azúcar como el manitol o sorbitol, contraiones formadores de sales tales como sodio, y/o tensoactivos no iónicos, tales como Tween™, PLURONICS™

o PEG.

[0128] Las formulaciones que se utilizarán para administración in vivo deben ser estériles. Esto se logra fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración estériles, antes o después de la liofilización y la reconstitución.

[0129] Las composiciones terapéuticas de la presente invención se colocan generalmente en un recipiente con un puerto de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa de solución intravenosa o vial con un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica.

[0130] La vía de administración está de acuerdo con los procedimientos conocidos, por ejemplo, inyección o infusión por vía intravenosa, intraperitoneal, intracerebral, intramuscular, intraocular, intraarterial o intralesional, administración tópica, o por sistemas de liberación controlada.

[0131] Las dosis y las concentraciones del fármaco deseadas de composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden variar dependiendo del uso particular previsto. La determinación de la dosis apropiada o vía de administración está dentro de la capacidad de un médico ordinario. Los experimentos en animales proporcionan una orientación fiable para la determinación de las dosis eficaces para la terapia humana. El escalado entre especies de dosis eficaces se puede realizar siguiendo los principios establecidos por Mordenti, J. y Chappell, W. "The use of interspecies scaling in toxicokinetics" In Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi et al., Eds., Pergamon Press, New York 1989, pág. 42-96.

[0132] Cuando se emplea la administración in vivo de un polipéptido modificado o agonistas o antagonistas del mismo, las cantidades de dosis normales pueden variar desde aproximadamente 10 ng/kg hasta 100 mg/kg de peso corporal del mamífero o más por día, preferiblemente aproximadamente de 1 μg/kg/día a 10 mg/kg/día, dependiendo de la vía de administración. La orientación en cuanto a las dosis y procedimientos de liberación se proporciona en la literatura, véase, por ejemplo, Patentes de Estados Unidos N º 4.657.760; 5.206.344 ó 5.225.212. Se prevé que diferentes formulaciones serán efectivas para diferentes compuestos de tratamiento y diferentes trastornos, que la administración dirigida a un órgano o tejido, por ejemplo, puede requerir la liberación de una manera diferente de la de otro órgano o tejido.

[0133] Cuando se desea la administración de liberación controlada de un polipéptido modificado en una formulación con características de liberación adecuadas para el tratamiento de cualquier enfermedad o trastorno que requiera la administración del polipéptido modificado, se contempla la microencapsulación del polipéptido modificado. La microencapsulación de proteínas recombinantes para la liberación controlada se ha realizado con éxito con la hormona de crecimiento humano (rhGH), interferón-(rhIFN-), interleucina-2, y MN rgp120. Johnson et al., Nat. Med., 2:795-799 (1996); Yasuda, Biomed. Allí., 27:1221-1223 (1993); Hora et al., Bio / Technology, 8:755-758 (1990); Cleland, "Design and Production of Single Immunization Vaccines Using Polylactide Polyglycolide Microsphere

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Systems en Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach", Powell y Newman, eds, (Plenum Press: New York, 1995), pp. 439-462; WO 97/03692, WO 96/40072, WO 96/07399 y la patente de Estados Unidos 5.654.010.

[0134] Las formulaciones de liberación controlada de estas proteínas se desarrollaron usando el polímero de ácido poliláctico-coglicólico (PLGA) debido a su biocompatibilidad y la amplia gama propiedades biodegradables. Los productos de degradación de PLGA, ácidos láctico y glicólico, se pueden eliminar rápidamente en el cuerpo humano. Además, la degradabilidad de este polímero se puede ajustar desde meses a años dependiendo de su peso molecular y la composición. Lewis, "Controlled release of bioactive agents from lactide/glycolide polymer," en: M. Chasin and R. Langer (Eds.), Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems (Marcel Dekker: Nueva York, 1990), pág. 1-4.

[0135] Una trombopoyetina modificada se puede administrar a pacientes con trombocitopenia utilizando las dosis y medios de administración para la trombopoyetina recombinante humana de secuencia nativa como orientación tal como se conoce por los expertos en la materia y tal como se describe en WO 97/26907 y WO 98/52598.

[0136] Se entenderá que aunque se ha observado que una administración única de una trombopoyetina a un paciente será terapéuticamente eficaz para el tratamiento de la trombocitopenia, se puede apreciar que se puede utilizar un régimen múltiple bajo (diario), pero sin significancia terapéutica apreciable o significativa a parte de las desventajas clínicas obvias. En la presente invención se ha observado que una dosis única estimula la aparición de una respuesta terapéutica y aunque en la presente invención se contempla una dosificación múltiple, quizás dictada por las condiciones y práctica clínica, la terminación de la dosificación después de una administración única o múltiple baja es independiente de la respuesta terapéutica.

[0137] Se ha observado que el régimen de administración única o de administración múltiple baja de la presente invención es efectiva a tasas de dosificación relativamente bajas del orden de aproximadamente 0,1 a 10, preferiblemente aproximadamente 0,3 a 10, más preferiblemente aproximadamente 0,5 a 10, aún más preferiblemente aproximadamente 0,5 a 5 μg/kg de peso corporal del paciente. En la dosificación única, se preferiría la administración total de aproximadamente 2 ± 1,5 μg/kg de peso corporal. En la dosificación múltiple baja, se preferiría la administración de aproximadamente 0,5 a 1,5 μg/kg de peso corporal por dosis. Las dosis anteriores se predican en la administración intravenosa preferida. En la administración mediante vía subcutánea, la cantidad total administrada estaría en el intervalo de aproximadamente una a tres veces la cantidad administrada mediante la vía intravenosa, preferiblemente aproximadamente dos veces.

