DE69829230T2

DE69829230T2 - Polypeptid und dafür kodieredes Nukleinsäure

Info

Publication number: DE69829230T2
Application number: DE69829230T
Authority: DE
Inventors: William I. Wood; Austin L. Gurney; Audrey Goddard; Diana Pennica; Jian Chen; Jean Yuan
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1997-09-17
Filing date: 1998-09-16
Publication date: 2006-05-18
Anticipated expiration: 2018-09-17
Also published as: ES2239089T3; DE69829230D1; EP1207168B1; ATE290018T1; EP1207168A1; DK1207168T3; PT1207168E

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich im Allgemeinen auf die Identifikation und Isolation neuer DNA und auf die rekombinante Produktion neuer Polypeptide, die durch diese DNA kodiert werden.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Extrazelluläre und membrangebundene Proteine spielen wichtige Rollen in der Bildung, Differenzierung und Erhaltung von multizellulären Organismen. Das Schicksal zahlreicher einzelner Zellen, z.B. Proliferation, Migration, Differenzierung oder Wechselwirkung mit anderen Zellen, wird typischerweise durch Informationen gesteuert, die von anderen Zelten und/oder der unmittelbaren Umgebung erhalten, werden. Diese Informationen werden oft durch sekretierte Polypeptide (beispielsweise mitogene Faktoren, Überlebensfaktoren, cytotoxische Faktoren, Differenzierungsfaktoren, Neuropeptide und Hormone) übertragen, die wiederum von unterschiedlichen Zellrezeptoren oder membrangebundenen Proteinen empfangen oder interpretiert werden. Diese sekretierten Polypeptide oder Signalmoleküle wandern normalerweise über den zellulären Sekretionsweg, um ihre Wirkungsstelle in der extrazellulären Umgebung, üblicherweise an einem membrangebundenen Rezeptorprotein, zu erreichen.
Sekretierte Proteine haben verschiedene gewerbliche Anwendbarkeiten, umfassend die Verwendung als Pharmazeutika, Diagnostika, Biosensoren und Bioreaktoren. Die meisten Protein-Medikamente, die heute erhältlich sind, wie beispielsweise thrombolytische Mittel, Interferone, Interleukine, Erythropoietine, Koloniewachstum stimulierende Faktoren und verschiedene andere Cytokine, sind Sekretionsproteine. Ihre Rezeptoren, die membrangebundene Proteine sind, haben auch Potential, als Therapeutika oder Diagnostika eingesetzt zu werden. Rezeptor-Immunoadhäsine beispielsweise können als therapeutische Mittel eingesetzt werden, um Rezeptor-Liganden-Wechselwirkungen zu blockieren. Membrangebundene Proteine können auch zum Screenen eines potentiellen Peptids oder Inhibitoren kleiner Moleküle der relevanten Rezeptor-Liganden-Wechselwirkung verwendet werden. Solche membrangebundenen Proteine und Zeltrezeptoren umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Cytokinrezeptoren, Rezeptorkinasen, Rezeptorphosphatasen, Rezeptoren, die in Zell-Zell-Wechselwirkungen eingebunden sind, und zelluläre Adhäsinmoleküle wie Selektine und Integrine. Transduktion von Signalen, die Zellwachstum und -Differenzierung regulieren, wird teilweise durch Phosphorylierung verschiedener zellulärer Proteine reguliert. Proteintyrosinkinasen, Enzyme, die diesen Prozess katalysieren, können auch als Wachstumsfaktorrezeptoren wirken. Beispiele umfassen Fibroblasten-Wachstumsfaktorezeptor und Nerven-Wachstumsfaktorrezeptor.
Es wurden sowohl seitens der Industrie als auch seitens der akademischen Forschung Anstrengungen unternommen, um neue, native sekretierte und membrangebundene Rezeptorproteine zu identifizieren. Zahlreiche Anstrengungen konzentrierten sich auf das Screenen von rekombinanten Säugetier-DNA-Bibliotheken, um die Codiersequenzen für neue sekretierte und membrangebundene Rezeptorproteine zu identifizieren. Beispiele für Screening-Verfahren und -Techniken sind in der Literatur beschrieben [siehe beispielsweise Klein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 93, 7108-7113 (1996); US-Patent Nr. 5.536.637)].
Die Erfinder beschreiben hierin die Identifizierung und Charakterisierung neuer sekretierter und transmembraner Polypeptide und neuer Nucleinsäuren, die für diese Polypeptide kodieren.
PRO224
Cholesterinaufnahme kann schwerwiegende Auswirkungen auf die Gesundheit haben. Cholesterinaufnahme kann Zellen mit einem Großteil des Cholesterins versorgen, das sie zur Membransynthese benötigen. Wird die Aufnahme blockiert, so sammelt sich Cholesterin im Blut und kann zur Bildung von Arterioskleroseplättchen an Blutgefäßwänden führen. Das meiste Cholesterin wird gebunden an Protein in Form von Komplexen, die als Lipoproteine geringer Dichte (low-density lipoproteins, LDL) bekannt sind, im Blut transportiert. LDL werden über LDL-Rezeptorproteine in Zellen Endozytose unterzogen. Daher sind LDL-Rezeptorproteine und Proteine mit Homologie hierzu für die Bereiche der Forschung und Medizin von Interesse. Membrangebundene Proteine und Rezeptoren können in der Bildung, Differenzierung und Aufrechterhaltung von mutizellulären Organismen eine wichtige Rolle spielen. Die LDL-Rezeptoren sind ein Beispiel für Membran-gebundene Proteine, die in die Synthese und Bildung von Zellmembranen eingebunden sind, worin die Gesundheit einer Person durch deren Funktion direkt und indirekt beeinflusst wird. Zahlreiche Membran-gebundene Proteine wirken als Rezeptoren, wie beispielsweise der LDL-Rezeptor. Diese Rezeptoren können so funktionieren, dass sie Substrate Endozytose unterziehen, oder sie können als ein Rezeptor für einen Kanal funktionieren. Andere Membran-gebundene Proteine funktionieren als Signale oder Antigene.
Membran-gebundene Proteine und Rezeptormoleküle sind für verschiedene industrielle Anwendungsbereiche geeignet, umfassend die Anwendung als pharmazeutische oder diagnostische Mittel. Die Membran-gebundenen Proteine können auch zum Screenen potentieller Peptid- oder kleiner Molekülregulatoren der relevanten Rezeptor/Liganden-Wechselwirkung verwendet werden. Im Fall des LDL-Rezeptors ist es wünschenswert, Moleküle zu finden, die Endozytose fördern, um den Blutcholesterinspiegel und die Plättchenbildung zu senken. Auch ist es wünschenswert, Moleküle zu identifizieren, die Endozytose hemmen, sodass diese Moleküle von Personen mit hohem Blutcholesterin vermieden oder reguliert werden können. Polypeptide, die zu Lipoproteinrezeptoren homolog sind, die jedoch nicht als Lipoproteinrezeptoren funktionieren, sind zur Bestimmung der Funktion der Fragmente, die Homolgie aufweisen, auch von Interesse.
Die folgenden Studien berichten von bereits bekannten Rezeptoren für Lipoproteine geringer Dichte und verwandten Proteinen, umfassend Apolipoproteine: Sawamura et al., Nippon Chemiphar Co., Japanische Patentanmeldung J09.098.787; S. Novak et al., J. Biol. Chem. 271(20), 11732-11736 (1996); D. Blaas, J. Virol. 69(11), 7244- 7247 (Nov. 1995); J. Scott, J. Inherit. Metab. Dis. (UK) 9/Beilage 1, 3-16 (1986); Yamamoto et al., Cell 39, 27-38 (1984); Rebece et al., Neurobiol. Aging 15, 5117 (1994); S. Novak et al., J. Biol. Chemistry 271, 11732-11736 (1996); und Sestavel & Fruchart, Cell. Mol. Biol. 40(4), 461-481 (Juni 1994). Diese Veröffentlichungen und andere, die vor dem Einreichungsdatum dieser Anmeldung veröffentlicht wurden, liefern weitere Hintergrundinformationen zu Peptiden, die auf dem Gebiet der Erfindung bereits bekannt sind.
Sowohl in der Industrie als auch in der Forschung wurden Anstrengungen unternommen, um neue, native Membran-gebundene Rezeptorproteine zu identifizieren, insbesondere solche, die Homologie zu Lipoproteinrezeptoren aufweisen. Die Erfinder beschreiben hierin die Identifikation und Charakterisierung neuer Polypeptide mit Homologie zu Lipoproteinrezeptoren, die hierin als PRO224-Polypeptide bezeichnet werden.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
PRO224
Die Anmelder identifizierten einen cDNA-Klon, der für ein neues Polypeptid kodiert, worin das Polypeptid in der vorliegenden Anmeldung als " PRO224" bezeichnet wird.
In einer Ausführungsform stellt die Erfindung ein isoliertes Nucleinsäuremolekül bereit, das DNA wie in den Ansprüchen definiert umfasst, die für ein PRO224-Polypeptid kodiert. In einem Aspekt umfasst die isolierte Nucleinsäure DNA, die für das PRO224-Polypeptid mit den Aminosäureresten 1 bis 282 aus 2 (Seq.-ID Nr. 2) kodiert, oder sie ist komplementär zu solch einer kodierenden Nucleinsäuresequenz und bleibt unter zumindest moderat stringenten, und gegebenenfalls unter hochstringenten, Bedingungen an sie gebunden.
In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung isolierte PRO224-Polypeptide gemäß der Definition der Ansprüche bereit. Insbesondere stellt die Erfindung isoliertes Nativsequenz-PRO224-Polypeptid bereit, das in einer Ausführungsform eine Aminosäuresequenz umfassend die Reste 1 bis 282 aus 2 (Seq.-ID Nr. 2) einbindet.
Zusätzliche Ausführungsformen
In anderen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung stellt die Erfindung Vektoren bereit, die für jedes der zuvor oder nachstehend beschriebenen Polypeptide kodierende DNA umfasst. Eine Wirtszelle, die jegliche solcher Vektoren umfasst, wird auch bereitgestellt. Als Beispiel können Wirtszellen CHO-Zellen, E. coli oder Hefe sein. Weiters wird ein Verfahren zur Herstellung jedes der zuvor oder nachstehend beschriebenen Polypeptide bereitgestellt, das das Kultivieren von Wirtszellen unter geeigneten Bedingungen zur Expression des erwünschten Polypeptids und die Gewinnung des erwünschten Polypeptids aus der Zellkultur umfasst.
In anderen Ausführungsformen stellt die Erfindung chimäre Moleküle bereit, die jedes der zuvor und nachstehend beschriebenen Polypeptide, die mit einem heterologen Polypeptid oder Aminosäuresequenz fusioniert sind, umfasst. Ein Beispiel für solch ein chimäres Molekül umfasst jedes der zuvor oder nachstehend beschriebenen Polypeptide, die mit einer Epitopmarkierungs-Sequenz oder einer Fc-Region eines Immunglobulins fusioniert sind.
In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung einen Antikörper bereit, der sich an jedes der zuvor oder nachstehend beschriebenen Polypeptide spezifisch bindet. Gegebenenfalls ist der Antikörper ein monoklonaler Antikörper.
In wiederum anderen Ausführungsformen stellt die Erfindung Oligonucleotidsonden bereit, die zum Isolieren genomischer und cDNA-Nucleotidsequenzen nützlich sind, worin diese Sonden von jeder der zuvor und nachstehend beschriebenen Nucleotidsequenzen abgeleitet sein können.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt eine Nucleotidsequenz (Seq.-ID Nr. 1) einer Nativsequenz-PRO224-cDNA, worin Seq.-ID Nr. 1 ein Klon ist, der hierin als "UNQ198" und/oder "DNA33221-1133" bezeichnet wird.
2 zeigt die Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 2), die von der Codiersequenz von Seq.-ID Nr. 1, gezeigt in 1, abgeleitet ist.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
I. Definitionen
Die hierin verwendeten Bezeichnungen "PRO-Polypeptid" und "PRO" beziehen sich, sofern eine Nummernbezeichnung folgt, auf verschiedene Polypeptide, worin sich die vollständige Bezeichnung (d.h. PRO/Nummer) auf spezifische Polypeptidsequenzen, wie sie hierin beschrieben sind, beziehen. Die Bezeichnungen "PRO/Nummer-Polypeptid" und "PRO/Nummer", wie sie hierin verwendet werden, umfassen Nativsequenz-Polypeptide und Polypeptidvarianten (die hierin näher beschrieben werden). Die hierin beschriebenen PRO-Polypeptide können aus zahlreichen Quellen, wie beispielsweise aus menschlichen Gewebetypen oder aus anderen Quellen, isoliert oder durch Rekombinations- oder Syntheseverfahren hergestellt werden.
Ein "Nativsequenz-PRO-Polypeptid" umfasst ein Polypeptid mit derselben Aminosäuresequenz wie das entsprechende PRO-Polypeptid, das aus natürlichen Quellen abgeleitet ist. Solche Nativsequenz-PRO-Polypeptide können aus der Natur isoliert oder durch Rekombinations- oder Synthesemittel hergestellt werden. Die Bezeich nung "Nativsequenz-PRO-Polypeptid" umfasst spezifisch natürlich vorkommende, trunkierte oder sekretierte Formen des spezifischen PRO-Polypeptids (z.B. eine Sequenz der extrazellulären Domäne), natürlich vorkommende Varianten (z.B. abwechselnd gespleißte Formen) und natürlich vorkommende Allelvarianten des Polypeptids. In einer Ausführungsform der Erfindung ist das Nativsequenz-PRO224-Polypeptid ein reifes oder Vollängen-Nativsequenz-PRO224-Polypeptid, das die Aminosäuren 1 bis 282 aus 2 (Seq.-ID Nr. 2) umfasst.
"PRO-Polypeptid-Variante" bedeutet ein aktives PRO-Polypeptid wie zuvor oder nachstehend definiert, das zumindest etwa 80 % Aminosäuresequenzidentität mit der hierin offenbarten Sequenz des Nativsequenz-PRO-Polypeptids voller Länge aufweist. Solche PRO-Polypeptid-Varianten umfassen beispielsweise PRO-Polypeptide, worin ein oder mehrere Aminosäurereste am N- oder C-Terminus der nativen Aminosäuresequenz voller Länge hinzugefügt oder deletiert werden. Gewöhnlicherweise weist eine PRO-Polypeptidvariante zumindest etwa 80 % Aminosäurensequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 90 % Aminosäuresequenzidentität, und insbesondere bevorzugt zumindest 95 % Aminosäuresequenzidentität, mit der Aminosäuresequenz der hierin offenbarten, nativen Aminosäuresequenz voller Länge auf.
"Prozent (%) an Aminosäuresequenzidentität" in Bezug auf die hierin identifizierten PRO-Polypeptidsequenzen ist definiert als der Prozentsatz der Aminosäurereste in einer vermutlichen Sequenz, die mit den Aminosäureresten in der spezifischen PRO-Polypeptidsequenz, nach Angleichen der Sequenzen und Einführen von Lücken, sofern erforderlich, um den maximalen Prozentsatz an Sequenzidentität zu erreichen, identisch sind, wobei konservativen Substitutionen nicht als Teil der Sequenzidentität betrachtet werden. Eine Angleichung zum Zweck der Bestimmung der prozentuellen Aminosäuresequenzidentität kann auf verschiedene Weisen erreicht werden, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, beispielsweise unter Verwendung im Handel erhältlicher Computersoftware wie BLAST-, ALIGN- oder Megalign(DNASTAR-) Software. Das bevorzugte Software-Angleichungsprogramm ist BLAST.
Fachleute können geeignete Parameter zur Messung der Angleichung, umfassend jegliche Algorithmen, die erforderlich sind, um maximale Angleichung über die volle Länge der zu vergleichenden Sequenzen zu erlangen, bestimmen.
"Prozent (%) an Nucleinsäuresequenzidentität" in Bezug auf die hierin identifizierten, für PRO kodierenden Nucleinsäuresequenzen ist definiert als der Prozentsatz der Nucleotide in einer vermutlichen Sequenz, die mit den Nucleotiden in der PRO-Nucleinsäuresequenz von Interesse, nach Angleichung der Sequenzen und Einführen von Lücken, sofern erforderlich, um den maximalen Prozentsatz an Sequenzidentität zu erreichen, identisch sind. Eine Angleichung zum Zweck der Bestimmung der prozentuellen Nucleinsäuresequenzidentität kann auf verschiedene Weisen erreicht werden, die im Fachbereich der Erfindung liegen, beispielsweise unter Verwendung im Handel erhältlicher Computersoftware wie BLAST-, ALIGN- oder Megalign- (DNASTAR-) Software. Fachleute können geeignete Parameter zur Messung der Angleichung, umfassend jegliche Algorithmen, die erforderlich sind, um maximale Angleichung über die volle Länge der zu vergleichenden Sequenzen zu erlangen, bestimmen.
"Isoliert", sofern es verwendet wird, um die verschiedenen, hierin offenbarten Polypeptide zu beschreiben, bezeichnet ein Polypeptid, das aus einer Komponente seiner natürlichen Umgebung identifiziert und getrennt und/oder gewonnen wurde. Verunreinigende Komponenten seiner natürlichen Umgebung sind Materialien, die typischerweise die diagnostische oder therapeutische Verwendung des Polypeptids stören würden, und können Enzyme, Hormone und andere proteinische und nichtproteinische Gelöststoffe umfassen. In bevorzugten Ausführungsformen wird das Polypeptid (1) bis zu einem ausreichenden Grad, um zumindest 15 Reste der Nterminalen oder inneren Aminosäuresequenz durch die Verwendung eines Zentrifugenröhrchen-Sequenzierers zu erhalten, oder (2) bis zur Homogenität durch SDS-PAGE unter nicht-reduzierenden oder reduzierenden Bedingungen unter Verwendung von Coomassie-Blau- oder, vorzugsweise, Silberfärbung gereinigt. Isoliertes Polypeptid umfasst Polypeptid in situ innerhalb rekombinanter Zellen, da zumindest eine Komponente aus der natürlichen PRO-Polypeptid-Umgebung nicht vorhanden ist. Üblicherweise wird jedoch isoliertes Polypeptid durch zumindest einen Reinigungsschritt hergestellt.
Eine "isolierte" PRO-Polypeptid-Nucleinsäure ist ein Nucleinsäuremolekül, das aus zumindest einem verunreinigendem Nucleinsäuremolekül identifiziert und abgetrennt wird, mit dem es üblicherweise in der natürlichen Quelle der PRO-Polypeptidnucleinsäure verbunden ist. Ein isoliertes PRO-Polypeptidnucleinsäuremolekül liegt in anderer Form oder Anordnung vor, in der es in der Natur gefunden wird. Isolierte PRO-Polypeptidnucleinsäuremoleküle werden daher vom spezifischen PRO-Polypeptidnucleinsäuremolekül unterschieden, wie es in natürlichen Zellen existiert. Ein isoliertes PRO-Polypeptidnucleinsäuremolekül umfasst jedoch PRO-Polypeptidnucleinsäuremoleküle, die in Zellen enthalten sind, die üblicherweise das PRO-Polypeptid exprimieren, wenn beispielsweise das Nucleinsäuremolekül an einem anderen chromosomalen Ort vorkommt als die natürlichen Zellen.
"Southern-Analyse" oder "Southern-Blotting" ist ein Verfahren, durch das die Gegenwart von DNA-Sequenzen in einem Restriktionsendonuclease-Verdau von DNA oder einer DNA-enthaltenden Zusammensetzung durch Hybridisierung an ein bekanntes, markiertes Oligonucleotid oder DNA-Fragment bestätigt wird. Southern-Analyse umfasst typischerweise Elektrophorese-Trennung von DNA-Verdauen auf Agarose-Gelen, Denaturierung der DNA nach Elektrophoresetrennung und Übertragung der DNA auf Nitrocellulose, Nylon oder andere geeignete Membranträger zur Analyse mit einer radioaktiv markierten, biotinylierten oder Enzym-markierten Sonde, wie in den Kapiteln 9.37-9.52 aus Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Gold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) beschrieben wird.
"Northern-Analyse" oder "Northern-Blotting" ist ein Verfahren, das verwendet wird, um RNA-Sequenzen zu identifizieren, die an eine bekannte Sonde wie ein Oligonucleotid, DNA-Fragment, cDNA oder ein Fragment davon oder ein RNA-Fragment hybridisieren. Die Sonde ist mit einem Radioisotop wie ³²P oder durch Biotinylierung oder mit einem Enzym markiert. Die zu analysierende RNA wird üblicherweise über Elektrophorese auf einem Agarose- oder Polyacrylamidgel getrennt, auf Nitrocellulose, Nylon oder andere geeignete Membranen übertragen und mit der Sonde hybridisiert, wobei Standardverfahren verwendet werden, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, wie beispielsweise jene, die in den Kapiteln 7.39-7.52 von Sambrook et al., s.o., beschrieben werden.
Die Bezeichnung "Kontrollsequenzen" bezieht sich auf DNA-Sequenzen, die für die Expression einer operabel gebundenen Codiersequenz in einem bestimmten Wirtsorgansimus notwendig sind. Die Kontrollsequenzen, die beispielsweise für Prokaryoten geeignet sind, umfassen einen Promotor, gegebenenfalls eine Operatorsequenz und eine Ribosom-Bindungsstelle. Eukaryotische Zellen sind dafür bekannt, Promotoren, Polyadenylierungssignale und Enhancer einzusetzen.
Nucleinsäure ist "operabel gebunden", wenn sie in eine funktionelle Beziehung mit einer anderen Nucleinsäuresequenz gebracht wird. Beispielsweise ist DNA für eine Präsequenz oder einen sekretorischen Leader dann an DNA für ein Polypeptid operabel gebunden, wenn sie als ein Präprotein exprimiert wird, das an der Sekretion des Polypeptids beteiligt ist; ein Promotor oder Enhancer ist an eine kodierende Sequenz operabel gebunden, wenn er die Transkription der Sequenz beeinflusst; oder eine Ribosom-Bindungsstelle ist an eine kodierende Sequenz operabel gebunden, wenn sie so angeordnet ist, dass sie Translation erleichtert. Im Allgemeinen bedeutet "operabel gebunden", dass die zu bindenden DNA-Sequenzen zusammenhängend sind und im Fall eines sekretorischen Leaders zusammenhängend sind und sich in Lesephase befinden. Enhancer müssen jedoch nicht zusammenhängend sein. Das Binden erfolgt über Ligation an geeigneten Restriktionsstellen. Existieren solche Stellen nicht, werden die synthetischen Oligonucleotid-Adaptoren gemäß herkömmlichen Praktiken verwendet.
Die Bezeichnung "Antikörper" wird im breitesten Sinn verwendet und deckt insbesondere einzelne monoklonale Anti-PRO-Polypeptid-Anitkörper (umfassend Agonist, Antagonist und neutralisierende Antikörper) und Anti-PRO-Polypeptid-Antikörper-Zusammensetzungen mit polyepitopischer Spezifität ab. Die hierin verwendete Bezeichnung "monoklonaler Antikörper" bezieht sich auf einen Antikörper, der aus einer Population von im Wesentlichen homogenen Antikörpern erhalten wurde, d.h. die einzelnen in der Population vorkommenden Antikörper sind identisch, mit Ausnahme möglicher natürlich vorkommender Mutationen, die in geringen Mengen vorhanden sein können.
