DE69936234T2 - Verfahren und Zusammenstzung zur Hemmung des Wachtums von neoplastischen Zellen - Google Patents

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Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren und Zusammensetzungen zur Inhibierung von neoplastischem Zellwachstum. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung Antitumorzusammensetzungen und Verfahren zur Behandlung von Tumoren. Die Erfindung betrifft ferner Screeningverfahren zur Identifikation von wachstumshemmenden Verbindungen, z.B. von Antitumor-Verbindungen.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Maligne Tumoren (Krebs) sind, nach Herzerkrankungen, die zweithäufigste Todesursache in den Vereinigten Staaten (Boring et al., CA Cancel J. Clin. 43, 7 (1993)).
  • Krebs ist gekennzeichnet durch das Anwachsen der Anzahl an abnormalen oder neoplastischen Zellen, die aus einem normalen Gewebe stammen und proliferieren, um eine Tumormasse zu bilden, durch den Befall benachbarter Gewebe durch diese neoplastischen Tumorzellen und durch die Bildung maligner Zellen, die sich schließlich über das Blut- oder Lymphsystem auf regionale Lymphknoten und auf entfernte Stellen ausbreiten (Metastasenbildung). Im Erkrankungszustand von Krebs proliferiert eine Zelle unter Bedingungen, unter denen sich normale Zellen nicht vermehren würden. Krebs manifestiert sich in zahlreichen verschiedenen Formen, die durch verschiedene Grade an Invasivität und Aggressivität gekennzeichnet sind.
  • Trotz jüngster Fortschritte im Bereich der Krebstherapie gibt es einen großen Bedarf an neuen therapeutischen Mitteln, die in der Lage sind, neoplastisches Zellwachstum zu inhibieren. Folglich ist es das Ziel der vorliegenden Erfindung, Verbindungen zu identifizieren, die in der Lage sind, das Wachstum neoplastischer Zellen, wie etwa Krebszellen, zu inhibieren.
  • Die EP 0861.894 A1 beschreibt ein Polypeptid, das als menschliches Delta-1 bezeichnet wird, sowie Varianten davon und Antikörper dagegen. Das Polypeptid wird in Bezug auf die Unterdrückung der Differenzierung von undifferenzierten Blutkörper chen erläutert, und es wird davon ausgegangen, dass es in der Medizin und in der medizinischen Versorgung zweckdienlich sein wird.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Zusammensetzungen zur Inhibierung von neoplastischem Zellwachstum und zugehörige Verwendungen. Insbesondere betrifft die Erfindung Zusammensetzungen zur Behandlung von Tumoren, einschließlich Krebsarten, wie z.B. Brust-, Prostata-, Kolon-, Lungen-, Ovarial-, Nieren- und ZNS-Krebs, Leukämie, Melanom usw., in Säugetierpatienten, vorzugsweise Menschen, sowie zugehörige Verwendungen.
  • In einem Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung Materialzusammensetzungen, die zur Inhibierung von neoplastischem Zellwachstum nützlich sind und eine wirksame Menge eines PRO172-Polypeptids oder eines Fragments davon, wie in den Ansprüchen definiert, im Gemisch mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger umfassen. in einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Materialzusammensetzung eine das Wachstum hemmende Menge eines PRO172-Polypeptids oder eines Fragments davon. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfasst die Zusammensetzung eine zytotoxische Menge eines PRO172-Polypeptids oder eines Fragments davon. Die Materialzusammensetzungen enthalten ein oder mehrere zusätzliche wachstumshemmende und/oder zytotoxische und/oder andere chemotherapeutische Mittel.
  • In einem weiteren Aspekt, wie in den Ansprüchen definiert, betrifft die Erfindung ein In-vitro-Verfahren zur Inhibierung des Wachstums einer Tumorzelle, umfassend das Aussetzen der Zelle gegenüber einer wirksamen Menge eines PRO172-Polypeptids oder eines Fragments davon.
  • In wiederum einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung einen- Herstellungsartikel, umfassend:
    ein Behältnis; und
    eine Zusammensetzung, umfassend einen Wirkstoff, der im Behältnis enthalten ist, worin die Zusammensetzung zur Inhibierung des neoplastischen Zellwachstums, z.B. des Wachstums von Tumorzellen, wirksam ist und der Wirkstoff in der Zusammensetzung ein PRO172-Polypeptid oder ein Fragment davon, wie in den Ansprüchen definiert, Ist. Ähnliche Herstellungsartikel, die ein PRO172-Polypeptid oder ein Fragment davon, wie in den Ansprüchen definiert, in einer Menge umfassen, die zur Behandlung von Tumoren therapeutisch wirksam ist, liegen ebenfalls im Schutzumfang der vorliegenden Erfindung. Die Herstellungsartikel umfassen ein PRO172-Polypeptid oder ein Fragment davon und ein weiteres wachstumshemmendes Mittel, zytotoxisches Mittel oder chemotherapeutisches Mittel.
  • KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • Die 1A-B zeigen eine Nucleotidsequenz (Seq.-ID Nr. 1) einer Nativsequenz-PRO172-cDNA, worin Seq.-ID Nr. 1 ein Klon ist, der hierin als „DNA35916-1161" bezeichnet wird.
  • 2 zeigt die Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 2), die von der kodierenden Sequenz der in den 1A-B gezeigten Seq.-ID Nr. 1 abgeleitet ist.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die Bezeichnung „PRO172"-Polypeptid oder -Protein, wie hierin verwendet, umfasst Nativsequenz-PRO172-Varianten (die hierin noch näher definiert werden). Das PRO-172-Polypeptid kann aus zahlreichen verschiedenen Quellen isoliert werden, wie z.B. aus menschlichen Gewebetypen oder aus einer anderen Quelle, oder es kann mittels Rekombinations- und/oder Syntheseverfahren hergestellt werden.
  • Ein „Nativsequenz-PRO172" umfasst ein Polypeptid mit derselben Aminosäuresequenz wie PRO172-Polypeptid, das aus der Natur stammt. Solch ein Nativsequenz-PRO172-Polypeptid kann aus der Natur isoliert werden oder kann mittels Rekombinations- und/oder Syntheseverfahren produziert werden. Die Bezeichnung „Nativsequenz"-PRO172 umfasst insbesondere natürlich vorkommende trunkierte oder sekretierte Formen (z.B. eine Sequenz einer extrazellulären Domäne), natürlich vorkommende variable Formen (z.B. alternativ gespleißte Formen) und natürlich vorkommende Allelvarianten des PRO172-Polypeptids. In einer Ausführungsform der Erfindung ist das Nativsequenz-PRO172-Polypeptid ein reifes oder Volllängen-Nativsequenz-PRO172-Polypeptid, wie es in 2 gezeigt ist (Seq.-ID Nr. 2). Es ist jedoch, auch wenn das in 2 offenbarte PRO172-Polypeptid (Seq.-ID Nr. 2) als eines gezeigt ist, das mit dem hierin als Aminosäureposition 1 bezeichneten Methioninrest beginnt, ebenfalls denkbar und möglich, dass ein anderer Methioninrest, der stromauf oder stromab von Aminosäureposition 1 in 2 (Seq.-ID Nr. 2) liegt, als Start-Aminosäurerest für das PRO172-Polypeptid verwendet werden kann.
  • Die „extrazelluläre Domäne" oder „ECD” eines hierin offenbarten Polypeptids bezieht sich auf eine Form des Polypeptids, die im Wesentlichen frei von Transmembran- und zytoplasmatischen Domänen ist. Üblicherweise weist eine Polypeptid-ECD weniger als etwa 1 % solcher Transmembran- und/oder zytoplasmatischer Domänen auf, vorzugsweise weniger als etwa 0,5 % solcher Domänen. Es gilt zu verstehen, dass jegliche Transmembrandomäne(n), die für die Polypeptide der vorliegenden Erfindung identifiziert werden, gemäß Kriterien identifiziert werden, die auf dem Gebiet der Erfindung üblicherweise zur Identifizierung dieses Typs von hydrophober Domäne verwendet werden. Die exakten Grenzen einer Transmembrandomäne können variieren, sehr wahrscheinlich jedoch nicht um mehr als etwa 5 Aminosäuren an beiden Enden der Domäne, wie ursprünglich identifiziert und in den beiliegenden Figuren gezeigt wird. Als solche umfasst in einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung die extrazelluläre Domäne eines Polypeptids der vorliegenden Erfindung die Aminosäuren 1 bis X der reifen Aminosäuresequenz, worin X für eine beliebige Aminosäure innerhalb von 5 Aminosäuren an beiden Seiten der Grenze der extrazellulären Domäne/Transmembrandomäne steht.
  • Die ungefähre Lage des „Signalpeptids" der hierin offenbarten PRO172-Polypeptide wird in den beiliegenden Figuren gezeigt. Es sei jedoch angemerkt, dass die C-terminale Grenze eines Signalpeptids variieren kann, jedoch sehr wahrscheinlich nicht mehr als um etwa 5 Aminosäuren an beiden Seiten der C-terminalen Grenze des Signalpeptids, wie anfänglich hierin identifiziert, worin die C-terminale Grenze des Signalpeptids gemäß den Kriterien identifiziert werden kann, die üblicherweise auf dem Gebiet der Erfindung zur Identifikation dieses Typs von Aminosäuresequenzelementen verwendet werden (z.B. Nielsen et al., Prot. Eng. 10, 1-6 (1997), und von Heinje et al., Nucl. Acids. Res.14, 4683-4690 (1986)). Darüber hinaus ist auch bekannt, dass in manchen Fällen die Abspaltung einer Signalsequenz von einem sekretierten Polypeptid nicht vollkommen gleichförmig geschieht, was zu mehr als einer sekretierten Spezies führt. Diese reifen Polypeptide, bei denen das Signalpeptid innerhalb von nicht mehr als etwa 5 Aminosäuren an jeder Seite der C-terminalen Grenze des Signalpeptids, wie hierin identifiziert, gespalten wird, und die dafür kodierenden Polynucleotide werden in der vorliegenden Erfindung behandelt.
  • „PRO172-Polypeptidvariante" bezeichnet ein aktives PRO172-Polypeptid (das kein Nativsequenz-PRO172-Polypeptid ist), wie nachstehend definiert, mit zumindest etwa 80 % Aminosäuresequenzidentität mit der Aminosäuresequenz von: (a) den Resten 1 oder etwa 22 bis 723 des in 2 gezeigten PRO172-Polypeptids (Seq.-ID Nr. 2), (b) X bis 723 des in 2 gezeigten PRO172-Polypeptids (Seq.-ID Nr. 2), worin X für einen beliebigen Aminosäurerest von 17 bis 26 aus 2 (Seq.-ID Nr. 2) steht, (c) 1 oder etwa 22 bis X aus 2 (Seq.-ID Nr. 2), worin X für einen beliebigen Aminosäurerest von Aminosäure 543 bis Aminosäure 552 aus 2 (Seq.-ID Nr. 2) steht, oder (d) einem anderen spezifisch abgeleiteten Fragment der in 2 gezeigten Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 2).
  • Solche PRO172-Varianten umfassen beispielsweise PRO172-Polypeptide, in denen ein oder mehrere Aminosäurereste am N- oder C-Terminus sowie innerhalb einer oder mehrerer innen gelegenen Domänen der Nativsequenz hinzugefügt oder deletiert sind.
  • Üblicherweise weist eine PRO172-Variante zumindest etwa 80 % Aminosäuresequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 81 % Aminosäuresequenzidentitat, noch bevorzugter zumindest etwa 82 % Aminosäuresequenzidentität, noch be vorzugter zumindest etwa 83 % Aminosäuresequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 84 % Aminosäuresequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 85 % Aminosäuresequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 86 % Aminosäuresequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 87 % Aminosäuresequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 88 % Aminosäuresequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 89 % Aminosäuresequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 90 % Aminosäuresequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 91 % Aminosäuresequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 92 % Aminosäuresequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 93 % Aminosäuresequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 94 % Aminosäuresequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 95 % Aminosäuresequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 96 % Aminosäuresequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 97 % Aminosäuresequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 98 % Aminosäuresequenzidentität, und wiederum noch bevorzugter zumindest etwa 99 % Aminosäuresequenzidentität, mit (a) den Resten 1 oder etwa 22 bis 723 des in 2 gezeigten PRO172-Polypeptids (Seq.-ID Nr. 2), (b) X bis 723 des in 2 gezeigten PRO172-Polypeptids (Seq.-ID Nr. 2), worin X für einen beliebigen Aminosäurerest von 17 bis 26 aus 2 (Seq.-ID Nr. 2) steht, (c) 1 oder etwa 22 bis X aus 2 (Seq.-ID Nr. 2), worin X für einen beliebigen Aminosäurerest von Aminosäure 543 bis Aminosäure 552 aus 2 (Seq.-ID Nr. 2) steht, oder (d) einem anderen spezifisch abgeleiteten Fragment der in 2 gezeigten Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 2) auf.
  • Üblicherweise weisen PRO172-Polypeptidvarianten eine Länge von zumindest etwa 10 Aminosäuren, häufig von zumindest etwa 20 Aminosäuren, noch häufiger von zumindest etwa 30 Aminosäuren, noch häufiger von zumindest etwa 40 Aminosäuren, noch häufiger von zumindest etwa 50 Aminosäuren, noch häufiger von zumindest etwa 60 Aminosäuren, noch häufiger von zumindest etwa 70 Aminosäuren, noch häufiger von zumindest etwa 80 Aminosäuren, noch häufiger von zumindest etwa 90 Aminosäuren, noch häufiger von zumindest etwa 100 Aminosäuren, noch häufiger von zumindest etwa 150 Aminosäuren, noch häufiger von zumindest etwa 200 Amino sauren, noch häufiger von zumindest etwa 250 Aminosäuren, noch häufiger von zumindest etwa 300 Aminosäuren, oder mehr auf.
  • Wie nachstehend gezeigt stellt Tabelle 1 den vollständigen Quellcode für das ALIGN-2-Computerprogramm zum Sequenzvergleich bereit. Dieser Quellcode kann routinemäßig zur Verwendung mit einem UNIX-Betriebssystem kompiliert werden, um das ALIGN-2-Sequenzvergleich-Computerprogramm bereitzustellen.
  • Darüber hinaus zeigen die Tabellen 2A-2B hypothetische Beispiele für die Verwendung des nachstehend beschriebenen Verfahrens zur Bestimmung der prozentuellen Aminosäuresequenzidentität (Tabellen 2A-2B) und der prozentuellen Nucleinsäuresequenzidentität (Tabellen 2C-2D) unter Einsatz des ALIGN-2-Sequenzvergleich-Computerprogramms, worin „PRO" für die Aminosäuresequenz eines hypothetischen PEACH-Polypeptids von Interesse steht, „Vergleichsprotein" für die Aminosäuresequenz eines Polypeptids steht, mit dem das „PRO"-Polypeptid von Interesse verglichen wird, „PRO-DNA" für eine hypothetische PROXXX- oder PROXXX-kodierende Nucleinsäuresequenz von Interesse steht, „Vergleichs-DNA" für die Nucleotidsequenz eines Nucleinsäuremoleküls steht, mit dem das „PRO-DNA"-Nucleinsäuremolekül von Interesse verglichen wird, „X", „Y" und „Z" jeweils für verschiedene hypothetische Aminosäurereste stehen und „N", „L", und „V" jeweils für verschiedene hypothetische Nucleotide stehen. Tabelle 1
    Figure 00080001
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    Figure 00230001
    Figure 00240001
    Tabelle 2A
    PRO XXXXXXXXXXXXXXX (Länge = 15 Aminosäuren)
    Vergleichsprotein XXXXXYYYYYYY (Länge = 12 Aminosäuren)
    • % Aminosäuresequenzidentität = (die Anzahl identisch übereinstimmender Aminosäurereste zwischen den zwei Polypeptidsequenzen wie durch ALIGN-2 bestimmt) dividiert durch (die Gesamtzahl an Aminosäureresten des PRO-Polypeptids) = 5 dividiert durch 15 = 33,3 %
    Tabelle 2B
    PRO XXXXXXXXXX (Länge = 10 Aminosäuren)
    Vergleichsprotein XXXXXYYYYYYZZYZ (Länge = 15 Aminosäuren)
    • % Aminosäuresequenzidentität = (die Anzahl identisch übereinstimmender Aminosäurereste zwischen den zwei Polypeptidsequenzen wie durch ALIGN-2 bestimmt) dividiert durch (die Gesamtzahl an Aminosäureresten des PRO-Polypeptids) = 5 dividiert durch 10 = 50 %
    Tabelle 2C
    PRO-DNA NNNNNNNNNNNNNN (Länge = 14 Nucleotide)
    Vergleichs-DNA NNNNNNLLLLLLLLLL (Länge = 16 Nucleotide)
    • % Nucleinsäuresequenzidentität = (die Anzahl identisch übereinstimmender Nucleotide zwischen den zwei Nucleinsäuresequenzen wie durch ALIGN-2 bestimmt) dividiert durch (die Gesamtzahl an Nucleotiden der PRO-DNA-Nucleinsäuresequenz) = 6 dividiert durch 14 = 42,9 %
    Tabelle 2D
    PRO-DNA NNNNNNNNNNNN (Länge = 12 Nucleotide)
    Vergleichs-DNA NNNNLLLW (Länge = 9 Nucleotide)
    • % Nucleinsäuresequenzidentität = (die Anzahl identisch übereinstimmender Nucleotide zwischen den zwei Nucleinsäuresequenzen wie durch ALIGN-2 bestimmt) dividiert durch (die Gesamtzahl an Nucleotiden der PRO-DNA-Nucleinsäuresequenz) = 4 dividiert durch 12 = 33,3 %
  • „Prozent (%) Aminosäuresequenzidentität” in Bezug auf die hierin identifizierte PRO-172-Polypeptidsequenz ist als der Prozentsatz an Aminosäureresten in einer Kandidatensequenz definiert, die mit den Aminosäureresten in einer PRO172-Sequenz nach Abgleich der Sequenzen und Einführen von Lücken, sofern zur Erreichung maximaler prozentueller Sequenzidentität erforderlich, und ohne Berücksichtigung irgendwelcher konservativer Substitutionen als Teil der Sequenzidentität identisch sind. Abgleich zum Zwecke der Bestimmung der prozentuellen Aminosäuresequenzidentität kann auf verschiedene Arten erreicht werden, die innerhalb des Gebiets der Erfindung liegen, beispielsweise unter Verwendung von allgemein erhältlichen Computerprogrammen wie z.B. BLAST-, BLAST-2-, ALIGN-, ALIGN-2- oder Megalign-Software (DNASTAR). Fachleute können geeignete Parameter zur Messung von Abgleichen bestimmen, einschließlich sämtlicher Algorithmen, die erforderlich sind, um maximalen Abgleich über die volle Länge der zu vergleichenden Sequenzen zu erreichen. Für die vorliegenden Zwecke jedoch werden % Aminosäuresequenzidentitätswerte unter Verwendung des Computerprogramms ALIGN-2 zum Sequenzvergleich wie nachstehend beschrieben erhalten, worin der vollständige Quellcode für das ALIGN-2-Programm in Tabelle 1 bereitgestellt ist. Das ALIGN-2-Computerprogramm zum Sequenzvergleich wurde von Genentech, Inc., entworfen, und der in der nachstehenden Tabelle 1 gezeigte Quellcode wurde mit Benutzerunterlagen im U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559, eingereicht, wo er unter der U.S.-Copyright-Registrierungsnummer TXU510087 registriert ist. Das ALIGN-2-Programm ist über Genentech, Inc., South San Francisco, Kalifornien, öffentlich erhältlich oder kann aus dem in der nachstehenden Tabelle 1 bereitgestellten Quellcode kompiliert werden. Das ALIGN-2-Programm sollte zur Verwendung mit einem UNIX-Betriebssystem, vorzugsweise digital UNIX V4.0D, kompiliert werden. Alle Sequenzvergleichsparameter sind durch das ALIGN-2-Programm festgesetzt und variieren nicht.
  • Für die vorliegenden Zwecke werden die % Aminosäuresequenzidentität einer bestimmten Aminosäuresequenz A zu, mit oder gegen eine(r) bestimmte(n) Aminosäuresequenz B (was alternativ auch als eine bestimmte Aminosäuresequenz A beschrieben werden kann, die bestimmte % Aminosäuresequenzidentität zu, mit oder gegen eine(r) bestimmte(n) Aminosäuresequenz B hat oder umfasst) wie folgt berechnet:
    100 mal den Bruch X/Y
    worin X die Anzahl an Aminosäureresten ist, die durch das Sequenzabgleichungsprogramm ALIGN-2 in diesem Abgleich des Programms von A und B als identische Übereinstimmungen verzeichnet wurden, und Y die Gesamtanzahl an Aminosäureresten in B ist. Es versteht sich, dass, sofern die Länge der Aminosäuresequenz A mit der Länge der Aminosäuresequenz B nicht übereinstimmt, die % Aminosäuresequenzidentität von A zu B nicht gleich der % Aminosäuresequenzidentität von B zu A sind. Als Beispiele für % Aminosäuresequenzidentität-Berechnungen zeigen Tabelle 2A und 2B, wie die % Aminosäuresequenzidentität der Aminosäuresequenz, die als „Vergleichsprotein" bezeichnet wird, zur Aminosäuresequenz, die als „PRO" bezeichnet wird, berechnet werden.
  • Außer spezifisch anders festgehalten, werden alle hierin verwendeten % Aminosäuresequenzidentitätswerte wie oben beschrieben unter Verwendung des ALIGN-2-Computerprogramms erhalten. % Aminosäuresequenzidentitätswerte können jedoch auch unter Verwendung des Sequenzvergleichprogramms NCBI-BLAST2 (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25, 3389-3402 (1997)) bestimmt werden. Das NCBI-BLAST2-Sequenzvergleichprogramm kann unter der Adresse http://www.ncbi.nlm.nig.gov heruntergeladen werden. NCBI-BLAST2 verwendet mehrere Suchparameter, worin alle diese Suchparameter auf Standardwerte eingestellt sind, einschließlich beispielsweise unmask = yes, strand = all, expected occurrences = 10, minimum low complexity length = 15/5, multi-pass e-value = 0,01, constant for multi-pass = 25, dropoff for final gapped alignment = 25 und scoring matrix = BLOSUM62.
  • In Situationen, in denen NCBI-BLAST2 für Aminosäuresequenzvergleiche verwendet wird, werden die % Aminosäuresequenzidentität einer bestimmten Aminosäuresequenz A zu, mit oder gegen eine(r) bestimmte(n) Aminosäuresequenz B (die alternativ auch als eine bestimmte Aminosäuresequenz A beschrieben werden kann, die bestimmte % Aminosäuresequenzidentität zu, mit oder gegen eine(r) bestimmte(n) Aminosäuresequenz B aufweist oder umfasst) wie folgt berechnet:
    100 mal den Bruch X/Y
    worin X für die Anzahl an Aminosäureresten steht, die als identische Übereinstimmungen des Sequenzabgleichungsprogramms NCBI-BLAST2 im Abgleich von A und B durch das Programm verzeichnet werden, und worin Y für die Gesamtzahl an Aminosäureresten in B steht. Es versteht sich, dass, sofern die Länge von Aminosäuresequenz A nicht der Länge von Aminosäuresequenz B entspricht, die % Aminosäuresequenzidentität von A zu B nicht gleich der % Aminosäuresequenzidentität von B zu A sind.
  • Darüber hinaus können die % Aminosäuresequenzidentität auch unter Verwendung des WU-BLAST-2-Computerprogramms (Altschul et al., Methods in Enzymology 266, 460-480 (1996)) erhalten werden. Die meisten der WU-BLAST-2-Suchparameter sind auf Standardwerte eingestellt. Jene, die nicht auf Standardwerte eingestellt sind, d.h. die veränderbaren Parameter, werden mit den folgenden Werten eingestellt: overlap span = 1, overlap fraction = 0,125, Word threshold (T) = 11 und scoring matrix = BLOSUM62. Für die vorliegenden Zwecke wird ein %-Aminosäuresequenzidentitätswert durch Teilen (a) der Anzahl an übereinstimmenden identischen Aminosäureresten zwischen der Aminosäuresequenz des PRO-Polypeptids von Interesse mit einer Sequenz, die vom nativen PRO-Polypeptid abgeleitet ist, und der Vergleichs-Aminosäuresequenz von Interesse (d.h. der Sequenz, mit der das PRO-Polypeptid von Interesse verglichen wird, die eine PRO-Polypeptidvariante sein kann) wie durch WU-BLAST-2 bestimmt durch (b) die Gesamtzahl an Aminosäureresten des PRO-Polypeptids von Interesse bestimmt. Beispielsweise ist in der Feststellung „ein Polypeptid, das die Aminosäuresequenz A umfasst, die zumindest 80 % Aminosäuresequenzidentität mit Aminosäuresequenz B aufweist" die Aminosäuresequenz A die Vergleichs-Aminosäuresequenz von Interesse, und die Aminosäuresequenz-B ist die Aminosäuresequenz des PRO-Polypeptids von Interesse.
  • „Isoliert”, sofern verwendet, um die verschiedenen, hierin offenbarten Polypeptide zu beschreiben, bezeichnet ein Polypeptid, das identifiziert und von einer Komponente seiner natürlichen Umgebung abgetrennt und/oder daraus gewonnen wurde. Vorzugsweise ist das isolierte Polypeptid frei von Verbindungen zu jeglichen Komponenten, mit denen es in der Natur assoziiert ist. Verunreinigende Komponenten seiner natürlichen Umgebung sind Materialien, die typischerweise diagnostische oder therapeutische Verwendungen für das Polypeptid stören würden, und können Enzyme, Hormone und andere proteinartige oder nichtproteinartige Gelöststoffe einbinden. In bevorzugten Ausführungsformen wird das Polypeptid (1) bis zu einem ausreichenden Grad durch Verwendung eines Zentrifugenröhrchensequenzierers gereinigt, um zumindest 15 Reste einer N-terminalen oder inneren Aminosäuresequenz zu erhalten, oder (2) durch SDS-PAGE unter nichtreduzierenden oder reduzierenden Bedingungen mittels Coomassie-Blau- oder vorzugsweise Silberfärbung bis zur Homogenität gereinigt. Isoliertes Polypeptid schließt Polypeptid in situ innerhalb rekombinanter Zellen ein, da zumindest eine Komponente der natürlichen Umgebung von PRO172 nicht vorhanden ist. Üblicherweise wird ein isoliertes Polypeptid durch zumindest einen Reinigungsschritt hergestellt.
