ES2269509T3 - Gen expresado altamente en el tejido cartilaginoso. - Google Patents

Abstract

Molécula aislada de ácido nucleico que comprende ADN que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con un (a) una molécula de ADN que codifica al polipéptido PRO21074 que comprende la secuencia de residuos de amino ácido desde 1 o 24 hasta 1313 de la figura 2, o (b) el complemento de la molécula de ADN de (a).

Description

Gen expresado altamente en el tejido cartilaginoso.

Campo de la invención

La presente invención se refiere generalmente a la identificación y aislamiento de ADN nuevo y a la producción recombinante de polipéptidos nuevos que tienen similitud en la secuencia al inhibidor humano de inter alfa tripsina (ITI), designados aquí como polipéptidos "PRO21074". La presente invención se refiere generalmente además al diagnóstico y tratamiento de desórdenes cartilaginosos.

Antecedentes de la invención

Las proteínas extracelulares cumplen roles importantes en, entre otras cosas, la formación, diferenciación y mantenimiento de organismos multicelulares. El hecho de que muchas células individuales, por ejemplo, proliferen, migren, se diferencien o interactúen con otras células, está típicamente gobernado mediante la información recibida de otras células y/o del medio ambiente inmediato. Esta información con frecuencia es transmitida mediante polipéptidos secretados (por ejemplo, factores mitogénicos, factores de supervivencia, factores citotóxicos, factores de diferenciación, neuropéptidos y hormonas) que son, a su vez, recibido e interpretados mediante diversos receptores celulares o proteínas unidas a la membrana celular. Estos polipéptidos secretados o moléculas señalizadoras normalmente pasan a través del pasaje secretor celular para alcanzar su lugar de acción en el medio ambiente extracelular.

Las proteínas secretadas tienen diversas aplicaciones industriales, incluyendo farmacéuticas, diagnósticas, biosensores y birreactores. La mayoría de las drogas de proteína disponibles en el presente, tales como los agentes trombolíticos, interferones, interleuquinas, eritropoyetinas, factores estimulantes de la colonia, y otras citoquinas diversas, son proteínas de secreción. Sus receptores, que son proteínas de la membrana, también tienen potencial como agentes terapéuticos o de diagnóstico. Se han hecho esfuerzos tanto por la industria como por la academia para identificar proteínas secretadas nativas nuevas. Muchos esfuerzos se han enfocado en la detección de bibliotecas de ADN recombinante de mamíferos para identificar las secuencias de codificación para proteínas secretadas nuevas. Ejemplos de procedimientos y técnicas de detección se describen en la literatura [ver por ejemplo, Klein et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 93:7108-7113 (1996); Patente U.S. Nº 5.536.637)].

El inhibidor inter alfa tripsina (TIT) es una glicoproteína del plasma humano comprendida por un complejo de tres proteínas diferentes: bicunina y cadenas pesadas, H1 y H2. Morelle et al. demostraron que estas tres cadenas están unidas de forma covalente mediante una cadena de sulfato de condrotina. (Eur. J. Biochem., 221(2):881-8(1994)). Ver también, Enghild, J.J. et al., J. Biol. Chem. 268(12):8711-8716 (1993). Bost et al. informaron que ARNm de la cadena pesada de ITI, H1, se encuentra exclusivamente en tejido hepático. Bost F. et al., Eur. J. Biochem. 218(2):283-91 (1993).

Se ha encontrado que el ITI humano inactiva la tripsina, quimotripsina, elastasa neutrófila y catespina humanas G. Morii, M. and Travis, J., Biol. Chem. Hoppe Seyler 366(1):19-21 (1985). Se ha informado que las cadenas pesadas contienen sitios potenciales de unión calcio y regiones homólogas al sitio reactivo propuesto para inhibidores tiol-proteasa, indicando que el ITI es una proteína compleja, multifuncional. Salier, J.P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84(23):8272-6 (1987). Por otra parte, la interacción del ITI y ácido hialurónico se cree que juega un rol crítico en la organización y estabilización de la matriz extracelular. H. Kobayashi et al., Cell Tissue Res. 296:587-597
(1999).

También se ha sugerido que el ITI puede actuar como un portador de hialurona en suero, o como una proteína de unión entre hialurona y otras proteínas de la matriz, y que puede jugar un rol en la estimulación de células fagocíticas.

Se ha sugerido además que el ITI, como inhibidor de las proteasas de serina, puede proteger los condorcitos articulares y evitar el daño del cartílago en desórdenes cartilaginosos. D.C. Fischer et al., Artritis Rheum. 42(9):1936-45 (1999).

Describimos aquí la identificación y caracterización de nuevos polipéptidos que tienen secuencia similar al inhibidor inter alfa tripsina (ITI), designados como polipéptidos PRO21074, y su uso potencial en el diagnóstico y tratamiento de desórdenes cartilaginosos.

Descripción de la invención

La presente solicitud describe procedimientos para el diagnóstico y tratamiento de desórdenes cartilaginosos. Por otra parte, la presente invención proporciona un clon ADNc (designado aquí como ADN 153576-2925) - identificado por ser homólogo al ácido nucleico que codifica el inhibidor inter alfa tripsina (ITI) - que codifica un polipéptido nuevo, designado en la presente solicitud como "PRO21074".

En una realización, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótido que codifica el polipéptido PRO21074.

En un aspecto, la molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia de nucleótido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 81% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 82% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 83% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 84% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 85% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 86% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 87% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 88% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 89% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 90% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 91% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 92% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 93% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 94% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 96% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 97% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 98% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 99% de identidad de secuencia con (a) una molécula de ADN que codifica un polipéptido PRO21074 que tiene la secuencia de residuos de amino ácido de 1 o 24 a 1313, inclusive, de la figura 2 (SEQ ID NO:2), o (b) el complemento de la molécula de ADN de (a).

En otro aspecto, la molécula de ácido nucleico aislada comprende (a) una secuencia de nucleótido que codifica a un polipéptido PRO21074 que tiene los residuos de la secuencia de amino ácido de 1 o 24 a 1313, inclusive, de la figura 2 (SEQ ID No:2), o (b) el complemento de la secuencia de nucleótido de (a).

La molécula de ácido nucleico aislada puede comprender una secuencia de nucleótido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 81% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 82% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 83% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 84% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 85% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 86% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 87% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 88% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 89% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 90% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 91% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 92% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 93% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 94% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 96% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 97% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 98% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 99% de identidad de secuencia de (a) una molécula de ADN que tiene la secuencia de nucleótidos de 31 o 100 a 3969, inclusive, de la figura 1 (SEQ ID NO: 1), o (b) el complemento de la molécula de ADN de (a).

La molécula de ácido nucleico aislada puede comprender (a) la secuencia de nucleótido de entre 31 o 100 a 3969, inclusive, de la figura 1 (SEQ ID NO:1), o (b) el complemento de la secuencia de nucleótido de (a).

En un aspecto adicional, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 81% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 82% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 83% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 84% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 85% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 86% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 87% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 88% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 89% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 90% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 91% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 92% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 93% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 94% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 96% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 97% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 98% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 99% de identidad de secuencia de (a) una molécula de ADN que codifica el mismo polipéptido maduro codificado mediante en ADNc humano depositado con el ATCC el 23 de mayo, 2000, bajo ATCC Depósito Nº 1907-PTA (DNA 153576-2925) o (b) el complemento de la molécula de ADN de (a). En una realización preferida, la molécula de ácido nucleico aislada comprende (a) una secuencia de nucleótido que codifica el mismo polipéptido maduro codificado mediante el ADNc humano depositado con el ATCC el 23 de mayo, 2000 bajo del ATCC Depósito Nº 1907-PTA (DNA 153576-2925) o (b) el complemento de la secuencia de nucleótido de (a).

En otro aspecto, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 81% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 82% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 83% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 84% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 85% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 86% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 87% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 88% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 89% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 90% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 91% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 92% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 93% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 94% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 96% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 97% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 98% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 99% de identidad de secuencia de (a) la secuencia de codificación completa del polipéptido del ADNc depositado con el ATCC el 23 de mayo, 2000 bajo ATCC Deposit Nº 1907-PTA (DNA 153576-2925) o (b) el complemento de la secuencia de nucleótido de (a). En una realización preferida, la molécula de ácido nucleico aislada comprende (a) la secuencia de codificación completa del polipéptido del ADN depositado con el ATCC el 23 de mayo, 2000 bajo ATCC Deposit Nº 1907-PTA (DNA 153576-2925) o (b) el complemento de la secuencia de nucleótido de (a).

En otro aspecto, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un polipéptido PRO21074 activo como se define a continuación que comprende una secuencia de nucleótido que comprende al menos 2036 nucleótidos que hibridizan al complemento de una secuencia de ácido nucleico que codifica amino ácidos 1 o 24 a 1313, inclusive, de la figura 2 (SEQ ID NO: 2). La hibridación se produce bajo condiciones rigurosas de hibridación y lavado.

La solicitud también describe una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un polipéptido PRO21074 activo como se define a continuación que comprende una secuencia de nucleótido que hibridiza al complemento de la secuencia de ácido nucleico entre aproximadamente nucleótidos 31 o 100 a 3936, inclusive, de la figura 1 (SEQ ID NO: 1). Preferentemente, la hibridación se produce bajo condiciones rigurosas de hibridación y lavado.

En un aspecto adicional, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que tiene al menos 2036 nucleótidos y que se produce mediante la hibridación de una molécula de ADN de prueba bajo condiciones rigurosas con (a) una molécula de ADN que codifique un polipéptido PRO21074 que tiene la secuencia de residuos de amino ácidos de 1 o 24 a 1313, inclusive, de la figura 2 (SEQ ID NO: 2), o (b) el complementario de la molécula de ADN de (a), y, si la molécula de ADN de prueba tiene al menos 80% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 81% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 82% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 83% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 84% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 85% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 86% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 87% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 88% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 89% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 90% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 91% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 92% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 93% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 94% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 96% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 97% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 98% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 99% de identidad de secuencia de (a) o (b), y aislando la molécula de ADN de prueba.

En un aspecto específico, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende ADN que codifica un polipéptido PRO21074 sin la secuencia de señal N-terminal y/o la metionina inicial, o es complementaria a dicha molécula de ácido nucleico de codificación. El péptido señal se ha identificado tentativamente extendiéndose desde aproximadamente la posición amino ácido 1 hasta aproximadamente la posición amino ácido 23 en la secuencia de la figura 2 (SEQ ID NO: 2). Se observa, sin embargo, que la unión C terminal del péptido señal puede variar, pero más probablemente en no más de 5 amino ácidos a cada lado de la unión C terminal del péptido señal como inicialmente se identificó aquí, donde la unión C terminal del péptido señal puede identificarse de conformidad con el criterio empleado rutinariamente en la técnica para identificar dicho tipo de secuencia elemento de amino ácido (e.g., Nielsen et al., Prot. Eng. 10:1-6 (1997) y von Heinje et al., Nucl. Acids. Res. 14:4683-4690 (1986)). Por otro lado, también se reconoce que, en algunos casos, la división de una secuencia de señal a partir de un polipéptido secretado no es completamente uniforme, resultando en más de una especie secretada. Estos polipéptidos, y los poli nucleótidos que codifican el polipéptido PRO21074 mostrado en la figura 2 (SEQ ID NO: 2) se extienden desde amino ácidos 1 a X de la figura 2 (SEQ ID NO: 2), donde X es cualquier amino ácido de 18 a 28 de la figura 2 (SEQ ID NO: 2). Por lo tanto, las formas maduras del polipéptido PRO21074 que están englobadas en la presente invención incluyen aquellas que comprenden amino ácidos X a 1313 de la figura 2 (SEQ ID NO: 2), donde X es cualquier amino ácido de 18 a 28 de la figura 2 (SEQ ID NO: 2) y variantes del mismo como se describe a continuación. También se contemplan las moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican estos polipéptidos.

La presente solicitud también describe fragmentos de poli nucleótidos de una secuencia de codificación del polipéptido PRO21074 que pueden encontrar uso como, por ejemplo, sonda de hibridación o para codificar fragmentos de un polipéptido PRO21074 que puede opcionalmente codificar un polipéptido que comprende un sitio de unión para un anticuerpo anti-PRO21074. Tales fragmentos de ácido nucleico pueden al menos tener aproximadamente 20 nucleótidos de longitud, alternativamente al menos aproximadamente 30 nucleótidos de longitud, alternativamente al menos aproximadamente 40 nucleótidos de longitud, alternativamente al menos aproximadamente 50 nucleótidos de longitud, alternativamente al menos aproximadamente 60 nucleótidos de longitud, alternativamente al menos aproximadamente 70 nucleótidos de longitud, alternativamente al menos aproximadamente 80 nucleótidos de longitud, alternativamente al menos aproximadamente 90 nucleótidos de longitud, alternativamente al menos aproximadamente 100 nucleótidos de longitud, alternativamente al menos aproximadamente 110 nucleótidos de longitud, alternativamente al menos aproximadamente 120 nucleótidos de longitud, alternativamente al menos aproximadamente 130 nucleótidos de longitud, alternativamente al menos aproximadamente 140 nucleótidos de longitud, alternativamente al menos aproximadamente 150 nucleótidos de longitud, alternativamente al menos aproximadamente 160 nucleótidos de longitud, alternativamente al menos aproximadamente 170 nucleótidos de longitud, alternativamente al menos aproximadamente 180 nucleótidos de longitud, alternativamente al menos aproximadamente 190 nucleótidos de longitud, alternativamente al menos aproximadamente 200 nucleótidos de longitud, alternativamente al menos aproximadamente 250 nucleótidos de longitud, alternativamente al menos aproximadamente 300 nucleótidos de longitud, alternativamente al menos aproximadamente 350 nucleótidos de longitud, alternativamente al menos aproximadamente 400 nucleótidos de longitud, alternativamente al menos aproximadamente 450 nucleótidos de longitud, alternativamente al menos aproximadamente 500 nucleótidos de longitud, alternativamente al menos aproximadamente 600 nucleótidos de longitud, alternativamente al menos aproximadamente 700 nucleótidos de longitud, alternativamente al menos aproximadamente 800 nucleótidos de longitud, alternativamente al menos aproximadamente 900 nucleótidos de longitud y alternativamente al menos aproximadamente 1000 nucleótidos de longitud, donde en este contexto el término "aproximadamente" significa la longitud de secuencia del nucleótido mencionada más o menos 10% de la longitud mencionada. El fragmento de secuencia de nucleótido puede derivarse a partir de cualquier segmento mostrado en la figura 1 (SEQ ID NO: 1), por ejemplo, regiones de codificación y no traducidas. En una realización alternativa, el fragmento de secuencia de nucleótido se deriva a partir de cualquier región de codificación de la secuencia de nucleótido mostrada en la figura 1 (SEQ ID NO: 1). Se observa que los fragmentos nuevos de una secuencia de codificación de nucleótido de polipéptido PRO21074 puede determinarse en una forma rutinaria mediante la alineación de la secuencia de codificación de nucleótido de polipéptido con otras secuencias de nucleótidos conocidas utilizando cualquiera de un número de programas de alineación de secuencias conocidos y determinando qué fragmento(s) de secuencia de codificación de nucleótido del polipéptido PRO21074 son nuevos. Todas dichas secuencias de codificación de nucleótido del polipéptido PRO21074 se contemplan aquí y pueden determinarse sin demasiada experimentación. También se contemplan los fragmentos de polipéptido PRO 21074 codificados por estos fragmentos de molécula de nucleótido, preferentemente aquellos fragmentos de polipéptido PRO21074 que comprenden un sitio de unión para un anticuerpo anti-PRO21074.

En otra realización, la invención proporciona un vector que comprende una secuencia de nucleótido que codifica PRO21074. Este vector puede comprender cualquiera de las moléculas aisladas de ácido nucleico aquí previamente identificadas.

En otra realización, la invención proporciona una célula huésped que comprende un vector que codifica PRO21074 o sus variantes. A modo de ejemplo, las células huésped puede ser células CHO, E. coli, o levadura.

En otra realización, la invención proporciona un procedimiento para producir polipéptidos PRO21074 que comprenden cultivar células huésped bajo condiciones adecuadas para la expresión de PRO21074 y recuperación de PRO21074 a partir de cultivo celular.

En otra realización, la invención proporciona polipéptido PRO21074 aislado codificado mediante cualquiera de las secuencias de ácido nucleico aisladas aquí previamente identificadas.

En un aspecto específico, la invención proporciona una secuencia aislada nativa de polipéptido PRO21074, que en ciertas realizaciones, incluye una secuencia de amino ácido que comprende residuos desde aproximadamente 1 o aproximadamente 24 hasta aproximadamente 1313 de la figura 2 (SEQ ID NO: 2).

En otro aspecto, la invención proporciona un polipéptido PRO21074 aislado, que comprende una secuencia de amino ácido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 81% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 82% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 83% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 84% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 85% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 86% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 87% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 88% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 89% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 90% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 91% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 92% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 93% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 94% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 96% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 97% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 98% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 99% de identidad de secuencia de la secuencia de residuos de amino ácido de 1 o 24 a 1313, inclusive, de la figura 2 (SEQ ID NO: 2).

En un aspecto adicional, la invención proporciona un polipéptido PRO21074 aislado que comprende una secuencia de amino ácido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 81% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 82% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 83% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 84% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 85% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 86% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 87% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 88% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 89% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 90% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 91% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 92% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 93% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 94% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 96% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 97% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 98% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 99% de identidad de secuencia de una secuencia de amino ácido codificada mediante el ADNc depositado con el ATCC el 23 de mayo, 2000 bajo ATCC Deposit Nº 1907-PTA (DNA 153576-2925). En una realización preferida, el polipéptido PRO21074 aislado comprende una secuencia de amino ácido codificada mediante el ADNc depositado con el ATCC el 23 de mayo, 2000 bajo ATCC Deposit Nº 1907-PTA (DNA 153576-2925).

En un aspecto específico, la invención proporciona un polipéptido PRO21074 aislado sin la secuencia de señal N-terminal y/o la metionina inicial y está codificado mediante una secuencia de nucleótido que codifica dicha secuencia de amino ácido como se ha descrito aquí previamente. Los procedimientos para producir el mismo también se describen aquí, en donde dichos procedimientos comprenden cultivar una célula huésped que comprende un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de codificación apropiada bajo condiciones adecuadas de expresión del polipéptido PRO21074 y recuperar el polipéptido PRO21074 a partir del cultivo celular.

En otro aspecto adicional, la invención proporciona un polipéptido PRO21074 aislado, que comprende la secuencia de residuos de amino ácido desde 1 o 24 a 1313, inclusive, de la figura 2 (SEQ ID NO: 2). La identificación de los fragmentos de polipéptido PRO21074 que poseen actividad biológica o proporcionan un sitio de unión para un anticuerpo anti-PRO21074 pueden conseguirse a través de una forma rutinaria utilizando técnicas que son conocidas en la técnica. Preferentemente, el fragmento PRO21074 retiene una actividad biológica cualitativa de un polipéptido PRO21074.

En otro aspecto más, la invención proporciona un polipéptido producido mediante (i) hibridación de una molécula de ADN de prueba bajo condiciones rigurosas con (a) una molécula de ADN que codifica un polipéptido PRO21074 que tiene una secuencia de residuos de amino ácido desde 1 o 24 hasta 1313, inclusive, de la figura 2 (SEQ ID NO: 2), o (b) el complemento de la molécula de ADN de (a), y si la molécula de ADN de prueba tiene al menos 80% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 81% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 82% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 83% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 84% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 85% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 86% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 87% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 88% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 89% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 90% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 91% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 92% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 93% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 94% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 96% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 97% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 98% de identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 99% de identidad de secuencia de (a) o (b), (ii) cultivar una célula huésped que comprende la molécula de ADN de prueba bajo condiciones adecuadas para la expresión del polipéptido, y (iii) recuperar el polipéptido a partir del cultivo celular.

En otra realización, la invención proporciona moléculas quiméricas que comprenden un polipéptido PRO21074 fusionado con un polipéptido o secuencia de amino ácido heterólogos, donde el polipéptido de PRO21074 puede comprender cualquier polipéptido PRO21074, variante o fragmento del mismo como aquí se describe con anterioridad. Un ejemplo de dicha molécula quimérica comprende un polipéptido PRO21074 fusionado con una secuencia de marca epitopo o una región Fc de una inmunoglobulina.

En otra realización, la invención proporciona un anticuerpo como se define a continuación que se une específicamente a un polipéptido PRO21074 como se ha descrito con anterioridad. Opcionalmente, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, un fragmento de anticuerpo o un anticuerpo de cadena simple.

La presente solicitud también describe agonistas y antagonistas de un polipéptido PRO21074 nativo como se define a continuación. El agonista o antagonista puede ser un anticuerpo anti-PRO21074 o una molécula pequeña.

La solicitud también describe un procedimiento para identificar agonistas o antagonistas de un polipéptido
PRO21074 que comprende poner en contacto el polipéptido PRO21074 con una molécula candidata y monitorizar una actividad biológica de mediación mediante dicho polipéptido PRO21074. Preferentemente, el polipéptido PRO21074 es un polipéptido PRO21074 nativo.

En otra realización adicional, la invención proporciona una composición de materia que comprende un polipéptido PRO21074, o un anticuerpo anti-PRO21074, en combinación con un portador. El portador es un portador farmacéuticamente aceptable.

La presente solicitud también proporciona el uso de un polipéptido PRO21074, o un agonista o antagonista del mismo como se ha descrito aquí, o un anticuerpo anti-PRO21074, para la preparación de un medicamento útil en el tratamiento de una condición que responde al polipéptido PRO21074, a un agonista o antagonista del mismo o a un anticuerpo anti-PRO21074.

También se describe aquí un procedimiento para utilizar un polipéptido PRO21074 para un procedimiento de diagnóstico o monitorización de la progresión de un desorden cartilaginoso. Dicho procedimiento puede comprender medir el nivel del polipéptido PRO21074 en el suero o líquido sinovial, donde un cambio en el nivel de dicho polipéptido relativo al tejido normal se correlaciona con la relativa severidad o pronóstico de dicho desorden. El polipéptido PRO21074 puede medirse en la orina o en la matriz del cartílago.

También se describe aquí un procedimiento de tratamiento de un mamífero que sufre un desorden cartilaginoso, que comprende administrar a dicho mamífero una cantidad terapéuticamente efectiva de un PRO21074. Opcionalmente el desorden cartilaginoso es un desorden cartilaginoso degenerativo. El desorden cartilaginoso degenerativo puede ser artritis, más específicamente osteoartritis o artritis reumatoide. Opcionalmente, el cartílago es un cartílago articular. El procedimiento puede comprender además la combinación de PRO21074 con una técnica quirúrgica estándar y/o una cantidad efectiva de al menos un agente del cartílago. Opcionalmente, el PRO21074 comprende además un portador, excipiente o estabilizador.

La solicitud también describe un procedimiento de tratamiento de un mamífero que sufre un desorden cartilaginoso, que comprende administrar a dicho mamífero una cantidad terapéuticamente efectiva de un antagonista de PRO21074. Opcionalmente el desorden cartilaginoso es un desorden cartilaginoso degenerativo. El desorden cartilaginoso degenerativo puede ser artritis, más específicamente osteoartritis o artritis reumatoide. El antagonista de PRO21074 puede ser un anticuerpo anti-PRO21074. Opcionalmente, el cartílago es un cartílago articular. El procedimiento puede comprender además la combinación del antagonista de PRO21074 con una técnica quirúrgica estándar y/o una cantidad efectiva de al menos un agente del cartílago. Opcionalmente, el antagonista de PRO21074 comprende además un portador, excipiente o estabilizador.

La solicitud también describe un procedimiento para el tratamiento de un cartílago dañado o para evitar el daño de un cartílago, que comprende contactar dicho cartílago con una cantidad efectiva de un PRO21074 o un antagonista del mismo. El antagonista del PRO21074 puede ser un anticuerpo anti-PRO21074. El cartílago puede ser un cartílago articular. Más específicamente, el daño del cartílago se produce por un desorden cartilaginoso, aún más específicamente, un desorden cartilaginoso degenerativo. Aún más específicamente, el desorden cartilaginoso es artritis, incluyendo, por ejemplo, reumatoide y osteoartritis. Alternativamente, dicho daño puede resultar de una lesión, por ejemplo, microdaño o trauma cerrado, una fractura cartilaginosa, una fractura osteocartilaginosa, daño a tendones, meniscos o ligamentos o el resultado de excesiva tensión mecánica u otra inestabilidad biomecánica resultante de una lesión u obesidad. El cartílago puede estar contenido dentro de un mamífero, incluyendo humanos, y la cantidad administrada a dicho mamífero es una cantidad terapéuticamente efectiva. El polipéptido PRO21074 o el antagonista pueden administrarse a través de una inyección o infusión mediante administración intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, intramuscular, intralesional, intraarticular o tópica. Alternativamente, la composición puede inyectarse directamente en la región o articulación cartilaginosa afectada. El procedimiento puede comprender además una cantidad efectiva de un agente de cartílago y/o una técnica quirúrgica estándar. El polipéptido PRO21074 o el antagonista pueden administrarse antes, después y/o simultáneamente con la técnica quirúrgica estándar del cartílago. La cantidad efectiva de polipéptido PRO21074 o del antagonista puede comprender además una cantidad efectiva de agente de cartílago.

También se describe aquí un procedimiento de tratamiento de cartílago dañado o para evitar daño inicial o continuado que comprende contactar dicho cartílago con una cantidad efectiva de polipéptido PRO21074 en combinación con una cantidad efectiva de agente de cartílago. Opcionalmente, el cartílago se halla presente dentro de un mamífero y la cantidad administrada es una cantidad terapéuticamente efectiva.

También se describe aquí un procedimiento para mantener, mejorar o promover el crecimiento de condrocitos en cultivo sin suero mediante el cultivo de condrocitos con una cantidad efectiva de polipéptido PRO21074. Alternativamente, el procedimiento propone contactar dichos condrocitos con una cantidad efectiva de polipéptido PRO21074 en una formulación de liberación controlada o extendida.

También se describe aquí un procedimiento para tratar cartílago dañado o evitar el daño inicial o continuo, que comprende tratar células en y alrededor de las articulaciones con una cantidad efectiva de polipéptido PRO21074. Dicho tratamiento puede ocurrir mediante aplicación exógena del polipéptido PRO21074, o alternativamente, a través de la introducción de ácido nucleico que codifique PRO21074 o fragmentos del mismo, dentro de dichas células mediante transfección, infección, u otras técnicas estándar in vitro o in vivo. En técnicas de terapia in vitro puede comprender extraer una "célula en y alrededor de la articulación" introduciendo dicho ácido nucleico dentro de dicha célula, y transplantado de nuevo dicha célula en el tejido a partir del cual se extrajo inicialmente. Las células relacionadas al cartílago pueden ser condrocitos, sinoviocitos, fibroblastos, células de los tendones o ligamentos, osteoblastos o mioblastos.

Alternativamente, la solicitud describe un procedimiento de promoción de la adherencia de los condrocitos entre sí o a la matriz de cartílago. En un aspecto específico, la adherencia se produce en un cultivo sin suero in vitro. La adherencia puede producirse in vivo.

La solicitud también describe un equipo terapéutico, que comprende PRO21074 y un portador, excipiente, y/o estabilizador (por ejemplo, un tampón) en un embalaje adecuado. El equipo contiene preferentemente instrucciones para utilizar el PRO21074 para tratar cartílago dañado o para evitar daño inicial o continuado al cartílago como resultado de lesión o desorden cartilaginoso. Alternativamente, el equipo puede contener instrucciones para utilizar el PRO21074 para tratar un desorden cartilaginoso. También se describe aquí un artículo de fabricación, que
comprende:

un contenedor,

una instrucción en el contenedor; y

una composición que comprende un agente activo contenido en el contenedor;

donde la composición es efectiva para tratar un desorden cartilaginoso, la instrucción en el contenedor indica que la composición puede utilizarse para tratar un desorden cartilaginoso, y el agente activo en la composición es un polipéptido PRO21074.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 muestra la secuencia de nucleótido (SEQ ID NO: 1) de un ADNc que contiene secuencia de nucleótido (nucleótidos 31-3969) que codifica la secuencia nativa de PRO21074, donde la secuencia de nucleótido (SEQ ID NO: 1) es un clon designado aquí como AADN 15376-2925''. También se presentan en letra negrita y subrayada las posiciones de los respectivos codones de inicio y de terminación.

La figura 2A-B muestra la secuencia de amino ácido (SEQ ID NO: 2) de una secuencia nativa de polipéptido PRO21074 derivado a partir de la secuencia de codificación de SEQ ID NO: 1. También se muestran las ubicaciones aproximadas de otros dominios de polipéptidos.

La figura 3 muestra una secuencia de nucleótido designada aquí como ADN 144306 (SEQ ID NO: 3).

La figura 4 muestra un análisis de la expresión del ADN 153576 en bancos preparados a partir de un número de tejidos diferentes relativos a la expresión observada en cartílago articular fetal. Como se indica, la expresión parece ser altamente específica al cartílago. Para todas las muestras, se utilizaron 50 ng de banco de ADNc por reacción. Todas las muestras se normalizaron a beta actin y marcados relativos a la expresión ADN 153576 en el banco de cartílago articular fetal.

La figura 5 muestra un análisis de la expresión del ADN 153576 en distintos tejidos relativos a la expresión observada en cartílago articular fetal. El gráfico ilustra la expresión relativa que es muy específica al cartílago (adulto sano, enfermo y fetal) y al menisco. La cantidad de ARN utilizado por muestra de tejido fue 6-50 ng dependiendo de la muestra. Todas las muestras se normalizaron a beta actin y se marcaron relativas a la expresión del ADN 153576 en la muestra de cartílago articular de enfermedad degenerativa de la articulación (DJD). El nivel de expresión de ADN 153576 en el banco ADNc 682-3 cartílago articular fetal se tomó a partir del "cartílago" en la figura 4 y se incluyó para permitir comparaciones relativas entre las figuras 4 y 5.

La figura 6 muestra un análisis logarítmico expandido de la figura 5, ilustrando además la expresión de ADN 153576 en tejidos de la articulación relativos a la expresión observada en cartílago articular fetal.

Descripción detallada de las realizaciones preferidas I. Definiciones

Los términos "polipéptido PRO21074", "proteína PRO21074" y "PRO21074" cuando se utilizan aquí abarcan la secuencia nativa de PRO21074 y variantes del polipéptido PRO21074 (que se describen aquí adicionalmente). El polipéptido PRO21074 puede aislarse a partir de una variedad de fuentes, tales como a partir de tipos de tejidos humanos o a partir de otra fuente, o prepararse mediante procedimientos recombinantes y/o sintéticos.

Una "secuencia nativa de PRO21074" comprende un polipéptido que tiene la misma secuencia de amino ácido como un derivado de la naturaleza del PRO21074. Dicha secuencia nativa de PRO21074 pueden aislarse a partir de la naturaleza o pueden producirse a través de medios recombinantes y/o sintéticos. El término "secuencia nativa de PRO21074" engloba específicamente formas naturales truncadas o secretadas (por ejemplo, una secuencia de dominio extracelular), variantes de formas naturales (por ejemplo, formas combinadas alternativamente) y variantes alélicas naturales del PRO21074. En una realización de la invención, la secuencia nativa PRO21074 es una secuencia nativa de PRO21074 de longitud completa que comprende amino ácidos 1 a 1313 de la figura 2 (SEQ ID NO: 2). También mientras que el polipéptido PRO21074 descrito en la figura 2 (SEQ ID NO: 2) muestra que comienza con el residuo de metionina designado aquí como posición amino ácido 1, es concebible y posible que otro residuo de metionina ubicado tanto hacia arriba o hacia debajo de la posición amino ácido 1 en la figura 2 (SEQ ID NO: 2) puede emplearse como el residuo de amino ácido inicial del polipéptido PRO21074.

"Variante del polipéptido PRO21074" significa un polipéptido activo PRO21074 como se define más adelante que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con la secuencia de amino ácido de (a) residuos 1 o aproximadamente 24 a 1313 del polipéptido PRO21074 mostrado en la figura 2 (SEQ ID NO: 2), (b) X a 1313 del polipéptido PRO21074 mostrado en la figura 2 (SEQ ID NO: 2), donde X es cualquier residuo de amino ácido desde 18 a 28 de la figura 2 (SEQ ID NO: 2), o (c) otro fragmento específicamente derivado de la secuencia de amino ácido mostrada en la figura 2 (SEQ ID NO: 2). Dichas variantes de polipéptido PRO21074 incluye, por ejemplo, polipéptidos PRO21074 donde se añaden, o se eliminan, uno o más residuos de amino ácido, en los N- y/o C-terminales, así como dentro de uno o más dominios internos, de la secuencia de la figura 2 (SEQ ID NO: 2). Ordinariamente, una variante del polipéptido PRO21074 tendrá al menos al menos 80% de identidad de secuencia de amino ácido, alternativamente al menos aproximadamente 81% de identidad de secuencia de amino ácido, alternativamente al menos aproximadamente 82% de identidad de secuencia de amino ácido, alternativamente al menos aproximadamente 83% de identidad de secuencia de amino ácido, alternativamente al menos aproximadamente 84% de identidad de secuencia de amino ácido, alternativamente al menos aproximadamente 85% de identidad de secuencia de amino ácido, alternativamente al menos aproximadamente 86% de identidad de secuencia de amino ácido, alternativamente al menos aproximadamente 87% de identidad de secuencia de amino ácido, alternativamente al menos aproximadamente 88% de identidad de secuencia de amino ácido, alternativamente al menos aproximadamente 89% de identidad de secuencia de amino ácido, alternativamente al menos aproximadamente 90% de identidad de secuencia de amino ácido, alternativamente al menos aproximadamente 91% de identidad de secuencia de amino ácido, alternativamente al menos aproximadamente 92% de identidad de secuencia de amino ácido, alternativamente al menos aproximadamente 93% de identidad de secuencia de amino ácido, alternativamente al menos aproximadamente 94% de identidad de secuencia de amino ácido, alternativamente al menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia de amino ácido, alternativamente al menos aproximadamente 96% de identidad de secuencia de amino ácido, alternativamente al menos aproximadamente 97% de identidad de secuencia de amino ácido, alternativamente al menos aproximadamente 98% de identidad de secuencia de amino ácido, alternativamente al menos aproximadamente 99% de identidad de secuencia de amino ácido con (a) residuos 1 o aproximadamente 24 a 1313 del polipéptido PRO21074 mostrado en la figura 2 (SEQ ID NO: 2), (b) X a 1313 del polipéptido PRO21074 mostrado en la figura 2 (SEQ ID NO: 2), donde X es cualquier residuo de amino ácido de 18 a 28 de la figura 2 (SEQ ID NO: 2), o (c) otro fragmento específicamente derivado de la secuencia de amino ácido mostrada en la figura 2 (SEQ ID NO: 2). Las variantes de polipéptido PRO21074 no engloban la secuencia de polipéptido PRO21074 nativo. Ordinariamente, las variantes del polipéptido PRO21074 tienen una longitud de al menos aproximadamente 10 amino ácidos, con frecuencia de al menos aproximadamente 20 amino ácidos de longitud, con más frecuencia de al menos aproximadamente 30 amino ácidos de longitud, con más frecuencia de al menos aproximadamente 40 amino ácidos de longitud, con más frecuencia de al menos aproximadamente 50 amino ácidos de longitud, con más frecuencia de al menos aproximadamente 60 amino ácidos de longitud, con más frecuencia de al menos aproximadamente 70 amino ácidos de longitud, con más frecuencia de al menos aproximadamente 80 amino ácidos de longitud, con más frecuencia de al menos aproximadamente 90 amino ácidos de longitud, con más frecuencia de al menos aproximadamente 100 amino ácidos de longitud, con más frecuencia de al menos aproximadamente 150 amino ácidos de longitud, con más frecuencia de al menos aproximadamente 200 amino ácidos de longitud, con más frecuencia de al menos aproximadamente 250 amino ácidos de longitud, con más frecuencia de al menos aproximadamente 300 amino ácidos de longitud,
o más.

"Porcentaje (%) de identidad de secuencia de amino ácido" respecto a las secuencias de polipéptido PRO21074 aquí identificadas se define como el porcentaje de residuos de amino ácido en una secuencia candidata que son idénticos con los residuos de amino ácido en la secuencia de PRO21074, después de alinear las secuencias e introducir intervalos, si es necesario, para lograr el porcentaje máximo de identidad de secuencia, y sin considerar ninguna sustitución conservativa como parte de la identidad de secuencia. Las alineaciones para determinar el porcentaje de amino ácido de la identidad de secuencia pueden lograrse a través de distintos modos, que se hallan dentro de la habilidad en la técnica, por ejemplo: utilizar software públicamente disponible para ordenadores tal como BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 o software Megalign (DNASTAR). Aquellos entendidos en la técnica pueden determinar los parámetros apropiados para medir la alineación, incluyendo cualquier algoritmo necesario para lograr la máxima alineación sobre la longitud total de las secuencias que se comparan. Para los presentes propósitos, sin embargo, los valores % de amino ácido de la identidad de la secuencia se obtienen como se describe a continuación mediante el uso del programa de ordenador de comparación de secuencias ALIGN-2, donde el código fuente completa para el programa ALIGN-2 se proporciona en la Tabla 2. El programa de ordenador de comparación de secuencias ALIGN-2 fue escrito por Genentech, Inc. y el código fuente mostrado en la Tabla 2 se ha presentado con la documentación del usuario en la U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559, donde está registrado bajo U.S. Copyright Registration Nº TXU510087. El programa ALIGN-2 está disponible públicamente a través de Genentech, Inc., South San Francisco, California o puede recabarse desde el código fuente provisto en la Tabla 2. El programa ALIGN-2 debe recabarse para utilizarse en un sistema operativo UNIX, preferentemente UNIX V4.0D digital. Todos los parámetros de comparación de secuencia se ajustan mediante el programa ALIGN-2 y no varían.