"Aktiv" oder "Aktivität" für den hierin verwendeten Zweck bezieht sich auf (eine) Formen) von PRO-Polypeptid, die die biologischen und/oder immunologischen Aktivitäten des spezifischen nativen oder natürlich vorkommenden PRO-Polypeptids beibehält/beibehalten.
"Behandlung" oder "Behandeln" bezieht sich sowohl auf therapeutische Behandlung als auch auf prophylaktische oder präventive Maßnahmen. Jene, die einer Behandlung bedürfen, umfassen jene, die bereits an einer Erkrankung leiden, und jene, die für solche Erkrankungen empfänglich sind, oder jene, bei denen es die Erkrankung zu unterbinden gilt.
"Säugetier" für den Zweck der Behandlung bezieht sich auf jedes Tier, das als Säugetier klassifiziert ist, umfassend Menschen, Zucht- und Nutztiere, und Zoo-, Sport- oder Haustiere, wie Schafe, Hunde, Pferde, Katzen, Kühe und dergleichen. Vorzugsweise ist das Säugetier hierin ein Mensch.
"Träger", wie sie hierin verwendet werden, umfassen pharmazeutisch annehmbare Träger, Arzneimittelträger oder Stabilisatoren, die für die Zelle oder das Säugetier, denen diese Substanz verabreicht wird, in den verwendeten Dosen und Konzentrationen nicht toxisch sind. Oft ist der physiologisch annehmbare Träger eine wässrige pH-gepufferte Lösung. Beispiele für physiologisch annehmbare Träger umfassen Puffer wie Phosphat, Citrat und andere organische Säuren; Antioxidantien umfassend Ascorbinsäure; niedermolekulare Polypeptide (weniger als etwa 10 Reste); Proteine wie Serumalbumin, Gelatine oder Immunglobuline; hydrophile Polymere wie Polyvinylpyrrolidon; Aminosäuren wie Glycin, Glutamin, Asparagin, Arginin oder Lysin; Monosaccharide, Disaccharide und andere Kohlenhydrate, umfassend Glucose, Mannose oder Dextrine; Chelatbildner wie EDTA; Zuckeralkohole wie Mannit oder Sorbit; Salz-bildende Gegenionen wie Natrium; und/oder nichtionische Tenside wie TWEEN^TM, Polyethylenglykol (PEG) und PLURONICS^TM.
Die Bezeichnung "Agonist" wird verwendet, um auf Peptid- oder Nicht-Peptid-Analoga der nativen PRO-Polypeptide (worin sich natives PRO-Polypeptid auf Pro-PRO-Polypeptid, Prä-PRO-Polypeptid, Präpro-PRO-Polypeptid oder reifes PRO-Polypeptid bezieht) der vorliegenden Erfindung und auf Antikörper Bezug zu nehmen, die solche nativen PRO-Polypeptide spezifisch binden, vorausgesetzt, dass sie zumindest eine biologische Aktivität eines nativen PRO-Polypeptids beibehalten. Vorzugsweise behalten die Agonisten der vorliegenden Erfindung die qualitativen Bindungs-Erkennungseigenschaften und Rezeptor-Aktivierungseigenschaften des nativen PRO-Polypeptids bei.
Die Bezeichnung "Antagonist" wird verwendet, um Bezug auf ein Molekül zu nehrnen, das eine biologische Aktivität eines nativen PRO-Polypeptids der vorliegenden Erfindung hemmt, worin sich natives PRO-Polypeptid auf Pro-PRO-Polypeptid, Prä-PRO-Polypeptid, Prapro-PRO-Polypeptid oder reifes PRO-Polypeptid bezieht. Vorzugsweise hemmen die Antagonisten hierin die Bindung eines nativen PRO-Polypeptids der vorliegenden Erfindung.
Ein PRO-Polypeptid-"Antagonist" ist ein Molekül, das eine PRO-Antagonisten-Effektorfunktion unterbindet oder stört (z.B. ein Molekül, das das Binden und/oder die Aktivierung eines PRO-Polypeptid-Rezeptors durch PRO-Polypeptid unterbindet oder stört). Solche Moleküle können beispielsweise auf ihre Fähigkeit gescreent werden, PRO-Polypeptid-Rezeptoraktivierung durch Überwachen der Bindung nativen PRO-Polypeptids in Gegenwart und Abwesenheit des Testantagonisten-Moleküls durch Konkurrenz zu hemmen.
Ein Antagonist der Erfindung umfasst auch ein Antisense-Polynucleotid gegen das PRO-Polypeptidgen, worin das Antisense-Polynucleotid Transkription oder Translation des PRO-Polypeptidgens blockiert, wodurch seine Expression und biologische Aktivität gehemmt werden.
"Stringente Bedingungen" bedeuten (1) den Einsatz geringer lonenstärke und hoher Temperatur beim Waschschritt, beispielsweise 0,015 Natriumchlorid/0,0015 M Natriumcitrat/0,1 % Natriumdodecylsulfat bei 50 °C, oder (2) den Einsatz eines Denaturierungsmittels wie Formamid während der Hybridisierung, beispielsweise 50 Vol.- % Formamid mit 0,1 % Rinderserumalbumin/0,1 % Ficoll/0,1 % Polyvinylpyrrolidon/50 nM Natriumphosphatpuffer bei pW 6,5 mit 750 mM Natriumchlorid, 75 mM Natriumcitrat bei 42 °C. Ein weiteres Beispiel ist die Verwendung von 50 % Formamid, 5 × SSC (0,75 M NaCl, 0,075 M Natriumcitrat), 50 mM Natriumphosphat (pH 6/8), 0,1 % Natriumpyrophosphat, 5 × Denhardts Lösung, beschallte Lachssperma-DNA (50 μg/ml), 0,1 % SDS und 10 % Dextransulfat bei 42 °C, wobei Waschschritte bei 42 °C in 0,2 × SSC und 0,1 % SDS durchgeführt werden. Wiederum ein anderes Beispiel ist Hybridisierung unter Verwendung eines Puffers aus 10 % Dextransulfat, 2 × SSC (Natriumchlorid/Natriumcitrat) und 50 % Formamid bei 55 °C, gefolgt von einem hochstringenten Waschschritt, bestehend aus 0,1 × SSC mit EDTA bei 55 °C.
"Moderat stringente Bedingungen" sind in Sambrook et al., s.o., beschrieben und umfassen die Verwendung einer Waschlösung und von Hybridisierungsbedingungen (z.B. Temperatur, lonenstärke und % SDS), die weniger stringent sind als zuvor beschrieben. Ein Beispiel für moderat stringente Bedingungen ist eine Bedingung wie Inkubation über Nacht bei 37 °C in einer Lösung, umfassend: 20 % Formamid, 5 × SSC (150 mM NaCl, 15 mM Trinatriumcitrat), 50 mM Natriumphosphat (pH 7,6), 5 × Denhardts Lösung, 10 % Dextransulfat und 20 mg/ml denaturierte, abgeschnittene Lachssperma-DNA, gefolgt von Waschen der Filter in 1 x SSC bei etwa 37-50 °C. Der Fachmann wird erkennen, wie Temperatur, lonenstärke usw. einzustellen sind, um Faktoren wie Sondenlänge und dergleichen Rechnung zu tragen.
II Zusammensetzungen und Verfahren der Erfindung
Volllängen-PRO224-Polypeptide
Die vorliegende Erfindung stellt neu identifizierte und isolierte Nucleotidsequenzen bereit, die für Polypeptide kodieren, auf die in der vorliegenden Erfindung mit PRO224 Bezug genommen wird. Insbesondere identifizierten und isolierten die Anmelder cDNA, die für ein PRO224-Polypeptid kodiert, wie näher im nachstehenden Beispiel offenbart wird. Durch die Verwendung von BLAST- und FastA-Computerprogrammen zur Sequenzangleichung fanden die Anmelder heraus, dass natives Volllängen-PRO224 (2, Seq.-ID Nr. 2) Aminosäureidentität mit Apolipoprotein-E-Rezeptor 2906 von Homo sapiens aufweist. Die Abgleichungen verschiedener Abschnitte dieser zwei Polypeptide zeigen Aminosäureidentität von 37 %, 36 %, 30 %, 44 %, 44 % bzw. 28 %. Natives Volllängen-PRO224 (2, Seq.-ID Nr. 2) weist auch Aminosäureidentität mit Lipoprotein-Rezeptorvorläufer sehr geringer Dichte aus der Galle auf. Die Abgleichungen verschiedener Abschnitte dieser zwei Polypeptide weisen Aminosäureidentitäten von 38 %, 37 %, 42 %, 33 % bzw. 37 % auf. Darüber hinaus weist natives Volllängen-PRO224 (2, Seq.-ID Nr. 2) Aminosäurenidentität mit dem Hühner-Oozyten-Rezeptor P95 der Spezies Gallus gallus auf. Die Abgleichungen verschiedener Abschnitte dieser zwei Polypeptide weisen Aminosäureidentität von 38 %, 37 %, 42 %, 33 % bzw. 37 % auf. Weiters weist natives Vollängen-PRO224 (2, Seq.-ID Nr. 2) Aminosäurenidentität mit Kurzform-Vorläufer des Lipoproteinrezeptors sehr geringer Dichte von Menschen auf. Die Abgleichungen verschiedener Abschnitte dieser zwei Polypeptide weisen Aminosäureidentität von 32 %, 38 %, 34 %, 45 % bzw. 31 % auf. Demgemäß wird gegenwärtig angenommen, dass PRO224-Polypeptid, das in der vorliegenden Anmeldung offenbart wird, ein neu identifiziertes Mitglied der Familie von Lipoproteinrezeptoren geringer Dichte darstellt und die strukturellen Eigenschaften besitzt, die erforderlich sind, um die funktionelle Fähigkeit zu besitzen, Lipoproteine geringer Dichte, die für die Familie der Lipoproteinrezeptoren geringer Dichte typisch sind, zu erkennen und Endozytose zu unterziehen. (Die zuvor beschriebenen Abgleichungen entstanden unter Verwendung der folgenden Wertungsparametern: T = 7, S +65, S2 = 36, Matrix: BLOSUM62.)
PRO-Polypeptid-Varianten
Zusätzlich zu den hierin beschriebenen Volllängen-Nativsequenz-PRO-Polypeptiden wird erwogen, dass PRO-Polypeptid-Varianten hergestellt werden können: PRO-Polypeptid-Varianten können durch Einführen geeigneter Nucleotidänderungen in die PRO-Polypeptid-DNA oder durch Synthese des erwünschten PRO-Polypeptids hergestellt werden. Fachleuten wird bekannt sein, dass Aminosäurenänderungen posttranslationelle Prozesse der PRO-Polypeptide verändern können, wie beispielsweise das Ändern der Anzahl oder der Position von Glykosylierungsstellen oder das Ändern der Membranverankerungseigenschaften.
Variationen in den hierin beschriebenen Volllängen-Nativsequenz-PRO-Polypeptiden oder in verschiedenen Domänen der PRO-Polypeptide können beispielsweise unter Verwendung jeglicher der beispielsweise im US-Patent Nr. 5.364.934 beschriebenen Verfahren und Richtlinien für konservative und nicht konservative Mutationen hervorgebracht werden. Variationen können in Form von Substitutionen, Deletionen oder Insertionen eines oder mehrerer Codons, die für das PRO-Polypeptid kodieren, vollzogen werden, was zu einer Änderung der Aminosäuresequenz des PRO-Polypeptids im Vergleich zum Nativsequenz-PRO-Polypeptid führt. Gegebenenfalls erfolgt die Variation durch Substitution von zumindest einer Aminosäure mit einer anderen Aminosäure in einer oder mehreren Domänen des PRO-Polypeptids. Bezugspunkte zur Bestimmung, welcher Aminosäurerest insertiert, substituiert oder deletiert werden kann, ohne die erwünschte Aktivität negativ zu beeinflussen, können durch einen Vergleich der Sequenz des PRO-Polypeptids mit jener der homologen, bekannten Proteinmoleküle und durch Minimieren der Anzahl der Aminosäuresequenzänderungen in Regionen hoher Homologie gefunden werden. Aminosäure-Substitutionen können das Resultat der Ersetzung einer Aminosäure durch eine andere Aminosäure mit ähnlichen strukturellen und/oder chemischen Eigenschaften sein, wie beispielsweise die Ersetzung eines Leucins durch ein Serin, d.h. konservative Aminosäuren-Ersetzungen. Insertionen oder Deletionen können gegebenenfalls 1 bis 5 Aminosäuren umfassen. Die zugelassene Variation kann durch systematisches Durchführen von Insertionen, Deletionen oder Substitutionen von Aminosäuren in der Sequenz und Testen der resultierenden Varianten auf Aktivität im In-vitro-Test, der in den nachstehenden Beispielen beschrieben wird, bestimmt werden.
Die Variationen können unter Verwendung von auf dem Gebiet der Erfindung bekannten Verfahren, wie Oligonucleotid-vermittelte (ortsgerichtete) Mutagenese, Alanin-Scanning und PCR-Mutagenese, durchgeführt werden. Ortsgerichtete Mutagenese [Carter et al., Nucl. Acids Res. 13, 4331 (1986); Zoller et al., Nucl. Acids Res. 10, 6487 (1987)], Kassettenmutagenese [Wells et al., Gene 34, 315 (1985)], Restriktionsselektions-Mutagenese [Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA 317, 415 (1986)] oder andere bekannte Verfahren können an der klonierten DNA durchgeführt werden, um die erwünschte PRO-Polypeptid-Varianten-DNA herzustellen.
Die Scanning-Aminosäure-Analyse kann auch verwendet werden, um eine oder mehrere Aminosäuren entlang einer zusammenhängenden Sequenz zu identifizieren. Zu den bevorzugten Scanning-Aminosäuren gehören relativ kleine, neutrale Aminosäuren. Solche Aminosäuren umfassen Alanin, Glycin, Serin und Cystein. Alanin ist typischerweise eine bevorzugte Scanning-Aminosäure aus dieser Gruppe, da sie die Seitenketten nach dem Beta-Kohlenstoff eliminiert und weniger dazu neigt, die Hauptketten-Konformation der Variante zu ändern. Alanin ist auch typischerweise bevorzugt, da sie die üblichste Aminosäure ist. Weiters wird sie häufig sowohl in tiefliegenden als auch in offenliegenden Positionen gefunden [Creighton, The Proteins (W.H. Freeman & Co, N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol. 150, 1 (1976)]. Ergibt Alaninsubstitution keine angemessenen Mengen an Varianten, so kann eine isoterische Aminosäure verwendet werden.
Modifikationen von PRO-Polypeptiden
Kovalente Modifikationen von PRO-Polypeptiden sind vom Schutzumfang der Erfindung umfasst. Eine Art kovalenter Modifikation umfasst die Umsetzung von Ziel-Aminosäureresten des PRO-Polypeptids mit einem organischen Derivatisierungsittel, das in der Lage ist, mit ausgewählten Seitenketten oder N- oder C-terminalen Resten des PRO-Polypeptids zu reagieren. Die Derivatisierung mit bifunktionellen Mitteln ist nützlich, beispielsweise zum Vernetzen eines PRO-Polypeptids zu einer wasserunlöslichen Trägermatrix oder Oberfläche zur Verwendung im Verfahren zur Reinigung von Anti-PRO-Polypeptid-Antikörper, und umgekehrt. Herkömmlich verwendete Vernetzer umfassen z.B. 1,1-Bis(diazoacetyl)-2-phenylethan, Glutaraldehyd, N-Hydroxysuccinimidester, beispielsweise Ester mit 4-Azidosalicylsäure, homobifunktionelle Imidoester, umfassend Disuccinimidylester wie 3,3'-Dithiobis(succinimidylpropionat), bifunktionelle Maleinimide wie Bis-N-maleinimido-1,8-octan und Mittel wie Methyl-3-[(p-azidophenyl)dithio]propioimidat.
Andere Modifikationen umfassen Desamidierung von Glutaminyl- und Asparaginylresten zu den entsprechenden Glutamyl- bzw. Aspartylresten, Hydroxylierung von Prolin und Lysin, Phosphorylierung von Hydroxygruppen von Seryl- oder Threonylresten, Methylierung der α-Aminogruppen von Lysin-, Arginin- und Histidin-Seitenketten [T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, 79-86 (1983)], Acetylierung des N-terminalen Amins und Amidierung jeder beliebigen C-terminalen Carboxygruppe.
Eine andere Art kovalenter Modifikation der PRO-Polypeptide, die in den Schutzumfang dieser Erfindung eingeschlossen ist, umfasst das Ändern des nativen Glykosylierungsmusters des Polypeptids. Unter "Ändern des nativen Glykosylierungsmusters" wird im Rahmen der hierin beabsichtigten Zwecke das Deletieren einer oder mehrerer Kohlenhydrat-Gruppierungen, die in einem Nativsequenz-PRO-Polypeptid zu finden sind, und/oder das Hinzufügen einer oder mehrerer Glykosylierungs-Stellen, die im Nativsequenz-PRO-Polypeptid nicht vorhanden sind, verstanden.
Das Hinzufügen von Glykosylierungsstellen zum PRO-Polypeptid kann durch Ändern der Aminosäuresequenz erfolgen. Die Änderung kann beispielsweise durch das Hinzufügen oder die Substitution von einem oder mehreren Serin- oder Threoninresten zum bzw. im Nativsequenz-PRO-Polypeptid (für O-verbundene Glykosylierungsstellen) erfolgen. Die PRO-Polypeptid-Aminosäuresequenz kann gegebenenfalls durch Veränderungen auf DNA-Niveau geändert werden, insbesondere durch Mutieren der DNA, die für das PRO-Polypeptid kodiert, an vorbestimmten Basen, sodass Codons gebildet werden, die in die erwünschten Aminosäuren translatiert werden.
Ein anderes Mittel zur Steigerung der Anzahl der Kohlenhydratgruppierungen am PRO-Polypeptid ist chemisches oder enzymatisches Binden von Glykosiden an das Polypeptid. Solche Verfahren sind auf dem Gebiet der Erfindung beschrieben, z.B. in der WO 87/05.330, veröffentlicht am 11. September 1987, und in Aplin und Writson, CRC Crit. Rev. Biochem., 259-306 (1981).
Das Entfernen von Kohlenhydratgruppierungen, die am PRO-Polypeptid vorhanden sind, kann chemisch oder enzymatisch oder durch Mutations-Substitution von Codons erfolgen, die für Aminosäurereste kodieren, die als Targets für Glykosylierung dienen. Chemische Deglykosylierungsverfahren sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und beschrieben, beispielsweise von Hakimuddin et al., Arch. Biochem. Biophys. 259, 52 (1987), und von Edge et al., Anal. Biochem: 118, 131 (1981). Enzymatische Spaltung von Kohlenhydrat-Gruppierungen auf Polypeptiden kann durch die Verwendung einer Vielzahl an Endo- und Exoglykosidasen erreicht werden, wie von Thotakura et al., Meth. Enzymol. 138, 350 (1987), beschrieben.
Eine andere Art der kovalenten Modifikation von PRO-Polypeptiden der Erfindung umfasst das Binden des PRO-Polypeptids an eines von zahlreichen, nichtproteinischen Polymeren, z.B. Polyethylenglykol, Polypropylenglykol oder Polyoxyalkylene, auf die Weise, wie sie in den US-Patenten Nr. 4.640.835, 4.496.689, 4.301.144, 4.670.417, 4.791.192 oder 4.179.337 beschrieben wird.
Die PRO-Polypeptide der vorliegenden Erfindung können auch auf eine Weise modifiziert werden, dass sie ein chimäres Molekül bilden, das ein PRO-Polypeptid umfasst, das an ein anderes, heterologes Polypeptid oder eine andere, heterologe Aminosäuresequenz gebunden ist. In einer Ausführungsform umfasst solch ein chimäres Molekül eine Fusion des PRO-Polypeptids mit einem Markierungs-Polypeptid, das ein Epitop bereitstellt, an das sich ein Anti-Markierung-Antikörper selektiv binden kann. Die Epitop-Markierung ist im Allgemeinen am Amino- oder Carboxy-Terminus des PRO-Polypeptids angeordnet. Die Gegenwart solcher Epitop-markierten Formen des PRO-Polypeptids kann unter Verwendung eines Antikörpers gegen das Markierungs-Polypeptid nachgewiesen werden. Auch ermöglicht das Bereitstellen der Epitop-Markierung, dass das PRO-Polypeptid leicht durch Affinitätsreinigung unter Verwendung eines Anti-Markierung-Antikörpers oder einer anderen Art an Affinitätsmatrix, die sich an die Epitop-Markierung bindet, gereinigt werden kann. In einer alter nativen Ausführungsform kann das chimäre Molekül eine Fusion des PRO-Polypeptids mit einem Immunglobulin oder einer bestimmten Region eines Immunglobulins umfassen. Für eine zweiwertige Form des chimären Moleküls könnte solch eine Fusion an die Fc-Region eines IgG-Moleküls erfolgen.
Verschiedene Markierungs-Polypeptide und ihre entsprechenden Antikörper sind auf dem Gebiet der Erfindung gut bekannt. Beispiele umfassen Polyhistidin- (poly-his-) oder Poly-Histidin-Glycin- (poly-his-gly-) Markierungen; das flu-HA-Markierungs-Polypeptid und seinen Antikörper 12CA5 [Field et al., Mol. Cell. Biol. 8, 2159-2165 (1988)]; die c-myc-Markierung und die 8F9-, 3C7-, 6E10-, G4-, B7- und 9E10-Antikörper dazu [Evan et al., Molecular and Cellular Biology 5, 3610-3616 (1985)]; und die Herpes-Simplex-Virus-Glykoprotein-D- (-gD-) Markierung und ihren Antikörper [Paborsky et al., Protein Engineering 3(6), 547-553 (1990)]. Andere Markierungs-Polypeptide umfassen das Flag-Peptid [Hopp et al., BioTechnology 6, 1204-1210 (1988)]; das KT3-Epitoppeptid [Martin et al., Science 255, 192-194 (1992)]; ein α-Tubulinepitoppeptid [Skinner et al., J. Biol. Chem. 266, 15163-15166 (1991)]; und die T7-Gen-10-Proteinpeptid-Markierung [Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 6393-6397 (1990)].
Herstellung von PRO-Polypeptiden
Die nachstehende Beschreibung bezieht sich hautpsächlich auf die Herstellung von PRO-Polypeptiden mittels Kultivieren von Zellen, die mit einem Vektor, der die gewünschte PRO-Polypeptid-Nucleinsäure enthält, transformiert oder transfiziert sind. Beispielsweise kann die PRO-Polypeptid-Sequenz, oder Teile davon, mittels direkter Peptidsynthese unter Verwendung von Festphasenverfahren hergestellt [siehe z.B. Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2154 (1963)]. In-vitro-Proteinsynthese kann mittels manueller Verfahren oder mittels Automation durchgeführt werden. Automatisierte Synthese kann beispielsweise unter Verwendung eines Applied Biosystems Peptide Synthesizer (Foster City, CA) und Befolgung der Anweisungen des Herstellers erfolgen. Verschiedene Abschnitte des erwünschten PRO-Polypeptids können einzeln chemisch synthetisiert und mittels chemischer oder enzymatischer Verfahren kombiniert werden, um das Volllängen-PRO-Polypeptid herzustellen.