  • Die Bezeichnung „Kontrollsequenzen" bezieht sich auf DNA-Sequenzen, die zur Expression einer operabel gebundenen kodierenden Sequenz in einem bestimmten Wirtsorganismus erforderlich sind. Die Kontrollsequenzen, die beispielsweise für Prokaryoten geeignet sind, schließen einen Promotor, gegebenenfalls eine Operatorsequenz, und eine Ribosombindungsstelle ein. Eukaryotische Zellen sind bekannt dafür, Promotoren, Polyadenylierungssignale und Enhancer zu verwenden.
  • Nucleinsäure ist „operabel gebunden", wenn sie in eine funktionelle Beziehung mit einer anderen Nucleinsäuresequenz gebracht wird. Beispielsweise ist DNA für eine Präsequenz oder einen Sekretionsleader operabel an DNA für ein Polypeptid gebunden, wenn sie als Präprotein exprimiert wird, das an der Sekretion des Polypeptids teilnimmt; ein Promotor oder ein Enhancer ist operabel an eine kodierende Sequenz gebunden, wenn er die Transkription der Sequenz beeinflusst; oder eine Ribosombindungsstelle ist operabel an eine kodierende Sequenz gebunden, wenn sie so po sitioniert ist, dass sie Translation unterstützt. Allgemein bedeutet „operabel gebunden", dass die DNA-Sequenzen, die verbunden sind, zusammenhängend sind und im Fall eines Sekretionsleaders zusammenhängend und in Lesephase sind. Enhancer müssen jedoch nicht zusammenhängend sein. Bindung erfolgt durch Ligation an passenden Restriktionsstellen. Existieren solche Stellen nicht, so werden synthetische Oligonucleotidadaptoren oder Linker gemäß herkömmlichen Praktiken verwendet.
  • Die Bezeichnung „epitopmarkiert", wie hierin verwendet, bezieht sich auf ein Hybridpolypeptid, das ein an ein „Markierungs-Polypeptid" fusioniertes PRO172-Polypeptid umfasst. Das Markierungs-Polypeptid weist genug Reste auf, um ein Epitop bereitzustellen, gegen das ein Antikörper hergestellt werden kann, ist jedoch auch ausreichend kurz, dass es die Aktivität des Polypeptids, an das es fusioniert ist, nicht stört. Das Markierungs-Polypeptid ist vorzugsweise auch ziemlich einmalig, sodass der Antikörper mit anderen Epitopen im Wesentlichen nicht kreuzreagiert. Geeignete Markierungs-Polypeptide weisen im Allgemeinen zumindest sechs Aminosäurenreste und üblicherweise zwischen etwa 8 und 50 Aminosäurereste (vorzugsweise zwischen etwa 10 und 20 Aminosäurereste) auf.
  • Wie hierin verwendet bezieht sich die Bezeichnung „Immunoadhäsin" auf antikörperähnliche Moleküle, die die Bindungsspezifität eines heterologen Proteins (eines „Adhäsins") mit den Effektorfunktionen von konstanten Immunglobulindomänen kombinieren. Strukturell gesehen umfassen die Immunoadhäsine eine Fusion zwischen einer Aminosäuresequenz mit der gewünschten Bindungsspezifität, die sich von der Antigenerkennungs- und -bindungsstelle eines Antikörpers unterscheidet (d.h. „heterolog" ist), und einer Immunglobulin-Konstantdomänensequenz. Der Adhäsinteil eines Immunoadhäsinmoleküls ist typischerweise eine zusammenhängende Aminosäuresequenz, die zumindest die Bindungsstelle eines Rezeptors oder eines Liganden umfasst. Die Immunglobulin-Konstantdomänensequenz im Immunoadhäsin kann aus einem Immunglobulin wie z.B. IgG-1-, IgG-2-, IgG-3- oder IgG-4-Subtypen, IgA (einschließlich IgA-1 und IgA-2), IgE, IgD oder IgM erhalten werden.
  • „Aktiv” oder „Aktivität" für die Zwecke hierin bezieht sich auf eine oder mehrere Formen von PRO172, die eine biologische und/oder eine immunologische Aktivität von nativem oder natürlich auftretendem PRO172 in sich tragen, worin sich „biologische" Aktivität auf eine biologische Funktion (entweder hemmend oder stimulierend) bezieht, die durch ein natives oder natürlich vorkommendes PRO172 verursacht wird und nicht die Fähigkeit Ist, die Produktion eines Antikörpers gegen ein antigenes Epitop zu induzieren, das ein natives oder natürlich vorkommendes PRO172 aufweist, und eine „immunologische" Aktivität bezieht sich auf die Fähigkeit, die Produktion eines Antikörpers gegen ein antigenes Epitop zu induzieren, das ein natives oder natürlich vorkommendes PRO172 aufgeweist.
  • Die Bezeichnung „biologische Aktivität" im Zusammenhang mit einem Antikörper oder einem anderen Agonisten, der durch die hierin offenbarten Screeningverfahren identifiziert werden kann (z.B. ein organisches oder anorganisches kleines Molekül, Peptid usw.), wird verwendet, um auf die Fähigkeit solcher Moleküle Bezug zu nehmen, eine oder mehrere der hierin in Verbindung mit der Definition einer „therapeutisch wirksamen Menge" genannten Wirkungen hervorzurufen. In einer spezifischen Ausführungsform ist „biologische Aktivität" die Fähigkeit, neoplastisches Zellwachstum oder Proliferation zu inhibieren. Eine bevorzugte biologische Aktivität ist Inhibierung, einschließlich von Verlangsamung oder vollkommener Arretierung, des Wachstums einer Target-Tumor-(z.B. Krebs-)Zelle. Eine andere bevorzugte biologische Aktivität ist zytotoxische Aktivität, die zum Tod der Target-Tumor-(z.B. Krebs-)Zelle führt. Wiederum eine andere bevorzugte biologische Aktivität ist die Induktion von Apoptose einer Target-Tumor-(z.B. Krebs-) Zelle.
  • Die Bezeichnung „immunologische Aktivität" bezieht sich auf immunologische Kreuzreaktivität mit zumindest einem Epitop eines PRO172-Polypeptids.
  • „Immunologische Kreuzreaktivität", wie hierin verwendet, bedeutet, dass das Kandidaten-Polypeptid in der Lage ist, auf kompetitive Weise die qualitative biologische Aktivität eines PRO172-Polypeptids, das diese Aktivität aufweist, mit polyklonalen Antiseren zu inhibieren, die gegen das bekannte aktive PRO172-Polypeptid gezüch tet wurden. Solche Antiseren werden auf herkömmliche Weise durch subkutanes Injizieren des bekannten aktiven Analogons in komplettem Freundschem Adjuvans beispielsweise in Ziegen oder Kaninchen, gefolgt von einer intraperitonealen oder subkutanen Booster-Injektion in inkomplettem Freundschem Adjuvans, gebildet. Die immunologische Kreuzreaktivität ist vorzugsweise „spezifisch", was bedeutet, dass die Bindungsaffinität des identifizierten, immunologisch kreuzreaktiven Moleküls (z.B. Antikörpers) für das entsprechende PRO172-Polypeptid signifikant höher (vorzugsweise zumindest etwa zweimal, noch bevorzugter zumindest etwa viermal, noch bevorzugter zumindest etwa sechsmal, am meisten bevorzugt zumindest etwa achtmal, höher) als die Bindungsaffinität dieses Moleküls für jedes andere bekannte, native Polypeptid ist.
  • „Tumor", wie hierin verwendet, bezieht sich auf jegliches neoplastisches Wachstum und jegliche Proliferation, unabhängig davon, ob bös- oder gutartig, und alle vorkarzinomatösen und karzinomatösen Zellen und Gewebe.
  • Die Bezeichnungen „Krebs" und „karzinomatös" beziehen sich auf oder beschreiben das physiologische Leiden bei Säugetieren, das typischerweise durch ungeregeltes Zellwachstum charakterisiert ist. Beispiele für Krebs umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf Karzinom, Lymphom, Blastom, Sarkom und Leukämie. Spezifischere Beispiele für solche Krebsarten umfassen Brustkrebs, Prostatakrebs, Kolonkrebs, Plattenepithelkarzinom, kleinzelliges Lungenkarzinom, nichtkleinzeiliges Lungenkarzinom, Ovarialkarzinom, Zervixkarzinom, Magen-Darm-Krebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Glioblastom, Leberkrebs, Blasenkrebs, Hepatom, Kolorektalkarzinom, Endometriumkarzinom, Speicheldrüsenkarzinom, Nierenkrebs, Vulvakarzinom, Schilddrüsenkrebs, Leberkarzinom und verschiedene Typen von Kopf- und Halskrebs.
  • „Behandlung" ist eine Maßnahme, die mit der Intention gesetzt wird, die Entwicklung oder Veränderung der Pathologie einer Erkrankung zu unterbinden. Folglich bezieht sich „Behandlung" sowohl auf therapeutische Behandlung als auch auf prophylaktische oder präventive Maßnahmen. Jene, die einer Behandlung bedürfen, umfassen sowohl jene, die bereits an der Erkrankung leiden, als auch jene, in denen es die Er krankung zu unterbinden gilt. Im Fall einer Tumor-(z.B. Krebs-)Behandlung kann ein therapeutisches Mittel die Pathologie von Tumorzellen direkt reduzieren oder die Tumorzellen für eine Behandlung durch andere therapeutische Mittel, z.B. durch Strahlen- und/oder Chemotherapie, empfänglicher machen.
  • Die „Pathologie" oder das „Krankheitsbild" von Krebs umfasst sämtliche Phänomene, die das Wohlbefinden des Patienten beeinträchtigen. Dies umfasst, ohne Einschränkung, abnormales oder unkontrollierbares Zellwachstum, Metastasenbildung, Störung der normalen Funktion benachbarter Zellen, Freisetzung von Cytokinen oder anderen Sekretionsprodukten in abnormalen Konzentrationen, Unterdrückung oder Verschlimmerung von Entzündungs- oder immunologischen Reaktionen und dergleichen.
  • Eine „wirksame Menge" eines hierin offenbarten Polypeptids oder eines Agonisten davon in Bezug auf die Hemmung von neoplastischem Zellwachstum ist eine Menge, die in der Lage ist, das Wachstum von Target-Zellen in einem gewissen Ausmaß zu hemmen. Die Bezeichnung umfasst eine Menge, die in der Lage ist, eine wachstumshemmende, zytostatische und/oder zytotoxische Wirkung und/oder Apoptose der Target-Zellen hervorzurufen. Eine „wirksame Menge" eines PRO172-Polypeptids oder eines Agonisten davon für die Zwecke der Inhibierung von neoplastischem Zellwachstum kann empirisch und routinemäßig bestimmt werden.
  • Eine „therapeutisch wirksame Menge" in Bezug auf die Behandlung von Tumoren bezieht sich auf eine Menge, die in der Lage ist, eine oder mehrere der folgenden Wirkungen hervorzurufen: (1) Hemmung von Tumorwachstum in einem gewissen Ausmaß, einschließlich von Verlangsamung und vollständiger Arretierung von Tumorwachstum; (2) Reduktion der Anzahl an Tumorzellen; (3) Reduktion der Tumorgröße; (4) Inhibierung (d.h. Reduktion, Verlangsamung oder vollständiges Anhalten) von Tumorzellinfiltration in periphere Organe; (5) Inhibierung (d.h. Reduktion, Verlangsamung oder vollständiges Anhalten) von Metastasenbildung; (6) Förderung der Anti-Tumor-Immunantwort, die zur Regression oder Abstoßung des Tumors führen kann, aber nicht muss; und/oder (7) Erleichterung, in einem gewissen Ausmaß, eines oder mehrerer Symptome, die mit der Erkrankung assoziiert sind. Eine „therapeutisch wirksame Menge" eines PRO172-Polypeptids oder eines Agonisten davon kann für die Zwecke einer Tumorbehandlung empirisch und routinemäßig bestimmt werden.
  • Eine „wachstumshemmende Menge" eines PRO172-Polypeptids oder eines Agonisten davon ist eine Menge, die in der Lage ist, das Wachstum einer Zelle, insbesondere eines Tumors, z.B. einer Krebszelle, entweder in vitro oder in vivo, zu hemmen. Eine „wachstumshemmende Menge" eines PRO172-Polypeptids oder eines Agonisten davon zur Hemmung von neoplastischem Zellwachstum kann empirisch und routinemäßig bestimmt werden.
  • Eine „zytotoxische Menge" eines PRO172-Polypeptids oder eines Agonisten davon ist eine Menge, die in der Lage ist, die Zerstörung einer Zelle, insbesondere einer Tumor-, z.B. Krebs-, Zelle, entweder in vitro oder in vivo, zu verursachen. Eine „zytotoxische Menge" eines PRO172-Polypeptids oder eines Agonisten davon zur Hemmung von neoplastischem Zellwachstum kann empirisch und routinemäßig bestimmt werden.
  • Die Bezeichnung „zytotoxisches Mittel", wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine Substanz, die die Funktion von Zellen hemmt oder unterbindet und/oder die Zerstörung von Zellen verursacht. Die Bezeichnung soll radioaktive Isotope (z.B. I131, I125, Y90 und Re186), chemotherapeutische Mittel und Toxine, wie z.B. enzymatisch aktive Toxine, die aus Bakterien, Pilzen, Pflanzen oder Tieren stammen, oder Fragmente davon umfassen.
  • Ein „chemotherapeutisches Mittel" ist eine chemische Verbindung, die bei der Behandlung von Tumoren, z.B. Krebs, nützlich ist. Beispiele für chemotherapeutische Mittel umfassen Adriamycin, Doxorubicin, Epirubicin, 5-Fluoruracil, Cytosinarabinosid („Ara-C"), Cyclophosphamid, Thiotepa, Busulfan, Cytoxin, Taxoide, z.B. Paclitaxel (Taxol, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ) und Doxetaxel (Taxotere, Rhône-Poulenc Rorer, Antony, Rnace), Toxotere, Methotrexat, Cisplatin, Melphalan, Vinblastin, Bleomycin, Etoposid, Ifosfamid, Mitomycin C, Mitoxantron, Vincristin, Vinorelbin, Carboplatin, Teniposid, Daunomycin, Carminomycin, Aminopterin, Dactinomycin, Mitomycine, Esperamicine (siehe US-Patent Nr. 4.675.187 ), Melphalan und andere verwandte Stickstofflosts. Ebenfalls in diese Definition eingebunden sind hormonelle Mittel, die durch Regulierung oder Hemmung von Hormonwirkung auf Tumoren wirken, wie z.B. Tamoxifen und Onapriston.
  • Ein „wachstumshemmendes Mittel" bezieht sich bei Verwendung hierin auf eine Verbindung oder Zusammensetzung, die das Wachstum einer Zelle, insbesondere Tumor-, z.B. Krebs-, Zelle, entweder in vitro oder in vivo inhibiert. Demnach ist das wachstumshemmende Mittel eines, das den prozentuellen Anteil der Target-Zellen in S-Phase signifikant vermindert. Beispiele für wachstumshemmende Mittel umfassen Mittel, die die Zellzyklusprogression (an einer Stelle, die nicht die S-Phase ist) blockieren, wie z.B. Mittel, die eine G1-Arretierung und M-Phasen-Arretierung auslösen. Klassische M-Phasen-Blocker umfassen Vincas-(Vincristin- und Vinblastin-), Taxol- und Topo-II-Inhibitoren, wie z.B. Doxorubicin, Epirubicin, Daunorubicin, Etoposid und Bleomycin. Jene Mittel, die G1 arretieren, greifen auch auf die 3-Phasen-Arretierung über, beispielsweise DNA-alkylierende Mittel, wie z.B. Tamoxifen, Prednison, Dacarbazin, Mechlorethamin, Cisplatin, Methotrexat, 5-Fluoruracil und Ara-C. Weitere Informationen finden sich in The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn & Israel (Hrsg.), Kapitel 1, mit dem Titel „Cell cycle regulation, oncogens, and antineoplastic drugs" von Murakami et al., WB Saudners, Philadelphia (1995), insbesondere S. 13.
  • Die Bezeichnung „Cytokin" ist ein allgemeiner Ausdruck für Proteine, die von einer Zellpopulation freigesetzt werden, die auf eine andere Zelle als intrazelluläre Vermittler wirken. Beispiele derartiger Cytokine sind Lymphokine, Monokine und herkömmliche Polypeptidhormone. Zu den Cytokinen gehören Wachstumshormon, wie z.B. menschliches Wachstumshormon, menschliches N-Methionyl-Wachstumshormon und Rinderwachstumshormon; Parathormon; Thyroxin; Insulin; Proinsulin; Relaxin; Prorelaxin; Glykoproteinhormone, wie z.B. follikelstimulierendes Hormon (FSH), thyroidstimulierendes Hormon (TSH) und luteinisierendes Hormon (LH); Leberwachstumsfaktor; Fibroblastenwachstumsfaktor; Prolactin; Plazentalaktogen; Tumornekrosefaktor-α und -β; Müller-Inhibierungs-Substanz; Maus-Gonadotropin-assoziiertes Peptid; Inhibin; Activin; Gefäßendothelwachstumsfaktor; Integrin; Thrombopoietin (TPO); Nervenwachstumsfaktoren, wie z.B. NGF-β; Blutplättchenwachstumsfaktor; transformierende Wachstumsfaktoren (TGFs), wie z.B. TGF-α und TGF-β; Insulinähnlicher Wachstumsfaktor-I und -II; Erythropoietin (EPO); osteoinduktive Faktoren; Interferone, wie z.B. Interferon-α, -β und -γ; koloniestimulierende Faktoren (CSFs), wie z.B. Makrophagen-CSF (M-CSF); Granulozyten-Makrophagen-CSF (GM-CSF); und Granulozyten-CSF (G-CSF); Interleukine (ILs), wie z.B. IL-1, IL-1α, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12; ein Tumornekrosefaktor, wie z.B. TNF-α oder TNF-β; und andere Polypeptidfaktoren, einschließlich LIF und kit-Ligand (KL). Wie hierin verwendet, umfasst der Ausdruck Cytokin Proteine aus natürlichen Quellen oder aus rekombinanter Zellkultur und biologisch aktive Entsprechungen der Cytokine nativer Sequenz.
  • Die Bezeichnung „Prodrug" wie in dieser Anmeldung verwendet bezieht sich auf eine Vorläufer- oder Derivatform einer pharmazeutisch aktiven Substanz, die weniger zytotoxisch gegenüber Tumorzellen ist als der verwandte Wirkstoff und in der Lage ist, enzymatisch aktiviert oder zur aktiveren verwandten Form umgesetzt zu werden. Siehe z.B. Wilman, „Prodrugs in Cancer Chemotherapy", Biochemical Society Transactions 14, 375-382, 615th Meeting Belfast (1986), und Stella et al., „Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery", Directed Drug Delivery, Borchardt et al. (Hrsg.), Humana Press, 247-267 (1985). Die Prodrugs dieser Erfindung umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf phosphathältige Prodrugs, thiophosphathältige Prodrugs, glykosylierte Prodrugs und gegebenenfalls substituierte Phenylacetamid-hältige Prodrugs, 5-Fluorcytosin- und andere 5-Fluoruridin-Prodrugs, die zu einer Prodrug-Form zur Verwendung in dieser Erfindung derivatisiert werden können; Beispiele hierfür umfassen jene chemotherapeutischen Mittel, die zuvor beschrieben wurden, sind jedoch nicht darauf beschränkt.
  • Die Bezeichnung „Agonist" wird im weitesten Sinne verwendet und umfasst jegliches Molekül, das eine biologische Aktivität eines hierin offenbarten nativen PRO172-Polypeptids nachahmt. Geeignete Agonisten-Moleküle umfassen insbesondere Ago nisten-Antikörper oder Agonisten-Fragmente, Fragmente oder Aminosäuresequenzvarianten von nativen PRO172-Polypeptiden, Peptide, kleine organische Moleküle und dergleichen. Verfahren zur Identifikation von Agonisten eines PRO172-Polypeptids können das Kontaktieren einer Tumorzelle mit einem Kandidaten-Agonisten und das Messen der Inhibierung von Tumorzellwachstum umfassen.
  • „Chronische" Verabreichung bezieht sich im Gegensatz zu einem akuten Modus auf die Verabreichung des Mittels/der Mittel auf kontinuierliche Weise, um die anfängliche therapeutische Wirkung (Aktivität) über eine längere Zeitspanne aufrechtzuerhalten. „Diskontinuierliche" Verabreichung ist eine Behandlung, die nicht in Serie ohne Unterbrechung erfolgt, sondern vielmehr auf zyklische Weise durchgeführt wird.
  • „Säugetier" für die Zwecke der Behandlung bezieht sich auf jedes beliebige Tier, das als Säugetier klassifiziert ist, einschließlich von Mensch, Nutz- und Zuchttieren, Zoo-, Sport- und Haustieren, wie beispielsweise Hunde, Katzen, Rinder, Pferde, Schafe, Schweine, Ziegen, Kaninchen usw. Vorzugsweise ist das Säugetier ein Mensch.
  • Verabreichung „in Kombination mit" einem oder mehreren therapeutischen Mitteln schließt simultane (gleichzeitige) und aufeinander folgende Verabreichung in jeder beliebigen Reihenfolge ein.
  • „Träger" wie hierin verwendet schließen pharmazeutisch annehmbare Träger, Exzipienten oder Stabilisatoren ein, die gegenüber der Zelle oder dem Säugetier, die/das ihnen ausgesetzt wird, in den verwendeten Dosierungen und Konzentrationen nicht toxisch sind. Häufig ist der physiologisch annehmbare Träger eine wässrige, pH-gepufferte Lösung. Beispiele für physiologisch annehmbare Träger umfassen Puffer wie z.B. Phosphat, Citrat und andere organische Säuren; Antioxidanzien einschließlich Ascorbinsäure; niedermolekulare Polypeptide (mit weniger als etwa 10 Resten); Proteine, wie z.B. Serumalbumin, Gelatine oder Immunglobuline; hydrophile Polymere wie z.B. Polyvinylpyrrolidon; Aminosäuren wie z.B. Glycin, Glutamin, Asparagin, Arginin oder Lysin; Monosaccharide, Disaccharide und andere Kohlenhydrate einschließlich Glucose, Mannose oder Dextrine; Chelatbildner wie z.B. EDTA; Zuckeralkohole wie z.B. Mannit oder Sorbit; salzbildende Gegenionen wie z.B. Natrium; und/oder nichtionische Tenside wie z.B. TWEENTM, Polyethylenglykol (PEG) und PLURO-NICSTM.
  • Ein „Liposom" ist ein kleines Vesikel, das sich aus verschiedenen Typen von Lipiden, Phospholipiden und/oder Tensid zusammensetzt und zur Zufuhr eines Wirkstoffs (wie z.B. eines PRO172-Polypeptids) zu einem Säugetier nützlich ist. Die Komponenten des Liposoms sind üblicherweise in einer zweischichtigen Formation angeordnet, ähnlich der Lipidanordnung biologischer Membranen.
  • Ein „kleines Molekül" ist hierin als ein Molekül definiert, das ein Molekulargewicht von unter etwa 500 Da aufweist.
  • II. Zusammensetzungen und Verfahren
  • A. Volllängen-PRO172-Polypeptide
  • Die vorliegende Offenbarung stellt identifizierte und isolierte Nucleotidsequenzen bereit, die für Polypeptide kodieren, die in der vorliegenden Anmeldung als PRO172 bezeichnet werden. Insbesondere wurde cDNA, die für ein PRO172-Polypeptid kodiert, identifiziert und isoliert, wie dies in den nachstehenden Beispielen detaillierter offenbart wird.
  • Wie in den Beispielen nachstehend offenbart, wurde ein cDNA-Klon, der für PRO172 kodiert, bei der ATCC hinterlegt. Die tatsächliche Nucleotidsequenz des Klons kann von Fachleuten durch Sequenzieren der hinterlegten Klone mittels Verfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung Standard sind, leicht bestimmt werden. Die vorhergesagte Aminosäuresequenz kann aus der Nucleotidsequenz mittels Standardverfahren bestimmt werden. Für das hierin beschriebene PRO172-Polypeptide und die dafür kodierende Nucleinsäure konnten die Anmelder das identifizieren, was als der Leseraster angenommen wird, wie er mit der zu dem Zeitpunkt zur Verfügung stehenden Sequenzinformation am besten identifizierbar war.
  • B. PRO172-Varianten
  • Zusätzlich zu dem hierin beschriebenen Volllängen-Nativsequenz-PRO172-Polypeptid wird erwogen, dass PRO172-Varianten hergestellt werden können. PRO172-Varianten können durch Einführen geeigneter Nucleotidänderungen in die PRO172-DNA und/oder durch Synthese des gewünschten PRO172-Polypeptids erzeugt werden. Fachleuten wird bekannt sein, dass Aminosäureänderungen posttranslationale Prozesse des PRO172-Polypeptids verändern können, beispielsweise Änderung der Anzahl oder Position von Glykosylierungsstellen oder Änderung der Membranverankerungs-Eigenschaften.