Para los presentes propósitos, el % de identidad de secuencia de amino ácido de una secuencia de amino ácido A dada hacia, con, o contra una secuencia de amino ácido B dada (que puede alternativamente expresarse como una secuencia de amino ácido A dada que tiene o comprende un cierto % de identidad de secuencia de amino ácido hacia, con o contra una secuencia de amino ácido B dada) se calcula como sigue:

100 veces la fracción X/Y

donde X es el número de residuos de amino ácido marcados como coincidencias idénticas mediante el programa de alineación de secuencia ALIGN-2 en dicha alineación del programa de A y B, y donde Y es el número total de residuos de amino ácido en B. Se observará que donde la longitud de la secuencia de amino ácido A no es igual a la longitud de la secuencia de amino ácido B, el % de identidad de secuencia de amino ácido de A a B no será igual al % de la identidad de secuencia de amino ácido de B a A. Como ejemplos de cálculos de % de identidad de secuencia de amino ácido, la Tabla 1A-B demuestran cómo calcular el % de identidad de secuencia de amino ácido de la secuencia de amino ácido designado como "Proteína de Comparación" a la secuencia de amino ácido designada "PRO".

A menos que se especifique especialmente de otra manera, todos los valores de % de identidad de secuencia de amino ácido aquí utilizados se obtienen como se describe con anterioridad utilizando el programa de ordenador de comparación de secuencia ALIGN-2. Sin embargo, el % de identidad de secuencia de amino ácido también puede determinarse utilizarse el programa de comparación de secuencia NCBI-BLAST2 (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997)). El programa de comparación de secuencia NCBI-BLAST2 puede descargarse en http://www.ncbi.nlm.nih.gov o de otra forma obtenerse a partir del National Institute of Health, Bethesda, MD. El NCBI-BLAST2 utiliza diversos parámetros de búsqueda, donde todos aquellos parámetros de búsqueda se ajustan a valores por defecto que incluyen, por ejemplo, "unmask = yes", "strand = all", "expected occurrences = 10", "minimum low complexity length = 15/5", "multi-pass e-value = 0.01", "constant for multi-pass = 25", "dropoff for final gapped alignment = 25" y "scoring matrix = BLOSUM62".

En situaciones donde se emplea NCBI-BLAST2 para comparaciones de secuencia de amino ácido, el % de identidad de secuencia de amino ácido de una secuencia de amino ácido A dada a, con o contra una secuencia de amino ácido B dada (que puede alternativamente expresarse como una secuencia de amino ácido A dada que tiene o comprende un cierto % de identidad de secuencia de amino ácido hacia, con o contra una secuencia de amino ácido B dada) se calcula como sigue:

100 veces la fracción X/Y

donde X es el número de residuos de amino ácido marcados como coincidencias idénticas mediante el programa de alineación de secuencia NCBI-BLAST2 en dicha alineación del programa de A y B, y donde Y es el número total de residuos de amino ácido en B. Se observará que donde la longitud de la secuencia de amino ácido A no es igual a la longitud de la secuencia de amino ácido B, el % de identidad de secuencia de amino ácido de A a B no será igual al % de la identidad de secuencia de amino ácido de B a A.

"Variante del poli nucleótido PRO21074" o "Variante de secuencia de ácido nucleico PRO21074" significa una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido PRO21074 activo como se define a continuación y que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia de ácido nucleico tanto con (a) una secuencia de ácido nucleico que codifica residuos 1 o aproximadamente 24 a 1313 del polipéptido PRO21074 mostrado en la figura 2 (SEQ ID NO: 2), (b) una secuencia de ácido nucleico que codifica amino ácidos X a 1313 del polipéptido PRO21074 mostrado en la figura 2 (SEQ ID NO: 2), donde X es cualquier residuo de amino ácido de 18 a 28 de la figura 2 (SEQ ID NO: 2), o (c) un secuencia de ácido nucleico que codifica otro fragmento específicamente derivado de la secuencia de amino ácido mostrada en la figura 2 (SEQ ID NO: 2). Ordinariamente, una variante de poli nucleótido PRO21074 tendrá al menos al menos 80% de identidad de secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 81% de identidad de secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 82% de identidad de secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 83% de identidad de secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 84% de identidad de secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 85% de identidad de secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 86% de identidad de secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 87% de identidad de secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 88% de identidad de secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 89% de identidad de secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 90% de identidad de secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 91% de identidad de secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 92% de identidad de secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 93% de identidad de secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 94% de identidad de secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 96% de identidad de secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 97% de identidad de secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 98% de identidad de secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 99% de identidad de secuencia de ácido nucleico tanto con (a) una secuencia de ácido nucleico que codifica residuos 1 o aproximadamente 24 a 1313 del polipéptido PRO2 mostrado en la figura 2 (SEQ ID NO: 2), (b) una secuencia de ácido nucleico que codifica amino ácidos X a 1313 del polipéptido PRO21074 mostrado en la figura 2 (SEQ ID NO: 2), donde X es cualquier residuo de amino ácido de 18 a 28 de la figura 2 (SEQ ID NO: 2), o (c) una secuencia de ácido nucleico que codifica otro fragmento específicamente derivado de la secuencia de amino ácido en figura 2 (SEQ ID NO: 2). Las variantes de poli nucleótido PRO21074 no engloban la secuencia del nucleótido PRO21074 nativo.

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Ordinariamente, las variantes de poli nucleótidos PRO21074 son de al menos aproximadamente 30 nucleótidos de longitud, con frecuencia de al menos aproximadamente 60 nucleótidos de longitud, más frecuentemente de al menos aproximadamente 90 nucleótidos de longitud, más frecuentemente de al menos aproximadamente 120 nucleótidos de longitud, más frecuentemente de al menos aproximadamente 150 nucleótidos de longitud, más frecuentemente de al menos aproximadamente 180 nucleótidos de longitud, más frecuentemente de al menos aproximadamente 210 nucleótidos de longitud, más frecuentemente de al menos aproximadamente 240 nucleótidos de longitud, más frecuentemente de al menos aproximadamente 270 nucleótidos de longitud, más frecuentemente de al menos aproximadamente 300 nucleótidos de longitud, más frecuentemente de al menos aproximadamente 450 nucleótidos de longitud, más frecuentemente de al menos aproximadamente 600 nucleótidos de longitud, más frecuentemente de al menos aproximadamente 900 nucleótidos de longitud, o más.

"Porcentaje (%) de identidad de secuencia de ácido nucleico" respecto a las secuencias de ácido nucleico que codifica el polipéptido PRO21074 aquí identificadas se define como el porcentaje de nucleótidos en una secuencia candidata que son idénticos con la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido PRO21074, después de alinear la secuencia e introducir intervalos, si es necesario, para lograr el máximo porcentaje de identidad de secuencia. La alineación con el propósito de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de ácido nucleico puede lograrse de varias formas que se hallan dentro de las habilidades de la técnica, por ejemplo, utilizando software para ordenadores disponible públicamente tal como BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 o software Megalign (DNASTAR). Aquellos entendidos en la técnica pueden determinar parámetros apropiados para medir la alineación, incluyendo cualquier algoritmo necesario para lograr alineación máxima sobre la longitud total de las secuencias que se comparan. Para los presentes propósitos, sin embargo, los valores de % de identidad de secuencia de ácido nucleico se obtienen como se describe a continuación mediante el uso del programa de ordenador de comparación de secuencia ALIGN-2, donde el código fuente completo para el programa ALIGN-2 se proporciona en la Tabla 2. El programa de ordenador de comparación de secuencia ALIGN-2 escrito por Genentech, Inc. y el código fuente mostrado en la Tabla 2 se ha presentado con documentación del usuario en la U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559, donde está registrado como U.S. Copyright Registration No. TXU510087. El programa ALIGN-2 está públicamente disponible a través de Genentech, Inc., South San Francisco, California o puede recopilarse a partir del código fuente provisto en la Tabla 2. El programa ALIGN-2 debe recopilarse para utilizarse en un sistema operativo UNIX, preferentemente UNIX V4.0D digital. Todos los parámetros de comparación de secuencia se ajustan mediante el programa ALIGN-2 y no varían.

Para los presentes propósitos, el % de identidad de secuencia de ácido nucleico de una secuencia de ácido nucleico C dada a, con o contra una secuencia de ácido nucleico D dada (que alternativamente puede expresarse como una secuencia de ácido nucleico C dada que tiene o comprende un cierto % de identidad de secuencia de ácido nucleico hacia, con o contra una secuencia de ácido nucleico D dada) se calcula como sigue:

100 veces la fracción W/Z

donde W es el número de nucleótidos marcados como coincidencias idénticas mediante el programa de alineación de secuencia ALIGN-2 en dicha alineación del programa de C y D, y donde Z es el número total de nucleótidos en D. Se observará que donde la longitud de la secuencia de ácido nucleico C no es igual a la longitud de la secuencia de ácido nucleico D, el % de identidad de secuencia de ácido nucleico de C a D no será igual al % de la identidad de secuencia de ácido nucleico de D a C. Como ejemplos de cálculos de % de identidad de secuencia de ácido nucleico, la Tabla 1C-D demuestra cómo calcular el % de identidad de secuencia de ácido nucleico de la secuencia de ácido nucleico designada como "ADN de comparación" con la secuencia de ácido nucleico designada "PRO-ADN".

A menos que se especifique de otra forma, todos los valores de % de identidad de secuencia de ácido nucleico aquí utilizados se obtienen como se describe con anterioridad utilizando el programa de ordenador de comparación de secuencia ALIGN-2. Sin embargo, el % de identidad de secuencia de ácido nucleico también puede determinarse utilizando el programa de comparación de secuencia NCBI-BLAST2 (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997)). El programa de comparación de secuencia NCBI-BLAST2 puede descargarse en http://www.ncbi.nlm.nih.gov o de otra forma obtenerse a partir del National Institute of Health, Bethesda, MD. El NCBI-BLAST2 utiliza diversos parámetros de búsqueda, donde todos aquellos parámetros de búsqueda se ajustan a valores por defecto que incluyen, por ejemplo, "unmask = yes", "strand = all", "expected occurrences = 10", "minimum low complexity length = 15/5", "multi-pass e-value = 0.01", "constant for multi-pass = 25", "dropoff for final gapped alignment = 25" y "scoring matrix = BLOSUM62".

En situaciones donde se emplea NCBI-BLAST2 para comparaciones de secuencia, el % de identidad de secuencia de ácido nucleico de una secuencia de ácido nucleico C dada a, con o contra una secuencia de ácido nucleico D dada (que puede alternativamente expresarse como una secuencia de ácido nucleico C dada que tiene o comprende un cierto % de identidad de secuencia de ácido nucleico hacia, con o contra una secuencia de ácido nucleico D dada) se calcula como sigue:

100 veces la fracción X/Y

donde W es el número de nucleótidos marcados como coincidencias idénticas mediante el programa de alineación de secuencia NCBI-BLAST2 en dicha alineación del programa de C y D, y donde Z es el número total nucleótidos en D. Se observará que donde la longitud de la secuencia de ácido nucleico C no es igual a la longitud de la secuencia de ácido nucleico D, el % de identidad de secuencia de ácido nucleico de C a D no será igual al % de la identidad de secuencia de ácido nucleico de D a C.

En otras realizaciones, las variantes de poli nucleótidos PRO21074 son moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido PRO21074 activo y que son capaces de hibridarse, preferentemente utilizando condiciones de hibridación y lavado rigurosas, con secuencias de nucleótidos que codifican la totalidad de la longitud del polipéptido PRO21074 mostrado en la figura 2 (SEQ ID NO: 2). Las variantes de polipéptido PRO21074 pueden ser aquellas que están codificadas mediante una variante de poli nucleótido PRO21074.

"Aislado", cuando se emplea aquí para describir los distintos polipéptidos, significa polipéptido que se ha identificado y separado y/o recuperado a partir de un componente de su ambiente natural. Preferentemente, el polipéptido aislado está libre de asociación con todos los componentes con los cuales está naturalmente asociado. Los componentes contaminantes de su ambiente natural son materiales que típicamente podrían interferir con usos diagnósticos o terapéuticos del polipéptido, y pueden incluir enzimas, hormonas, y otros solutos proteínicos o no proteínicos. En realizaciones preferidas, el polipéptido se purificará (1) en un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de secuencia de amino ácido N-terminal o interno mediante el uso de un secuenciador de copa giratoria, o (2) hasta la homogeneidad mediante SDS-PAGE bajo condiciones reductoras o no reductoras utilizando azul de Coomassie o, preferentemente, cementación con plata. El polipéptido aislado incluye polipéptido in situ dentro de células recombinantes; debido a que al menos un componente del ambiente natural del PRO21074 no estará presente. Ordinariamente, sin embargo, el polipéptido aislado se preparará mediante al menos una etapa de purificación.

Una molécula "aislada" de ácido nucleico que codifica un polipéptido PRO21074 es una molécula de ácido nucleico que se identifica y se separa a partir de al menos una molécula contaminante de ácido nucleico con la cual está ordinariamente asociada en la fuente natural del ácido nucleico que codifica el PRO21074. Preferentemente, el nucleico aislado está libre de asociación con todos los componentes con los cuales está naturalmente asociado. Una molécula aislada de ácido nucleico que codifica al PRO21074 es diferente a la forma o combinación en la cual se encuentra en la naturaleza. Las moléculas aisladas de ácido nucleico por lo tanto se distinguen de la molécula aislada de ácido nucleico que codifica al PRO21074 como existe en las células naturales. Sin embargo, una molécula aislada de ácido nucleico que codifica un polipéptido PRO21074 incluye moléculas de ácido nucleico que codifica PRO21074 contenidas en células que ordinariamente expresan PRO21074 donde, por ejemplo, la molécula de ácido nucleico está en una localización cromosómica diferente de aquella de las células naturales.

El término "secuencias de control" se refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia de codificación operativamente unida en un organismo huésped particular. Las secuencias de control que son adecuadas para procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia operativa, y un sitio de unión de ribosoma. Las células escaritas son conocidas por utilizar promotores, señales de poliadenilación, y potenciadores.

El ácido nucleico está "operativamente unido" cuando está colocado en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN para una guía presecuencia o secretora está operativamente unido a ADN para un polipéptido si está expresado como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador está operativamente unido a una secuencia de codificación si afecta la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión del ribosoma está operativamente unido a una secuencia de codificación si está ubicada de forma de facilitar la traducción. Generalmente "operativamente unido" significa que las secuencias de ADN que se unen son contiguas, y, en el caso de la guía de secreción, contiguas y en fase de lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen que ser contiguos. La unión se consigue mediante ligadura en sitios convenientemente limitados. Si dichos sitios no existen, los adaptadores sintéticos oligonucleótidos o montadores se utilizan de acuerdo con la práctica
convencional.

El término "anticuerpo" se utiliza en el sentido amplio y cubre, específicamente, por ejemplo, anticuerpos monoclonales anti-PRO21074 individuales (incluyendo agonista, antagonista, y neutralizando anticuerpos), composiciones de anticuerpos anti-PRO21074 con especificidad poliepitópica, anticuerpos anti-PRO21074 de cadena única, y fragmentos de anticuerpos anti-PRO21074 (ver a continuación). El término "anticuerpo monoclonal" como se utiliza aquí se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos substancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprende la población son idénticos excepto por posibles mutaciones producidas naturalmente que puede estar presentes en cantidades menores.

La "rigurosidad" de las reacciones de hibridación es fácilmente determinable por alguien con habilidad ordinaria en la técnica, y generalmente es un cálculo empírico que depende de longitud sonda, temperatura de lavado, y concentración de sal. En general, sondas más largas requieren temperaturas más altas para un templado adecuado, mientras que sondas más cortas necesitan temperaturas más bajas. La hibridación generalmente depende de la habilidad del ADN desnaturalizado para retemplarse cuando se presentan filamentos complementarios en un ambiente por debajo de su temperatura de fundición. A más alto el grado de homología deseado entre la sonda y la secuencia hibridable, más alta la temperatura relativa que puede usarse. Como resultado, se entiende que temperaturas relativas más altas tenderían a volver más rigurosas las condiciones de reacción, mientras que a temperaturas menores serían menores. Para detalles y explicación adicionales de rigurosidad de las reacciones de hibridación, ver Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995).

"Condiciones rigurosas" o "condiciones muy rigurosas", como se definen aquí, pueden identificarse mediante aquellas que: (1) emplean baja fuerza iónica y alta temperatura para lavar, por ejemplo 0,015 M cloruro de sodio/0,0015 M citrato de sodio/0,1% dodecil sulfato de sodio a 50ºC; (2) emplean durante la hibridación un agente desnaturalizante, tal como formamida, por ejemplo, 50% (v/v) formamida con 0,1% albúmina de suero bovino/0,1% Ficoll/0,1% polivinilpirrolidona/50 mM fosfato de sodio tampón a pH 6,5 con 750 mM cloruro de sodio, 75 mM citrato de sodio a 42ºC; o (3) emplean 50% formamida, 5 x SSC (0,75 M NaCl, 0,075 M citrato de sodio), 50 mM fosfato de sodio (pH 6,8), 0,1% pirofosfato de sodio, 5 x solución Denhardt's, ADN de esperma de salmón sonicado (50 \mug/ml), 0,1% SDS, y 10% sulfato dextran a 42ºC, con lavados a 42ºC en 0,2 x SSC (cloruro de sodio/citrato de sodio) y 50% formamida a 55ºC, seguido por un lavado altamente riguroso consistente en 0,1 x SSC que contiene EDTA a 55ºC.

"Condiciones moderadamente rigurosas" pueden identificarse como describe Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989, e incluyen el uso de una solución de lavado y condiciones de hibridación (por ejemplo, temperatura, fuerza iónica y % SDS) menos rigurosas que aquellas descritas con anterioridad. Un ejemplo de condiciones moderadamente rigurosas es la incubación durante toda la noche a 37ºC en una solución que comprende 20% formamida, 5 x SSC (150 mM NaCl, 15 mM citrato trisódico), 50 mM fosfato de sodio (pH 7,6), 5 x solución Denhardt's, 10% sulfato dextran, y 20 mg/ml de ADN desnaturalizado de esperma de salmón cortado, seguido por lavado de los filtros en 1 x SSC a aproximadamente 37-50ºC. El técnico entendido reconocerá cómo ajustar la temperatura, fuerza iónica, etc. según sea necesario para acomodar los factores tales como longitud de sonda y otros.

El término "epitope marcado" cuando se emplea aquí se refiere a un polipéptido quimérico que comprende un polipéptido PRO21074 fusionado con un "polipéptido marcador". El polipéptido marcador tiene suficientes residuos para proporcionar un epitope contra el cual puede hacerse un anticuerpo, pero es suficientemente corto de forma tal que no interfiere con la actividad del polipéptido al cual se fusiona. El polipéptido marcador preferentemente también es bastante único de forma que el anticuerpo substancialmente no interactúa con otros epitopes. Los polipéptidos marcadores adecuados generalmente tienen al menos seis residuos de amino ácido y usualmente entre 8 y 50 residuos de amino ácido (preferentemente, entre 10 y 20 residuos de amino ácido).

Como se emplea aquí, el término "inmunoadhesina" designa moléculas a modo de anticuerpos que combinan la especificidad de fijación de una proteína heteróloga (una "adhesina") con las funciones de un efector de los dominios constantes de inmunoglobulina. Estructuralmente, las inmunoadhesinas comprenden una fusión de una secuencia de amino ácido con la especificidad de fijación deseada que es distinta de la del sitio de reconocimiento y fijación del antígeno de un anticuerpo (es decir, es "heterólogo"), y una secuencia constante de dominio de una inmunoglobulina. La parte de adhesina de una molécula de inmunoadhesina típicamente es una secuencia de amino ácido contigua que comprende al menos el sitio de fijación de un receptor o ligando. La secuencia constante de dominio de la inmunoglobulina en la inmunoadhesina puede obtenerse a partir de cualquier inmunoglobulina, tal como de los subtipos IgG-1, IgG-2, IgG-3, o IgG-4, IgA (incluyendo IgA-1 e IgA-2), IgE, IgD o IgM.

"Activo" o "actividad" para los presentes propósitos se refiere aquí a forma(s) de PRO21074 que retienen una actividad biológica y/o inmunológica del PRO21074 nativo o producido naturalmente, donde actividad "biológica" se refiere a una función biológica (ya sea inhibidora o estimulante) provocada por un PRO21074 nativo o naturalmente producido distinta de la habilidad de inducir la producción de un anticuerpo contra un epitope antigénico poseído por un PRO21074 nativo o producido naturalmente y una actividad "inmunológica" se refiere a la actividad para inducir la producción de un anticuerpo contra un epitope antigénico poseída por un PRO21074 nativo o producido naturalmente. Las actividades biológicas preferidas pueden incluir, por ejemplo, regulación de la degradación del péptido y regulación de la fijación de matrices de proteínas.

El término "antagonista" se utiliza en el sentido más amplio, e incluye cualquier molécula que bloquea, inhibe o neutraliza parcial o totalmente una actividad biológica de un polipéptido PRO21074 nativo aquí descrito. En forma similar, el término "agonista" se utiliza en el sentido amplio e incluye cualquier molécula que imite una actividad biológica de un polipéptido PRO21074 aquí descrito. Las moléculas agonistas o antagonistas adecuadas incluyen específicamente anticuerpos o fragmentos de anticuerpos agonistas o antagonistas, fragmentos o variantes de secuencias de amino ácido de polipéptidos PRO21074 nativo, péptidos, pequeñas moléculas orgánicas, etc. Los procedimientos para identificar agonistas o antagonistas de un polipéptido PRO21074 pueden comprender contactar un polipéptido PRO21074 con una molécula agonista o antagonista candidata y medir un cambio detectable en una o más actividades biológicas normalmente asociadas con el polipéptido PRO21074.

"Tratamiento" se refiere tanto a tratamiento terapéutico y profiláctico o medidas preventivas, donde el objetivo es evitar o frenar (atenuar) la condición o desorden patológico identificado. Aquellos en necesidad de tratamiento incluyen tanto a aquellos que ya tienen el desorden como a aquellos propensos a tener el desorden o aquellos en quienes debe evitarse el desorden.

Administración "crónica" se refiere a la administración del agente(s) en una forma continua como opuesto a un modo agudo, para mantener el efecto terapéutico inicial (actividad) durante un período de tiempo extendido. Administración "intermitente" es el tratamiento que no se realiza consecutivamente sin interrupción, pero que es bastante cíclico en su naturaleza.

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"Mamífero" para los propósitos de tratamiento se refiere a cualquier animal clasificado como mamífero, incluyendo humanos, animales domésticos y de granja, y animales de zoológico, deporte, o mascotas, tales como perros, gatos, reses, caballos, ovejas, cerdos, cabras, conejos, etc. Preferentemente, el mamífero es humano.

La administración "en combinación con" uno o más agentes terapéuticos adicionales incluye administración simultánea (concurrente) y consecutiva en cualquier orden.

"Portadores" tal como se emplea aquí incluye portadores farmacéuticamente aceptables, excipientes, o estabilizadores que son no tóxicos para la célula o el mamífero que se expone al mismo en las dosis y concentraciones empleadas. Con frecuencia el portador fisiológicamente aceptable es una solución acuosa de pH tamponado. Ejemplos de portadores fisiológicamente aceptables incluyen tampones tales como fosfato, citrato, y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico; polipéptido de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina, o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tales como polivinilpirrolidona; amino ácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos, y otros carbohidratos que incluyen glucosa, manosa, o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; alcoholes de azúcar tales como manitol o sorbitol; contrapones formadores de sal tales como sodio; y/o surfactantes no iónicos tales como TWEEN^{TM}, polietilen glicol (PEG), y PLURONICS^{TM}.

"Fragmentos de anticuerpo" comprende una porción de un anticuerpo intacto, preferentemente la región de fijación del antígeno o variable del anticuerpo intacto. Ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen Fab, Fab', F(ab')_{2}, y fragmentos Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales (Zapata et al., Protein Eng. 8(10): 1057-1062 [1995]); moléculas de anticuerpo de cadena única; y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos.

La digestión papaínica de los anticuerpos produce dos fragmentos idénticos de fijación de antígeno; llamados fragmentos "Fab", cada uno con un único sitio de fijación de antígeno, y un fragmento residual "Fc", una designación que refleja la habilidad de cristalizar fácilmente. El tratamiento de pepsina produce un fragmento F(ab')_{2} que tiene dos sitios de combinación de antígeno y que todavía son capaces de reticular un antígeno.

"Fv" es el fragmento mínimo de anticuerpo que contiene un sitio completo de reconocimiento y fijación de antígeno. Esta región consiste en un dímero de un dominio variable de una cadena pesada y una ligera en asociación estrecha, no covalente. Es en esta configuración que los tres CDRs de cada dominio variable interactúa para definir un sitio de fijación de anticuerpo sobre la superficie del dímero VH-VL. Colectivamente, los seis CDRs confieren especificidad de fijación del antígeno al anticuerpo. Sin embargo, aún un único dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende sólo tres CDRs específicos para un antígeno) tiene la habilidad de reconocer y fijar un antígeno, aunque una afinidad inferior que el sitio de fijación entero.

El fragmento Fab también contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab difieren de los fragmentos Fab' mediante la adición de unos pocos residuos en el término carboxi del dominio de la cadena pesada CH1 incluyendo una o más cisteínas de la región de articulación del anticuerpo. Fab'-SH es aquí la designación de Fab' en la cual el residuo(s) de cisteína de los dominios constantes soporta un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpo F(ab')_{2} originalmente eran producidos como pares de fragmentos Fab' que tienen cisteínas articuladas entre ellos. También se conocen otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpos.

Las "cadenas ligeras" de anticuerpos (inmunoglobulinas) de cualquier especie vertebrada pueden asignarse a uno de dos tipos claramente distintos, llamados kapa y lambda, basados en las secuencias de amino ácidos de sus dominios constantes.

Dependiendo de la secuencia de amino ácido del dominio constante de sus cadenas pesadas, las inmunoglobulinas pueden asignarse a diferentes clases. Hay cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, y varias de éstas puede además subdividirse en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, e IgA2.

Los fragmentos "Fv de cadena simple" o "sFv" comprenden los dominios de anticuerpo VH y VL, donde estos dominios están presentes en una única cadena de polipéptido. Preferentemente, el polipéptido Fv comprende además un enlazador de polipéptido entre los dominios VH y VL que permiten que el sFv forme la estructura deseada para la fijación del antígeno. Para una reseña de sFv, ver Pluckthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994).

El término "diacuerpos" se refiere a pequeños fragmentos de anticuerpo con dos sitios de fijación de antígeno, dichos fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado con un dominio variable de cadena ligera (VL) en la misma cadena de polipéptido (VH-VL). Mediante el uso de un enlazador que es demasiado corto para permitir emparejar entre los dos dominios de la misma cadena, los dominios son forzados a aparearse con los dominios complementarios de otra cadena y crean dos sitios de fijación de antígeno. Los diacuerpos se describen detalladamente en, por ejemplo, EP 404,097; WO 93/11161; y Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993).

Un anticuerpo "aislado" es uno que se ha identificado y separado y/o recuperado a partir de un componente de su ambiente natural. Los componentes contaminantes de su ambiente natural son materiales que pueden interferir con el diagnóstico o los usos terapéuticos del anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas, y otros solutos protéicos o no protéicos. En realizaciones preferidas, el anticuerpo se purificará (1) a más de 95% en peso del anticuerpo como se determina en el procedimiento Lowry, y más preferentemente más del 99% en peso, (2) hasta un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos N-terminal o secuencia de amino ácido interna mediante el uso de un secuenciador de copa giratoria, o (3) hasta la homogeneidad mediante SDS-PAGE bajo condiciones reductoras o no reductoras utilizando azul Coomassie o, preferentemente, cementación con plata. El anticuerpo aislado incluye anticuerpo in situ dentro de células recombinantes; debido a que al menos un componente del ambiente natural del anticuerpo no estará presente. Ordinariamente, sin embargo, el anticuerpo aislado se preparará mediante al menos una etapa de purificación.

Un anticuerpo que "se fija específicamente a" o es "específico para" un polipéptido particular o un epitope en un polipéptido particular es uno que se fija a un polipéptido o epitope particular sin fijarse substancialmente a cualquier otro polipéptido o epitope polipéptido.

La palabra "marca" cuando se utiliza aquí se refiere a un compuesto o composición detectable que se conjuga directa o indirectamente al anticuerpo para generar un anticuerpo "marcado". La marca puede detectarse por sí misma (por ejemplo, marcadores radioisótopos o marcadores fluorescentes) o, en el caso de un marcador enzimático, puede catalizar la alteración química de un compuesto o composición de sustrato que es detectable.

Mediante "fase sólida" se indica una matriz no acuosa a la cual el anticuerpo de la presente invención puede adherirse. Los ejemplos de las fases sólidas aquí englobadas comprenden aquellas formas parcial o totalmente de vidrio (por ejemplo, vidrio de poro controlado), polisacáridos (por ejemplo, agarosa), poliacrilamidas, poliestireno, polivinil alcohol y siliconas. En ciertas realizaciones, dependiendo del contexto, la fase sólida puede comprender el pozo de una placa de ensayo; en otras en una columna de purificación (por ejemplo, columna de cromatografía por afinidad). Este término también incluye una fase sólida discontinua de partículas discretas, tales como aquellas descritas en U.S. Patent Nº 4.275.149.

Un "liposoma" es una pequeña vesícula compuesta de varios tipos de lípidos, fosfolípidos y/o surfactantes que es útil para la entrega de una droga (tal como polipéptido PRO21074 o anticuerpo) a un mamífero. Los componentes del liposoma comúnmente se disponen en una formación bicapa, similar a la disposición de lípidos de las membranas biológicas.

Una "pequeña molécula" se define aquí como la que tiene un peso molecular por debajo de 500 Daltons.

El término "desorden(es) cartilaginoso(s)" se refiere a un cartílago que manifiesta al menos una condición patológica tal como un desarreglo metabólico, incremento de la rotura de la matriz proteoglicana y/o reducción de síntesis de matriz proteoglicana, que se produce como resultado de enfermedad o lesión. Incluidos en el ámbito de "desórdenes cartilaginosos" se hallan "desórdenes cartilaginosos degenerativos" - una colección de desórdenes caracterizados, al menos en parte, por degeneración o desarreglos metabólicos de los tejidos conectivos cartilaginosos del cuerpo, incluyendo no sólo las articulaciones o estructuras relacionadas, incluyendo músculos, bolsa (membrana sinovial), tendones y tejido fibroso, pero también con la placa de crecimiento. En una realización, el término incluye "desórdenes articulares cartilaginosos" que están caracterizado por el trastorno de la superficie articular cartilaginosa lisa y la degradación de la matriz del cartílago. En un mamífero, los "desórdenes articulares cartilaginosos" se manifiestan además a través de síntomas de dolor, rigidez y/o limitación de movimiento de las partes del cuerpo afectadas.

Incluidos dentro del ámbito de "desórdenes articulares cartilaginosos" se hallan la osteoartritis (OA) y artritis reumatoidea (RA). OA define no un único desorden, sino como el camino final común de destrucción de la articulación resultante de múltiples procesos. La OA está caracterizada por la destrucción asimétrica localizada del cartílago acorde con alargamientos óseos palpables en los márgenes de las articulaciones. La OA afecta típicamente las juntas interfalángicas de las manos, la primera articulación carpometacarpiana, las caderas, las rodillas, la columna, y algunas articulaciones del medio del pie, mientras que las articulaciones grandes, tales como los tobillos, codos y hombros tienden a no afectarse. La OA puede asociarse con enfermedades metabólicas tales como hemocromatosis y alkaptonuria, abnormalidades del desarrollo tales como displasia del desarrollo de las caderas (dislocación congénita de caderas), discrepancias en la longitud de miembros incluyendo artritis traumáticas e inflamatorias tales como gota, artritis séptica, artritis neuropática. La OA también puede desarrollarse después de una inestabilidad biomecánica extendida, tales como resultados de una lesión deportiva u obesidad.

La artritis reumatoidea (RA) es un desorden sistémico, crónico, autoinmune caracterizado por sinovitis simétrica de la articulación y afecta de forma típica por igual a articulaciones diartroides pequeñas y grandes. Al progresar la RA, los síntomas pueden incluir fiebre, pérdida de peso, afinamiento de la piel, participación multiorgánica, escleritis, úlceras córneas, la formación de nódulos subcutáneos o subperiostios e incluso muerte prematura. Los síntomas de RA con frecuencia aparecen durante la juventud y pueden incluir vasculitis, atrofia de la piel y del músculo, nódulos subcutáneos, linfadenopatía, esplenomegalia, leucopaenia y anemia crónica.

Por otra parte, el término "desorden cartilaginoso degenerativo" puede incluir lupus eritematoso sistémico y gota, amiloidosis o síndrome de Felty. Adicionalmente, el término cubre la degradación del cartílago y la destrucción asociada con artritis soriásica, inflamación aguda (por ejemplo, artritis por yersinia, artritis por pirofosfato, artritis gotosa (artritis úrica), artritis séptica), artritis asociadas con trauma, enfermedad inflamatoria intestinal (por ejemplo, colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn, enteritis regional, ileitis distal, enteritis granulomatosa, ileitis regiona, ileitis terminal), esclerosis múltiple, diabetes (por ejemplo, insulino-dependiente y no insulino-dependiente), obesidad, artritis de células gigantes y síndrome de Sjögren.

Ejemplos de otras enfermedades inmunes e inflamatorias, al menos algunas de las cuales puede tratarse mediante los procedimientos de la invención incluyen artritis crónica juvenil, espondiloartropatías, esclerosis múltiples (escleroderma), miopatías idiomáticas inflamatorias (dermatomiositis), vasculitis sistémica, sarcoidosis, anemia hemolítica autoinmune (pancitopenia inmune, hemoglobinuria paroximal nocturna), trombocitopenia autoinmune (púrpura trombocitofénica idiomática, trombocitofenia de mediación inmune), tiroiditis (enfermedade de Grave, tiroiditis Hashimoto, tiroiditis linfocítica juvenil, tiroiditis atrófica) enfermedades inflamatorias autoinmune (por ejemplo, encefalomielitis alérgica, esclerosis múltiple, diabetes mellitus insulino-dependiente, uveoretinitis autoinmune, tirotoxicosis, enfermedad tiroidea autoinmune, anemia perniciosa, rechazo de autotrasplante, diabetes mellitus, enfermedad renal de mediación inmune (glomeruonefritis, nefritis tubulointersticial)), enfermedades desmielinizantes de los sistemas nerviosos central y periférico tales como esclerosis múltiple, polineuropatía desmielinizante idiomática o síndrome de Guillain-Barré y polineuropatías desmielinezantes inflamatorias crónicas, enfermedades hepatobiliares tales como hepatitis infecciosas (hepatitis A, B, C, D, E y otros virus no hepatotrópicos), hepatitis activa autoinmune crónica, cirrosis biliar primaria, hepatitis granulomatosa y colangitis esclerosantes, enteropatía sensible al gluten, y enfermedad de Whipple, enfermedades de piel autoinmunes o por mediación inmune que incluye enfermedades de piel bulosa, eritema multiforme y dermatitis de contacto, psoriasis, enfermedades alérgicas tales como asma, rinitis alérgica, dermatitis atópica, hipersensibilidad alimentaria y urticaria, enfermedades inmunológicas del pulmón tales como neumonía eosinofílica, fibrosis pulmonar idiomática y neumonitis hipersensible, enfermedades asociadas al transplante que incluyen rechazo y enfermedad rechazo-versus-huésped. Enfermedades infecciosas que incluyen enfermedades víricas tales como SIDAA (infección HIV), hepatitis, herpes, etc., infecciones bacterianas, infecciones protozoarias, infecciones parasíticas y virus respiratorio sincitial, virus de inmunodeficiencia humana, etc.) y desórdenes alérgicos, tales como hipersensibilidad anafiláctica, asma, rinitis alérgica, dermatitis atópica, conjuntivitis primaveral, eritema, urticaria y alergias alimentarias, etc.

"Tratamiento" es una intervención realizada con la intención de evitar el desarrollo o alterar la patología de un desorden. Por lo tanto, "tratamiento" se refiere tanto al tratamiento terapéutico y profiláctico o a medidas preventivas, donde el objeto es evitar o atenuar la progresión o de disminuir la severidad de la condición patológica o desorden objetivo. Aquellos en necesidad de tratamiento incluyen aquellos que ya tienen el desorden así como aquellos en quienes debe prevenirse el desorden. En el tratamiento de un desorden cartilaginoso, un agente terapéutico puede directamente disminuir o incrementar la magnitud de respuesta a un componente patológico del desorden, o volver más susceptible la enfermedad al tratamiento con otros agentes terapéuticos, por ejemplo, anticuerpos, antifúngicos, agentes antiinflamatorios, quimioterápicos, etc.

El término "cantidad efectiva" es al menos la concentración mínima de PRO21074 o antagonista del mismo que causa, induce o resulta tanto en una mejora detectable o reparación en el cartílago dañado o proporciona un grado medible de protección de la destrucción continua o inducida de cartílago (por ejemplo, retención de proteoglicanos en la matriz, inhibición de liberación de proteoglicanos desde la matriz, estimulación de síntesis de proteoglicanos). Alternativamente, la actividad biológica puede cuantificarse mediante la medición del efecto del PRO21074 o antagonistas del mismo sobre el cultivo celular de cartílago y comparando la fisiología celular y tisular (es decir, crecimiento celular, supervivencia, unión, montaje de la matriz, etc.) en comparación con controles no tratados. Por otra parte, una "cantidad terapéutica efectiva" es al menos la concentración mínima (cantidad) de polipéptido PRO21074 o antagonista administrado a un mamífero que pueden ser efectivos en al menos atenuar un síntoma patológico (por ejemplo, causar, inducir o resultar tanto en una mejora detectable o reparar cartílago articular dañado o causar, inducir o resultar en una protección medible de la destrucción continuada o inicial del cartílago, mejora en el rango de movimiento, reducción del dolor, etc.) que se produce como resultado de lesión o de un desorden cartilagi-
noso.

