ES2268901T3 - Procedimientos y composiciones para la inhibicion del crecimiento celular neoplastico. - Google Patents

Abstract

Utilización de un polipéptido PRO211 o agonista del mismo en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un tumor en un mamífero mediante inhibició ndirecta de la proliferación de las células tumorales, en la que dicho polipéptido PRO211 comprende una identidad de secuencia de aminoácidos de por lo menos el 80% con (a) los residuos 1 o aproximadamente 25 a 353 del polipéptido PRO211 mostrado en la figura 2 (SEC ID nº 2), o (b) X a 353 del polipéptido PRO211 mostrado en la figura 2 (SEC ID nº 2), en el que X es cualquier residuo mainoácido entre 20 y 29 de la figura 2 (SEC ID nº 2) y en el que dicho agonista es un anticuerpo agonista contra dicho polipéptido PRO211 o un fargmento del polipéptido PRO211 mostrado en la figura 2 (SEC ID nº 2).

Description

Procedimientos y composiciones para la inhibición del crecimiento celular neoplásico.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a procedimientos y composiciones para inhibir el crecimiento celular neoplásico. En particular, la presente invención se refiere a composiciones antitumorales y a procedimientos para el tratamiento de tumores. La invención se refiere además a procedimientos de cribado para identificar compuestos inhibidores del crecimiento, por ejemplo compuestos antitumorales.

Antecedentes de la invención

Los tumores malignos (cánceres) son la segunda causa principal de muerte en los Estados Unidos, tras la enfermedad cardíaca (Boring et al., CA Cancer J. Clin. 43:7, 1993).

El cáncer se caracteriza por el incremento del número de células anormales, neoplásicas, derivadas de un tejido normal que proliferan formando una masa tumoral, la invasión de tejidos contiguos a estas células tumorales neoplásicas, y la generación de células malignas que finalmente se extienden a través de la sangre o el sistema linfático a nódulos linfáticos regionales y a sitios distantes (metástasis). En un estado canceroso, la célula prolifera bajo condiciones en las que no crecerían las células normales. El cáncer se manifiesta en una amplia diversidad de formas, caracterizadas por diferentes grados de invasividad y agresividad.

A pesar de los recientes avances en la terapia del cáncer, existe una gran necesidad de nuevos agentes terapéuticos capaces de inhibir el crecimiento celular neoplásico. Por consiguiente, es el objetivo de la presente invención identificar compuestos capaces de inhibir el crecimiento de las células neoplásicas, tales como las células de cáncer.

Descripción resumida de la invención

La presente invención se refiere a procedimientos y a composiciones para inhibir el crecimiento celular neoplásico. Más particularmente, la invención se refiere a procedimientos y a composiciones para el tratamiento de tumores, incluyendo cánceres, tales como los cánceres de mama, próstata, colon, pulmón, ovario, renal y del SNC, leucemia, melanoma, etc., en pacientes mamíferos, preferentemente seres humanos.

En un aspecto, la presente invención se refiere a composiciones de materia que resultan útiles para la inhibición del crecimiento celular neoplásico, que comprender una cantidad eficaz de un polipéptido PRO211 o un agonista del mismo, según se define en las reivindicaciones, en mezcla con un portador farmacéuticamente aceptable. En una realización preferente, la composición de materia comprende una cantidad inhibidora del crecimiento de un polipéptido PRO211, o un agonista del mismo. En otra realización preferente, la composición comprende una cantidad citotóxica de un polipéptido PRO211, o un agonista del mismo. Opcionalmente las composiciones de materia pueden contener uno o más agentes adicionales inhibidores del crecimiento y/o citotóxicos y/o otros agentes quimioterapéuticos.

En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a composiciones de materia que resultan útiles para el tratamiento de un tumor en un mamífero, que comprender una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido PRO211 o un agonista del mismo, según se define en las reivindicaciones. El tumor preferentemente es un cáncer.

En otro aspecto, la invención se refiere a un procedimiento in vitro para inhibir el crecimiento de una célula tumoral, que comprende exponer la célula a una cantidad eficaz de un polipéptido PRO211 o a un agonista del mismo, según se define en las reivindicaciones. En una realización particular, el agonista es un anticuerpo anti-agonista PRO211. La invención también proporciona productos para la utilización en procedimientos de tratamiento y la utilización de productos en la preparación de medicamentos para tratamientos médicos, ambos según se define en las reivindicaciones.

En todavía otra realización, la invención se refiere a un artículo manufacturado que comprende:

un recipiente; y

una composición que comprende un agente activo contenido dentro del recipiente; en el que la composición resulta eficaz para inhibir el crecimiento celular neoplásico, por ejemplo el crecimiento de las células tumorales, y el agente activo en la composición es un polipéptido PRO211 o un agonista del mismo, según se define en las reivindicaciones. En una realización particular, el agonista es un anticuerpo anti-agonista PRO211. También se encuentran dentro del alcance de la presente invención artículos manufacturados similares que comprenden un polipéptido PRO211 o un agonista del mismo, en una cantidad que resulta terapéuticamente eficaz para el tratamiento de un tumor. También se encuentran dentro del alcance de la invención artículos manufacturados que comprenden un polipéptido PRO211 o un agonista del mismo según se define en las reivindicaciones y un agente adicional inhibidor del crecimiento, citotóxico o quimioterapéutico.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 muestra una secuencia de nucleótidos (SEC ID nº 1) de una secuencia nativa de ADNc de PRO211, en la que la SEC ID nº 1 es un clon denominado en la presente invención "DNA32292-1131".

La figura 2 muestra la secuencia de aminoácidos (SEC ID nº 2) derivada de la secuencia codificante de la SEC ID nº 1 mostrada en la figura 1.

Descripción detallada de la invención

El término "PRO211" referido a un polipéptido o proteína cuando se utiliza en la presente memoria abarca las variantes de la secuencia nativa de PRO211 (que se definen adicionalmente en la presente memoria). El polipéptido PRO211 puede aislarse a partir de una diversidad de fuentes, tales como tipos de tejido humano, o de otra fuente, o pueden prepararse mediante procedimientos recombinantes y/o sintéticos.

La expresión "PRO211 de secuencia nativa" comprende un polipéptido con la misma secuencia de aminoácidos que el polipéptido PRO211 tal como se deriva de la naturaleza. Este polipéptido PRO211 de secuencia nativa puede aislarse de la naturaleza o puede producirse por medios recombinantes y/o sintéticos. La expresión "secuencia nativa" referida a PRO211, abarca específicamente las formas de origen natural truncadas o secretadas (por ejemplo una secuencia de dominio extracelular), las formas variantes de origen natural (por ejemplo las formas de corte y empalme alternativos) y las variantes alélicas de origen natural del polipéptido PRO211. En una realización del a invención, el polipéptido PRO211 de secuencia nativa es un polipéptido PRO211 de secuencia nativa maduro o de longitud completa, tal como se muestra en la figura 2 (SEC ID nº 2). Además, aunque el polipéptido PRO211 dado a conocer en la figura 2 (SEC ID nº 2) se muestra que se inicia con el residuo metionina denominado en la misma posición de aminoácido I, resulta concebible y posible que se utilice otro residuo metionina situado más arriba o más abajo de la posición de aminoácido 1 en la figura 2 (SEC ID nº 2) como el residuo aminoácido de partida para el polipéptido
PRO211.

El "dominio extracelular" o "ECD" de un polipéptido dado a conocer en la presente memoria se refiere a una forma del polipéptido que se encuentra esencialmente libre de los dominios transmembranal y citoplasmático. Habitualmente, un polipéptido ECD presentará menos de aproximadamente 1% de estos dominios transmembranal y/o citoplasmático y preferentemente presentará menos de aproximadamente 0,5% de estos dominios. Se entiende que cualquier dominio o dominios transmembranal identificados para los polipéptidos de la presente invención se identifican de acuerdo con los criterios utilizados rutinariamente en la técnica para identificar ese tipo de dominio hidrofóbico. Los límites exactos de un dominio transmembranal pueden variar pero lo más probable es que no varíen en más de aproximadamente 5 aminoácidos en cualquiera de los dos extremos del dominio tal como se ha identificado inicialmente y tal como se muestra en las figuras adjuntas. Como tal, en una realización de la presente invención, el dominio extracelular de un polipéptido de la presente invención comprende los aminoácidos 1 a X de la secuencia madura de aminoácidos, en la que X es cualquier aminoácido a menos de 5 aminoácidos en cualquiera de los dos lados del límite dominio extracelular/dominio transmembranal.

La localización aproximada de los "péptidos de señal" de los diversos polipéptidos PRO dados a conocer en la presente invención se muestra en las figuras adjuntas. Sin embargo, se indica que el límite C-terminal de un péptido de señal puede variar, pero lo más probable es que en no más de aproximadamente 5 aminoácidos en cualquiera de los dos lados del límite C-terminal del péptido de señal tal como se ha identificado inicialmente en la presente memoria, en el que el límite C-terminal del péptido de señal puede identificarse de acuerdo con los criterios utilizados rutinariamente en la técnica para identificar ese tipo de elemento de secuencia de aminoácidos (por ejemplo Nielsen et al., Prot. Eng. 10:1-6, 1996, y von Heinje et al., Nucl. Acids Res. 14:4683-4690, 1986). Además, también se reconoce que, en algunos casos, el corte de una secuencia de señal de un polipéptido secretado no es completamente uniforme, resultando en la existencia de más de una especie secretada. Estos polipéptidos maduros, en los que el péptido de señal se corta a no más de aproximadamente 5 aminoácidos en ambos lados del límite C-terminal del péptido de señal tal como se identifica en la presente memoria, y los polinucleótidos que los codifican, se encuentran contemplados por la presente invención.

La expresión "polipéptido PRO211 variante" se refiere a un polipéptido PRO211 activo (diferente de un polipéptido PRO211 de secuencia nativa) tal como se define posteriormente, que presenta por lo menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de (a) residuos 1 o aproximadamente 25 a 353 del polipéptido PRO211 mostrado en la figura 2 (SEC ID nº 2), (b) X a 353 del polipéptido PRO211 mostrado en la figura 2 (SEC ID nº 2), en la que X es cualquier residuo aminoácido entre 20 y 29 de la figura 2 (SEC ID nº 2), o (c) otro fragmento derivado específicamente de la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 2 (SEC
ID nº 2).

Entre dichas variantes de PRO211 se incluyen, por ejemplo, los polipéptidos PRO211 en los que se añaden, o se delecionan, uno o más residuos aminoácidos en el extremo N-terminal o C-terminal, así como dentro de uno o más dominios internos de la secuencia nativa.

Habitualmente una variante de PRO211 presentará una identidad de secuencia de aminoácidos de aproximadamente 80%, más preferentemente de por lo menos aproximadamente 81%, más preferentemente de por lo menos aproximadamente 82%, más preferentemente de por lo menos aproximadamente 83%, más preferentemente de por lo menos aproximadamente 84%, más preferentemente de por lo menos aproximadamente 85%, más preferentemente de por lo menos aproximadamente 86%, más preferentemente de por lo menos aproximadamente 87%, más preferentemente de por lo menos aproximadamente 88%, más preferentemente de por lo menos aproximadamente 89%, más preferentemente de por lo menos aproximadamente 90%, más preferentemente de por lo menos aproximadamente 91%, más preferentemente de por lo menos aproximadamente 92%, más preferentemente de por lo menos aproximadamente 93%, más preferentemente de por lo menos aproximadamente 94%, más preferentemente de por lo menos aproximadamente 95%, más preferentemente de por lo menos aproximadamente 96%, más preferentemente de por lo menos aproximadamente 97%, más preferentemente de por lo menos aproximadamente 98% y todavía más preferentemente de por lo menos aproximadamente 99% con (a) los residuos I o aproximadamente 25 a 353 del polipéptido PRO211 mostrado en la figura 2 (SEC ID nº 2), (b) X a 353 del polipéptido PRO211 mostrado en la figura 2 (SEC ID nº 2), en el que X es cualquier residuo aminoácido entre 20 y 29 de la figura 2 (SEC ID nº 2), o (c) otro fragmento derivado específicamente de la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 2 (SEC
ID nº 2).

Habitualmente, los polipéptidos PRO211 variantes presentan una longitud de por lo menos aproximadamente 10 aminoácidos, con frecuencia de por lo menos aproximadamente 20 aminoácidos, más frecuentemente de por lo menos aproximadamente 30 aminoácidos, con más frecuencia de por lo menos aproximadamente 40 aminoácidos, con más frecuencia de por lo menos aproximadamente 50 aminoácidos, con más frecuencia de por lo menos aproximadamente 60 aminoácidos, con más frecuencia de por lo menos aproximadamente 70 aminoácidos, con más frecuencia de por lo menos aproximadamente 80 aminoácidos, con más frecuencia de por lo menos aproximadamente 90 aminoácidos, con más frecuencia de por lo menos aproximadamente 100 aminoácidos, con más frecuencia de por lo menos aproximadamente 150 aminoácidos, con más frecuencia de por lo menos aproximadamente 200 aminoácidos, con más frecuencia de por lo menos aproximadamente 250 aminoácidos, con más frecuencia de por lo menos aproximadamente 300 aminoácidos, o más.

Tal como se muestra posteriormente, la Tabla 1 proporciona el código fuente completo para el programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2. Este código fuente puede compilarse rutinariamente para la utilización en un sistema operativo UNIX para proporcionar el programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2.

Además, las Tablas 2A-2B muestran ejemplificaciones hipotéticas para utilizar el procedimiento anteriormente indicado para determinar el % de identidad de secuencia de aminoácidos (Tablas 2A-2B) y el % de identidad de secuencias de ácidos nucleicos (Tablas 2C-2D) utilizando el programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2, en el que "PRO" representa la secuencia de aminoácidos de un polipéptido PEACH hipotético de interés, "proteína de comparación" representa la secuencia de aminoácidos de un polipéptido frente a la que se compara el polipéptido "PRO" de interés, el "ADN de comparación" representa la secuencia de nucleótidos de una molécula de ácidos nucleicos frente a la que se compara la molécula de ácidos nucleicos "ADN de PRO", "X", "Y" y "Z" representan cada uno diferentes residuos aminoácidos hipotéticos, y "N", "L" y "V" representan cada uno diferentes nucleótidos hipotéticos.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1

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TABLA 2A

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TABLA 2B

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TABLA 2C

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TABLA 2D

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La expresión "porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácidos" con respecto a las secuencias del polipéptido POR211 identificadas en la presente invención se define como el porcentaje de residuos aminoácidos en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos aminoácidos en una secuencia de PRO211, tras alinear las secuencias e introducir huecos, si resulta necesario, para conseguir el máximo porcentaje de identidad de secuencia, y sin considerar ninguna sustitución conservativa como parte de la identidad de secuencia. La alineación con fines de determinar la el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos puede conseguirse de diversas maneras que se encuentran dentro de los conocimientos del experto en la materia, por ejemplo, utilizar software informático disponible públicamente, tal como BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 o Megalign (DNASTAR). Los expertos en la materia pueden determinar parámetros apropiados para medir la alineación, incluyendo cualquier algoritmo necesario para conseguir la alineación máxima a lo largo de la longitud completa de las secuencias que se comparan. Sin embargo, para los fines de la presente invención, los valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos se obtienen tal como se describe posteriormente, mediante la utilización del programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2, en el que el código fuente completo para el programa ALIGN-2 se proporciona en la Tabla 1. El autor del programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2 es Genentech, Inc., y el código fuente mostrado en la Tabla 2 ha sido presentado con la documentación de usuario en la U.S. Copyright Office, Washington D.C. 20559, donde se encuentra registrado bajo el nº de registro U.S. Copyright TXU510087. El programa ALIGN-2 se encuentra disponible públicamente a través de Genentech, Inc., South San Francisco, California, o puede compilarse a partir del código fuente proporcionado en la Tabla 1. El programa ALIGN-2 debe compilarse para la utilización en un sistema operativo UNIX, preferentemente UNIX digital V4.0D. Todos los parámetros de las comparaciones de secuencias son fijados por el programa ALIGN-2 y no varían.

Para los fines de la presente invención, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos dada A respecto a, o con, o contra una secuencia de aminoácidos dada B (que alternativamente puede expresarse como una secuencia de aminoácidos A dada A que presenta o comprende un determinado % de identidad de secuencias de aminoácidos respecto a, con o contra una secuencia de aminoácidos dada B) se calcula de la manera siguiente:

100 veces la fracción X/Y

en la que X es el número de residuos aminoácidos registrados como correspondencias idénticas por el programa de alineación de secuencias ALIGN-2 en la alineación de este programa de A y B, y en la que Y es el número total de residuos aminoácidos en B. Se apreciará que en el caso de que la longitud de la secuencia de aminoácidos A no sea igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de A respecto A no será igual al % de identidad de secuencia de aminoácidos de B respecto a A. Como ejemplos de los cálculos de % de identidad de secuencia de aminoácidos, las Tablas 2A-2B demuestran cómo calcular el % de identidad de secuencias de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos denominada "proteína de comparación" respecto a la secuencia de aminoácidos denominada "PRO".

A menos que se indique específicamente lo contrario, los valores de % de identidad de secuencias de aminoácidos utilizados en la presente invención se obtienen tal como se ha indicado anteriormente utilizando el programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2. Sin embargo, el % de identidad de secuencias de aminoácidos también puede determinarse utilizando el programa de comparación de secuencias NCB1-BLAST2 (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997). El programa de comparación de secuencias NCB1-BLAST2 puede descargarse desde http://www.ncbi.nlm.nih.gov. NCB1-BLAST2 utiliza varios parámetros de búsqueda, en el que todos aquellos parámetros de búsqueda se fijan a valores por defecto, incluyendo, por ejemplo, unmask = yes, strand = all, expected occurrences = 10, minimum low complexity length = 15/5, multi-pass e-value = 0,01, constant for multi-pass = 25, dropoff for final gapped alignment = 25 and scoring matrix = BLOSUM62.

En las situaciones en las que se utiliza NCB1-BLAST2 para las comparaciones de secuencias de aminoácidos, el % de identidad de secuencias de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos dada A respecto a, con, o contra una secuencia de aminoácidos dada B (que alternativamente puede expresarse como que una secuencia de aminoácidos dada A que presenta o que comprende un % determinado de identidad de secuencia de aminoácidos respecto a, con, o contra una secuencia de aminoácidos dada B) se calcula de la manera siguiente:

100 veces la fracción X/Y

en la que X es el número de residuos aminoácidos registrado como correspondencias idénticas por el programa de alineación de secuencias NCB1-BLAST2 en la alineación de este programa de A y B, y en la que Y es el número total de residuos aminoácidos de B. Se apreciará de que en el caso de que la longitud de la secuencia de aminoácidos A no sea igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de A respecto B no será igual al % de identidad de secuencia de aminoácidos de B respecto a A.

Además, el % de identidad de secuencia de aminoácidos también puede determinarse utilizando el programa informático WU-BLAST-2 (Altschul et al., Methods in Enzymology 266:460-480, 1996). La mayoría de los parámetros de búsqueda de WU-BLAST-2 se fijan en los valores por defecto. Aquellos no fijados a valores por defecto, es decir los parámetros ajustables, se fijan en los valores siguientes: overlap span = 1, overlap fraction = 0,125, word threshold (T) = 11, y scoring matrix = BLOSUM62. Para los fines de la presente invención, se determina un valor de % de identidad de secuencias de aminoácidos dividiendo (a) el número de residuos aminoácidos correspondientes idénticos entre la secuencia de aminoácidos del polipéptido PRO de interés con una secuencia derivada del polipéptido PRO nativo y la secuencia de aminoácidos de comparación de interés (es decir, la secuencia respecto a la que se compara el polipéptido PRO de interés que puede ser un polipéptido PRO variante) según determina WU-BLAST-2, por (b) el número total de residuos aminoácidos del polipéptido PRO de interés. Por ejemplo, en la expresión "un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos A que presenta una identidad de secuencia de aminoácidos de por lo menos el 80% respecto a la secuencia de aminoácidos B", la secuencia de aminoácidos A es la secuencia de aminoácidos de comparación de interés y la secuencia de aminoácidos B es la secuencia de aminoácidos del polipéptido PRO de interés.

La expresión "polinucleótido PRO211 variante" o la expresión "secuencia variante de ácidos nucleicos de PRO211" se refieren a una molécula de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido PRO211 activo tal como se define posteriormente y que presenta una identidad de secuencia de ácidos nucleicos de por lo menos aproximadamente el 80% con (a) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica los residuos I o aproximadamente 25 a 353 del polipéptido PRO211 mostrado en la figura 2 (SEC ID nº 2), (b) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica los aminoácidos X a 353 del polipéptido PRO211 mostrado en la figura 2 (SEC ID nº 2), en el que X es cualquier residuos aminoácido entre 20 y 29 de la figura 2 (SEC ID nº 2), o (c) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica otro fragmento específicamente derivado de la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 2 (SEC ID nº 2). Habitualmente, un polinucleótido PRO211 variante presentar una identidad de secuencia de ácidos nucleicos de por lo menos aproximadamente el 80%, más preferentemente de por lo menos aproximadamente el 81%, más preferentemente de por lo menos aproximadamente el 82%, más preferentemente de por lo menos aproximadamente el 83%, más preferentemente de por lo menos aproximadamente el 84%, más preferentemente de por lo menos aproximadamente el 85%, más preferentemente de por lo menos aproximadamente el 86%, más preferentemente de por lo menos aproximadamente el 87%, más preferentemente de por lo menos aproximadamente el 88%, más preferentemente de por lo menos aproximadamente el 89%, más preferentemente de por lo menos aproximadamente el 90%¸ más preferentemente de por lo menos aproximadamente el 91%, más preferentemente de por lo menos aproximadamente el 92%, más preferentemente de por lo menos aproximadamente el 93%, más preferentemente de por lo menos aproximadamente el 94%, más preferentemente de por lo menos aproximadamente el 95%, más preferentemente de por lo menos aproximadamente el 96%, más preferentemente de por lo menos aproximadamente el 97%, más preferentemente de por lo menos aproximadamente el 98%, y todavía más preferentemente de por lo menos aproximadamente el 99% con (a) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica los residuos I o aproximadamente 25 a 353 del polipéptido PRO211 mostrado en la figura 2 (SEC ID nº 2), (b) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica los aminoácidos X a 353 del polipéptido PRO211 mostrado en la figura 2 (SEC ID nº 2), en el que X es cualquier residuo aminoácido entre 20 y 29 de la figura 2 (SEC ID nº 2), o (c) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica otro fragmento específicamente derivado de la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 2 (SEC ID nº 2). Las variantes del polinucleótido PRO21 no abarcan la secuencia de nucleótidos de PRO211 nativo.

Habitualmente, los polinucleótidos PRO211 variantes presenta una longitud de por lo menos aproximadamente 30 nucleótidos, con frecuencia de por lo menos aproximadamente 60 nucleótidos, con más frecuencia de por lo menos aproximadamente 90 nucleótidos, con más frecuencia de por lo menos aproximadamente 120 nucleótidos, con más frecuencia de por lo menos aproximadamente 150 nucleótidos, con más frecuencia de por lo menos aproximadamente 180 nucleótidos, con más frecuencia de por lo menos aproximadamente 210 nucleótidos, con más frecuencia de por lo menos aproximadamente 240 nucleótidos, con más frecuencia de por lo menos aproximadamente 270 nucleótidos, con más frecuencia de por lo menos aproximadamente 300 nucleótidos, con más frecuencia de por lo menos aproximadamente 450 nucleótidos, con más frecuencia de por lo menos aproximadamente 600 nucleótidos, con más frecuencia de por lo menos aproximadamente 900 nucleótidos, o más.

La expresión "porcentaje (%) de identidad de secuencia de ácidos nucleicos" con respecto a las secuencias de ácidos nucleicos codificantes del polipéptido PRO211 identificadas en la presente memoria se define como el porcentaje de nucleótidos en una secuencia candidata que es idéntico a los nucleótidos en una secuencia de ácidos nucleicos codificante del polipéptido PRO211 tras alinear las secuencias e introducir huecos, si resulta necesario, para conseguir el porcentaje máximo de identidad de secuencias. La alineación con fines a determinar el porcentaje de identidad de secuencia de ácidos nucleicos puede conseguirse de diversas maneras que se encuentran dentro de los conocimientos del experto en la materia, por ejemplo utilizando software informático disponible públicamente, tal como BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 o Megalign (DNASTAR). Los expertos en la materia pueden determinar parámetros apropiados para medir la alineación, incluyendo cualquier algoritmo necesario para conseguir la alineación máxima a lo largo de la longitud completa de las secuencias que se comparan. Para los fines de la presente invención, sin embargo, los valores de % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos se obtienen tal como se describe posteriormente mediante la utilización del programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2, en el que el código fuente completo para el programa ALIGN-2 se proporciona en la Tabla 1. El autor del programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2 es Genentech, Inc., y el código fuente mostrado en la Tabla 1 ha sido presentado junto con la documentación de usuario en la U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559, donde se encuentra registrado bajo el nº de registro U.S. Copyright TXU510087. El programa ALIGN-2 se encuentra disponible públicamente a través de Genentech, Inc., South San Francisco, California, o puede compilarse a partir del código fuente proporcionado en la Tabla 1. El programa ALIGN-2 debe compilarse para su utilización en un sistema operativo UNIX, preferentemente UNIX digital V4.0D. Todos los parámetros de comparación de secuencias son fijados por el programa ALIGN-2 y no varían.

Para los fines de la presente invención, el % de identidad de secuencias de ácidos nucleicos de una secuencia de ácidos nucleicos dada C respecto a, con o contra una secuencia de ácidos nucleicos dada D (que alternativamente puede expresarse como que una secuencia de ácidos nucleicos dada C que presenta o que comprende un % determinado de identidad de secuencias de ácidos nucleicos respecto a, con, o contra una secuencia de ácidos nucleicos dada D) se calcula de la manera siguiente:

100 veces la fracción W/Z,

en la que W es el número de nucleótidos registrado como correspondencias idénticas por el programa de alineación de secuencias ALING-2 en la alineación del programa de C y D, y en la que Z es el número total de nucleótidos de D. Se apreciará que en el caso de que la longitud de la secuencia de ácidos nucleicos C no se a igual a la longitud de la secuencia de ácidos nucleicos D, el % de identidad de secuencias de ácidos nucleicos de C respecto a D no será igual al % de identidad de secuencias de ácidos nucleicos de D respecto a C. Como ejemplos de cálculos de % de identidad de secuencias de ácidos nucleicos, las Tablas 2C-2D demuestran cómo calcular el % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos de la secuencia de ácidos nucleicos denominada "ADN de comparación" respecto a la secuencia de ácidos nucleicos denominada "ADN de PRO".

A menos que se indique específicamente lo contrario, todos los valores de % de identidad de secuencias de ácidos nucleicos utilizados en la presente memoria se obtienen tal como se ha indicado anteriormente, utilizando el programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2. Sin embargo, el % de identidad de ácidos nucleicos también puede determinarse utilizando el programa de comparación de secuencias NCB1-BLAST2 (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-33402, 1997). El programa de comparación de secuencias NCB1-BLAST2 puede descargarse desde http://www.ncbi.nim.nih.gov. NCB1-BLAST2 utiliza varios parámetros de búsqueda, en el que todos aquellos parámetros de búsqueda se fijan a valores por defecto, incluyendo, por ejemplo, unmask = yes, strand = all, expected occurrences = 10, minimum low complexity length = 15/5, multi-pass e-value = 0,01, constant for multi-pass = 25, dropoff for final gapped alignment = 25 y scoring matrix = BLOSUM62.

En las situaciones en las que se utilice NCB1-BLAST2 para las comparaciones entre secuencias, el % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos de una secuencia de ácidos nucleicos dada C respecto a, con, o contra una secuencia de ácidos nucleicos dada D (que alternativamente puede expresarse como una secuencia de ácidos nucleicos dada C que presenta o que comprende un % determinado de identidad de secuencias de ácidos nucleicos respecto a, con, o contra una secuencia de ácidos nucleicos dada D) se calcula de la manera siguiente:

100 veces la fracción W/Z,

en la que W es el número de nucleótidos registrado como correspondencias idénticas por el programa de alineación de secuencias NCB1-BLAST2 en la alineación del programa de C y D, y en la que Z es el número total de nucleótidos de D. Se apreciará que en el caso de que la longitud de la secuencia de ácidos nucleicos C no sea igual a la longitud de la secuencia de ácidos nucleicos D, el % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos de C respecto a D no será igual al % de identidad de secuencias de ácidos nucleicos de D respecto a C.