  • Variationen im nativen Volllängensequenz-PRO172 oder in verschiedenen Domänen des hierin beschriebenen PRO172 können beispielsweise unter Verwendung aller Verfahren und Richtlinien für konservative und nichtkonservative Mutationen, die beispielsweise im US-Patent Nr. 5.364.934 beschrieben werden, vorgenommen werden. Variationen können eine Substitution, Deletion oder Insertion eines oder mehrerer Codons sein, die für das PRO172 kodieren, die im Vergleich mit dem Nativsequenz-PRO172 zu einer Änderung der Aminosäuresequenz des PRO172 führen. Gegebenenfalls erfolgt diese Variation durch Substitution zumindest einer Aminosäure durch eine beliebige andere Aminosäure in einer oder mehreren Domänen des PRO172. Hilfestellung bei der Bestimmung, welcher Aminosäurerest insertiert, substituiert oder deletiert werden kann, ohne die gewünschte Aktivität negativ zu beeinflussen, kann durch Vergleichen der Sequenz des PRO172 mit jener von homologen bekannten Proteinmolekülen und durch Minimieren der Anzahl an Aminosäuresequenzänderungen in Regionen hoher Homologie gefunden werden. Aminosäuresubstitutionen können durch Ersetzen einer Aminosäure durch eine andere Aminosäure mit ähnlichen strukturellen und/oder chemischen Eigenschaften, beispielsweise durch Ersetzen eines Leucins durch ein Serin, d.h. durch konservative Aminosäureersetzungen, entstehen. Insertionen oder Deletionen können gegebenenfalls im Bereich von etwa 1 bis 5 Aminosäuren liegen. Die zugelassene Variation kann durch systematisches Durchführen von Insertionen, Deletionen oder Substitutionen von Aminosäuren in die Sequenz und Testen der resultierenden Varianten auf Aktivität, die die Volllängen- oder reife native Sequenz zeigt, bestimmt werden.
  • PRO172-Polypeptidfragmente werden hierin auch bereitgestellt. Solche Fragmente können am N-Terminus oder C-Terminus trunkiert sein, oder ihnen können, beispielsweise im Vergleich zu einem Volllängennativprotein, innen gelegene Reste fehlen. Bestimmten Fragmenten fehlen Aminosäurereste, die für eine gewünschte biologische Aktivität des PRO172-Polypeptids nicht essenziell sind.
  • PRO172-Fragmente können durch eine beliebige Anzahl an herkömmlichen Verfahren hergestellt werden. Gewünschte Peptidfragmente können chemisch synthetisiert werden. Ein alternativer Ansatz umfasst die Bildung von PRO172-Fragmenten durch enzymatischen Verdau, z.B. durch Behandlung des Proteins mit einem Enzym, das bekannt dafür ist, Proteine an Stellen zu spalten, die durch bestimmte Aminosäurereste definiert sind, oder durch Verdau der DNA mit geeigneten Restriktionsenzymen und Isolieren des gewünschten Fragments. Wiederum ein anderes, nützliches Verfahren umfasst das isolieren und Amplifizieren eines DNA-Fragments, das für ein gewünschtes Polypeptidfragment kodiert, durch Polymerasekettenreaktion (PCR). Oligonucleotide, welche die gewünschten Termini des DNA-Fragments definieren, werden an den 5'- und 3'-Primern in der PCR verwendet. Vorzugsweise haben PRO172-Polypeptidfragmente zumindest eine biologische und/oder immunologische Aktivität mit dem nativen, in 2 gezeigten PRO172-Polypeptid (Seq.-ID Nr. 2) gemein.
  • Für spezielle Ausführungsformen sind konservative Substitutionen in Tabelle 3 unter der Überschrift „Bevorzugte Substitutionen" gezeigt. Führen solche Substitutionen zu einer Veränderung der biologischen Aktivität, so werden substanziellere Veränderungen, die in Tabelle 3 als „Beispielhafte Substitutionen" bezeichnet sind oder wie nachstehend unter Verweis auf Aminosäureklassen noch näher beschrieben wird, eingeführt und die Produkte gescreent. Tabelle 3
    Ursprünglicher Beispielhafte Bevorzugte
    Rest Substitutionen Substitutionen
    Ala (A) val; leu; ile val
    Arg (R) lys; gln; asn lys
    Asn (N) gln; his; lys; arg gln
    Asp (D) glu glu
    Cys (C) ser ser
    Gln (Q) asn asn
    Glu (E) asp asp
    Gly (G) pro; ala ala
    His (H) asn; gln; lys; arg arg
    Ile (I) leu; val; met; ala; phe;
    Norleucin leu
    Leu (L) Norleucin; ile; val; met; ala; phe ile
    Lys (K) arg; gln; asn arg
    Met (M) leu; phe; ile leu
    Phe (F) leu; val; ile; ala; tyr leu
    Pro (P) ala ala
    Ser (S) thr thr
    Thr (T) ser ser
    Trp (W) tyr; phe tyr
    Tyr (Y) trp; phe; thr; ser phe
    Val (V) ile; leu; met; phe; ala;
    Norleucin leu
  • Wesentliche Modifikationen in Funktion oder immunologischer Identität des PRO172-Polypeptids erfolgen durch Auswahl von Substitutionen, die sich in ihrer Wirkung auf die Aufrechterhaltung (a) der Struktur der Polypeptidhauptkette im Bereich der Substitution, beispielsweise in Form einer Faltblatt- oder Helixkonformation, (b) der La dung oder Hydrophobie des Moleküls an der Target-Stelle oder (c) des Volumens der Seitenkette signifikant unterscheiden. Natürlich vorkommende Reste werden auf Grundlage gemeinsamer Seitenketteneigenschaften in die folgenden Gruppen eingeteilt:
    • (1) hydrophob: Norleucin, met, ala, val, leu, ile;
    • (2) neutral hydrophil: cys, ser, thr;
    • (3) sauer: asp, glu;
    • (4) basisch: asn, gln, his, lys, arg;
    • (5) Reste, die die Kettenausrichtung beeinflussen: gly, pro; und
    • (6) aromatisch: trp, tyr, phe.
  • Nichtkonservative Substitutionen erfordern den Austausch eine Vertreters einer dieser Klassen gegen eine andere Klasse. Solche substituierte Reste können auch in die konservativen Substitutionsstellen oder, noch bevorzugter, in die übrigen (nicht-konservierten) Stellen eingeführt werden.
  • Die Variationen können unter Verwendung von auf dem Gebiet der Erfindung bekannten Verfahren, wie beispielsweise Oligonucleotid-vermittelte (ortsgerichtete) Mutagenese, Alaninscanning und PCR-Mutagenese, gebildet werden. Ortsgerichtete Mutagenese [Carter et al., Nucl. Acids Res. 13, 4331 (1986); Zoller et al., Nucl. Acids Res. 10, 6487 (1987)], Kassettenmutagenese [Wells et al., Gene 34, 315 (1985)], Restriktionsselektionsmutagenese [Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA 317, 415 (1986)] oder andere bekannte Verfahren können an der klonierten DNA durchgeführt werden, um die PRO172-, PRO228-, PRO538-, PRO172- oder PRO-182-DNA-Varianten zu bilden.
  • Scanning-Aminosäureanalyse kann auch verwendet werden, um eine oder mehrere Aminosäuren gemeinsam mit einer zusammenhängenden Sequenz zu identifizieren. Zu den bevorzugten Scanning-Aminosäuren zählen relativ kleine, neutrale Aminosäuren. Solche Aminosäuren schließen Alanin, Glycin, Serin und Cystein ein. Alanin ist typischerweise eine bevorzugte Scanning-Aminosäure in dieser Gruppe, da es die Seitenkette über den β-Kohlenstoff hinaus eliminiert und weniger wahrscheinlich die Hauptkettenkonformation der Variante verändert [Cunningham & Wells, Science 244, 1081-1085 (1989)]. Typischerweise wird auch Alanin bevorzugt, da es die häufigste Aminosäure ist. Weiters wird es häufig sowohl an verborgenen als auch an freiliegenden Positionen gefunden [Creighton, The Proteins (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol. 150, 1 (1976)]. Ergibt Alaninsubstitution keine adäquaten Mengen an Varianten, so kann eine isoterische Aminosäure verwendet werden.
  • C. Modifikationen von PRO172
  • Kovalente Modifikationen von PRO172 liegen im Schutzumfang dieser Erfindung. Ein Typ von kovalenter Modifikation umfasst das Umsetzen gerichteter Aminosäurereste eines PRO172-Polypeptids mit einem organischen Derivatisierungsmittel, das in der Lage ist, mit ausgewählten Seitenketten oder den N- oder C-terminalen Resten des PRO172 zu reagieren. Derivatisierung mit bifunktionellen Mitteln ist beispielsweise zum Vernetzen von PRO172 mit einer wasserunlöslichen Trägermatrix oder -oberfläche zur Verwendung im Verfahren zur Reinigung von Anti-PRO172-Antikörpern und umgekehrt nützlich. Üblicherweise verwendete Vernetzer umfassen z.B. 1,1-Bis-(diazoacetyl)-2-phenylethan, Glutaraldehyd, N-Hydroxysuccinimidester, beispielsweise Ester mit 4-Azidosalicylsäure, homobifunktionelle Imidoester, einschließlich Disuccinimidylester, wie z.B. 3,3'-Dithiobis(succinimidylpropionat), bifunktionelle Maleinimide wie z.B. Bis-N-maleinimido-1,8-octan, und Mittel wie Methyl-3-[(p-azidophenyl)-dithio]propionimidat.
  • Andere Modifikationen umfassen Desamidierung von Glutaminyl- und Asparaginylresten zu den entsprechenden Glutamyl- bzw. Aspartylresten, Hydroxylierung von Prolin und Lysin, Phosphorylierung von Hydroxygruppen von Seryl- oder Threonylresten, Methylierung der α-Aminogruppen von Lysin-, Arginin- und Histidin-Seitenketten [T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, 79-86 (1983)], Acetylierung des N-terminalen Amins und Amidierung einer beliebigen C-terminalen Carboxygruppe.
  • Eine andere Art von kovalenter Modifikation des PRO172-Polypeptids, die in den Schutzumfang dieser Erfindung fällt, umfasst das Ändern des nativen Glykosylierungsmusters des Polypeptids. „Ändern des nativen Glykosylierungsmusters" bedeutet für die vorliegenden Zwecke die Deletion einer oder mehrerer Kohlenhydratgruppierungen, die in Nativsequenz-PRO172 zu finden sind (entweder durch Entfernen der zugrundeliegenden Glykosylierungsstelle oder durch Deletion der Glykosylierung durch chemische und/oder enzymatische Mittel), und/oder das Hinzufügen einer oder mehrerer Glykosylierungsstellen, die im Nativsequenz-PRO172 nicht zu finden sind. Darüber hinaus bindet diese Bezeichnung auch qualitative Änderungen an der Glykosylierung der nativen Proteine ein, einschließlich einer Änderung der Beschaffenheit und der Anteile der verschiedenen vorhandenen Kohlenhydratgruppierungen.
  • Das Hinzufügen von Glykosylierungsstellen zum PRO172-Polypeptid kann durch Änderung der Aminosäuresequenz erfolgen. Die Änderung kann beispielsweise durch Hinzufügung von oder die Substitution durch einem/einen oder mehrere(n) Serin- oder Threoninreste(n) zum oder im Nativsequenz-PRO172 (für O-gebundene Glykosylierungsstellen) durchgeführt werden. Die PRO172-Aminosäuresequenz kann gegebenenfalls durch Änderungen auf DNA-Ebene geändert werden, insbesondere durch Mutation der DNA, die für das PRO172-Polypeptid kodiert, an vorbestimmten Basen, sodass Codons gebildet werden, die in die gewünschten Aminosäuren translatiert werden.
  • Ein anderes Mittel zur Steigerung der Anzahl an Kohlenhydratgruppierungen am PRO172-Polypeptid ist chemisches oder enzymatisches Binden von Glykosiden an das Polypeptid. Solche Verfahren werden auf dem Gebiet der Erfindung, z.B. in der WO 87/05330 , veröffentlicht am 11. September 1987, und in Aplin & Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., 259-306 (1981), beschrieben.
  • Das Entfernen von Kohlenhydratgruppierungen, die am PRO172-Polypeptid vorhanden sind, kann chemisch oder enzymatisch oder durch Mutationssubstitutionen von Codons, die für Aminosäurereste kodieren, die als Targets für Glykosylierung dienen, durchgeführt werden. Chemische Deglykosylierungsverfahren sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und werden beispielsweise von Hakimuddin et al., Arch. Biochem. Biophys. 259, 52 (1987), und von Edge et al., Anal. Biochem. 118, 131 (1981), beschrieben. Enzymatische Spaltung von Kohlenhydratgruppierungen an Polypeptiden kann unter Verwendung einer Vielzahl von Endo- und Exo-Glykosidasen erreicht werden, wie von Thotakura et al. in: Meth. Enzymol. 138, 350 (1987), beschrieben wird.
  • Eine andere Art von kovalenter Modifikation von PRO172 umfasst das Binden des PRO172-Polypeptids an eines einer Vielzahl nichtproteinhältiger Polymere, z.B. Polyethylenglykol (PEG), Polypropylenglykol oder Polyoxyalkylene, wie dies in den US-Patenten Nr. 4.640.835 ; 4.496.689 ; 4.301.144 ; 4.670.417 ; 4.791.192 oder 4.179.337 beschrieben wird.
  • Das PRO172-Polypeptid der vorliegenden Erfindung kann auch so modifiziert werden, dass ein Hybridmolekül gebildet wird, das PRO172, fusioniert an ein anderes, heterologes Polypeptid oder eine andere, heterologe Aminosäuresequenz umfasst.
  • In einer Ausführungsform umfasst solch ein Hybridmolekül eine Fusion des PRO172-Polypeptids an ein Markierungspolypeptid, das ein Epitop bereitstellt, an das sich ein Anti-Markierungs-Antikörper selektiv binden kann. Die Epitopmarkierung wird im Allgemeinen am Amino- oder Carboxyterminus des PRO172-Polypeptids platziert. Die Gegenwart solcher Epitop-markierten Formen des PRO172-Polypeptids kann unter Verwendung eines Antikörpers gegen das Markierungs-Polypeptid nachgewiesen werden. Die Bereitstellung der Epitopmarkierung ermöglicht somit auch, dass das PRO172-Polypeptid leicht mittels Affinitätsreinigung unter Verwendung eines Anti-Markierungs-Antikörpers oder eines anderen Typs von Affinitätsmatrix, die sich an die Epitopmarkierung bindet, gereinigt werden kann. Verschiedene Markierungspolypeptide und ihre jeweiligen Antikörper sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Beispiele umfassen Poly-Histidin-(poly-his-) oder Poly-Histidin-Glycin-(poly-his-gly-) Markierungen; das flu-HA-Markierungspolypeptid und seinen Antikörper-12CA5 [Field et al., Mol. Cell. Biol. 8, 2159-2165 (1988)]; die c-myc-Markierung und die Antikörper 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 und 9E10 hierzu [Evan et al., Molecular and Cellular Biology 5, 3610-3616 (1985)]; und die Herpes-Simplex-Virus-Glykoprotein-D-(-gD-) Markierung und ihren Antikörper [Paborsky et al., Protein Engineering 3(6), 547-553 (1990)]. Andere Markierungspolypeptide umfassen das Flag-Peptid [Hopp et al., Bio-Technology 6, 1204-1210 (1988)]; das KT3-Epitoppeptid [Martin et al., Science 255, 192-194 (1992)]; ein α-Tubulinepitoppeptid [Skinner et al., J. Biol. Chem. 266, 15163-15166 (1991)]; und die T7-Gen-10-Proteinpeptidmarkierung [Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 6393-6397 (1990)].
  • In einer alternativen Ausführungsform kann das Hybridmolekül eine Fusion des PRO-172-Polypeptids mit einem Immunglobulin oder einer bestimmten Region eines Immunglobulins umfassen. Für eine zweiwertige Form des Hybridmoleküls (auch als „Immunadhäsin" bezeichnet) könnte solch eine Fusion eine an die Fc-Region eines IgG-Moleküls sein. Die Ig-Fusionen umfassen vorzugsweise die Substitution einer löslichen Form (mit deletierter oder inaktivierter Transmembrandomäne) eines PRO-172-Polypeptids anstelle zumindest einer variablen Region innerhalb eines Ig-Moleküls. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst die Immunglobulinfusion die Gelenks-, CH2- und CH3- oder die Gelenks-, CH1-, CH2- und CH3-Regionen eines IgG1-Moleküls. Für weitere Informationen zur Herstellung von Immunglobulinfusionen siehe auch US-Patent Nr. 5.428.130 , ausgegeben am 27. Juni 1995.
  • D. Herstellung von PRO172
  • Die nachstehende Beschreibung betrifft vorrangig die Herstellung von PRO172 durch Kultivieren von Zellen, die mit einem PRO172-Nucleinsäure-hältigen Vektor transformiert oder transfiziert sind. Natürlich wird erwogen, dass alternative Verfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, zur Herstellung von PRO172 verwendet werden können. Beispielsweise kann die PRO172-Polypeptidsequenz oder können Teile davon durch direkte Peptidsynthese unter Verwendung von Festphasenverfahren hergestellt werden [siehe z.B. Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2154 (1963)]. In-vitro-Proteinsynthese kann unter Anwendung manueller oder automatisierter Verfahren durchgeführt werden. Automatisierte Synthese kann bei spielsweise unter Verwendung eines Applied Biosystems Peptide Synthesizer (Foster City, CA) gemäß den Agaben des Herstellers erfolgen. Verschiedene Teile des PRO172-Polypeptids können separat chemisch synthetisiert und mittels chemischer oder enzymatischer Verfahren kombiniert werden, um das Volllängen-PRO172-Polypeptid zu bilden.
  • 1. Isolierung von für PRO172 kodierender DNA
  • DNA, die für PRO172 kodiert, kann aus einer cDNA-Bibliothek gewonnen werden, die aus Gewebe erstellt wird, von dem angenommen wird, dass es die PRO172-mRNA aufweist und diese in nachweisbarem Ausmaß exprimiert. Demgemäß kann menschliche PRO172-DNA leicht aus einer cDNA-Bibliothek gewonnen werden, die aus menschlichem Gewebe erstellt wurde, wie dies auch in den Beispielen beschrieben wird. Das für PRO172 kodierende Gen kann auch aus einer genomischen Bibliothek oder mittels bekannter Syntheseverfahren (z.B. automatisierter Nucleinsäuresynthese) gewonnen werden.
  • Bibliotheken können mit Sonden (wie z.B. Antikörpern gegen das PRO172 oder Oligonucleotide aus zumindest etwa 20-80 Basen) gescreent werden, deren Zweck es ist, das Gen von Interesse oder das von diesem Gen kodierte Protein zu identifizieren. Screening der cDNA oder der genomischen Bibliothek mit der ausgewählten Sonde kann unter Anwendung von Standardverfahren durchgeführt werden, die z.B. in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laborstory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laborstory Press (1989)), beschrieben sind. Ein alternatives Mittel zum Isolieren des für PRO172 kodierenden Gens ist die Verwendung der PCR-Methode [Sambrook et al., s.o.; Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laborstory Manual (Cold Spring Harbor Laborstory Press (1995))].
  • Die nachstehenden Beispiele beschreiben Verfahren zum Screenen einer cDNA-Bibliothek. Die als Sonden ausgewählten Oligonucleotidsequenzen sollten ausreichende Länge aufweisen und ausreichend eindeutig sein, sodass falsche Positive minimiert werden. Das Oligonucleotid ist vorzugsweise so markiert, dass es durch Hybridisie rung an DNA in der zu screenenden Bibliothek nachgewiesen werden kann. Markierungsverfahren sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und umfassen die Verwendung von radioaktiven Markierungen wie z.B. von 32P-markiertem ATP, Biotinylierung oder Enzymmarkierung. Hybridisierungsbedingungen, einschließlich mäßiger Stringenz und hoher Stringenz, werden von Sambrook et al., s.o., beschrieben.
  • Sequenzen, die in solchen Bibliotheks-Screening-Verfahren identifiziert werden, können mit anderen bekannten Sequenzen, die in öffentlichen Datenbanken wie z.B. GenBank oder anderen privaten Sequenzdatenbanken hinterlegt und zugänglich sind, verglichen und abgeglichen werden. Sequenzidentität (entweder auf Aminosäure- oder Nucleotid-Ebene) innerhalb definierter Regionen des Moleküls oder über die gesamte Volllängensequenz hinweg kann mittels auf dem Gebiet bekannter Verfahren und wie hierin beschrieben bestimmt werden.
  • Nucleinsäure mit Protein-kodierender Sequenz kann durch Screenen ausgewählter cDNA oder genomischer Bibliotheken unter Verwendung der hierin erstmalig offenbarten, abgeleiteten Aminosäuresequenz und, falls erforderlich, unter Anwendung herkömmlicher Primerextensionsverfahren, wie von Sambrook et al., s.o., beschrieben, um Vorläufer und Verarbeitungs-Zwischenprodukte von mRNA zu detektieren, die eventuell nicht in cDNA rücktranskribiert worden sind, gewonnen werden.
  • 2. Selektion und Transformation von Wirtszellen
  • Wirtszellen werden mit Expressions- oder Kloniervektoren, die hierin zur PRO172-Produktion beschrieben werden, transfiziert oder transformiert und in herkömmlichem Nährmedium kultiviert, das zum Induzieren von Promotoren, zur Selektion von Transformanten oder Amplifikation der Gene, die für die gewünschten Sequenzen kodieren, geeignet modifiziert ist. Die Kulturbedingungen, wie z.B. Medium, Temperatur, pH und dergleichen, können von Fachleuten ohne unzumutbaren Aufwand ausgewählt werden. Im Allgemeinen können Prinzipien, Arbeitsvorschriften und praktische Techniken zur Maximierung der Produktivität von Zellkulturen in Mammalian Cell Bio technology: A Practical Approach, M. Butler (Hrsg.), IRL Press (1991), und bei Sambrook et al., s.o., gefunden werden.
  • Verfahren zur eukaryotischen Zelltransfektion und prokaryotischen Zelltransformation sind durchschnittlichen Fachleuten bekannt, z.B. CaCl2-Verfahren, CaPO4-Verfahren, Liposom-vermitteltes Verfahren und Elektroporation. Je nach verwendeten Wirtszellen erfolgt die Transformation unter Anwendung von Standardverfahren, die für die entsprechenden Zellen geeignet sind. Calciumbehandlung mittels Calciumchlorid, wie von Sambrook et al., s.o., beschrieben, oder Elektroporation wird im Allgemeinen für Prokaryoten verwendet. Infektion mit Agrobacterium tumefaciens wird zur Transformation bestimmter Pflanzenzellen verwendet, wie Shaw et al., Gene 23, 315 (1983), und die WO 89/05859 , veröffentlicht am 29. Juni 1989, beschreiben. Für Säugetierzellen ohne solche Zellwände kann das Calciumphosphat-Präzipitationsverfahren von Graham & van der Eb, Virology 52, 456-457 (1978), angewandt werden. Allgemeine Aspekte von Säugetierzellen-Wirtssystemtransfektionen werden im US-Patent Nr. 4.399.216 beschrieben. Transformationen in Hefe werden typischerweise nach dem Verfahren von Van Solingen et al., J. Bact. 130, 946 (1977), und Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 76, 3829 (1979), durchgeführt. Es können jedoch auch andere Verfahren zum Einführen von DNA in Zellen, wie beispielsweise Kernmikroinjektion, Elektroporation, bakterielle Protoplastenfusion mit intakten Zellen, oder Polykationen, z.B. Polybren, Polyornithin, angewandt werden. Für verschiedene Verfahren zur Transformation von Säugetierzellen siehe Keown et al., Methods in Enzymology 185, 527-537 (1990), und Mansour et al., Nature 336, 348-352 (1988).
  • Geeignete Wirtszellen zum Klonieren oder Exprimieren der DNA in die bzw. den Vektor(en) hierin schließen Prokaryoten-, Hefe- oder höhere Eukaryotenzellen ein. Geeignete Prokaryoten umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf Eubakterien, wie z.B. gramnegative oder grampositive Organismen, beispielsweise Enterobacteriaceae wie z.B. E. coli. Verschiedene E.-coli-Stämme sind öffentlich erhältlich, wie z.B. E.-coli-K12-Stamm MM294 (ATCC 31.446); E. coli X1776 (ATCC 31.537); E.-coli-Stamm W3110 (ATCC 27.325) und K5 772 (ATCC 53.635). Andere geeignete prokaryotische Wirtszellen umfassen Enterobacteriaceae wie Escherichia, z.B. E. coli, En terobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonelle, z.B. Salmonelle typhimurium, Serratia, z.B. Serratia marcescans, und Shigella sowie Bacilli wie z.B. B. subtilis und B. licheniformis (z.B. B. licheniformis 41P, offenbart in DD 266.710 , veröffentlicht am 12. April 1989), Pseudomonas, wie z.B. P. aeruginosa, und Streptomyces. Diese Beispiele stellen eine Veranschaulichung und keine Einschränkung dar. Stamm W3110 ist ein besonders bevorzugter Wirt oder Ausgangswirt, da er ein üblicher Wirtstamm für Fermentationen von Rekombinations-DNA-Produkten ist. Vorzugsweise sekretiert die Wirtszelle minimale Mengen an proteolytischen Enzymen. Beispielsweise kann Stamm W3110 modifiziert werden, um in den Genen, die für die zum Wirt endogenen Proteine kodieren, eine genetische Mutation zu bewirken, wobei Beispiele für solche Wirte E. coli-W3110-Stamm 1A2, der den vollständigen Genotyp tonA aufweist; E.-coli-W3110-Stamm 9E4, der den vollständigen Genotyp tonA ptr3 aufweist; E.-coli-W3110-Stamm 27C7 (ATCC 55.244), der den vollständigen Genotyp tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT kanr aufweist; E.-coli-W3110-Stamm 37D6, der den vollständigen Genotyp tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT rbs7ilvG kanr aufweist; E.-coli-W3110-Stamm 40B4, der Stamm 37D6 mit einer nicht Kanamycinresistenten degP-Deletionsmutation ist; und ein E.-coli-Stamm mit mutierter periplasmatischer Protease, offenbart im US-Patent Nr. 4.946.783 , ausgegeben am 7. August 1990, sind. Alternativ dazu sind In-vitro-Kionierverfahren, z.B. PCR oder andere Nucleinsäure-Polymerasereaktionen, geeignet.