A. Isolierung von für PRO-Polypeptide kodierender DNA
DNA, die für PRO-Polypeptide kodiert, kann aus einer cDNA-Bibliothek erhalten werden, die aus Geweben hergestellt wird; von denen angenommen wird, dass sie die erwünschte PRO-Polypeptid-mRNA aufweist und sie in detektierbarer Konzentration exprimiert. Demgemäß kann menschliche PRO-Polypeptid-DNA gut aus einer cDNA-Bibliothek, die aus menschlichem Gewebe hergestellt wurde, erhalten werden, wie in den Beispielen beschrieben wird. Das für PRO-Polypeptid kodierende Gen kann auch aus einer genomischen Bibliothek oder durch Oligonucleotid-Synthese erhalten werden.
Bibliotheken können mit Sonden (wie Antikörpern gegen das erwünschte PRO-Polypeptid oder Oligonucleotiden von zumindest etwa 20-80 Basen) gescreent werden, deren Zweck es ist, das Gen von Interesse oder das durch dieses Gen kodierte Protein zu identifizieren. Screening der cDNA- oder der genomischen Bibliothek mit der ausgewählten Sonde kann unter Verwendung von Standardverfahren durchgeführt werden, wie in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) beschrieben wird. Ein alternatives Mittel, um das Gen, das das erwünschte PRO-Polypeptid kodiert, zu isolieren, ist die Verwendung der PCR-Methodik [Sambrook et al., s.o.; Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press (1995))].
Die nachstehenden Beispiele beschreiben Verfahren zum Screenen einer cDNA-Bibliothek. Die als Sonden ausgewählten Oligonucleotid-Sequenzen sollten von ausreichender Länge sein und ausreichend eindeutig sein, um falsche Positive zu minimieren. Das Oligonucleotid ist vorzugsweise so markiert, dass es über Hybridisierung an DNA in der zu screenenden Bibliothek nachgewiesen werden kann. Markierungsverfahren sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und umfassen die Verwendung von radioaktiven Markierungen wie ³²P-markiertem ATP, Biotinylierung oder Enzymmarkierung. Hybridisierungsbedingungen, umfassend moderate Stringenz und hohe Stringenz, sind in Sambrook et al., s.o., bereitgestellt.
Sequenzen, die im Rahmen solcher Bibliotheks-Screening-Verfahren identifiziert werden, können mit anderen bekannten Sequenzen verglichen und abgeglichen werden, die in öffentlichen Datenbanken wie GenBank oder anderen privaten Sequenzdatenbanken hinterlegt und zugänglich sind. Sequenzidentität (entweder auf Niveau der Aminosäure oder des Nucleotids) innerhalb definierter Regionen des Moleküls oder über die Volllängen-Sequenz können mittels Sequenzangleichung unter Verwendung von Computer-Softwareprogrammen wie BLAST, ALIGN, DNAstar und INHERIT bestimmt werden, die verschiedene Algorithmen verwenden, um Homologie zu berechnen.
Nucleinsäure mit Protein-Codiersequenz kann durch Screenen ausgewählter cDNA- oder genomischer Bibliotheken unter Verwendung der abgeleiteten Aminosäuresequenz, die hierin zum ersten Mal offenbart wird, und, sofern notwendig, unter Ver wendung herkömmlicher Primer-Extensions-Verfahren, wie sie in Sambrook et al., s.o., beschrieben sind, erhalten werden, um Vorläufer und Processing-Zwischenprodukte von mRNA nachzuweisen, die eventuell nicht in cDNA reverstranskribiert worden sind.
B. Auswahl und Transformation von Wirtszellen
Wirtszellen werden mit hierin für die Herstellung von PRO-Polypeptid beschriebenen Expressions- oder Kloniervektoren transfiziert oder transformiert und in herkömmlichen Nährmedien kultiviert, die geeignet sind, um Promotoren zu induzieren, Transformanten auszuwählen oder die für die erwünschten Sequenzen kodierenden Gene zu amplifizieren. Die Kultivierungsbedingungen wie Medium, Temperatur, pH und dergleichen können von Fachleuten ohne übermäßiges Experimentieren ausgewählt werden. Im Allgemeinen können Prinzipien, Protokolle und praktische Verfahren zur Maximierung der Produktivität von Zellkulturen in Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M. Butler (Hrsg.); IRL Press (1991), und Sambrook et al., s.o., nachgelesen werden.
Transfektionsverfahren sind Fachleuten bekannt, beispielsweise CaPO₄ und Elektroporation. Je nach verwendeter Wirtszelle erfolgt Transformation mittels Standardverfahren, die für solche Zellen geeignet sind. Die Calciumbehandlung, die Calciumchlorid verwendet, wie sie in Sambrook et al., s.o., beschrieben wird, oder Elektroporation wird im Allgemeinen für Prokaryoten oder andere Zellen verwendet, die wesentliche Zellwandbarrieren aufweisen. Infektion mit Agrobacterium tumefaciens wird zur Transformation bestimmter Pflanzenzellen verwendet, wie von Shaw et al., Gene 23, 315 (1983), und in der WO 89/05.859, veröffentlicht am 29. Juni 1989, beschrieben wird. Für Säugetierzellen ohne solche Zellwände kann das Calciumphosphat-Ausfällungsverfahren von Graham & van der Eb, Virology 52, 456-457 (1978), verwendet werden. Allgemeine Aspekte der Säugetierzellen-Wirtssystem-Transformationen sind im US-Patent Nr. 4.399.216 beschrieben. Transformationen zu Hefe werden typischerweise gemäß dem von Van Solingen et al., J. Bact. 130, 946 (1977), und Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 76, 3829 (1979), beschriebenen Verfahren durchgeführt. Jedoch können auch andere Verfahren zum Einführen von DNA in Zellen, wie durch Kern-Mikroinjektion, Elektroporation, bakterielle Protoplastenfusion mit intakten Zellen oder Polykationen, z.B. Polybren, Polyornithin, verwendet werden. Verschiedene Verfahren zur Transformation von Säugetierzellen können in Keown et al., Methods in Enzymology 185, 527-537 (1990), und Mansour et al., Nature 336, 348-352 (1988), nachgelesen werden.
Geeignete Wirtszellen zum Klonieren oder Exprimieren der DNA in den hierin beschriebenen Vektoren umfassen Prokaryoten-, Hefe- oder höhere Eukaryotenzellen. Geeignete Prokaryoten umfassen Eubakterien, wie Gram-negative oder Grampositive Organismen, beispielsweise Enterobacteriaceae wie E. coli, sind jedoch nicht beschränkt darauf. Verschiedene E.-coli-Stämme sind öffentlich erhältlich, wie der E.-coli-K12-Stamm MM294 (ATCC 31.446); E. coli X1776 (ATCC 31.537); E.coli-Stamm W3110 (ATCC 27.325) und K5 772 (ATCC 53.635). Andere geeignete prokaryotische Wirtszellen umfassen Enterobacteriaceae wie Escherichia, z.B. E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, z.B. Salmonella typhimurium, Serratia, z.B. Serratia marcescans, und Shigella sowie Bacilli, wie B. subtilis und B. licheniformis (z.B. B. licheniformis 41P, offenbart in DD 266.710, veröffentlicht am 12. April 1989), Pseudomonas, wie P. aeruginosa, und Streptomyces. Verschiedene E.-coli-Stämme sind öffentlich zugänglich, wie E.-coli-K12-Stamm MM294 (ATCC 31.466); E. coli X1776 (ATCC 31.537); E.-coli-Stamm W3110 (ATCC 27.325) und K5 772 (ATCC 53.635). Diese Beispiele sind illustrativ und nicht einschränkend. Stamm W3110 ist ein besonders bevorzugter Wirt oder Elternwirt, da er ein häufiger Wirtsstamm für rekombinante DNA-Produkt-Fermentationen ist. Vorzugsweise sekretiert die Wirtszelle minimale Mengen an proteolytischen Enzymen. Stamm W3110 kann modifiziert werden, um eine genetische Mutation in den Genen zu bewirken, die für zum Wirt endogene Proteine kodieren, wobei Beispiele für solche Wirte Folgendes umfassen: E.-coli-W3110-Stamm 1A2, der den kompletten Genotypus tonA aufweist; E.-coli-W3110-Stamm 9E4, der den kompletten Genotypus tonA ptr3 aufweist; E.-coli-W3110-Stamm 27C7 (ATCC 55.244), der den kompletten Genotypus tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT kan' aufweist; E.-coli-W3110-Stamm 37D6, der den kompletten Genotypus tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT rbs7 ilvG kan' aufweist; E-coli-W3110-Stamm 40B4, der Stamm 37D6 mit einer nicht-Kanamycin-resistenten degP-Deletionsmutation ist; und ein E.coli-Stamm mit mutanter periplasmatischer Protease, offenbart im US-Patent Nr. 4.946.783, ausgegeben am 7. August 1990. Alternativ dazu sind In-vitro-Klonierungsverfahren, z.B. PCR oder andere Nucleinsäure-Polymerasereaktionen, geeignet.
Zusätzlich zu Prokaryoten sind eukaryotische Mikroben wie Fadenpilze oder Hefe geeignete Klonierungs- oder Expressionswirte für für PRO-Polypeptid kodierende Vektoren. Saccharomyces cerevisiae ist ein üblicherweise verwendeter, niederer eukaryotischer Wirtsmikroorganismus. Andere umfassen Schizosaccharomyces pombe (Beach and Nurse, Nature 290, 140 [1981]; EP 139.383 , veröffentlicht am 2. Mai 1985); Kluyveromyces-Wirte (US-Patent Nr. 4.943.529; Fleer et al., Bio/Technology 9, 968-975 (1991)) wie z.B. K. lactis (MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt et al., J. Bacteriol., 737 [1983]), K. fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045), K. wickeramii (ATCC 24.178), K. waltii (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906; Van den Berg et al., Bio/Technology 8, 135 (1990)), K. thermotolerans und K. marxianus; Yarrowia ( EP 402.226) ; Pichia pastoris ( EP 183.070 ; Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol. 28, 265-278 [1988]); Candida; Trichoderma reesia ( EP 244.234 ); Neurospora crassa (Case. et al., Proc. Natl.. Acad. Sci. USA 76, 5259- 5263 [1979]); Schwanniomyces wie Schwanniomyces occidentalis ( EP 394.538 , veröffentlicht am 31. Oktober 1990); und Fadenpilze wie z.B. Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (WO 91/00357, veröffentlicht am 10. Jänner 1991) und Aspergillus-Wirte wie A. nidulans (Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 112, 284-289 [1983]; Tilburn et al., Gene 26, 205-221 [1983]; Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1470-1474 [1984], und A. niger (Kelly & Hynes, EMBO J. 4, 475-479 [1985]). Metyhlotropische Hefearten sind hierin geeignet und umfassen Hefe, die in der Lage ist, auf Methanol zu wachsen, ausgewählt aus den aus Hansenula, Candida, Kloeckera, Pichia, Saccharomyces, Torulopsis und Rhodotorula bestehenden Genera, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Eine Liste spezifischer Spezies, die beispielhaft für diese Klasse von Hefearten ist, ist in C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982), zu finden.
Geeignete Wirtszellen für die Expression von glykosylierten PRO-Polypeptiden sind von multizellulären Organismen abgeleitet. Beispiele für Zellen von Wirbellosen umfassen Insektenzellen wie Drosophila S2 und Spodoptera Sf9 sowie Pflanzenzellen. Beispiele für nützliche Säugetier-Zelllinien umfassen Chinahamster-Eierstockzellen (CHO) und COS-Zellen. Spezifischere Beispiele umfassen die Affennieren-CV1-Linie, transformiert durch SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); menschliche Embryonennieren-Linie (293 oder 293-Zellen, subkloniert für Wachstum in Suspensionskultur, Graham et al., J. Gen Virol. 36, 59 (1977)); Chinahamster-Eierstockzellen/-DHFR (CHO, Urlaub & Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216 (1980)); Maus-Sertolizellen (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23, 243-251 (1980)); menschliche Lungenzellen (W138, ATCC CCL 75); menschliche Leberzellen (Hep G2, HB 8065); und Maus-Mammakarzinom (MMT 060562, ATCC CCL51). Es wird erachtet, dass die Auswahl der geeigneten Wirtszelle im Rahmen des Gebiets der Erfindung möglich ist.
C. Auswahl und Verwendung eines replikablen Vektors
Die Nucleinsäure (z.B. cDNA oder genomische DNA), die für ein erwünschtes PRO-Polypeptid kodiert, kann in einen replikablen Vektor zum Klonieren (Amplifikation der DNA) oder zur Expression insertiert werden. Verschiedene Vektoren sind öffentlich erhältlich. Der Vektor kann beispielsweise in Form eines Plasmids, Cosmids, viralen Partikels oder Phagen sein. Die geeignete Nucleinsäuresequenz kann in den Vektor durch zahlreiche Verfahren insertiert werden. Im Allgemeinen wird DNA in (eine) geeignete Restriktionsendonuclease-Stelle(n) unter Verwendung von Verfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, insertiert. Vektorkomponenten umfassen im Allgemeinen eine oder mehrere Signalsequenzen, einen Replikationsstartpunkt, ein oder mehrere Markierungsgene, ein Enhancer-Element, einen Promotor und eine Transkriptionsterminationssequenz, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Zur Kon struktion geeigneter Vektoren, die eine oder mehrere dieser Komponenten umfassen, werden Standard-Ligationsverfahren verwendet, die Fachleuten bekannt sind.
Das PRO-Polypeptid von Interesse kann rekombinant nicht nur direkt produziert werden, sondern kann auch als Fusions-Polypeptid mit einem heterologen Polypeptid produziert werden, das eine Signalsequenz oder ein anderes Polypeptid mit einer spezifischen Spaltungsstelle am N-Terminus des reifen Proteins oder Polypeptids sein kann. Im Allgemeinen kann die Signalsequenz eine Komponente des Vektors sein, oder sie kann ein Teil der PRO-Polypeptid-DNA sein, die in den Vektor insertiert wird. Die Signalsequenz kann eine prokaryotische Signalsequenz sein, die beispielsweise aus der Gruppe der alkalischen Phosphatase, Penicillinase, Ipp oder wärmestabilen Enterotoxin-II-Leader ausgewählt ist. Zur Hefesekretion kann die Signalsequenz z.B. der Hefe-Invertase-Leader, Alpha-Faktor-Leader (umfassend Saccharomyces- und Kluyveromyces-α-Faktor-Leader, wobei Letzterer im US-Patent Nr. 5.010.182 beschrieben ist) oder Saure-Phosphatase-Leader, der C.-albicans-Glucoamylase-Leader ( EP 362.179 , veröffentlicht am 4. April 1990) oder das Signal sein, das in der WO 90/13.646, veröffentlicht am 15. November 1990, beschrieben ist. Bei Säugetierzellenexpression können Säugetier-Signalsequenzen verwendet werden, um die Sekretion des Proteins zu steuern, wie beispielsweise Signalsequenzen aus sekretierten Polypeptiden derselben oder verwandter Spezies, sowie virale sekretorische Leader.
Sowohl Expressions- als auch Klonierungs-Vektoren enthalten eine Nucleinsäuresequenz, die es dem Vektor ermöglicht, sich in einer oder mehreren ausgewählten Wirtszellen zu replizieren. Solche Sequenzen sind für eine Vielzahl an Bakterien, Hefe und Viren gut bekannt. Der Replikationsstartpunkt des Plasmids pBR322 ist für die meisten Gram-negativen Bakterien geeignet, der 2μ-Plasmid-Startpunkt ist für Hefe zweckdienlich, und verschiedene virale Startpunkte (SV40, Polyoma, Adenovirus, VSV oder BPV) sind für Klonierungsvektoren in Säugetierzellen zweckdienlich.
Expressions- und Klonierungs-Vektoren enthalten typischerweise ein Selektionsgen, das auch als selektierbarer Marken bezeichnet wird. Typische Selektionsgene kodieren für Proteine, die (a) Resistenz gegen Antibiotika oder andere Toxine, z.B. Ampicillin, Neomycin, Methotrexat oder Tetracyclin, verleihen, (b) auxotrophe Mängel ergänzen oder (c) maßgebliche Nährstoffe zur Verfügung stellen, die aus komplexen Medien nicht verfügbar sind, beispielsweise das Gen, das für die D-Alaninracemase für Bacilli kodiert.
Ein Beispiel für geeignete selektierbare Marker für Säugetierzellen umfasst eine, die in der Lage sind, die Identifikation von Zellen zu ermöglichen, die fähig sind, die PRO-Polypeptid-Nucleinsäure aufzunehmen, wie beispielsweise DHFR oder Thymidinkinase. Eine geeignete Wirtszelle, wenn Wildtyp-DHFR verwendet wird, ist die CHO-Zelllinie, die in DHFR-Aktivität unzureichend ist, die hergestellt und verlängert worden ist, wie von Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216 (1980), beschrieben wurde. Ein zur Verwendung in Hefe geeignetes Selektionsgen ist das trp1-Gen, das im Hefe-Plasmid YRp7 vorhanden ist [Stinchcomb et al., Nature 282, 39 (1979); Kingsman et al., Gene 7, 141 (1979); Tschemper et al., Gene 10, 157 (1980)]. Das trp1-Gen stellt einen Selektionsmarker für einen Mutantenstamm von Hefe bereit, dem die Fähigkeit fehlt, in Tryptophan zu wachsen, beispielsweise ATCC Nr. 44.076 oder PEP4-1 [Jones, Genetics 85, 12 (1977)].
Expressions- und Klonierungs-Vektoren enthalten üblicherweise einen Promotor, der operabel mit der PRO-Polypeptid-Nucleinsäuresequenz verbunden ist, um mRNA-Synthese zu lenken. Promotoren, die durch eine Vielzahl potentieller Wirtszellen erkannt werden, sind bekannt. Promotoren, die zur Verwendung mit prokaryotischen Wirten geeignet sind, umfassen die β-Lactamase- und Lactose-Promotorsysteme [Chang et al., Nature 275, 615 (1978); Goeddel et al., Nature 281, 544 (1979)], alkalische Phosphatase, ein Tryptophan- (trp-) Promotorsystem [Goeddel, Nucleic Acids Res. 8, 4057 (1980); EP 36.776 ] und Hybridpromotoren wie den Tac-Promotor [deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 21-25 (1983)]. Promotoren zur Verwendung in bakteriellen Systemen enthalten auch eine Shine-Dalgarno- (S.D.-) Se quenz, die operabel an die DNA gebunden ist, die für das erwünschte PRO-Polypeptid kodiert.
Beispiele für geeignete Promotor-Sequenzen zur Verwendung mit Hefewirten umfassen die Promotoren für 3-Phosphoglycerat-Kinase [Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 225, 2073 (1980)] oder andere glykolytische Enzyme [Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7, 149 (1968); Holland, Biochemistry 17, 4900 (1978)], wie beispielsweise Enolase, Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase, Hexokinase, Pyruvatdecarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-6-phosphatisomerase, 3-Phosphoglyceratmutase, Pyruvatkinase, Triosephosphatisomerase, Phosphoglucoseisomerase und Glucokinase.
Andere Hefe-Promotoren, die induzierbare Promotoren mit dem zusätzlichen Vorteil von durch Wachstumsbedingungen kontrollierter Transkription sind, sind die Promotorregionen von Alkoholdehydrogenase 2, Isocytochrom C, Saure Phosphatase, abbauende Enzyme, verbunden mit Stickstoffmetabolismus, Metallothionein, Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase und Enzyme, die für Maltose- und Galactose-Verwertung verantwortlich sind. Für die Verwendung bei Hefeexpression geeigneter Vektoren und Promotoren sind in dem EP 73.657 näher beschrieben.
PRO-Polypeptid-Transkription von Vektoren in Säugetierwirtszellen wird beispielsweise durch Promotoren gesteuert, die aus den Genomen von Viren wie Polyomavirus, Geflügelpockenvirus (UK 2.211.504, veröffentlicht am 5. Juli 1989), Adenovirus (wie Adenovirus 2), Rinder-Papillomavirus, Vogel-Sarkomvirus, Zytomegalie-Virus, ein Retrovirus, Hepatitis-B-Virus und Simian-Virus 40 (SV40), aus heterologen Säugetierpromotoren wie z.B. dem Actinpromotor oder einem Immunglobulinpromotor und aus Hitzeschockpromtoren erhalten werden, vorausgesetzt, solche Promotoren sind mit dem Wirtszellsystem kompatibel.
Die Transkription einer DNA, die für das erwünschte PRO-Polypeptid kodiert, durch höhere Eukaryoten kann durch Insertieren einer Enhancer-Sequenz in den Vektor erhöht werden. Enhancer sind cis-wirkende Elemente von DNA, üblicherweise von etwa 10 bis 300 bp, die auf einen Promotor wirken, um seine Transkription zu steigern. Zahlreiche Enhancer-Sequenzen von Säugetiergenen (Globin, Elastase, Albumin, α-Fötoprotein und Insulin) sind bekannt. Typischerweise wird jedoch ein Enhancer aus einem eukaryotischen Zellvirus verwendet. Beispiele umfassen den SV40-Enhancer an der späten Seite des Replikationsstartpunktes (bp 100-270), den frühen Zytomegalie-Promotor-Enhancer, den Polyoma-Enhancer an der späten Seite des Replikationsstartpunktes und Adenovirus-Enhancer. Der Enhancer kann in den Vektor an einer Position 5' oder 3' zur PRO-Polypeptid-Codiersequenz gespleißt sein, ist vorzugsweise jedoch an einer Stelle 5' vom Promtor angeordnet.
Expressionsvektoren, die in eukaryotischen Wirtszellen (Hefe, Pilzen, Insekten, Pflanzen, Tieren, Menschen oder kernhaltigen Zellen von anderen, mehrzelligen Organismen) verwendet werden, enthalten auch Sequenzen, die für die Transkriptionstermination und zum Stabilisieren der mRNA notwendig sind. Solche Sequenzen sind von den untranslatierten 5'-, und manchmal 3'-, Regionen von eukaryotischen oder viralen DNA oder cDNA üblicherweise erhältlich. Diese Regionen enthalten Nucleotidsegmente, die als polyadenylierte Fragmente im untranslatierten Abschnitt der für die PRO-Polypeptide kodierenden mRNA transkribiert sind.
Weitere andere Verfahren, Vektoren und Wirtszellen, die zur Anpassung an die Synthese von PRO-Polypeptiden in rekombinanter Wirbeltier-Zellkultur geeignet sind, sind in Gething et al., Nature 293, 620-625 (1981); Mantei et al., Nature 281, 40-46 (1979); dem EP 117.060 und dem EP 117.058 beschrieben.
D. Nachweisen von Genamplifikation/-Expression
Genamplifikation und/oder -Expression können in einer Probe direkt gemessen werden, beispielsweise durch herkömmliches Southern-Blotting, Northern-Blotting, um die Transkription von mRNA zu quantifizieren [Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 5201-5205 (1980)], Dot-Blotting (DNA-Analyse) oder In-situ-Hybridisierung, wo bei eine geeignet markierte Sonde, basierend auf den hierin bereitgestellten Sequenzen, verwendet wird. Alternativ dazu können Antikörper verwendet werden, die spezifische Duplexe, umfassend DNA-Duplexe, RNA-Duplexe und DNA-RNA-Hybridduplexe oder DNA-Protein-Duplexe, erkennen können. Die Antikörper wiederum können markiert werden, und der Test kann durchgeführt werden, wo der Duplex an eine Oberfläche gebunden ist, sodass bei der Bildung eines Duplex an der Oberfläche die Gegenwart von Antikörpern, die an den Duplex gebunden sind, nachgewiesen werden kann.
