DE60038740T2

DE60038740T2 - Stimulierung oder hemmung von angiogenese und herzvaskularisierung

Info

Publication number: DE60038740T2
Application number: DE60038740T
Authority: DE
Inventors: Avi J. Askenazi; Kevin P. Baker; Napoleone Ferrara; Hanspeter Gerber; Mary E. Gerritsen; Audrey Goddard; Paul J. Godowski; Austin L. Gurney; Sophia S. Kuo; Malanie R. Mark; Scot A. Marsters; Nicholas F. Paoni; Robert M. Pitti; Colin K. Moraga Watanabe; P. Mickey Williams; William I. Wood
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1999-06-02
Filing date: 2000-05-17
Publication date: 2009-07-02
Anticipated expiration: 2020-05-18
Also published as: AU5441200A; ATE393825T1; EP1212417B1; DK1212417T3; DE60038740D1; WO2000073445A2; EP1212417A2; CA2376116A1; ES2307515T3; JP4297317B2; JP2004506595A; JP2009019032A; PT1212417E; WO2000073445A3

Description

Hintergrund der Erfindung
Fachgebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Zusammensetzungen und Verfahren zur Förderung oder Hemmung von Angiogenese und/oder Kardiovaskularisierung in Säugetieren, die eine solche biologische Wirkung benötigen. Dies umfasst die Diagnose und Behandlung von kardiovaskulären Erkrankungen sowie onkologischen Erkrankungen.
Beschreibung des Hintergrunds der Erfindung
A. Herzerkrankungen und Faktoren
Herzinsuffizienz betrifft etwa fünf Millionen Amerikaner, und neue Fälle von Herzinsuffizienz belaufen sich auf etwa 400.000 pro Jahr. Es ist die häufigste alleinige Ursache für Krankenhausaufenthalt von Menschen im Alter von 65 Jahren und älter in den Vereinigten Staaten. Jüngste Fortschritte im Umgang mit akuten Herzerkrankungen, einschließlich akuten Myokardinfarkt, führten zu einer expandierenden Patientenpopulation, die letztlich chronische Herzinsuffizienz entwickeln wird. Von 1979 bis 1995 stiegen Hospitalisierungen aufgrund von Stauungsinsuffizienz (CHF) von 377.000 auf 872.000 (ein 130-prozentiger Anstieg), und CHF-Todesfälle stiegen um 116 Prozent.
CHF ist ein Syndrom, das durch eine Fehlfunktion des linken Ventrikels, reduzierte Toleranz gegenüber körperlicher Betätigung, gestörte Lebensqualität und deutlich verkürzte Lebenserwartung gekennzeichnet ist. Das Sine qua non von Herzinsuffizienz ist ein Unvermögen des Herzens, Blut in einer ausreichenden Rate zu pumpen, um die Stoffwechselbedürfnisse der Körpergewebe zu erfüllen (in anderen Worten besteht unzureichende Herzleistung).
Zumindest vier große Kompensationsmechanismen werden im Bereich von Herzinsuffizienz aktiviert, um die Herzleistung, einschließlich peripherer Vasokonstriktion, erhöhter Herzrate, erhöhter Herzkontraktilität und erhöhtes Plasmavolumen, zu boosten. Diese Wirkungen werden primär durch das sympathische Nervensystem und das Renin-Angiotensin-System vermittelt. Siehe Eichhorn, American Journal of Medicine 104, 163–169 (1998). Erhöhte Leistung des sympathischen Nervensystems erhöht den Gefäßtonus, die Herzrate und Kontraktilität. Angiotensin-II erhöhte Blutdruck durch (1) direkte Stimulation der Muskelkontraktion der glatten Muskulatur, (2) Förderung der Plasmavolumenexpansion durch Stimulation von Aldosteron und antidiuretischer Hormonsekretion, (3) Stimulation von sympathisch vermitteltem Gefäßtonus und (4) Katalysieren des Abbaus von Bradykinin, das vasodilatorische und natriuretische Aktivität aufweist. Siehe Übersichtsartikel von Brown und Vaughan, Circulation 97, 1411–1420 (1998). Wie nachstehend beschrieben, kann Angiotensin II auch direkt schädliche Wirkungen auf das Herz haben, indem Myozytennekrose (wodurch die systolische Funktion geschädigt wird) und intrakardiale Fibrose (was diastolische und in manchen Fällen systolische Funktion schädigt) gefördert wird. Siehe Weber, Circulation 96, 4065–4082 (1998).
Ein beständiges Merkmal von Stauungsinsuffizienz (CHF) ist Herzhypertrophie, eine Vergrößerung des Herzens, die sowohl durch mechanische als auch hormonelle Reize aktiviert wird und dem Herzen ermöglicht, sich an die Bedürfnisse erhöhter Herzleistung anzupassen. Morgan und Baker, Circulation 83, 13–25 (1991). Diese hypertrophe Reaktion wird häufig mit einer Vielzahl von verschiedenen pathologischen Leiden wie Hypertonie, Aortenstenose, Myokardinfarkt, Kardiomyopathie, Klappeninsuffizienz und intrakardialem Shunt assoziiert, wovon alle zu chronischer hämodynamischer Überlastung führen.
Hypertrophie ist im Allgemeinen als Anstieg der Größe eines Organs oder Struktur unabhängig vom natürlichem Wachstum definiert, welches keine Tumorbildung umfasst. Hypertrophie des Herzens ist entweder auf einen Anstieg der Masse der individuellen Zellen (Myozyten) oder einen Anstieg der Zahl der Zellen, die das Gewebe bilden (Hyperplasie), zurückzuführen oder beides. Während die Erweiterung eines embryonalen Herzens stark vom Anstieg der Myozytenzahl abhängt (die bis kurz nach der Geburt fortgesetzt wird), verlieren postnatale Myozyten ihre proliferative Kapazität. Weiteres Wachstum tritt durch Hypertrophie der individuellen Zellen auf.