Además, los valores de % de identidad de secuencias de ácidos nucleicos también pueden generarse utilizando el programa informático WU-BLAST-2 (Altschul et al., Methods in Enzymology 266:460-480, 1996). La mayoría de los parámetros de búsqueda de WU-BLAST-2 se fijan en valores por defecto. Aquellos no fijados en valores por defecto, es decir los parámetros ajustables, se fijan en los valores siguientes: overlap span = 1, overlap fraction = 0,125, word threshold (T) = 11, y scoring matrix = BLOSUM62. Para los fines de la presente invención, se determina un valor de % de identidad de secuencias de ácidos nucleicos dividiendo (a) el número de nucleótidos correspondientemente idénticos entre la secuencia de ácidos nucleicos de la molécula de ácidos nucleicos codificante del polipéptido PRO de interés que presenta una secuencia derivada de la secuencia nativa de los ácidos nucleicos codificantes del polipéptido PRO, y la molécula de ácidos nucleicos de interés (es decir, la secuencia respecto a la que se compara la molécula de ácidos nucleicos de interés codificante del polipéptido PRO, que puede ser un polinucleótido PRO variante) según determina WU-BLAST-2, por (b) el número total de nucleótidos de la molécula de ácidos nucleicos de interés codificante del polipéptido PRO. Por ejemplo, en la expresión "una molécula de ácidos nucleicos aislada que comprende una secuencia de ácidos nucleicos A que presenta una identidad de secuencia de ácidos nucleicos de por lo menos el 80% respecto a la secuencia de ácidos nucleicos B", la secuencia de ácidos nucleicos A es la molécula de ácidos nucleicos de comparación de interés y la secuencia de ácidos nucleicos B es la secuencia de ácidos nucleicos de la molécula de ácidos nucleicos de interés codificante del polipéptido PRO.

En otras realizaciones, los polinucleótidos PRO211 variantes son moléculas de ácidos nucleicos que codifican un polipéptido PRO211 activo, y que son capaces de hibridarse, preferentemente bajo condiciones de hibridación restrictiva y de lavado, con secuencias de nucleótidos que codifican el polipéptido PRO211 de longitud completa mostrado en la figura 2 (SEC ID nº 2). Los polipéptidos PRO211 variantes pueden ser aquellos codificados por un polinucleótido de PRO211 variante.

El término "positivos" en el contexto de las comparaciones de identidad de secuencias de aminoácidos llevadas a cabo tal como se ha indicado anteriormente, incluye residuos aminoácidos en las secuencias comparadas que no sólo son idénticas, sino también aquéllas que presentan propiedades similares. Los residuos aminoácidos que puntúan un valor positivo para un residuo aminoácido de interés son aquellos que son idénticos al residuo aminoácido de interés o son una sustitución preferente (tal como se define en la Tabla 3 posteriormente) del residuo aminoácido de interés.

Para los fines de la presente invención, el valor de % de positivos de una secuencia de aminoácidos dada A respecto a, con, o contra una secuencia de aminoácidos dada B (que alternativamente puede expresarse como una secuencia de aminoácidos dada A que presenta o que comprende un determinado % de positivos respecto a, con, o contra una secuencia de aminoácidos dada B) se calcula de la manera siguiente:

100 veces la fracción X/Y,

en la que X es el número de residuos aminoácidos con un valor positivo tal como se ha definido anteriormente con el programa de alineación de secuencias ALIGN-2 en la alineación del programa de A y B, y en la que Y es el número total de residuos aminoácidos en B. Se apreciará que en el caso en que la secuencia de aminoácidos A no sea igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el % de positivos de A respecto a B no será igual al % de positivos de B respecto a A.

El término "aislado" cuando se utiliza para describir los diversos polipéptidos dados a conocer en la presente invención, se refiere a un polipéptido que ha sido identificado y separado y/o recuperado de un componente de su ambiente natural. Preferentemente, el polipéptido aislado se encuentra libre de asociaciones con todos los componentes con los que se encuentra asociado naturalmente. Los componentes contaminantes de su ambiente natural son materiales que habitualmente interferirían con los usos diagnósticos o terapéuticos del polipéptido, y entre ellos pueden incluirse enzimas, hormonas y otros solutos proteináceos o no proteináceos. En realizaciones preferentes, el polipéptido se purifica (1) en un grado suficiente para obtener por lo menos 15 residuos de secuencia de aminoácidos N-terminal o interna mediante la utilización de un secuenciador de taza giratoria, o (2) hasta la homogeneidad mediante SDS-PAGE bajo condiciones no reductoras o reductoras utilizando azul de Coomassie o, preferentemente, tinción de plata. Entre los polipéptidos aislados se incluyen un polipéptido in situ dentro de células recombinantes, debido a que por lo menos un componentes del ambiente natural de PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 o PRO182 no se encontrará presente. Habitualmente, sin embargo, el polipéptido aislado se prepara mediante por lo menos una etapa de purificación.

Una molécula de ácidos nucleicos "aislada" codificante de un polipéptido PRO211 o una molécula de ácidos nucleicos "aislada" codificante de un anticuerpo anti-PRO211 es una molécula de ácidos nucleicos que se identifica y se separa de por lo menos una molécula contaminante de ácidos nucleicos con la que se encuentra habitualmente asociada en la fuente natural de los ácidos nucleicos codificantes de PRO211 o los ácidos nucleicos codificantes anti-PRO211. Una molécula de ácidos nucleicos codificante de PRO211 aislada o una molécula de ácidos nucleicos codificante de anti-PRO211 aislada es diferente de la forma o contexto en la que se encuentra en la naturaleza. Por lo tanto, las moléculas de ácidos nucleicos aisladas se distinguen de la molécula de ácidos nucleicos codificante de PRO211 o de la molécula de ácidos nucleicos codificante de anti-PRO211 tal como existe en las células naturales. Sin embargo, una molécula de ácidos nucleicos aislada codificante de un polipéptido PRO211 o de una molécula de ácidos nucleicos aislada codificante de un anticuerpo anti-PRO211 incluye moléculas de ácidos nucleicos de PRO211 o moléculas de ácidos nucleicos anti-PRO211 contenidas en células que habitualmente expresan polipéptidos PRO211 o anticuerpos anti-PRO211 en los que, por ejemplo, la molécula de ácidos nucleicos se encuentra en una localización cromosómica diferente de la de las células naturales.

La expresión "secuencias de control" se refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia codificante operablemente ligada en un organismo huésped particular. Las secuencias de control que resultan adecuadas para los procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia operadora, y un sitio de unión ribosómica. Las células eucarióticas es conocido que utilizan promotores, señales de poliadenilación e intensificadores.

Los ácidos nucleicos se encuentran "operablemente ligados" cuando se sitúan en una relación funcional con otra secuencia de ácidos nucleicos. Por ejemplo, el ADN para una presecuencia o líder secretor se une operablemente a ADN para un polipéptido si se expresa en forma de una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o un intensificador se encuentra operablemente ligado a una secuencia codificante si afecta a la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión ribosómica se encuentra operablemente ligado a una secuencia codificante si se sitúa de manera que facilite la traducción. Generalmente, "operablemente ligado" significa que las secuencias de ADN que se unen son contiguas y, en el caso de un líder secretor, contiguas y en el mismo marco de lectura. Sin embargo, los intensificadores no son necesariamente contiguos. El ligamiento se consigue mediante ligación en sitios de restricción convenientes. Si estos sitios no existen, se utilizan adaptadores o línkers oligonucleótidos de síntesis de acuerdo con la práctica convencional.

El término "anticuerpo" se utiliza en el sentido más amplio y específicamente cubre, por ejemplo, anticuerpos monoclonales anti-PRO211 únicos (incluyendo anticuerpos agonistas), composiciones de anticuerpo anti-PRO211 con especificidad poliepitópica, anticuerpos anti-PRO211 de cadena única, y fragmentos de anticuerpos anti-PRO211 (ver posteriormente). La expresión "anticuerpo monoclonal" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posiblemente mutaciones naturales que pueden encontrarse presentes en cantidades menores.

La "astringencia" de las reacciones de hibridación puede ser fácilmente determinada por un experto ordinario en la materia, y generalmente es un cálculo empírico dependiente de la longitud de la sonda, la temperatura de lavado y la concentración de sales. En general, las sondas más largas requieren temperaturas más altas para una hibridación correcta, mientras que las sondas más cortas requieren temperaturas más bajas. La hibridación generalmente depende de la capacidad del ADN desnaturalizado de aparearse nuevamente en presencia de cadenas complementarias en un ambiente a una temperatura inferior a la de fusión. Cuanto más alto sea el grado de homología deseada entre la sonda y la secuencia hibridable, más alta será la temperatura relativa que podrá utilizarse. Como resultado, se infiere que las temperaturas relativas más altas tenderán a provocar que las condiciones de reacción sean más astringentes, mientras que las temperaturas más bajas, lo harán en menor medida. Para más detalles y una explicación de la astringencia de las reacciones de hibridación, ver Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, 1995.

Las "condiciones astringentes" o las "condiciones de alta astringencia", tal como se definen en la presente memoria, pueden identificarse como aquéllas que: (1) utilizan una fuerza iónica reducida y una temperatura elevada para el lavado, por ejemplo cloruro sódico 0,015 M/citrato sódico 0,0015 M/dodecil sulfato sódico al 0,1% a 50ºC; (2) utilizan durante la hibridación un agente desnaturalizante, tal como formamida, por ejemplo formamida al 50% (v/v) con albúmina de suero bovino al 0,1%/Ficoll al 0,1%/polivinilpirrolidona al 0,1%/tampón de fosfato sódico 50 mM a pH 6,5 con cloruro sódico 750 mM, citrato sódico 75 mM a 42ºC; o (3) utilizan formamida al 50%, 5 x SSC (NaCl 0,75 M, citrato sódico 0,075 M), fosfato sódico 50 mM (pH 6,8), pirofosfato sódico al 0,1%, 5 x solución de Denhardt, ADN de esperma de salmón sonicado (50 \mug/ml), SDS al 0,1% y dextrán sulfato al 10% a 42ºC, con lavados a 42ºC en 0,2 x SSC (cloruro sódico/citrato sódico) y formamida al 50% a 55ºC, seguido de un lavado de alta astringencia consistente en 0,1 x SSC que contiene EDTA a 55ºC.

Las "condiciones moderadamente astringentes" pueden identificarse como las descritas por Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989, e incluyen la utilización de una solución de lavado y condiciones de hibridación (por ejemplo temperatura, fuerza iónica y % de SDS) menos astringentes que aquéllas indicadas anteriormente. Un ejemplo de condiciones moderadamente astringentes es la incubación durante la noche a 37ºC en una solución que comprende: formamida al 20%, 5 x SSC (NaCl 150 mM, citrato trisódico 15 mM), fosfato sódico 50 mM (pH 7,6), 5 x solución de Denhardt, dextrán sulfato al 10% y 20 mg/ml de ADN de esperma de salmón triturado desnaturalizado, seguido del lavado de los filtros en 1 x SSC a aproximadamente 37ºC a 50ºC. El experto en la materia reconocerá cómo ajustar la temperatura, la fuerza iónica, etc., según resulte necesario para ajustarse a factores tales como la longitud de la sonda y similares.

La expresión "etiquetado con epítopo" cuando se utiliza en la presente memoria se refiere a un polipéptido quimérico que comprende un polipéptido PRO211 fusionado a un "polipéptido etiqueta". El polipéptido etiqueta presenta suficientes residuos para proporcionar un epítopo contra el que se puede preparar un anticuerpo, aunque es suficientemente corto para no interferir con la actividad del polipéptido al que se encuentra fusionado. El polipéptido etiqueta preferentemente también es bastante único de manera que el anticuerpo no reacciona cruzadamente de manera sustancial con otros epítopos. Los polipéptido etiqueta adecuados generalmente presentan por lo menos seis residuos aminoácidos y habitualmente entre aproximadamente 8 y 50 residuos aminoácidos (preferentemente entre aproximadamente 10 y 20 residuos aminoácidos).

Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "inmunoadhesina" se refiere a moléculas similares a anticuerpos que combinan la especificidad de unión de una proteína heteróloga (de una "adhesina") con las funciones efectoras de dominios constantes de inmunoglobulina. Estructuralmente las inmunoadhesinas comprenden una fusión de una secuencia de aminoácidos con la especificidad de unión deseada que es diferente el sitio de reconocimiento y unión de antígeno de un anticuerpo (es decir, es "heterólogo") y una secuencia de dominio constante de inmunoglobulina. La parte adhesina de una molécula de inmunoadhesina habitualmente es una secuencia de aminoácidos contigua que comprende por lo menos el sitio de unión de un receptor o de un ligando. La secuencia de dominio constante de inmunoglobulina en la inmunoadhesina puede obtenerse a partir de cualquier inmunoglobulina, tal como los subtipos IgG-1, IgG-2, IgG-3 o IgG-4, IgA (incluyendo IgA-1 y IgA-2), IgE, IgD o IgM.

El término "activo" o "actividad" para los fines de la presente invención se refiere a una o más formas de PRO211 que conservan una actividad biológica y/o inmunológica de PRO211 nativa o natural, en la que actividad "biológica" se refiere a una función biológica (inhibidora o estimuladora) causada por una PRO211 nativa o natural diferente de la capacidad de inducir la producción de un anticuerpo contra un epítopo antigénico que posee una PRO211 nativa o natural, y una actividad "inmunológica" se refiere a la capacidad de inducir la producción de un anticuerpo contra un epítopo antigénico que posee una PRO211 nativa o natural.

La expresión "actividad biológica" en el contexto de un anticuerpo u otro agonista que pueda identificarse mediante los ensayos de cribado dados a conocer en la presente invención (por ejemplo una molécula pequeña orgánica o inorgánica, un péptido, etc.) se utiliza para referirse a la capacidad de estas moléculas de inducir uno o más de los efectos indicados en la presente memoria en relación a la definición de una "cantidad terapéuticamente eficaz". En una realización específica, "actividad biológica" es la capacidad de inhibir el crecimiento o proliferación de células neoplásicas. Una actividad biológica preferente es la inhibición, incluyendo el enlentecimiento o la detención completa, del crecimiento de una diana celular tumoral (por ejemplo una célula cancerosa). Otra actividad biológica preferente es la actividad citotóxica resultante en la muerte de la diana celular tumoral (por ejemplo una célula cancerosa). Todavía otra actividad biológica preferente es la inducción de la apoptosis de una diana celular tumoral (por ejemplo una célula cancerosa).

La expresión "actividad inmunológica" se refiere a la reactividad inmunológica cruzada con por lo menos un epítopo de un polipéptido PRO211.

La expresión "reactividad inmunológica cruzada" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a que el polipéptido candidato es capaz de inhibir competitivamente la actividad biológica cualitativa de un polipéptido PRO211 que presenta esta actividad con antisueros policlonales cultivados contra el polipéptido PRO211 activo conocido. Estos antisueros se preparan de manera convencional inyectando por ejemplo cabras o conejos subcutáneamente con el análogo activo conocido en adyuvante completo de Freund, seguido de la inyección intraperitoneal o subcutánea de refuerzo en adyuvante de Freund incompleto. La reactividad inmunológica cruzada preferentemente es "específica", lo que significa que la afinidad de unión de la molécula de reactividad inmunológica cruzada (por ejemplo el anticuerpo) identificado, con el polipéptido PRO211 correspondiente es significativamente más alta (preferentemente por lo menos aproximadamente 2 veces, más preferentemente por lo menos aproximadamente 4 veces, todavía más preferentemente por lo menos aproximadamente 6 veces, con la máxima preferencia por lo menos aproximadamente 8 veces más alta) que la afinidad de unión de esa molécula a cualquier otro polipéptido nativo conocido.

El término "tumor" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a todo crecimiento y proliferación de células neoplásicas, malignas o benignas, y a todas las células y tejidos precancerosos y cancerosos.

Los términos "cáncer" y "canceroso" se refiere o describen la condición fisiológica en mamíferos que se caracteriza habitualmente por un crecimiento celular no regulado. Entre los ejemplos de cáncer se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia. Entre los ejemplos más particulares de estos cánceres se incluyen cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de colon, cáncer de células escamosas, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de ovario, cáncer cervical, cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer colorrectal, carcinoma endometrial, carcinoma de las glándulas salivares, cáncer renal, cáncer vulvar, cáncer del tiroides, carcinoma hepático y diversos tipos de cáncer de cabeza y cuello.

El término "tratamiento" se refiere a una intervención que se lleva a cabo con la intención de prevenir el desarrollo, o de alterar la patología, de un trastorno. Por consiguiente, el término "tratamiento" se refiere tanto al tratamiento terapéutico como a medidas profilácticas o preventivas. Entre aquellos que necesitan tratamiento se incluyen aquellos que ya presentan el trastorno, así como aquellos en los que debe prevenirse el trastorno. En el tratamiento de tumores (por ejemplo del cáncer), un agente terapéutico puede reducir directamente la patología de las células tumorales o provocar que las células tumorales sean más susceptibles al tratamiento con otros agentes terapéuticos, por ejemplo la radiación y/o la quimioterapia.

La "patología" del cáncer incluye todos los fenómenos que comprometen el bienestar del paciente. Esto incluye, sin limitación, el crecimiento celular anormal o incontrolable, la metástasis, la interferencia con el funcionamiento normal de células vecinas, la liberación de citoquinas o de otros productos secretorios a niveles anormales, la supresión o el agravamiento de la respuesta inflamatoria o inmunológica, etc.

Una "cantidad eficaz" de un polipéptido dado a conocer en la presente memoria o un agonista del mismo en referencia a la inhibición del crecimiento celular neoplásico es una cantidad capaz de inhibir, en algún grado, el crecimiento de las células diana. El término incluye una cantidad capaz de inducir un efecto inhibidor del crecimiento, citostático y/o citotóxico y/o la apoptosis de las células diana. Una "cantidad eficaz" de un polipéptido PRO211 o un agonista del mismo para los fines de inhibir el crecimiento celular neoplásico puede determinarse empíricamente y de una manera rutinaria.

La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" en referencia al tratamiento de un tumor se refiere a una cantidad capaz de inducir uno o más de los efectos siguientes: (1) inhibición, en algún grado, del crecimiento tumoral, incluyendo, el enlentecimiento y detención completa del crecimiento; (2) reducción del número de células tumorales; (3) reducción del tamaño del tumor; (4) inhibición (es decir, reducción, enlentecimiento o detención completa) de la infiltración de células tumorales en órganos periféricos; (5) inhibición (es decir, reducción, enlentecimiento o detención completa) de la metástasis; (6) intensificación de la respuesta inmunológica antitumoral, que puede, aunque no necesariamente, resulta en agresión o rechazo del tumor; y/o (7) alivia, en algún grado, uno o más de los síntomas asociados al trastorno. Una "cantidad terapéuticamente eficaz" de un polipéptido PRO211 o un agonista del mismo para los fines del tratamiento de un tumor puede determinarse eficazmente y de una manera rutinaria.

Una "cantidad inhibidora del crecimiento" de un polipéptido PRO211 o un agonista del mismo es una cantidad capaz de inhibir el crecimiento de una célula, especialmente de un tumor, por ejemplo una célula cancerosa, sea in vitro o in vivo. Una "cantidad inhibidora del crecimiento" de un polipéptido PRO211 o un agonista del mismo para los fines de inhibir el crecimiento celular neoplásico puede determinarse empíricamente y de una manera rutinaria.

Una "cantidad citotóxica" de un polipéptido PRO211 o de un agonista del mismo es una cantidad capaz de causar la destrucción de una célula, especialmente de un tumor, por ejemplo de una célula cancerosa, sea in vitro o in vivo. Una "cantidad citotóxica" de un polipéptido PRO211 o de un agonista del mismo para los fines de inhibir el crecimiento celular neoplásico puede determinarse rutinariamente y de una manera rutinaria.

La expresión "agente citotóxico" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a una sustancia que inhibe o que previene la función de las células y/o causa la destrucción de las mismas. La expresión pretende incluir isótopos radioactivos (por ejemplo I131, I125, Y90 y Re186), agentes quimioterapéuticos, y toxinas, tales como toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o fragmentos de las mismas.

Un "agente quimioterapéutico" es un compuesto químico que resulta útil en el tratamiento de un tumor, por ejemplo de un cáncer. Entre los ejemplos de agentes quimioterapéuticos se incluyen adriamicina, doxorubicina, epirubicina, 5-fluorouracilo, citosina arabinósido ("Ara-C"), ciclofosfamida, tiotepa, busulfán, citoxina, taxoides, por ejemplo paclitaxel (Taxol, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ) y doxetaxel (Taxotere, Rhône-Poulen Rorer, Antony, Francia), toxotere, metotrexato, cisplatino, melfalán, vinblastina, bleomicina, etopósido, ifosfamida, mitomicina C, mitoxantrona, vincristina, vinorelbina, carboplatino, tenipósido, daunomicina, carminomicina, aminopterina, dactinomicina, mitomicinas, esperamicinas (ver la patente US nº 4.675.187), melfalán y otras mostazas nitrogenadas relacionadas. También se incluyen en esta definición los agentes hormonales que actúan regulando o inhibiendo la acción hormonal sobre los tumores, tales como el tamoxifén y la onapristona.

Un "agente inhibidor del crecimiento" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un compuesto o a una composición que inhibe el crecimiento de una célula, especialmente de un tumor, por ejemplo de una célula cancerosa, sea in vitro o in vivo. De esta manera, el agente inhibidor del crecimiento es uno que reduce significativamente le porcentaje de las células diana en la fase S. Entre los ejemplos de agentes inhibidores del crecimiento se incluyen los agentes que bloquean la progresión del ciclo celular (en un momento diferente de la fas eS), tales como los agentes que inducen la detención de la fase GI y la detención de la fase M. Entre los bloqueantes clásicos de la fase M se incluyen los vincas (vincristina y vinblastina), taxol, y los inhibidores topo II, tales como doxorubicina, epirubicina, daunorubicina, etopósido y bleomicina. Aquellos agentes que detienen la fase G también se desbordan hacia la detención de la fase S, por ejemplo los agentes alquilantes del ADN, tales como tamoxifén, prednisona, decarbazina, mecloretamina, cisplatino, metotrexato, 5-fluorouracilo y ara-C. Puede encontrarse más información en The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn y Israel, editores, capítulo 1, titulado "Cell cycle regulation, oncogens, and antineoplastic drugs", por Murakami et al. (WB Saunders: Philadelphia, 1995), especialmente la página 13.

El término "citoquina" es un término genérico para las proteínas liberadas por una población celular que actúan sobre otra célula como mediadores intercelulares. Entre los ejemplos de estas citoquinas se encuentran la hormona del crecimiento humana, la N-metionil-hormona de crecimiento humana y la hormona de crecimiento bovina; hormona paratiroide; tiroxina; insulina; proinsulina; relaxina; prorelaxina; hormonas glucoproteínas, tales como la hormona folículo-estimulante (FSH), la hormona estimulante del tiroides (TSH) y la hormona luteinizante (LH); el factor de crecimiento hepático; el factor de crecimiento fibroblástico; prolactina; lactógeno placentario; factores \alpha y \beta de necrosis tumoral; sustancia inhibidora mulleriana; péptido asociado a gonadotropina de ratón; inhibina; activina; factor de crecimiento vascular endotelial; integrina; trombopoyetina (TPO); factores de crecimiento nervioso, tales como NGF-\beta; factor de crecimiento plaquetario; factores de crecimiento transformante (TGFs), tales como TGF-\alpha y TGF-\beta; factores I y II de crecimiento similar a insulina; eritropoyetina (EPO); factores osteoinductores; itnerferones, tales como los itnerferones \alpha, \beta y \gamma, factores estimulantes de colonias (CSFs), tales como el CSF de macrófagos (M-CSF), el CSF de granulocito-macrófago (GM-CSF) y CSF de granulocito (G-CSF), interleuquinas (ILs), tales como IL-1, IL-1\alpha, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12; un factor de necrosis tumoral, tal como TNF- \alpha o TNF-\beta, y otros factores polipéptidos, incluyendo LIF y ligando de kit (KL). Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "citoquina" incluye proteínas de fuentes naturales o de cultivo celular recombinante y equivalentes biológicamente activos de las citoquinas de secuencia nativa.

El término "profármaco" tal como se utiliza en la presente solicitud se refiere a un precursor o forma derivada de una sustancia farmacéuticamente activa que es menor citotóxica para las células tumorales comparado con el fármaco parental y que es capaz de activarse o convertirse enzimáticamente en la forma parental más activa (ver, por ejemplo, Wilman, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy", Biochemical Society Transactions 14:375-382, 615th Meeting Belfast, 1986, y Stella et al., "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery", Directed Drug Delivery, Borchardt et al., editores, páginas 247 a 267, Humana Press, 1985. Entre los profármacos de la presente invención se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, los profármacos que contienen fosfato, los profármacos que contienen tiofosfato, los profármacos glicosilados o los profármacos que contienen fenilacetamida opcionalmente sustituidos, 5-fluorocitosina y entre otros fármacos 5-fluorouridina que pueden derivatizarse en una forma profármaco para la utilización en la presente invención se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, aquellos agentes quimioterapéuticos indicados anteriormente.

El término "agonista" se utiliza en el sentido más amplio e incluye cualquier molécula que imite una actividad biológica de un polipéptido PRO211 nativo dada a conocer en la presente invención. Entre las moléculas agonistas adecuadas se incluyen específicamente anticuerpos agonistas o fragmentos de anticuerpo, fragmentos o secuencias variantes de aminoácidos de polipéptido PRO211 nativo, péptidos, moléculas orgánicas pequeñas, etc. Los procedimientos para identificar agonistas de un polipéptido PRO211 pueden comprender poner en contacto una célula tumoral con un agonista candidato y medir la inhibición del crecimiento de las células tumorales.

La administración "crónica" se refiere a la administración del agente o agentes en un modo continuo, por oposición a un modo agudo, de manera que se mantenga el efecto (actividad) terapéutico inicial durante un periodo de tiempo prolongado. La administración "intermitente" es el tratamiento que no se realiza consecutivamente sin interrupción, sino que más bien es de naturaleza cíclica.

El término "mamífero" para los fines del tratamiento se refiere a cualquier animal clasificado como mamífero, incluyendo el ser humano, animales domésticos y de granja, animales de zoológico, de competición o de compañía, tales como perros, gatos, vacas, caballos, ovejas, cerdos, cabras, conejos, etc. Preferentemente, el mamífero es un ser humano.

La administración "en combinación con" uno o más agentes terapéuticos adicionales incluye la administración simultánea (concurrente) y consecutiva en cualquier orden.

El término "portadores" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a portadores, excipientes o estabilizantes farmacéuticamente aceptables que resultan no tóxicos para la célula o el mamífero expuesto a los mismos a las dosis y concentraciones utilizadas. Con frecuencia, el portador fisiológicamente aceptable es una solución acuosa de pH tamponado. Entre lo ejemplos de portadores fisiológicamente aceptables se incluyen tampones, tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes, incluyendo el ácido ascórbico; un polipéptido de bajo peso molecular (de menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como la albúmina sérica, la gelatina o las inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, tales como la polivnilpirrolidona; aminoácidos, tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos, y otros carbohidratos, incluyendo glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes, tales como EDTA; alcoholes de azúcar, tales como manitol o sorbitol; contraiones formadores de sal, tales como sodio; y/o surfactantes no iónicos, tales como TWEEN^{TM}, polietilenglicol (PEG) y PLURONICS^{TM}.