Genexpression kann, alternativ dazu, durch immunologische Verfahren wie beispielsweise immunohistochemisches Färben von Zellen oder Gewebeschnitte und Tests an Zellkulturen oder Körperflüssigkeiten gemessen werden, um die Expression von Genprodukten direkt zu quantifizieren. Antikörper, die für immunohistochemisches Färben und/oder Tests an Probenflüssigkeiten verwendet werden, können entweder monoklonal oder polyklonal sein und können in jedem Säugetier hergestellt werden. Gut können Antikörper gegen ein Nativsequenz-PRO-Polypeptid oder gegen ein synthetisches Peptid, basierend auf den DNA-Sequenzen, die hierin bereitgestellt werden, oder gegen exogene Sequenzen, die an eine PRO-Polypeptid-DNA fusioniert sind und für ein spezifisches Antikörper-Epitop kodieren, hergestellt werden.
E. Reinigung von Polypeptid
Formen von PRO-Polypeptiden können aus Kulturmedium oder aus Wirtszelllysaten gewonnen werden. Ist es membrangebunden, so kann es aus der Membran mittels einer geeigneten Detergenzienlösung (z.B. Triton-X 100) oder mittels enzymatischer Spaltung freigesetzt werden. Zellen, die zur Expression von PRO-Polypeptiden verwendet werden, können durch verschiedene physikalische oder chemische Mittel, wie Gefrier-Auftau-Zyklieren, Beschallen, mechanisches Aufbrechen oder Zell-Lysiermittel, aufgeschlossen werden.
Es kann wünschenswert sein, PRO-Polypeptide aus rekombinanten Zellproteinen oder Polypeptiden zu reinigen. Die folgenden Verfahren sind Beispiele für geeignete Reinigungsverfahren: Fraktionierung an einer lonenaustausch-Säule; Ethanolfällung; Umkehrphasen-HPLC; Chromatographie auf Siliciumdioxid oder einem Kationenaustausch-Harz wie DEAE; Chromatofokussierung,. SDS-PAGE; Ammoniumsulfat-Ausfällung; Gelfiltration unter Verwendung von beispielsweise Sephadex G-75; Protein-A-Sepharose-Säulen, um Kontaminanten wie IgG zu entfernen; und Metall chelatierende Säulen, um Epitop-markierte Formen des PRO-Polypeptids zu binden. Zahlreiche Verfahren der Proteinreinigung können verwendet werden, und solche Verfahren sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und beispielsweise in Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982), beschrieben. Der/Die ausgewählte(n) Reinigungsschritte) hängt/hängen beispielsweise von der Beschaffenheit des Herstellungsverfahrens und des bestimmten, hergestellten PRO-Polypeptids ab.
Verwendungen für PRO-Polypeptide
Nucleotidsequenzen (oder ihre Komplemente), die für die PRO-Polypeptide der vorliegenden Erfindung kodieren, haben verschiedene Anwendungsgebiete im Bereich der Molekularbiologie, umfassend Verwendungen als Hybridisierungssonden, beim Chromosom- und Genkartieren und bei der Herstellung von Antisense-RNA und – DNA. Für PRO-Polypeptid kodierende Nucleinsäure ist auch zur Herstellung von PRO-Polypeptiden durch die hierin beschriebenen Rekombinationsverfahren nützlich.
Die Nucleinsäure, die für das Volllängen-Nativsequenz-PRO-Polypeptid kodiert, oder Teile davon können als Hybridisierungssonden für eine cDNA-Bibliothek verwendet werden, um das Volllängen-PRO-Polypeptidgen zu isolieren oder um weitere andere Gene (beispielsweise jene, die für natürlich vorkommende Varianten des PRO-Polypeptids oder der PRO-Polypeptide anderer Spezies kodieren) zu isolieren, die eine erwünschte Sequenzidentität mit den PRO-Polypeptid-Nucleinsäuresequenzen aufweisen. Gegebenenfalls umfasst die Länge der Sonden etwa 20 bis etwa 50 Basen. Die Hybridisierungssonden können von der Nucleotidsequenz jedes der hierin offenbarten DNA-Moleküle oder von den genomischen Sequenzen, umfassend Promotoren, Enhancer-Elemente und Introns der für das Nativsequenz-PRO-Polypeptid kodierenden DNA, abgeleitet sein. Beispielsweise umfasst ein Screening-Verfahren das Isolieren der Codierregion des PRO-Polypeptidgens unter Verwendung der bekannten DNA-Sequenz, um eine ausgewählte Sonde von etwa 40 Basen zu synthetisieren. Hybridisierungssonden können durch zahlreiche verschiedene Markierungen, umfassend Radionucleotide wie ³²P oder ³⁵S, oder durch enzymatische Markierungen wie alkalische Phosphatase, an die Sonde über Avidin/Biotin-Bindungssysteme gebunden, markiert sein. Markierte Sonden mit einer Sequenz, die zu jener des spezifischen PRO-Polypeptidgens der vorliegenden Erfindung komplementär ist, können verwendet werden, um Bibliotheken menschlicher cDNA, genomischer DNA oder mRNA zu screenen, um zu bestimmen, welche Bestandteile solcher Bibliotheken an die Sonde hybridisieren. Hybridisierungsverfahren werden in den folgenden Beispielen näher beschrieben.
Die in der vorliegenden Anmeldung offenbarten EST können unter Venrwendung der hierin offenbarten Verfahren ähnlich als Sonden verwendet werden.
Die Sonden können auch in PCR-Verfahren verwendet werden, um einen Pool an Sequenzen zur Identifikation von eng verwandten PRO-Polypeptidsequenzen zu bilden.
Nucleotidsequenzen, die für ein PRO-Polypeptid kodieren, können auch verwendet werden, um Hybridisierungssonden zur Kartierung des Gens, das für dieses PRO-Polypeptid kodiert, und für die genetische Analyse von Personen mit Erbkrankheiten zu konstruieren. Die hierin bereitgestellten Nucleotidsequenzen können an ein Chromosom und spezifische Regionen eines Chromosoms unter Verwendung bekannter Verfahren, wie beispielsweise durch In-situ-Hybridisierung, Bindungsanalyse gegen bekannte chromosomale Marker und Hybridisierungs-Screenen mit Bibliotheken, kartiert werden.
Das PRO-Polypeptid kann in Tests zur Identifizierung seiner Liganden verwendet werden. Dem ähnlich können Inhibitoren der Rezeptor/Liganden-Bindungswechselwirkung identifiziert werden. Proteine, die in solche Bindungswechselwirkungen eingebunden sind, können auch verwendet werden, um auf Peptid oder kleinere Molekülinhibitoren oder Agonisten der Bindungswechselwirkung zu screenen. Screening-Tests können entworfen werden, um Leitverbindungen zu finden, die die biologische Aktivität eines nativen PRO-Polypeptids oder eines Liganden für das PRO-Polypeptid nachahmen. Solche Screening-Tests umfassen Tests, die für das High-Throughput-Screenen chemischer Bibliotheken geeignet sind, was sie für die Identifikation kleiner vermutlicher Arzneimittel-Moleküle besonders geeignet macht. Kleine in Betracht gezogene Moleküle umfassen synthetische organische oder anorganische Verbindungen. Die Tests können in zahlreichen verschiedenen Formaten durchgeführt werden, umfassend Protein-Protein-Bindungstests, biochemische Screening-Tests, Immuntests und zellbasierte Tests, die auf dem Gebiet der Erfindung gut beschrieben sind.
Nucleinsäuren, die für ein PRO-Polypeptid kodieren, oder seine modifizierten Formen können auch verwendet werden, um entweder transgene Tiere oder "Knockout"-Tiere zu bilden, die ihrerseits zur Entwicklung und zum Screenen therapeutisch nützlicher Reagenzien nützlich sind. Ein transgenes Tier (z.B. eine Maus oder Ratte) ist ein Tier, das Zellen aufweist, die ein Transgen enthalten, wobei dieses Transgen in das Tier oder einen Vorfahren des Tiers in einem pränatalen Stadium, z.B. dem Embryonalstadium, eingeführt wurde. Ein Transgen ist eine DNA, die in das Genom einer Zelle integriert ist, aus der sich ein transgenes Tier entwickelt. In einer Ausführungsform kann eine cDNA, die für ein PRO-Polypeptid von Interesse kodiert, verwendet werden, um genomische DNA, die für das PRO-Polypeptid kodiert, gemäß anerkannter Verfahren und genomische Sequenzen zu klonieren, die verwendet werden, um transgene Tiere zu bilden, welche Zellen enthalten, die für PRO- Polypeptid kodierende DNA exprimieren. Verfahren zur Bildung transgener Tiere, besonders von Tieren wie Mäusen oder Ratten, sind auf dem Gebiet der Erfindung bereits alltäglich und sind beispielsweise in den US-Patenten Nr. 4.736.866 und 4.870.009 beschrieben. Typischerweise würde auf Zellen für den Einbau von PRO-Polypeptid-Transgenen mit gewebespezifischen Enhancern abgezielt werden. Transgene Tiere, die eine Kopie eines Transgens aufweisen, das für ein PRO-Polypeptid kodiert, das in einem Embryonalstadium in die Keimbahn des Tiers eingeführt wurde, können verwendet werden, um die Auswirkung erhöhter Expression von DNA, die für das PRO-Polypeptid kodiert, zu untersuchen. Solche Tiere können als Testtiere für Reagenzien verwendet werden, die so entworfen sind, dass sie Schutz beispielsweise vor Krankheitszuständen, die mit Überexpression von PRO-Polypeptid in Verbindung stehen, bieten. Gemäß diesem Aspekt der Erfindung wird ein Tier mit dem Reagens behandelt, und ein im Vergleich mit nicht behandelten Tieren, die das Transgen in sich tragen, reduziertes Auftreten des Krankheitszustandes würde auf eine mögliche therapeutische Wirkung für diesen Krankheitszustand hinweisen.
Alternativ dazu können nichtmenschliche Homologe von PRO-Polypeptiden verwendet werden, um ein PRO-Polypeptid-"Knock-out"-Tier zu konstruieren, das aufgrund homologer Rekombination zwischen dem endogenen Gen, das für das PRO-Polypeptid kodiert, und der geänderten genomischen DNA, die für das PRO-Polypeptid kodiert, die in eine Embryonenzelle des Tiers eingeführt wurden, ein defektes oder verändertes Gen aufweist, das für das PRO-Polypeptid von Interesse kodiert. Beispielsweise kann cDNA, die für ein PRO-Polypeptid kodiert, verwendet werden, um genomische DNA, die für das PRO-Polypeptid kodiert, gemäß den anerkannten Verfahren zu klonieren. Ein Teil der genomischen DNA, die für ein PRO-Polypeptid kodiert, kann deletiert oder durch ein anderes Gen ersetzt werden, beispielsweise ein Gen, das für einen selektierbaren Marken kodiert, der verwendet werden kann, um Integration zu überwachen. Typischennreise sind mehrere Kilobasen nicht geänderter, flankierender DNA (sowohl am 5'- als auch am 3'-Ende) in den Vektor eingebunden [siehe z.B. Thomas & Capecchi, Cell 51, 503 (1987), für eine Beschreibung homologer Rekombinationsvektoren]. Der Vektor wird in eine embryonale Stammzellenlinie (z.B. durch Elektroporation) eingeführt, und Zellen, in denen sich die eingeführte DNA homolog mit der endogenen DNA rekombiniert hat, werden ausgewählt [siehe z.B. Li et al., Cell 69, 915 (1992)]. Die ausgewählten Zellen werden anschließend in eine Blastozyste eines Tiers (z.B. einer Maus oder Ratte) injiziert, um Aggregationschimären zu bilden [siehe z.B. Bradley, in Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E.J. Robertson (Hrsg.), 113-152, (IRL, Oxford (1987))]. Ein chimärer Embryo kann dann in ein geeignetes, scheinschwangeres weibliches Leihmuttertier implantiert werden, und das Embryo wird von diesem Tier ausgetragen, um ein "Knock-out"-Tier zu bilden. Nachkommenschaft, die die homolog rekombinierte DNA in ihren Keimzellen trägt, kann durch Standardverfahren identifiziert und weiters verwendet werden, um Tiere zu züchten, in denen alle Zellen die homolog rekombinierte DNA enthalten. Knockout-Tiere können beispielsweise über ihre Fähigkeit; selbst gegen bestimmte Krankheitszustände resistent zu sein, und über ihre Entwicklung von Krankheitszuständen aufgrund fehlenden PRO-Polypeptids charakterisiert werden.
Anti-PRO-Polypeptid-Antikörper
Die vorliegende Erfindung stellt weiters Anti-PRO-Polypeptid-Antikörper bereit. Beispiele für Antikörper umfassen polyklonale, monoklonale, humanisierte, bispezifische und heterokonjugierte Antikörper.
A. Polyklonale Antikörper
Die Anti-PRO-Polypeptid-Antikörper können polyklonale Antikörper umfassen. Verfahren zur Herstellung polyklonaler Antikörper sind Fachleuten bekannt. Polyklonale Antikörper können in einem Säugetier beispielsweise durch eine oder mehr Injektionen eines Immunisierungsmittels und, falls gewünscht, eines Adjuvans. Typischerweise wird das Immunisierungsmittel und/oder das Adjuvans durch mehrfache subkutane oder intraperitoneale Injektionen in das Säugetier injiziert. Das Immunisie rungsmittel kann das PRO-Polypeptid oder ein Fusionsprotein davon enthalten. Es kann nützlich sein, das Immunisierungsmittel an ein Protein zu konjugieren, von dem bekannt ist, dass es im zu immunisierenden Säugetier immunogen ist. Beispiele für solche immunogenen Proteine umfassen Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin, Serumalbumin, Rinder-Thyroglobulin und Sojabohnen-Trypsinhemmer, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Beispiele für Adjuvantia, die verwendet werden können, sind komplettes Freundsches Adjuvans und MPL-TDM-Adjuvans (Monophosphoryl-Lipid A, synthetisches Trehalosedicorynomycolat). Das Immunisierungsprotokoll kann von Fachleuten ohne übermäßiges Experimentieren ausgewählt werden.
B. Monoklonale Antikörper
Alternativ dazu können die Anti-PRO-Polypeptid-Antikörper monoklonale Antikörper sein. Monoklonale Antikörper können unter Verwendung von Hybridomverfahren, wie jenen, die von Kohler und Milstein, Nature 256, 495 (1975), beschrieben werden, hergestellt werden. In einem Hybridomverfahren wird eine Maus, ein Hamster oder ein anderes, geeignetes Wirtstier mit einem Immunisierungsmittel typischerweise immunisiert, um Lymphozyten hervorzurufen, die Antikörper produzieren oder produzieren können, die sich spezifisch an das Immunisierungsmittel binden. Alternativ dazu können die Lymphozyten in vitro immunisiert werden. –
Das Immunisierungsmittel umfasst typischerweise das PRO-Polypeptid von Interesse oder ein Fusionsprotein davon. Im Allgemeinen werden entweder Lymphozyten peripheren Bluts ("PBL" = peripheral blood lymphocytes) verwendet, wenn Zellen menschlichen Ursprungs erwünscht sind, oder es werden Milzzellen oder Lymphknotenzellen verwendet, wenn nichtmenschliche Säugetierquellen erwünscht sind. Die Lymphozyten werden anschließend mit einer sich unbegrenzt vermehrenden Zelllinie unter Verwendung eines geeigneten Fusionsmittels wie Polyethylenglykol fusioniert, um eine Hybridomzelle zu bilden [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, 59-103 (1986)]. Sich unbegrenzt vermehrende Zelllinien sind üblicherweise transformierte Säugetierzellen, insbesondere Myelomzellen von Nagetieren, Rindern oder Menschen. Üblicherweise werden Ratten- oder Maus-Myelomzelllinien verwendet. Die Hybridomzellen können in einem geeigneten Kulturmedium kultiviert werden, das vorzugsweise eine oder mehrere Substanzen enthält, die das Wachstum oder Überleben der nicht fusionierten, sich unbegrenzt vermehrenden Zellen hemmt. Fehlt beispielsweise den Ausgangszellen das Enzym Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyl-Transferase (HGPRT oder HPRT), umfasst das Kulturmedium für die Hybridomen typischerweise Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin ("HAT-Medium"), die das Wachstum von HGPRT-defizienten Zellen unterbindet.
Bevorzugte, sich unbegrenzt vermehrende Zelllinien sind jene, die sich wirksam fusionieren, die stabile, hohe Antikörper-Expression durch die ausgewählten Antikörperproduzierenden Zellen unterstützen und die gegenüber einem Medium wie das HAT-Medium empfindlich sind. Noch bevorzugtere, sich unbegrenzt vermehrende Zelllinien sind Maus-Myelomlinien, die beispielsweise vom Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Kalifornien, und von der Amercian Type Culture Collection, Rockville, Maryland, erhalten werden können. Menschliche Myelom- und Maus-Menschen-Heteromyelom-Zelllinien sind auch zur Herstellung menschlicher monoklonalen Antikörper beschrieben worden [Kozbor, J. Immunol. 133, 3001 (1984); Brodeuret al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, 51-63 (1987)].
Das Kulturmedium, in dem die Hybridomzellen kultiviert werden, können anschließend auf die Gegenwart von monoklonalen Antikörpern getestet werden, die gegen das PRO-Polypeptid von Interesse gerichtet sind. Vorzugsweise wird die Bindungsspezifität von monoklonalen Antikörpern, die durch die Hybridomzellen produziert werden, durch Immunfällung oder durch einen In-vitro-Bindungstest, wie Radioimmuntest (RIA) oder enyzmgekoppelte Immunadsorptionsbestimmung (ELISA), bestimmt. Solche Verfahren und Tests sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Die Bindungsaffinität des monoklonalen Antikörpers kann beispielsweise durch die Scat chard-Analyse von Munson und Pollard, Anal. Biochem. 107, 220 (1980), bestimmt werden.
Nachdem die erwünschten Hybridomzellen identifiziert wurden, können die Klone durch Grenzverdünnungsverfahren subkloniert und mittels Standardverfahren [Goding, s.o.] gezüchtet werden. Geeignete Kulturmedien für diesen Zweck umfassen beispielsweise Dulbecco's Modified Eagle's Medium und RPMI-1640-Medium. Alternativ dazu können die Hybridomzellen in vivo in einem Säugetier als Aszites gezüchtet werden.
Die monoklonalen, durch die Subklone sekretierten Antikörper können aus dem Kulturmedium oder der Aszites-Flüssigkeit durch herkömmliche Immunglobulin-Reinigungsverfahren, beispielsweise Protein-A-Sepharose, Hydroxylapatit-Chromatographie, Gelelektrophorese, Dialyse oder Affinitätschromatographie, isoliert oder gereinigt werden.
Die monoklonalen Antikörper können auch durch DNA-Rekombinationsverfahren, wie beispielsweise jenen, die im US-Patent Nr. 4.816.567 beschrieben wurden, hergestellt werden. Die für die monoklonalen Antikörper gemäß vorliegender Erfindung kodierende DNA kann unter Verwendung herkömmlicher Verfahren (z.B. unter Verwendung von Oligonucleotidsonden, die in der Lage sind, sich spezifisch an Gene zu binden, die für die Schwer- und Leichtketten von Maus-Antikörpern kodieren) einfach isoliert und sequenziert werden. Die Hybridomzellen der Erfindung dienen als eine bevorzugte Quelle für solche DNA. Wurde sie isoliert, kann die DNA in Expressionsvektoren platziert werden, die anschließend in Wirtszellen wie Affen-COS-Zellen, Chinahamster-Eierstock- (CHO-) Zellen oder Myelomzellen transfiziert werden, die anderenfalls kein Immunglobulinprotein produzieren, um die Synthese monoklonaler Antikörper in den rekombinanten Wirtszellen zu erreichen. Die DNA kann beispielsweise auch durch Substituieren der homologen Maus-Sequenzen durch die Codiersequenz von menschlichen konstanten Domänen der Schwer- und Leichtkette [US-Patent Nr. 4.816.567; Morrison et al., s.o.] oder durch kovalentes Binden der gesam ten Codiersequenz für ein Nicht-Immunglobulin-Polypeptid oder eines Teils davon an die Immunglobulin-Codiersequenz modifiziert werden. Solch ein Nicht-Immunglobulin-Polypeptid kann die konstanten Domänen eines Antikörpers der Erfindung oder die variablen Domänen einer Antigen-kombinierenden Stelle eines Antikörpers der Erfindung ersetzen, um einen chimären, zweiwertigen Antikörper zu bilden.
Die Antikörper können einwertige Antikörper sein. Verfahren zur Herstellung einwertiger Antikörper sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Ein Verfahren umfasst beispielsweise die rekombinante Expression von Immunglobulinleichtkette und modifizierter -schwerkette. Die Schwerkette ist im Allgemeinen an jeder Stelle in der Fc-Region trunkiert, sodass Schwerketten-Vernetzung unterbunden wird. Alternativ dazu werden die relevanten Cysteinreste durch einen anderen Aminosäurerest ersetzt, oder sie werden deletiert, um Vernetzung zu unterbinden.
In-vitro-Verfahren sind auch zur Herstellung einwertiger Antikörper geeignet. Verdau von Antikörpern, um Fragmente davon, besonders Fab-Fragmente, herzustellen, können mittels auf dem Gebiet der Erfindung bekannter Routine-Verfahren durchgeführt werden.
C. Humanisierte Antikörper
Die Anti-PRO-Polypeptid-Antikörper der Erfindung können weiters humanisierte Antikörper oder menschliche Antikörper umfassen. Humanisierte Formen nichtmenschlicher (z.B. Maus-) Antikörper sind chimäre Immunglobuline, Immunglobulinketten oder Fragmente davon (wie beispielsweise Fv, Fab, Fab', F(ab')₂ oder andere, Antigen-bindende Subsequenzen von Antikörpern), die eine Minimalsequenz enthalten, die von nichtmenschlichem Immunglobulin abgeleitet ist. Humanisierte Antikörper umfassen menschliche Immunglobuline (Rezipienten-Antikörper), in denen Reste einer komplementaritätsbestimmenden Region (CDR) des Rezipienten durch Reste von einer CDR einer nichtmenschlichen Spezies (Spender-Antikörper), wie einer Maus, einer Ratte oder eines Kaninchens, mit der enrwünschten Spezifität, Affinität und Kapazität ersetzt werden. Humanisierte Antikörper können auch Reste umfassen, die weder im Rezipienten-Antikörper noch in der importierten CDR oder den Gerüstsequenzen zu finden sind. Im Allgemeinen umfasst der humanisierte Antikörper im Wesentlichen die gesamte von zumindest einer, und typischerweise zwei, variablen Domäne(n), in denen alle oder im Wesentlichen alle der CDR-Regionen jenen eines nichtmenschlichen Immunglobulins entsprechen und alle oder im Wesentlichen alle der FR-Regionen jene einer menschlichen Immunglobulin-Consensus-Sequenz sind. Der humanisierte Antikörper umfasst im besten Fall auch zumindest einen Anteil einer konstanten Immunglobulinregion (Fc), typischerweise jenen eines menschlichen Immunglobulins [Jones et al., Nature 321, 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332, 323-329 (1988); und Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2, 593-596 (1992)].