[0138] Las tasas y regímenes de dosificación óptimas se determinarán por el médico tomando en consideración varios factores conocidos por modificar la acción de los fármacos, incluyendo la gravedad y el tipo de enfermedad, el peso corporal, el sexo, la dieta, el tiempo y vía de administración, otros medicamentos y otros factores clínicos relevantes. El régimen consistirá en una administración única o múltiple baja de un material de trombopoyetina de la presente invención en un amplio intervalo de aproximadamente 0,1 a 100 μg/kg de peso corporal, preferiblemente una dosis en el intervalo de aproximadamente 0,1 a 50 μg/kg de peso corporal. Una administración única o múltiple baja de una dosis que varía de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 1,0 o más preferiblemente aproximadamente 0,5 a aproximadamente 5 μg/kg produce un efecto terapéutico que es equivalente terapéuticamente a la administración de la misma cantidad de material o más sobre un régimen que abarca la administración diaria durante un conjunto de días superiores a una semana o más.

[0139] Los materiales de trombopoyetina modificada biológicamente activa de la presente invención se pueden administrar, de acuerdo con la presente invención, en varias rutas que incluyen a través de la nariz o el pulmón, subcutáneamente, y preferiblemente intravenosamente. En todos los casos, dependiendo de la ruta de administración, los materiales de trombopoyetina modificada biológicamente de la presente invención se administran preferiblemente en combinación con un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable apropiado. Cuando se administran sistémicamente, la composición terapéutica debería estar libre de pirógenos y en una solución parenteralmente aceptable con la debida consideración de isotonicidad y estabilidad a pH fisiológico. Estas condiciones son generalmente conocidas y aceptadas por los expertos apropiados en la materia.

[0140] Los siguientes ejemplos pretenden ilustrar pero no limitar la invención. Aunque son los habituales de los que se podría utilizar, se pueden utilizar alternativamente otros procedimientos conocidos por los expertos en la materia.

Ejemplo 1

[0141] La administración de TPO recombinante humana provoca un incremento dependiente de la dosis en el recuento de plaquetas en humanos y varias especies de animales, incluyendo chimpancés, monos rhesus,

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babuínos, mono synomolous y ratones. Sin embargo, se ha observado que la TPO recombinante es una molécula inmunogénica y que los anticuerpos para la TPO recombinante pueden causar problemas.

[0142] Los monos rhesus se inyectaron subcutáneamente con varias dosis de TPO recombinante humana que variaban de 0,1 a 30 μg/kg durante 14 días. Se midieron con el tiempo el recuento de plaquetas y anticuerpos para TPO. La figura 2 muestra los perfiles de plaquetas en monos rhesus inyectados con varias dosis de TPO recombinante humana. Los resultados muestran un incremento dependiente con la dosis en el recuento de plaquetas alcanzando un máximo entre los días 14 y 21. Sin embargo, en el día 28, las plaquetas están cerca de la línea base. Esta tendencia descendente en el recuento de plaquetas continuó a lo largo de todo el periodo de 77 días. Todos los animales dieron positivo para anticuerpos anti-TPO desde el día 21 en adelante. Estos resultados muestran que los anticuerpos para TPO pueden causar trombocitopenia.

[0143] Dado que existe aproximadamente un 15% de diferencia entre la secuencia de TPO humana y la de rhesus, se analizaron los efectos de la administración de TPO recombinante de rhesus en monos rhesus sobre el recuento de plaquetas y el desarrollo de los anticuerpos. Los resultados fueron muy similares: se observó un incremento en el recuento de plaquetas seguido de trombocitopenia, que coincidió con la aparición de anticuerpos (datos no mostrados). Se observó el mismo fenómeno en ratones inyectados con TPO murina (datos no mostrados). Estos resultados indican que un polipéptido recombinante idéntico a un homólogo endógeno en una especie particular puede obtener una respuesta de anticuerpo en esas especies y que la respuesta de anticuerpo es perjudicial para el animal.

[0144] Los anticuerpos para TPO no sólo coinciden con la trombocitopenia, sino que también pueden causar la misma. Se purificó una fracción de IgG de ratones trombocitopénicos anti-TPO murino positivos y se inyectó en animales sin tratar. La IgG de animales normales sirvió de control. Los resultados se muestran en la figura 3. Los recuentos de plaquetas en animales tratados con anticuerpos anti-TPO (mostrados en cuadrados transparentes) disminuyeron significativamente, mientras que los animales inyectados con IgG de control mantuvieron su recuento de plaquetas a nivel base. Los resultados muestran que los anticuerpos desarrollados contra TPO recombinante pueden neutralizar TPO endógena y causan un descenso de los recuentos de plaquetas.

[0145] Estos resultados muestran que se forma una respuesta de anticuerpo a un polipéptido recombinante terapéutico con un homólogo endógeno en animales tratados con el polipéptido recombinante. La respuesta del anticuerpo al polipéptido trombopoyetina recombinante no sólo puede reducir la efectividad terapéutica del polipéptido recombinante, sino que también puede causar una trombocitopenia mediada por anticuerpo.

Ejemplo 2

[0146] Además de la trombocitopenia mediada por anticuerpo descrita en ejemplo 1, se observó que aproximadamente un 10% de los animales sin tratar de todas las especies examinadas tenían anticuerpos preformados para TPO y un recuento de plaquetas normal. Las especies examinadas incluían humana, monos rhesus, chimpancés y ratones. Fue sorprendente que los animales presentaran anticuerpos para una proteína endógena. Se caracterizó la respuesta de anticuerpo a trombopoyetina humana en pacientes humanos.

[0147] Se desarrollaron cuatro ensayos diferentes a efectos de determinar si los anticuerpos de pacientes humanos era específicas para trombopoyetina y también eran capaces de inhibir la función de trombopoyetina.