Myozytenhypertrophie beim Erwachsenen ist anfänglich als kurzfristige Reaktion auf gestörte Herzfunktion durch Ermöglichung eines Rückgangs der Belastung auf individuellen Muskelfasern vorteilhaft. Mit schwerer, lang andauernder Überlastung beginnt sich der Zustand der einer Hypertrophie unterworfenen Zellen zu verschlechtern bzw. beginnen sie abzusterben. Katz, „Heart Failure", in: A. M. Katz, Hrsg., Physiology of the Heart, New York, Raven Press, 638–668 (1992). Herzhypertrophie ist ein signifikanter Risikofaktor sowohl für Mortalität als auch Morbidität im klinischen Verlauf von Herzinsuffizienz. Katz, Trends Cardiovasc. Med. 5, 37–44 (1995). Für weitere Details für die Gründe und die Pathologie von Herzhypertrophie siehe z. B. Heart Disease, A Textbook of Cardiovascular Medicine, E. Braunwald, Hrsg., [W. B. Saunders Co. (1988)] Kapitel 14, „Pathophysiology of Heart Failure".
Auf zellulärer Ebene besteht das Herz aus Myozyten und sie umgebenden Trägerzellen, die im Allgemeinen Nicht-Myozyten genannt werden. Während Nicht-Myozyten hauptsächlich Fibroblasten/Mesenchymzellen sind, umfassen sie auch Endothelzellen und Zellen glatter Muskulatur. Obwohl Myozyten den Großteil der erwachsenen Myokardmasse ausmachen, repräsentieren sie nur etwa 30% der gesamten Zellzahl, die im Herz gegenwärtig ist. Als Reaktion of hormonelle, physiologische, hämodynamische und pathologische Reize können sich erwachsene Ventrikelmuskelzellen an erhöhte Arbeitspensen durch die Aktivierung eines hypertrophen Verfahrens anpassen. Diese Reaktion ist durch einen Anstieg der Myozytenzellgröße und des kontraktilen Proteingehalts von individuellen Herzmuskelzellen ohne gleichzeitige Zellteilung und Aktivierung von Embryogenen gekennzeichnet, das Gen für atriales natriuretisches Peptid (ANP) umfassend. Chien et al., FASEB J. 5, 3037–3046 (1991), Chien et al., Annu Rev. Physiol. 55, 77–95 (1993). Ein Anstieg der Myokardmasse als Folge eines Anstieges der Myozytengröße, die mit einer Akkumulation von interstitiellem Collagen innerhalb der extrazellulären Matrix verbunden ist, und um Intramyokard-Koronararterien ist bei Hypertrophie des linken Ventrikels sekundär zur Drucküberladung bei Menschen beschrieben worden. Caspari et al., Cardiovasc. Res. 11, 554–558 (1977), Schwarz et al., Am J. Cardiol. 42, 895–903 (1978), Hess et al., Circulation 63, 360–371 (1981), Pearlman et al., Lab. Invest. 46, 158–164 (1982).
Es ist auch vorgeschlagen worden, dass parakrine Faktoren, die durch nicht-myozyten-tragende Zellen produziert werden, zusätzlich in die Entwicklung von Herzhypertrophie involviert sein können, und verschiedene von Nicht-Myozyten abstammende Hypertrophiefaktoren, wie z. B. Leukozytenhemmfaktor (LIF) und Endothelin, sind identifiziert worden. Metcalf, Growth Factors 7, 169–173 (1992), Kurzrock et al., Endocrine Reviews 12, 208–217 (1991), Inoue et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 86, 2863–2867 (1989), Yanagisawa und Masski, Trends Pharm. Sci. 10, 374–378 (1989), US-Patent Nr. 5.573.762 (am 12. November 1996 ausgegeben). Weitere beispielhafte Faktoren, die als potenzielle Mediatoren von Herzhypertrophie identifiziert worden sind, umfassen Cardiotrophin-1 (CT-1) [Pennica et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 92, 1142–1146 (1995)], Catecholamine, Adrenocorticosteroide, Angiotensin und Prostaglandine.
Derzeit variiert die Behandlung von Herzhypertrophie abhängig von der zugrunde liegenden Herzerkrankung. Catecholamine, Adrenocorticosteroide, Angiotensin, Prostaglandine, LIF, Endothelin (einschließlich Endothelin-1, -2, und -3 und großes Endothelin) und CT-1 gehören zu den Faktoren, die als potenzielle Mediatoren von Hypertrophie identifiziert wurden. Zum Beispiel sind betaadrenerge rezeptorblockierende Arzneimittel (Betablocker, z. B. Propranolol, Timolol, Tertalolol, Carteolol, Nadolol, Betaxolol, Penbutolol, Acetobutolol, Atenolol, Metoprolol, Carvedilol etc.) und Verapamil in der Behandlung von hypertropher Kardiomyopathie umfassend verwendet worden. Die günstigen Wirkungen von Betablockern auf Symptome (z. B. Brustschmerzen) und Toleranz von körperlicher Betätigung sind großteils auf einen Rückgang der Herzrate mit einer nachfolgenden Verlängerung der Diastole und erhöhte passive Ventrikelfüllung zurückzuführen. Thompson et al., Br. Heart J. 44, 488–98 (1980), Harrison et al., Circulation 29, 84–98 (1964). Von Verapamil ist berichtet worden, dass es Ventrikelfüllung verbessert und möglicherweise Myokardischämie reduziert. Bonow et al., Circulation 72, 853–64 (1985).