El "agente cartilaginoso" puede ser un factor de crecimiento, citoquina, molécula pequeña, anticuerpo, pieza de ARN o ADN, partícula vírica, péptido, o químico que tiene un efecto benéfico sobre el cartílago, incluyendo factores de crecimiento peptídicos, antagonistas catabólicos, factores antiinflamatorios, y aquellos que afectan el hueso y/o sinovio. Alternativamente, "agente cartilaginoso" puede ser un factor de crecimiento peptídico -tal como cualquiera de los factores de crecimiento fibroblástico (por ejemplo, FGF-1, FGF-2,... FGF-21, etc.), IGFs, (I y II), TGF-\betas (1-3), BMPs (1-7), o elemento de la familia de factores de crecimiento epidérmico tales como EGF, HB-EGF, TGF-\alpha- que pueden potenciar la respuesta reparadora intrínseca del cartílago, por ejemplo mediante la alteración de la proliferación, diferenciación, migración, adhesión, o producción de matriz mediante condrocitos. Alternativamente, un "agente cartilaginoso" puede ser un factor que antagoniza con el catabolismo del cartílago (por ejemplo, IL-1 antagonista receptor (IL-1 ra), inhibidores NO, inhibidores IL-1\beta convertasa (ICE), factores inhibidores de la actividad de IL-6, IL-8, LF, IFN-\gamma, actividad de TNF-\alpha, tetraciclinas y variantes de las mismas, inhibidores de apoptosis, inhibidores MMP, inhibidores agrecanasa, inhibidores de serina y proteasas cisteína tales como catepsinas, y activadores uroquinasa o tejido-plasminogen (uPA o tPA). Más alternativamente, "agente cartilaginoso" incluye factores que actúan indirectamente sobre el cartílago afectando el hueso subyacente (es decir, osteofactores, por ejemplo biofosfonatos, osteoprotegerin), o el sinovio circundante (es decir, factores sinoviales) o factores antiinflamatorios (es decir, anti-TNF-\alpha, IL1ra, IL-10, NSAIDs). Para un repaso de ejemplos de agentes cartilaginosos, ver Martel-Pelletier et al., Front. Biosci. 4: d694-703 (1999); Hering, T.M., Front. Biosci. 4:d743-761
(1999).

Las "Técnicas quirúrgicas estándar" son procedimientos quirúrgicos que se emplean comúnmente para manipulaciones terapéuticas del cartílago, que incluyen: afeitado del cartílago, abrasión condroplástica, reparación láser, desbridamiento, condroplastia, microfractura con o sin penetración ósea subcondrial, mosaicoplastia, autotrasplante de células cartilaginosas, autotrasplante de células madre, autotrasplante de cartílagos costales, estimulación química, estimulación eléctrica, autotrasplantes periocondriales, autotrasplante de periostio, andamios cartilaginosos, autotrasplante u homoinjerto shee (osteoarticular), o osteotomía. Estas técnicas se reseñan y se describen con mayor detalle en Frenkel et al., Front. Bioscience 4: d671-685 (1999).

Administración "crónica" se refiere a la administración en un modo continuo como opuesto a un modo agudo, para mantener el efecto terapéutico inicial (actividad) durante un período extendido de tiempo. Administración "intermitente" es el tratamiento que se realiza no consecutivamente sin interrupción, pero que es bastante cíclico en su naturaleza.

La "patología" de un desorden cartilaginoso incluye cualquier fenómeno fisiológico que compromete el bienestar de la entidad afectada. Esto incluye, sin limitación, la destrucción del cartílago, reparación disminuida del cartílago, crecimiento o diferenciación celular anormal o incontrolable, producción de anticuerpos, producción de auto-anticuerpos, producción y activación de complemento, interferencia con el normal funcionamiento de células vecinas, producción de citoquina u otros productos de secreción en niveles anormales, supresión o agravamiento de cualquier respuesta inflamatoria o inmunológica, infiltración de células inflamatorias (netrofílicas, eosinofílicas, monolíticas, linfocíticas) en los espacios titulares, inducción de dolor, o cualquier efecto tisular que resulte en discapacidad de la función o movilidad articular.

"Actividad biológica" para los presentes propósitos se refiere aquí a la habilidad del polipéptido PRO21074 o antagonistas del mismo para promover la regeneración y/o evitar la destrucción del cartílago. Opcionalmente, el cartílago es cartílago articular y la regeneración y/o destrucción del cartílago se asocia con una lesión o un desorden cartilaginoso. Por ejemplo, la actividad biológica puede cuantificarse mediante la medición del efecto de PRO21074 sobre un cultivo de células de cartílago y comparando la fisiología celular y tisular (es decir, crecimiento celular, supervivencia, unión, montaje de la matriz, etc.) en comparación con controles no tratados. Alternativamente, la actividad biológica puede cuantificarse mediante la inhibición de la liberación de proteoglicano (PG) desde el cartílago, el incremento en la síntesis de PG en el cartílago, la inhibición de la producción de óxido nítrico (NO), etc.

El término "modular" significa afectar (es decir, tanto sobreregular, subregular o controlar de otra forma) la respuesta de un camino de señalización. Los procesos celulares bajo el control de transducción de señal incluyen, pero no están limitados, a la transcripción de genes específicos, funciones celulares normales, tales como metabolismo, proliferación, diferenciación, adhesión, apoptosis, y supervivencia, así como procesos anormales, tales como transformación, des-diferenciación y metástasis.

El término "células en y alrededor de las articulaciones" incluye células que pueden afectar, causar o jugar un papel en la formación, reparación, regeneración o soporte del tejido cartilaginoso. Incluidas en el ámbito de este término están los condrocitos, sinoviocitos, fibroblastos, células dentro de los tendones o ligamentos, osteoblastos o mioblastos.

Las Tablas 1A-D muestran ejemplificaciones hipotéticas para utilizar el procedimiento que se describe a continuación para determinar el % de identidad de secuencia de amino ácido (Tablas 1A-B) y el % de identidad de secuencia de ácido nucleico (Tablas 1C-D) utilizando el programa de ordenador de alineación de secuencia ALIGN-2, donde "PRO" representa la secuencia de amino ácido de un polipéptido PRO21074 hipotético de interés, "Proteína de comparación" representa la secuencia de amino ácido de un polipéptido con el cual se compara el polipéptido "PRO" de interés, "PRO-DNA" representa una secuencia de ácido nucleico que codifica PRO21074 de interés, "ADN de comparación" representa la secuencia de nucleótido de una molécula de ácido nucleico con la cual se compara la molécula de ácido nucleico de "PRO-ADN" de interés, "X", "Y" y "Z" representan cada uno diferentes residuos de amino ácidos hipotéticos y "N", "L" y "V" representan cada uno diferentes nucleótidos hipotéticos.

TABLA 1A

100

TABLA 1B

101

TABLA 1C

102

TABLA 1D

104

La Tabla 2 proporciona el código fuente completo del programa de ordenador de comparación de secuencia ALIGN-2. Este código fuente puede recopilarse rutinariamente para su empleo en un sistema operativo UNIX para proporcionar el programa de ordenador de comparación de secuencia ALIGN-2.

TABLA 2

1

TABLA 2 (continuación)

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II. Descripción detallada de la invención Osteoartritis v. Artritis reumatoidea

La artritis reumatoidea (RA) es una enfermedad sistémica, autoinmune, degenerativa que causa trastornos en sinovium tanto de articulaciones diartroideales grandes y pequeñas por igual. Cuando la enfermedad progresa, los síntomas de RA pueden incluir fiebre, pérdida de peso, afinamiento de la piel, implicación multiorgánica, escleritis, úlceras córneas, la formación de nódulos subcutáneos o subperiostios y muerte prematura. En contraste con la OA, los síntomas de la RA aparecen durante la juventud, las manifestaciones extra articulares pueden afectar cualquier sistema orgánico, y la destrucción de las articulaciones es simétrica y se produce tanto en articulaciones grandes como pequeñas por igual. Los síntomas extra articulares pueden incluir vasculitis, atrofia de la piel y el músculo, nódulos subcutáneos, linfadenopatía, esplenomegalia, leucopenia y anemia crónica. Por otra parte, la RA es de naturaleza heterogénea con una expresión de enfermedad variable y se asocia con la formación de factor reumatoide en suero en 90% de los pacientes en algún momento durante el transcurso de la enfermedad.

Curiosamente, pacientes con RA también tienen un sistema inmune hiperactivo. La gran mayoría de gente con RA tiene una susceptibilidad genética asociada con la activación incrementada de moléculas del complejo principal de histocompatibilidad de clase II en monolitos y macrófagos. Estas moléculas del complejo de histocompatibilidad están implicadas en la presentación de antígeno de las células T activadas que llevan receptores para estas moléculas de clase II. La predisposición genética de RA se soporta mediante la prevalencia del antígeno leucocito altamente conservado DR subtipo Dw4, Dw14 y Dw15 en pacientes humanos con enfermedad muy severa.

Los monolitos y macrófagos activados, al interactuar con las células T apropiadas, estimulan una cascada de eventos que incluyen otra activación de monolitos y macrófagos adicionales, células T, células B y células endoteliales. Con la sobreregulación de las moléculas de adhesión, células mononucleares y células polinucleares adicionales son atraídas a la articulación inflamada. Este influjo estimula la secreción de citoquinas quimiotácticas, potenciando así el influjo de las células inflamatorias en el sinovio y el líquido sinovial.

La osteoartritis (OA) es una enfermedad degenerativa localizada que afecta cartílago y hueso articular y resulta en dolor y disminución de la función articular. OA puede clasificarse en dos tipos: primaria y secundaria. La OA primaria se refiere al espectro de enfermedades degenerativas de la articulación para las cuales no se ha determinado una etiología subyacente. Típicamente, la articulación afectada por OA primaria son las articulaciones interfalanges de las manos, las primeras articulaciones carpometacarpianas, las caderas, las rodillas, la columna y algunas articulaciones en el pie medio. Curiosamente, parece que las articulaciones grandes, tales como los tobillos, codos y hombros tienden a ser indemnes a la OA primaria. En contraste, la OA secundaria se produce con frecuencia como resultado de una lesión o trauma definidos. La artritis secundaria también puede encontrarse en individuos con enfermedades metabólicas tales como hemocromatosis y alcaptonuria, anormalidades del desarrollo tales como displacia de cadera (dislocación congénita de cadera) y discrepancias de longitud de los miembros, obesidad, artritis inflamatoria tal como artritis reumatoide o gota, artritis séptica y artritis neuropáticas.

OA es un desorden progresivo, degenerativo. La degradación asociada con OA inicialmente aparece como desgaste y fibrilación de la superficie articular del cartílago cuando los proteoglicanos se pierden desde la matriz. Con el uso continuo de la articulación, la superficie de fibrilación progresa, los defectos penetran más profundamente dentro del cartílago, y se pierden piezas de tejido cartilaginoso. Además, el hueso subyacente bajo el cartílago (hueso subcondrial) se engrosa, y, como el cartílago se pierde, el hueso lentamente queda expuesto. Con la destrucción asimétrica del cartílago, puede producirse la desfiguración. Los nódulos óseos, llamados osteofitas, se forman con frecuencia en la periferia de la superficie del cartílago y ocasionalmente crecen sobre las áreas erosionadas adyacentes. Si se penetra la superficie de dichos brotes óseos, puede producirse crecimiento vascular y provocar la formación de tapones de tejido que contienen fibrocartílago.

Debido a que el cartílago es avascular, el daño que se produce en la capa de cartílago pero no penetra en el hueso subcondral, deja el trabajo de reparación a los condrocitos residentes, que tienen un potencial intrínseco de replicación pequeño. Sin embargo, cuando se penetra el hueso subcondral, su suministro vascular permite que tenga lugar un proceso de reparación trifásico. El cartílago subóptimo que se sintetiza en respuesta a este tipo de daño, calificado aquí como "fibrocartílago" debido a su matriz fibrosa, tiene propiedades bioquímicas y mecánicas subóptimas, y por lo tanto es sometido a desgaste y destrucción adicionales. En una articulación enferma o dañada, la liberación incrementada de metaloproteínas (MMPs) tales como colagenasas, gelatinazas, estromelisinas, agrecanasas, y otras proteasas, conducen a mayor adelgazamiento y pérdida del cartílago. Estudios in vitro han mostrado que las citoquinas tales como IL-1\alpha, IL-1\beta, TNF-\alpha, PDGF, GM-CSF, IFN-\gamma, TGF-\beta, LIF, IL-2 e IL-6, IL-8 pueden alterar la actividad de las células sinoviales a modo de fibroblastos, macrófago, células T, y/o osteoclastos, y estas citoquinas pueden por lo tanto tener efectos indirectos sobre la renovación de la matriz del cartílago in vivo. Como tales, cualquiera de estas citoquinas puede amplificar y perpetuar un ciclo destructivo de la degeneración de la articulación in vivo. De hecho, la inhibición de la actividad de IL-2 o TNF-\alpha en animales artríticos y humanos ha mostrado ser una forma efectiva en la cual al menos lentificar la progresión de la artritis. Mientras que los eventos de iniciación en RA y OA son claramente diferentes, la pérdida subsecuente de cartílago y hueso en estos dos desórdenes degenerativos parecen implicar muchas de las mismas citoquinas y proteinasas.

Las propiedades mecánicas del cartílago se determinan mediante su composición bioquímica. Mientras que la arquitectura del colágeno contribuye a la fuerza de tensión y rigidez de un cartílago, la compresibilidad (o elasticidad) se debe a su componente proteoglicano. En el cartílago articular saludable, predomina el colágeno tipo II (comprendiendo aproximadamente 90-95%), sin embargo, cantidades pequeñas de colágeno de tipo V, VI, IX y XI también están presentes. Los proteoglicanos del cartílago (PG) incluye PG hidrodinámicamente mayor, de agregación con glicosaminoglicanos sulfatados unidos covalentemente, así como PC hidrodinámicamente más pequeños no de agregación tales como decorin, biglicano y lumicano.

Tipos de lesiones del cartílago

Las lesiones del cartílago entran en tres categorías: (1) microdaño o trauma cerrado, (2) fracturas condrales, y (3) fracturas osteocondrales.

El microdaño a los condrocitos y la matriz del cartílago pueden ser causados por un impacto único, a través de trauma cerrado repetitivo, o con el uso continuo de una articulación biomecánicamente inestable. De hecho, cambios metabólicos y bioquímicos tales como aquellos encontrados en las etapas tempranas de la artritis degenerativa puede replicarse en modelos animales mediante la carga repetitiva del cartílago articular. Radin et al., Clin. Orthop. Relat. Res. 131: 288-93 (1978). Tales experimentos, junto con el patrón distintivo de pérdida de cartílago hallada en las articulaciones artríticas, subrayan el papel que la carga biomecánica juega en la pérdida de homeostasis e integridad del cartílago articular en la enfermedad. Radin et al., J. Orthop. Res. 2: 221-234 (1984); Radin et al., Semin. Arthritis. Rheum. (suppl. 2) 21:12-21 (1991); Wei et al., Acta Orthop. Scand. 69: 351-357 (1998). Mientras que los condrocitos inicialmente pueden ser capaces de reponer la matriz cartilaginosa con proteoglicanos a una tasa basal, el daño concurrente de la red de colágeno puede incrementar la tasa de pérdida y resultar en una degeneración irreversible. Buckwalter et al., J. Am. Acad. Orthop. Surg. 2: 192-201 (1994).

Las fracturas condrales se caracterizan por el trastorno de la superficie articular sin violación de la placa subcondral. Se produce la necrosis condrocítica en el sitio de lesión, seguida por el incremento de actividad mitótica y metabólica de los condrocitos supervivientes que bordean la lesión que condicen a la alineación de las grietas de la superficie articular con el tejido fibroso. El incremento de la actividad condrocítica es transitoria, y la respuesta reparadora resulta en una cantidad y calidad insuficientes de los nuevos componentes de la matriz.

Las fracturas osteocondrales, las más serias de los tres tipos de lesiones, son lesiones que cruzan el límite dentro de la placa subcondral subyacente. En este tipo de lesión, la presencia de vascularización subcondral provoca la respuesta en tres fases típicamente hallada en tejidos vasculares: (1) necrosis, (2) inflamación, y (3) reparación. Inicialmente la lesión se llena con sangre y coágulos. El coágulo de fibrina resultante activa una respuesta inflamatoria y se vuelve tejido vascularizado de reparación, y los distintos componentes celulares liberan factores de crecimiento y citoquinas que incluyen factor de crecimiento beta transformador (TGF-beta), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), proteínas óseas morfogénicas, y factores de crecimiento a modo de insulina I y II. Buckwalter et al., J. Am. Acad. Orthop. Surg. 2:191-201 (1994).

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La respuesta reparadora inicial asociada con fracturas osteocondrales se caracteriza por el reclutamiento, proliferación y diferenciación de precursores en condrocitos. Las células madres mesenquimales se depositan en la red de fibrina, que eventualmente se transforma en una zona fibrocartilaginosa. F. Shapiro et al., J. Bone Joint Surg. 75:532-53 (1993); N. Mitchell and N. Shepard, J. Bone Joint Surg. 58:230-33 (1976). Estas células madre que se cree provienen de la médula del hueso subyacente más que de la superficie articular adyacente, progresivamente se diferencia en condrocitos. Entre seis y ocho semanas después de la lesión, el tejido reparador contiene células a modo de condrocitos en una matriz de proteoglicanos y colágeno predominantemente de tipo II, con algún colágeno de tipo I. T. Furukawa et al., J. Bone Joint Surg. 62: 79-89 (1980); J. Cheung et al., Arthritis Rheum. 23: 211-19 (1980); S.O. Hjertquist & R. Lemperg, Calc. Tissue Res. 8: 54-72 (1971). Sin embargo, esta matriz recién depositada degenera y el tejido condroidal es reemplazado por más tejido fibroso y fibrocartílago y un cambio en la síntesis de colágeno del tipo II al tipo I. H.S. Cheung et al., J. Bone Joint Surg. 60: 1076-81 (1978); D. Hamerman, "Prospects for medical intervention in cartilage repair", Joint cartilage degradation: Basic and clinical aspects, Eds. Woessner JF et al., (1993); Shapiro et al., J. Bone Joint Surg. 75: 532-53 (1993); N. Mitchell & N. Shepard, J. Bone Joint Surg. 58: 230-33 (1976); S.O. Hjertquist & R. Lemperg, Calc. Tissue Res. 8: 54-72 (1971). Los primeros cambios degenerativos incliyen la fibrilación de la superficie, reducción de proteoglicanos, condrocitos clonados y muertos y fisurado vertical desde las capas superficiales a las profundas. Un año posterior a la lesión, el tejido reparador es una mezcla de fibrocartílago y cartílago hialino, con una cantidad substancial de colágeno de tipo I, que no se encuentra en cantidades apreciables en el cartílago articular normal. T. Furukawa, et al., J. Bone Joint Surg. 62: 79-89 (1980).

Desde un punto de vista clínico, el tejido reparador fibrocartilaginoso puede funcionar satisfactoriamente durante un cierto período de tiempo. Sin embargo, el fibrocartílago tiene propiedades biomecánicas inferiores relativas a las del cartílago hialino normal. Las fibras de colágeno se disponen en una orientación errática con un módulo de elasticidad inferior que en el cartílago hialino normal. J. Colletti et al., J. Bone Joint Surg. 54:147-60 (1972). La permeabilidad del tejido reparador también es elevada, reduciendo así la capacidad de transporte de carga de la presión de fluido del tejido. H. Mankin et al., "Form and Function of Articular Cartilage", Orthopaedic Basic Science, Ed: Simon & Schuster, American Academy of Orthopeadic Surgeons, Rosemont, IL (1994). Estos cambios resultan en una deformación viscoelástica incrementada, haciendo que el tejido reparador sea menos capaz de soportar cargas repetitivas que el cartílago articular normal. Se ha informado que los niveles de glicosaminoglicano (GAG) en el cartílago adyacente a los defectos osteocondriales se reducen aproximadamente a 42% de los valores normales, indicando que la lesión conduce a la degeneración más allá del defecto inicial. Osteoarthritis Cartilage 3:61-70 (1995).

Transplante y supervivencia de condrocitos

El transplante de condrocitos, las células responsables de secretar la matriz del cartílago, también se ha sugerido como medio de realizar la reparación del cartílago. Sin embargo, las desventajas de los transplantes alogénicos, es decir la posibilidad de la respuesta inmunogénica del huésped así como la transmisión de enfermedades víricas y otras enfermedades infecciosas, realmente ha limitado el ámbito del transplante alogénico de condrocitos. A pesar que estos riesgos pueden minimizarse mediante el uso del tejido o células propios del paciente, este procedimiento requiere cirugía adicional, creación de una nueva lesión en el cartílago del paciente, y un cultivo y crecimiento celular caro de las células específicas del paciente.

Cuando se cultiva como monocapas sobre placas de cultivo de tejido, los condrocitos aislados se des-diferenciarán, y con el tiempo de cultivo, se parecerán a los fibroblastos. Por ejemplo, la producción de colágeno cambiará desde predominantemente el tipo II a tipo I, y las células sintetizarán una proporción incrementada de ácido hialurónico relativa al contenido total de glicosaminoglicano (GAG). W. Green, Clin. Orthop. Relat. Res. 124: 237-50 (1977). Sin embargo, los condrocitos que crecen en geles de colágeno o como agregados de cultivo mantendrán una morfología normal, proteoglicano y síntesis de colágeno II así como retendrán su habilidad de acumular matriz metacromática in vitro. Por lo tanto, bajo estas condiciones, los condrocitos permanecerán relativamente diferenciados y fenotípicamente estables durante varias semanas in vitro. T. Kimura et al., Clin. Orthop. Relat. Res. 186: 231-39 (1984).

Ingeniería tisular

Las dificultades y gastos asociados con el cultivo de condrocitos ha llevado al diseño de implantes sembrados de condrocitos o libres de células para la reparación del cartílago articular utilizando una variedad de biomateriales, incluyendo hueso desmineralizado o tratado enzimáticamente, L. Dahlberg et al., J. Orthop. Res. 9: 11-19 (1991); B.C. Toolan et al., J. Biomed. Mat. Res. 41: 244-50 (1998); ácido poliláctico, C.R. Chu et al., J. Biomed Mat. Res. 29: 1147-54 (1995); ácido poliglicólico, C.A. Vacanti et al., Mat. Res. Soc. Symp. Proc. 252: 367-74 (1992); hidroxiapaptita/compuestos de Dacron, K. Messner & J. Gillquist, Biomaterials 14: 513-21 (1993); fibrina, D.A. Hendrickson et al., J. Orthop. Res. 12: 485-97 (1994); geles de colágeno, D. Grande et al., J. Orthop. Res. 7: 208-18 (1989), S. Wakitani et al., J. Bone Joint Surg. 71: 74-80 (1989), S. Wakitani et al., J. Bone Joint Surg. 76: 579-92 (1994); y fibras de colágeno, J.M. Pachence et al., "Development of a tissue analog for cartilage repair", Tissue inducing biomaterials, Eds, L. Cima & E. Ron, Materials Research Soc. Press, Pittsburgh, PA (1992); B.C. Toolan et al., J. Biomed. Mat. Res. 31: 273-80 (1996). Tejidos alternativos empleados incluyen tejido sinovial, A.G. Rothwell, Orthopedics 13: 433-42 (1990); o tejidos ricos en células madres mesenquimales (es decir, médula ósea o tejido periostio), K. Messner & J. Gillquist, Mat. Res. Soc. Symp. Proc. 252: 367-74 (1992).

Técnicas quirúrgicas estándar de cartílagos

El presente procedimiento también puede administrarse en combinación con cualquier técnica quirúrgica estándar de cartílago. Las técnicas quirúrgicas estándar son procedimientos quirúrgicos que se emplean comúnmente para manipulaciones terapéuticas del cartílago, que incluyen: afeitado del cartílago, abrasión condroplástica, reparación láser, desbridamiento, condroplastia, microfractura con o sin penetración del hueso subcondrial, mosaicoplastia, transplantes alográficos de células cartilaginosas, transplantes alográficos de células madre, transplantes alográficos costales, estimulación química, estimulación eléctrica, transplantes alográficos pericondriales, transplantes alográficos del periostio, andamios cartilaginosos, transplantes alográficos o autográficos de concha (osteoarticular), u osteotomía. Estas técnicas se describen y se discuten con mayor detalle en Frenkel et al., Front. Bioscience 4: d671-685 (1999).

Agentes de cartílago

En combinación con o en compensación de la ingeniería tisular, la administración de agentes de cartílago (es decir, factores de crecimiento peptídicos) se ha considerado como una forma de aumentar la reparación del cartílago. Los factores de crecimiento peptídicos son reguladores muy significativos de la diferenciación celular, migración, adhesión y metabolismo cartilaginoso. F. S. Chen et al., Am J. Orthop. 26: 396-406 (1997). Debido a que los agentes de cartílago son proteínas solubles de masa molecular relativamente pequeña y son rápidamente absorbidos y/o degradados, existe un gran desafío en hacerlos disponibles para las células en cantidad suficiente y durante una duración suficiente. Las proteínas secretadas pueden por lo tanto necesitar ser incorporadas dentro de dispositivos de ingeniería, implantables para una efectividad máxima. El vehículo de suministro ideal es biocompatible, reabsorbible, tiene las propiedades mecánicas adecuadas y se degrada en subproductos no tóxicos.

Diversos péptidos secretados tienen el potencial de inducir la reparación del cartílago huésped sin transplante de células. El factor de crecimiento a modo de insulina (IGF-1) estimula tanto la síntesis de matriz como la proliferación celular en el cultivo, K. Osborn. J. Orthop. Res. 7: 35-42 (1989), y una insuficiencia de IGF-1 puede tener un papel etiológico en el desarrollo de la osteoartritis. R.D. Coutts, et al., Instructional Course Lect. 47: 487-94, Amer. Acad. Orthop. Surg. Rosemont, IL (1997). Algunos estudios indican que las concentraciones en suero de IGF-1 son menores en pacientes con osteoartritis que en grupos de control, mientras que otros estudios no han encontrado diferencias. Sin embargo, tanto los niveles de IGF-1 y la respuesta de los condrocitos al IGF-1 disminuyen con la edad. J.R. Florini & S.B. Roberts, J. Gerontol. 35: 23-30 (1980). Por lo tanto, tanto la disponibilidad disminuida de IGF-1 como la respuesta disminuida de los condrocitos al IGF-1 pueden contribuir a la homeostasis del cartílago y conducir a la degeneración con la edad avanzada.

El IGF-1 se ha propuesto para el tratamiento o la prevención de la osteoartritis. De hecho, la administración intraarticular de IGF-1 en combinación con polisulfato pentosan de sodio (un inhibidor catabólico de la actividad del condorcito) provoca una apariencia histológica mejorada, y niveles cercanos a los normales de enzimas degradativas (metaloproteinasas neutrales y colagenasa), inhibidores titulares de metaloproteinasa y colágeno matricial. R.A. Rogachefsky, et al., Ann. N. Y. Acad. Sci. 732: 889-95 (1994). El uso de IGF-1 tanto solo como coadyuvante con otros factores de crecimiento para estimular la regeneración del cartílago se ha descrito en WO 91/19510, WO 92/13565, US 5,444,047, EP 434,652.

Las proteínas morfogenéticas óseas (BMPs) son elemento del factor de crecimiento beta transformador (TGF-\beta) de la gran familia de factores de crecimiento. Estudios in vitro e in vivo han mostrado que las BMPs inducen la diferenciación de las células mesenquimales en condrocitos. K. Sato & M. Urist, Clin. Orthop. Relat. Res. 183: 180-87 (1984). Además, el factor de crecimiento esquelético y los factores de crecimiento derivados del cartílago tienen efectos sinérgicos con las BMP, como la combinación de estos factores de crecimiento con BMP y hormona de crecimiento inicia la diferenciación de células mesenquimales. La proliferación subsiguiente de las células diferenciadas es estimulada por otros factores. D.J. Hill & A. Logan, Prog. Growth Fac. Res. 4: 45-68 (1992).

El factor de crecimiento transformador beta (TGF-\beta) es producido por osteoblastos, condrocitos, plaquetas, linfocitos activados, y otras células. R.D. Coutts et al., supra. El TGF-\beta puede tener tanto propiedades estimulantes como inhibidoras sobre la síntesis de matriz y la proliferación celular dependiendo de la célula objetivo, dosis, y condiciones de cultivo celular. P. Guerne et al., J. Cell Physiol. 158: 476-84 (1994); H. Van Beuningen et al., Ann. Rheum. Dis. 52: 185-91 (1993); P. Van der Kraan et al., Ann. Rheum. Dis. 51: 643-47 (1992). Además, como con IGF-1, la capacidad de respuesta a TGF-\beta decrece con la edad. P. Guerne et al., J. Cell Physiol. 158: 476-84 (1994). Sin embargo, TGF-\beta es un estimulador más potente de la proliferación de condrocitos que otros factores de crecimiento, incluyendo el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), bFGF, e IGF-1 (Guerne et al., supra), y puede estimular la producción de proteoglicano por los condrocitos. El TGF-\beta también regula a la baja los efectos de las citoquinas que estimulan el catabolismo de los condrocitos. Van der Kraan et al., supra. in vivo, TGF-\beta induce la proliferación y diferenciación de las células mesenquimáticas en condrocitos y potencia la reparación de defectos de grosor parcial en cartílago articular de conejo. E.B. Hunziker & L. Rosenberg, Trans. Orthopaed. Res. Soc. 19: 236 (1994).

Antagonismo del catabolismo del cartílago

Se cree que la degradación de la matriz del cartílago se debe a la fisura de las moléculas de la matriz (proteoglicanos y colágenos) mediante las proteasas (reseñado por Woessner JF Jr., "Proteases of the extracellular matrix", en Mow, V., Ratcliffe, A. (eds): Structure and Function of Articular Cartilage. Boca Raton, FL, CRC Press, 1994 y Smith R.L., Front. In Biosci. 4:d704-712. Mientras que las enzimas clave implicadas en la rotura de la matriz aún no se han identificado claramente, las metaloproteínas de la matriz (MMPs) y "agrecanasas" parecen jugar papeles clave en la destrucción articular. Además, elementos de la familia de proteinasas de la serina y la cisteína, por ejemplo la catepsia y uroquinasa o el activador del plasminogen tisular (uPA y tPA) también pueden estar implicados. Plasmita, activador uroquinasa del plasminogen (uPA) y el activador del plasminogen tisular (tPA) pueden jugar un papel importante en el camino de activación de las metaloproteinasas. La evidencia conecta el grupo muy relacionado de catepsia B, L y S a la rotura de matriz, y estas catepsias son incrementadas de alguna forma en OA. Varias citoquinas, incluyendo IL-1, TNF-\alpha y LIF inducen la expresión de MMP en condrocitos. La inducción de MMPs puede antagonizarse mediante TGF-\beta y se potencia, al menos en conejos, por FGF y PDGF. Como se muestra en estudios animales, los inhibidores de estas proteasas (MMP y agrecanasas) pueden al menos proteger parcialmente del daño al tejido articular in vivo.

Otros procedimientos de estimulación de la reparación del cartílago incluyen el bloqueo de los efectos de moléculas que están asociadas con la destrucción del cartílago. Por ejemplo, tanto IL-1 (-\alpha y -\beta) y el óxido nítrico son sustancias con efectos catabólicos conocidos sobre el cartílago. La citoquina IL-1 produce rotura del cartílago, incluyendo la generación de inflamación sinovial y sobre-regulación de las metaloproteinasas y agrecanasas de la matriz. V. Baragi, et al., J. Clin. Invest. 96: 2454-60 (1995); V.M. Baragi et al., Osteoarthritis Cartilage 5: 275-82 (1997); C.H. Evans et al., J. Leukoc. Biol. 64: 55-61 (1998); C.H Evans and P.D. Robbins, J. Rheumatol. 24: 2061-63 (1997); R. Kang et al., Biochem. Soc. Trans. 25: 533-37 (1997); R. Kang et al., Osteoarthritis Cartilage 5: 139-43 (1997). Debido a que se encuentran altos niveles de IL-1 en articulaciones enfermas y se cree que el IL-1 juega un papel de pivote en la iniciación y desarrollo de la artritis, la inhibición de la actividad IL-1 puede demostrar que es una terapia exitosa. En mamíferos sólo una proteasa, llamada interleuquina 1 \beta-convertasa (ICE), puede generar específicamente IL-1\beta maduro, activo. Se ha mostrado que la inhibición de ICE bloquea la producción de IL-1\beta y puede lentificar la degeneración artrítica (reseñado por Martel-Pelletier J. et al., Front. Biosci. 4: d694-703). El receptor antagonista soluble IL-1 (IL-1ra), una proteína producida naturalmente que puede inhibir los efectos del IL-1 mediante la prevención de la interacción entre el IL-1 con los condrocitos, también ha mostrado ser efectivo en modelos animales de artritis y actualmente se está evaluando en humanos por su habilidad para prevenir la incidencia o progresión de la artritis.

El óxido nítrico (NO) se ha implicado jugando un papel en la destrucción del cartílago. Attur et al., Arthritis & Rheum. 40: 1050-1053 (1997); Ashok et al., Curr. Opin. Rheum. 10: 263-268 (1998). A diferencia del cartílago normal que no produce NO a menos que se estimule con citoquinas tales como IL-1\alpha, el cartílago obtenido a partir de articulaciones osteoartríticas produce cantidades mayores de óxido nítrico durante 3 días en cultivo a pesar de la ausencia de estímulos adicionales. Por otra parte, la inhibición de la producción de NO ha mostrado que previene que el IL-1\alpha medie en la destrucción de cartílago y en la muerte de condrocitos así como en la progresión de osteoartritis en modelos animales. Además, los explantes de tejido a partir de tales pacientes libera espontáneamente altos niveles de nitrito en ausencia de estimulación con citoquinas tales como IL-1. Amin et al., Cur. Opin. Rheum. 10: 263-268 (1998). Mientras que una determinación concluyente del papel positivo o negativo de NO en la progresión de la determinación articular aún no se ha realizado, la inhibición de NO puede atenuar los efectos de IL-1\alpha sobre la producción de metaloproteinasa de la matriz, síntesis de agrecanasa, y producción de lactato por los condrocitos - así, la inhibición de NO puede ser una forma de evitar la destrucción del cartílago.

Al igual que con IL-1\alpha y \beta, el TNF-\alpha también tiene efecto sinérgico con IL-1 en términos de destrucción de cartílago. La inhibición de la actividad TNF-\alpha, en animales y humanos artríticos ha mostrado que inhibe la progresión de la artritis.

El factor inhibidor de leucemia (LIF), que se sintetiza tanto en el cartílago como en el sinovio, está presente en fluidos sinoviales humanos. Debido a que el LIF induce la síntesis de metaloproteinasas de la matriz (MMPs) por los condrocitos, puede estar implicado en la rotura de la matriz cartilaginosa.

El interferón-gamma (IFN-\gamma) inhibe la síntesis de proteoglicanos por los condrocitos humanos son potenciar su rotura. De hecho, IFN-\gamma puede suprimir la pérdida de proteoglicanos mediante la inhibición de la inducción de MMPs.

La interleuquina 8, una potente citoquina quimiotáctica para neutrófilos polimorfonucleares (PMN), se sintetiza por una variedad de células que incluyen monolitos/macrófagos, condrocitos y fibroblastos y está inducida por TNF-\alpha. En pacientes de OA, IL-1\beta, IL-6, TNF-\alpha y IL-8 se hallan todos en el fluido sinovial. IL-8 puede potenciar la liberación de citoquinas inflamatorias en células humanas mononucleares, incluyendo las de IL-1\beta, IL-6 y TNF-\alpha, que pueden además modular la reacción inflamatoria (reseñado por Martel-Pelletier J. et al., Front. Biosci. 4: d694-703).

El IL-6 también se ha propuesto como un contribuyente del proceso patológico OA mediante el incremento de las células inflamatorias en el tejido sinovial y mediante la estimulación de la proliferación de condrocitos. Además, IL-6 puede amplificar los efectos de IL-1 en la síntesis de MMP y la inhibición de la producción de proteoglicano (reseñado por Martel-Pelletier J. et al., Front. Biosci. 4: d694-703).

La interleuquina 17 sobreregula la producción de IL-1\beta, IL-6 y MMPs en macrófagos humanos. El IL-17 también induce la producción de NO en condrocitos, y se expresa en articulaciones artríticas, pero no en normales (reseñado por Martel-Pelletier J. et al., Front. Biosci. 4: d694-703).

El factor de crecimiento básico de fibroblastos (bFGF), que se sintetiza por los condrocitos, puede inducir la replicación de condrocitos articulares, B. C. Toolan et al., J. Biomed. Mat. Res. 41: 244-50 (1998). En explantes tomados de animales jóvenes, el bFGF en cantidades pequeñas (es decir, 3 ng/ml) estimula la síntesis e inhibe la rotura de proteoglicanos, mientras que niveles más altos (es decir, 30-300 ng/ml) tiene exactamente el efecto opuesto (es decir, inhibición de síntesis y rotura potenciada). En tejidos adultos, las dosis más altas de FGF estimulan la síntesis del proteoglicano, proteína y colágeno sin proliferación celular. R.L. Sah et al., Arch. Biochem. Biophys. 308: 137-47 (1994). El bFGF también regula la homeostasis del cartílago induciendo la liberación autocrina de interleuquina 1 (IL-1)a partir de los condrocitos, un potente estimulador del comportamiento catabólico en el cartílago. El bFGF también potencia la liberación de IL-1 de mediación por proteasa, quizás a través de su habilidad de sobreregular los receptores IL-1 sobre los condrocitos. J.E. Chin et al., Arthritis Rheum. 34: 314-24 (1991). De forma similar, el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) puede potenciar los efectos catabólicos de IL-1 y presumiblemente del TNF-\alpha. Sin embargo, alguna evidencia sugiere que en el cartílago humano bFGF y PDGF puede tener un efecto anticatabólico; mientras que queda por determinar si este fenómeno es específico de las especies o es un efecto de la edad.