[0148] Se desarrollaron los siguientes ensayos para monitorizar la respuesta de anticuerpo a TPO de los pacientes: 1) ELISA para anticuerpos para TPO de longitud completa: 2) ELISA para anticuerpos para TPO truncada, (región Nterminal, aminoácidos 1-153); 3) ELISA para anticuerpos que bloquean la unión de TPO a receptor c-mpl recombinante; y 4) un bioensayo para anticuerpos que inhiben la proliferación de células HU3 megacariocíticas humanas.

[0149] Los anticuerpos para TPO de longitud completa también se cribaron en los ensayos por los anticuerpos que se unen a TPO truncada, así como en el ensayo de bloqueo de receptor y proliferación de HU3. Los anticuerpos específicos para TPO truncada también es más probable que sean anticuerpos que bloquean o reducen la unión a receptor como la proliferación de células HU3, ya que se sabe que las actividades biológicas de TPO se hallan en la región N-terminal de TPO (aminoácidos 1-153). Los anticuerpos para TPO de longitud completa, pero no reactivos en el ensayo para la unión a TPO truncada, el ensayo de unión a receptor o el ensayo proliferativo de HU3, es más probable que sean anticuerpos específicos para un epítopo en la región C-terminal de TPO.

[0150] En los ensayos ELISA para TPO de longitud completa y truncada, se utilizaron placas recubiertas de estreptavidina y TPO biotinilada, ya que el recubrimiento directo de placas con TPO tiende a enmascarar el epítopo

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de unión a receptor. La TPO recombinante humana y la TPO truncada están disponibles en Genentech, Inc y se pueden marcar con biotina utilizando métodos estándar. Sin embargo, el recubrimiento de TPO con estreptavidinabiotina creó su propio problema debido a anticuerpos para estreptavidina que están presentes en algunos individuos. Para evitar esto, se utilizó el formato de Relación de Densidad Óptica u ODR en el que la misma muestra se incuba en pocillo con TPO con estreptavidina y estreptavidina sola. Después de la detección de anticuerpos unidos con conjugado IgG humana-HRP, se calcula la ODR dividiendo la DO en pocillo con TPO por la DO del pocillo sin TPO. El corte de la positividad se determinó mediante análisis repetidos de un panel de muestras de 50 individuos sin tratar con TPO. Se utilizó el principio de media más 3 SD y la ODR de corte resultó ser 1,5 para el ELISA de TPO de longitud completa y 1,8 para ELISA de TPO truncada.

[0151] En el ELISA de bloqueo de c-mpl, se preincubaron muestras de suero con TPO conjugada con HRP. Los métodos para fabricar el receptor C-mpl recombinante se han citado en WO 98/52598. La TPO se conjuga con HRP utilizando métodos estándar. A continuación, las muestras se incubaron con pocillos recubiertos de receptor y se determinó la señal de DO. Los pocillos con TPO sola sirven como referencia. Los anticuerpos que se unen al epítopo de TPO de unión a receptor causan un descenso en la señal que se expresa como el porcentaje de señal observada en el pocillo de referencia. De nuevo, utilizando un panel de 50 individuos sin tratar con TPO y la misma media más 3 SD se llegó a un punto de corte del 25%. Una muestra de suero que causa un descenso del 25% o más en la DO se considera positiva para anticuerpos que bloquean la unión de TPO a su receptor.

[0152] El bioensayo de HU3 utiliza línea celular megacariocítica HU3 humana. Las muestras de suero se inactivaron con calor, se preincubaron con TPO y, a continuación, se incubaron con células carentes de TPO. Las células HU3 están disponibles en la Hahnemann University of Philadelphia, PA y se describen en la Patente de Estados Unidos No. 5.128.259. La proliferación celular se determina midiendo la reducción con alamar-Blue™. Un método para utilizar alamarBlue™ está disponible en Biosource International, Camarillo, CA y se describe en Ahmed et al, Journal of Immunological Methods 170:211 (1994). Brevemente, los anticuerpos de TPO neutralizantes inhiben la proliferación celular, lo cual da lugar a una señal inferior de alamarBlue™ en comparación con el pocillo de referencia que sólo contenía TPO. Las señales de alamarBlue™, cuando se miden espectrofotométricamente, se miden a 570 y 600 nm. La reducción de alamarBlue™ se expresa como el porcentaje de disminución en la señal causado por anticuerpos en comparación con la señal en el pocillo de referencia. El corte en este ensayo es del 30%, lo que significa que un suero que causa un descenso del 30% o superior en la señal se considera positivo para anticuerpos neutralizantes.

[0153] Para validar estos ensayos, se estudiaron monos rhesus tratados con TPO recombinante de rhesus. Se compararon los niveles de anticuerpo en los cuatro ensayos con el grado de trombocitopenia. Los niveles de anticuerpo, medidos por los 4 ensayos, eran inversamente proporcionales al recuento de plaquetas (figura 4). Cuando mayor era los niveles de anticuerpo, menor era el recuento de plaquetas. Debe indicarse que esta relación inversa es más importante en ambos ensayos funcionales lo cual se espera de ensayos que son más específicos para anticuerpos neutralizantes.