Nifedipin und Diltiazem sind ebenfalls gelegentlich in der Behandlung von hypertropher Kardiomyopathie verwendet worden. Lorell et al., Circulation 65, 499–507 (1982), Betocchi et al., Am. J. Cardiol 78, 451–457 (1996). Jedoch kann Nifedipin aufgrund seiner kräftigen vasodilatorischen Eigenschaften schädlich sein, insbesondere bei Patienten mit Ausflussverschluss. Disopyramid ist verwendet worden, um Symptome durch seine negativen inotropen Eigenschaften zu lindern. Pollick, N. Engl. J. Med. 307, 997–999 (1982). Bei vielen Patienten nehmen die anfänglichen Vorteile jedoch mit der Zeit ab. Wigle et al., Circulation 92, 1680–1692 (1995). Von Antihypertonikatherapie ist berichtet worden, dass sie positive Wirkungen auf Herzhypertrophie zeigen, die mit erhöhtem Blutdruck assoziiert ist. Beispiele für Arzneimittel, die in Antihypertonietherapie verwendet werden, alleine oder in Kombination, sind Kalziumantagonisten, z. B. Nitrendipin, adrenerge rezeptor-blockierende Mittel, z. B. die oben angeführten, angiotensinumwandelnde Enzym-(ACE-)Inhibitoren, wie Quinapril, Captopril, Enalapril, Ramipril, Benazepril, Fosinopril und Lisinopril; Diuretika, z. B. Chlorthiazid, Hydrochlorthiazid, Hydroflumethazid, Methylchlothiazid, Benzthiazid, Dichlorphenamid, Acetazolamid und Indapamid; und Kalziumkanalblocker, z. B. Diltiazem, Nifedipin, Verapamil und Nicardipin.
Zum Beispiel zeigte die Behandlung von Hypertonie mit Diltiazem und Captopril einen Rückgang der Muskelmasse des linken Ventrikels, aber die Doppler-Indizes der diastolischen Funktionen normalisierten sich nicht. Szlachcic et al., Am. J. Cardiol. 63, 198–201 (1989), Shahi et al., Lancet 336, 458–461 (1990). Diese Ergebnisse wurden interpretiert, um zu zeigen, dass übermäßige Mengen von interstitiellem Collagen nach Regression der Hypertrophie des linken Ventrikels bleiben. Rossi et al., Am Heart J. 124, 700–709 (1992). Rossi et al., siehe oben, untersuchten die Wirkung von Captopril auf die Prävention und Regression von Myokardzellhypertrophie und interstitieller Fibrose in Drucküberlastungsherzhypertrophie bei Versuchsratten.
Von Mitteln, die Herzkontraktilität direkt verstärken (inotropische Mittel), wurde anfänglich angenommen, dass sie Patienten mit Herzinsuffizienz zugute kommen, weil sie die Herzleistung kurzfristig verbesserten. Jedoch hat sich herausgestellt, dass alle positiven inotropischen Mittel mit Ausnahme von Digoxigenin zu erhöhter langfris tiger Mortalität führen, trotz kurzfristiger Verbesserungen der Herzleistung. Massie, Curr. Opin. Cardiology 12, 209–217 (1997), Reddy et al., Curr. Opin. Cardiol. 12, 233–241 (1997). Betaadrenerge Rezeptorenblocker sind kürzlich für ihre Verwendung bei Herzinsuffizienz verteidigt worden. Beweise aus klinischen Verfahren lassen vermuten, dass Verbesserungen der Herzfunktion ohne erhöhte Mortalität erreicht werden können, obwohl bisher dokumentierte Verbesserungen des Patientenüberlebens noch nicht demonstriert worden sind. Siehe auch US-Patent Nr. 5.935.924 , 5.624.806 , 5.661.122 und 5.610.134 und WO95/28173 hinsichtlich der Verwendung von Cardiotropin-1 oder Antagonisten davon oder Wachstumhormon und/oder insulinähnlichem Wachstumsfaktor I bei der Behandlung von CHF. Eine andere Behandlungsmodalität ist Herztransplantation, aber diese ist durch die Verfügbarkeit von Spenderherzen eingeschränkt.
Endothelin ist ein Vasokonstringenz-Peptid, 21 Aminosäuren umfassend, das aus Kulturüberstand von Schweinearterien-Endothelkultur isoliert wird und strukturell bestimmt wird. Yanagisawa et al., Nature 332, 411–415 (1988). Es wurde später festgestellt, dass Endothelin verschiedene Wirkungen zeigt, und Endothelinantikörper als Endothelinantagonisten haben sich als wirkungsvoll in der Behandlung von Myokardinfarkt, Nierenversagen und anderen Erkrankungen erwiesen. Da Endothelin in lebenden Körpern gegenwärtig ist und Vasokonstringenzwirkung zeigt, wird erwartet, dass es ein endogener Faktor ist, der in die Regulierung des Kreislaufsystems involviert ist, und mit Hypertonie, kardiovaskulären Erkrankungen wie Myokardinfarkt und Nierenerkrankungen wie akutem Nierenversagen assoziiert sein kann. Endothelinantagonisten sind z. B. in US-Patent Nr. 5.773.414 ; JP Pat.-Veröffentlichung 3130299/1991 , EP 457.195 ; EP 460.679 und EP 552.489 beschrieben. Ein neuer Endothelin-B-Rezeptor zur Identifikation von Endothelin-Rezeptorantagonisten ist in US-Patent Nr. 5.773.223 beschrieben.
Die derzeitige Therapie für Herzinsuffizienz ist primär auf die Verwendung von angiotensinkonvertierenden Enzym-(ACE-)Hemmern, wie z. B. Captopril, und Diuretika ausgerichtet. Diese Arzneimittel verbessern das hämodynamische Profil und die Toleranz körperlicher Betätigung und reduzieren die Inzidenz von Morbidität und Morta lität bei Patienten mit CHF. Kramer et al., Circulation 67 (4), 807–816 (1983); Captopril Multicenter Research Group, J. A. C. C. 2(4), 755–763 (1983); The CONSENUS Trial Study Group, N. Engl. J. Med. 316 (23), 1429–1435 (1987); THE SOLVD Investigators, N. Engl. J Med. 325 (5), 293–302 (1991). Weiters sind sie zur Behandlung von Hypertonie, Fehlfunktion des linken Ventrikels, atherosklerotischer Gefäßerkrankung und diabetischer Nephropathie nützlich. Brown und Vaughan, siehe oben. Jedoch ist die Reaktion auf ACE-Inhibitoren trotz bewiesener Wirksamkeit eingeschränkt. Zum Beispiel scheinen ACE-Inhibitoren, während sie das Überleben bei Herzinsuffizienz verlängern, das Fortschreiten Richtung Herzinsuffizienz im Endstadium zu verlangsamen, und wesentliche Zahlen von Patienten, die mit ACE-Inhibitoren behandelt werden, weisen funktionelle Klasse-III-Herzinsuffizienz auf.