Verfahren zur Humanisierung von nichtmenschlichen Antikörpern sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Im Allgemeinen weist ein humanisierter Antikörper einen oder mehrere Aminosäurereste auf, die in ihn aus einer Quelle eingeführt wurden, die nichtmenschlich ist. Diese nichtmenschlichen Aminosäurereste werden oft als "Import"-Reste bezeichnet, die typischerweise aus einer variablen "Import"-Domäne entnommen sind. Humanisierung kann im Wesentlichen nach dem Verfahren von Winter und Mitarbeitern [Jones et al., Nature 321, 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332, 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239, 1534-1536 (1988)] erfolgen, indem die entsprechenden Sequenzen eines menschlichen Antikörpers durch Nagetier-CDR oder -CDR-Sequenzen ersetzt werden. Demgemäß sind solche "humanisierten" Antikörper chimäre Antikörper (US-Patent Nr. 4.816.567), worin im Wesentlichen weniger als eine intakte menschliche variable Domäne durch die entsprechende Sequenz aus einer nichtmenschlichen Spezies substituiert wurde. In der praktischen Anwendung sind humanisierte Antikörper typischerweise menschliche Antikörper, in denen manche CDR-Reste und möglicherweise manche FR-Reste durch Reste analoger Stellen in Nagetier-Antikörper ersetzt sind.
Menschliche Antikörper können auch unter Verwendung verschiedener Verfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, umfassend Phagendisplay-Bibliotheken, hergestellt werden [Hoogenboom & Winter, J. Mol. Biol. 227, 381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581 (1991)]. Die Verfahren von Cole et al. und Boerner et al. sind zur Herstellung von menschlichen monoklonalen Antikörpern ebenso verfügbar [Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, 77 (1985), und Boerner et al., J. Immunol. 147(1), 86-95 (1991)].
D. Bispezifische Antikörper
Bispezifische Antikörper sind monoklonale, vorzugsweise menschliche oder humanisierte, Antikörper, die Bindungsspezifitäten für zumindest zwei verschiedene Antigene aufweisen. Im vorliegenden Fall betrifft eine der Bindungsspezifitäten das PRO-Polypeptid, die andere ein beliebiges anderes Antigen und vorzugsweise ein Zelloberflächen-Protein oder einen Rezeptor oder eine Rezeptoruntereinheit.
Verfahren zur Herstellung bispezifischer Antikörper sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Üblicherweise beruht die rekombinante Herstellung bispezifischer Antikörper auf der Co-Expression von zwei Immunglobulin-Leichtketten/Schwerketten-Paaren, worin die zwei Schwerketten unterschiedliche Spezifitäten aufweisen [Milstein & Cuello, Nature 305, 537-539 (1983)]. Aufgrund der zufälligen Auswahl von Immunglobulinschwer- und -leichtketten produzieren diese Hybridome (Quadrome) ein mögliches Gemisch aus zehn verschiedenen Antikörpermolekülen, von denen nur eines die korrekte bispezifische Struktur aufweist. Die Reinigung des korrekten Moleküls erfolgt üblicherweise über Verfahrensschritte der Affinitätschromatographie. Ähnliche Verfahren sind in der WO 93/08.829, veröffentlicht am 13. Mai 1993, und in Traunecker et al., EMBO J. 10, 3655-3659 (1991), offenbart.
Variable Antikörper-Domänen mit den erwünschten Bindungsspezifitäten (Antikörper-Antigen-Bindungsstellen) können an konstante Immunglobulinsequenzen fusioniert werden. Die Fusion erfolgt vorzugsweise mit einer konstanten Immunglo bulinschwerketten-Domäne, umfassend zumindest einen Teil der Gelenks-, CH2-und CH3-Region. Vorzugsweise enthält die erste konstante Schwerketten-Region (CH1) die notwendige Stelle für die Leichtketten-Bindung, die in zumindest einer der Fusionen vorhanden ist. DNA, die für die Immunglobulin-Leichtketten-Fusionen und, sofern erwünscht, die Immunglobulinleichtkette kodieren, werden in zwei getrennte Expressionsvektoren insertiert und in geeignete Wirtsorganismen co-transfiziert. Für nähere Details bezüglich der Herstellung bispezifischer Antikörper siehe beispielsweise Suresh et al., Methods in Enzymology 121, 210 (1986).
E. Heterokonjugierte Antikörper
Heterokonjugierte Antikörper liegen auch innerhalb des Schutzumfangs der vorliegenden Erfindung. Heterokonjugierte Antikörper setzen sich aus zwei kovalent gebundenen Antikörpern zusammen. Solche Antikörper wurden beispielsweise vorgeschlagen, um Immunsystemzellen auf nicht erwünschte Zellen zu richten [US-Patent Nr. 4.676.980], sowie zur Behandlung von HIV-Infektion [WO 91/00.360; WO 92/200.373; EP 03.089 ]. Es wird erwogen, dass die Antikörper in vitro unter Verwendung bekannter chemischer Verfahren für synthetische Proteine hergestellt werden, umfassend jene Verfahren, die Vernetzer einbinden. Beispielsweise können Immuntoxine unter Einsatz einer Disulfid-Austauschreaktion oder durch Bilden einer Thioetherbindung konstruiert werden. Beispiele für geeignete Reagenzien für diesen Zweck umfassen Iminothiolat und Methyl-4-mercaptobutyrimidat und jene, die beispielsweise im US-Patent Nr. 4.676.980 offenbart wurden.
Verwendungen für Anti-PRO-Polypeptid-Antikörper
Die Anti-PRO-Polypeptid-Antikörper der Erfindung sind auf verschiedene Weise nützlich. Beispielsweise können Anti-PRO-Polypeptid-Antikörper für diagnostische Tests für ein PRO-Polypeptid verwendet werden, z.B. zur Detektion seiner Expression in spezifischen Zellen, Geweben oder Serum. Verschiedene diagnostische Testverfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, können verwendet wer den, beispielsweise kompetitive Bindungstests, direkte oder indirekte Sandwich-Tests und Immunfällungstests, die entweder in heterogenen oder homogenen Phasen durchgeführt werden [Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., 147-158 (1987)]. Die in den diagnostischen Tests verwendeten Antikörper können mit einer nachweisbaren Gruppierung markiert werden. Die nachweisbare Gruppierung sollte in der Lage sein, entweder direkt oder indirekt ein nachweisbares Signal zu produzieren. Beispielsweise kann die nachweisbare Gruppierung ein Radioisotop, wie z.B. ³H, ¹ ⁴C, ³²P, ³⁵S oder¹²⁵I, eine fluoreszierende oder chemilumineszierende Verbindung, wie z.B. Fluoresceinisothiocyanat, Rhodamin oder Luciferin, oder ein Enzym, wie z.B. alkalische Phosphatase, Beta-Galactosidase oder Meerrettichperoxidase, sein. Jedes beliebige Verfahren, das auf dem Gebiet der Erfindung zur Konjugation des Antikörpers mit der nachweisbaren Gruppierung bekannt ist, kann eingesetzt werden, umfassend jene von Hunter et al., Nature 144, 945 (1962); David et al., Biochemistry 13, 1014 (1974); Pain et al., J. Immunol. Meth. 40, 219 (1981); und Nygren, J. Histochem. and Cytochem. 30, 407 (1982), beschriebenen Verfahren.
Anti-PRO-Polypeptid-Antikörper sind auch für die Affinitätsreinigung von PRO-Polypeptid aus rekombinanter Zellkultur oder natürlichen Quellen nützlich. In diesem Verfahren werden die Antikörper gegen das PRO-Polypeptid auf einem geeigneten Träger wie Sephadex-Harz oder Filterpapier unter Verwendung von Verfahren immobilisiert, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind. Der immobilisierte Antikörper wird dann mit einer Probe kontaktiert, die das zu reinigende PRO-Polypeptid enthält, und hiernach wird der Träger mit einem geeigneten Lösungsmittel gewaschen, das im Wesentlichen das gesamte Material in der Probe außer dem PRO-Polypeptid entfernt, das an den immobilisierten Antikörper gebunden ist. Schließlich wird der Träger mit einem anderen geeigneten Lösungsmittel gewaschen, das das PRO-Polypeptid vom Antikörper freisetzt.
Mit Krebs verbundene oder für Krebs spezifische Antigene ermöglichen das Bilden von Tumor- oder Krebs-spezifischen monoklonalen Antikörpern (mAb), die für solche Tumor-Antigene spezifisch sind. Solche mAb, die zwischen normalen und kanzerösen Zellen unterscheiden können, sind zur Diagnose, Prognose und Behandlung der Krankheit nützlich.
Für Krebs spezifische monoklonale Antikörper (mAb) sind für Tumor-Antigene spezifisch. Solche mAb, die zwischen normalen und kanzerösen Zellen unterscheiden können, sind zur Diagnose, Prognose und Behandlung der Krankheit nützlich. Bestimmte Antigene sind dafür bekannt, mit neoplastischen Krankheiten wie kolorektalem Krebs oder Brustkrebs in Verbindung zu stehen. Da Kolonkarzinome eine weit verbreitete Krankheit darstellen, sind Frühdiagnose und frühe Behandlung ein wichtiges medizinisches Ziel. Diagnose und Behandlung von Krebs können unter Verwendung monoklonaler Antikörper (mAb), die dafür spezifisch sind und fluoreszierende, kernmagnetische oder radioaktive Markierungen aufweisen, durchgeführt werden. Radioaktive Gene, Toxine und/oder Wirkstoff-markierte mAb können zur Insitu-Behandlung mit minimaler Patientbeschreibung verwendet werden.
Die folgenden Beispiele sind nur zur Veranschaulichung bereitgestellt und sollen in keiner Weise den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung einschränken.
Alle Patente und Literaturverweise, die in der vorliegenden Beschreibung zitiert werden, sind in ihrer Gesamtheit hierin durch Verweis aufgenommen.
BEISPIELE
Im Handel erhältliche Reagenzien, auf die in den Beispielen Bezug genommen wird, wurden, außer es wird anders angegeben, gemäß den Anweisungen der Hersteller verwendet. Die Quelle dieser in den folgenden Beispielen und in der gesamten Beschreibung durch die ATCC-Zugriffsnummern identifizierten Zellen ist die Amercian Type Culture Collection, Rockville, Maryland.
BEISPIEL 1: Homologie-Screenen der extrazellulären Domäne zur Identifikation neuer Polypeptide und dafür kodierender cDNA
Die extrazellulären Domänen- (ECD-) Sequenzen (umfassend die Sekretionssignalsequenz, sofern vorhanden) aus etwa 950 bekannten sekretierten Proteinen aus der öffentlichen Swiss-Prot-Datenbank wurden verwendet, um EST-Datenbanken zu durchsuchen. Die EST-Datenbanken umfassten öffentliche Datenbanken (z.B. Dayhoff, GenBank) und rechtlich geschützte Datenbanken (z.B. LIFESEQ^TM, Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA). Die Suche wurde unter Verwendung des Computerprogramms BLAST oder BLAST2 (Altschul & Gish, Methods in Enzymology 266, 460-480 (1996); http://blast.wustl/edu/blast/README.html) als ein Vergleich der ECD-Proteinsequenzen mit einer 6-Raster-Translation der EST-Sequenzen durchgeführt. Diese Vergleiche mit einem Blast-Score von 70 (oder in manchen Fällen 90) oder mehr, die nicht für bekannte Proteine kodierten, wurden gruppiert und zu Consensus-DNA-Sequenzen mit dem Programm "phrap" zusammengeset (Phil Green, University of Washington, Seattle, WA; http://bozeman.mbt.washington.edu/phrap.docs/phrap.html).
Unter Verwendung dieses Homologie-Screens extrazellulärer Domänen wurden Consensus-DNA-Sequenzen in Bezug auf die anderen, identifizierten EST-Sequenzen zusammengesetzt. Weiters wurden die erhaltenen Consensus-DNA Sequenzen oft (jedoch nicht immer) unter Verwendung wiederholter Durchläufe von BLAST und phrap verlängert, um die Consensus-Sequenz so weit wie möglich unter Verwendung der Quellen von zuvor erläuterten EST-Sequenzen zu verlängern.
Basierend auf den wie zuvor beschrieben erhaltenen Consensus-Sequenzen wurden anschließend Oligonucleotide synthetisiert und verwendet, um durch PCR eine cDNA-Bibliothek zu identifizieren, die die Sequenz von Interesse enthielt, und um als Sonden verwendet zu werden, um einen Klon der Codiersequenz voller Länge für ein PRO-Polypeptid zu isolieren. Vorwärts- (.f-) und Rückwärts- (.r-) PCR, Primer liegen im Allgemeinen im Bereich von 20 bis 30 Nucleotiden und sind oft dafür bestimmt, ein PCR-Produkt von einer Länge von etwa 100-1.000 bp zu bilden. Die Sonden- (.p-Sequenzen umfassen typischerweise eine Länge von 40-55 bp. In manchen Fällen werden zusätzliche Oligonucleotide dann synthetisiert, wenn die Consensus-Sequenz länger als etwa 1-1,5 kbp ist. Um mehrere Bibliotheken für ein Volllängen-Klon zu screenen, wurde DNA aus den Bibliotheken mittels PCR-Amplifikation, nach Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, mit dem PCR-Primerpaar gescreent. Eine positive Bibliothek wurde dann verwendet, um Klone, die für das Gen von Interesse kodieren, mittels des Sondenoligonucleotids und eines der Primerpaare zu isolieren.
Die cDNA-Bibliotheken, die verwendet wurden, um die cDNA-Klone zu isolieren, wurden mittels Standardverfahren unter Verwendung von im Handel erhältlichen Reagenzien, wie jenen von Invitrogen, San Diego, CA, konstruiert. Die cDNA wurde mit Oligo-dT, das eine Notl-Stelle enthielt, geprimt, über das stumpfe Ende mit mit Sall-Hemikinase verdauten Adaptoren verbunden, mit Notl gespalten, geeignet mittels Gel-Elektrophorese klassifiziert und in einer definierten Ausrichtung in einen geeigneten Kloniervektor (wie pRKB oder pRKD; pRK5B ist ein Vorläufer von pRK5D, der die Sfil-Stelle nicht enthält; siehe Holmes et al., Science 253, 1278-1280 (1991)) in die einzigartigen Xhol- und Notl-Stellen kloniert.
BEISPIEL 2: Isolierung von cDNA-Klonen, die für menschliches PRO224 kodieren
Eine Consensus-DNA-Sequenz assemblierte sich in Bezug auf die anderen identifizierten EST-Sequenzen wie in Beispiel 1 beschrieben, worin die Consensus-Sequenz hierin als DNA30845 bezeichnet wird. Basierend auf der DNA30845-Consensus-Sequenz wurden Oligonucleotide synthetisiert, um mittels PCR eine cDNA-Bibliothek zu identifizieren, die die Sequenz von Interesse enthielt, und zur Verwendung als Sonden, um einen Klon der Volllängen-Codiersequenz für PRO224 zu isolieren.
Ein Paar von (Vorwärts- und Rückwärts-) PCR-Primern wurde synthetisiert:
Vorwärts-PCR-Primer: 5'-AAGTTCCAGTGCCGCACCAGTGGC-3' (Seq.-ID Nr. 3)
Rückwärts-PCR-Primer: 5'-TTGGTTCCACAGCCGAGCTCGTCG-3' (Seq.-ID Nr. 4)
Weiters wurde eine synthetische Oligonucleotid-Hybridisierungssonde aus der Consensus-DNA30845-Sequenz konstruiert, die die folgende Nucleotidsequenz aufwies:
Hybridisierungssonde:

5'-GAGGAGGAGTGCAGGATTGAGCCATGTACCCAGAAAGGGCAATGCCCACC-3' (Seq.-ID Nr. 5)

Um mehrere Bibliotheken für eine Quelle eines Volllängen-Klons zu screenen, wurde DNA aus den Bibliotheken mittels PCR-Amplifikation mit dem PCR-Primerpaar, das zuvor identifiziert wurde, gescreent. Eine positive Bibliothek wurde dann verwendet, um Klone, die für das PRO224-Gen kodieren, unter Verwendung des Sonden-Oligonucleotids und eines der PCR-Primer zu isolieren.
RNA zur Konstruktion der cDNA-Bibliotheken wurde aus menschlichem Fötal-Lebergewebe isoliert. DNA-Sequenzieren der wie zuvor beschrieben isolierten Klone ergab die Volllängen-DNA-Sequenz für PRO224 [hierin bezeichnet als UNQ198 (DNA33221-1133)] und die abgeleitete Proteinsequenz für PRO224.
Die gesamte Nucleotidsequenz von UNQ198 (DNA33221-1133) ist in den 1 (Seq.-ID Nr. 1) dargestellt. Der Klon UNQ198 (DNA33221-1133) enthält einen einzelnen offenen Leseraster mit einer scheinbaren Translationsinitiationsstelle an den Nucleotidpositionen 96-98 und endet am Stoppcodon an den Nucleotidpositionen 942-944 (1, Seq.-ID Nr. 1). Der Start der Transmembranregion beginnt an Nucleotidposition 777. Der vorhergesagte Polypeptidvorläufer ist 282 Aminosäuren lang (2). Klon UNQ198 (DNA33221-1133) wurde bei der ATCC hinterlegt, und ihm wurde die ATCC-Zugriffsnummer ATCC 209263 zugeteilt.
Eine Analyse der Aminosäuresequenz des Volllängen-PRO224-Polypeptids lässt darauf schließen, dass es Homologie mit den Lipoproteinrezeptoren sehr geringer Dichte, Apolipoprotein-E-Rezeptor und Hühner-Oozyt-Rezeptoren P95 aufweist. Auf Grundlage einer BLAST- und FastA-Sequenzabgleichungs-Analyse der Volllängensequenz weist PRO224 Aminosäureidentität mit Abschnitten dieser Proteine im Bereich von 28 % bis 45 % und vollständige Identität mit diesen Proteinen im Bereich von 33 % bis 39 % auf.
BEISPIEL 3: Verwendung von für PRO-Polypeptid kodierender Nucleinsäure als Hybridisierungssonden
Das folgende Verfahren beschreibt die Verwendung einer Nucleotidsequenz, die für ein PRO-Polypeptid kodiert, als eine Hybridisierungssonde.
DNA, umfassend die Codiersequenz für ein PRO-Polypeptid von Interesse, das hierin offenbart ist, kann als eine Sonde verwendet werden oder als Grundlage verwendet werden, von der ausgehend Sonden hergestellt werden, um in menschlichen Gewebe-cDNA-Bibliotheken oder menschlichen genomischen Gewebebibliotheken auf homologe DNA (wie jene, die für natürlich vorkommende Varianten des PRO-Polypeptids kodieren) zu screenen.
Hybridisierung und Waschen von Filtern, die jede Bibliotheks-DNA enthalten, erfolgt unter den folgenden, hochstringenten Bedingungen. Hybridisierung einer radioaktiv markierten, von für das PRO-Polypeptid kodierender Nucleinsäure abgeleiteten Sonde an die Filter erfolgt in einer Lösung von 50 % Formamid, 5 × SSC, 0,1 SDS, 0,1 % Natriumpyrophosphat, 50 mM Natriumphosphat, pH 6,8, 2× Denhardts Lösung und 10 % Dextransulfat bei 42 °C 20 Stunden lang. Das Waschen der Filter erfolgt in einer wässrigen Lösung von 0,1× SSC und 0,1 % SDS bei 42 °C.
DNA mit einer erwünschten Sequenzidentität mit der DNA, die für das Volllängen-Nativsequenz-PRO-Polypeptid kodiert, können anschließend mittels Standardverfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, identifiziert werden.
BEISPIEL 4: Expression von PRO-Polypeptiden in E. coli
Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung einer nicht glykosylierten Form eines erwünschten PRO-Polypeptids durch rekombinante Expression in E. coli.
Die DNA-Sequenz, die für das erwünschte PRO-Polypeptid kodiert, wird anfänglich unter Verwendung ausgewählter PCR-Primer amplifiziert. Die Primer sollten Restriktionsenzymstellen enthalten, die den Restriktionsenzymstellen am ausgewählten Expressionsvektor entsprechen. Zahlreiche verschiedene Expressionsvektoren können verwendet werden. Ein Beispiel für einen geeigneten Vektor ist pBR322 (abgeleitet von E. coli; siehe Bolivar et al., Gene 2, 95 (1977)), der Gene zur Ampicillin- und Tetracyclin-Resistenz enthält. Der Vektor wird mit Restriktionsenzym verdaut und dephosphoryliert. Die PCR-amplifizierten Sequenzen werden anschließend in den Vektor ligiert. Der Vektor umfasst vorzugsweise Sequenzen, die für ein Antibiotikum-Resistenzgen kodieren, einen trp-Promotor, einen polyhis-Leader (umfassend die ersten sechs STII-Codons, polyhis-Sequenz und Enterokinase-Spaltungsstelle), die spezifische PRO-Polypeptid-Codierregion, Lambda-Transkriptionsterminator und ein argU-Gen.
Das Ligationsgemisch wird anschließend verwendet, um einen ausgewählten E.-coli-Stamm unter Verwendung der in Sambrook et al., s.o., beschriebenen Verfahren zu transformieren. Die Transformanten werden durch ihre Fähigkeit identifiziert, auf LB-Platten zu wachsen, und Antibiotikum-resistente Kolonien werden anschließend ausgewählt. Plasmid-DNA kann isoliert und durch Restriktionsanalyse und DNA-Sequenzieren bestätigt werden.
Ausgewählte Klone können über Nacht in flüssigem Kulturmedium wie LB-Nährlösung, ergänzt mit Antibiotika, gezüchtet werden. Die Übernacht-Kultur kann in weiterer Folge verwendet werden, um eine größere Kultur zu beimpfen. Die Zellen werden dann zu einer erwünschten optischen Dichte gezüchtet, währenddessen der Expressionspromotor angeschaltet wird.
Nach dem Kultivieren der Zellen über mehrere Stunden hinweg können die Zellen mittels Zentrifugation geerntet werden. Das durch die Zentrifugation erhaltene Zell-Pellet kann unter Verwendung verschiedener, auf dem Gebiet der Erfindung bekannter Mittel löslich gemacht werden, und das solubilisierte PRO-Polypeptid kann dann unter Verwendung einer Metallchelatbildungssäule unter Bedingungen gereinigt werden, die enges Binden des Proteins erlauben.
PRO 224 wurde in E. coli in einer poly-His-markierten Form unter Verwendung des folgenden Verfahrens erfolgreich exprimiert. Die für PRO 224 kodierende DNA wurde anfänglich unter Verwendung selektierter PCR-Primer amplifiziert. Die Primer enthielten Restriktionsenzymstellen, die den Restriktionsenzymstellen am ausgewählten Expressionsvektor entsprachen, und andere nützliche Sequenzen, die für effiziente und zuverlässige Translationsinitiation, rasche Reinigung an einer Metallchelatbildungssäule und proteolytische Entfernung mit Enterokinase sorgten. Die PCR-amplifizierten, poly-His-markierten Sequenzen wurden anschließend in einen Expressionsvektor ligiert, der verwendet wurde, um einen E.-coli-Wirt, basierend auf Stamm 52, (W3110 fuhA(tonA) lon galE rpoHts(htpRts) clpP(laclq)) zu transformieren. Die Transformanten wurden zuerst in LB mit 50 mg/ml Carbenicillin bei 30 °C unter Schütteln gezüchtet, bis eine O.D.600 von 3-5 erreicht war. Die Kulturen wurden 50- bis 100fach in CRAP-Medien (hergestellt durch Vermischen von 3,57 g (NHa)₂SO₄, 0,71 g Natriumcitrat₂H₂O, 1,07 g KCl, 5,36 g Difco-Hefeextrakt, 5,36 g Sheffield-Hycase SF in 500 ml Wasser sowie 110 mM MPOS, pH 7,3, 0,55 % (Gew./Vol.) Glucose und 7 mM MgSO₄) verdünnt und etwa 20-30 Stunden lang bei 30 °C unter Schütteln gezüchtet. Proben wurden entfernt, um Expression mittels SDS-PAGE-Analyse zu überprüfen, und der Großteil der Kultur wurde zentrifugiert, um die Zellen zu pelletieren. Zellpellets wurden bis zur Reinigung und Neufaltung eingefroren.
