ES2269509T3 - Gen expresado altamente en el tejido cartilaginoso. - Google Patents
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Abstract
Molécula aislada de ácido nucleico que comprende ADN que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con un (a) una molécula de ADN que codifica al polipéptido PRO21074 que comprende la secuencia de residuos de amino ácido desde 1 o 24 hasta 1313 de la figura 2, o (b) el complemento de la molécula de ADN de (a).
Description
Gen expresado altamente en el tejido
cartilaginoso.
La presente invención se refiere generalmente a
la identificación y aislamiento de ADN nuevo y a la producción
recombinante de polipéptidos nuevos que tienen similitud en la
secuencia al inhibidor humano de inter alfa tripsina (ITI),
designados aquí como polipéptidos "PRO21074". La presente
invención se refiere generalmente además al diagnóstico y
tratamiento de desórdenes cartilaginosos.
Las proteínas extracelulares cumplen roles
importantes en, entre otras cosas, la formación, diferenciación y
mantenimiento de organismos multicelulares. El hecho de que muchas
células individuales, por ejemplo, proliferen, migren, se
diferencien o interactúen con otras células, está típicamente
gobernado mediante la información recibida de otras células y/o del
medio ambiente inmediato. Esta información con frecuencia es
transmitida mediante polipéptidos secretados (por ejemplo, factores
mitogénicos, factores de supervivencia, factores citotóxicos,
factores de diferenciación, neuropéptidos y hormonas) que son, a su
vez, recibido e interpretados mediante diversos receptores celulares
o proteínas unidas a la membrana celular. Estos polipéptidos
secretados o moléculas señalizadoras normalmente pasan a través del
pasaje secretor celular para alcanzar su lugar de acción en el medio
ambiente extracelular.
Las proteínas secretadas tienen diversas
aplicaciones industriales, incluyendo farmacéuticas, diagnósticas,
biosensores y birreactores. La mayoría de las drogas de proteína
disponibles en el presente, tales como los agentes trombolíticos,
interferones, interleuquinas, eritropoyetinas, factores estimulantes
de la colonia, y otras citoquinas diversas, son proteínas de
secreción. Sus receptores, que son proteínas de la membrana, también
tienen potencial como agentes terapéuticos o de diagnóstico. Se han
hecho esfuerzos tanto por la industria como por la academia para
identificar proteínas secretadas nativas nuevas. Muchos esfuerzos se
han enfocado en la detección de bibliotecas de ADN recombinante de
mamíferos para identificar las secuencias de codificación para
proteínas secretadas nuevas. Ejemplos de procedimientos y técnicas
de detección se describen en la literatura [ver por ejemplo, Klein
et al., Proc. Natl. Acad. Sci.,
93:7108-7113 (1996); Patente U.S. Nº
5.536.637)].
El inhibidor inter alfa tripsina (TIT) es una
glicoproteína del plasma humano comprendida por un complejo de tres
proteínas diferentes: bicunina y cadenas pesadas, H1 y H2. Morelle
et al. demostraron que estas tres cadenas están unidas de
forma covalente mediante una cadena de sulfato de condrotina.
(Eur. J. Biochem.,
221(2):881-8(1994)). Ver también,
Enghild, J.J. et al., J. Biol. Chem.
268(12):8711-8716 (1993). Bost et al.
informaron que ARNm de la cadena pesada de ITI, H1, se encuentra
exclusivamente en tejido hepático. Bost F. et al., Eur. J.
Biochem. 218(2):283-91 (1993).
Se ha encontrado que el ITI humano inactiva la
tripsina, quimotripsina, elastasa neutrófila y catespina humanas G.
Morii, M. and Travis, J., Biol. Chem. Hoppe Seyler
366(1):19-21 (1985). Se ha informado que las
cadenas pesadas contienen sitios potenciales de unión calcio y
regiones homólogas al sitio reactivo propuesto para inhibidores
tiol-proteasa, indicando que el ITI es una proteína
compleja, multifuncional. Salier, J.P. et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. U.S.A. 84(23):8272-6 (1987). Por
otra parte, la interacción del ITI y ácido hialurónico se cree que
juega un rol crítico en la organización y estabilización de la
matriz extracelular. H. Kobayashi et al., Cell Tissue Res.
296:587-597
(1999).
(1999).
También se ha sugerido que el ITI puede actuar
como un portador de hialurona en suero, o como una proteína de unión
entre hialurona y otras proteínas de la matriz, y que puede jugar un
rol en la estimulación de células fagocíticas.
Se ha sugerido además que el ITI, como inhibidor
de las proteasas de serina, puede proteger los condorcitos
articulares y evitar el daño del cartílago en desórdenes
cartilaginosos. D.C. Fischer et al., Artritis Rheum.
42(9):1936-45 (1999).
Describimos aquí la identificación y
caracterización de nuevos polipéptidos que tienen secuencia similar
al inhibidor inter alfa tripsina (ITI), designados como polipéptidos
PRO21074, y su uso potencial en el diagnóstico y tratamiento de
desórdenes cartilaginosos.
La presente solicitud describe procedimientos
para el diagnóstico y tratamiento de desórdenes cartilaginosos. Por
otra parte, la presente invención proporciona un clon ADNc
(designado aquí como ADN 153576-2925) -
identificado por ser homólogo al ácido nucleico que codifica el
inhibidor inter alfa tripsina (ITI) - que codifica un polipéptido
nuevo, designado en la presente solicitud como "PRO21074".
En una realización, la invención proporciona una
molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de
nucleótido que codifica el polipéptido PRO21074.
En un aspecto, la molécula de ácido nucleico
aislada comprende una secuencia de nucleótido que tiene al menos
80% de identidad de secuencia, alternativamente al menos
aproximadamente 81% de identidad de secuencia, alternativamente al
menos aproximadamente 82% de identidad de secuencia,
alternativamente al menos aproximadamente 83% de identidad de
secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 84% de
identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente
85% de identidad de secuencia, alternativamente al menos
aproximadamente 86% de identidad de secuencia, alternativamente al
menos aproximadamente 87% de identidad de secuencia,
alternativamente al menos aproximadamente 88% de identidad de
secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 89% de
identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente
90% de identidad de secuencia, alternativamente al menos
aproximadamente 91% de identidad de secuencia, alternativamente al
menos aproximadamente 92% de identidad de secuencia,
alternativamente al menos aproximadamente 93% de identidad de
secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 94% de
identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente
95% de identidad de secuencia, alternativamente al menos
aproximadamente 96% de identidad de secuencia, alternativamente al
menos aproximadamente 97% de identidad de secuencia,
alternativamente al menos aproximadamente 98% de identidad de
secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 99% de
identidad de secuencia con (a) una molécula de ADN que codifica un
polipéptido PRO21074 que tiene la secuencia de residuos de amino
ácido de 1 o 24 a 1313, inclusive, de la figura 2 (SEQ ID NO:2), o
(b) el complemento de la molécula de ADN de (a).
En otro aspecto, la molécula de ácido nucleico
aislada comprende (a) una secuencia de nucleótido que codifica a un
polipéptido PRO21074 que tiene los residuos de la secuencia de amino
ácido de 1 o 24 a 1313, inclusive, de la figura 2 (SEQ ID No:2), o
(b) el complemento de la secuencia de nucleótido de (a).
La molécula de ácido nucleico aislada puede
comprender una secuencia de nucleótido que tiene al menos 80% de
identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente
81% de identidad de secuencia, alternativamente al menos
aproximadamente 82% de identidad de secuencia, alternativamente al
menos aproximadamente 83% de identidad de secuencia,
alternativamente al menos aproximadamente 84% de identidad de
secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 85% de
identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente
86% de identidad de secuencia, alternativamente al menos
aproximadamente 87% de identidad de secuencia, alternativamente al
menos aproximadamente 88% de identidad de secuencia,
alternativamente al menos aproximadamente 89% de identidad de
secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 90% de
identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente
91% de identidad de secuencia, alternativamente al menos
aproximadamente 92% de identidad de secuencia, alternativamente al
menos aproximadamente 93% de identidad de secuencia,
alternativamente al menos aproximadamente 94% de identidad de
secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 95% de
identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente
96% de identidad de secuencia, alternativamente al menos
aproximadamente 97% de identidad de secuencia, alternativamente al
menos aproximadamente 98% de identidad de secuencia,
alternativamente al menos aproximadamente 99% de identidad de
secuencia de (a) una molécula de ADN que tiene la secuencia de
nucleótidos de 31 o 100 a 3969, inclusive, de la figura 1 (SEQ ID
NO: 1), o (b) el complemento de la molécula de ADN de (a).
La molécula de ácido nucleico aislada puede
comprender (a) la secuencia de nucleótido de entre 31 o 100 a 3969,
inclusive, de la figura 1 (SEQ ID NO:1), o (b) el complemento de la
secuencia de nucleótido de (a).
En un aspecto adicional, la invención
proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende
una secuencia de nucleótido que tiene al menos 80% de identidad de
secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 81% de
identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente
82% de identidad de secuencia, alternativamente al menos
aproximadamente 83% de identidad de secuencia, alternativamente al
menos aproximadamente 84% de identidad de secuencia,
alternativamente al menos aproximadamente 85% de identidad de
secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 86% de
identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente
87% de identidad de secuencia, alternativamente al menos
aproximadamente 88% de identidad de secuencia, alternativamente al
menos aproximadamente 89% de identidad de secuencia,
alternativamente al menos aproximadamente 90% de identidad de
secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 91% de
identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente
92% de identidad de secuencia, alternativamente al menos
aproximadamente 93% de identidad de secuencia, alternativamente al
menos aproximadamente 94% de identidad de secuencia,
alternativamente al menos aproximadamente 95% de identidad de
secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 96% de
identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente
97% de identidad de secuencia, alternativamente al menos
aproximadamente 98% de identidad de secuencia, alternativamente al
menos aproximadamente 99% de identidad de secuencia de (a) una
molécula de ADN que codifica el mismo polipéptido maduro codificado
mediante en ADNc humano depositado con el ATCC el 23 de mayo, 2000,
bajo ATCC Depósito Nº 1907-PTA (DNA
153576-2925) o (b) el complemento de la molécula de
ADN de (a). En una realización preferida, la molécula de ácido
nucleico aislada comprende (a) una secuencia de nucleótido que
codifica el mismo polipéptido maduro codificado mediante el ADNc
humano depositado con el ATCC el 23 de mayo, 2000 bajo del ATCC
Depósito Nº 1907-PTA (DNA
153576-2925) o (b) el complemento de la secuencia de
nucleótido de (a).
En otro aspecto, la invención proporciona una
molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de
nucleótido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia,
alternativamente al menos aproximadamente 81% de identidad de
secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 82% de
identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente
83% de identidad de secuencia, alternativamente al menos
aproximadamente 84% de identidad de secuencia, alternativamente al
menos aproximadamente 85% de identidad de secuencia,
alternativamente al menos aproximadamente 86% de identidad de
secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 87% de
identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente
88% de identidad de secuencia, alternativamente al menos
aproximadamente 89% de identidad de secuencia, alternativamente al
menos aproximadamente 90% de identidad de secuencia,
alternativamente al menos aproximadamente 91% de identidad de
secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 92% de
identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente
93% de identidad de secuencia, alternativamente al menos
aproximadamente 94% de identidad de secuencia, alternativamente al
menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia,
alternativamente al menos aproximadamente 96% de identidad de
secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 97% de
identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente
98% de identidad de secuencia, alternativamente al menos
aproximadamente 99% de identidad de secuencia de (a) la secuencia de
codificación completa del polipéptido del ADNc depositado con el
ATCC el 23 de mayo, 2000 bajo ATCC Deposit Nº
1907-PTA (DNA 153576-2925) o (b) el
complemento de la secuencia de nucleótido de (a). En una realización
preferida, la molécula de ácido nucleico aislada comprende (a) la
secuencia de codificación completa del polipéptido del ADN
depositado con el ATCC el 23 de mayo, 2000 bajo ATCC Deposit Nº
1907-PTA (DNA 153576-2925) o (b) el
complemento de la secuencia de nucleótido de (a).
En otro aspecto, la invención proporciona una
molécula de ácido nucleico aislada que codifica un polipéptido
PRO21074 activo como se define a continuación que comprende una
secuencia de nucleótido que comprende al menos 2036 nucleótidos que
hibridizan al complemento de una secuencia de ácido nucleico que
codifica amino ácidos 1 o 24 a 1313, inclusive, de la figura 2 (SEQ
ID NO: 2). La hibridación se produce bajo condiciones rigurosas de
hibridación y lavado.
La solicitud también describe una molécula de
ácido nucleico aislada que codifica un polipéptido PRO21074 activo
como se define a continuación que comprende una secuencia de
nucleótido que hibridiza al complemento de la secuencia de ácido
nucleico entre aproximadamente nucleótidos 31 o 100 a 3936,
inclusive, de la figura 1 (SEQ ID NO: 1). Preferentemente, la
hibridación se produce bajo condiciones rigurosas de hibridación y
lavado.
En un aspecto adicional, la invención
proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que tiene al
menos 2036 nucleótidos y que se produce mediante la hibridación de
una molécula de ADN de prueba bajo condiciones rigurosas con (a) una
molécula de ADN que codifique un polipéptido PRO21074 que tiene la
secuencia de residuos de amino ácidos de 1 o 24 a 1313, inclusive,
de la figura 2 (SEQ ID NO: 2), o (b) el complementario de la
molécula de ADN de (a), y, si la molécula de ADN de prueba tiene al
menos 80% de identidad de secuencia, alternativamente al menos
aproximadamente 81% de identidad de secuencia, alternativamente al
menos aproximadamente 82% de identidad de secuencia,
alternativamente al menos aproximadamente 83% de identidad de
secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 84% de
identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente
85% de identidad de secuencia, alternativamente al menos
aproximadamente 86% de identidad de secuencia, alternativamente al
menos aproximadamente 87% de identidad de secuencia,
alternativamente al menos aproximadamente 88% de identidad de
secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 89% de
identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente
90% de identidad de secuencia, alternativamente al menos
aproximadamente 91% de identidad de secuencia, alternativamente al
menos aproximadamente 92% de identidad de secuencia,
alternativamente al menos aproximadamente 93% de identidad de
secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 94% de
identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente
95% de identidad de secuencia, alternativamente al menos
aproximadamente 96% de identidad de secuencia, alternativamente al
menos aproximadamente 97% de identidad de secuencia,
alternativamente al menos aproximadamente 98% de identidad de
secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 99% de
identidad de secuencia de (a) o (b), y aislando la molécula de ADN
de prueba.
En un aspecto específico, la invención
proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende ADN
que codifica un polipéptido PRO21074 sin la secuencia de señal
N-terminal y/o la metionina inicial, o es
complementaria a dicha molécula de ácido nucleico de codificación.
El péptido señal se ha identificado tentativamente extendiéndose
desde aproximadamente la posición amino ácido 1 hasta
aproximadamente la posición amino ácido 23 en la secuencia de la
figura 2 (SEQ ID NO: 2). Se observa, sin embargo, que la unión C
terminal del péptido señal puede variar, pero más probablemente en
no más de 5 amino ácidos a cada lado de la unión C terminal del
péptido señal como inicialmente se identificó aquí, donde la unión C
terminal del péptido señal puede identificarse de conformidad con el
criterio empleado rutinariamente en la técnica para identificar
dicho tipo de secuencia elemento de amino ácido (e.g.,
Nielsen et al., Prot. Eng.
10:1-6 (1997) y von Heinje et al., Nucl.
Acids. Res. 14:4683-4690 (1986)). Por
otro lado, también se reconoce que, en algunos casos, la división de
una secuencia de señal a partir de un polipéptido secretado no es
completamente uniforme, resultando en más de una especie secretada.
Estos polipéptidos, y los poli nucleótidos que codifican el
polipéptido PRO21074 mostrado en la figura 2 (SEQ ID NO: 2) se
extienden desde amino ácidos 1 a X de la figura 2 (SEQ ID NO: 2),
donde X es cualquier amino ácido de 18 a 28 de la figura 2 (SEQ ID
NO: 2). Por lo tanto, las formas maduras del polipéptido PRO21074
que están englobadas en la presente invención incluyen aquellas que
comprenden amino ácidos X a 1313 de la figura 2 (SEQ ID NO: 2),
donde X es cualquier amino ácido de 18 a 28 de la figura 2 (SEQ ID
NO: 2) y variantes del mismo como se describe a continuación.
También se contemplan las moléculas de ácido nucleico aisladas que
codifican estos polipéptidos.
La presente solicitud también describe
fragmentos de poli nucleótidos de una secuencia de codificación del
polipéptido PRO21074 que pueden encontrar uso como, por ejemplo,
sonda de hibridación o para codificar fragmentos de un polipéptido
PRO21074 que puede opcionalmente codificar un polipéptido que
comprende un sitio de unión para un anticuerpo
anti-PRO21074. Tales fragmentos de ácido nucleico
pueden al menos tener aproximadamente 20 nucleótidos de longitud,
alternativamente al menos aproximadamente 30 nucleótidos de
longitud, alternativamente al menos aproximadamente 40 nucleótidos
de longitud, alternativamente al menos aproximadamente 50
nucleótidos de longitud, alternativamente al menos aproximadamente
60 nucleótidos de longitud, alternativamente al menos
aproximadamente 70 nucleótidos de longitud, alternativamente al
menos aproximadamente 80 nucleótidos de longitud, alternativamente
al menos aproximadamente 90 nucleótidos de longitud,
alternativamente al menos aproximadamente 100 nucleótidos de
longitud, alternativamente al menos aproximadamente 110 nucleótidos
de longitud, alternativamente al menos aproximadamente 120
nucleótidos de longitud, alternativamente al menos aproximadamente
130 nucleótidos de longitud, alternativamente al menos
aproximadamente 140 nucleótidos de longitud, alternativamente al
menos aproximadamente 150 nucleótidos de longitud, alternativamente
al menos aproximadamente 160 nucleótidos de longitud,
alternativamente al menos aproximadamente 170 nucleótidos de
longitud, alternativamente al menos aproximadamente 180 nucleótidos
de longitud, alternativamente al menos aproximadamente 190
nucleótidos de longitud, alternativamente al menos aproximadamente
200 nucleótidos de longitud, alternativamente al menos
aproximadamente 250 nucleótidos de longitud, alternativamente al
menos aproximadamente 300 nucleótidos de longitud, alternativamente
al menos aproximadamente 350 nucleótidos de longitud,
alternativamente al menos aproximadamente 400 nucleótidos de
longitud, alternativamente al menos aproximadamente 450 nucleótidos
de longitud, alternativamente al menos aproximadamente 500
nucleótidos de longitud, alternativamente al menos aproximadamente
600 nucleótidos de longitud, alternativamente al menos
aproximadamente 700 nucleótidos de longitud, alternativamente al
menos aproximadamente 800 nucleótidos de longitud, alternativamente
al menos aproximadamente 900 nucleótidos de longitud y
alternativamente al menos aproximadamente 1000 nucleótidos de
longitud, donde en este contexto el término "aproximadamente"
significa la longitud de secuencia del nucleótido mencionada más o
menos 10% de la longitud mencionada. El fragmento de secuencia de
nucleótido puede derivarse a partir de cualquier segmento mostrado
en la figura 1 (SEQ ID NO: 1), por ejemplo, regiones de codificación
y no traducidas. En una realización alternativa, el fragmento de
secuencia de nucleótido se deriva a partir de cualquier región de
codificación de la secuencia de nucleótido mostrada en la figura 1
(SEQ ID NO: 1). Se observa que los fragmentos nuevos de una
secuencia de codificación de nucleótido de polipéptido PRO21074
puede determinarse en una forma rutinaria mediante la alineación de
la secuencia de codificación de nucleótido de polipéptido con otras
secuencias de nucleótidos conocidas utilizando cualquiera de un
número de programas de alineación de secuencias conocidos y
determinando qué fragmento(s) de secuencia de codificación de
nucleótido del polipéptido PRO21074 son nuevos. Todas dichas
secuencias de codificación de nucleótido del polipéptido PRO21074
se contemplan aquí y pueden determinarse sin demasiada
experimentación. También se contemplan los fragmentos de polipéptido
PRO 21074 codificados por estos fragmentos de molécula de
nucleótido, preferentemente aquellos fragmentos de polipéptido
PRO21074 que comprenden un sitio de unión para un anticuerpo
anti-PRO21074.
En otra realización, la invención proporciona un
vector que comprende una secuencia de nucleótido que codifica
PRO21074. Este vector puede comprender cualquiera de las moléculas
aisladas de ácido nucleico aquí previamente identificadas.
En otra realización, la invención proporciona
una célula huésped que comprende un vector que codifica PRO21074 o
sus variantes. A modo de ejemplo, las células huésped puede ser
células CHO, E. coli, o levadura.
En otra realización, la invención proporciona un
procedimiento para producir polipéptidos PRO21074 que comprenden
cultivar células huésped bajo condiciones adecuadas para la
expresión de PRO21074 y recuperación de PRO21074 a partir de cultivo
celular.
En otra realización, la invención proporciona
polipéptido PRO21074 aislado codificado mediante cualquiera de las
secuencias de ácido nucleico aisladas aquí previamente
identificadas.
En un aspecto específico, la invención
proporciona una secuencia aislada nativa de polipéptido PRO21074,
que en ciertas realizaciones, incluye una secuencia de amino ácido
que comprende residuos desde aproximadamente 1 o aproximadamente 24
hasta aproximadamente 1313 de la figura 2 (SEQ ID NO: 2).
En otro aspecto, la invención proporciona un
polipéptido PRO21074 aislado, que comprende una secuencia de amino
ácido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia,
alternativamente al menos aproximadamente 81% de identidad de
secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 82% de
identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente
83% de identidad de secuencia, alternativamente al menos
aproximadamente 84% de identidad de secuencia, alternativamente al
menos aproximadamente 85% de identidad de secuencia,
alternativamente al menos aproximadamente 86% de identidad de
secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 87% de
identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente
88% de identidad de secuencia, alternativamente al menos
aproximadamente 89% de identidad de secuencia, alternativamente al
menos aproximadamente 90% de identidad de secuencia,
alternativamente al menos aproximadamente 91% de identidad de
secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 92% de
identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente
93% de identidad de secuencia, alternativamente al menos
aproximadamente 94% de identidad de secuencia, alternativamente al
menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia,
alternativamente al menos aproximadamente 96% de identidad de
secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 97% de
identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente
98% de identidad de secuencia, alternativamente al menos
aproximadamente 99% de identidad de secuencia de la secuencia de
residuos de amino ácido de 1 o 24 a 1313, inclusive, de la figura 2
(SEQ ID NO: 2).
En un aspecto adicional, la invención
proporciona un polipéptido PRO21074 aislado que comprende una
secuencia de amino ácido que tiene al menos 80% de identidad de
secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 81% de
identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente
82% de identidad de secuencia, alternativamente al menos
aproximadamente 83% de identidad de secuencia, alternativamente al
menos aproximadamente 84% de identidad de secuencia,
alternativamente al menos aproximadamente 85% de identidad de
secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 86% de
identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente
87% de identidad de secuencia, alternativamente al menos
aproximadamente 88% de identidad de secuencia, alternativamente al
menos aproximadamente 89% de identidad de secuencia,
alternativamente al menos aproximadamente 90% de identidad de
secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 91% de
identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente
92% de identidad de secuencia, alternativamente al menos
aproximadamente 93% de identidad de secuencia, alternativamente al
menos aproximadamente 94% de identidad de secuencia,
alternativamente al menos aproximadamente 95% de identidad de
secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 96% de
identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente
97% de identidad de secuencia, alternativamente al menos
aproximadamente 98% de identidad de secuencia, alternativamente al
menos aproximadamente 99% de identidad de secuencia de una secuencia
de amino ácido codificada mediante el ADNc depositado con el ATCC el
23 de mayo, 2000 bajo ATCC Deposit Nº 1907-PTA (DNA
153576-2925). En una realización preferida, el
polipéptido PRO21074 aislado comprende una secuencia de amino ácido
codificada mediante el ADNc depositado con el ATCC el 23 de mayo,
2000 bajo ATCC Deposit Nº 1907-PTA (DNA
153576-2925).
En un aspecto específico, la invención
proporciona un polipéptido PRO21074 aislado sin la secuencia de
señal N-terminal y/o la metionina inicial y está
codificado mediante una secuencia de nucleótido que codifica dicha
secuencia de amino ácido como se ha descrito aquí previamente. Los
procedimientos para producir el mismo también se describen aquí, en
donde dichos procedimientos comprenden cultivar una célula huésped
que comprende un vector que comprende la molécula de ácido nucleico
de codificación apropiada bajo condiciones adecuadas de expresión
del polipéptido PRO21074 y recuperar el polipéptido PRO21074 a
partir del cultivo celular.
En otro aspecto adicional, la invención
proporciona un polipéptido PRO21074 aislado, que comprende la
secuencia de residuos de amino ácido desde 1 o 24 a 1313, inclusive,
de la figura 2 (SEQ ID NO: 2). La identificación de los fragmentos
de polipéptido PRO21074 que poseen actividad biológica o
proporcionan un sitio de unión para un anticuerpo
anti-PRO21074 pueden conseguirse a través de una
forma rutinaria utilizando técnicas que son conocidas en la técnica.
Preferentemente, el fragmento PRO21074 retiene una actividad
biológica cualitativa de un polipéptido PRO21074.
En otro aspecto más, la invención proporciona un
polipéptido producido mediante (i) hibridación de una molécula de
ADN de prueba bajo condiciones rigurosas con (a) una molécula de ADN
que codifica un polipéptido PRO21074 que tiene una secuencia de
residuos de amino ácido desde 1 o 24 hasta 1313, inclusive, de la
figura 2 (SEQ ID NO: 2), o (b) el complemento de la molécula de ADN
de (a), y si la molécula de ADN de prueba tiene al menos 80% de
identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente
81% de identidad de secuencia, alternativamente al menos
aproximadamente 82% de identidad de secuencia, alternativamente al
menos aproximadamente 83% de identidad de secuencia,
alternativamente al menos aproximadamente 84% de identidad de
secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 85% de
identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente
86% de identidad de secuencia, alternativamente al menos
aproximadamente 87% de identidad de secuencia, alternativamente al
menos aproximadamente 88% de identidad de secuencia,
alternativamente al menos aproximadamente 89% de identidad de
secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 90% de
identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente
91% de identidad de secuencia, alternativamente al menos
aproximadamente 92% de identidad de secuencia, alternativamente al
menos aproximadamente 93% de identidad de secuencia,
alternativamente al menos aproximadamente 94% de identidad de
secuencia, alternativamente al menos aproximadamente 95% de
identidad de secuencia, alternativamente al menos aproximadamente
96% de identidad de secuencia, alternativamente al menos
aproximadamente 97% de identidad de secuencia, alternativamente al
menos aproximadamente 98% de identidad de secuencia,
alternativamente al menos aproximadamente 99% de identidad de
secuencia de (a) o (b), (ii) cultivar una célula huésped que
comprende la molécula de ADN de prueba bajo condiciones adecuadas
para la expresión del polipéptido, y (iii) recuperar el polipéptido
a partir del cultivo celular.
En otra realización, la invención proporciona
moléculas quiméricas que comprenden un polipéptido PRO21074
fusionado con un polipéptido o secuencia de amino ácido heterólogos,
donde el polipéptido de PRO21074 puede comprender cualquier
polipéptido PRO21074, variante o fragmento del mismo como aquí se
describe con anterioridad. Un ejemplo de dicha molécula quimérica
comprende un polipéptido PRO21074 fusionado con una secuencia de
marca epitopo o una región Fc de una inmunoglobulina.
En otra realización, la invención proporciona un
anticuerpo como se define a continuación que se une específicamente
a un polipéptido PRO21074 como se ha descrito con anterioridad.
Opcionalmente, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, un
fragmento de anticuerpo o un anticuerpo de cadena simple.
La presente solicitud también describe agonistas
y antagonistas de un polipéptido PRO21074 nativo como se define a
continuación. El agonista o antagonista puede ser un anticuerpo
anti-PRO21074 o una molécula pequeña.
La solicitud también describe un procedimiento
para identificar agonistas o antagonistas de un polipéptido
PRO21074 que comprende poner en contacto el polipéptido PRO21074 con una molécula candidata y monitorizar una actividad biológica de mediación mediante dicho polipéptido PRO21074. Preferentemente, el polipéptido PRO21074 es un polipéptido PRO21074 nativo.
PRO21074 que comprende poner en contacto el polipéptido PRO21074 con una molécula candidata y monitorizar una actividad biológica de mediación mediante dicho polipéptido PRO21074. Preferentemente, el polipéptido PRO21074 es un polipéptido PRO21074 nativo.
En otra realización adicional, la invención
proporciona una composición de materia que comprende un polipéptido
PRO21074, o un anticuerpo anti-PRO21074, en
combinación con un portador. El portador es un portador
farmacéuticamente aceptable.
La presente solicitud también proporciona el uso
de un polipéptido PRO21074, o un agonista o antagonista del mismo
como se ha descrito aquí, o un anticuerpo
anti-PRO21074, para la preparación de un medicamento
útil en el tratamiento de una condición que responde al polipéptido
PRO21074, a un agonista o antagonista del mismo o a un anticuerpo
anti-PRO21074.
También se describe aquí un procedimiento para
utilizar un polipéptido PRO21074 para un procedimiento de
diagnóstico o monitorización de la progresión de un desorden
cartilaginoso. Dicho procedimiento puede comprender medir el nivel
del polipéptido PRO21074 en el suero o líquido sinovial, donde un
cambio en el nivel de dicho polipéptido relativo al tejido normal se
correlaciona con la relativa severidad o pronóstico de dicho
desorden. El polipéptido PRO21074 puede medirse en la orina o en la
matriz del cartílago.
También se describe aquí un procedimiento de
tratamiento de un mamífero que sufre un desorden cartilaginoso, que
comprende administrar a dicho mamífero una cantidad terapéuticamente
efectiva de un PRO21074. Opcionalmente el desorden cartilaginoso es
un desorden cartilaginoso degenerativo. El desorden cartilaginoso
degenerativo puede ser artritis, más específicamente osteoartritis o
artritis reumatoide. Opcionalmente, el cartílago es un cartílago
articular. El procedimiento puede comprender además la combinación
de PRO21074 con una técnica quirúrgica estándar y/o una cantidad
efectiva de al menos un agente del cartílago. Opcionalmente, el
PRO21074 comprende además un portador, excipiente o
estabilizador.
La solicitud también describe un procedimiento
de tratamiento de un mamífero que sufre un desorden cartilaginoso,
que comprende administrar a dicho mamífero una cantidad
terapéuticamente efectiva de un antagonista de PRO21074.
Opcionalmente el desorden cartilaginoso es un desorden cartilaginoso
degenerativo. El desorden cartilaginoso degenerativo puede ser
artritis, más específicamente osteoartritis o artritis reumatoide.
El antagonista de PRO21074 puede ser un anticuerpo
anti-PRO21074. Opcionalmente, el cartílago es un
cartílago articular. El procedimiento puede comprender además la
combinación del antagonista de PRO21074 con una técnica quirúrgica
estándar y/o una cantidad efectiva de al menos un agente del
cartílago. Opcionalmente, el antagonista de PRO21074 comprende
además un portador, excipiente o estabilizador.
La solicitud también describe un procedimiento
para el tratamiento de un cartílago dañado o para evitar el daño de
un cartílago, que comprende contactar dicho cartílago con una
cantidad efectiva de un PRO21074 o un antagonista del mismo. El
antagonista del PRO21074 puede ser un anticuerpo
anti-PRO21074. El cartílago puede ser un cartílago
articular. Más específicamente, el daño del cartílago se produce por
un desorden cartilaginoso, aún más específicamente, un desorden
cartilaginoso degenerativo. Aún más específicamente, el desorden
cartilaginoso es artritis, incluyendo, por ejemplo, reumatoide y
osteoartritis. Alternativamente, dicho daño puede resultar de una
lesión, por ejemplo, microdaño o trauma cerrado, una fractura
cartilaginosa, una fractura osteocartilaginosa, daño a tendones,
meniscos o ligamentos o el resultado de excesiva tensión mecánica u
otra inestabilidad biomecánica resultante de una lesión u obesidad.
El cartílago puede estar contenido dentro de un mamífero, incluyendo
humanos, y la cantidad administrada a dicho mamífero es una cantidad
terapéuticamente efectiva. El polipéptido PRO21074 o el antagonista
pueden administrarse a través de una inyección o infusión mediante
administración intravenosa, intraarterial, intraperitoneal,
intramuscular, intralesional, intraarticular o tópica.
Alternativamente, la composición puede inyectarse directamente en la
región o articulación cartilaginosa afectada. El procedimiento puede
comprender además una cantidad efectiva de un agente de cartílago
y/o una técnica quirúrgica estándar. El polipéptido PRO21074 o el
antagonista pueden administrarse antes, después y/o simultáneamente
con la técnica quirúrgica estándar del cartílago. La cantidad
efectiva de polipéptido PRO21074 o del antagonista puede comprender
además una cantidad efectiva de agente de cartílago.
También se describe aquí un procedimiento de
tratamiento de cartílago dañado o para evitar daño inicial o
continuado que comprende contactar dicho cartílago con una cantidad
efectiva de polipéptido PRO21074 en combinación con una cantidad
efectiva de agente de cartílago. Opcionalmente, el cartílago se
halla presente dentro de un mamífero y la cantidad administrada es
una cantidad terapéuticamente efectiva.
También se describe aquí un procedimiento para
mantener, mejorar o promover el crecimiento de condrocitos en
cultivo sin suero mediante el cultivo de condrocitos con una
cantidad efectiva de polipéptido PRO21074. Alternativamente, el
procedimiento propone contactar dichos condrocitos con una cantidad
efectiva de polipéptido PRO21074 en una formulación de liberación
controlada o extendida.
También se describe aquí un procedimiento para
tratar cartílago dañado o evitar el daño inicial o continuo, que
comprende tratar células en y alrededor de las articulaciones con
una cantidad efectiva de polipéptido PRO21074. Dicho tratamiento
puede ocurrir mediante aplicación exógena del polipéptido PRO21074,
o alternativamente, a través de la introducción de ácido nucleico
que codifique PRO21074 o fragmentos del mismo, dentro de dichas
células mediante transfección, infección, u otras técnicas estándar
in vitro o in vivo. En técnicas de terapia in
vitro puede comprender extraer una "célula en y alrededor de
la articulación" introduciendo dicho ácido nucleico dentro de
dicha célula, y transplantado de nuevo dicha célula en el tejido a
partir del cual se extrajo inicialmente. Las células relacionadas al
cartílago pueden ser condrocitos, sinoviocitos, fibroblastos,
células de los tendones o ligamentos, osteoblastos o mioblastos.
Alternativamente, la solicitud describe un
procedimiento de promoción de la adherencia de los condrocitos entre
sí o a la matriz de cartílago. En un aspecto específico, la
adherencia se produce en un cultivo sin suero in vitro. La
adherencia puede producirse in vivo.
La solicitud también describe un equipo
terapéutico, que comprende PRO21074 y un portador, excipiente, y/o
estabilizador (por ejemplo, un tampón) en un embalaje adecuado. El
equipo contiene preferentemente instrucciones para utilizar el
PRO21074 para tratar cartílago dañado o para evitar daño inicial o
continuado al cartílago como resultado de lesión o desorden
cartilaginoso. Alternativamente, el equipo puede contener
instrucciones para utilizar el PRO21074 para tratar un desorden
cartilaginoso. También se describe aquí un artículo de fabricación,
que
comprende:
comprende:
un contenedor,
una instrucción en el contenedor; y
una composición que comprende un agente activo
contenido en el contenedor;
donde la composición es efectiva para tratar un
desorden cartilaginoso, la instrucción en el contenedor indica que
la composición puede utilizarse para tratar un desorden
cartilaginoso, y el agente activo en la composición es un
polipéptido PRO21074.
La figura 1 muestra la secuencia de nucleótido
(SEQ ID NO: 1) de un ADNc que contiene secuencia de nucleótido
(nucleótidos 31-3969) que codifica la secuencia
nativa de PRO21074, donde la secuencia de nucleótido (SEQ ID NO: 1)
es un clon designado aquí como AADN 15376-2925''.
También se presentan en letra negrita y subrayada las posiciones de
los respectivos codones de inicio y de terminación.
La figura 2A-B muestra la
secuencia de amino ácido (SEQ ID NO: 2) de una secuencia nativa de
polipéptido PRO21074 derivado a partir de la secuencia de
codificación de SEQ ID NO: 1. También se muestran las ubicaciones
aproximadas de otros dominios de polipéptidos.
La figura 3 muestra una secuencia de nucleótido
designada aquí como ADN 144306 (SEQ ID NO: 3).
La figura 4 muestra un análisis de la expresión
del ADN 153576 en bancos preparados a partir de un número de tejidos
diferentes relativos a la expresión observada en cartílago articular
fetal. Como se indica, la expresión parece ser altamente específica
al cartílago. Para todas las muestras, se utilizaron 50 ng de banco
de ADNc por reacción. Todas las muestras se normalizaron a beta
actin y marcados relativos a la expresión ADN 153576 en el banco de
cartílago articular fetal.
La figura 5 muestra un análisis de la expresión
del ADN 153576 en distintos tejidos relativos a la expresión
observada en cartílago articular fetal. El gráfico ilustra la
expresión relativa que es muy específica al cartílago (adulto sano,
enfermo y fetal) y al menisco. La cantidad de ARN utilizado por
muestra de tejido fue 6-50 ng dependiendo de la
muestra. Todas las muestras se normalizaron a beta actin y se
marcaron relativas a la expresión del ADN 153576 en la muestra de
cartílago articular de enfermedad degenerativa de la articulación
(DJD). El nivel de expresión de ADN 153576 en el banco ADNc
682-3 cartílago articular fetal se tomó a partir del
"cartílago" en la figura 4 y se incluyó para permitir
comparaciones relativas entre las figuras 4 y 5.
La figura 6 muestra un análisis logarítmico
expandido de la figura 5, ilustrando además la expresión de ADN
153576 en tejidos de la articulación relativos a la expresión
observada en cartílago articular fetal.
Los términos "polipéptido PRO21074",
"proteína PRO21074" y "PRO21074" cuando se utilizan aquí
abarcan la secuencia nativa de PRO21074 y variantes del polipéptido
PRO21074 (que se describen aquí adicionalmente). El polipéptido
PRO21074 puede aislarse a partir de una variedad de fuentes, tales
como a partir de tipos de tejidos humanos o a partir de otra fuente,
o prepararse mediante procedimientos recombinantes y/o
sintéticos.
Una "secuencia nativa de PRO21074"
comprende un polipéptido que tiene la misma secuencia de amino ácido
como un derivado de la naturaleza del PRO21074. Dicha secuencia
nativa de PRO21074 pueden aislarse a partir de la naturaleza o
pueden producirse a través de medios recombinantes y/o sintéticos.
El término "secuencia nativa de PRO21074" engloba
específicamente formas naturales truncadas o secretadas (por
ejemplo, una secuencia de dominio extracelular), variantes de formas
naturales (por ejemplo, formas combinadas alternativamente) y
variantes alélicas naturales del PRO21074. En una realización de la
invención, la secuencia nativa PRO21074 es una secuencia nativa de
PRO21074 de longitud completa que comprende amino ácidos 1 a 1313 de
la figura 2 (SEQ ID NO: 2). También mientras que el polipéptido
PRO21074 descrito en la figura 2 (SEQ ID NO: 2) muestra que comienza
con el residuo de metionina designado aquí como posición amino ácido
1, es concebible y posible que otro residuo de metionina ubicado
tanto hacia arriba o hacia debajo de la posición amino ácido 1 en la
figura 2 (SEQ ID NO: 2) puede emplearse como el residuo de amino
ácido inicial del polipéptido PRO21074.
"Variante del polipéptido PRO21074"
significa un polipéptido activo PRO21074 como se define más adelante
que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con la secuencia de
amino ácido de (a) residuos 1 o aproximadamente 24 a 1313 del
polipéptido PRO21074 mostrado en la figura 2 (SEQ ID NO: 2), (b) X a
1313 del polipéptido PRO21074 mostrado en la figura 2 (SEQ ID NO:
2), donde X es cualquier residuo de amino ácido desde 18 a 28 de la
figura 2 (SEQ ID NO: 2), o (c) otro fragmento específicamente
derivado de la secuencia de amino ácido mostrada en la figura 2 (SEQ
ID NO: 2). Dichas variantes de polipéptido PRO21074 incluye, por
ejemplo, polipéptidos PRO21074 donde se añaden, o se eliminan, uno o
más residuos de amino ácido, en los N- y/o
C-terminales, así como dentro de uno o más dominios
internos, de la secuencia de la figura 2 (SEQ ID NO: 2).