Los "anticuerpos nativos" y las "inmunoglobulinas nativas" habitualmente son glucoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150.000 daltons, compuesta de dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Cada cadena ligera se encuentra unida a una cadena pesada por un enlace covalente disulfuro, mientras que el número de enlaces disulfuro varía entre las cadenas pesadas de diferentes isotipos de inmunoglobulina. Cada cadena pesada y cada cadena ligera también presenta enlaces disulfuro intracadena espaciados regularmente. Cada cadena pesada presenta en un extremo un dominio variable (VH) seguido de varios dominios constantes. Cada cadena ligera presenta un dominio variable en un extremo (VL) y un dominio constante en su otro extremo: el dominio constante de la cadena ligera se encuentra alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada, y el dominio variable de la cadena ligera se encuentra alineado con el dominio variable de la cadena pesada. Se cree que residuos aminoácidos particulares forman una interfase entre los dominios variables de cadena ligera y de cadena
pesada.

El término "variable" se refiere al hecho de que determinadas partes de los dominios variables difieren extensivamente en secuencia entre anticuerpos y resultan útiles en la unión y especificidad de cada anticuerpo particular para su antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad no se distribuye uniformemente por todos los dominios variables de los anticuerpos. Se concentra en tres segmentos denominados regiones determinantes de complementariedad (CDRs) o regiones hipervariables en los dominios de tanto cadenas ligeras como cadenas pesadas. Las partes más altamente conservadas de los dominios variables se denominan regiones de marco (FR). Los dominios variables de las cadenas pesadas y ligeras nativas comprenden cada uno cuatro regiones FR, adoptando mayoritariamente una conformación de hoja \beta, conectada por tres CDRs, que forman bucles que conectan, y en algunos casos que forman parte, de la estructura de hoja \beta. Las CDRs en cada cadena se mantienen próximas entre sí gracias a las regiones FR y, con las CDRs de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión de antígeno de los anticuerpos (ver Kabat et al., NIH Publ. nº 91-3242, vol. I, páginas 647-669, 1991). Los dominios constantes no se encuentran directamente implicados en la unión de un anticuerpo a un antígeno, sino que muestran diversas funciones efectoras, tales como la participación del anticuerpo en la toxicidad celular dependiente de anticuerpo.

La expresión "región hipervariable" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a los residuos aminoácidos de un anticuerpo que son responsables de la unión de antígeno. La región hipervariable comprende residuos aminoácidos de una "región determinante de complementariedad" o "CDR" (es decir, los residuos 24 a 34 (L1), 50 a 56 (L2) y 89 a 97 (L3) en el dominio variable de cadena ligera, y 31 a 35 (H1), 50 a 65 (H2) y 95 a 102 (H3) en el dominio variable de cadena pesada; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a edición, Publich Health Service, National Institute of Health, Bethesda, MD, 1991, y/o aquellos residuos de un "bucle hipervariable" (es decir los residuos 26 a 32 (L1), 50 a 52 (L2) y 91 a 96 (L3) en el dominio variable de cadena ligera y 26 a 32 (H1), 53 a 55 (H2) y 96 a 101 (H3) en el dominio variable de cadena pesada; Clothia y Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917, 1987). Los residuos "de marco" o "FR" son aquellos residuos de dominio variable diferentes de los residuos de región hipervariable tal como se definen en la presente invención.

Los "fragmentos de anticuerpo" comprender una parte de un anticuerpo intacto, preferentemente la región de unión de antígeno o región variable del anticuerpo intacto. Entre los ejemplos de fragmentos de anticuerpos se incluyen Fab, Fab', F(ab')_{2} y fragmentos Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales (Zapata et al., Protein Eng. 8(10):1057-1062, 1995); moléculas de anticuerpo de cadena única; y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos.

La digestión con papaína de anticuerpos produce dos fragmentos de unión a antígeno idénticos denominados fragmentos "Fab", cada uno con un solo sitio de unión a antígeno, y un fragmento "Fc" residual, una denominación que indica la capacidad de cristalizar con facilidad. El tratamiento con pepsina proporciona un fragmento F(ab')_{2} que presenta dos sitios de combinación a antígeno y todavía es capaz de unirse cruzadamente a un antígeno.

"Fv" es el fragmento mínimo de anticuerpo que contiene un sitio completo de reconocimiento y de unión de antígeno. Esta región consiste de un dímero que consta de un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera en asociación estrecha no covalente. Es en esta configuración que los tres CDRs de cada dominio variable interaccionan definiendo un sitio de unión a antígeno sobre la superficie del dímero VH-VL. Colectivamente los seis CDRs proporcionando especificidad de unión a antígeno al anticuerpo. Sin embargo, incluso un solo dominio variable (o medio Fv que comprende únicamente tres CDR2 específicos para un antígeno) presenta la capacidad de reconocer y unirse a un antígeno, aunque a una afinidad más baja que el sitio de unión entero.

El fragmento Fab también contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab difieren de los fragmentos Fab' en la adición de unos cuantos residuos en el extremo carboxi-terminal del dominio CH1 de cadena pesada, incluyendo una o más cisteínas de la región bisagra del anticuerpo. Fab'-SH es la denominación en la presente memoria para Fab' en la que el residuo o residuos de cisteína de los dominios constantes portan un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpo F(ab')_{2} originalmente se produjeron como pares de fragmentos Fab' con cisteínas de bisagra entre ellas. También son conocidos otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpos.

Las "cadenas ligeras" de los anticuerpos (inmunoglobulinas) de cualquier especie de vertebrado pueden clasificarse en dos tipos claramente diferenciados, denominados kappa y lambda, basándose en las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes.

Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, las inmunoglobulinas pueden incluirse en diferentes clases. Existen cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG y IgM, y varias de éstas pueden dividirse adicionalmente en subclases (isotipos), por ejemplo IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA y IgA2.

La expresión "anticuerpo monoclonal" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, de los anticuerpos individuales que comprende la población son idénticos excepto por posibles mutaciones naturales que pueden encontrarse presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, dirigiéndose contra un solo sitio antigénico. Además, en contraste con las preparaciones de anticuerpo (policlonal) convencionales, que habitualmente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un solo determinante sobre el antígeno. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales resultan ventajosos en que se sintetizan en un cultivo de hibridoma, no contaminado por otras inmunoglobulinas. El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo, obtenido a partir de un población de anticuerpos sustancialmente homogénea, y no debe interpretarse como que requiere la producción del anticuerpo mediante cualquier procedimiento particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que deben utilizarse de acuerdo con la presente invención pueden prepararse mediante el procedimiento de hibridoma descrito por primera vez por Kohler et al., Nature 256:495, 1975, o pueden prepararse mediante procedimientos de ADN recombinante (ver, por ejemplo, la patente US nº 4.816.567). Los "anticuerpos monoclonales" también pueden aislarse a partir de bibliotecas de anticuerpos fágicos utilizando las técnicas descritas en Clackson et al., Nature 352:624-628, 1991, y en Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597, 1991, por ejemplo.

Los anticuerpos monoclonales en la presente invención incluyen específicamente anticuerpos "quiméricos" (inmunoglobulinas) en los que una parte de la cadena pesada y/o de la cadena ligera es idéntica u homóloga a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o perteneciente a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de la cadena o cadenas es idéntico u homólogo a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivadas de otra especie o perteneciente a otra clase o subclase de anticuerpos, así como fragmentos de dichos anticuerpos, con la condición de que muestren la actividad biológica deseada (patente US nº 4.816.567; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855, 1984).

Las formas "humanizadas" de los anticuerpos no humanos (por ejemplo murinos) son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulina o fragmentos de los mismos (tales como Fv, Fab', F(ab')_{2} u otras subsecuencias de unión a antígeno de los anticuerpos) que contienen secuencias mínimas derivadas de una inmunoglobulina no humana. En su mayoría, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que los residuos de un CDR del receptor se sustituyen por residuos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo donante), tal como ratón, rata o conejo con la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de FR de Fv de la inmunoglobulina humana se sustituyen por los residuos no humanos correspondientes. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran ni en el anticuerpo receptor ni en la CDR o secuencias de marco importadas. Estas modificaciones se llevan a cabo para refinar y maximizar adicionalmente el rendimiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprende sustancialmente la totalidad de por lo menos un dominio variable, y habitualmente de dos. En general, el anticuerpo humanizado comprende sustancialmente la totalidad de por lo menos uno, y habitualmente de dos, dominios variables, en los que la totalidad o sustancialmente la totalidad de todas las regiones CDR corresponden a aquéllas de una inmunoglobulina humana, y la totalidad o sustancialmente la totalidad de las regiones FR son aquéllas de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado óptimamente comprende también por lo menos una parte de una región constante (Fc) de inmunoglobulina, habitualmente la de una inmunoglobulina humana. Para más detalles ver Jones et al., Nature 321:522-525, 1986; Reichmann et al., Nature 332:323-329, 1988; y Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596, 1992. El anticuerpo humanizado incluye un anticuerpo PRIMATIZED^{TM}, en el que la región de unión a antígeno del anticuerpo se derivada de un anticuerpo producido mediante la inmunización de monos macacos con el antígeno de
interés.

Los fragmentos de anticuerpo "Fv de cadena única" o "sFv" comprenden los dominios V_{H} y V_{L} de anticuerpo, en los que estos dominios se encuentran presentes en una sola cadena de polipéptido. Preferentemente, el polipéptido Fv comprende además un línker de polipéptido entre los dominios V_{H} y V_{L} que permita que sFv forme la estructura deseada para la unión de antígeno. Para una revisión de sFv, ver Pluckthun, en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore, editores, Springer-Verlag, New York, páginas 269-315, 1994.

El término "diacuerpos" se refiere a fragmentos de anticuerpo pequeños con dos sitios de unión a antígeno, fragmentos que comprenden un dominio variable (V_{H}) de cadena pesada conectado a un dominio variable de cadena ligera (V_{L}) en la misma cadena polipeptídica (V_{H}-V_{L}). Mediante la utilización de un línker que no sea excesivamente corto para permitir el apareamiento entere los dos dominios en la misma cadena, se fuerza que los dominios se apareen con los dominios complementarios de otra cadena y creen dos sitios de unión a antígeno. Los diacuerpos se describen más completamente en, por ejemplo, la patente EP nº 404.097, la patente WO nº 93/11161; y Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448, 1993.

Un anticuerpo "aislado" es uno que ha sido identificado y separado y/o recuperado de un componente de su ambiente natural. Los componentes contaminantes de su ambiente natural son materiales que interferirían con los usos diagnósticos o terapéuticos del anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteináceos o no proteináceos. En las realizaciones preferentes, el anticuerpo se purifica (1) hasta más del 95% en peso de anticuerpo según se determina mediante el procedimiento de Lowry, y más preferentemente hasta más del 99% en peso, (2) en un grado suficiente para obtener por lo menos 15 residuos N-terminales o internos a la secuencia de aminoácidos mediante la utilización de un secuenciador de taza giratoria, o (3) hasta la homogeneidad mediante SDS-PAGE bajo condiciones reductoras o no reductoras utilizando azul de Coomassie o, preferentemente, tinción de plata. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ dentro de células recombinantes debido a que por lo menos un componente del ambiente natural del anticuerpo no se encuentra presente. Habitualmente, sin embargo, el anticuerpo aislado se prepara mediante por lo menos una etapa de purificación.

El término "marcaje" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un compuesto o composición detectable que se conjuga directamente o indirectamente con el anticuerpo de manera que genera un anticuerpo "marcado". El marcaje puede ser detectable por sí mismo (por ejemplo marcajes de isótopo radioactivo o marcajes fluorescentes) o, en el caso de un marcaje enzimático, pueden catalizar la alteración química de un compuesto o composición de sustrato que resulta detectable.

La expresión "fase sólida" se refiere a una matriz no acuosa a la que puede adherirse el anticuerpo de la presente invención. Entre los ejemplos de fases sólidas abarcadas por la presente invención se incluyen aquéllas formadas parcial o enteramente de vidrio (por ejemplo vidrio de poro controlado), polisacáridos (por ejemplo agarosa), poliacrilamidas, poliestireno, alcohol polivinílico y siliconas. En determinadas realizaciones, dependiendo del contexto, la fase sólida puede comprender el pocillo de una placa de ensayo; en otras, es una columna de purificación (por ejemplo de una columna de cromatografía de afinidad). Este término también incluye una fase sólida discontinua de partículas discretas, tal como aquéllas descritas en la patente US nº 4.275.149.

Un "liposoma" es una vesícula pequeña compuesta de diversos tipos de lípidos, fosfolípidicos y/o surfactante, que resulta útil para la administración de un fármaco (tal como un polipéptido PRO211 o un anticuerpo del mismo) a un mamífero. Los componentes del liposoma comúnmente se disponen en una formación en bicapa, similar a la disposición de los lípidos en las membranas biológicas.

La expresión "molécula pequeña" se define en la presente memoria como de peso molecular inferior a aproximadamente 500 daltons.

II. Composiciones y procedimientos A. Polipéptidos PRO211 de longitud completa

La presente solicitud da a conocer una secuencia aislada de nucleótidos codificante de un polipéptido al que se hace referencia en la presente solicitud como PRO211. En particular, ha sido identificado y aislado el ADNc codificante de polipéptido PRO211, tal como se da a conocer en más detalle en los Ejemplos posteriormente.

Tal como se da a conocer en los Ejemplos posteriormente, se ha depositado un clon de ADNc codificante del polipéptido PRO211 en la ATCC. El experto en la materia podrá determinar con facilidad las secuencias reales de nucleótidos mediante la secuenciación de los clones depositados utilizando procedimientos rutinarios de la técnica. Las secuencias teóricas de aminoácidos pueden determinarse a partir de las secuencias de nucleótidos utilizando técnicas rutinarias. Para el polipéptido PRO211 y los ácidos nucleicos codificantes del mismo indicados en la presente invención, los solicitantes han identificado lo que se considera el marco de lectura más identificable con la información de secuencia disponible en la actualidad.

B. Variantes de PRO211

Además del polipéptido PRO211 de secuencia nativa de longitud completa descrito en la presente memoria, se contempla que puedan prepararse variantes de PRO211. Las variantes de PRO211 pueden prepararse mediante la introducción de cambios apropiados de nucleótidos en el ADN de PRO211, y/o mediante la síntesis del polipéptido PRO211 deseado. Los expertos en la materia apreciarán que los cambios de aminoácidos podrían alterar los procesos post-traduccionales del polipéptido PRO211, tal como cambiar el número o la posición de los sitios de glucosilación o alterar las características de anclaje a la membrana.

Pueden llevarse a cabo variaciones de la PRO211 de secuencia nativa de longitud completa o en diversos dominios de la PRO211 indicada en la presente memoria, por ejemplo utilizando cualquiera de las técnicas y directrices de mutaciones conservativas y no conservativas proporcionadas, por ejemplo, en la patente US nº 5.364.934. Las variaciones pueden ser sustituciones, deleciones o inserciones de uno o más codones codificantes de PRO211 que resultan en un cambio en la secuencia de aminoácidos de PRO211 en comparación con la PRO211 de secuencia nativa. Opcionalmente, la variación es mediante la sustitución de por lo menos un aminoácido por cualquier otro aminoácido en uno o más de los dominios de PRO211. Puede encontrarse una guía para determinar qué residuo aminoácido puede insertarse, sustituirse o delecionarse sin afectar adversamente la actividad deseada mediante la comparación de la secuencia de PRO211 con la de moléculas de proteína conocidas homólogas y minimizando el número de cambios de la secuencia de aminoácidos realizados en las regiones de homología elevada. Las sustituciones de aminoácidos pueden ser el resultado de sustituir un aminoácido por otro aminoácido con propiedades estructurales y/o químicas similares, tal como la sustitución de una leucina por una serina, es decir, sustituciones de aminoácidos conservativas. Las inserciones o deleciones opcionalmente pueden ser de entre aproximadamente 1 y 5 aminoácidos. La variación permitida puede determinarse realizando sistemáticamente inserciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos en la secuencia y analizando las variantes resultantes para la actividad mostrada por la secuencia de longitud completa o la secuencia nativa madura.

En la presente invención se dan a conocer fragmentos del polipéptido PRO211. Estos fragmentos pueden truncarse en el extremo N-terminal o C-terminal, o pueden carecer de residuos internos, por ejemplo, cuando se comparan con una proteína nativa de longitud completa. Determinados fragmentos carecen de residuos aminoácidos que no resultan esenciales para una actividad biológica deseada del polipéptido PRO211.

Los fragmentos de PRO211 pueden prepararse mediante cualquiera de entre varias técnicas convencionales. Los fragmentos de péptido deseados pueden sintetizarse químicamente. Un enfoque alternativo implica generar fragmentos de PRO211 mediante digestión enzimática, por ejemplo mediante tratamiento de la proteína con un enzima que es conocido que corta proteínas en sitios definidos por residuos aminoácidos particulares o mediante la digestión del ADN con enzimas de restricción adecuados y el aislamiento del fragmento deseado. Todavía otra técnica adecuada implica aislar y amplificar un fragmento de ADN codificante de un fragmento de polipéptido deseado, mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Los oligonucleótidos que definen los extremos deseados del fragmento de ADN se utilizan en los cebadores 5' y 3' en la PCR. Preferentemente, los fragmentos del polipéptido PRO211 comparten por lo menos una actividad biológica y/o inmunológica con el polipéptido PRO211 nativo mostrado en la figura 2 (SEC ID nº 2).

En realizaciones particulares, se muestran las sustituciones conservativas en la Tabla 3 bajo el título de sustituciones preferentes. Si estas sustituciones resultan en un cambio de actividad biológica, entonces se introducen cambios más sustanciales, denominados sustituciones ejemplares en la Tabla 3, o que se describen en más detalle posteriormente en referencia a las clases de aminoácidos, y se criban los productos.

TABLA 3

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18

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Se consiguen modificaciones sustanciales de función o de identidad inmunológica del polipéptido PRO211 mediante la selección de sustituciones que difieren significativamente en su efecto sobre el mantenimiento de: (a) la estructura del esqueleto de polipéptido en el área de la sustitución, por ejemplo de conformación de hoja o de hélice, (b) la carga o la hidrofobicidad de la molécula en el sitio diana, o (c) el volumen de la cadena lateral. Los residuos naturales se dividen en grupos basándose en propiedades comunes de sus cadenas laterales:

(1)

hidrofóbicos: norleucina, met, ala, val, leu, ile;

(2)

neutros hidrofílicso: cys, ser, thr;

(3)

ácidos: asp, glu;

(4)

básicos: asn, ain, his, lys, arg;

(5)

residuos que influyen sobre la orientación de cadena: gly, pro; y

(6)

aromáticos: trp, tyr, phe.

Las sustituciones no conservativas suponen intercambiar un miembro de estas clases por un miembro de otra clase. Estos residuos sustituidos también pueden introducirse en los sitios de sustitución conservativa o, más preferentemente, en los sitios restantes (no conservados).

Las variaciones pueden llevarse a cabo utilizando procedimientos conocidos de la técnica, tales como la mutagénesis mediada por oligonucleótidos (sitio-dirigida), el escaneo de alaninas, y la mutagénesis por PCR. Puede llevarse a cabo mutagénesis sitio-dirigida (Carter et al., Nucl. Acids Res. 13:4331, 1986; Zoller et al., Nucl. Acids Res. 10:6487, 1987), mutagénesis por inserción de casete (Wells et al., Gene 34:315, 1985), mutagénesis de selección por restricción (Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA 317:415, 1986) u otras técnicas conocidas sobre el ADN clonado con el fin de producir ADN variante de PRO211, de PRO228, de PRO538, de PRO172 o de PRO182.

También puede utilizarse el análisis de escaneo de aminoácidos para identificar uno o más aminoácidos junto con una secuencia contigua. Entre los aminoácidos de escaneo preferentes se encuentran los aminoácidos neutros de tamaño relativamente reducido. Entre estos aminoácidos se incluyen alanina, glicina, serina y cisteína. La alanina es habitualmente un aminoácido de escaneo preferente de entre este grupo debido a que elimina la cadena lateral más allá del carbono beta y es menos probable que altere la conformación de la cadena principal de la variante (Cunningham y Wells, Science 244:1081-1085, 1989). La alanina habitualmente también resulta preferente debido a que es el aminoácido más frecuente. Además, con frecuencia se encuentra en posiciones tanto enterradas como expuestas ((Creighton, The Proteins, W.H. Freeman & Co., N.Y.), Chothia, J. Mol. Biol. 150:1, 1976)). Si la sustitución de alaninas no proporciona cantidades adecuadas de variante, puede utilizarse un aminoácido isotérico.

C. Modificaciones de PRO211

Las modificaciones covalentes de PRO211 se incluyen dentro del alcance de la presente invención. Un tipo de modificación covalente incluye reaccionar residuos aminoácidos diana de un polipéptido PRO211 con un agente derivatizante orgánico que es capaz de reaccionar con cadenas laterales seleccionadas o con los residuos N-terminales o C-terminales de PRO211. La derivatización con agentes bifuncionales resulta útil, por ejemplo, para reticular PRO211 con una matriz o superficie de soporte insoluble en agua para la utilización en el procedimiento para purificar anticuerpos anti-PRO211, y viceversa. Entre los agentes reticulantes utilizados comúnmente se incluyen, por ejemplo, 1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletano, glutaraldehído, ésteres de N-hidroxisuccinimida, por ejemplo ésteres con ácido 4-azidosalícilico, imidoésteres homobifuncionales, incluyendo ésteres de succinimidilo, tales como 3,3'-ditiobis(succinimidilpropionato), maleimidas bifuncionales, tales como bis-N-maleimido-1,8-octano, y agentes, tales como metil-3-[(p-azidofenil)ditio]propioimidato.

Entre otras modificaciones se incluyen la desamidación de los residuos glutaminilo y asparaginilo para formar los residuos glutamilo y aspartilo correspondientes, respectivamente, la hidroxilación de prolina y de lisina, la fosforilación de grupos hidroxilo de residuos serilo o treonilo, la metilación de los grupos \alpha-amino de cadenas laterales de lisina, arginina e histidina (T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, páginas 79-86, 1983), la acetilación de la amina N-terminal, y la amidación de cualquier grupo carboxilo C-terminal.

Otro tipo de modificación covalente del polipéptido PRO211 incluido dentro del alcance de la presente invención comprende alterar el patrón nativo de glucosilación del polipéptido. La expresión "alterar el patrón nativo de glucosilación" pretende referirse para los fines de la presente invención a delecionar uno o más grupos carbohidrato en la PRO211 de secuencia nativa (eliminando el sitio de glucosilación subyacente o delecionando la glucosilación por medios químicos y/o enzimáticos), y/o añadiendo uno o más sitios de glucosilación que no se encuentran presentes en la PRO211 de secuencia nativa.

Además, la expresión incluye cambios cualitativos en la glucosilación de las proteínas nativas, implicando un cambio en la naturaleza y en las proporciones de los diversos grupos carbohidrato presentes.

La adición de sitios de glucosilación al polipéptido PRO211 puede conseguirse mediante la alteración de la secuencia de aminoácidos. La alteración puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante la adición o sustitución de uno o más residuos serina o treonina en la PRO211 de secuencia nativa (para los sitios de glucosilación ligados a O). La secuencia de aminoácidos de PRO211 opcionalmente puede alterarse mediante cambios a nivel del ADN, particularmente mutando el ADN codificante del polipéptido PRO211 en bases preseleccionadas de manera que se generen codones que se traducirán en los aminoácidos deseados.

Otro medio de incrementar el número de grupos carbohidrato en el polipéptido PRO211 es mediante acoplamiento químico o enzimático de glucósidos al polipéptido. Estos procedimientos han sido descritos en la técnica, por ejemplo en la patente WO nº 87/05330, publicada el 11 de septiembre de 1987, y en Aplin y Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., páginas 259-306, 1981.

La eliminación de los grupos carbohidrato presentes en el polipéptido PRO211 puede conseguirse química o enzimáticamente o mediante la sustitución mutacional de codones codificantes de los residuos aminoácidos que sirven como dianas para la glucosilación. Se conocen en la técnica técnicas químicas de desglucosilación y que se describen, por ejemplo, en Hakimuddin et al., Arch. Biochem. Biophys 259:52, 1987, y en Edge et al., Anal. Biochem. 118:1311, 1981. El corte enzimático de grupos carbohidrato en los polipéptidos puede conseguirse mediante la utilización de una diversidad de endoglucosidasas y exoglucosidasas, tal como describen Thotakura et al., Meth. Enzymol. 138:350, 1987.

Otro tipo de modificación covalente de PRO211 comprende unir el polipéptido PRO211 a uno de entre una diversidad de polímeros no proteináceos, por ejemplo polietilenglicol (PEG), propilenglicol, o polioxialquilenos, de la manera expuesta en las patentes US nº 4.640.835, nº 4.496.689, nº 4.301.144, nº 4.670.417, nº 4.791.192 o nº 4.179.337.

El polipéptido PRO211 de la presente invención también puede modificarse de manera que forme una molécula quimérica que comprende PRO211 fusionado con otro polipéptido o secuencia de aminoácidos heterólogo.

En una realización, dicha molécula quimérica comprende una fusión del polipéptido PRO211 con un polipéptido etiqueta que proporciona un epítopo al que puede unirse selectivamente un anticuerpo anti-etiqueta. El epítopo etiqueta generalmente se sitúa en el extremo aminoterminal o carboxiterminal del polipéptido PRO211. La presencia de estas formas etiquetas con epítopos del polipéptido PRO211 pueden detectarse utilizando un anticuerpo contra el polipéptido etiqueta. Además, la provisión del epítopo etiqueta permite purificar con facilidad el polipéptido PRO2111 mediante purificación por afinidad utilizando un anticuerpo anti-etiqueta u otro tipo de matriz de afinidad que se una al epítopo etiqueta. Son bien conocidos de la técnica diversos polipéptidos etiqueta y sus anticuerpos respectivos. Entre los ejemplos se incluyen etiquetas polihistidina (poli-His) o poli-histidina-glicina (poli-His-gly); el polipéptido etiqueta HA de la gripe y su anticuerpo 12CA5 (Field et al., Mol. Cell Biol. 8:2159-2165, 1988); la etiqueta c-myc y los anticuerpos de la misma 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 y 9E10 (Evan et al., Molecular and Cellular Biology 5:3610-3616, 1985) y la etiqueta glucoproteína D del virus del herpes simplex (gD) y su anticuerpo (Paborsky et al., Protein Engineering 3(6):547-553, 1990). Entre otros polipéptidos etiqueta se incluyen el péptido Flag (Hopp et al., BioTechnology 6:1204-1210, 1988), el epítopo péptido KT3 (Martin et al., Science 255:192-194, 1992); un epítopo péptido \alpha-tubulina (Skinner et al., J. Biol. Chem. 266:15163-15166, 1991); y la etiqueta péptido de la proteína del gen 10 de T7 (Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6393-6397,
1990).

En una realización alternativa, la molécula quimérica puede comprender una fusión del polipéptido PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 o PRO182 con una inmunoglobulina o una región particular de una inmunoglobulina. Para una forma bivalente de la molécula quimérica (también denominada "inmunoadhesina"), esta fusión podría ser con la región Fc de una molécula de IgG. Las fusiones de Ig preferentemente incluyen la sustitución de una forma (con deleción o inactivación del dominio transmembranal) soluble de un polipéptido PRO211 en lugar de por lo menos una región variable dentro de una molécula de Ig. En una realización particularmente preferente, la fusión de inmunoglobulina incluye las regiones bisagra CH2 y CH3, o CH1, CH2 y CH3 de una molécula de IgG. Para la producción de fusiones de inmunoglobulina ver también la patente US nº 5.428.130, publicada el 27 de junio de 1995.

D. Preparación de PRO211

La descripción siguiente se refiere principalmente a la producción de PRO211 mediante el cultivo de células transformadas o transfectadas con un vector que contiene ácidos nucleicos de PRO211. Evidentemente se contempla que puedan utilizarse procedimientos alternativos, que son bien conocidos de la técnica, para preparar PRO211. Por ejemplo, puede producirse la secuencia del polipéptido PRO211, o partes de la misma, mediante síntesis directa de péptidos utilizando técnicas en fase sólida (ver, por ejemplo, Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, CA, 1969; Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154, 1963). La síntesis de proteínas in vitro puede llevarse a cabo utilizando técnicas manuales o mediante automatización. La síntesis automatizada puede conseguirse, por ejemplo, utilizando un sintetizador de péptidos de Applied Biosystems (Foster City, CA) siguiendo las instrucciones del fabricante. Diversas partes del polipéptido PRO211 pueden sintetizarse químicamente de manera separada y combinarse utilizando procedimientos químicos o enzimáticos para producir el polipéptido PRO211 de longitud completa.