Mientras que la inflamación no aparece como un evento iniciador en la osteoartritis, la inflamación se presenta en las articulaciones osteoartríticas. Las células inflamatorias (por ejemplo, monolitos, macrófagos y neutrófilos) que invaden el revestimiento sinovial después de la lesión y durante la inflamación producen metaloproteinasas así como cioquinas catabólicas que pueden contribuir a la liberación adicional de enzimas degradativas. A pesar que la inflamación y la destrucción de la articulación no muestran una correlación perfecta en todos los modelos animales de artritis, los agentes que inhiben la inflamación (por ejemplo, IL-4, IL-13, IL-10) también disminuyen la patología del cartílago y del hueso en animales artríticos (reseñado por Martel-Pelletier J. et al., Front. Biosci. 4: d694-703). La aplicación de agentes que inhiben las citoquinas inflamatorias pueden lentificar la progresión de OA contrarrestando la sinovitis local que se produce en pacientes de OA.

Numerosos estudios muestra que miembros de la familia de los antibióticos de la tetraciclina son efectivos en la inhibición de la actividad de la colagenasa y la gelatinasa. La administración oral de uno de éstos, doxiciclina, muestra que disminuye tanto la actividad de la colagenasa y la gelatinasa en el cartílago de la osteoartritis terminal de cadera. Estos datos sugieren que una dosis oral efectiva de doxiciclina puede lentificar la progresión de la osteoartritis. Smith R.L., Front. Biosci. 4: d704-712.

La patología de la OA implica no sólo la degeneración del cartílago articular que conduce a la eburnación del hueso, sino también el remodelado extensivo del hueso subcondrial que resulta en la llamada esclerosis de este tejido. Estos cambios óseos con frecuencia están acompañados por la formación de quistes subcondriales como resultado de la reabsorción focal. Los agentes que inhiben la reabsorción ósea, es decir, osteoprotegerina o bisfosfonatos han mostrado resultados promisorios en modelos animales de artritis, y por lo tanto muestran promesas en el tratamiento de desórdenes cartilaginosos. Kong et al. Nature 402: 304-308.

El ADN153576 parece que se expresa a altos niveles específicamente en cartílago (figuras 4 y 5). No se ha detectado expresión de ADN153576 en bancos preparados a partir del bazo, corazón, timo, placenta, riñón, testículo, útero, piel, hígado, pulmón, esófago, tiroides (figura 4) ni en ARN preparado a partir de colon, riñón, pulmón, intestino delgado, nódulo linfático, duodeno y arteria (figura 5).

El nivel de expresión de ADN153576 en el cartílago es similar al de actina, indicando que el gen está altamente expresado. Además, los niveles en el cartílago adulto aparece como similar al encontrado en cartílago fetal (figuras 5, 6), sugiriendo que esta molécula juega un papel importante en la biología del condorcito. Curiosamente, niveles diez veces más bajos de expresión se encontraron en el menisco, que es fibrocartílago, en contraste con el cartílago articular, que es cartílago hialino (figura 6). Además, a pesar de expresarse a valores muy bajos (\sim100x menor que en el cartílago articular) en sinovio enfermo, la expresión en sinovio normal fue aún menor (10.000x) que en sinovio enfermo (figura 6). Aún así, la sobreregulación de la expresión del ADN153576 en el sinovio puede ser parte del proceso de la enfermedad en articulaciones.

La secuencia nativa de PRO21074 codificada por ADN153576 muestra la homología de secuencia con el inhibidor inter-alfa-tripsina (ITI), un polipéptido que parece unirse a un hialurona (HA); ITI puede por lo tanto estar implicado en el montaje de, y la adherencia a las células de, la matriz del cartílago. Basado en su homología a ITI, el PRO21074 probablemente también juega un papel significativo en la unión de condrocitos y el montaje de la matriz de cartílago. Como tal, la secuencia nativa del PRO21074 probablemente será útil como un agente terapéutico para estimular la reparación del tejido cartilaginoso, especialmente en la interfaz del cartílago "nuevo" y "viejo". Dado que la matriz puede proporcionar señales de retorno a los condrocitos, el PRO21074 también puede afectar la proliferación y diferenciación de condrocitos. Dichas actividades también serían beneficiosas para la reparación del cartílago.

Dado el alto nivel de homología de secuencia entre ITI y la proteína codificada por ADN153576 (secuencia nativa de PRO21074), esperamos que la secuencia nativa de PRO21074 se una a la hialurona y se retenga dentro de la matriz extracelular. Debido a que la artritis se caracteriza por la degeneración del cartílago y la liberación de moléculas de la matriz del cartílago, cambia en los niveles de la secuencia nativa de PRO21074, o fragmentos del mismo (por ejemplo, en el fluido sinovial, plasma/serum, u orina) pueden ser indicativos de distintas etapas de la degeneración de la articulación.

Como se menciona en el párrafo anterior, la presencia de la secuencia nativa de PRO21074 (incluyendo agonistas del mismo) es probable que beneficie o sea terapéutica para la reparación o regeneración del cartílago. Sin embargo, también es posible que niveles excesivamente altos de la secuencia nativa de PRO21074, o fragmentos del mismo (es decir, dentro de la articulación o en el fluido sinovial) también pueden ser perjudiciales. En dicha situación, el beneficio terapéutico descansaría en la administración de antagonistas del PRO21074.

III. Composiciones y procedimientos de la invención A. Polipéptido PRO21074 de longitud completa

La presente invención proporciona secuencias de nucleótidos recientemente identificadas y aisladas que codifican polipéptidos referidos en la presente solicitud como PRO21074 (o también UNQ6369). En particular, el ADNc que codifica el polipéptido PRO21074 se ha identificado y aislado, y se describe con mayor detalle en los ejemplos siguientes. Se observa que las proteínas producidas en series de expresión separadas pueden darse diferentes números de PRO pero el número de UNQ es único para cualquier ADN dado y la proteína codificada, y no cambiará. Sin embargo, por razones de simplicidad, en la presente especificación la proteína codificada mediante ADN 153576-2925 así como todos los homólogos adicionales y variantes incluidas en la definición anterior de PRO21074, será referido como "PRO21074", sin importar su origen o modo de preparación.

Como se describe en los ejemplos siguientes, un clon ADNc designado aquí como ADN 153576-2925 se ha depositado con el ATCC. La secuencia de nucleótido real del clon puede determinarse fácilmente por aquellos técnicos entendidos mediante el secuenciado del clon depositado utilizando procedimientos de rutina en la técnica. La secuencia de amino ácido predicha puede determinarse a partir de la secuencia de nucleótido utilizando habilidades rutinarias. Para el polipéptido PRO21074 y el ácido nucleico codificador aquí descrito, los solicitantes han identificado lo que se cree que es el marco de lectura más identificable con la información de la secuencia disponible en este momento.

Utilizando el programa de ordenador de alineación de secuencia ALIGN-2 antes citado, se ha encontrado que la secuencia nativa PRO21074 de longitud completa (mostrada en la figura 2 y SEQ ID NO: 2) tiene cierta identidad de secuencia de amino ácido con secuencia de una pieza de ADN genómico (Dayhoff Nº HS1409_1). Sin embargo, este clon genómico no contiene la secuencia de codificación completa del PRO21074. Por ello, actualmente se cree que el polipéptido PRO21074 descrito en la presente solicitud es un miembro recientemente identificado del la familia de proteínas inhibidor de inter-alfa-tripsina y puede poseer una o más actividades o propiedades biológicas, enzimáticas y/o inmunológicas de miembros de dicha familia de proteínas.

B. Variantes de PRO21074

Además de las secuencias de polipéptidos PRO21074 nativos de longitud completa aquí descritos, se contempla que pueden prepararse variantes del PRO21074. Las variantes del PRO21074 pueden prepararse mediante la introducción de los apropiados cambios de nucleótidos en el ADN PRO21074, y/o mediante la síntesis del polipéptido PRO21074 deseado. Aquellos entendidos en la técnica apreciarán que los cambios de amino ácido pueden alterar procesos post-translacionales del PRO21074, tales como cambiar el número o posición de los sitios de glicosilación o alterar las características de anclaje de la membrana.

Variaciones en la secuencia nativa de PRO21074 de longitud completa o en varios dominios del PRO21074 aquí descrito, puede hacerse, por ejemplo, utilizando cualquiera de las técnicas y guías para mutaciones conservadoras y no conservadoras establecidas, por ejemplo, en la U.S. Patent Nº 5.364.934. Las variaciones pueden ser una sustitución, eliminación o inserción de uno o más codones que codifican el PRO21074 que resulta en un cambio en la secuencia de amino ácido del PRO21074 en comparación con la secuencia nativa de PRO21074. Opcionalmente, la variación es por sustitución de al menos un amino ácido con cualquier otro amino ácido en uno o más de los dominios del PRO21074. La orientación en determinar qué residuo de amino ácido puede insertarse, sustituirse o eliminarse sin afectar de forma adversa la actividad deseada puede hallarse mediante comparación de la secuencia del PRO21074 con aquella de las moléculas de proteínas homólogas conocidas y minimizando el número de cambios de secuencia de amino ácido hechos en regiones de alta homología. Las sustituciones de amino ácido pueden ser el resultado de reemplazar un amino ácido con otro amino ácido que tenga propiedades estructurales y/o químicas similares, tales como el reemplazo de una leucina por una serina, es decir, reemplazos conservadores de amino ácido. Las inserciones o eliminaciones opcionalmente pueden ser en el rango de aproximadamente 1 a 5 amino ácidos. La variación permitida puede determinarse mediante la realización sistemática de inserciones, eliminaciones o sustituciones de amino ácidos en la secuencia y comprobando la actividad de las variantes resultantes exhibida con la secuencia de longitud completa o nativa madura.

Se proporcionan aquí los fragmentos del polipéptido PRO21074. Dichos fragmentos pueden estar truncados en N-terminal o C-terminal, o pueden carecer de residuos internos, por ejemplo, cuando se comparan con una proteína nativa de longitud completa. Ciertos fragmentos carece de residuos de amino ácidos que no son esenciales para una actividad biológica deseada del polipéptido PRO21074.

Los fragmentos de PRO21074 pueden prepararse mediante cualquiera de un número de técnicas convencionales. Los fragmentos deseados de péptido pueden sintetizarse químicamente. Una aproximación alternativa implica generar fragmentos de PRO21074 mediante digestión enzimática, es decir, mediante el tratamiento de la proteína con una enzima conocida por partir las proteínas en sitios definidos por residuos particulares de amino ácido, o mediante la digestión del ADN con enzimas adecuadas de restricción y aislando el fragmento deseado. Otra técnica adicional adecuada implica aislar y amplificar un fragmento de ADN que codifica un fragmento deseado de polipéptido, mediante la reacción en cadena de polimerasa (PCR). Los oligonucleótidos que definen el término deseado del fragmento de ADN se emplean en los iniciadores 5' 3' en PCR. Preferentemente, los fragmentos del polipéptido PRO21074 comparten al menos una actividad biológica y/o inmunológica con el polipéptido nativo PRO21074 mostrado en la figura 2 (SEQ ID NO: 2).

En realizaciones particulares, se muestran sustituciones conservadoras de interés en la Tabla 3 bajo el encabezado de sustituciones preferidas. Si dichas sustituciones resultan en un cambio en la actividad biológica, se introducen entonces cambios más substanciales, denominados sustituciones ejemplares en la Tabla 3, o como se describe a continuación con referencia a clases de amino ácidos, y se examinan los productos.

TABLA 3

18

Las modificaciones sustanciales en la función o la identidad inmunológica del polipéptido PRO21074 se logran mediante la selección de sustituciones que difieren significativamente en su efecto en mantener (a) la estructura del segmento principal del polipéptido en el área de la sustitución, por ejemplo, como una hoja o conformación elíptica, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio objetivo, o (c) el volumen de la cadena lateral. Los residuos producidos naturalmente se dividen en grupos basados en propiedades comunes de las cadenas laterales:

(1)

hidrofóbico: norleucina, met, ala, val, leu, ile;

(2)

hidrofílico neutral: cys, ser, thr;

(3)

ácido: asp, glu;

(4)

básico: asn, gln, his, lys, arg;

(5)

residuos que influencian la orientación de la cadena: gly, pro; y

(6)

aromático: trp, tyr, phe.

Las sustituciones no conservadoras conllevarán el intercambio de un miembro de una de estas clases por otra clase. Dichos residuos sustituidos también pueden introducirse en los sitios de sustitución conservadora o, más preferentemente, en los restantes sitios (no conservados).

Las variaciones pueden hacerse utilizando procedimientos conocidos en la técnica tales como mutagénesis de mediación por oligonucleótidos (específica puntual), barrido de alanina, y mutagénesis PCR. La mutagénesis específica puntual [Carter et al., Nucl. Acids Res., 13:4331 (1986); Zoller et al., Nucl. Acids Res., 10:6487 (1987)], mutagénesis modular [Wells et al., Gene, 34:315 (1985)], mutagénesis de selección restringida [Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317:415 (1986)] u otras técnicas conocidas pueden realizarse sobre el ADN clonado para producir el ADN de la variante del PRO21074.

También pueden emplearse análisis de barrido de amino ácidos para identificar uno o más amino ácidos a lo largo de una secuencia continua. Entre los amino ácidos de barrido preferido se hallan amino ácidos relativamente pequeños, neutrales. Tales amino ácidos incluyen alanina, glicina, serina y cisteina. La alanina es típicamente un amino ácido de barrido preferido entre este grupo porque elimina la cadena lateral más allá del carbono-beta y es menos probable que altere la conformación de la cadena principal de la variante [Cunningham and Wells, Science, 244: 1081-1085 (1989)]. La alanina también es preferida típicamente porque es el amino ácido más común. Además, se encuentra con frecuenta tanto en posiciones enterradas como expuestas [Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150:1 (1976)]. Si la sustitución de alanina no produce las cantidades adecuadas de la variante, puede utilizarse un amino ácido isotérico.

C. Modificaciones de PRO21074

Las modificaciones covalentes de PRO21074 se incluyen dentro del ámbito de esta invención. Un tipo de modificación covalente incluye reaccionar residuos de amino ácido marcados de un polipéptido PRO21074 con un agente orgánico derivatizador que es capaz de reaccionar con cadenas laterales seleccionadas de los residuos N- o C-terminal del PRO21074. La derivatización con agentes bifuncionales es útil, por ejemplo, para reticular el PRO21074 con una matriz de soporte insoluble en agua o superficie para utilizar en el procedimiento para purificar anticuerpos anti-PRO21074, y viceversa. Los agentes reticulantes comúnmente utilizados incluyen, por ejemplo, 1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletano, glutaraldehido, ésteres de N-hidroxisuccinimida, por ejemplo, ésteres con 4-ácido azidosalicílico, imidoésteres homobifuncionales, incluyendo ésteres disuccinimidil tales como 3,3'-ditiobis(succinimidilpropionato), maleimidas bifuncionales tales como bis-N-maleimido-1,8-octano y agentes tales como metil-3-[(p-azidofenil)ditio]propioimidato.

Otras modificaciones incluyen desamidación de residuos glutaminil y asparaginil a los correspondientes residuos glutamil y aspartil, respectivamente, hidroxilación de prolina y lisina, fosforilación de grupos hidroxil de residuos seril o treonil, metilación de los grupos \alpha-amino de cadenas laterales de lisina, arginina, e histidina. [T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)], acetilación de la amina N-terminal, y amidación de cualquier grupo carboxilo C-terminal.

Otro tipo de modificación covalente del polipéptido PRO21074 incluido dentro del ámbito de esta invención comprende alterar el diseño nativo de glicosilación del polipéptido. "Alterar el partrón nativo de glicosilación" busca para los presentes propósitos para indicar eliminar uno o más fracciones de carbohidrato encontradas en la secuencia nativa del PRO21074 (ya sea extrayendo el sitio de glicosilación subyacente o mediante la eliminación de la glicosilación a través de medios químicos y/o enzimáticos), y/o añadir uno o más sitios de glicosilación que no están presentes en la secuencia nativa de PRO21074. Además, la frase incluye cambios cualitativos en la glicosilación de las proteínas nativas, implicando un cambio en la naturaleza y proporciones de las distintas fracciones de carbohidratos presentes.

La adición de sitios de glicosilación al polipéptido PRO21074 pueden lograrse mediante la alteración de la secuencia de amino ácido. La alteración puede hacerse, por ejemplo, mediante la adición de, o sustitución por, uno o más residuos de serina o treonina a la secuencia nativa de PRO21074 (para sitios de glicosilación enlace O). La secuencia de amino ácido PRO21074 puede opcionalmente alterarse a través de cambios en el nivel de ADN, particularmente mediante la mutación del ADN que codifica al polipéptido PRO21074 en bases preseleccionadas tales que se generan codones que se traducirán en los amino ácidos deseados.

Otros medios para incrementar el número de fracciones de carbohidratos del polipéptido PRO21074 es mediante el acoplamiento químico o enzimático de glicósidos al polipéptido. Dichos procedimientos se describen en la técnica, por ejemplo, WO 87/05330 publicada 11 Septiembre 1987, y en Aplin and Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981).

La extracción de fracciones de carbohidrato presentes en el polipéptido PRO21074 puede lograrse química o enzimáticamente o mediante sustitución por mutación de codones que codifican los residuos de amino ácido que sirven como marcadores para la glicosilación. Las técnicas de desglicosilación química son conocidas en la técnica y se describen, por ejemplo en Hakimuddin, et al., Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987) y en Edge et al., Anal. Biochem., 118:131 (1981). La división enzimática de las fracciones de carbohidratos de los polipéptidos puede lograrse mediante el uso de una variedad de endo- y exo-glicosidasas como describe Thotakura et al., Meth. Enzymol., 138:350 (1987).

Otro tipo de modificación covalente del PRO21074 comprende unir el polipéptido PRO21074 a uno de una variedad de polímeros no protéicos, es decir, polietilen glicol (PEG), polipropilen glicon, o polioxialquilenos, en la forma establecida en U.S. Patent Nº. 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192 o 4.179.337.

El PRO21074 de la presente invención puede modificarse también en un modo para formar una molécula quimérica que comprende PRO21074 fusionado a otro polipéptido o secuencia de amino ácido heterólogo.

En una realización, tal molécula quimérica comprende una fusión del PRO21074 con un polipéptido marcador que proporciona un epitope al cual puede unirse selectivamente un anticuerpo anti-marcador. El epitope marcador generalmente se coloca en el término amino o carboxil del PRO21074. La presencia de dichas formas con epitope marcador del PRO21074 pueden detectarse utilizando un anticuerpo contra el polipéptido marcador. También, la provisión del epitope marcador permite que el PRO21074 se purifique fácilmente mediante purificación por afinidad utilizando un anticuerpo anti-marcador u otro tipo de matriz de afinidad que se une al epitope marcador. En la técnica se conocen varios polipéptidos marcadores y sus respectivos anticuerpos. Los ejemplos incluyen marcadores poli-histidina poli-his), o poli-histidina-glicina (poli-his-gli); el polipéptido marcador de la gripe HA y su anticuerpo 12CA5 [Field et al., Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)]; el marcador c-myc y los anticuerpos 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 y 9E10 [Evan et al., Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)]; y el marcador de la glicoproteína D del virus del Herpes Simple (gD) y su anticuerpo [Paborsky et al., Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)]. Otros polipéptidos marcadores incluye el péptido Flag [Hopp et al., BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)]; el péptido epitope KT3 [Martin et al., Science, 255:192-194 (1992)]; un péptido epitope \alpha-tubulina [Skinner et al., J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)]; y el marcador péptido gen T7 10 proteína [Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990)].

En una realización alternativa, la molécula quimérica puede comprender una fusión del PRO21074 con una inmunoglobulina o una región particular de una inmunoglobulina. Para una forma bivalente de la molécula quimérica (también referida como "inmunoadhesina"), dicha fusión pude ser en la región Fe de una molécula IgG. Las fusiones Ig preferentemente incluyen la sustitución de una forma soluble (dominio transmembrana eliminado o inactivado) de un polipéptido PRO21074 en lugar de al menos una región variable dentro de una molécula Ig. En una realización preferida particularmente, la fusión de inmunoglobulina incluye las regiones de la bisagra, CH2 y CH3, o la bisagra, CH1, CH2 y CH3 de una molécula IgG1. Para la producción de fusiones de inmunoglobulinas ver también la patente US Nº 5.428.130 publicada en Junio 27, 1995.

D. Preparación de PRO21074

La siguiente descripción se refiere primariamente a la producción de PRO21074 mediante células cultivadas transformadas o trasnfectadas con un vector que contiene ácido nucleico PRO21074 y la purificación de la proteína resultante. Por supuesto, se contempla que puedan aplicarse procedimientos alternativos, que son bien conocidos en la técnica, para preparar PRO21074. Por ejemplo, la secuencia PRO21074, o porciones del mismo, puede producirse mediante síntesis directa de péptido utilizando técnicas de fase sólida [ver por ejemplo, Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963)]. La síntesis in vitro de proteínas puede realizarse utilizando técnicas manuales o mediante automatización. La síntesis automatizada puede lograrse, por ejemplo, utilizando un Applied Biosystems Peptide Synthesizer (Foster City, CA) empleando las instrucciones del fabricante. Varias porciones del PRO21074 pueden sintetizarse químicamente de forma separada y combinarse utilizando procedimientos químicos o enzimáticos para producir PRO21074 de longitud completa.

1. Aislamiento de ADN que codifica PRO21074

El ADN que codifica PRO21074 puede obtenerse a partir de un banco de ADNc preparado a partir de tejido que se cree que posee el ARNm PRO21074 y expresarlo en un nivel detectable. En consecuencia, el ADN humano de PRO21074 puede ser obtenido convenientemente a partir de un banco de ADNc preparado a partir de tejido humano, tal como se describe en los ejemplos. El gen que codifica PRO21074 también puede obtenerse a partir de un banco de genoma o mediante procedimientos de síntesis conocidos (por ejemplo, síntesis automatizada de ácido nucleico).

Los bancos pueden barrerse con sondas (tales como anticuerpos del PRO21074 u oligonicleótidos de al menos 20-80 bases) designadas para identificar el gen de interés o la proteína por él codificada. El barrido del ADNc o banco de genoma con la sonda seleccionada puede realizarse utilizando procedimientos estándar, tales como se describe en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Un medio alternativo para aislar el gen que codifica el PRO21074 es utilizar metodología PCR [Sambrook et al., supra; Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)].

Los siguientes ejemplos describen técnicas de barrido de un banco de ADNc. Las secuencias de oligonucleótidos seleccionadas como sondas deben ser de longitud suficiente y suficientemente no ambiguas para minimizar los falsos positivos. El oligonucleótido preferentemente se marca de forma tal que pueda detectarse al hibridarse con el ADN en el banco que se barre. Los procedimientos de marcado son bien conocidos en la técnica, e incluyen el uso de radiomarcadores tales como ^{32}P-ATP marcado, biotinación o marcado de enzimas. Las condiciones de hibridación, incluyendo moderadamente rigurosas y altamente rigurosas, se proporcionan en Sambrook et al., supra.

Las secuencias identificadas en dichos procedimientos de barrido de banco pueden compararse y alinearse con otras secuencias conocidas depositadas en bases de datos públicas tales como Genbank y otras bases de datos privados de secuencias. La identidad de secuencia (tanto en el nivel amino ácido como de nucleótido) dentro de regiones definidas de la molécula o a través de la longitud completa de la secuencia puede determinarse utilizando procedimientos conocidos en la técnica y como se describe aquí.

El ácido nucleico con secuencia codificadora de proteína puede obtenerse mediante el barrido de ADNc seleccionado o de bancos de genoma utilizando la secuencia de amino ácido deducida aquí descrita por primera vez, y, si es necesario, utilizando procedimientos convencionales de iniciación como se describe en Sambrook et al., supra, para detectar precursores e intermediarios de proceso del ARNm que pueden no haber sido trascripto a la inversa en
ADNc.

2. Selección y Transformación de Células Huésped

Las células huésped se transfectan o transforman con vectores de expresión o de clonación aquí descritos para la producción de PRO21074 y se cultivan en medios nutrientes convencionales modificados apropiados para inducir promotores, seleccionar transformantes, o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas. Las condiciones de cultivo, tales como medio, temperatura, pH y similares, pueden seleccionarse mediante el operador entendido sin demasiada experimentación. En general, pueden encontrarse los principios, protocolos y técnicas prácticas para maximizar la productividad de los cultivos celulares en Mammalian Cell Biotechnology: A Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991) y Sambrook et al., supra.

Los procedimientos de transfección de células eucarióticas y la transformación de células procarióticas son conocidos para los operarios ordinariamente hábiles, por ejemplo, CaCl_{2}, CaPO_{4}, mediado por liposomas y electroporación. Dependiendo de la célula huésped utilizada, la transformación se realiza utilizando técnicas estándar apropiadas para dichas células. El tratamiento con calcio empleando cloruro de calcio, como se describe en Sambrook et al., supra, o la electroporación se usan generalmente para procariotas. La infección con Agrobacterium tumefaciens se utiliza para la transformación de ciertas células de plantas, como se describe en Shaw et al., Gene, 23:315 (1983) y WO 89/05859 publicada el 29 Junio 1989. Para células de mamífero sin dichas paredes celulares, puede emplearse el procedimiento de precipitación por fosfato de calcio de Graham y van der Eb, Virology, 52:456-457 (1978). Los aspectos generales de la transfección del sistema huésped de células de mamífero se ha descrito en U.S. Patent Nº 4.399.216. Las transformaciones en levadura típicamente se llevan a cabo según el procedimiento de Van Solingen et al., J. Bact., 130:946 (1977) y Hsiao et al., Proc. Natl. Acad Sci. (USA), 76:3829 (1979). Sin embargo, pueden usarse otros procedimientos para introducir ADN en las células, tales como mediante microinyección nuclear, electroporación, fusión de protoplasto bacteriano con células intactas, o policationes, por ejemplo, polibreno, poliomitina. Para distintas técnicas para transformar células de mamífero, ver Keown et al., Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990) y Mansour et al., Nature, 336:348-352 (1988).

Las células huésped adecuadas para clonar o expresar el ADN en los vectores incluyen aquí procariotes, levadura o células eucariotas más altas. Los procariotres adecuados incluyen pero no están limitados a eubacterias, tales como organismos Gram negativos o Gram positivos, por ejemplo, Enterobacteriáceas como E. coli. Distinas cepas de E. coli está públicamente disponibles, tales como E. coli K12 cepa MM294 (ATCC 31,446); E. coli X1776 (ATCC 31,537); E. coli cepa W3110 (ATCC 27,325) y K5 772 (ATCC 53,635). Otras células huésped procariotas adecuadas incluyen Enterobacteriáceas tales como Escherichia, es decir, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por ejemplo, Salmonella typhimurium, Serratia, es decir, Serratia marcescans, y Shigella, así como Bacilli tales como B. subtilis y B. licheniformis (es decir, B. licheniformis 41P descrito en DD 266.710 publicado el 12 Abril 1989), Pseudomonas tales como P. aeruginosa, y Streptomyces. Estos ejemplos son ilustrativos más que limitantes. La cepa W3110 es un huésped particularmente preferido o huésped madre porque es una cepa huésped común para las fermentaciones de producto ADN recombinante. Preferentemente, la célula huésped secreta cantidades mínimas de enzimas proteolíticas. Por ejemplo, la cepa W3110 puede modificarse para realizar una mutación genética en los genes que codifican proteínas endógenas del huésped, con ejemplos de dichos huéspedes que incluyen E. coli W3110 cepa 1A2, que tiene el genotipo completo tonA; E. coli W3110 cepa 9E4, que tiene el genotipo completo tonA ptr3; E. coli W3110 cepa 27C7 (ATCC 55.244), que tiene el genotipo completo tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT kan^{r}; E. coli W3110 cepa 37D6, que tiene el genitivo completo tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT rbs7 ilvG kan^{r}; E. coli W3110 cepa 40B4, que es la cepa 37D6 con una mutación de eliminación con un no camamicin resistente degP; y una cepa de E. coli que tiene proteasa periplásmica mutante descrita en U.S. Patent Nº 4.946.783 publicada el 7 Agosto 1990. Alternativamente, son adecuados procedimientos de clonación in vitro, por ejemplo, PCR u otras reacciones de polimerasa de ácido nucleico.

Además de los procariotas, microbios eucariotas tales como hongos filamentosos o levaduras son huéspedes adecuados de clonado o expresión para los vectores que codifican PRO21074. Saccharomyces cerevisiae es un microorganismo huésped eucariota menor comúnmente utilizado. Otros incluyen Schizosaccharomyces pombe (Beach and Nurse, Nature, 290:140 [1981]; EP 139.383 publicada 2 Mayo 1985); huéspedes Kluyveromyces (U.S. Patent Nº 4.943.529; Fleer et al., Bio/Technology, 9:968-975 (1991)) tales como, por ejemplo, K. lactis (MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt et al., J. Bacteriol., 154(2): 737-42 [1983]), K. fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045), K. wickeramii (ATCC 24.178), K. waltii (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906; Van den Berg et al., Bio/Technology, 8:135 (1990)), K. thermotolerans, and K. marxianus; yarrowia (EP 402.226); Pichia pastoris (EP 183.070; Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol., 28:265-278 [1988]); Candida; Trichoderma reesia (EP 244.234); Neurospora crassa (Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:5259-5263 [1979]); Schwanniomyces tales como Schwanniomyces occidentalis (EP 394.538 publicada 31 Octubre 1990); y hongos filamentosos tales como, por ejemplo, Neurospora, Penicillium, Tolypocladiuni (WO 91/00357 publicada 10 Enero 1991), y huéspedes Aspergillus tales como A. nidulans (Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 112:284-289 [1983]; Tilburn et al., Gene, 26:205-221 [1983]; Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1470-1474 [1984]) y A. niger (Kelly and Hynes, EMBO J., 4:475-479 [1985]). Las levaduras metilotrópicas son aquí adecuadas e incluyen, pero no están limitadas, levaduras capaces de crecer en metanol seleccionadas a partir del género consistente en Hansenula, Candida, Kloeckera, Pichia, Saccharomyces, Torulopsis, y Rhodotorula. Una lista de especies específicas que son ejemplares de esta clase de levaduras puede encontrase en C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269
(1982).

Células huésped adecuadas para la expresión de PRO21074 glicosilato se derivan a partir de organismos multicelulares. Ejemplos de células de invertebrados incluyen células de insectos tales como Drosophila S2 y Spodoptera Sf9, así como células de plantas. Ejemplos de líneas de células huésped útiles de mamíferos incluyen ovario de hámster Chino (CHO) y células COS. Ejemplos más específicos incluyen riñón de mono línea CV1 transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); línea de riñón embrionario humano (293 o células 293 subclonadas para crecer en cultivo en suspensión, Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 (1977)); células de ovario de hámster Chino/-DHFR (CHO, Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad Sci. USA, 77:4216 (1980)); células Sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)); células pulmonares humanas (W138, ATCC CCL 75); células hepáticas humanas (Hep G2, HB 8065); y tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51). La selección de la célula huésped apropiada se considera dentro de la habilidad en la técnica.

3. Selección y Uso de un Vector Replicable

El ácido nucleico (es decir, ADNc o ADN genómico) que codifica PRO21074 puede insertarse en un vector replicable para clonación (amplificación del ADN) o para expresión. Diferentes vectores están disponibles públicamente. El vector puede, por ejemplo, estar en la forma de un plásmido, cósmido, partícula viral o fago. La secuencia de ácido nucleico apropiada puede insertarse en el vector mediante una variedad de procedimientos. En general, el ADN se inserta en un sitio(s) de restricción de endonucleasa apropiado utilizando técnicas conocidas en la técnica. Los componentes vector generalmente incluyen, pero no están limitados, una o más secuencia de señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor, y una secuencia de terminación de transcripción. La construcción de vectores adecuados que contengan uno o más de estos componentes emplea técnicas de ligadura estándar que son conocidas para el operario entendido.

El PRO21074 puede producirse de forma recombinante no sólo directamente, sino también como un polipéptido de fusión con un polipéptido heterólogo, que puede ser una secuencia de señal u otro polipéptido que tenga un sitio de rotura específico en el N-terminal de la proteína madura o polipéptido. En general, la secuencia de señal puede ser un componente del vector, y puede ser una parte del ADN que codifica al PRO21074 que se inserta en el vector. La secuencia de señal puede ser una secuencia de señal procariota seleccionada, por ejemplo, a partir del grupo de fosfatasa alcalina, penicilinasa, 1 pp, o conductores de enterotoxina II térmicamente estable. Por secreción de levadura la secuencia de señal puede ser, por ejemplo de conductor de invertasa de levadura, conductor de factor alfa (incluyendo conductores de factores \alpha de Saccharomyces y Kluyveromyces, éste último descrito en la U.S. Patent Nº 5.010.182), o conductores de fosfatasa ácida, el conductor glucoamilasa C. albicans (EP 362.179 publicada el 4 Abril 1990), o la señal descrita en WO 90/13646 publicada el 15 Noviembre 1990. En la expresión celular de mamíferos, las secuencias de señal de mamíferos pueden usarse para dirigir la secreción de la proteína, tales como secuencias de señal a partir de polipéptidos secretados de la misma o de especies relacionadas, así como conductores virales de secre-
ción.

Tanto los vectores de expresión como los de clonado contienen una secuencia de ácido nucleico que permite que el vector se replique en una o más células huésped seleccionadas. Tales secuencias son bien conocidas para una variedad de bacteria, levadura, y virus. El origen de replicación a partir del plásmido pBR322 es adecuada para la mayoría de las bacterias Gram-negativas, el plásmido origen 2 \mu es adecuado para levadura y varios orígenes virales (SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) son útiles para vectores de clonado en células de mamífero.

Los vectores de expresión y clonado típicamente contendrán un gen de selección, también llamado un marcador seleccionable. Los genes típicos de selección codifican proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato, o tetraciclina, (b) complementan deficiencias autotróficas, o (c) suplir nutrientes críticos no disponibles a partir del medio complejo, por ejemplo el gen que codifica D-alanina racemasa para Bacilli.

Un ejemplo de marcadores seleccionables adecuados para células de mamífero son aquellos que permiten la identificación de células competentes para aceptar el ácido nucleico que codifica el PRO21074, tales como DHFR o timidina quinasa. Una célula huésped apropiada cuando se emplea el DHFR de tipo salvaje es la línea de células CHO deficiente en actividad DHFR, preparada y propagada como se describe en Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980). Un gen de selección adecuado para usar en levadura es el gen trp1 presente en el plásmido de levadura YRp7 [Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979); Kingsman et al., Gene, 7:141 (1979); Tschemper et al., Gene, 10:157 (1980)]. El gen trp1 proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura que carece de la habilidad de crecimiento en triptofano, por ejemplo, ATCC No. 44076 o PEP4-1 [Jones, Genetics, 85:12 (1977)].

Los vectores de expresión y clonado usualmente contienen un promotor unido de forma operativa a la secuencia de ácido nucleico que codifica PRO21074 para dirigir la síntesis ARNm. Los promotores reconocidos por una variedad de células huésped potenciales son bien conocidos. Los promotores adecuados para utilizar con huéspedes procarióticos incluyen la \beta-lactamasa y sistemas promotores de lactosa [Chang et al., Nature, 275:615 (1978); Goeddel et al., Nature, 281:544 (1979)], fosfatasa alcalina, un sistema promotor de triptofano (trp) [Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); EP 36.776], y promotores híbridos tales como el promotor tac [deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)]. Los promotores para utilizar en sistemas bacterianos también contendrán una secuencia Dalgarno (S.D.) unida de forma operativa al ADN que codifica PRO21074.

Ejemplos de secuencias adecuadas de promotores para utilizar con huéspedes de levadura incluyen los promotores 3-fosfogliquerata quinasa [Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)] u otras enzimas glicolíticas [Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968); Holland, Biochemistry, 17:4900 (1978)], tales como enolasa, gliceraldehído-3-fosfato dehidrogenasa, hexoquinasa, piruvato decarboxilasa, fosfofructoquinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato quinasa, triosefosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucoquinasa.

Otros promotores de levadura, que son promotores inducibles que tienen la ventaja adicional de transcripción controlada con condiciones de crecimiento, son regiones promotoras para alcohol dehidrogenasa 2, isocitocromo C, fosfatasa ácida, enzimas degradativas asociadas con el metabolismo del nitrógeno, metalotioneina, gliceraldhehido-3-fosfato deshidrogenada, y enzimas responsables de la utilización de la maltosa y la galactosa. Los vectores y promotores adecuados para utilizar en expresión de levadura se describen adicionalmente en EP 73.657.

La transcripción PRO21074 a partir de vectores en células huésped de mamíferos está controlada, por ejemplo, por promotores obtenidos de los genomas de virus tales como virus polioma, virus fowlpox (UK 2.211.504 publicada el 5 Julio 1989), adenovirus (tal como Adenovirus 2), virus del papiloma bovino, virus de sarcoma aviar, citomegalovirus, un retrovirus, virus de hepatitis B y virus Simian 40 (SV40), a partir de promotores heterólogos de mamífero, por ejemplo el promotor de actina o un promotor de inmunoglobulina, y a partir de promotores de choque térmico, siempre que tales promotores sean compatibles con los sistemas de células huésped.

La transcripción del ADN que codifica PRO21074 por eucariotas superiores puede incrementarse mediante la inserción de una secuencia potenciadora en el vector. Los potenciadores son elementos que actúan en cis del ADN, usualmente aproximadamente de 10 a 300 bp, que actúan sobre un promotor para incrementar su transcripción. Muchas secuencias potenciadoras se conocen ahora a partir de genes de mamífero (globin, elastasa, albúmina, \alpha-fetoproteína, e insulina). Típicamente, sin embargo, se empleará un potenciador a partir de virus de células eucariotas. Los ejemplos incluyen el potenciador SV40 sobre el último lado del origen de replicación (bp 100-270), el potenciador temprano del promotor del citomegalivirus, el potenciador del polioma en el último lado del origen de replicación, y potenciadores de adenovirus. El potenciador puede ensamblarse en el vector en una posición 5' o 3' de la secuencia de codificación PRO21074, pero preferentemente se ubica en el sitio 5' del promotor.

Los vectores de expresión utilizados en células huésped eucarióticas (levadura, hongos, células nicleadas de insectos, plantas, animales u otros organismos multicelulares) también contendrán secuencias necesarias para la finalización de la transcripción y para estabilizar el ARNm. Dichas secuencias están disponibles comúnmente a partir de las regiones no traducidas 5', y ocasionalmente 3', de ADNs o ADNcs eucarióticos o virales. Estas regiones contienen segmentos de nucleótido transcritos como fragmentos poliadenilatados en la porción no traducida del ARNm que codifica PRO21074.