Ordinariamente, una variante del polipéptido PRO21074 tendrá al
menos al menos 80% de identidad de secuencia de amino ácido,
alternativamente al menos aproximadamente 81% de identidad de
secuencia de amino ácido, alternativamente al menos aproximadamente
82% de identidad de secuencia de amino ácido, alternativamente al
menos aproximadamente 83% de identidad de secuencia de amino ácido,
alternativamente al menos aproximadamente 84% de identidad de
secuencia de amino ácido, alternativamente al menos aproximadamente
85% de identidad de secuencia de amino ácido, alternativamente al
menos aproximadamente 86% de identidad de secuencia de amino ácido,
alternativamente al menos aproximadamente 87% de identidad de
secuencia de amino ácido, alternativamente al menos aproximadamente
88% de identidad de secuencia de amino ácido, alternativamente al
menos aproximadamente 89% de identidad de secuencia de amino ácido,
alternativamente al menos aproximadamente 90% de identidad de
secuencia de amino ácido, alternativamente al menos aproximadamente
91% de identidad de secuencia de amino ácido, alternativamente al
menos aproximadamente 92% de identidad de secuencia de amino ácido,
alternativamente al menos aproximadamente 93% de identidad de
secuencia de amino ácido, alternativamente al menos aproximadamente
94% de identidad de secuencia de amino ácido, alternativamente al
menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia de amino ácido,
alternativamente al menos aproximadamente 96% de identidad de
secuencia de amino ácido, alternativamente al menos aproximadamente
97% de identidad de secuencia de amino ácido, alternativamente al
menos aproximadamente 98% de identidad de secuencia de amino ácido,
alternativamente al menos aproximadamente 99% de identidad de
secuencia de amino ácido con (a) residuos 1 o aproximadamente 24 a
1313 del polipéptido PRO21074 mostrado en la figura 2 (SEQ ID NO:
2), (b) X a 1313 del polipéptido PRO21074 mostrado en la figura 2
(SEQ ID NO: 2), donde X es cualquier residuo de amino ácido de 18 a
28 de la figura 2 (SEQ ID NO: 2), o (c) otro fragmento
específicamente derivado de la secuencia de amino ácido mostrada en
la figura 2 (SEQ ID NO: 2). Las variantes de polipéptido PRO21074
no engloban la secuencia de polipéptido PRO21074 nativo.
Ordinariamente, las variantes del polipéptido PRO21074 tienen una
longitud de al menos aproximadamente 10 amino ácidos, con frecuencia
de al menos aproximadamente 20 amino ácidos de longitud, con más
frecuencia de al menos aproximadamente 30 amino ácidos de longitud,
con más frecuencia de al menos aproximadamente 40 amino ácidos de
longitud, con más frecuencia de al menos aproximadamente 50 amino
ácidos de longitud, con más frecuencia de al menos aproximadamente
60 amino ácidos de longitud, con más frecuencia de al menos
aproximadamente 70 amino ácidos de longitud, con más frecuencia de
al menos aproximadamente 80 amino ácidos de longitud, con más
frecuencia de al menos aproximadamente 90 amino ácidos de longitud,
con más frecuencia de al menos aproximadamente 100 amino ácidos de
longitud, con más frecuencia de al menos aproximadamente 150 amino
ácidos de longitud, con más frecuencia de al menos aproximadamente
200 amino ácidos de longitud, con más frecuencia de al menos
aproximadamente 250 amino ácidos de longitud, con más frecuencia de
al menos aproximadamente 300 amino ácidos de longitud,
o más.
o más.
"Porcentaje (%) de identidad de secuencia de
amino ácido" respecto a las secuencias de polipéptido PRO21074
aquí identificadas se define como el porcentaje de residuos de amino
ácido en una secuencia candidata que son idénticos con los residuos
de amino ácido en la secuencia de PRO21074, después de alinear las
secuencias e introducir intervalos, si es necesario, para lograr el
porcentaje máximo de identidad de secuencia, y sin considerar
ninguna sustitución conservativa como parte de la identidad de
secuencia. Las alineaciones para determinar el porcentaje de amino
ácido de la identidad de secuencia pueden lograrse a través de
distintos modos, que se hallan dentro de la habilidad en la técnica,
por ejemplo: utilizar software públicamente disponible para
ordenadores tal como BLAST, BLAST-2, ALIGN,
ALIGN-2 o software Megalign (DNASTAR). Aquellos
entendidos en la técnica pueden determinar los parámetros apropiados
para medir la alineación, incluyendo cualquier algoritmo necesario
para lograr la máxima alineación sobre la longitud total de las
secuencias que se comparan. Para los presentes propósitos, sin
embargo, los valores % de amino ácido de la identidad de la
secuencia se obtienen como se describe a continuación mediante el
uso del programa de ordenador de comparación de secuencias
ALIGN-2, donde el código fuente completa para el
programa ALIGN-2 se proporciona en la Tabla 2. El
programa de ordenador de comparación de secuencias
ALIGN-2 fue escrito por Genentech, Inc. y el código
fuente mostrado en la Tabla 2 se ha presentado con la documentación
del usuario en la U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559,
donde está registrado bajo U.S. Copyright Registration Nº TXU510087.
El programa ALIGN-2 está disponible públicamente a
través de Genentech, Inc., South San Francisco, California o puede
recabarse desde el código fuente provisto en la Tabla 2. El programa
ALIGN-2 debe recabarse para utilizarse en un sistema
operativo UNIX, preferentemente UNIX V4.0D digital. Todos los
parámetros de comparación de secuencia se ajustan mediante el
programa ALIGN-2 y no varían.
Para los presentes propósitos, el % de identidad
de secuencia de amino ácido de una secuencia de amino ácido A dada
hacia, con, o contra una secuencia de amino ácido B dada (que puede
alternativamente expresarse como una secuencia de amino ácido A dada
que tiene o comprende un cierto % de identidad de secuencia de amino
ácido hacia, con o contra una secuencia de amino ácido B dada) se
calcula como sigue:
100 veces la
fracción
X/Y
donde X es el número de residuos de
amino ácido marcados como coincidencias idénticas mediante el
programa de alineación de secuencia ALIGN-2 en dicha
alineación del programa de A y B, y donde Y es el número total de
residuos de amino ácido en B. Se observará que donde la longitud de
la secuencia de amino ácido A no es igual a la longitud de la
secuencia de amino ácido B, el % de identidad de secuencia de amino
ácido de A a B no será igual al % de la identidad de secuencia de
amino ácido de B a A. Como ejemplos de cálculos de % de identidad de
secuencia de amino ácido, la Tabla 1A-B demuestran
cómo calcular el % de identidad de secuencia de amino ácido de la
secuencia de amino ácido designado como "Proteína de
Comparación" a la secuencia de amino ácido designada
"PRO".
A menos que se especifique especialmente de otra
manera, todos los valores de % de identidad de secuencia de amino
ácido aquí utilizados se obtienen como se describe con anterioridad
utilizando el programa de ordenador de comparación de secuencia
ALIGN-2. Sin embargo, el % de identidad de secuencia
de amino ácido también puede determinarse utilizarse el programa de
comparación de secuencia NCBI-BLAST2 (Altschul et
al., Nucleic Acids Res.
25:3389-3402 (1997)). El programa de
comparación de secuencia NCBI-BLAST2 puede
descargarse en http://www.ncbi.nlm.nih.gov o de otra forma obtenerse
a partir del National Institute of Health, Bethesda, MD. El
NCBI-BLAST2 utiliza diversos parámetros de búsqueda,
donde todos aquellos parámetros de búsqueda se ajustan a valores por
defecto que incluyen, por ejemplo, "unmask = yes", "strand =
all", "expected occurrences = 10", "minimum low complexity
length = 15/5", "multi-pass
e-value = 0.01", "constant for
multi-pass = 25", "dropoff for final gapped
alignment = 25" y "scoring matrix = BLOSUM62".
En situaciones donde se emplea
NCBI-BLAST2 para comparaciones de secuencia de amino
ácido, el % de identidad de secuencia de amino ácido de una
secuencia de amino ácido A dada a, con o contra una secuencia de
amino ácido B dada (que puede alternativamente expresarse como una
secuencia de amino ácido A dada que tiene o comprende un cierto % de
identidad de secuencia de amino ácido hacia, con o contra una
secuencia de amino ácido B dada) se calcula como sigue:
100 veces la
fracción
X/Y
donde X es el número de residuos de
amino ácido marcados como coincidencias idénticas mediante el
programa de alineación de secuencia NCBI-BLAST2 en
dicha alineación del programa de A y B, y donde Y es el número total
de residuos de amino ácido en B. Se observará que donde la longitud
de la secuencia de amino ácido A no es igual a la longitud de la
secuencia de amino ácido B, el % de identidad de secuencia de amino
ácido de A a B no será igual al % de la identidad de secuencia de
amino ácido de B a
A.
"Variante del poli nucleótido PRO21074" o
"Variante de secuencia de ácido nucleico PRO21074" significa
una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido PRO21074
activo como se define a continuación y que tiene al menos
aproximadamente 80% de identidad de secuencia de ácido nucleico
tanto con (a) una secuencia de ácido nucleico que codifica residuos
1 o aproximadamente 24 a 1313 del polipéptido PRO21074 mostrado en
la figura 2 (SEQ ID NO: 2), (b) una secuencia de ácido nucleico que
codifica amino ácidos X a 1313 del polipéptido PRO21074 mostrado en
la figura 2 (SEQ ID NO: 2), donde X es cualquier residuo de amino
ácido de 18 a 28 de la figura 2 (SEQ ID NO: 2), o (c) un secuencia
de ácido nucleico que codifica otro fragmento específicamente
derivado de la secuencia de amino ácido mostrada en la figura 2 (SEQ
ID NO: 2). Ordinariamente, una variante de poli nucleótido PRO21074
tendrá al menos al menos 80% de identidad de secuencia de ácido
nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 81% de identidad
de secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos
aproximadamente 82% de identidad de secuencia de ácido nucleico,
alternativamente al menos aproximadamente 83% de identidad de
secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos
aproximadamente 84% de identidad de secuencia de ácido nucleico,
alternativamente al menos aproximadamente 85% de identidad de
secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos
aproximadamente 86% de identidad de secuencia de ácido nucleico,
alternativamente al menos aproximadamente 87% de identidad de
secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos
aproximadamente 88% de identidad de secuencia de ácido nucleico,
alternativamente al menos aproximadamente 89% de identidad de
secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos
aproximadamente 90% de identidad de secuencia de ácido nucleico,
alternativamente al menos aproximadamente 91% de identidad de
secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos
aproximadamente 92% de identidad de secuencia de ácido nucleico,
alternativamente al menos aproximadamente 93% de identidad de
secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos
aproximadamente 94% de identidad de secuencia de ácido nucleico,
alternativamente al menos aproximadamente 95% de identidad de
secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos
aproximadamente 96% de identidad de secuencia de ácido nucleico,
alternativamente al menos aproximadamente 97% de identidad de
secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos
aproximadamente 98% de identidad de secuencia de ácido nucleico,
alternativamente al menos aproximadamente 99% de identidad de
secuencia de ácido nucleico tanto con (a) una secuencia de ácido
nucleico que codifica residuos 1 o aproximadamente 24 a 1313 del
polipéptido PRO2 mostrado en la figura 2 (SEQ ID NO: 2), (b) una
secuencia de ácido nucleico que codifica amino ácidos X a 1313 del
polipéptido PRO21074 mostrado en la figura 2 (SEQ ID NO: 2), donde X
es cualquier residuo de amino ácido de 18 a 28 de la figura 2 (SEQ
ID NO: 2), o (c) una secuencia de ácido nucleico que codifica otro
fragmento específicamente derivado de la secuencia de amino ácido en
figura 2 (SEQ ID NO: 2). Las variantes de poli nucleótido PRO21074
no engloban la secuencia del nucleótido PRO21074 nativo.
\newpage
Ordinariamente, las variantes de poli
nucleótidos PRO21074 son de al menos aproximadamente 30 nucleótidos
de longitud, con frecuencia de al menos aproximadamente 60
nucleótidos de longitud, más frecuentemente de al menos
aproximadamente 90 nucleótidos de longitud, más frecuentemente de al
menos aproximadamente 120 nucleótidos de longitud, más
frecuentemente de al menos aproximadamente 150 nucleótidos de
longitud, más frecuentemente de al menos aproximadamente 180
nucleótidos de longitud, más frecuentemente de al menos
aproximadamente 210 nucleótidos de longitud, más frecuentemente de
al menos aproximadamente 240 nucleótidos de longitud, más
frecuentemente de al menos aproximadamente 270 nucleótidos de
longitud, más frecuentemente de al menos aproximadamente 300
nucleótidos de longitud, más frecuentemente de al menos
aproximadamente 450 nucleótidos de longitud, más frecuentemente de
al menos aproximadamente 600 nucleótidos de longitud, más
frecuentemente de al menos aproximadamente 900 nucleótidos de
longitud, o más.
"Porcentaje (%) de identidad de secuencia de
ácido nucleico" respecto a las secuencias de ácido nucleico que
codifica el polipéptido PRO21074 aquí identificadas se define como
el porcentaje de nucleótidos en una secuencia candidata que son
idénticos con la secuencia de ácido nucleico que codifica el
polipéptido PRO21074, después de alinear la secuencia e introducir
intervalos, si es necesario, para lograr el máximo porcentaje de
identidad de secuencia. La alineación con el propósito de determinar
el porcentaje de identidad de secuencia de ácido nucleico puede
lograrse de varias formas que se hallan dentro de las habilidades de
la técnica, por ejemplo, utilizando software para ordenadores
disponible públicamente tal como BLAST, BLAST-2,
ALIGN, ALIGN-2 o software Megalign (DNASTAR).
Aquellos entendidos en la técnica pueden determinar parámetros
apropiados para medir la alineación, incluyendo cualquier algoritmo
necesario para lograr alineación máxima sobre la longitud total de
las secuencias que se comparan. Para los presentes propósitos, sin
embargo, los valores de % de identidad de secuencia de ácido
nucleico se obtienen como se describe a continuación mediante el uso
del programa de ordenador de comparación de secuencia
ALIGN-2, donde el código fuente completo para el
programa ALIGN-2 se proporciona en la Tabla 2. El
programa de ordenador de comparación de secuencia
ALIGN-2 escrito por Genentech, Inc. y el código
fuente mostrado en la Tabla 2 se ha presentado con documentación del
usuario en la U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559, donde
está registrado como U.S. Copyright Registration No. TXU510087. El
programa ALIGN-2 está públicamente disponible a
través de Genentech, Inc., South San Francisco, California o puede
recopilarse a partir del código fuente provisto en la Tabla 2. El
programa ALIGN-2 debe recopilarse para utilizarse en
un sistema operativo UNIX, preferentemente UNIX V4.0D digital. Todos
los parámetros de comparación de secuencia se ajustan mediante el
programa ALIGN-2 y no varían.
Para los presentes propósitos, el % de identidad
de secuencia de ácido nucleico de una secuencia de ácido nucleico C
dada a, con o contra una secuencia de ácido nucleico D dada (que
alternativamente puede expresarse como una secuencia de ácido
nucleico C dada que tiene o comprende un cierto % de identidad de
secuencia de ácido nucleico hacia, con o contra una secuencia de
ácido nucleico D dada) se calcula como sigue:
100 veces la
fracción
W/Z
donde W es el número de nucleótidos
marcados como coincidencias idénticas mediante el programa de
alineación de secuencia ALIGN-2 en dicha alineación
del programa de C y D, y donde Z es el número total de nucleótidos
en D. Se observará que donde la longitud de la secuencia de ácido
nucleico C no es igual a la longitud de la secuencia de ácido
nucleico D, el % de identidad de secuencia de ácido nucleico de C a
D no será igual al % de la identidad de secuencia de ácido nucleico
de D a C. Como ejemplos de cálculos de % de identidad de secuencia
de ácido nucleico, la Tabla 1C-D demuestra cómo
calcular el % de identidad de secuencia de ácido nucleico de la
secuencia de ácido nucleico designada como "ADN de comparación"
con la secuencia de ácido nucleico designada
"PRO-ADN".
A menos que se especifique de otra forma, todos
los valores de % de identidad de secuencia de ácido nucleico aquí
utilizados se obtienen como se describe con anterioridad utilizando
el programa de ordenador de comparación de secuencia
ALIGN-2. Sin embargo, el % de identidad de secuencia
de ácido nucleico también puede determinarse utilizando el programa
de comparación de secuencia NCBI-BLAST2 (Altschul
et al., Nucleic Acids Res.
25:3389-3402 (1997)). El programa de
comparación de secuencia NCBI-BLAST2 puede
descargarse en http://www.ncbi.nlm.nih.gov o de otra forma obtenerse
a partir del National Institute of Health, Bethesda, MD. El
NCBI-BLAST2 utiliza diversos parámetros de búsqueda,
donde todos aquellos parámetros de búsqueda se ajustan a valores
por defecto que incluyen, por ejemplo, "unmask = yes",
"strand = all", "expected occurrences = 10", "minimum
low complexity length = 15/5", "multi-pass
e-value = 0.01", "constant for
multi-pass = 25", "dropoff for final gapped
alignment = 25" y "scoring matrix = BLOSUM62".
En situaciones donde se emplea
NCBI-BLAST2 para comparaciones de secuencia, el % de
identidad de secuencia de ácido nucleico de una secuencia de ácido
nucleico C dada a, con o contra una secuencia de ácido nucleico D
dada (que puede alternativamente expresarse como una secuencia de
ácido nucleico C dada que tiene o comprende un cierto % de identidad
de secuencia de ácido nucleico hacia, con o contra una secuencia de
ácido nucleico D dada) se calcula como sigue:
100 veces la
fracción
X/Y
donde W es el número de nucleótidos
marcados como coincidencias idénticas mediante el programa de
alineación de secuencia NCBI-BLAST2 en dicha
alineación del programa de C y D, y donde Z es el número total
nucleótidos en D. Se observará que donde la longitud de la secuencia
de ácido nucleico C no es igual a la longitud de la secuencia de
ácido nucleico D, el % de identidad de secuencia de ácido nucleico
de C a D no será igual al % de la identidad de secuencia de ácido
nucleico de D a
C.
En otras realizaciones, las variantes de poli
nucleótidos PRO21074 son moléculas de ácido nucleico que codifican
un polipéptido PRO21074 activo y que son capaces de hibridarse,
preferentemente utilizando condiciones de hibridación y lavado
rigurosas, con secuencias de nucleótidos que codifican la totalidad
de la longitud del polipéptido PRO21074 mostrado en la figura 2 (SEQ
ID NO: 2). Las variantes de polipéptido PRO21074 pueden ser aquellas
que están codificadas mediante una variante de poli nucleótido
PRO21074.
"Aislado", cuando se emplea aquí para
describir los distintos polipéptidos, significa polipéptido que se
ha identificado y separado y/o recuperado a partir de un componente
de su ambiente natural. Preferentemente, el polipéptido aislado está
libre de asociación con todos los componentes con los cuales está
naturalmente asociado. Los componentes contaminantes de su ambiente
natural son materiales que típicamente podrían interferir con usos
diagnósticos o terapéuticos del polipéptido, y pueden incluir
enzimas, hormonas, y otros solutos proteínicos o no proteínicos. En
realizaciones preferidas, el polipéptido se purificará (1) en un
grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de secuencia de
amino ácido N-terminal o interno mediante el uso de
un secuenciador de copa giratoria, o (2) hasta la homogeneidad
mediante SDS-PAGE bajo condiciones reductoras o no
reductoras utilizando azul de Coomassie o, preferentemente,
cementación con plata. El polipéptido aislado incluye polipéptido
in situ dentro de células recombinantes; debido a que al
menos un componente del ambiente natural del PRO21074 no estará
presente. Ordinariamente, sin embargo, el polipéptido aislado se
preparará mediante al menos una etapa de purificación.
Una molécula "aislada" de ácido nucleico
que codifica un polipéptido PRO21074 es una molécula de ácido
nucleico que se identifica y se separa a partir de al menos una
molécula contaminante de ácido nucleico con la cual está
ordinariamente asociada en la fuente natural del ácido nucleico que
codifica el PRO21074. Preferentemente, el nucleico aislado está
libre de asociación con todos los componentes con los cuales está
naturalmente asociado. Una molécula aislada de ácido nucleico que
codifica al PRO21074 es diferente a la forma o combinación en la
cual se encuentra en la naturaleza. Las moléculas aisladas de ácido
nucleico por lo tanto se distinguen de la molécula aislada de ácido
nucleico que codifica al PRO21074 como existe en las células
naturales. Sin embargo, una molécula aislada de ácido nucleico que
codifica un polipéptido PRO21074 incluye moléculas de ácido nucleico
que codifica PRO21074 contenidas en células que ordinariamente
expresan PRO21074 donde, por ejemplo, la molécula de ácido nucleico
está en una localización cromosómica diferente de aquella de las
células naturales.
El término "secuencias de control" se
refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una
secuencia de codificación operativamente unida en un organismo
huésped particular. Las secuencias de control que son adecuadas
para procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente
una secuencia operativa, y un sitio de unión de ribosoma. Las
células escaritas son conocidas por utilizar promotores, señales de
poliadenilación, y potenciadores.
El ácido nucleico está "operativamente
unido" cuando está colocado en una relación funcional con otra
secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN para una guía
presecuencia o secretora está operativamente unido a ADN para un
polipéptido si está expresado como una preproteína que participa en
la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador está
operativamente unido a una secuencia de codificación si afecta la
transcripción de la secuencia; o un sitio de unión del ribosoma está
operativamente unido a una secuencia de codificación si está ubicada
de forma de facilitar la traducción. Generalmente "operativamente
unido" significa que las secuencias de ADN que se unen son
contiguas, y, en el caso de la guía de secreción, contiguas y en
fase de lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen que ser
contiguos. La unión se consigue mediante ligadura en sitios
convenientemente limitados. Si dichos sitios no existen, los
adaptadores sintéticos oligonucleótidos o montadores se utilizan de
acuerdo con la práctica
convencional.
convencional.
El término "anticuerpo" se utiliza en el
sentido amplio y cubre, específicamente, por ejemplo, anticuerpos
monoclonales anti-PRO21074 individuales (incluyendo
agonista, antagonista, y neutralizando anticuerpos), composiciones
de anticuerpos anti-PRO21074 con especificidad
poliepitópica, anticuerpos anti-PRO21074 de cadena
única, y fragmentos de anticuerpos anti-PRO21074
(ver a continuación). El término "anticuerpo monoclonal" como
se utiliza aquí se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una
población de anticuerpos substancialmente homogéneos, es decir, los
anticuerpos individuales que comprende la población son idénticos
excepto por posibles mutaciones producidas naturalmente que puede
estar presentes en cantidades menores.
La "rigurosidad" de las reacciones de
hibridación es fácilmente determinable por alguien con habilidad
ordinaria en la técnica, y generalmente es un cálculo empírico que
depende de longitud sonda, temperatura de lavado, y concentración de
sal. En general, sondas más largas requieren temperaturas más altas
para un templado adecuado, mientras que sondas más cortas necesitan
temperaturas más bajas. La hibridación generalmente depende de la
habilidad del ADN desnaturalizado para retemplarse cuando se
presentan filamentos complementarios en un ambiente por debajo de su
temperatura de fundición. A más alto el grado de homología deseado
entre la sonda y la secuencia hibridable, más alta la temperatura
relativa que puede usarse. Como resultado, se entiende que
temperaturas relativas más altas tenderían a volver más rigurosas
las condiciones de reacción, mientras que a temperaturas menores
serían menores. Para detalles y explicación adicionales de
rigurosidad de las reacciones de hibridación, ver Ausubel et
al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley
Interscience Publishers, (1995).
"Condiciones rigurosas" o "condiciones
muy rigurosas", como se definen aquí, pueden identificarse
mediante aquellas que: (1) emplean baja fuerza iónica y alta
temperatura para lavar, por ejemplo 0,015 M cloruro de sodio/0,0015
M citrato de sodio/0,1% dodecil sulfato de sodio a 50ºC; (2) emplean
durante la hibridación un agente desnaturalizante, tal como
formamida, por ejemplo, 50% (v/v) formamida con 0,1% albúmina de
suero bovino/0,1% Ficoll/0,1% polivinilpirrolidona/50 mM fosfato de
sodio tampón a pH 6,5 con 750 mM cloruro de sodio, 75 mM citrato de
sodio a 42ºC; o (3) emplean 50% formamida, 5 x SSC (0,75 M NaCl,
0,075 M citrato de sodio), 50 mM fosfato de sodio (pH 6,8), 0,1%
pirofosfato de sodio, 5 x solución Denhardt's, ADN de esperma de
salmón sonicado (50 \mug/ml), 0,1% SDS, y 10% sulfato dextran a
42ºC, con lavados a 42ºC en 0,2 x SSC (cloruro de sodio/citrato de
sodio) y 50% formamida a 55ºC, seguido por un lavado altamente
riguroso consistente en 0,1 x SSC que contiene EDTA a 55ºC.
"Condiciones moderadamente rigurosas"
pueden identificarse como describe Sambrook et al.,
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring
Harbor Press, 1989, e incluyen el uso de una solución de lavado y
condiciones de hibridación (por ejemplo, temperatura, fuerza iónica
y % SDS) menos rigurosas que aquellas descritas con anterioridad. Un
ejemplo de condiciones moderadamente rigurosas es la incubación
durante toda la noche a 37ºC en una solución que comprende 20%
formamida, 5 x SSC (150 mM NaCl, 15 mM citrato trisódico), 50 mM
fosfato de sodio (pH 7,6), 5 x solución Denhardt's, 10% sulfato
dextran, y 20 mg/ml de ADN desnaturalizado de esperma de salmón
cortado, seguido por lavado de los filtros en 1 x SSC a
aproximadamente 37-50ºC. El técnico entendido
reconocerá cómo ajustar la temperatura, fuerza iónica, etc. según
sea necesario para acomodar los factores tales como longitud de
sonda y otros.
El término "epitope marcado" cuando se
emplea aquí se refiere a un polipéptido quimérico que comprende un
polipéptido PRO21074 fusionado con un "polipéptido marcador".
El polipéptido marcador tiene suficientes residuos para proporcionar
un epitope contra el cual puede hacerse un anticuerpo, pero es
suficientemente corto de forma tal que no interfiere con la
actividad del polipéptido al cual se fusiona. El polipéptido
marcador preferentemente también es bastante único de forma que el
anticuerpo substancialmente no interactúa con otros epitopes. Los
polipéptidos marcadores adecuados generalmente tienen al menos seis
residuos de amino ácido y usualmente entre 8 y 50 residuos de amino
ácido (preferentemente, entre 10 y 20 residuos de amino ácido).
Como se emplea aquí, el término
"inmunoadhesina" designa moléculas a modo de anticuerpos que
combinan la especificidad de fijación de una proteína heteróloga
(una "adhesina") con las funciones de un efector de los
dominios constantes de inmunoglobulina. Estructuralmente, las
inmunoadhesinas comprenden una fusión de una secuencia de amino
ácido con la especificidad de fijación deseada que es distinta de la
del sitio de reconocimiento y fijación del antígeno de un anticuerpo
(es decir, es "heterólogo"), y una secuencia constante de
dominio de una inmunoglobulina. La parte de adhesina de una molécula
de inmunoadhesina típicamente es una secuencia de amino ácido
contigua que comprende al menos el sitio de fijación de un receptor
o ligando. La secuencia constante de dominio de la inmunoglobulina
en la inmunoadhesina puede obtenerse a partir de cualquier
inmunoglobulina, tal como de los subtipos IgG-1,
IgG-2, IgG-3, o
IgG-4, IgA (incluyendo IgA-1 e
IgA-2), IgE, IgD o IgM.
"Activo" o "actividad" para los
presentes propósitos se refiere aquí a forma(s) de PRO21074
que retienen una actividad biológica y/o inmunológica del PRO21074
nativo o producido naturalmente, donde actividad "biológica"
se refiere a una función biológica (ya sea inhibidora o estimulante)
provocada por un PRO21074 nativo o naturalmente producido distinta
de la habilidad de inducir la producción de un anticuerpo contra un
epitope antigénico poseído por un PRO21074 nativo o producido
naturalmente y una actividad "inmunológica" se refiere a la
actividad para inducir la producción de un anticuerpo contra un
epitope antigénico poseída por un PRO21074 nativo o producido
naturalmente. Las actividades biológicas preferidas pueden incluir,
por ejemplo, regulación de la degradación del péptido y regulación
de la fijación de matrices de proteínas.
El término "antagonista" se utiliza en el
sentido más amplio, e incluye cualquier molécula que bloquea, inhibe
o neutraliza parcial o totalmente una actividad biológica de un
polipéptido PRO21074 nativo aquí descrito. En forma similar, el
término "agonista" se utiliza en el sentido amplio e incluye
cualquier molécula que imite una actividad biológica de un
polipéptido PRO21074 aquí descrito. Las moléculas agonistas o
antagonistas adecuadas incluyen específicamente anticuerpos o
fragmentos de anticuerpos agonistas o antagonistas, fragmentos o
variantes de secuencias de amino ácido de polipéptidos PRO21074
nativo, péptidos, pequeñas moléculas orgánicas, etc. Los
procedimientos para identificar agonistas o antagonistas de un
polipéptido PRO21074 pueden comprender contactar un polipéptido
PRO21074 con una molécula agonista o antagonista candidata y medir
un cambio detectable en una o más actividades biológicas normalmente
asociadas con el polipéptido PRO21074.
"Tratamiento" se refiere tanto a
tratamiento terapéutico y profiláctico o medidas preventivas, donde
el objetivo es evitar o frenar (atenuar) la condición o desorden
patológico identificado. Aquellos en necesidad de tratamiento
incluyen tanto a aquellos que ya tienen el desorden como a aquellos
propensos a tener el desorden o aquellos en quienes debe evitarse el
desorden.
Administración "crónica" se refiere a la
administración del agente(s) en una forma continua como
opuesto a un modo agudo, para mantener el efecto terapéutico inicial
(actividad) durante un período de tiempo extendido. Administración
"intermitente" es el tratamiento que no se realiza
consecutivamente sin interrupción, pero que es bastante cíclico en
su naturaleza.
\newpage
"Mamífero" para los propósitos de
tratamiento se refiere a cualquier animal clasificado como mamífero,
incluyendo humanos, animales domésticos y de granja, y animales de
zoológico, deporte, o mascotas, tales como perros, gatos, reses,
caballos, ovejas, cerdos, cabras, conejos, etc. Preferentemente, el
mamífero es humano.
La administración "en combinación con" uno
o más agentes terapéuticos adicionales incluye administración
simultánea (concurrente) y consecutiva en cualquier orden.
"Portadores" tal como se emplea aquí
incluye portadores farmacéuticamente aceptables, excipientes, o
estabilizadores que son no tóxicos para la célula o el mamífero que
se expone al mismo en las dosis y concentraciones empleadas. Con
frecuencia el portador fisiológicamente aceptable es una solución
acuosa de pH tamponado. Ejemplos de portadores fisiológicamente
aceptables incluyen tampones tales como fosfato, citrato, y otros
ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico;
polipéptido de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10
residuos); proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina, o
inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tales como
polivinilpirrolidona; amino ácidos tales como glicina, glutamina,
asparagina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos, y otros
carbohidratos que incluyen glucosa, manosa, o dextrinas; agentes
quelantes tales como EDTA; alcoholes de azúcar tales como manitol o
sorbitol; contrapones formadores de sal tales como sodio; y/o
surfactantes no iónicos tales como TWEEN^{TM}, polietilen glicol
(PEG), y PLURONICS^{TM}.
"Fragmentos de anticuerpo" comprende una
porción de un anticuerpo intacto, preferentemente la región de
fijación del antígeno o variable del anticuerpo intacto. Ejemplos de
fragmentos de anticuerpos incluyen Fab, Fab', F(ab')_{2}, y
fragmentos Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales (Zapata et
al., Protein Eng. 8(10): 1057-1062
[1995]); moléculas de anticuerpo de cadena única; y anticuerpos
multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos.
La digestión papaínica de los anticuerpos
produce dos fragmentos idénticos de fijación de antígeno; llamados
fragmentos "Fab", cada uno con un único sitio de fijación de
antígeno, y un fragmento residual "Fc", una designación que
refleja la habilidad de cristalizar fácilmente. El tratamiento de
pepsina produce un fragmento F(ab')_{2} que tiene dos
sitios de combinación de antígeno y que todavía son capaces de
reticular un antígeno.
"Fv" es el fragmento mínimo de anticuerpo
que contiene un sitio completo de reconocimiento y fijación de
antígeno. Esta región consiste en un dímero de un dominio variable
de una cadena pesada y una ligera en asociación estrecha, no
covalente. Es en esta configuración que los tres CDRs de cada
dominio variable interactúa para definir un sitio de fijación de
anticuerpo sobre la superficie del dímero VH-VL.
Colectivamente, los seis CDRs confieren especificidad de fijación
del antígeno al anticuerpo. Sin embargo, aún un único dominio
variable (o la mitad de un Fv que comprende sólo tres CDRs
específicos para un antígeno) tiene la habilidad de reconocer y
fijar un antígeno, aunque una afinidad inferior que el sitio de
fijación entero.
El fragmento Fab también contiene el dominio
constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de
la cadena pesada. Los fragmentos Fab difieren de los fragmentos Fab'
mediante la adición de unos pocos residuos en el término carboxi del
dominio de la cadena pesada CH1 incluyendo una o más cisteínas de la
región de articulación del anticuerpo. Fab'-SH es
aquí la designación de Fab' en la cual el residuo(s) de
cisteína de los dominios constantes soporta un grupo tiol libre. Los
fragmentos de anticuerpo F(ab')_{2} originalmente eran
producidos como pares de fragmentos Fab' que tienen cisteínas
articuladas entre ellos. También se conocen otros acoplamientos
químicos de fragmentos de anticuerpos.
Las "cadenas ligeras" de anticuerpos
(inmunoglobulinas) de cualquier especie vertebrada pueden asignarse
a uno de dos tipos claramente distintos, llamados kapa y lambda,
basados en las secuencias de amino ácidos de sus dominios
constantes.
Dependiendo de la secuencia de amino ácido del
dominio constante de sus cadenas pesadas, las inmunoglobulinas
pueden asignarse a diferentes clases. Hay cinco clases principales
de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, y varias de éstas
puede además subdividirse en subclases (isotipos), por ejemplo,
IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, e IgA2.
Los fragmentos "Fv de cadena simple" o
"sFv" comprenden los dominios de anticuerpo VH y VL, donde
estos dominios están presentes en una única cadena de polipéptido.
Preferentemente, el polipéptido Fv comprende además un enlazador de
polipéptido entre los dominios VH y VL que permiten que el sFv forme
la estructura deseada para la fijación del antígeno. Para una reseña
de sFv, ver Pluckthun en The Pharmacology of Monoclonal
Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds.,
Springer-Verlag, New York, pp.
269-315 (1994).
El término "diacuerpos" se refiere a
pequeños fragmentos de anticuerpo con dos sitios de fijación de
antígeno, dichos fragmentos comprenden un dominio variable de cadena
pesada (VH) conectado con un dominio variable de cadena ligera (VL)
en la misma cadena de polipéptido (VH-VL). Mediante
el uso de un enlazador que es demasiado corto para permitir
emparejar entre los dos dominios de la misma cadena, los dominios
son forzados a aparearse con los dominios complementarios de otra
cadena y crean dos sitios de fijación de antígeno. Los diacuerpos se
describen detalladamente en, por ejemplo, EP 404,097; WO 93/11161; y
Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
90:6444-6448 (1993).
Un anticuerpo "aislado" es uno que se ha
identificado y separado y/o recuperado a partir de un componente de
su ambiente natural. Los componentes contaminantes de su ambiente
natural son materiales que pueden interferir con el diagnóstico o
los usos terapéuticos del anticuerpo, y pueden incluir enzimas,
hormonas, y otros solutos protéicos o no protéicos. En realizaciones
preferidas, el anticuerpo se purificará (1) a más de 95% en peso del
anticuerpo como se determina en el procedimiento Lowry, y más
preferentemente más del 99% en peso, (2) hasta un grado suficiente
para obtener al menos 15 residuos N-terminal o
secuencia de amino ácido interna mediante el uso de un secuenciador
de copa giratoria, o (3) hasta la homogeneidad mediante
SDS-PAGE bajo condiciones reductoras o no reductoras
utilizando azul Coomassie o, preferentemente, cementación con plata.
El anticuerpo aislado incluye anticuerpo in situ dentro de
células recombinantes; debido a que al menos un componente del
ambiente natural del anticuerpo no estará presente. Ordinariamente,
sin embargo, el anticuerpo aislado se preparará mediante al menos
una etapa de purificación.
Un anticuerpo que "se fija específicamente
a" o es "específico para" un polipéptido particular o un
epitope en un polipéptido particular es uno que se fija a un
polipéptido o epitope particular sin fijarse substancialmente a
cualquier otro polipéptido o epitope polipéptido.
La palabra "marca" cuando se utiliza aquí
se refiere a un compuesto o composición detectable que se conjuga
directa o indirectamente al anticuerpo para generar un anticuerpo
"marcado". La marca puede detectarse por sí misma (por
ejemplo, marcadores radioisótopos o marcadores fluorescentes) o, en
el caso de un marcador enzimático, puede catalizar la alteración
química de un compuesto o composición de sustrato que es
detectable.
Mediante "fase sólida" se indica una matriz
no acuosa a la cual el anticuerpo de la presente invención puede
adherirse. Los ejemplos de las fases sólidas aquí englobadas
comprenden aquellas formas parcial o totalmente de vidrio (por
ejemplo, vidrio de poro controlado), polisacáridos (por ejemplo,
agarosa), poliacrilamidas, poliestireno, polivinil alcohol y
siliconas. En ciertas realizaciones, dependiendo del contexto, la
fase sólida puede comprender el pozo de una placa de ensayo; en
otras en una columna de purificación (por ejemplo, columna de
cromatografía por afinidad). Este término también incluye una fase
sólida discontinua de partículas discretas, tales como aquellas
descritas en U.S. Patent Nº 4.275.149.
Un "liposoma" es una pequeña vesícula
compuesta de varios tipos de lípidos, fosfolípidos y/o surfactantes
que es útil para la entrega de una droga (tal como polipéptido
PRO21074 o anticuerpo) a un mamífero. Los componentes del liposoma
comúnmente se disponen en una formación bicapa, similar a la
disposición de lípidos de las membranas biológicas.
Una "pequeña molécula" se define aquí como
la que tiene un peso molecular por debajo de 500 Daltons.
El término "desorden(es)
cartilaginoso(s)" se refiere a un cartílago que manifiesta
al menos una condición patológica tal como un desarreglo metabólico,
incremento de la rotura de la matriz proteoglicana y/o reducción de
síntesis de matriz proteoglicana, que se produce como resultado de
enfermedad o lesión. Incluidos en el ámbito de "desórdenes
cartilaginosos" se hallan "desórdenes cartilaginosos
degenerativos" - una colección de desórdenes caracterizados, al
menos en parte, por degeneración o desarreglos metabólicos de los
tejidos conectivos cartilaginosos del cuerpo, incluyendo no sólo las
articulaciones o estructuras relacionadas, incluyendo músculos,
bolsa (membrana sinovial), tendones y tejido fibroso, pero también
con la placa de crecimiento. En una realización, el término incluye
"desórdenes articulares cartilaginosos" que están caracterizado
por el trastorno de la superficie articular cartilaginosa lisa y la
degradación de la matriz del cartílago. En un mamífero, los
"desórdenes articulares cartilaginosos" se manifiestan además a
través de síntomas de dolor, rigidez y/o limitación de movimiento de
las partes del cuerpo afectadas.
Incluidos dentro del ámbito de "desórdenes
articulares cartilaginosos" se hallan la osteoartritis (OA) y
artritis reumatoidea (RA). OA define no un único desorden, sino como
el camino final común de destrucción de la articulación resultante
de múltiples procesos. La OA está caracterizada por la destrucción
asimétrica localizada del cartílago acorde con alargamientos óseos
palpables en los márgenes de las articulaciones. La OA afecta
típicamente las juntas interfalángicas de las manos, la primera
articulación carpometacarpiana, las caderas, las rodillas, la
columna, y algunas articulaciones del medio del pie, mientras que
las articulaciones grandes, tales como los tobillos, codos y hombros
tienden a no afectarse. La OA puede asociarse con enfermedades
metabólicas tales como hemocromatosis y alkaptonuria, abnormalidades
del desarrollo tales como displasia del desarrollo de las caderas
(dislocación congénita de caderas), discrepancias en la longitud de
miembros incluyendo artritis traumáticas e inflamatorias tales como
gota, artritis séptica, artritis neuropática. La OA también puede
desarrollarse después de una inestabilidad biomecánica extendida,
tales como resultados de una lesión deportiva u obesidad.
La artritis reumatoidea (RA) es un desorden
sistémico, crónico, autoinmune caracterizado por sinovitis simétrica
de la articulación y afecta de forma típica por igual a
articulaciones diartroides pequeñas y grandes. Al progresar la RA,
los síntomas pueden incluir fiebre, pérdida de peso, afinamiento de
la piel, participación multiorgánica, escleritis, úlceras córneas,
la formación de nódulos subcutáneos o subperiostios e incluso muerte
prematura. Los síntomas de RA con frecuencia aparecen durante la
juventud y pueden incluir vasculitis, atrofia de la piel y del
músculo, nódulos subcutáneos, linfadenopatía, esplenomegalia,
leucopaenia y anemia crónica.