Weiters ist die Verbesserung von funktioneller Kapazität und Dauer sportlicher Betätigung nur gering, und Mortalität, obwohl reduziert, ist weiterhin hoch. The Consensus Trial Study Group, N. Engl. J. Med. 316 (23), 1429–1453 (1987); The SOLVD Investigators, N. Engl. J. Med. 325 (5), 293–302 (1991); Cohn et al., N. Engl. J. Med. 325 (5), 303–310 (1991); The Captopril-Digoxin Multicenter Research Group, JAMA 259 (4), 539–544 (1988). Daher scheinen ACE-Inhibitoren durchwegs nicht in der Lage zu sein, Symptome bei mehr als 60% der Herzinsuffizienzpatienten zu lindern, und reduzieren Mortalität von Herzinsuffizienz nur um etwa 15–20%. Für weitere Nebenwirkungen siehe Brown und Vaughan, siehe oben.
Eine Alternative zu ACE-Inhibitoren ist durch spezifische AT1-Rezeptorantagonisten dargestellt. Klinische Studien sollen die Wirksamkeit dieser beiden Modalitäten in der Behandlung von kardiovaskulärer Erkrankung und Nierenerkrankung vergleichen. Jedoch lassen Tiermodell-Daten vermuten, dass der ACE/Ang-II-Weg, obgleich er eindeutig in Herzhypertrophie involviert ist, nicht der einzige oder gar der primäre in dieser Rolle aktive Weg ist. Genetische Maus-„Knockout"-Modelle sind hergestellt worden, um individuelle Komponenten des Wegs zu testen. In einem solchen Modell ist der primäre Herzrezeptor für Ang II, AT sub 1A, genetisch deletiert worden. Diese Mäuse entwickeln keine Hypertrophie, wenn Ang II experimentell gegeben wird (was den grundlegenden Erfolg des Modells in der Elimination von Hypertrophie sekundär zu Ang II bestätigt). Jedoch werden die Herzen immer noch hypertrophisch, wenn die Aorta in diesen Tieren eingeengt ist (ein Modell hypertoner Herzbelastung). Dies lässt vermuten, dass alternative Signalgebungswege, die nicht von diesem Rezeptor (AT sub 1A) abhängen, bei Hypertonie aktiviert werden. ACE-Inhibitoren wären vermutlich nicht in der Lage, diese Wege zu hemmen. Siehe Harada et al., Circulation 97, 1952–1959 (1998). Siehe auch Homcy, Circulation 97, 1890–1892 (1998), hinsichtlich des Rätsels, das mit dem Verfahren und Mechanismus von Herzhypertrophie assoziiert ist.
Etwa 750.000 Patienten erleiden jährlich akuten Myokardinfarkt (AMI), und etwa ein Viertel aller Todesfälle in den Vereinigten Staaten sind auf AMI zurückzuführen. In den letzten Jahren haben thrombolytische Mittel, z. B. Streptokinase, Urokinase und insbesondere Gewebsplasminogenaktivator (t-PA), das Überleben von Patienten, die Myokardinfarkt erlitten, signifikant erhöht. Wenn als kontinuierliche intravenöse Infusion über 1,5 bis 4 Stunden verabreicht, produziert t-PA Koronardurchgängigkeit bei 90 Minuten bei 69% bis 90% der behandelten Patienten. Topol et al., Am. J. Cardiol. 61, 723–728 (1988), Neuhaus et al., J. Am. Coll. Cardiol. 12, 581–587 (1988), Neuhaus et al., J. Am Coll. Cardiol. 14, 1566–1569 (1989). Die höchsten Durchgängigkeitsraten sind bei höherer Dosis oder beschleunigten Dosierungsplänen berichtet worden. Topol, J. Am. Coll. Cardiol. 15, 922–924 (1990). t-PA kann auch als einzelner Bolus verabreicht werden, obwohl es aufgrund seiner relativ kurzen Halbwertszeit für Infusionstherapie besser geeignet ist. Tebbe et al., Am. J. Cardiol. 64, 448–453 (1989). Eine t-PA-Variante, die spezifisch entworfen ist, um eine längere Halbwertszeit und sehr hohe Fibrinspezifität zu haben, TNK-t-PA (eine T103N, N117Q KHRR (296–299) AAAA t-PA-Variante, Keyt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 3670–3674 (1994)), ist besonders für Bolus-Verabreichung geeignet. Jedoch hängt trotz aller Vorteile die Langzeitprognose von Patientenüberleben stark von der Überwachung und Behandlung der Patienten nach Infarkt ab, was Monitoring und Behandlung von Herzhypertrophie umfassen sollte.
B. Wachstumsfaktoren
Verschiedene natürlich auftretende Polypeptide haben wie berichtet die Proliferation von Endothelzellen induziert. Zu diesen Polypeptiden zählen die basischen und sauren Fibroblastenwachstumfaktoren (FGF) (Burgess und Maciag, Annual Rev. Biochem. 58, 575 (1989)), von Blutplättchen abstammende Endothelzellwachstumsfaktoren (PD-ECGF) (Ishikawa et al., Nature 338, 557 (1989)) und Gefäßendothelwachstumsfaktor (VEGF). Leung et al., Science 246, 1306 (1989), Ferrara und Henzel, Biochem. Biophys. Res. Commun. 161, 851 (1989), Tischer et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 165, 1198 (1989), EP 471.7546 , erteilt am 31. Juli 1996.