Otros procedimientos, vectores y células huésped adecuadas para la adaptación a la síntesis de PRO21074 en cultivos recombinantes celulares de vertebrados se describen en Gething et al., Nature, 293:620-625 (1981); Mantei et al., Nature, 281:40-46 (1979); EP 117.060; y EP 117.058.

4. Detectar Amplificación/Expresión de Genes

La amplificación y/o expresión de genes puede medirse directamente en una muestra, por ejemplo, mediante análisis de Southern, análisis de Northern para cuantificar la transcripción del ARNm [Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 (1980)], análisis de punto (análisis de ADN), o hibridación in situ, utilizando una sonda marcada apropiada, basado en las secuencias aquí proporcionadas. Alternativamente, pueden emplearse los anticuerpos que pueden reconocer dúplex específicos, incluyendo dúplex ADN, dúplex ARN, y dúplex híbridos ADN-ARN o dúplex ADN-proteína. Los anticuerpos a su vez pueden marcarse y el ensayo puede llevarse a cabo donde el dúplex se une a una superficie, de forma que por la formación del dúplex sobre la superficie, puede detectarse la presencia de anticuerpos unidos al dúplex.

La expresión de genes, alternativamente, puede medirse mediante procedimientos inmunológicos, tales como teñido inmunohistoquímico de células o secciones de tejido y ensayo de cultivo celular o fluidos corporales, para cuantificar directamente la expresión del producto génico. Los anticuerpos útiles para el teñido inmunohistoquímico y/o ensayo de fluidos muestra puede ser tanto monoclonal o policlonal, y puede prepararse en cualquier mamífero. Convenientemente, los anticuerpos pueden prepararse contra una secuencia nativa de polipéptido PRO21074 o contra un péptido sintético basado en las secuencias de ADN aquí provistas o contra una secuencia exógena fusionada al ADN PRO21074 y que codifica un epitope de anticuerpo específico.

5. Purificación del Polipéptido

Pueden recuperarse formas de PRO21074 a partir de medio de cultivo o a partir de lisatos de células huésped. Si están unidas a la membrana, pueden liberarse de la membrana utilizando una solución adecuada de detergente (por ejemplo, Triton-X 100) o mediante rotura enzimática. Las células empleadas en la expresión de PRO21074 pueden romperse mediante distintos medios físicos o químicos, tales como ciclos de congelación-descongelación, sonicación, ruptura mecánica, o agentes de lisis celular.

Puede desearse purificar PRO21074 a partir de proteínas o polipéptidos de células recombinantes. Los siguientes procedimientos son ejemplares de procedimientos adecuados de purificación: mediante fraccionamiento sobre una columna de intercambio de iones; precipitación con etanol; PHL de fase reversa; cromatografía sobre sílice o resina de intercambio de cationes tales como DEAE; cromatofocalizando; SDS-PAGE; precipitación con sulfato de amonio; filtración con gel utilizando, por ejemplo, Sephadex G-75; columnas de Sepharose proteína A para extraer contaminantes tales como IgG; y columnas quelantes de metal para unir formas unidas marcadas por epitope del PRO21074. Pueden emplearse distintos procedimientos de purificación de proteína y tales procedimientos son conocidos en la técnica y descritos por ejemplo en Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982). La etapa(s) de purificación seleccionadas dependerán, por ejemplo, de la naturaleza del proceso de producción utilizado y el PRO21074 particular producido.

E. Usos de PRO21074

Las secuencias de nucleótidos (o sus complementos) que codifican PRO21074 tienen distintas aplicaciones en la técnica de la biología molecular, incluyendo usos como sondas de hibridación, en el mapeo de cromosomas y genes y en la generación de ARN y ADN antisentido. El ácido nucleico PRO21074 también será útil para la preparación de polipéptidos PRO21074 mediante las técnicas recombinantes aquí descritas.

El gen de secuencia nativa de PRO21074 de longitud completa (SEQ ID NO: 1), o porciones del mismo, pueden usarse como sondas de hibridación para banco de ADNc para aislar la longitud completa de ADNc de PRO21074 o para aislar aún otros ADNcs (por ejemplo, aquellos que codifican las variantes naturalmente producidas de PRO21074 o PRO21074 de otras especies) que tienen una identidad de secuencia deseada con la secuencia de PRO21074 descrita en la figura 1 (SEQ ID NO: 1). Opcionalmente, la longitud de las sondas será aproximadamente de 20 a 50 bases. Las sondas de hibridación pueden derivarse de regiones al menos parcialmente nuevas de la secuencia de nucleótido de SEQ ID NO: 1 donde esas regiones pueden determinarse sin excesiva experimentación o a partir de secuencias genómicas que incluyen promotores, elementos potenciadores e intrones de secuencia nativa PRO21074. A modo de ejemplo, un procedimiento de barrido comprenderá aislar la región codificadora o la región no traducida del gen PRO21074 utilizando la secuencia conocida de ADN para sintetizar una sonda seleccionada de aproximadamente 40 bases. Las sondas de hibridación pueden marcarse mediante una variedad de marcadores, incluyendo radionucleótidos tales como ^{32}P o ^{35}S, de marcadores enzimáticos tales como fosfatasa alcalina acoplada a la sonda a través de sistemas de acoplamiento avidina/biotina. Las sondas marcadas que tienen una secuencia complementaria a la del gen de PRO21074 de la presente invención pueden usarse para barrer bancos de ADNc humano, ADN o ARNm genómico para determinar a qué elementos de dichos bancos se hibridiza la sonda. Las técnicas de hibridación se describen con mayor detalle en los ejemplos a continuación.

Cualquier secuencia EST descritas en la presente solicitud puede emplearse similarmente a las sondas, utilizando los procedimientos aquí descritos.

Otros fragmentos útiles de los ácidos nucleico de PRO21074 incluyen oligonucleótidos antisentido o sentido que comprenden una secuencia de ácido nucleico de hebra simple (ya sea ARN o ADN) capaz de unirse a la secuencia ARNm PRO21074 objetivo (sentido) o ADN PRO21074 (antisentido). Los oligonucleótidos antisentido o sentido, según la presente invención, comprende un fragmento de la región de codificación o la región no traducida de ADN PRO21074. Un fragmento así generalmente comprende al menos aproximadamente 14 nucleótidos, preferentemente de aproximadamente 14 a 30 nucleótidos. La habilidad de derivar un oligonucleótido antisentido o sentido, basado en la secuencia de ADNc que codifica una proteína dada se describe, por ejemplo, en Stein y Cohen (Cancer Res. 48:2659, 1988) y van der Krol et al. (BioTechniques 6:958, 1988).

La unión de oligonucleótidos antisentido o sentido con secuencias objetivo de ácido nucleico resulta en la formación de dúplex que bloquean la transcripción o traducción de la secuencia objetivo a través de uno de varios medios, incluyendo la degradación potenciada de los dúplex, terminación prematura de la transcripción o la traducción, o por otros medios. Los oligonucleótidos antisentido por lo tanto pueden usarse para bloquear la expresión de las proteínas PRO21074. Los oligonucleótidos antisentido o sentido comprenden además oligonucleótidos que han modificado los ejes centrales de azúcar-fosfodiéster (u otras uniones azúcar, tales como las descritas en WO 91/06629) y donde dichas uniones azúcar son resistentes a nucleasas endógenas. Dichos oligonucleótidos con uniones azúcar resistentes son estables in vivo (es decir, capaces de resistir la degradación enzimática) pero retiene especificidad de secuencia para ser capaz de unirse a secuencias objetivo de nucleótidos.

Otros ejemplos de oligonucleótidos sentido o antisentido incluyen aquellos oligonucleótidos que están unidos covalentemente a fracciones orgánicas, tales como las descritas en WO 90/10048, y otras fracciones que incrementan la afinidad del oligonucleótido por una secuencia de ácido nucleico objetivo, tal como poli-(L-lisina). Aún más, agentes intercalantes, tales como elipticina, y agentes alquilantes o complejos metálicos pueden unirse a oligonucleótidos sentido o antisentido para modificar las especificidades de unión para el oligonucleótidos sentido o antisentido para la secuencia de nucleótido objetivo.

Los oligonucleótidos antisentido o sentido pueden introducirse en una célula que contenga la secuencia de ácido nucleico objetivo mediante cualquier procedimiento de transferencia de genes, incluyendo, por ejemplo, transfección de ADN de mediación por CaPO_{4}, electroporación, o mediante el uso de vectores de transferencia de genes tales como el virus Epstein-Barr. En un procedimiento preferido, un oligonucleótido antisentido o sentido se inserta en un vector retroviral adecuado. Una célula que contiene la secuencia de ácido nucleico objetivo contacta con el vector retroviral recombinante, ya sea in vivo o ex vivo. Los vectores retrovirales adecuados incluyen, pero no están limitados a, aquellos derivados del retrovirus murina M-MuLV, N2 (un retrovirus derivado de M-MuLV), o los vectores de copia doble designada DCT5A, DCT5B y DCT5C (ver WO 90/13641).

Los oligonucleótidos sentido o antisentido también pueden introducirse en una célula que contenga la secuencia de nucleótido objetiva mediante la formación de un conjugado con una molécula ligando de unión, como se describe en WO 91/04753. Las moléculas ligando de unión adecuada incluyen, pero no están limitadas a, receptores de superficie de la célula, factores de crecimiento, otras citoquinas, u otros ligandos que se unen a los receptores de la superficie celular. Preferentemente, la conjugación de la molécula ligando de unión para unirse con su correspondiente molécula o receptor, o bloquear la entrada del oligonucleótido sentido o antisentido o su versión conjugada dentro de la
célula.

Alternativamente, un oligonucleótido sentido o antisentido puede introducirse en una célula que contiene la secuencia objetivo de ácido nucleico mediante la formación de un complejo oligonucleótido-lípido, como se describe en WO 90/10448. El complejo oligonucleótidos sentido o antisentido-lípido preferentemente se disocia dentro de la célula mediante una lipasa endógena.

Las sondas también pueden emplearse en técnicas PCR para generar un grupo de secuencias para identificación de las secuencias que codifican PRO21074 más relacionadas.

Las secuencias de nucleótido que codifican un PRO21074 también pueden usarse para construir sondas de hibridación para determinar sitios de expresión de ADN 153576 en tejidos (hibridación in situ), mapear el gene que codifica PRO21074, y para el análisis genético de individuos con enfermedades particulares. Las secuencias de nucleótidos aquí provistas pueden mapearse en un cromosoma y regiones específicas de un cromosoma utilizando técnicas conocidas, tales como hibridación in situ, análisis de unión contra marcadores cromosómicos conocidos, y barrido de hibridación con bancos.

Cuando las secuencias de codificación de PRO21074 codifican una proteína que se une a otra proteína (ejemplo, donde el PRO21074 es un receptor), el PRO21074 puede usarse en ensayos para identificar las otras proteínas o moléculas implicadas en la interacción de unión. Mediante dichos procedimientos, los inhibidores de la interacción de unión receptor/ligando pueden identificarse. Las proteínas implicadas en tales interacciones de unión también pueden usarse para barrer péptidos o inhibidores de molécula pequeña o agonistas de la interacción de unión. También, el receptor PRO21074 puede usarse para aisla ligando(s) correlativo. Los ensayos de barrido pueden diseñarse para encontrar componentes guía que imitan la actividad biológica del PRO21074 nativo o un receptor para PRO21074. Tales ensayos de barrido incluirán ensayos adecuados para el barrido de alto rendimiento de bancos químicos, haciéndolos particularmente adecuados para identificar pequeñas moléculas candidatas a la droga. Las pequeñas moléculas contempladas incluyen compuestos sintéticos orgánicos o inorgánicos. Los ensayos pueden realizarse en una variedad de formatos, incluyendo ensayos de unión proteína-proteína, ensayos de barrido bioquímico, inmunoensayos y ensayos basados en células, que están bien caracterizados en la técnica.

Los ácidos nucleicos que codifican PRO21074 o sus formas modificadas también pueden usarse para generar ya sea animales transgénicos o animales "genéticamente deficientes" que, a su vez, son útiles en el desarrollo y el barrido de reactivos terapéuticamente útiles. Un animal transgénico (por ejemplo, un ratón o rata) es un animal que tiene células que contienen un transgen, dicho transgen se introdujo en el animal o en un ancestro del animal en una etapa prenatal, por ejemplo, embrionaria. Un transgen es un ADN que está integrado en el genoma de una célula a partir de la cual se desarrolla un animal transgénico. En una realización, el ADNc que codifica PRO21074 puede usarse para clonar ADN genómico que codifica PRO21074 según con las técnicas establecidas y las secuencias genómicas utilizadas para generar animales transgénicos que contienen células que expresan ADN que codifica PRO21074. Los procedimientos para generar animales transgénicos, particularmente animales tales como ratones o ratas, se han vuelto convencionales en la técnica y se describen, por ejemplo, en U.S. Patent Nº. 4.736.866 y 4.870.009. Típicamente, células particulares se marcaran para la incorporación del transgen PRO21074 con potenciadores tisulares específicos. Los animales transgénicos que incluyen una copia de un transgen que codifica PRO21074 introducido en la línea germinal del animal en una etapa embrionaria pueden usarse para examinar el efecto de la expresión incrementada del ADN que codifica PRO21074. Tales animales pueden usarse como animales de prueba para reactivos a pesar de conferir protección para, por ejemplo, condiciones patológicas asociadas con su sobreexpresión. Según esta faceta de la invención, un animal se trata con el reactivo y una incidencia reducida de la condición patológica, comparada con animales no tratados que llevan el transgen, indicaría una intervención potencialmente terapéutica para la condición patológica.

Alternativamente, pueden usarse homólogos no humanos para PRO21074 para construir un animal PRO21074 "genéticamente deficiente" que tiene un gen defectuoso o alterado que codifica PRO21074 como resultado de recombinación homóloga entre el gen endógeno que codifica PRO21074 y ADN genómico alterado que codifica PRO21074 introducido en una célula madre embrionaria del animal. Por ejemplo, ADNc que codifica PRO21074 puede usarse para clonar ADN genómico que codifica PRO21074 según las técnicas establecidas. Una porción del ADN genómico que codifica PRO21074 puede detectarse o reemplazarse con otro gen, tal como un gen que codifique un marcador selectivo que puede usarse para control de integración. Típicamente, varias kilobases de ADN inalterado complementario (tanto en los extremos 5' como 3') se incluyen en el vector [ver por ejemplo, Thomas y Capecchi, Cell, 51:503 (1987) para una descripción de vectores homólogos de recombinación]. El vector se introduce en una línea germinal embrionaria de células madre (por ejemplo mediante electroporación) y se seleccionan células en las que el ADN introducido que se han recombinado de forma homóloga con el ADN endógeno [ver, por ejemplo, Li et al., Cell, 69:915 (1992)]. Las células seleccionadas se inyectan entonces en un blastocisto de un animal (por ejemplo, un ratón o una rata) para formar quimeras de agregación [ver, por ejemplo, Bradley, en Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), pp. 113-152]. Un embrión quimérico puede implantarse entonces en un animal femenino adoptivo pseudopreñado y el embrión llevado a término para crear un animal "genéticamente deficiente". La progenie que alberga el ADN recombinado homólogamente en sus células germinales puede identificarse mediante técnicas estándar y utilizarse para criar animales en los cuales todas las células del animal contienen el ADN recombinado homólogamente. Los animales genéticamente deficientes pueden caracterizarse por ejemplo, por su habilidad para defenderse contra ciertas condiciones patológicas y por su desarrollo de condiciones patológicas debidas a la ausencia del polipéptido PRO21074.

Los ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos PRO21074 también pueden usarse en terapia génica. En las aplicaciones de terapia génica, los genes se introducen en las células para lograr la síntesis in vitro de un producto genético terapéuticamente efectivo, por ejemplo para el reemplazo de un gen defectuoso. "Terapia génica" incluye tanto la terapia génica convencional donde se logra un efecto duradero mediante un único tratamiento, y la administración de agentes génicos terapéuticos, que implica la administración una vez o repetida de un ADN o ARNm terapéuticamente efectivo. Los ARNs y ADNs antisentido pueden usarse como agentes terapéuticos para bloquear la expresión de ciertos genes in vivo. Ya se ha mostrado que los oligonucleótidos antisentido cortos pueden importarse en las células donde actúan como inhibidores, a pesar de sus bajas concentraciones intracelulares causada por su absorción restringida por la membrana celular. (Zamecnik et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:4143-4146 [1986]). Los oligonucleótidos pueden modificarse para potenciar su absorción, por ejemplo sustituyendo sus grupos fosfodiéster cargados negativamente por grupos no cargados.

Hay una variedad de técnicas disponibles para introducir ácido nucleico en células viables. Las técnicas varían dependiendo de si el ácido nucleico se transfiere en células cultivadas in vitro, o in vivo en células del huésped deseado. Las técnicas adecuadas para la transferencia de ácido nucleico en células de mamífero in vitro incluyen el uso de liposomas, electroporación, microinyección, fusión celular, DEAE-dextrano, procedimiento de precipitación de fosfato de calcio, etc. Las técnicas actualmente preferidas de transferencia de genes in vivo incluyen transfección con vectores virales (típicamente retrovirales) y transfección de mediación por proteino-liposoma de cubierta vírica (Dzau et al., Trends in Bioteclanology 11, 205-210 [1993]). En algunas situaciones es deseable proporcionar la fuente de ácido nucleico con un agente que identifica las células objetivo, tales como un anticuerpo específico para la proteína de la superficie de la membrana celular o la célula objetivo, un ligando para un receptor sobre la célula objetivo, etc. Donde se emplean liposomas, las proteínas que se unen a una proteína de la superficie de la membrana celular asociada con endocitosis puede usarse para identificar y/o facilitar la absorción, por ejemplo proteínas de la cápside o fragmentos de el misma trópico para un tipo de célula particular, anticuerpos para proteínas que se someten a una internalización en repetición, proteínas que identifican la localización intracelular y potencian la vida media intracelular. La técnica de endocitosis de mediación por receptor se describe por ejemplo en Wu et al., J. Biol. Chem. 262, 4429-4432 (1987); y Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3410-3414 (1990). Para reseñas de protocolos de marcado génico y terapia génica ver Anderson et al., Science 256, 808-813 (1992).

Los polipéptidos PRO21074 aquí descritos también podrían emplearse como marcadores de peso molecular con propósitos de electroforesis de proteínas.

Las moléculas de ácido nucleico que codifican los polipéptidos PRO21074 o fragmentos del mismo aquí descrito son útiles para la identificación de cromosomas. A este respecto, existe una necesidad en curso de identificar nuevos marcadores cromosómicos, debido a que muy pocos reactivos de marcadores cromosómicos, basados en los datos reales de secuencia, se encuentran actualmente disponibles. Cada molécula de ácido nucleico PRO21074 de la presente invención puede usarse como un marcador cromosómico.

Los polipéptidos PRO21074 y moléculas de ácido nucleico de la presente invención también pueden usarse para determinación el tipo de tejido, donde los polipéptidos PRO21074 de la presente invención pueden expresarse diferencialmente en un tejido en comparación con otro. Las moléculas de ácido nucleico PRO21074 encontrarán uso para generar sondas para PCR, análisis Northern, análisis Southern y análisis Western.

Los polipéptidos PRO21074 y moléculas de ácido nucleico de la invención pueden ser útiles también en aplicaciones terapéuticas relacionadas con la piel, por ejemplo, injertos de piel, quemaduras, curaciones de la piel, reducción de cicatrices, etc. La similitud estructural entre cartílago y piel, así como la importancia de la matriz extracelular en la biología celular de la piel sugiere que los polipéptidos PRO21074 y moléculas de ácido nucleico aquí descritas potencialmente también causarían o resultarían en reparación de la piel.

Los polipéptidos PRO21074 aquí descritos también pueden emplearse como agentes terapéuticos. Los polipéptidos PRO21074 de la presente invención pueden formularse según los procedimientos conocidos para preparar composiciones farmacéuticamente útiles, donde el presente producto PRO21074 se combina en adición con un vehículo de transporte farmacéuticamente aceptable. Las formulaciones terapéutica se preparará para almacenarse mediante la mezcla del ingrediente activo que tiene el grado de pureza deseado con transportadores, excipientes o estabilizadores opcionales fisiológicamente aceptables (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)), en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los transportadores, excipientes o estabilizadores son no tóxicos para los receptores en las dosis y concentraciones empleadas, e incluyen tampones tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tales como polivinilpirrolidona, amino ácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos que incluyen glucosa, mañosa, o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; alcoholes de azúcar tales como manitol o sorbitol; contrapones formadores de sal, tales como sodio; y surfactantes no iónicos tales como TWEEN^{TM}, PLURONICS^{TM} o PEG.

Las formulaciones a utilizar para administración in vivo deben ser estériles. Esto se consigue fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración estériles, antes o a continuación de liofilización y reconstitución.

Las presentes composiciones terapéuticas generalmente se colocan en un contenedor que tiene un puerto de acceso estéril, por ejemplo una bolsa de solución intravenosa o vial que tenga un tapón que pueda atravesarse con una aguja de inyección hipodérmica.

La ruta de administración está de acuerdo con procedimientos conocidos, por ejemplo inyección o infusión mediante rutas intravenosas, intraperitoneales, intracerebrales, intramusculares, intraoculares, intraarteriales o intralesionales, administración tópica, o mediante sistemas de liberación sostenidos.

Las dosis y concentraciones deseadas de la droga de composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden variar dependiendo del uso particular previsto. La determinación de la dosis o ruta de administración apropiada también está dentro de la habilidad de un médico ordinario. Los experimentos con animales proporcionan una guía confiable para la determinación de dosis efectivas para terapia humana. La escala interespecífica de dosis efectivas puede realizarse siguiendo los principios establecidos por Mordenti, J. y Chappell, W. "The use of interspecies scaling in toxicokinetics" In Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi et al., Eds., Pergamon Press, New York 1989, pp. 42-96.

Cuando se emplea la administración in vivo de un polipéptido PRO21074 o agonista o antagonista del mismo, las dosis de cantidades normales pueden variar desde aproximadamente 10 ng/kg hasta más de 100 mg/kg de peso corporal del mamífero o más por día, preferentemente aproximadamente 1 \mug/kg/día a 10 mg/kg/día, dependiendo de la ruta de administración. Las guías para dosis particulares y procedimientos de suministro se proporcionan en la literatura, ver por ejemplo, U.S. Pat. Nos. 4.657.760; 5.206.344; o 5.225.212. Se anticipa que diferentes formulaciones serán efectivas para diferentes compuestos de tratamiento y distintos desórdenes, que la administración dirigida a un órgano o tejido, por ejemplo, puede necesitar el suministro en una forma diferente de aquel de otro órgano o tejido.

Donde se desea la administración de liberación sostenida de un polipéptido PRO21074 en una formulación con características de liberación adecuadas para el tratamiento de cualquier enfermedad o desorden que requiera administración del polipéptido PRO21074, se contempla el microencapsulado del polipéptido PRO21074. El microencapsulado de proteínas recombinantes para una liberación sostenida se han realizado exitosamente con hormona de crecimiento humana (rhGH), interferon (rhIFN), interleuquina 2 y MN rgp 120. Johnson et al., Nat. Med., 2:795-799 (1996); Yasuda, Biomed. Ther., 27:1221-1223 (1993); Hora et al., Bio/Technology, 8:755-758 (1990); Cleland, "Design and Production of Single Immunization Vaccines Using Polylactide Polyglycolide Microsphere Systems", en Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach, Powell and Newman, eds, (Plenum Press: New York, 1995), pp. 439-462; WO 97/03692, WO 96/40072, WO 96/07399; y U.S. Pat. No. 5.654.010.

Las formulaciones de liberación sostenida de estas proteínas fueron desarrolladas utilizando polímero de ácido poli-láctico-coglicólico (PLGA) debido a su biocompatibilidad y amplio rango de propiedades biodegradables. Los productos de degradación de PLGA, ácidos láctico y glicólico, pueden desalojarse rápidamente dentro del cuerpo humano. Por otra parte, la degradabilidad de este polímero puede ajustarse desde meses hasta años dependiendo de su peso molecular y composición. Lewis, "Controlled release of bioactive agents from lactide/glycolide polymer", en: M. Chasin and R. Langer (Eds.), Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems (Marcel Dekker: New York, 1990), pp. 1-41.

Esta invención engloba procedimientos de barrido de compuestos para identificar aquellos que imitan al polipéptido PRO21074 (agonistas) o evitan el efecto del polipéptido PRO21074 (antagonistas). Los ensayos de barrido para drogas candidatas a antagonistas se diseñan para identificar compuestos que unen o se acomplejan con los polipéptidos PRO21074 codificados por los genes aquí identificados, o que de otra forma interfieren con la interacción de los polipéptidos codificados con otras proteínas celulares. Tales ensayos de barrido incluirán ensayos adecuados para un barrido de alto rendimiento de bancos químicos, haciéndolos particularmente adecuados para identificar drogas candidatas de molécula pequeña.

Los ensayos pueden realizarse en una variedad de formatos, incluyendo ensayos de unión proteína-proteína, ensayos de barrido bioquímico, inmunoensayos, y ensayos basados en células, que están bien caracterizados en la técnica.

Todos los ensayos para antagonistas son comunes en que llaman al contacto con la droga candidata con un polipéptido PRO21074 codificado mediante un ácido nucleico aquí identificado bajo condiciones y durante un termino suficiente para permitir que estos dos componentes interactúen.

En ensayos de unión, la interacción es de unión y el complejo formado puede aislarse o detectarse en la mezcla de reacción. En una realización particular, el polipéptido PRO21074 codificado por el gen aquí identificado o la droga candidata se inmoviliza en la fase sólida, por ejemplo, en una placa microtiter, mediante uniones covalentes o no covalentes. La unión no covalente generalmente se logra mediante el revestimiento de la fase sólida con una solución del polipéptido PRO21074 y secándola. Alternativamente, un anticuerpo inmobilizado, por ejemplo un anticuerpo monoclonal, específico para el polipéptido PRO21074 a inmovilizar puede usarse para anclarlo a una superficie sólida. El ensayo se realiza mediante la adición del componente no inmovilizado, que puede estar marcado con un marcador detectable, al componente inmovilizado, por ejemplo, la superficie de revestimiento que contiene el componente anclado. Cuando la reacción se completa, los componentes no reaccionados se extraen, por ejemplo, mediante lavado, y se detectan los complejos anclados sobre la superficie sólida. Cuando el componente originalmente no inmovilizado lleva una etiqueta detectable, la detección de una etiqueta inmovilizada sobre la superficie indica que se ha producido el complejo. Donde el componente originalmente no inmovilizado no lleva una etiqueta, el complejo puede detectarse, por ejemplo, mediante el uso de un anticuerpo marcado que se une específicamente al complejo inmovilizado.

Si el componente candidato interactúa pero no se une a un polipéptido PRO21074 particular codificado por un gen aquí identificado, su interacción con ese polipéptido puede ensayarse por procedimientos bien conocidos para detectar interacciones proteína-proteína. Tales ensayos incluyen aproximaciones tradicionales, tales como, por ejemplo, reticulado, co-inmunoprecipitación, y co-purificación a través de gradientes o columnas cromatográficas. Además las interacciones proteína-proteína pueden monitorizarse mediante el uso de un sistema genético basado en levadura descrito por Fields y co-autores (Fields y Song, Nature (London), 340:245-246 (1989); Chien et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA, 88:9578-9582 (1991)) como describen Chevray y Nathans, Proc. Natl. Acad Sci. USA, 89: 5789-5793 (1991). Muchos activadores transcripcionales, tales como la levadura GAL4, consistente en dos dominios modulares físicamente discretos, uno que actúa como el dominio de unión de ADN, el otro funcionando como el dominio de transcripción-activación. El sistema de expresión de levadura descrito por las publicaciones anteriores (generalmente referidas como el "sistema de dos híbridos") toma ventaja de esta propiedad, y emplea dos proteínas híbridas, una en la cual la proteína identificada se fusiona con el dominio de ADN de unión de GAL4, y otra, en la cual las proteínas candidatas de activación se fusionan al dominio de activación. La expresión de un gen indicador GAL1-lacZ bajo control de un promotor activado con GAL-4 depende de la reconstitución de la actividad de GAL4 a través de una interacción proteína-proteína. Las colonias que contienen polipéptidos interactivos se detectan con un sustrato cromogénico de \beta-galactosidasa. Un equipo completo (MATCHMAKER^{TM}) para identificar interacciones proteína-proteína entre dos proteínas específicas usando la técnica de dos híbridos está comercialmente disponible en Clontech. Este sistema también puede extenderse para mapear dominios de proteínas en interacciones específicas de proteínas así como para observar residuos de amino ácido que son cruciales para estas interacciones.

Los compuestos que interfieren con la interacción de un gen que codifica un polipéptido PRO21074 aquí identificado y otros componentes intra- o extracelulares pueden examinarse como sigue: usualmente se prepara una mezcla de reacción conteniendo el producto del gen y el componente intra- o extracelular bajo condiciones y durante un tiempo que permite la interacción y la unión de los dos productos. Para examinar la habilidad de un compuesto candidato para inhibir la unión, la reacción se ejecuta en ausencia y en presencia del compuesto de prueba. Además, puede añadirse un placebo a una tercera mezcla de reacción, para servir como control positivo. La unión (formación de complejo) entre el compuesto de prueba y el componente intra- o extracelular presente en la mezcla se monitoriza como se ha descrito con anterioridad. La formación de un complejo en la reacción(es) de control pero no en la mezcla de reacción que contiene el complejo de prueba indica que el compuesto de prueba interfiere en la interacción del compuesto de prueba y en su socio de reacción.

Para ensayar los antagonistas, el polipéptido PRO21074 puede añadirse a una célula junto con el compuesto a barrer para una actividad particular y la habilidad del compuesto para inhibir la actividad de interés en presencia de polipéptido PRO21074 indica que el compuesto es un antagonista del polipéptido PRO21074. Alternativamente, los antagonistas pueden detectarse mediante la combinación del polipéptido PRO21074 y un antagonista potencial con receptores unidos a la membrana de polipéptido PRO21074 o receptores recombinantes bajo condiciones apropiadas para el ensayo de inhibición competitiva. El polipéptido PRO21074 pueden marcarse, como mediante radioactividad, de forma tal que el número de moléculas polipéptido PRO21074 unidas al receptor pueden usarse para determinar la efectividad del antagonista potencial. El gen que codifica el receptor puede identificarse mediante numerosos procedimientos conocidos para aquellos entendidos en la técnica, por ejemplo, cribado de ligandos y clasificación de FACS. Coligan et al., Current Protocols in Immun., 1(2): Chapter 5 (1991). Preferentemente, la expresión del clonado se emplea donde el ARN poliadenilatado se prepara a partir de una célula que responde al polipéptido PRO21074 y un banco de ADNc creado a partir de este ARN se divide en grupos y se usa para la transfección de células COS u otras células que no responden al polipéptido PRO21074. Las células transfectadas que crecen en placas de vidrio se exponen a polipéptido PRO21074 marcado. El polipéptido PRO21074 puede marcarse mediante una variedad de medios que incluyen la yodación o inclusión de un sitio de reconocimiento para una proteína quinasa específica del sitio. A continuación de la fijación e incubación, las placas se someten a análisis autoradiográfico. Los grupos positivos se identifican y se preparan subgrupos y se re-transfectan utilizando un proceso de subagrupamiento y re-barrido, produciendo eventualmente un único clon que codifica al receptor putativo.

Como una aproximación alternativa para la identificación del receptor, el polipéptido PRO21074 marcado puede unirse por fotoactividad con la membrana celular o extraer preparaciones que expresan la molécula del receptor. El material reticulado se resuelve mediante PAGE y se exponen a película de rayos X. El complejo marcado que contiene el receptor puede eliminarse, resolverse en fragmentos de péptido, y someterse a micro secuenciado de proteína. La secuencia de amino ácido obtenida del micro secuenciado se utilizará para designar un juego de sondas degeneradas de oligonucleótidos para barrer un bando de ADNc para identificar el gen que codifica al receptor putativo.

En otro ensayo para antagonistas, las células de mamíferos o una preparación de membrana que exprese el receptor podría incubarse con polipéptido PRO21074 marcado en presencia del compuesto candidato. La habilidad del compuesto para potenciar o bloquear esta interacción puede medirse entonces.

Ejemplos más específicos de antagonistas potenciales incluyen un oligonucleótido que se une a las fusiones de inmunoglobulinas con polipéptido PRO21074, y, en particular, anticuerpos que incluyen, sin limitación, anticuerpos poli- y monoclonales y fragmentos de anticuerpos, anticuerpos de cadena simple, anticuerpos de anti-idiotípicos, y versiones quiméricas o humanizadas de dichos anticuerpos o fragmentos, así como anticuerpos humanos y fragmentos de anticuerpos. Alternativamente, un antagonista potencial puede ser una proteína relacionada próximamente, por ejemplo, una forma mutada del polipéptido PRO21074 que reconoce al receptor pero no imparte efectos, inhibiendo así competitivamente la acción del polipéptido PRO21074.

Otro antagonista potencial del polipéptido PRO21074 es un ARN o ADN antisentido constructivamente preparado usando tecnología antisentido, donde, por ejemplo, una molécula de ARN o ADN antisentido para bloquear directamente la traslación de ARNm mediante la hibridación al ARNm identificado y evitando la traducción de proteína. La tecnología antisentido puede usarse para controlar la expresión del gen a través de la formación de una triple hélice o ADN o ARN antisentido, ambos procedimientos se basan en la unión de un polinucleótido a ADN o ARN. Por ejemplo, la porción 5' que codifica la secuencia de polinucleótido, que aquí codifica los polipéptidos PRO21074 maduros, se usa para diseñar un oligonucleótido ARN antisentido de entre aproximadamente 10 a 40 pares de bases de longitud. Un oligonucleótido ADN se diseña para ser complementario a una región del gen implicada en la transcripción (triple hélice, ver Lee et al., Nucl. Acids Res., 6:3073 (1979); Cooney et al., Science, 241: 456 (1988); Dervan et al., Science, 251:1360 (1991)), evitando así la transcripción y la producción del polipéptido PRO21074. El oligonucleótido ARN antisentido se hibrida con el ARNm in vivo y bloquea la traducción de la molécula de ARNm en el polipéptido PRO21074 (antisentido - Okano, Neurochem., 56:560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression (CRC Press: Boca Raton, FL, 1988). Los oligonucleótidos antes descritos también pueden entregarse a células tales que el ARN o ADN antisentido puede expresarse in vivo para inhibir la producción del polipéptido PRO21074. Cuando se usa ADN antisentido, los oligodeoxiribonucleótidos derivados del sitio de traducción-iniciación, por ejemplo, se prefieren entre aproximadamente -10 y +10 posiciones de la secuencia de nucleótido del gen identificado.

Los antagonistas potenciales incluyen pequeñas moléculas que se unen al sitio activo, el sitio de unión del receptor, o factor de crecimiento u otro sitio relevante de unión del polipéptido PRO21074, bloqueando así la actividad biológica normal del polipéptido PRO21074. Ejemplos de pequeñas moléculas incluyen, pero no están limitados a, pequeñas moléculas de péptidos o a modo de péptidos, péptidos preferentemente solubles, y compuestos sintéticos no peptidil orgánicos o inorgánicos.

Las ribozimas son moléculas enzimáticas de ARN capaces de catalizar la rotura específica de ARN. Las ribozimas actúan mediante hibridación específica de secuencia al ARN complementario identificado, seguido por rotura endonucleótida. Los sitios específicos de rotura de ribozimas dentro de un ARN potencial identificado pueden identificarse mediante técnicas conocidas. Para mayores detalles, ver por ejemplo, Rossi, Current Biology, 4:469-471 (1994), y PCT publicación Nº WO 97/33551 (publicado Setiembre 18, 1997).

Las moléculas de ácido nucleico en formación de triple hélice usadas para inhibir la transcripción deben ser de hebra simple y compuestas de deoxinucleótidos. La composición base de estos oligonucleótidos se diseñan de forma tal que promueve la formación de triple hélice mediante las reglas de emparejado de bases de Hoogsteen, que generalmente requiere considerables tramos de purinas o pirimidinas en una hebra de un dúplex. Para mayores detalles ver, por ejemplo, PCT publicación Nº WO 97/33551, supra.

Estas pequeñas moléculas pueden identificarse mediante cualquiera o más de los ensayos de barridos discutidos con anterioridad y/o mediante cualquier otra técnica de barrido bien conocidas por aquellos entendidos en la técnica. Basado en su identidad de secuencia con otros polipéptidos conocidos, los usos potenciales para el polipéptido PRO21074 incluyen el uso como un agente regulador en la degradación de péptidos, o en la regulación de la unión de matriz proteica.

F. Anticuerpos Anti-PRO21074

La presente invención proporciona además anticuerpos anti-PRO21074. Anticuerpos ejemplares incluyen anticuerpos policlonales, monoclonales, humanizados, biespecífico, y heteroconjugados.

1. Anticuerpos Policlonales

Los anticuerpos anti-PRO21074 pueden comprender anticuerpos policlonales. Los procedimientos para preparar anticuerpos policlonales son conocidos para los entendidos en la técnica. Los anticuerpos policlonales pueden extraerse en un mamífero, por ejemplo, mediante una o más inyecciones de un agente de inmunización y, si se desea, un adyuvante. Típicamente, el agente de inmunización y/o adyuvante se inyectará en el mamífero mediante múltiples inyecciones subcutáneas o intraperitoneales. El agente de inmunización puede incluir el polipéptido PRO21074 o una proteína de fusión del mismo. Puede ser útil conjugar el agente de inmunización a una proteína conocida por ser inmunogénica en el mamífero que se inmuniza. Ejemplos de tales proteínas inmunogénicas incluyen, pero no están limitadas a, keyhole limpet hemocianina, albúmina sérica, tiroglobulina bovina, e inhibidor de tripsina de la soya. Ejemplos de adyuvantes que pueden emplearse incluyen adyuvante completo de Freund y adyuvante MPL-TDM (monofosforil Lípido A, trehalosa dicorinomicolato sintético). El protocolo de inmunización puede seleccionarse por un entendido en la técnica sin excesiva experimentación.