1. Aislamiento del ADN codificante de PRO211

El ADN codificante de PRO211 puede obtenerse de una biblioteca de ADNc preparada a partir de tejido que se considere que posee ARNm de PRO211 y que lo exprese a nivel detectable. Por consiguiente, puede obtenerse convenientemente ADN de PRO211 humana de una biblioteca de ADNc preparada a partir de tejido humano, tal como se describe en los Ejemplos. El gen codificante de PRO211 también puede obtenerse a partir de una biblioteca genómica o mediante procedimientos sintéticos conocidos (por ejemplo la síntesis automatizada de ácidos nucleicos).

Las bibliotecas pueden cribarse con sondas (tales como anticuerpos contra PRO211 u oligonucleótidos de por lo menos aproximadamente 20 a 80 bases) diseñados para identificar el gen de interés o la proteína codificada por el mismo. El cribado del ADNc o de la biblioteca genómica con la sonda seleccionada puede llevarse a cabo utilizando procedimientos estándar, tal como se describe en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Un medio alternativo de aislar el gen codificante de PRO211 es utilizar metodología de PCR (Sambrook et al., supra; Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995).

Los Ejemplos posteriormente describen técnicas para cribar una biblioteca de ADNc. Las secuencias de oligonucleótidos seleccionadas como sondas deben ser de suficiente longitud y suficientemente no ambiguas para minimizar los falsos positivos. El oligonucleótido preferentemente se marca de manera que pueda detectarse tras la hibridación con ADN en la biblioteca que se está cribado. Son conocidos de la técnica los procedimientos de marcaje, y entre ellos se incluyen la utilización de marcajes radioactivos, tales como el ATP marcado con 32P, la biotinilación o el marcaje enzimático. Las condiciones de hibridación, incluyendo la astringencia moderada y la astringencia elevada, se proporcionan en Sambrook et al., supra.

Las secuencias identificadas en estos procedimientos de cribado de biblioteca pueden compararse y alinearse a otras secuencias conocidas depositadas y disponibles en bases de datos públicas, tales como GenBank u otras bases de datos de secuencias privadas. La identidad de secuencias (a nivel de aminoácidos o de nucleótidos) dentro de regiones definidas de la molécula o a lo largo de la secuencia de longitud completa, puede determinarse utilizando procedimientos conocidos de la técnica y tal como se describe en la presente invención.

Los ácidos nucleicos que presentan secuencia codificante de proteína pueden obtenerse cribando bibliotecas seleccionadas de ADNc o genómicas con la secuencia de aminoácidos deducida que se da a conocer en la presente invención por primera vez y, si resulta necesario, utilizando procedimientos convencionales de extensión de cebadores, tal como se describe en Sambrook et al., supra, para la detección de precursores y el procesamiento de intermediarios de ARNm que posiblemente no han sido transcritos inversamente para formar ADNc.

2. Selección y transformación de células huésped

Las células huésped se transfectan o se transforman con los vectores de expresión o de clonación indicados en la presente invención para la producción de PRO211 y se cultivan en medio nutritivo convencional según resulte apropiado para inducir los promotores, seleccionar los transformantes, o amplificar los genes codificantes de las secuencias deseadas. Las condiciones de cultivo, tales como los medios, la temperatura, el pH y similares, pueden ser seleccionados por el experto en la materia sin experimentación excesiva. En general pueden encontrarse principios, protocolos y técnicas prácticas para maximizar la productividad de los cultivos celulares en Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M. Butler, editor (IRL Press, 1991) y en Sambrook et al., supra.

Los procedimientos de transfección de células eucarióticas y de transformación de células procarióticas son conocidos para el experto ordinario en la materia, por ejemplo CaCl_{2}, CaPO_{4}, mediada por liposomas y electroporación. Dependiendo de la célula huésped utilizada, la transformación se lleva a cabo utilizando técnicas estándar apropiadas para estas células. El tratamiento con calcio utilizando cloruro de calcio, tal como se describe en Sambrook et al., supra, o la electroporación generalmente se utiliza para procariotas. La infección con Agrobacterium tumefaciens se utiliza para la transformación de determinadas células vegetales, tal como describen Shaw et al., Gene 23:315, 1983, y la patente WO nº 89/05859, publicada el 29 de junio de 1989. Para las células de mamífero sin estas paredes celulares, puede utilizarse el procedimiento de precipitación con fosfato de calcio de Graham y van der Eb, Virology 52:456-457, 1978. Los aspectos generales de las transfecciones de sistemas de célula huésped de mamífero se han descrito en la patente US nº 4.399.216. Las transformación en las levaduras habitualmente se llevan a cabo de acuerdo con el procedimiento de van Solingen et al., J. Bact. 130:946, 1977, y de Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 76:3829, 1979. Sin embargo, también pueden utilizarse otros procedimientos para introducir ADN en las células, tales como mediante microinyección nuclear, electroporación, fusión de protoplasto bacteriano con células intactas, o policationes, por ejemplo polibreno o poliornitina. Para las diversas técnicas para transformar células de mamífero ver Keown et al., Methods in Enzymology 185:527-537, 1990, y Mansour et al., Nature 336:348-352, 1988.

Entre las células huésped adecuadas para la clonación y la expresión de ADN en los vectores de la presente invención se incluyen las células de procariotas, de levadura o de eucariotas superiores. Entre los procariotas adecuados se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, eubacterias, tales como los organismos Gram-negativos y Gram-positivos, por ejemplo Enterobacteriaceae, tales como E. coli. Se encuentran públicamente disponibles diversas cepas de E. coli, tales como E. coli K12 cepa MM294 (ATCC nº 31.446); E. coli X1776 (ATCC nº 31.537); E. coli cepa W3110 (ATCC nº 27.325) y K5772 (ATCC nº 53.635). Entre otras células huésped procarióticas adecuados se incluyen Enterobacteriaceae tales como Escherichia, por ejemplo E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por ejemplo Salmonella typhimurium, Serratia, por ejemplo Serratia marcescens, y Shigella, así como Bacilli, tales como B. subtilis y B. licheniformis (por ejemplo B. licheniformis 41P, dada a conocer en la patente DD nº 266.710, publicada el 12 de abril de 1989); Pseudomonas, tales como P. aeruginosa y Streptomyces. Estos ejemplos son ilustrativos y no limitativos. La cepa W3110 es un huésped particularmente preferente o huésped parental debido a que es una cepa común de huésped para las fermentaciones de productos de ADN recombinante. Preferentemente, la célula huésped secreta cantidades mínimas de enzimas proteolíticos. Por ejemplo, la cepa W3110 puede modificarse para producir una mutación genética en los genes codificantes de proteínas endógenas al huésped, incluyéndose entre los ejemplos de estos huéspedes E. coli W3110 cepa 1A2, que presenta el genotipo tonA completo; E. coli W3110 cepa 9E4, que presenta el genotipo tonA ptr3 completo; E. coli W3110 cepa 27C7 (ATCC nº 55.244), que presenta el genotipo completo tonA ptr3 phoA EI5 (argF-lac) 169 degP ompT karf; E. coli W3110 cepa 37D6, que presenta el genotipo completo tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac) 169 degP ompT rbs7 ilvG kan'; E. coli W3110 cepa 40B4, que es una cepa 37D6 con una mutación por deleción degP no resistente a la canamicina; y una cepa de E. coli con una proteasa periplásmica mutante dada a conocer en la patente US nº 4.946.783, publicada el 7 de agosto de 1990. Alternativamente, resultan adecuados los procedimientos in vitro de clonación, por ejemplo PCR u otras reacciones de polimerasa de ácidos nucleicos.

Además de los procariotas, los microbios eucarióticos, tales como los hongos filamentosos o levadura, son huéspedes de expresión o de clonación adecuados para los vectores codificantes de PRO211. Saccharomyces cerevisiae es un microorganismo huésped eucariótico inferior utilizado comúnmente. Otros incluyen Schizosaccharomyces pombe (Beach y Nurse, Nature 290:140, 1981; patente EP nº 139.383, publicada el 2 de mayo de 1985); huéspedes Kluyveromyces (patente US nº 4.943.529; Fleer et al., Bio/Techology 9:968-975, 1991), tales como, por ejemplo, K. lactis (MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt et al., J. Bacteriol. 737, 1983), K. fragilis (ATCC nº 12.424), K. bulgaricus (ATCC nº 16.045), K. wickeramii (ATCC nº 24.178), K. waltii (ATCC nº 56.500), K. drosophilarum (ATCC nº 36.906; Van den Berg et al., Bio/Technology 8:135, 1990), K. thermotolerans, y K. marxianus; yarrowia (patente EP nº 402.226); Pichiapastoris (patente EP nº 183.070; Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol. 28:265-278, 1988); Candida: Trichoderma reesia (patente EP nº 244.234); Neurospora crassa (Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:5259-5263, 1979); Schwanniomyces, tales como Schwanniomyces occidentalis (patente EP nº 394.538, publicada el 31 de octubre de 1990); y hongos filamentosos, tales como, por ejemplo, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (patente WO nº 91/00357, publicada el 10 de enero de 1991), y huéspedes Aspergillus, tales como A. nidulans (Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 112:284-289, 1983); Tilburn et al., Gene 26:205-221, 1983; Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:1470-1474, 1984), y A. niger (Kelly y Hynes, EMBO J. 4:475-479, 1985). Las levaduras metilotróficas resultan adecuadas en la presente invención e incluyen, aunque sin limitarse a ellas, levaduras capaces de crecer en metanol seleccionadas de entre los géneros que consisten en Hansenula, Candida, Kloeckera, Pichia, Saccharomyces, Torulopsis y Rhodotorula. Una lista de especies específicas que son ejemplares de esta clase de levaduras puede encontrarse en C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs 269, 1982.

Las células huésped adecuadas para la expresión de PRO211 glucosilado se derivan de organismos multicelulares. Entre los ejemplos de células de invertebrado se incluyen células de insecto, tales como Drosophila S2 y Spodoptera Sf9, así como células vegetales. Entre los ejemplos de líneas de células huésped de mamífero se incluyen las células de ovario de hámster chino (CHO) y las células COS. Entre ejemplos más específicos se incluyen la línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL nº 1651), la línea renal embrionaria humana (células 293 o células 293 subclonadas para el crecimiento en cultivo en suspensión, Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59, 1977; células de ovario de hámster chino/-DHFR (CHO, Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216, 1980), células de sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251, 1980); células pulmonares humanas (W138, ATCC CCL 75); células hepáticas humanas (HepG2, HB 8065), y tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL 51). La selección de la célula huésped apropiada se considera que se encuentra dentro de los conocimientos del experto en la materia.

3. Selección y utilización de un vector replicable

El ácido nucleico (por ejemplo ADNc o ADN genómico) codificante de PRO211 puede insertarse en un vector replicable para la clonación (amplificación del ADN) o para la expresión. Se encuentran públicamente disponibles diversos vectores. El vector puede encontrarse, por ejemplo, en la forma de un plásmido, cósmido, partícula vírica, o fago. La secuencia de ácidos nucleicos apropiada puede insertarse en el vector mediante una diversidad de procedimientos. En general, se inserta ADN en uno o más sitios apropiados de restricción por endonucleasa utilizando técnicas conocidas de la técnica. Entre los componentes de vector se incluyen generalmente, aunque sin limitarse a ellos, uno o más de entre una secuencia de señal, un origen de replicación, u no o más genes marcadores, un elemento intensificador, un promotor, y una secuencia de terminación de transcripción. La construcción de vectores adecuados que contienen uno o más de estos componentes utilizando técnicas estándar de ligación que son conocidas para el experto en la materia.

El PRO211 puede producirse recombinantemente no sólo de manera directa, sino también como polipéptido de fusión con un polipéptido heterólogo, que puede ser una secuencia de señal u otro polipéptido con un sitio de corte específico en el extremo N-terminal de la proteína madura o polipéptido. En general, la secuencia de señal puede ser un componente del vector, o puede ser una parte del ADN codificante de PRO211 que se inserta en el vector. La secuencia de señal puede ser una secuencia de señal procariótica seleccionada, por ejemplo, de entre el grupo de fosfatasa alcalina, penicilasa, Ipp, o líderes de la enterotoxina II estable al calor. Para la secreción en la levadura, la secuencia de señal puede ser, por ejemplo, el líder invertasa de levadura, el líder factor alfa (incluyendo los líderes de factor \alpha de Saccharomyces y de Kluyveromyces, éste último descrito en la patente US nº 5.010.182), o el líder de la fosfatasa ácida, el líder de glucoamilasa de C. albicans (patente EP nº 362.179, publicada el 4 de abril de 1990), o la señal descrita en la patente WO 90/t3646, publicada el 15 de noviembre de 1990. En la expresión celular de mamífero, las secuencias de señal de mamífero pueden utilizarse para dirigir la secreción de la proteína, tal como secuencias de señal de polipéptidos secretados de la misma especie o de una especie relacionada, así como líderes secretorios víricos.

Los vectores tanto de expresión como de clonación contienen una secuencia de ácidos nucleicos que permite que el vector se replique en una o más células huésped seleccionadas. Estas secuencias son bien conocidas en una diversidad de bacterias, levaduras y virus. El origen de replicación del plásmido pBR322 resulta adecuado para la mayoría de las bacterias Gram-negativas, el origen del plásmido 2 \mu resulta adecuado para las levaduras, y diversos orígenes víricos (SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) resultan útiles para la clonación de vectores en células de mamífero.

Los vectores de expresión y de clonación habitualmente contienen un gen de selección, también denominado marcador seleccionable. Los genes de selección típicos codifican proteínas que (a) proporcionan resistencia a antibióticos o a otras toxinas, por ejemplo a ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina, (b) complementan deficiencias auxotróficas, o (c) suministran nutrientes críticos no disponibles en medios complejos, por ejemplo el gen codificante de la D-alanina racemasa para los Bacilli.

Un ejemplo de marcador seleccionable adecuado para las células de mamífero es aquel que permite la identificación de células competentes para incorporar el ácido nucleico codificante de PRO211, tal como DHFR o timidina quinasa. Una célula huésped apropiado cuando se utiliza DHFR de tipo salvaje es la línea celular CHO deficiente en actividad de DHFR, preparada y propagada tal como se describe en Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216, 1980. Un gen de selección adecuado para la utilización en las levaduras es el gen trpI presentes en el plásmido de levadura YRp7 (Stinchcomb et al., Nature 282:39, 1979; Kingsman et al., Gene 7:141, 1979; Tschemper et al., Gene 10:157, 1980). El gen trp1 proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura que carece de la capacidad de crecer en triptófano, por ejemplo ATCC nº 44076 o PEP4-1 (Jones, Genetics 85:12, 1977).

Los vectores de expresión y de clonación habitualmente contienen un promotor operablemente ligado a la secuencia de ácidos nucleicos codificante de PRO211 para dirigir la síntesis de ARNm. Los promotores reconocidos por un diversidad de potenciales células huésped son bien conocidos. Los promotores adecuados para la utilización con huésped procarióticos incluyen los sistemas promotores de la \beta-lactamasa y de la lactosa (Chang et al., Nature 275:615, 1978; Goeddel et al., Nature 281:544, 1979), la fosfatasa alcalina, un sistema promotor triptófano (trp) (Goeddel, Nucleic Acids Res. 8:4057, 1980, patente EP nº 36.776) y promotores híbridos, tales como el promotor tac (deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:21-25, 1983). Los promotores para la utilización en los sistemas bacterianos también contienen una secuencia de Shine-Dalgarno (S.D.) operablemente ligada al ADN codificante de PRO211.

Entre los ejemplos de secuencias promotoras adecuados para la utilización con huéspedes levaduras e incluyen promotores para la 3-fosfoglicerato quinasa (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255:2073, 1980) u otros enzimas glicolíticos (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7:149, 1968; Holland, Biochemistry 17:4900, 1978), tales como enolasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructoquinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato quinasa, triosafosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucoquinasa.

Otros promotores de levadura que son promotores inducibles con la ventaja adicional de que la transcripción se encuentra controlada por las condiciones de crecimiento, son las regiones promotoras para la alcohol deshidrogenasa 2, el isocitocromo C, la fosfatasa ácida, los enzimas degradativos asociados al metabolismo del nitrógeno, metalotioneína, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, y los enzimas responsables de la utilización de la maltosa y de la galactosa. Los vectores y promotores adecuados para la utilización en sistemas de expresión de levadura se describen adicionalmente en la patente EP nº 73.657.

La transcripción de PRO211 a partir de vectores en células huésped de mamífero se encuentra controlada, por ejemplo, por promotores obtenidos de los genomas de virus, tales como el virus polioma, el poxvirus aviar (patente UK nº 2.211.504, publicada el 5 de julio de 1989), adenovirus (tales como el adenovirus 2), virus del papiloma bovino, virus del sarcoma aviar, citomegalovirus, un retrovirus, el virus de la hepatitis B y el virus 40 del simio (SV40), de promotores heterólogos de mamífero, por ejemplo el promotor actina o un promotor inmunoglobulina, y de promotores de choque térmico, con la condición de que estos promotores sean compatibles con los sistemas celulares huésped.

La transcripción de un ADN codificante de PRO211 por los eucariotas superiores puede incrementarse insertando una secuencia intensificadora en el vector. Los intensificadores son elementos de ADN que actúan en cis, habitualmente de entre aproximadamente 10 y 300 pb, que actúan sobre un promotor incrementando su transcripción. En la actualidad se conocen muchas secuencias intensificadoras de genes de mamífero (globina, clastasa, albúmina, \alpha-fetoproteína, e insulina). Habitualmente, sin embargo, se utiliza un intensificador de un virus de célula eucariótica. Entre los ejemplos se incluyen el intensificador de SV40 en el lado tardío del origen de replicación (pb 100 a 270), el intensificador del promotor temprano del citomegalovirus, el intensificador del polioma en el lado tardío del origen de replicación, y los intensificadores de adenovirus. El intensificador puede cortarse y empalmarse en el vector en una posición 5' o 3' respecto a la secuencia codificante de PRO211, pero preferentemente se localiza en un sitio 5' respecto al promotor.

Los vectores de expresión utilizados en las células huésped eucarióticas (levaduras, hongos, células de insecto, planta, animal, ser humano, o células nucleadas de otros organismos multicelulares) también contienen secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para estabilizar el ARNm. Estas secuencias se encuentran disponibles comúnmente de regiones no traducidas 5' y ocasionalmente 3' respecto a ADNs o ADNc víricos o eucarióticos. Estas regiones contienen segmentos de nucleótidos transcritos como fragmentos poliadenilados en la parte no traducida del ARNm codificante de PRO211.

Todavía otros procedimientos, vectores y células huésped que resultan adecuados para su adaptación a la síntesis de PRO211 en cultivo celular vertebrado recombinante se describen en Gething et al., Nature 293:620-625, 1981; Mantei et al., Nature 281:40-46, 1979; patente EP nº 117.060 y patente EP nº 117.058.

4. Detección de la amplificación/expresión génica

La amplificación y/o expresión génica puede medirse en una muestra directamente, por ejemplo mediante transferencia southern convencional, transferencia northern para cuantificar la transcripción del ARNm (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:5201-5205, 1980), transferencia en mancha (análisis de ADN), o hibridación in situ, utilizando una sonda apropiadamente marcada, basada en las secuencias proporcionadas en la presente invención. Alternativamente, pueden utilizarse anticuerpos que pueden reconocer dúplex específicos, incluyendo dúplex de ADN, dúplex de ARN, y dúplex híbridos ADN-ARN o dúplex ADN-proteína. Los anticuerpos, a su vez, pueden marcarse y el ensayo llevarse a cabo donde el dúplex se encuentra unido a una superficie, de manera que tras la formación de dúplex sobre la superficie, pueda detectarse la presencia de anticuerpo unido al dúplex.

La expresión génica, alternativamente, puede medirse mediante procedimientos inmunológicos, tal como la tinción inmunohistoquímica de células o de secciones de tejido y el ensayo del cultivo celular o de líquidos corporales, para cuantificar directamente la expresión del producto génico. Los anticuerpos que resultan útiles para la tinción inmunohistoquímica y/o el ensayo de líquidos de muestra puede ser monoclonal o policlonal, y puede prepararse en cualquier mamífero. Convenientemente, los anticuerpos pueden prepararse contra un polipéptido PRO211 de secuencia nativa o contra un péptido sintético basado en las secuencias de ADN proporcionadas en la presente invención o contra secuencias exógenas fusionadas al ADN de PRO211 y codificantes de un epítopo de anticuerpo específico.

5. Purificación de polipéptido

Pueden recuperarse formas de PRO211 del medio de cultivo o de lisados de las células huésped. Si se encuentra unido a membrana, puede liberarse de la membrana utilizando una solución detergente adecuada (por ejemplo Triton-X100) o mediante corte enzimático. Las células utilizadas en la expresión de PRO211 pueden romperse mediante diversos medios físicos o químicos, tales como el ciclado congelación-descongelación, la sonicación, la rotura mecánica o agentes de lisado celular.

Puede resultar deseable purificar PRO211 a partir de proteínas o polipéptidos celulares recombinantes. Los procedimientos siguientes son ejemplares de procedimientos de purificación adecuados: mediante fraccionamiento en una columna de intercambio iónico; precipitación con etanol; HPLC de fase inversa; cromatografía en sílice o en una resina de intercambio catiónico, tal como DEAE; cromatoenfoque; SDS-PAGE; precipitación con sulfato amónico; filtración en gel utilizando, por ejemplo columnas de Sephadex G-75; proteína A-sefarosa, para eliminar contaminantes, tales como IgG; y columnas quelantes de metales para unir formas etiquetadas con epítopos de PRO211. Pueden utilizarse diversos procedimientos de purificación de proteínas y estos procedimientos son conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en Deutscher, Methods in Enzymology 182, 1990; Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York, 1982. La etapa o etapas de purificación seleccionadas dependerán, por ejemplo, de la naturaleza del procedimiento de producción utilizado y del PRO211 particular producido.

E. Anticuerpos

Algunos fármacos candidatos para la utilización en las composiciones y en los procedimientos de la presente invención son anticuerpos y fragmentos de anticuerpo que imitan la actividad biológica de un polipéptido PRO211.

1. Anticuerpos policlonales

Los procedimientos de preparación de anticuerpos policlonales son conocidos para el experto en la materia. Los anticuerpos policlonales pueden cultivarse en un mamífero, por ejemplo, mediante una o más inyecciones de un agente inmunizante y, si se desea, un adyuvante. Habitualmente, el agente inmunizante y/o adyuvante se inyecta en el mamífero mediante múltiples inyecciones subcutáneas o intraperitoneales. El agente inmunizante puede incluir el polipéptido PRO211 o una proteína de fusión del mismo. Puede resultar útil conjugar el agente inmunizante a una proteína conocida para que resulte inmunogénica en el mamífero que se inmuniza. Entre los ejemplos de estas proteínas inmunogénicas se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, la hemocianina de lapa, la albúmina sérica, tiroglobulina bovina e inhibidor de la tripsina de soja. Entre los ejemplos de adyuvantes que pueden utilizarse se incluyen el adyuvante completo de Freund y el adyuvante MPL-TDM (monofosforil lípido A, dicorinomicolato de trehalosa sintético). El protocolo de inmunización puede ser seleccionado por un experto en la materia sin experimentación excesiva.

2. Anticuerpos monoclonales

Los anticuerpos pueden ser, alternativamente, anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse utilizando procedimientos de hibridoma, tales como aquellos descritos por Kohler y Milstein, Nature 256:495, 1971. En un procedimiento de hibridoma, un ratón, un hámster, u otro animal huésped apropiado, típicamente se inmuniza con un agente inmunizante para inducir linfocitos que producen, o que son capaces de producir, anticuerpos que se unirán específicamente al agente inmunizante. Alternativamente, los linfocitos pueden inmunizarse in vitro.

El agente inmunizante típicamente incluye el polipéptido PRO211 o una proteína de fusión del mismo. Generalmente, se utilizan linfocitos sanguíneos periféricos ("PBLs") si se desean células de origen humano, o células de bazo o de nódulo linfático si se desean fuentes de mamífero no humano. A continuación, los linfocitos se fusionan con una línea celular inmortalizada utilizando un agente de fusión adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, 1986, páginas 59-103). Las líneas celulares inmortalizadas habitualmente son células de mamífero transformadas, particularmente células de mieloma de origen roedor, bovino y humano. Habitualmente, se utilizan líneas celulares de mieloma de rata o de ratón. Las células de hibridoma pueden cultivarse en un medio de cultivo adecuado que preferentemente contiene una o más sustancias que inhiben el crecimiento o la supervivencia de las células inmortalizadas no fusionadas. Por ejemplo, si las células parentales carecen del enzima hipoxantina guanina fosforibosiltransferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas típicamente incluirá hipoxantina, aminopterina y timidina ("medio HAT"), sustancias que previenen el crecimiento de las células deficientes en HGPRT.

Las líneas celulares inmortalizadas preferentes son aquéllas que se fusionan eficazmente, que dan soporte a una expresión de nivel elevado estable de anticuerpos mediante las células productoras de anticuerpo seleccionadas, y que son sensibles a un medio, tal como el medio HAT. Unas líneas celulares inmortalizadas más preferentes son las líneas de mieloma murino, que pueden obtenerse, por ejemplo, del Salk Institute Cell Distributin Center, San Diego, California, y de la American Type Culture Collection, Manassas, Virginia. El mieloma humano y las líneas celulares de heteromieloma de ratón-humano han sido descritas para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor, J. Immunol. 133:3011, 1984; Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, 1987, páginas 51-63).

El medio de cultivo en el que se cultivan las células de hibridoma después puede someterse a ensayo para la presencia de anticuerpos monoclonales dirigidos contra PRO211. Preferentemente, la especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos por las células de hibridoma se determina mediante inmunoprecipitación o mediante un ensayo de unión in vitro, tal como un radioinmunoensayo (RIA) o ensayo de inmunosorción ligada a enzima (ELISA). Estas técnicas y ensayos son conocidos de la técnica. La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal puede determinarse, por ejemplo, mediante el análisis de Scatchard de Munson y Pollar, Anal. Biochem. 107:220, 1980.

Tras identificar las células de hibridoma deseadas, los clones pueden subclonarse mediante procedimientos de dilución limitante y cultivarse mediante procedimientos estándar (Goding, supra). Entre los medios de cultivo adecuados para este fin se incluyen, por ejemplo, el medio de Eagle modificado por Dulbecco y el medio RPMI-1640. Alternativamente, pueden cultivarse células de hibridoma in vivo en forma de ascites en un mamífero.

Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones pueden aislarse o purificarse a partir del medio de cultivo o líquido ascites mediante procedimientos convencionales de purificación de inmunoglobulinas, tales como, por ejemplo, proteína A-sefarosa, cromatografía en hidroxiapatito, electroforesis en gel, diálisis o cromatografía de afinidad.

Los anticuerpos monoclonales también pueden prepararse mediante procedimientos de ADN recombinante, tales como aquellos descritos en la patente US nº 4.816.567. El ADN codificante de los anticuerpos monoclonales de la invención puede aislarse y secuenciarse con facilidad utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo utilizando sondas de oligonucleótidos que son capaces de unirse específicamente a genes codificantes de las cadenas pesadas y ligeras de los anticuerpos murinos). Las células de hibridoma de la invención sirven como fuente preferente de este ADN. Tras su aislamiento, el ADN puede introducirse en vectores de expresión, que después se transfectan en células huésped, tales como células COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO) o células de mieloma que de otra manera no producirían proteína inmunoglobulina, con el fin de obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células huésped recombinantes. El ADN también puede modificarse, por ejemplo, sustituyendo la secuencia codificante por un polipéptido no inmunoglobulina. Este polipéptido no inmunoglobulina puede sustituirse por los dominios constantes de un anticuerpo de la invención, o puede sustituirse por los dominios variables de un sitio de unión a antígeno de un anticuerpo de la invención para crear un anticuerpo bivalente quimérico.