  • Zusätzlich zu Prokaryoten sind eukaryotische Mikroben wie beispielsweise Fadenpilze oder Hefe geeignete Klonier- oder Expressionswirte für PRO172-kodierende Vektoren. Saccharomyces cerevisiae ist ein üblicherweise verwendeter, nieder-eukaryotischer Wirtsmikroorganismus. Andere umfassen Schizosaccharomyces pombe (Beach & Nurse, Nature 290, 140 (1981); EP 139.383 , veröffentlicht am 2. Mai 1985); Kluyveromyces-Wirte ( US-Patent Nr. 4.943.529 ; Fleer et al., Bio/Technology 9, 968-975 (1991)) wie z.B. K. lactis (MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt et al., J. Bacteriol. 154(2), 737-742 (1983)), K. fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045), K. wickeramii (ATCC 24.178), K. waltii (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906; Van den Berg et al., Bio/Technology 8, 135 (1990)), K. thermotolerans und K. marxianus; yarrowia ( EP 402.226 ); Pichia pastoris ( EP 183.070 ; Sree krishna et al., J. Basic Microbiol. 28, 265-278 (1988)); Candida; Trichoderma reesia ( EP 244.234 ); Neurospora crassa (Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 5339-5363 (1979)); Schwanniomyces wie z.B. Schwanniomyces occidentalis ( EP 394.538 , veröffentlicht am 31. Oktober 1990); und Fadenpilze wie z.B. Neurospora, Penicillium, Tolypocladium ( WO 91/00357 , veröffentlicht am 10. Januar 1991) und Aspergillus-Wirte wie z.B. A. nidulans (Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 112, 284-289 (1983); Tilburn et al., Gene 26, 205-221 (1983); Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1470-1474 (1984)) und A. niger (Kelly & Hynes, EMBO J. 4, 475-479 (1985)). Methylotrophe Hefen sind hierin geeignet und umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf Hefe, die in der Lage ist, sich auf Methanol zu vermehren, ausgewählt aus den Gattungen von Hansenula, Candida, Kloeckera, Pichia, Saccharomyces, Torulopsis und Rhodotorula. Eine Liste spezifischer Spezies, die für diese Klasse von Hefe beispielhaft sind, ist in C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982), zu finden.
  • Geeignete Wirtszellen für die Expression von glykosyliertem PRO172 werden von mehrzelligen Organismen abgeleitet. Beispiele für Wirbellosenzellen umfassen Insektenzellen wie z.B. Drosophila S2 und Spodoptera Sf9 sowie Pflanzenzehen. Beispiele für nützliche Säugetierwirtszelllinien umfassen Chinahamster-Eierstock(CHO-) und COS-Zellen. Spezifischere Beispiele umfassen Affennieren-CV1-Linie, transformiert mit SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); menschliche embryonale Nierenlinie (293 oder 293-Zellen, subkloniert zum Wachstum in Suspensionskultur, Graham et al., J. Gen Virol. 36, 59 (1977)); Chinahamster-Eierstockzellen/-DHFR (CHO, Urlaub & Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216 (1980)); Maus-Sertolizellen (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23, 243-251 (1980)); menschliche Lungenzellen (W138, ATCC CCL 75); menschliche Leberzellen (Hep G2, HB 8065); und Maus-Brusttumor (MMT 060562, ATCC CCL51). Die Auswahl der geeigneten Wirtszelle ist Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannt.
  • 3. Auswahl und Verwendung eines replizierbaren Vektors
  • Die Nucleinsäure (z.B. cDNA oder genomische DNA), die für PRO172 kodiert, kann zum Klonieren (Amplifikation der DNA) oder zur Expression in einen replizierbaren Vektor insertiert werden. Verschiedene Vektoren sind öffentlich erhältlich. Der Vektor kann beispielsweise in Form eines Plasmids, Cosmids, viralen Partikels oder Phagen vorliegen. Die geeignete Nucleinsäuresequenz kann in den Vektor mittels zahlreicher verschiedener Verfahren insertiert werden. Im Allgemeinen wird DNA in (eine) geeignete Restriktionsendonucleasestelle(n) mittels auf dem Gebiet der Erfindung bekannter Verfahren insertiert. Vektorkomponenten umfassen im Allgemeinen, sind jedoch nicht beschränkt auf eine oder mehrere Signalsequenzen, einen Replikationsursprung, ein oder mehrere Markergene, ein Enhancer-Element, einen Promotor und eine Transkriptionsterminationssequenz. Bei der Konstruktion geeigneter Vektoren, die eine oder mehrere dieser Komponenten enthalten, werden herkömmliche, dem Fachmann bekannte Ligationsverfahren eingesetzt.
  • Das PRO172 kann rekombinant nicht nur direkt, sondern auch als Fusionspolypeptid mit einem heterologen Polypeptid hergestellt werden, das eine Signalsequenz oder ein anderes Polypeptid mit einer spezifischen Spaltungsstelle am N-Terminus des reifen Proteins oder Polypeptids sein kann. Im Allgemeinen kann die Signalsequenz eine Komponente des Vektors oder kann ein Teil der für PRO172 kodierenden DNA sein, die in den Vektor insertiert wird. Die Signalsequenz kann eine prokaryotische Signalsequenz, ausgewählt beispielsweise aus der aus alkalische-Phosphatase-, Penicillinase-, Ipp- und wärmestabilem Enterotoxin-II-Leader bestehenden Gruppe, sein. Zur Hefesekretion kann die Signalsequenz z.B. der Hefe-Invertase-Leader, α-Faktorleader (einschließlich Saccharomyces- und Kluyveromyces-α-Faktorleader, wovon Letzterer im US-Patent Nr. 5.010.182 beschrieben wird) oder saure-Phosphatase-Leader, der C.-albicans-Glucoamylase-Leader ( EP 362.179 , veröffentlicht am 4. April 1990) oder das in der WO 90/13646 , veröffentlicht am 15. November 1990, beschriebene Signal sein. Zur Säugetierzellexpression können Säugetiersignalsequenzen verwendet werden, um die Sekretion des Proteins zu steuern, wie beispielsweise Signalsequenzen aus sekretierten Polypeptiden derselben oder einer verwandten Spezies sowie virale Sekretionsleader.
  • Sowohl Expressions- als auch Kloniervektoren enthalten eine Nucleinsäuresequenz, die ermöglicht, dass sich der Vektor in einer oder mehreren der sekretierten Wirtszellen repliziert. Solche Sequenzen sind für zahlreiche verschiedene Bakterien, Hefen und Viren bekannt. Der Replikationsstartpunkt aus dem Plasmid pBR322 ist für die meisten gramnegativen Bakterien geeignet, der 2μ-Plasmidursprung ist für Hefe geeignet, und verschiedene virale Startpunkte (SV40, Polyoma, Adenovirus, VSV oder BPV) sind für Kloniervektoren in Säugetierzellen nützlich.
  • Expressions- und Kloniervektoren enthalten typischerweise ein Selektionsgen, das auch als selektierbarer Marker bezeichnet wird. Typische Selektionsgene kodieren für Proteine, die (a) Resistenz gegenüber Antibiotika oder anderen Toxinen, z.B. Ampicillin, Neomycin, Methotrexat oder Tetracyclin, verleihen, (b) auxotrophe Mängel beheben oder (c) essenzielle Nährstoffe, die aus komplexem Medium nicht erhältlich sind, zuführen, z.B. das für D-Alanin-Racemase kodierende Gen für Bacilli.
  • Ein Beispiel für geeignete selektierbare Marker für Säugetierzellen sind jene, die die Identifikation von Zellen ermöglichen, die in der Lage sind, die für PRO172 kodierende Nucleinsäure aufzunehmen, wie z.B. DHFR oder Thymidinkinase. Eine geeignete Wirtszelle ist, sofern Wildtyp-DHFR verwendet wird, die CHO-Zelllinie, der DHFR-Aktivität fehlt und die wie von Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216 (1980), beschrieben hergestellt und vermehrt wird. Ein geeignetes Selektionsgen zur Verwendung in Hefe ist das trp1-Gen, das im Hefeplasmid YRp7 vorhanden ist [Stinchcomb et al., Nature 282, 39 (1979); Kingsman et al., Gene 7, 141 (1979); Tschemper et al., Gene 10, 157 (1980)]. Das trp1-Gen stellt einen Selektionsmarker für einen mutierten Hefestamm dar, dem die Fähigkeit fehlt, sich in Tryptophan zu vermehren, beispielsweise ATCC Nr. 44076 oder PEP4-1 [Jones, Genetics 85, 12 (1977)].
  • Expressions- und Kloniervektoren enthalten üblicherweise einen Promotor, der operabel an die für PRO172 kodierende Nucleinsäuresequenz gebunden ist, um mRNA-Synthese zu steuern. Promotoren, die von zahlreichen verschiedenen potenziellen Wirtszellen erkannt werden, sind bekannt. Promotoren, die zur Verwendung mit prokaryotischen Wirten geeignet sind, umfassen die β-Lactamase- und Lactose-Promotorsysteme [Chang et al., Nature 275, 615 (1978); Goeddel et al., Nature 281, 544 (1979)], alkalische Phosphatase, ein Tryptophan-(trp-)Promotorsystem [Goeddel, Nucleic Acids Res. 8, 4057 (1980); EP 36.776 ] und Hybridpromotoren wie z.B. den tac-Promotor [deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 21-25 (1983)]. Promotoren zur Verwendung in bakteriellen Systemen enthalten auch eine Shine-Dalgarno(S.D.-)Sequenz, die operabel an die für PRO172 kodierende DNA gebunden ist.
  • Beispiele für geeignete Promotorsequenzen zur Verwendung mit Hefewirten umfassen die Promotoren für 3-Phosphoglyceratkinase [Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255, 2073 (1980)] oder andere glykolytische Enzyme [Ness et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7, 149 (1968); Holland, Biochemistry 17, 4900 (1978)] wie z.B. Enolase, Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase, Hexokinase, Pyruvatdecarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-6-phosphatisomerase, 3-Phosphoglyceratmutase, Pyruvatkinase, Triosephosphatisomerase, Phosphoglucoseisomerase und Glucokinase.
  • Andere Hefepromotoren, die induzierbare Promotoren sind und den zusätzlichen Vorteil haben, dass ihre Transkription durch Wachstumsbedingungen gesteuert wird, sind die Promotorregionen für Alkoholdehydrogenase 2, Isocytochrom C, saure Phosphatase, Abbauenzyme, die mit Stickstoffmetabolismus assoziiert sind, Metallothionein, Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase und Enzyme, die für Maltose- und Galactoseverwendung verantwortlich sind. Geeignete Vektoren und Promotoren zur Verwendung bei Hefeexpression werden näher in EP 73.657 beschrieben.
  • PRO172-Transkription aus Vektoren in Säugetier-Wirtszellen wird beispielsweise von Promotoren gesteuert, die aus den Genomen von Viren wie z.B. Polyomavirus, Geflügelpockenvirus ( UK 2.211.504 , veröffentlicht am 5. Juli 1989), Adenovirus (wie z.B. Adenovirus 2), Rinderpapillomavirus, Vogel-Sarkomvirus, Zytomegalie-Virus, einem Retrovirus, Hepatitis-B-Virus und Affenvirus 40 (SV40), aus heterologen Säugetierpromotoren, z.B. dem Actinpromotor oder einem Immunglobulinpromotor, und aus Hitzeschock-Promotoren gewonnen werden, vorausgesetzt, solche Promotoren sind mit den Wirtszellsystemen kompatibel.
  • Transkription von DNA, die für das PRO172 kodiert, durch höhere Eukaryoten kann durch Insertieren einer Enhancersequenz in den Vektor gesteigert werden. Enhancer sind cis-wirkende Elemente von DNA, üblicherweise etwa mit 10 bis 300 bp, die auf einen Promotor so wirken, dass seine Transkription gesteigert wird. Zahlreiche Enhancersequenzen sind aus Säugetiergenen bekannt (Globin, Elastase, Albumin, α-Fetoprotein und Insulin). Typischerweise wird jedoch ein Enhancer aus einem eukaryotischen Zellvirus verwendet. Beispiele umfassen den SV40-Enhancer an der späten Seite des Replikationsursprungs (bpp 100-270), den frühen Zytomegalie-Virus-Promotor-Enhancer, den Polyoma-Enhancer an der späten Seite des Replikationsursprungs und Adenovirus-Enhancer. Der Enhancer kann in den Vektor an einer Position 5' oder 3' zur PRO172-Kodiersequenz gespleißt werden, wird jedoch vorzugsweise an einer Stelle 5' vom Promotor angeordnet.
  • Expressionsvektoren, die in eukaryotischen Wirtszellen (Hefe-, Pilz-, Insekten-, Pflanzen-, Tier-, Menschen- oder kernhaltige Zellen aus anderen mehrzelligen Organismen) verwendet werden, enthalten auch Sequenzen, die zum Abschluss der Transkription und zur Stabilisierung der mRNA erforderlich sind. Solche Sequenzen sind üblicherweise aus den untranslatierten 5'- und gegebenenfalls 3'-Regionen eukaryotischer oder viraler DNA oder cDNA erhältlich. Diese Regionen enthalten Nucleotidsegmente, die als polyadenylierte Fragmente im untranslatierten Abschnitt der für PRO172 kodierenden mRNA transkribiert werden.
  • Weitere Verfahren, Vektoren und Wirtszellen, die zur Adaptierung an die Synthese von PRO172 in rekombinanter Wirbeltierzellkultur geeignet sind, werden in Gething et al., Nature 293, 620-625 (1981); Mantei et al., Nature 281, 40-46 (1979); EP 117.060 ; und EP 117.058 beschrieben.
  • 4. Detektion von Gen-Amplifikation/Expression
  • Genamplifikation und/oder -expression kann basierend auf den hierin bereitgestellten Sequenzen in einer Probe direkt gemessen werden, z.B. durch herkömmliches Southern-Blotting, Northern-Blotting zur Quantifizierung der Transkription von mRNA [Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 5201-5205 (1980)], Dot-Blotting (DNA-Analyse) oder In-situ-Hybridisierung unter Verwendung einer geeigneten markierten Sonde. Alternativ dazu können Antikörper verwendet werden, die spezifische Duplices, einschließlich DNA-Duplices, RNA-Duplices und DNA-RNA-Hybridduplices oder DNA-Proteinduplices, erkennen. Die Antikörper wiederum können markiert sein, und der Test kann durchgeführt werden, wenn der Duplex an eine Oberfläche gebunden ist, sodass bei Bildung von Duplex an der Oberfläche die Gegenwart von Antikörper, der an den Duplex gebunden ist, nachgewiesen werden kann.
  • Genexpression kann alternativ dazu durch immunologische Verfahren, wie beispielsweise immunhistochemisches Färben von Zellen oder Gewebeschnitten und Tests von Zellkultur- oder Körperflüssigkeiten, gemessen werden, um die Expression von Genprodukt direkt zu quantifizieren. Antikörper, die für immunhistochemisches Färben und/oder Testen von Probenflüssigkeiten nützlich sind, können entweder monoklonal oder polyklonal sein und können in jedem beliebigen Säugetier erzeugt werden. Auf einfache Weise können die Antikörper gegen ein Nativsequenz-PRO172-Polypeptid oder gegen ein synthetisches Peptid, basierend auf den hierin bereitgestellten DNA-Sequenzen, oder gegen exogene Sequenz, fusioniert an PRO172-DNA und für ein spezifisches Antikörperepitop kodierend, hergestellt werden.
  • 5. Reinigung von Polvpeptiden
  • Formen von PRO172 können aus Kulturmedium oder aus Wirtszelllysaten gewonnen werden. Sofern membrangebunden, kann es unter Verwendung einer geeigneten Tensidlösung (z.B. Triton-X 100) oder durch enzymatische Spaltung aus der Membran freigesetzt werden. Zellen, die zur Expression von PRO172 verwendet werden, können mittels verschiedener physikalischer oder chemischer Mittel, wie z.B. Gefrier- Auftau-Zyklieren, Beschallung, mechanischer Aufbruch oder Zelllysemittel, aufgeschlossen werden.
  • Es kann erwünscht sein, PRO172 aus rekombinanten Zellproteinen oder Polypeptiden zu reinigen. Die folgenden Verfahren sind Beispiele für geeignete Reinigungsverfahren: Fraktionierung an einer Ionenaustauschsäule; Ethanolfällung; Umkehrphasen-HPLC; Chromatographie auf Kieselgel oder einem Kationenaustauschharz wie z.B. DEAE; Chromatofokussierung; SDS-PAGE; Ammoniumsulfatfällung; Gelfiltration unter Verwendung von beispielsweise Sephadex G-75; Protein-A-Sepharose-Säulen zur Entfernung von Verunreinigungen wie IgG; und Metallchelator-Säulen zur Bindung von Epitop-markierten Formen des PRO172. Verschiedene Verfahren von Proteinreinigung können verwendet werden, und solche Verfahren sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und werden beispielsweise von Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982), beschrieben. Der/Die ausgewählte(n) Reinigungsschritt(e) hängen beispielsweise von der Beschaffenheit des verwendeten Herstellungsverfahrens und dem jeweils produzierten PRO172 ab.
  • E. Identifikation von Proteinen, die in der Lage sind, neoplastisches Zellwachstum oder Proliferation zu hemmen
  • Die in der vorliegenden Anmeldung offenbarten Proteine wurden in einer Gruppe von 60 Tumorzelllinien getestet, die zur Zeit im experimentellen, Krankheits-orientierten In-vitro-Wirkstofffindungsscreen des National Cancer Institute (NCI) verwendet wird. Zweck dieses Screens ist die Identifikation von Molekülen, die zytotoxische und/oder zytostatische Aktivität gegen verschiedene Typen von Tumoren aufweisen. Das NCI screent mehr als 10.000 neue Moleküle jährlich (Monks et al., J. Natl. Cancer Inst. 83, 757-766 (1991); Boyd, Cancer: Princ. Pract. Oncol. Update 3(10), 1-12 (1989)). Die in dieser Studie verwendeten Tumorzelllinien wurden von Monks et al., s.o., beschrieben. Die Zelllinien, deren Wachstum durch die Proteine der vorliegenden Anmeldung signifikant reduziert wurde, sind in den Beispielen gesondert erwähnt.
  • Die Resultate zeigten, dass die getesteten Proteine zytostatische und in manchen Fällen und Konzentrationen zytotoxische Aktivitäten in zahlreichen verschiedenen Krebszelllinien zeigen und daher nützliche Kandidaten für die Tumortherapie sind.
  • Andere zellbasierte Tests und Tiermodelle für Tumoren (z.B. Krebsarten) können auch angewandt werden, um die Erkenntnisse des NCI-Krebsscreens zu überprüfen und um die Beziehung zwischen dem hierin identifizierten Protein und der Entwicklung und Pathogenese von neoplastischem Zellwachstum besser zu verstehen. Primäre Kulturen, die aus Tumoren von transgenen Tieren abstammen (nachstehend beschrieben), können beispielsweise hierin in den zellbasierten Tests verwendet werden, auch wenn stabile Zelllinien bevorzugt werden. Verfahren zur Ableitung kontinuierlicher Zelllinien aus transgenen Tieren sind auf dem Gebiet der Erfindung durchwegs bekannt (siehe z.B. Small et al., Mol. Cell. Biol. 5, 642-648 (1985)).
  • F. Tiermodelle
  • Zahlreiche verschiedene bekannte Tiermodelle können verwendet werden, um die Rolle der hierin identifizierten Moleküle bei der Entwicklung und Pathogenese von Tumoren besser zu verstehen und um die Wirksamkeit von Kandidaten für therapeutische Mittel, einschließlich Antikörper, und anderer Agonisten der nativen Polypeptide, einschließlich niedermolekularer Agonisten, zu testen. Die In-vivo-Beschaffenheit solcher Modelle macht sie besonders prognostisch für die Reaktionen in menschlichen Patienten. Tiermodelle von Tumoren und Krebsarten (z.B. Brustkrebs, Kolonkrebs, Prostatakrebs, Lungenkrebs usw.) umfassen sowohl nichtrekombinante als auch rekombinante (transgene) Tiere. Nichtrekombinante Tiermodelle umfassen beispielsweise Nagetiermodelle, z.B. murine Modelle. Solche Modelle können durch Einführen von Tumorzellen in syngenetische Mäuse unter Anwendung von Standardverfahren, z.B. von subkutaner Injektion, Schwanzveneninjektion, Milzimplantation, intraperitonealer Implantation, Implantation unter der Nierenkapsel oder Orthopin-Implantation, z.B. Kolonkrebszellen, die in Kolongewebe implantiert werden, gebildet werden (siehe z.B. die PCT-Veröffentlichung Nr. WO 97/33551 , veröffentlicht am 18. September 1997).
  • Die in onkologischen Studien wahrscheinlich am häufigsten verwendete Tierspezies sind Mäuse mit Immunschwäche und insbesondere Nacktmäuse. Die Beobachtung, dass die Nacktmaus mit Hypo/Aplasie erfolgreich als Wirt für menschliche Tumor-Xenotransplantate eingesetzt werden könnte, führte zu der weit verbreiteten Verwendung dieser Maus zu diesem Zweck. Das autosomale rezessive nu-Gen wurde in zahlreiche unterschiedliche kongene Stämme von Nacktmäusen eingeführt, einschließlich z.B. ASW, A/He, AKR, BALG/c, B10.LP, C17, C3H, C57BL, C57, CBA, DBA, DDD, 1/st, NC, NFR, NFS, NFS/N, NZB, NZC, NZW, P, RIII und SJL. Darüber hinaus wurde eine große Vielzahl an anderen Tieren mit vererbten immunologischen Defekten, die nicht Nacktmäuse waren, gezüchtet und als Rezipienten von Tumor-Xenotransplantaten verwendet. Nähere Details hierzu sind z.B. in: The Nude Mouse in Oncology Research, E. Boven & B. Winograd (Hrsg.), CRC Press Inc. (1991), zu finden.
  • Die in solche Tiere eingeführten Zellen können von bekannten Tumor/Krebszelllinien, wie z.B. von jeglichen oben genannten Tumorzelllinien, und beispielsweise von der B104-1-1-Zelllinie (stabile NIH-3T3-Zelllinie, transfiziert mit dem neu-Protoonkogen); ras-transfizierten NIH-3T3-Zellen; Caco-2 (ATCC HTB-37); einer menschlichen Kolon-Adenokarzinomzelllinie HT-29 von mäßig gut differenziertem Grad II (ATCC HTB-38) oder von anderen Tumoren und Krebsarten abstammen. Proben von Tumor- oder Krebszellen können unter Verwendung von Standardbedingungen, einschließlich Einfrieren und Lagern in flüssigem Stickstoff, aus Patienten im Rahmen eines chirurgischen Eingriffs gewonnen werden (Karmali et al., Br. J. Cancer 48, 689-696 (1983)).
  • Tumorzellen können in Tiere, wie z.B. Nacktmäuse, mittels zahlreicher verschiedener Verfahren eingeführt werden. Der subkutane (s.k.) Raum bei Mäusen ist für Tumorimplantation sehr gut geeignet. Tumoren können s.k. als feste Blöcke, in Form von Nadelbiopsien unter Verwendung eines Trokars oder als Zellsuspensionen transplantiert werden. Im Fall der Implantation eines festen Blocks oder mittels Trokars werden Tumorgewebefragmente mit geeigneter Größe in den s.k. Raum eingeführt. Zellsuspensionen werden frisch aus primären Tumoren oder stabilen Tumorzelllinien herge stellt und subkutan injiziert. Tumorzellen können auch als subdermale Implantate injiziert werden. Bei dieser Positionierung wird das Inokulum zwischen dem unteren Teil des dermalen Bindegewebes und dem s.k. Gewebe platziert. Boven & Winograd (1991), s.o. Tiermodelle von Brustkrebs können beispielsweise durch Implantieren von Ratten-Neuroblastomzellen (aus denen das neu-Onkogen ursprünglich isoliert wurde) oder neu-transformierten NIH-3T3-Zellen in Nacktmäuse, im Wesentlichen wie von Drebin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 9129-9133 (1986), beschrieben, gebildet werden.
  • In ähnlicher Weise können Tiermodelle von Kolonkrebs durch Überführen von Kolonkrebszellen in Tiere, z.B. Nacktmäuse, gebildet werden, was um Auftreten von Tumoren in diesen Tieren führt. Ein orthotopisches Transplantationsmodell von menschlichem Kolonkrebs in Nacktmäusen wurde beispielsweise von Wang et al., Cancer Research 54, 4726-4728 (1994), und von Too et al., Cancer Research 55, 681-684 (1995), beschrieben. Dieses Modell basiert auf der so genannten „METAMOUSE", die bei AntiCancer, Inc., San Diego, Kalifornien, erhältlich ist.
  • Tumoren, die in Tieren auftreten, können entfernt und in vitro kultiviert werden. Zellen aus den In-vitro-Kulturen können dann auf Tiere übertragen werden. Solche Tumoren können als Targets für weiteres Screening oder Wirkstoff-Screening dienen. Alternativ dazu können die aus der Übertragung resultierenden Tumoren isoliert werden, und RNA aus Zellen vor der Passage und Zellen, die nach einem oder mehreren Passage-Durchgängen isoliert werden, können auf differenzielle Expression von Genen von Interesse analysiert werden. Solche Passage-Verfahren können mit jeglichen bekannten Tumoren oder jeglichen bekannten Krebszelllinien durchgeführt werden.
  • Meth A, CMS4, CMS5, CMS21 und WEHT-164 beispielsweise sind chemisch induzierte Fibrosarkome von weiblichen BALB/c-Mäusen (DeLeo et al., J. Exp. Med. 146, 720 (1977)), die ein sehr gut steuerbares Modellsystem zur Untersuchung der krebsbekämpfenden Aktivitäten verschiedener Mittel bereitstellen (Palladino et al., J. Immunol. 138, 4023-4032 (1987)). Kurz zusammengefasst werden Tumorzellen in vitro in Zellkultur vermehrt. Vor der Injektion in die Tiere werden die Zelllinien gewaschen und in Puffer bei einer Zelldichte von etwa 10 × 106 bis 10 × 107 Zellen/ml suspendiert. Die Tiere werden dann subkutan mit 10 bis 100 μl der Zellsuspension infiziert, was das Auftreten eines Tumors innerhalb von einer bis drei Wochen ermöglicht.
  • Darüber hinaus kann das Lewis-Lungen-(3LL-)Karzinom von Mäusen, das einer der am ausführlichsten untersuchten Versuchstumoren ist, als Versuchs-Tumormodell verwendet werden. Die Wirksamkeit in diesem Tumormodell wurde mit günstigen Wirkungen in der Behandlung menschlicher Patienten, deren Diagnose kleinzelliges Lungenkarzinom (SCCL) lautet, korreliert. Dieser Tumor kann in normale Mäuse durch Injektion von Tumorfragmenten aus einer erkrankten Maus oder von Zellen, die in Kultur gehalten werden, eingeführt werden (Zupi et al., Br. J. Cancer 41, Beilage 4, 309 (1980)), und Beweise zeigen, dass sich Tumoren sogar durch die Injektion einer einzelnen Zelle entwickeln können und dass ein sehr großer Anteil infizierter Tumorzellen überleben. Nähere Informationen zu diesem Tumormodell sind bei Zacharski, Haemostasis 16, 300-320 (1986), zu finden.