Por otra parte, el término "desorden
cartilaginoso degenerativo" puede incluir lupus eritematoso
sistémico y gota, amiloidosis o síndrome de Felty. Adicionalmente,
el término cubre la degradación del cartílago y la destrucción
asociada con artritis soriásica, inflamación aguda (por ejemplo,
artritis por yersinia, artritis por pirofosfato, artritis gotosa
(artritis úrica), artritis séptica), artritis asociadas con trauma,
enfermedad inflamatoria intestinal (por ejemplo, colitis ulcerosa,
enfermedad de Crohn, enteritis regional, ileitis distal, enteritis
granulomatosa, ileitis regiona, ileitis terminal), esclerosis
múltiple, diabetes (por ejemplo,
insulino-dependiente y no
insulino-dependiente), obesidad, artritis de células
gigantes y síndrome de Sjögren.
Ejemplos de otras enfermedades inmunes e
inflamatorias, al menos algunas de las cuales puede tratarse
mediante los procedimientos de la invención incluyen artritis
crónica juvenil, espondiloartropatías, esclerosis múltiples
(escleroderma), miopatías idiomáticas inflamatorias
(dermatomiositis), vasculitis sistémica, sarcoidosis, anemia
hemolítica autoinmune (pancitopenia inmune, hemoglobinuria paroximal
nocturna), trombocitopenia autoinmune (púrpura trombocitofénica
idiomática, trombocitofenia de mediación inmune), tiroiditis
(enfermedade de Grave, tiroiditis Hashimoto, tiroiditis linfocítica
juvenil, tiroiditis atrófica) enfermedades inflamatorias autoinmune
(por ejemplo, encefalomielitis alérgica, esclerosis múltiple,
diabetes mellitus insulino-dependiente,
uveoretinitis autoinmune, tirotoxicosis, enfermedad tiroidea
autoinmune, anemia perniciosa, rechazo de autotrasplante, diabetes
mellitus, enfermedad renal de mediación inmune (glomeruonefritis,
nefritis tubulointersticial)), enfermedades desmielinizantes de los
sistemas nerviosos central y periférico tales como esclerosis
múltiple, polineuropatía desmielinizante idiomática o síndrome de
Guillain-Barré y polineuropatías desmielinezantes
inflamatorias crónicas, enfermedades hepatobiliares tales como
hepatitis infecciosas (hepatitis A, B, C, D, E y otros virus no
hepatotrópicos), hepatitis activa autoinmune crónica, cirrosis
biliar primaria, hepatitis granulomatosa y colangitis esclerosantes,
enteropatía sensible al gluten, y enfermedad de Whipple,
enfermedades de piel autoinmunes o por mediación inmune que incluye
enfermedades de piel bulosa, eritema multiforme y dermatitis de
contacto, psoriasis, enfermedades alérgicas tales como asma, rinitis
alérgica, dermatitis atópica, hipersensibilidad alimentaria y
urticaria, enfermedades inmunológicas del pulmón tales como neumonía
eosinofílica, fibrosis pulmonar idiomática y neumonitis
hipersensible, enfermedades asociadas al transplante que incluyen
rechazo y enfermedad rechazo-versus-huésped. Enfermedades
infecciosas que incluyen enfermedades víricas tales como SIDAA
(infección HIV), hepatitis, herpes, etc., infecciones bacterianas,
infecciones protozoarias, infecciones parasíticas y virus
respiratorio sincitial, virus de inmunodeficiencia humana, etc.) y
desórdenes alérgicos, tales como hipersensibilidad anafiláctica,
asma, rinitis alérgica, dermatitis atópica, conjuntivitis
primaveral, eritema, urticaria y alergias alimentarias, etc.
"Tratamiento" es una intervención realizada
con la intención de evitar el desarrollo o alterar la patología de
un desorden. Por lo tanto, "tratamiento" se refiere tanto al
tratamiento terapéutico y profiláctico o a medidas preventivas,
donde el objeto es evitar o atenuar la progresión o de disminuir la
severidad de la condición patológica o desorden objetivo. Aquellos
en necesidad de tratamiento incluyen aquellos que ya tienen el
desorden así como aquellos en quienes debe prevenirse el desorden.
En el tratamiento de un desorden cartilaginoso, un agente
terapéutico puede directamente disminuir o incrementar la magnitud
de respuesta a un componente patológico del desorden, o volver más
susceptible la enfermedad al tratamiento con otros agentes
terapéuticos, por ejemplo, anticuerpos, antifúngicos, agentes
antiinflamatorios, quimioterápicos, etc.
El término "cantidad efectiva" es al menos
la concentración mínima de PRO21074 o antagonista del mismo que
causa, induce o resulta tanto en una mejora detectable o reparación
en el cartílago dañado o proporciona un grado medible de protección
de la destrucción continua o inducida de cartílago (por ejemplo,
retención de proteoglicanos en la matriz, inhibición de liberación
de proteoglicanos desde la matriz, estimulación de síntesis de
proteoglicanos). Alternativamente, la actividad biológica puede
cuantificarse mediante la medición del efecto del PRO21074 o
antagonistas del mismo sobre el cultivo celular de cartílago y
comparando la fisiología celular y tisular (es decir, crecimiento
celular, supervivencia, unión, montaje de la matriz, etc.) en
comparación con controles no tratados. Por otra parte, una
"cantidad terapéutica efectiva" es al menos la concentración
mínima (cantidad) de polipéptido PRO21074 o antagonista administrado
a un mamífero que pueden ser efectivos en al menos atenuar un
síntoma patológico (por ejemplo, causar, inducir o resultar tanto en
una mejora detectable o reparar cartílago articular dañado o causar,
inducir o resultar en una protección medible de la destrucción
continuada o inicial del cartílago, mejora en el rango de
movimiento, reducción del dolor, etc.) que se produce como resultado
de lesión o de un desorden cartilagi-
noso.
noso.
El "agente cartilaginoso" puede ser un
factor de crecimiento, citoquina, molécula pequeña, anticuerpo,
pieza de ARN o ADN, partícula vírica, péptido, o químico que tiene
un efecto benéfico sobre el cartílago, incluyendo factores de
crecimiento peptídicos, antagonistas catabólicos, factores
antiinflamatorios, y aquellos que afectan el hueso y/o sinovio.
Alternativamente, "agente cartilaginoso" puede ser un factor de
crecimiento peptídico -tal como cualquiera de los factores de
crecimiento fibroblástico (por ejemplo, FGF-1,
FGF-2,... FGF-21, etc.), IGFs, (I y
II), TGF-\betas (1-3), BMPs
(1-7), o elemento de la familia de factores de
crecimiento epidérmico tales como EGF, HB-EGF,
TGF-\alpha- que pueden potenciar la respuesta
reparadora intrínseca del cartílago, por ejemplo mediante la
alteración de la proliferación, diferenciación, migración, adhesión,
o producción de matriz mediante condrocitos. Alternativamente, un
"agente cartilaginoso" puede ser un factor que antagoniza con
el catabolismo del cartílago (por ejemplo, IL-1
antagonista receptor (IL-1 ra), inhibidores NO,
inhibidores IL-1\beta convertasa (ICE), factores
inhibidores de la actividad de IL-6,
IL-8, LF, IFN-\gamma, actividad de
TNF-\alpha, tetraciclinas y variantes de las
mismas, inhibidores de apoptosis, inhibidores MMP, inhibidores
agrecanasa, inhibidores de serina y proteasas cisteína tales como
catepsinas, y activadores uroquinasa o
tejido-plasminogen (uPA o tPA). Más
alternativamente, "agente cartilaginoso" incluye factores que
actúan indirectamente sobre el cartílago afectando el hueso
subyacente (es decir, osteofactores, por ejemplo biofosfonatos,
osteoprotegerin), o el sinovio circundante (es decir, factores
sinoviales) o factores antiinflamatorios (es decir,
anti-TNF-\alpha, IL1ra,
IL-10, NSAIDs). Para un repaso de ejemplos de
agentes cartilaginosos, ver Martel-Pelletier et
al., Front. Biosci. 4: d694-703
(1999); Hering, T.M., Front. Biosci.
4:d743-761
(1999).
(1999).
Las "Técnicas quirúrgicas estándar" son
procedimientos quirúrgicos que se emplean comúnmente para
manipulaciones terapéuticas del cartílago, que incluyen: afeitado
del cartílago, abrasión condroplástica, reparación láser,
desbridamiento, condroplastia, microfractura con o sin penetración
ósea subcondrial, mosaicoplastia, autotrasplante de células
cartilaginosas, autotrasplante de células madre, autotrasplante de
cartílagos costales, estimulación química, estimulación eléctrica,
autotrasplantes periocondriales, autotrasplante de periostio,
andamios cartilaginosos, autotrasplante u homoinjerto shee
(osteoarticular), o osteotomía. Estas técnicas se reseñan y se
describen con mayor detalle en Frenkel et al., Front.
Bioscience 4: d671-685 (1999).
Administración "crónica" se refiere a la
administración en un modo continuo como opuesto a un modo agudo,
para mantener el efecto terapéutico inicial (actividad) durante un
período extendido de tiempo. Administración "intermitente" es
el tratamiento que se realiza no consecutivamente sin interrupción,
pero que es bastante cíclico en su naturaleza.
La "patología" de un desorden cartilaginoso
incluye cualquier fenómeno fisiológico que compromete el bienestar
de la entidad afectada. Esto incluye, sin limitación, la destrucción
del cartílago, reparación disminuida del cartílago, crecimiento o
diferenciación celular anormal o incontrolable, producción de
anticuerpos, producción de auto-anticuerpos,
producción y activación de complemento, interferencia con el normal
funcionamiento de células vecinas, producción de citoquina u otros
productos de secreción en niveles anormales, supresión o
agravamiento de cualquier respuesta inflamatoria o inmunológica,
infiltración de células inflamatorias (netrofílicas, eosinofílicas,
monolíticas, linfocíticas) en los espacios titulares, inducción de
dolor, o cualquier efecto tisular que resulte en discapacidad de la
función o movilidad articular.
"Actividad biológica" para los presentes
propósitos se refiere aquí a la habilidad del polipéptido PRO21074 o
antagonistas del mismo para promover la regeneración y/o evitar la
destrucción del cartílago. Opcionalmente, el cartílago es cartílago
articular y la regeneración y/o destrucción del cartílago se asocia
con una lesión o un desorden cartilaginoso. Por ejemplo, la
actividad biológica puede cuantificarse mediante la medición del
efecto de PRO21074 sobre un cultivo de células de cartílago y
comparando la fisiología celular y tisular (es decir, crecimiento
celular, supervivencia, unión, montaje de la matriz, etc.) en
comparación con controles no tratados. Alternativamente, la
actividad biológica puede cuantificarse mediante la inhibición de la
liberación de proteoglicano (PG) desde el cartílago, el incremento
en la síntesis de PG en el cartílago, la inhibición de la producción
de óxido nítrico (NO), etc.
El término "modular" significa afectar (es
decir, tanto sobreregular, subregular o controlar de otra forma) la
respuesta de un camino de señalización. Los procesos celulares bajo
el control de transducción de señal incluyen, pero no están
limitados, a la transcripción de genes específicos, funciones
celulares normales, tales como metabolismo, proliferación,
diferenciación, adhesión, apoptosis, y supervivencia, así como
procesos anormales, tales como transformación,
des-diferenciación y metástasis.
El término "células en y alrededor de las
articulaciones" incluye células que pueden afectar, causar o
jugar un papel en la formación, reparación, regeneración o soporte
del tejido cartilaginoso. Incluidas en el ámbito de este término
están los condrocitos, sinoviocitos, fibroblastos, células dentro de
los tendones o ligamentos, osteoblastos o mioblastos.
Las Tablas 1A-D muestran
ejemplificaciones hipotéticas para utilizar el procedimiento que se
describe a continuación para determinar el % de identidad de
secuencia de amino ácido (Tablas 1A-B) y el % de
identidad de secuencia de ácido nucleico (Tablas
1C-D) utilizando el programa de ordenador de
alineación de secuencia ALIGN-2, donde "PRO"
representa la secuencia de amino ácido de un polipéptido PRO21074
hipotético de interés, "Proteína de comparación" representa la
secuencia de amino ácido de un polipéptido con el cual se compara el
polipéptido "PRO" de interés, "PRO-DNA"
representa una secuencia de ácido nucleico que codifica PRO21074 de
interés, "ADN de comparación" representa la secuencia de
nucleótido de una molécula de ácido nucleico con la cual se compara
la molécula de ácido nucleico de "PRO-ADN" de
interés, "X", "Y" y "Z" representan cada uno
diferentes residuos de amino ácidos hipotéticos y "N", "L"
y "V" representan cada uno diferentes nucleótidos
hipotéticos.
La Tabla 2 proporciona el código fuente completo
del programa de ordenador de comparación de secuencia
ALIGN-2. Este código fuente puede recopilarse
rutinariamente para su empleo en un sistema operativo UNIX para
proporcionar el programa de ordenador de comparación de secuencia
ALIGN-2.
La artritis reumatoidea (RA) es una enfermedad
sistémica, autoinmune, degenerativa que causa trastornos en sinovium
tanto de articulaciones diartroideales grandes y pequeñas por igual.
Cuando la enfermedad progresa, los síntomas de RA pueden incluir
fiebre, pérdida de peso, afinamiento de la piel, implicación
multiorgánica, escleritis, úlceras córneas, la formación de nódulos
subcutáneos o subperiostios y muerte prematura. En contraste con la
OA, los síntomas de la RA aparecen durante la juventud, las
manifestaciones extra articulares pueden afectar cualquier sistema
orgánico, y la destrucción de las articulaciones es simétrica y se
produce tanto en articulaciones grandes como pequeñas por igual. Los
síntomas extra articulares pueden incluir vasculitis, atrofia de la
piel y el músculo, nódulos subcutáneos, linfadenopatía,
esplenomegalia, leucopenia y anemia crónica. Por otra parte, la RA
es de naturaleza heterogénea con una expresión de enfermedad
variable y se asocia con la formación de factor reumatoide en suero
en 90% de los pacientes en algún momento durante el transcurso de la
enfermedad.
Curiosamente, pacientes con RA también tienen un
sistema inmune hiperactivo. La gran mayoría de gente con RA tiene
una susceptibilidad genética asociada con la activación incrementada
de moléculas del complejo principal de histocompatibilidad de clase
II en monolitos y macrófagos. Estas moléculas del complejo de
histocompatibilidad están implicadas en la presentación de antígeno
de las células T activadas que llevan receptores para estas
moléculas de clase II. La predisposición genética de RA se soporta
mediante la prevalencia del antígeno leucocito altamente conservado
DR subtipo Dw4, Dw14 y Dw15 en pacientes humanos con enfermedad muy
severa.
Los monolitos y macrófagos activados, al
interactuar con las células T apropiadas, estimulan una cascada de
eventos que incluyen otra activación de monolitos y macrófagos
adicionales, células T, células B y células endoteliales. Con la
sobreregulación de las moléculas de adhesión, células mononucleares
y células polinucleares adicionales son atraídas a la articulación
inflamada. Este influjo estimula la secreción de citoquinas
quimiotácticas, potenciando así el influjo de las células
inflamatorias en el sinovio y el líquido sinovial.
La osteoartritis (OA) es una enfermedad
degenerativa localizada que afecta cartílago y hueso articular y
resulta en dolor y disminución de la función articular. OA puede
clasificarse en dos tipos: primaria y secundaria. La OA primaria se
refiere al espectro de enfermedades degenerativas de la articulación
para las cuales no se ha determinado una etiología subyacente.
Típicamente, la articulación afectada por OA primaria son las
articulaciones interfalanges de las manos, las primeras
articulaciones carpometacarpianas, las caderas, las rodillas, la
columna y algunas articulaciones en el pie medio. Curiosamente,
parece que las articulaciones grandes, tales como los tobillos,
codos y hombros tienden a ser indemnes a la OA primaria. En
contraste, la OA secundaria se produce con frecuencia como resultado
de una lesión o trauma definidos. La artritis secundaria también
puede encontrarse en individuos con enfermedades metabólicas tales
como hemocromatosis y alcaptonuria, anormalidades del desarrollo
tales como displacia de cadera (dislocación congénita de cadera) y
discrepancias de longitud de los miembros, obesidad, artritis
inflamatoria tal como artritis reumatoide o gota, artritis séptica y
artritis neuropáticas.
OA es un desorden progresivo, degenerativo. La
degradación asociada con OA inicialmente aparece como desgaste y
fibrilación de la superficie articular del cartílago cuando los
proteoglicanos se pierden desde la matriz. Con el uso continuo de
la articulación, la superficie de fibrilación progresa, los defectos
penetran más profundamente dentro del cartílago, y se pierden piezas
de tejido cartilaginoso. Además, el hueso subyacente bajo el
cartílago (hueso subcondrial) se engrosa, y, como el cartílago se
pierde, el hueso lentamente queda expuesto. Con la destrucción
asimétrica del cartílago, puede producirse la desfiguración. Los
nódulos óseos, llamados osteofitas, se forman con frecuencia en la
periferia de la superficie del cartílago y ocasionalmente crecen
sobre las áreas erosionadas adyacentes. Si se penetra la superficie
de dichos brotes óseos, puede producirse crecimiento vascular y
provocar la formación de tapones de tejido que contienen
fibrocartílago.
Debido a que el cartílago es avascular, el daño
que se produce en la capa de cartílago pero no penetra en el hueso
subcondral, deja el trabajo de reparación a los condrocitos
residentes, que tienen un potencial intrínseco de replicación
pequeño. Sin embargo, cuando se penetra el hueso subcondral, su
suministro vascular permite que tenga lugar un proceso de reparación
trifásico. El cartílago subóptimo que se sintetiza en respuesta a
este tipo de daño, calificado aquí como "fibrocartílago" debido
a su matriz fibrosa, tiene propiedades bioquímicas y mecánicas
subóptimas, y por lo tanto es sometido a desgaste y destrucción
adicionales. En una articulación enferma o dañada, la liberación
incrementada de metaloproteínas (MMPs) tales como colagenasas,
gelatinazas, estromelisinas, agrecanasas, y otras proteasas,
conducen a mayor adelgazamiento y pérdida del cartílago. Estudios
in vitro han mostrado que las citoquinas tales como
IL-1\alpha, IL-1\beta,
TNF-\alpha, PDGF, GM-CSF,
IFN-\gamma, TGF-\beta, LIF,
IL-2 e IL-6, IL-8
pueden alterar la actividad de las células sinoviales a modo de
fibroblastos, macrófago, células T, y/o osteoclastos, y estas
citoquinas pueden por lo tanto tener efectos indirectos sobre la
renovación de la matriz del cartílago in vivo. Como tales,
cualquiera de estas citoquinas puede amplificar y perpetuar un ciclo
destructivo de la degeneración de la articulación in vivo. De
hecho, la inhibición de la actividad de IL-2 o
TNF-\alpha en animales artríticos y humanos ha
mostrado ser una forma efectiva en la cual al menos lentificar la
progresión de la artritis. Mientras que los eventos de iniciación en
RA y OA son claramente diferentes, la pérdida subsecuente de
cartílago y hueso en estos dos desórdenes degenerativos parecen
implicar muchas de las mismas citoquinas y proteinasas.
Las propiedades mecánicas del cartílago se
determinan mediante su composición bioquímica. Mientras que la
arquitectura del colágeno contribuye a la fuerza de tensión y
rigidez de un cartílago, la compresibilidad (o elasticidad) se debe
a su componente proteoglicano. En el cartílago articular saludable,
predomina el colágeno tipo II (comprendiendo aproximadamente
90-95%), sin embargo, cantidades pequeñas de
colágeno de tipo V, VI, IX y XI también están presentes. Los
proteoglicanos del cartílago (PG) incluye PG hidrodinámicamente
mayor, de agregación con glicosaminoglicanos sulfatados unidos
covalentemente, así como PC hidrodinámicamente más pequeños no de
agregación tales como decorin, biglicano y lumicano.
Las lesiones del cartílago entran en tres
categorías: (1) microdaño o trauma cerrado, (2) fracturas condrales,
y (3) fracturas osteocondrales.
El microdaño a los condrocitos y la matriz del
cartílago pueden ser causados por un impacto único, a través de
trauma cerrado repetitivo, o con el uso continuo de una articulación
biomecánicamente inestable. De hecho, cambios metabólicos y
bioquímicos tales como aquellos encontrados en las etapas tempranas
de la artritis degenerativa puede replicarse en modelos animales
mediante la carga repetitiva del cartílago articular. Radin et
al., Clin. Orthop. Relat. Res. 131:
288-93 (1978). Tales experimentos, junto con el
patrón distintivo de pérdida de cartílago hallada en las
articulaciones artríticas, subrayan el papel que la carga
biomecánica juega en la pérdida de homeostasis e integridad del
cartílago articular en la enfermedad. Radin et al., J.
Orthop. Res. 2: 221-234 (1984); Radin
et al., Semin. Arthritis. Rheum. (suppl. 2)
21:12-21 (1991); Wei et al., Acta
Orthop. Scand. 69: 351-357 (1998).
Mientras que los condrocitos inicialmente pueden ser capaces de
reponer la matriz cartilaginosa con proteoglicanos a una tasa basal,
el daño concurrente de la red de colágeno puede incrementar la tasa
de pérdida y resultar en una degeneración irreversible. Buckwalter
et al., J. Am. Acad. Orthop. Surg. 2:
192-201 (1994).
Las fracturas condrales se caracterizan por el
trastorno de la superficie articular sin violación de la placa
subcondral. Se produce la necrosis condrocítica en el sitio de
lesión, seguida por el incremento de actividad mitótica y
metabólica de los condrocitos supervivientes que bordean la lesión
que condicen a la alineación de las grietas de la superficie
articular con el tejido fibroso. El incremento de la actividad
condrocítica es transitoria, y la respuesta reparadora resulta en
una cantidad y calidad insuficientes de los nuevos componentes de la
matriz.
Las fracturas osteocondrales, las más serias de
los tres tipos de lesiones, son lesiones que cruzan el límite dentro
de la placa subcondral subyacente. En este tipo de lesión, la
presencia de vascularización subcondral provoca la respuesta en tres
fases típicamente hallada en tejidos vasculares: (1) necrosis, (2)
inflamación, y (3) reparación. Inicialmente la lesión se llena con
sangre y coágulos. El coágulo de fibrina resultante activa una
respuesta inflamatoria y se vuelve tejido vascularizado de
reparación, y los distintos componentes celulares liberan factores
de crecimiento y citoquinas que incluyen factor de crecimiento beta
transformador (TGF-beta), factor de crecimiento
derivado de plaquetas (PDGF), proteínas óseas morfogénicas, y
factores de crecimiento a modo de insulina I y II. Buckwalter et
al., J. Am. Acad. Orthop. Surg.
2:191-201 (1994).
\newpage
La respuesta reparadora inicial asociada con
fracturas osteocondrales se caracteriza por el reclutamiento,
proliferación y diferenciación de precursores en condrocitos. Las
células madres mesenquimales se depositan en la red de fibrina, que
eventualmente se transforma en una zona fibrocartilaginosa. F.
Shapiro et al., J. Bone Joint Surg.
75:532-53 (1993); N. Mitchell and N. Shepard,
J. Bone Joint Surg. 58:230-33 (1976).
Estas células madre que se cree provienen de la médula del hueso
subyacente más que de la superficie articular adyacente,
progresivamente se diferencia en condrocitos. Entre seis y ocho
semanas después de la lesión, el tejido reparador contiene células a
modo de condrocitos en una matriz de proteoglicanos y colágeno
predominantemente de tipo II, con algún colágeno de tipo I. T.
Furukawa et al., J. Bone Joint Surg. 62:
79-89 (1980); J. Cheung et al., Arthritis
Rheum. 23: 211-19 (1980); S.O. Hjertquist
& R. Lemperg, Calc. Tissue Res. 8:
54-72 (1971). Sin embargo, esta matriz recién
depositada degenera y el tejido condroidal es reemplazado por más
tejido fibroso y fibrocartílago y un cambio en la síntesis de
colágeno del tipo II al tipo I. H.S. Cheung et al., J.
Bone Joint Surg. 60: 1076-81 (1978); D.
Hamerman, "Prospects for medical intervention in cartilage
repair", Joint cartilage degradation: Basic and clinical
aspects, Eds. Woessner JF et al., (1993); Shapiro et
al., J. Bone Joint Surg. 75:
532-53 (1993); N. Mitchell & N. Shepard, J.
Bone Joint Surg. 58: 230-33 (1976); S.O.
Hjertquist & R. Lemperg, Calc. Tissue Res. 8:
54-72 (1971). Los primeros cambios degenerativos
incliyen la fibrilación de la superficie, reducción de
proteoglicanos, condrocitos clonados y muertos y fisurado vertical
desde las capas superficiales a las profundas. Un año posterior a la
lesión, el tejido reparador es una mezcla de fibrocartílago y
cartílago hialino, con una cantidad substancial de colágeno de tipo
I, que no se encuentra en cantidades apreciables en el cartílago
articular normal. T. Furukawa, et al., J. Bone Joint
Surg. 62: 79-89 (1980).
Desde un punto de vista clínico, el tejido
reparador fibrocartilaginoso puede funcionar satisfactoriamente
durante un cierto período de tiempo. Sin embargo, el fibrocartílago
tiene propiedades biomecánicas inferiores relativas a las del
cartílago hialino normal. Las fibras de colágeno se disponen en una
orientación errática con un módulo de elasticidad inferior que en el
cartílago hialino normal. J. Colletti et al., J. Bone
Joint Surg. 54:147-60 (1972). La
permeabilidad del tejido reparador también es elevada, reduciendo
así la capacidad de transporte de carga de la presión de fluido del
tejido. H. Mankin et al., "Form and Function of Articular
Cartilage", Orthopaedic Basic Science, Ed: Simon &
Schuster, American Academy of Orthopeadic Surgeons, Rosemont, IL
(1994). Estos cambios resultan en una deformación viscoelástica
incrementada, haciendo que el tejido reparador sea menos capaz de
soportar cargas repetitivas que el cartílago articular normal. Se ha
informado que los niveles de glicosaminoglicano (GAG) en el
cartílago adyacente a los defectos osteocondriales se reducen
aproximadamente a 42% de los valores normales, indicando que la
lesión conduce a la degeneración más allá del defecto inicial.
Osteoarthritis Cartilage 3:61-70
(1995).
El transplante de condrocitos, las células
responsables de secretar la matriz del cartílago, también se ha
sugerido como medio de realizar la reparación del cartílago. Sin
embargo, las desventajas de los transplantes alogénicos, es decir la
posibilidad de la respuesta inmunogénica del huésped así como la
transmisión de enfermedades víricas y otras enfermedades
infecciosas, realmente ha limitado el ámbito del transplante
alogénico de condrocitos. A pesar que estos riesgos pueden
minimizarse mediante el uso del tejido o células propios del
paciente, este procedimiento requiere cirugía adicional, creación de
una nueva lesión en el cartílago del paciente, y un cultivo y
crecimiento celular caro de las células específicas del
paciente.
Cuando se cultiva como monocapas sobre placas de
cultivo de tejido, los condrocitos aislados se
des-diferenciarán, y con el tiempo de cultivo, se
parecerán a los fibroblastos. Por ejemplo, la producción de
colágeno cambiará desde predominantemente el tipo II a tipo I, y las
células sintetizarán una proporción incrementada de ácido
hialurónico relativa al contenido total de glicosaminoglicano (GAG).
W. Green, Clin. Orthop. Relat. Res. 124:
237-50 (1977). Sin embargo, los condrocitos que
crecen en geles de colágeno o como agregados de cultivo mantendrán
una morfología normal, proteoglicano y síntesis de colágeno II así
como retendrán su habilidad de acumular matriz metacromática in
vitro. Por lo tanto, bajo estas condiciones, los condrocitos
permanecerán relativamente diferenciados y fenotípicamente estables
durante varias semanas in vitro. T. Kimura et al.,
Clin. Orthop. Relat. Res. 186:
231-39 (1984).
Las dificultades y gastos asociados con el
cultivo de condrocitos ha llevado al diseño de implantes sembrados
de condrocitos o libres de células para la reparación del cartílago
articular utilizando una variedad de biomateriales, incluyendo hueso
desmineralizado o tratado enzimáticamente, L. Dahlberg et
al., J. Orthop. Res. 9: 11-19
(1991); B.C. Toolan et al., J. Biomed. Mat. Res. 41:
244-50 (1998); ácido poliláctico, C.R. Chu et
al., J. Biomed Mat. Res. 29:
1147-54 (1995); ácido poliglicólico, C.A. Vacanti
et al., Mat. Res. Soc. Symp. Proc. 252:
367-74 (1992); hidroxiapaptita/compuestos de Dacron,
K. Messner & J. Gillquist, Biomaterials 14:
513-21 (1993); fibrina, D.A. Hendrickson et
al., J. Orthop. Res. 12: 485-97
(1994); geles de colágeno, D. Grande et al., J. Orthop.
Res. 7: 208-18 (1989), S. Wakitani
et al., J. Bone Joint Surg. 71:
74-80 (1989), S. Wakitani et al., J. Bone
Joint Surg. 76: 579-92 (1994); y fibras
de colágeno, J.M. Pachence et al., "Development of a tissue
analog for cartilage repair", Tissue inducing biomaterials, Eds,
L. Cima & E. Ron, Materials Research Soc. Press, Pittsburgh, PA
(1992); B.C. Toolan et al., J. Biomed. Mat.
Res. 31: 273-80 (1996). Tejidos
alternativos empleados incluyen tejido sinovial, A.G. Rothwell,
Orthopedics 13: 433-42 (1990); o tejidos
ricos en células madres mesenquimales (es decir, médula ósea o
tejido periostio), K. Messner & J. Gillquist, Mat. Res. Soc.
Symp. Proc. 252: 367-74 (1992).
El presente procedimiento también puede
administrarse en combinación con cualquier técnica quirúrgica
estándar de cartílago. Las técnicas quirúrgicas estándar son
procedimientos quirúrgicos que se emplean comúnmente para
manipulaciones terapéuticas del cartílago, que incluyen: afeitado
del cartílago, abrasión condroplástica, reparación láser,
desbridamiento, condroplastia, microfractura con o sin penetración
del hueso subcondrial, mosaicoplastia, transplantes alográficos de
células cartilaginosas, transplantes alográficos de células madre,
transplantes alográficos costales, estimulación química,
estimulación eléctrica, transplantes alográficos pericondriales,
transplantes alográficos del periostio, andamios cartilaginosos,
transplantes alográficos o autográficos de concha (osteoarticular),
u osteotomía. Estas técnicas se describen y se discuten con mayor
detalle en Frenkel et al., Front. Bioscience 4:
d671-685 (1999).
En combinación con o en compensación de la
ingeniería tisular, la administración de agentes de cartílago (es
decir, factores de crecimiento peptídicos) se ha considerado como
una forma de aumentar la reparación del cartílago. Los factores de
crecimiento peptídicos son reguladores muy significativos de la
diferenciación celular, migración, adhesión y metabolismo
cartilaginoso. F. S. Chen et al., Am J. Orthop.
26: 396-406 (1997). Debido a que los agentes
de cartílago son proteínas solubles de masa molecular relativamente
pequeña y son rápidamente absorbidos y/o degradados, existe un gran
desafío en hacerlos disponibles para las células en cantidad
suficiente y durante una duración suficiente. Las proteínas
secretadas pueden por lo tanto necesitar ser incorporadas dentro de
dispositivos de ingeniería, implantables para una efectividad
máxima. El vehículo de suministro ideal es biocompatible,
reabsorbible, tiene las propiedades mecánicas adecuadas y se degrada
en subproductos no tóxicos.
Diversos péptidos secretados tienen el potencial
de inducir la reparación del cartílago huésped sin transplante de
células. El factor de crecimiento a modo de insulina
(IGF-1) estimula tanto la síntesis de matriz como la
proliferación celular en el cultivo, K. Osborn. J. Orthop.
Res. 7: 35-42 (1989), y una insuficiencia
de IGF-1 puede tener un papel etiológico en el
desarrollo de la osteoartritis. R.D. Coutts, et al.,
Instructional Course Lect. 47: 487-94,
Amer. Acad. Orthop. Surg. Rosemont, IL (1997). Algunos
estudios indican que las concentraciones en suero de
IGF-1 son menores en pacientes con osteoartritis que
en grupos de control, mientras que otros estudios no han encontrado
diferencias. Sin embargo, tanto los niveles de IGF-1
y la respuesta de los condrocitos al IGF-1
disminuyen con la edad. J.R. Florini & S.B. Roberts, J.
Gerontol. 35: 23-30 (1980). Por lo tanto,
tanto la disponibilidad disminuida de IGF-1 como la
respuesta disminuida de los condrocitos al IGF-1
pueden contribuir a la homeostasis del cartílago y conducir a la
degeneración con la edad avanzada.
El IGF-1 se ha propuesto para el
tratamiento o la prevención de la osteoartritis. De hecho, la
administración intraarticular de IGF-1 en
combinación con polisulfato pentosan de sodio (un inhibidor
catabólico de la actividad del condorcito) provoca una apariencia
histológica mejorada, y niveles cercanos a los normales de enzimas
degradativas (metaloproteinasas neutrales y colagenasa), inhibidores
titulares de metaloproteinasa y colágeno matricial. R.A.
Rogachefsky, et al., Ann. N. Y. Acad. Sci. 732:
889-95 (1994). El uso de IGF-1 tanto
solo como coadyuvante con otros factores de crecimiento para
estimular la regeneración del cartílago se ha descrito en WO
91/19510, WO 92/13565, US 5,444,047, EP 434,652.
Las proteínas morfogenéticas óseas (BMPs) son
elemento del factor de crecimiento beta transformador
(TGF-\beta) de la gran familia de factores de
crecimiento. Estudios in vitro e in vivo han mostrado
que las BMPs inducen la diferenciación de las células mesenquimales
en condrocitos. K. Sato & M. Urist, Clin. Orthop. Relat.
Res. 183: 180-87 (1984). Además, el
factor de crecimiento esquelético y los factores de crecimiento
derivados del cartílago tienen efectos sinérgicos con las BMP, como
la combinación de estos factores de crecimiento con BMP y hormona de
crecimiento inicia la diferenciación de células mesenquimales. La
proliferación subsiguiente de las células diferenciadas es
estimulada por otros factores. D.J. Hill & A. Logan, Prog.
Growth Fac. Res. 4: 45-68 (1992).
El factor de crecimiento transformador beta
(TGF-\beta) es producido por osteoblastos,
condrocitos, plaquetas, linfocitos activados, y otras células. R.D.
Coutts et al., supra. El TGF-\beta
puede tener tanto propiedades estimulantes como inhibidoras sobre la
síntesis de matriz y la proliferación celular dependiendo de la
célula objetivo, dosis, y condiciones de cultivo celular. P. Guerne
et al., J. Cell Physiol. 158:
476-84 (1994); H. Van Beuningen et al.,
Ann. Rheum. Dis. 52: 185-91 (1993); P.
Van der Kraan et al., Ann. Rheum. Dis. 51:
643-47 (1992). Además, como con
IGF-1, la capacidad de respuesta a
TGF-\beta decrece con la edad. P. Guerne et
al., J. Cell Physiol. 158: 476-84
(1994). Sin embargo, TGF-\beta es un estimulador
más potente de la proliferación de condrocitos que otros factores de
crecimiento, incluyendo el factor de crecimiento derivado de
plaquetas (PDGF), bFGF, e IGF-1 (Guerne et
al., supra), y puede estimular la producción de
proteoglicano por los condrocitos. El TGF-\beta
también regula a la baja los efectos de las citoquinas que estimulan
el catabolismo de los condrocitos. Van der Kraan et al.,
supra. in vivo, TGF-\beta induce la
proliferación y diferenciación de las células mesenquimáticas en
condrocitos y potencia la reparación de defectos de grosor parcial
en cartílago articular de conejo. E.B. Hunziker & L. Rosenberg,
Trans. Orthopaed. Res. Soc. 19: 236 (1994).
Se cree que la degradación de la matriz del
cartílago se debe a la fisura de las moléculas de la matriz
(proteoglicanos y colágenos) mediante las proteasas (reseñado por
Woessner JF Jr., "Proteases of the extracellular matrix", en
Mow, V., Ratcliffe, A. (eds): Structure and Function of Articular
Cartilage. Boca Raton, FL, CRC Press, 1994 y Smith R.L., Front.
In Biosci. 4:d704-712. Mientras que las
enzimas clave implicadas en la rotura de la matriz aún no se han
identificado claramente, las metaloproteínas de la matriz (MMPs) y
"agrecanasas" parecen jugar papeles clave en la destrucción
articular. Además, elementos de la familia de proteinasas de la
serina y la cisteína, por ejemplo la catepsia y uroquinasa o el
activador del plasminogen tisular (uPA y tPA) también pueden estar
implicados. Plasmita, activador uroquinasa del plasminogen (uPA) y
el activador del plasminogen tisular (tPA) pueden jugar un papel
importante en el camino de activación de las metaloproteinasas. La
evidencia conecta el grupo muy relacionado de catepsia B, L y S a la
rotura de matriz, y estas catepsias son incrementadas de alguna
forma en OA. Varias citoquinas, incluyendo IL-1,
TNF-\alpha y LIF inducen la expresión de MMP en
condrocitos. La inducción de MMPs puede antagonizarse mediante
TGF-\beta y se potencia, al menos en conejos, por
FGF y PDGF. Como se muestra en estudios animales, los inhibidores de
estas proteasas (MMP y agrecanasas) pueden al menos proteger
parcialmente del daño al tejido articular in vivo.
Otros procedimientos de estimulación de la
reparación del cartílago incluyen el bloqueo de los efectos de
moléculas que están asociadas con la destrucción del cartílago. Por
ejemplo, tanto IL-1 (-\alpha y -\beta) y el
óxido nítrico son sustancias con efectos catabólicos conocidos sobre
el cartílago. La citoquina IL-1 produce rotura del
cartílago, incluyendo la generación de inflamación sinovial y
sobre-regulación de las metaloproteinasas y
agrecanasas de la matriz. V. Baragi, et al., J. Clin.
Invest. 96: 2454-60 (1995); V.M. Baragi
et al., Osteoarthritis Cartilage 5:
275-82 (1997); C.H. Evans et al., J. Leukoc.
Biol. 64: 55-61 (1998); C.H Evans and
P.D. Robbins, J. Rheumatol. 24:
2061-63 (1997); R. Kang et al., Biochem.
Soc. Trans. 25: 533-37 (1997); R. Kang
et al., Osteoarthritis Cartilage 5:
139-43 (1997). Debido a que se encuentran altos
niveles de IL-1 en articulaciones enfermas y se cree
que el IL-1 juega un papel de pivote en la
iniciación y desarrollo de la artritis, la inhibición de la
actividad IL-1 puede demostrar que es una terapia
exitosa. En mamíferos sólo una proteasa, llamada interleuquina 1
\beta-convertasa (ICE), puede generar
específicamente IL-1\beta maduro, activo. Se ha
mostrado que la inhibición de ICE bloquea la producción de
IL-1\beta y puede lentificar la degeneración
artrítica (reseñado por Martel-Pelletier J. et
al., Front. Biosci. 4: d694-703).
El receptor antagonista soluble IL-1
(IL-1ra), una proteína producida naturalmente que
puede inhibir los efectos del IL-1 mediante la
prevención de la interacción entre el IL-1 con los
condrocitos, también ha mostrado ser efectivo en modelos animales de
artritis y actualmente se está evaluando en humanos por su habilidad
para prevenir la incidencia o progresión de la artritis.
El óxido nítrico (NO) se ha implicado jugando un
papel en la destrucción del cartílago. Attur et al.,
Arthritis & Rheum. 40: 1050-1053
(1997); Ashok et al., Curr. Opin. Rheum. 10:
263-268 (1998). A diferencia del cartílago normal
que no produce NO a menos que se estimule con citoquinas tales como
IL-1\alpha, el cartílago obtenido a partir de
articulaciones osteoartríticas produce cantidades mayores de óxido
nítrico durante 3 días en cultivo a pesar de la ausencia de
estímulos adicionales. Por otra parte, la inhibición de la
producción de NO ha mostrado que previene que el
IL-1\alpha medie en la destrucción de cartílago y
en la muerte de condrocitos así como en la progresión de
osteoartritis en modelos animales. Además, los explantes de tejido a
partir de tales pacientes libera espontáneamente altos niveles de
nitrito en ausencia de estimulación con citoquinas tales como
IL-1. Amin et al., Cur. Opin. Rheum.
10: 263-268 (1998). Mientras que una
determinación concluyente del papel positivo o negativo de NO en la
progresión de la determinación articular aún no se ha realizado, la
inhibición de NO puede atenuar los efectos de
IL-1\alpha sobre la producción de metaloproteinasa
de la matriz, síntesis de agrecanasa, y producción de lactato por
los condrocitos - así, la inhibición de NO puede ser una forma de
evitar la destrucción del cartílago.
Al igual que con IL-1\alpha y
\beta, el TNF-\alpha también tiene efecto
sinérgico con IL-1 en términos de destrucción de
cartílago. La inhibición de la actividad
TNF-\alpha, en animales y humanos artríticos ha
mostrado que inhibe la progresión de la artritis.
El factor inhibidor de leucemia (LIF), que se
sintetiza tanto en el cartílago como en el sinovio, está presente en
fluidos sinoviales humanos. Debido a que el LIF induce la síntesis
de metaloproteinasas de la matriz (MMPs) por los condrocitos, puede
estar implicado en la rotura de la matriz cartilaginosa.
El interferón-gamma
(IFN-\gamma) inhibe la síntesis de proteoglicanos
por los condrocitos humanos son potenciar su rotura. De hecho,
IFN-\gamma puede suprimir la pérdida de
proteoglicanos mediante la inhibición de la inducción de MMPs.