Los anticuerpos pueden ser anticuerpos monovalentes. Los procedimientos para preparar anticuerpos monovalentes son bien conocidos de la técnica. Por ejemplo, un procedimiento implica la expresión recombinante de una cadena ligera y una cadena pesada modificada de inmunoglobulina. La cadena pesada se trunca generalmente en cualquier punto en la región Fc de manera que se evite el entrecruzamiento de la cadena pesada. Alternativamente, los residuos cisteína relevantes se sustituyen con otro residuo aminoácido o se delecionan de manera que se evite el entrecruzamiento.

Los procedimientos in vitro también resultan adecuados para preparar anticuerpos monovalentes. La digestión de anticuerpos para producir fragmentos de los mismos, particularmente fragmentos Fab, puede conseguirse utilizando técnicas rutinarias conocidas de la técnica.

3. Anticuerpos humanos y humanizados

Los anticuerpos de la invención pueden comprender además anticuerpos humanizados o anticuerpos humanos. Las formas humanizadas de anticuerpos no humanos (por ejemplo murinos) son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulina o fragmentos de los mismos (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab')_{2} u otras subsecuencias de unión a antígeno de los anticuerpos) que contienen secuencias mínimas derivadas de inmunoglobulina no humana. Entre los anticuerpos humanizados se incluyen inmunoglobulinas humanas (anticuerpos receptores) en las que los residuos de una región determinante de complementariedad (CDR) del receptor se sustituyen por residuos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo donante), tal como ratón, rata o conejo, que presente la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de marco de Fv de la inmunoglobulina humana se sustituyen con los residuos no humanos correspondientes. Los anticuerpos humanizados también pueden comprender residuos que no se encuentran ni en el anticuerpo receptor ni en la secuencias de CDR o secuencias marco importadas. En general, el anticuerpo humanizado comprende sustancialmente la totalidad o por lo menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los que la totalidad o sustancialmente la totalidad de las regiones CDR correspondientes a aquellos de una inmunoglobulina no humana y la totalidad o sustancialmente la totalidad de las regiones FR son aquéllas de una secuencia de consenso de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado típicamente también comprende por lo menos una parte de una región constante de inmunoglobulina (Fc), habitualmente la de una inmunoglobulina humana (Jones et al., Nature 321:522-525, 1986; Riechmann et al., Nature 332:323-329, 1988, y Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596, 1992).

Los procedimientos para humanizar anticuerpos no humanos son bien conocidos de la técnica. Generalmente, en un anticuerpo humanizado se han introducido o más residuos aminoácidos procedentes de una fuente no humana. Estos residuos aminoácidos no humanos con frecuencia se denominan residuos "importados", que típicamente proceden de un dominio variable "importado". La humanización esencialmente puede llevarse a cabo siguiendo el procedimiento de Winter y colaboradores (Jones et al., Nature 321:522-525, 1986; Riechmann et al., Nature 332:323-327, 1988; Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536, 1988) mediante la sustitución de una o más secuencias de CDR de roedor por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. Por consiguiente, estos anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (patente US nº 4.816.567), en los que se ha sustituido una parte sustancialmente inferior a un dominio variable humano intacto por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados típicamente son anticuerpos humanos en los que se sustituyen algunos residuos CDR y posiblemente algunos residuos de FR por residuos de sitios análogos en los anticuerpos de roedor.

También pueden producirse anticuerpos humanos utilizando diversas técnicas conocidas de la técnica, incluyendo las bibliotecas de expresión fágica (Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol. 227:381, 1991; Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581, 1991). Las técnicas de Cole et al. y de Boerner et al., también se encuentran disponibles para la preparación de anticuerpos monoclonales humanos (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, página 77, 1985, Boerner et al., J. Immunol. 147(1):86-95, 1991). De manera similar, pueden prepararse anticuerpos humanos mediante la introducción de loci de inmunoglobulina humana en animales transgénicos, por ejemplo ratones en los que se han inactivado parcial o completamente los genes de la inmunoglobulina endógena. Tras el reto, se observa la producción de anticuerpo humano, que se asemeja estrechamente a lo observado en seres humanos en todos los aspectos, incluyendo la reorganización, ensamblaje y repertorio de anticuerpos. Este enfoque se describe, por ejemplo, en las patentes US nº 5.545.807, nº 5.545.806, nº 5.569.825, nº 5.625.126, nº 5.633.425, nº 5.661.016 y en las publicaciones científicas siguientes: Marks et al., Bio/Technology 10:779-783, 1992; Lonberg et al., Nature 368:856-859, 1994; Morrison, Nature 368:812-13, 1994; Fishwild et al., Nature Biotechnology 14:845-51, 1996; Neuberger, Nature Biotechnology 14:826, 1996; Lonberg y Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93, 1995.

4. Anticuerpos biespecíficos

Los anticuerpos biespecíficos son monoclonales, preferentemente anticuerpos humanos o humanizados, que presentan especificidades de unión para por lo menos dos antígenos diferentes. En el presente caso, una de las especificidades de unión es para PRO211 y la otra es para cualquier otro antígeno, y preferentemente para una proteína o receptor o subunidad de receptor de superficie celular.

Son conocidos de la técnica procedimientos para preparar anticuerpos biespecíficos. Tradicionalmente, la producción recombinante de anticuerpos biespecíficos se ha basado en la coexpresión de dos pares de cadena pesada/cadena ligera de inmunoglobulina, en los que las dos cadenas pesadas presentaban diferentes especificidades (Milstein y Cuello, Nature 305:537-539, 1983). Debido a la selección aleatoria de cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de diez diferentes moléculas de anticuerpo, de las que sólo una presenta la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta habitualmente se consigue mediante etapas de cromatografía de afinidad. Se dan a conocer procedimientos similares en la patente WO nº 93/08829, publicada el 13 de mayo de 1993, y en Traunecker et al., EMBO J. 10:3655-3659, 1991.

Los dominios variables de anticuerpos con las especificidades de unión deseadas (sitios de combinación anticuerpo-antígeno) pueden fusionarse a secuencias d dominio constante de inmunoglobulina. La fusión preferentemente es con un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina, que comprende por lo menos parte de las regiones CH2 y CH3 de bisagra. Resulta preferente que la región constante de la primera cadena pesada (CH1) que contiene el sitio necesario para la unión de la cadena ligera se encuentra presente en por lo menos una de las fusiones. Los ADNs codificantes de las fusiones de cadena pesada de inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados, y se cotransfectan en un organismo huésped adecuado. Para más detalles sobre la generación de anticuerpos biespecíficos ver, por ejemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology 12:210, 1986.

De acuerdo con otro enfoque, descrito en la patente WO nº 96/27011, la interfaz entre un par de moléculas de anticuerpos puede manipularse para que maximice el porcentaje de heterodímeros que se recuperan del cultivo celular recombinante. La interfaz preferente comprende por lo menos una parte de la región CH3 de un dominio constante de anticuerpo. En este procedimiento, una o más cadenas laterales de aminoácidos pequeños de la interfaz de la primera molécula de anticuerpo se sustituye por cadenas laterales mayores (por ejemplo de tirosina o de triptófano). Se crean "cavidades" compensatorias de tamaño idéntico o similar al de la cadena o cadenas laterales grandes en la interfaz de la segunda molécula de anticuerpo mediante la sustitución de las cadenas laterales de aminoácidos grandes por cadenas de aminoácidos más pequeños (por ejemplo de alanina o de treonina). Esto proporciona un mecanismo para incrementar el rendimiento del heterodímero respecto a otros productos finales no deseados, tales como homodí-
meros.

Pueden prepararse anticuerpos biespecíficos en forma de anticuerpos de longitud completa o de fragmentos de anticuerpos (por ejemplo anticuerpos biespecíficos F(ab')_{2}). Se han descrito en la literatura técnicas para generar anticuerpos biespecíficos a partir de fragmentos de anticuerpos. Por ejemplo, pueden prepararse anticuerpos biespecíficos utilizando ligamiento químico. Brennan et al., Science 229:81, 1985, describen un procedimiento en el que se corta proteolíticamente anticuerpos intactos para generar fragmentos F(ab')_{2}. Estos fragmentos se reducen en presencia del agente acomplejante ditiol arsenito sódico para estabilizar los ditioles vecinos y para prevenir la formación de disulfuros intermoleculares. Los fragmentos Fab' generados seguidamente se convierten en derivados tionitrobenzoato (TNB). Seguidamente, se reconvierte uno de los derivados Fab'-TNB al Fab'-tiol mediante reducción con mercaptoetilamina y se mezcla con una cantidad equimolar del otro derivado Fab'-TNB para formar el anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos biespecíficos producidos pueden utilizarse como agentes para la inmovilización selectiva de
enzimas.

Los fragmentos Fab' pueden recuperarse directamente de E. coli y acoplarse químicamente para formar anticuerpos biespecíficos. Shalaby et al., J. Exp. Med. 175:217-225, 1992, describen la producción de una molécula F(ab')_{2} de anticuerpo biespecífico completamente humanizada. Cada fragmento Fab' se segregó separadamente de E. coli y se sometió a acoplamiento químico dirigido in vitro para formar el anticuerpo biespecífico. El anticuerpo biespecífico formado de esta manera fue capaz de unirse a células que sobreexpresaban el receptor ErbB2 y a células T humanas normales, así como de desencadenar la actividad lítica de los linfocitos citotóxicos humanos contra las dianas de tumor mamario humano.

También se han descrito diversas técnicas para preparar y aislar fragmentos de anticuerpo biespecífico directamente a partir de cultivo celular recombinante. Por ejemplo, se han producido anticuerpos biespecíficos utilizando cremalleras de leucina (Kostelny et al., J. Immunol. 148(5):1547-1553, 1992). Los péptidos de cremallera de leucina de las proteínas Fos y Jun se ligaron a partes Fab' de los dos diferentes anticuerpos mediante fusión génica. Los homodímeros de anticuerpo se redujeron en la región bisagra para formar monómeros y después se reoxidaron para formar los heterodímeros de anticuerpo. Este procedimiento también puede utilizarse para la producción de homodímeros de anticuerpo. La tecnología de "diacuerpos" descrita por Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448, 1993, ha proporcionado un mecanismo alternativo para preparar fragmentos de anticuerpo biespecífico. Los fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) por un línker que es excesivamente corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena. Por consiguiente, los dominios VH y VL de un fragmento se fuerza que se apareen con los dominios VL y VH complementarios de otro fragmento, formando de esta manera dos sitios de unión a antígeno. También se ha descrito otra estrategia para preparar fragmentos de anticuerpo biespecífico mediante la utilización de dímeros de Fv de cadena única (sFv) (ver Gruber et al., J. Immunol. 152:5368, 1994).

Se encuentran contemplados los anticuerpos con más de dos valencias. Por ejemplo, pueden prepararse anticuerpos triespecíficos (Tutt et al., J. Immunol. 147:60, 1991).

Los anticuerpos biespecíficos ejemplares pueden unirse a dos epítopos diferentes en un polipéptido PRO211 dado en la presente invención. Alternativamente, puede combinarse un polipéptido anti-PRO211 con un brazo se una a una molécula inductora de activación en un leucocito, tal como una molécula de receptor de célula T (por ejemplo CD2, CD3, CD28 o B7) o receptores Fc para IgG (Fc\gammaR), tal como Fc\gammaR1 (CD64), Fc\gammaRII (CD32) y Fc\gammaRIII (CD16) de manera que se centran los mecanismos de defensa celular en la célula que expresa el polipéptido PRO211 particular. También pueden utilizarse anticuerpos biespecíficos para localizar agentes citotóxicos para células que expresan un polipéptido PRO211 particular. Estos anticuerpos poseen un brazo de unión a PRO211 y un brazo que se une a un agente citotóxico o a un radionucleido quelante, tal como EOTUBE, DPTA, DSTA o TETA. Otro anticuerpo biespecífico de interés se une al polipéptido PRO211 y se une además a factor tisular (TF).

5. Anticuerpos heteroconjugados

Los anticuerpos heteroconjugados también se encuentran comprendidos dentro del alcance de la presente invención. Los anticuerpos heteroconjugados están compuestos de dos anticuerpos unidos covalentemente. Estos anticuerpos se han propuesto, por ejemplo, para dirigir células del sistema inmunológico a células no deseadas (patente US nº 4.676.980) y para el tratamiento de la infección por VIH (patente WO nº 91/00360, patente WO nº 92/200373, patente EP nº 03089). Se contempla que los anticuerpos pueden prepararse in vitro utilizando procedimientos conocidos en química sintética de proteínas, incluyendo aquellos que implican agentes reticulantes. Por ejemplo, pueden construirse inmunotoxinas utilizando una reacción de intercambio de disulfuros o mediante la formación de un enlace 3-tioéter. Entre los ejemplos de agentes adecuados para este propósito se incluyen el iminotiolato y el metil-4-mercaptobutirimidato y aquellos dados a conocer, por ejemplo, en la patente US nº 4.676.980.

6. Manipulación de la función efectora

Puede resultar deseable modificar el anticuerpo de la invención con respecto a la función efectora, de manera que se intensifique, por ejemplo, la eficacia del anticuerpo en el tratamiento del cáncer. Por ejemplo, puede introducirse uno o más residuos de cisteína en la región Fc, permitiendo de esta manera la formación de enlaces disulfuro entre cadenas en esta región. El anticuerpo homodimérico generado de esta manera puede presentar una capacidad de internalización mejorada y/o eliminación celular mediada por el complemento incrementada y citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) (ver Caron et al., J. Exp. Med. 176:1191-1195, 1992, y Shopes, J. Immunol. 148:2918-2922, 1992). Los anticuerpos homodiméricos con actividad antitumoral intensificada también pueden prepararse utilizando reticulantes heterobifuncionales, tal como se describe en Wolff et al., Cancer Research 53:2560-2565, 1993. Alternativamente, puede manipularse un anticuerpo que presenta regiones Fc dobles, que de esta manera puede presentar capacidades de lisis del complemento y ADCC intensificadas (ver Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3:219-230, 1989).

7. Inmunoconjugados

La invención también se refiere a inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo conjugado a un agente citotóxico, tal como un agente quimioterapéutico, toxina (por ejemplo una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o fragmentos de la misma) o un isótopo radioactivo (por ejemplo un radioconjugado).

Los agentes quimioterapéuticos que resultan útiles en la generación de dichos inmunoconjugados han sido descritos anteriormente. Entre las toxinas enzimáticamente activas y fragmentos de las mismas que pueden utilizarse se incluyen la cadena A de la difteria, fragmentos activos no ligantes de la toxina diftérica, la cadena A de la exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), la cadena A de la ricina, la cadena A de la abrina, la cadena A de la modeccina, la alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII, y PAPS), inhibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de Saponaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina, y los tricocenos. Se encuentran disponibles una diversidad de radionucleidos para la producción de anticuerpos radioconjugados. Entre los ejemplos se incluyen ^{212}Bi, ^{131}I, ^{131}In, ^{90}Y y ^{186}Re.

Los conjugados de anticuerpo y agente citotóxico se preparan utilizando una diversidad de agentes acoplantes de proteína bifuncional, tales como N-succinimidil-3-(2-piridilditiol)propionato (SPDP), iminotiolano (11), derivados bifuncionales ofimidoésteres (tales como HCl de dimetiladipimidato); ésteres activos (tales como suberato de disuccinimidilo), aldehídos (tales como glutaraldehído), compuestos bis-azido (tales como bis(p-azidobenzoil)hexanodiamina), derivados bis-diazonio (tales como bis-(p-diazoniumbenzoil)etilenodiamina), diisocianatos (tales como tolilén-2,6-diisocianato) y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1,5-difluoro-2,4-nitrobenceno). Por ejemplo, puede prepararse una inmunotoxina ricina tal como se describe en Vitetta et al., Science 238:1098, 1987. el ácido 1-isotiocianatobenzil-3-metildietilén triaminapentaacético (MX-DTPA) marcado con carbono 14 es un agente quelante ejemplar para la conjugación de radionucleótido y anticuerpo (ver la patente WO nº 94/11026).

En otra realización, el anticuerpo puede conjugarse con un "receptor" (tal como estreptavidina) para la utilización en el pre-reconocimiento tumoral, en el que el conjugado de anticuerpo-receptor se administra al paciente, seguido de la eliminación de la circulación de conjugado no unido utilizando un agente de eliminación y después la administración de un "ligando" (por ejemplo avidina) que se conjuga con un agente citotóxico (por ejemplo un radionucleótido).

8. Immunoliposomas

Los anticuerpos dados a conocer en la presente invención también pueden formularse como inmunoliposomas. Los liposomas que contienen el anticuerpo se preparan mediante procedimientos conocidos en la materia, tales como los descritos en Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688, 1985; Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030, 1980, y en las patentes US nº 4.485.045 y nº 4.544.545. Se dan a conocer liposomas con un tiempo de circulación mejorado en la patente US nº 5.013.556.

Pueden generarse liposomas particularmente útiles mediante el procedimiento de evaporación en fase reversa con una composición de lípidos que comprende fosfatidilcolina, colesterol y fosfatidiletanolamina derivatizada con PEG (PEG-PE). Los liposomas se extrusionan a través de filtros de tamaño de poro definido, rindiendo liposomas con el diámetro deseado. Los fragmentos Fab' del anticuerpo de la presente invención pueden conjugarse con los liposomas descritos en Martin et al., J. Biol. Chem. 257:286-288, 1982, a través de una reacción de intercambio de disulfuros. Un agente quimioterapéutico (tal como la doxorubicina) se encuentra contenido opcionalmente dentro del liposoma (ver Gabizon et al., J. National Cancer Inst. 81(19):1484, 1989).

F. Identificación de proteínas capaces de inhibir el crecimiento o proliferación de células neoplásicas

Las proteínas dadas a conocer en la presente solicitud han sido sometidas a ensayo en un panel de 60 líneas de células tumorales utilizadas en la actualidad en el cribado in vitro experimental para el descubrimiento de fármacos del National Cancer Institute (NCI). El propósito de este cribado es identificar moléculas que presentan actividad citotóxica y/o citostática contra diferentes tipos de tumores. El NCI criba más de 10.000 nuevas moléculas al año (Monks et al., J. Natl. Cancer Inst. 83:757-766, 1991; Boyd, Cancer: Princ. Pract. Oncol. Update 3(10):1-12, 1989). Las líneas de células tumorales utilizadas en el presente estudio han sido descritas en Monks et al., supra. Las líneas celulares cuyo crecimiento ha resultado significativamente inhibido por las proteínas de la presente solicitud se especifican en los Ejemplos.

Los resultados demuestran que las proteínas sometidas a ensayo muestran actividades citostáticas y, en algunas casos y concentraciones, actividades citotóxicas en una diversidad de líneas de células cancerosas y por lo tanto resultan candidatos útiles para la terapia tumoral.

También pueden utilizarse otros ensayos basados en células y modelos animales para los tumores (por ejemplo para cánceres) con el fin de verificar los resultados del cribado de cáncer del NCI, y para entender adicionalmente la relación entre la proteína identificada en la presente invención y el desarrollo y la patogénesis del crecimiento celular neoplásico. Por ejemplo, los cultivos primarios derivados de tumores en animales transgénicos (tal como se describe posteriormente) pueden utilizarse en los ensayos basados en células de la presente invención, aunque resultan preferente las líneas celulares estables. Las técnicas para derivar líneas celulares continuas a partir de animales transgénicos son bien conocidas de la técnica (ver, por ejemplo, Small et al., Mol. Cell Biol. 5:642-648, 1985).

G. Modelos animales

Puede utilizarse una diversidad de modelos animales bien conocidos para entender adicionalmente el papel de las moléculas identificadas en la presente invención en el desarrollo y en la patogénesis de los tumores, y para someter a ensayo la eficacia de los agentes terapéuticos candidatos, incluyendo los anticuerpos, y otros agonistas de los polipéptidos nativos, incluyendo los agonistas de molécula pequeña. La naturaleza in vivo de estos modelos los convierte en particularmente predictivos de las respuestas producidas en pacientes humanos. Entre los modelos animales de tumores y cánceres (por ejemplo cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de próstata, cáncer de pulmón, etc.) se incluyen los animales tanto no recombinantes como recombinantes (transgénicos). Entre los modelos animales no recombinantes se incluyen, por ejemplo, los modelos de roedor o murinos. Estos modelos pueden generarse mediante la introducción de células tumorales en ratones singénicos utilizando técnicas estándar, por ejemplo la inyección subcutánea, la inyección en la vena de la cola, la implantación en el bazo, la implantación intraperitoneal, la implantación bajo la cápsula renal, o la implantación de ortopina, por ejemplo células de cáncer de colon implantadas en tejido colónico (ver, por ejemplo, la publicación PCT nº WO 97/33551, publicada el 18 de septiembre
de 1997).

Probablemente las especies animales utilizadas más frecuentemente en los estudios oncológicos son los ratones inmunodeficientes y, en particular, los ratones desnudos. La observación de que el ratón desnudo con hipo/aplasia puede actuar con éxito como huésped para los xenoinjertos de tumor humano ha conducido a su utilización generalizada con este propósito. El gen recesivo autosómico nu ha sido introducido en un número muy grande de cepas congénicas diferentes de ratón desnudo, incluyendo, por ejemplo, ASW, A/He, AKR, BALB/c, B10.LP, C17, C3H, C57BL, C57, CBA, DBA, DDD, l/st, NC, NFR, NFS, NFS/N, NZB, NZC, NZW, P, RIII y SJL. Además, se han criado y utilizado como receptores de xenoinjertos tumorales una amplia diversidad de otros animales con defectos inmunológicos heredados diferentes del ratón desnudo. Para más detalles ver, por ejemplo, The Nude Mouse in Oncology Research, E. Boven y B. Winograd, editores, CRC Press, Inc., 1991.

Las células introducidas en estos animales pueden derivarse de líneas celulares tumorales/cancerosas conocidas, tales como cualquiera de las líneas celulares tumorales indicadas anteriormente, y, por ejemplo, la línea celular B104-1-1 (línea celular NIH-3T3 estable transfectada con el protooncogén neu); células NIH-3T3 transfectadas con ras; Caco-2 (ATCC nº HTB-37); una línea celular de adenocarcinoma de colon humano de grado II moderadamente bien diferenciado, HT-29 (ATCC nº HTB-38) o de tumores y cánceres. Las muestras de células tumorales o cancerosas pueden obtenerse de pacientes sometidos a cirugía utilizando condiciones estándar que implican la congelación y el almacenamiento en nitrógeno líquido (Karmali et al., Br. J. Cancer 48:689-696, 1983).

Las células tumorales pueden introducirse en animales, tales como los ratones desnudos, mediante una diversidad de procedimientos. El espacio subcutáneo (s.c.) en ratones resulta muy adecuado para la implantación de tumores. Los tumores pueden trasplantarse s.c. en forma de bloques sólidos, como biopsias con aguja mediante la utilización de una aguja de punción, o en forma de suspensiones celulares. Para la implantación de un bloque sólido o una aguja de punción, se introducen fragmentos de tejido tumoral de tamaño adecuado en el espacio s.c. Las suspensiones celulares se preparan frescas a partir de tumores primarios o de líneas celulares tumorales estables, y se inyectan subcutáneamente. Las células tumorales también pueden inyectarse como implantes subdérmicos. En esta localización, el inóculo se deposita entre la parte inferior del tejido conectivo dérmico y el tejido s.c. (Boven y Winograd, 1991, supra). Pueden generarse modelos animales de cáncer de mama, por ejemplo, mediante la implantación de células de neuroblastoma de rata (a partir de los que se aisló inicialmente el oncogén neu) o células NIH-3T3 transformadas con neu en ratones desnudos, esencialmente tal como describen Drebin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:9129-9133, 1986.

De manera similar, pueden generarse modelos animales de cáncer de colon subcultivando células de cáncer de colon en animales, por ejemplo ratones desnudos, conduciendo a la aparición de tumores en estos animales. Se ha descrito un modelo de trasplante ortotópico de cáncer de colon humano en ratones desnudos, por ejemplo en Wang et al., Cancer Research 54:4726-4728, 1994, y en Too et al., Cancer Research 55:681-684, 1995. Este modelo se basa en el denominado "METAMOUSE" comercializado por AntiCancer, Inc. (San Diego, California).

Los tumores que surgen en los animales pueden extirparse y cultivarse in vitro. Las células procedentes de cultivos in vitro seguidamente pueden subcultivarse en animales. Estos tumores pueden servir como dianas para el ensayo adicional o para el cribado de fármacos. Alternativamente, los tumores resultantes del subcultivo pueden aislarse y el ARN de las células pre-subcultivo y las células aisladas tras una o más rondas o subcultivos, pueden analizarse para la expresión diferencial de genes de interés. Estas técnicas de subcultivo pueden llevarse a cabo con cualquier línea celulares tumoral o cancerosa conocida.

Por ejemplo, Meth A, CMS4, CMS5, CMS21 y WEHI-164 son fibrosarcomas inducidos químicamente de ratones BALB/c hembra (DeLeo et al., J. Exp. Med. 146:720, 1977) que proporcionan un sistema modelo altamente controlable para estudiar las actividades antitumorales de diversos agentes (Palladino et al., J. Immunol. 138:4023-4032, 1987). En resumen, las células tumorales se propagan in vitro en cultivo celular. Previamente a la inyección en los animales, las líneas celulares se lavan y se suspenden en tampón, a una densidad celular de aproximadamente 10 x 10^{6} a 10 x 10^{7} células/ml. Los animales seguidamente se infectan subcutáneamente con 10 a 100 \mul de la suspensión celular, dejando una a tres semanas para que aparezca un tumor.

Además, el carcinoma pulmonar (3LL) de Lewis de ratón, que es uno de los tumores experimentales estudiado más a fondo, puede utilizarse como un modelo experimental de tumor. La eficacia en este modelo tumoral se ha correlacionado con efectos beneficiosos en el tratamiento de los pacientes humanos diagnosticados con carcinoma de células pequeñas del pulmón (SCCL). Este tumor puede introducirse en ratones normales tras la inyección de fragmentos de tumor de un ratón afectado o de células mantenidas en cultivo (Zupi et al., Br. J. Cancer 41, suppl. 4:309, 1980) y la evidencia indica que los tumores pueden iniciarse a partir de la inyección de incluso una sola célula y que sobrevive una proporción muy elevada de células tumorales infectadas. Para más información sobre este modelo tumoral ver Zacharski, Haemostasis 16:300-320, 1986.

Una manera de evaluar la eficacia de un compuesto de ensayo en un modelo animal en un tumor implantado es medir el tamaño del tumor antes y después del tratamiento. Tradicionalmente, el tamaño de los tumores implantados se ha medido con un calibrador pie de rey en dos o en tres dimensiones. La medida limitada a las dos dimensiones no refleja con exactitud el tamaño del tumor, por lo tanto habitualmente se convierte al volumen correspondiente utilizando una fórmula matemática. Sin embargo, la medición del tamaño del tumor resulta muy inexacta. Los efectos terapéuticos de un fármaco candidato pueden describirse mejor como el retraso del crecimiento y el retraso específico del crecimiento inducidos por el tratamiento. Otra variable importante en la descripción del crecimiento tumoral es el tiempo de doblado del volumen tumoral. También se encuentran disponibles programas de ordenador para el cálculo y la descripción del crecimiento tumoral, tales como el programa indicado por Rygaard y Spang-Thomsen, Proc. 6th Int. Workshop on Immune-Deficient Animals, Wu y Sheng, editores, Basel, 1989, 301. Se indica, sin embargo, que la necrosis y las respuestas inflamatorias tras el tratamiento de hecho pueden resultar en un incremento del tamaño tumoral, por lo menos inicialmente. Por lo tanto, estos cambios deben seguirse cuidadosamente, mediante una combinación de un procedimiento morfomético y análisis de citometría de flujo.