  • Eine Art, die Wirksamkeit einer Testverbindung in einem Tiermodell auf einen implantierten Tumor zu bewerten, ist das Messen der Größe des Tumors vor und nach der Behandlung. Herkömmlicherweise wurde die Größe implantierter Tumoren mit einer Schublehre in zwei oder drei Dimensionen gemessen. Das auf zwei Dimensionen eingeschränkte Maß spiegelt die Größe des Tumors nicht exakt wider, und daher wird es üblicherweise unter Verwendung einer mathematischen Formel in das entsprechende Volumen umgerechnet. Das Messen von Tumorgrößen führt jedoch nur zu sehr ungenauen Resultaten. Die therapeutischen Wirkungen eines Wirkstoffkandidaten kann als behandlungsinduzierte Wachstumsverzögerung und spezifische Wachstumsverzögerung besser beschrieben werden. Eine andere wichtige Variable bei der Beschreibung von Tumorwachstum ist die Zeit, die der Tumor braucht, um sein Volumen zu verdoppeln. Computerprogramme zur Berechnung und Beschreibung von Tumorwachstum sind ebenfalls erhältlich, wie beispielsweise das Programm, über das Rygaard & Spang-Thomsen, Proc. 6th Int. Workshop an Immune-Deficient Animals, Wu &Sheng (Hrsg.), Basel, 301 (1989), berichteten. Es gilt jedoch anzumerken, dass Nekrose- und Entzündungsreaktionen nach der Behandlung, zumindest anfänglich, tatsächlich zu einer Steigerung der Tumorgröße führen können. Daher müssen diese Veränderungen sorgfältig mittels einer Kombination aus einem morphometrischen Verfahren und Durchflusszytometrieanalyse verfolgt werden.
  • Rekombinante (transgene) Tiermodelle können durch Einführen des kodierenden Abschnitts der hierin identifizierten Gene in das Genom von Tieren von Interesse unter Anwendung von Standardverfahren zur Bildung transgener Tiere gentechnisch verändert werden. Tiere, die als Target für transgene Manipulation dienen können, umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Mäuse, Ratten, Kaninchen, Meerschweinchen, Schafe, Ziegen, Schweine und nichtmenschliche Primaten, z.B. Paviane, Schimpansen und Affen. Verfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, um ein Transgen in solche Tiere einzuführen, umfassen pronukleare Mikroinjektion (Hoppe & Wanger, US-Patent Nr. 4.873.191 ); Retrovirus-vermittelten Gentransfer in Keimlinien (z.B. Van der Putten et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 6148-615 (1985)); Gentargeting in embryonalen Stammzellen (Thompson et al., Cell 56, 313-321 (1989)); Elektroporation von Embryonen (Lo, Mol. Cell. Biol. 3, 1803-1814 (1983)); und Sperma-vermittelten Gentransfer (Lavitrano et al., Cell 57, 717-773 (1989)). Ein Überblick hierzu ist beispielsweise im US-Patent Nr. 4.736.866 zu finden.
  • Für den Zweck der vorliegenden Erfindung umfassen transgene Tiere jene, die das Transgen nur in einem Teil ihrer Zellen tragen („Mosaik-Tiere"). Das Transgen kann entweder als einzelnes Transgen oder in Concatameren, z.B. Kopf-an-Kopf- oder Kopf-an-Schwanz-Tandems, integriert werden. Selektives Einführen eines Transgens in einen bestimmten Zelltyp ist ebenfalls möglich, beispielsweise gemäß dem Verfahren von Lasko et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 6232-636 (1992).
  • Die Expression des Transgens in transgenen Tieren kann mittels Standardverfahren überwacht werden. Southern-Blot-Analyse oder PCR-Amplifikation beispielsweise kann verwendet werden, um die Integration des Transgens zu überprüfen. Das Ausmaß von mRNA-Expression kann anschließend unter Anwendung von Verfahren wie z. B. In-situ-Hybridisierung, Northern-Blot-Analyse, PCR oder Immunozytochemie analysiert werden. Die Tiere werden ferner auf Anzeichen von Tumor- oder Krebsentwicklung untersucht.
  • Die Wirksamkeit von Antikörpern, die sich spezifisch an die hierin identifizierten Polypeptide und andere Wirkstoffkandidaten binden, kann auch bei der Behandlung von spontanen Tiertumoren getestet werden. Ein geeignetes Target für solche Studien ist das feline orale Plattenepithelkarzinom. Felines orales Plattenepithelkarzinom ist ein höchst invasiver, maligner Tumor, der die am häufigsten auftretende orale Malignität bei Katzen mit mehr als 60 % der oralen Tumoren, von denen bei dieser Spezies berichtet wird, darstellt. Dieser Tumor metastasiert nur selten an entfernten Stellen, wobei jedoch dieses seltene Vorkommen von Metastasen lediglich ein Resultat der kurzen Überlebensdauer von Katzen, die an diesem Tumor erkrankt sind, sein kann. Diese Tumoren können üblicherweise keinem chirurgischen Eingriff unterzogen werden, hauptsächlich aufgrund der Anatomie der felinen Mundhöhle. Zur Zeit gibt es noch kein wirksames Behandlungsverfahren für diesen Tumor. Vor Aufnahme in diese Studie wird jede Katze einer vollständigen klinischen Untersuchung, einer Biopsie, unterzogen und wird mittels Computertomographie (CT) gescannt. Katzen, für die sublinguale orale Plattenepitheltumoren diagnostiziert werden, werden von der Studie ausgeschlossen. Die Zunge kann infolge eines solchen Tumors gelähmt werden, und auch wenn die Behandlung den Tumor abtötet, sind die Tiere nicht in der Lage, selbstständig ausreichend Nahrung aufzunehmen. Jede Katze wird wiederholt innerhalb eines längeren Zeitraums behandelt. Im Verlauf der Behandlungszeit werden täglich Photographien von den Tumoren gemacht, und auch bei jeder Nachuntersuchung wird gleich vorgegangen. Nach der Behandlung wird jede Katze einer weiteren CT unterzogen. CTs und Thorax-Radiogramme werden hiernach alle 8 Wochen ausgewertet. Die Daten werden auf Unterschiede bezogen auf das Überleben, die Reaktion und die Toxizität im Vergleich zu Kontrollgruppen evaluiert. Eine positive Reaktion kann einen Beweis für Tumorregression erfordern, vorzugsweise mit gleichzeitiger Verbesserung der Lebensqualität und/oder verlängerter Lebenserwartung.
  • Darüber hinaus können auch andere spontane Tiertumoren, wie z.B. Fibrosarkom, Adenokarzinom, Lymphom, Chondrom, Leiomyosarkom, von Hunden, Katzen und Pavianen getestet werden. Davon ist das Mammaadenokarzinom bei Hunden und Katzen ein bevorzugtes Modell, da sein Auftreten und Verhalten jenen Karzinomen in Menschen sehr ähnlich sind. Die Verwendung dieses Modells ist jedoch durch das seltene Auftreten dieses Typs von Tumor in Tieren limitiert.
  • G. Screening-Tests auf Wirkstoffkandidaten
  • Screening-Tests auf Wirkstoffkandidaten werden entworfen, um Verbindungen zu identifizieren, die sich kompetitiv an den/die Rezeptor(en) der hierin identifizierten Polypeptide binden oder damit kompetitiv einen Komplex bilden oder auf andere Weise durch einen oder mehrere solcher Rezeptoren Signale abgeben. Solche Screening-Tests umfassen Tests, die auf Hochdurchsatzscreenen chemischer Bibliotheken anwendbar sind, was sie besonders geeignet zur Identifikation von niedermolekularen Wirkstoffkandidaten macht. Kleine Moleküle, die in Betracht gezogen werden, umfassen synthetische organische und anorganische Verbindungen, einschließlich Peptide, vorzugsweise löslicher Peptide, (Poly-)Peptid-Immunglobulin-Fusionen und insbesondere Antikörper, umfassend, ohne darauf eingeschränkt zu sein, poly- und monoklonale Antikörper und Antikörperfragmente, einkettige Antikörper, antiidiotypische Antikörper und chimäre oder humanisierte Versionen solcher Antikörper oder Fragmente sowie menschliche Antikörper und Antikörperfragmente. Die Tests können in zahlreichen verschiedenen Formaten durchgeführt werden, einschließlich Protein-Protein-Bindungstests, biochemischer Screening-Tests, Immuntests und zellbasierter Tests, die auf dem Gebiet der Erfindung gut beschrieben sind.
  • Bei Bindungstests ist die stattfindende Wechselwirkung eine Bindung, und der gebildete Komplex kann isoliert oder im Reaktionsgemisch nachgewiesen werden. In einer bestimmten Ausführungsform wird ein Rezeptor eines Polypeptids, für den das hierin identifizierte Gen kodiert, oder der Wirkstoffkandidat an einer Festphase, z.B. an einer Mikrotiterplatte, durch kovalente oder nichtkovalente Bindung isoliert. Nichtkovalente Bindung erfolgt im Allgemeinen durch Beschichten der festen Oberfläche mit einer Lösung des Polypeptids und Trocknen. Alternativ dazu kann ein immobilisierter Antikörper, z.B. ein monoklonaler Antikörper, der für das zu immobilisierende Polypeptid spezifisch ist, verwendet werden, um es an einer festen Oberfläche zu verankern. Der Test wird durch Zusetzen der nicht immobilisierten Komponente, die mit einer nachweisbaren Markierung markiert sein kann, zur immobilisierten Komponente, z.B. der beschichteten Oberfläche, die die verankerte Komponente enthält, durchgeführt. Sobald die Reaktion abgeschlossen ist, werden die nicht umgesetzten Komponenten, z.B. durch Waschen, entfernt, und Komplexe, die an der festen Oberfläche verankert sind, werden detektiert. Trägt die ursprünglich nicht immobilisierte Komponente eine nachweisbare Markierung, so zeigt die Detektion von Markierung, die an der Oberfläche immobilisiert ist, an, dass es zu Komplexbildung gekommen ist. Trägt die ursprünglich nicht immobilisierte Komponente keine Markierung, so kann Komplexbildung beispielsweise unter Verwendung eines markierten Antikörpers, der sich spezifisch an den immobilisierten Komplex bindet, nachgewiesen werden.
  • Findet zwischen der Kandidatenverbindung und einem bestimmten Rezeptor Wechselwirkung statt, kommt es jedoch zu keiner Bindung zwischen den beiden, so kann ihre Wechselwirkung mit diesem Polypeptid mittels Verfahren getestet werden, die zur Detektion von Protein-Protein-Wechselwirkungen bekannt sind. Solche Tests umfassen herkömmliche Ansätze, wie z.B. Vernetzung, Co-Immunfällung und Co-Reinigung durch Gradienten oder Chromatographiesäulen. Darüber hinaus können Protein-Protein-Wechselwirkungen unter Verwendung eines hefebasierten genetischen Systems, das von Fields und Mitarbeitern beschrieben wird (Fields & Song, Nature (London) 340, 245-246 (1989); Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 9578-9582 (1991)), wie von Chevray & Nathans (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 5789-5793 (1991)) offenbart, überwacht werden. Zahlreiche Transkriptionsaktivatoren, wie z.B. Hefe-GAL4, bestehen aus zwei physikalisch unterschiedlichen modularen Domänen, wobei eine als DNA-Bindungsdomäne wirkt, während die andere als Transkriptionsaktivierungsdomäne funktioniert. Das in den oben genannten Publikationen beschriebene Hefeexpressionssystem (im Allgemeinen als „Zwei-Hybrid-System" bezeichnet) profitiert von dieser Eigenschaft und verwendet zwei Hybridproteine, eines, in dem das Targetprotein an die DNA-Bindungsdomäne von GAL4 fusioniert ist, und ein anderes, in dem Kandidaten-Aktivierungsproteine an die Aktivierungsdomäne fusioniert sind. Die Expression eines GAL1-lacZ-Reportergens unter der Steuerung eines GAL4-aktivierten Promotors hängt von der Wiederherstellung von GAL4-Aktivität über Protein-Protein-Wechselwirkung ab. Kolonien, die wechselwirkende Polypeptide enthalten, werden mit einem chromogenen Substrat für β-Galactosidase detektiert. Ein vollständiges Set (MATCHMAKERTM) zur Identifikation von Protein-Protein-Wechselwirkungen zwischen zwei spezifischen Proteinen unter Verwendung des Zwei-Hybrid-Verfahrens ist im Handel bei Clontech erhältlich. Dieses System kann auch erweitert werden, um Proteindomänen, die in spezifische Proteinwechselwirkungen eingebunden sind, zu kartieren sowie um Aminosäurereste, die für diese Wechselwirkungen maßgeblich sind, zu lokalisieren.
  • H. Pharmazeutische Zusammensetzungen
  • Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung, Agonisten-Antikörper, die hierin identifizierte Proteine spezifisch binden, sowie andere Moleküle, die durch die hierin offenbarten Screening-Tests identifiziert werden, können zur Behandlung von Tumoren, einschließlich Krebs, in Form von pharmazeutischen Zusammensetzungen verabreicht werden.
  • Werden Antikörperfragmente verwendet, so wird das kleinste inhibierende Fragment, das sich spezifisch an die Bindungsdomäne des Targetproteins bindet, bevorzugt. Basierend auf den Sequenzen der variablen Regionen eines Antikörpers beispielsweise können Peptidmoleküle entworfen werden, die die Fähigkeit beibehalten, die Targetproteinsequenz zu binden. Solche Peptide können chemisch synthetisiert und/oder mittels DNA-Rekombinationsverfahren produziert werden (siehe z.B. Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 7889-7893(1993)).
  • Die Formulierung hierin kann, je nach Bedarf für die bestimmte zu behandelnde Indikation, auch mehr als eine aktive Verbindung enthalten, vorzugsweise jene mit komplementären Aktivitäten, die sich gegenseitig nicht negativ beeinflussen. Alterna tiv oder zusätzlich dazu kann die Zusammensetzung ein Mittel umfassen, das ihre Funktion verstärkt, wie z.B. ein zytotoxisches Mittel, ein Cytokin, ein chemotherapeutisches Mittel oder ein wachstumshemmendes Mittel. Solche Moleküle sind geeigneterweise in Kombination in Mengen vorhanden, die für den beabsichtigten Zweck wirksam sind.
  • Therapeutische Formulierungen der hierin identifizierten Polypeptide oder Agonisten davon werden zur Lagerung durch Vermischen des Wirkstoffs mit dem gewünschten Reinheitsgrad mit optionalen, pharmazeutisch annehmbaren Trägern, Arzneimittelträgern oder Stabilisatoren (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. Auflage, A. Osol. (Hrsg.) (1980)) in Form von lyophilisierten Formulierungen oder wässrigen Lösungen hergestellt. Annehmbare Träger, Arzneimittelträger oder Stabilisatoren sind in den verwendeten Dosierungen und Konzentrationen gegenüber Rezipienten nicht toxisch und umfassen Puffer wie z.B. Phosphat, Citrat und andere organische Säuren; Antioxidanzien, einschließlich Ascorbinsäure und Methionin; Konservierungsmittel (wie z.B. Octadecyldimethylbenzylammoniumchlorid; Hexamethoniumchlorid; Benzalkoniumchlorid, Benzethoniumchlorid; Phenol, Butyl- oder Benzylalkohol; Alkylparabene wie z.B. Methyl- oder Propylparaben; Catechin, Resorcin; Cyclohexanol; 3-Pentanol; und m-Kresol); niedermolekulare Polypeptide (mit weniger als etwa 10 Resten); Proteine wie z.B. Serumalbumin, Gelatine oder Immunglobuline; hydrophile Polymere wie z.B. Polyvinylpyrrolidon; Aminosäuren wie Glycin, Glutamin, Asparagin, Histidin, Arginin oder Lysin; Monosaccharide, Disaccharide und andere Kohlenhydrate einschließlich Glucose, Mannose oder Dextrine; Chelatbildner wie EDTA; Zucker wie z.B. Saccharose, Mannit, Trehalose oder Sorbit; salzbildende Gegenionen wie Natrium; Metallkomplexe (z.B. Zn-Protein-Komplexe); und/oder nichtionische Tenside wie TWEENTM, PLURONICSTM oder Polyethylenglykol (PEG).
  • Die Formulierung hierin kann, je nach Erfordernis für die jeweils zu behandelnde Indikation, auch mehr als eine aktive Verbindung enthalten, vorzugsweise solche mit komplementären Aktivitäten, die sich gegenseitig nicht negativ beeinflussen. Alternativ oder zusätzlich dazu kann die Zusammensetzung ein zytotoxisches Mittel, Cytokin oder ein wachstumshemmendes Mittel umfassen. Solche Moleküle sind geeigneter weise in Kombination in Mengen, die für den beabsichtigten Zweck wirksam sind, vorhanden.
  • Die Wirkstoffe können auch in Mikrokapseln eingeschlossen sein, die beispielsweise durch Koazervierungsverfahren oder durch Grenzflächenpolymerisation hergestellt werden, beispielsweise Hydroxymethylcellulose bzw. Gelatine-Mikrokapseln und Poly(methylmethacrylat)-Mikrokapseln in kolloidalen Arzneimittelzufuhrsystemen (beispielsweise Liposomen, Albuminmikrokügelchen, Mikroemulsionen, Nanopartikeln und Nanokapseln), oder in Makroemulsionen. Solche Verfahren sind in Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. Auflage, A. Osol (Hrsg.) (1980), offenbart.
  • Die zur In-vivo-Verabreichung zu verwendenden Formulierungen müssen steril sein. Dies kann leicht durch Filtration durch sterile Filtrationsmembranen vor oder nach Lyophilisierung und Rekonstitution erreicht werden.
  • Therapeutische Zusammensetzungen hierin werden im Allgemeinen in Behältnisse gefüllt, die eine sterile Zugangsöffnung aufweisen, beispielsweise einen Beutel für intravenöse Lösungen oder eine Phiole mit einem Septum, das mit einer subkutanen Injektionsnadel durchstochen werden kann.
  • Es können Retardpräparate hergestellt werden. Geeignete Beispiele für Retardpräparate umfassen semipermeable Matrices aus festen hydrophoben Polymeren, die den Antikörper enthalten, wobei diese Matrices in Form von Formteilen, z.B. Folien oder Mikrokapseln, vorliegen. Beispiele für Retard-Matrices umfassen Polyester, Hydrogele (beispielsweise Poly(2-hydroxyethylmethacrylat) oder Poly(vinylalkohol)), Polylactide ( US-Patent Nr. 3.773.919 ), Copolymere von L-Glutaminsäure und γ-Ethyl-L-glutamat, nicht abbaubare Ethylen-Vinylacetat-, abbaubare Milchsäure-Glykolsäure-Copolymere wie z.B. LUPRON DEPOTTM (injizierbare Mikrokügelchen, zusammengesetzt aus Milchsäure-Glykolsäure-Copolymer und Leuprolidacetat) und Poly-D-(-)-3-hydroxybuttersäure. Während Polymere wie Ethylen-Vinylacetat und Milchsäure-Glykolsäure die Freisetzung von Molekülen über mehr als 100 Tage hinweg ermöglichen, setzen bestimmte Hydrogele Proteine innerhalb von kürzeren Zeiträu men frei. Bleiben eingekapselte Antikörper länger im Körper zurück, so können sie infolge der Aussetzung gegenüber Feuchtigkeit bei 37°C denaturieren oder aggregieren, was zu einem Verlust an biologischer Aktivität und möglichen Veränderungen der Immunogenität führt. Je nach eingebundenem Mechanismus können vernünftige Vorgehensweisen zur Stabilisierung entwickelt werden. Wird der Aggregationsmechanismus beispielsweise als intermolekulare S-S-Bindungsbildung über Thio-Disulfid-Wechselwirkung erkannt, so kann Stabilisierung durch Modifizieren von Sulfhydrylresten, Lyophilisieren aus sauren Lösungen, Steuern des Feuchtigkeitsgehalts, Verwenden geeigneter Additive und Entwickeln spezifischer Polymermatrix-Zusammensetzungen erzielt werden.
  • I. Behandlungsverfahren
  • Es wird erwogen, dass die Polypeptide der vorliegenden Erfindung und ihre Agonisten, einschließlich Antikörper, Peptide und niedermolekularer Agonisten, verwendet werden können, um verschiedene Tumoren, z.B. Krebsarten, zu behandeln. Beispiele für Leiden oder Erkrankungen, die behandelt werden können, umfassen gut- oder bösartige Tumoren (z.B. Nieren-, Leber-, Blasen-, Brust-, Magen-, Ovarial-, Kolorektal-, Prostata-, Bauchspeicheldrüsen-, Lungen-, Vulva-, Schilddrüsen- und Leberkarzinome; Sarkome; Glioblastome; und verschiedene Kopf- und Halstumoren); Leukämiearten und Malignitäten an den Lymphorganen; andere Erkrankungen wie neuronale, gliale, Astrozyten-, Hypothalamus- und andere Drüsenstörungen, Makrophagen-, Epithel-, Stroma- und Blastozöl-Erkrankungen; und Entzündungs-, Gefäßbildungs- und Immunkrankheiten. Die Antitumormittel der vorliegenden Erfindung (einschließlich der hierin offenbarten Polypeptide und Agonisten, die ihre Aktivität nachahmen, z.B. Antikörper, Peptide und kleine organische Moleküle) werden einem Säugetier, vorzugsweise einem Menschen, gemäß bekannten Verfahren, wie z.B. durch intravenöse Verabreichung in Form eines Bolus oder durch kontinuierliche Infusion über einen bestimmten Zeitraum hinweg oder durch intramuskuläre, intraperitoneale, intrazerebrospinale, intraokulare, intraarterille, intraläsionale, subkutane, intraartikuläre, intrasynoviale, intrathekale, orale oder topische Verabreichung oder durch Inhalation, verabreicht.
  • Andere therapeutische Behandlungspläne können mit der Verabreichung der Antikrebsmittel der vorliegenden Erfindung kombiniert werden. Beispielsweise kann der mit solchen Antikrebsmitteln zu behandelnde Patient auch gleichzeitig Strahlentherapie unterzogen werden. Alternativ oder zusätzlich dazu kann dem Patienten ein chemotherapeutisches Mittel verabreicht werden. Präparate und Dosierungspläne für solche chemotherapeutischen Mittel können gemäß den Angaben des Herstellers oder laut empirischer Bestimmung durch den Facharzt verwendet werden. Vorbereitungs- und Dosierungspläne für solch eine Chemotherapie werden auch in Chemotherapy Service, M.C. Perry (Hrsg.), Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992), beschrieben. Das chemotherapeutische Mittel kann vor oder nach Verabreichung des Antitumormittels der vorliegenden Erfindung verabreicht werden oder kann auch gleichzeitig damit zugeführt werden. Die Antikrebsmittel der vorliegenden Erfindung können mit einer Anti-Östrogen-Verbindung wie Tamoxifen oder einem Anti-Progesteron wie Onapriston (siehe die EP 616.812 ) in für solche Moleküle bekannten Dosierungen kombiniert werden.
  • Es kann wünschenswert sein, auch Antikörper gegen Tumor-assoziierte Antigene zu verabreichen, wie beispielsweise Antikörper, die sich an ErbB2, EGFR, ErbB3, ErbB4 oder Gefäßendothelwachstumsfaktor (VEGF) binden. Alternativ oder zusätzlich dazu können zwei oder mehrere Antikörper, die dieselben oder zwei oder mehrere verschiedene Krebs-assoziierte Antigene binden, dem Patienten gleichzeitig verabreicht werden. Manchmal kann es von Nutzen sein, dem Patienten auch ein oder mehrere Cytokine zu verabreichen. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die vorliegenden Antikrebsmittel zusammen mit einem wachstumshemmenden Mittle verabreicht. Das wachstumshemmende Mittel kann beispielsweise als erstes verabreicht werden, und hierauf folgt die Verabreichung eines Antikrebsmittels der vorliegenden Erfindung. Es werden jedoch auch gleichzeitige Verabreichung oder Verabreichung des Antikrebsmittels der vorliegenden Erfindung als erstes in Betracht gezogen. Geeignete Dosierungen für das wachstumshemmende Mittel sind jene, die zur Zeit verwendet werden, und können aufgrund der kombinierten Wirkung (Synergie) des wachstumshemmenden Mittels und des vorliegenden Antikörpers reduziert werden.
  • Zur Prävention oder Behandlung von Erkrankung hängt die geeignete Dosierung eines Antitumormittels der vorliegenden Erfindung vom Typ der zu behandelnden Erkrankung, wie oben definiert, von Schwere und Verlauf der Erkrankung, davon, ob das Mittel zu präventiven oder therapeutischen Zwecken verabreicht wird, von der Anamnese des Patienten und seiner Reaktion auf das Mittel sowie vom Ermessen des behandelnden Arztes ab. Das Mittel wird dem Patienten geeigneterweise einnmalig oder im Rahmen einer Reihe von Behandlungen verabreicht. Tierversuche liefern zuverlässige Hinweise auf die Festlegung wirksamer Dosen für die Therapie für Menschen. Das Umrechnen wirksamer Dosen von einer Spezies auf eine andere kann gemäß den Prinzipien erfolgen, die von J. Mordenti & W. Chappell, „The use of interspecies scaling in toxicokinetics", in: Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi et al. (Hrsg.), Pergamon Press, New York, 42-96 (1989), dargelegt wurden.