La interleuquina 8, una potente citoquina
quimiotáctica para neutrófilos polimorfonucleares (PMN), se
sintetiza por una variedad de células que incluyen
monolitos/macrófagos, condrocitos y fibroblastos y está inducida por
TNF-\alpha. En pacientes de OA,
IL-1\beta, IL-6,
TNF-\alpha y IL-8 se hallan todos
en el fluido sinovial. IL-8 puede potenciar la
liberación de citoquinas inflamatorias en células humanas
mononucleares, incluyendo las de IL-1\beta,
IL-6 y TNF-\alpha, que pueden
además modular la reacción inflamatoria (reseñado por
Martel-Pelletier J. et al., Front.
Biosci. 4: d694-703).
El IL-6 también se ha propuesto
como un contribuyente del proceso patológico OA mediante el
incremento de las células inflamatorias en el tejido sinovial y
mediante la estimulación de la proliferación de condrocitos. Además,
IL-6 puede amplificar los efectos de
IL-1 en la síntesis de MMP y la inhibición de la
producción de proteoglicano (reseñado por
Martel-Pelletier J. et al., Front.
Biosci. 4: d694-703).
La interleuquina 17 sobreregula la producción de
IL-1\beta, IL-6 y MMPs en
macrófagos humanos. El IL-17 también induce la
producción de NO en condrocitos, y se expresa en articulaciones
artríticas, pero no en normales (reseñado por
Martel-Pelletier J. et al., Front.
Biosci. 4: d694-703).
El factor de crecimiento básico de fibroblastos
(bFGF), que se sintetiza por los condrocitos, puede inducir la
replicación de condrocitos articulares, B. C. Toolan et al.,
J. Biomed. Mat. Res. 41: 244-50
(1998). En explantes tomados de animales jóvenes, el bFGF en
cantidades pequeñas (es decir, 3 ng/ml) estimula la síntesis e
inhibe la rotura de proteoglicanos, mientras que niveles más altos
(es decir, 30-300 ng/ml) tiene exactamente el efecto
opuesto (es decir, inhibición de síntesis y rotura potenciada). En
tejidos adultos, las dosis más altas de FGF estimulan la síntesis
del proteoglicano, proteína y colágeno sin proliferación celular.
R.L. Sah et al., Arch. Biochem. Biophys.
308: 137-47 (1994). El bFGF también regula la
homeostasis del cartílago induciendo la liberación autocrina de
interleuquina 1 (IL-1)a partir de los
condrocitos, un potente estimulador del comportamiento catabólico en
el cartílago. El bFGF también potencia la liberación de
IL-1 de mediación por proteasa, quizás a través de
su habilidad de sobreregular los receptores IL-1
sobre los condrocitos. J.E. Chin et al., Arthritis
Rheum. 34: 314-24 (1991). De forma
similar, el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) puede
potenciar los efectos catabólicos de IL-1 y
presumiblemente del TNF-\alpha. Sin embargo,
alguna evidencia sugiere que en el cartílago humano bFGF y PDGF
puede tener un efecto anticatabólico; mientras que queda por
determinar si este fenómeno es específico de las especies o es un
efecto de la edad.
Mientras que la inflamación no aparece como un
evento iniciador en la osteoartritis, la inflamación se presenta en
las articulaciones osteoartríticas. Las células inflamatorias (por
ejemplo, monolitos, macrófagos y neutrófilos) que invaden el
revestimiento sinovial después de la lesión y durante la inflamación
producen metaloproteinasas así como cioquinas catabólicas que pueden
contribuir a la liberación adicional de enzimas degradativas. A
pesar que la inflamación y la destrucción de la articulación no
muestran una correlación perfecta en todos los modelos animales de
artritis, los agentes que inhiben la inflamación (por ejemplo,
IL-4, IL-13, IL-10)
también disminuyen la patología del cartílago y del hueso en
animales artríticos (reseñado por Martel-Pelletier
J. et al., Front. Biosci. 4:
d694-703). La aplicación de agentes que inhiben las
citoquinas inflamatorias pueden lentificar la progresión de OA
contrarrestando la sinovitis local que se produce en pacientes de
OA.
Numerosos estudios muestra que miembros de la
familia de los antibióticos de la tetraciclina son efectivos en la
inhibición de la actividad de la colagenasa y la gelatinasa. La
administración oral de uno de éstos, doxiciclina, muestra que
disminuye tanto la actividad de la colagenasa y la gelatinasa en el
cartílago de la osteoartritis terminal de cadera. Estos datos
sugieren que una dosis oral efectiva de doxiciclina puede lentificar
la progresión de la osteoartritis. Smith R.L., Front. Biosci.
4: d704-712.
La patología de la OA implica no sólo la
degeneración del cartílago articular que conduce a la eburnación del
hueso, sino también el remodelado extensivo del hueso subcondrial
que resulta en la llamada esclerosis de este tejido. Estos cambios
óseos con frecuencia están acompañados por la formación de quistes
subcondriales como resultado de la reabsorción focal. Los agentes
que inhiben la reabsorción ósea, es decir, osteoprotegerina o
bisfosfonatos han mostrado resultados promisorios en modelos
animales de artritis, y por lo tanto muestran promesas en el
tratamiento de desórdenes cartilaginosos. Kong et al.
Nature 402: 304-308.
El ADN153576 parece que se expresa a altos
niveles específicamente en cartílago (figuras 4 y 5). No se ha
detectado expresión de ADN153576 en bancos preparados a partir del
bazo, corazón, timo, placenta, riñón, testículo, útero, piel,
hígado, pulmón, esófago, tiroides (figura 4) ni en ARN preparado a
partir de colon, riñón, pulmón, intestino delgado, nódulo linfático,
duodeno y arteria (figura 5).
El nivel de expresión de ADN153576 en el
cartílago es similar al de actina, indicando que el gen está
altamente expresado. Además, los niveles en el cartílago adulto
aparece como similar al encontrado en cartílago fetal (figuras 5,
6), sugiriendo que esta molécula juega un papel importante en la
biología del condorcito. Curiosamente, niveles diez veces más bajos
de expresión se encontraron en el menisco, que es fibrocartílago, en
contraste con el cartílago articular, que es cartílago hialino
(figura 6). Además, a pesar de expresarse a valores muy bajos
(\sim100x menor que en el cartílago articular) en sinovio enfermo,
la expresión en sinovio normal fue aún menor (10.000x) que en
sinovio enfermo (figura 6). Aún así, la sobreregulación de la
expresión del ADN153576 en el sinovio puede ser parte del proceso de
la enfermedad en articulaciones.
La secuencia nativa de PRO21074 codificada por
ADN153576 muestra la homología de secuencia con el inhibidor
inter-alfa-tripsina (ITI), un
polipéptido que parece unirse a un hialurona (HA); ITI puede por lo
tanto estar implicado en el montaje de, y la adherencia a las
células de, la matriz del cartílago. Basado en su homología a ITI,
el PRO21074 probablemente también juega un papel significativo en la
unión de condrocitos y el montaje de la matriz de cartílago. Como
tal, la secuencia nativa del PRO21074 probablemente será útil como
un agente terapéutico para estimular la reparación del tejido
cartilaginoso, especialmente en la interfaz del cartílago
"nuevo" y "viejo". Dado que la matriz puede proporcionar
señales de retorno a los condrocitos, el PRO21074 también puede
afectar la proliferación y diferenciación de condrocitos. Dichas
actividades también serían beneficiosas para la reparación del
cartílago.
Dado el alto nivel de homología de secuencia
entre ITI y la proteína codificada por ADN153576 (secuencia nativa
de PRO21074), esperamos que la secuencia nativa de PRO21074 se una a
la hialurona y se retenga dentro de la matriz extracelular. Debido a
que la artritis se caracteriza por la degeneración del cartílago y
la liberación de moléculas de la matriz del cartílago, cambia en los
niveles de la secuencia nativa de PRO21074, o fragmentos del mismo
(por ejemplo, en el fluido sinovial, plasma/serum, u orina) pueden
ser indicativos de distintas etapas de la degeneración de la
articulación.
Como se menciona en el párrafo anterior, la
presencia de la secuencia nativa de PRO21074 (incluyendo agonistas
del mismo) es probable que beneficie o sea terapéutica para la
reparación o regeneración del cartílago. Sin embargo, también es
posible que niveles excesivamente altos de la secuencia nativa de
PRO21074, o fragmentos del mismo (es decir, dentro de la
articulación o en el fluido sinovial) también pueden ser
perjudiciales. En dicha situación, el beneficio terapéutico
descansaría en la administración de antagonistas del PRO21074.
La presente invención proporciona secuencias de
nucleótidos recientemente identificadas y aisladas que codifican
polipéptidos referidos en la presente solicitud como PRO21074 (o
también UNQ6369). En particular, el ADNc que codifica el polipéptido
PRO21074 se ha identificado y aislado, y se describe con mayor
detalle en los ejemplos siguientes. Se observa que las proteínas
producidas en series de expresión separadas pueden darse diferentes
números de PRO pero el número de UNQ es único para cualquier ADN
dado y la proteína codificada, y no cambiará. Sin embargo, por
razones de simplicidad, en la presente especificación la proteína
codificada mediante ADN 153576-2925 así como todos
los homólogos adicionales y variantes incluidas en la definición
anterior de PRO21074, será referido como "PRO21074", sin
importar su origen o modo de preparación.
Como se describe en los ejemplos siguientes, un
clon ADNc designado aquí como ADN 153576-2925 se ha
depositado con el ATCC. La secuencia de nucleótido real del clon
puede determinarse fácilmente por aquellos técnicos entendidos
mediante el secuenciado del clon depositado utilizando
procedimientos de rutina en la técnica. La secuencia de amino ácido
predicha puede determinarse a partir de la secuencia de nucleótido
utilizando habilidades rutinarias. Para el polipéptido PRO21074 y el
ácido nucleico codificador aquí descrito, los solicitantes han
identificado lo que se cree que es el marco de lectura más
identificable con la información de la secuencia disponible en este
momento.
Utilizando el programa de ordenador de
alineación de secuencia ALIGN-2 antes citado, se ha
encontrado que la secuencia nativa PRO21074 de longitud completa
(mostrada en la figura 2 y SEQ ID NO: 2) tiene cierta identidad de
secuencia de amino ácido con secuencia de una pieza de ADN genómico
(Dayhoff Nº HS1409_1). Sin embargo, este clon genómico no contiene
la secuencia de codificación completa del PRO21074. Por ello,
actualmente se cree que el polipéptido PRO21074 descrito en la
presente solicitud es un miembro recientemente identificado del la
familia de proteínas inhibidor de
inter-alfa-tripsina y puede poseer
una o más actividades o propiedades biológicas, enzimáticas y/o
inmunológicas de miembros de dicha familia de proteínas.
Además de las secuencias de polipéptidos
PRO21074 nativos de longitud completa aquí descritos, se contempla
que pueden prepararse variantes del PRO21074. Las variantes del
PRO21074 pueden prepararse mediante la introducción de los
apropiados cambios de nucleótidos en el ADN PRO21074, y/o mediante
la síntesis del polipéptido PRO21074 deseado. Aquellos entendidos en
la técnica apreciarán que los cambios de amino ácido pueden alterar
procesos post-translacionales del PRO21074, tales
como cambiar el número o posición de los sitios de glicosilación o
alterar las características de anclaje de la membrana.
Variaciones en la secuencia nativa de PRO21074
de longitud completa o en varios dominios del PRO21074 aquí
descrito, puede hacerse, por ejemplo, utilizando cualquiera de las
técnicas y guías para mutaciones conservadoras y no conservadoras
establecidas, por ejemplo, en la U.S. Patent Nº 5.364.934. Las
variaciones pueden ser una sustitución, eliminación o inserción de
uno o más codones que codifican el PRO21074 que resulta en un cambio
en la secuencia de amino ácido del PRO21074 en comparación con la
secuencia nativa de PRO21074. Opcionalmente, la variación es por
sustitución de al menos un amino ácido con cualquier otro amino
ácido en uno o más de los dominios del PRO21074. La orientación en
determinar qué residuo de amino ácido puede insertarse, sustituirse
o eliminarse sin afectar de forma adversa la actividad deseada puede
hallarse mediante comparación de la secuencia del PRO21074 con
aquella de las moléculas de proteínas homólogas conocidas y
minimizando el número de cambios de secuencia de amino ácido hechos
en regiones de alta homología. Las sustituciones de amino ácido
pueden ser el resultado de reemplazar un amino ácido con otro amino
ácido que tenga propiedades estructurales y/o químicas similares,
tales como el reemplazo de una leucina por una serina, es decir,
reemplazos conservadores de amino ácido. Las inserciones o
eliminaciones opcionalmente pueden ser en el rango de
aproximadamente 1 a 5 amino ácidos. La variación permitida puede
determinarse mediante la realización sistemática de inserciones,
eliminaciones o sustituciones de amino ácidos en la secuencia y
comprobando la actividad de las variantes resultantes exhibida con
la secuencia de longitud completa o nativa madura.
Se proporcionan aquí los fragmentos del
polipéptido PRO21074. Dichos fragmentos pueden estar truncados en
N-terminal o C-terminal, o pueden
carecer de residuos internos, por ejemplo, cuando se comparan con
una proteína nativa de longitud completa. Ciertos fragmentos carece
de residuos de amino ácidos que no son esenciales para una actividad
biológica deseada del polipéptido PRO21074.
Los fragmentos de PRO21074 pueden prepararse
mediante cualquiera de un número de técnicas convencionales. Los
fragmentos deseados de péptido pueden sintetizarse químicamente. Una
aproximación alternativa implica generar fragmentos de PRO21074
mediante digestión enzimática, es decir, mediante el tratamiento de
la proteína con una enzima conocida por partir las proteínas en
sitios definidos por residuos particulares de amino ácido, o
mediante la digestión del ADN con enzimas adecuadas de restricción y
aislando el fragmento deseado. Otra técnica adicional adecuada
implica aislar y amplificar un fragmento de ADN que codifica un
fragmento deseado de polipéptido, mediante la reacción en cadena de
polimerasa (PCR). Los oligonucleótidos que definen el término
deseado del fragmento de ADN se emplean en los iniciadores 5' 3' en
PCR. Preferentemente, los fragmentos del polipéptido PRO21074
comparten al menos una actividad biológica y/o inmunológica con el
polipéptido nativo PRO21074 mostrado en la figura 2 (SEQ ID NO:
2).
En realizaciones particulares, se muestran
sustituciones conservadoras de interés en la Tabla 3 bajo el
encabezado de sustituciones preferidas. Si dichas sustituciones
resultan en un cambio en la actividad biológica, se introducen
entonces cambios más substanciales, denominados sustituciones
ejemplares en la Tabla 3, o como se describe a continuación con
referencia a clases de amino ácidos, y se examinan los
productos.
Las modificaciones sustanciales en la función o
la identidad inmunológica del polipéptido PRO21074 se logran
mediante la selección de sustituciones que difieren
significativamente en su efecto en mantener (a) la estructura del
segmento principal del polipéptido en el área de la sustitución, por
ejemplo, como una hoja o conformación elíptica, (b) la carga o
hidrofobicidad de la molécula en el sitio objetivo, o (c) el volumen
de la cadena lateral. Los residuos producidos naturalmente se
dividen en grupos basados en propiedades comunes de las cadenas
laterales:
- (1)
- hidrofóbico: norleucina, met, ala, val, leu, ile;
- (2)
- hidrofílico neutral: cys, ser, thr;
- (3)
- ácido: asp, glu;
- (4)
- básico: asn, gln, his, lys, arg;
- (5)
- residuos que influencian la orientación de la cadena: gly, pro; y
- (6)
- aromático: trp, tyr, phe.
Las sustituciones no conservadoras conllevarán
el intercambio de un miembro de una de estas clases por otra clase.
Dichos residuos sustituidos también pueden introducirse en los
sitios de sustitución conservadora o, más preferentemente, en los
restantes sitios (no conservados).
Las variaciones pueden hacerse utilizando
procedimientos conocidos en la técnica tales como mutagénesis de
mediación por oligonucleótidos (específica puntual), barrido de
alanina, y mutagénesis PCR. La mutagénesis específica puntual
[Carter et al., Nucl. Acids Res., 13:4331
(1986); Zoller et al., Nucl. Acids Res.,
10:6487 (1987)], mutagénesis modular [Wells et al.,
Gene, 34:315 (1985)], mutagénesis de selección
restringida [Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London
SerA, 317:415 (1986)] u otras técnicas conocidas pueden
realizarse sobre el ADN clonado para producir el ADN de la variante
del PRO21074.
También pueden emplearse análisis de barrido de
amino ácidos para identificar uno o más amino ácidos a lo largo de
una secuencia continua. Entre los amino ácidos de barrido preferido
se hallan amino ácidos relativamente pequeños, neutrales. Tales
amino ácidos incluyen alanina, glicina, serina y cisteina. La
alanina es típicamente un amino ácido de barrido preferido entre
este grupo porque elimina la cadena lateral más allá del
carbono-beta y es menos probable que altere la
conformación de la cadena principal de la variante [Cunningham and
Wells, Science, 244: 1081-1085
(1989)]. La alanina también es preferida típicamente porque es el
amino ácido más común. Además, se encuentra con frecuenta tanto en
posiciones enterradas como expuestas [Creighton, The
Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol.
Biol., 150:1 (1976)]. Si la sustitución de alanina no
produce las cantidades adecuadas de la variante, puede utilizarse un
amino ácido isotérico.
Las modificaciones covalentes de PRO21074 se
incluyen dentro del ámbito de esta invención. Un tipo de
modificación covalente incluye reaccionar residuos de amino ácido
marcados de un polipéptido PRO21074 con un agente orgánico
derivatizador que es capaz de reaccionar con cadenas laterales
seleccionadas de los residuos N- o C-terminal del
PRO21074. La derivatización con agentes bifuncionales es útil, por
ejemplo, para reticular el PRO21074 con una matriz de soporte
insoluble en agua o superficie para utilizar en el procedimiento
para purificar anticuerpos anti-PRO21074, y
viceversa. Los agentes reticulantes comúnmente utilizados incluyen,
por ejemplo,
1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletano,
glutaraldehido, ésteres de N-hidroxisuccinimida, por
ejemplo, ésteres con 4-ácido azidosalicílico, imidoésteres
homobifuncionales, incluyendo ésteres disuccinimidil tales como
3,3'-ditiobis(succinimidilpropionato),
maleimidas bifuncionales tales como
bis-N-maleimido-1,8-octano
y agentes tales como
metil-3-[(p-azidofenil)ditio]propioimidato.
Otras modificaciones incluyen desamidación de
residuos glutaminil y asparaginil a los correspondientes residuos
glutamil y aspartil, respectivamente, hidroxilación de prolina y
lisina, fosforilación de grupos hidroxil de residuos seril o
treonil, metilación de los grupos \alpha-amino de
cadenas laterales de lisina, arginina, e histidina. [T.E. Creighton,
Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman
& Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)],
acetilación de la amina N-terminal, y amidación de
cualquier grupo carboxilo C-terminal.
Otro tipo de modificación covalente del
polipéptido PRO21074 incluido dentro del ámbito de esta invención
comprende alterar el diseño nativo de glicosilación del polipéptido.
"Alterar el partrón nativo de glicosilación" busca para los
presentes propósitos para indicar eliminar uno o más fracciones de
carbohidrato encontradas en la secuencia nativa del PRO21074 (ya sea
extrayendo el sitio de glicosilación subyacente o mediante la
eliminación de la glicosilación a través de medios químicos y/o
enzimáticos), y/o añadir uno o más sitios de glicosilación que no
están presentes en la secuencia nativa de PRO21074. Además, la frase
incluye cambios cualitativos en la glicosilación de las proteínas
nativas, implicando un cambio en la naturaleza y proporciones de las
distintas fracciones de carbohidratos presentes.
La adición de sitios de glicosilación al
polipéptido PRO21074 pueden lograrse mediante la alteración de la
secuencia de amino ácido. La alteración puede hacerse, por ejemplo,
mediante la adición de, o sustitución por, uno o más residuos de
serina o treonina a la secuencia nativa de PRO21074 (para sitios de
glicosilación enlace O). La secuencia de amino ácido PRO21074 puede
opcionalmente alterarse a través de cambios en el nivel de ADN,
particularmente mediante la mutación del ADN que codifica al
polipéptido PRO21074 en bases preseleccionadas tales que se generan
codones que se traducirán en los amino ácidos deseados.
Otros medios para incrementar el número de
fracciones de carbohidratos del polipéptido PRO21074 es mediante el
acoplamiento químico o enzimático de glicósidos al polipéptido.
Dichos procedimientos se describen en la técnica, por ejemplo, WO
87/05330 publicada 11 Septiembre 1987, y en Aplin and Wriston,
CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306
(1981).
La extracción de fracciones de carbohidrato
presentes en el polipéptido PRO21074 puede lograrse química o
enzimáticamente o mediante sustitución por mutación de codones que
codifican los residuos de amino ácido que sirven como marcadores
para la glicosilación. Las técnicas de desglicosilación química son
conocidas en la técnica y se describen, por ejemplo en Hakimuddin,
et al., Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987)
y en Edge et al., Anal. Biochem., 118:131
(1981). La división enzimática de las fracciones de carbohidratos
de los polipéptidos puede lograrse mediante el uso de una variedad
de endo- y exo-glicosidasas como describe Thotakura
et al., Meth. Enzymol., 138:350 (1987).
Otro tipo de modificación covalente del PRO21074
comprende unir el polipéptido PRO21074 a uno de una variedad de
polímeros no protéicos, es decir, polietilen glicol (PEG),
polipropilen glicon, o polioxialquilenos, en la forma establecida
en U.S. Patent Nº. 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417;
4.791.192 o 4.179.337.
El PRO21074 de la presente invención puede
modificarse también en un modo para formar una molécula quimérica
que comprende PRO21074 fusionado a otro polipéptido o secuencia de
amino ácido heterólogo.
En una realización, tal molécula quimérica
comprende una fusión del PRO21074 con un polipéptido marcador que
proporciona un epitope al cual puede unirse selectivamente un
anticuerpo anti-marcador. El epitope marcador
generalmente se coloca en el término amino o carboxil del PRO21074.
La presencia de dichas formas con epitope marcador del PRO21074
pueden detectarse utilizando un anticuerpo contra el polipéptido
marcador. También, la provisión del epitope marcador permite que el
PRO21074 se purifique fácilmente mediante purificación por afinidad
utilizando un anticuerpo anti-marcador u otro tipo
de matriz de afinidad que se une al epitope marcador. En la técnica
se conocen varios polipéptidos marcadores y sus respectivos
anticuerpos. Los ejemplos incluyen marcadores
poli-histidina poli-his), o
poli-histidina-glicina
(poli-his-gli); el polipéptido
marcador de la gripe HA y su anticuerpo 12CA5 [Field et al.,
Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)];
el marcador c-myc y los anticuerpos 8F9, 3C7, 6E10,
G4, B7 y 9E10 [Evan et al., Molecular and Cellular
Biology, 5:3610-3616 (1985)]; y el
marcador de la glicoproteína D del virus del Herpes Simple (gD) y su
anticuerpo [Paborsky et al., Protein Engineering,
3(6):547-553 (1990)]. Otros polipéptidos
marcadores incluye el péptido Flag [Hopp et al.,
BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)]; el
péptido epitope KT3 [Martin et al., Science,
255:192-194 (1992)]; un péptido epitope
\alpha-tubulina [Skinner et al., J.
Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)]; y
el marcador péptido gen T7 10 proteína
[Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 87:6393-6397 (1990)].
En una realización alternativa, la molécula
quimérica puede comprender una fusión del PRO21074 con una
inmunoglobulina o una región particular de una inmunoglobulina. Para
una forma bivalente de la molécula quimérica (también referida como
"inmunoadhesina"), dicha fusión pude ser en la región Fe de una
molécula IgG. Las fusiones Ig preferentemente incluyen la
sustitución de una forma soluble (dominio transmembrana eliminado o
inactivado) de un polipéptido PRO21074 en lugar de al menos una
región variable dentro de una molécula Ig. En una realización
preferida particularmente, la fusión de inmunoglobulina incluye las
regiones de la bisagra, CH2 y CH3, o la bisagra, CH1, CH2 y CH3 de
una molécula IgG1. Para la producción de fusiones de
inmunoglobulinas ver también la patente US Nº 5.428.130 publicada en
Junio 27, 1995.
La siguiente descripción se refiere
primariamente a la producción de PRO21074 mediante células
cultivadas transformadas o trasnfectadas con un vector que contiene
ácido nucleico PRO21074 y la purificación de la proteína resultante.
Por supuesto, se contempla que puedan aplicarse procedimientos
alternativos, que son bien conocidos en la técnica, para preparar
PRO21074. Por ejemplo, la secuencia PRO21074, o porciones del mismo,
puede producirse mediante síntesis directa de péptido utilizando
técnicas de fase sólida [ver por ejemplo, Stewart et al.,
Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman
Co., San Francisco, CA (1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc.,
85:2149-2154 (1963)]. La síntesis in
vitro de proteínas puede realizarse utilizando técnicas manuales
o mediante automatización. La síntesis automatizada puede lograrse,
por ejemplo, utilizando un Applied Biosystems Peptide Synthesizer
(Foster City, CA) empleando las instrucciones del fabricante. Varias
porciones del PRO21074 pueden sintetizarse químicamente de forma
separada y combinarse utilizando procedimientos químicos o
enzimáticos para producir PRO21074 de longitud completa.
El ADN que codifica PRO21074 puede obtenerse a
partir de un banco de ADNc preparado a partir de tejido que se cree
que posee el ARNm PRO21074 y expresarlo en un nivel detectable. En
consecuencia, el ADN humano de PRO21074 puede ser obtenido
convenientemente a partir de un banco de ADNc preparado a partir de
tejido humano, tal como se describe en los ejemplos. El gen que
codifica PRO21074 también puede obtenerse a partir de un banco de
genoma o mediante procedimientos de síntesis conocidos (por ejemplo,
síntesis automatizada de ácido nucleico).
Los bancos pueden barrerse con sondas (tales
como anticuerpos del PRO21074 u oligonicleótidos de al menos
20-80 bases) designadas para identificar el gen de
interés o la proteína por él codificada. El barrido del ADNc o banco
de genoma con la sonda seleccionada puede realizarse utilizando
procedimientos estándar, tales como se describe en Sambrook et
al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York:
Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Un medio alternativo
para aislar el gen que codifica el PRO21074 es utilizar metodología
PCR [Sambrook et al., supra; Dieffenbach et
al., PCR Primer: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor
Laboratory Press, 1995)].
Los siguientes ejemplos describen técnicas de
barrido de un banco de ADNc. Las secuencias de oligonucleótidos
seleccionadas como sondas deben ser de longitud suficiente y
suficientemente no ambiguas para minimizar los falsos positivos. El
oligonucleótido preferentemente se marca de forma tal que pueda
detectarse al hibridarse con el ADN en el banco que se barre. Los
procedimientos de marcado son bien conocidos en la técnica, e
incluyen el uso de radiomarcadores tales como
^{32}P-ATP marcado, biotinación o marcado de
enzimas. Las condiciones de hibridación, incluyendo moderadamente
rigurosas y altamente rigurosas, se proporcionan en Sambrook et
al., supra.
Las secuencias identificadas en dichos
procedimientos de barrido de banco pueden compararse y alinearse con
otras secuencias conocidas depositadas en bases de datos públicas
tales como Genbank y otras bases de datos privados de secuencias. La
identidad de secuencia (tanto en el nivel amino ácido como de
nucleótido) dentro de regiones definidas de la molécula o a través
de la longitud completa de la secuencia puede determinarse
utilizando procedimientos conocidos en la técnica y como se describe
aquí.
El ácido nucleico con secuencia codificadora de
proteína puede obtenerse mediante el barrido de ADNc seleccionado o
de bancos de genoma utilizando la secuencia de amino ácido deducida
aquí descrita por primera vez, y, si es necesario, utilizando
procedimientos convencionales de iniciación como se describe en
Sambrook et al., supra, para detectar precursores e
intermediarios de proceso del ARNm que pueden no haber sido
trascripto a la inversa en
ADNc.
ADNc.
Las células huésped se transfectan o transforman
con vectores de expresión o de clonación aquí descritos para la
producción de PRO21074 y se cultivan en medios nutrientes
convencionales modificados apropiados para inducir promotores,
seleccionar transformantes, o amplificar los genes que codifican las
secuencias deseadas. Las condiciones de cultivo, tales como medio,
temperatura, pH y similares, pueden seleccionarse mediante el
operador entendido sin demasiada experimentación. En general, pueden
encontrarse los principios, protocolos y técnicas prácticas para
maximizar la productividad de los cultivos celulares en Mammalian
Cell Biotechnology: A Practical Approach, M. Butler, ed.
(IRL Press, 1991) y Sambrook et al., supra.
Los procedimientos de transfección de células
eucarióticas y la transformación de células procarióticas son
conocidos para los operarios ordinariamente hábiles, por ejemplo,
CaCl_{2}, CaPO_{4}, mediado por liposomas y electroporación.
Dependiendo de la célula huésped utilizada, la transformación se
realiza utilizando técnicas estándar apropiadas para dichas células.
El tratamiento con calcio empleando cloruro de calcio, como se
describe en Sambrook et al., supra, o la
electroporación se usan generalmente para procariotas. La infección
con Agrobacterium tumefaciens se utiliza para la
transformación de ciertas células de plantas, como se describe en
Shaw et al., Gene, 23:315 (1983) y WO 89/05859
publicada el 29 Junio 1989. Para células de mamífero sin dichas
paredes celulares, puede emplearse el procedimiento de precipitación
por fosfato de calcio de Graham y van der Eb, Virology,
52:456-457 (1978). Los aspectos generales de
la transfección del sistema huésped de células de mamífero se ha
descrito en U.S. Patent Nº 4.399.216. Las transformaciones en
levadura típicamente se llevan a cabo según el procedimiento de Van
Solingen et al., J. Bact., 130:946 (1977) y
Hsiao et al., Proc. Natl. Acad Sci. (USA),
76:3829 (1979). Sin embargo, pueden usarse otros
procedimientos para introducir ADN en las células, tales como
mediante microinyección nuclear, electroporación, fusión de
protoplasto bacteriano con células intactas, o policationes, por
ejemplo, polibreno, poliomitina. Para distintas técnicas para
transformar células de mamífero, ver Keown et al., Methods
in Enzymology, 185:527-537 (1990) y Mansour
et al., Nature, 336:348-352
(1988).
Las células huésped adecuadas para clonar o
expresar el ADN en los vectores incluyen aquí procariotes, levadura
o células eucariotas más altas. Los procariotres adecuados incluyen
pero no están limitados a eubacterias, tales como organismos Gram
negativos o Gram positivos, por ejemplo, Enterobacteriáceas como
E. coli. Distinas cepas de E. coli está públicamente
disponibles, tales como E. coli K12 cepa MM294 (ATCC 31,446);
E. coli X1776 (ATCC 31,537); E. coli cepa W3110 (ATCC
27,325) y K5 772 (ATCC 53,635). Otras células huésped procariotas
adecuadas incluyen Enterobacteriáceas tales como Escherichia,
es decir, E. coli, Enterobacter, Erwinia,
Klebsiella, Proteus, Salmonella, por ejemplo,
Salmonella typhimurium, Serratia, es decir,
Serratia marcescans, y Shigella, así como
Bacilli tales como B. subtilis y B.
licheniformis (es decir, B. licheniformis 41P descrito en
DD 266.710 publicado el 12 Abril 1989), Pseudomonas tales
como P. aeruginosa, y Streptomyces. Estos ejemplos son
ilustrativos más que limitantes. La cepa W3110 es un huésped
particularmente preferido o huésped madre porque es una cepa huésped
común para las fermentaciones de producto ADN recombinante.
Preferentemente, la célula huésped secreta cantidades mínimas de
enzimas proteolíticas. Por ejemplo, la cepa W3110 puede modificarse
para realizar una mutación genética en los genes que codifican
proteínas endógenas del huésped, con ejemplos de dichos huéspedes
que incluyen E. coli W3110 cepa 1A2, que tiene el genotipo
completo tonA; E. coli W3110 cepa 9E4, que tiene el
genotipo completo tonA ptr3; E. coli W3110 cepa 27C7
(ATCC 55.244), que tiene el genotipo completo tonA ptr3 phoA E15
(argF-lac)169 degP ompT kan^{r}; E.
coli W3110 cepa 37D6, que tiene el genitivo completo tonA
ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT rbs7
ilvG kan^{r}; E. coli W3110 cepa 40B4, que es la cepa
37D6 con una mutación de eliminación con un no camamicin resistente
degP; y una cepa de E. coli que tiene proteasa
periplásmica mutante descrita en U.S. Patent Nº 4.946.783 publicada
el 7 Agosto 1990. Alternativamente, son adecuados procedimientos de
clonación in vitro, por ejemplo, PCR u otras
reacciones de polimerasa de ácido nucleico.
Además de los procariotas, microbios eucariotas
tales como hongos filamentosos o levaduras son huéspedes adecuados
de clonado o expresión para los vectores que codifican PRO21074.
Saccharomyces cerevisiae es un microorganismo huésped
eucariota menor comúnmente utilizado. Otros incluyen
Schizosaccharomyces pombe (Beach and Nurse, Nature,
290:140 [1981]; EP 139.383 publicada 2 Mayo 1985); huéspedes
Kluyveromyces (U.S. Patent Nº 4.943.529; Fleer et al.,
Bio/Technology, 9:968-975 (1991))
tales como, por ejemplo, K. lactis (MW98-8C,
CBS683, CBS4574; Louvencourt et al., J. Bacteriol.,
154(2): 737-42 [1983]), K. fragilis
(ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045), K.
wickeramii (ATCC 24.178), K. waltii (ATCC 56.500), K.
drosophilarum (ATCC 36.906; Van den Berg et al.,
Bio/Technology, 8:135 (1990)), K.
thermotolerans, and K. marxianus; yarrowia (EP
402.226); Pichia pastoris (EP 183.070; Sreekrishna et
al., J. Basic Microbiol., 28:265-278
[1988]); Candida; Trichoderma reesia (EP 244.234);
Neurospora crassa (Case et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 76:5259-5263 [1979]);
Schwanniomyces tales como Schwanniomyces occidentalis
(EP 394.538 publicada 31 Octubre 1990); y hongos filamentosos tales
como, por ejemplo, Neurospora, Penicillium, Tolypocladiuni
(WO 91/00357 publicada 10 Enero 1991), y huéspedes
Aspergillus tales como A. nidulans (Ballance et
al., Biochem. Biophys. Res. Commun.,
112:284-289 [1983]; Tilburn et al.,
Gene, 26:205-221 [1983]; Yelton et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:
1470-1474 [1984]) y A. niger (Kelly and
Hynes, EMBO J., 4:475-479 [1985]). Las
levaduras metilotrópicas son aquí adecuadas e incluyen, pero no
están limitadas, levaduras capaces de crecer en metanol
seleccionadas a partir del género consistente en Hansenula,
Candida, Kloeckera, Pichia,
Saccharomyces, Torulopsis, y Rhodotorula. Una
lista de especies específicas que son ejemplares de esta clase de
levaduras puede encontrase en C. Anthony, The Biochemistry of
Methylotrophs, 269
(1982).
(1982).
Células huésped adecuadas para la expresión de
PRO21074 glicosilato se derivan a partir de organismos
multicelulares. Ejemplos de células de invertebrados incluyen
células de insectos tales como Drosophila S2 y Spodoptera Sf9, así
como células de plantas. Ejemplos de líneas de células huésped
útiles de mamíferos incluyen ovario de hámster Chino (CHO) y células
COS. Ejemplos más específicos incluyen riñón de mono línea CV1
transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); línea
de riñón embrionario humano (293 o células 293 subclonadas para
crecer en cultivo en suspensión, Graham et al., J. Gen
Virol., 36:59 (1977)); células de ovario de hámster Chino/-DHFR
(CHO, Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad Sci. USA, 77:4216
(1980)); células Sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol.
Reprod., 23:243-251 (1980)); células pulmonares
humanas (W138, ATCC CCL 75); células hepáticas humanas (Hep G2, HB
8065); y tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51). La
selección de la célula huésped apropiada se considera dentro de la
habilidad en la técnica.
El ácido nucleico (es decir, ADNc o ADN
genómico) que codifica PRO21074 puede insertarse en un vector
replicable para clonación (amplificación del ADN) o para expresión.
Diferentes vectores están disponibles públicamente. El vector puede,
por ejemplo, estar en la forma de un plásmido, cósmido, partícula
viral o fago. La secuencia de ácido nucleico apropiada puede
insertarse en el vector mediante una variedad de procedimientos. En
general, el ADN se inserta en un sitio(s) de restricción de
endonucleasa apropiado utilizando técnicas conocidas en la técnica.
Los componentes vector generalmente incluyen, pero no están
limitados, una o más secuencia de señal, un origen de replicación,
uno o más genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor, y
una secuencia de terminación de transcripción. La construcción de
vectores adecuados que contengan uno o más de estos componentes
emplea técnicas de ligadura estándar que son conocidas para el
operario entendido.
El PRO21074 puede producirse de forma
recombinante no sólo directamente, sino también como un polipéptido
de fusión con un polipéptido heterólogo, que puede ser una secuencia
de señal u otro polipéptido que tenga un sitio de rotura específico
en el N-terminal de la proteína madura o
polipéptido. En general, la secuencia de señal puede ser un
componente del vector, y puede ser una parte del ADN que codifica al
PRO21074 que se inserta en el vector. La secuencia de señal puede
ser una secuencia de señal procariota seleccionada, por ejemplo, a
partir del grupo de fosfatasa alcalina, penicilinasa, 1 pp, o
conductores de enterotoxina II térmicamente estable. Por secreción
de levadura la secuencia de señal puede ser, por ejemplo de
conductor de invertasa de levadura, conductor de factor alfa
(incluyendo conductores de factores \alpha de Saccharomyces
y Kluyveromyces, éste último descrito en la U.S. Patent Nº
5.010.182), o conductores de fosfatasa ácida, el conductor
glucoamilasa C. albicans (EP 362.179 publicada el 4 Abril
1990), o la señal descrita en WO 90/13646 publicada el 15 Noviembre
1990. En la expresión celular de mamíferos, las secuencias de señal
de mamíferos pueden usarse para dirigir la secreción de la proteína,
tales como secuencias de señal a partir de polipéptidos secretados
de la misma o de especies relacionadas, así como conductores virales
de secre-
ción.
ción.
Tanto los vectores de expresión como los de
clonado contienen una secuencia de ácido nucleico que permite que el
vector se replique en una o más células huésped seleccionadas. Tales
secuencias son bien conocidas para una variedad de bacteria,
levadura, y virus. El origen de replicación a partir del plásmido
pBR322 es adecuada para la mayoría de las bacterias
Gram-negativas, el plásmido origen 2 \mu es
adecuado para levadura y varios orígenes virales (SV40, polioma,
adenovirus, VSV o BPV) son útiles para vectores de clonado en
células de mamífero.
Los vectores de expresión y clonado típicamente
contendrán un gen de selección, también llamado un marcador
seleccionable. Los genes típicos de selección codifican proteínas
que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, por
ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato, o tetraciclina, (b)
complementan deficiencias autotróficas, o (c) suplir nutrientes
críticos no disponibles a partir del medio complejo, por ejemplo el
gen que codifica D-alanina racemasa para
Bacilli.
Un ejemplo de marcadores seleccionables
adecuados para células de mamífero son aquellos que permiten la
identificación de células competentes para aceptar el ácido nucleico
que codifica el PRO21074, tales como DHFR o timidina quinasa. Una
célula huésped apropiada cuando se emplea el DHFR de tipo salvaje es
la línea de células CHO deficiente en actividad DHFR, preparada y
propagada como se describe en Urlaub et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980). Un gen de selección
adecuado para usar en levadura es el gen trp1 presente en el
plásmido de levadura YRp7 [Stinchcomb et al., Nature,
282:39 (1979); Kingsman et al., Gene,
7:141 (1979); Tschemper et al., Gene, 10:157 (1980)].
El gen trp1 proporciona un marcador de selección para una
cepa mutante de levadura que carece de la habilidad de crecimiento
en triptofano, por ejemplo, ATCC No. 44076 o PEP4-1
[Jones, Genetics, 85:12 (1977)].
Los vectores de expresión y clonado usualmente
contienen un promotor unido de forma operativa a la secuencia de
ácido nucleico que codifica PRO21074 para dirigir la síntesis ARNm.
Los promotores reconocidos por una variedad de células huésped
potenciales son bien conocidos. Los promotores adecuados para
utilizar con huéspedes procarióticos incluyen la
\beta-lactamasa y sistemas promotores de lactosa
[Chang et al., Nature, 275:615 (1978); Goeddel
et al., Nature, 281:544 (1979)], fosfatasa
alcalina, un sistema promotor de triptofano (trp) [Goeddel,
Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); EP 36.776], y
promotores híbridos tales como el promotor tac [deBoer et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
80:21-25 (1983)]. Los promotores para
utilizar en sistemas bacterianos también contendrán una secuencia
Dalgarno (S.D.) unida de forma operativa al ADN que codifica
PRO21074.