2. Anticuerpos Monoclonales

Los anticuerpos anti-PRO21074 pueden, alternativamente, ser anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse usando procedimientos de hibridoma, tales como aquellos descritos por Kohler y Milstein, Nature, 256:495 (1975). En un procedimiento de hibridoma, un ratón, hámster u otro animal huésped apropiado, se inmuniza típicamente con un agente inmunizante para provocar linfocitos que producen o son capaces de producir anticuerpos que específicamente se unirán al agente inmunizante. Alternativamente, los linfocitos pueden inmunizarse in vitro.

El agente inmunizante típicamente incluirá el polipéptido PRO21074 o una proteína de fusión del mismo. Generalmente, se usan tanto linfocitos periféricos de sangre ("PBLs") si se desean células de origen humano, o se usan células del bazo o células lymph nodE si se desean fuentes mamíferas no humanas. Los linfocitos se fusionan con una línea de células inmortalizadas utilizando un agente de fusión adecuado, tal como polietilen glicol, para formar una célula hibridoma [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103]. Las líneas de células inmortalizadas usualmente son células mamíferas transformadas, particularmente células de mieloma de origen roedor, bovino y humano. Usualmente, se emplean las líneas de células de mieloma de rata o ratón. Las células de hibridoma pueden cultivarse en un medio de cultivo adecuado que preferentemente contiene una o más sustancias que inhiben el crecimiento o supervivencia de las células no fusionadas, inmortalizadas. Por ejemplo, si las células parentales carecen de la enzima hipoxanina guanina fosforibosil transferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas típicamente incluirá hipoxantina, aminopterina, y timidina ("medio HAT"), dichas sustancias evitan el crecimiento de células deficientes en HGPRT.

Las líneas de células inmortalizadas son aquellas que se fusionan eficientemente, soportan un alto nivel de expresión de anticuerpo mediante las células productoras de anticuerpos seleccionadas, y son sensibles a un medio como el medio HAT. Las líneas más preferidas de células inmortalizadas son líneas de mieloma murina, que pueden obtenerse, por ejemplo en el Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California y el American Type Culture Collection, Manassas, Virginia. Las líneas de células de mieloma humano y de heteromieloma ratón-humano también se han descrito para la producción de anticuerpos monoclonales humanos [Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63].

El medio de cultivo en el cual se cultivan las células de hibridoma puede ensayarse entonces para ver la presencia de anticuerpos monoclonales dirigidos contra PRO21074. Preferentemente, la especificidad de unión de anticuerpos monoclonales producidos por las células de hibridoma se determina mediante inmunoprecipitación o mediante un ensayo de unión in vitro, tal como un inmunoensayo (RIA) o ensayo inmunoabsorbente de enzimas unidas (ELISA). Tales técnicas y ensayos son conocidos en la técnica. La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal puede, por ejemplo, determinarse mediante el análisis Scatchard de Munson y Pollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980).

Después de identificar las células de hibridoma deseadas, los clones pueden subclonarse limitando los procedimientos de dilución y cultivados mediante procedimientos estándar [Goding, supra]. Los medios de cultivo adecuados para este propósito incluyen, por ejemplo, Dulbecco's Modified Eagle's Medium y medio RPMI-1640. Alternativamente, las células de hibridoma pueden cultivarse in vivo como ascites en un mamífero.

Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones puede aislarse o purificarse a partir del medio de cultivo o fluido de ascites mediante procedimientos de purificación de inmunoglobulinas convencionales tales como, por ejemplo, proteína A-Sefarosa, cromatografía de hidroxilapatita, electroforesis de gel, diálisis o cromatografía de afinidad.

Los anticuerpos monoclonales puede hacerse también mediante procedimientos de ADN recombinante, tales como aquellos descritos en U.S. Patent Nº 4.816.567. El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales de la invención puede aislarse y secuenciarse fácilmente utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas de oligonucleótidos que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas pesadas y livianas de anticuerpos de murina). Las células de hibridoma de la invención sirven como fuente preferida de dicho ADN. Una vez aislado, el ADN puede colocarse en vectores de expresión, que luego se transfectan en células huésped tales como células COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO), o células de mieloma que de otra forma no producen proteína inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células huésped recombinantes. El ADN también puede modificarse, por ejemplo, mediante la sustitución de la secuencia de codificación de dominios humanos constantes de cadena pesada y liviana en lugar de las secuencias de murina homóloga [U.S. Patent Nº 4.816.567; Morrison et al., supra] o uniendo covalentemente la secuencia de codificación de inmunoglobulina toda o parte de la secuencia de codificación de un polipéptido no inmunoglobulina. Dicho polipéptido no inmunoglobulina puede sustituirse por los dominios constantes de un anticuerpo de la invención, o puede sustituirse para los dominios variables de un sitio de combinación de antígeno de un anticuerpo de la invención para crear un anticuerpo quimérico bivalente.

Los anticuerpos pueden ser anticuerpos monovalentes. Los procedimientos para preparar anticuerpos monovalentes son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, un procedimiento implica la expresión recombinante de inmunoglobulina de cadena liviana y cadena pesada modificada. La cadena pesada se trunca generalmente en cualquier punto de la región Fc para evitar el reticulado de la cadena pesada. Alternativamente, los residuos relevantes de cisteína son sustituidos con otro residuo de amino ácido o se eliminan para evitar el reticulado.

Los procedimientos in vitro también son adecuados para preparar anticuerpos monovalentes. La digestión de anticuerpos para producir fragmentos del mismo, en particular, fragmentos Fab, puede lograrse usando técnicas de rutina conocidas en la técnica.

3. Anticuerpos Humanos y Humanizados

Los anticuerpos anti-PRO21074 de la invención puede comprender además anticuerpos humanizados o anticuerpos humanos. Las formas humanizadas de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murina) son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulinas o fragmentos de la misma (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab')_{2} u otras subsecuencias de unión de antígenos de anticuerpos) que contienen secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. Los anticuerpos humanizados incluyen inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las cuales residuos de una región determinante complementaria (CDR) del receptor se reemplazan con residuos de un CDR de una especie no humana (anticuerpo donante) tal como un ratón, rata o conejo que tenga la especificidad, afinidad y capacidad deseada. En algunos ejemplos, los residuos de elementos estructurales Fv de la inmunoglobulina humana son reemplazados por correspondientes residuos no humanos. Los anticuerpos humanizados también pueden comprender residuos que se encuentran ni en el anticuerpo receptor ni en el CDR importado o en las secuencias de elementos estructurales. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente la totalidad de al menos un, típicamente dos, dominios variables, en el cual todas las regiones CDR corresponden a aquellas de una inmunoglobulina no humana y todas o substancialmente todas las regiones FR son aquellas de una secuencia de consenso de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado óptimamente también comprenderá al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente aquella de una inmunoglobulina humana [Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992)].

Los procedimientos para humanizar anticuerpos no humanos son bien conocidos en la técnica. Generalmente, un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos de amino ácido introducidos a partir de una fuente que no es humana. Estos residuos de amino ácidos no humanos con frecuencia se denominan como residuos "importados", que típicamente se toman de un dominio variable "importado". La humanización puede realizarse esencialmente siguiendo el procedimiento de Winters y coautores [Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)], mediante la sustitución de secuencias CDRs o CDR de roedor para las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. En consecuencia, dichos anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (U.S. Patent Nº 4.816.567), en los que substancialmente menos de un dominio variable humano intacto se ha sustituido por la secuencia correspondiente a partir de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son típicamente anticuerpos humanos en los cuales algunos residuos CDR y posiblemente algunos residuos FR son sustituidos por residuos a partir de sitios análogos en anticuerpos de roedores.

Los anticuerpos humanos también pueden producirse usando varias técnicas conocidas en la técnica, incluyendo biblioteca visual de fagos [Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)]. Las técnicas de Cole et al. y Boerner et al. también están disponibles para la preparación de anticuerpos humanos monoclonales (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985) y Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991)]. Similarmente, los anticuerpos humanos pueden hacerse introduciendo loci de inmunoglobulina humana en animales transgénicos, por ejemplo, ratones en los cuales los genes endógenos de la inmunoglobulina han sido parcial o completamente inactivados. Ante la agresión, se observa producción de anticuerpos humanos, lo que se parece mucho a lo visto en humanos en todos los aspectos, incluyendo reacomodación de genes, ensamblaje, y repertorio de anticuerpos. Esta aproximación se describe, por ejemplo, en U.S. Patent Nº 5.545.807; 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.661.016, y en las siguientes publicaciones científicas: Marks et al., Bio/Technology 10, 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368 856-859 (1994); Morrison, Nature 368, 812-13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996); Lonberg y Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13 65-93 (1995).

4. Anticuerpos Biespecíficos

Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos monoclonales, preferentemente humanos o humanizados, que tienen especificidades de unión para al menos dos antígenos diferentes. En el presente caso, una de las especificidades de unión es para el PRO21074, la otra de para cualquier otro antígeno, y preferentemente para una proteína o receptor o subunidad receptora de la superficie celular.

Los procedimientos para hacer anticuerpos biespecíficos son conocidos en la técnica. Tradicionalmente, la producción recombinante de anticuerpos biespecíficos se basa en la co-expresión de dos pares de cadena pesada/cadena liviana de inmunoglobulina, donde las dos cadenas pesadas tienen diferentes especificidades [Milstein y Cuello, Nature, 305:537-539 (1983)]. Debido al surtido aleatorio de cadenas pesadas y livianas de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadrotas) producen una mezcla potencial de diez moléculas diferentes de anticuerpos, de las cuales sólo una tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta usualmente se logra mediante etapas de cromatografía de afinidad. Procedimientos similares se describen en WO 93/08829, publicada 13 Mayo 1993, y en Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991).

Los dominios variables de anticuerpos con las especificidades de unión deseadas (sitios de combinación anticuerpo-antígeno) pueden fusionarse a secuencias de dominio constante de inmunoglobulina. La fusión preferentemente es con un dominio constante de inmunoglobulina de cadena pesada, comprendiendo al menos parte de las regiones de bisagra, CH2 y CH3. Se prefiere tener la primera región constante de cadena pesada (CH1) conteniendo el sitio para la unión de la cadena liviana presente en la menos una de las fusiones. Los ADNs que codifican las fusiones de inmunoglobulina de cadena pesada y, si se desea, de inmunoglobulina de cadena liviana, se insertan en vectores de expresión separados, y se co-transfectan a un organismo huésped adecuado. Para mayores detalles de la generación de anticuerpos biespecíficos ver, por ejemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986).

Según otra aproximación descrita en WO 96/27011, la interfaz entre un par de moléculas de anticuerpos puede fraguarse para maximizar el porcentaje de heterodímeros que se recuperan del cultivo recombinante de células. La interfaz preferida comprende al menos una parte de la región CH3 de un dominio constante de anticuerpo. En este procedimiento, una o más cadenas pequeñas laterales de amino ácidos de la interfaz de la primera molécula de anticuerpo se reemplaza con cadenas laterales más grandes (por ejemplo, tirosina o triptofano). Se crean las "cavidades" compensatorias de tamaño idéntico o similar a la cadena(s) lateral más grande sobre la interfaz de la segunda molécula de anticuerpo reemplazando las cadenas laterales grandes de amino ácido por unas más pequeñas (por ejemplo, alanina o treonina). Esto proporciona un mecanismo para incrementar el rendimiento del heterodímero sobre otros endoproductos no deseados tales como homodímeros.

Los anticuerpos biespecíficos pueden prepararse como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpo (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos F(ab')_{2}). Las técnicas para generar anticuerpos biespecíficos a partir de fragmentos de anticuerpos se han descrito en la literatura. Por ejemplo, anticuerpos biespecíficos pueden prepararse usando unión química. Brennan et al., Science 229:81 (1985) describe un procedimiento en donde anticuerpos intactos se rompen proteolíticamente para generar fragmentos F(ab')_{2}. Estos fragmentos se reducen en presencia de agente acomplejante ditiol arsenito sódico para estabilizar ditioles vecinales y evitar la formación intermolecular de disulfuro. Los fragmentos Fab' generados se convierten en derivados tionitrobenzoato (TNB). Uno de los derivados Fab'-TNB se reconvierte luego a Fab'-tiol mediante reducción con mecaptoetilamina y se mezcla con una cantidad equimolar de otro derivado Fab'-TNB para formar el anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos biespecíficos producidos pueden usarse como agentes para la inmovilización selectiva de enzimas.

Pueden recuperarse directamente fragmentos Fab' a partir de E. coli y acoplarse químicamente para formar anticuerpos biespecíficos. Shalaby et al., J. Exp. Med. 175:217-225 (1992) describe la producción de una molécula de anticuerpo biespecífico completamente humanizado F(ab')_{2}. Cada fragmento Fab' se secretó separadamente a partir de E. coli y se sometió a acoplamiento químico dirigido in vitro para formar el anticuerpo biespecífico. El anticuerpo biespecífico así formado era capaz de unirse a células que sobreexpresaban el receptor ErbB2 y a células humanas T normales, así como disparar la actividad lítica de linfocitos humanos citotóxicos contra tumores de mama humanos objetivos.

Distintas técnicas para hacer y aislar fragmentos de anticuerpos biespecíficos directamente a partir de cultivo recombinante de células también se han descrito. Por ejemplo, se han producido anticuerpos biespecíficos utilizando cierres de leucina. Kostelny et al., J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992). Los péptidos de cierre de leucina de las proteínas Fos y Jun se unieron a las porciones Fab' de dos anticuerpos diferentes mediante fusión de genes. Los anticuerpos homodímeros se redujeron a la región de bisagra para formar monómeros y luego se ç re-oxidaron para formar los anticuerpos heterodímeros. Este procedimiento también puede usarse para la producción de anticuerpos homodímeros. La tecnología "diacuerpo" descrita por Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993) ha proporcionado un mecanismo alternativo para producir fragmentos de anticuerpos biespecíficos. Los fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (V_{H}) conectado a un dominio variable de cadena ligera (V_{L}) mediante un vínculo que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena. En consecuencia, los dominios V_{H} y V_{L} de un fragmento se fuerzan a emparejarse con los dominios complementarios V_{L} y V_{H} de otro fragmento, formando así dos sitios de unión de antígeno. También se ha reseñado otra estrategia para producir fragmentos de anticuerpos biespecíficos es el uso de dímeros de cadena simple Fv (sFv). Ver Gruber et al., J. Immunol. 152:5368 (1994).

Se contemplan anticuerpos con más de dos valencias. Por ejemplo, pueden prepararse anticuerpos triespecíficos. Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991).

Los anticuerpos biespecíficos ejemplares pueden unirse aquí a dos epitopes diferentes en un polipéptido PRO21074 dado. Alternativamente, un brazo polipéptido anti PRO21074 puede combinarse con un brazo que se une a una molécula que dispare sobre un leucocito tal como una molécula receptora de células T (por ejemplo, CD2, CD3, CD28, o B7) o receptores Fc para IgG (Fc\gammaR), tal como Fc\gammaRI (CD64), Fc\gammaRII (CD32) y Fc\gammaRIII (CD16) para enfocar los mecanismos celulares de defensa a la célula que expresa el polipéptido PRO21074 particular. Los anticuerpos específicos también pueden usarse para localizar los agentes citotóxicos a células que expresan un polipéptido PRO21074 particular. Estos anticuerpos poseen un brazo de unión de PRO21074 y un brazo que une un agente citotóxico o un quelante radionúclido, tal como EOTUBE, DPTA, DOTA o TETA. Otro anticuerpo biespecífico de interés une el polipéptido PRO21074 y une además el factor de tejido (TF).

5. Anticuerpos Heteroconjugados

Los anticuerpos heteroconjugados también están dentro del ámbito de la presente invención. Los anticuerpos heteroconjugados están compuestos de dos anticuerpos unidos en forma covalente. Dichos anticuerpos han, por ejemplo, sido propuestos para marcar sistemas celulares inmunes para células indeseadas [U.S. Patent Nº 4.676.980], y para el tratamiento de infección por HIV [WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089]. Se contempla que los anticuerpos pueden prepararse in vitro utilizando procedimientos conocidos en química de proteína sintética, incluyendo aquellos que implican agentes reticuladores. Por ejemplo, las inmunotoxinas pueden construirse usando una reacción de intercambio de disulfuro o mediante la formación de una unión tioéter. Los ejemplos de reactivos adecuados para este propósito incluyen iminotiolato y metil-4-mercaptobutrimidato y aquellos descritos, por ejemplo, en la U.S. Patent Nº 4.676.980.

6. Preparación de la Función Efector

Puede ser deseable modificar el anticuerpo de la invención respecto a la función efector, para potenciar, por ejemplo, la efectividad del anticuerpo en el tratamiento del cáncer. Por ejemplo, puede introducirse residuo(s) de cisteína en la región Fc, permitiendo así la formación de intercadena de unión disulfuro en esta región. El anticuerpo homodimérico así generado puede tener una capacidad de internalización mejorada y/o incrementar la muerte celular de mediación por el complemento y citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC). Caron et al., J. Exp Med., 176: 1191-1195 (1992) y Shopes, J. Immunol., 148: 2918-2922 (1992). Los anticuerpos homodiméricos con actividad antitumoral potenciada también pueden prepararse usando reticuladores heterobifuncionales como se describen en Wolff et al. Cancer Research, 53: 2560-2565 (1993). Alternativamente, un anticuerpo puede prepararse que tiene regiones Fc duales y puede por lo tanto tener lisis complementaria potenciada y capacidades ADCC. Ver Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design, 3: 219-230 (1989).

7. Inmunoconjugados

La invención también concierne inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo conjugado a un agente citotóxico tal como un agente quimoterapéutico, toxina (por ejemplo, una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o fragmentos de la misma), o un isótopo radioactivo (por ejemplo un radioconjugado).

Los agentes quimioterapéuticos útiles en la generación de tales inmunoconjugados se ha descrito con anterioridad. Las toxinas enzimáticamente activas y fragmentos del mismo que pueden usarse incluyen difteria cadena A, fragmenos activos no vinculantes de toxina de difteria, exotoxina cadena A (de Pseudomonas aeruginosa), ricino cadena A, abrina cadena A, modecina cadena A, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII, y PAP-S), inhibidor momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de Saponaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina, y los tricotecenes. Una variedad de radionúclidos está disponible para la producción de anticuerpos radioconjugados. Los ejemplos incluye ^{212}Bi, ^{131}I, ^{131}In, ^{90}Y, y ^{186}Re.

Los conjugados del anticuerpo y el agente citotóxico se producen usando una variedad de agentes bifuncionales acoplantes de proteína tales como N-succinimidil-3-(2-piridilditiol) propionato (SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como dimetil adipimidato HCL), ésteres activos (tales como disuccinimidil suberato), aldehídos (tales como glutareldehído), compuestos bis-azido (tales como bis (p-azidobenzoil) hexanediamina), derivadoss bis-diazonio (tales como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilenediamina), diisocianatos (tal como tolieno 2,6-diisocianato), y compuestos fluorina bis-activo (tales como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzeno). Por ejemplo, una inmunotoxina de ricino puede prepararse como se describe en Vitetta et al., Science, 238: 1098 (1987). El ácido 1-isotiocianatobenzil-3-metildietilen triamino penta acético marcado con Carbono-14 (MX-DTPA) es un agente quelante ejemplar para la conjugación de radionucleótido al anticuerpo. Ver WO94/11026.

En otra realización, el anticuerpo puede conjugarse a un "receptor" (tal como streptavidin) para su utilización en premarcado de tumores donde el conjugado anticuerpo-receptor se administra al paciente, seguido por la extracción de la circulación del conjugado no unido usando un agente de compensación y luego la administración de un "ligando" (por ejemplo, avidina) que está conjugado con un agente citotóxico (por ejemplo, radionucleótido).

8. Inmunoliposomas

Los anticuerpos aquí descritos también pueden formularse como inmunoliposomas. Las liposomas que contienen el anticuerpo mediante procedimientos conocidos en la técnica, tal como se describe en Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); y U.S. Pat. Nº 4.485.045 y 4.544.545. Los liposomas con tiempo de circulación potenciada se describen en U.S. Patent Nº 5.013.556.

Los liposomas particularmente útiles pueden generarse mediante el procedimiento de evaporación de fase reversa con una composición lipídica que comprende fosfatidilcolina, colesterol, y fosfatidiletanolamina derivada de PEG (PEG-PE). Los liposomas se extruden a través de filtros de tamaño de poro definido para producir liposomas con el diámetro deseado. Los fragmentos Fab' del anticuerpo de la presente invención puede conjugarse a los liposomas descritos por Martin et al., J. Biol. Chem., 257: 286-288 (1982) a través de reacción de intercambio disulfuro. Un agente quimioterapéutico (tal como Doxorubicin) opcionalmente está contenido dentro del liposoma. Ver Gabizon et al., J. National Cancer Inst., 81(19): 1484 (1989).

9. Composiciones Farmacéuticas de Anticuerpos

Los anticuerpos que se unen específicamente al polipéptido PRO21074 aquí identificado, así como otras moléculas identificadas mediante los ensayos de barrido aquí descritos con anterioridad, pueden administrarse para el tratamiento de varios desórdenes en forma de composiciones farmacéuticas.

Si el polipéptido PRO21074 es intracelular y se usan anticuerpos completos como inhibidores, se prefieren anticuerpos internalizadores. Sin embargo, pueden también usarse lipecciones o liposomas para entregar el anticuerpo, o un fragmento de anticuerpo, dentro de las células. Donde se emplean fragmentos de anticuerpos, se prefiere el fragmento inhibidor más pequeño que se une específicamente al dominio de unión de la proteína marcada. Por ejemplo, basado en las secuencias de región variables de un anticuerpo, pueden designarse moléculas de péptido que retienen la habilidad de unir la secuencia de proteína marcada. Tales péptidos pueden sintetizarse químicamente y/o producirse mediante tecnología de ADN recombinante. Ver, por ejemplo, Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7889-7893 (1993).

La presente formulación también puede contener más de un compuesto activo según sea necesario para la indicación particular que se trata, preferentemente aquellos con actividades complementarias que no se afectan adversamente entre sí. Alternativamente, o además, la composición puede comprender un agente que potencia su función, tales como, por ejemplo, un agente citotóxico, citoquina, agente quimioterapéutico, o agente inhibidor del crecimiento. Dichas moléculas están adecuadamente presentes en combinación en cantidades que son efectivas para el propósito pretendido.

Los ingredientes activos también pueden encerrarse en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y microcápsulas de poli-(metilmetacilato), respectivamente, en sistemas coloidales de suministro de drogas (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas, y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Tales técnicas se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, supra.

Las formulaciones a utilizar para administración in vivo deben ser estériles. Esto se consigue fácilmente mediante filtración a través de membranas estériles de filtración.

Pueden prepararse preparaciones de liberación sostenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros sólidos hidrofóbicos que contienen el anticuerpo, dichas matrices son en la forma de artículos con forma, por ejemplo, películas o microcápsulas. Los ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo poli(2-hidroxietil-metacrilato), o poli(vinilalcohol)) poliláctidos (U.S. Pat. Nº 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutámico y \gamma etil-L-glutamato, etilen-vinil acetato no degradable, copolímeros degradables de ácido láctico-ácido glicólico tales como el LUPRON DEPOT^{TM} (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y leuprolido acetato) y ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Mientras que los polímeros tales como etilen-vinil acetato y ácido láctico-ácido glicólico permiten la liberación de moléculas durante 100 días, ciertos hidrogeles liberan proteínas durante períodos de tiempo más cortos. Cuando los anticuerpos encapsulados permanecen en el cuerpo por un largo tiempo, pueden desnaturalizarse o agregarse como un resultado de la exposición a humedad a 37ºC, resultando en una pérdida de actividad biológica y posibles cambios en inmunogenicidad. Pueden concebirse estrategias racionales para la estabilización dependiendo del mecanismo implicado. Por ejemplo, si el mecanismo de agregación se descubre que es intermolecular la formación de unión S-S a través de intercambio de tio-disulfuro, la estabilización puede lograrse mediante la modificación de los residuos sulfidril, liofilizando a partir de soluciones ácidas, controlando el contenido de humedad, utilizando los aditivos apropiados, y desarrollando composiciones de matrices de polímero específicas.

G. Usos para Anticuerpos anti-PRO21074

Los anticuerpos anti-PRO21074 de la invención tienen distintas utilidades. Por ejemplo, los anticuerpos anti-PRO21074 pueden usarse en ensayos diagnósticos para PRO21074, por ejemplo, detectando su expresión en células específicas, tejidos, fluido sinovial, plasma/suero, u orina. Por ejemplo, el nivel de expresión de PRO21074 en el cartílago articular mediante un anticuerpo anti-PRO21074 puede usarse como un marcador para la presencia y severidad de un desorden cartilaginoso. Distintas técnicas de ensayos diagnóstico conocidas en la técnica pueden utilizarse, tales como ensayos de unión competitiva, ensayos sandwich directos o indirectos y ensayos de inmunoprecipitación conducidos tanto en fases heterogéneas como homogéneas [Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc. (1987) pp. 147-158]. Los anticuerpos utilizados en los ensayos diagnóstico pueden marcarse con una fracción detectable. La fracción detectable debe ser capaz de producir, ya sea directa o indirectamente, una señal detectable. Por ejemplo, la fracción detectable puede ser un radioisótopo ^{3}H, ^{14}C, ^{32}P, ^{35}S, o ^{125}I, un compuesto fluorescente o quimiluminiscente, tal como fluoresceína isotiocianato, rodamina, o luciferina, o una enzima, tal como fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa o peroxidasa de rábano rusticano. Puede emplearse cualquier procedimiento conocido en la técnica para conjugar el anticuerpo con la fracción detectable, incluyendo aquellos procedimientos descritos en Hunter et al., Nature, 144:945 (1962); David et al., Biochemistry, 13:1014 (1974); Pain et al., J. Immunol. Meth., 40:219 (1981); and Nygren, J. Histochem. and Cytochem., 30:407 (1982).

Los anticuerpos anti-PRO21074 también son útiles para la purificación por afinidad de PRO21074 a partir de cultivos celulares recombinantes o fuentes naturales. En este procedimiento, los anticuerpos contra PRO21074 se inmovilizan sobre un soporte adecuado, tal como resina Sephadex o papel de filtro, utilizando procedimientos bien conocidos en la técnica. El anticuerpo inmovilizado se contacta entonces con una muestra que contiene el PRO21074 a purificar, y a continuación el soporte se lava con un solvente adecuado que extraerá substancialmente todo el material en la muestra excepto el PRO21074, que está unido al anticuerpo inmovilizado. Finalmente, el soporte se lava con otro solvente adecuado que liberará el PRO21074 del anticuerpo.

H. Composiciones Farmacéuticas y Dosis

Los polipéptidos PRO21074 y antagonistas utilizables con el procedimiento de la invención pueden administrarse para el tratamiento de desórdenes cartilaginosos en forma de una composición farmacéutica. Adicionalmente, pueden usarse lipofecciones o liposomas para suministrar el polipéptido PRO21074 o el antagonista.

Donde se utilizan fragmentos de anticuerpos, se prefiere el fragmento inhibitorio más pequeño que se une específicamente al dominio de unión de la proteína marcada. Por ejemplo, basado en las secuencias de región variable de un anticuerpo, pueden diseñarse moléculas de péptido que retienen la habilidad de unir la secuencia de proteína marcada. Dichos péptidos pueden sintetizarse químicamente y/o producirse mediante tecnología de ADN recombinante (ver, por ejemplo, Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 7889-7893 [1993]).

Las formulaciones terapéuticas se preparan para el almacenamiento mediante el mezclado de un ingrediente activo que tiene el grado deseado de pureza con transportadores farmacéuticamente aceptables, excipientes y estabilizadores opcionales (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. [1980]), en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los transportadores, excipientes o estabilizadores aceptables son no tóxicos para los receptores en las dosis y concentraciones empleadas, e incluyen e incluyen tampones tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y metionina; preservativos (tales como cloruro octadecildimetilbenzil amonio; hexametonio cloruro; benzalconio cloruro, benzetonio cloruro, butil o benzil alcohol; alquil parabenos tales como metil o propil parabeno, catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tales como polivinilpirrolidona, amino ácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos que incluyen glucosa, manosa, o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azúcares tales como sucrosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sal, tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos Zn-proteína) y/o surfactantes no iónicos tales como TWEEN^{TM}, PLURONICS^{TM} o polietilen glicol (PEG).

En cuanto a las formulaciones a utilizar para administración in vivo, éstas deben ser estériles. La formulación puede volverse estéril mediante filtración a través de membranas de filtración estériles, antes o a continuación de liofilización y reconstitución. Las presentes composiciones terapéuticas generalmente se colocan en un contenedor que tiene un puerto de acceso estéril, por ejemplo una bolsa de solución intravenosa o vial que tenga un tapón que pueda atravesarse con una aguja de inyección hipodérmica.

La presente formulación puede contener además más de un compuesto activo según se necesite para la indicación particular que se trata, preferentemente aquellas con actividades complementarias que no se afecten adversamente entre sí. Alternativamente, o además, la composición puede comprender un agente citotóxico, citoquina, o agente inhibidor del crecimiento. Dichas moléculas están adecuadamente presentes en combinación en cantidades que son efectivas para el propósito pretendido.

La ruta de administración está de acuerdo con procedimientos conocidos, por ejemplo inyección o infusión mediante rutas intravenosas, intraperitoneales, intramusculares, intraarteriales o intraarticulares, administración tópica, o mediante sistemas de liberación sostenidos o de liberación extendida. Opcionalmente, el compuesto activo de la formulación se inyecta directamente dentro de la región cartilaginosa o junta articular afectada.

Los agentes activos de la presente invención, por ejemplo, anticuerpos, se administran a un mamífero, preferentemente un humano, según los procedimientos conocidos, tales como administración intravenosa como un bolo o mediante infusión continua durante un período de tiempo, de forma intramuscular, intraperitoneal, intracerebral, intracerebroespinal, subcutánea, intraarticular, intrasinovial, intratecal, intraocular, intralesional, oral, tópica, por inhalación o través de sistemas de liberación sostenidos.

Las dosis y concentraciones deseadas de la droga de composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden variar dependiendo del uso particular previsto. La determinación de la dosis o ruta de administración apropiada también está dentro de la habilidad de un médico ordinario. Los experimentos con animales proporcionan una guía confiable para la determinación de dosis efectivas para terapia humana. La escala interespecífica de dosis efectivas puede realizarse siguiendo los principios establecidos por Mordenti, J. y Chappell, W. "The use of interspecies scaling in toxicokinetics" In Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi et al., Eds., Pergamon Press, New York 1989, pp. 42-96.

Los ingredientes activos también pueden encerrase en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcápsulas de poli-(metilmetacilato), respectivamente, en sistemas coloidales de suministro de droga (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Tales técnicas se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980).

Pueden prepararse preparaciones de liberación sostenida. Ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros sólidos hidrofóbicos que contienen el anticuerpo, dichas matrices están en forma de artículos conformados, por ejemplo, películas o microcápsulas. Ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(2-hidroximetil-metacrilato), o poli(vinilalcohol)), poliactidos (U.S. Patent Nº 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutámico y \gamma-etil-L-glutamato, etileno no degradable, etilen-vinil acetato, copolímeros degradables de ácido láctico-ácido glicólico tal como LUPRON DEPOT^{TM} (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolido), y ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. La microencapsulación de proteínas recombinantes para liberación sostenida se ha realizado con éxito con hormona de crecimiento humano (rhGH), interferón-(rhIFN-), interleuquina-2, y MN rpg 120. Johnson et al., Nat. Med. 2: 795-799 (1996); Yasuda et al., Biomed. Ther. 27: 1221-1223 (1993); Hora et al., Bio/Technology 8: 755-758 (1990); Cleland, "Design and Production of Single Immunization Vaccines Using Polylactide Polyglycolide Microsphere Systems", in Vaccine Design: The Subunit und Adjuvant Approach, Powell and Newman, eds., (Penum Press: New York, 1995), pp. 439-462; WO 97/03692; WO 96/40072; WO 96/07399; y U.S. Pat. No.
5.654.010.

Las formulaciones de liberación sostenida de estas proteínas pueden desarrollarse utilizando polímero de poli láctico-ácido coglicólico (PLGA) debido a su biocompatibilidad y amplio rango de propiedades biodegradables. Los productos de degradación del PLGA, ácidos láctico y glicólico, pueden desalojarse rápidamente dentro del cuerpo humano. Por otra parte, la degradabilidad de este polímero puede ajustarse desde meses hasta años dependiendo de su peso molecular y composición. Lewis, "Controlled release of bioactive agents from lactide/glycolide polymer", en: M. Chasin and R. Langer (Eds.), Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems (Marcel Dekker: New York, 1990), pp. 1-41.

Mientras que los polímeros tales como etilen-vinil acetato y ácido láctico-ácido glicólico permiten la liberación de moléculas durante 100 días, ciertos hidrogeles liberan proteínas durante períodos de tiempo más cortos. Cuando los anticuerpos encapsulados permanecen en el cuerpo por un largo tiempo, pueden desnaturalizarse o agregarse como un resultado de la exposición a humedad a 37ºC, resultando en una pérdida de actividad biológica y posibles cambios en inmunogenicidad. Pueden concebirse estrategias racionales para la estabilización dependiendo del mecanismo implicado. Por ejemplo, si el mecanismo de agregación se descubre que es intermolecular la formación de unión S-S a través de intercambio de tio-disulfuro, la estabilización puede lograrse mediante la modificación de los residuos sulfidril, liofilizando a partir de soluciones ácidas, controlando el contenido de humedad, utilizando los aditivos apropiados, y desarrollando composiciones de matrices de polímero específicas.

Cuando se emplea la administración in vivo de PRO21074 o antagonistas de PRO21074, las dosis de cantidades normales pueden variar desde aproximadamente 10 ng/kg hasta más de 100 mg/kg de peso corporal del mamífero o más por día, preferentemente aproximadamente 1 mg/kg/día a 10 mg/kg/día, dependiendo de la ruta de administración. Las guías para dosis particulares y procedimientos de suministro se proporcionan en la literatura, ver por ejemplo, U.S. Pat. Nos. 4.657.760; 5.206.344; o 5.225.212. Se anticipa que diferentes formulaciones serán efectivas para diferentes compuestos de tratamiento y distintos desórdenes, que la administración dirigida a un órgano o tejido, por ejemplo, puede necesitar el suministro en una forma diferente de aquel de otro órgano o tejido. Por otra parte, las dosis pueden administrarse en una o más administraciones separadas, o mediante infusión continua. Para administraciones repetidas durante varios días o más tiempo, dependiendo de la condición, el tratamiento se sostiene hasta que se produce una supresión deseada de los síntomas de la enfermedad. Sin embargo, otros regímenes de dosis pueden ser útiles. El progreso de esta terapia se monitoriza fácilmente mediante técnicas y ensayos convencionales.

I. Procedimientos de Tratamiento

Para la prevención o tratamiento de la enfermedad, la dosis apropiada de un agente activo dependerá del tipo de enfermedad a tratar, como se definió con anterioridad, la severidad y curso de la enfermedad, si el agente se administra con propósitos preventivos o terapéuticos, terapia previa, la historia clínica del paciente y la respuesta al agente, y la discreción del médico a cargo. El agente se administra adecuadamente al paciente una vez o durante una serie de tratamientos.

Se contempla que los polipéptidos, anticuerpos, y otros compuestos activos de la presente invención pueden usarse para tratar distintos desórdenes cartilaginosos. Las condiciones o desórdenes ejemplares a tratar con los polipéptidos de la invención incluyen, pero no están limitados a, lupus sistémico eritematoso, artritis reumatoidea, artritis juvenil crónica, osteoartritis, espondiloartropatías, esclerosis sistémica (escleroderma), miopatías idiopáticas inflamatorias (dermatomiositis, polimiositis), síndrome de Sjörgren, vasculitis sistémica, sarcoidiosis, anemia hemolítica autoinmune (pancitopenia inmune, hemoglobinuria nocturna paroxismal), trombocitopenia autoinmune (púrpura trombocitopénica idiomática, trombocitopenia de mediación inmune), tiroiditis (enfermedad de Grave, tiroiditis de Hashimoto, tiroiditis linfocítica, tiroiditis atrófica), diabetes mellitus, enfermedad renal de mediación inmune (glomerulonefritis, nefritis túbulointersticial), enfermedades desmielinizantes de los sistemas nervioso central y periférico tales como esclerosis múltiple, polineuropatía desmielinizante idiomática o síndrome Guillain-Barré, y polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, enfermedades hepatobiliares tales como hepatitis infecciosa (hepatitis A, B, C, D, E y otros virus no hepatotrópicos), hepatitis crónica activa autoinmune, cirrosis biliar primaria, hepatitis granulomatosa, y colangitis esclerosante, enfermedades inflamatorias intestinales (colitis ulcerosa: enfermedad de Crohn), enteropatía sensible al glúten, y enfermedad de Whipple, enfermedades autoinmunes o de mediación inmune de piel, incluyendo enfermedades de piel bulosa, eritema multiforme y dermatitis de contacto, psoriasis, enfermedades alérgicas tales como asma, rinitis alérgica, dermatitis atópica, hipersensibilidad alimentaria y urticaria, enfermedades inmunológicas del pulmón tales como neumonías eosinofílicas, fibrosis pulmonar idiomática y neumonitis hipersensible, enfermedades asociadas a transplantes incluyendo rechazo del transplante y enfermedad de injerto-versus-huésped.

En el lupus sistémico eritematoso, el mediador central de la enfermedad es la producción de anticuerpos auto-reactivos a auto proteínas/tejidos y la subsiguiente generación de inflamación medidada inmune. Estos anticuerpos ya sea directa o indirectamente median la lesión tisular. A pesar que los linfocitos T no han mostrado estar directamente implicados en el daño tisular, los linfocitos T se requieren para el desarrollo de los anticuerpos auto-reactivos. La génesis de la enfermedad es por lo tanto dependiente de los linfocitos T. Múltiples órganos y sistemas son afectados clínicamente, incluyendo riñón, pulmón, sistema musculoesquelético, mucocutáneo, ojo, sistema nervioso central, sistema cardiovascular, tracto gastrointestinal, médula ósea y sangre.