  • Je nach Typ und Schwere der Erkrankung sind beispielsweise etwa 1 μg/kg bis 15 mg/kg (z.B. 0,1-20 mg/kg) des Antitumormittels eine anfängliche Kandidatendosierung zur Verabreichung an den Patienten entweder mittels einer oder mehrerer getrennter Verabreichungen oder mittels kontinuierlicher Infusion. Eine typische tägliche Dosierung kann, je nach den oben genannten Faktoren, im Bereich von etwa 1 μg/kg bis 100 mg/kg oder mehr liegen. Im Fall der wiederholten Verabreichung über mehrere Tage hinweg oder länger wird, je nach betreffendem Leiden, die Behandlung fortgesetzt, bis eine erwünschte Unterdrückung der Krankheitssymptome eintritt. Es können jedoch auch andere Dosierungspläne nützlich sein. Der Fortschritt dieser Therapie kann leicht mittels herkömmlicher Verfahren und Tests überwacht werden. Ein Leitfaden zu bestimmen Dosierungen und Verabreichungsverfahren ist in der Literatur zu finden; siehe beispielsweise die US-Patente Nr. 4.657.760 ; 5.206.344 oder 5.225.212 . Es wird vorweggenommen, dass verschiedene Formulierungen für verschiedene Behandlungsverbindungen und verschiedene Erkrankungen wirksam sind, dass die Verabreichung, die auf ein Organ oder Gewebe abzielt, beispielsweise die Zufuhr des Wirkstoffs auf eine andere Weise erfordern kann als im Fall eines anderen Organs oder Gewebes.
  • J. Herstellungsartikel
  • In einer Ausführungsform der Erfindung wird ein Herstellungsartikel, der Materialien enthält, die für die Diagnose oder Behandlung der oben beschriebenen Erkrankungen nützlich sind, bereitgestellt. Der Herstellungsartikel umfasst ein Behältnis und eine Markierung. Geeignete Behältnisse umfassen beispielsweise Flaschen, Phiolen, Spritzen und Teströhrchen. Die Behältnisse können aus zahlreichen verschiedenen Materialien wie z.B. Glas oder Kunststoff hergestellt sein. Das Behältnis enthält eine Zusammensetzung, die zur Diagnose oder Behandlung des Leidens wirksam ist, und kann eine sterile Zugangsöffnung aufweisen (beispielsweise kann das Behältnis ein intravenöser Lösungsbeutel oder eine Phiole mit einem Septum, das mit einer subkutanen Injektionsnadel durchstochen werden kann, sein). Der Wirkstoff in der Zusammensetzung ist ein Antitumormittel der vorliegenden Erfindung. Die Markierung am Behältnis oder in Verbindung mit dem Behältnis gibt an, dass die Zusammensetzung zur Diagnose oder Behandlung der betreffenden Erkrankung verwendet wird. Der Herstellungsartikel kann ferner ein zweites Behältnis umfassen, das einen pharmazeutisch annehmbaren Puffer wie z.B. phosphatgepufferte Kochsalzlbsung, Ringer-Lösung und Dextrose-Lösung umfasst. Weiters kann er andere Materialien umfassen, die aus wirtschaftlicher Sicht und aus der Sicht des Benutzers wünschenswert sind, einschließlich anderer Puffer, Verdünnungsmittel, Filter, Nadeln, Spritzen und Packungsbeilagen mit Bedienungsanleitungen.
  • Die folgenden Beispiele werden ausschließlich zur Veranschaulichung und in keiner Weise als Einschränkung des Schutzumfangs der vorliegenden Erfindung bereitgestellt.
  • BEISPIELE
  • Im Handel erhältliche Reagenzien, auf die in den Beispielen verwiesen wird, wurden, sofern nichts anderes angemerkt ist, gemäß den Angaben der Hersteller verwendet. Die Quelle jener Zellen, die in den folgenden Beispielen und in der gesamten Be schreibung anhand von ATCC-Zugriffsnummern identifiziert werden, ist die American Type Culture Collection, Manassas, VA.
  • BEISPIEL 1
  • Isolieren von cDNA-Klonen, die für PRO172 kodieren
  • PRO172
  • Die extrazellulären Domänen-(ECD-)Sequenzen (einschließlich der Sekretionssignalsequenz, sofern vorhanden) aus etwa 950 bekannten sekretierten Proteinen aus der öffentlich zugänglichen Swiss-Prot-Datenbank wurden verwendet, um EST-Datenbanken zu durchsuchen. Die EST-Datenbanken umfassten öffentliche Datenbanken (z.B. GenBank) und private Datenbanken (LIFESEQTM, Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA). Die Suche wurde unter Verwendung des Computerprogramms BLAST oder BLAST-2 (Altschul et al., Methods in Enzymology 266, 460-480 (1996)) in Form eines Vergleichs der ECD-Proteinsequenzen mit einer 6-Raster-Translation der EST-Sequenzen durchgeführt. Diese Vergleiche, die zu einem BLAST-Score von 70 (oder in manchen Fällen von 90) oder mehr führen, die nicht für bekannte Proteine kodierten, wurden gruppiert und mit dem Programm „phrap" (Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington) zu Consensus-DNA-Sequenzen assembliert.
  • Eine Consensus-DNA-Sequenz wurde in Bezug auf andere EST-Sequenzen unter Verwendung von phrap, wie oben beschrieben, assembliert. Diese Consensus-Sequenz wird hierin als DNA28765 bezeichnet. In manchen Fällen stammt die Consensus-Sequenz von einer Zwischen-Consensus-DNA-Sequenz, die mittels wiederholter Zyklen von BLAST und phrap verlängert wurde, um die Zwischen-Consensus-Sequenz unter Verwendung der Quellen von zuvor erläuterten EST-Sequenzen möglichst weit zu verlängern.
  • Auf Grundlage der DNA28765-Consensus-Sequenz wurden Oligonucleotide synthetisiert: 1) um mittels PCR eine cDNA-Bibliothek zu identifizieren, die die Sequenz von Interesse enthielt, und 2) zur Verwendung als Sonden, um einen Klon der Volllängen-Kodiersequenz für das PRO172 zu isolieren. Vorwärts- und Rückwärts-PCR-Primer weisen im Allgemeinen 20 bis 30 Nucleotide auf und sind oft so beschaffen, dass sie ein PCR-Produkt mit einer Länge von etwa 100-1.000 bp ergeben. Die Sondensequenzen weisen typischerweise eine Länge von 40-55 bp auf. In manchen Fällen werden zusätzliche Oligonucleotide synthetisiert, wenn die Consensussequenz länger als etwa 1-1,5 kbp war. Um mehrere Bibliotheken auf einen Volllängenklon zu screenen, wurde DNA aus den Bibliotheken durch PCR-Amplifikation, wie von Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, s.o., beschrieben, mit dem PCR-Primerpaar gescreent. Eine positive Bibliothek wurde dann verwendet, um unter Verwendung des Sonden-Oligonucleotids und eines der Primerpaare Klone zu isolieren, die für das Gen von Interesse kodieren.
  • PCR-Primer (vorwärts und rückwärts) wurden synthetisiert:
  • Vorwärts-PCR-Primer:
    • 5'-GGATCTCGAGAACAGCTACTCCC-3' (Seq.-ID Nr. 3)
  • Rückwärts-PCR-Primer:
    • 5'-TCGTCCACGTTGTCGTCACATG-3' (Seq.-ID Nr. 4)
  • Darüber hinaus wurde eine synthetische Oligonucleotid-Hybridisierungssonde aus der Consensus-DNA28765-Sequenz konstruiert, die die folgende Nucleotidsequenz aufwies:
  • Hybridisierungssonde:
    • 5'-AAATCTGTOAATTGAGTGCCATGGACCTGTTGCGGACGGCCCTTGCTT-3' (Seq.-ID Nr. 5)
  • RNA zur Konstruktion der cDNA-Bibliotheken wurde aus menschlichem fötalem Lungengewebe isoliert. Die cDNA-Bibliotheken, die verwendet wurden, um die cDNA-Klone zu isolieren, wurden mittels Standardverfahren unter Verwendung von handelsüblichen Reagenzien wie z.B. jenen von Invitrogen, San Diego, CA, konstruiert.
  • Die cDNA wurde mit Oligo-dT, das eine NotI-Stelle enthielt, geprimt, mit dem stumpfen Ende an SalI-halbkinasierte Adaptoren gebunden, mit NotI gespalten, mittels Gelelektrophorese ungefähr der Größe nach geordnet und in einer definierten Ausrichtung in einen geeigneten Klonierungsvektor (wie z.B. pRKB oder pRKD; pRK5B ist ein Vorläufer von pRK5D, der die SfiI-Stele nicht enthält; siehe Holmes et al., Science 253, 1278-1280 (1991)) in die einmaligen XhoI- und NotI-Stellen kloniert.
  • DNA-Sequenzieren der wie oben beschrieben isolierten Klone ergab die Volllängen-DNA-Sequenz für ein Volllängen-PRO172-Polypeptid (das hierin als DNA35916-1161 (1A-B, Seq.-ID Nr. 1) bezeichnet wird) und die abgeleitete Proteinsequenz für dieses PRO172-Polypeptid.
  • Der oben identifizierte Klon voller Länge enthielt einen einzelnen offenen Leseraster mit einer offensichtlichen Translationsinitiationsstelle an den Nucleotidpositionen 38-40 und einem Stoppsignal an den Nucleotidpositionen 2207-2209 (1A-B, Seq.-ID Nr. 1). Der vorhergesagte Polypeptidvorläufer ist 723 Aminosäuren lang. Eine Analyse der in 2 gezeigten Volllängen-PRO172-Sequenz (Seq.-ID Nr. 2) beweist die Gegenwart zahlreicher verschiedener wichtiger Polypeptiddomänen, worin die für jene wichtigen Polypeptiddomänen angegebenen Positionen, wie oben beschrieben, nur ungefähre Werte sind. Eine Analyse der Volllängen-PRO172-Sequenz zeigte Folgendes: ein Signalpeptid von etwa Aminosäure 1 bis etwa Aminosäure 21; eine Transmembrandomäne von etwa Aminosäure 548 bis etwa Aminosäure 568; eine N-Glykosylierungsstelle von etwa Aminosäure 477 bis etwa Aminosäure 481; eine cAMP- und cGMP-abhängige Proteinkinase-Phosphorylierungsstelle von etwa Aminosäure 660 bis etwa Aminosäure 664; Caseinkinase-II-Phosphorylierungsstellen von etwa Aminosäure 93 bis etwa Aminosäure 97, von etwa Aminosäure 131 bis etwa Aminosäure 135, von etwa Aminosäure 154 bis etwa Aminosäure 158, von etwa Aminosäure 203 bis etwa Aminosäure 207, von etwa Aminosäure 342 bis etwa Aminosäure 346, von etwa Aminosäure 344 bis etwa Aminosäure 348, von etwa Aminosäure 369 bis etwa Aminosäure 373, von etwa Aminosäure 457 bis etwa Aminosäure 461, von etwa Aminosäure 483 bis etwa Aminosäure 487, von etwa Aminosäure 495 bis etwa Aminosäure 499, von etwa Aminosäure 659 bis etwa Aminosäure 663, von etwa Aminosäure 670 bis etwa Aminosäure 674, von etwa Aminosäure 671 bis etwa Aminosäure 675 und von etwa Aminosäure 698 bis etwa Aminosäure 702; Tyrosinkinase-Phosphorylierungsstellen von etwa Aminosäure 176 bis etwa Aminosäure 185 und von etwa Aminosäure 252 bis etwa Aminosäure 261; N-Myristoylierungsstellen von etwa Aminosäure 2 bis etwa Aminosäure 8, von etwa Aminosäure 37 bis etwa Aminosäure 43, von etwa Aminosäure 40 bis etwa Aminosäure 46, von etwa Aminosäure 98 bis etwa Aminosäure 104, von etwa Aminosäure 99 bis etwa Aminosäure 105, von etwa Aminosäure 262 bis etwa Aminosäure 268, von etwa Aminosäure 281 bis etwa Aminosäure 287, von etwa Aminosäure 282 bis etwa Aminosäure 288, von etwa Aminosäure 301 bis etwa Aminosäure 307, von etwa Aminosäure 310 bis etwa Aminosäure 316, von etwa Aminosäure 328 bis etwa Aminosäure 334, von etwa Aminosäure 340 bis etwa Aminosäure 346, von etwa Aminosäure 378 bis etwa Aminosäure 384, von etwa Aminosäure 387 bis etwa Aminosäure 393, von etwa Aminosäure 512 bis etwa Aminosäure 518, von etwa Aminosäure 676 bis etwa Aminosäure 682, von etwa Aminosäure 683 bis etwa Aminosäure 689 und von etwa Aminosäure 695 bis etwa Aminosäure 701; Asparaginsäure und Asparaginhydroxylierungsstellen von etwa Aminosäure 343 bis 355, von etwa Aminosäure 420 bis etwa Aminosäure 432 und von Aminosäure 458 bis etwa Aminosäure 480; eine Prokaryontenmembran-Lipoprotein-Lipid-Anbindungsstelle von etwa Aminosäure 552 bis etwa Aminosäure 563; und EGF-ähnliche Domänen-Cysteinmustersignaturen von etwa Aminosäure 243 bis etwa Aminosäure 255, von etwa Aminosäure 274 bis etwa Aminosäure 286, von etwa Aminosäure 314 bis etwa Aminosäure 326, von etwa Aminosäure 352 bis etwa Aminosäure 364, von etwa Aminosäure 391 bis etwa Aminosäure 403, von etwa Aminosäure 429 bis etwa Aminosäure 441, von etwa Aminosäure 467 bis etwa Aminosäure 479 und von etwa Aminosäure 505 bis etwa Aminosäure 517.
  • Klon DNA35916-1161 wurde am 28. Oktober 1997 bei der ATCC hinterlegt und bekam die ATCC-Hinterlegungs-Nr. 209419 zugeteilt.
  • Eine Analyse der Dayhoff-Datenbank (Version 35.45 SwissProt 35) unter Verwendung der WU-BLAST2-Sequenzangleichungsanalyse der in 2 gezeigten Se quenz voller Länge (Seq.-ID Nr. 2) zeigte eine Sequenzidentität von 89 % zwischen der PRO172-Aminosäuresequenz und dem Delta-1-Mausprotein.
  • BEISPIEL 2
  • Expression von PRO172 in E. coli
  • Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung einer unglykosylierten Form von PRO172 durch rekombinante Expression in E. coli.
  • Die für PRO172 kodierende DNA-Sequenz wird anfänglich unter Verwendung von selektierten PCR-Primern amplifiziert. Die Primer sollten Restriktionsenzymstellen enthalten, die den Restriktionsenzymstellen am ausgewählten Expressionsvektor entsprechen. Zahlreiche verschiedene Expressionsvektoren können verwendet werden. Ein Beispiel für einen geeigneten Vektor ist pBR322 (abgeleitet von E. coli; siehe Bolivar et al., Gene 2, 95 (1977)), der Gene für Ampicillin- und Tetracyclinresistenz enthält. Der Vektor wird mit Restriktionsenzym verdaut und dephosphoryliert. Die PCR-amplifizierten Sequenzen werden dann in den Vektor ligiert. Der Vektor umfasst vorzugsweise Sequenzen, die für ein Antibiotikaresistenzgen kodieren, einen trp-Promotor, einen Polyhis-Leader (einschließlich der ersten sechs STII-Codons, Polyhis-Sequenz und Enterokinase-Spaltungsstelle), die PRO172-Kodierregion, den λ-Transkriptionsterminator und ein argU-Gen.
  • Das Ligationsgemisch wird dann verwendet, um einen ausgewählten E.-coli-Stamm unter Anwendung der in Sambrook et al., s.o., beschriebenen Verfahren zu transformieren. Transformanten werden anhand ihrer Fähigkeit identifiziert, auf LB-Platten zu wachsen, und Antibiotika-resistente Kolonien werden dann selektiert. Plasmid-DNA kann isoliert und durch Restriktionsanalyse und DNA-Sequenzieren bestätigt werden.
  • Selektierte Klone können über Nacht in flüssigem Kulturmedium wie beispielsweise LB-Nährmedium, ergänzt mit Antibiotika, gezüchtet werden. Die Übernacht-Kultur kann in weiterer Folge verwendet werden, um eine Kultur größeren Ausmaßes zu inokulieren. Die Zellen werden dann bis zu einer gewünschten optischen Dichte gezüchtet, währenddessen der Expressionspromotor aktiviert wird.
  • Nach dem Kultivieren der Zellen über mehrere weitere Stunden hinweg können die Zellen durch Zentrifugation geerntet werden. Das durch die Zentrifugation erhaltene Zellpellet kann unter Verwendung verschiedener, auf dem Gebiet der Erfindung bekannter Mittel solubilisiert werden, und das solubilisierte PRO172-Protein kann dann unter Verwendung einer Metallchelatbildnersäule unter Bedingungen, die eine feste Bindung des Proteins ermöglichen, gereinigt werden.
  • PRO172 kann in E. coli in einer poly-His-markierten Form unter Verwendung des folgenden Verfahrens exprimiert werden. Die für PRO172 kodierende DNA wird anfänglich unter Verwendung selektierter PCR-Primer amplifiziert. Die Primer enthalten Restriktionsenzymstellen, die den Restriktionsenzymstellen am ausgewählten Expressionsvektor entsprechen, sowie andere nützliche Sequenzen, die für wirksame und zuverlässige Translationsinitiation, rasche Reinigung an einer Metallchelatierungssäule und proteolytische Entfernung mit Enterokinase sorgen. Die PCR-amplifizierten, poly-His-markierten Sequenzen werden dann in einen Expressionsvektor ligiert, der verwendet wird, um einen E.-coli-Wirt, basierend auf Stamm 52 (W3110 fuhA(tonA) Ion galE rpoHts(htpRts) c(pP(laclq)), zu transformieren. Transformanten werden zuerst in LB, das 50 mg/ml Carbenicillin enthält, bei 30°C unter Schütteln gezüchtet, bis eine O.D.600 von 3-5 erreicht ist. Kulturen werden dann in CRAP-Medium (hergestellt durch Vermischen von 3,57 g (NH4)2SO4, 0,71 g Natriumcitrat 2H2O, 1,07 g KCl, 5,36 g Difco Hefeextrakt, 5,36 g Sheffield-Hycase SF in 500 ml Wasser sowie 110 mM MPOS, pH 7,3, 0,55 % (Gew./Vol.) Glucose und 7 mM MgSO4) auf das 50- bis 100fache verdünnt und etwa 20-30 Stunden lang bei 30°C unter Schütteln gezüchtet. Proben werden dann entnommen, um Expression durch SDS-PAGE-Analyse zu überprüfen, und der Hauptteil der Kultur wird zentrifugiert, um die Zellen zu pelletieren. Zellpellets werden bis zur Reinigung und Neufaltung eingefroren.
  • E.-coli-Paste aus 0,5- bis 1-1-Fermentationen (6-10 g Pellets) wird im 10fachen Volumen (Gew./Vol.) an 7 M Guanidin, 20 mM Tris, pH 8 (Puffer) resuspendiert. Festes Natriumsulfit und Natriumtetrathiosulfat werden zugesetzt, um Endkonzentrationen von 0,1 M bzw. 0,02 M zu erreichen, und die Lösung wird über Nacht bei 4°C gerührt. Dieser Schritt führt zu einem denaturierten Protein, in dem alle Cysteinreste durch Sulfitolisierung blockiert sind. Die Lösung wird bei 40.000 U/min in einer Beckman-Ultrazentrifuge 30 min lang zentrifugiert. Der Überstand wird mit dem 3- bis 5fachen Volumen Metallchelatsäulenpuffer (6 M Guanidin, 20 mM Tris, pH 7,4) verdünnt und durch 0,22-μm-Filter zur Klärung filtriert. Der geklärte Extrakt wird auf eine 5-ml-Qiagen-Ni-NTA-Metallchelatsäule geladen, die in Metallchelatsäulenpuffer äquilibriert wurde. Die Säule wird mit zusätzlichem Puffer gewaschen, der 50 mM Imidazol (Calbiochem, Utrol-Reinheit), pH 7,4, enthält. Das Protein wird mit Puffer, der 250 mM Imidazol enthält, eluiert. Die das gewünschte Protein enthaltenden Fraktionen werden gesammelt und bei 4°C gelagert. Die Proteinkonzentration wird durch sein Absorptionsvermögen bei 280 nm unter Verwendung des berechneten Extinktionskoeffizienten basierend auf seiner Aminosäuresequenz geschätzt.
  • Die Proteine werden durch Verdünnen der Probe langsam in frisch hergestellten Neufaltungspuffer, der aus 20 mM Tris, pH 8,6, 0,3 M NaCl, 2,5 M Harnstoff, 5 mM Cystein, 20 mM Glycin und 1 mM EDTA besteht, neu gefaltet. Neufaltungsvolumina werden so ausgewählt, dass die Endproteinkonzentration zwischen 50 und 100 μg/ml liegt. Die Neufaltungslösung wird sanft bei 4°C 12-36 Stunden lang gerührt. Die Neufaltungsreaktion wird durch den Zusatz von TFA in einer Endkonzentration von 0,4 % (pH etwa 3) gequencht. Vor weiterer Reinigung des Proteins wird die Lösung durch ein 0,22-μm-Filter filtriert, und Acetonitril wird zur Erreichung einer 2-10%igen Endkonzentration zugesetzt. Das neugefaltete Protein wird an einer Poros-R1/H-Umkehrphasensäule unter Verwendung eines mobilen Puffers von 0,1 % TFA mittels Flution mit einem Acetonitril-Gradienten von 10 bis 80 % chromatographiert. Aliquoten von Fraktionen mit A280-Absorption werden an SDS-Polyacrylamidgelen analysiert, und Fraktionen, die homogenes neugefaltetes Protein enthalten, werden gesammelt. Im Allgemeinen eluieren die korrekt gefalteten Spezies der meisten Proteine bei den niedrigsten Acetonitril-Konzentrationen, da diese Spezies mit ihrem hydrophoben Inneren am kompaktesten und vor Wechselwirkung mit dem Umkehrphasenharz geschützt sind. Aggregierte Spezies eluieren üblicherweise bei höheren Acetonitril-Konzentrationen. Zusätzlich zum Auflösen fehlgefalteter Formen von Proteinen von der gewünschten Form entfernt der Umkehrphasenschritt auch Endotoxin aus den Proben.
  • Fraktionen, die das gewünschte gefaltete PRO172-Polypeptid enthalten, werden gesammelt, und das Acetonitril wird unter Verwendung eines schwachen Stickstoffstroms, der auf die Lösung gerichtet ist, entfernt. Proteine werden in 20 mM Hepes, pH 6,8, mit 0,14 M Natriumchlorid und 4 % Mannit durch Dialyse oder durch Gelfiltration unter Verwendung von G25-Superfine-Harzen (Pharmacia), äquilibriert im Formulierungspuffer, formuliert und steril filtriert.
  • BEISPIEL 3
  • Expression von PRO172 in Säugetierzellen
  • Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung einer potenziell glykosylierten Form von PRO172 durch rekombinante Expression in Säugetierzellen.
  • Der Vektor pRK5 (siehe die EP 307.247 , veröffentlicht am 15. März 1989) wird als Expressionsvektor verwendet. Gegebenenfalls wird die PRO172-DNA unter Anwendung von Ligationsverfahren, wie sie in Sambrook et al., s.o., beschrieben werden, mit ausgewählten Restriktionsenzymen, um Insertion der PRO172-DNA zu ermöglichen, in pRK5 ligiert. Der resultierende Vektor wird als pRK5-PRO172 bezeichnet.
  • In einer Ausführungsform können die ausgewählten Wirtszellen 293-Zellen sein. Menschliche 293-Zellen (ATCC CCL 1573) werden bis zur Konfluenz in Gewebekulturplatten in Medium wie z.B. DMEM, ergänzt mit fötalem Kälberserum und gegebenenfalls Nährstoffkomponenten und/oder Antibiotika, gezüchtet. Etwa 10 μg pRK5-PRO172-DNA werden mit etwa 1 μg DNA, die für das VA-RNA-Gen kodiert [Thimmappaya et al., Cell 31, 543 (1982)], vermischt und in 500 μl von 1 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, 0,227 M CaCl2 aufgelöst. Zu diesem Gemisch werden 500 μl von 50 mM HEPES (pH 7,35), 280 mM NaCl, 1,5 mM NaPO4 zugetropft, und ein Niederschlag wird 10 min lang bei 25°C bilden gelassen. Der Niederschlag wird suspen dient, zu den 293-Zellen zugesetzt und etwa vier Stunden lang bei 37°C absetzen gelassen. Das Kulturmedium wird abgesaugt, und 2 ml von 20 % Glycerin in PBS werden 30 Sekunden lang zugesetzt. Die 293-Zellen werden dann mit serumfreiem Medium gewaschen, frisches Medium wird zugesetzt, und die Zellen werden etwa 5 Tage lang inkubiert.
  • Etwa 24 Stunden nach den Transfektionen wird das Kulturmedium entfernt und durch Kulturmedium (alleine) oder Kulturmedium, das 200 μCi/ml 35S-Cystein und 200 μCi/ml 35S-Methionin enthält, ersetzt. Nach einer 12-ständigen Inkubation wird das konditionierte Medium gesammelt, an einem Zentrifugenfilter eingeengt und auf ein 15%iges SDS-Gel geladen. Das bearbeitete Gel kann getrocknet werden, und ein Film kann damit eine ausgewählte Zeitspanne lang belichtet werden, um die Gegenwart von PRO172-Polypeptid aufzuzeigen. Die Kulturen, die transfizierte Zellen enthalten, können weiterer Inkubation (in serumfreiem Medium) unterzogen werden, und das Medium wird in ausgewählten Biotests getestet.
  • In einem alternativen Verfahren kann PRO172 in 293-Zellen unter Verwendung des Dextransulfatverfahrens, das von Somparyrac et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 12, 7575 (1981), beschrieben wird, vorübergehend eingeführt werden. 293-Zellen werden in einem Zentrifugenkolben bis zu maximaler Dichte gezüchtet, und 700 μg pRK5-PRO-172-DNA werden zugesetzt. Die Zellen werden zuerst aus dem Zentrifugenkolben durch Zentrifugieren eingeengt und mit PBS gewaschen. Das DNA-Dextran-Präzipitat wird am Zellpellet vier Stunden lang inkubiert. Die Zellen werden mit 20 % Glycerin 90 Sekunden lang behandelt, mit Gewebekulturmedium gewaschen und neuerlich in den Zentrifugenkolben, der Gewebekulturmedium, 5 μg/ml Rinderinsulin und 0,1 μg/ml Rindertransferrin enthält, eingeführt. Nach etwa vier Tagen wird das konditionierte Medium zentrifugiert und filtriert, um Zellen und Zelltrümmer zu entfernen. Die Probe, die exprimiertes PRO172 enthält, kann dann eingeengt und mittels jedes beliebigen Verfahrens wie z.B. Dialyse und/oder Säulenchromatographie gereinigt werden.