Ejemplos de secuencias adecuadas de promotores
para utilizar con huéspedes de levadura incluyen los promotores
3-fosfogliquerata quinasa [Hitzeman et al.,
J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)] u otras enzimas
glicolíticas [Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg.,
7:149 (1968); Holland, Biochemistry, 17:4900 (1978)],
tales como enolasa,
gliceraldehído-3-fosfato
dehidrogenasa, hexoquinasa, piruvato decarboxilasa,
fosfofructoquinasa,
glucosa-6-fosfato isomerasa,
3-fosfoglicerato mutasa, piruvato quinasa,
triosefosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucoquinasa.
Otros promotores de levadura, que son promotores
inducibles que tienen la ventaja adicional de transcripción
controlada con condiciones de crecimiento, son regiones promotoras
para alcohol dehidrogenasa 2, isocitocromo C, fosfatasa ácida,
enzimas degradativas asociadas con el metabolismo del nitrógeno,
metalotioneina,
gliceraldhehido-3-fosfato
deshidrogenada, y enzimas responsables de la utilización de la
maltosa y la galactosa. Los vectores y promotores adecuados para
utilizar en expresión de levadura se describen adicionalmente en EP
73.657.
La transcripción PRO21074 a partir de vectores
en células huésped de mamíferos está controlada, por ejemplo, por
promotores obtenidos de los genomas de virus tales como virus
polioma, virus fowlpox (UK 2.211.504 publicada el 5 Julio 1989),
adenovirus (tal como Adenovirus 2), virus del papiloma bovino, virus
de sarcoma aviar, citomegalovirus, un retrovirus, virus de hepatitis
B y virus Simian 40 (SV40), a partir de promotores heterólogos de
mamífero, por ejemplo el promotor de actina o un promotor de
inmunoglobulina, y a partir de promotores de choque térmico, siempre
que tales promotores sean compatibles con los sistemas de células
huésped.
La transcripción del ADN que codifica PRO21074
por eucariotas superiores puede incrementarse mediante la inserción
de una secuencia potenciadora en el vector. Los potenciadores son
elementos que actúan en cis del ADN, usualmente aproximadamente de
10 a 300 bp, que actúan sobre un promotor para incrementar su
transcripción. Muchas secuencias potenciadoras se conocen ahora a
partir de genes de mamífero (globin, elastasa, albúmina,
\alpha-fetoproteína, e insulina). Típicamente, sin
embargo, se empleará un potenciador a partir de virus de células
eucariotas. Los ejemplos incluyen el potenciador SV40 sobre el
último lado del origen de replicación (bp 100-270),
el potenciador temprano del promotor del citomegalivirus, el
potenciador del polioma en el último lado del origen de replicación,
y potenciadores de adenovirus. El potenciador puede ensamblarse en
el vector en una posición 5' o 3' de la secuencia de codificación
PRO21074, pero preferentemente se ubica en el sitio 5' del
promotor.
Los vectores de expresión utilizados en células
huésped eucarióticas (levadura, hongos, células nicleadas de
insectos, plantas, animales u otros organismos multicelulares)
también contendrán secuencias necesarias para la finalización de la
transcripción y para estabilizar el ARNm. Dichas secuencias están
disponibles comúnmente a partir de las regiones no traducidas 5', y
ocasionalmente 3', de ADNs o ADNcs eucarióticos o virales. Estas
regiones contienen segmentos de nucleótido transcritos como
fragmentos poliadenilatados en la porción no traducida del ARNm que
codifica PRO21074.
Otros procedimientos, vectores y células huésped
adecuadas para la adaptación a la síntesis de PRO21074 en cultivos
recombinantes celulares de vertebrados se describen en Gething et
al., Nature, 293:620-625 (1981); Mantei
et al., Nature, 281:40-46 (1979); EP
117.060; y EP 117.058.
La amplificación y/o expresión de genes puede
medirse directamente en una muestra, por ejemplo, mediante análisis
de Southern, análisis de Northern para cuantificar la transcripción
del ARNm [Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
77:5201-5205 (1980)], análisis de punto
(análisis de ADN), o hibridación in situ, utilizando una
sonda marcada apropiada, basado en las secuencias aquí
proporcionadas. Alternativamente, pueden emplearse los anticuerpos
que pueden reconocer dúplex específicos, incluyendo dúplex ADN,
dúplex ARN, y dúplex híbridos ADN-ARN o dúplex
ADN-proteína. Los anticuerpos a su vez pueden
marcarse y el ensayo puede llevarse a cabo donde el dúplex se une a
una superficie, de forma que por la formación del dúplex sobre la
superficie, puede detectarse la presencia de anticuerpos unidos al
dúplex.
La expresión de genes, alternativamente, puede
medirse mediante procedimientos inmunológicos, tales como teñido
inmunohistoquímico de células o secciones de tejido y ensayo de
cultivo celular o fluidos corporales, para cuantificar directamente
la expresión del producto génico. Los anticuerpos útiles para el
teñido inmunohistoquímico y/o ensayo de fluidos muestra puede ser
tanto monoclonal o policlonal, y puede prepararse en cualquier
mamífero. Convenientemente, los anticuerpos pueden prepararse contra
una secuencia nativa de polipéptido PRO21074 o contra un péptido
sintético basado en las secuencias de ADN aquí provistas o contra
una secuencia exógena fusionada al ADN PRO21074 y que codifica un
epitope de anticuerpo específico.
Pueden recuperarse formas de PRO21074 a partir
de medio de cultivo o a partir de lisatos de células huésped. Si
están unidas a la membrana, pueden liberarse de la membrana
utilizando una solución adecuada de detergente (por ejemplo,
Triton-X 100) o mediante rotura enzimática. Las
células empleadas en la expresión de PRO21074 pueden romperse
mediante distintos medios físicos o químicos, tales como ciclos de
congelación-descongelación, sonicación, ruptura
mecánica, o agentes de lisis celular.
Puede desearse purificar PRO21074 a partir de
proteínas o polipéptidos de células recombinantes. Los siguientes
procedimientos son ejemplares de procedimientos adecuados de
purificación: mediante fraccionamiento sobre una columna de
intercambio de iones; precipitación con etanol; PHL de fase reversa;
cromatografía sobre sílice o resina de intercambio de cationes tales
como DEAE; cromatofocalizando; SDS-PAGE;
precipitación con sulfato de amonio; filtración con gel utilizando,
por ejemplo, Sephadex G-75; columnas de Sepharose
proteína A para extraer contaminantes tales como IgG; y columnas
quelantes de metal para unir formas unidas marcadas por epitope del
PRO21074. Pueden emplearse distintos procedimientos de purificación
de proteína y tales procedimientos son conocidos en la técnica y
descritos por ejemplo en Deutscher, Methods in Enzymology,
182 (1990); Scopes, Protein Purification: Principles and
Practice, Springer-Verlag, New York (1982). La
etapa(s) de purificación seleccionadas dependerán, por
ejemplo, de la naturaleza del proceso de producción utilizado y el
PRO21074 particular producido.
Las secuencias de nucleótidos (o sus
complementos) que codifican PRO21074 tienen distintas aplicaciones
en la técnica de la biología molecular, incluyendo usos como sondas
de hibridación, en el mapeo de cromosomas y genes y en la generación
de ARN y ADN antisentido. El ácido nucleico PRO21074 también será
útil para la preparación de polipéptidos PRO21074 mediante las
técnicas recombinantes aquí descritas.
El gen de secuencia nativa de PRO21074 de
longitud completa (SEQ ID NO: 1), o porciones del mismo, pueden
usarse como sondas de hibridación para banco de ADNc para aislar la
longitud completa de ADNc de PRO21074 o para aislar aún otros ADNcs
(por ejemplo, aquellos que codifican las variantes naturalmente
producidas de PRO21074 o PRO21074 de otras especies) que tienen una
identidad de secuencia deseada con la secuencia de PRO21074 descrita
en la figura 1 (SEQ ID NO: 1). Opcionalmente, la longitud de las
sondas será aproximadamente de 20 a 50 bases. Las sondas de
hibridación pueden derivarse de regiones al menos parcialmente
nuevas de la secuencia de nucleótido de SEQ ID NO: 1 donde esas
regiones pueden determinarse sin excesiva experimentación o a partir
de secuencias genómicas que incluyen promotores, elementos
potenciadores e intrones de secuencia nativa PRO21074. A modo de
ejemplo, un procedimiento de barrido comprenderá aislar la región
codificadora o la región no traducida del gen PRO21074 utilizando la
secuencia conocida de ADN para sintetizar una sonda seleccionada de
aproximadamente 40 bases. Las sondas de hibridación pueden marcarse
mediante una variedad de marcadores, incluyendo radionucleótidos
tales como ^{32}P o ^{35}S, de marcadores enzimáticos tales como
fosfatasa alcalina acoplada a la sonda a través de sistemas de
acoplamiento avidina/biotina. Las sondas marcadas que tienen una
secuencia complementaria a la del gen de PRO21074 de la presente
invención pueden usarse para barrer bancos de ADNc humano, ADN o
ARNm genómico para determinar a qué elementos de dichos bancos se
hibridiza la sonda. Las técnicas de hibridación se describen con
mayor detalle en los ejemplos a continuación.
Cualquier secuencia EST descritas en la presente
solicitud puede emplearse similarmente a las sondas, utilizando los
procedimientos aquí descritos.
Otros fragmentos útiles de los ácidos nucleico
de PRO21074 incluyen oligonucleótidos antisentido o sentido que
comprenden una secuencia de ácido nucleico de hebra simple (ya sea
ARN o ADN) capaz de unirse a la secuencia ARNm PRO21074 objetivo
(sentido) o ADN PRO21074 (antisentido). Los oligonucleótidos
antisentido o sentido, según la presente invención, comprende un
fragmento de la región de codificación o la región no traducida de
ADN PRO21074. Un fragmento así generalmente comprende al menos
aproximadamente 14 nucleótidos, preferentemente de aproximadamente
14 a 30 nucleótidos. La habilidad de derivar un oligonucleótido
antisentido o sentido, basado en la secuencia de ADNc que codifica
una proteína dada se describe, por ejemplo, en Stein y Cohen
(Cancer Res. 48:2659, 1988) y van der Krol et al.
(BioTechniques 6:958, 1988).
La unión de oligonucleótidos antisentido o
sentido con secuencias objetivo de ácido nucleico resulta en la
formación de dúplex que bloquean la transcripción o traducción de la
secuencia objetivo a través de uno de varios medios, incluyendo la
degradación potenciada de los dúplex, terminación prematura de la
transcripción o la traducción, o por otros medios. Los
oligonucleótidos antisentido por lo tanto pueden usarse para
bloquear la expresión de las proteínas PRO21074. Los
oligonucleótidos antisentido o sentido comprenden además
oligonucleótidos que han modificado los ejes centrales de
azúcar-fosfodiéster (u otras uniones azúcar, tales
como las descritas en WO 91/06629) y donde dichas uniones azúcar son
resistentes a nucleasas endógenas. Dichos oligonucleótidos con
uniones azúcar resistentes son estables in vivo (es decir,
capaces de resistir la degradación enzimática) pero retiene
especificidad de secuencia para ser capaz de unirse a secuencias
objetivo de nucleótidos.
Otros ejemplos de oligonucleótidos sentido o
antisentido incluyen aquellos oligonucleótidos que están unidos
covalentemente a fracciones orgánicas, tales como las descritas en
WO 90/10048, y otras fracciones que incrementan la afinidad del
oligonucleótido por una secuencia de ácido nucleico objetivo, tal
como poli-(L-lisina). Aún más, agentes
intercalantes, tales como elipticina, y agentes alquilantes o
complejos metálicos pueden unirse a oligonucleótidos sentido o
antisentido para modificar las especificidades de unión para el
oligonucleótidos sentido o antisentido para la secuencia de
nucleótido objetivo.
Los oligonucleótidos antisentido o sentido
pueden introducirse en una célula que contenga la secuencia de ácido
nucleico objetivo mediante cualquier procedimiento de transferencia
de genes, incluyendo, por ejemplo, transfección de ADN de mediación
por CaPO_{4}, electroporación, o mediante el uso de vectores de
transferencia de genes tales como el virus
Epstein-Barr. En un procedimiento preferido, un
oligonucleótido antisentido o sentido se inserta en un vector
retroviral adecuado. Una célula que contiene la secuencia de ácido
nucleico objetivo contacta con el vector retroviral recombinante, ya
sea in vivo o ex vivo. Los vectores retrovirales
adecuados incluyen, pero no están limitados a, aquellos derivados
del retrovirus murina M-MuLV, N2 (un retrovirus
derivado de M-MuLV), o los vectores de copia doble
designada DCT5A, DCT5B y DCT5C (ver WO 90/13641).
Los oligonucleótidos sentido o antisentido
también pueden introducirse en una célula que contenga la secuencia
de nucleótido objetiva mediante la formación de un conjugado con una
molécula ligando de unión, como se describe en WO 91/04753. Las
moléculas ligando de unión adecuada incluyen, pero no están
limitadas a, receptores de superficie de la célula, factores de
crecimiento, otras citoquinas, u otros ligandos que se unen a los
receptores de la superficie celular. Preferentemente, la conjugación
de la molécula ligando de unión para unirse con su correspondiente
molécula o receptor, o bloquear la entrada del oligonucleótido
sentido o antisentido o su versión conjugada dentro de la
célula.
célula.
Alternativamente, un oligonucleótido sentido o
antisentido puede introducirse en una célula que contiene la
secuencia objetivo de ácido nucleico mediante la formación de un
complejo oligonucleótido-lípido, como se describe en
WO 90/10448. El complejo oligonucleótidos sentido o
antisentido-lípido preferentemente se disocia dentro
de la célula mediante una lipasa endógena.
Las sondas también pueden emplearse en técnicas
PCR para generar un grupo de secuencias para identificación de las
secuencias que codifican PRO21074 más relacionadas.
Las secuencias de nucleótido que codifican un
PRO21074 también pueden usarse para construir sondas de hibridación
para determinar sitios de expresión de ADN 153576 en tejidos
(hibridación in situ), mapear el gene que codifica PRO21074,
y para el análisis genético de individuos con enfermedades
particulares. Las secuencias de nucleótidos aquí provistas pueden
mapearse en un cromosoma y regiones específicas de un cromosoma
utilizando técnicas conocidas, tales como hibridación in
situ, análisis de unión contra marcadores cromosómicos
conocidos, y barrido de hibridación con bancos.
Cuando las secuencias de codificación de
PRO21074 codifican una proteína que se une a otra proteína (ejemplo,
donde el PRO21074 es un receptor), el PRO21074 puede usarse en
ensayos para identificar las otras proteínas o moléculas implicadas
en la interacción de unión. Mediante dichos procedimientos, los
inhibidores de la interacción de unión receptor/ligando pueden
identificarse. Las proteínas implicadas en tales interacciones de
unión también pueden usarse para barrer péptidos o inhibidores de
molécula pequeña o agonistas de la interacción de unión. También, el
receptor PRO21074 puede usarse para aisla ligando(s)
correlativo. Los ensayos de barrido pueden diseñarse para encontrar
componentes guía que imitan la actividad biológica del PRO21074
nativo o un receptor para PRO21074. Tales ensayos de barrido
incluirán ensayos adecuados para el barrido de alto rendimiento de
bancos químicos, haciéndolos particularmente adecuados para
identificar pequeñas moléculas candidatas a la droga. Las pequeñas
moléculas contempladas incluyen compuestos sintéticos orgánicos o
inorgánicos. Los ensayos pueden realizarse en una variedad de
formatos, incluyendo ensayos de unión
proteína-proteína, ensayos de barrido bioquímico,
inmunoensayos y ensayos basados en células, que están bien
caracterizados en la técnica.
Los ácidos nucleicos que codifican PRO21074 o
sus formas modificadas también pueden usarse para generar ya sea
animales transgénicos o animales "genéticamente deficientes"
que, a su vez, son útiles en el desarrollo y el barrido de
reactivos terapéuticamente útiles. Un animal transgénico (por
ejemplo, un ratón o rata) es un animal que tiene células que
contienen un transgen, dicho transgen se introdujo en el animal o en
un ancestro del animal en una etapa prenatal, por ejemplo,
embrionaria. Un transgen es un ADN que está integrado en el genoma
de una célula a partir de la cual se desarrolla un animal
transgénico. En una realización, el ADNc que codifica PRO21074 puede
usarse para clonar ADN genómico que codifica PRO21074 según con las
técnicas establecidas y las secuencias genómicas utilizadas para
generar animales transgénicos que contienen células que expresan ADN
que codifica PRO21074. Los procedimientos para generar animales
transgénicos, particularmente animales tales como ratones o ratas,
se han vuelto convencionales en la técnica y se describen, por
ejemplo, en U.S. Patent Nº. 4.736.866 y 4.870.009. Típicamente,
células particulares se marcaran para la incorporación del transgen
PRO21074 con potenciadores tisulares específicos. Los animales
transgénicos que incluyen una copia de un transgen que codifica
PRO21074 introducido en la línea germinal del animal en una etapa
embrionaria pueden usarse para examinar el efecto de la expresión
incrementada del ADN que codifica PRO21074. Tales animales pueden
usarse como animales de prueba para reactivos a pesar de conferir
protección para, por ejemplo, condiciones patológicas asociadas con
su sobreexpresión. Según esta faceta de la invención, un animal se
trata con el reactivo y una incidencia reducida de la condición
patológica, comparada con animales no tratados que llevan el
transgen, indicaría una intervención potencialmente terapéutica para
la condición patológica.
Alternativamente, pueden usarse homólogos no
humanos para PRO21074 para construir un animal PRO21074
"genéticamente deficiente" que tiene un gen defectuoso o
alterado que codifica PRO21074 como resultado de recombinación
homóloga entre el gen endógeno que codifica PRO21074 y ADN genómico
alterado que codifica PRO21074 introducido en una célula madre
embrionaria del animal. Por ejemplo, ADNc que codifica PRO21074
puede usarse para clonar ADN genómico que codifica PRO21074 según
las técnicas establecidas. Una porción del ADN genómico que codifica
PRO21074 puede detectarse o reemplazarse con otro gen, tal como un
gen que codifique un marcador selectivo que puede usarse para
control de integración. Típicamente, varias kilobases de ADN
inalterado complementario (tanto en los extremos 5' como 3') se
incluyen en el vector [ver por ejemplo, Thomas y Capecchi,
Cell, 51:503 (1987) para una descripción de vectores
homólogos de recombinación]. El vector se introduce en una línea
germinal embrionaria de células madre (por ejemplo mediante
electroporación) y se seleccionan células en las que el ADN
introducido que se han recombinado de forma homóloga con el ADN
endógeno [ver, por ejemplo, Li et al., Cell,
69:915 (1992)]. Las células seleccionadas se inyectan
entonces en un blastocisto de un animal (por ejemplo, un ratón o una
rata) para formar quimeras de agregación [ver, por ejemplo, Bradley,
en Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical
Approach, E. J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), pp.
113-152]. Un embrión quimérico puede implantarse
entonces en un animal femenino adoptivo pseudopreñado y el embrión
llevado a término para crear un animal "genéticamente
deficiente". La progenie que alberga el ADN recombinado
homólogamente en sus células germinales puede identificarse mediante
técnicas estándar y utilizarse para criar animales en los cuales
todas las células del animal contienen el ADN recombinado
homólogamente. Los animales genéticamente deficientes pueden
caracterizarse por ejemplo, por su habilidad para defenderse contra
ciertas condiciones patológicas y por su desarrollo de condiciones
patológicas debidas a la ausencia del polipéptido PRO21074.
Los ácidos nucleicos que codifican los
polipéptidos PRO21074 también pueden usarse en terapia génica. En
las aplicaciones de terapia génica, los genes se introducen en las
células para lograr la síntesis in vitro de un producto
genético terapéuticamente efectivo, por ejemplo para el reemplazo de
un gen defectuoso. "Terapia génica" incluye tanto la terapia
génica convencional donde se logra un efecto duradero mediante un
único tratamiento, y la administración de agentes génicos
terapéuticos, que implica la administración una vez o repetida de un
ADN o ARNm terapéuticamente efectivo. Los ARNs y ADNs antisentido
pueden usarse como agentes terapéuticos para bloquear la expresión
de ciertos genes in vivo. Ya se ha mostrado que los
oligonucleótidos antisentido cortos pueden importarse en las células
donde actúan como inhibidores, a pesar de sus bajas concentraciones
intracelulares causada por su absorción restringida por la membrana
celular. (Zamecnik et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
83:4143-4146 [1986]). Los oligonucleótidos
pueden modificarse para potenciar su absorción, por ejemplo
sustituyendo sus grupos fosfodiéster cargados negativamente por
grupos no cargados.
Hay una variedad de técnicas disponibles para
introducir ácido nucleico en células viables. Las técnicas varían
dependiendo de si el ácido nucleico se transfiere en células
cultivadas in vitro, o in vivo en células del huésped
deseado. Las técnicas adecuadas para la transferencia de ácido
nucleico en células de mamífero in vitro incluyen el uso de
liposomas, electroporación, microinyección, fusión celular,
DEAE-dextrano, procedimiento de precipitación de
fosfato de calcio, etc. Las técnicas actualmente preferidas de
transferencia de genes in vivo incluyen transfección con
vectores virales (típicamente retrovirales) y transfección de
mediación por proteino-liposoma de cubierta vírica
(Dzau et al., Trends in Bioteclanology 11,
205-210 [1993]). En algunas situaciones es deseable
proporcionar la fuente de ácido nucleico con un agente que
identifica las células objetivo, tales como un anticuerpo específico
para la proteína de la superficie de la membrana celular o la célula
objetivo, un ligando para un receptor sobre la célula objetivo, etc.
Donde se emplean liposomas, las proteínas que se unen a una proteína
de la superficie de la membrana celular asociada con endocitosis
puede usarse para identificar y/o facilitar la absorción, por
ejemplo proteínas de la cápside o fragmentos de el misma trópico
para un tipo de célula particular, anticuerpos para proteínas que se
someten a una internalización en repetición, proteínas que
identifican la localización intracelular y potencian la vida media
intracelular. La técnica de endocitosis de mediación por receptor se
describe por ejemplo en Wu et al., J. Biol. Chem.
262, 4429-4432 (1987); y Wagner et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87,
3410-3414 (1990). Para reseñas de protocolos de
marcado génico y terapia génica ver Anderson et al.,
Science 256, 808-813 (1992).
Los polipéptidos PRO21074 aquí descritos también
podrían emplearse como marcadores de peso molecular con propósitos
de electroforesis de proteínas.
Las moléculas de ácido nucleico que codifican
los polipéptidos PRO21074 o fragmentos del mismo aquí descrito son
útiles para la identificación de cromosomas. A este respecto, existe
una necesidad en curso de identificar nuevos marcadores
cromosómicos, debido a que muy pocos reactivos de marcadores
cromosómicos, basados en los datos reales de secuencia, se
encuentran actualmente disponibles. Cada molécula de ácido nucleico
PRO21074 de la presente invención puede usarse como un marcador
cromosómico.
Los polipéptidos PRO21074 y moléculas de ácido
nucleico de la presente invención también pueden usarse para
determinación el tipo de tejido, donde los polipéptidos PRO21074 de
la presente invención pueden expresarse diferencialmente en un
tejido en comparación con otro. Las moléculas de ácido nucleico
PRO21074 encontrarán uso para generar sondas para PCR, análisis
Northern, análisis Southern y análisis Western.
Los polipéptidos PRO21074 y moléculas de ácido
nucleico de la invención pueden ser útiles también en aplicaciones
terapéuticas relacionadas con la piel, por ejemplo, injertos de
piel, quemaduras, curaciones de la piel, reducción de cicatrices,
etc. La similitud estructural entre cartílago y piel, así como la
importancia de la matriz extracelular en la biología celular de la
piel sugiere que los polipéptidos PRO21074 y moléculas de ácido
nucleico aquí descritas potencialmente también causarían o
resultarían en reparación de la piel.
Los polipéptidos PRO21074 aquí descritos también
pueden emplearse como agentes terapéuticos. Los polipéptidos
PRO21074 de la presente invención pueden formularse según los
procedimientos conocidos para preparar composiciones
farmacéuticamente útiles, donde el presente producto PRO21074 se
combina en adición con un vehículo de transporte farmacéuticamente
aceptable. Las formulaciones terapéutica se preparará para
almacenarse mediante la mezcla del ingrediente activo que tiene el
grado de pureza deseado con transportadores, excipientes o
estabilizadores opcionales fisiológicamente aceptables
(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A.
Ed. (1980)), en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones
acuosas. Los transportadores, excipientes o estabilizadores son no
tóxicos para los receptores en las dosis y concentraciones
empleadas, e incluyen tampones tales como fosfato, citrato y otros
ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico;
polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10
residuos); proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina o
inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tales como
polivinilpirrolidona, amino ácidos tales como glicina, glutamina,
asparagina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros
carbohidratos que incluyen glucosa, mañosa, o dextrinas; agentes
quelantes tales como EDTA; alcoholes de azúcar tales como manitol o
sorbitol; contrapones formadores de sal, tales como sodio; y
surfactantes no iónicos tales como TWEEN^{TM}, PLURONICS^{TM} o
PEG.
Las formulaciones a utilizar para administración
in vivo deben ser estériles. Esto se consigue fácilmente
mediante filtración a través de membranas de filtración estériles,
antes o a continuación de liofilización y reconstitución.
Las presentes composiciones terapéuticas
generalmente se colocan en un contenedor que tiene un puerto de
acceso estéril, por ejemplo una bolsa de solución intravenosa o vial
que tenga un tapón que pueda atravesarse con una aguja de inyección
hipodérmica.
La ruta de administración está de acuerdo con
procedimientos conocidos, por ejemplo inyección o infusión mediante
rutas intravenosas, intraperitoneales, intracerebrales,
intramusculares, intraoculares, intraarteriales o intralesionales,
administración tópica, o mediante sistemas de liberación
sostenidos.
Las dosis y concentraciones deseadas de la droga
de composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden
variar dependiendo del uso particular previsto. La determinación de
la dosis o ruta de administración apropiada también está dentro de
la habilidad de un médico ordinario. Los experimentos con animales
proporcionan una guía confiable para la determinación de dosis
efectivas para terapia humana. La escala interespecífica de dosis
efectivas puede realizarse siguiendo los principios establecidos por
Mordenti, J. y Chappell, W. "The use of interspecies scaling in
toxicokinetics" In Toxicokinetics and New Drug Development,
Yacobi et al., Eds., Pergamon Press, New York 1989, pp.
42-96.
Cuando se emplea la administración in
vivo de un polipéptido PRO21074 o agonista o antagonista del
mismo, las dosis de cantidades normales pueden variar desde
aproximadamente 10 ng/kg hasta más de 100 mg/kg de peso corporal del
mamífero o más por día, preferentemente aproximadamente 1
\mug/kg/día a 10 mg/kg/día, dependiendo de la ruta de
administración. Las guías para dosis particulares y procedimientos
de suministro se proporcionan en la literatura, ver por ejemplo,
U.S. Pat. Nos. 4.657.760; 5.206.344; o 5.225.212. Se anticipa que
diferentes formulaciones serán efectivas para diferentes compuestos
de tratamiento y distintos desórdenes, que la administración
dirigida a un órgano o tejido, por ejemplo, puede necesitar el
suministro en una forma diferente de aquel de otro órgano o
tejido.
Donde se desea la administración de liberación
sostenida de un polipéptido PRO21074 en una formulación con
características de liberación adecuadas para el tratamiento de
cualquier enfermedad o desorden que requiera administración del
polipéptido PRO21074, se contempla el microencapsulado del
polipéptido PRO21074. El microencapsulado de proteínas recombinantes
para una liberación sostenida se han realizado exitosamente con
hormona de crecimiento humana (rhGH), interferon (rhIFN),
interleuquina 2 y MN rgp 120. Johnson et al., Nat.
Med., 2:795-799 (1996); Yasuda,
Biomed. Ther., 27:1221-1223 (1993);
Hora et al., Bio/Technology,
8:755-758 (1990); Cleland, "Design and
Production of Single Immunization Vaccines Using Polylactide
Polyglycolide Microsphere Systems", en Vaccine Design: The
Subunit and Adjuvant Approach, Powell and Newman, eds, (Plenum
Press: New York, 1995), pp. 439-462; WO 97/03692, WO
96/40072, WO 96/07399; y U.S. Pat. No. 5.654.010.
Las formulaciones de liberación sostenida de
estas proteínas fueron desarrolladas utilizando polímero de ácido
poli-láctico-coglicólico (PLGA)
debido a su biocompatibilidad y amplio rango de propiedades
biodegradables. Los productos de degradación de PLGA, ácidos láctico
y glicólico, pueden desalojarse rápidamente dentro del cuerpo
humano. Por otra parte, la degradabilidad de este polímero puede
ajustarse desde meses hasta años dependiendo de su peso molecular y
composición. Lewis, "Controlled release of bioactive agents from
lactide/glycolide polymer", en: M. Chasin and R. Langer (Eds.),
Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems (Marcel
Dekker: New York, 1990), pp. 1-41.
Esta invención engloba procedimientos de barrido
de compuestos para identificar aquellos que imitan al polipéptido
PRO21074 (agonistas) o evitan el efecto del polipéptido PRO21074
(antagonistas). Los ensayos de barrido para drogas candidatas a
antagonistas se diseñan para identificar compuestos que unen o se
acomplejan con los polipéptidos PRO21074 codificados por los genes
aquí identificados, o que de otra forma interfieren con la
interacción de los polipéptidos codificados con otras proteínas
celulares. Tales ensayos de barrido incluirán ensayos adecuados para
un barrido de alto rendimiento de bancos químicos, haciéndolos
particularmente adecuados para identificar drogas candidatas de
molécula pequeña.
Los ensayos pueden realizarse en una variedad de
formatos, incluyendo ensayos de unión
proteína-proteína, ensayos de barrido bioquímico,
inmunoensayos, y ensayos basados en células, que están bien
caracterizados en la técnica.
Todos los ensayos para antagonistas son comunes
en que llaman al contacto con la droga candidata con un polipéptido
PRO21074 codificado mediante un ácido nucleico aquí identificado
bajo condiciones y durante un termino suficiente para permitir que
estos dos componentes interactúen.
En ensayos de unión, la interacción es de unión
y el complejo formado puede aislarse o detectarse en la mezcla de
reacción. En una realización particular, el polipéptido PRO21074
codificado por el gen aquí identificado o la droga candidata se
inmoviliza en la fase sólida, por ejemplo, en una placa microtiter,
mediante uniones covalentes o no covalentes. La unión no covalente
generalmente se logra mediante el revestimiento de la fase sólida
con una solución del polipéptido PRO21074 y secándola.
Alternativamente, un anticuerpo inmobilizado, por ejemplo un
anticuerpo monoclonal, específico para el polipéptido PRO21074 a
inmovilizar puede usarse para anclarlo a una superficie sólida. El
ensayo se realiza mediante la adición del componente no
inmovilizado, que puede estar marcado con un marcador detectable, al
componente inmovilizado, por ejemplo, la superficie de revestimiento
que contiene el componente anclado. Cuando la reacción se completa,
los componentes no reaccionados se extraen, por ejemplo, mediante
lavado, y se detectan los complejos anclados sobre la superficie
sólida. Cuando el componente originalmente no inmovilizado lleva una
etiqueta detectable, la detección de una etiqueta inmovilizada sobre
la superficie indica que se ha producido el complejo. Donde el
componente originalmente no inmovilizado no lleva una etiqueta, el
complejo puede detectarse, por ejemplo, mediante el uso de un
anticuerpo marcado que se une específicamente al complejo
inmovilizado.
Si el componente candidato interactúa pero no se
une a un polipéptido PRO21074 particular codificado por un gen aquí
identificado, su interacción con ese polipéptido puede ensayarse por
procedimientos bien conocidos para detectar interacciones
proteína-proteína. Tales ensayos incluyen
aproximaciones tradicionales, tales como, por ejemplo, reticulado,
co-inmunoprecipitación, y
co-purificación a través de gradientes o columnas
cromatográficas. Además las interacciones
proteína-proteína pueden monitorizarse mediante el
uso de un sistema genético basado en levadura descrito por Fields y
co-autores (Fields y Song, Nature (London),
340:245-246 (1989); Chien et al.,
Proc. Natl. Acad Sci. USA,
88:9578-9582 (1991)) como describen Chevray y
Nathans, Proc. Natl. Acad Sci. USA, 89:
5789-5793 (1991). Muchos activadores
transcripcionales, tales como la levadura GAL4, consistente en dos
dominios modulares físicamente discretos, uno que actúa como el
dominio de unión de ADN, el otro funcionando como el dominio de
transcripción-activación. El sistema de expresión de
levadura descrito por las publicaciones anteriores (generalmente
referidas como el "sistema de dos híbridos") toma ventaja de
esta propiedad, y emplea dos proteínas híbridas, una en la cual la
proteína identificada se fusiona con el dominio de ADN de unión de
GAL4, y otra, en la cual las proteínas candidatas de activación se
fusionan al dominio de activación. La expresión de un gen indicador
GAL1-lacZ bajo control de un promotor activado con
GAL-4 depende de la reconstitución de la actividad
de GAL4 a través de una interacción
proteína-proteína. Las colonias que contienen
polipéptidos interactivos se detectan con un sustrato cromogénico de
\beta-galactosidasa. Un equipo completo
(MATCHMAKER^{TM}) para identificar interacciones
proteína-proteína entre dos proteínas específicas
usando la técnica de dos híbridos está comercialmente disponible en
Clontech. Este sistema también puede extenderse para mapear dominios
de proteínas en interacciones específicas de proteínas así como para
observar residuos de amino ácido que son cruciales para estas
interacciones.
Los compuestos que interfieren con la
interacción de un gen que codifica un polipéptido PRO21074 aquí
identificado y otros componentes intra- o extracelulares pueden
examinarse como sigue: usualmente se prepara una mezcla de reacción
conteniendo el producto del gen y el componente intra- o
extracelular bajo condiciones y durante un tiempo que permite la
interacción y la unión de los dos productos. Para examinar la
habilidad de un compuesto candidato para inhibir la unión, la
reacción se ejecuta en ausencia y en presencia del compuesto de
prueba. Además, puede añadirse un placebo a una tercera mezcla de
reacción, para servir como control positivo. La unión (formación de
complejo) entre el compuesto de prueba y el componente intra- o
extracelular presente en la mezcla se monitoriza como se ha descrito
con anterioridad. La formación de un complejo en la
reacción(es) de control pero no en la mezcla de reacción que
contiene el complejo de prueba indica que el compuesto de prueba
interfiere en la interacción del compuesto de prueba y en su socio
de reacción.
Para ensayar los antagonistas, el polipéptido
PRO21074 puede añadirse a una célula junto con el compuesto a barrer
para una actividad particular y la habilidad del compuesto para
inhibir la actividad de interés en presencia de polipéptido
PRO21074 indica que el compuesto es un antagonista del polipéptido
PRO21074. Alternativamente, los antagonistas pueden detectarse
mediante la combinación del polipéptido PRO21074 y un antagonista
potencial con receptores unidos a la membrana de polipéptido
PRO21074 o receptores recombinantes bajo condiciones apropiadas para
el ensayo de inhibición competitiva. El polipéptido PRO21074 pueden
marcarse, como mediante radioactividad, de forma tal que el número
de moléculas polipéptido PRO21074 unidas al receptor pueden usarse
para determinar la efectividad del antagonista potencial. El gen que
codifica el receptor puede identificarse mediante numerosos
procedimientos conocidos para aquellos entendidos en la técnica, por
ejemplo, cribado de ligandos y clasificación de FACS. Coligan et
al., Current Protocols in Immun., 1(2): Chapter 5
(1991). Preferentemente, la expresión del clonado se emplea donde el
ARN poliadenilatado se prepara a partir de una célula que responde
al polipéptido PRO21074 y un banco de ADNc creado a partir de este
ARN se divide en grupos y se usa para la transfección de células COS
u otras células que no responden al polipéptido PRO21074. Las
células transfectadas que crecen en placas de vidrio se exponen a
polipéptido PRO21074 marcado. El polipéptido PRO21074 puede marcarse
mediante una variedad de medios que incluyen la yodación o inclusión
de un sitio de reconocimiento para una proteína quinasa específica
del sitio. A continuación de la fijación e incubación, las placas se
someten a análisis autoradiográfico. Los grupos positivos se
identifican y se preparan subgrupos y se
re-transfectan utilizando un proceso de
subagrupamiento y re-barrido, produciendo
eventualmente un único clon que codifica al receptor putativo.
Como una aproximación alternativa para la
identificación del receptor, el polipéptido PRO21074 marcado puede
unirse por fotoactividad con la membrana celular o extraer
preparaciones que expresan la molécula del receptor. El material
reticulado se resuelve mediante PAGE y se exponen a película de
rayos X. El complejo marcado que contiene el receptor puede
eliminarse, resolverse en fragmentos de péptido, y someterse a micro
secuenciado de proteína. La secuencia de amino ácido obtenida del
micro secuenciado se utilizará para designar un juego de sondas
degeneradas de oligonucleótidos para barrer un bando de ADNc para
identificar el gen que codifica al receptor putativo.
En otro ensayo para antagonistas, las células de
mamíferos o una preparación de membrana que exprese el receptor
podría incubarse con polipéptido PRO21074 marcado en presencia del
compuesto candidato. La habilidad del compuesto para potenciar o
bloquear esta interacción puede medirse entonces.
Ejemplos más específicos de antagonistas
potenciales incluyen un oligonucleótido que se une a las fusiones de
inmunoglobulinas con polipéptido PRO21074, y, en particular,
anticuerpos que incluyen, sin limitación, anticuerpos poli- y
monoclonales y fragmentos de anticuerpos, anticuerpos de cadena
simple, anticuerpos de anti-idiotípicos, y versiones
quiméricas o humanizadas de dichos anticuerpos o fragmentos, así
como anticuerpos humanos y fragmentos de anticuerpos.
Alternativamente, un antagonista potencial puede ser una proteína
relacionada próximamente, por ejemplo, una forma mutada del
polipéptido PRO21074 que reconoce al receptor pero no imparte
efectos, inhibiendo así competitivamente la acción del polipéptido
PRO21074.
Otro antagonista potencial del polipéptido
PRO21074 es un ARN o ADN antisentido constructivamente preparado
usando tecnología antisentido, donde, por ejemplo, una molécula de
ARN o ADN antisentido para bloquear directamente la traslación de
ARNm mediante la hibridación al ARNm identificado y evitando la
traducción de proteína. La tecnología antisentido puede usarse para
controlar la expresión del gen a través de la formación de una
triple hélice o ADN o ARN antisentido, ambos procedimientos se basan
en la unión de un polinucleótido a ADN o ARN. Por ejemplo, la
porción 5' que codifica la secuencia de polinucleótido, que aquí
codifica los polipéptidos PRO21074 maduros, se usa para diseñar un
oligonucleótido ARN antisentido de entre aproximadamente 10 a 40
pares de bases de longitud. Un oligonucleótido ADN se diseña para
ser complementario a una región del gen implicada en la
transcripción (triple hélice, ver Lee et al., Nucl. Acids
Res., 6:3073 (1979); Cooney et al.,
Science, 241: 456 (1988); Dervan et al.,
Science, 251:1360 (1991)), evitando así la
transcripción y la producción del polipéptido PRO21074. El
oligonucleótido ARN antisentido se hibrida con el ARNm in
vivo y bloquea la traducción de la molécula de ARNm en el
polipéptido PRO21074 (antisentido - Okano, Neurochem.,
56:560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense
Inhibitors of Gene Expression (CRC Press: Boca Raton, FL, 1988).
Los oligonucleótidos antes descritos también pueden entregarse a
células tales que el ARN o ADN antisentido puede expresarse in
vivo para inhibir la producción del polipéptido PRO21074. Cuando
se usa ADN antisentido, los oligodeoxiribonucleótidos derivados del
sitio de traducción-iniciación, por ejemplo, se
prefieren entre aproximadamente -10 y +10 posiciones de la secuencia
de nucleótido del gen identificado.
Los antagonistas potenciales incluyen pequeñas
moléculas que se unen al sitio activo, el sitio de unión del
receptor, o factor de crecimiento u otro sitio relevante de unión
del polipéptido PRO21074, bloqueando así la actividad biológica
normal del polipéptido PRO21074. Ejemplos de pequeñas moléculas
incluyen, pero no están limitados a, pequeñas moléculas de péptidos
o a modo de péptidos, péptidos preferentemente solubles, y
compuestos sintéticos no peptidil orgánicos o inorgánicos.
Las ribozimas son moléculas enzimáticas de ARN
capaces de catalizar la rotura específica de ARN. Las ribozimas
actúan mediante hibridación específica de secuencia al ARN
complementario identificado, seguido por rotura endonucleótida. Los
sitios específicos de rotura de ribozimas dentro de un ARN potencial
identificado pueden identificarse mediante técnicas conocidas. Para
mayores detalles, ver por ejemplo, Rossi, Current Biology,
4:469-471 (1994), y PCT publicación Nº WO
97/33551 (publicado Setiembre 18, 1997).
Las moléculas de ácido nucleico en formación de
triple hélice usadas para inhibir la transcripción deben ser de
hebra simple y compuestas de deoxinucleótidos. La composición base
de estos oligonucleótidos se diseñan de forma tal que promueve la
formación de triple hélice mediante las reglas de emparejado de
bases de Hoogsteen, que generalmente requiere considerables tramos
de purinas o pirimidinas en una hebra de un dúplex. Para mayores
detalles ver, por ejemplo, PCT publicación Nº WO 97/33551,
supra.