Medien, die durch Zellen konditioniert sind, die mit der menschlichen VEGF-(hVEGF-)cDNA transfiziert sind, förderten die Proliferation von kapillaren Endothelzellen, während Kontrollzellen dies nicht taten. Leung et al., Science 246, 1306 (1989). Mehrere zusätzliche cDNAs wurden in menschlichen cDNA-Bibliotheken identifiziert, die für 121-, 189- und 206-Aminosäureisoformen von hVEGF kodierten (allgemein auch als hVEGF-verwandte Proteine bezeichnet). Das 121-Aminosäureprotein unterscheidet sich von hVEGF durch die Deletion der 44 Aminosäuren zwischen den Resten 116 und 159 in hVEGF. Das 189-Aminosäureprotein unterscheidet sich von hVEGF durch die Insertion von 24 Aminosäuren an Rest 116 in hVEGF und ist offensichtlich mit menschlichem Gefäßpermeabilitätsfaktor (hVPF) identisch. Das 206-Aminosäureprotein unterscheidet sich von hVEGF durch eine Insertion von 41 Aminosäuren an Rest 116 in hVEGF. Houck et al., Mol. Endocrin. 5, 1806 (1991), Ferrara et al., J. Cell Biochem. 47, 211 (1991), Ferrara et al., Endocrine Reviews 13, 18 (1992), Keck et al., Science 246, 1309 (1989), Connolly et al., J. Biol. Chem. 264, 20017 (1989), EP 370.989 , veröffentlicht am 30. Mai 1990.
Es ist nun klar, dass Angiogenese, welche die Bildung von neuen Blutgefäßen aus vorher bestehendem Endothel umfasst, in die Pathogenese einer Vielzahl von Erkrankungen impliziert ist. Diese umfassen feste Tumoren und Metastase, Atherosklerose, retrolentale Fibroplasie, Hämangiome, chronische Entzündung, intraokulare neovaskuläre Syndrome, wie z. B. proliferative Retinopathien, z. B. diabetische Reti nopathie, altersbedingte Makuladegeneration (AMD), neovaskuläres Glaukom, Immunabstoßung von transplantiertem Hornhautgewebe und anderen Geweben, rheumatoide Arthritis und Psoriasis. Folkman et al., J. Biol. Chem. 267, 10931–10934 (1992), Klagsbrun et al., Annu. Rev. Physiol. 53, 217–239 (1991), und A. Garner, „Vascular diseases", in: Pathobiology of Ocular Disease, A Dynamic Approach, A. Garner, G. K. Klintworth, Hrsg., 2. Auflage (Marcel Dekker NY, 1994), 1625–1710.
Im Fall von Tumorwachstum scheint Angiogenese für die Umwandlung von Hyperplasie in Neoplasie und für die Bereitstellung von Nahrung für den wachsenden festen Tumor entscheidend zu sein. Folkman et al., Nature 339, 58 (1989). Die Neovaskularisierung ermöglicht den Tumorzellen einen Wachstumsvorteil und proliferative Autonomie im Vergleich zu normalen Zellen. Dementsprechend ist eine Beziehung zwischen der Dichte von Mikrogefäßen in Tumorsektionen und Patientenüberleben in Brustkrebs sowie in mehreren anderen Tumoren beobachtet worden. Weidner et al., New Engl. J. Med. 324, 1–6 (1991), Horak et al., Lancet 340, 1120–1124 (1992); Macchiarini et al., Lancet 340, 145–146 (1992).
Die Suche nach positiven Regulatoren von Angiogenese hat mehrere Kandidaten erbracht, einschließlich ein aFGF, bFGF, TGF-α, TGF-β, HGF, TNF-α, Angiogenin, IL-8 etc. Folkman et al., J. B. C., siehe oben, und Klagsbrun et al., siehe oben. Die bisher identifizierten negativen Regulatoren umfassen Thrombospondin (Good et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 6624–6628 (1990)), das N-terminale 16-Kilodalton-Fragment von Prolactin (Clapp et al., Endocrinology 133, 1292–1299 (1993)), Angiostatin (O'Reilly et al., Cell 79, 315–328 (1994)) und Endostatin. O'Reilly et al., Cell 88, 277–285 (1996).
Was in den letzten Jahren erreicht worden ist, hat die Schlüsselrolle von VEGF geschaffen, nicht nur in der Stimulation von Gefäßendothelzellproliferation, sondern auch in der Induktion von Gefäßpermeabilität und Angiogenese. Ferrara et al., Endocr. Rev. 18, 4–25 (1997). Das Ergebnis, dass der Verlust von sogar einem einzigen VEGF-Allel zur embryonalen Letalität führt, weist auf eine unersetzbare Rolle hin, die dieser Faktor in der Entwicklung und Differenzierung des Gefäßsystems übernimmt.
Weiters hat sich VEGF als Schlüsselmediator von Neovaskularisierung erwiesen, die mit Tumoren und intraokularen Erkrankungen assoziiert ist. Ferrara et al., Endocr. Rev., siehe oben. Die VEGF-mRNA wird durch die Mehrheit von untersuchten menschlichen Tumoren überexprimiert. Berkman et al., J. Clin. Invest. 91, 153–159 (1993), Brown et al., Human Pathol. 26, 86–91 (1995), Brown et al., Cancer Res. 53, 4727–4735 (1993), Mattern et al., Brit. J. Cancer 73, 931–934 (1996), Dvorak et al., Am J. Pathol. 146, 1029–1039 (1995).
Auch sind die Konzentrationsspiegel von VEGF in Augenfluiden eng mit der Gegenwart von aktiver Proliferation von Blutgefäßen in Patienten mit diabetischen und anderen ischämieverwandten Retinopathien verbunden. Aiello et al., N. Engl. J. Med. 331, 1480–1487 (1994). Weiters haben jüngste Studien die Lokalisierung von VEGF in neovaskulären Chorioidea-Membranen bei Patienten gezeigt, die von AMD betroffen sind. Lopez et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 37, 855–868 (1996).