Los modelos animales recombinantes (transgénicos) pueden manipularse introduciendo la parte codificante de los genes identificados en la presente invención en el genoma de los animales de interés utilizando técnicas estándar para producir animales transgénicos. Entre los animales que pueden servir como diana para la manipulación transgénica se incluyen, sin limitarse a ellos, ratones, ratas, conejos, cobayas, ovejas, cabras, cerdos y primates no humanos, por ejemplo babuinos, chimpancés y monos. Entre las técnicas conocidas en la técnica para introducir un transgén en estos animales se incluyen la microinyección pronucleica (Hoppe y Wagner, patente US nº 4.873.191), la transferencia génica a líneas germinales medida por retrovirus (por ejemplo Van der Putten et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:6148-615, 1985), el direccionamiento génico en células madre embrionarias (Thompson et al., Cell 56:313-321, 1989); la electroporación de embriones (Lo, Mol. Cell Biol. 3:1803-1814, 1983); la transferencia génica mediada por esperma (Lavitrano et al., Cell 57:717-73, 1989). Para una revisión ver, por ejemplo, la patente US nº 4.736.866.

Para el propósito de la presente invención, entre los animales transgénicos se incluyen aquellos que portan el transgén únicamente en parte de sus células ("animales mosaico"). El transgén puede integrarse o en forma de transgén único, o en concatámeros, por ejemplo en tándems cabeza-a-cabeza o cabeza-a-cola. La introducción selectiva de un transgén en un tipo celular particular también resulta posible siguiendo, por ejemplo, la técnica de Lasko et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6232-636, 1992.

La expresión del transgén en animales transgénicos puede seguirse mediante técnicas estándar. Por ejemplo, puede utilizarse análisis de transferencia southern o amplificación por PCR para verificar que se ha producido la integración del transgén. A continuación, puede analizarse el nivel de expresión en ARNm utilizando técnicas tales como la hibridación in situ, el análisis de transferencia northern, PCR, o inmunocitoquímica. Los animales se examina adicionalmente para indicios de desarrollo de tumor o de cáncer.

La eficacia de los anticuerpos que se unen específicamente a los polipéptidos identificados en la presente invención y otros fármacos candidatos, también puede someterse a ensayo en el tratamiento de tumores animales espontáneos. Una diana adecuada para estos estudios es el carcinoma oral felino de células escamosas (SCC). El SCC oral felino es un tumor maligno altamente invasivo que es el cáncer oral más frecuente de los gatos, explicando más del 60% de los tumores orales descritos para esta especie. En raras ocasiones se produce la metástasis a sitios distantes, aunque esta baja incidencia de la metástasis meramente podría ser un reflejo de los reducidos tiempos de supervivencia de los gatos que presentan este tumor. Estos tumores habitualmente no son accesibles a la cirugía, principalmente debido a la anatomía de la cavidad oral felina. En la actualidad no existe ningún tratamiento eficaz para este tumor. Previamente a la entrada en el estudio, cada gato se sometió a un examen clínico completo, a biopsia y recibe un escáner mediante tomografía computerizada (CT). Los gatos diagnosticados con tumores orales sublinguales de células escamosas se excluyeron del estudio. La lengua puede resultar paralizada como resultado de este tumor, e incluso si el tratamiento elimina el tumor, los animales pueden no ser capaces de alimentarse por sí mismos. Cada gato se trató repetidamente, a lo largo de un periodo más largo de tiempo. Se tomaron fotografías de los tumores diariamente durante el periodo de tratamiento, y en cada nueva comprobación posterior. Tras el tratamiento, cada gato se sometió a otro escaneo de CT. Posteriormente, los escaneos de CT y los radiogramas torácicos se evaluaron cada 8 semanas. Los datos se evaluaron para diferencias de supervivencia, respuesta y toxicidad en comparación con los grupos de control. La respuesta positiva podría requerir evidencia de regresión tumoral, preferentemente con mejora de la calidad de vida y/o una esperanza de vida incrementada.

Además, también pueden someterse a ensayo otros tumores animales espontáneos, tales como fibrosarcoma, adenocarcinoma, linfoma, condroma, leiomiosarcoma de perros, gatos y babuinos. De estos, el adenocarcinoma mamario en perros y en gatos es un modelo preferente debido a que la apariencia y el comportamiento son muy similares a aquellos en el ser humano. Sin embargo, la utilización de este modelo se ve limitada porque este tipo de humor se da raramente en los animales.

H. Ensayos de cribado para fármacos candidatos

Los ensayos de cribado para fármacos candidatos se diseñan para identificar compuestos que se unen competitivamente o se acomplejan con el receptor o receptores de los polipéptidos identificados en la presente invención, o que de otra manera señalizan a través de este receptor o receptores. Entre estos ensayos de cribado se incluyen los ensayos que pueden someterse a cribado de alto rendimiento de bibliotecas químicas, haciendo que resulten particularmente adecuados para identificar fármacos candidatos de molécula pequeña. Entre las moléculas pequeñas contempladas se incluyen los compuestos orgánicos o inorgánicos sintéticos, incluyendo péptidos, preferentemente péptidos solubles, fusiones de (poli)péptido-inmunoglobulina y, en particular, anticuerpos, incluyen, aunque sin limitación, anticuerpos policlonales y monoclonales y fragmentos de anticuerpos, anticuerpos de cadena única, anticuerpos antiidiotípicos, y versiones quiméricas y humanizadas de estos anticuerpos o fragmentos, así como anticuerpos o fragmentos de anticuerpos humanos. Los ensayos pueden llevarse a cabo en una diversidad de formatos, incluyendo ensayo de unión proteína-proteína, ensayos de cribado bioquímico, inmunoensayos y ensayos basados en células, que se encuentran bien caracterizados en la técnica.

En los ensayos de unión, la interacción es la unión y el complejo formado puede aislarse o detectarse en la mezcla de reacción. En una realización particular, un receptor de un polipéptido codificada por el gen identificado en la presente invención o el fármaco candidato puede inmovilizarse en una fase sólida, por ejemplo en una placa de microtitulación, mediante enlaces covalentes o no covalentes. El enlace no covalente se consigue generalmente recubriendo la superficie sólida con una solución del polipéptido y el secado. Alternativamente, puede utilizarse un anticuerpo inmovilizado, por ejemplo un anticuerpo monoclonal específico para el polipéptido que debe inmovilizarse, para anclarlo a una superficie sólida. El ensayo se lleva a cabo mediante la adición del componente no inmovilizado, que puede marcarse con un marcaje detectable, al componente inmovilizado, por ejemplo la superficie recubierta que contiene el componente anclado. Cuando se ha completado la reacción, se extraen los componentes no reaccionados, por ejemplo mediante lavado, y los complejos anclados en la superficie sólida se detectan. Cuando el componente originalmente no inmovilizado porta un marcaje detectable, la detección de marcaje inmovilizado sobre la superficie indica que se ha producido un acomplejamiento. Cuando el componente originalmente no inmovilizado no porta un marcaje, puede detectarse el acomplejamiento, por ejemplo, utilizando un anticuerpo marcado que se une específicamente al complejo inmovilizado.

Si el compuesto candidato interacciona con un receptor particular aunque sin unirse a él, su interacción con este polipéptido puede someterse a ensayo mediante procedimientos bien conocidos para la detección de interacciones proteína-proteína. Entre estos ensayos se incluyen los enfoques tradicionales, tales como la reticulación, la coinmunoprecipitación y la copurificación a través de gradientes o columnas cromatográficas. Además, las interacciones proteína-proteína pueden seguirse utilizando el sistema genético basado en una levadura descrito por Fields y colaboradores (Fields y Song, Nature (London) 340:245-246, 1989); Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:9578-9582, 1991), tal como dan a conocer Chevray y Nathans (Proc. Natl. Acad. Sci. US 89:5789-5793, 1991). Muchos activadores transcripcionales tales como GAL4 de levadura, consisten de dos dominios modulares físicamente discretos, uno que actúa como dominio de unión a ADN, mientras que el otro funciona como el dominio de activación de la transcripción. El sistema de expresión de levadura descrito en las publicaciones anteriores (generalmente denominado "sistema de dos híbridos") aprovecha esta propiedad, y utiliza dos proteínas híbridas, una en la que la proteína diana se encuentra fusionada con el dominio de unión a ADN de GAL4, y otra en la que las proteínas activadoras candidatas se encuentran fusionadas con el dominio de activación. La expresión de un gen informador GAL1-lacZ bajo el control de un promotor activado por GAL4 depende de la reconstitución de la actividad de GAL4 mediante la interacción proteína-proteína. Las colonias que contienen polipéptidos interaccionantes se detectan con un sustrato cromogénico para la \beta-galactosidasa. Un kit completo (MATCHMAKER^{TM}) para identificar las interacciones proteína-proteína entre dos proteínas específicas utilizando la técnica de dos híbridos se encuentra disponible comercialmente de Clontech. Este sistema también puede extenderse al mapaje de dominios de proteína implicados en interacciones específicas de proteínas, así como para identificar residuos aminoácidos que resultan cruciales para estas interacciones.

I. Composiciones farmacéuticas

Los polipéptidos de la presente invención, los anticuerpos agonistas que se unen específicamente a las proteínas identificadas en la presente invención, así como otras moléculas identificadas mediante los ensayos de cribado dados a conocer en la presente invención, pueden administrarse para el tratamiento de tumores, incluyendo cánceres, en la forma de composiciones farmacéuticas.

En el caso de que se utilizan fragmentos de anticuerpo, el fragmento inhibidor mínimo que se une específicamente al dominio de unión de la proteína diana resulta preferente. Por ejemplo, basándose en las secuencias de región variable de un anticuerpo, pueden diseñarse moléculas péptido que conservan la capacidad de unirse a la secuencia proteica diana. Estos péptidos pueden sintetizarse químicamente y/o producirse mediante tecnología de ADN recombinante (ver, por ejemplo, Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7889-7893, 1993).

La formulación en la presente invención también puede contener más de un compuesto activo según resulte necesario para la indicación particular que se trata, preferentemente aquellos con actividades complementarias que no se afecten negativamente entre sí. Alternativamente, o adicionalmente, la composición puede comprender un agente que intensifique su función, tal como, por ejemplo, un agente citotóxico, una citoquina, un agente quimioterapéutico, o un agente inhibidor del crecimiento. Estas moléculas se encuentran convenientemente presentes en combinación en cantidades que resultan eficaces para el propósito pretendido.

Las formulaciones terapéuticas de los polipéptidos identificados en la presente invención, o los agonistas de los mismos, se preparan para su almacenamiento mediante la mezcla del ingrediente activo con el grado de pureza deseado con portadores, excipientes o estabilizantes opcionales farmacéuticamente aceptables (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edición, Osol A., editor, 1980) en la forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los portadores, excipientes o estabilizantes aceptables resultan no tóxicos para los recipientes a las dosis y concentraciones utilizadas, e incluyen tampones, tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes, incluyendo el ácido ascórbico y la metionina; conservantes (tales como el cloruro de octadecildimetilbencilamonio; cloruro de hexametonio, cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, fenol, alcohol butílico o bencílico; alquilparabens, tales como metil o propilparabén, catecol, resorcinol, ciclohexano, 3-pentanol, y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos, y otros carbohidratos, incluyendo glucosa, manosa, o dextrinas; agentes quelantes, tales como EDTA; azúcares, tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sales, tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo complejos de Zn-proteína) y/o tensioactivos no iónicos, tales como TWEEN^{TM}, PLURONICS^{TM} o polietilenglicol (PEG).

La formulación de la presente invención también puede contener más de un compuesto activo según resulte necesario para la indicación particular que se está tratando, preferentemente aquellos con actividades complementarias que no se afecten negativamente entre sí. Alternativamente, o adicionalmente, la composición puede comprender un agente citotóxico, citoquina o agente inhibidor del crecimiento. Estas moléculas se encuentran convenientemente presentes en combinación en cantidades que resultan eficaces para el propósito pretendido.

Los ingredientes activos también pueden encapsularse en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, por ejemplo microcápsulas de hidroximetilcelulosa o de gelatina y microcápsulas de poli(metilmetacrilato), respectivamente, en sistemas de administración de fármaco coloidal (por ejemplo liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Estas técnicas se dan a conocer en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edición, Osol A., editor, 1980.

Las formulaciones a utilizar en la administración in vivo deben ser estériles. Esto se consigue fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración estériles, previamente o posteriormente a la liofilización y reconstitución.

Las composiciones terapéuticas de la presente invención generalmente se introducen en un recipiente con una abertura de acceso estéril, por ejemplo una bolsa de solución intravenosa o un vial con un tapón agujereable con una aguja de inyección hipodérmica.

Pueden prepararse preparaciones de liberación sostenida. Entre los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida se incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen el anticuerpo, las cuales presentan la forma de artículos conformados, por ejemplo películas o microcápsulas Entre los ejemplos de matrices de liberación sostenida se incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo poli(2-hidroxietil-metacrilato) o alcohol polivinílico, poliláctidos (patente US nº 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutámico y \gamma-etil-L-glutamato, copolímeros de etileno-acetato de vinilo no degradable, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólido degradables, tales como LUPRON DEPOT^{TM} (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólido y acetato de leuprólido) y ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Aunque polímeros tales como etileno-acetato de vinilo y ácido láctico-ácido glicólico permiten la liberación de moléculas a lo largo de más de 100 días, determinados hidrogeles liberan proteínas durante periodos de tiempo más cortos. Cuando los anticuerpos encapsulados permanecen en el cuerpo durante un tiempo prolongado, pueden desnaturalizarse o agregarse como resultado de la exposición a la humedad a 37ºC, resultando en una pérdida de actividad biológica y en posibles cambios de inmunogenicidad. Pueden diseñarse estrategias racionales para la estabilización dependiendo del mecanismo implicado. Por ejemplo, si el mecanismo de agregación se descubre que es la formación de enlaces S-S- intermoleculares a través de intercambio tiodisulfuro, la estabilización puede conseguirse modificando los residuos sulfhidrilo, liofilizando a partir de soluciones ácidas, controlando el contenido de humedad, utilizando aditivos apropiados, y desarrollando composiciones de matriz polimérica específicas.

J. Procedimientos de tratamiento

Se contempla que los polipéptidos de la presente invención y sus agonistas, incluyendo anticuerpos, péptidos y agonistas de molécula pequeña, puedan utilizarse para tratar diversos tumores, por ejemplo cánceres. Entre las condiciones o trastornos ejemplares que deben tratarse se incluyen los tumores benignos o malignos (por ejemplo renal, de hígado, de riñón, de vejiga, de mama, gástrico, ovárico, colorrectal, de próstata, pancreático, de pulmón, vulvar, del tiroides, carcinomas hepáticos; sarcomas; glioblastomas; y diversos tumores de cabeza y cuello); leucemias y cánceres linfoides; otros trastornos, tales como trastornos neuronales, gliales, astrocitales, hipotalámicos y otros trastornos glandulares, macrofágicos, epiteliales, estromales y blastocélicos; y trastornos inflamatorios, angiogénicos e inmunológicos. Los agentes antitumorales de la presente invención, incluyendo los polipéptidos dados a conocer en la presente invención y los agonistas que mimetizan su actividad, por ejemplo anticuerpos, péptidos y moléculas orgánicas pequeñas), se administran a un mamífero, preferentemente a un ser humano, de acuerdo con procedimientos conocidos, tales como la administración intravenosa en forma de bolo o mediante infusión continua a lo largo de un periodo de tiempo, o por las vías intramuscular, intraperitoneal, intracerebroespinal, intraocular, intraarterial, intralesional, subcutánea, intraarticular, intrasinovial, intratecal, oral, tópica o por inhalación.

Pueden combinarse otros regímenes terapéuticos con la administración de los agentes anticáncer de la invención. Por ejemplo, el paciente que debe tratarse con estos agentes anticáncer también puede recibir terapia de radiación. Alternativamente, o adicionalmente, puede administrarse un agente quimioterapéutico al paciente. La preparación y programas de dosificación para estos agentes quimioterapéuticos puede llevarse a cabo siguiendo las instrucciones del fabricante o según se determine empíricamente por el experto en la materia. La preparación y programas de dosificación para esta quimioterapia también se describen en Chemotherapy Service, editores: M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 1992. El agente quimioterapéutico puede ser anterior o posterior a la administración del agente antitumoral de la presente invención, o puede administrarse simultáneamente con el mismo. Los agentes anticáncer de la presente invención pueden combinarse con un compuesto antiestrógeno, tal como tamoxifeno o una antiprogesterona, tal como onapristona (ver la patente EP nº 616.812) en dosis conocidas para estas
moléculas.

Puede resultar deseable administrar también anticuerpos contra antígenos asociados a tumores, tales como anticuerpos que se unen a ErbB2, EGFR, ErbB3, ErbB4 o al factor vascular endotelial (VEGF). Alternativamente, o adicionalmente, pueden coadministrarse al paciente dos o más anticuerpos que se unen a dos o más antígenos diferentes o iguales asociados a cáncer. En ocasiones, puede resultar beneficioso administrar también una o más citoquinas al paciente. En una realización preferente, los agentes anticáncer de la presente invención se coadministran con un agente inhibidor del crecimiento. Por ejemplo, el agente inhibidor del crecimiento puede administrarse en primer lugar, seguido de la administración de un agente anticáncer de la presente invención. Sin embargo, la administración simultánea o la administración de primero el agente anticáncer de la presente invención también se encuentra contemplada. Las dosis adecuadas de agente inhibidor del crecimiento son aquéllas utilizadas en la actualidad y pueden reducirse debido a la acción combinada (sinergia) del agente inhibidor del crecimiento y el anticuerpo de la presente
invención.

Para la prevención o el tratamiento de la enfermedad, la dosis apropiada de un agente antitumoral de la presente invención dependerá del tipo de enfermedad que debe tratarse, tal como se ha indicado anteriormente, de la severidad y curso de la enfermedad, de si el agente se administra con fines preventivos o terapéuticos, de la terapia anterior, el historial clínico del paciente y de su respuesta al agente, y del criterio del médico responsable. El agente se administra convenientemente al paciente en una vez o a lo largo de una serie de tratamientos. Los experimentos animales proporcionan directrices fiables para la determinación de las dosis eficaces para la terapia en el ser humano. El escalado entre especies de las dosis eficaces puede llevarse a cabo siguiendo los principios establecidos por Mordenti, J. y Chappell, W., "The use of interspecies scaling in toxicokinetics", en: Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi et al., editores, Pergamon Press, New York, 1989, páginas 42-96.

Por ejemplo, dependiendo del tipo y severidad de la enfermedad, aproximadamente 1 \mug/kg a 15 mg/kg (por ejemplo 0,1 a 20 mg/kg) de un agente antitumoral es una dosis candidata inicial para la administración al paciente, sea, por ejemplo, mediante una o más administraciones separadas, o mediante infusión continua. Una dosis diaria típica se encuentra comprendida entre aproximadamente 1 \mug/kg y 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores anteriormente indicados. Para administraciones repetidas a lo largo de varios días o más, dependiendo de la condición, el tratamiento se sostiene hasta que se produce una supresión deseada de los síntomas de la enfermedad. Sin embargo, pueden resultar útiles otros regímenes de dosificación. El progreso de esta terapia se sigue con facilidad mediante técnicas y ensayos convencionales. En la literatura se proporcionan directrices sobre las dosis y procedimientos de administración particulares; ver, por ejemplo, las patentes US nº 4.657.760, nº 5.206.344 o nº 5.225.212. Se prevé que diferentes formulaciones resulten eficaces para diferentes compuestos de tratamiento y para diferentes trastornos, que la administración dirigida a un órgano o tejido, por ejemplo, puede requerir la administración de una manera diferente que para otro órgano o tejido.

K. Artículos manufacturados

En otra realización de la invención, se proporciona un artículo manufacturado que contiene materiales que resultan útiles para el diagnóstico o para el tratamiento de los trastornos indicados anteriormente. El artículo manufacturado comprende un recipiente y una etiqueta. Entre los recipientes adecuados se incluyen, por ejemplo, botellas, viales, jeringas y probetas. Los recipientes pueden formarse a partir de una diversidad de materiales, tales como vidrio o plástico. El recipiente contiene una composición que resulta eficaz para diagnosticar o para tratar la condición y puede presentar una abertura de acceso estéril (por ejemplo el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial con un tapón agujereable con una aguja de inyección hipodérmica). El agente activo en la composición es un agente antitumoral de la presente invención. La etiqueta sobre el recipiente o asociada al mismo indica que la composición se utiliza para diagnostica o para tratar la condición de elección. El artículo manufacturado puede comprender además un segundo recipiente que comprende un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como solución salina tamponada con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y de usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas, jeringas y folletos en el paquete con instrucciones de utilización.

Los ejemplos siguientes se ofrecen únicamente a título ilustrativo, y no pretenden limitar el alcance de la presente invención en modo alguno.

Ejemplos

Los reactivos disponibles comercialmente a los que se hace referencia en los ejemplos se utilizaron siguiendo las instrucciones del fabricante, a menos que se indique lo contrario. La fuente de las células identificadas en los ejemplos siguientes y a lo largo de toda la especificación con los números de acceso ATCC es la American Type Culture Collection, Manassas, VA.

Ejemplo I Aislamiento de un clon de ADNc codificante de PRO211 (A) PRO211

Las secuencias de dominio extracelular (ECD) (incluyendo la secuencia de señal de secreción, si existe) de entre aproximadamente 950 proteínas secretadas conocidas de la base de datos pública Swiss-Prot se utilizaron para las búsquedas de las bases de datos EST. Entre las bases de datos EST se incluían las bases de datos EST públicas (por ejemplo GenBank) y una base de datos patentada (LIFESEQ®, Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA). La búsqueda se llevó a cabo utilizando el programa informático BLAST o BLAST2 (Altschul et al., Methods in Enzymology 266:460-480, 1996) como comparación de las secuencias de proteína ECD con una traducción de 6 marcos de las secuencias de EST. Aquellas comparaciones resultantes en una puntuación BLAST de 70 (o en algunos casos de 90) o más que no codificaban las proteínas conocidas se agruparon y se ensamblaron formando secuencias de ADN de consenso utilizando el programa "phrap" (Phil Green, University of Washington, Seanle, Washington).

Se ensambló una secuencia de ADN de consenso respecto a otras secuencias de EST utilizando phrap tal como se ha descrito anteriormente. Esta secuencia de consenso se denomina en la presente invención DNA28730. En algunos casos, la secuencia de consenso deriva de una secuencia de ADN de consenso intermedia que se extendió utilizando ciclos repetidos de BLAST y phrap para extender esta secuencia de consenso intermedia tanto como resultó posible utilizando las fuentes de secuencias de EST comentadas anteriormente.

Basándose en la secuencia de consenso DNA28730 se sintetizaron oligonucleótidos: 1) para identificar mediante PCR una biblioteca de ADNc que contenga la secuencia de interés, y 2) para la utilización como sondas para aislar un clon de la secuencia codificante de longitud completa para PRO211. Los cebadores de PCR forward y reversa generalmente presentan entre 20 y 30 nucleótidos y con frecuencia se diseñan para proporcionar un producto PCR de aproximadamente 100 a 1.000 pb de longitud. Las secuencias de sonda presenta una longitud de habitualmente 40 a 55 pb. En algunos casos, se sintetizan oligonucleótidos adicionales cuando la secuencia de consenso es mayor de aproximadamente 1 a 1,5 kpb. Con el fin de cribar varias bibliotecas para un clon de longitud completa, se cribó el ADN de las bibliotecas mediante amplificación por PCR, siguiendo Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, supra, con el par de cebadores para PCR. A continuación, se utilizó una biblioteca positiva para aislar los clones codificantes del gen de interés utilizando el oligonucleótido sonda y uno de los pares cebadores.

Se sintetizaron los cebadores para PCR (forward y reversos):

cebador PCR forward:

5'-AGAGTGTATCTCTGGCTACGC-3'

(SEC ID nº 3)

cebador PCR inverso:

5'-TAAGTCCGGCACATTACAGGTC3'

(SEC ID nº 4)

Además, se construyó una sonda de hibridación de oligonucleótido sintético a partir de la secuencia de consenso DNA28730 que presentaba la secuencia de nucleótidos siguientes:

sonda de hibridación:

5'-AGGGAGCACGGACAGTGTGCAGATGTGGACGAGTGCTCACTAGCA-3'

(SEC ID nº 5)

Se aisló ARN para la construcción de las bibliotecas de ADNc a partir de tejido pulmonar fetal humano. Las bibliotecas de ADNc utilizadas para aislar los clones de ADNc se construyeron procedimientos estándar utilizando reactivos disponibles comercialmente, tales como aquellos de Invitrogen, San Diego, CA. El ADNc se cebó con oligo-dT que contenían un sitio NotI, ligado con adaptadores hemiquinasados blunt-a-SalI, cortado con NotI, dimensionado apropiadamente mediante electroforesis en gel, y clonado en una orientación definida en un vector de clonación adecuado (tal como pRKB o pRKD; pRK5B es un precursor de pRK5D que no contiene el sitio SfiI; Holmes et al., Science 253:1278-1280, 1991) en los sitios XhoI y NotI únicos.

La secuenciación de ADN de los clones aislados tal como se ha descrito anteriormente proporcionó la secuencia de ADN de longitud completa para un polipéptido PRO211 de longitud completa (denominada en la presente memoria DNA32292-1131 (figura 1, SEC ID nº 1)) y la secuencia de proteína derivada para ese polipéptido PRO211.

El clon de longitud completa identificado anteriormente contenía un solo marco de lectura abierto con un sitio de inicio traduccional aparente en las posiciones nucleótidas 65-67 y una señal de parada en las posiciones nucleótidas 1124-1126 (figura 1, SEC ID nº 1). El precursor polipéptido teórico presentaba una longitud de 353 aminoácidos y un peso molecular calculado de aproximadamente 38.190 daltons. El análisis de la secuencia de longitud completa de PRO211 mostrada en la figura 2 (SEC ID nº 2) pone de manifiesto la presencia de una diversidad de importantes dominios de polipéptido, en los que las localizaciones proporcionadas para esos dominios importantes de polipéptido son aproximadas, tal como se ha descrito anteriormente. El análisis de la secuencia de longitud completa de PRO211 puso de manifiesto lo siguiente: un péptido de señal entre aproximadamente el aminoácido 1 y aproximadamente el aminoácido 24; sitios de N-glucosilación entre aproximadamente el aminoácido 190 y aproximadamente el aminoácido 194, y entre aproximadamente el aminoácido 251 y aproximadamente el aminoácido 255; sitios de unión de glucosaminoglicano entre aproximadamente el aminoácido 149 y aproximadamente el aminoácido 153, y entre aproximadamente el aminoácido 155 y aproximadamente el aminoácido 159; un sitio de fosforilación de proteína quinasa dependiente de GMPc y de AMPc entre aproximadamente el aminoácido 26 y aproximadamente el aminoácido 30; sitios de fosforilación de caseína quinasa II entre aproximadamente el aminoácido 58 y aproximadamente el aminoácido 62, entre aproximadamente el aminoácido 66 y aproximadamente el aminoácido 70, entre aproximadamente el aminoácido 86 y aproximadamente el aminoácido 90, entre aproximadamente el aminoácido 197 y aproximadamente el aminoácido 201, entre aproximadamente el aminoácido 210 y aproximadamente el aminoácido 214, entre aproximadamente el aminoácido 255 y aproximadamente el aminoácido 259, entre aproximadamente el aminoácido 295 y aproximadamente el aminoácido 299, entre aproximadamente el aminoácido 339 y aproximadamente el aminoácido 343, y entre aproximadamente el aminoácido 349 y aproximadamente el aminoácido 353; un sitio de fosforilación de tirosina quinasa entre aproximadamente el aminoácido 303 y aproximadamente el aminoácido 310; sitios de N-miristoilación entre aproximadamente el aminoácido 44 y aproximadamente el aminoácido 50, entre aproximadamente el aminoácido 54 y aproximadamente el aminoácido 60, entre aproximadamente el aminoácido 55 y aproximadamente el aminoácido 61, entre aproximadamente el aminoácido 81 y aproximadamente el aminoácido 87, entre aproximadamente el aminoácido 150 y aproximadamente el aminoácido 156, entre aproximadamente el aminoácido 158 y aproximadamente el aminoácido 164, entre aproximadamente el aminoácido 164 y aproximadamente el aminoácido 170, entre aproximadamente el aminoácido 252 y aproximadamente el aminoácido 258, y entre aproximadamente el aminoácido 313 y aproximadamente el aminoácido 319; un ácido aspártico y un sitio de hidroxilación de asparagina entre aproximadamente el aminoácido 308 y aproximadamente el aminoácido 320; un patrón distintivo de cisteínas del dominio similar a EGF entre aproximadamente el aminoácido 166 y aproximadamente el aminoácido 178; y un patrón de cremallera de leucina entre aproximadamente el aminoácido 94 y aproximadamente el aminoácido 116.