La artritis reumatoidea (RA) es una enfermedad inflamatoria crónica sistémica autoinmune que afecta la membrana sinovial de múltiples articulaciones y que resultan en daño al cartílago articular. La patogénesis es dependiente de los linfocitos T y se asocia con la producción de factores reumatoideos, auto-anticuerpos dirigidos contra proteínas endógenas, con la formación resultante de complejos inmunes que alcanzan altos niveles en el fluido articular y en sangre. Estos complejos pueden inducir la infiltración por linfocitos, monolitos, y neutrófilos en el compartimiento sinovial. Los tejidos afectados son primariamente las articulaciones, con frecuencia en un patrón simétrico. Sin embargo, la enfermedad fuera de las articulaciones se produce en dos formas principales. En una forma, las lesiones típicas son fibrosis pulmonares, vasculitis, y úlceras cutáneas. La segunda forma es el llamado síndrome de Felty que se produce tarde en el curso de la enfermedad de RA, algunas veces después de que la enfermedad de la articulación se ha vuelto inactiva, e implica la presencia de neutropenia, trombocitopenia y esplenomegalia. Esto puede estar acompañado por vasculitis en órganos múltiples y presencia de infartos, úlceras de piel y gangrena. Los pacientes con frecuencia también desarrollan nódulos reumatoideos en el tejido subcutáneo que recubre las articulaciones afectadas; en estados tardíos, los nódulos tienen centros necróticos rodeados por un infiltrado celular inflamatorio mixto. Otras manifestaciones que pueden producirse en RA incluyen: pericarditis, pleuritis, arteritis coronaria, neumonitis intersticial con fibrosis pulmonar, queratitis seca, y nódulos reumatoides.

La artritis juvenil crónica es una enfermedad inflamatoria crónica idiomática que comienza con frecuencia a edades menores a 16 años y que tiene algunas similitudes con RA. Algunos pacientes que son positivos en factor reumatoide se clasifican con artritis juvenil reumatoide. La enfermedad se subclasifica en tres categorías principales: pauciarticular, poliarticular y sistémica. La artritis puede ser severa y conduce a la anquilosis articular y crecimiento retardado. Otras manifestaciones pueden incluir uveitis crónica anterior y amiloidosis sistémica.

Las espóndiloartropatías son un grupo de desórdenes con algunas características clínicas comunes y la asociación común con la expresión del producto génico HLA-B27. Los desórdenes incluyen: anquilosis esponilitis, síndrome de Reiter (artritis reactiva), artritis asociada con enfermedad inflamatoria intestinal, esponilitis asociada con psoriasis, esponiloartropatía juvenil y espondiloartropatía indiferenciada. Las características distintivas incluyen sacroielitis con o sin spondylitis; artritis inflamatoria asimétrica; asociación con HLA-B27 (un alelo serológicamente definido del locus HLA-B clase I MHC); inflamación ocular, y ausencia de anticuerpos asociados con otra enfermedad reumatoide. La célula más implicada como clave para la inducción de la enfermedad es el linfocito T CD8+, una célula que marca antígeno presentado en las moléculas de clase I MHC. Las células T CD8+ pueden reaccionar contra el alelo MHC de clase I HLA-B27 como si el mismo fuera un péptido foráneo expresado por moléculas MHC clase I. Se han hecho hipótesis de que un epitope de HLA-B27 puede imitar un epitope bacteriano u otro antigénico microbiano y por lo tanto inducir una respuesta de células T CD8+.

La esclerosis sistémica (escleroderma) tiene una etiología desconocida. Un distintivo de la enfermedad es la induración de la piel que se probablemente inducida por un proceso inflamatorio activo. El escleroderma puede ser localizado o sistémico. Las lesiones vasculares son comunes, y la lesión de célula endotelial en la microvasculatura es un suceso temprano e importante en el desarrollo de la esclerosis sistémica. Una base inmunológica está implicada en la presencia de infiltrados celulares en las lesiones cutáneas y la presencia de anticuerpos anti-nucleares en muchos pacientes. El ICAM-1 se sobreregula con frecuencia sobre la superficie celular de los fibroblastos en lesiones de piel sugiriendo que la interacción de las células T con estas células puede tener un papel en la patogénesis de la enfermedad. Otros órganos también pueden estar implicados. En el tracto gastrointestinal, la atrofia y fibrosis del músculo liso puede resultar en peristalisis/motilidad anormal. En el riñón, la proliferación subendotelial intimal concéntrica que afecta arterias de pequeña curvatura e interlobulares puede resultar en un flujo sanguíneo renal reducido y por lo tanto proteinuria, azotemia e hipertensión. En el músculo esquelético y cardíaco puede producirse atrofia, fibrosis/cicatrizado intersticial, y necrosis. Finalmente, el pulmón puede tener neumonitis intersticial y fibrosis intersticial.

Las miopatías idiopáticas inflamatorias incluyendo dermatomiositis, polimiositis y otros que son desórdenes de inflamación muscular crónica de etiología desconocida que resultan en debilidad muscular. La lesión/inflamación muscular con frecuencia es simétrica y progresiva. Los autoanticuerpos están asociados con la mayoría de formas. Estos anticuerpos específicos de miositis se dirigen contra e inhiben la función de componentes implicados en la síntesis de proteínas.

El síndrome de Sjögren es el resultado de una inflamación de mediación inmune y la subsiguiente destrucción funcional de las glándulas lagrimales y las glándulas salivales. Esta enfermedad puede asociarse con o acompañarse de enfermedades inflamatorias del tejido conectivo. La enfermedad se asocia con producción de autoanticuerpos contra los antígenos Ro y La, siendo ambos pequeños complejos de proteína-ARN. Las lesiones resultan en queratitis seca, xerostomía, con otras manifestaciones o asociaciones que incluyen cirrosis biliar, neuropatía periférica o sensorial, y púrpura palpable.

Las vasculitis sistémicas son enfermedades en las cuales la lesión primaria es la inflamación y subsiguiente daño a los vasos sanguíneos que resulta en isquemia/necrosis/degeneración de los tejidos provistos por los vasos afectados y eventual disfunción endorgánica en algunos casos. Las vasculitis también pueden producirse como una lesión secundaria o secuela de otras enfermedades inmunes de mediación por inflamación tales como artritis reumatoide, esclerosis sistémica, etc., en particular en enfermedades también asociadas con la formación de complejos inmunes. Las enfermedades en el grupo primario de vasculitis sistémicas incluyen: vasculitis sistémica necrotizante; poliarteritis nudosa, angeítis alérgica y granulomatosis, poliangeítis; granulomatosis de Wegener, granulomatosis linfomatoidea, y arteritis de células gigantes. Las vasculitis misceláneas incluyen: síndrome de nudo linfático mucocutáneo (MLNS o enfermedad de Kawasaki), vasculitis CNS aislada, enfermedad de Behet, tromboangeítis obliterante (enfermedad de Buerger) y venulitis cutánea necrotizante. El mecanismo patogénico de muchos de los tipos de vasculitis enumeradas se cree que se deben primariamente a la deposición de complejos de inmunoglobulina en la pared del vaso y la subsiguiente inducción a una respuesta inflamatoria ya sea vía ADCC, activación de complemento, o ambos.

La sarcoidosis es una condición de etiología desconocida que está caracterizada por la presencia de granulomas epitelioides en prácticamente cualquier tejido del cuerpo; el más común es que implica al pulmón. La patogénesis implica la persistencia de macrófagos activados y células linfáticas en sitios de la enfermedad con subsiguientes secuelas crónicas resultantes de la liberación de productos local y sistemáticamente activos liberados por estos tipos de células.

La anemia hemolítica autoinmune incluyendo la anemia hemolítica, pancitopenia inmune y hemoglobinuria paroxismal nocturna es un resultado de la producción de anticuerpos que reacciona con antígenos expresados sobre la superficie de las células rojas de la sangre (y en algunos casos, también algunas otras células sanguíneas incluyendo plaquetas) y es un reflejo de la extracción aquellas células recubiertas de anticuerpos a través de lisis de mediación y/o mecanismos ADCC/Fc-mediado por receptor.

En la trombocitopenia autoinmune incluyendo púrpura trombocitopénica, y trombocitopenias de mediación inmune en otros ajustes clínicos, la destrucción/extracción de plaquetas se produce como resultado tanto de un anticuerpo o complemento que se une a las plaquetas y la subsiguiente extracción mediante lisis de complemento, ADCC o mecanismos FC-mediado receptor.

La tiroiditis incluyendo la enfermedad de Grave, tiroiditis de Hashimoto, tiroiditis linfocítica juvenil, y tiroiditis atrópica, son el resultado de una respuesta autoinmune contra antígenos tiroideos con producción de anticuerpos que reaccionan con las proteínas presentes u con frecuencia específicas de la glándula tiroides. Existen modelos experimentales que incluyen modelos espontáneos: ratas (ratas BUF y BB) y pollos (cepa de pollos obesos); modelos inducibles: inmunización de animales ya sea con tiroglobulina o con antígeno tiroideo microsomal (peroxidada tiroidea).

La diabetes mellitus es un desorden genético del metabolismo de los carbohidratos, proteína y grasa asociada con una insuficiencia relativa o absoluta de secreción de insulina y con varios grados de resistencia a la insulina. En su expresión clínica completamente desarrollada, está caracterizada por hiperglicemia en ayunas y en la mayoría de pacientes antiguos mediante enfermedad vascular arteroesclerótica y microangiopática y neuropatía. Las diferencias entre las distintas formas de la enfermedad se expresan en términos de causa y patogénesis, historia natural y respuesta al tratamiento. Por lo tanto, la diabetes no es una enfermedad única sino un síndrome.

La diabetes mellitus tipo I o insulino-dependiente (IDDM) se produce aproximadamente en un 10 por ciento de todos los pacientes diabéticos en el mundo occidental. La diabetes mellitus tipo I o diabetes insulino-dependiente es la destrucción autoinmune de células \beta del islote pancreático; esta destrucción está de mediación por auto-anticuerpos y células T auto-reactivas. Los anticuerpos de la insulina o del receptor de insulina también puede producir el fenotipo de no reactividad a la insulina.

Clásicamente, este tipo de enfermedad se produce con más frecuencia en la infancia y la adolescencia; sin embargo, puede reconocerse y volverse sintomática a cualquier edad. En el tipo más común de IDDM (Tipo IA), se ha postulado que factores ambientales (adquiridos) tales como ciertas infecciones víricas, y posiblemente agentes químicos, superpuestos sobre factores genéticos, pueden conducir a la destrucción autoinmune de mediación por células de las células \beta. Por lo tanto, respuestas genéticamente determinadas inmunes anormales (unidas a asociaciones HLA) caracterizadas por autoinmunidad de mediación por células y humoral se cree que juegan un papel patogenético después de la evocación por un factor ambiental. Un segundo tipo de IDDM (Tipo IB) se cree que se debe a autoinmunidad primaria. Estos pacientes han asociado enfermedades endocrinas autoinmunes tales como tiroiditis de Hashimoto, enfermedad de Grave, enfermedad de Addison, fallo gonadal primario, y enfermedades autoinmunes no endocrinas asociadas tales como anemia perniciosa, enfermedades del tejido conectivo, enfermedad celíaca y miastenia grave. La dependencia de la insulina implica que la administración de insulina es esencial para evitar la cetosis espontánea, el coma y la muerte. Sin embargo, aún con tratamiento con insulina, los pacientes diabéticos pueden tener muchos de los problemas adicionales asociados con la diabetes, por ejemplo, desórdenes del tejido conectivo, neuropatía, etc.

El segundo tipo de diabetes, Tipo II o diabetes mellitus no insulino-dependiente (NIDDM), presente en aproximadamente el 90% de todos los diabéticos, también tiene una base genética. Los pacientes con diabetes tipo II pueden tener un peso corporal que oscila de normal a excesivo. La obesidad y la resistencia patológica a la insulina ni mucho menos son esenciales en la evolución de NIDDM. En la mayoría de los pacientes con NIDDM, el diagnóstico se hace a mediana edad. Los pacientes con NIDDM no son insulino-dependientes para evitar la cetosis, pero pueden requerir insulina para la corrección de hiperglicemia de ayuno sintomática o no sintomática si esto no puede lograrse con el uso de la dieta o de agentes orales. Por lo tanto, la administración terapéutica de insulina no distingue entre IDDM y NIDDM. En algunas familias NIDDM, las respuestas secretoras de insulina a la glucosa son tan bajas que pueden parecerse a aquellas de diabetes Tipo I temprana en cualquier momento. Temprano en su historia natural, el defecto secretor de insulina y la resistencia a la insulina puede ser reversible mediante tratamiento (por ejemplo, reducción de peso) con normalización de la tolerancia a la glucosa. Las complicaciones crónicas típicas de la diabetes, en concreto macroangiopatía, microangiopatía, neuropatía, y cataratas vistas en IDDM también se observan en NIDDM.

Otros tipos de diabetes incluyen entidades secundarias o asociadas con ciertas otras condiciones o síndromes. La diabetes puede ser secundaria a la enfermedad pancreática o extracción de tejido pancreático; enfermedades endocrinas tales como acromegalia, síndrome de Cushing, feocromocitoma, glucagonoma, somatostatinoma, o aldoteronism primaria; la administración de hormonas, que causan hiperglicemia; y la administración de ciertas drogas (por ejemplo, drogas antihipertensivas, diuréticos tiazide, preparaciones que contienen estrógeno, drogas psicoactivas, agentes simpatomiméticos). La diabetes puede asociarse con un gran número de síndromes genéticos. Finalmente, la diabetes puede asociarse con defectos genéticos del receptor insulínico o debido a anticuerpos del receptor de insulina con o sin desórdenes inmunes asociados.

Las enfermedades de mediación inmune renales, incluyendo glomerulonefritis y nefritis tubulointersticial, son el resultado lesión de mediación de anticuerpos o linfocitos T del tejido renal ya sea directamente como resultado de la producción de anticuerpos autoreactivos o células T contra antígenos renales o indirectamente como un resultado de la deposición de anticuerpos y/o complejos inmunes en el riñón y que son reactivos contra otros antígenos no renales. Por lo tanto, otras enfermedades de mediación inmune que resultan en la formación de complejos inmune también pueden inducir enfermedad renal de mediación inmune como una secuela indirecta. Tanto los mecanismos inmunes directos e indirectos resultan en una respuesta inflamatoria que produce/induce el desarrollo de la lesión en tejidos renales con la resultante discapacidad de la función del órgano y en algunos casos, progresión al fallo renal. Pueden implicarse tanto mecanismos humorales como celulares inmunes en la patogénesis de la lesión.

Las enfermedades desmielinizantes de los sistemas nerviosos central y periférico, incluyendo esclerosis múltiple; polineuropatía idiomática desmielinizante o síndrome Guillain-Barré; y Polineuropatía Crónica Inflamatoria Desmielinizante, se cree que tienen una base autoinmune y resultan en la desmielinización del nervio como resultado de daño causado a los oligodendrocitos o directamente a la mielina. En MS hay evidencia que sugiere que la inducción y progresión de la enfermedad depende de los linfocitos T. La esclerosis múltiple es una enfermedad desmielinizante que es linfocitos T-dependiente y tiene tanto un curso recurrente-remitente o un curso progresivo crónico. La etiología es desconocida; sin embargo, infecciones víricas, predisposición genética, ambiente, y autoinmunidad contribuyen. Las lesiones contienen infiltrados de células microgliales predominantemente de mediación linfocitos T e infiltrando macrófagos; CD4+ linfocitos T son el tipo celular predominante en las lesiones. El mecanismo de muerte celular oligodendrocitos y la subsiguiente desmielinización no es conocida pero es probable que sea conducida por linfocitos T.

La enfermedad pulmonar inflamatoria y fibrótica, incluyendo neumonías eosinofílicas, fibrosis pulmonares idiopáticas, y neumonitis hipersensitivas pueden implicar una respuesta inflamatoria inmune desregulada. La inhibición de esta respuesta puede ser de beneficio terapéutico y está dentro del ámbito de la invención.

La enfermedad autoinmune o de mediación inmune de piel, incluyendo enfermedades bulosas de piel, eritema multiforme y dermatitis de contacto están de mediación por auto-anticuerpos, la génesis de las cuales es linfocito T-dependiente.

La psoriasis es una enfermedad inflamatoria de mediación linfocito T. Las lesiones contienen infiltrados de linfocitos T, macrófagos y células procesadoras de antígeno, y algunos neutrófilos.

Enfermedades asociadas a los transplantes, incluyendo rechazo de Grafo y enfermedad injerto-versus-huépsed (GVHD) son dependientes de linfocito T; la inhibición de la función del linfocito T es paliativa.

Otras enfermedades en las cuales la intervención de la respuesta inmune y/o inflamatoria tiene beneficio son enfermedades infecciosas que incluyen pero no se limitan a infección vírica (incluyendo, pero no limitándose a, AIDS, hepatitis A, B, C, D, E y herpes), infección bacteriana, infecciones fúngicas, e infecciones protozoarias y parasíticas (moléculas (o derivados/agonistas) que estimulan la MLR pueden utilizarse terapéuticamente para potenciar la respuesta inmune a agentes infecciosos), enfermedades de inmunodeficiencia (moléculas/derivados/agonistas) que estimula la MLR puede utilizarse terapéuticamente para potenciar la respuesta inmune para condiciones de inmunodeficiencia por infecciones hereditarias, adquiridas, inducidas (como la infección HIV), o iatrogénicas (por ejemplo, a partir de quimioterapia) y neoplasia.

Adicionalmente, la inhibición de moléculas con propiedades proinflamatorias puede tener beneficio terapéutico en lesiones de reperfusión; apoplejía; infarto de miocardo; aterosclerosis; lesión aguda del pulmón, choque hemorrágico; quemaduras; sepsis/choque séptico; necrosis tubular aguda; endometriosis; enfermedad degenerativa articular y pancreatitis.

Los compuestos de la presente invención, por ejemplo polipéptidos o anticuerpos, se administran a un mamífero, preferentemente humano, según procedimientos conocidos, tales como administración intravenosa como un bolo o mediante infusión continua durante un período de tiempo, a través de rutas intramusculares, intraperitoneales, intracerebroespinales, subcutáneas, intraarticulares, intrasinoviales, intratecales, orales, tópicas o por inhalación (intranasal, intrapulmonar).

Puede ser deseable administrar también anticuerpos contra otras enfermedades inmunes asociadas o antígenos asociados a tumores, tales como anticuerpos que se unen a CD20, CD11a, CD 40, CD18, ErbB2, EGFR, ErbB3, ErbB4, o factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF). Alternativamente, o además, pueden coadministrarse al paciente dos o más anticuerpos que unen dos o más antígenos diferentes aquí descritos. Algunas veces, puede ser beneficioso administrar también una o más citoquinas al paciente. En una realización, los polipéptidos de la invención se coadministran con un agente inhibidor del crecimiento. Por ejemplo, el agente inhibidor del crecimiento puede administrarse primero, seguido por un polipéptido de la invención. Sin embargo, también se contempla la administración simultánea o primera administración. Las dosis adecuadas para el agente inhibidor del crecimiento son aquellas utilizadas actualmente y pueden disminuirse debido a la acción combinada (sinergia) del agente inhibidor del crecimiento y el polipéptido de la invención.

Para el tratamiento o la reducción en la severidad de la enfermedad relacionada con la inmunidad, la dosis apropiada de un compuesto de la invención dependerá del tipo de enfermedad a tratar, como se define con anterioridad, la severidad y el curso de la enfermedad, si el agente se administra con propósitos preventivos o terapéuticos, terapia previa, la historia clínica del paciente y la respuesta al compuesto, y la discreción del médico asistente. El compuesto se administra adecuadamente al paciente en una vez o durante una serie de tratamientos.

J. Artículos de Fabricación

En otra realización de la invención, se proporciona un artículo de fabricación que contenga materiales útiles para el diagnóstico o tratamiento de los desórdenes descritos con anterioridad. El artículo de fabricación comprende un contenedor y una instrucción. Los contenedores adecuados incluyen, por ejemplo, botella, viales, jeringas y tubos de ensayo. Los contenedores pueden estar formados a partir de una variedad de materiales tales como cristal o plástico. El contenedor soporta una composición que es efectiva para diagnosticar o tratar la condición y puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo el contenedor puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que tenga un tapón que pueda atravesarse con una aguja de inyección hipodérmica). El agente activo en la composición típicamente es un polipéptido PRO21074 o antagonista del mismo. La composición puede comprender además cualquier o múltiples ingredientes aquí descritos. La instrucción sobre, o asociada con, el contenedor indica que la composición se utiliza para diagnosticar o tratar la condición de elección. Por ejemplo, la instrucción puede indicar que la composición es efectiva para el tratamiento de osteoartritis, artritis reumatoide o cualquier otro desorden cartilaginoso. El artículo de fabricación puede comprender además un segundo contenedor que comprende un tampón farmacéuticamente aceptable, tales como salino tamponado con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Puede incluir además otros materiales deseables desde el punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas, jeringas, e inserciones del embalaje con instrucciones para el uso.

Los siguientes ejemplos se ofrecen sólo con propósitos ilustrativos, y no intentan limitar el ámbito de la presente invención de ninguna forma.

Ejemplos

Los reactivos comercialmente disponibles referidos en los ejemplos se utilizaron según las instrucciones del fabricante a menos que se indique otra cosa. La fuente de aquellas células identificadas en los siguientes ejemplos, y a lo largo de la especificación, mediante números de registro ATCC es la American Type Culture Collection, Manassas, VA.

Ejemplo 1 Aislamiento de Clonos ADNc que Codifican un PRO21074 Humano

Las secuencias de dominio extracelular (ECD) (incluyendo la secuencia de señal de secreción, si hay alguna) de aproximadamente 950 proteínas secretadas conocidas de la base de datos pública Swiss-Prot se utilizaron para buscar las bases de datos de secuencia. Las bases de datos incluyeron bases de datos públicas (por ejemplo, GenBank). En este ejemplo, la secuencia de ADN genómico de GenBank se analizó utilizando el programa de predicción de genes GENSCAN, autorizado por la Stanford University. El análisis GENSCAN predice las regiones de codificación de genes, creando secuencias que pueden someterse a la búsqueda ECD. La búsqueda se realizó utilizando el programa de ordenador BLAST o BLAST2 [Altschul et al., Methods in Enzymology, 266:460-480 (1996)] como una comparación de las secuencias de proteína s de ECD con una traducción de 6 marcos de las secuencias. Esas comparaciones resultaron en un marcador BLAST de 70 (o en algunos casos, 90) o mayor que no codifique proteínas conocidas se agruparon y montaron en secuencias de consenso de ADN con el programa "phrap" (Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington) si fuera necesario.

Se ensambló una secuencia de consenso de ADN. Esta secuencia de consenso se designa aquí como DNA144306. Basado en la secuencia de consenso DNA144306, se sintetizaron oligonucleótidos: 1) para identificar mediante PCR un banco de ADNc que contenga la secuencia de interés, y 2) para usar como sondas para aislar un clon de la secuencia de codificación de longitud completa para el PRO21074. Los iniciadores PCR hacia delante y hacia atrás generalmente oscilaron desde 20 a 30 nucleótidos y con frecuencia se diseñan para dar un producto PCR de aproximadamente 100-1000 bp de longitud. Las secuencias de sonda típicamente tienen 40-55 bp de longitud. En algunos casos, los oligonucleótidos adicionales se sintetizan cuando la secuencia de consenso es mayor de aproximadamente 1-1,5kbp. Para barrer varios bancos para un clon de longitud completa, el ADN de los bancos se barrió mediante amplificación PCR, como por Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, supra, con el par iniciador PCR. Un banco positivo se utilizó entonces para aislar clones que codifican el gen de interés utilizando el oligonucleótido sonda y uno de los pares iniciadores.

Se sintetizaron los iniciadores PCR (hacia delante y hacia detrás):

Iniciador PCR hacia delante

5'-AGAGGCCTTCCACCTATGGAGAAGAATGT-3'

(SEQ ID NO: 4)

Iniciador PCR hacia atrás

5'-GGGGGCAAAGTAGTGAATGAAATAGTC-3'

(SEQ ID NO: 5)

Adicionalmente, se construyó una sonda de hibridación de oligonucleótido sintético a partir de la secuencia de consenso DNA144306 que tiene la siguiente secuencia de nucleótidos:

Sonda de hibridación

5'-GTTATTGACATAAGTGGCTTCATGTTTGGTACCAAGATGAAACAGGA-3'

(SEQ ID NO: 6).

Un grupo de 50 bancos de ADNc humano diferentes de distintos tejidos se utilizo en el clonado. Los bancos de ADNc utilizado para aislar los clones de ADNc se construyó mediante procedimientos estándar utilizando reactivos comercialmente disponibles tales como aquellos de Invitrogen, San Diego, CA. El ADNc se inició con oligo dT conteniendo un sitio NotI, unido cerrado a adaptadores SalI de hemiquinasa, partido con NotI, apropiadamente dimensionado con electroforesis de gel, y clonado en una orientación adecuada en un vector de clonado adecuado (tal como pRKB o pRKD; pRK5B es un precursor de pRK5D que no contiene el sitio Sfil; ver Holmes et al., Science, 253:1278-1280 (1991)) en los sitios únicos XhoI y NotI.

El secuenciado de ADN de los clones aislados como se ha descrito con anterioridad dieron la secuencia de ADN de longitud completa para un polipéptido PRO21074 de longitud completa (designado aquí como ADN153576-2925 [figura 1, SEQ ID NO: 1]) y la secuencia de proteína derivada para aquel polipéptido PRO21074.

El clon de longitud completa identificado con anterioridad contenía un único marco abierto de lectura con un sitio de iniciación translacional aparente en las posiciones de nucleótido 31-33 y una señal de terminación en las posiciones de nucleótido 3970-3972 (figura 1, SEQ ID NO: 1). EL precursor de polipéptido predicho es de 1313 amino ácidos de longitud, tiene un peso molecular calculado de aproximadamente 143187 daltons y un pl estipulado de aproximadamente 9,27. El análisis de la secuencia de longitud completa PRO21074 mostrada en la figura 2 (SEQ ID NO: 2) evidencia la presencia de una variedad de importantes dominios de polipéptidos como se muestra en la figura 2, donde las locaciones dadas por aquellos importantes dominios de polipéptidos son aproximados a los descritos con anterioridad. El ADN153576-2526 se ha depositado con ATCC de Mayo 23, 2000 y se le asignó el Nº de Depósito ATCC 1907-PTA.

Un análisis de la base de datos Dayhoff (versión 35.45 SwissProt 35), utilizando el análisis de alineación de secuencia ALIGN-2 de la secuencia de longitud completa mostrada en la figura 2 (SEQ ID NO: 2), evidenció identidad de secuencia entre la secuencia de amino ácido PRO21074 y las siguientes secuencias Dayhoff: HS1409_1; P_Y17829; P_Y32169; ITH3_HUMAN; ITH4_HUMAN; ITH2_HUMAN; ITH1_HUMAN; AF119856_1; P_Y48475;
HSU70136_1.

Ejemplo 2 Uso de PRO21074 como sonda de hibridación

El siguiente procedimiento describe el uso de una secuencia de nucleótido que codifica PRO21074 como una sonda de hibridación.

Se emplea el ADN que comprende todo o parte del gen que codifica PRO21074 como una sonda para barrer ADNs homólogos (tales como aquellos que codifican variantes de PRO21074 producidas naturalmente) en bancos de ADNc de tejido humano o bancos de tejido genómico humano.

La hibridación y lavado de los filtros que contienen alguno de los bancos de ADNs se realiza bajo las siguientes condiciones estrictas. La hibridación de la sonda radiomarcada derivada de PRO21074 a los filtros se realiza en una solución de 50% formamida, 5x SSC, 0,1% SDS, 0,1% pirofosfato de sodio, 50 mM fosfato de sodio, pH 6,8, 2x solución sw Denhardt, y 10% sulfato dextrano a 42ºC durante 20 horas. El lavado de los filtros se realiza en una solución acuosa de 0,1x SSC y 0,1% SDS a 42ºC.

Los ADNs que tienen una identidad de secuencia deseada con el ADN que codifica la secuencia nativa PRO21074 de longitud completa pueden identificarse entonces utilizando técnicas estándar conocidas en la técnica.

El ADN que comprende cualquier parte del gen que codifica PRO21074 puede también usarse como una sonda para detectar sitos de expresión en secciones de tejido.

Ejemplo 3 Expresión de PRO21074 en E. Coli

Este ejemplo ilustra la preparación de una forma unglicosilada de PRO21074 mediante expresión recombinante en E. coli.

La secuencia de ADN que codifica el PRO21074 es inicialmente amplificada utilizando iniciadores PCR seleccionados. Los iniciadores deben contener sitios de restricción de enzimas que corresponden a los sitios de restricción de enzimas del vector de expresión seleccionado. Puede emplearse una variedad de vectores de expresión. Un ejemplo de un vector adecuado es pBR322 (derivado de E. coli; ver Bolivar et al., Gene, 2:95 (1977)) que contiene genes para resistencia a la ampicilina y a la tetraciclina. El vector es digerido con la enzima de restricción y desfosforilado. Las secuencias amplificadas de PCR se ligan entonces en el vector. El vector preferentemente incluirá secuencias que codifiquen un gen de resistencia a los antibióticos, un promotor trp, un conductor polihis (incluyendo los primeros seis codones STII, secuencia polihis, y sitio de rotura de enteroquinasa), la región de codificación de PRO21074, terminación transcripcional lambda, y un gen argU. Además, el vector puede incluir al menos porciones no significativas de las secciones 5' y 3' no traducidas del ácido nucleico que codifica la secuencia nativa de PRO21074.

La mezcla de ligamiento se usa entonces para transformar una cepa seleccionada de E. coli utilizando los procedimientos descritos en Sambrook et al., supra. Los transformantes se identifican por su habilidad para crecer sobre placas LB y se seleccionan entonces colonias resistentes a los antibióticos. El ADN plásmido puede aislarse y confirmarse mediante análisis de restricción y secuenciado de ADN.

Clones seleccionados pueden cultivarse durante una noche en medio de cultivo líquido tal como caldo LB suplementado con antibióticos. El cultivo durante una noche puede usarse a continuación para inocular un cultivo a mayor escala. Las células se cultivan hasta una densidad óptica deseada, durante la cual el promotor de expresión se enciende.

Después de cultivar las células durante unas horas más, las células pueden cosecharse mediante centrifugación. El gránulo de células obtenido por la centrifugación puede solubilizarse utilizando varios agentes conocidos en la técnica, y la proteína PRO21074 solubilizada puede purificarse entonces usando una columna quelante de metal bajo condiciones que permitan una unión fuerte de la proteína.

El PRO21074 puede expresarse en E. coli en una forma marcada poli-His, utilizando el siguiente procedimiento. El ADN que codifica al PRO21074 se amplia inicialmente utilizando iniciadores PCR seleccionados. Los iniciadores contendrán sitios de restricción de enzimas que corresponden a los sitios de restricción de enzimas del vector de expresión seleccionado, y otras secuencias útiles provistas para una iniciación de la traducción eficiente y confiable, la purificación rápida sobre una columna quelante de metal, y la extracción proteolítica con enteroquinasa. Las secuencias PCR ampliadas, marcadas poli-His se ligan entonces en un vector de expresión, que se usa para transformar una E. coli huésped basada en la cepa 52 (W3110 fuhA(tonA) lon galE rpoHts(htpRts) clpP(lacIq). La células transformables se cultivan primero en LB que contiene 50 mg/ml carbenicillin a 30ºC con agitado hasta que se alcanza una O.D.600 de 3-5. Los cultivos se diluyen luego 50-100 veces en medio CRAP (preparado mezclando 3,57 g (NH_{4})_{2}SO_{4}, 0,71 g citrato de sodio\cdot2H_{2}O, 1,07 g KCl, 5,36 g extracto de levadura Difco, 5,36 g Sheffield hycase SF en 500 mL de agua, así como 110 mM MPOS, pH 7,3, 0,55% (peso/volumen) glucosa y 7 mM MgSO_{4}) y se cultivan durante aproximadamente 20-30 horas a 30ºC con agitado. Se extraen muestras para verificar la expresión mediante análisis SDS-PAGE, y la mayor parte del cultivo se centrifuga para granular las células. Los gránulos de células se congelan hasta la purificación y reincorporación.

Fermentaciones de la pasta de E. coli desde 0,5 a 1 L (6-10 g gránulos) se vuelve a suspender en 10 volúmenes (peso/volumen) en M guanidina, 20 mM Tris, pH 8 tampón. Se añade sulfito de sodio sólido y tetrationato de sodio para hacer concentraciones finales de 0,1 M y 0,02 M, respectivamente, y la solución se agita toda la novel a 4ºC. Esta etapa resulta en una proteína desnaturalizada con todos los residuos de cisteína bloqueados mediante sulfitolización. La solución se centrifuga a 40.000 rpm en una Beckman Ultracentifuge durante 30 min. El sobrenadante se diluye con 3-5 volúmenes de columna de quelato metálico tampón (6 M guanidina, 20 mM Tris, pH 7,4) y se filtra a través de filtros de 0,22 micron para clarificar. El extracto clarificado se carga en una columna de quelato metálico 5 ml Qiagen Ni-NTA equilibrada en la columna de quelato metálico tampón. La columna se lava con tampón adicional que contiene 50 mM imidazol (Calbiochem, grado Utrol), pH 7,4. La proteína se eluye con tampón conteniendo 250 mM de imidazol. Las fracciones que contienen la proteína deseada se agrupan y se guardan a 4ºC. La concentración de proteína se estima mediante su absorbancia a 280 nm usando el coeficiente de extinción basado en su secuencia de amino ácido.

Las proteínas se reincorporan mediante la dilución de la muestra lentamente en tampón de reincorporación recién preparado consistente en: 20 mM Tris, pH 8,6, 0,3 M NaCl, 2,5 M urea, 5 mM cisteína, 20 mM glicina y 1 mM EDTA. Los volúmenes de reincorporación se eligen de forma tal que la concentración final de proteína está entre 50 a 100 microgramos/ml. La solución de reincorporación se agita suavemente a 4ºC durante 12-36 horas. La reacción de reincorporación se enfría mediante la adición de TFA hasta una concentración final de 0,4% (pH de aproximadamente 3). Antes de una purificación adicional de la proteína, la solución se filtra a través de un filtro de 0,22 micrones y se añade acetonitrilo hasta una concentración final de 2-10%. La proteína reincorporada se cromatografía en una columna de fase reversa Poros R1/H utilizando un tampón móvil de 0,1% TFA con elución con un gradiente de acetonitrilo de 10 al 80%. Las alícuotas o fracciones con absorbancia A280 se analizan sobre geles SDS de poliacrilamida y las fracciones que contienen proteína reincorporada homogénea se agrupan. Generalmente, las especies adecuadamente incorporadas de muchas proteínas se eluyen en las concentraciones más bajas de acetonitrilo dado que aquellas especies son las más compactas con sus interiores hidrofóbicos protegidos de la interacción con la fase reversa de resina. Las especies agregadas usualmente se eluyen a concentraciones más altas de acetonitrilo. Además para redisolver formas mal incorporadas de proteínas de la forma deseada, la etapa de fase reversa también extrae endotoxinas de las
muestras.

Las fracciones que contienen el polipéptido PRO21074 incorporado se agrupan y el acetonitrilo se extrae usando una corriente suave de nitrógeno dirigida a la solución. Las proteínas se formulan en 20 mM Hepes, pH 6,8 con cloruro de sodio 0,14 M y 4% manitol mediante diálisis o mediante filtración en gel utilizando resinas G25 Superfine (Pharmacia) equilibradas en el tampón de formulación y filtrada estéril.

Ejemplo 4 Expresión del PRO21074 en células de mamíferos

Este ejemplo ilustra la preparación de una forma potencialmente glicosilada de PRO21074 mediante expresión recombinante en células de mamíferos.

El vector pRK5 (ver EP 307.247, publicado en Marzo 15, 1989), se emplea como el vector de expresión. Opcionalmente el ADN de PRO21074 se liga en pRK5 con enzimas de restricción seleccionadas para permitir la inserción del ADN de PRO21074 utilizando procedimientos de ligazón tales como los descritos en Sambrook et al., supra. El vector resultante se llama pRK5-PRO21074.

En una realización, las células huésped seleccionadas pueden ser células 293. Células humanas 293 (ATCC CCL 1573) se cultivan para confluir en placas de cultivo de tejido en medios tales como DMEM suplementado con suero fetal de ternero y opcionalmente componentes nutrientes y/o antibióticos. Aproximadamente 10 \mug ADN pRK5-PRO21074 se mezcla con aproximadamente 1 \mug ADN que codifica el gen VA ARN Thimmappaya et al., Cell, 31:543 (1982)] y disuelto en 500 \mul de 1 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, 0,227 M CaCl_{2}. A esta mezcla se añade, en forma de gotas, 500 \mul de 50 mM HEPES (pH 7,35), 280 mM NaCl, 1,5 mM NaPO_{4}, y se deja formar un precipitado durante 10 minutos a 25ºC. El precipitado se suspende y se añade a las células 293 y se deja reposar durante aproximadamente cuatro horas a 37ºC. El medio de cultivo se aspira y se añaden 2 ml de glicerol 20% en PBS durante 30 segundos. Las células 293 se lavan entonces con medio libre de suero, se añade medio recién hechos y las células se incuban durante aproximadamente 5 días.

Aproximadamente 24 horas después de las transfecciones, el medio de cultivo se extrae y se reemplaza con medio de cultivo (solo) o medio de cultivo conteniendo 200 \muCi/ml ^{35}S-cisteína y 200 \muCi/ml^{35}S-metionina. Después de 12 horas de incubación, el medio condicionado se recoge, se concentra en un filtro pivotante, y se carga sobre gel SDS 15%. El gel procesado puede secarse y exponerse a una película durante un período seleccionado de tiempo para revelar la presencia del polipéptido PRO21074. Los cultivos que contienen células transfectadas pueden someterse a incubación adicional (en medio libre de suero) y el medio se comprueba en bioensayos seleccionados.