Neutralisierende Anti-VEGF-Antikörper supprimieren das Wachstum einer Vielzahl von menschlichen Tumorzelllinien bei Nacktmäusen [Kim et al., Nature 362, 841–844 (1993), Warren et al., J. Clin. Invest. 95, 1789–1797 (1995), Borgström et al., Cancer Res. 56, 4032–4039 (1996), Melnyk et al., Cancer Res. 56, 921–924 (1996)] und hemmen auch intraokulare Angiogenese in Modellen von ischämischen Retinaerkrankungen. Adamis et al., Arch. Ophthalmol. 114, 66–71 (1996). Deshalb sind monoklonale Anti-VEGF-Antikörper oder andere Inhibitoren von VEGF-Wirkung vielversprechende Kandidaten für die Behandlung von festen Tumoren und verschiedenen intraokularen neovaskulären Erkrankungen. Solche Antikörper sind z. B. in EP 817.648 , veröffentlicht am 14. Jänner 1998, und in WO 98/45331 und WO 98/45332 , beide veröffentlicht am 15. Oktober 1998, beschrieben.
Es gibt mehrere andere Wachstumsfaktoren und Mitogene, einschließlich transformierender Onkogene, die in der Lage sind, eine komplexe Reihe an Genen rasch zu induzieren, um durch bestimmte Zellen exprimiert zu werden. Lau und Nathans, Molecular Aspects of Cellular Regulation 6, 165–202 (1991). Diese Gene, die als unmittelbare frühe oder frühe Reaktionsgene bezeichnet werden, sind transkriptionell in nerhalb weniger Minuten nach Kontakt mit einem Wachstumsfaktor oder Mitogen aktiviert, unabhängig von der De-novo-Proteinsynthese. Eine Gruppe dieser unmittelbaren-frühen Gene kodiert für sekretierte, extrazelluläre Proteine, die für Koordination von komplexen biologischen Verfahren wie z. B. Differenzierung und Proliferation, Regeneration und Wundheilung nötig sind. Ryseck et al., Cell Growth Differ. 2, 235–233 (1991).
Höchst verwandte Proteine, die dieser Gruppe angehören, umfassen cef 10 (Simmons et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1178–1182 (1989)), cyr 61, das rasch durch von Serum oder Blutplättchen abstammenden Wachstumsfaktor (PDGF) aktiviert wird (O'Brien et al., Mol. Cell Biol. 10, 3569–3577 (1990)), menschlichen Bindegewebswachstumsfaktor (CTGF) [Bradham et al., J. Cell Biol. 114, 1285–1294 (1991)], der durch menschliche Gefäßendothelzellen in höheren Spiegeln nach Aktivierung mit transformierendem Wachstumsfaktor beta (TGF-β) sekretiert wird, PDGF-ähnliche biologische oder immunologische Aktivitäten zeigt und mit PDGF um einen bestimmten Zelloberflächenrezeptor konkurriert, fisp-12 (Ryseck et al., Cell Growth Differ. 2, 235–233 (1991)), menschlichen Gefäß-IBP-ähnlichen Wachstumsfaktor (VIGF) ( WO96/17931 ) und nov, normalerweise in erwachsenen Nierenzellen arretiert, das in myeloblastose-assozierten Virus-Typ1-induzierten Nephroblastomen überexprimiert wurde. Joloit et al., Mol. Cell. Biol. 12, 10–21 (1992).
Die Expression dieser unmittelbaren frühen Gene wirkt als „dritte Messenger" in der Reihe von Ereignissen, die durch Wachstumsfaktoren ausgelöst werden. Es ist auch zu erwarten, dass sie notwendig sind, um komplexe biologische Verfahren, wie z. B. Differenzierung und Wundheilung, in welchen Zellproliferation ein häufiges Ereignis ist, zu integrieren und zu koordinieren.
Es hat sich gezeigt, dass insulinähnliche Wachstumsfaktorbindungsproteine (IGFBPs) als zusätzliche Mitogene in Komplex mit insulinähnlichem Wachstumsfaktor (IGF) erhöhte Bindung von IGF an Fibroblast und Glattmuskelzelloberflächenrezeptoren stimulieren. Clemmons et al., J. Clin. Invest. 77, 1548 (1986). Hemmwirkungen von IGFBP auf verschiedene IGF-Wirkungen in vitro umfassen Stimulation von Glukosetransport durch Adipozyten, Sulfatinkorporation durch Chondrozyten und Thymidininkorporation in Fibroblasten. Zapf et al., J. Clin. Invest. 63, 1077 (1979). Zusätzlich dazu sind Hemmwirkungen von IGFBPs auf wachstumsfaktorvermittelte Mitogenaktivität in normalen Zellen gezeigt worden.
C. Bedarf an weiteren Behandlungen
Angesichts der Rolle des Gefäßendothelzellwachstums und der Angiogenese bei vielen Erkrankungen und Störungen ist es wünschenswert, über ein Mittel zur Reduktion oder Inhibition einer oder mehrerer biologischer Wirkungen zu verfügen, die diese Prozesse verursachen. Es ist auch wünschenswert, über ein Mittel zum Testen der Gegenwart von pathogenen Polypeptiden unter normalen und unter Krankheitsbedingungen und insbesondere Krebs zu verfügen. Weiters ist in einem besonderen Aspekt, da keine allgemein anwendbare Therapie zur Behandlung von Herzyhypertrophie vorhanden ist, die Identifikation von Faktoren, die Herzmyozytenhypertrophie vermeiden oder reduzieren können, von primärer Bedeutung in der Entwicklung für neue therapeutische Strategien, um pathophysiologisches Herzwachstum zu hemmen. Während es mehrere Behandlungsmodalitäten für verschiedene kardiovaskuläre und onkologische Erkrankungen gibt, besteht noch immer ein Bedarf an zusätzlichen therapeutischen Ansätzen.