[0154] Se utilizó una estrategia dependiente para cribar muestras clínicas para la inmunoreactividad anti-TPO e identificar clínicamente respuestas de anticuerpos relevantes utilizando ensayos funcionales. El método de cribado implica cribar el suero de pacientes (sin tratar) antes y después de la administración (tratados) con TPO recombinante humana para cada uno de los 4 ensayos descritos previamente. Se cribaron las muestras de todos los pacientes antes y después de la administración de TPO utilizando el ELISA de FL-TPO. Se analizaron posteriormente muestras positivas mediante ELISA de TPO truncada y ELISA de bloqueo de c-mpl. Las muestras positivas sólo en el ensayo de FL-TPO se consideraron negativas para anticuerpos neutralizantes. Las muestras positivas en ELISAS de FL y TR, pero negativas en ELISA de bloqueo de c-mpl, también se consideraron negativas para anticuerpos neutralizantes. Las que fueron positivas en los tres ELISA se analizaron en un bioensayo de HU3 para confirmar la existencia de anticuerpos neutralizantes.

[0155] De acuerdo con la FDA, se consideran pacientes humanos positivos para anticuerpos neutralizantes si el ensayo de HU3 es positivo y asociado con una trombocitopenia clínicamente significativa. Los resultados de análisis de anticuerpos de muestras de suero de pacientes en pruebas clínicas para tratamiento con TPO recombinante se

muestran en la tabla 1.

Tabla 1 Anticuerpos anti-TPO en pacientes

Número de pacientes analizados Número de pacientes positivos en:

23 379 % de pacientes positivos

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ELISA de FL-TPO 25(8*) (7%) ELISA de TR-TPO 3(1*) (<1%) ELISA de bloqueo de c-mpl 2 (<1%) Bioensayo de proliferación de HU3 1 (<1%) *Número de pacientes positivos para anticuerpos antes de la administración de TPO

[0156] De los 379 pacientes analizados, 25 (7%) fueron positivos en el ELISA de FL-TPO, 17 presentaban anticuerpos inducidos y 8 presentaban anticuerpos preformados. Tres de los 25 pacientes positivos en el ensayo de FL-TPO también fueron positivos en ELISA de TR-TPO con un paciente con anticuerpo preformado. Dos de los tres pacientes anteriores también fueron positivos en el ELISA de bloqueo de c-mpl. De forma destacada, sólo uno de los dos sueros positivos de c-mpl era positivo en el bioensayo de HU3. Ninguno de los pacientes, incluyendo el que tenía un resultado de HU3 positivo, presentaba una trombocitopenia relacionada con anticuerpo clara. Debe indicarse que todos los pacientes también estaban recibiendo quimioterapia.

[0157] Estos resultados muestran que algunos pacientes presentaban anticuerpos preformados para TPO antes de la administración de TPO recombinante, y que se pudo observar una respuesta de anticuerpo a la administración de TPO en algunos pacientes, a pesar del hecho de que se inmunosuprimieron.

Ejemplo 3

[0158] Con el objetivo de identificar los epítopos de TPO recombinante reconocidos por anticuerpos de pacientes sin tratar y tratados, se utilizó una biblioteca de anticuerpos de conejo desarrollados contra péptidos de TPO sintéticos de secuencia conocida. Dado que el 90% de todos los pacientes positivos fueron positivos sólo en el ELISA de FL-TPO, se dirigió a la mayoría de los anticuerpos inducidos y preformados contra la mitad c-terminal de la molécula. La Tabla 2 muestra la lista de péptidos generados a partir de la parte C-terminal de la molécula con sus secuencias y longitudes además de números de ID de los anticuerpos correspondientes.

Tabla 2 Péptidos de epítopo C-terminal de TPO sintéticos y anticuerpos anti-péptido de conejo correspondientes

secuencia de péptido (longitud) Anticuerpo ID #

154-170(17) 24

175-190(16) 48

195-211(17) 28

218-234(17) 19

244-259(16) 17

258-268(11) 49

268-283(16) 16

296-311(16) 51

318-332(15) 15

[0159] Los péptidos tienen las siguientes secuencias:

154- 170 RAPPTTAVPSRTSLVLT 175-190 PNRTSGLLETNFTASA 195-211 SGLLKWQQGFRAKIPGL 218-234 SLDQIPGYLNRIHELLN 244-259 SRRTLGAPDISSGTSD 258-268 SDTGSLPPNLQ 268-283 QPGYSPSPTHPPTGQY 296-311 VVQLHPLLPDPSAPTP 318-332 LNTSYTHSQNLSQEG

[0160] Estos anticuerpos se produjeron utilizando métodos estándar y se seleccionaron en base a su alta afinidad y especificidad estricta tal y como se mide mediante ensayos de unión competitiva. Se inhibe la unión del anti-péptido 19 al TPO de longitud completa en presencia de concentraciones crecientes de péptido # 19. La unión a TPO de longitud completa no es inhibida por el péptido 15 ó 28, sólo el péptido 19 inhibió el antipéptido 19 de conejo. (Figura 4) El resto de los anticuerpos anti-péptido mostraron especificidad similar. A pesar de que hay algunos espacios, se cubre más del 80% de la mitad C-terminal completa.

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[0161] Para caracterizar ambos anticuerpos de humanos tratados y no tratados, más detalladamente, se llevaron a cabo un conjunto de estudios de unión competitiva utilizando los anticuerpos anti-TPO de conejo anteriores de especificidad conocida. Se seleccionaron cinco pacientes para la caracterización en base al volumen de suero disponible. Dos de ellos (HH y CPM) presentaban anticuerpos preformados antes de la administración de TPO mientras que tres (PE, CMC, BFJ) desarrollaron anticuerpos durante el tratamiento. Los cinco pacientes fueron positivos sólo por el ELISA de FL-TPO.