E.-coli-Paste aus 0,5- bis 1-1-Fermentationen (6-10 g Pellets) wurde in 10 Volumina (Gew./Vol.) in 7 M Guanidin, 20 mM Tris-Puffer, pH 8, resuspendiert. Festes Natriumsulfit und Natriumtetrathionat wurden zugesetzt, um die Endkonzentrationen von 0,1 M bzw. 0,02 M herzustellen, und die Lösung wurde über Nacht bei 4 °C gerührt. Dieser Verfahrensschritt resultierte in einem denaturierten Protein, in dem alle Cysteinreste durch Sulfitolisierung blockiert waren. Die Lösung wurde bei 40.000 Ulmin in einer Beckman Ultracentrifuge 30 Minuten lang zentrifugiert. Der Überstand wurde mit 3-5 Volumina Metallchelatsäulen-Puffer (6 M Guanidin, 20 mM Tris, pH 7,4) verdünnt und durch 0,22-μm-Filter filtriert, um ihn zu klären. Eventuell wurde der geklärte Extrakt auf eine 5-ml-Qiagen-Ni-NTA-Metallchelatsäule geladen, die im Metallchelatsäulenpuffer äquilibriert worden war. Die Säule wurde mit zusätzlichem Puffer, der 50 mM Imidazol (Calbiochem, Utrol-Gütegrad), pH 7,4, enthielt, gewaschen. Das Protein wurde mit 250 mM Imidazol enthaltendem Puffer eluiert. Fraktionen, die das erwünschte Protein enthielten, wurden gepoolt und bei 4 °C gelagert. Die Proteinkonzentration wurde durch seine Absorption bei 280 nm unter Verwendung des auf Grundlage seiner Aminosäuresequenz berechneten Extinktionskoeffizienten berechnet.
Die Proteine wurden durch langsames Verdünnen der Probe in frisch vorbereiteten, rückfaltenden Puffer aus 20 mM Tris, pH 8,6, 0,3 M NaCl, 2,5 M Harnstoff, 5 mM Cystein, 20 mM Glycin und 1 mM EDTA rückgefaltet. Die rückfaltenden Volumina wurden so gewählt, dass die endgültige Proteinkonzentration im Bereich zwischen 50 bis 100 μg/ml lag. Die Rückfaltungs-Lösung wurde bei 4 °C 12-36 Stunden lang leicht gerührt. Die Rückfaltungs-Reaktion wurde durch Zusatz von TFA auf eine Endkonzentration von 0,4 % (pH etwa 3) gequencht. Vor weiterer Reinigung des Proteins wurde die Lösung durch einen 0,22-μm-Filter filtriert, und Acetonitril wurde zugesetzt, sodass eine Endkonzentration von 2 bis 10 % erhalten wurde. Das rückgefaltete Protein wurde mittels Chromatographie auf einer reversen Poros-R1/H-Umkehr phasensäule unter Verwendung eines mobilen Puffers aus 0,1 % TFA unter Elution mit einem Gradienten aus Acetonitril von 10 bis 80 % untersucht. Aliquoten von Fraktionen mit A280-Extinktion wurden auf SDS-Polyacrylamidgelen analysiert, und Fraktionen, die homogene, rückgefaltete Proteine enthielten, wurden gepoolt. Im Allgemeinen werden die korrekt rückgefalteten Spezies der meisten Proteine bei geringsten Konzentrationen von Acetonitril verdünnt, da diese Spezies die kompaktesten sind, deren hydrophobes Innere von Wechselwirkungen mit dem Umkehrphasenharz geschützt ist. Aggregierte Spezies werden üblicherweise bei höheren Acetonitril-Konzentrationen eluiert. Zusätzlich zum erneuten Lösen fehlgefalteter Proteine von der erwünschten Form entfernt der Umkehrphasenschritt auch Endotoxin aus den Proben.
Fraktionen, die das erwünschte gefaltete Protein PRO224 enthalten, wurden gepoolt, und Acetonitril wurde unter Verwendung eines schwachen Stickstoffstroms, der auf die Lösung gerichtet war, entfernt. Proteine wurden in 20 mM Hepes, pH 6,8, mit 0,14 M Natriumchlorid und 4 % Mannit durch Dialyse oder Gelfiltration unter Verwendung von G25-Superfine-Harzen (Pharmacia), äquilibriert im Formulierungspuffer, formuliert und steril filtriert.
BEISPIEL 5: Expression von PRO-Polypeptiden in Säugetierzellen
Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung einer glykosylierten Form eines erwünschten PRO-Polypeptids durch rekombinante Expression in Säugetierzellen.
Der Vektor, pRK5 (siehe EP 307.247 , veröffentlicht am 15. März 1989), wird als Expressionsvektor verwendet. Gegebenenfalls ist die für PRO-Polypeptid kodierende DNA in pRK5 mit ausgewählten Restriktionsenzymen ligiert, um die Insertion der PRO-Polypeptid-DNA unter Verwendung von Ligationsverfahren, wie sie in Sambrook et al., s.o., beschrieben sind, zu ermöglichen. Der resultierende Vektor heißt pRK5-PRO-Polypeptid.
In einer Ausführungsform können die ausgewählten Wirtszellen 293-Zellen sein. Menschliche 293-Zellen (ATCC CCL 1573) werden bis zur Konfluenz in Gewebekulturplatten in einem Medium wie DMEM, ergänzt mit fötalem Rinderserum und gegebenenfalls Nährkomponenten und/oder Antibiotika, gezüchtet. Etwa 10 μg pRK5-PRO-Polypeptid-DNA werden mit etwa 1 μg DNA, die für das VA-RNA-Gen [Thimmappaya et al., Cell 31, 543 (1982)] kodiert, vermischt und in 500 μl von 1 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, 0,227 M CaCl₂ aufgelöst. Diesem Gemisch werden 500 μl von 50 mM HEPES (pH 7,35), 280 mM NaCl, 1,5 mM NaPO₄ zugetropft, und ein Präzipitat wird 10 Minuten lang bei 25 °C bilden gelassen. Das Präzipitat wird suspendiert und den 293-Zellen zugesetzt und wird etwa vier Stunden lang bei 37 °C sich absetzen gelassen. Das Kulturmedium wird abgesaugt, und 2 ml von 20%igem Glycerin in PBS werden 30 Sekunden lang zugesetzt. Die 293-Zellen werden anschließend mit Serum-freiem Medium gewaschen, frisches Medium wird zugesetzt, und die Zellen werden etwa 5 Tage lang inkubiert.
Etwa 24 Stunden nach den Transfektionen wird das Kulturmedium entfernt und durch Kulturmedium (alleine) oder Kulturmedium, das 200 μCi/ml ³⁵S-Cystein und 200 μCi/ml ³⁵S-Methionin enthält, ersetzt. Nach 12 Stunden Inkubation wird das konditionierte Medium gesammelt, auf einem Rotationsfilter konzentriert und auf ein 15%iges SDS-Gel geladen. Das verarbeitete Gel kann getrocknet und eine gewahlte Zeit lang einem Film ausgesetzt werden, um die Gegenwart von PRO-Polypeptid nachzuweisen. Die transfizierte Zellen enthaltenden Kulturen können weiteren Inkubationen (in Serum-freiem Medium) unterzogen werden, und das Medium wird im Rahmen ausgewählter Biotests getestet.
In einem alternativen Verfahren kann PRO-Polypeptid vorübergehend in 293-Zellen unter Verwendung des Dextransulfatverfahrens, wie es von Somparyrac et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 12, 7575 (1981), beschrieben ist, eingeführt werden. 293-Zellen werden bis zu maximaler Dichte in einem Rotationskolben gezüchtet, und 700 μg pRK5-PRO-Polypeptid-DNA werden zugesetzt. Die Zellen werden zuerst aus dem Rotationskolben durch Zentrifugation konzentriert und mit PBS gewaschen. Das DNA-Dextran-Präzipitat wird auf dem Zellpellet vier Stunden lang inkubiert. Die Zellen werden mit 20 % Glycerin 90 Sekunden lang behandelt, mit Gewebekulturmedium gewaschen und wieder in den Rotationskolben eingeführt, der Gewebekulturmedium, 5 μg/ml Rinderinsulin und 0,1 μg/ml Rindertransferrin enthält. Nach etwa vier Tagen wird das konditionierte Medium zentrifugiert und filtriert, um Zellen und Bruchstücke zu entfernen. Die Probe, die das exprimierte PRO-Polypeptid enthält, kann anschließend konzentriert und durch jegliches ausgewählte Verfahren wie Dialyse und/oder Säulenchromatographie gereinigt werden.
In einer anderen Ausführungsform können PRO-Polypeptide in CHO-Zellen exprimiert werden. Das pRK5-PRO-Polypeptid kann unter Verwendung bekannter Reagenzien wie CaPO₄ oder DEAE-Dextran in CHO-Zellen transfiziert werden. Wie zuvor beschrieben können die Zellkulturen inkubiert und das Medium durch Kulturmedium (alleine) oder Medium, das eine radioaktive Markierung wie ³⁵S-Methionin enthält, ersetzt werden. Nach Bestimmung der Gegenwart von PRO-Polypeptid kann das Kulturmedium mit Serum-freiem Medium ersetzt werden. Vorzugsweise werden Kulturen etwa 6 Tage lang inkubiert, und anschließend wird das konditionierte Medium geerntet. Das Medium, das das exprimierte PRO-Polypeptid enthält, kann dann konzentriert und durch jedes beliebige ausgewählte Verfahren gereinigt werden.
Epitop-markiertes PRO–Polypeptid -kann auch in Wirts-CHO–Zellen exprimiert werden. Das PRO-Polypeptid kann aus dem pRK5-Vektor subkloniert werden. Das Subklon-Insert kann PCR unterzogen werden, um im Raster mit einer ausgewählten Epitop-Markierung wie einer poly-his-Markierung in einen Baculovirus-Expressionsvektor zu fusionieren. Das poly-his-markierte PRO-Polypeptid-Insert kann anschließend in einen SV40-getriebenen Vektor, der einen Selektionsmarker wie DHFR zur Auswahl stabiler Klone enthält, subkloniert werden. Schließlich können die CHO-Zellen mit dem SV40-getriebenen Vektor (wie zuvor beschrieben) transfiziert werden. Das Markieren kann, wie zuvor beschrieben, erfolgen, um Expression zu überprüfen. Das Kulturmedium, das das exprimierte poly-His-markierte PRO-Polypeptid enthält, kann dann konzentriert und durch jegliches ausgewählte Verfahren, wie durch Ni²⁺-Chelat-Affinitätschromatographie, gereinigt werden.
PRO224 wurde in CHO-Zellen sowohl mittels eines vorübergehenden als auch eines permanenten Expressionsverfahren erfolgreich exprimiert.
Stabile Expression in CHO-Zellen wurde unter Einsatz der folgenden Verfahren durchgeführt. Die Proteine wurden als ein IgG-Konstrukt (Immunadhäsin) exprimiert, in dem die kodierenden Sequenzen für die löslichen Formen (z.B. extrazellulären Domänen) der entsprechenden Proteine an eine konstante Region der IgG1-. Sequenz, die die Gelenks-, CH2- und CH2-Domänen enthielt und/oder eine poly-Hismarkierte Form ist, fusioniert waren.
Nach der PCR-Amplifikation wurden die betreffenden DNA mittels Standardverfahren, wie sie in Ausubel et al., Current Protocols of Molecular Biology, Kapitel 3.16, John Wiley and Sons (1997), beschrieben sind, in einem CHO-Expressionsvektor subkloniert. CHO-Expressionsvektoren sind so konstruiert, dass sie kompatible Restriktionsstellen 5' und 3' von der DNA von Interesse aufweisen, die gutes Pendeln der cDNA ermöglichen. Der für die Expression in CHO-Zellen verwendete Vektor ist wie in Lucas et al., Nucl. Acids Res. 24(9), 1774-1779 (1996), beschrieben beschaffen und verwendet den frühen SV40-Promotor/Enhancer, um Expression der cDNA von Interesse und von Dihydrofolatreductase (DHFR) voranzutreiben. DHFR-Expression ermöglicht die Auswahl aufgrund stabiler Aufrechterhaltung des Plasmids nach der Transfektion.
12 μg der erwünschten Plasmid-DNA wurden in etwa 10 Millionen CHO-Zellen unter Verwendung von im Handel erhältlichen Reagenzien, Superfect* (Qiagen), Dosper* oder Fugene* (Boehringer Mannheim), eingeführt. Die Zellen wurden gezüchtet und in Lucas et al., s.o., beschrieben. Etwa 3 × 10^-7 Zellen wurden in einer Ampulle zum weiteren Züchten und Herstellung, wie nachstehend beschrieben wird, eingefroren.
Die die Plasmid-DNA enthaltenden Ampullen wurden durch Platzieren in ein Wasserbad aufgetaut und durch Wirbeln vermischt. Der Inhalt wurde in ein Zentrifugenröhrchen pipettiert, das 10 ml Medium enthielt, und wurde bei 1.000 U/min 5 Minuten lang zentrifugiert. Der Überstand wurde abgesaugt, und die Zellen wurden in 10 ml selektivem Medium (0,2-μm-filtriertes PS20 mit 5 % 0,2-μm-diafiltriertem, fötalem Rinderserum) resuspendiert. Die Zellen wurden anschließend in eine 100-ml-Zentrifuge, die 90 ml selektives Medium enthielt, aliquot aufgeteilt. Nach 1-2 Tagen wurden die Zellen in eine 250-ml-Zentrifuge, die mit 150 ml selektivem Wachstumsmedium gefüllt war, übertragen und bei 37 °C inkubiert. Nach weiteren 2-3 Tagen wurden eine 250-ml-, eine 500-ml- und eine 2.000-ml-Zentrifuge mit 3 × 10⁵ Zellen/ml beimpft. Das Zellmedium wurde gegen frisches Medium durch Zentrifugation und Resuspension im Produktionsmedium ausgetauscht. Obwohl jedes geeignete CHO-Medium verwendet werden kann, wurde ein im US-Patent Nr. 5.122.469, aus gegeben am 16. Juni 1992, beschriebenes Produktionsmedium tatsächlich verwendet. Eine 3-l-Produktionszentrifuge wird mit einer Konzentration von 1,2 × 10⁶ Zellen/ml beimpft. An Tag 0 wurde der Zellanzahl-pN bestimmt. An Tag 1 wurden der Zentrifuge Proben entnommen, und das Besprengen mit filtrierter Luft wurde begonnen. An Tag 2 wurden der Zentrifuge Proben entnommen, die Temperatur wurde auf 33 °C verändert, und 30 ml von 500g/l Glucose und 0,6 ml von 10 % Antischaummittel (z.B. 35 % Polydimethylsiloxan-Emulsion, Dow Corning 365 Medical Grade Emulsion) wurden zugesetzt.- Während der Produktion wurde der pH nach Bedarf eingestellt, um ihn auf etwa 7,2 zu halten. Nach 10 Tagen, oder nachdem die Lebensfähigkeit unter 70 % gefallen war, wurde die Zellkultur mittels Zentrifugation und Filtrieren durch ein 0,22-μm-Filter geerntet. Das Filtrat wurde entweder bei 4 °C gelagert oder sofort zur Reinigung auf Säulen geladen.
Für die poly-His-markierten Konstrukte wurden die Proteine unter Verwendung einer Ni-NTA-Säule (Qiagen) gereinigt. Vor der Reinigung wurde dem konditionierten Medium Imidazol bis zu einer Konzentration von 5 mM zugesetzt. Das konditionierte Medium wurde auf eine 6-ml-Ni-NTA-Säule, die in 20 mM Hepes-Puffer, pH 7,4, der 0,3 M NaCl und 5 mM Imidazol enthielt, äquilibriert wurde, mit einer Fließgeschwin digkeit von 4-5 ml/min bei 4 °C gepumpt. Nach dem Beladen wurde die Säule mit zusätzlichem Äquilibrierungspuffer gewaschen und das Protein mit Äquilibrierungspuffer, der 0,25 M Imidazol enthielt, eluiert. Das hochgereinigte Protein wurde danach in einen Lagerungspuffer, der 10 mM Hepes, 0,14 M NaCl und 4 % Mannit, pH 6,8, enthielt, mit einer 25-ml-G25-Superfine-Säule (Pharmacia) entsalzt und bei -80 °C gelagert.
Immunadhäsin-Konstrukte (Fc enthaltend) wurden von den konditioniertem Medien wie folgt gereinigt. Das konditionierte Medium wurde auf eine 5-ml-Protein-A-Säule (Pharmacia) gepumpt, die davor in 20 mM Na-Phosphat-Puffer, pH 6,8, äquilibriert worden war. Nach dem Laden wurde die Säule mit Äquilibrierungspuffer ausführlich gewaschen, bevor mit 100 mM Zitronensäure, pH 3,5, eluiert wurde. Das eluierte Protein wurde unverzüglich durch Sammeln von 1-ml-Fraktionen in Röhrchen, die 275 μl von 1 M Tris-Puffer, pH 9, enthielten, neutralisiert. Das hochgereinigte Protein wurde in weiterer Folge in Lagerungspuffer, wie zuvor für die poly-His-markierten Proteine beschrieben wurde, entsalzt. Die Homogenität wurde mittels SDS-Polyacrylamidgelen und durch Sequenzieren von N-terminalen Aminosäuren mittels Edman-Abbau bestimmt.
PRO224 wurde auch erfolgreich vorübergehend in COS-Zellen exprimiert.
BEISPIEL 6: Expression von PRO-Polypeptiden in Hefe
Das folgende Verfahren beschreibt rekombinante Expression eines erwünschten PRO-Polypeptids in Hefe.
Zuerst werden Hefe-Expressionsvektoren zur intrazellulären Produktion oder Sekretion von PRO-Polypeptiden aus dem ADH2/GAPDH-Promotor konstruiert. DNA, die für ein erwünschtes PRO-Polypeptid kodiert, ein ausgewähltes Signalpeptid und der Promotor werden in geeignete Restriktionsenzymstellen im ausgewählten Plasmid insertiert, um intrazelluläre Expression des PRO-Polypeptids zu steuern. Zur Sekre tion kann DNA, die für das PRO-Polypeptid kodiert, gemeinsam mit der DNA, die für den ADH2/GAPDH-Promotor kodiert, der Hefe-Alpha-Faktor-Sekretions-Signal/Leader-Sequenz und Linkersequenzen (sofern erforderlich) zur Expression des PRO-Polypeptids in das ausgewählte Plasmid kloniert werden.
Hefezellen, wie beispielsweise Hefestamm AB110, können anschließend mit den Expressionsplasmiden, die zuvor beschrieben wurden, transformiert und in ausgewählten Fermentationsmedien kultiviert werden. Die transformierten Hefe-Überstände können durch Ausfällen mit 10 % Trichloressigsäure und Trennung durch SDS-PAGE analysiert werden, gefolgt von Färben der Gele mit Coomassie-Blau.
Rekombinantes PRO-Polypeptid kann danach durch Entfernen der Hefezellen aus dem Fermentationsmedium durch Zentrifugieren und anschließendes Konzentrieren des Mediums unter Verwendung ausgewählter Filterpatronen isoliert und gereinigt werden. Das das PRO-Polypeptid enthaltende Konzentrat kann weiters unter Verwendung von Säulenchromatographieharzen gereinigt werden.
BEISPIEL 7: Expression von PRO-Polypeptiden in Baculovirus-infizierten Insektenzellen
Das folgende Verfahren beschreibt rekombinante Expression von PRO-Polypeptiden in Baculovirus-infizierten Insektenzellen.
Das erwünschte PRO-Polypeptid ist stromauf einer enthaltenen Epitop-Markierung mit einem Baculovirus-Expressionsvektor fusioniert. Solche Epitop-Markierungen umfassen poly-his-Markierungen und Immunglobulin-Markierungen (wie Fc-Regionen von IgG). Zahlreiche Plasmide können verwendet werden, umfassend Plasmide, die von im Handel erhältlichen Plasmiden wie pVL1393 (Novagen) abgeleitet sind. Kurz beschrieben wird das PRO-Polypeptid oder der erwünschte Abschnitt des PRO-Polypeptids (wie die Sequenz, die für die extrazelluläre Domäne ei nes transmembranen Proteins kodiert) mittels PCR mit Primern, die komplementär zu den 5'- und 3'-Regionen sind, amplifiziert. Der 5'-Primer kann flankierende (ausgewählte) Restriktionsenzymstellen inkorporieren. Das Produkt wird dann mit jenen ausgewählten Restriktionsenzymen verdaut und in den Expressionsvektor subkloniert.
Rekombinantes Baculovirus wird durch Co-Transfizieren des obigen Plasmids und BaculoGold^TM-Virus-DNA (Pharmingen) in Spodoptera-frugiperda- ("Sf9-") Zellen (ATCC CRL 1711) unter Verwendung von Lipofectin (im Handel bei GIBCO-BRL erhältlich) erzeugt. Nach 4-5 Tagen Inkubation bei 28 °C werden die freigesetzten Viren geerntet und zur weiteren Amplifikation verwendet. Virale Infektion und Proteinexpression werden wie von O'Reilley et al., Baculovirus expression vectors: A laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994), beschrieben durchgeführt.
Exprimiertes poly-his-markiertes PRO-Polypeptid kann anschließend, beispielsweise durch Ni²⁺-Chelat-Affinitätschromatographie, wie folgt gereinigt werden. Extrakte werden aus rekombinanten, virusinfizierten Sf9-Zellen, wie von Rupert et al., Nature 362, 175-179 (1993), beschrieben, hergestellt. Kurz zusammengefasst werden Sf9-Zellen gewaschen, in Beschallungspuffer (25 ml Hepes, pH 7,9; 12,5 mM MgCl₂; 0,1 mM EDTA; 10 % Glycerin; 0,1 % NP-40; 0,4 M KCI) resuspendiert und zweimal 20 Sekunden lang auf Eis beschallt. Die Beschallungsprodukte werden mittels Zentrifugation geklärt, und der Überstand wird 50fach in Beladungspuffer (50 mM Phosphat, 300 mM NaCl, 10 % Glycerin, pH 7,8) verdünnt und durch ein 0,45-μm-Filter filtriert. Eine Ni²⁺-NTA-Agarose-Säule (im Handel bei Qiagen erhältlich) wird mit einem Bettvolumen von 5 ml hergestellt, mit 25 ml Wasser gewaschen und anschließend mit 25 ml Beladungspuffer äquilibriert. Der filtrierte Zellextrakt wird mit einer Geschwindigkeit von 0,5 ml pro Minute auf die Säule geladen. Die Säule wird bis zur Basislinie A₂₈₀ mit Beladungspuffer gewaschen, sodann die Fraktionssammlung beginnt. Als Nächstes wird die Säule mit einem zweiten Waschpuffer (50 mM Phosphat; 300 mM NaCl, 10 % Glycerin, pH 6,0) gewaschen, der nicht-spezifisch gebundenes Protein eluiert. Nach neuerlichem Erreichen der A₂₈₀-Basislinie wird die Säule mit einem Imidazolgradienten von 0 bis 500 mM im zweiten Waschpuffer entwickelt. 1-ml-Fraktionen werden gesammelt und durch SDS-PAGE und Silberfärbung oder Western-Blotting mit an alkalische Phosphatase konjugiertem Ni²⁺-NTA (Qiagen) analysiert. Fraktionen, die eluiertes, His₁₀-markiertes PRO-Polypeptid enthalten, werden gepoolt und gegen Beladungspuffer dialysiert.