Zusammenfassung der Erfindung
A. Ausführungsformen
Dementsprechend betrifft die vorliegende Erfindung Zusammensetzungen, Verwendungen und Verfahren, wie in den Ansprüchen definiert, zur Hemmung von Angiogenese und/oder Kardiovaskularisierung bei Säugetieren. Die vorliegende Erfindung basiert auf der Identifikation von Proteinen, die positiv in verschiedenen kardiovaskulären Tests abschneiden, welche die Förderung oder Inhibierung gewisser biologischer Aktivitäten testen. Dementsprechend sollen die Proteine nützliche Arzneimittel zur Diagnose und/oder Behandlung (einschließlich Prävention) von Erkrankungen sein, wo solche Wirkungen gewünscht sind, wie z. B. die Förderung oder Hemmung von Angiogenese, die Hemmung oder Stimulation des Wachstums von Gefäßendothelzellen, die Stimulation des Wachstums oder der Proliferation von Gefäßendothelzellen, die Hemmung von Tumorwachstum, die Hemmung von angiogeneseabhängigem Gewebswachstum, die Stimulation von angiogeneseabhängigem Gewebswachstum, die Inhibierung von Herzhypertrophie und die Stimulation von Herzhypertrophie, z. B. für die Behandlung von Stauungsinsuffizienz.
In einer Ausführungsform, wie in den Ansprüchen definiert, stellt die vorliegende Erfindung eine Zusammensetzung bereit, umfassend ein PRO-Polypeptid in Beimischung mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger. In einem Aspekt umfasst die Zusammensetzung eine therapeutisch wirksame Menge des Polypeptids. In einem anderen Aspekt umfasst die Zusammensetzung einen weiteren aktiven Inhaltsstoff, nämlich ein kardiovaskuläres, endotheliales oder angiogenes Mittel oder ein angiostatisches Mittel, vorzugsweise ein angiogenes oder angiostatisches Mittel. Vorzugsweise ist die Zusammensetzung steril. Das PRO-Polypeptid kann in Form einer flüssigen pharmazeutischen Formulierung verabreicht werden, die konserviert werden kann, um verlängerte Lagerstabilität zu erreichen. Konservierte flüssige pharmazeutische Formulierungen können Mehrfachdosen von PRO-Polypeptid enthalten und können daher für wiederholte Verwendung geeignet sein.
In einer weiteren Ausführungsform, wie in den Ansprüchen definiert, stellt die vorliegende Erfindung eine Zusammensetzung bereit, umfassend einen Agonisten eines PRO-Polypeptids in Beimischung mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger. In einem Aspekt umfasst die Zusammensetzung eine therapeutisch wirksame Menge des Agonisten. In einem anderen Aspekt umfasst die Zusammensetzung einen weiteren aktiven Inhaltsstoff, nämlich ein kardiovaskuläres, endotheliales oder angiogenes Mittel oder ein angiostatisches Mittel, vorzugsweise ein angiogenes oder angiostatisches Mittel. Vorzugsweise ist die Zusammensetzung steril. Der PRO-Polypeptid-Agonist oder -Antagonist kann in Form einer flüssigen pharmazeutischen Formulierung verabreicht werden, die konserviert werden kann, um verlängerte Lagerstabilität zu erreichen. Konservierte flüssige pharmazeutische Formulierungen können Mehrfachdosen von PRO-Polypeptid-Agonist oder -Antagonist enthalten und können daher für wiederholte Verwendung geeignet sein.
Diese Ausführungsform betrifft eine Zusammensetzung, umfassend einen Anti-PRO-Antikörper in Beimischung mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger. In einem Aspekt umfasst die Zusammensetzung eine therapeutisch wirksame Menge des Antikörpers. In einem anderen Aspekt umfasst die Zusammensetzung einen weiteren aktiven Inhaltsstoff, nämlich ein kardiovaskuläres, endotheliales oder angiogenes Mittel oder ein angiostatisches Mittel, vorzugsweise ein angiogenes oder angiostatisches Mittel. Vorzugsweise ist die Zusammensetzung steril. Die Zusammensetzung kann in Form einer flüssigen pharmazeutischen Formulierung verabreicht werden, die konserviert werden kann, um verlängerte Lagerstabilität zu erreichen. Konservierte flüssige pharmazeutische Formulierungen können Mehrfachdosen des Anti-PRO-Antikörpers enthalten und können daher für wiederholte Verwendung geeignet sein. In bevorzugten Ausführungsformen handelt es sich bei dem Antikörper um einen monoklonalen Antikörper, ein Antikörperfragment, einen humanisierten Antikörper oder einen Einzelketten-Antikörper.
In noch einem weiteren Aspekt, wie in den Ansprüchen definiert, stellt die vorliegende Erfindung ein Fabrikat bereit, umfassend:

(a) eine Zusammensetzung an Material, umfassend ein PRO-Polypeptid oder einen Agonisten davon;
(b) einen Behälter, der die Zusammensetzung enthält; sowie
(c) eine Markierung, die an dem Behälter angebracht ist, oder eine Packungsbeilage, die in dem Behälter inkludiert ist, die sich auf die Verwendung des PRO-Polypeptids oder Agonisten davon in der Behandlung einer kardiovaskulären, endothelialen oder angiogenen Erkrankung bezieht, worin der Agonist ein Antikörper ist, der an das PRO-Polypeptid bindet. Die Zusammensetzung kann eine therapeutisch wirksame Menge des PRO-Polypeptids oder des Agonisten davon umfassen.