Estas pequeñas moléculas pueden identificarse
mediante cualquiera o más de los ensayos de barridos discutidos con
anterioridad y/o mediante cualquier otra técnica de barrido bien
conocidas por aquellos entendidos en la técnica. Basado en su
identidad de secuencia con otros polipéptidos conocidos, los usos
potenciales para el polipéptido PRO21074 incluyen el uso como un
agente regulador en la degradación de péptidos, o en la regulación
de la unión de matriz proteica.
La presente invención proporciona además
anticuerpos anti-PRO21074. Anticuerpos ejemplares
incluyen anticuerpos policlonales, monoclonales, humanizados,
biespecífico, y heteroconjugados.
Los anticuerpos anti-PRO21074
pueden comprender anticuerpos policlonales. Los procedimientos para
preparar anticuerpos policlonales son conocidos para los entendidos
en la técnica. Los anticuerpos policlonales pueden extraerse en un
mamífero, por ejemplo, mediante una o más inyecciones de un agente
de inmunización y, si se desea, un adyuvante. Típicamente, el agente
de inmunización y/o adyuvante se inyectará en el mamífero mediante
múltiples inyecciones subcutáneas o intraperitoneales. El agente de
inmunización puede incluir el polipéptido PRO21074 o una proteína de
fusión del mismo. Puede ser útil conjugar el agente de inmunización
a una proteína conocida por ser inmunogénica en el mamífero que se
inmuniza. Ejemplos de tales proteínas inmunogénicas incluyen, pero
no están limitadas a, keyhole limpet hemocianina, albúmina sérica,
tiroglobulina bovina, e inhibidor de tripsina de la soya. Ejemplos
de adyuvantes que pueden emplearse incluyen adyuvante completo de
Freund y adyuvante MPL-TDM (monofosforil Lípido A,
trehalosa dicorinomicolato sintético). El protocolo de inmunización
puede seleccionarse por un entendido en la técnica sin excesiva
experimentación.
Los anticuerpos anti-PRO21074
pueden, alternativamente, ser anticuerpos monoclonales. Los
anticuerpos monoclonales pueden prepararse usando procedimientos de
hibridoma, tales como aquellos descritos por Kohler y Milstein,
Nature, 256:495 (1975). En un procedimiento de
hibridoma, un ratón, hámster u otro animal huésped apropiado, se
inmuniza típicamente con un agente inmunizante para provocar
linfocitos que producen o son capaces de producir anticuerpos que
específicamente se unirán al agente inmunizante. Alternativamente,
los linfocitos pueden inmunizarse in vitro.
El agente inmunizante típicamente incluirá el
polipéptido PRO21074 o una proteína de fusión del mismo.
Generalmente, se usan tanto linfocitos periféricos de sangre
("PBLs") si se desean células de origen humano, o se usan
células del bazo o células lymph nodE si se desean fuentes mamíferas
no humanas. Los linfocitos se fusionan con una línea de células
inmortalizadas utilizando un agente de fusión adecuado, tal como
polietilen glicol, para formar una célula hibridoma [Goding,
Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic
Press, (1986) pp. 59-103]. Las líneas de células
inmortalizadas usualmente son células mamíferas transformadas,
particularmente células de mieloma de origen roedor, bovino y
humano. Usualmente, se emplean las líneas de células de mieloma de
rata o ratón. Las células de hibridoma pueden cultivarse en un medio
de cultivo adecuado que preferentemente contiene una o más
sustancias que inhiben el crecimiento o supervivencia de las
células no fusionadas, inmortalizadas. Por ejemplo, si las células
parentales carecen de la enzima hipoxanina guanina fosforibosil
transferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas
típicamente incluirá hipoxantina, aminopterina, y timidina ("medio
HAT"), dichas sustancias evitan el crecimiento de células
deficientes en HGPRT.
Las líneas de células inmortalizadas son
aquellas que se fusionan eficientemente, soportan un alto nivel de
expresión de anticuerpo mediante las células productoras de
anticuerpos seleccionadas, y son sensibles a un medio como el medio
HAT. Las líneas más preferidas de células inmortalizadas son líneas
de mieloma murina, que pueden obtenerse, por ejemplo en el Salk
Institute Cell Distribution Center, San Diego, California y el
American Type Culture Collection, Manassas, Virginia. Las líneas de
células de mieloma humano y de heteromieloma
ratón-humano también se han descrito para la
producción de anticuerpos monoclonales humanos [Kozbor, J.
Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al.,
Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,
Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp.
51-63].
El medio de cultivo en el cual se cultivan las
células de hibridoma puede ensayarse entonces para ver la presencia
de anticuerpos monoclonales dirigidos contra PRO21074.
Preferentemente, la especificidad de unión de anticuerpos
monoclonales producidos por las células de hibridoma se determina
mediante inmunoprecipitación o mediante un ensayo de unión in
vitro, tal como un inmunoensayo (RIA) o ensayo inmunoabsorbente
de enzimas unidas (ELISA). Tales técnicas y ensayos son conocidos en
la técnica. La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal puede,
por ejemplo, determinarse mediante el análisis Scatchard de Munson y
Pollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980).
Después de identificar las células de hibridoma
deseadas, los clones pueden subclonarse limitando los procedimientos
de dilución y cultivados mediante procedimientos estándar [Goding,
supra]. Los medios de cultivo adecuados para este propósito
incluyen, por ejemplo, Dulbecco's Modified Eagle's Medium y medio
RPMI-1640. Alternativamente, las células de
hibridoma pueden cultivarse in vivo como ascites en un
mamífero.
Los anticuerpos monoclonales secretados por los
subclones puede aislarse o purificarse a partir del medio de cultivo
o fluido de ascites mediante procedimientos de purificación de
inmunoglobulinas convencionales tales como, por ejemplo, proteína
A-Sefarosa, cromatografía de hidroxilapatita,
electroforesis de gel, diálisis o cromatografía de afinidad.
Los anticuerpos monoclonales puede hacerse
también mediante procedimientos de ADN recombinante, tales como
aquellos descritos en U.S. Patent Nº 4.816.567. El ADN que codifica
los anticuerpos monoclonales de la invención puede aislarse y
secuenciarse fácilmente utilizando procedimientos convencionales
(por ejemplo, usando sondas de oligonucleótidos que son capaces de
unirse específicamente a genes que codifican las cadenas pesadas y
livianas de anticuerpos de murina). Las células de hibridoma de la
invención sirven como fuente preferida de dicho ADN. Una vez
aislado, el ADN puede colocarse en vectores de expresión, que luego
se transfectan en células huésped tales como células COS de simio,
células de ovario de hámster chino (CHO), o células de mieloma que
de otra forma no producen proteína inmunoglobulina, para obtener la
síntesis de anticuerpos monoclonales en las células huésped
recombinantes. El ADN también puede modificarse, por ejemplo,
mediante la sustitución de la secuencia de codificación de dominios
humanos constantes de cadena pesada y liviana en lugar de las
secuencias de murina homóloga [U.S. Patent Nº 4.816.567; Morrison
et al., supra] o uniendo covalentemente la secuencia
de codificación de inmunoglobulina toda o parte de la secuencia de
codificación de un polipéptido no inmunoglobulina. Dicho polipéptido
no inmunoglobulina puede sustituirse por los dominios constantes de
un anticuerpo de la invención, o puede sustituirse para los dominios
variables de un sitio de combinación de antígeno de un anticuerpo de
la invención para crear un anticuerpo quimérico bivalente.
Los anticuerpos pueden ser anticuerpos
monovalentes. Los procedimientos para preparar anticuerpos
monovalentes son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, un
procedimiento implica la expresión recombinante de inmunoglobulina
de cadena liviana y cadena pesada modificada. La cadena pesada se
trunca generalmente en cualquier punto de la región Fc para evitar
el reticulado de la cadena pesada. Alternativamente, los residuos
relevantes de cisteína son sustituidos con otro residuo de amino
ácido o se eliminan para evitar el reticulado.
Los procedimientos in vitro también son
adecuados para preparar anticuerpos monovalentes. La digestión de
anticuerpos para producir fragmentos del mismo, en particular,
fragmentos Fab, puede lograrse usando técnicas de rutina conocidas
en la técnica.
Los anticuerpos anti-PRO21074 de
la invención puede comprender además anticuerpos humanizados o
anticuerpos humanos. Las formas humanizadas de anticuerpos no
humanos (por ejemplo, murina) son inmunoglobulinas quiméricas,
cadenas de inmunoglobulinas o fragmentos de la misma (tales como Fv,
Fab, Fab', F(ab')_{2} u otras subsecuencias de unión de
antígenos de anticuerpos) que contienen secuencia mínima derivada de
inmunoglobulina no humana. Los anticuerpos humanizados incluyen
inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las cuales
residuos de una región determinante complementaria (CDR) del
receptor se reemplazan con residuos de un CDR de una especie no
humana (anticuerpo donante) tal como un ratón, rata o conejo que
tenga la especificidad, afinidad y capacidad deseada. En algunos
ejemplos, los residuos de elementos estructurales Fv de la
inmunoglobulina humana son reemplazados por correspondientes
residuos no humanos. Los anticuerpos humanizados también pueden
comprender residuos que se encuentran ni en el anticuerpo receptor
ni en el CDR importado o en las secuencias de elementos
estructurales. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá
sustancialmente la totalidad de al menos un, típicamente dos,
dominios variables, en el cual todas las regiones CDR corresponden a
aquellas de una inmunoglobulina no humana y todas o substancialmente
todas las regiones FR son aquellas de una secuencia de consenso de
inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado óptimamente también
comprenderá al menos una porción de una región constante de
inmunoglobulina (Fc), típicamente aquella de una inmunoglobulina
humana [Jones et al., Nature,
321:522-525 (1986); Riechmann et al.,
Nature, 332:323-329 (1988); y Presta,
Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596
(1992)].
Los procedimientos para humanizar anticuerpos no
humanos son bien conocidos en la técnica. Generalmente, un
anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos de amino ácido
introducidos a partir de una fuente que no es humana. Estos residuos
de amino ácidos no humanos con frecuencia se denominan como residuos
"importados", que típicamente se toman de un dominio variable
"importado". La humanización puede realizarse esencialmente
siguiendo el procedimiento de Winters y coautores [Jones et
al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et
al., Nature, 332:323-327 (1988);
Verhoeyen et al., Science,
239:1534-1536 (1988)], mediante la
sustitución de secuencias CDRs o CDR de roedor para las secuencias
correspondientes de un anticuerpo humano. En consecuencia, dichos
anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (U.S.
Patent Nº 4.816.567), en los que substancialmente menos de un
dominio variable humano intacto se ha sustituido por la secuencia
correspondiente a partir de una especie no humana. En la práctica,
los anticuerpos humanizados son típicamente anticuerpos humanos en
los cuales algunos residuos CDR y posiblemente algunos residuos FR
son sustituidos por residuos a partir de sitios análogos en
anticuerpos de roedores.
Los anticuerpos humanos también pueden
producirse usando varias técnicas conocidas en la técnica,
incluyendo biblioteca visual de fagos [Hoogenboom y Winter, J.
Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J.
Mol. Biol., 222:581 (1991)]. Las técnicas de Cole et
al. y Boerner et al. también están disponibles para la
preparación de anticuerpos humanos monoclonales (Cole et al.,
Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77
(1985) y Boerner et al., J. Immunol.,
147(1):86-95 (1991)]. Similarmente,
los anticuerpos humanos pueden hacerse introduciendo loci de
inmunoglobulina humana en animales transgénicos, por ejemplo,
ratones en los cuales los genes endógenos de la inmunoglobulina han
sido parcial o completamente inactivados. Ante la agresión, se
observa producción de anticuerpos humanos, lo que se parece mucho a
lo visto en humanos en todos los aspectos, incluyendo reacomodación
de genes, ensamblaje, y repertorio de anticuerpos. Esta aproximación
se describe, por ejemplo, en U.S. Patent Nº 5.545.807; 5.545.806;
5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.661.016, y en las siguientes
publicaciones científicas: Marks et al.,
Bio/Technology 10, 779-783 (1992);
Lonberg et al., Nature 368
856-859 (1994); Morrison, Nature 368,
812-13 (1994); Fishwild et al., Nature
Biotechnology 14, 845-51 (1996);
Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996);
Lonberg y Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13
65-93 (1995).
Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos
monoclonales, preferentemente humanos o humanizados, que tienen
especificidades de unión para al menos dos antígenos diferentes. En
el presente caso, una de las especificidades de unión es para el
PRO21074, la otra de para cualquier otro antígeno, y preferentemente
para una proteína o receptor o subunidad receptora de la superficie
celular.
Los procedimientos para hacer anticuerpos
biespecíficos son conocidos en la técnica. Tradicionalmente, la
producción recombinante de anticuerpos biespecíficos se basa en la
co-expresión de dos pares de cadena pesada/cadena
liviana de inmunoglobulina, donde las dos cadenas pesadas tienen
diferentes especificidades [Milstein y Cuello, Nature,
305:537-539 (1983)]. Debido al surtido
aleatorio de cadenas pesadas y livianas de inmunoglobulina, estos
hibridomas (cuadrotas) producen una mezcla potencial de diez
moléculas diferentes de anticuerpos, de las cuales sólo una tiene la
estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula
correcta usualmente se logra mediante etapas de cromatografía de
afinidad. Procedimientos similares se describen en WO 93/08829,
publicada 13 Mayo 1993, y en Traunecker et al., EMBO
J., 10:3655-3659 (1991).
Los dominios variables de anticuerpos con las
especificidades de unión deseadas (sitios de combinación
anticuerpo-antígeno) pueden fusionarse a secuencias
de dominio constante de inmunoglobulina. La fusión preferentemente
es con un dominio constante de inmunoglobulina de cadena pesada,
comprendiendo al menos parte de las regiones de bisagra, CH2 y CH3.
Se prefiere tener la primera región constante de cadena pesada (CH1)
conteniendo el sitio para la unión de la cadena liviana presente en
la menos una de las fusiones. Los ADNs que codifican las fusiones de
inmunoglobulina de cadena pesada y, si se desea, de inmunoglobulina
de cadena liviana, se insertan en vectores de expresión separados, y
se co-transfectan a un organismo huésped adecuado.
Para mayores detalles de la generación de anticuerpos biespecíficos
ver, por ejemplo, Suresh et al., Methods in
Enzymology, 121:210 (1986).
Según otra aproximación descrita en WO 96/27011,
la interfaz entre un par de moléculas de anticuerpos puede fraguarse
para maximizar el porcentaje de heterodímeros que se recuperan del
cultivo recombinante de células. La interfaz preferida comprende al
menos una parte de la región CH3 de un dominio constante de
anticuerpo. En este procedimiento, una o más cadenas pequeñas
laterales de amino ácidos de la interfaz de la primera molécula de
anticuerpo se reemplaza con cadenas laterales más grandes (por
ejemplo, tirosina o triptofano). Se crean las "cavidades"
compensatorias de tamaño idéntico o similar a la cadena(s)
lateral más grande sobre la interfaz de la segunda molécula de
anticuerpo reemplazando las cadenas laterales grandes de amino ácido
por unas más pequeñas (por ejemplo, alanina o treonina). Esto
proporciona un mecanismo para incrementar el rendimiento del
heterodímero sobre otros endoproductos no deseados tales como
homodímeros.
Los anticuerpos biespecíficos pueden prepararse
como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpo
(por ejemplo, anticuerpos biespecíficos F(ab')_{2}). Las
técnicas para generar anticuerpos biespecíficos a partir de
fragmentos de anticuerpos se han descrito en la literatura. Por
ejemplo, anticuerpos biespecíficos pueden prepararse usando unión
química. Brennan et al., Science 229:81 (1985)
describe un procedimiento en donde anticuerpos intactos se rompen
proteolíticamente para generar fragmentos F(ab')_{2}. Estos
fragmentos se reducen en presencia de agente acomplejante ditiol
arsenito sódico para estabilizar ditioles vecinales y evitar la
formación intermolecular de disulfuro. Los fragmentos Fab' generados
se convierten en derivados tionitrobenzoato (TNB). Uno de los
derivados Fab'-TNB se reconvierte luego a
Fab'-tiol mediante reducción con mecaptoetilamina y
se mezcla con una cantidad equimolar de otro derivado
Fab'-TNB para formar el anticuerpo biespecífico. Los
anticuerpos biespecíficos producidos pueden usarse como agentes para
la inmovilización selectiva de enzimas.
Pueden recuperarse directamente fragmentos Fab'
a partir de E. coli y acoplarse químicamente para formar
anticuerpos biespecíficos. Shalaby et al., J. Exp.
Med. 175:217-225 (1992) describe la producción
de una molécula de anticuerpo biespecífico completamente humanizado
F(ab')_{2}. Cada fragmento Fab' se secretó separadamente a
partir de E. coli y se sometió a acoplamiento químico
dirigido in vitro para formar el anticuerpo biespecífico. El
anticuerpo biespecífico así formado era capaz de unirse a células
que sobreexpresaban el receptor ErbB2 y a células humanas T
normales, así como disparar la actividad lítica de linfocitos
humanos citotóxicos contra tumores de mama humanos objetivos.
Distintas técnicas para hacer y aislar
fragmentos de anticuerpos biespecíficos directamente a partir de
cultivo recombinante de células también se han descrito. Por
ejemplo, se han producido anticuerpos biespecíficos utilizando
cierres de leucina. Kostelny et al., J. Immunol.
148(5):1547-1553 (1992). Los péptidos de
cierre de leucina de las proteínas Fos y Jun se unieron a las
porciones Fab' de dos anticuerpos diferentes mediante fusión de
genes. Los anticuerpos homodímeros se redujeron a la región de
bisagra para formar monómeros y luego se ç
re-oxidaron para formar los anticuerpos
heterodímeros. Este procedimiento también puede usarse para la
producción de anticuerpos homodímeros. La tecnología
"diacuerpo" descrita por Hollinger et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)
ha proporcionado un mecanismo alternativo para producir fragmentos
de anticuerpos biespecíficos. Los fragmentos comprenden un dominio
variable de cadena pesada (V_{H}) conectado a un dominio variable
de cadena ligera (V_{L}) mediante un vínculo que es demasiado
corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la
misma cadena. En consecuencia, los dominios V_{H} y V_{L} de un
fragmento se fuerzan a emparejarse con los dominios complementarios
V_{L} y V_{H} de otro fragmento, formando así dos sitios de
unión de antígeno. También se ha reseñado otra estrategia para
producir fragmentos de anticuerpos biespecíficos es el uso de
dímeros de cadena simple Fv (sFv). Ver Gruber et al., J.
Immunol. 152:5368 (1994).
Se contemplan anticuerpos con más de dos
valencias. Por ejemplo, pueden prepararse anticuerpos
triespecíficos. Tutt et al., J. Immunol. 147:60
(1991).
Los anticuerpos biespecíficos ejemplares pueden
unirse aquí a dos epitopes diferentes en un polipéptido PRO21074
dado. Alternativamente, un brazo polipéptido anti PRO21074 puede
combinarse con un brazo que se une a una molécula que dispare sobre
un leucocito tal como una molécula receptora de células T (por
ejemplo, CD2, CD3, CD28, o B7) o receptores Fc para IgG
(Fc\gammaR), tal como Fc\gammaRI (CD64), Fc\gammaRII (CD32) y
Fc\gammaRIII (CD16) para enfocar los mecanismos celulares de
defensa a la célula que expresa el polipéptido PRO21074 particular.
Los anticuerpos específicos también pueden usarse para localizar los
agentes citotóxicos a células que expresan un polipéptido PRO21074
particular. Estos anticuerpos poseen un brazo de unión de PRO21074 y
un brazo que une un agente citotóxico o un quelante radionúclido,
tal como EOTUBE, DPTA, DOTA o TETA. Otro anticuerpo biespecífico de
interés une el polipéptido PRO21074 y une además el factor de tejido
(TF).
Los anticuerpos heteroconjugados también están
dentro del ámbito de la presente invención. Los anticuerpos
heteroconjugados están compuestos de dos anticuerpos unidos en forma
covalente. Dichos anticuerpos han, por ejemplo, sido propuestos para
marcar sistemas celulares inmunes para células indeseadas [U.S.
Patent Nº 4.676.980], y para el tratamiento de infección por HIV [WO
91/00360; WO 92/200373; EP 03089]. Se contempla que los anticuerpos
pueden prepararse in vitro utilizando procedimientos
conocidos en química de proteína sintética, incluyendo aquellos que
implican agentes reticuladores. Por ejemplo, las inmunotoxinas
pueden construirse usando una reacción de intercambio de disulfuro o
mediante la formación de una unión tioéter. Los ejemplos de
reactivos adecuados para este propósito incluyen iminotiolato y
metil-4-mercaptobutrimidato y
aquellos descritos, por ejemplo, en la U.S. Patent Nº 4.676.980.
Puede ser deseable modificar el anticuerpo de la
invención respecto a la función efector, para potenciar, por
ejemplo, la efectividad del anticuerpo en el tratamiento del cáncer.
Por ejemplo, puede introducirse residuo(s) de cisteína en la
región Fc, permitiendo así la formación de intercadena de unión
disulfuro en esta región. El anticuerpo homodimérico así generado
puede tener una capacidad de internalización mejorada y/o
incrementar la muerte celular de mediación por el complemento y
citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC). Caron et
al., J. Exp Med., 176: 1191-1195
(1992) y Shopes, J. Immunol., 148:
2918-2922 (1992). Los anticuerpos homodiméricos con
actividad antitumoral potenciada también pueden prepararse usando
reticuladores heterobifuncionales como se describen en Wolff et
al. Cancer Research, 53: 2560-2565
(1993). Alternativamente, un anticuerpo puede prepararse que tiene
regiones Fc duales y puede por lo tanto tener lisis complementaria
potenciada y capacidades ADCC. Ver Stevenson et al.,
Anti-Cancer Drug Design, 3:
219-230 (1989).
La invención también concierne inmunoconjugados
que comprenden un anticuerpo conjugado a un agente citotóxico tal
como un agente quimoterapéutico, toxina (por ejemplo, una toxina
enzimáticamente activa de origen bacteriano, fúngico, vegetal o
animal, o fragmentos de la misma), o un isótopo radioactivo (por
ejemplo un radioconjugado).
Los agentes quimioterapéuticos útiles en la
generación de tales inmunoconjugados se ha descrito con
anterioridad. Las toxinas enzimáticamente activas y fragmentos del
mismo que pueden usarse incluyen difteria cadena A, fragmenos
activos no vinculantes de toxina de difteria, exotoxina cadena A (de
Pseudomonas aeruginosa), ricino cadena A, abrina cadena A,
modecina cadena A, alfa-sarcina, proteínas de
Aleurites fordii, proteínas de Phytolaca americana
(PAPI, PAPII, y PAP-S), inhibidor momordica
charantia, curcina, crotina, inhibidor de Saponaria officinalis,
gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina, y los
tricotecenes. Una variedad de radionúclidos está disponible para la
producción de anticuerpos radioconjugados. Los ejemplos incluye
^{212}Bi, ^{131}I, ^{131}In, ^{90}Y, y ^{186}Re.
Los conjugados del anticuerpo y el agente
citotóxico se producen usando una variedad de agentes bifuncionales
acoplantes de proteína tales como
N-succinimidil-3-(2-piridilditiol)
propionato (SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de
imidoésteres (tales como dimetil adipimidato HCL), ésteres activos
(tales como disuccinimidil suberato), aldehídos (tales como
glutareldehído), compuestos bis-azido (tales como
bis (p-azidobenzoil) hexanediamina), derivadoss
bis-diazonio (tales como
bis-(p-diazoniobenzoil)-etilenediamina),
diisocianatos (tal como tolieno 2,6-diisocianato), y
compuestos fluorina bis-activo (tales como
1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzeno).
Por ejemplo, una inmunotoxina de ricino puede prepararse como se
describe en Vitetta et al., Science, 238: 1098
(1987). El ácido
1-isotiocianatobenzil-3-metildietilen
triamino penta acético marcado con Carbono-14
(MX-DTPA) es un agente quelante ejemplar para la
conjugación de radionucleótido al anticuerpo. Ver WO94/11026.
En otra realización, el anticuerpo puede
conjugarse a un "receptor" (tal como streptavidin) para su
utilización en premarcado de tumores donde el conjugado
anticuerpo-receptor se administra al paciente,
seguido por la extracción de la circulación del conjugado no unido
usando un agente de compensación y luego la administración de un
"ligando" (por ejemplo, avidina) que está conjugado con un
agente citotóxico (por ejemplo, radionucleótido).
Los anticuerpos aquí descritos también pueden
formularse como inmunoliposomas. Las liposomas que contienen el
anticuerpo mediante procedimientos conocidos en la técnica, tal como
se describe en Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 82: 3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl
Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); y U.S. Pat. Nº 4.485.045
y 4.544.545. Los liposomas con tiempo de circulación potenciada se
describen en U.S. Patent Nº 5.013.556.
Los liposomas particularmente útiles pueden
generarse mediante el procedimiento de evaporación de fase reversa
con una composición lipídica que comprende fosfatidilcolina,
colesterol, y fosfatidiletanolamina derivada de PEG
(PEG-PE). Los liposomas se extruden a través de
filtros de tamaño de poro definido para producir liposomas con el
diámetro deseado. Los fragmentos Fab' del anticuerpo de la presente
invención puede conjugarse a los liposomas descritos por Martin
et al., J. Biol. Chem., 257:
286-288 (1982) a través de reacción de intercambio
disulfuro. Un agente quimioterapéutico (tal como Doxorubicin)
opcionalmente está contenido dentro del liposoma. Ver Gabizon et
al., J. National Cancer Inst., 81(19): 1484
(1989).
Los anticuerpos que se unen específicamente al
polipéptido PRO21074 aquí identificado, así como otras moléculas
identificadas mediante los ensayos de barrido aquí descritos con
anterioridad, pueden administrarse para el tratamiento de varios
desórdenes en forma de composiciones farmacéuticas.
Si el polipéptido PRO21074 es intracelular y se
usan anticuerpos completos como inhibidores, se prefieren
anticuerpos internalizadores. Sin embargo, pueden también usarse
lipecciones o liposomas para entregar el anticuerpo, o un fragmento
de anticuerpo, dentro de las células. Donde se emplean fragmentos de
anticuerpos, se prefiere el fragmento inhibidor más pequeño que se
une específicamente al dominio de unión de la proteína marcada. Por
ejemplo, basado en las secuencias de región variables de un
anticuerpo, pueden designarse moléculas de péptido que retienen la
habilidad de unir la secuencia de proteína marcada. Tales péptidos
pueden sintetizarse químicamente y/o producirse mediante tecnología
de ADN recombinante. Ver, por ejemplo, Marasco et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:
7889-7893 (1993).
La presente formulación también puede contener
más de un compuesto activo según sea necesario para la indicación
particular que se trata, preferentemente aquellos con actividades
complementarias que no se afectan adversamente entre sí.
Alternativamente, o además, la composición puede comprender un
agente que potencia su función, tales como, por ejemplo, un agente
citotóxico, citoquina, agente quimioterapéutico, o agente inhibidor
del crecimiento. Dichas moléculas están adecuadamente presentes en
combinación en cantidades que son efectivas para el propósito
pretendido.
Los ingredientes activos también pueden
encerrarse en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante
técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, por
ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y
microcápsulas de poli-(metilmetacilato), respectivamente, en
sistemas coloidales de suministro de drogas (por ejemplo, liposomas,
microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas, y
nanocápsulas) o en macroemulsiones. Tales técnicas se describen en
Remington's Pharmaceutical Sciences, supra.
Las formulaciones a utilizar para administración
in vivo deben ser estériles. Esto se consigue fácilmente
mediante filtración a través de membranas estériles de
filtración.
Pueden prepararse preparaciones de liberación
sostenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación
sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros sólidos
hidrofóbicos que contienen el anticuerpo, dichas matrices son en la
forma de artículos con forma, por ejemplo, películas o
microcápsulas. Los ejemplos de matrices de liberación sostenida
incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo
poli(2-hidroxietil-metacrilato),
o poli(vinilalcohol)) poliláctidos (U.S. Pat. Nº 3.773.919),
copolímeros de ácido L-glutámico y \gamma
etil-L-glutamato,
etilen-vinil acetato no degradable, copolímeros
degradables de ácido láctico-ácido glicólico tales como el LUPRON
DEPOT^{TM} (microesferas inyectables compuestas de copolímero de
ácido láctico-ácido glicólico y leuprolido acetato) y ácido
poli-D-(-)-3-hidroxibutírico.
Mientras que los polímeros tales como etilen-vinil
acetato y ácido láctico-ácido glicólico permiten la liberación de
moléculas durante 100 días, ciertos hidrogeles liberan proteínas
durante períodos de tiempo más cortos. Cuando los anticuerpos
encapsulados permanecen en el cuerpo por un largo tiempo, pueden
desnaturalizarse o agregarse como un resultado de la exposición a
humedad a 37ºC, resultando en una pérdida de actividad biológica y
posibles cambios en inmunogenicidad. Pueden concebirse estrategias
racionales para la estabilización dependiendo del mecanismo
implicado. Por ejemplo, si el mecanismo de agregación se descubre
que es intermolecular la formación de unión S-S a
través de intercambio de tio-disulfuro, la
estabilización puede lograrse mediante la modificación de los
residuos sulfidril, liofilizando a partir de soluciones ácidas,
controlando el contenido de humedad, utilizando los aditivos
apropiados, y desarrollando composiciones de matrices de polímero
específicas.
Los anticuerpos anti-PRO21074 de
la invención tienen distintas utilidades. Por ejemplo, los
anticuerpos anti-PRO21074 pueden usarse en ensayos
diagnósticos para PRO21074, por ejemplo, detectando su expresión en
células específicas, tejidos, fluido sinovial, plasma/suero, u
orina. Por ejemplo, el nivel de expresión de PRO21074 en el
cartílago articular mediante un anticuerpo
anti-PRO21074 puede usarse como un marcador para la
presencia y severidad de un desorden cartilaginoso. Distintas
técnicas de ensayos diagnóstico conocidas en la técnica pueden
utilizarse, tales como ensayos de unión competitiva, ensayos
sandwich directos o indirectos y ensayos de inmunoprecipitación
conducidos tanto en fases heterogéneas como homogéneas [Zola,
Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press,
Inc. (1987) pp. 147-158]. Los anticuerpos utilizados
en los ensayos diagnóstico pueden marcarse con una fracción
detectable. La fracción detectable debe ser capaz de producir, ya
sea directa o indirectamente, una señal detectable. Por ejemplo, la
fracción detectable puede ser un radioisótopo ^{3}H, ^{14}C,
^{32}P, ^{35}S, o ^{125}I, un compuesto fluorescente o
quimiluminiscente, tal como fluoresceína isotiocianato, rodamina, o
luciferina, o una enzima, tal como fosfatasa alcalina,
beta-galactosidasa o peroxidasa de rábano rusticano.
Puede emplearse cualquier procedimiento conocido en la técnica para
conjugar el anticuerpo con la fracción detectable, incluyendo
aquellos procedimientos descritos en Hunter et al.,
Nature, 144:945 (1962); David et al.,
Biochemistry, 13:1014 (1974); Pain et al.,
J. Immunol. Meth., 40:219 (1981); and Nygren, J.
Histochem. and Cytochem., 30:407 (1982).
Los anticuerpos anti-PRO21074
también son útiles para la purificación por afinidad de PRO21074 a
partir de cultivos celulares recombinantes o fuentes naturales. En
este procedimiento, los anticuerpos contra PRO21074 se inmovilizan
sobre un soporte adecuado, tal como resina Sephadex o papel de
filtro, utilizando procedimientos bien conocidos en la técnica. El
anticuerpo inmovilizado se contacta entonces con una muestra que
contiene el PRO21074 a purificar, y a continuación el soporte se
lava con un solvente adecuado que extraerá substancialmente todo el
material en la muestra excepto el PRO21074, que está unido al
anticuerpo inmovilizado. Finalmente, el soporte se lava con otro
solvente adecuado que liberará el PRO21074 del anticuerpo.
Los polipéptidos PRO21074 y antagonistas
utilizables con el procedimiento de la invención pueden
administrarse para el tratamiento de desórdenes cartilaginosos en
forma de una composición farmacéutica. Adicionalmente, pueden usarse
lipofecciones o liposomas para suministrar el polipéptido PRO21074 o
el antagonista.
Donde se utilizan fragmentos de anticuerpos, se
prefiere el fragmento inhibitorio más pequeño que se une
específicamente al dominio de unión de la proteína marcada. Por
ejemplo, basado en las secuencias de región variable de un
anticuerpo, pueden diseñarse moléculas de péptido que retienen la
habilidad de unir la secuencia de proteína marcada. Dichos péptidos
pueden sintetizarse químicamente y/o producirse mediante tecnología
de ADN recombinante (ver, por ejemplo, Marasco et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:
7889-7893 [1993]).
Las formulaciones terapéuticas se preparan para
el almacenamiento mediante el mezclado de un ingrediente activo que
tiene el grado deseado de pureza con transportadores
farmacéuticamente aceptables, excipientes y estabilizadores
opcionales (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition,
Osol, A. Ed. [1980]), en forma de formulaciones liofilizadas o
soluciones acuosas. Los transportadores, excipientes o
estabilizadores aceptables son no tóxicos para los receptores en las
dosis y concentraciones empleadas, e incluyen e incluyen tampones
tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes
que incluyen ácido ascórbico y metionina; preservativos (tales como
cloruro octadecildimetilbenzil amonio; hexametonio cloruro;
benzalconio cloruro, benzetonio cloruro, butil o benzil alcohol;
alquil parabenos tales como metil o propil parabeno, catecol;
resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y
m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular
(menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como
albúmina de suero, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros
hidrofílicos tales como polivinilpirrolidona, amino ácidos tales
como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina;
monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos que incluyen
glucosa, manosa, o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA;
azúcares tales como sucrosa, manitol, trehalosa o sorbitol;
contraiones formadores de sal, tales como sodio; complejos metálicos
(por ejemplo, complejos Zn-proteína) y/o
surfactantes no iónicos tales como TWEEN^{TM}, PLURONICS^{TM} o
polietilen glicol (PEG).
En cuanto a las formulaciones a utilizar para
administración in vivo, éstas deben ser estériles. La
formulación puede volverse estéril mediante filtración a través de
membranas de filtración estériles, antes o a continuación de
liofilización y reconstitución. Las presentes composiciones
terapéuticas generalmente se colocan en un contenedor que tiene un
puerto de acceso estéril, por ejemplo una bolsa de solución
intravenosa o vial que tenga un tapón que pueda atravesarse con una
aguja de inyección hipodérmica.
La presente formulación puede contener además
más de un compuesto activo según se necesite para la indicación
particular que se trata, preferentemente aquellas con actividades
complementarias que no se afecten adversamente entre sí.
Alternativamente, o además, la composición puede comprender un
agente citotóxico, citoquina, o agente inhibidor del crecimiento.
Dichas moléculas están adecuadamente presentes en combinación en
cantidades que son efectivas para el propósito pretendido.
La ruta de administración está de acuerdo con
procedimientos conocidos, por ejemplo inyección o infusión mediante
rutas intravenosas, intraperitoneales, intramusculares,
intraarteriales o intraarticulares, administración tópica, o
mediante sistemas de liberación sostenidos o de liberación
extendida. Opcionalmente, el compuesto activo de la formulación se
inyecta directamente dentro de la región cartilaginosa o junta
articular afectada.
Los agentes activos de la presente invención,
por ejemplo, anticuerpos, se administran a un mamífero,
preferentemente un humano, según los procedimientos conocidos, tales
como administración intravenosa como un bolo o mediante infusión
continua durante un período de tiempo, de forma intramuscular,
intraperitoneal, intracerebral, intracerebroespinal, subcutánea,
intraarticular, intrasinovial, intratecal, intraocular,
intralesional, oral, tópica, por inhalación o través de sistemas de
liberación sostenidos.
Las dosis y concentraciones deseadas de la droga
de composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden
variar dependiendo del uso particular previsto. La determinación de
la dosis o ruta de administración apropiada también está dentro de
la habilidad de un médico ordinario. Los experimentos con animales
proporcionan una guía confiable para la determinación de dosis
efectivas para terapia humana. La escala interespecífica de dosis
efectivas puede realizarse siguiendo los principios establecidos por
Mordenti, J. y Chappell, W. "The use of interspecies scaling in
toxicokinetics" In Toxicokinetics and New Drug Development,
Yacobi et al., Eds., Pergamon Press, New York 1989, pp.
42-96.
Los ingredientes activos también pueden
encerrase en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante
técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, por
ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y
microcápsulas de poli-(metilmetacilato), respectivamente, en
sistemas coloidales de suministro de droga (por ejemplo, liposomas,
microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y
nanocápsulas) o en macroemulsiones. Tales técnicas se describen en
Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A.
Ed. (1980).
Pueden prepararse preparaciones de liberación
sostenida. Ejemplos adecuados de preparaciones de liberación
sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros sólidos
hidrofóbicos que contienen el anticuerpo, dichas matrices están en
forma de artículos conformados, por ejemplo, películas o
microcápsulas. Ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen
poliésteres, hidrogeles (por ejemplo,
poli(2-hidroximetil-metacrilato),
o poli(vinilalcohol)), poliactidos (U.S. Patent Nº
3.773.919), copolímeros de ácido L-glutámico y
\gamma-etil-L-glutamato,
etileno no degradable, etilen-vinil acetato,
copolímeros degradables de ácido láctico-ácido glicólico tal como
LUPRON DEPOT^{TM} (microesferas inyectables compuestas de
copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de
leuprolido), y ácido
poli-D-(-)-3-hidroxibutírico.
La microencapsulación de proteínas recombinantes para liberación
sostenida se ha realizado con éxito con hormona de crecimiento
humano (rhGH), interferón-(rhIFN-), interleuquina-2,
y MN rpg 120. Johnson et al., Nat. Med. 2:
795-799 (1996); Yasuda et al., Biomed.
Ther. 27: 1221-1223 (1993); Hora et
al., Bio/Technology 8: 755-758
(1990); Cleland, "Design and Production of Single Immunization
Vaccines Using Polylactide Polyglycolide Microsphere Systems", in
Vaccine Design: The Subunit und Adjuvant Approach, Powell and
Newman, eds., (Penum Press: New York, 1995), pp.
439-462; WO 97/03692; WO 96/40072; WO 96/07399; y
U.S. Pat. No.
5.654.010.
5.654.010.
Las formulaciones de liberación sostenida de
estas proteínas pueden desarrollarse utilizando polímero de poli
láctico-ácido coglicólico (PLGA) debido a su biocompatibilidad y
amplio rango de propiedades biodegradables. Los productos de
degradación del PLGA, ácidos láctico y glicólico, pueden desalojarse
rápidamente dentro del cuerpo humano. Por otra parte, la
degradabilidad de este polímero puede ajustarse desde meses hasta
años dependiendo de su peso molecular y composición. Lewis,
"Controlled release of bioactive agents from lactide/glycolide
polymer", en: M. Chasin and R. Langer (Eds.), Biodegradable
Polymers as Drug Delivery Systems (Marcel Dekker: New York,
1990), pp. 1-41.
Mientras que los polímeros tales como
etilen-vinil acetato y ácido láctico-ácido glicólico
permiten la liberación de moléculas durante 100 días, ciertos
hidrogeles liberan proteínas durante períodos de tiempo más cortos.
Cuando los anticuerpos encapsulados permanecen en el cuerpo por un
largo tiempo, pueden desnaturalizarse o agregarse como un resultado
de la exposición a humedad a 37ºC, resultando en una pérdida de
actividad biológica y posibles cambios en inmunogenicidad. Pueden
concebirse estrategias racionales para la estabilización dependiendo
del mecanismo implicado. Por ejemplo, si el mecanismo de agregación
se descubre que es intermolecular la formación de unión
S-S a través de intercambio de
tio-disulfuro, la estabilización puede lograrse
mediante la modificación de los residuos sulfidril, liofilizando a
partir de soluciones ácidas, controlando el contenido de humedad,
utilizando los aditivos apropiados, y desarrollando composiciones de
matrices de polímero específicas.
Cuando se emplea la administración in
vivo de PRO21074 o antagonistas de PRO21074, las dosis de
cantidades normales pueden variar desde aproximadamente 10 ng/kg
hasta más de 100 mg/kg de peso corporal del mamífero o más por día,
preferentemente aproximadamente 1 mg/kg/día a 10 mg/kg/día,
dependiendo de la ruta de administración. Las guías para dosis
particulares y procedimientos de suministro se proporcionan en la
literatura, ver por ejemplo, U.S. Pat. Nos. 4.657.760; 5.206.344; o
5.225.212. Se anticipa que diferentes formulaciones serán efectivas
para diferentes compuestos de tratamiento y distintos desórdenes,
que la administración dirigida a un órgano o tejido, por ejemplo,
puede necesitar el suministro en una forma diferente de aquel de
otro órgano o tejido. Por otra parte, las dosis pueden administrarse
en una o más administraciones separadas, o mediante infusión
continua. Para administraciones repetidas durante varios días o más
tiempo, dependiendo de la condición, el tratamiento se sostiene
hasta que se produce una supresión deseada de los síntomas de la
enfermedad. Sin embargo, otros regímenes de dosis pueden ser útiles.
El progreso de esta terapia se monitoriza fácilmente mediante
técnicas y ensayos convencionales.