Alternativ dazu kann die Reinigung des IgG-markierten (oder Fc-markierten) PRO-Polypeptids unter Verwendung bekannter Chromatographieverfahren, umfassend beispielsweise Protein-A- oder Protein-G-Säulenchromatographie, durchgeführt werden.
PRO224 wurde erfolgreich in Baculovirus-infizierten Sf9- oder high5-Insektenzellen exprimiert. Während die Expression hierbei in einem Maßstab von 0,5-2 l erfolgte, kann sie leicht auf größere Ansätze (z.B. 8 l) gesteigert werden. Die Proteine wurden als ein IgG-Konstrukt (Immunadhäsin), in dem die extrazelluläre Proteinregion mit einer konstanten Region der IgG1-Sequenz, die Gelenks-, CH2- und CH3-Domänen enthält, fusioniert wurde, und/oder in poly-His-markierten exprimiert.
Nach der PCR-Amplifikation wurden die jeweiligen Codiersequenzen in einen Baculovirus-Expressionsvektor subkloniert (pb.PH.IgG für IgG-Fusionen und pb:PH.His.c für poly-His-markierte Proteine), und der Vektor und die Bacalogold^®-Baculovirus-DNA (Pharmingen) wurden in 105 Spodoptera-frugiperda- ("Sf9"-) Zellen (ATCC CRL 1711) unter Verwendung von Lipofectin (Gibco BRL) co-transfiziert. pb.PH.IgG und pb.PH.His sind Modifikationen vom im Handel erhältlichen Baculovirus-Expressionsvektor pVL1393 (Pharmigen) mit modifizierten Polylinker-Regionen, um die His- oder Fc-Markierungs-Sequenzen zu enthalten. Die Zellen wurden in Hinks TNM-FH-Medium, ergänzt mit 10 % FBS (Hyclone), gezüchtet. Die Zellen wurden 5 Tage lang bei 28 °C inkubiert. Der Überstand wurde geerntet und in weiterer Folge zur ersten viralen Amplifikation durch Infizieren von Sf9-Zellen in Hinks TNM-FH-Medium, ergänzt mit 10 % FBS, bei einer ungefähren Infektionsmultiplizität (MOI = multiplicity of infection) von 10 verwendet. Die Zellen wurden drei Tage lang bei 28 °C inkubiert. Der Überstand wurde geerntet, und die Expression der Konstrukte im Baculovirus-Expressionsvektor wurde durch Batch-Bindung von 1 ml Überstand an 25 ml Ni-NTA-Kügelchen (Qiagen) für Histidin-markierte Proteine oder Protein-A-Sepharose-CL-4B-Kügelchen (Pharmacia) für IgG-markierte Proteine bestimmt, wonach sie durch SDS-PAGE-Analyse mit einer bekannten Konzentration von Proteinstandard durch Coomassie-Blaufärbung verglichen wurde.
Der erste virale Amplifikationsüberstand wurde verwendet, um eine Schleuderkultur (500 ml) von Sf9-Zellen, die in ESF-921-Medium (Expression Systems LLC) bei einer ungefähren MOI von 0,1 gezüchtet wurden, zu infizieren. Die Zellen wurden 3 Tage lang bei 28 °C inkubiert. Der Überstand wurde geerntet und filtriert. Batch-Bindung und SDS-PAGE-Analyse wurden, sofern notwendig, wiederholt, bis die Expression der Schleuderkultur bestätigt war.
Das konditionierte Medium aus den transfizierten Zellen (0,5 bis 3 l) wurde durch Zentrifugation geerntet, um die Zellen zu entfernen, und wurde durch 0,22-μm-Filter filtriert. Für die poly-His-markierten Konstrukte wurde das Proteinkonstrukt unter Verwendung einer Ni-NTA-Säule (Qiagen) gereinigt. Vor der Reinigung wurde dem konditioniertem Medium Imidazol bis zu einer Konzentration von 5 mM zugesetzt. Die konditionierten Medien wurden auf eine 6-ml-Ni-NTA-Säule gepumpt, die in 20 mM Hepes–Puffer, pH- 7,4,-äquilibriert worden war, wobei der Puffer 0,3-M NaCl und 5 mM Imidazol bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 4-5 ml/min bei 4 °C enthielt. Nach dem Beladen wurde die Säule mit zusäztlichem Äquilibrationspuffer gewaschen, und das Protein wurde mit Äquilibrationspuffer, der 0,25 M Imidazol enthielt, eluiert. Das hochgereinigte Protein wurde in weiterer Folge in einen Speicherpuffer, der 10 mM Hepes, 0,14 M NaCl und 4 % Mannit, pH 6,8, enthielt, mit einer 25-ml-G25-Superfine-Säule (Pharmacia) entsalzt und bei -80 °C gelagert.
Immunadhäsin- (Fc-enthaltende) Proteinkonstrukte wurden aus den konditionierten Medien wie folgt gereinigt. Die vorbehandelten Medien wurden auf eine 5-ml-Protein-A-Säule (Pharmacia) gepumpt, die in 20 mM Na-Phosphat-Puffer, pH 6,8, äquilibriert worden war. Nach dem Beladen wurde die Säule ausführlich mit Äquilibrationspuffer gewaschen, bevor mit 100 mM Zitronensäure, pH 3,5, eluiert wurde. Das eluierte Protein wurde unverzüglich durch Sammeln von 1-ml-Fraktionen in Röhrchen, die 275 ml eines 1 M Tris-Puffers, pH 9, enthielten, neutralisiert. Das hoch gereinigte Protein wurde weiters in Speicherpuffer, wie zuvor für die poly-His-markierten Proteine beschrieben, entsalzt. Die Homogenität dieser Proteine wurde durch SDS-Polyacrylamidgel- (PEG-) Elektrophorese und N-terminales Aminosäuresequenzieren mittels Edman-Abbau überprüft.
BEISPIEL 8: Herstellung von Antikörpern die sich an PRO-Polypeptide binden
Dieses Beispiel illustriert die Herstellung von monoklonalen Antikörpern, die sich spezifisch an ein PRO-Polypeptid binden können.
Verfahren zur Herstellung der monoklonalen Antikörper sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und werden beispielsweise in Goding, s.o., beschrieben. Immunogene, die verwendet werden können, umfassen gereinigtes PRO-Polypeptid, Fusionsproteine, die das PRO-Polypeptid enthalten, und Zellen, die rekombinantes PRO-Polypeptid an der Zellobertläche exprimieren. Die Auswahl des Immungens kann von Fachleuten ohne übermäßiges Experimentieren erfolgen. Mäuse, wie beispielsweise Balb/c, werden mit dem PRO-Polypeptid-Immunogen, das in komplettem Freundschen Adjuvans emulgiert ist und subkutan oder intraperitoneal in einer Menge von 1-100 μg injiziert wird, immunisiert. Alternativ dazu wird das Immunogen in MPL-TDM-Adjuvans (Ribi Immunochemical Research, Hamilton, MT) emulgiert und in die Hinterpfoten des Tiers injiziert. Die immunisierten Mäuse werden dann 10 oder 12 Tage später mit zusätzlichem Immunogen, das im ausgewählten Adjuvans emulgiert wurde, geboostet. Hiernach können die Mäuse mehrere Wochen lang mit zusätzlichen Immunisierungsinjektionen geboostet werden. Serumproben können periodisch durch Blutabnahme hinter der Augenhöhle für Tests in Form von ELISA-Tests von den Mäusen erhalten werden, um Anti-PRO-Polypeptid-Antikörper nachzuweisen.
Nachdem ein geeigneter Antikörper-Titer nachgewiesen wurde, kann den Tieren, die in Bezug auf Antikörper "positiv" sind, eine letzte intravenöse Injektion von PRO-Polypeptid verabreicht werden. Drei oder vier Tage später werden die Mäuse getötet, und die Milzzellen werden geerntet. Die Milzzellen werden anschließend (unter Verwendung von 35 % Polyethylenglykol) mit einer ausgewählten Maus-Hybridpmzelllinie wie P3X63AgU.1 fusioniert, die aus ATCC, Nr. CRL 1597, erhältlich ist. Die Fusionen bilden Hybridomzellen, die anschließend in 96-Well-Gewebekulturplatten, die HAT- (Nypoxanthin, Aminopterin und Thymidin) Medium enthalten, ausplattiert werden, um Proliferation von nicht-fusionierten Zellen, Myelomhybriden und Milzzellhybriden zu hemmen.
Die Hybridomzellen werden in einem ELISA auf Reaktivität gegen das PRO-Polypeptid gescreent. Die Bestimmung von "positiven" Hybridomzellen, die die erwünschten monoklonalen Antikörper gegen das PRO-Polypeptid sekretieren, liegt auf dem Gebiet der Erfindung.
Die positiven Hybridomzellen können intraperitoneal in syngenetische Balb/c-Mäuse injiziert werden, um Aszites zu bilden, das die monoklonalen Anti-PRO-Polypeptid-Antikörper enthält. Alternativ dazu können die Hybridomzellen in Gewebekulturkolben oder -rollflaschen gezüchtet werden. Die Reinigung der monoklonalen Antikörper, die in den Aszites gebildet werden, kann mittels Ammoniumsulfatfällung, gefolgt von Gel-Ausschlusschromatographie, erfolgen. Alternativ dazu kann Affinitätschromatographie, basierend auf dem Binden von Antikörper an Protein A oder Protein G, verwendet werden.
BEISPIEL 9: Chimäre PRO-Polypeptide
PRO-Polypeptide können als chimäre Proteine exprimiert werden, wobei eine oder mehrere zusätzliche Polypeptiddomänen hinzugefügt werden, um Proteinreinigung zu erleichtern. Solche die Reinigung erleichternde Domänen umfassen, sind jedoch nicht limitiert auf, Metall-chelatierende Peptide wie Histidin-Tryptophan-Module, die Reinigung auf immobilisierten Metallen ermöglichen, Protein-A-Domänen, die Reinigung auf immobilisiertem Immunglobulin ermöglichen, und die Domäne, die im FLAGS^TM-Verlängerungs/Affinitätsreinigungssystem (Immunex Corp., Seattle, Wash.) verwendet wird. Die Einbindung einer spaltbaren Linkersequenz wie Factor XA oder Enterokinase (Invitrogen, San Diego, Kalifornien) zwischen der Reinigungsdomäne und der PRO-Polypeptidsequenz kann nützlich sein, um Expression von DNA, die für PRO-Polypeptid kodiert, zu erleichtern.
BEISPIEL 10: Reinigung von PRO-Polypeptiden unter Verwendung spezifischer Antikörper
Native oder rekombinante PRO-Polypeptide können mittels zahlreicher Standardverfahren, die auf dem Gebiet der Proteinreinigung zur Verfügung stehen, gereinigt werden. Beispielsweise wird Pro-PRO-Polypeptid, reifes PRO-Polypeptid oder Prä-PRO-Polypeptid durch Immunaffinitätschromatographie unter Verwendung von Antikörpern gereinigt, die spezifisch für das PRO-Polypeptid von Interesse sind. Im Allgemeinen wird eine Immunaffinitätssäule durch kovalentes Binden des Anti-PRO-Polypeptid-Antikörpers an ein aktiviertes Chromatographie-Harz konstruiert.
Polyklonale Immunglobuline werden aus Immunseren entweder durch Ausfällung mit Ammoniumsulfat oder durch Reinigung an immobilisiertem Protein A (Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, N.J.) hergestellt. Dem ähnlich werden monoklonale Antikörper aus Maus-Aszites-Flüssigkeit durch Ammoniumsulfatfällung oder Chromatographie auf immobilisiertem Protein A hergestellt. Teilweise gereinigtes Immunglobulin wird kovalent an ein Chromatographieharz wie CnBr-aktivierte SEPHAROSE^TM (Pharmacia LKB Biotechnology) gebunden. Der Antikörper wird an das Harz gebunden, das Harz wird blockiert, und das Derivat-Harz wird gemäß den Anleitungen der Hersteller gewaschen.
Solch eine Immunaffinitätssäule wird zur Reinigung von PRO-Polypeptid durch Herstellung einer Fraktion von Zellen, die PRO-Polypeptid in löslicher Form enthalten, verwendet. Dieses Präparat ist durch Solubilisierung der gesamten Zelle oder einer subzellulären Fraktion abgeleitet, die durch differentielle Zentrifugation durch den Zusatz von Detergens oder durch andere Verfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, erhalten werden. Alternativ dazu kann lösliches PRO-Polypeptid, das eine Signalsequenz enthält, in nützlicher Menge in das Medium, in dem die Zellen gezüchtet werden, sekretiert werden.
Ein lösliches, PRO-Polypeptid enthaltendes Präparat wird über die Immunaffinitätssäule geführt, und die Säule wird unter Bedingungen gewaschen, die die bevorzugte Absorption von PRO-Polypeptid (z.B. Puffer mit hoher lonenstärke in Gegenwart von Detergens) ermöglichen. Anschließend wird die Säule unter Bedingungen eluiert, die Antikörper/PRO-Polypeptid-Bindung stören (z.B. ein Puffer mit niedrigem pH wie etwa pH 2-3 oder eine hohe Konzentration eines Chaotrops wie Harnstoff oder Thiocyanat-Ion), und PRO-Polypeptid wird gesammelt.
BEISPIEL 11: Wirkstoff-Screenen
Diese Erfindung ist besonders nützlich zum Screenen von Verbindungen unter Verwendung von PRO-Polypeptiden oder Bindungsfragmenten davon in jedem beliebigen Wirkstoff-Screening-Verfahren. Das PRO-Polypeptid oder das Fragment, das in solchen Tests verwendet wird, kann entweder frei in Lösung, fixiert an einen festen Träger, auf einer Zelloberfläche getragen oder zwischen den Zellen angeordnet vorhanden sein. Ein Verfahren des Wirkstoff-Screenens verwendet eukaryotische oder prokaryotische Wirtszellen, die mit rekombinanten Nucleinsäuren, die das PRO-Polypeptid oder das Fragment exprimieren, stabil transformiert werden. Wirkstoffe werden gegen solche transformierten Zellen in kompetitiven Bindungstests gescreent. Solche Zellen, entweder in lebensfähiger oder in fixierter Form, können für Standard-Bindungstests verwendet werden. Es kann beispielsweise die Bildung von Komplexen zwischen PRO-Polypeptid oder einem Fragment und dem zu testenden Mittel gemessen werden. Alternativ dazu kann der Rückgang der Komplexbildung zwischen dem PRO-Polypeptid und seiner Targetzelle oder Targetrezeptoren, der durch das zu testende Mittel verursacht wird, untersucht werden.
So stellt die vorliegende Erfindung Screening-Verfahren für Wirkstoffe oder andere Mittel bereit, die eine mit PRO-Polypeptid verbundene Krankheit oder Störung beeinflussen können. Diese Verfahren umfassen das Kontaktieren eines solchen Mittels mit einem PRO-Polypeptid oder Fragment davon und das Testen (i) auf die Gegenwart eines Komplexes zwischen dem Mittel und dem PRO-Polypeptid oder Fragment oder (ii) auf die Gegenwart eines Komplexes zwischen dem PRO-Polypeptid oder Fragment und der Zelle durch Verfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind. In solchen kompetitiven Bindungstests wird das PRO-Polypeptid oder das Fragment typischerweise markiert. Nach geeigneter Inkubation wird freies PRO-Polypeptid oder Fragment von jenem getrennt, das in gebundener Form vorliegt, und die Menge an freier oder nicht komplexierter Markierung stellt ein Maß für die Fähigkeit des bestimmten Mittels dar, sich an PRO-Polypeptid zu binden oder den PRO Polypeptid/Zell-Komplex zu stören.
Ein anderes Verfahren zum Wirkstoff-Screenen stellt High-Throughput-Screening für Verbindungen bereit, die geeignete Bindungsaffinität zu einem Polypeptid aufweisen, und wird näher in der WO 84/03.564, veröffentlicht am 13. September 1984, beschrieben. Kurz zusammengefasst werden große Mengen unterschiedlicher kleiner Peptidtestverbindungen auf einem festen Träger wie Kunststoffstiften oder anderen Oberflächen synthetisiert. Bei der Anwendung auf ein PRO-Polypeptid werden die Peptidtestverbindungen mit PRO-Polypeptid umgesetzt und gewaschen. Gebundenes PRO-Polypeptid wird mittels Verfahren nachgewiesen, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind. Gereinigtes PRO-Polypeptid kann zur Verwendung in den zuvor genannten Wirkstoff-Screening-Verfahren auch direkt auf Platten aufgetragen werden. Darüber hinaus können nicht neutralisierende Antikörper verwendet werden, um das Peptid einzufangen und es auf dem festen Träger zu immobilisieren.
Die Erfindung erwägt auch die Verwendung von kompetitiven Wirkstoff-Screening-Tests, in denen neutralisierende Antikörper, die in der Lage sind, PRO-Polypeptid zu binden, spezifisch mit einer Testverbindung um das Binden an PRO-Polypeptid oder Fragmente davon konkurrieren. Auf diese Weise können die Antikörper verwendet werden, um die Gegenwart jedes beliebigen Peptids nachzuweisen, das eine oder mehrere antigene Determinanten mit PRO-Polypeptid gemeinsam hat.
BEISPIEL 12: Rationales Wirkstoffdesign
Ziel des rationalen Wirkstoffdesigns ist, strukturelle Analoga von biologisch aktivem Polypeptid von Interesse (d.h. einem PRO-Polypeptid) oder von kleinen Molekülen herzustellen, mit denen sie wechselwirken, z.B. Agonisten, Antagonisten oder Inhibitoren. Jedes dieser Beispiele kann verwendet werden, um Wirkstoffe zu gestalten, die aktivere oder stabilere Formen des PRO-Polypeptids darstellen oder die die Funktion des PRO-Polypeptids in vivo fördern oder stören (vgl. Hodgson, Bio/Technology 9, 19-21 (1991)).
In einem Ansatz wird die dreidimensionale Struktur des PRO-Polypeptids oder eines PRO-Polypeptid-Inhibitor-Komplexes durch Röntgenkristallographie, durch Computer-Modellieren oder, am häufigsten, durch eine Kombination dieser zwei Ansätze bestimmt. Sowohl die Form als auch die Ladungen des PRO-Polypeptids müssen ermittelt werden, um die Struktur zu erklären und aktive Stelle(n) des Moleküls zu bestimmen. Weniger häufig können nützliche Informationen hinsichtlich der Struktur des PRO-Polypeptids durch Modellieren auf Grundlage der Struktur homologer Proteine gewonnen werden. In beiden Fällen wird relevante strukturelle Information verwendet, um analoge PRO-Polypeptid-ähnliche Moleküle zu entwerfen oder wirksame Inhibitoren zu identifizieren. Nützliche Beispiele rationalen Wirkstoffdesigns können Moleküle umfassen, die Aktivität oder Stabilität verbesserten, wie von Braxton & Wells, Biochemistry 31, 7796-7801 (1992), gezeigt wurde, oder die als Inhibitoren; Agonisten oder Antagonisten nativer Peptide wirken, wie von Athauda et al., J. Biochem. 113, 742-746 (1993), gezeigt wurde.
Auch ist es möglich, einen Ziel-spezifischen Antikörper zu isolieren, der durch funktionelle Tests wie zuvor beschrieben ausgewählt wird, und anschließend seine Kristallstruktur zu lösen. Dieser Ansatz erbringt prinzipiell ein Pharmakon, auf das weitere Wirkstoffdesigns aufbauen können. Es ist möglich, Proteinkristallographie durch das Bilden von anti-idiotypischen Antikörpern (anti-id) gegen einen funktionellen, pharmakologisch aktiven Antikörper gänzlich zu umgehen. Als Spiegelbild eines Spiegelbildes würde von der Bindungsstelle der anti-id erwartet werden, dass sie ein Analogon des originalen Rezeptors ist. Der anti-id könnte verwendet werden, um Peptide aus Banken chemisch oder biologisch hergestellter Peptide zu identifizieren und isolieren. Die isolierten Peptide würden dann als das Pharmakon wirken.
Aufgrund der vorliegenden Erfindung können ausreichende Mengen des PRO-Polypeptids erhältlich gemacht werden, um solche analytischen Studien wie Röntgenkristallographie durchzuführen. Darüber hinaus dient das hierin bereitgestellte Wissen über die PRO-Polypeptid-Aminosäuresequenz als Anhaltspunkt für jene, die Computer-Modellierungsverfahren anstelle von oder zusätzlich zu Röntgenkristallographie einsetzen.
BEISPIEL 13: Verwendung von PRO224 zum Screenen von Verbindungen
PRO224 wird in einer Zelle exprimiert, von der die Membranproteine entfernt wurden und die in der Lage ist, PRO224 zu exprimieren. Lipoproteine geringer Dichte mit einer detektierbaren Markierung werden den Zellen zugesetzt und ausreichend lang zur Endozytose inkubiert. Die Zellen werden gewaschen. Die Zellen werden anschließend auf Markierung analysiert, die an die Membran und nach der Zelllyse innerhalb der Zelle gebunden ist. Das Nachweisen der Lipoproteine geringer Dichte innerhalb der Zelle legt fest, dass PRO224 der Familie von Rezeptorproteinen für Lipoproteine geringer Dichte angehört. Mitglieder, die innerhalb dieser Familie gefunden wurden, werden anschließend zum Screenen von Verbindungen verwendet, die diese Rezeptoren, und insbesondere die Aufnahme von Cholesterin über diese Rezeptoren, beeinflussen.