[0162] Los pacientes positivos exclusivamente en el ELISA de FL-TPO tenían anticuerpos dirigidos contra epítopos comprendidos dentro del epítopo C-terminal de TPO. Se determinó la especificidad precisa de estos anticuerpos mediante unión competitiva contra anticuerpos de conejo específicos para 9 péptidos sintéticos diferentes que abarcaban el epítopo C-terminal (Tabla 2). Sólo los anticuerpos específicos para un péptido que incluía los aminoácidos en el extremo C-terminal (aminoácidos 318-332) competían con los sueros del paciente (Figura 6). La competición era completa e igualmente efectiva contra anticuerpos de pacientes no tratados (HH y CPM) y anticuerpos de pacientes tratados (PE, CMC, y BFJ) (Figura 6). Estos datos indican que el repertorio de anticuerpos (no tratado e inducido) dirigidos contra el epítopo C-terminal de FL-TPO tiende a ser restrictivo ante un epítopo inmunodominante en el extremo C-terminal. Estos datos también indican que la especificidad de anticuerpo de los anticuerpos de pacientes no tratados es la misma que la especificidad de anticuerpo después del tratamiento o la administración del polipéptido.

Ejemplo 4

[0163] Se conocen o se han descrito recientemente un conjunto de métodos de predicción de epítopos en base a la secuencia proteica. Los epítopo pueden localizarse utilizando estrategia de localización lineal, estrategias que utilizan modelación por ordenador de estructuras 3-D del polipéptido, así como la utilización de software disponible a través de tales compañías como Epivax, Inc.

[0164] Se proporcionó la secuencia entera de aminoácidos lineal de TPO recombinante humana a EpiVax, Inc. para el análisis y la predicción de los epítopos inmunodominantes. Los resultados de EpiVax, Inc. identificaron 3 regiones en el epítopo C-terminal que tienen motivos de unión a MHC de clase II. Se muestra una de estas regiones de epítopo predichas (idénticas a los aminoácidos 312-331):

TPTSPLLNTSYTHSQNLSQE

[0165] Los otros 2 epítopos predichos por Epivax fueron demasiado largos para analizar posteriormente.

[0166] Catorce de cada 15 residuos de aminoácidos del péptido inmunodominante identificado utilizando anticuerpos de pacientes tratados y no tratados mostraron una homología del 100% con los 14 residuos en el C-terminal de la región de 20 aminoácidos predicha por EpiVax.

[0167] Estos resultados indicaron que un epítopo inmunodominante identificado en base a la especificidad de anticuerpo puede predecirse utilizando un análisis de motivos de unión a Clase II en un polipéptido recombinante. Puede utilizarse la predicción de epítopos inmunodominantes como herramienta para reconocer la región de una molécula para empezar la localización del epítopo del polipéptido y, por tanto, se puede ahorrar tiempo y recursos importantes.

[0168] Una vez se han predicho o identificado los epítopos inmunodominantes utilizando un algoritmo, como el proporcionado por Epivax, Inc., los epítopos predichos también se valoran por la probabilidad de unirse a los alelos HLA DR y DQ. Esta información proporciona una indicación de la extensión del reconocimiento de este epítopo inmunodominante en la población. Un criterio de selección adicional puede incluir opcionalmente aquellos epítopos inmunodominantes que son reconocidos a lo largo de un conjunto de tipos de HLA. Se observó que el epítopo o sitio identificado anteriormente incluye un motivo que es probable que se una a 11 alelos HLA DR y DQ. Estos alelos se encuentran en el 42,2% de americanos nativos, 31,3% de caucásicos, 26,6% de afroamericanos, y 23,7% de americanos asiáticos.

Ejemplo 5

[0169] La secuencia nativa de TPO es bien conocida. La expresión y purificación de TPO de secuencia nativa humana se describe en WO 98/52598.

1. Descripción de vectores de expresión en CHO

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[0170] Los vectores de expresión utilizados en los protocolos de electroporación descritos a continuación se han designado como:

pSV15.ID.LL.MLORF (longitud completa o hTPO332), y

2. Preparación de vectores de expresión en CHO

[0171] Se obtuvo un ADNc correspondiente al marco de lectura abierto completo de hTPO mediante PCR utilizando los cebadores oligonucleótidos de la siguiente tabla.

Cebadores de PCR de vectores de expresión en CHO

Cla.FL.F2 5’ ATCC GAT ATC GAT AGC CAG ACA CCC CGG CCA G 3’

ORF.Sal 5’ AGT CGA CGT CGA CGT CGG CAG TGT CTG AGA ACC 3’

[0172] Se utilizó PRK5-hmpl I como plantilla para la reacción en presencia de pfu ADN polimerasa (Stratagene). La desnaturalización inicial fue durante 7 min a 94°C seguido de 25 ciclos de amplificación (1 min a 94°C , 1 min a 55°C y 1 min a 72°C). La extensión final fue durante 15 min a 72°C. El producto PCR se purificó y se clonó en tre los sitios de restricción Clal and Sall del plásmido pSV15.ID.LL para obtener el vector pSV15.ID.LL.MLORF. Se verificó la secuencia de la construcción.

[0173] En esencia, las secuencias codificantes para la longitud completa se introdujeron en el sitio de clonación múltiple del vector de expresión pSV15.ID.LL en CHO. Este vector contiene la región de promotor temprano/potenciador de SV40, una unidad de corte y empalme modificada que contiene el ADNc de DHFR de ratón, un sitio de clonación múltiple para la introducción del gen de interés (en este caso las secuencias de TPO descritas), una señal de poliadenilación y origen de replicación de SV40 y el gen de beta-lactamasa para la selección y amplificación de plásmidos en bacterias.