Para la prevención o tratamiento de la
enfermedad, la dosis apropiada de un agente activo dependerá del
tipo de enfermedad a tratar, como se definió con anterioridad, la
severidad y curso de la enfermedad, si el agente se administra con
propósitos preventivos o terapéuticos, terapia previa, la historia
clínica del paciente y la respuesta al agente, y la discreción del
médico a cargo. El agente se administra adecuadamente al paciente
una vez o durante una serie de tratamientos.
Se contempla que los polipéptidos, anticuerpos,
y otros compuestos activos de la presente invención pueden usarse
para tratar distintos desórdenes cartilaginosos. Las condiciones o
desórdenes ejemplares a tratar con los polipéptidos de la invención
incluyen, pero no están limitados a, lupus sistémico eritematoso,
artritis reumatoidea, artritis juvenil crónica, osteoartritis,
espondiloartropatías, esclerosis sistémica (escleroderma), miopatías
idiopáticas inflamatorias (dermatomiositis, polimiositis), síndrome
de Sjörgren, vasculitis sistémica, sarcoidiosis, anemia hemolítica
autoinmune (pancitopenia inmune, hemoglobinuria nocturna
paroxismal), trombocitopenia autoinmune (púrpura trombocitopénica
idiomática, trombocitopenia de mediación inmune), tiroiditis
(enfermedad de Grave, tiroiditis de Hashimoto, tiroiditis
linfocítica, tiroiditis atrófica), diabetes mellitus, enfermedad
renal de mediación inmune (glomerulonefritis, nefritis
túbulointersticial), enfermedades desmielinizantes de los sistemas
nervioso central y periférico tales como esclerosis múltiple,
polineuropatía desmielinizante idiomática o síndrome
Guillain-Barré, y polineuropatía desmielinizante
inflamatoria crónica, enfermedades hepatobiliares tales como
hepatitis infecciosa (hepatitis A, B, C, D, E y otros virus no
hepatotrópicos), hepatitis crónica activa autoinmune, cirrosis
biliar primaria, hepatitis granulomatosa, y colangitis esclerosante,
enfermedades inflamatorias intestinales (colitis ulcerosa:
enfermedad de Crohn), enteropatía sensible al glúten, y enfermedad
de Whipple, enfermedades autoinmunes o de mediación inmune de piel,
incluyendo enfermedades de piel bulosa, eritema multiforme y
dermatitis de contacto, psoriasis, enfermedades alérgicas tales como
asma, rinitis alérgica, dermatitis atópica, hipersensibilidad
alimentaria y urticaria, enfermedades inmunológicas del pulmón tales
como neumonías eosinofílicas, fibrosis pulmonar idiomática y
neumonitis hipersensible, enfermedades asociadas a transplantes
incluyendo rechazo del transplante y enfermedad de
injerto-versus-huésped.
En el lupus sistémico eritematoso, el mediador
central de la enfermedad es la producción de anticuerpos
auto-reactivos a auto proteínas/tejidos y la
subsiguiente generación de inflamación medidada inmune. Estos
anticuerpos ya sea directa o indirectamente median la lesión
tisular. A pesar que los linfocitos T no han mostrado estar
directamente implicados en el daño tisular, los linfocitos T se
requieren para el desarrollo de los anticuerpos
auto-reactivos. La génesis de la enfermedad es por
lo tanto dependiente de los linfocitos T. Múltiples órganos y
sistemas son afectados clínicamente, incluyendo riñón, pulmón,
sistema musculoesquelético, mucocutáneo, ojo, sistema nervioso
central, sistema cardiovascular, tracto gastrointestinal, médula
ósea y sangre.
La artritis reumatoidea (RA) es una enfermedad
inflamatoria crónica sistémica autoinmune que afecta la membrana
sinovial de múltiples articulaciones y que resultan en daño al
cartílago articular. La patogénesis es dependiente de los linfocitos
T y se asocia con la producción de factores reumatoideos,
auto-anticuerpos dirigidos contra proteínas
endógenas, con la formación resultante de complejos inmunes que
alcanzan altos niveles en el fluido articular y en sangre. Estos
complejos pueden inducir la infiltración por linfocitos, monolitos,
y neutrófilos en el compartimiento sinovial. Los tejidos afectados
son primariamente las articulaciones, con frecuencia en un patrón
simétrico. Sin embargo, la enfermedad fuera de las articulaciones se
produce en dos formas principales. En una forma, las lesiones
típicas son fibrosis pulmonares, vasculitis, y úlceras cutáneas. La
segunda forma es el llamado síndrome de Felty que se produce tarde
en el curso de la enfermedad de RA, algunas veces después de que la
enfermedad de la articulación se ha vuelto inactiva, e implica la
presencia de neutropenia, trombocitopenia y esplenomegalia. Esto
puede estar acompañado por vasculitis en órganos múltiples y
presencia de infartos, úlceras de piel y gangrena. Los pacientes con
frecuencia también desarrollan nódulos reumatoideos en el tejido
subcutáneo que recubre las articulaciones afectadas; en estados
tardíos, los nódulos tienen centros necróticos rodeados por un
infiltrado celular inflamatorio mixto. Otras manifestaciones que
pueden producirse en RA incluyen: pericarditis, pleuritis, arteritis
coronaria, neumonitis intersticial con fibrosis pulmonar, queratitis
seca, y nódulos reumatoides.
La artritis juvenil crónica es una enfermedad
inflamatoria crónica idiomática que comienza con frecuencia a edades
menores a 16 años y que tiene algunas similitudes con RA. Algunos
pacientes que son positivos en factor reumatoide se clasifican con
artritis juvenil reumatoide. La enfermedad se subclasifica en tres
categorías principales: pauciarticular, poliarticular y sistémica.
La artritis puede ser severa y conduce a la anquilosis articular y
crecimiento retardado. Otras manifestaciones pueden incluir uveitis
crónica anterior y amiloidosis sistémica.
Las espóndiloartropatías son un grupo de
desórdenes con algunas características clínicas comunes y la
asociación común con la expresión del producto génico
HLA-B27. Los desórdenes incluyen: anquilosis
esponilitis, síndrome de Reiter (artritis reactiva), artritis
asociada con enfermedad inflamatoria intestinal, esponilitis
asociada con psoriasis, esponiloartropatía juvenil y
espondiloartropatía indiferenciada. Las características distintivas
incluyen sacroielitis con o sin spondylitis; artritis inflamatoria
asimétrica; asociación con HLA-B27 (un alelo
serológicamente definido del locus HLA-B clase I
MHC); inflamación ocular, y ausencia de anticuerpos asociados con
otra enfermedad reumatoide. La célula más implicada como clave para
la inducción de la enfermedad es el linfocito T CD8+, una célula que
marca antígeno presentado en las moléculas de clase I MHC. Las
células T CD8+ pueden reaccionar contra el alelo MHC de clase I
HLA-B27 como si el mismo fuera un péptido foráneo
expresado por moléculas MHC clase I. Se han hecho hipótesis de que
un epitope de HLA-B27 puede imitar un epitope
bacteriano u otro antigénico microbiano y por lo tanto inducir una
respuesta de células T CD8+.
La esclerosis sistémica (escleroderma) tiene una
etiología desconocida. Un distintivo de la enfermedad es la
induración de la piel que se probablemente inducida por un proceso
inflamatorio activo. El escleroderma puede ser localizado o
sistémico. Las lesiones vasculares son comunes, y la lesión de
célula endotelial en la microvasculatura es un suceso temprano e
importante en el desarrollo de la esclerosis sistémica. Una base
inmunológica está implicada en la presencia de infiltrados celulares
en las lesiones cutáneas y la presencia de anticuerpos
anti-nucleares en muchos pacientes. El
ICAM-1 se sobreregula con frecuencia sobre la
superficie celular de los fibroblastos en lesiones de piel
sugiriendo que la interacción de las células T con estas células
puede tener un papel en la patogénesis de la enfermedad. Otros
órganos también pueden estar implicados. En el tracto
gastrointestinal, la atrofia y fibrosis del músculo liso puede
resultar en peristalisis/motilidad anormal. En el riñón, la
proliferación subendotelial intimal concéntrica que afecta arterias
de pequeña curvatura e interlobulares puede resultar en un flujo
sanguíneo renal reducido y por lo tanto proteinuria, azotemia e
hipertensión. En el músculo esquelético y cardíaco puede producirse
atrofia, fibrosis/cicatrizado intersticial, y necrosis. Finalmente,
el pulmón puede tener neumonitis intersticial y fibrosis
intersticial.
Las miopatías idiopáticas inflamatorias
incluyendo dermatomiositis, polimiositis y otros que son desórdenes
de inflamación muscular crónica de etiología desconocida que
resultan en debilidad muscular. La lesión/inflamación muscular con
frecuencia es simétrica y progresiva. Los autoanticuerpos están
asociados con la mayoría de formas. Estos anticuerpos específicos de
miositis se dirigen contra e inhiben la función de componentes
implicados en la síntesis de proteínas.
El síndrome de Sjögren es el resultado de una
inflamación de mediación inmune y la subsiguiente destrucción
funcional de las glándulas lagrimales y las glándulas salivales.
Esta enfermedad puede asociarse con o acompañarse de enfermedades
inflamatorias del tejido conectivo. La enfermedad se asocia con
producción de autoanticuerpos contra los antígenos Ro y La, siendo
ambos pequeños complejos de proteína-ARN. Las
lesiones resultan en queratitis seca, xerostomía, con otras
manifestaciones o asociaciones que incluyen cirrosis biliar,
neuropatía periférica o sensorial, y púrpura palpable.
Las vasculitis sistémicas son enfermedades en
las cuales la lesión primaria es la inflamación y subsiguiente daño
a los vasos sanguíneos que resulta en isquemia/necrosis/degeneración
de los tejidos provistos por los vasos afectados y eventual
disfunción endorgánica en algunos casos. Las vasculitis también
pueden producirse como una lesión secundaria o secuela de otras
enfermedades inmunes de mediación por inflamación tales como
artritis reumatoide, esclerosis sistémica, etc., en particular en
enfermedades también asociadas con la formación de complejos
inmunes. Las enfermedades en el grupo primario de vasculitis
sistémicas incluyen: vasculitis sistémica necrotizante;
poliarteritis nudosa, angeítis alérgica y granulomatosis,
poliangeítis; granulomatosis de Wegener, granulomatosis
linfomatoidea, y arteritis de células gigantes. Las vasculitis
misceláneas incluyen: síndrome de nudo linfático mucocutáneo (MLNS o
enfermedad de Kawasaki), vasculitis CNS aislada, enfermedad de
Behet, tromboangeítis obliterante (enfermedad de Buerger) y
venulitis cutánea necrotizante. El mecanismo patogénico de muchos de
los tipos de vasculitis enumeradas se cree que se deben
primariamente a la deposición de complejos de inmunoglobulina en la
pared del vaso y la subsiguiente inducción a una respuesta
inflamatoria ya sea vía ADCC, activación de complemento, o
ambos.
La sarcoidosis es una condición de etiología
desconocida que está caracterizada por la presencia de granulomas
epitelioides en prácticamente cualquier tejido del cuerpo; el más
común es que implica al pulmón. La patogénesis implica la
persistencia de macrófagos activados y células linfáticas en sitios
de la enfermedad con subsiguientes secuelas crónicas resultantes de
la liberación de productos local y sistemáticamente activos
liberados por estos tipos de células.
La anemia hemolítica autoinmune incluyendo la
anemia hemolítica, pancitopenia inmune y hemoglobinuria paroxismal
nocturna es un resultado de la producción de anticuerpos que
reacciona con antígenos expresados sobre la superficie de las
células rojas de la sangre (y en algunos casos, también algunas
otras células sanguíneas incluyendo plaquetas) y es un reflejo de la
extracción aquellas células recubiertas de anticuerpos a través de
lisis de mediación y/o mecanismos ADCC/Fc-mediado
por receptor.
En la trombocitopenia autoinmune incluyendo
púrpura trombocitopénica, y trombocitopenias de mediación inmune en
otros ajustes clínicos, la destrucción/extracción de plaquetas se
produce como resultado tanto de un anticuerpo o complemento que se
une a las plaquetas y la subsiguiente extracción mediante lisis de
complemento, ADCC o mecanismos FC-mediado
receptor.
La tiroiditis incluyendo la enfermedad de Grave,
tiroiditis de Hashimoto, tiroiditis linfocítica juvenil, y
tiroiditis atrópica, son el resultado de una respuesta autoinmune
contra antígenos tiroideos con producción de anticuerpos que
reaccionan con las proteínas presentes u con frecuencia específicas
de la glándula tiroides. Existen modelos experimentales que incluyen
modelos espontáneos: ratas (ratas BUF y BB) y pollos (cepa de pollos
obesos); modelos inducibles: inmunización de animales ya sea con
tiroglobulina o con antígeno tiroideo microsomal (peroxidada
tiroidea).
La diabetes mellitus es un desorden genético del
metabolismo de los carbohidratos, proteína y grasa asociada con una
insuficiencia relativa o absoluta de secreción de insulina y con
varios grados de resistencia a la insulina. En su expresión clínica
completamente desarrollada, está caracterizada por hiperglicemia en
ayunas y en la mayoría de pacientes antiguos mediante enfermedad
vascular arteroesclerótica y microangiopática y neuropatía. Las
diferencias entre las distintas formas de la enfermedad se expresan
en términos de causa y patogénesis, historia natural y respuesta al
tratamiento. Por lo tanto, la diabetes no es una enfermedad única
sino un síndrome.
La diabetes mellitus tipo I o
insulino-dependiente (IDDM) se produce
aproximadamente en un 10 por ciento de todos los pacientes
diabéticos en el mundo occidental. La diabetes mellitus tipo I o
diabetes insulino-dependiente es la destrucción
autoinmune de células \beta del islote pancreático; esta
destrucción está de mediación por auto-anticuerpos y
células T auto-reactivas. Los anticuerpos de la
insulina o del receptor de insulina también puede producir el
fenotipo de no reactividad a la insulina.
Clásicamente, este tipo de enfermedad se produce
con más frecuencia en la infancia y la adolescencia; sin embargo,
puede reconocerse y volverse sintomática a cualquier edad. En el
tipo más común de IDDM (Tipo IA), se ha postulado que factores
ambientales (adquiridos) tales como ciertas infecciones víricas, y
posiblemente agentes químicos, superpuestos sobre factores
genéticos, pueden conducir a la destrucción autoinmune de mediación
por células de las células \beta. Por lo tanto, respuestas
genéticamente determinadas inmunes anormales (unidas a asociaciones
HLA) caracterizadas por autoinmunidad de mediación por células y
humoral se cree que juegan un papel patogenético después de la
evocación por un factor ambiental. Un segundo tipo de IDDM (Tipo IB)
se cree que se debe a autoinmunidad primaria. Estos pacientes han
asociado enfermedades endocrinas autoinmunes tales como tiroiditis
de Hashimoto, enfermedad de Grave, enfermedad de Addison, fallo
gonadal primario, y enfermedades autoinmunes no endocrinas asociadas
tales como anemia perniciosa, enfermedades del tejido conectivo,
enfermedad celíaca y miastenia grave. La dependencia de la insulina
implica que la administración de insulina es esencial para evitar la
cetosis espontánea, el coma y la muerte. Sin embargo, aún con
tratamiento con insulina, los pacientes diabéticos pueden tener
muchos de los problemas adicionales asociados con la diabetes, por
ejemplo, desórdenes del tejido conectivo, neuropatía, etc.
El segundo tipo de diabetes, Tipo II o diabetes
mellitus no insulino-dependiente (NIDDM), presente
en aproximadamente el 90% de todos los diabéticos, también tiene una
base genética. Los pacientes con diabetes tipo II pueden tener un
peso corporal que oscila de normal a excesivo. La obesidad y la
resistencia patológica a la insulina ni mucho menos son esenciales
en la evolución de NIDDM. En la mayoría de los pacientes con NIDDM,
el diagnóstico se hace a mediana edad. Los pacientes con NIDDM no
son insulino-dependientes para evitar la cetosis,
pero pueden requerir insulina para la corrección de hiperglicemia de
ayuno sintomática o no sintomática si esto no puede lograrse con el
uso de la dieta o de agentes orales. Por lo tanto, la administración
terapéutica de insulina no distingue entre IDDM y NIDDM. En algunas
familias NIDDM, las respuestas secretoras de insulina a la glucosa
son tan bajas que pueden parecerse a aquellas de diabetes Tipo I
temprana en cualquier momento. Temprano en su historia natural, el
defecto secretor de insulina y la resistencia a la insulina puede
ser reversible mediante tratamiento (por ejemplo, reducción de peso)
con normalización de la tolerancia a la glucosa. Las complicaciones
crónicas típicas de la diabetes, en concreto macroangiopatía,
microangiopatía, neuropatía, y cataratas vistas en IDDM también se
observan en NIDDM.
Otros tipos de diabetes incluyen entidades
secundarias o asociadas con ciertas otras condiciones o síndromes.
La diabetes puede ser secundaria a la enfermedad pancreática o
extracción de tejido pancreático; enfermedades endocrinas tales
como acromegalia, síndrome de Cushing, feocromocitoma, glucagonoma,
somatostatinoma, o aldoteronism primaria; la administración de
hormonas, que causan hiperglicemia; y la administración de ciertas
drogas (por ejemplo, drogas antihipertensivas, diuréticos tiazide,
preparaciones que contienen estrógeno, drogas psicoactivas, agentes
simpatomiméticos). La diabetes puede asociarse con un gran número de
síndromes genéticos. Finalmente, la diabetes puede asociarse con
defectos genéticos del receptor insulínico o debido a anticuerpos
del receptor de insulina con o sin desórdenes inmunes asociados.
Las enfermedades de mediación inmune renales,
incluyendo glomerulonefritis y nefritis tubulointersticial, son el
resultado lesión de mediación de anticuerpos o linfocitos T del
tejido renal ya sea directamente como resultado de la producción de
anticuerpos autoreactivos o células T contra antígenos renales o
indirectamente como un resultado de la deposición de anticuerpos y/o
complejos inmunes en el riñón y que son reactivos contra otros
antígenos no renales. Por lo tanto, otras enfermedades de mediación
inmune que resultan en la formación de complejos inmune también
pueden inducir enfermedad renal de mediación inmune como una secuela
indirecta. Tanto los mecanismos inmunes directos e indirectos
resultan en una respuesta inflamatoria que produce/induce el
desarrollo de la lesión en tejidos renales con la resultante
discapacidad de la función del órgano y en algunos casos, progresión
al fallo renal. Pueden implicarse tanto mecanismos humorales como
celulares inmunes en la patogénesis de la lesión.
Las enfermedades desmielinizantes de los
sistemas nerviosos central y periférico, incluyendo esclerosis
múltiple; polineuropatía idiomática desmielinizante o síndrome
Guillain-Barré; y Polineuropatía Crónica
Inflamatoria Desmielinizante, se cree que tienen una base autoinmune
y resultan en la desmielinización del nervio como resultado de daño
causado a los oligodendrocitos o directamente a la mielina. En MS
hay evidencia que sugiere que la inducción y progresión de la
enfermedad depende de los linfocitos T. La esclerosis múltiple es
una enfermedad desmielinizante que es linfocitos
T-dependiente y tiene tanto un curso
recurrente-remitente o un curso progresivo crónico.
La etiología es desconocida; sin embargo, infecciones víricas,
predisposición genética, ambiente, y autoinmunidad contribuyen. Las
lesiones contienen infiltrados de células microgliales
predominantemente de mediación linfocitos T e infiltrando
macrófagos; CD4+ linfocitos T son el tipo celular predominante en
las lesiones. El mecanismo de muerte celular oligodendrocitos y la
subsiguiente desmielinización no es conocida pero es probable que
sea conducida por linfocitos T.
La enfermedad pulmonar inflamatoria y fibrótica,
incluyendo neumonías eosinofílicas, fibrosis pulmonares idiopáticas,
y neumonitis hipersensitivas pueden implicar una respuesta
inflamatoria inmune desregulada. La inhibición de esta respuesta
puede ser de beneficio terapéutico y está dentro del ámbito de la
invención.
La enfermedad autoinmune o de mediación inmune
de piel, incluyendo enfermedades bulosas de piel, eritema multiforme
y dermatitis de contacto están de mediación por
auto-anticuerpos, la génesis de las cuales es
linfocito T-dependiente.
La psoriasis es una enfermedad inflamatoria de
mediación linfocito T. Las lesiones contienen infiltrados de
linfocitos T, macrófagos y células procesadoras de antígeno, y
algunos neutrófilos.
Enfermedades asociadas a los transplantes,
incluyendo rechazo de Grafo y enfermedad
injerto-versus-huépsed (GVHD) son dependientes de linfocito
T; la inhibición de la función del linfocito T es paliativa.
Otras enfermedades en las cuales la intervención
de la respuesta inmune y/o inflamatoria tiene beneficio son
enfermedades infecciosas que incluyen pero no se limitan a infección
vírica (incluyendo, pero no limitándose a, AIDS, hepatitis A, B, C,
D, E y herpes), infección bacteriana, infecciones fúngicas, e
infecciones protozoarias y parasíticas (moléculas (o
derivados/agonistas) que estimulan la MLR pueden utilizarse
terapéuticamente para potenciar la respuesta inmune a agentes
infecciosos), enfermedades de inmunodeficiencia
(moléculas/derivados/agonistas) que estimula la MLR puede utilizarse
terapéuticamente para potenciar la respuesta inmune para condiciones
de inmunodeficiencia por infecciones hereditarias, adquiridas,
inducidas (como la infección HIV), o iatrogénicas (por ejemplo, a
partir de quimioterapia) y neoplasia.
Adicionalmente, la inhibición de moléculas con
propiedades proinflamatorias puede tener beneficio terapéutico en
lesiones de reperfusión; apoplejía; infarto de miocardo;
aterosclerosis; lesión aguda del pulmón, choque hemorrágico;
quemaduras; sepsis/choque séptico; necrosis tubular aguda;
endometriosis; enfermedad degenerativa articular y pancreatitis.
Los compuestos de la presente invención, por
ejemplo polipéptidos o anticuerpos, se administran a un mamífero,
preferentemente humano, según procedimientos conocidos, tales como
administración intravenosa como un bolo o mediante infusión
continua durante un período de tiempo, a través de rutas
intramusculares, intraperitoneales, intracerebroespinales,
subcutáneas, intraarticulares, intrasinoviales, intratecales,
orales, tópicas o por inhalación (intranasal, intrapulmonar).
Puede ser deseable administrar también
anticuerpos contra otras enfermedades inmunes asociadas o antígenos
asociados a tumores, tales como anticuerpos que se unen a CD20,
CD11a, CD 40, CD18, ErbB2, EGFR, ErbB3, ErbB4, o factor de
crecimiento endotelial vascular (VEGF). Alternativamente, o además,
pueden coadministrarse al paciente dos o más anticuerpos que unen
dos o más antígenos diferentes aquí descritos. Algunas veces, puede
ser beneficioso administrar también una o más citoquinas al
paciente. En una realización, los polipéptidos de la invención se
coadministran con un agente inhibidor del crecimiento. Por ejemplo,
el agente inhibidor del crecimiento puede administrarse primero,
seguido por un polipéptido de la invención. Sin embargo, también se
contempla la administración simultánea o primera administración. Las
dosis adecuadas para el agente inhibidor del crecimiento son
aquellas utilizadas actualmente y pueden disminuirse debido a la
acción combinada (sinergia) del agente inhibidor del crecimiento y
el polipéptido de la invención.
Para el tratamiento o la reducción en la
severidad de la enfermedad relacionada con la inmunidad, la dosis
apropiada de un compuesto de la invención dependerá del tipo de
enfermedad a tratar, como se define con anterioridad, la severidad
y el curso de la enfermedad, si el agente se administra con
propósitos preventivos o terapéuticos, terapia previa, la historia
clínica del paciente y la respuesta al compuesto, y la discreción
del médico asistente. El compuesto se administra adecuadamente al
paciente en una vez o durante una serie de tratamientos.
En otra realización de la invención, se
proporciona un artículo de fabricación que contenga materiales
útiles para el diagnóstico o tratamiento de los desórdenes descritos
con anterioridad. El artículo de fabricación comprende un
contenedor y una instrucción. Los contenedores adecuados incluyen,
por ejemplo, botella, viales, jeringas y tubos de ensayo. Los
contenedores pueden estar formados a partir de una variedad de
materiales tales como cristal o plástico. El contenedor soporta una
composición que es efectiva para diagnosticar o tratar la condición
y puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo el contenedor
puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que tenga un
tapón que pueda atravesarse con una aguja de inyección hipodérmica).
El agente activo en la composición típicamente es un polipéptido
PRO21074 o antagonista del mismo. La composición puede comprender
además cualquier o múltiples ingredientes aquí descritos. La
instrucción sobre, o asociada con, el contenedor indica que la
composición se utiliza para diagnosticar o tratar la condición de
elección. Por ejemplo, la instrucción puede indicar que la
composición es efectiva para el tratamiento de osteoartritis,
artritis reumatoide o cualquier otro desorden cartilaginoso. El
artículo de fabricación puede comprender además un segundo
contenedor que comprende un tampón farmacéuticamente aceptable,
tales como salino tamponado con fosfato, solución de Ringer y
solución de dextrosa. Puede incluir además otros materiales
deseables desde el punto de vista comercial y del usuario,
incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas, jeringas, e
inserciones del embalaje con instrucciones para el uso.
Los siguientes ejemplos se ofrecen sólo con
propósitos ilustrativos, y no intentan limitar el ámbito de la
presente invención de ninguna forma.
Los reactivos comercialmente disponibles
referidos en los ejemplos se utilizaron según las instrucciones del
fabricante a menos que se indique otra cosa. La fuente de aquellas
células identificadas en los siguientes ejemplos, y a lo largo de la
especificación, mediante números de registro ATCC es la American
Type Culture Collection, Manassas, VA.
Las secuencias de dominio extracelular (ECD)
(incluyendo la secuencia de señal de secreción, si hay alguna) de
aproximadamente 950 proteínas secretadas conocidas de la base de
datos pública Swiss-Prot se utilizaron para buscar
las bases de datos de secuencia. Las bases de datos incluyeron bases
de datos públicas (por ejemplo, GenBank). En este ejemplo, la
secuencia de ADN genómico de GenBank se analizó utilizando el
programa de predicción de genes GENSCAN, autorizado por la Stanford
University. El análisis GENSCAN predice las regiones de codificación
de genes, creando secuencias que pueden someterse a la búsqueda ECD.
La búsqueda se realizó utilizando el programa de ordenador BLAST o
BLAST2 [Altschul et al., Methods in Enzymology,
266:460-480 (1996)] como una comparación de
las secuencias de proteína s de ECD con una traducción de 6 marcos
de las secuencias. Esas comparaciones resultaron en un marcador
BLAST de 70 (o en algunos casos, 90) o mayor que no codifique
proteínas conocidas se agruparon y montaron en secuencias de
consenso de ADN con el programa "phrap" (Phil Green, University
of Washington, Seattle, Washington) si fuera necesario.
Se ensambló una secuencia de consenso de ADN.
Esta secuencia de consenso se designa aquí como DNA144306. Basado en
la secuencia de consenso DNA144306, se sintetizaron
oligonucleótidos: 1) para identificar mediante PCR un banco de ADNc
que contenga la secuencia de interés, y 2) para usar como sondas
para aislar un clon de la secuencia de codificación de longitud
completa para el PRO21074. Los iniciadores PCR hacia delante y hacia
atrás generalmente oscilaron desde 20 a 30 nucleótidos y con
frecuencia se diseñan para dar un producto PCR de aproximadamente
100-1000 bp de longitud. Las secuencias de sonda
típicamente tienen 40-55 bp de longitud. En algunos
casos, los oligonucleótidos adicionales se sintetizan cuando la
secuencia de consenso es mayor de aproximadamente
1-1,5kbp. Para barrer varios bancos para un clon de
longitud completa, el ADN de los bancos se barrió mediante
amplificación PCR, como por Ausubel et al., Current Protocols
in Molecular Biology, supra, con el par iniciador PCR. Un
banco positivo se utilizó entonces para aislar clones que codifican
el gen de interés utilizando el oligonucleótido sonda y uno de los
pares iniciadores.
Se sintetizaron los iniciadores PCR (hacia
delante y hacia detrás):
Iniciador PCR hacia delante
5'-AGAGGCCTTCCACCTATGGAGAAGAATGT-3' | (SEQ ID NO: 4) |
Iniciador PCR hacia atrás
5'-GGGGGCAAAGTAGTGAATGAAATAGTC-3' | (SEQ ID NO: 5) |
Adicionalmente, se construyó una sonda de
hibridación de oligonucleótido sintético a partir de la secuencia
de consenso DNA144306 que tiene la siguiente secuencia de
nucleótidos:
Sonda de hibridación
5'-GTTATTGACATAAGTGGCTTCATGTTTGGTACCAAGATGAAACAGGA-3' | (SEQ ID NO: 6). |
Un grupo de 50 bancos de ADNc humano diferentes
de distintos tejidos se utilizo en el clonado. Los bancos de ADNc
utilizado para aislar los clones de ADNc se construyó mediante
procedimientos estándar utilizando reactivos comercialmente
disponibles tales como aquellos de Invitrogen, San Diego, CA. El
ADNc se inició con oligo dT conteniendo un sitio NotI, unido cerrado
a adaptadores SalI de hemiquinasa, partido con NotI, apropiadamente
dimensionado con electroforesis de gel, y clonado en una orientación
adecuada en un vector de clonado adecuado (tal como pRKB o pRKD;
pRK5B es un precursor de pRK5D que no contiene el sitio Sfil; ver
Holmes et al., Science,
253:1278-1280 (1991)) en los sitios únicos
XhoI y NotI.
El secuenciado de ADN de los clones aislados
como se ha descrito con anterioridad dieron la secuencia de ADN de
longitud completa para un polipéptido PRO21074 de longitud completa
(designado aquí como ADN153576-2925 [figura 1, SEQ
ID NO: 1]) y la secuencia de proteína derivada para aquel
polipéptido PRO21074.
El clon de longitud completa identificado con
anterioridad contenía un único marco abierto de lectura con un sitio
de iniciación translacional aparente en las posiciones de nucleótido
31-33 y una señal de terminación en las posiciones
de nucleótido 3970-3972 (figura 1, SEQ ID NO: 1). EL
precursor de polipéptido predicho es de 1313 amino ácidos de
longitud, tiene un peso molecular calculado de aproximadamente
143187 daltons y un pl estipulado de aproximadamente 9,27. El
análisis de la secuencia de longitud completa PRO21074 mostrada en
la figura 2 (SEQ ID NO: 2) evidencia la presencia de una variedad de
importantes dominios de polipéptidos como se muestra en la figura 2,
donde las locaciones dadas por aquellos importantes dominios de
polipéptidos son aproximados a los descritos con anterioridad. El
ADN153576-2526 se ha depositado con ATCC de Mayo 23,
2000 y se le asignó el Nº de Depósito ATCC
1907-PTA.
Un análisis de la base de datos Dayhoff (versión
35.45 SwissProt 35), utilizando el análisis de alineación de
secuencia ALIGN-2 de la secuencia de longitud
completa mostrada en la figura 2 (SEQ ID NO: 2), evidenció
identidad de secuencia entre la secuencia de amino ácido PRO21074 y
las siguientes secuencias Dayhoff: HS1409_1; P_Y17829; P_Y32169;
ITH3_HUMAN; ITH4_HUMAN; ITH2_HUMAN; ITH1_HUMAN; AF119856_1;
P_Y48475;
HSU70136_1.
HSU70136_1.
El siguiente procedimiento describe el uso de
una secuencia de nucleótido que codifica PRO21074 como una sonda de
hibridación.
Se emplea el ADN que comprende todo o parte del
gen que codifica PRO21074 como una sonda para barrer ADNs homólogos
(tales como aquellos que codifican variantes de PRO21074 producidas
naturalmente) en bancos de ADNc de tejido humano o bancos de tejido
genómico humano.
La hibridación y lavado de los filtros que
contienen alguno de los bancos de ADNs se realiza bajo las
siguientes condiciones estrictas. La hibridación de la sonda
radiomarcada derivada de PRO21074 a los filtros se realiza en una
solución de 50% formamida, 5x SSC, 0,1% SDS, 0,1% pirofosfato de
sodio, 50 mM fosfato de sodio, pH 6,8, 2x solución sw Denhardt, y
10% sulfato dextrano a 42ºC durante 20 horas. El lavado de los
filtros se realiza en una solución acuosa de 0,1x SSC y 0,1% SDS a
42ºC.
Los ADNs que tienen una identidad de secuencia
deseada con el ADN que codifica la secuencia nativa PRO21074 de
longitud completa pueden identificarse entonces utilizando técnicas
estándar conocidas en la técnica.
El ADN que comprende cualquier parte del gen que
codifica PRO21074 puede también usarse como una sonda para detectar
sitos de expresión en secciones de tejido.
Este ejemplo ilustra la preparación de una forma
unglicosilada de PRO21074 mediante expresión recombinante en E.
coli.
La secuencia de ADN que codifica el PRO21074 es
inicialmente amplificada utilizando iniciadores PCR seleccionados.
Los iniciadores deben contener sitios de restricción de enzimas que
corresponden a los sitios de restricción de enzimas del vector de
expresión seleccionado. Puede emplearse una variedad de vectores de
expresión. Un ejemplo de un vector adecuado es pBR322 (derivado de
E. coli; ver Bolivar et al., Gene, 2:95
(1977)) que contiene genes para resistencia a la ampicilina y a la
tetraciclina. El vector es digerido con la enzima de restricción y
desfosforilado. Las secuencias amplificadas de PCR se ligan entonces
en el vector. El vector preferentemente incluirá secuencias que
codifiquen un gen de resistencia a los antibióticos, un promotor
trp, un conductor polihis (incluyendo los primeros seis codones
STII, secuencia polihis, y sitio de rotura de enteroquinasa), la
región de codificación de PRO21074, terminación transcripcional
lambda, y un gen argU. Además, el vector puede incluir al menos
porciones no significativas de las secciones 5' y 3' no traducidas
del ácido nucleico que codifica la secuencia nativa de PRO21074.
La mezcla de ligamiento se usa entonces para
transformar una cepa seleccionada de E. coli utilizando los
procedimientos descritos en Sambrook et al., supra.
Los transformantes se identifican por su habilidad para crecer sobre
placas LB y se seleccionan entonces colonias resistentes a los
antibióticos. El ADN plásmido puede aislarse y confirmarse mediante
análisis de restricción y secuenciado de ADN.
Clones seleccionados pueden cultivarse durante
una noche en medio de cultivo líquido tal como caldo LB suplementado
con antibióticos. El cultivo durante una noche puede usarse a
continuación para inocular un cultivo a mayor escala. Las células
se cultivan hasta una densidad óptica deseada, durante la cual el
promotor de expresión se enciende.
Después de cultivar las células durante unas
horas más, las células pueden cosecharse mediante centrifugación. El
gránulo de células obtenido por la centrifugación puede
solubilizarse utilizando varios agentes conocidos en la técnica, y
la proteína PRO21074 solubilizada puede purificarse entonces usando
una columna quelante de metal bajo condiciones que permitan una
unión fuerte de la proteína.
El PRO21074 puede expresarse en E. coli
en una forma marcada poli-His, utilizando el
siguiente procedimiento. El ADN que codifica al PRO21074 se amplia
inicialmente utilizando iniciadores PCR seleccionados. Los
iniciadores contendrán sitios de restricción de enzimas que
corresponden a los sitios de restricción de enzimas del vector de
expresión seleccionado, y otras secuencias útiles provistas para una
iniciación de la traducción eficiente y confiable, la purificación
rápida sobre una columna quelante de metal, y la extracción
proteolítica con enteroquinasa. Las secuencias PCR ampliadas,
marcadas poli-His se ligan entonces en un vector de
expresión, que se usa para transformar una E. coli huésped
basada en la cepa 52 (W3110 fuhA(tonA) lon galE
rpoHts(htpRts) clpP(lacIq). La células transformables
se cultivan primero en LB que contiene 50 mg/ml carbenicillin a 30ºC
con agitado hasta que se alcanza una O.D.600 de 3-5.
Los cultivos se diluyen luego 50-100 veces en medio
CRAP (preparado mezclando 3,57 g (NH_{4})_{2}SO_{4},
0,71 g citrato de sodio\cdot2H_{2}O, 1,07 g KCl, 5,36 g extracto
de levadura Difco, 5,36 g Sheffield hycase SF en 500 mL de agua, así
como 110 mM MPOS, pH 7,3, 0,55% (peso/volumen) glucosa y 7 mM
MgSO_{4}) y se cultivan durante aproximadamente
20-30 horas a 30ºC con agitado. Se extraen muestras
para verificar la expresión mediante análisis
SDS-PAGE, y la mayor parte del cultivo se centrifuga
para granular las células. Los gránulos de células se congelan hasta
la purificación y reincorporación.
Fermentaciones de la pasta de E. coli
desde 0,5 a 1 L (6-10 g gránulos) se vuelve a
suspender en 10 volúmenes (peso/volumen) en M guanidina, 20 mM Tris,
pH 8 tampón. Se añade sulfito de sodio sólido y tetrationato de
sodio para hacer concentraciones finales de 0,1 M y 0,02 M,
respectivamente, y la solución se agita toda la novel a 4ºC. Esta
etapa resulta en una proteína desnaturalizada con todos los residuos
de cisteína bloqueados mediante sulfitolización. La solución se
centrifuga a 40.000 rpm en una Beckman Ultracentifuge durante 30
min. El sobrenadante se diluye con 3-5 volúmenes de
columna de quelato metálico tampón (6 M guanidina, 20 mM Tris, pH
7,4) y se filtra a través de filtros de 0,22 micron para clarificar.
El extracto clarificado se carga en una columna de quelato metálico
5 ml Qiagen Ni-NTA equilibrada en la columna de
quelato metálico tampón. La columna se lava con tampón adicional que
contiene 50 mM imidazol (Calbiochem, grado Utrol), pH 7,4. La
proteína se eluye con tampón conteniendo 250 mM de imidazol. Las
fracciones que contienen la proteína deseada se agrupan y se guardan
a 4ºC. La concentración de proteína se estima mediante su
absorbancia a 280 nm usando el coeficiente de extinción basado en su
secuencia de amino ácido.
Las proteínas se reincorporan mediante la
dilución de la muestra lentamente en tampón de reincorporación
recién preparado consistente en: 20 mM Tris, pH 8,6, 0,3 M NaCl, 2,5
M urea, 5 mM cisteína, 20 mM glicina y 1 mM EDTA. Los volúmenes de
reincorporación se eligen de forma tal que la concentración final de
proteína está entre 50 a 100 microgramos/ml. La solución de
reincorporación se agita suavemente a 4ºC durante
12-36 horas. La reacción de reincorporación se
enfría mediante la adición de TFA hasta una concentración final de
0,4% (pH de aproximadamente 3). Antes de una purificación adicional
de la proteína, la solución se filtra a través de un filtro de 0,22
micrones y se añade acetonitrilo hasta una concentración final de
2-10%. La proteína reincorporada se cromatografía en
una columna de fase reversa Poros R1/H utilizando un tampón móvil de
0,1% TFA con elución con un gradiente de acetonitrilo de 10 al 80%.
Las alícuotas o fracciones con absorbancia A280 se analizan sobre
geles SDS de poliacrilamida y las fracciones que contienen proteína
reincorporada homogénea se agrupan. Generalmente, las especies
adecuadamente incorporadas de muchas proteínas se eluyen en las
concentraciones más bajas de acetonitrilo dado que aquellas especies
son las más compactas con sus interiores hidrofóbicos protegidos de
la interacción con la fase reversa de resina. Las especies agregadas
usualmente se eluyen a concentraciones más altas de acetonitrilo.
Además para redisolver formas mal incorporadas de proteínas de la
forma deseada, la etapa de fase reversa también extrae endotoxinas
de las
muestras.
muestras.
Las fracciones que contienen el polipéptido
PRO21074 incorporado se agrupan y el acetonitrilo se extrae usando
una corriente suave de nitrógeno dirigida a la solución. Las
proteínas se formulan en 20 mM Hepes, pH 6,8 con cloruro de sodio
0,14 M y 4% manitol mediante diálisis o mediante filtración en gel
utilizando resinas G25 Superfine (Pharmacia) equilibradas en el
tampón de formulación y filtrada estéril.
Este ejemplo ilustra la preparación de una forma
potencialmente glicosilada de PRO21074 mediante expresión
recombinante en células de mamíferos.
El vector pRK5 (ver EP 307.247, publicado en
Marzo 15, 1989), se emplea como el vector de expresión.
Opcionalmente el ADN de PRO21074 se liga en pRK5 con enzimas de
restricción seleccionadas para permitir la inserción del ADN de
PRO21074 utilizando procedimientos de ligazón tales como los
descritos en Sambrook et al., supra. El vector
resultante se llama pRK5-PRO21074.
En una realización, las células huésped
seleccionadas pueden ser células 293. Células humanas 293 (ATCC CCL
1573) se cultivan para confluir en placas de cultivo de tejido en
medios tales como DMEM suplementado con suero fetal de ternero y
opcionalmente componentes nutrientes y/o antibióticos.