BEISPIEL 14: Fähigkeit von PRO-Polypeptiden, durch vaskulären Endothelwachstumsfaktor (VEGF) stimulierte Vermehrung von Endothelzellen zu hemmen
Die Fähigkeit verschiedener PRO-Polypeptide, VEGF-stimulierte Vermehrung von Endothelzellen zu hemmen, wurde getestet. Insbesondere wurden Rinder-Nebennierenrinden-Kapillarendothel- (ACE-) Zellen (aus Primärkultur, maximal 12-14 Passagen) auf 96-Well-Mikrotiterplatten (Amersham Life Science) bei einer Dichte von 500 ZellenM/Well pro 100 μl in DMEM mit niedrigem Glucose-Gehalt, 10 % Kälberserum, 2 mM Glutamin, 1 × Pen/Strep und Fungizone, ergänzt mit 3 ng/ml VEGF, ausplattiert. Kontrollen wurden auf dieselbe Weise ausplattiert, enthielten jedoch keinen VEGF. Eine Testprobe des PRO-Polypeptids von Interesse wurde in ein 100-μl-Volumen zu einem Endvolumen von 200 μl zugesetzt. Die Zellen wurden 6-7 Tage lang bei 37 °C inkubiert. Das Medium wurde abgesaugt, und die Zellen wurden 1 × mit PBS gewaschen. Einsaures Phosphatase-Reaktionsgemisch (100 μl, 0,1 M Natriumacetat, pH 5,5, 0,1 % Triton-100, 100 mM p-Nitrophenylphosphat) wurde zugesetzt. Nach 2-stündiger Inkubation bei 37 °C wurde die Reaktion durch Zusatz von 10 μl 1 N NaOH gestoppt. OD wurde auf einem Mikrotiterplattenleser bei 405 nm gemessen. Kontrollen waren keine Zellen, Zellen alleine, Zellen + FGF (5 ng/ml), Zellen + VEGF (3 ng/ml), Zellen + VEGF (3 ng(ml) + TGF-β (1 ng/ml) und Zellen + VEGF (3 ng/ml) + LIF 5 ng/ml). (TGF-β bei einer Konzentration von 1 ng/ml ist bekannt dafür, 70-90 % von VEGF-stimulierter Zellvermehrung zu blockieren.) Die Ergebnisse wurden durch Berechnen der prozentuellen Inhibition von VEGF(3 ng/ml) stimulierten Zellenvermehrung, bestimmt durch Messen von sauren Phos phatase-Aktivität bei OD 405 nm, (1) in Bezug auf Zellen ohne Stimulation und (2) in Bezug auf die Referenz-TGF-β-Inhibition von VEGF-stimulierter Aktivität bewertet. Die Resultate weisen wie in Tabelle 2 nachstehend gezeigt auf die Nützlichkeit der PRO-Polypeptide im Rahmen der Krebstherapie und spezifisch zum Hemmen von Tumor-Angiogenese hin. Die in Tabelle 2 gezeigten Zahlenwerte (relative Inhibition) werden durch Berechnen der prozentuellen Hemmung von VEGF-stimulierter Vermehrung durch das PRO-Polypeptid in Bezug auf die Zellen ohne Stimulierung und anschließendes Dividieren dieses Prozentsatzes in Prozent Hemmung, die durch TGF-β bei 1 ngl/ml erhalten wird, das dafür bekannt ist, 70-90 % von VEGF- stimulierter Zellvermehrung zu blockieren, bestimmt.
Tabelle 2
BEISPIEL 15: Durch PRO224 induzierte Steigerung von Herz-Neonatal-Hypertrophie
Dieser Test zielt darauf ab, die Fähigkeit von PRO224-Polypeptiden zu messen, Hypertrophie von neonatalen Herzen zu stimulieren.
Es wurden Herzmuskelzellen von 1 Tag alten Harlan-Sprague-Dawley-Ratten entnommen. Zellen (180 μl bei 7,5 × 10⁴/ml, Serum <0,1 %, frisch isoliert) werden an Tag 1 96-Well-Platten zugesetzt, die davor mit DMEM/F12 + 4 % FCS beschichtet wurden. Testproben, die nur das Test-PRO224-Polypeptid oder Wachstumsmedium (negative Kontrolle) (20 μl/Well) enthielten, wurden den Wells direkt an Tag 1 zugesetzt. PGF (20 μl/Well) wurde anschließend an Tag 2 bei einer Endkonzentration von 10^-6 M zugesetzt. Die Zellen wurden dann an Tag 4 gefärbt und an Tag 5 nach visuellen Kriterien beurteilt, worin Zellen ohne Größenwachstum im Vergleich zu negativen Kontrollen mit 0,0, Zellen mit einem geringen bis moderaten Wachstum im Vergleich zu negativen Kontrollen mit 1,0 und Zellen mit einem großen Wachstum im Vergleich mit negativen Kontrollen mit 2,0 bewertet wurden. Diese Resultate sind nachstehend in Tabelle 9 gezeigt.
Tabelle 9
BEISPIEL 16: In-situ-Hybridisierung
In-situ-Hybridisierung ist ein leistungsfähiges und vielfältiges Verfahren zur Detektion und Lokalisierung von Nucleinsäuresequenzen innerhalb von Zell- oder Gewebepräparaten. Es kann beispielsweise nützlich sein, um Stellen von Genexpression zu identifizieren, die Gewebeverteilung von Transkription zu analysieren, virale Infektion zu identifizieren und lokalisieren, Veränderungen in spezifischer mRNA-Synthese zu beobachten und um Chromosom-Kartierung zu unterstützen.
In-situ-Hybridisierung wurde gemäß einer optimierten Version des Protokolls von Lu & Gillett, Cell Vision 1, 169-176 (1994), unter Verwendung von PCR-gebildeten, ³³Pmarkierten Ribosonden durchgeführt. Kurz zusammengefasst wurden in Formalin fixierte, in Paraffin eingebettete, menschliche Gewebe unterteilt, entparaffiniert, in Proteinase K (20 g/ml) 15 Minuten lang bei 37 °C deproteinisiert und zur In-situ-Hybridisierung, wie in Lu & Gillett, s.o., beschrieben, weiter bearbeitet. Eine [³³-P]-UTP-markierte Antisense-Ribosonde wurde aus einem PCR-Produkt gebildet und bei 55 °C über Nacht hybridisiert. Die Objektträger wurden in Kodak-NTB2-Kernspuremulsion getaucht und 4 Wochen lang exponiert.
³³P-RNA-Hybridisierungssonden-Synthese
6,0 μl (125 mCi) von 33P-UTP (Amersham BF 1002, SA<2000 Ci/mmol) wurden schnell-vakuumgetrocknet. Jedem Röhrchen, das getrocknetes ³³P-UTP enthielt, wurden die folgenden Bestandteile zugesetzt:
2,0 μl 5× Transkriptionspuffer
1,0 μl DTT (100 mM)
2,0 μl NTP-Gemisch (2,5 mM : 10 μ; jeweils von 10 mM GTP, CTP & ATP + 10 μl H₂O)
1,0 μl UTP (50 μM)
1,0 μl Rnasin
1,0 μl DNA-Matrize (1 μg)
1,0 μl H₂O
1,0 μl RNA-Polymerase (für PCR-Produkte T3 = AS, T7 = S, üblicherweise)
Die Röhrchen wurden bei 37 °C eine Stunde lang inkubiert. 1,0 μl RQ1-DNase wurden zugesetzt, worauf Inkubation bei 37 °C 15 Minuten lang folgte 90 μl TE-(10 mM Tris, pH 7,6/1 mM EDTA, pH 8,0) wurden zugesetzt, und das Gemisch wurde auf DE81-Papier pipettiert. Die verbleibende Lösung wurde in eine Microcon-50-Ultrafiltrationseinheit geladen und unter Verwendung von Programm 10 (6 Minuten) geschleudert. Die Filtrationseinheit wurde über einem zweiten Röhrchen umgedreht und unter Verwendung von Programm 2 (3 Minuten) geschleudert. Nach dem abschließenden Schleudern zur Gewinnung wurden 100 μl TE zugesetzt. 1 μl des Endprodukts wurde auf DE81-Papier pipettiert und in 6 ml Biofluor II gezählt.
Die Sonde wurde auf TBE/Harnstoff-Gel laufen gelassen. 1-3 μl der Sonde oder 5 μl von RNA Mrk III wurden zu 3 μl Beladungspuffer zugesetzt. Nach dreiminütigem Erhitzen auf einem 95-°C-Heizblock wurde das Gel sofort auf Eis gegeben. Die Gel-Wells wurden gespült, die Probe geladen und bei 180-250 Volt 45 Minuten lang laufen gelassen. Das Gel wurde mit Saran-Hülle umhüllt und einem XAR-Film mit einer Verstärkerfolie in einem -70-°C-Tiefkühler für eine Dauer von einer Stunde bis über Nacht ausgesetzt.
³³P-Hybridisierung
A. Vorbehandlung gefrorener Schnitte
Die Objektträger wurden aus dem Tiefkühler entfernt, in Aluminiumschalen gegeben und bei Raumtemperatur 5 Minuten lang aufgetaut. Die Schafen wurden fünf Minuten lang in einen 55-°C-Inkubator gegeben, um Kondensation zu reduzieren. Die Objektträger wurden 10 Minuten lang in 4%igem Paraformaldehyd auf Eis im Abzug fixiert und in 0,5 × SSC 5 Minuten lang bei Raumtemperatur gewaschen (25 ml 20 × SSC + 975 ml SQ H₂O). Nach zehnminütiger Deproteinisierung in 0,5 μg/ml Proteinase K bei 37 °C (12,5 μl von 10 mg/ml Stammlösung in 250 ml vorgewärmtem, RNase-freiem RNase-Puffer) wurden die Schnitte in 0,5 × SSC 10 Minuten lang bei Raumtemperatur gewaschen. Die Schnitte wurden in 70 %, 95 %, 100 % Ethanol, 2 Minuten jeweils, dehydriert.
B. Vorbehandlung von in Paraffin eingebetteten Schnitten
Die Schnitte wurden entparaffiniert, in SQ H₂O gegeben und zweimal mit 2 × SSC bei Raumtemperatur, jeweils 5 Minuten lang, gewaschen. Die Schnitte wurden in 20 μg/ml Proteinase K (500 μl von 10 mg/ml in 250 ml RNase-freiem RNase-Puffer; 37 °C, 15 Minuten) – menschlicher Embryo, oder in 8 × Proteinase K (100 μl in 250 ml RNase-Puffer, 37 °C, 30 Minuten) – Formalingewebe, deproteinisiert. Darauffolgendes Spülen in 0,5 × SSC und Dehydrierung erfolgten wie zuvor beschrieben.
C. Prähybridisierung
Die Schnitte wurden in einem Kunststoffbehälter, der mit Box-Puffer- (4 × SSC, 50 Formamid) gesättigtem Filterpapier ausgekleidet war, ausgelegt. Das Gewebe wurde mit 50 μl Hybridisierungspuffer (3,75 g Dextransulfat + 6 ml SQ H₂O) bedeckt, gewirbelt und in der Mikrowelle 2 Minuten lang mit gelockertem Deckel erhitzt. Nachdem es auf Eis abgekühlt worden war, wurden 18,75 ml Formamid, 3,75 ml 20 × SSC und 9 ml SQ H₂O zugesetzt, das Gewebe wurde gut gewirbelt und bei 42 °C 1-4 Stunden lang inkubiert.
D. Hybridisierung
1,0 × 10⁶ cpm Sonde und 1,0 μl tRNA (50 mg/ml Stammlösung) pro Objektträger wurden 3 Minuten lang bei 95 °C erhitzt. Die Objektträger wurden auf Eis gekühlt, und 48 μl Hybridisierungspuffer wurden pro Objektträger zugesetzt. Nach dem Wirbeln wurden 50 μl ³³P-Mischung der 50 μl Prähybridisierung auf dem Objektträger zugesetzt. Die Objektträger wurden über Nacht bei 55 °C inkubiert.
E. Waschschritte
Das Waschen-erfolgte 2 × 10 Minuten lang mit 2xSSC, EDTA bei Raumtemperatur (400 ml 20 × SSC + 16 ml 0,25 M EDTA, V_f = 4 l), gefolgt von RNaseA-Behandlung bei 37 °C 30 Minuten lang (500 μl von 10 mg/ml in 250 ml RNase-Puffer = 20 μg/ml). Die Objektträger wurden 2 × 10 Minuten mit 2 × SSC, EDTA bei Raumtemperatur gewaschen. Die Stringezn der Waschbedingungen lauteten wie folgt: 2 Stunden bei 55 °C, 0,1 × SSC, EDTA (20 ml 20 × SSC + 16 ml EDTA, V_f = 4 l).
F. Oligonucleotide
In-situ-Analyse wurde an zahlreichen hierin offenbarten DNA-Sequenzen durchgeführt. Die für diese Analyse verwendeten Oligonucleotide waren wie folgt beschaffen:
DNA33221-1133 (PRO224)

p1 5'-GGATTCTAATACGACTCACTATAGGGCGCAGCGATGGCAGCGATGAGG-3' (Seq.-ID Nr. 6)
p2 5'-CTATGAAATTAACCCTCACTAAAGGGACAGACGGGGCAGAGGGAGTG-3' (Seq.-ID Nr. 7)

G. Resultate
In-situ-Analyse wurde an zahlreichen hierin offenbarten DNA-Sequenzen durchgeführt. Die Resultate aus diesen Analysen sind nachstehend beschrieben.
DNA33221-1133 (PRO224)
Expression war auf vaskuläres Endothel in fötaler Milz, erwachsener Milz, fötaler Leber, erwachsener Schilddrüse und erwachsenen Lymphknoten (Schimpanse) limitiert. Eine zusätzliche Expressionsstelle stellen die sich entwickelnden Spinalganglien dar. Alle anderen Gewebe wiesen negative Resultate auf.
Untersuchte menschliche Fötalgewebe (E12-E16-Wochen) umfassen:
Plazenta, Nabelschnur, Leber, Niere, Nebennieren, Schilddrüse, Lungen, Herz, große Blutgefäße, Speiseröhre, Magen, Dünndarm, Milz; Thymus, Bauchspeicheldrüse, Gehirn, Auge, Rückenmark, Körperwand, Becken und untere Extremität.
Untersuchte menschliches Erwachsenen-Gewebe:
Niere (normal und Endstadium), Nebenniere, Herzmuskel, Aorta, Milz, Lymphknoten, Bauchspeicheldrüse, Lunge, Haut, Auge (inkl. Netzhaut), Blase, Leber (normal, zirrhotisch, akutes Versagen).
Untersuchte nichtmenschliche Gewebe:
Schimpansen-Gewebe:
Speicheldrüse, Magen, Schilddrüse, Nebenschilddrüse, Haut, Thymus, Eierstock, Lymphknoten.
Rhesusaffen-Gewebe:
Großhirnrinde, Hippocampus, Kleinhirn, Penis.
Hinterlegung von Material
Das folgende Material wurde bei der American Type Culture Collection, 12301 Park-lawn Drive, Rockville, MD, USA (ATCC), hinterlegt:
Diese Hinterlegung erfolgte gemäß den Bestimmungen des Budapester Vertrags über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren und die darin enthaltenen Regelungen (Vertrag von Budapest). Dies stellt die Erhaltung von lebensfähigen Kulturen der Hinterlegung 30 Jahre lang nach der Hinterlegung sicher. Die Hinterlegungen werden durch ATCC unter den Bestimmungen des Vertrags von Budapest zugänglich gemacht und unterliegen einem Abkommen zwischen Genentech, Inc., und ATCC, das permanente und uneingeschränkte öffentliche Verfügbarkeit der Nachkommenschaft der Kultur der Hinterlegung für die Öffentlichkeit bei Erteilung des gemäßen US-Patents oder bei Offenlegung jeglicher US- oder ausländischen Patentanmeldung sicherstellt, welche auch immer zuerst vorliegt, und das die Verfügbarkeit der Nachkommenschaft für jemanden sicherstellt, der vom US-Commissioner of Patents and Trademarks bestimmt wird, gemäß 35 USC § 122 und den demgemäßen Bestimmungen des Commissioners (umfassend 37 CFR § 1.14, unter besonderem Verweis auf 886 OG 638) dazu befugt zu sein.
Der Zessionar der vorliegenden Anmeldung hat sich bereit erklärt, die Materialien unverzüglich nach Kenntnisnahme durch eine andere oder dieselbe Kultur zu ersetzen, sofern eine Kultur der hinterlegten Materialien sterben, verloren gehen oder zerstört werden sollte, obwohl sie unter geeigneten Bedingungen kultiviert wurde. Die Verfügbarkeit des hinterlegten Materials ist nicht als eine Lizenz zur praktischen Durchführung der Erfindung zu sehen, die einen Verstoß gegen die unter der Be fugnis jeder beliebigen Regierung gemäß ihren Patentrechten zuerkannten Rechte darstellen würde.
Die obige Beschreibung wird als ausreichend erachtet, um Fachleute in die Lage zu versetzen, die Erfindung durchzuführen. Die vorliegende Erfindung ist durch das hinterlegte Konstrukt nicht in ihrem Schutzumfang eingeschränkt, da die hinterlegte Ausführungsform lediglich als eine Veranschaulichung bestimmter Aspekte der Erfindung zu betrachten ist. Die Hinterlegung von Material hierin ist nicht mit einem Zugeständnis gleichzusetzen, dass die hierin festgehaltene Beschreibung inadäquat sei, die praktische Durchführung jedes Aspekts der Erfindung, umfassend den besten Modus davon, zu ermöglichen, noch ist sie als eine Einschränkung des Schutzumfangs der Ansprüche in Bezug auf die spezifischen Darstellungen, die sie darstellt, zu betrachten. Verschiedene Modifikationen zusätzlich zu jenen, die hierin gezeigt und beschrieben wurden, werden für Fachleute aus der obigen Beschreibung ersichtlich sein und fallen in den Schutzumfang der beiliegenden Ansprüche.
Anhang
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isolierte Nucleinsäure, die entweder: (a) Nucleinsäure, die für ein Polypeptid codiert, das zumindest 80 % Sequenzidentität mit der in 2 gezeigten Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 2) aufweist, oder deren Komplement, worin die Sequenzidentität über die gesamte Länge der verglichenen Sequenzen bestimmt wird und worin Expression des Polypeptids unter den folgenden menschlichen Geweben: Fötales Gewebe (E12-E16 Wochen): Plazenta, Nabelschnur, Leber, Niere, Nebennieren, Schilddrüse, Lungen, große Gefäße, Speiseröhre, Magen, Dünndarm, Milz, Thymus, Bauchspeicheldrüse, Gehirn, Auge, Rückenmark, Rumpfwand, Becken und untere Gliedmaßen; und Enrwachsenes Gewebe: Niere (normal und Endstadium), Nebenniere, Myocardium, Aorta, Milz, Lymphknoten, Bauchspeicheldrüse, Lunge, Haut, Auge (inkl. Netzhaut), Blase, Leber (normal, zirrhotisch, akutes Versagen); auf das vaskuläre Endothel fötaler Milz, erwachsener Milz, fötaler Leber und erwachsener Schilddrüse und sich entwickelnder Spinalganglien beschränkt ist; oder (b) Nucleinsäure ist, die die Codiersequenz voller Länge des in Zugriffsnummer ATCC 209263 enthaltenen Nucleinsäureinserts (DNA 33221-1133) umfasst.
Nucleinsäure nach Anspruch 1, worin die Nucleotidsequenz die in 1 gezeigte Nucleotidsequenz (Seq.-ID Nr. 1) umfasst, oder deren Komplement.
Nucleinsäure nach Anspruch 1, worin die Nucleotidsequenz die Codiersequenz voller Länge der in 1 gezeigten Sequenz (Seq.-ID Nr. 1) umfasst, oder deren Komplement.
Nucleinsäure nach Anspruch 1, die für ein Polypeptid kodiert, das die in 2 gezeigte Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 2) umfasst.
Nucleinsäure nach Anspruch 1, Abschnitt (a), worin der Identitätsgrad zumindest 90 % beträgt.
Nucleinsäure nach Anspruch 5, worin der Identitätsgrad zumindest 95 % beträgt.
Vektor, umfassend Nucleinsäure nach einem der vorangehenden Ansprüche.
Vektor nach Anspruch 7, der operabel mit Kontrollsequenzen verbunden ist, die von einer mit dem Vektor transformierten Wirtszelle erkannt werden.
Wirtszelle, die einen Vektor nach Anspruch 7 oder Anspruch 8 umfasst.
Wirtszelle nach Anspruch 9, worin die Zelle eine CHO-Zelle ist.
Wirtszelle nach Anspruch 9, worin die Zelle eine E. coli-Zelle ist.
Wirtszelle nach Anspruch 9, worin die Zelle eine Hefezelle ist.
Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, umfassend das Kultivieren einer Wirtszelle nach einem der Ansprüche 9 bis 12 unter zur Expression des Polypeptids geeigneten Bedingungen und das Gewinnen des Polypeptids aus der Zellkultur.
Isoliertes Polypeptid mit zumindest 80%iger Sequenzidentität mit der in 2 gezeigten Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 2), worin das Polypeptid unter den folgenden menschlichen Geweben: Fötales Gewebe (E12-E16 Wochen): Plazenta, Nabelschnur, Leber, Niere, Nebennieren, Schilddrüse, Lungen, große Gefäße, Speiseröhre, Magen, Dünndarm, Milz, Thymus, Bauchspeicheldrüse, Gehirn, Auge, Rückenmark, Rumpfwand, Becken und untere Gliedmaßen; und Erwachsenes Gewebe: Niere (normal und Endstadium), Nebenniere, Myocardium, Aorta, Milz, Lymphknoten, Bauchspeicheldrüse, Lunge, Haut, Auge (inkl. Netzhaut), Blase, Leber (normal, zirrhotisch, akutes Versagen); auf das vaskuläre Endothel fötaler Milz, erwachsener Milz, fötaler Leber und erwachsener Schilddrüse und sich entwickelnder Spinalganglien beschränkt ist.
Isoliertes Polypeptid nach Anspruch 14, das aus der in 2 gezeigten Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 2) besteht.
Isoliertes Polypeptid mit zumindest 80%iger Sequenzidentität mit der Aminosäuresequenz, für welche die Codiersequenz voller Länge des in der Zugriffsnummer ATCC 209258 enthaltenen Nucleinsäureinserts (DNA 32292-1131) codiert, worin Expression des Polypeptids unter den folgenden menschlichen Geweben: Fötales Gewebe (E12-E16 Wochen): Plazenta, Nabelschnur, Leber, Niere, Nebennieren, Schilddrüse, Lungen, große Gefäße, Speiseröhre, Magen, Dünndarm, Milz, Thymus, Bauchspeicheldrüse, Gehirn, Auge, Rückenmark, Rumpfwand, Becken und untere Gliedmaßen; und Erwachsenes Gewebe: Niere (normal und Endstadium), Nebenniere, Myocardium, Aorta, Milz, Lymphknoten, Bauchspeicheldrüse, Lunge, Haut, Auge (inkl. Netzhaut), Blase, Leber (normal, zirrhotisch, akutes Versagen); auf das vaskuläre Endothel fötaler Milz, erwachsener Milz, fötaler Leber und erwachsener Schilddrüse und sich entwickelnder Spinalganglien beschränkt ist.
Isoliertes Polypeptid nach Anspruch 16, das aus der Aminosäuresequenz besteht, für welche die Codiersequenz voller Länge des in der Zugriffsnummer ATCC 209263 enthaltenen Nucleinsäureinserts (DNA 33221-1133) kodiert.
Polypeptid nach Anspruch 14 oder Anspruch 16, worin der Identitätsgrad zumindest 90 % beträgt.
Polypeptid nach Anspruch 18, worin der Identitätsgrad zumindest 95 % beträgt.
Chimäres Molekül, das ein an eine heterologe Aminosäuresequenz fusioniertes Polypeptid nach einem der Ansprüche 14 bis 19 umfasst.
Chimäres Molekül nach Anspruch 20, worin die heterologe Aminosäuresequenz eine Epitopmarkierungs-Sequenz ist.
Chimäres Molekül nach Anspruch 20, worin die heterologe Aminosäuresequenz eine Fc-Region eines Immunglobulins ist.
Antikörper, der sich spezifisch an ein Polypeptid nach Anspruch 15 oder Anspruch 17 bindet.
Antikörper nach Anspruch 23, worin der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.