El clon DNA32292-1 131 ha sido depositado en la ATCC el 16 de septiembre de 1996, y ha sido asignado el nº de depósito ATCC 209258.

Un análisis de la base de datos Dayhoff (versión 35.45, SwissProt 35) con el análisis de alineación de secuencias WU-BLAST2 de la secuencia de longitud completa mostrada en la figura 2 (SEC ID nº 2) puso de manifiesto la identidad de secuencias entre la secuencia de aminoácidos de PRO211 y de la EGF humana.

Ejemplo 2 Expresión de PRO211 en E. coli

El presente ejemplo ilustra la preparación de una forma no glucosilada de PRO211 mediante la expresión recombinante en E. coli.

La secuencia de ADN codificante de PRO211 inicialmente se amplifica utilizando cebadores de PCR seleccionados. Los cebadores deben contener sitios de enzimas de restricción que correspondan a los sitios de enzimas de restricción en el vector de expresión seleccionado. Puede utilizarse una diversidad de vectores de expresión. Un ejemplo de un vector adecuado es pBR322 (derivado de E. coli; ver Bolivar et al., Gene 2:95, 1977), que contiene genes para la resistencia a la ampicilina y a la tetraciclina. El vector se digiere con enzima de restricción y se desfosforila. Las secuencias amplificadas por PCR seguidamente se ligan en el vector. El vector preferentemente incluye secuencias que codifican un gen de resistencia a antibiótico, un promotor trp, un líder poli-His (incluyendo los primeros seis codones STII, secuencia poli-His, y sitio de corte de enteroquinasa), la región codificante de PRO211, el terminador de transcripción lambda, y un gen argU.

A continuación, la mezcla de ligación se utiliza para transformar una cepa de E. coli seleccionada utilizando los procedimientos descritos en Sambrook et al., supra. Los transformantes se identifican por su capacidad de crecer en placas LB y seguidamente se seleccionan las colonias resistentes a antibiótico. El ADN de plásmido puede aislarse y confirmarse mediante análisis de restricción y secuenciación de ADN.

Los clones seleccionados pueden cultivarse durante la noche en medio de cultivo líquido, tal como caldo LB suplementado con antibióticos. El cultivo de la noche posteriormente puede utilizarse para inocular un cultivo a mayor escala. Después, las células se cultivan hasta una densidad óptica deseada, momento en el que se activa el promotor de expresión.

Tras cultivar las células durante varias horas más, las células pueden recolectarse mediante centrifugación. El pellet celular obtenido mediante la centrifugación puede solubilizarse utilizando diversos agentes conocidos de la técnica, y la proteína PRO211 solubilizada seguidamente puede purificarse utilizando una columna quelante de metales bajo condiciones que permitan la unión fuerte de la proteína.

PRO211 puede expresarse en E. coli en una forma etiquetada con poli-His, utilizando el procedimiento siguiente. El ADN codificante de PRO211 inicialmente se amplifica utilizando cebadores PCR seleccionados. Los cebadores contienen sitios de enzimas de restricción que corresponden a los sitios de enzimas de restricción en el vector de expresión seleccionado, y otras secuencias útiles que permiten un inicio de traducción eficiente y fiable, una purificación rápida en una columna de quelación de metales, y la eliminación proteolítica con enteroquinasa. Las secuencias amplificadas por PCR etiquetadas con poli-His seguidamente se ligan en un vector de expresión, que se utiliza para transformar un huésped E. coli basado en la cepa 52 (W3110 fuhA(tonA) Ion galE rpoHts(thpRts) cLpP(lacIq). Los transformantes en primer lugar se cultivan en LB que contiene 50 mg/ml de carbenicilina a 30ºC con agitación hasta alcanzar una DO_{600} de 3 a 5. Los cultivos seguidamente se diluyen 50 a 100 veces en medio CRAP (preparado mezclando 3,57 g de (NH_{4})2SO_{4}, 0,71 g de citrato sódico\cdot2H_{2}O, 1,07 g de KCl, 5,36 g de extracto de levadura Difco, 5,36 g de hicasa SF de Sheffield en 500 ml de agua, así como MPOS 110 mM, pH 7,3, glucosa al 0,55% (p/v) y MgSO_{4} 7 mM) y se cultivan durante aproximadamente 20 a 30 horas a 30ºC con agitación. Las muestras se extraen para verificar la expresión mediante análisis de SDS-PAGE, y el cultivo total se centrifuga para formar un pellet con las células. Los pellets celulares se congelan hasta su purificación y replegamiento.

Se resuspende pasta de E. coli procedente de 0,5 a 1 litro de fermentaciones (pellets de 6 a 10 g) en 10 volúmenes (p/v) de tampón guanidina 7 M, Tris 20 mM; pH 8. Se añaden sulfito sódico sólido y tetrationato sódico para preparar concentraciones finales de 0,1 M y 0,02 M, respectivamente, y la solución se agita durante la noche a 4ºC. Esta etapa resulta en una proteína desnaturalizada con todos los residuos de cisteína bloqueados mediante sulfitolización. La solución se centrifuga a 40.000 rpm en una ultracentrífuga Beckman durante 30 minutos. El sobrenadante se diluye con 3 a 5 volúmenes de tampón de columna de quelato metálico (guanidina 6 M, Tris 20 mM, pH 7,4) y se filtra a través de filtros de 0,22 micrómetros para clarificarlo. El extracto clarificado se carga en una columna de quelato metálico Ni^{2+}-NTA de Qiagen de 5 ml equilibrada con el tampón de la columna de quelato metálico. La columna se lava con tampón adicional que contiene imidazol 50 mM (Calbiochem, grado Utrol), pH 7,4. La proteína se eluye con tampón que contiene imidazol 250 mM. Las fracciones que contienen la proteína deseada se agrupan y se almacenan a 4ºC. La concentración de proteína se estima a partir de su absorbancia a 280 nm utilizando el coeficiente de extinción calculado basándose en su secuencia de aminoácidos.

Las proteínas se repliegan mediante dilución de la muestra lentamente en tampón de replegamiento recién preparado consistente en: Tris 20 mM, pH 8,6, NaCl 0,3 M, urea 2,5 M, cisteína 5 mM, glicina 20 mM y EDTA 1 mM. Los volúmenes de replegamiento se seleccionan de manera que la concentración final de proteínas se encuentre comprendida entre 50 y 100 microgramos/ml. La solución de replegamiento se agita suavemente a 4ºC durante 12 a 36 horas. La reacción de replegamiento se refresca mediante la adición de TFA hasta una concentración final del 0,4% (pH de aproximadamente 3). Antes de la purificación adicional de la proteína, la solución se filtra a través de un filtro de 0,22 micrómetros y se añade acetonitrilo hasta una concentración final de entre 2% y 10%. La proteína replegada se cromatografía en una columna de fase reversa Pros RI/H utilizando un tampón móvil de TFA al 0,1% con elución a través de un gradiente de acetonitrilo de 10% a 80%. Se analizan alícuotas de las fracciones de absorbancia A_{280} en geles de poliacrilamida-SDS y las fracciones que contienen proteína replegada homogénea se agrupan. Generalmente, las especies replegadas correctamente de la mayoría de proteínas eluyen a las concentraciones más bajas de acetonitrilo, debido a que estas especies son las más compactas al estar sus interiores hidrofóbicos protegidos de la interacción con la resina de fase inversa. Las especies agregadas habitualmente se eluyen a concentraciones de acetonitrilo más elevadas. Además de resolver las formas mal plegadas de proteína de la forma deseada, la etapa de fase inversa también elimina la endotoxina de las muestras.

Las fracciones que contienen el polipéptido PRO211 plegado deseado se agrupan, y el acetonitrilo se elimina utilizando un flujo suave de nitrógeno que se pasa por la solución. Las proteínas se formulan en Hepes 20 mM, pH 6,8 con cloruro sódico 0,14 M y manitol al 4% mediante diálisis o mediante filtración en gel utilizando resinas G25 Superfine (Pharmacia) equilibradas en el tampón de formulación y filtradas hasta la esterilidad.

Ejemplo 3 Expresión de PRO211 en células de mamífero

El presente ejemplo ilustra la preparación de una forma potencialmente glucosilada de PRO211, mediante expresión recombinante en células de mamífero.

El vector, pRK5 (ver la patente EP nº 307.247, publicada el 15 de marzo de 1989) se utiliza como vector de expresión. Opcionalmente, el ADN de PRO211 se liga en pRK5 con enzimas de restricción seleccionados para permitir la inserción del ADN de PRO211 utilizando procedimientos de ligación, tales como los descritos en Sambrook et al., supra. El vector resultante se denomina pRK5-PRO211.

En una realización, las células huésped seleccionadas pueden ser células 293. Las células 293 humanas (ATCC nº CCL 1573) se cultivan hasta la confluencia en placas de cultivo de tejidos en un medio tal como DMEM suplementado con suero de feto bovino y opcionalmente, con componentes nutritivos y/o con antibióticos. Se mezclan aproximadamente 10 \mug de ADN de pRK5-PRO211 con aproximadamente 1 \mug de AND codificante del gen ARN de VA (Thimmappaya et al., Cell 31:543, 1982) y se disuelven en 500 \mul de Tris-HCl 1 mM, EDTA 0,1 mM, CaCl_{2} 0,227 mM. A esta mezcla se añaden, gota a gota, 500 \mul de HEPES 50 mM (pH 7,35), NaCl 280 mM, NaPO_{4} 1,5 mM y se deja que se forme un precipitado durante 10 minutos a 25ºC. El precipitado se suspende y se añade a las células 293 y se deja que sedimente durante aproximadamente cuatro horas a 37ºC. El medio de cultivo se separa por aspiración y se añaden 2 ml de glicerol al 20% en PBS a lo largo de 30 segundos. A continuación, las células 293 se lavan con medio libre de suero, se añade medio fresco y las células se incuban durante aproximadamente 5 días.

Aproximadamente 24 horas tras las transfecciones, el medio de cultivo se elimina y se sustituye por medio de cultivo (solo) o medio de cultivo que contiene 200 \muCi/ml de ^{35}S-cisteína y 200 \muCi/ml de ^{35}S-metionina. Tras una incubación de 12 horas, se recoge el medio acondicionado, se concentra en un filtro giratorio y se carga en un gel de SDS al 15%. El gel procesado puede secarse y exponerse a película durante un periodo de tiempo seleccionado para revelar la presencia del polipéptido PRO211. Los cultivos que contienen las células transfectadas pueden someterse a una incubación adicional (en medio libre de suero) y el medio puede someterse a ensayo en bioensayos seleccionados.

En una técnica alternativa, puede introducirse PRO211 en células 293 transitoriamente utilizando el procedimiento del dextrán sulfato descrito por Somparyrac et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 12:7575, 1981. Las células 293 se cultivan hasta la densidad máxima en un matraz de centrifugación y se añaden 700 \mug de ADN pRK5-PRO211. Las células en primer lugar se concentran del matraz giratorio mediante centrifugación y se lavan con PBS. El precipitado ADN-dextrano se incuba en el pellet celular durante cuatro horas. Las células se tratan con glicerol al 20% durante 90 segundos, se lavan con medio de cultivo de tejidos, y se reintroducen en el matraz de centrifugación que contiene medio de cultivo de tejidos, 5 \mug/ml de insulina bovina y 0,1 \mug/ml de transferrina bovina. Tras aproximadamente cuatro días, el medio acondicionado se centrifuga y se filtra para eliminar las células y los residuos. La muestra que contiene PRO211 expresado seguidamente puede concentrarse y purificarse mediante cualquier procedimiento seleccionado, tal como diálisis y/o cromatografía de columna.

En otra realización, PRO211 puede expresarse en células CHO. pRK5-PRO211 puede transfectarse en células CHO utilizando reactivos conocidos, tales como CaPO_{4} o DEAE-dextran. Tal como se ha indicado anteriormente, los cultivos celulares pueden incubarse, y el medio sustituirse por medio de cultivo (solo) o medio que contenga un marcador radioactivo, tal como ^{35}S-metionina. Tras determinar la presencia de un polipéptido PRO211, el medio de cultivo puede sustituirse con medio libre de suero. Preferentemente, los cultivos se incuban durante aproximadamente 6 días, y después se recolecta el medio acondicionado. El medio que contiene el polipéptido PRO211 expresado seguidamente puede concentrarse y purificarse mediante cualquier procedimiento seleccionado.

PRO211 etiquetado con epítopo también puede expresarse en células huésped CHO. PRO211 puede subclonarse extrayéndolo del vector pRK5. La inserción subclonada puede someterse a PCR para fusionarla en el mismo marco con una etiqueta epítopo seleccionada, tal como una etiqueta poli-His en un vector de expresión baculovirus. PRO211 etiquetada con poli-His seguidamente puede subclonarse en un vector controlado por SV40 que contiene un marcador de selección, tal como DHFR para la selección de clones estables. Finalmente, las células CHO pueden transfectarse (tal como se ha indicado anteriormente) con el vector controlado por SV40. El marcaje puede llevarse a cabo, tal como se ha indicado anteriormente, para verificar que se ha producido la expresión. El medio de cultivo que contiene PRO211 etiquetado con poli-His, que se ha expresado, seguidamente puede concentrarse y purificarse mediante cualquier procedimiento seleccionado, tal como cromatografía de afinidad de Ni^{2+}-quelato.

PRO211 también puede expresarse en células CHO y/o COS mediante un procedimiento de expresión transitoria o en células CHO mediante otro procedimiento de expresión estable.

La expresión estable en células CHO se lleva a cabo utilizando el procedimiento siguiente. Las proteínas se expresan en forma de constructo de IgG (inmunoadhesina) en la que las secuencias codificantes para las formas solubles (por ejemplo los dominios extracelulares) de las proteínas respectivas se fusionan con una secuencia de región constante de IgG I que contiene la bisagra, dominios CH2 y CH2, y/o como forma etiquetada con poli-His.

Tras la amplificación por PCR, los ADNs respectivos se subclonan en un vector de expresión CHO utilizando técnicas estándar tal como se describe en Ausubel et al., Current Protocols of Molecular Biology, unidad 3.16, John Wiley and Sons, 1997. Los vectores de expresión CHO se construyen para que presentan sitios de restricción compatibles 5' y 3' del ADN de interés para permitir el transporte conveniente de los ADNc. El vector utilizado en la expresión en células CHO es tal como se describe en Lucas et al., Nucl. Acids Res. 24:9(1774-1779), 1996, y utiliza el promotor temprano/intensificador para regular la expresión del ADNc de interés y de la dihidrofolato reductasa (DHFR). La expresión de DHFR permite la selección para el mantenimiento estable del plásmido tras la transfección.

Se introdujeron doce microgramos del ADN de plásmido deseado en aproximadamente 10 millones de células HO utilizando los reactivos de transfección disponibles comercialmente Superfect® (Qiagen), Dosper® o Fugene® (Boehringer Mannheim). Las células se cultivan tal como se describe en Lucas et al., supra. Se congelaron aproximadamente 3 x 10^{7} células en una ampolla para su cultivo y producción posteriores tal como se describe posteriormente.

Las ampollas que contenían el ADN de plásmido se descongelaron introduciéndolas en un baño de agua y se mezclaron en un vórtex. El contenido se introdujo con una pipeta en un tubo de centrifugación que contenía 10 ml de medio y se centrifugó a 1.000 rpm durante 5 minutos. El sobrenadante se aspiró y las células se resuspendieron en 10 ml de medio selectivo (PS20 filtrado a través de 0,2 \mum con suero de feto bovino al 5% diafiltrado por 0,2 \mum). A continuación, se prepararon alícuotas de las células en un tubo de centrífuga de 100 ml que contenía 90 ml de medio selectivo. Tras 1 a 2 días, las células se transfirieron a un tubo de centrífuga de 250 ml lleno con 150 ml de medio de cultivo selectivo y se incubaron a 37ºC. Tras 2 a 3 días adicionales, se sembraron tubos de centrífuga de 250 ml, de 500 ml y de 2.000 ml con 3 x 10^{5} células/ml. El medio celular se intercambió por medio fresco mediante centrifugación y se resuspendió en medio de producción. Aunque pueden utilizarse medios CHO adecuados, de hecho puede utilizarse un medio de producción descrito en la patente US nº 5.122.469, publicada el 16 de junio de 1992. Se sembró un tubo de centrífuga de producción de 3 litros con 1,2 x 10^{6} células/ml. El día 0, se determinó el número de células y el pH. El día 1, se muestreo el tubo de centrífuga y se inició el burbujeó con aire filtrado. El día 2, se muestreó el tubo de centrífuga, se modificó la temperatura a 33ºC, y se extrajeron 30 ml de 500 g/l de glucosa y 0,6 ml de antiespumante al 10% (por ejemplo emulsión de polidimetilsiloxano al 35%, emulsión de grado médico Dow Corning 365). Durante la producción, se ajustó el pH según resultase necesario para mantenerlo a aproximadamente 7,2. Tras 10 días, o hasta que la viabilidad cayese por debajo del 70%, se recolectó el cultivo celular mediante centrifugación y filtración a través de un filtro de 0,22 \mum. El filtrado se almacenó a 4ºC o se cargó inmediatamente en columnas para la purificación.

Para los constructos etiquetados con poli-His, las proteínas se purificaron utilizando una columna de Ni^{2+}-NTA (Qiagen). Antes de la purificación, se añadió imidazol al medio acondicionado hasta una concentración de 5 mM. El medio acondicionado se bombeó por una columna de Ni^{2+}-NTA de 6 ml equilibrada en tampón Hepes 20 mM, pH 7,5, que contenía NaCl 0,3 M e imidazol 5 mM a un caudal de 4 a 5 ml/min a 4ºC. Tras la carga, la columna se lavó con tampón de equilibrado adicional y la proteína se eluyó con tampón de equilibración que contenía imidazol 0,25 M. La proteína altamente purificada posteriormente se desaló en tampón de almacenamiento que contenía Hepes 10 mM, NaCl 0,14 M y manitol al 4%, pH 6,8, con una columna G25 Superfine de 25 ml (Pharmacia) y se almacenó a -80ºC.

Se purificaron constructos de inmunoadhesina (que contenía Fc) a partir del medio acondicionado de la manera siguiente. El medio acondicionado se bombeó por una columna de proteína A de 5 ml (Pharmacia) que había sido equilibrada en tampón fosfato de Na 20 mM, pH 6,8. Tras la carga, la columna se lavó extensivamente con tampón de equilibración antes de la elución con ácido cítrico 100 mM, pH 3,5. La proteína eluida se neutralizó inmediatamente recogiendo fracciones de 1 ml en tubos que contenían 275 \mul de tampón Tris 1 M, pH 9. La proteína altamente purificada posteriormente se desaló en tampón de almacenamiento tal como se ha descrito anteriormente para las proteínas etiquetadas con poli-His. La homogeneidad se evaluó en geles de SDS-poliacrilamida y mediante secuenciación de aminoácidos N-terminales por degradación de Edman.

PRO211 se expresó establemente en células CHO mediante el procedimiento anteriormente descrito. En experimentos relacionados, descritos en la patente WO nº 00/21996, se expresó PRO172 en células CHO mediante el procedimiento de expresión transitoria.

Ejemplo 4 Expresión de PRO211 en levaduras

El procedimiento siguiente describe la expresión recombinante de PRO211 en levaduras.

En primer lugar, se construyen vectores de expresión levaduras para la producción intracelular o la secreción de PRO211 desde el promotor ADH2/GAPDH. El ADN codificante de PRO211 y el promotor se insertan en sitios de enzima de restricción adecuados en el plásmido seleccionado para dirigir la expresión intracelular de PRO211. Para la secreción, el ADN codificante de PRO211 puede clonarse en el plásmido seleccionado, junto con ADN codificante del promotor ADH2/GAPDH, una PRO211 nativa, un péptido de señal u otro péptido de señal de mamífero, o, por ejemplo, un factor alfa de levadura o secuencia de señal secretoria de invertasa/líder, y secuencias línker (si resultan necesarias), para la expresión de PRO211.

Las células de levadura, tales como la cepa AB110 de levadura, seguidamente pueden transformarse con los plásmidos de expresión indicados anteriormente y cultivarse en medios de fermentación seleccionados. Los sobrenadantes de levadura transformada pueden analizarse mediante precipitación con ácido tricloroacético al 10% y separación mediante SDS-PAGE seguido de tinción de los genes con tinción de azul de Coomassie.

Posteriormente, puede aislarse y purificarse PRO211 recombinante separando las células de levadura del medio de fermentación mediante centrifugación y después concentrando el medio utilizando filtros de cartucho seleccionados. El concentrado que contiene PRO211 puede purificarse adicionalmente utilizando resinas de cromatografía de columna seleccionadas.

Ejemplo 5 Expresión de PRO211 en células de insecto infectadas por baculovirus

El procedimiento siguiente describe la expresión recombinante en células de insecto infectadas por baculovirus.

La secuencia codificante de PRO211 se fusiona más arriba de una etiqueta epítopo contenida dentro de un vector de expresión baculovirus. Entre estas etiquetas epítopo se incluyen las etiquetas poli-His y las etiquetas inmunoglobulina (tales como las regiones Fc de IgG). Puede utilizarse una diversidad de plásmidos, incluyendo los plásmidos derivados de plásmidos disponibles comercialmente, tales como pVL 1393 (Novagen). Brevemente, la secuencia codificante de PRO211 o la parte deseada de la secuencia codificante de PRO211 (tal como la secuencia codificante del dominio extracelular de una proteína transmembranal o la secuencia codificante de la proteína madura si la proteína es extracelular) se amplifica por PCR con cebadores complementarios a las regiones 5' y 3'. El cebador 5' puede incorporar sitios de enzima de restricción (seleccionados) flanqueantes. A continuación, el producto se digiere con esos enzimas de restricción seleccionados y se subclona en el vector de expresión.

Se genera un baculovirus recombinante mediante la cotransfección del plásmido anteriormente indicado y el ADN vírico BaculoGold^{TM} (Pharmingen) en células de Spodoptera frugiperda ("Sf9") (ATCC nº CRL 1711) utilizando lipofectina (disponible comercialmente de GIBCO-BRL). Tras 4 a 5 días de incubación a 28ºC, los virus liberados se recolectan y se utilizan para amplificaciones adicionales. La infección vírica y la expresión de proteínas se lleva a cabo tal como describen O'Reilley et al., Baculovirus expression vectors: A Laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press, 1994.

A continuación, PRO211 etiquetado con poli-His que se ha expresado puede purificarse, por ejemplo mediante cromatografía de afinidad de Ni^{2+}-quelato, de la manera siguiente. Se preparan extractos a partir de células Sf9 recombinantes infectadas por virus tal como describen Rupert et al., Nature 362:175-179, 1993. Brevemente, las células Sf9 se lavan, se resuspenden en tampón de sonicación (25 ml de Hepes, pH 7,9; MgCl_{2} 12,5 mM, EDTA 0,1 mM, glicerol al 10%, NP-40 al 0,1%, KCl 0,4 M) y se sonican dos veces durante 20 segundos en hielo. Los sonicados se clarifican mediante centrifugación, y el sobrenadante se diluye 50 veces en tampón de carga (fosfato 50 mM, NaCl 300 mM, glicerol al 10%, pH 7,8) y se filtra a través de un filtro de 0,45 mm. Se prepara una columna de Ni^{2+}-NTA agarosa (disponible comercialmente de Qiagen) con un volumen de lecho de 5 ml, se lava con 25 ml de agua y se equilibra con 25 ml de tampón de carga. El extracto celular filtrado se carga en la columna a un caudal de 0,5 ml por minuto. La columna se lava hasta la A_{280} de línea base con tampón de carga, punto en el que se inicia la recolección de fracciones. A continuación, la columna se lava con un tampón de lavado secundario (fosfato 50 mM, NaCl 300 mM, glicerol al 10%, pH 6,0), que eluye no específicamente proteína unida. Tras alcanzar la línea base A_{280} nuevamente, la columna se revela con un gradiente de imidazol de 0 a 500 mM en el tampón de lavado secundario. Se recogen fracciones de 1 ml y se analizan mediante SDS-PAGE y tinción de plata o transferencia western con Ni^{2+}-NTA conjugado con fosfatasa alcalina (Qiagen). Las fracciones que contenían PRO211 etiquetado con His_{10} eluido se agrupan y se dializan contra el tampón de carga.

Alternativamente, la purificación de PRO211 etiquetado con IgG (o etiquetado con Fc) puede llevarse a cabo utilizando técnicas de cromatografía conocidas, incluyendo, por ejemplo, cromatografía de columna de proteína A o de proteína G.

Tras la amplificación por PCR, las secuencias codificantes respectivas se subclonan en un vector de expresión baculovirus (pb.PH.IgG para las fusiones de IgG, y pb.PH.His.c para las proteínas etiquetadas con poli-His), y el vector y el ADN vírico Baculogold® (Pharmingen) se cotransfectan en 10^{5} células de Spodoptera frugiperda ("Sf9") (ATCC nº CRL 1711) utilizando lipofectina (Gibco BRL). pb.PH.IgG y pb.PH.His son modificaciones del vector de expresión baculovirus disponible comercialmente pVL1393 (Pharmingen), con regiones polilínker modificadas para que incluyen las secuencias de etiqueta His o Fc. Las células se cultivan en medio TNM-FH de Hink suplementado con FBS al 10% (Hyclone). Las células se incuban durante 5 días a 28ºC. Se recoge el sobrenadante y posteriormente se utiliza para la primera amplificación vírica mediante la infección de células Sf9 en medio TNM-FH de Hink suplementado con FBS al 10% a una multiplicidad de infección (MOI) aproximada de 10. Las células se incuban durante 3 días a 28ºC. El sobrenadante se recoge y la expresión de los constructos en el vector de expresión baculovirus se determina mediante unión por lotes de 1 ml de sobrenadante a 25 ml de perlas de Ni^{2+}-NTA (Qiagen) para las proteínas etiquetadas con histidina o perlas de proteína A-sefarosa CL-4B (Pharmacia) para las proteínas etiquetadas con IgG, seguido de análisis de SDS-PAGE comparando con una concentración conocida de estándar de proteína mediante tinción de azul de Coomassie.

El sobrenadante de la primera amplificación vírica se utilizó para infectar un cultivo celular en tubo de centrífuga (500 ml) de células Sf9 cultivadas en medio ESF-921 (Expression Systems LLC) a una MOI aproximada de 0,1. Las células se incubaron durante 3 días a 28ºC. El sobrenadante se recogió y se filtró. Se repitió la unión por lotes y el análisis de SDS-PAGE, según resultase necesario, hasta confirmar la expresión del cultivo en tubo de centrífuga.

El medio acondicionado de las células transfectadas (0,5 a 3 litros) se recolectó mediante centrifugación para separar las células y se filtró a través de filtros de 0,22 micrómetros. Para los constructos etiquetados con poli-His, el constructo de proteína se purificó utilizando una columna de Ni^{2+}-NTA (Qiagen). Antes de la purificación, se añadió imidazol al medio acondicionado hasta una concentración de 5 mM. El medio acondicionado se bombeó por una columna de Ni^{2+}-NTA de 6 ml equilibrada en tampón Hepes 20 mM, pH 7,4, que contenía NaCl 0,3 M e imidazol 5 mM a un caudal de 4 a 5 ml/min a 4ºC. Tras la carga, la columna se lavó con tampón de equilibrado adicional y la proteína se eluyó con tampón de equilibración que contenía imidazol 0,25 M. La proteína altamente purificada posteriormente se desaló en un tampón de almacenamiento que contenía Hepes 10 mM, NaCl 0,14 M y manitol al 4%, pH 6,8, con una columna G25 Superfine de 25 ml (Pharmacia) y se almacenó a -80ºC.