3. Metodología para establecer líneas celulares de CHO estables que expresan la TPO332 recombinante humana

a. Descripción de la línea celular parental de CHO

[0174] La línea celular de CHO (Ovario de Hámster Chino) huésped utilizada para la expresión de las moléculas de TPO descritas en la presente invención se conoce como CHO-DP12 (véase EP 307,247 publicada el 15 de marzo de 1989). Esta línea celular de mamífero se seleccionó por clonación a partir de una transfección de la línea parental (CHO-K1 DUX-B11 (DHFR-)- obtenida del Dr. Frank Lee de la Universidad de Stanford con el permiso del Dr. L. Ctienein) con un vector que expresaba preproinsulina para obtener clones con menores requisitos de insulina. Estas células también eran DHFR menos y se pueden seleccionar los clones por la presencia de secuencias del vector de ADNc para DHFR mediante el crecimiento en medio carente de suplementos de nucleósidos (glicina, hipoxantina, y timidina). Este sistema de selección para la expresión estable de líneas celulares de CHO es utilizado habitualmente.

b. Método de transfección (electroporación)

[0175] Se generaron líneas celulares que expresan TPO332 mediante la transfección de células DP12 a través de electroporación (véase, por ejemplo, Andreason, G.L. J. Tiss. Cult. Meth., 15, 56 (1993) con pSV15.ID.LL.MLORF linealizado. Se establecieron tres (3) mezclas de reacción de enzimas de restricción para cada corte del plásmido; 10 microgramos, 25 microgramos y 50 microgramos del vector con la enzima NOTI mediante métodos estándar de biología molecular. Este sitio de restricción se halla sólo una vez en el vector en la región de linealización 3’ y fuera de las unidades de transcripción de ligando TO. Se establecieron reacciones de 100 microlitros durante incubación por la noche a 37 grados. Al día siguiente las mezclas eran fenol-cloroformo-alcohol isoamílico (50:49:1) extraídas una vez y se precipitó con etanol en hielo seco durante aproximadamente una hora. A continuación, se recogió el precipitado mediante una microcentrifugación de 15 minutos y se secó. El ADN linealizado se resuspendió en 50 microlitros de medio DMEM de Ham-F12 1:1 suplementado con antibióticos estándar y glutamina 2 mM.

[0176] Se recogieron células DP12 crecientes en suspensión, se lavaron una vez en el medio descrito para resuspender el ADN y finalmente se resuspendieron en el mismo medio a una concentración de 107 células por 750 microlitros. Se incubaron alícuotas de células (750 microlitros) y cada mezcla de ADN linealizado a temperatura ambiente durante una hora y, a continuación, se transfirieron a una cámara de electroporación BRL. A continuación, cada mezcla de reacción se electroporó en un aparato de electroporación BRL estándar a 350 voltios fijados a 330 micro F y baja capacitancia. Después de la electroporación, las células se dejaron reposar en el aparato durante 5 minutos y, a continuación, en hielo durante un periodo de incubación adicional de 10 minutos. Las células electroporadas se transfirieron a placas de cultivo celular de 60 mm que contenían 5 ml de medio de crecimiento

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completo estándar para células CHO (glucosa elevada, DMEM-F12 50:50 sin glicina suplementado con 1X GHT, glutamina 2 mM, y suero de ternera fetal al 5%) y se desarrollaron durante la noche en un incubador de cultivo celular con CO2 al 5%.

c. Método de selección y cribado

[0177] El día siguiente, las células se tripsinizaron fuera de las placas mediante métodos estándar y se transfirieron a placas de cultivo de tejido de 150 mm que contenían medio selectivo de DHFR (medio DMEM de Ham-F12 1:1 descrito anteriormente suplementado con suero de ternera fetal dializado al 2% ó 5% pero carente de glicina, hipoxantina y timidina, éste es el medio de selección de DHFR estándar que se utilizó). Las células de cada placa de 60 mm se replacaron posteriormente en placas de 5/150 mm. Las células se incubaron a continuación durante 10 a 15 días (con un cambio de medio) a 37 grados/CO2 al 15% hasta que los clones empezaron a aparecer y alcanzaron tamaños susceptibles de transferirse a placas de 96 pocillos. Durante un periodo de 4-5 días, las líneas celulares se transfirieron a placas de 96 pocillos utilizando puntas estériles amarillas en un juego pipettman a 50 ml. Las células se dejaron crecer hasta la confluencia (normalmente 3-5 días) y, a continuación, los soportes se tripsinizaron y se reprodujeron 2 copias del soporte original. Dos de estas copias se almacenaron a corto plazo en el congelador con células en cada pocillo diluidas en 50 microlitros de FCS al 10% en DMSO. Se analizaron muestras de medio libre de suero condicionado de 5 días de pocillos confluentes en el tercer soporte para la expresión de TPO mediante el ensayo de actividad basado en células Ba/F. Se revivieron los clones de mayor expresión en este ensayo a partir del almacenamiento y se escalaron hasta 2 matraces T de 150 mm confluentes para la transferencia al grupo de cultivo celular para la adaptación de la suspensión, reensayo y almacenamiento.

d. Protocolo de amplificación

[0178] Varias de las líneas celulares con la mayor titulación de la selección descrita anteriormente se pusieron posteriormente en régimen de amplificación estándar con metotrexato para generar clones de mayor titulación. Los clones de células CHO se expandieron y se emplacaron en placas de 10 cm a 4 concentraciones de metotrexato (es decir, 50 nM, 100 nM, 200 nM y 400 nM) en dos o tres grupos celulares (105, 5x105 y 106 células por placa). A continuación, estos cultivos se incubaron a 37 grados/CO2 al 5% hasta que se establecen los clones y son susceptibles de transferirse a placas de 96 pocillos para el análisis posterior. De nuevo se sometieron varios clones de titulación elevada de esta selección a concentraciones mayores de metotrexato (es decir, 600 nM, 800 nM, 1000 nM y 1200 nM) y, al igual que antes, los clones resistentes se dejaron reposar y, a continuación se transfirieron a placas de 96 pocillos y se analizaron.