  • In einer anderen Ausführungsform kann PRO172 in CHO-Zellen exprimiert werden. Das pRK5-PRO172 kann unter Verwendung bekannter Reagenzien wie beispielsweise CaPO4 oder DEAE-Dextran in CHO-Zellen transfiziert werden. Wie zuvor beschrieben können die Zellkulturen inkubiert und das Medium durch Kulturmedium (alleine) oder Medium, das eine radioaktive Markierung wie z.B. 35S-Methionin enthält, ersetzt werden. Nach Bestimmen der Gegenwart eines PRO172-Polypeptids kann das Kulturmedium durch serumfreies Medium ersetzt werden. Vorzugsweise werden die Kulturen etwa 6 Tage lang inkubiert, und dann wird das konditionierte Medium geerntet. Das das exprimierte PRO172 enthaltende Medium kann dann konzentriert und durch jedes ausgewählte Verfahren gereinigt werden.
  • Epitopmarkiertes PRO172 kann auch in CHO-Wirtszellen exprimiert werden. Das PRO172 kann aus dem pRK5-Vektor subkloniert werden. Das Subklon-Insert kann PCR unterzogen werden, um in Raster mit einer ausgewählten Epitopmarkierung wie beispielsweise einer poly-His-Markierung in einen Baculovirus-Expressionsvektor zu fusionieren. Das poly-His-markierte PRO172-Insert kann dann in einen SV40-gesteuerten Vektor subkloniert werden, der einen Selektionsmarker wie z.B. DHFR zur Selektion stabiler Klone enthält. Schließlich können die CHO-Zellen (wie zuvor beschrieben) mit dem SV40-gesteuerten Vektor transfiziert werden. Es kann eine Markierung wie zuvor beschrieben vorgesehen werden, um Expression zu überprüfen. Das Kulturmedium, welches das exprimierte poly-His-markierte PRO172 enthält, kann dann eingeengt und durch jedes ausgewählte Verfahren wie z.B. durch Ni2+-Chelat-Affinitätschromatographie gereinigt werden.
  • PRO172 kann auch in CHO- und/oder COS-Zellen durch ein Verfahren zur vorübergehenden Expression oder in CHO-Zellen durch ein anderes Verfahren zur stabilen Expression exprimiert werden.
  • Stabile Expression in CHO-Zellen wird unter Anwendung des folgenden Verfahrens durchgeführt. Die Proteine werden als IgG-Konstrukt (Immunoadhäsin) exprimiert, in dem die kodierenden Sequenzen für die löslichen Formen (z.B. extrazelluläre Domänen) der jeweiligen Proteine an eine IgG1-Konstantregionensequenz, die die Ge lenks-, CH2 und CH2-Domänen enthält, fusioniert werden, und/oder als poly-His-markierte Form.
  • Nach PCR-Amplifikation werden die jeweiligen DNAs in einem CHO-Expressionsvektor unter Anwendung herkömmlicher Verfahren wie in Ausubel et al., Current Protocols of Molecular Biology, Unit 3.16, John Wiley & Sons (1997), beschrieben subkloniert. CHO-Expressionsvektoren werden so konstruiert, dass sie kompatible Restriktionsstellen 5' und 3' zur DNA von Interesse aufweisen, um leichtes cDNA-Shuttling zu ermöglichen. Der Vektor, der für Expression in CHO-Zellen verwendet wird, ist wie in Lucas et al., Nucl. Acids Res. 24(9), 1774-1779 (1996), beschrieben und verwendet den frühen SV40-Promotor/Enhancer, um Expression der cDNA von Interesse und von Dihydrofolatreductase (DHFR) zu steuern. DHFR-Expression ermöglicht Selektion auf stabile Aufrechterhaltung des Plasmids nach erfolgter Transfektion.
  • 12 μg der gewünschten Plasmid-DNA werden in etwa 10 Millionen CHO-Zellen unter Verwendung von im Handel erhältlichen Transfektionsreagenzien Superfect® (Qiagen), Dosper® oder Fugene® (Boehringer Mannheim) eingeführt. Die Zellen werden wie in Lucas et al., s.o., beschrieben gezüchtet. Etwa 3 × 10–7 Zellen werde in einer Ampulle für weitere Züchtung und Produktion wie nachstehend beschrieben eingefroren.
  • Die die Plasmid-DNA enthaltenden Ampullen werden durch Platzieren in ein Wasserbad aufgetaut und durch Verwirbeln vermischt. Die Inhalte werden in ein Zentrifugenröhrchen pipettiert, das 10 ml Medium enthält, und werden bei 1.000 U/min 5 Minuten lang zentrifugiert. Der Überstand wird abgesaugt, und die Zellen werden in 10 ml selektivem Medium (0,2-μm-filtriertes PS20 mit 5 % 0,2-μm-diafiltriertem fötalem Rinderserum) resuspendiert. Die Zellen werden dann in einer 100-ml-Zentrifuge, die 90 ml selektives Medium enthält, aliquotiert. Nach 1-2 Tagen werden die Zellen in eine 250-ml-Zentrifuge, gefüllt mit 150 ml selektivem Wachstumsmedium, übertragen und bei 37°C inkubiert. Nach weiteren 2-3 Tagen werden 250-ml-, 500-ml- und 2:000-ml-Zentrifugen mit 3 × 105 Zellen/ml beimpft. Das Zellmedium wird durch frisches Me dium durch Zentrifugieren und Resuspension in Produktionsmedium ausgetauscht. Obwohl jedes geeignete CHO-Medium verwendet werden kann, kann hier ein Produktionsmedium, das im US-Patent Nr. 5.122.469 , ausgegeben am 16. Juni 1992, beschrieben wird, verwendet werden. Eine 3-l-Produktionszentrifuge wird in einer Konzentration von 1,2 × 106 Zellen/ml beimpft. An Tag 0 werden die Zellanzahl und der pH bestimmt. An Tag 1 werden der Zentrifuge Proben entnommen, und es wird filtrierte Luft hindurchperlen gelassen. An Tag 2 werden der Zentrifuge Proben entnommen, die Temperatur wird auf 33°C geändert, und 30 ml von 500 g/l Glucose und 0,6 ml von 10%igem Antischaummittel (z.B. 35%ige Polydimethylsiloxan-Emulsion, Dow Corning 365 Medical Grade Emulsion) werden genommen. Im Laufe der Produktion wird der pH sofern erforderlich eingestellt, um ihn auf etwa 7,2 zu halten. Nach 10 Tagen, oder sobald die Lebensfähigkeit auf unter 70 % abgefallen ist, wird die Zellkultur durch Zentrifugieren und Filtrieren durch ein 0,22-μm-Filter geerntet. Das Filtrat wird entweder bei 4°C gelagert oder sofort auf Säulen zur Reinigung geladen.
  • Für die poly-His-markierten Konstrukte wurden die Proteine unter Verwendung einer Ni2+-NTA-Säule (Qiagen) gereinigt. Vor der Reinigung wird Imidazol zu dem konditionierten Medium in einer Konzentration von 5 mM zugesetzt. Das konditionierte Medium wird auf eine 6-ml-Ni2 +-NTA-Säule, äquilibriert in 20 mM Hepes-Puffer, pH 7,4, der 0,3 M NaCl und 5 mM Imidazol enthält, bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 4-5 ml/min bei 4°C gepumpt. Nach dem Laden wird die Säule mit zusätzlichem Äquilibrierungspuffer gewaschen, und das Protein wird mit Äquilibrierungspuffer, der 0,25 M Imidazol enthält, eluiert. Das hochgereinigte Protein wird daraufhin in einen Lagerungspuffer, der 10 mM Hepes, 0,14 M NaCl und 4% Mannit, pH 6,8, enthält, mit einer 25-ml-G25-Superfine-Säule (Pharmacia) entsalzt und bei -80°C gelagert.
  • (Fc-hältige) Immunoadhäsin-Konstrukte werden aus dem konditionierten Medium wie folgt gereinigt. Das konditionierte Medium wird auf eine 5-ml-Protein-A-Säule (Pharmacia) gepumpt, die in 20 mM Na-Phosphatpuffer, pH 6,8, äquilibriert wurde. Nach dem Laden wird die Säule ausgiebig mit Äquilibrierungspuffer gewaschen, bevor mit 100 mM Citronensäure, pH 3,5, eluiert wird. Das eluierte Protein wird unverzüglich durch Sammeln von 1-ml-Fraktionen in Röhrchen, die 275 μl von 1 M Tris-Puffer, pH 9, enthält, neutralisiert. Das hochgereinigte Protein wird daraufhin in Ladepuffer wie zuvor für die poly-His-markierten Proteine beschrieben entsalzt. Die Homogenität wird durch SDS-Palyacrylamidgele und durch Sequenzieren N-terminaler Aminosäuren durch Edman-Abbau bewertet.
  • PRO172 wurde durch das oben beschriebene Verfahren stabil in CHO-Zellen exprimiert. Außerdem wurde PRO172 durch das Verfahren für vorübergehende Expression in CHO-Zellen exprimiert.
  • BEISPIEL 4
  • Expression von PRO172 in Hefe
  • Das folgende Verfahren beschreibt rekombinante Expression von PRO172 in Hefe.
  • Zuerst werden Hefe-Expressionsvektoren zur intrazellulären Produktion oder Sekretion von PRO172 aus dem ADH2/GAPDH-Promotor konstruiert. DNA, die für PRO-172 und den Promotor kodiert, wird in geeignete Restriktionsenzymstellen im selektierten Plasmid insertiert, um intrazelluläre Expression von PRO172 zu steuern. Zur Sekretion kann für PRO172 kodierende DNA zusammen mit DNA, die für den ADH2/GAPDH-Promotor, ein natives PRO172-Signalpeptid oder ein anderes Säugetier-Signalpeptid kodiert, oder beispielsweise einer Hefe-α-Faktor- oder -Invertase-Sekretionssignal/Leadersequenz und Linkersequenzen (sofern erforderlich) zur Expression von PRO172 in das selektierte Plasmid kloniert werden.
  • Hefezellen, wie z.B. Hefestamm AB110, können dann mit den zuvor beschriebenen Expressionsplasmiden transformiert und in ausgewähltem Fermentationsmedium kultiviert werden. Die Überstände transformierter Hefe können durch Fällen mit 10%iger Trichloressigsäure und durch Trennen mittels SDS-PAGE, gefolgt von Färben der Gele mit Coomassie-Blaufärbung, analysiert werden.
  • Rekombinantes PRO172 kann daraufhin isoliert und durch Entfernen der Hefezellen aus dem Fermentationsmedium durch Zentrifugieren und anschließendes Einengen des Mediums unter Verwendung ausgewählter Patronenfilter gereinigt werden. Das PRO172-hältige Konzentrat kann weiters unter Verwendung ausgewählter Säulenchromatographieharze gereinigt werden.
  • BEISPIEL 5
  • Expression von PRO172 in mit Baculovirus infizierten Insektenzellen
  • Das folgende Verfahren beschreibt rekombinante Expression in mit Baculovirus infizierten Insektenzellen.
  • Die für PRO172 kodierende Sequenz wird stromauf einer Epitopmarkierung, die in einem Baculovirus-Expressionsvektor enthalten ist, fusioniert. Solche Epitop-Markierungen umfassen poly-His-Markierungen und Immunglobulinmarkierungen (wie Fc-Regionen von IgG). Zahlreiche verschiedene Plasmide können verwendet werden, einschließlich Plasmiden, die aus im Handel erhältlichen Plasmiden wie z.B. pVL-1393 (Novagen) stammen. Kurz zusammengefasst wird die für PRO172 kodierende Sequenz oder der gewünschte Abschnitt der kodierenden Sequenz von PRO172 (wie z.B. die Sequenz, die für die extrazelluläre Domäne eines Transmembranproteins kodiert, oder die Sequenz, die für das reife Protein kodiert, sofern das Protein extrazellulär ist) durch PCR mit Primern, die zu den 5'- und 3'-Regionen komplementär sind, amplifiziert. Der 5'-Primer kann flankierende (selektierte) Restriktionsenzymstellen enthalten. Das Produkt wird dann mit jenen ausgewählten Restriktionsenzymen verdaut und in den Expressionsvektor subkloniert.
  • Rekombinantes Baculovirus wird durch Co-Transfektion des obigen Plasmids und BaculoGoldTM-Virus-DNA (Pharmingen) in Spodoptera-frugiperda-(„Sf9"-)Zellen (ATCC CRL 1711) unter Verwendung von Lipofectin (im Handel bei GIBCO-BRL erhältlich) hergestellt. Nach 4-5 Tagen Inkubation bei 28°C werden die freigesetzten Viren geerntet und zur weiteren Amplifikation verwendet. Virusinfektion und Protein expression werden wie von O'Reilley et al., Baculovirus expression vectors: A Laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994), beschrieben durchgeführt.
  • Exprimiertes poly-His-markiertes PRO172 kann dann, beispielsweise durch Ni2+-Chelat-Affinitätschromatographie, wie folgt gereinigt werden. Extrakte werden aus rekombinanten, virusinfizierten Sf9-Zellen wie von Rupert et al., Nature 362, 175-179 (1993), beschrieben hergestellt. Kurz zusammengefasst werden Sf9-Zellen gewaschen, in Beschallungspuffer (25 ml Hepes, pH 7,9; 12,5 mM MgCl2; 0,1 mM EDTA; 10 % Glycerin, 0,1 % NP-40; 0,4 M KCl) resuspendiert und zweimal 20 Sekunden lang auf Eis beschallt. Die beschallten Produkte werden durch Zentrifugation geklärt, und der Überstand wird in Ladepuffer (50 mM Phosphat, 300 mM NaCl, 10 % Glycerin, pH 7,8) auf das 50fache verdünnt und durch ein 0,45-μm-Filter filtriert. Eine Ni2+-NTA-Agarosesäule (im Handel bei Qiagen erhältlich) wird mit einem Bettvolumen von 5 ml hergestellt, mit 25 ml Wasser gewaschen und mit 25 ml Ladepuffer äquilibriert. Der filtrierte Zellextrakt wird mit 0,5 ml pro Minute auf die Säule geladen. Die Säule wird mit Ladepuffer bis zur A280-Grundlinie gewaschen, ein Punkt, an dem Fraktionsabnahme gestartet wird. Als Nächstes wird die Säule mit einem sekundären Waschpuffer (50 mM Phosphat; 300 mM NaCl, 10 % Glycerin, pH 6,0) gewaschen, der nicht spezifisch gebundenes Protein eluiert. Nach neuerlichem Erreichen der A280-Grundlinie wird die Säule mit einem 0- bis 500-mM-Imidazolgradienten im sekundären Waschpuffer entwickelt. 1-ml-Fraktionen werden abgenommen und durch SOS-PAGE und Silberfärbung oder Western-Blot mit Ni2+-NTA, konjugiert an alkalische Phosphatase (Qiagen) analysiert. Fraktionen, die das eluierte His10-markierte PRO-172 enthalten, werden gesammelt und gegen Ladepuffer dialysiert.
  • Alternativ dazu kann Reinigung des IgG-markierten (oder Fc-markierten) PRO172 unter ANwendung bekannter Chromatographieverfahren, einschließlich beispielsweise Protein-A- oder Protein-G-Säulenchromatographie, durchgeführt werden.
  • Nach PCR-Amplifikation werden die jeweiligen kodierenden Sequenzen in einen Baculovirus-Expressionsvektor (pb.PH.IgG für IgG-Fusionen und pb.PH.His.c für poly-His-markierte Proteine) subkloniert, und der Vektor und Baculogold®-Baculo virus-DNA (Pharmingen) werden in 105 Spodoptera-frugiperda-(„Sf9") Zellen (ATCC CRL 1711) unter Verwendung von Lipofectin (Gibco BRL) co-transfiziert. pb.PH.IgG und pb.PH.His sind Modifikationen des im Handel erhältlichen Baculovirus-Expressionsvektors pVL1393 (Pharmingen) mit modifizierten Polylinkerregionen, die die His- oder Fc-Markierungssequenzen einbinden. Die Zellen werden in Hinks TNM-FH-Medium, ergänzt mit 10 % FBS (Hyclone), gezüchtet. Die Zellen werden 5 Tage lang bei 28°C inkubiert. Der Überstand wird geerntet und daraufhin für die erste virale Amplifikation durch Infizieren von Sf9-Zellen in Hinks TNM-FH-Medium, ergänzt mit 10 % FBS, bei einer ungefähren Infektionsmultiplizität (MOI) von 10 verwendet. Die Zellen werden 3 Tage lang bei 28°C inkubiert. Der Überstand wird geerntet, und die Expression der Konstrukte im Baculovirus-Expressionsvektor wird durch Chargenbindung von 1 ml Überstand an 25 ml Ni2+-NTA-Perlen (QIAGEN) für Histidin-markierte Proteine oder Protein-A-SepharoseCL-4B-Perlen (Pharmacia) für IgG-markierte Proteine bestimmt, gefolgt von SDS-PAGE-Analyse, die einen Vergleich mit einer bekannten Konzentration von Proteinstandard mittels Coomassie-Blaufärbung anstellt.
  • Der Überstand aus der ersten viralen Amplifikation wird verwendet, um eine Zentrifugenkultur (500 ml) von Sf9-Zellen, die auf ESF-921-Medium (Expression Systems LLC) bei einer ungefähren MOI von 0,1 gezüchtet wurden, zu infizieren. Die Zellen wurden 3 Tage lang bei 28°C inkubiert. Der Überstand wird geerntet und filtriert. Chargenbindung und SDS-PAGE-Analyse werden, sofern erforderlich, wiederholt, bis Expression der Zentrifugenkultur bestätigt wird.
  • Das konditionierte Medium aus den transfizierten Zellen (0,5 bis 3 l) wird durch Zentrifugation geerntet, um die Zellen zu entfernen, und durch 0,22-μm-Filter filtriert. Für die poly-His-markierten Konstrukte wird das Proteinkonstrukt unter Verwendung einer Ni2+-NTA-Säule (Qiagen) gereinigt. Vor der Reinigung wird Imidazol zum konditionierten Medium in einer Konzentration von 5 mM zugesetzt. Das konditionierte Medium wird mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 4-5 ml/min bei 4°C auf eine 6-ml-Ni2 +-NTA-Säule, die in 20 mM Hepes-Puffer, pH 7,4, der 0,3 M NaCl und 5 mM Imidazol enthielt, äquilibriert wurde, gepumpt. Nach dem Laden wird die Säule mit zu sätzlichem Äquilibrierungspuffer gewaschen, und das Protein wird mit Äquilibrierungspuffer, der 0,25 M Imidazol enthält, eluiert. Das hochgereinigte Protein wird daraufhin in einen Lagerungspuffer, der 10 mM Hepes, 0,14 M NaCl und 4 % Mannit, pH 6,8, enthält, mit einer 25-ml-G25-Superfine-Säule (Pharmacia) entsalzt und bei -80°C gelagert.
  • (Fc-hältige) Immunoadhäsin-Konstrukte von Proteinen werden aus dem konditionierten Medium wie folgt gereinigt. Das konditionierte Medium wird auf eine 5-ml-Protein-A-Säule (Pharmacia) gepumpt, die davor in 20 mM Na-Phosphatpuffer, pH 6,8, äquilibriert wurde. Nach dem Laden wird die Säule ausgiebig mit Äquilibrierungspuffer gewaschen, bevor Flution mit 100 mM Zitronensäure, pH 3,5, stattfindet. Das eluierte Protein wird unmittelbar durch Abnehmen von 1-ml-Fraktionen in Röhrchen, die 275 ml von 1 M Tris-Puffer, pH 9, enthalten, neutralisiert. Das hochgereinigte Protein wird daraufhin in Lagerungspuffer, wie zuvor für die poly-His-markierten Proteine beschrieben, entsalzt. Die Homogenität der Proteine wird durch SDS-Polyacrylamidgel(-PEG-) Elektrophorese und durch Sequenzieren N-terminaler Aminosäure mittels Edman-Abbau überprüft.
  • PRO172 wurde in Baculovirus-infizierten Sf9-Insektenzellen exprimiert.
  • Alternativ dazu kann ein modifiziertes Baculovirus-Verfahren angewandt werden, das High-5-Zellen umfasst. In diesem Verfahren wird die für die gewünschte Sequenz kodierende DNA mit geeigneten Systemen, wie z.B. Pfu (Stratagene), amplifiziert oder stromauf einer Epitopmarkierung (5' davon), die innerhalb eines Baculovirus-Expressionsvektors enthalten ist, fusioniert. Solche Epitopmarkierungen umfassen poly-His-Markierungen und Immunglobulinmarkierungen (wie Fc-Regionen von IgG). Zahlreiche Plasmide können verwendet werden, einschließlich Plasmide, die von handelsüblichen Plasmiden wie z.B. pIE1-1 (Novagen) abstammen. Die pIE1-1- und p1E1-2-Vektoren sind zur konstitutiven Expression rekombinanter Proteine aus dem Baculovirus-ie1-Promotor in stabil transformierten Insektenzellen (1) entworfen. Die Plasmide unterscheiden sich nur in der Ausrichtung der mehrfachen Klonierungsstellen und enthalten alle Promotorsequenzen, die dafür bekannt sind, dass sie für ie1-vermittel te Genexpression in nichtinfizierten Insektenzellen wichtig sind, sowie das hr5-Enhancerelement. pIE1-1 und pIE1-2 umfassen die Translationsinitiationsstelle und können verwendet werden, um Fusionsproteine zu produzieren. Kurz zusammengefasst wird die gewünschte Sequenz oder der gewünschte Abschnitt der Sequenz (wie z.B. der Sequenz, die für die extrazelluläre Domäne eines Transmembranproteins kodiert) mittels PCR mit Primern, die zu den 5'- und 3'-Regionen komplementär sind, amplifiziert. Der 5'-Primer kann flankierende (selektierte) Restriktionsenzymstellen enthalten. Das Produkt wird dann mit jenen ausgewählten Restriktionsenzymen verdaut und in den Expressionsvektor subkloniert. Derivate von pIE1-1 beispielsweise können die Fc-Region von menschlichem IgG (pb.PH.IgG) oder eine 8-Histidin(pb.PH.His) Markierung stromab der gewünschten Sequenz (3' davon) umfassen. Vorzugsweise wird das Vektorkonstrukt zur Bestätigung sequenziert.
  • High-5-Zellen werden bis zu einer Konfluenz von 50 % unter den Bedingungen: 27°C, kein CO2, kein Pen/Strep; gezüchtet. Für jede 150-mm-Platte werden 30 μg von pIE-basiertem Vektor, der die Sequenz enthält, mit 1 ml Ex-Gell-Medium (Medium: Ex-Cell 401 + 1/100 L-Glu JRH Biosciences Nr. 14401-78P (Anmerkung: dieses Medium ist lichtempfindlich)) vermischt, und in einem separaten Röhrchen werden 100 μl CellFectin (CellFECTIN (GibcoBRL Nr. 10362-010) (durch Zentrifugieren vermischt)) mit 1 ml Ex-Cell-Medium vermischt. Die zwei Lösungen werden vereinigt und bei Raumtemperatur 15 min lang inkubieren gelassen. 8 ml Ex-Cell-Medium werden zu 2 ml von DNA/CeIIFECTIN-Gemisch zugesetzt, und dies wird auf High-5-Zellen aufgeschichtet, die davor einmal mit Ex-Cell-Medium gewaschen wurden. Die Platte wird dann in der Dunkelheit 1 h lang bei Raumtemperatur inkubiert. Das DNA/CellFECTIN-Gemisch wird anschließend abgesaugt, und die Zellen werden einmal mit Ex-Cell gewaschen, um überschüssiges CellFECTIN zu entfernen, 30 ml frisches Ex-Cell-Medium werden zugesetzt, und die Zellen werden 3 Tage lang bei 28°C inkubiert. Der Überstand wird geerntet, und die Expression der Sequenz im Baculovirus-Expressionsvektor wird durch Chargenbindung von 1 ml Überstand an 25 ml von Ni2+-NTA-Perlen (QIAGEN) für Histidin-markierte Proteine oder Protein-A-Sepharose-CL-4B-Perlen (Pharmacia) für IgG-markierte Proteine, gefolgt von SDS-PAGE- Analyse, die einen Vergleich mit einer bekannten Konzentration von Proteinstandard mittels Coomassie-Blaufärbung anstellt, bestimmt.
  • Das konditionierte Medium aus den transfizierten Zellen (0,5 bis 3 l) wird mittels Zentrifugation geerntet, um die Zellen zu entfernen, und durch 0,22-μm-Filter filtriert. Für die poly-His-markierten Konstrukte wird das Protein, das die Sequenz umfasst, unter Verwendung einer Ni2+-NTA-Säule (Qiagen) gereinigt. Vor der Reinigung wird Imidazol zum konditionierten Medium in einer Konzentration von 5 mM zugesetzt. Das konditionierte Medium wird mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 4-5 ml/min bei 48°C auf eine 6-ml-Ni2 +-NTA-Säule, die in 20 mM Hepes-Puffer, pH 7,4, der 0,3 M NaCl und 5 mM Imidazol enthält, äquilibriert wurde, gepumpt. Nach dem Laden wird die Säule mit zusätzlichem Äquilibrierungspuffer gewaschen, und das Protein wird mit Äquilibrierungspuffer, der 0,25 M Imidazol enthält, eluiert. Das hochgereinigte Protein wird daraufhin in einen Lagerungspuffer, der 10 mM Hepes, 0,14 M NaCl und 4 % Mannit, pH 6,8, enthält, mit einer 25-ml-G25-Superfine-Säule (Pharmacia) entsalzt und bei -80°C gelagert.