Aproximadamente 10 \mug ADN pRK5-PRO21074 se
mezcla con aproximadamente 1 \mug ADN que codifica el gen VA ARN
Thimmappaya et al., Cell, 31:543 (1982)] y
disuelto en 500 \mul de 1 mM Tris-HCl, 0,1 mM
EDTA, 0,227 M CaCl_{2}. A esta mezcla se añade, en forma de gotas,
500 \mul de 50 mM HEPES (pH 7,35), 280 mM NaCl, 1,5 mM NaPO_{4},
y se deja formar un precipitado durante 10 minutos a 25ºC. El
precipitado se suspende y se añade a las células 293 y se deja
reposar durante aproximadamente cuatro horas a 37ºC. El medio de
cultivo se aspira y se añaden 2 ml de glicerol 20% en PBS durante 30
segundos. Las células 293 se lavan entonces con medio libre de
suero, se añade medio recién hechos y las células se incuban durante
aproximadamente 5 días.
Aproximadamente 24 horas después de las
transfecciones, el medio de cultivo se extrae y se reemplaza con
medio de cultivo (solo) o medio de cultivo conteniendo 200
\muCi/ml ^{35}S-cisteína y 200
\muCi/ml^{35}S-metionina. Después de 12 horas de
incubación, el medio condicionado se recoge, se concentra en un
filtro pivotante, y se carga sobre gel SDS 15%. El gel procesado
puede secarse y exponerse a una película durante un período
seleccionado de tiempo para revelar la presencia del polipéptido
PRO21074. Los cultivos que contienen células transfectadas pueden
someterse a incubación adicional (en medio libre de suero) y el
medio se comprueba en bioensayos seleccionados.
En una técnica alternativa, el PRO21074 puede
introducirse en células 293 de forma pasajera utilizando el
procedimiento de dextrano sulfato descrito por Somparyrac et
al., Proc. Natl. Acad Sci., 12:7575 (1981). Las
células 293 se cultivan hasta densidad máxima en un matraz para
centrifugar y se añaden 700 \mug ADN
pRK5-PRO21074. Las células primero se concentran a
partir del matraz para centrifugar mediante centrifugación y se
lavan con PBS. El precipitado ADN-dextrano se incuba
sobre el gránulo de células durante cuatro horas. Las células se
tratan con glicerol 20% durante 90 segundos, se lavan con medio de
cultivo de tejido, y se reintroducen en el matraz spinner que
contiene medio de cultivo de tejido, 5 \mug/ml insulina bovina y
0,1 trasferrina bovina. Después de aproximadamente cuatro días, el
medio condicionado se centrifuga y se filtra para extraer células y
residuos. La muestra que contiene PRO21074 expresado pueden
concentrarse y purificarse mediante cualquier procedimiento
seleccionado, tales como diálisis y/o cromatografía de columna.
En otra realización, el PRO21074 puede
expresarse en células CHO. El pRK5-PRO21074 puede
transfectarse en células CHO utilizando reactivos conocidos tales
como CaPO_{4} o DEAE-dextrano. Como se describe
con anterioridad, los cultivos celulares pueden incubarse, y el
medio reemplazarse con medio de cultivo (solo) o medio conteniendo
un radiomarcador tale como ^{35}S-metionina.
Después de determinar la presencia de polipéptido PRO21074, el medio
de cultivo puede reemplazarse con medio libre de suero.
Preferentemente, los cultivos se incuban durante aproximadamente 6
días, y luego se recoge el medio condicionado. El medio conteniendo
el PRO21074 expresado puede concentrarse y purificarse mediante
cualquier procedimiento seleccionado.
El PRO21074 marcado epitope también puede
expresarse en las células CHO huésped. El PRO21074 puede subclonarse
fuera del vector pRK5. La inserción del subclon puede someterse a
PCR para fusionarse en marco con un marcador epitope seleccionado
tal como un marcador poli-his en un vector de
expresión Baculovirus. La inserción de PRO21074 marcado
poli-his puede entonces subclonarse en un vector
conducido SV40 que contiene un marcador de selección tal como DHFR
para la selección de clones estables. Finalmente, las células CHO
pueden transfectarse (como se describe con anterioridad) con el
vector conducido SV40. El marcado puede realizarse, como se describe
con anterioridad, para verificar la expresión. El medio de cultivo
que contiene el PRO21074 marcado poli-his expresado
puede luego concentrarse y purificarse mediante cualquier
procedimiento seleccionado, tal como mediante cromatografía quelante
de afinidad Ni^{2+-}.
El PRO21074 también puede expresarse en células
CHO y/o COS mediante un procedimiento de expresión pasajera o en
células CHO mediante otro procedimiento estable de expresión.
La expresión estable en células CHO se realiza
utilizando el siguiente procedimiento. Las proteínas se expresan
como una construcción IgG (inmunoadhesina), en la cual las
secuencias de codificación para las formas solubles (por ejemplo,
dominios extracelulares) de las respectivas proteínas se fusionan en
una secuencia de región constante IgG1 que contiene la bisagra, CH2
y dominios CH2 y/o es una forma marcada
poli-His.
A continuación de la amplificación PCR, los
respectivos ADNs son subclonados en un vector de expresión CHO
utilizando técnicas estándar como se describe en Ausubel et
al., Current Protocols of Molecular Biology, Unit 3.16,
John Wiley and Sons (1997). Los vectores de expresión CHO se
construyen para tener sitios de restricción 5' y 3' compatibles del
ADN de interés para permitir el conveniente puenteo del ADNc. El
vector utilizado en la expresión en células CHO se describe en Lucas
et al., Nucl. Acids Res. 24:9
(1774-1779 (1996), y utiliza el promotor
temprano/potenciador SV40 para conducir la expresión del ADNc de
interés y dihidrofolato reductasa (DHFR). La expresión DHFR permite
la selección para un mantenimiento estable del plásmido a
continuación de la transfección.
Doce microorganismos del plásmido ADN deseado se
introduce en aproximadamente 10 millones de células CHO utilizando
reactivos de transfección comercialmente disponibles Superfect®
(Quialigen), Dosper® o Fungene®
(Boehringer Mannheim). Las células se cultivan como se describe en Lucas et al., supra. Aproximadamente 3 x 10^{-7} células se congelan en una ampolla para cultivo y producción adicional como se describe a continuación.
(Boehringer Mannheim). Las células se cultivan como se describe en Lucas et al., supra. Aproximadamente 3 x 10^{-7} células se congelan en una ampolla para cultivo y producción adicional como se describe a continuación.
Las ampollas que contienen el plásmido ADN se
derriten mediante la colocación en baño de agua y se mezclan
mediante torbellino. Los contenidos se pipetean en un tubo de
centrífuga que contiene 10 mLs de medio y se centrifugan a 1000 rpm
durante 5 minutos. El sobrenadante se aspira y las células se
resuspenden en 10 mL de medio selectivo (0,2 \mum de PS20 filtrado
con 5% suero bovino fetal diafiltrado 0,2 \mum). Las células se
ponen en alícuotas en un centrífugador de 100 mL que contiene 90 mL
de medio selectivo. Después de 1-2 días, las células
se transfieren a un spinner de 250 mL lleno con 150 mL de medio de
cultivo selectivo y se incuban a 37ºC. Después de otros
2-3 días, se siembran centrifugadores de 250 mL, 500
mL y 2000 mL con 3 x 10^{5} células/mL. El medio celular se
intercambia con medio fresco mediante centrifugación y resuspensión
en medio de producción. A pesar que puede emplearse cualquier medio
CHO, puede utilizarse un medio de producción descrito en U.S. Patent
Nº 5.122.469, publicada en Junio 16, 1992. Un spinner de producción
de 3L se siembra con 1,2 x 10^{6} células/mL. En el día 0, se
determinan el número de células y el pH. En el día 1, el spinner se
muestrea y se inicia la aspersión con aire filtrado. El día 2, el
spinner se muestrea, la temperatura se ajusta a 33ºC, y se toman 30
mL de glucosa 500 g/L y 0,6 mL de antiespumante 10% (por ejemplo,
emulsión polidimetilsiloxano 35%, Dow Corning 365 Medical Grade
Emulsion). A lo largo de la producción, el pH se ajusta según sea
necesario para mantenerlo alrededor de 7,2. Después de 10 días, o
hasta que la viabilidad caiga por debajo del 70%, el cultivo celular
se recoge mediante centrifugación y filtrado a través de un filtro
de 0,22 \mum. El filtrado se almacenó a 4ºC o se cargó
inmediatamente en columnas de purificación.
Para las construcciones marcadas
poli-His, las proteínas se purificaron utilizando
columna Ni-NTA (Qiagen). Antes de la purificación,
se añade imidazol al medio condicionado hasta una concentración de 5
mM. El medio condicionado se bombea sobre una columna de 6 ml
Ni-NTA equilibrada a 4ºC en 20 mM Hepes, pH 7,4,
tampón conteniendo NaCl 0,3 M y 5 mM imidazol a una tasa de flujo de
4-5 ml/min. Después de la carga, la columna se lava
con tampón de equilibrado adicional y la proteína eluida con tampón
de equilibrado que contiene 0,25 M imidazol. La proteína altamente
purificada se desaliniza a continuación en un tampón de
almacenamiento que contiene 10 mM Hepes, 0,14 NaCl y 4% manitol, pH
6,8, con una columna 25 ml G25 Superfine (Pharmacia) y se almacena
a
-80ºC.
-80ºC.
Las construcciones de inmunoadhesina (que
contiene Fc) se purifican a partir del medio condicionado como
sigue. El medio condicionado se bombea sobre una columna de 5 ml de
proteína A (Pharmacia) que se ha equilibrado con 20 mM tampón Na
fosfato, pH 6,8. Después de la carga, la columna se lava
exhaustivamente con tampón de equilibrado antes de la elución con
100 mM ácido cítrico, pH 3,5. La proteína eluida se neutraliza
inmediatamente mediante la recogida de fracciones de 1 ml en tubos
que contienen 275 \muL de buffer 1M Tris, pH 9. La proteína
altamente purificada se desaliniza a continuación en tampón de
almacenamiento como se ha descrito con anterioridad para las
proteínas marcadas poli-His. La homogeneidad calcula
mediante geles de SDS poliacrilamida y secuenciando el amino ácido
N-terminal mediante degradación de Edman.
El siguiente procedimiento describe la expresión
recombinante del PRO21074 en levadura.
Primero, se construyen los vectores de expresión
en levadura para la producción o secreción intracelular de PRO21074
a partir del promotor ADH2/GAPDH. El ADN que codifica el PRO21074 y
el promotor se insertan en sitios de restricción de enzimas
adecuados en el plásmido seleccionado para dirigir la expresión
intracelular del PRO21074. Para la secreción, el ADN que codifica
PRO21074 puede clonarse en el plásmido seleccionado, junto con el
ADN que codifica el promotor ADH2/GAPDH, un péptido señal PRO21074
nativo u otro péptido señal de mamífero, o, por ejemplo, un
alfa-factor de levadura o señal secretoria de
invertasa/secuencia guía, y secuencias de unión (si es necesario)
para la expresión del PRO21074.
Las células de levadura, tales como la levadura
cepa AB110, pueden entonces transformarse con los plásmidos de
expresión descritos con anterioridad y cultivarse en medios de
fermentación seleccionados. Los sobrenadantes de levadura
transformada pueden analizarse mediante precipitación con 10% ácido
tricloroacético y la separación mediante SDS-PAGE,
seguido por teñido de los geles con tinte Coomassie Blue.
El PRO21074 recombinante puede aislarse a
continuación y purificarse mediante la extracción de células de
levadura a partir del medio de fermentación mediante centrifugación
y luego concentrando el medio utilizando filtros de cartucho
seleccionados. El concentrado que contiene PRO21074 puede
purificarse además utilizando resinas de cromatografía de columna
seleccionadas.
El siguiente procedimiento describe la expresión
recombinante de PRO21074 en células de insectos infectadas con
Baculovirus.
La secuencia que codifica PRO21074 se fusiona
hacia arriba de una marca de epitope contenida en un vector de
expresión de baculovirus. Tales marcadores epitopes incluyen
marcadores poli-his y marcadores inmunoglobulinas
(como regiones Fc de IgG). Pueden emplearse una variedad de
plásmidos, incluyendo plásmidos derivados de plásmidos
comercialmente disponibles, tales como pVL1393 (Novagen).
Brevemente, la secuencia que codifica el PRO21074 o la porción
deseada de la secuencia de codificación de PRO21074 tal como la
secuencia que codifica el dominio extracelular de una proteína
transmembrana o la secuencia que codifica la proteína madura si la
proteína es extracelular y se amplifica mediante PCR con iniciadores
complementarios a las regiones 5' y 3'. El iniciador 5' puede
incorporar sitios flanqueadores (seleccionados) de restricción de
enzimas. El producto se digieren con aquellas enzimas de restricción
seleccionadas y subclonadas en el vector de expresión.
El baculovirus recombinante se genera mediante
cotransfección del plásmido anterior y virus ADN BaculoGold^{TM}
(Pharmingen) en células de Spodoptera frugiperda ("Sf9")
(ATCC CRL 1711) utilizando lipofectina (comercialmente disponible en
GIBCO-BRL). Después de 4-5 días de
incubación a 28ºC, los virus liberados se recogen y se utilizan para
aplicaciones posteriores. La infección vírica y la expresión de
proteína se realizan como se describe en O'Reilley et al.,
Baculovirus expression vectors: A Laboratory Manual, Oxford:
Oxford University Press (1994).
EL PRO21074 expresado marcado
poli-his puede purificarse entonces, por ejemplo,
mediante cromatografía de afinidad Ni^{2+}-quelato
como sigue. Los extractos se preparan a partir de células Sf9
recombinantes infectadas por virus como se describen Rupert et
al., Nature, 362:175-179 (1993).
Brevemente, las células Sf9 se lavan, se resus-
penden en tampón de sonicación 25 mL Hepes, pH 7,9; 12,5 mM MgCl_{2}; 0,1 mM EDTA; 10% glicerol; 0,1% NP-40; 0,4 M KCl), y sonicado dos veces durante 20 segundos sobre hielo. Los sonicados se aclaran mediante centrifugación, y el sobrenadante se diluye 50 veces en tampón de carga (50 mM fosfato, 300 mM NaCl, 10% glicerol, pH 7,8) y se filtra a través de un filtro 0,45 \mum. Una columna de agarosa Ni^{2+-}NTA (comercialmente disponible en Qiagen) se prepara con un volumen de cama de 5 mL, se lava con 25 mL de agua y se equilibra con 25 mL de tampón de carga. El extracto celular filtrado se carga en la columna a 0,5 mL por minuto. La columna se lava a línea base A_{280} con tampón de carga, en cuyo punto se comienza la recolección de la fracción. A continuación, la columna se lava con un tampón secundario de lavado 50 mM fosfato; 300 mM NaCl, 10% glicerol, pH 6,0), que eluye la proteína unida no específicamente. Después de alcanzar de nuevo la línea base A280, la columna se desarrolla con 0 a 500 mM de gradiente Imidazol en el tampón de lavado secundario. Se recogen fracciones de un mL y se analizan con SDS-PAGE y cementación con plata o técnica de Western blot con Ni^{2+}-NTA conjugado con fosfatasa alcalina (Qiagen). Las fracciones que contienen el PRO21074 marcado His_{10} eluido se agrupan y se dializan contra el tampón de
carga.
penden en tampón de sonicación 25 mL Hepes, pH 7,9; 12,5 mM MgCl_{2}; 0,1 mM EDTA; 10% glicerol; 0,1% NP-40; 0,4 M KCl), y sonicado dos veces durante 20 segundos sobre hielo. Los sonicados se aclaran mediante centrifugación, y el sobrenadante se diluye 50 veces en tampón de carga (50 mM fosfato, 300 mM NaCl, 10% glicerol, pH 7,8) y se filtra a través de un filtro 0,45 \mum. Una columna de agarosa Ni^{2+-}NTA (comercialmente disponible en Qiagen) se prepara con un volumen de cama de 5 mL, se lava con 25 mL de agua y se equilibra con 25 mL de tampón de carga. El extracto celular filtrado se carga en la columna a 0,5 mL por minuto. La columna se lava a línea base A_{280} con tampón de carga, en cuyo punto se comienza la recolección de la fracción. A continuación, la columna se lava con un tampón secundario de lavado 50 mM fosfato; 300 mM NaCl, 10% glicerol, pH 6,0), que eluye la proteína unida no específicamente. Después de alcanzar de nuevo la línea base A280, la columna se desarrolla con 0 a 500 mM de gradiente Imidazol en el tampón de lavado secundario. Se recogen fracciones de un mL y se analizan con SDS-PAGE y cementación con plata o técnica de Western blot con Ni^{2+}-NTA conjugado con fosfatasa alcalina (Qiagen). Las fracciones que contienen el PRO21074 marcado His_{10} eluido se agrupan y se dializan contra el tampón de
carga.
Alternativamente, la purificación del PRO21074
marcado IgG (o marcado Fc) puede realizarse utilizando técnicas de
cromatografía conocidas, incluyendo por ejemplo, cromatografía de
columna Proteína A o proteína G.
Este ejemplo ilustra la preparación de
anticuerpos monoclonales que pueden unirse específicamente a
PRO21074.
Las técnicas para producir los anticuerpos
monoclonales son conocidas en la técnica y se describen, por
ejemplo, en Goding, supra. Los inmunogenes que pueden
emplearse incluyen PRO21074 purificado, proteínas de fusión que
contienen PRO21074 y células que expresan PRO21074 recombinante
sobre la superficie celular. La selección del inmunogen puede
hacerse por los entendidos en la técnica sin demasiada
experimentación.
Ratones, tales como Balb/c, se inmunizan con el
inmunogen PRO21074 emulsionado con adyuvante completo de Freund y se
inyecta subcutáneamente o intraperitonealmente en una cantidad de
1-100 microgramos. Alternativamente, el inmunogen
se emulsiona con adyuvante MPL-TDM (Ribi
Immunochemical Research, Hamilton, MT) y se inyectan en las
almohadillas plantales traseras del animal. Los ratones inmunizados
se estimulan 10 a 12 días más tarde con inmunogen adicional
emulsionado en el adyuvante seleccionado. A continuación, durante
varias semanas, los ratones también se estimulan con inyecciones
adicionales de inmunización. Pueden obtenerse muestras de suero
periódicamente a partir de los ratones mediante sangrado
retro-orbital para la comprobación en ensayos ELISA
para detectar anticuerpos PRO21074.
Después que se haya detectado un título de
anticuerpo adecuado, los animales "positivos" para anticuerpos
pueden inyectarse con una inyección intravenosa final de PRO21074.
Tres o cuatro días más tarde, los ratones se sacrifican y se recogen
las células del bazo. Las células del bazo se fusionan entonces
(utilizando 35% polietilen glicol) con una línea célula de mieloma
murina tal como P3X63AgU.1, disponible de ATCC, Nº CRL 1597. Las
fusiones generan células hibridoma que pueden entonces colocarse en
placas de cultivo celular de 96 pocillos que contienen medio HAT
(hipoxantina, aminopterina y timidina) para inhibir la proliferación
de células no fusionadas, híbridos de mieloma, e híbridos de células
del bazo.
Las células hibridoma se barrerán en un ELISA
para su reactividad contra PRO21074. La determinación de células de
hibridoma "positivas" que secretan los anticuerpos monoclonales
deseados contra PRO21074 está dentro de las habilidades de la
técnica.
Las células de hibridoma positivas pueden
inyectarse intraperitonealmente en ratones Balb/c singénicos para
producir ascitos que contienen los anticuerpos monoclonales
anti-PRO21074. Alternativamente, las células
hibridoma pueden cultivarse en un matraces o botellas rotativas de
cultivos de tejidos. La purificación de los anticuerpos monoclonales
producidos en los ascites puede lograrse utilizando precipitación
con sulfato de amonio, seguida por cromatografía de gel de
exclusión. Alternativamente, puede emplearse cromatografía por
afinidad basada en la unión del anticuerpo a proteína A o proteína
G.
Polipéptidos PRO21074 nativos o recombinantes
pueden purificarse mediante una variedad de técnicas estándar en la
técnica de purificación de proteínas. Por ejemplo, el polipéptido
pro-PRO21074, polipéptido PRO21074 maduro, o
polipéptido pre-PRO21074 se purifica mediante
cromatografía utilizando anticuerpos específicos para el polipéptido
PRO21074 de interés. En general, se construye una columna de
inmunoafinidad mediante el acoplamiento covalente del anticuerpo
anti-PRO21074 polipéptido a una resina activada de
cromatografía.
Las inmunoglobulinas policlonales se preparan a
partir de suero inmune ya sea mediante precipitación mediante
sulfato de amonio o mediante purificación sobre Proteína A
inmobilizada (Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, N.J.).
Asimismo, los anticuerpos monoclonales se preparan a partir de
fluido de ascites de ratón mediante precipitación con sulfato de
amonio o cromatografía sobre Proteína A. La inmunoglobulina
parcialmente purificada se une de forma covalente a una resina
cromatográfica tales como SEPHAROSE^{TM}
CnBr-activada (Pharmacia LKB Biotechnology). El
anticuerpo se acopla a la resina, la resina se bloquea, y la resina
derivativa se lava según las instrucciones del fabricante.
Dicha columna de inmunoafinidad se utiliza en la
purificación del polipéptido PRO21074 mediante la preparación de una
fracción a partir de células que contienen polipéptido PRO21074 en
una forma soluble. Esta preparación se deriva mediante
solubilización de la totalidad de la célula o de una fracción
subcelular obtenida mediante centrifugación diferencial mediante la
adición de detergente o mediante otros procedimientos bien conocidos
en la técnica. Alternativamente, el polipéptido PRO21074 soluble
conteniendo una secuencia de señal puede secretarse en una cantidad
útil en el medio en el cual se cultivan las células.
Una preparación que contiene polipéptido
PRO21074 soluble se pasa sobre la columna de inmunoafinidad, y la
columna se lava bajo condiciones que permiten la absorbancia
definitiva del polipéptido PRO21074 (por ejemplo, tampones de alta
fuerza iónica en presencia de detergente). Entonces, la columna se
eluye bajo condiciones que deterioran la unión
anticuerpo/polipéptido PRO21074 (por ejemplo, un tampón de bajo pH
tal como aproximadamente pH 2-3, o una alta
concentración de un caotropo tales como urea o ion tiocianato), y se
recoge el polipéptido PRO21074.
Esta invención es particularmente útil para
barrer compuestos mediante el uso del polipéptido PRO21074 o
fragmentos unidos del mismo en cualquiera de una variedad de
técnicas de barrido de drogas. El polipéptido PRO21074 o fragmento
empleado en dicha prueba puede esta tanto libre en solución, fijado
a un soporte sólido, soportado sobre una superficie celular, o
ubicado intracelularmente. Un procedimiento de barrido de droga
utiliza células huésped eucariotas o procariotas que se transforman
establemente con ácidos nucleicos recombinantes que expresan el
polipéptido PRO21074 o fragmentos. Las drogas se barren contra
dichas células transformadas en ensayos de unión competitiva. Dichas
células, ya sea en forma viable o fija, pueden usarse para ensayos
estándar de unión. Uno puede medir, por ejemplo, la formación de
complejos entre polipéptido PRO21074 o un fragmento y el agente que
se comprueba. Alternativamente, puede examinarse la disminución en
la formación de complejo entre el polipéptido PRO2 y su célula
marcada o receptores marcados causada por el agente que se
comprueba.
Por lo tanto, la presente invención proporciona
procedimientos para barrido para drogas y cualquier otro agente que
pueden afectar a una enfermedad o desorden asociado con el
polipéptido PRO21074. Estos procedimientos comprenden contactar
dicho agente con un polipéptido PRO21074 o un fragmento del mismo y
ensayar (i) la presencia de un complejo entre el agente y el
polipéptido PRO21074 o fragmento, o (ii) la presencia de un complejo
entre el polipéptido PRO21074 o fragmento y la célula, a través de
procedimientos conocidos en la técnica. En tales ensayos de unión
competitiva, el polipéptido PRO21074 o fragmento está típicamente
marcado. Después de una incubación adecuada, el polipéptido PRO21074
o fragmentos libres se separan del presente en la forma unida, y la
cantidad de marcador libre o no acomplejada es una medida de la
habilidad del agente particular para unirse al polipéptido PRO21074
o para interferir con el complejo polipéptido PRO21074/célula.
Otra técnica para el barrido de drogas
proporciona un barrido de alto rendimiento para compuestos que
tienen adecuada afinidad de unión a un polipéptido y se describe en
detalle en WO 84/03564, publicado en Setiembre 13, 1984. Brevemente
expuesto, grandes números de diferentes compuestos de prueba de
pequeños péptidos se sintetizan sobre un sustrato sólido, tal como
clavijas de plástico o alguna otra superficie. Cuando se aplican a
un polipéptido PRO21074, los compuestos de prueba de péptido
reaccionan con polipéptido PRO21074 y se lavan. El polipéptido
PRO21074 unido se detecta mediante procedimientos conocidos en la
técnica. El polipéptido PRO21074 también pueden revestirse
directamente sobre placas para su uso en las técnicas de barrido de
droga antes mencionadas. Además, pueden utilizarse anticuerpos no
neutralizantes para capturar el péptido e inmovilizarlo sobre el
soporte
sólido.
sólido.
Esta invención también contempla el uso de
ensayos de barrido de droga competitivos en los cuales anticuerpos
neutralizantes capaces de unir polipéptido PRO21074 específicamente
compiten con un compuesto de prueba para unir polipéptido PRO21074
o fragmentos del mismo. De esta forma, los anticuerpos pueden usarse
para detectar la presencia de cualquier péptido que comparta uno o
más determinantes antigénicos con el polipéptido PRO21074.
La meta del diseño racional de droga es producir
análogos estructurales de un polipéptido biológicamente activo de
interés (por ejemplo, un polipéptido PRO21074) o de pequeñas
moléculas con las cuales interactúan, por ejemplo, agonistas,
antagonistas o inhibidores. Cualquiera de estos ejemplos pueden
usarse para crear drogas que son formas más activas o estables del
polipéptido PRO21074 o que potencian o interfieren con la función
del polipéptido PRO21074 in vivo (c.f., Hodgson,
Bio/Technology, 9: 19-21 (1991)).
En una aproximación, la estructura
tridimensional del polipéptido PRO21074, o de un complejo inhibidor
del polipéptido PRO21074, se determina mediante cristalografía de
rayos X, mediante modelado por ordenador o, más típicamente,
mediante una combinación de las dos aproximaciones. Tanto la forma
como las cargas del polipéptido PRO21074 deben determinarse para
elucidar la estructura y para determinar el sitio(s) activo
de la molécula. Menos frecuentemente, la información útil referente
a la estructura del polipéptido PRO21074 puede obtenerse mediante
modelado basado en la estructura de proteínas homólogas. En ambos
casos, la información estructural relevante se utiliza para diseñar
moléculas análogas a modo de polipéptido PRO21074 o para
identificar inhibidores eficientes. Ejemplos útiles de diseño
racional de drogas pueden incluir moléculas que tienen una actividad
o estabilidad mejoradas como se muestra en Braxton y Wells,
Biochemistry, 31:7796-7801 (1992) o
que actúan como inhibidores, agonistas o antagonistas de péptidos
nativos como se muestra en Athauda et al., J.
Biochem., 113:742-746 (1993).
También es posible aislar un anticuerpo
específico del marcador, seleccionado mediante un ensayo funcional,
como se describe con anterioridad, y luego resolver su estructura
cristalina. Esta aproximación, en principio, produce un fármaco
sobre el cual puede basarse el subsiguiente diseño de droga. Es
posible evitar totalmente la cristalografía de proteína mediante la
generación de anticuerpos anti-idiotípicos
(anti-ids) hacia un anticuerpo funcional,
farmacológicamente activo. Como una imagen especular de una imagen
especular, el sitio de unión del anti-ids se
esperará que sea un análogo del receptor original. El
anti-id puede utilizarse entonces para identificar y
aislar péptidos de grupos de péptidos producidos química o
biológicamente. Los péptidos aislados actúan luego como el
farmacor.
En virtud de la presente invención, cantidades
suficientes de polipéptido PRO21074 pueden hacerse disponibles para
realizar dichos estudios analíticos como la cristalografía de rayos
X. Además, el conocimiento de la secuencia de amino ácidos del
polipéptido PRO21074 aquí proporcionada brindará una guía para
aquellos que emplean técnicas de modelado mediante ordenador en
lugar de o además de la cristalografía de rayos X.
Se construyeron sondas de oligonucleótidos
ADN153576 mostrado en los dibujos adjuntos para utilizar en
reacciones cuantitativas de amplificación PCR. Las sondas de
oligonucleótidos se eligieron de manera de dar un fragmento
amplificado de aproximadamente 50-300 pares de bases
a partir del extremo 3' de su plantilla asociada en una reacción PCR
estándar. Las sondas de oligonucleótidos se emplearon en reacciones
cuantitativas de amplificación PCR con bancos de ADNc aislados de
diferentes fuentes de tejidos humanos adultos y/o fetales y
analizados mediante electroforesis de gel de agarosa para obtener
una determinación cuantitativa del nivel de expresión del ácido
nucleico que codifica al polipéptido PRO21074 en los distintos
tejidos comprobados. El conocimiento del patrón de expresión o la
expresión diferencial del ácido nucleico que codifica al polipéptido
PRO21074 en varios tipos distintos de tejidos humanos proporciona un
marcador diagnóstico útil para la tipificación de tejido, con o sin
otros marcadores específicos de tejido, para determinar la fuente
primaria de tejido de un tumor metastático, y similares. Los
resultados de estos ensayos demostraron que la molécula de ADN
153576-2925 se expresa altamente en el cartílago y
se expresa a niveles muy bajos (100-1000 veces menos
que la del cartílago) en médula ósea y próstata. No se expresa en
bancos de ADNc preparados a partir de HUVEV, bazo, corazón, útero,
tumor de colon, sustancia negra, hipocampo, macrófago, dendrocito o
linfoblasto.
El patrón de expresión específico del cartílago
del ADN 153576 se analizó utilizando la metodología Taíman PCR en
una variedad de ARN preparados a partir de distintos tejidos humanos
así como de bancos de ADNc humano. Los iniciadores y la sonda
utilizada para el análisis Taíman son los que siguen:
Se utilizaron protocolos Taqman estándar para
todos los experimentos tal como se indica en PE Applied Biosystems
Inc. "User Bulletin #2 ABI Prism 7700 Sequence Detection System,
December 11, 1997". Brevemente, en una reacción de 25 \mul se
utilizaron 50 ng de banco de ADNc o 6-50 ng de ARN
para cada muestra. Todas las muestras se normalizaron para expresión
actin beta para permitir la comparación entre muestras. Las
condiciones para las reacciones Taqman fueron las siguientes:
Los datos Taqman se analizaron mediante el
"Comparative CT method" utilizando el programa "Sequence
Detection Systems Ver. 1.6", Perkin Elmer Corporation, Foster
City, CA como se describe en "User Bulletin #2 ABI Prism 7700
Sequence Detection System, Diciembre 11, 1997, pg.
11-16".
Los siguientes materiales se han depositado en
American Type Culture Collection, 10801 University Blvd., Manassas,
VA 20110-2209, USA (ATCC):
Este depósito de realizó bajo las previsiones
del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del
Depósito de Microorganismos para el Propósito del Procedimiento de
Patente y las Regulaciones adjunta (Tratado de Budapest). Budapest
Treaty on the International Recognition of the Deposit of
Microorganisms for the Purpose of Patent Procedure and the
Regulations thereunder (Budapest Treaty). Esto asegura el
mantenimiento de un cultivo viable del depósito durante 30 años
desde la fecha de depósito. El depósito estará disponible mediante
ATCC bajos los términos del Tratado de Budapest, y sujeto a un
acuerdo entre Genentech, Inc. y ATCC, que asegura disponibilidad
permanente e irrestricta de la progenie del cultivo del depósito al
público bajo seguro de la pertinente patente U.S. o quedando
disponible al público de cualquier patente U.S. o solicitud
extranjera de patente, la que llegue primero, y asegura
disponibilidad de la progenie a uno determinado por Cominisionado de
Patentes y Marcas estadounidense capacitado para ello según 35 USC
§122 y las reglas del Comisionado consiguiente (incluyebdo 37 CFR
§1.14 con particular referencia a 886 OG 638).
El cesionario de la presente solicitud ha
acordado que si un cultivo de los materiales en depósito debe morir
o perderse o destruirse cuando se cultiva bajo condiciones
adecuadas, los materiales se reemplazarán de inmediato bajo
notificación con otro del mismo. La disponibilidad del material
depositado no debe interpretarse como una licencia para practicar la
invención en contravención de los derechos concedidos bajo la
autoridad de cualquier gobierno según sus leyes de patentes.
La especificación escrita precedente se
considera suficiente para permitir a un entendido en la técnica
practicar la invención. La presente invención no está limitada en
ámbito mediante la ejecución depositada, debido a que la realización
depositada se entiende como una única ilustración de ciertos
aspectos de la invención y cualquier ejecución que sea
funcionalmente equivalente se hallan dentro del ámbito de esta
invención. Aquí el depósito de material no constituye una admisión
que la descripción escrita aquí contenida es inadecuada para
permitir la práctica de cualquier aspecto de la invención,
incluyendo la mejor modalidad de la misma, ni debe ejecutarse
limitando el ámbito de las reivindicaciones de las ilustraciones
específicas que representa. Es más, distintas modificaciones de las
realizaciones aquí descritas además de aquellas aquí mostradas y
descritas serán evidentes para aquellos entendidos en la técnica a
partir de la descripción anterior y se encuadran dentro del ámbito
de las reivindicaciones adjuntas.
<110> Genentech, Inc. et al.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> PROCEDIMIENTO DE DIAGNÓSTICO Y
TRATAMIENTO DE DESÓRDENES CARTILAGINOSOS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> P2925-1R1PCT
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> PCT/US01/47933
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2001-12-07
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/254.513
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2000-12-08
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4684
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1313
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 565
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia ADN virtual unida a partir
de fragmentos EST
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Prímero PCR directo usado en
aislamiento de ADN 153576-2925
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagaggccttc cacctatgga gaagaatgt
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Prímero PCR inverso usado en el
aislamiento de ADN 153576-2925
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgggggcaaag tagtgaatga aatagtc
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sonda de hibridización usada en el
aislamiento de ADN 153576-2925
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgttattgaca taagtggctt catgtttggt accaagatga aacagga
\hfill47
Claims (34)
1. Molécula aislada de ácido nucleico que
comprende ADN que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con
un (a) una molécula de ADN que codifica al polipéptido PRO21074 que
comprende la secuencia de residuos de amino ácido desde 1 o 24 hasta
1313 de la figura 2, o (b) el complemento de la molécula de ADN de
(a).
2. Molécula aislada de ácido nucleico según la
reivindicación 1, caracterizada por el hecho de que comprende
la secuencia de posiciones de nucleótidos de 31 o 100 hasta 3969 de
la figura 1.
3. Molécula aislada de ácido nucleico según la
reivindicación 1, caracterizada por el hecho de que comprende
la secuencia de nucleótidos de la figura 1.
4. Molécula aislada de ácido nucleico según la
reivindicación 1, caracterizada por el hecho de que comprende
una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de residuos
de amino ácido de 1 o 24 hasta 1313 de la figura 2.
5. Molécula aislada de ácido nucleico que
comprende ADN que comprende al menos 80% de identidad de secuencia
con un (a) una molécula de ADN que codifica el mismo polipéptido
maduro codificado por la proteína humana ADNc depositada ATCC en
Mayo 23, 2000 bajo ATCC Deposit Nº 1907-PTA, o (b)
el complemento de la molécula de ADN de (a).
6. Molécula aislada de ácido nucleico de la
reivindicación 5 que comprende ADN que codifica el mismo polipéptido
maduro codificado por la proteína humana ADNc depositada ATCC en
Mayo 23, 2000 bajo ATCC Deposit Nº 1907-PTA.
7. Molécula aislada de ácido nucleico que
comprende ADN que comprende al menos 80% de identidad de secuencia
con una (a) secuencia de codificación del polipéptido de longitud
completa de la proteína humana ADNc depositada en ATCC en Mayo 23,
2000 bajo el ATCC Deposit Nº 1907-PTA, o (b) el
complemento de la secuencia de codificación de (a).
8. Molécula aislada de ácido nucleico según la
reivindicación 7, caracterizada por el hecho de que comprende
la secuencia de codificación del polipéptido de longitud completa de
la proteína humana ADNc depositada en ATCC en Mayo 23, 2000 bajo el
ATCC Deposit Nº 1907-PTA.
9. Molécula aislada de ácido nucleico que
codifica un polipéptido PRO21074 que comprende ADN que comprende al
menos 2036 nucleótidos que se hibrida bajo condiciones rigurosas de
hibridación y lavado al complemento de la secuencia de ácido
nucleico que codifica los amino ácidos 1 o 24 a 1313 de la figura
2.
10. Molécula aislada de ácido nucleico que
comprende al menos 2036 nucleótidos y que se produce mediante
hibridación de una molécula de ADN de prueba bajo condiciones
rigurosas de hibridación con (a) una molécula de ADN que codifica un
polipéptido PRO21074 que comprende una secuencia de residuos de
ácidos nucleicos de 1 o 24 a 1313 de la figura 2, o (b) el
complemento de la molécula de ADN de (a), y aislando la molécula de
prueba de ADN.
11. Molécula aislada de ácido nucleico según la
reivindicación 10, caracterizada por el hecho de que tiene al
menos 80% de identidad de secuencia con un (a) una molécula de ADN
que codifica un polipéptido PRO21074 que comprende una secuencia de
residuos de amino ácido de 1 o 24 a 1313 de la figura 2, o (b) el
complemento de la molécula de ADN de (a).
12. Vector que comprende la molécula de ácido
nucleico de cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 11.
13. Vector según la reivindicación 12,
caracterizado por el hecho de que dicha molécula de ácido
nucleico está unida operativamente a secuencias de control
reconocidas por una célula huésped transformada con el vector.
14. Molécula de ácido nucleico depositada con el
ATCC bajo el número de acceso 1907-PTA.
15. Célula huésped aislada que comprende el
vector de la reivindicación 12.
16. Célula huésped según la reivindicación 15,
caracterizada por el hecho de que dicha célula es una célula
CHO.
17. Célula huésped según la reivindicación 15,
caracterizada por el hecho de que dicha célula es una E.
coli.
18. Célula huésped según la reivindicación 15,
caracterizada por el hecho de que dicha célula es una célula
de levadura.
19. Procedimiento para producir polipéptido
PRO21074 que comprende el cultivo de la célula huésped de la
reivindicación 15 bajo condiciones adecuadas para la expresión de
dicho polipéptido PRO21074 y recuperar dicho polipéptido PRO21074
del cultivo célular.
20. Polipéptido PRO21074 aislado que comprende
una secuencia de amino ácido que comprende al menos un 80% de
identidad de secuencia de la secuencia de los residuos de amino
ácido desde aproximadamente 1 o 24 a 1313 de la figura 2.
21. Polipéptido PRO21074 aislado según la
reivindicación 20, caracterizado por el hecho de que
comprende residuos de amino ácido de 1 o 24 a 1313 de la figura
2.
22. Polipéptido PRO21074 aislado que tiene al
menos un 80% de identidad de secuencia del polipéptido codificado
por el ADNc insertado en el vector depositado ATCC en Mayo 23, 2000
como ATCC Deposit Nº 1907-PTA.
23. Polipéptido PRO21074 aislado según la
reivindicación 22, caracterizado por el hecho de que está
codificado por el ADNc insertado del vector depositado ATCC en Mayo
23, 2000 como ATCC Deposit Nº 1907-PTA.
24. Polipéptido PRO21074 aislado que comprende
la secuencia de residuos de amino ácido de 1 o 24 a 1313 de la
figura 2.
25. Polipéptido PRO21074 aislado producido
mediante un cultivo de una célula huésped que comprende la molécula
aislada de ácido nucleico de la reivindicación 10 bajo condiciones
adecuadas para la expresión de dicho polipéptido, y la recuperación
de dicho polipéptido a partir del cultivo celular.
26. Polipéptido PRO21074 aislado según la
reivindicación 25, caracterizado por el hecho de que dicha
molécula aislada de ácido nucleico tiene al menos un 80% de
identidad de secuencia de (a) una molécula de ADN que codifica el
polipéptido PRO21074 que comprende una secuencia de residuos de
amino ácido de 1 o 24 a 1313 de la figura 2, o (b) el complemento de
la molécula de ADN de (a).
27. Molécula quimérica que comprende un
polipéptido PRO21074 según cualquiera de las reivindicaciones 20 a
24 fusionada con una secuencia de amino ácido heteróloga.
28. Molécula quimérica según la reivindicación
27, caracterizada por el hecho de que dicha secuencia
heteróloga de amino ácido es una secuencia epitope marcadora.
29. Molécula quimérica según la reivindicación
27, caracterizada por el hecho de que dicha secuencia
heteróloga de amino ácido es una región Fc de una
inmunoglobulina.
30. Anticuerpo que se une específicamente a un
polipéptido PRO21074 según cualquiera de las reivindicaciones 20 a
24.
31. Anticuerpo según la reivindicación 30,
caracterizado por el hecho de que dicho anticuerpo es un
anticuerpo monoclonal.
32. Anticuerpo según la reivindicación 30,
caracterizado por el hecho de que dicho anticuerpo es un
anticuerpo humanizado.
33. Anticuerpo según la reivindicación 30,
caracterizado por el hecho de que dicho anticuerpo es un
fragmento de anticuerpo.
34. Composición de material que comprende (a) un
polipéptido PRO21074 según cualquiera de las reivindicaciones 20 a
24, o (b) un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 30
a 33 en adición con un transportador farmacéuticamente
aceptable.
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