4.

Cultivo de líneas celulas de CHO estables que expresan TPO332 y TPO153 recombinantes humanas.

[0179] Las células se descongelaron y se expandió la población celular mediante métodos estándar de crecimiento celular en medio libre de suero o que contenía suero. Después de la expansión hasta una densidad celular suficiente, las células se lavaron para eliminar el medio de cultivo celular utilizado. A continuación, las células se cultivan mediante cualquier método estándar que incluye; cultivo por lotes, alimentación por lotes o continua a 2540°C, pH neutro, con un contenido de O 2 disuelto de por lo menos el 5% hasta que se acumula la TPO constitutivamente secretada. A continuación, el fluido del cultivo celular se separa de las células mediante medios mecánicos, tales como centrifugación.

5.

Purificación de TPO recombinante humana de fluidos de cultivos de CHO

[0180] Se aplica directamente el fluido de cultivo celular recogido (HCCF) a una columna BLUE-SEPHAROSE 6 FAST FLOW (Pharmacia) equilibrada en fosfato de sodio 0,01 M de pH 7,4, NaCl 0,15 M a una proporción de aproximadamente 100 L de HCCF por litro de resina y a una velocidad de flujo lineal de aproximadamente 300 ml/h/cm2. A continuación, la columna se lava con 3 a 5 volúmenes de columna de tampón de equilibrio seguido de 3 a 5 volúmenes de columna de fosfato de sodio 0,01 M a pH 7,4, urea 2,0 M. A continuación, la TPO se eluye con 3 a 5 volúmenes de columna de fosfato de sodio 0,01 M a pH 7,4, urea 2,0 M, NaCl 1,0 M. El fluido de BLUE-SEPHAROSE que contenía TPO se aplica a continuación a una columna de SEPHAROSE 6 MB con lectinas de germen de trigo (Pharmacia) equilibrada en fosfato de sodio 0,01 M a pH 7,4, urea 2,0 M y NaCl 1,0 M a una proporción de 8 a 16 ml de fluido de BLUE-SEPHAROSE por ml de resina a una velocidad de flujo de aproximadamente 50 ml/h/cm2. A continuación, la columna se lava con 2 a 3 volúmenes de columna de tampón de equilibrio. A continuación, la TPO se eluye con 2 a 5 volúmenes de columna de fosfato de sodio 0,01 M a pH 7,4, urea 2,0 M, N-acetil-D-glucosamina 0,5 M.

[0181] A continuación, el fluido de lectina de germen de trigo se ajusta hasta una concentración final de C12E8 al 0,04% y ácido trifluoroacético (TFA) al 0,1%. El fluido resultante se aplica a una columna de fase inversa C4 (Vydac

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214TP1022) equilibrada en TFA al 0,1%, C12E8 al 0,04% a una carga de aproximadamente 0,2 a 0,5 mg de proteína por ml a una velocidad de flujo de 157 ml/h/cm2.

[0182] La proteína se eluye en un gradiente lineal de dos fases de acetonitrilo que contiene TFA al 0,1%, C12E8 al 0,04%. La primera fase está compuesta de un gradiente lineal de 0 a 30% de acetonitrilo en 15 minutos, la segunda fase está compuesta de un gradiente lineal de 30 a 60% de acetonitrilo en 60 minutos. La TPO se eluye a aproximadamente el 50% de acetonitrilo. Se produce un fluido en la base de SDS-PAGE.

[0183] A continuación, el fluido de C4 se diluye con 2 volúmenes de fosfato de sodio 0,0 M a pH 7,4, NaCl 0,15 M y se diafiltra frente a aproximadamente 6 volúmenes de fosfato de sodio 0,01 M a pH 7,4, NaCL 0,15 M en una membrana de ultrafiltración AMICOM YM o similar que tiene un corte de peso molecular de 10.000 a 30.000 Dalton. El diafiltrado resultante se puede procesar a continuación directamente o concentrarse posteriormente mediante ultrafiltración. El diafiltrado/concentrado se ajusta hasta una concentración final de TWEEN-80 al 0,01%.

[0184] A continuación, se aplica toda o una parte del diafiltrado/concentrado equivalente al 2 a 5% del volumen de columna calculado a una columna SEPHACRYL S-300 HR (Pharmacia) equilibrada en fosfato de sodio 0,01 M a pH 7,4, NaCl 0,15 M, TWEEN-80 al 0,01% y se cromatografió a una velocidad de flujo de aproximadamente 17 ml/h/cm2. Las fracciones que contenían TPO que están libres de productos agregados y productos de degradación proteolítica se agrupan en la base de SDS-PAGE. El fluido resultante se filtra en un filtro de 0,22 micras, MILLEX-GV

o similar, y se almacena a 2-8°C.

Ejemplo 6

[0185] Se aísla un ácido nucleico que codifica una secuencia nativa de trombopoyetina humana tal como se describe en el ejemplo 5. El ácido nucleico que codifica una secuencia nativa de trombopoyetina humana se modifica para codificar una trombopoyetina recombinante humana modificada en uno o más aminoácidos 318-332 ó 312-331 (epítopo predicho). El método utilizado para modificar la secuencia de ácidos nucleicos para codificar la trombopoyetina humana modificada es la mutagénesis dirigida de sitio.

[0186] El ácido nucleico modificado se transforma en células CHO para la expresión del polipéptido modificado tal como se describe en el ejemplo 5 para la trombopoyetina recombinante humana de secuencia nativa. El polipéptido modificado se aísla y purifica de células CHO tal como se describe en el ejemplo 5.