En una técnica alternativa, el PRO21074 puede introducirse en células 293 de forma pasajera utilizando el procedimiento de dextrano sulfato descrito por Somparyrac et al., Proc. Natl. Acad Sci., 12:7575 (1981). Las células 293 se cultivan hasta densidad máxima en un matraz para centrifugar y se añaden 700 \mug ADN pRK5-PRO21074. Las células primero se concentran a partir del matraz para centrifugar mediante centrifugación y se lavan con PBS. El precipitado ADN-dextrano se incuba sobre el gránulo de células durante cuatro horas. Las células se tratan con glicerol 20% durante 90 segundos, se lavan con medio de cultivo de tejido, y se reintroducen en el matraz spinner que contiene medio de cultivo de tejido, 5 \mug/ml insulina bovina y 0,1 trasferrina bovina. Después de aproximadamente cuatro días, el medio condicionado se centrifuga y se filtra para extraer células y residuos. La muestra que contiene PRO21074 expresado pueden concentrarse y purificarse mediante cualquier procedimiento seleccionado, tales como diálisis y/o cromatografía de columna.

En otra realización, el PRO21074 puede expresarse en células CHO. El pRK5-PRO21074 puede transfectarse en células CHO utilizando reactivos conocidos tales como CaPO_{4} o DEAE-dextrano. Como se describe con anterioridad, los cultivos celulares pueden incubarse, y el medio reemplazarse con medio de cultivo (solo) o medio conteniendo un radiomarcador tale como ^{35}S-metionina. Después de determinar la presencia de polipéptido PRO21074, el medio de cultivo puede reemplazarse con medio libre de suero. Preferentemente, los cultivos se incuban durante aproximadamente 6 días, y luego se recoge el medio condicionado. El medio conteniendo el PRO21074 expresado puede concentrarse y purificarse mediante cualquier procedimiento seleccionado.

El PRO21074 marcado epitope también puede expresarse en las células CHO huésped. El PRO21074 puede subclonarse fuera del vector pRK5. La inserción del subclon puede someterse a PCR para fusionarse en marco con un marcador epitope seleccionado tal como un marcador poli-his en un vector de expresión Baculovirus. La inserción de PRO21074 marcado poli-his puede entonces subclonarse en un vector conducido SV40 que contiene un marcador de selección tal como DHFR para la selección de clones estables. Finalmente, las células CHO pueden transfectarse (como se describe con anterioridad) con el vector conducido SV40. El marcado puede realizarse, como se describe con anterioridad, para verificar la expresión. El medio de cultivo que contiene el PRO21074 marcado poli-his expresado puede luego concentrarse y purificarse mediante cualquier procedimiento seleccionado, tal como mediante cromatografía quelante de afinidad Ni^{2+-}.

El PRO21074 también puede expresarse en células CHO y/o COS mediante un procedimiento de expresión pasajera o en células CHO mediante otro procedimiento estable de expresión.

La expresión estable en células CHO se realiza utilizando el siguiente procedimiento. Las proteínas se expresan como una construcción IgG (inmunoadhesina), en la cual las secuencias de codificación para las formas solubles (por ejemplo, dominios extracelulares) de las respectivas proteínas se fusionan en una secuencia de región constante IgG1 que contiene la bisagra, CH2 y dominios CH2 y/o es una forma marcada poli-His.

A continuación de la amplificación PCR, los respectivos ADNs son subclonados en un vector de expresión CHO utilizando técnicas estándar como se describe en Ausubel et al., Current Protocols of Molecular Biology, Unit 3.16, John Wiley and Sons (1997). Los vectores de expresión CHO se construyen para tener sitios de restricción 5' y 3' compatibles del ADN de interés para permitir el conveniente puenteo del ADNc. El vector utilizado en la expresión en células CHO se describe en Lucas et al., Nucl. Acids Res. 24:9 (1774-1779 (1996), y utiliza el promotor temprano/potenciador SV40 para conducir la expresión del ADNc de interés y dihidrofolato reductasa (DHFR). La expresión DHFR permite la selección para un mantenimiento estable del plásmido a continuación de la transfección.

Doce microorganismos del plásmido ADN deseado se introduce en aproximadamente 10 millones de células CHO utilizando reactivos de transfección comercialmente disponibles Superfect® (Quialigen), Dosper® o Fungene®
(Boehringer Mannheim). Las células se cultivan como se describe en Lucas et al., supra. Aproximadamente 3 x 10^{-7} células se congelan en una ampolla para cultivo y producción adicional como se describe a continuación.

Las ampollas que contienen el plásmido ADN se derriten mediante la colocación en baño de agua y se mezclan mediante torbellino. Los contenidos se pipetean en un tubo de centrífuga que contiene 10 mLs de medio y se centrifugan a 1000 rpm durante 5 minutos. El sobrenadante se aspira y las células se resuspenden en 10 mL de medio selectivo (0,2 \mum de PS20 filtrado con 5% suero bovino fetal diafiltrado 0,2 \mum). Las células se ponen en alícuotas en un centrífugador de 100 mL que contiene 90 mL de medio selectivo. Después de 1-2 días, las células se transfieren a un spinner de 250 mL lleno con 150 mL de medio de cultivo selectivo y se incuban a 37ºC. Después de otros 2-3 días, se siembran centrifugadores de 250 mL, 500 mL y 2000 mL con 3 x 10^{5} células/mL. El medio celular se intercambia con medio fresco mediante centrifugación y resuspensión en medio de producción. A pesar que puede emplearse cualquier medio CHO, puede utilizarse un medio de producción descrito en U.S. Patent Nº 5.122.469, publicada en Junio 16, 1992. Un spinner de producción de 3L se siembra con 1,2 x 10^{6} células/mL. En el día 0, se determinan el número de células y el pH. En el día 1, el spinner se muestrea y se inicia la aspersión con aire filtrado. El día 2, el spinner se muestrea, la temperatura se ajusta a 33ºC, y se toman 30 mL de glucosa 500 g/L y 0,6 mL de antiespumante 10% (por ejemplo, emulsión polidimetilsiloxano 35%, Dow Corning 365 Medical Grade Emulsion). A lo largo de la producción, el pH se ajusta según sea necesario para mantenerlo alrededor de 7,2. Después de 10 días, o hasta que la viabilidad caiga por debajo del 70%, el cultivo celular se recoge mediante centrifugación y filtrado a través de un filtro de 0,22 \mum. El filtrado se almacenó a 4ºC o se cargó inmediatamente en columnas de purificación.

Para las construcciones marcadas poli-His, las proteínas se purificaron utilizando columna Ni-NTA (Qiagen). Antes de la purificación, se añade imidazol al medio condicionado hasta una concentración de 5 mM. El medio condicionado se bombea sobre una columna de 6 ml Ni-NTA equilibrada a 4ºC en 20 mM Hepes, pH 7,4, tampón conteniendo NaCl 0,3 M y 5 mM imidazol a una tasa de flujo de 4-5 ml/min. Después de la carga, la columna se lava con tampón de equilibrado adicional y la proteína eluida con tampón de equilibrado que contiene 0,25 M imidazol. La proteína altamente purificada se desaliniza a continuación en un tampón de almacenamiento que contiene 10 mM Hepes, 0,14 NaCl y 4% manitol, pH 6,8, con una columna 25 ml G25 Superfine (Pharmacia) y se almacena a
-80ºC.

Las construcciones de inmunoadhesina (que contiene Fc) se purifican a partir del medio condicionado como sigue. El medio condicionado se bombea sobre una columna de 5 ml de proteína A (Pharmacia) que se ha equilibrado con 20 mM tampón Na fosfato, pH 6,8. Después de la carga, la columna se lava exhaustivamente con tampón de equilibrado antes de la elución con 100 mM ácido cítrico, pH 3,5. La proteína eluida se neutraliza inmediatamente mediante la recogida de fracciones de 1 ml en tubos que contienen 275 \muL de buffer 1M Tris, pH 9. La proteína altamente purificada se desaliniza a continuación en tampón de almacenamiento como se ha descrito con anterioridad para las proteínas marcadas poli-His. La homogeneidad calcula mediante geles de SDS poliacrilamida y secuenciando el amino ácido N-terminal mediante degradación de Edman.

Ejemplo 5 Expresión de PRO21074 en Levadura

El siguiente procedimiento describe la expresión recombinante del PRO21074 en levadura.

Primero, se construyen los vectores de expresión en levadura para la producción o secreción intracelular de PRO21074 a partir del promotor ADH2/GAPDH. El ADN que codifica el PRO21074 y el promotor se insertan en sitios de restricción de enzimas adecuados en el plásmido seleccionado para dirigir la expresión intracelular del PRO21074. Para la secreción, el ADN que codifica PRO21074 puede clonarse en el plásmido seleccionado, junto con el ADN que codifica el promotor ADH2/GAPDH, un péptido señal PRO21074 nativo u otro péptido señal de mamífero, o, por ejemplo, un alfa-factor de levadura o señal secretoria de invertasa/secuencia guía, y secuencias de unión (si es necesario) para la expresión del PRO21074.

Las células de levadura, tales como la levadura cepa AB110, pueden entonces transformarse con los plásmidos de expresión descritos con anterioridad y cultivarse en medios de fermentación seleccionados. Los sobrenadantes de levadura transformada pueden analizarse mediante precipitación con 10% ácido tricloroacético y la separación mediante SDS-PAGE, seguido por teñido de los geles con tinte Coomassie Blue.

El PRO21074 recombinante puede aislarse a continuación y purificarse mediante la extracción de células de levadura a partir del medio de fermentación mediante centrifugación y luego concentrando el medio utilizando filtros de cartucho seleccionados. El concentrado que contiene PRO21074 puede purificarse además utilizando resinas de cromatografía de columna seleccionadas.

Ejemplo 6 Expresión de PRO21074 en Células de Insectos infectadas con Baculovirus

El siguiente procedimiento describe la expresión recombinante de PRO21074 en células de insectos infectadas con Baculovirus.

La secuencia que codifica PRO21074 se fusiona hacia arriba de una marca de epitope contenida en un vector de expresión de baculovirus. Tales marcadores epitopes incluyen marcadores poli-his y marcadores inmunoglobulinas (como regiones Fc de IgG). Pueden emplearse una variedad de plásmidos, incluyendo plásmidos derivados de plásmidos comercialmente disponibles, tales como pVL1393 (Novagen). Brevemente, la secuencia que codifica el PRO21074 o la porción deseada de la secuencia de codificación de PRO21074 tal como la secuencia que codifica el dominio extracelular de una proteína transmembrana o la secuencia que codifica la proteína madura si la proteína es extracelular y se amplifica mediante PCR con iniciadores complementarios a las regiones 5' y 3'. El iniciador 5' puede incorporar sitios flanqueadores (seleccionados) de restricción de enzimas. El producto se digieren con aquellas enzimas de restricción seleccionadas y subclonadas en el vector de expresión.

El baculovirus recombinante se genera mediante cotransfección del plásmido anterior y virus ADN BaculoGold^{TM} (Pharmingen) en células de Spodoptera frugiperda ("Sf9") (ATCC CRL 1711) utilizando lipofectina (comercialmente disponible en GIBCO-BRL). Después de 4-5 días de incubación a 28ºC, los virus liberados se recogen y se utilizan para aplicaciones posteriores. La infección vírica y la expresión de proteína se realizan como se describe en O'Reilley et al., Baculovirus expression vectors: A Laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994).

EL PRO21074 expresado marcado poli-his puede purificarse entonces, por ejemplo, mediante cromatografía de afinidad Ni^{2+}-quelato como sigue. Los extractos se preparan a partir de células Sf9 recombinantes infectadas por virus como se describen Rupert et al., Nature, 362:175-179 (1993). Brevemente, las células Sf9 se lavan, se resus-
penden en tampón de sonicación 25 mL Hepes, pH 7,9; 12,5 mM MgCl_{2}; 0,1 mM EDTA; 10% glicerol; 0,1% NP-40; 0,4 M KCl), y sonicado dos veces durante 20 segundos sobre hielo. Los sonicados se aclaran mediante centrifugación, y el sobrenadante se diluye 50 veces en tampón de carga (50 mM fosfato, 300 mM NaCl, 10% glicerol, pH 7,8) y se filtra a través de un filtro 0,45 \mum. Una columna de agarosa Ni^{2+-}NTA (comercialmente disponible en Qiagen) se prepara con un volumen de cama de 5 mL, se lava con 25 mL de agua y se equilibra con 25 mL de tampón de carga. El extracto celular filtrado se carga en la columna a 0,5 mL por minuto. La columna se lava a línea base A_{280} con tampón de carga, en cuyo punto se comienza la recolección de la fracción. A continuación, la columna se lava con un tampón secundario de lavado 50 mM fosfato; 300 mM NaCl, 10% glicerol, pH 6,0), que eluye la proteína unida no específicamente. Después de alcanzar de nuevo la línea base A280, la columna se desarrolla con 0 a 500 mM de gradiente Imidazol en el tampón de lavado secundario. Se recogen fracciones de un mL y se analizan con SDS-PAGE y cementación con plata o técnica de Western blot con Ni^{2+}-NTA conjugado con fosfatasa alcalina (Qiagen). Las fracciones que contienen el PRO21074 marcado His_{10} eluido se agrupan y se dializan contra el tampón de
carga.

Alternativamente, la purificación del PRO21074 marcado IgG (o marcado Fc) puede realizarse utilizando técnicas de cromatografía conocidas, incluyendo por ejemplo, cromatografía de columna Proteína A o proteína G.

Ejemplo 7 Preparación de Anticuerpos que unen PRO21074

Este ejemplo ilustra la preparación de anticuerpos monoclonales que pueden unirse específicamente a PRO21074.

Las técnicas para producir los anticuerpos monoclonales son conocidas en la técnica y se describen, por ejemplo, en Goding, supra. Los inmunogenes que pueden emplearse incluyen PRO21074 purificado, proteínas de fusión que contienen PRO21074 y células que expresan PRO21074 recombinante sobre la superficie celular. La selección del inmunogen puede hacerse por los entendidos en la técnica sin demasiada experimentación.

Ratones, tales como Balb/c, se inmunizan con el inmunogen PRO21074 emulsionado con adyuvante completo de Freund y se inyecta subcutáneamente o intraperitonealmente en una cantidad de 1-100 microgramos. Alternativamente, el inmunogen se emulsiona con adyuvante MPL-TDM (Ribi Immunochemical Research, Hamilton, MT) y se inyectan en las almohadillas plantales traseras del animal. Los ratones inmunizados se estimulan 10 a 12 días más tarde con inmunogen adicional emulsionado en el adyuvante seleccionado. A continuación, durante varias semanas, los ratones también se estimulan con inyecciones adicionales de inmunización. Pueden obtenerse muestras de suero periódicamente a partir de los ratones mediante sangrado retro-orbital para la comprobación en ensayos ELISA para detectar anticuerpos PRO21074.

Después que se haya detectado un título de anticuerpo adecuado, los animales "positivos" para anticuerpos pueden inyectarse con una inyección intravenosa final de PRO21074. Tres o cuatro días más tarde, los ratones se sacrifican y se recogen las células del bazo. Las células del bazo se fusionan entonces (utilizando 35% polietilen glicol) con una línea célula de mieloma murina tal como P3X63AgU.1, disponible de ATCC, Nº CRL 1597. Las fusiones generan células hibridoma que pueden entonces colocarse en placas de cultivo celular de 96 pocillos que contienen medio HAT (hipoxantina, aminopterina y timidina) para inhibir la proliferación de células no fusionadas, híbridos de mieloma, e híbridos de células del bazo.

Las células hibridoma se barrerán en un ELISA para su reactividad contra PRO21074. La determinación de células de hibridoma "positivas" que secretan los anticuerpos monoclonales deseados contra PRO21074 está dentro de las habilidades de la técnica.

Las células de hibridoma positivas pueden inyectarse intraperitonealmente en ratones Balb/c singénicos para producir ascitos que contienen los anticuerpos monoclonales anti-PRO21074. Alternativamente, las células hibridoma pueden cultivarse en un matraces o botellas rotativas de cultivos de tejidos. La purificación de los anticuerpos monoclonales producidos en los ascites puede lograrse utilizando precipitación con sulfato de amonio, seguida por cromatografía de gel de exclusión. Alternativamente, puede emplearse cromatografía por afinidad basada en la unión del anticuerpo a proteína A o proteína G.

Ejemplo 8 Purificación de Polipéptidos PRO21074 utilizando Anticuerpos Específicos

Polipéptidos PRO21074 nativos o recombinantes pueden purificarse mediante una variedad de técnicas estándar en la técnica de purificación de proteínas. Por ejemplo, el polipéptido pro-PRO21074, polipéptido PRO21074 maduro, o polipéptido pre-PRO21074 se purifica mediante cromatografía utilizando anticuerpos específicos para el polipéptido PRO21074 de interés. En general, se construye una columna de inmunoafinidad mediante el acoplamiento covalente del anticuerpo anti-PRO21074 polipéptido a una resina activada de cromatografía.

Las inmunoglobulinas policlonales se preparan a partir de suero inmune ya sea mediante precipitación mediante sulfato de amonio o mediante purificación sobre Proteína A inmobilizada (Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, N.J.). Asimismo, los anticuerpos monoclonales se preparan a partir de fluido de ascites de ratón mediante precipitación con sulfato de amonio o cromatografía sobre Proteína A. La inmunoglobulina parcialmente purificada se une de forma covalente a una resina cromatográfica tales como SEPHAROSE^{TM} CnBr-activada (Pharmacia LKB Biotechnology). El anticuerpo se acopla a la resina, la resina se bloquea, y la resina derivativa se lava según las instrucciones del fabricante.

Dicha columna de inmunoafinidad se utiliza en la purificación del polipéptido PRO21074 mediante la preparación de una fracción a partir de células que contienen polipéptido PRO21074 en una forma soluble. Esta preparación se deriva mediante solubilización de la totalidad de la célula o de una fracción subcelular obtenida mediante centrifugación diferencial mediante la adición de detergente o mediante otros procedimientos bien conocidos en la técnica. Alternativamente, el polipéptido PRO21074 soluble conteniendo una secuencia de señal puede secretarse en una cantidad útil en el medio en el cual se cultivan las células.

Una preparación que contiene polipéptido PRO21074 soluble se pasa sobre la columna de inmunoafinidad, y la columna se lava bajo condiciones que permiten la absorbancia definitiva del polipéptido PRO21074 (por ejemplo, tampones de alta fuerza iónica en presencia de detergente). Entonces, la columna se eluye bajo condiciones que deterioran la unión anticuerpo/polipéptido PRO21074 (por ejemplo, un tampón de bajo pH tal como aproximadamente pH 2-3, o una alta concentración de un caotropo tales como urea o ion tiocianato), y se recoge el polipéptido PRO21074.

Ejemplo 9 Barrido de Droga

Esta invención es particularmente útil para barrer compuestos mediante el uso del polipéptido PRO21074 o fragmentos unidos del mismo en cualquiera de una variedad de técnicas de barrido de drogas. El polipéptido PRO21074 o fragmento empleado en dicha prueba puede esta tanto libre en solución, fijado a un soporte sólido, soportado sobre una superficie celular, o ubicado intracelularmente. Un procedimiento de barrido de droga utiliza células huésped eucariotas o procariotas que se transforman establemente con ácidos nucleicos recombinantes que expresan el polipéptido PRO21074 o fragmentos. Las drogas se barren contra dichas células transformadas en ensayos de unión competitiva. Dichas células, ya sea en forma viable o fija, pueden usarse para ensayos estándar de unión. Uno puede medir, por ejemplo, la formación de complejos entre polipéptido PRO21074 o un fragmento y el agente que se comprueba. Alternativamente, puede examinarse la disminución en la formación de complejo entre el polipéptido PRO2 y su célula marcada o receptores marcados causada por el agente que se comprueba.

Por lo tanto, la presente invención proporciona procedimientos para barrido para drogas y cualquier otro agente que pueden afectar a una enfermedad o desorden asociado con el polipéptido PRO21074. Estos procedimientos comprenden contactar dicho agente con un polipéptido PRO21074 o un fragmento del mismo y ensayar (i) la presencia de un complejo entre el agente y el polipéptido PRO21074 o fragmento, o (ii) la presencia de un complejo entre el polipéptido PRO21074 o fragmento y la célula, a través de procedimientos conocidos en la técnica. En tales ensayos de unión competitiva, el polipéptido PRO21074 o fragmento está típicamente marcado. Después de una incubación adecuada, el polipéptido PRO21074 o fragmentos libres se separan del presente en la forma unida, y la cantidad de marcador libre o no acomplejada es una medida de la habilidad del agente particular para unirse al polipéptido PRO21074 o para interferir con el complejo polipéptido PRO21074/célula.

Otra técnica para el barrido de drogas proporciona un barrido de alto rendimiento para compuestos que tienen adecuada afinidad de unión a un polipéptido y se describe en detalle en WO 84/03564, publicado en Setiembre 13, 1984. Brevemente expuesto, grandes números de diferentes compuestos de prueba de pequeños péptidos se sintetizan sobre un sustrato sólido, tal como clavijas de plástico o alguna otra superficie. Cuando se aplican a un polipéptido PRO21074, los compuestos de prueba de péptido reaccionan con polipéptido PRO21074 y se lavan. El polipéptido PRO21074 unido se detecta mediante procedimientos conocidos en la técnica. El polipéptido PRO21074 también pueden revestirse directamente sobre placas para su uso en las técnicas de barrido de droga antes mencionadas. Además, pueden utilizarse anticuerpos no neutralizantes para capturar el péptido e inmovilizarlo sobre el soporte
sólido.

Esta invención también contempla el uso de ensayos de barrido de droga competitivos en los cuales anticuerpos neutralizantes capaces de unir polipéptido PRO21074 específicamente compiten con un compuesto de prueba para unir polipéptido PRO21074 o fragmentos del mismo. De esta forma, los anticuerpos pueden usarse para detectar la presencia de cualquier péptido que comparta uno o más determinantes antigénicos con el polipéptido PRO21074.

Ejemplo 10 Diseño Racional de Droga

La meta del diseño racional de droga es producir análogos estructurales de un polipéptido biológicamente activo de interés (por ejemplo, un polipéptido PRO21074) o de pequeñas moléculas con las cuales interactúan, por ejemplo, agonistas, antagonistas o inhibidores. Cualquiera de estos ejemplos pueden usarse para crear drogas que son formas más activas o estables del polipéptido PRO21074 o que potencian o interfieren con la función del polipéptido PRO21074 in vivo (c.f., Hodgson, Bio/Technology, 9: 19-21 (1991)).

En una aproximación, la estructura tridimensional del polipéptido PRO21074, o de un complejo inhibidor del polipéptido PRO21074, se determina mediante cristalografía de rayos X, mediante modelado por ordenador o, más típicamente, mediante una combinación de las dos aproximaciones. Tanto la forma como las cargas del polipéptido PRO21074 deben determinarse para elucidar la estructura y para determinar el sitio(s) activo de la molécula. Menos frecuentemente, la información útil referente a la estructura del polipéptido PRO21074 puede obtenerse mediante modelado basado en la estructura de proteínas homólogas. En ambos casos, la información estructural relevante se utiliza para diseñar moléculas análogas a modo de polipéptido PRO21074 o para identificar inhibidores eficientes. Ejemplos útiles de diseño racional de drogas pueden incluir moléculas que tienen una actividad o estabilidad mejoradas como se muestra en Braxton y Wells, Biochemistry, 31:7796-7801 (1992) o que actúan como inhibidores, agonistas o antagonistas de péptidos nativos como se muestra en Athauda et al., J. Biochem., 113:742-746 (1993).

También es posible aislar un anticuerpo específico del marcador, seleccionado mediante un ensayo funcional, como se describe con anterioridad, y luego resolver su estructura cristalina. Esta aproximación, en principio, produce un fármaco sobre el cual puede basarse el subsiguiente diseño de droga. Es posible evitar totalmente la cristalografía de proteína mediante la generación de anticuerpos anti-idiotípicos (anti-ids) hacia un anticuerpo funcional, farmacológicamente activo. Como una imagen especular de una imagen especular, el sitio de unión del anti-ids se esperará que sea un análogo del receptor original. El anti-id puede utilizarse entonces para identificar y aislar péptidos de grupos de péptidos producidos química o biológicamente. Los péptidos aislados actúan luego como el farmacor.

En virtud de la presente invención, cantidades suficientes de polipéptido PRO21074 pueden hacerse disponibles para realizar dichos estudios analíticos como la cristalografía de rayos X. Además, el conocimiento de la secuencia de amino ácidos del polipéptido PRO21074 aquí proporcionada brindará una guía para aquellos que emplean técnicas de modelado mediante ordenador en lugar de o además de la cristalografía de rayos X.

Ejemplo 11 Distribución de Expresión de Tejido

Se construyeron sondas de oligonucleótidos ADN153576 mostrado en los dibujos adjuntos para utilizar en reacciones cuantitativas de amplificación PCR. Las sondas de oligonucleótidos se eligieron de manera de dar un fragmento amplificado de aproximadamente 50-300 pares de bases a partir del extremo 3' de su plantilla asociada en una reacción PCR estándar. Las sondas de oligonucleótidos se emplearon en reacciones cuantitativas de amplificación PCR con bancos de ADNc aislados de diferentes fuentes de tejidos humanos adultos y/o fetales y analizados mediante electroforesis de gel de agarosa para obtener una determinación cuantitativa del nivel de expresión del ácido nucleico que codifica al polipéptido PRO21074 en los distintos tejidos comprobados. El conocimiento del patrón de expresión o la expresión diferencial del ácido nucleico que codifica al polipéptido PRO21074 en varios tipos distintos de tejidos humanos proporciona un marcador diagnóstico útil para la tipificación de tejido, con o sin otros marcadores específicos de tejido, para determinar la fuente primaria de tejido de un tumor metastático, y similares. Los resultados de estos ensayos demostraron que la molécula de ADN 153576-2925 se expresa altamente en el cartílago y se expresa a niveles muy bajos (100-1000 veces menos que la del cartílago) en médula ósea y próstata. No se expresa en bancos de ADNc preparados a partir de HUVEV, bazo, corazón, útero, tumor de colon, sustancia negra, hipocampo, macrófago, dendrocito o linfoblasto.

Ejemplo 12 Análisis Taqman

El patrón de expresión específico del cartílago del ADN 153576 se analizó utilizando la metodología Taíman PCR en una variedad de ARN preparados a partir de distintos tejidos humanos así como de bancos de ADNc humano. Los iniciadores y la sonda utilizada para el análisis Taíman son los que siguen:

105

Se utilizaron protocolos Taqman estándar para todos los experimentos tal como se indica en PE Applied Biosystems Inc. "User Bulletin #2 ABI Prism 7700 Sequence Detection System, December 11, 1997". Brevemente, en una reacción de 25 \mul se utilizaron 50 ng de banco de ADNc o 6-50 ng de ARN para cada muestra. Todas las muestras se normalizaron para expresión actin beta para permitir la comparación entre muestras. Las condiciones para las reacciones Taqman fueron las siguientes:

106

Los datos Taqman se analizaron mediante el "Comparative CT method" utilizando el programa "Sequence Detection Systems Ver. 1.6", Perkin Elmer Corporation, Foster City, CA como se describe en "User Bulletin #2 ABI Prism 7700 Sequence Detection System, Diciembre 11, 1997, pg. 11-16".

Depósito de material

Los siguientes materiales se han depositado en American Type Culture Collection, 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209, USA (ATCC):

107

Este depósito de realizó bajo las previsiones del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para el Propósito del Procedimiento de Patente y las Regulaciones adjunta (Tratado de Budapest). Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purpose of Patent Procedure and the Regulations thereunder (Budapest Treaty). Esto asegura el mantenimiento de un cultivo viable del depósito durante 30 años desde la fecha de depósito. El depósito estará disponible mediante ATCC bajos los términos del Tratado de Budapest, y sujeto a un acuerdo entre Genentech, Inc. y ATCC, que asegura disponibilidad permanente e irrestricta de la progenie del cultivo del depósito al público bajo seguro de la pertinente patente U.S. o quedando disponible al público de cualquier patente U.S. o solicitud extranjera de patente, la que llegue primero, y asegura disponibilidad de la progenie a uno determinado por Cominisionado de Patentes y Marcas estadounidense capacitado para ello según 35 USC §122 y las reglas del Comisionado consiguiente (incluyebdo 37 CFR §1.14 con particular referencia a 886 OG 638).

El cesionario de la presente solicitud ha acordado que si un cultivo de los materiales en depósito debe morir o perderse o destruirse cuando se cultiva bajo condiciones adecuadas, los materiales se reemplazarán de inmediato bajo notificación con otro del mismo. La disponibilidad del material depositado no debe interpretarse como una licencia para practicar la invención en contravención de los derechos concedidos bajo la autoridad de cualquier gobierno según sus leyes de patentes.

La especificación escrita precedente se considera suficiente para permitir a un entendido en la técnica practicar la invención. La presente invención no está limitada en ámbito mediante la ejecución depositada, debido a que la realización depositada se entiende como una única ilustración de ciertos aspectos de la invención y cualquier ejecución que sea funcionalmente equivalente se hallan dentro del ámbito de esta invención. Aquí el depósito de material no constituye una admisión que la descripción escrita aquí contenida es inadecuada para permitir la práctica de cualquier aspecto de la invención, incluyendo la mejor modalidad de la misma, ni debe ejecutarse limitando el ámbito de las reivindicaciones de las ilustraciones específicas que representa. Es más, distintas modificaciones de las realizaciones aquí descritas además de aquellas aquí mostradas y descritas serán evidentes para aquellos entendidos en la técnica a partir de la descripción anterior y se encuadran dentro del ámbito de las reivindicaciones adjuntas.

<110> Genentech, Inc. et al.

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<120> PROCEDIMIENTO DE DIAGNÓSTICO Y TRATAMIENTO DE DESÓRDENES CARTILAGINOSOS

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<130> P2925-1R1PCT

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<140> PCT/US01/47933

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<141> 2001-12-07

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<150> US 60/254.513

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<151> 2000-12-08

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<160> 6

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<210> 1

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<211> 4684

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<212> ADN

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<213> Homo Sapiens

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<400> 1

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19

20

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22

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<210> 2

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<211> 1313

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<212> PRT

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<213> Homo Sapiens

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<400> 2

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24

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<210> 3

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<211> 565

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Secuencia ADN virtual unida a partir de fragmentos EST

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<400> 3

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29

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<210> 4

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<211> 29

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Prímero PCR directo usado en aislamiento de ADN 153576-2925

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<400> 4

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\hskip-.1em\dddseqskip

agaggccttc cacctatgga gaagaatgt

\hfill

29

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<210> 5

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<211> 27

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Prímero PCR inverso usado en el aislamiento de ADN 153576-2925

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<400> 5

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gggggcaaag tagtgaatga aatagtc

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27

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<210> 6

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<211> 47

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Sonda de hibridización usada en el aislamiento de ADN 153576-2925

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<400> 6

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gttattgaca taagtggctt catgtttggt accaagatga aacagga

\hfill

47

Claims (34)

1. Molécula aislada de ácido nucleico que comprende ADN que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con un (a) una molécula de ADN que codifica al polipéptido PRO21074 que comprende la secuencia de residuos de amino ácido desde 1 o 24 hasta 1313 de la figura 2, o (b) el complemento de la molécula de ADN de (a).

2. Molécula aislada de ácido nucleico según la reivindicación 1, caracterizada por el hecho de que comprende la secuencia de posiciones de nucleótidos de 31 o 100 hasta 3969 de la figura 1.

3. Molécula aislada de ácido nucleico según la reivindicación 1, caracterizada por el hecho de que comprende la secuencia de nucleótidos de la figura 1.

4. Molécula aislada de ácido nucleico según la reivindicación 1, caracterizada por el hecho de que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de residuos de amino ácido de 1 o 24 hasta 1313 de la figura 2.

5. Molécula aislada de ácido nucleico que comprende ADN que comprende al menos 80% de identidad de secuencia con un (a) una molécula de ADN que codifica el mismo polipéptido maduro codificado por la proteína humana ADNc depositada ATCC en Mayo 23, 2000 bajo ATCC Deposit Nº 1907-PTA, o (b) el complemento de la molécula de ADN de (a).

6. Molécula aislada de ácido nucleico de la reivindicación 5 que comprende ADN que codifica el mismo polipéptido maduro codificado por la proteína humana ADNc depositada ATCC en Mayo 23, 2000 bajo ATCC Deposit Nº 1907-PTA.

7. Molécula aislada de ácido nucleico que comprende ADN que comprende al menos 80% de identidad de secuencia con una (a) secuencia de codificación del polipéptido de longitud completa de la proteína humana ADNc depositada en ATCC en Mayo 23, 2000 bajo el ATCC Deposit Nº 1907-PTA, o (b) el complemento de la secuencia de codificación de (a).

8. Molécula aislada de ácido nucleico según la reivindicación 7, caracterizada por el hecho de que comprende la secuencia de codificación del polipéptido de longitud completa de la proteína humana ADNc depositada en ATCC en Mayo 23, 2000 bajo el ATCC Deposit Nº 1907-PTA.

9. Molécula aislada de ácido nucleico que codifica un polipéptido PRO21074 que comprende ADN que comprende al menos 2036 nucleótidos que se hibrida bajo condiciones rigurosas de hibridación y lavado al complemento de la secuencia de ácido nucleico que codifica los amino ácidos 1 o 24 a 1313 de la figura 2.

10. Molécula aislada de ácido nucleico que comprende al menos 2036 nucleótidos y que se produce mediante hibridación de una molécula de ADN de prueba bajo condiciones rigurosas de hibridación con (a) una molécula de ADN que codifica un polipéptido PRO21074 que comprende una secuencia de residuos de ácidos nucleicos de 1 o 24 a 1313 de la figura 2, o (b) el complemento de la molécula de ADN de (a), y aislando la molécula de prueba de ADN.

11. Molécula aislada de ácido nucleico según la reivindicación 10, caracterizada por el hecho de que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con un (a) una molécula de ADN que codifica un polipéptido PRO21074 que comprende una secuencia de residuos de amino ácido de 1 o 24 a 1313 de la figura 2, o (b) el complemento de la molécula de ADN de (a).

12. Vector que comprende la molécula de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 11.

13. Vector según la reivindicación 12, caracterizado por el hecho de que dicha molécula de ácido nucleico está unida operativamente a secuencias de control reconocidas por una célula huésped transformada con el vector.

14. Molécula de ácido nucleico depositada con el ATCC bajo el número de acceso 1907-PTA.

15. Célula huésped aislada que comprende el vector de la reivindicación 12.

16. Célula huésped según la reivindicación 15, caracterizada por el hecho de que dicha célula es una célula CHO.

17. Célula huésped según la reivindicación 15, caracterizada por el hecho de que dicha célula es una E. coli.

18. Célula huésped según la reivindicación 15, caracterizada por el hecho de que dicha célula es una célula de levadura.

19. Procedimiento para producir polipéptido PRO21074 que comprende el cultivo de la célula huésped de la reivindicación 15 bajo condiciones adecuadas para la expresión de dicho polipéptido PRO21074 y recuperar dicho polipéptido PRO21074 del cultivo célular.

20. Polipéptido PRO21074 aislado que comprende una secuencia de amino ácido que comprende al menos un 80% de identidad de secuencia de la secuencia de los residuos de amino ácido desde aproximadamente 1 o 24 a 1313 de la figura 2.

21. Polipéptido PRO21074 aislado según la reivindicación 20, caracterizado por el hecho de que comprende residuos de amino ácido de 1 o 24 a 1313 de la figura 2.

22. Polipéptido PRO21074 aislado que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia del polipéptido codificado por el ADNc insertado en el vector depositado ATCC en Mayo 23, 2000 como ATCC Deposit Nº 1907-PTA.

23. Polipéptido PRO21074 aislado según la reivindicación 22, caracterizado por el hecho de que está codificado por el ADNc insertado del vector depositado ATCC en Mayo 23, 2000 como ATCC Deposit Nº 1907-PTA.

24. Polipéptido PRO21074 aislado que comprende la secuencia de residuos de amino ácido de 1 o 24 a 1313 de la figura 2.

25. Polipéptido PRO21074 aislado producido mediante un cultivo de una célula huésped que comprende la molécula aislada de ácido nucleico de la reivindicación 10 bajo condiciones adecuadas para la expresión de dicho polipéptido, y la recuperación de dicho polipéptido a partir del cultivo celular.

26. Polipéptido PRO21074 aislado según la reivindicación 25, caracterizado por el hecho de que dicha molécula aislada de ácido nucleico tiene al menos un 80% de identidad de secuencia de (a) una molécula de ADN que codifica el polipéptido PRO21074 que comprende una secuencia de residuos de amino ácido de 1 o 24 a 1313 de la figura 2, o (b) el complemento de la molécula de ADN de (a).

27. Molécula quimérica que comprende un polipéptido PRO21074 según cualquiera de las reivindicaciones 20 a 24 fusionada con una secuencia de amino ácido heteróloga.

28. Molécula quimérica según la reivindicación 27, caracterizada por el hecho de que dicha secuencia heteróloga de amino ácido es una secuencia epitope marcadora.

29. Molécula quimérica según la reivindicación 27, caracterizada por el hecho de que dicha secuencia heteróloga de amino ácido es una región Fc de una inmunoglobulina.

30. Anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido PRO21074 según cualquiera de las reivindicaciones 20 a 24.

31. Anticuerpo según la reivindicación 30, caracterizado por el hecho de que dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

32. Anticuerpo según la reivindicación 30, caracterizado por el hecho de que dicho anticuerpo es un anticuerpo humanizado.

33. Anticuerpo según la reivindicación 30, caracterizado por el hecho de que dicho anticuerpo es un fragmento de anticuerpo.

34. Composición de material que comprende (a) un polipéptido PRO21074 según cualquiera de las reivindicaciones 20 a 24, o (b) un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 30 a 33 en adición con un transportador farmacéuticamente aceptable.