Se purificaron constructos de inmunoadhesina (que contenía Fc) del medio acondicionado de la manera siguiente. El medio acondicionado se bombeó por una columna de proteína A de 5 ml (Pharmacia) que había sido equilibrada en tampón de fosfato de Na 20 mM, pH 6,8. Tras la carga, la columna se lavó extensivamente con tampón de equilibración antes de la elución con ácido cítrico 100 mM, pH 3,5. La proteína eluida se neutralizó inmediatamente recogiendo fracciones de 1 ml en tubos que contenían 275 ml de tampón Tris 1 M, pH 9. La proteína altamente purificada posteriormente se desaló en tampón de almacenamiento, tal como se ha descrito anteriormente para las proteínas etiquetadas con poli-His. La homogeneidad de las proteínas se verificó mediante electroforesis en gel de SDS-polacrilamida (PEG) y secuenciación de aminoácidos N-terminales por la degradación de Edman. En experimentos relacionados, descritos en la patente WO nº 00/21996, se expresaron PRO228, PRO538 y PRO172 en células de insecto Sf9 infectadas por baculovirus.

Alternativamente, puede utilizarse un procedimiento con baculovirus modificado incorporando células "High 5". En este procedimiento, el ADN codificante de la secuencia deseada se amplifica con sistemas adecuados, tales como Pfu (Stratagene) o se fusiona más arriba (5'-of) de una etiqueta epítopo contenida en un vector de expresión baculovirus. Entre estas etiquetas epítopo se incluyen etiquetas poli-His y etiquetas inmunoglobulina (tales como regiones Fc de IgG). Puede utilizarse una diversidad de plásmidos, incluyendo plásmidos derivados de plásmidos disponibles comercialmente, tales como pIE 1-1 (Novagen). Los vectores pIE11 y pIE1-2 están diseñados para la expresión constitutiva de proteínas recombinantes desde el promotor ie1 de baculovirus en células de insecto transformadas establemente (1). Los plásmidos difieren únicamente en la orientación de los múltiples sitios de clonación y contienen todas las secuencias de promotor que es conocido que resultan importantes para la expresión génica mediada por ie1 en células de insecto no infectadas, así como el elemento intensificador hr5. pIE1-1 y pIE1-2 incluyen el sitio de inicio de traducción y pueden utilizarse para producir proteínas de fusión. Brevemente, la secuencia deseada de la parte deseada de la secuencia (tal como la secuencia codificante del dominio extracelular de una proteína transmembranal) se amplifica por PCR con cebadores complementarios a las regiones 5' y 3'. El cebador 5' puede incorporar sitios de enzima de restricción (seleccionados) flanqueantes. A continuación, el producto se digiere con esos enzimas de restricción seleccionados y se subclona en el vector de expresión. Por ejemplo, los derivados de pIE1-1 pueden incluir la región Fc de IgG humana (pb.PH.IgG) o una etiqueta de 8 histidinas (pb.PH.His) más abajo (3'-Of) de la secuencia deseada. Preferentemente, el constructo vector se secuencia para la confirmación.

Las células High-5 se cultivan hasta una confluencia del 50% bajo las condiciones siguientes: 27ºC, sin CO_{2}, sin pen./strep. Para cada placa de 150 mm, se mezclaron 30 \mug de vector basado en pIE que contenía la secuencia con 1 ml de medio Ex-Cell (medios: Ex-Cell 401 + 1/100 de L-glu, JRH Biosciences nº 14401-78P (nota: este medio es fotosensible)), y en un tubo separado, se mezclaron 100 \mul de CellFectin (CellFECTIN, Gibco BRL nº 10362-010) (mezclado con vórtex)) con 1 ml de medio Ex-Cell. Las dos soluciones se agruparon y se dejaron incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos. Se añadieron 8 ml de medio Ex-Cell a los 2 ml de mezcla de ADN/CellFECTIN y ésta se utilizó para recubrir células high-5 que habían sido lavadas una vez con medio Ex-Cell. A continuación, la placa se incubó en la oscuridad durante 1 hora a temperatura ambiente. La mezcla de ADN/CellFectin seguidamente se aspiró, y las células se lavaron una vez con Ex-Cell para eliminar el exceso de CellFECTIN, se añadieron 30 ml de medio Ex-Cell fresco y las células se incubaron durante 3 días a 28ºC. Se recolectó el sobrenadante y se determinó la expresión de la secuencia en el vector de expresión baculovirus mediante unión por lotes de 1 ml de sobrenadante a 25 ml de perlas de Ni^{2+}-NTA (Qiagen) para las proteínas etiquetadas con histidina o perlas de proteína A-sefarosa CL-4B (Pharmacia) para las proteínas etiquetadas con IgG, seguido de análisis de SDS-PAGE comparando una concentración conocida de estándar de proteína mediante tinción con azul de Coomassie.

El medio acondicionado de las células transfectadas (0,5 a 3 litros) se recolectó mediante centrifugación para separar las células y se filtró a través de filtros de 0,22 micrómetros. Para los constructos etiquetados con poli-His, la proteína que comprendía la secuencia se purificó utilizando una columna de Ni^{2+}-NTA (Qiagen). Antes de la purificación, se añadió imidazol al medio acondicionado hasta una concentración de 5 mM. El medio acondicionado se bombeó por una columna de Ni^{2+}-NTA de 6 ml equilibrada en tampón Hepes 20 ml, pH 7,4, que contenía NaCl 0,3 M e imidazol 5 mM a un caudal de 4 a 5 ml/minutos a 48ºC. Tras la carga, la columna se lavó con tampón de equilibración adicional y la proteína eluida con tampón de equilibración que contenía imidazol 0,25 M. La proteína altamente purificada seguidamente se desaló en un tampón de almacenamiento que contenía Hepes 10 mM, NaCl 0,14 M y manitol al 4%, pH 6,8, con una columna G25 Superfine de 25 ml (Pharmacia) y se almacenó a -80ºC.

Se purificaron constructos de inmunoadhesina (que contenía Fc) a partir del medio acondicionado de la manera siguiente. El medio acondicionado se bombeó por una columna de proteína A de 5 ml (Pharmacia) que había sido equilibrada en tampón fosfato de Na 20 mM, pH 6,8. Tras la carga, la columna se lavó extensivamente con tampón de equilibración antes de la elución con ácido cítrico 100 mM, pH 3,5. La proteína eluida se neutralizó inmediatamente recogiendo fracciones de 1 ml en tubos que contenía 275 ml de tampón Tris 1 M, pH 9. La proteína altamente purificada posteriormente se desaló en tampón de almacenamiento, tal como se ha descrito anteriormente para las proteínas etiquetadas con poli-His. La homogeneidad de la secuencia se evaluó con geles de SDS-poliacrilamida y mediante secuenciación de aminoácidos N-terminales por la degradación de Edman y otros procedimientos analíticos según se desease o resultase necesario.

Se expresó PRO211 utilizando el procedimiento con baculovirus anterior utilizando células high-5.

Ejemplo 6 Preparación de anticuerpos que se unen a PRO211

El presente ejemplo ilustra la preparación de anticuerpos monoclonales que se pueden unir específicamente a PRO211.

Las técnicas para producir los anticuerpos monoclonales son conocidas de la técnica y se describen, por ejemplo, en Goding, supra. Entre los inmunógenos que pueden utilizarse se incluyen las proteínas de fusión de PRO211 que contienen PRO211 y las células que expresan PRO211 recombinante sobre la superficie celular. El experto en la materia puede llevar a cabo la selección del inmunógeno sin experimentación excesiva.

Los ratones, tales como Balb/c, se inmunizan con el inmunógeno PRO211 emulsionado con adyuvante incompleto de Freund e inyectado subcutáneamente o intraperitonealmente en una cantidad de entre 1 y 100 microgramos. Alternativamente, el inmunógeno se emulsiona en adyuvante MPL-TDM (Ribi Immunochemical Research, Hamilton, MT) y se inyecta en las almohadillas plantares de las patas traseras del animal. Los ratones inmunizados seguidamente reciben un refuerzo 10 a 12 días después con inmunógeno adicional emulsionado en el adyuvante seleccionado. Después, durante varias semanas, los ratones también pueden recibir inyecciones de inmunización adicionales. Pueden obtenerse periódicamente muestras de suero de los ratones mediante sangrado retroorbital para su análisis en ensayos ELISA para la detección de anticuerpos anti-PRO211.

Tras detectar un título de anticuerpos adecuado, los animales "positivos" para los anticuerpos pueden inyectarse con una inyección intravenosa final de PRO211. Tres a cuatro días después, los ratones son sacrificados y se recolectan las células de bazo. Las células de bazo después se fusionan (utilizando polietilenglicol al 35%) a una línea celular seleccionada de mieloma murino, tal como P3X63AgU.1, disponible de ATCC, nº CRL 1597. Las fusiones generan células de hibridoma que después pueden sembrarse en placas de cultivo de tejido de 96 pocillos que contienen medio HAT (hipoxantina, aminopterina y timidina) para inhibir la proliferación de las células no fusionadas, los híbridos de mieloma y los híbridos de células de bazo.

Las células de hibridoma pueden cribarse en una ELISA para su reactividad contra PRO211. La determinación de las células de hibridoma "positivas" que segregan los anticuerpos monoclonales deseados contra PRO211 se encuentran dentro de los conocimientos del experto en la materia.

Las células de hibridoma positivas pueden inyectarse intraperitonealmente en ratones Balb/c singénicos para producir ascites que contiene los anticuerpos monoclonales anti-PRO211. Alternativamente, pueden cultivarse células de hibridoma en matraces de cultivo de tejidos o botellas de cultivo. La purificación de los anticuerpos monoclonales producidos en el ascites puede conseguirse mediante precipitación con sulfato amónico, seguido de cromatografía de exclusión en gel. Alternativamente, puede utilizarse la cromatografía de afinidad basada en la unión del anticuerpo a proteína A o a proteína G.

Ejemplo 7 Purificación de polipéptidos PRO211 utilizando anticuerpos específicos

Pueden purificarse los polipéptidos PRO211 nativos o recombinantes mediante una diversidad de técnicas estándar en la técnica de la purificación de proteínas. Por ejemplo, se purifica polipéptido pro-PRO211, polipéptido PRO211 maduro o polipéptido pre-PRO211 mediante cromatografía de inmunoafinidad utilizando anticuerpos específicos para el polipéptido PRO211 de interés. En general, se construye una columna de inmunoafinidad acoplando covalentemente el anticuerpo anti-polipéptido PRO211 a una resina cromatográfica activada.

Se preparan inmunoglobulinas policlonales a partir de sueros inmunológicos mediante precipitación con sulfato amónico o mediante purificación en proteína A inmovilizada (Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, N.J.). De manera similar, se preparan anticuerpos monoclonales a partir de líquido ascites de ratón mediante precipitación con sulfato amónico o cromatografía en proteína A inmovilizada. Se une covalentemente una inmunoglobulina parcialmente purificada a una resina cromatográfica, tal como SEPHAROSE^{TM} activada con CnBr (Pharmacia LKB Biotechnology). El anticuerpo se acopla a la resina, la resina se bloquea, y la resina derivada se lava siguiendo las instrucciones del fabricante.

Esta columna de inmunoafinidad se utiliza en la purificación del polipéptido PRO211 mediante la preparación de una fracción de células que contienen el polipéptido PRO211 en una forma soluble. Esta preparación se deriva mediante solubilización de la célula completa o de una fracción subcelular obtenida a través de la centrifugación diferencial mediante la adición de detergente o mediante otros procedimientos bien conocidos de la técnica. Alternativamente, puede secretarse polipéptido PRO211 soluble que contiene una secuencia de señal en una cantidad útil hacia el medio en el que se cultivan las células.

Se pasa por una columna de inmunoafinidad una preparación que contiene polipéptido PRO211 soluble, y la columna se lava bajo condiciones que permiten la absorbancia preferente del polipéptido PRO211 (por ejemplo tampones de elevada fuerza iónica en presencia de detergente). A continuación, la columna se eluye bajo condiciones que alteran la unión de anticuerpo/polipéptido PRO211 (por ejemplo un tampón de pH reducido, tal como aproximadamente pH 2 a 3, o una concentración elevada de un caótropo, tal como urea o ion tiocianato) y se recoge el polipéptido
PRO211.

Ejemplo 8 Cribado de fármacos

La presente invención resulta particularmente útil para cribar compuestos mediante la utilización de polipéptidos PRO211 o un fragmento de unión de los mismos mediante cualquiera de entre una diversidad de técnicas de cribado de fármacos. El polipéptido PRO211 o fragmento utilizando en este ensayo puede encontrarse libre en solución, fijo a un soporte sólido, transportado sobre una superficie celular, o encontrarse localizado dentro de la célula. Un procedimiento de cribado de fármacos utiliza células huésped eucarióticas o procarióticas que se transforman establemente con ácidos nucleicos recombinantes que expresan el polipéptido PRO211 o un fragmento del mismo. Los fármacos se criban contra estas células transformadas en ensayos de unión competitiva. Estas células, sea en forma viable o fijas, pueden utilizarse para los ensayos de unión estándar. Un ensayo puede medir, por ejemplo, la formación de complejos entre un polipéptido PRO211 o un fragmento y el agente que se somete a ensayo. Alternativamente, puede examinarse la disminución de la formación de complejo entre el polipéptido PRO211 y su célula diana o receptores diana, causados por el agente que se somete a ensayo.

De esta manera, la presente invención proporciona procedimientos de cribado de fármacos o de cualquier otro agente que pueden afectar a una enfermedad o condición asociada al polipéptido PRO211. Estos procedimientos comprenden poner en contacto dicho agente con un polipéptido PRO211 o fragmento del mismo y someterlo a ensayo para (i) la presencia de un complejo entre el agente y el polipéptido PRO211 o fragmento del mismo, o (ii) presencia de un complejo entre el polipéptido PRO211 o fragmento del mismo y la célula, mediante procedimientos conocidos de la técnica. En estos ensayos de unión competitiva, el polipéptido PRO211 o fragmento habitualmente se marca. Tras una incubación adecuada, el polipéptido POR211 libre o fragmento del mismo se separada del que se encuentra presente en forma unida, y la cantidad de marcaje libre o no acomplejado constituye una medida de la capacidad de ese agente particular de unirse al polipéptido PRO211 o de interferir con el complejo de polipéptido PRO211/célula.

Otra técnica para el cribado de fármacos proporciona el cribado de alto rendimiento para compuestos que presentan una afinidad de unión adecuada con un polipéptido, y se describe en detalle en la patente WO nº 84/03564, publicada el 13 de septiembre de 1984. Para describirla brevemente, se sintetiza un gran número de diferentes péptidos pequeños que son compuestos de ensayo sobre un sustrato sólido, tal como clavos de plástico o alguna otra superficie. A medida que se aplican al polipéptido PRO211, los compuestos péptido de ensayo se hacen reaccionar con el polipéptido PRO211 y se lavan. El polipéptido PRO211 unido se detecta mediante procedimiento bien conocidos de la técnica. El polipéptido PRO211 purificado también puede recubrirse directamente sobre placas para la utilización en las técnicas de cribado de fármacos anteriormente indicadas. Además, pueden utilizarse anticuerpos no neutralizantes para capturar el péptido e inmovilizarlo sobre el soporte sólido.

La presente invención también contempla la utilización de ensayos de cribado competitivo de fármacos en los que anticuerpos neutralizantes capaces de unirse a un polipéptido PRO211 compiten específicamente con un compuesto de ensayo para la unión con el polipéptido PRO211 o fragmentos del mismo. De esta manera, los anticuerpos pueden utilizarse para detectar la presencia de cualquier péptido que comparte uno o más determinantes antigénicos con un polipéptido PRO211.

Ejemplo 9 Diseño racional de fármacos

El objetivo del diseño racional de fármacos es producir análogos estructurales de un polipéptido biológicamente activo de interés (es decir, un polipéptido PRO211) o de moléculas de tamaño reducido con las que interaccionan, por ejemplo agonistas, antagonistas o inhibidores. Cualquiera de estos ejemplos puede utilizarse para diseñar fármacos que resultan más activos o formas estables del polipéptido PRO211 o que intensifican o interfieren con la función del polipéptido PRO211 in vivo (c.f. Hodgson, Bio/Technology 9:12-21, 1991).

En un enfoque, se determina la estructura tridimensional del polipéptido PRO211, o de un complejo de polipéptido PRO211-inhibidor, mediante cristalografía de rayos X, mediante modelado por ordenador, o más habitualmente, mediante una combinación de los dos enfoques. Tanto la forma como las cargas del polipéptido PRO211 deben determinarse para elucidar la estructura y para determinar el sitio o sitios activos de la molécula. Menos frecuentemente, puede obtenerse información útil sobre la estructura del polipéptido PRO2211 mediante el modelado basado en la estructura de proteínas homólogas. En ambos casos, se utiliza la información estructural relevante para diseñar moléculas análogas similares al polipéptido PRO211 o para identificar inhibidores eficientes. Entre los ejemplos útiles de diseño racional de fármacos se incluyen las moléculas que presentan una actividad o una estabilidad mejoradas, tal como describen Braxton y Wells, Biochemistry 31:7796-7801, 1992, o que actúan como inhibidores, agonistas o antagonistas de péptidos nativos, tal como describen Athauda et al., J. Biochem. 113:742-746,
1993.

También resulta posible aislar un anticuerpo específico de diana, seleccionado mediante un ensayo funcional, tal como se ha descrito anteriormente, y después resolver su estructura cristalina. Este enfoque, en principio, proporciona un fármaco nuclear a partir del que se puede basar el posterior diseño de fármacos. Resulta posible evitar por completo la cristalografía de la proteína generando anticuerpos antiidiotípicos (anti-ids) contra un anticuerpo funcional farmacológicamente activo. Como imagen especular de una imagen especular, el sitio de unión de los anti-ids previsiblemente resultaría un análogo del receptor original. El anti-id seguidamente podría utilizarse para identificar y para aislar péptidos a partir de bancos de péptidos producidos química o biológicamente. Los péptidos aislados después podrían actuar como el fármaco nuclear.

En virtud de la presente invención, pueden proporcionarse suficientes cantidades del polipéptido PRO211 para llevar a cabo estudios analíticos tales como la cristalografía de rayos X. Además, el conocimiento de la secuencia de aminoácidos del polipéptido PRO211 proporcionada en la presente invención proporcionará directrices a aquellos que utilizan técnicas de modelado por ordenador en lugar de, o además de, la cristalografía de rayos X.

Ejemplo 10 Ensayo antitumoral in vitro

La actividad antiproliferativa de los polipéptidos PRO211 se determinó en el ensayo experimental in vitro de búsqueda de fármacos anticáncer orientada a enfermedades del National Cancer Institute (NCI), utilizando un ensayo de unión con pigmento sulforodamina B (SRB) esencialmente tal como describen Skehan et al., J. Natl. Cancer Inst. 82:1107-1112, 1990. Las 60 líneas celulares tumorales utilizadas en este estudio ("el panel de la NCI"), así como las condiciones para su mantenimiento y cultivo in vitro, han sido descritas por Monks et al., J. Natl. Cancer Inst. 83:757-766, 1991. El propósito de este cribado es evaluar inicialmente la actividad citotóxica y/o citostática de los compuestos de ensayo frente a diferentes tipos de tumores (Monks et al., supra; Boyd, Cancer Princ. Pract. Oncol. Update 3(10):1-12, 1989).

Se recolectaron células de aproximadamente 60 líneas celulares tumorales humanas con tripsina/EDTA (Gibco), se lavaron una vez, se resuspendieron en IMEM y se determinó su viabilidad. Las suspensiones celulares se añadieron mediante pipeta (volumen: 100 \mul) a placas de microtitulación separadas de 96 pocillos. La densidad celular para la incubación de 6 días era inferior a la de la incubación de 2 días para evitar el crecimiento excesivo. Los inóculos se dejaron reposar durante un periodo preincubación de 24 horas a 37ºC para su estabilización. En el tiempo 0 se añadieron diluciones al doble de la concentración de ensayo deseada en alícuotas de 100 \mul a los pocillos de la placa de microtitulación (dilución 1:2). Los compuestos de ensayo se evaluaron a 5 diluciones semilogarítmicas (1.000 a 100.000 veces). Las incubaciones tuvieron lugar durante dos días y durante seis días en una atmósfera de 5% de CO_{2} y de 100% de humedad.

Tras la incubación, el separó el medio y las células se fijaron en 0,1 ml de ácido tricloroacético al 10% a 40ºC. Las placas se enjuagaron cinco veces con agua desionizada, se tiñeron durante 30 minutos con 0,1 ml de pigmento sulforodamina B al 0,4% (Sigma) disuelto en ácido acético al 1%, se enjuagaron cuatro veces con ácido acético al 1% para eliminar el pigmento no unido, se secaron, y se extrajo el pigmento durante cinco minutos con 0,1 ml de base Tris 10 mM (tris(hidroximetil)aminometano), pH 10,5. La absorbancia (DO) de la sulforodamina a 492 nm se midió utilizando un lector de placas de microtitulación de 96 pocillos conectado a un ordenador.

Se consideró que una muestra de ensayo era positiva si mostraba un efecto de inhibidor de por lo menos el 40% a una o más concentraciones. Los resultados se muestran en la Tabla 5 siguiente, en la que las abreviaturas de tipo de célula tumoral son las siguientes:

NSCL = carcinoma pulmonar de células no pequeñas; SNC = sistema nervioso central

TABLA 5

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19

20

Depósito de material

Los materiales siguientes han sido depositados en la American Type Culture Collection, 10801 University Blvd., Manassas, VA 201 10-2209, USA (ATCC):

Material	nº de dep. ATCC	Fecha de depósito
DNA32292-1131	209258	16 de septiembre de 1997

Estos depósitos se realizaron bajo las disposiciones del Tratado de Budapest acerca del reconocimiento internacional del depósito de microorganismos a los fines del procedimiento en materia de patentes y las regulaciones en virtud del mismo (Tratado de Budapest). Este tratado garantiza el mantenimiento de un cultivo viable del depósito durante 30 años desde la fecha de depósito. Los depósitos serán proporcionados por la ATCC bajo los términos del Tratado de Budapest, y bajo un acuerdo entre Genentech Inc. y la ATCC, que garantiza una disponibilidad permanente y no limitada de la progenie del cultivo del depósito para el público tras concederse la patente US pertinente, o tras abrir al público cualquier solicitud de patente US o extranjera, lo que ocurra primero, y garantiza la disponibilidad de la progenie para una persona que el U.S. Commissioner of Patentes and Trademarks determinará que posee el derecho a ello de conformidad con la disposición 35 U.S.C. 122 y las normas del comisario al amparo de la misma (incluyendo la disposición 37 CFR 1.14, con referencia particular a la disposición 886 OG 638).

El cesionario de la presente solicitud ha acordado que si un cultivo de los materiales bajo depósito muriese o se perdiese o resultase destruido estando en cultivo bajo las condiciones adecuadas, los materiales serán inmediatamente sustituidos tras su advertimiento por otro cultivo igual. La disponibilidad del material depositado no debe interpretarse como una licencia para la práctica de la invención en contravención de los derechos concedidos bajo la autoridad de cualquier gobierno de acuerdo con su legislación en materia de patentes.

La especificación escrita anterior se considera suficiente para permitir que un experto en la materia ponga en práctica la invención. La presente invención no se encuentra limitada en su alcance por el constructo depositado, debido a que la realización depositada se proporciona únicamente a título ilustrativo de determinados aspectos de la invención. El depósito del material de la presente invención no constituye un reconocimiento de que la descripción escrita contenida en la presente memoria resulta inadecuada para permitir la práctica de cualquier aspecto de la invención, incluyendo el mejor modo de la misma, ni debe interpretarse como limitativa del alcance de las reivindicaciones de las ilustraciones específicas que representa. En efecto, resultarán evidentes para los expertos en la materia diversas modificaciones además de aquéllas mostradas y descritas en la presente memoria, a partir de la descripción anterior, y éstas se encuentran comprendidas dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

<110> Genentech, Inc.

\hskip1cm

Ashkenazi, Avi

\hskip1cm

Goddard, Audrey

\hskip1cm

Gurney, Austin L.

\hskip1cm

Klein, Robert D.

\hskip1cm

Napier, Mary

\hskip1cm

Wood, William I.

\hskip1cm

Yuan, Jean

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<120> PROCEDIMIENTOS Y COMPOSICIÓN PARA LA INHIBICIÓN DEL CRECIMIENTO CELULAR NEOPLÁSICO

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<130> P1694R1 PCT

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<140> PCT/US99/23089

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<141> 1999-10-05

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<150> US 60/104.080

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<151> 1998-10-13

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<160> 5

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<210> 1

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<211> 1364

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 1

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21

22

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<210> 2

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<211> 353

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 2

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23

24

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<210> 3

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<211> 21

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Sonda de oligonucleótidos sintéticos

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<400> 3

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\hskip-.1em\dddseqskip

agagtgtatc tctggctacg c

\hfill

21

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<210> 4

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<211> 22

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Sonda de oligonucleótidos sintéticos

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<400> 4

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\hskip-.1em\dddseqskip

taagtccggc acattacagg tc

\hfill

22

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<210> 5

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<211> 45

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Sonda de oligonucleótidos sintéticos

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<400> 5

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\hskip-.1em\dddseqskip

agggagcacg gacagtgtgc agatgtggac gagtgctcac tagca

\hfill

45

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Claims (10)

1. Utilización de un polipéptido PRO211 o agonista del mismo en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un tumor en un mamífero mediante inhibición directa de la proliferación de las células tumorales,

en la que dicho polipéptido PRO211 comprende una identidad de secuencia de aminoácidos de por lo menos el 80% con (a) los residuos 1 o aproximadamente 25 a 353 del polipéptido PRO211 mostrado en la figura 2 (SEC ID nº 2), o (b) X a 353 del polipéptido PRO211 mostrado en la figura 2 (SEC ID nº 2), en el que X es cualquier residuo mainoácido entre 20 y 29 de la figura 2 (SEC ID nº 2) y en el que dicho agonista es un anticuerpo agonista contra dicho polipéptido PRO211 o un fragmento del polipéptido PRO211 mostrado en la figura 2 (SEC ID nº 2).

2. Utilización según la reivindicación 1, en la que el medicamento comprende una cantidad citotóxica de dicho polipéptido PRO211, o dicho agonista del mismo.

3. Utilización según la reivindicación 1 ó 2, en el que el medicamento comprende además un agente inhibidor del crecimiento, agente citotóxico o agente quimioterapéutico adicional.

4. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicho polipéptido PRO211 comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 2 (SEC ID nº 2).

5. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicho tumor es un cáncer.

6. Utilización según la reivindicación 5, en la que el cáncer se selecciona de entre el grupo que consiste en cáncer de mama, cáncer ovárico, cáncer renal, cáncer colorrectal, cáncer uterino, cáncer de próstata, cáncer de pulmón, cáncer de vejiga, cáncer del sistema nervioso central, melanoma y leucemia.

7. Procedimiento para la inhibición del crecimiento de una célula tumoral, que comprende exponer dicha célula tumoral a una cantidad eficaz de un polipéptido PRO211 o agonista del mismo, según se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicha etapa de exposición se lleva a cabo in vitro.

8. Artículo manufacturado, que comprende:

un recipiente,

una composición que comprende un ingrediente activo contenido dentro del recipiente, en el que dicho ingrediente activo en la composición es un polipéptido PRO211 o agonista del mismo, según se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4; y una etiqueta en el recipiente o asociada al mismo, indicando la etiqueta que la composición es para la utilización según se define cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6; o

un folleto en el paquete con instrucciones para la utilización según se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

9. Artículo manufacturado según la reivindicación 8, en el que el agente activo se encuentra presente en una cantidad que resulta eficaz para el tratamiento de un tumor en un mamífero.

10. Artículo manufacturado según la reivindicación 8 ó 9, en el que dicha composición comprende además un agente inhibidor del crecimiento, agente citotóxico o agente quimioterapéutico adicional.