[0187] A continuación, se analiza el polipéptido modificado por la unión a un anticuerpo para el polipéptido de un humano o población de sujetos humanos sin tratar. El polipéptido modificado se incuba en un ensayo ELISA tal como se describe en el ejemplo 2 con anticuerpos para el polipéptido de una población humana sin tratar y/o con anticuerpos de una población humana o animal dosificada con el polipéptido. A continuación, se analiza un polipéptido modificado que tiene una unión reducida a los anticuerpos por la actividad terapéutica de trombopoyetina.

[0188] El polipéptido modificado se incuba en un ensayo de unión a receptor c-mpl y se compara con trombopoyetina humana no modificada o nativa obtenida de Genentech, Inc. de San Francisco. La capacidad de la trombopoyetina modificada de unirse al receptor se puede medir y comparar con la unión de trombopoyetina no modificada. Además, el polipéptido modificado se puede incubar con la célula megacariocito HU3 (disponible en la Hahnemann University of Philadelphia, Pa) y se mide la capacidad del polipéptido modificado de estimular la proliferación de la línea celular de megacariocitos HU3 utilizando un método estándar y se compara con la actividad de la trombopoyetina no modificada. El polipéptido modificado tiene preferiblemente aproximadamente el 60% o más, más preferiblemente aproximadamente el 90% o más de la actividad biológica de la trombopoyetina no modificada.

[0189] La memoria, ejemplos y datos anteriores proporciona una completa descripción de la fabricación y utilización de la composición de la invención. Dado que muchas realizaciones de la invención se pueden realizar sin apartarse del alcance de la invención, la invención reside en las reivindicaciones que se acompañan en la presente invención.

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Claims (12)

1. REIVINDICACIONES

   1. Método de modificación de un polipéptido terapéutico, que comprende:

   5 (a) identificar por lo menos un epítopo inmunodominante en el polipéptido utilizando un anticuerpo o población de anticuerpos obtenidos de un humano sin tratar o animal sin tratar o una población de los mismos, donde el polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a la secuencia nativa de un homólogo de polipéptido endógeno en el mismo humano o la misma especie de animal o un fragmento biológicamente activo del polipéptido endógeno, donde el anticuerpo o anticuerpos no inhiben

   10 sustancialmente una actividad terapéutica del polipéptido; y el epítopo inmunodominante no se localiza en una región del polipéptido que proporciona una actividad terapéutica del polipéptido; y

   (b) modificar el epítopo inmunodominante para reducir una respuesta inmune al polipéptido a la vez que mantiene una actividad terapéutica sustancial del polipéptido.

   15 2. Método según la reivindicación 1, donde el polipéptido se selecciona del grupo que consiste en trombopoyetina humana, hormonas de crecimiento, citoquinas y receptores.

2. 3.

   Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, donde el animal se selecciona del grupo que consiste en humanos, primates, ganado, cerdos, aves de corral y ratones.

3. 4.

   Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde la modificación es una deleción de por lo menos un epítopo inmunodominante.

4. 5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde la modificación es una modificación de por lo menos 25 un aminoácido en el epítopo inmunodominante mediante N-glicosilación o pegilación.
5. 6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde la modificación es una mutación de uno o más aminoácidos en por lo menos un epítopo inmunodominante.

   30 7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, donde el polipéptido se produce en una fuente no humana.

6. 8.

   Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, donde el polipéptido es un anticuerpo humanizado.

7. 9.

   Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, donde el epítopo inmunodominante se identifica mediante la

   35 unión tanto al anticuerpo como a una población de anticuerpos de un humano sin tratar o animal sin tratar o una población de los mismos y mediante la unión a un anticuerpo o población de anticuerpos de un humano o animal o población de los mismos tratados con el polipéptido terapéutico.
8. 10. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-9, donde la etapa de identificación comprende identificar por

   40 lo menos un epítopo inmunodominante en el polipéptido terapéutico utilizando un algoritmo, y confirmar que un epítopo predicho es un epítopo inmunodominante mediante la inmunoreacción de un péptido que tiene la secuencia del epítopo predicho con el anticuerpo o población de anticuerpos específicos para el polipéptido terapéutico de un humano sin tratar o animal sin tratar o población de los mismos.

   45 11. Método según la reivindicación 10, donde la identificación de por lo menos un epítopo inmunodominante comprende:

   a) proporcionar un grupo de datos del polipéptido terapéutico; b) analizar el grupo de datos con un algoritmo para identificar por lo menos un epítopo predicho en el 50 polipéptido terapéutico.
9. 12. Método según la reivindicación 11, donde el grupo de datos es la secuencia lineal de aminoácidos del polipéptido en una forma legible por una máquina.

   55 13. Método según la reivindicación 11 o la reivindicación 12, donde el algoritmo es un algoritmo que predice epítopos que se unen a proteínas mayores de histocompatibilidad de clase II.
10. 14. Método según cualquiera de las reivindicaciones 11-13, donde el algoritmo está implementado por un ordenador.

    60 15. Método según cualquiera de las reivindicaciones 10-14, que comprende además predecir si el epítopo inmunodominante se une a los alelos HLA DR y DQ.

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11. 16.

    Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-15, donde la modificación del epítopo inmunodominante comprende modificar una secuencia de ácidos nucleicos que codifica el polipéptido para codificar un polipéptido modificado.

12. 17.

    Método según la reivindicación 16, donde el polipéptido modificado es producido mediante el cultivo de células transformadas o transfectadas con un vector que contiene el ácido nucleico modificado.

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    Figura 1

    N-terminal (dominio Epo) Dominio C-terminal

    Factor principal de maduración de megacariocitos y producción de plaquetas de trombopoyetina (TPO)

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    Figura 2

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    Figura 3

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    Figura 5 E01988732 08-11-2011

    Figura 6

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    Figura 7A E01988732 08-11-2011

    Figura 7B