  • (Fc-hältige) Immunoadhäsin-Konstrukte von Proteinen werden aus dem konditionierten Medium wie folgt gereinigt. Das konditionierte Medium wird auf eine 5-ml-Protein-A-Säule (Pharmacia) gepumpt, die in 20 mM Na-Phosphatpuffer, pH 6,8, äquilibriert wurde. Nach dem Laden wird die Säule ausgiebig mit Äquilibrierungspuffer gewaschen, bevor mit 100 mM Zitronensäure, pH 3,5, eluiert wird. Das eluierte Protein wird unverzüglich durch Abnahme von 1-ml-Fraktionen in Röhrchen, die 275 ml von 1 M Tris-Puffer, pH 9, enthält, neutralisiert. Das hochgereinigte Protein wird daraufhin in Lagerungspuffer, wie zuvor für die poly-His-markierten Proteine beschrieben, entsalzt. Die Homogenität der Sequenz wird durch SOS-Polyacrylamidgele und durch Sequenzieren N-terminaler Aminosäuren durch Edman-Abbau und andere Analysenverfahren, je nach Bedarf und Wunsch, bewertet.
  • PRO172 wurde unter Verwendung des oben beschriebenen Baculovirus-Verfahrens unter Verwendung von High-5-Zellen exprimiert.
  • BEISPIEL 6
  • Herstellung von Antikörpern, die PRO172 binden
  • Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung monoklonaler Antikörper, die sich spezifisch an PRO172 binden können.
  • Verfahren zur Herstellung der monoklonalen Antikörper sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und werden beispielsweise in Goding, s.o., beschrieben. Immunogene, die verwendet werden können, umfassen gereinigtes PRO172, Fusionsproteine, die PRO172 enthalten, und Zellen, die rekombinantes PRO172 an der Zelloberfläche exprimieren. Die Auswahl des Immunogens können Fachleute ohne unzumutbaren Aufwand treffen.
  • Mäuse, wie z.B. Balb/c, werden mit dem PRO172-Immunogen immunisiert, das in komplettem Freundschem Adjuvans emulgiert und subkutan oder intraperitoneal in einer Menge von 1 bis 100 μg injiziert wird. Alternativ dazu wird das Immunogen in MPL-TDM-Adjuvans (Ribi Immunochemical Research, Hamilton, MT) emulgiert und in die Fußballen der Hinterläufe der Tiere injiziert. Die immunisierten Mäuse werden dann 10 bis 12 Tage später mit zusätzlichem Immunogen, das im ausgewählten Adjuvans emulgiert ist, geboostet. Hiernach können die Mäuse auch für mehrere Wochen mit zusätzlichen Immunisierungsinjektionen geboostet werden. Serumproben können den Mäusen durch retroorbitale Blutabnahme zum Testen mittels ELISA-Tests zur Detektion von Anti-PRO172-Antikörpern in periodischen Abständen entnommen werden.
  • Nachdem ein geeigneter Antikörpertiter nachgewiesen wurde, kann den Tieren mit „positiven" Antikörperwerten eine letzte intravenöse Injektion von PRO172 verabreicht werden. Drei oder vier Tage später werden die Mäuse getötet und die Milzzellen geerntet. Die Milzzellen werden dann an eine selektierte Mausmyelomzelllinie wie z.B. P3X63AgU.1, die bei der ATCC, Nr. CRL 1597, erhältlich ist, (unter Verwendung von 35%igem Polyethylenglykol) fusioniert. Die Fusionen bilden Hybridomzellen, die dann in 96-Well-Gewebekulturplatten, welche HAT-(Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin) Medium enthalten, ausplattiert werden, um Proliferation von nichtfusionierten Zellen, Myelomhybriden und Milzzellhybriden zu hemmen.
  • Die Hybridomzellen werden in einem ELISA auf Reaktivität gegen PRO172 gescreent. Bestimmung von „positiven" Hybridomzellen, welche die gewünschten monoklonalen Antikörper gegen PRO172 sekretieren, liegt im Bereich der Erfindung.
  • Die positiven Hybridomzellen können intraperitoneal in syngenetische Balb/c-Mäuse injiziert werden, um Ascites zu produzieren, die die monoklonalen Anti-PRO172-Antikörper enthalten. Alternativ dazu können die Hybridomzellen in Gewebekulturkolben oder Rollflaschen gezüchtet werden. Reinigung der monoklonalen Antikörper, die in Ascites produziert werden, kann unter Verwendung von Ammoniumsulfatfällung, gefolgt von Gelausschlusschromatographie, erfolgen. Alternativ dazu kann Affinitätschromatographie basierend auf Bindung von Antikörper an Protein A oder Protein G verwendet werden.
  • BEISPIEL 7
  • Reinigung von PRO172-Polypeptiden unter Verwendung spezifischer Antikörper Native oder rekombinante PRO172-Polypeptide können mittels zahlreicher verschiedener Verfahren zur Proteinreinigung, die auf dem Gebiet der Erfindung Standard sind, gereinigt werden. Beispielsweise wird pro-PRO172-Polypeptid, reifes PRO172-Polypeptid oder Prä-PRO172-Polypeptid mittels Immunaffinitätschromatographie unter Verwendung von Antikörpern, die für das PRO172-Polypeptid von Interesse spezifisch sind, gereinigt. Im Allgemeinen wird eine Immunaffinitätssäule durch kovalentes Binden des Anti-PRO172-Polypeptidantikörpers an ein aktiviertes Chromatographieharz konstruiert.
  • Polyklonale Immunglobuline werden aus Immunseren entweder durch Fällung mit Ammoniumsulfat oder durch Reinigung an immobilisiertem Protein A (Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, N.J.) hergestellt. Demähnlich werden monoklonale Antikörper aus Maus-Ascitesflüssigkeit durch Ammoniumsulfatfällung oder durch Chromatographie an immobilisiertem Protein A hergestellt. Teilweise gereinigtes Immunglobulin wird kovalent an ein Chromatographieharz wie z.B. CnBr-aktivierte SEPHAROSETM (Pharmacia LKB Biotechnology) gebunden. Der Antikörper wird an das Harz gebunden, das Harz wird blockiert, und das Derivatharz wird gemäß den Angaben des Herstellers gewaschen.
  • Solch eine Immunaffinitätssäule wird zur Reinigung von PRO172-Polypeptid durch Herstellung einer Fraktion von Zellen, die PRO172-Polypeptid in einer löslichen Form enthält, verwendet. Dieses Präparat wird durch Solubilisierung der ganzen Zelle oder einer subzellulären Fraktion, die durch differenzielles Zentrifugieren durch den Zusatz von Detergens oder mittels anderer Verfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, erhalten wurde, abgeleitet. Alternativ dazu kann lösliches PRO172-Polypeptid, das eine Signalsequenz enthält, in nützlicher Menge in das Medium sekretiert werden, in dem die Zellen gezüchtet werden.
  • Ein lösliches PRO172-Polypeptid-hältiges Präparat wird über eine Immunaffinitätssäule geführt, und die Säule wird unter Bedingungen gewaschen, die die präferenzielle Absorption von PRO172-Polypeptid ermöglichen (z.B. Puffer mit hoher Ionenstärke in Gegenwart von Detergens). Dann wird die Säule unter Bedingungen eluiert, die Antikörper/PRO172-Polypeptid-Bindung aufbrechen (z.B. ein Puffer mit niedrigem pH wie etwa pH 2-3 oder eine hohe Konzentration eines Chaotrops wie z.B. Harnstoff oder Thiocyanationen), und das PRO172-Polypeptid wird gesammelt.
  • BEISPIEL 8
  • Arzneimittel-Screenen
  • Diese Erfindung ist besonders nützlich zum Screenen von Verbindungen unter Verwendung von PRO172-Polypeptiden oder eines Bindungsfragments davon im Rahmen eines von zahlreichen verschiedenen Screeningverfahren. Das PRO172-Polypeptid oder -Fragment, das in solch einem Test verwendet wird, kann entweder frei in Lösung, fixiert an einen festen Träger, auf einer Zelloberfläche getragen oder intrazellulär vorliegen. Ein Verfahren zum Arzneimittel-Screenen verwendet eukaryo tische oder prokaryotische Wirtszellen, die mit rekombinanten Nucleinsäuren, die das PRO172-Polypeptid oder -Fragment exprimieren, stabil transformiert sind. Arzneimittel werden gegen solche transformierten Zellen in Konkurrenzbindungstests gescreent. Solche Zellen, entweder in lebensfähiger oder in fixierter Form, können für herkömmliche Bindungstests verwendet werden. Es kann beispielsweise die Bildung von Komplexen zwischen einem PRO172-Polypeptid oder -Fragment und dem zu testenden Mittel gemessen werden. Alternativ dazu kann die durch das zu testende Mittel verursachte Abnahme von Komplexbildung zwischen dem PRO172-Polypeptid und seiner Targetzelle oder seinen Targetrezeptoren untersucht werden.
  • Somit stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zum Screenen auf Arzneimittel oder auf beliebige andere Mittel bereit, die mit PRO172-Polypeptid assoziierte Erkrankungen oder Leiden beeinflussen können. Diese Verfahren umfassen das Kontaktieren solch eines Mittels mit einem PRO172-Polypeptid oder Fragment davon und das Testen (i) auf die Gegenwart eines Komplexes zwischen dem Mittel und dem PRO172-Polypeptid oder -Fragment oder (ii) auf die Gegenwart eines Komplexes zwischen dem PRO172-Polypeptid oder -Fragment und der Zelle mittels auf dem Gebiet der Erfindung bekannter Verfahren. In solchen Konkurrenzbindungstests wird das PRO172-Polypeptid oder -Fragment typischerweise markiert. Nach geeigneter Inkubation wird das freie PRO172-Polypeptid oder -Fragment von jenem, das in gebundener Form vorliegt, getrennt, und die Menge an freier oder nicht komplexierter Markierung stellt ein Maß für die Fähigkeit des bestimmten Mittels dar, sich an PRO172-Polypeptid zu binden oder den PRO172-Polypeptid/Zell-Komplex zu stören.
  • Ein anderes Verfahren zum Arzneimittel-Screenen sorgt für Screenen mit hohem Durchsatz von Verbindungen mit geeigneter Bindungsaffinität an ein Polypeptid und wird in der WO 84/03564 , veröffentlicht am 13. September 1984, detailliert beschrieben. Kurz zusammengefasst wird eine große Anzahl an verschiedenen kleinen Peptid-Testverbindungen an einem festen Substrat, wie z.B. an Kunststoffstiften oder einer anderen Oberfläche, synthetisiert. Nachdem sie auf ein PRO172-Polypeptid aufgetragen wurden, werden Peptidtestverbindungen mit PRO172-Polypeptid umgesetzt und gewaschen. Gebundenes PRO172-Polypeptid wird mittels auf dem Gebiet der Erfindung bekannter Verfahren nachgewiesen. Gereinigtes PRO172-Polypeptid kann zur Verwendung in den zuvor genannten Arzneimittel-Screening-Verfahren auch direkt auf Platten beschichtet werden. Darüber hinaus können nicht neutralisierende Antikörper verwendet werden, um das Peptid einzufangen und es am festen Träger zu immobilisieren.
  • Diese Erfindung erwägt auch die Verwendung von kompetitiven Arzneimittel-Screeningtests, in denen neutralisierende Antikörper, die in der Lage sind, ein PRO172-Polypeptid zu binden, spezifisch mit einer Testverbindung um Bindung an das PRO172-Polypeptid oder Fragmente davon konkurrieren. Auf diese Weise können die Antikörper verwendet werden, um die Gegenwart jedes beliebigen Peptids nachzuweisen, das mit einem PRO172-Polypeptid eine oder mehrere antigene Determinanten gemeinsam hat.
  • BEISPIEL 9
  • Rationales Arzneimitteldesign
  • Das Ziel von rationalem Arzneimitteldesign ist die Herstellung von Strukturanaloga von biologisch aktivem Polypeptid von Interesse (z.B. von einem PRO172-Polypeptid) oder von kleinen Molekülen, mit denen sie Wechselwirken, z.B. Agonisten, Antagonisten oder Inhibitoren. Jedes dieser Beispiele kann verwendet werden, um Arzneimittel zu entwerfen, die aktivere oder stabilere Formen des PRO172-Polypeptids sind oder die die Funktion des PRO172-Polypeptids in vivo verstärken oder stören (vgl. Hodgson, Bio/Technology 9, 19-21 (1991)).
  • In einem Ansatz wird die dreidimensionale Struktur des PRO172-Polypeptids oder eines PRO172-Polypeptid-Inhibitor-Komplexes durch Röntgenkristallographie, durch Computermodellierung oder, was am häufigsten vorkommt, durch eine Kombination der beiden Ansätze bestimmt. Sowohl die Form als auch die Ladungen des PRO172-Polypeptids müssen bestimmt werden, um die Struktur erkennen zu können und um eine oder mehrere aktive Stellen des Moleküls zu identifizieren. Weniger häufig können nützliche Informationen hinsichtlich der Struktur des PRO172-Polypeptids durch Modellieren auf Grundlage der Struktur homologer Proteine gewonnen werden. In beiden Fällen wird relevante strukturelle Information verwendet, um analoge PRO172-Polypeptid-ähnliche Moleküle zu entwerfen oder um wirksame Inhibitoren zu identifizieren. Nützliche Beispiele für rationales Arzneimitteldesign können Moleküle umfassen, die verbesserte Aktivität oder Stabilität aufweisen, wie von Braxton & Wells, Biochemistry 31, 7796-7801 (1992), gezeigt wird, oder die als Inhibitoren, Agonisten oder Antagonisten von nativen Peptiden wirken, wie von Athauda et al., J. Biochem. 113, 742-746 (1993), gezeigt wird.
  • Auch ist es möglich, einen targetspezifischen Antikörper zu isolieren, der wie zuvor beschrieben durch funktionelle Tests selektiert wird, und dann seine Kristallstruktur aufzuklären. Dieser Ansatz ergibt im Prinzip ein Pharmakor, auf Grundlage dessen Arzneimitteldesign vollzogen werden kann. Es ist möglich, Proteinkristallographie ganz zu umgehen, indem anti-idiotypische Antikörper (anti-ids) zu einem funktionellen, pharmakologisch aktiven Antikörper gebildet werden. Es wird erwartet, dass, als ein Spiegelbild eines Spiegelbildes, die Bindungsstelle der anti-ids analog zu dem Originalrezeptor ist. Der anti-id könnte dann verwendet werden, um Peptide aus Banken chemisch oder biologisch hergestellter Peptide zu identifizieren und zu isolieren. Die isolierten Peptide würden dann als der Pharmakor wirken.
  • Durch die vorliegende Erfindung können ausreichende Mengen des PRO172-Polypeptids verfügbar gemacht werden, um solche analytischen Studien wie z.B. Röntgenkristallographie durchzuführen. Darüber hinaus liefert die Kenntnis der hierin bereitgestellten PRO172-Polypeptid-Aminosäuresequenz einen Leitfaden für jene, die Computermodellierungsverfahren anstelle von oder zusätzlich zu Röntgenkristallographie verwenden.
  • BEISPIEL 10
  • In-vitro-Antitumortest
  • Die antiproliferative Aktivität der PRO172-Polypeptide wurde im experimentellen, erkrankungsorientierten Antikrebs-Arzneimittelfindungs-In-vitro-Test des National Can cer Institute (NCI) unter Verwendung eines Sulforhodamin-B-(SRB-)Farbstoff-Bindungstests, im Wesentlichen wie von Skehan et al., J. Natl. Cancer Inst. 82, 1107-1112 (1990), beschrieben, bestimmt. Die 60 Tumorzelllinien, die in dieser Studie verwendet wurden („das NCI-Panel"), sowie Bedingungen für ihre Aufrechterhaltung und Kultur in vitro wurden von Monks et al., J. Natl. Cancer Inst. 83, 757-766 (1991), beschrieben. Der Zweck dieses Screens ist es, die Zytotoxizität und/oder zytostatische Aktivität der Testverbindungen gegen verschiedene Tumortypen zu evaluieren (Monks et al., s.o.; Boyd, Cancer: Princ. Pract. Oncol. Update 3(10), 1-12 (1989)).
  • Zellen aus etwa 60 menschlichen Tumorzelllinien wurden mit Trypsin/EDTA (Gibco) geerntet, einmal gewaschen, in IMEM resuspendiert, und ihre Lebensfähigkeit wurde bestimmt. Die Zellsuspensionen wurden mittels Pipette (100 μl Volumen) in separate 96-Well-Mikrotiterplatten zugesetzt. Die Zelldichte für die 6-Tages-Inkubation war geringer als jene für die 2-Tages-Inkubation, um übermäßiges Wachstum zu vermeiden. Inokulaten wurde eine Präinkubationszeit von 24 h bei 37°C zur Stabilisierung zugestanden. Verdünnungen auf das Doppelte der beabsichtigten Testkonzentration wurden zum Zeitpunkt Null in 100-μl-Allquoten zu den Mikrotiterplattenwells zugesetzt (1:2-Verdünnung). Testverbindungen wurden in fünf Verdünnungen in halben dekadisch-logarithmischen Schritten (1.000- bis 100.000fach) evaluiert. Inkubationen fanden zwei Tage lang und sechs Tage lang in einer 5%igen CO2-Atmosphäre und bei 100 % Feuchtigkeit statt.
  • Nach der Inkubation wurde das Medium entfernt, und die Zellen wurden in 0,1 ml 10%iger Trichloressigsäure bei 40°C fixiert. Die Platten wurden fünfmal mit entionisiertem Wasser gespült, getrocknet, 30 min lang mit 0,1 ml von 0,4%igem Sulforhodamin-B-Farbstoff (Sigma), gelöst in 1 % Essigsäure, gefärbt, viermal mit 1%iger Essigsäure gespült, um ungebundenen Farbstoff zu entfernen, getrocknet, und der Farbstoff wurde fünf Minuten lang mit 0,1 ml von 10 mM Tris-Base [Tris(hydroxymethyl)aminomethan], pH 10,5, extrahiert. Die Absorption (OD) von Sulforhodamin B bei 492 nm wurde unter Verwendung eines 96-Well-Mikrotiterplattenlesers, der eine Schnittstelle zu einem Computer aufwies, gemessen.
  • Eine Testprobe wird als positiv betrachtet, wenn sie in einer oder mehreren Konzentrationen zumindest 40 % Wachstumsinhibierungswirkung zeigt. Die Resultate werden in der folgenden Tabelle 4 gezeigt, in der die Abkürzungen für den Tumorzelltyp folgende sind:
    NSCL = nichtkleinzelliges Lungenkarzinom; ZNS = Zentralnervensystem Tabelle 4
    Verbindung Konzentration Tage Tumorzelltyp Bezeichnung
    PRO172 1,25 nM 2 Brust T-470
    PRO172 1,25 nM 6 NSCL NCI-H460
    PRO172 1,25 nM 6 Kolon KM12
    PRO172 1,25 nM 6 ZNS SF-295
    PRO172 1,25 nM 6 Melanom UACC-62
    PRO172 1,25 nM 2 Brust MDA-MB-231/ATCC
    PRO172 1,25 nM 6 Leukämie CCRF-CEM
    PRO172 1,25 nM 6 Leukämie MOLT4
    PRO172 1,25 nM 6 NSCL NCI-H460
    PRO172 1,25 nM 6 Kolon HCT-116
    PRO172 1,25 nM 6 Kolon HT29
    PRO172 1,25 nM 6 ZNS SF-295
    PRO172 1,25 nM 6 ZNS U251
    PRO172 1,25 nM 6 Melanom LOX IMVI
    PRO172 1,25 nM 6 Melanom UACC-62
    PRO172 1,25 nM 6 Ovarien OVCAR-8
    PRO172 1,25 nM 6 Nieren RXF 393
    PRO172 1,25 nM 6 Brust T-470
  • Hinterlegung von Material
  • Die folgenden Materialien wurden bei der American Type Culture Collection, 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209, USA, (ATCC) hinterlegt:
    Material ATCC-Hinterlequngsnr. Hinterlequngsdatum
    DNA35916-1161 209419 28. Oktober 1997
  • Diese Hinterlegung erfolgte gemäß den Vorschriften des Budapester Vertrages über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren und den darunter gültigen Bestimmungen (Budapester Vertrag). Dies sichert die Erhaltung einer lebensfähigen Kultur der Hinterlegung 30 Jahre lang ab dem Zeitpunkt der Hinterlegung. Die Hinterlegungen werden von der ATCC gemäß den Bestimmungen des Budapester Vertrages und gemäß einem Abkommen zwischen Genentech, Inc., und ATCC verfügbar gemacht, das permanente und uneingeschränkte Verfügbarkeit der Nachkommenschaft der Kultur der Hinterlegung für die Öffentlichkeit bei Ausgabe des betreffenden US-Patents oder bei Offenlegung für die Öffentlichkeit entweder der US- oder einer ausländischen Patentanmeldung, je nachdem, was zuerst eintritt, garantiert und das die Verfügbarkeit der Nachkommenschaft für jemanden, der durch den Präsident des Patentamtes der Vereinigten Staaten hierzu gemäß 35 USC § 122 und den dazu gültigen Bestimmungen (einschließlich 37 CFR § 1.14 unter besonderem Verweis auf 886 OG 638) befugt ist, sicherstellt.
  • Der Zessionar der vorliegenden Anmeldung hat sich einverstanden erklärt, dass, sofern eine Kultur der hinterlegten Materialien, die unter geeigneten Bedingungen kultiviert wurde, sterben oder verloren gehen oder zerstört werden sollte, die Materialien unverzüglich nach Benachrichtigung durch neue derselben Art ersetzt werden. Die Verfügbarkeit des hinterlegten Materials ist nicht als Lizenz zur Ausführung der Erfindung in Widerspruch mit den unter der Behörde einer beliebigen Regierung gemäß ihrer Patentgesetze garantierten Rechte zu verstehen.
  • Die obige schriftliche Beschreibung wird als ausreichend erachtet, um Fachleuten die Möglichkeit zu geben, die Erfindung durchzuführen. Die vorliegende Erfindung soll in ihrem Schutzumfang durch das hinterlegte Konstrukt nicht als eingeschränkt gelten, da die hinterlegte Ausführungsform einzig als Veranschaulichung bestimmter Aspekte der Erfindung und anderer Konstrukte, die innerhalb des Schutzumfangs dieser Erfindung, wie er in den Ansprüchen definiert ist, funktionsäquivalent sind, zu verstehen ist. Die Hinterlegung des hierin offenbarten Materials stellt weder ein Eingeständnis dar, dass die hierin enthaltene schriftliche Beschreibung unzureichend sei, die praktische Durchführung irgendeines Aspektes der Erfindung, einschließlich der besten Ausführungsform davon, zu ermöglichen, noch ist sie als Einschränkung des Schutzumfangs der Ansprüche auf die spezifischen Veranschaulichungen, die sie darstellt, zu verstehen. Schließlich werden Fachleuten auf Grundlage der obigen Beschreibung verschiedene Modifikationen, zusätzlich zu jenen, die hierin gezeigt und beschrieben wurden, ersichtlich sein. SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 01030001
    Figure 01040001
    Figure 01050001
    Figure 01060001
    Figure 01070001
    Figure 01080001

Claims (11)

  1. Verwendung eines Mittels bei der Herstellung eines Medikaments zur Hemmung des Wachstums einer Tumorzelle, worin das Mittel Folgendes ist: (i) ein PRO172-Polypeptid mit zumindest etwa 80 % Aminosäuresequenzidentität mit: (a) den Resten 1 oder etwa 22 bis 723, die in 2 (Seq.-ID Nr. 2) dargestellt sind, (b) den Resten X bis 723, die in 2 (Seq.-ID Nr. 2) dargestellt sind, worin X ein beliebiger Aminosäurerest von 17 bis 26 aus 2 (Seq.-ID Nr. 2) ist, oder (c) den Resten 1 oder etwa 22 bis X aus 2 (Seq.-ID Nr. 2), worin X eine beliebige Aminosäure von Aminosäure 543 bis Aminosäure 552 aus 2 (Seq.-ID Nr. 2) ist, worin die Sequenzidentität über die gesamte Länge der angeführten Sequenz bestimmt wird; oder (ii) ein Fragment des in 2 (Seq.-ID Nr. 2) gezeigten PRO172-Polypeptids, worin das Mittel im In-vitro-Test zur Feststellung von Antikrebsarzneimitteln des National Cancer Institute antiproliferative Aktivität aufweist.
  2. In-vitro-Verfahren zur Hemmung des Wachstums einer Tumorzelle, umfassend das Aussetzen der Tumorzelle gegenüber einer wirksamen Menge eines Mittels, wie es in Anspruch 1 definiert ist.
  3. Verwendung oder Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin der Identitätsgrad zumindest 85 % beträgt.
  4. Verwendung oder Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin der Identitätsgrad zumindest 90 % beträgt.
  5. Verwendung oder Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin der Identitätsgrad zumindest 95 % beträgt.
  6. Verwendung oder Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin das PRO172-Polypeptid die in 2 (Seq.-ID Nr. 2) gezeigte Aminosäuresequenz umfasst.
  7. Verwendung oder Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin das PRO172-Polypeptid aus Folgendem besteht: (a) der in 2 (Seq.-ID Nr. 2) gezeigten Aminosäuresequenz, (b) der extrazellulären Domäne der in 2 (Seq.-ID Nr. 2) gezeigten Aminosäuresequenz oder (c) der in 2 (Seq.-ID Nr. 2) gezeigten Aminosäuresequenz ohne Signalpeptid.
  8. Verwendung oder Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin der Tumor ein Krebs ist.
  9. Verwendung oder Verfahren nach Anspruch 8, worin der Krebs aus der aus Brustkrebs, Ovarialkrebs, Nierenkrebs, Kolorektalkrebs, Lungenkrebs, ZNS-Krebs, Melanom und Leukämie bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
  10. Zusammensetzung, die zur Hemmung von neoplastischem Zellwachstum zweckdienlich ist und eine therapeutisch wirksame Menge eines Mittels nach einem der Ansprüche 1 bis 7 in einem Gemisch mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst und zusätzlich ein weiteres wachstumshemmendes Mittel, zytotoxisches Mittel oder chemotherapeutisches Mittel umfasst.
  11. Herstellungsartikel, umfassend: ein Behältnis; eine Zusammensetzung, die im Behältnis enthalten ist und ein Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 7 umfasst und zusätzlich ein weiteres wachstumshemmendes Mittel, zytotoxisches Mittel oder chemotherapeutisches Mittel umfasst.
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