In einer weiteren Ausführungsform, wie in den Ansprüchen definiert, stellt die Erfindung ein Verfahren zur Identifikation einer Verbindung bereit, welche die Aktivität eines PRO-Polypeptids inhibiert, umfassend das Kontaktieren einer Testverbindung mit einem PRO-Polypeptid unter Bedingungen und für eine Zeitspanne, die ausreicht, um eine Wechselwirkung zwischen der Testverbindung und dem Polypeptid zu ermöglichen, sowie das Bestimmen, ob die Aktivität des PRO-Polypeptids inhibiert wird. In einem spezifischen bevorzugten Aspekt wird entweder die Testverbindung oder das PRO-Polypeptid auf einem festen Träger immobilisiert. In einem weiteren bevorzugten Aspekt trägt die nicht-immobilisierte Komponente eine detektierbare Markierung. In einem bevorzugten Aspekt umfasst dieses Verfahren folgende Schritte:

(a) das Kontaktieren von Zellen und einer zu screenenden Testverbindung in Gegenwart eines PRO-Polypeptids unter Bedingungen, die für die Induktion einer zellulären Antwort geeignet sind, die normalerweise durch ein PRO-Polypeptid induziert wird; sowie
(b) das Bestimmen der Induktion der zellulären Antwort, um zu bestimmen, ob die Testverbindung ein wirksamer Antagonist ist.

In einem weiteren bevorzugten Aspekt umfasst dieses Verfahren folgende Schritte:

(a) das Kontaktieren von Zellen und einer zu screenenden Testverbindung in Gegenwart eines PRO-Polypeptids unter Bedingungen, die für die Stimulation der Zellproliferation durch ein PRO-Polypeptid geeignet sind; sowie
(b) das Messen der Proliferation der Zellen, um zu bestimmen, ob die Testverbindung ein wirksamer Antagonist ist.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung, wie in den Ansprüchen definiert, ist auf einen Agonisten eines PRO-Polypeptids gerichtet, der gegebenenfalls durch die oben stehend beschriebenen Verfahren identifiziert werden kann.
In noch einem weiteren Aspekt, wie in den Ansprüchen definiert, stellt die Erfindung ein Verfahren zur Diagnose kardiovaskulärer, endothelialer oder angiogener Erkrankungen bei einem Säugetier bereit, umfassend die Analyse des Expressionsausmaßes eines Gens, das für ein PRO-Polypeptid kodiert, und zwar (a) in einer Testprobe an Gewebezellen, die von dem Säugetier erhalten wurden, und (b) in einer Kontrollprobe bekannter normaler Gewebezellen desselben Zelltyps, worin eine höhere oder geringere Expressionsmenge in der Testprobe im Vergleich zur Kontrollprobe ein Indikator für die Gegenwart einer kardiovaskulären, endothelialen oder angiogenen Erkrankung bei dem Säugetier ist. Die Expression eines Gens, das für ein PRO-Polypeptid kodiert, kann gegebenenfalls durch Messen des mRNA-Spiegels oder des Polypeptids in der Testprobe im Vergleich zu der Kontrollprobe erzielt werden.
In noch einem weiteren Aspekt, wie in den Ansprüchen definiert, stellt die Erfindung ein Verfahren zur Diagnose kardiovaskulärer, endothelialer oder angiogener Erkrankungen bei einem Säugetier bereit, umfassend das Detektieren der Gegenwart oder Abwesenheit eines PRO-Polypeptids in einer Testprobe an Gewebezellen, die von dem Säugetier erhalten wurden, worin die Gegenwart oder Abwesenheit des PRO-Polypeptids in der Testprobe ein Indikator für die Gegenwart einer kardiovaskulären, endothelialen oder angiogenen Erkrankung bei dem Säugetier ist.
In noch einem weiteren Aspekt, wie in den Ansprüchen definiert, stellt die Erfindung ein Verfahren zur Diagnose kardiovaskulärer, endothelialer oder angiogener Erkrankungen bei einem Säugetier bereit, umfassend (a) das Kontaktieren eines Anti-PRO-Antikörpers mit einer Testprobe an Gewebezellen, die von dem Säugetier erhalten wurden, und (b) das Detektieren der Bildung eines Komplexes zwischen dem Antikörper und dem PRO-Polypeptid in der Testprobe, worin die Bildung des Komplexes ein Indikator für die Gegenwart einer kardiovaskulären, endothelialen oder angiogenen Erkrankung bei dem Säugetier ist. Die Detektion kann qualitativ oder quantitativ sein und kann in Vergleich mit der Beobachtung der Komplexbildung in einer Kontrollprobe von bekannten normalen Gewebezellen desselben Zelltyps durchgeführt werden. Eine größere oder kleinere Menge an Komplexen, die in der Testprobe gebildet wurde, zeigt die Gegenwart einer kardiovaskulären, endothelialen oder angio genen Dysfunktion bei dem Säugetier, von dem die Testgewebe-Zellen erhalten wurden. Der Antikörper trägt vorzugsweise eine detektierbare Markierung. Die Komplexbildung kann z. B. durch Lichtmikroskopie, Durchflusszytometrie, Fluorimetrie oder andere Verfahren, die nach dem Stand der Technik bekannt sind, beobachtet werden. Die Testprobe wird normalerweise von einem Individuum erhalten, bei dem eine kardiovaskuläre, endotheliale oder angiogene Erkrankung vermutet wird.
In wieder einer anderen Ausführungsform, wie in den Ansprüchen definiert, stellt die vorliegende Erfindung Mittel zur Behandlung einer kardiovaskulären, endothelialen oder angiogenen Erkrankung in einem Säugetier durch Verabreichung einer wirksamen Menge eines PRO-Polypetids bereit. Vorzugsweise ist die Erkrankung Herzhypertrophie, Trauma, wie Wunden oder Verbrennungen, oder eine Form von Krebs. In einem weiteren Aspekt ist das Säugetier weiters Angioplastie oder einem Arzneimittel ausgesetzt, das kardiovaskuläre, endotheliale oder angiogene Erkrankungen behandelt, wie z. B. ACE-Inhibitoren oder Chemotherapeutika, wenn die kardiovaskuläre, endotheliale und angiogene Erkrankung eine Form von Krebs ist. Vorzugsweise ist das Säugetier ein Mensch, vorzugsweise einer, der das Risiko aufweist, Herzhypertrophie zu entwickeln, und noch bevorzugter einen Myokardinfarkt erlitten hat.
In einem anderen bevorzugten Aspekt ist die Herzhypertrophie durch die Gegenwart eines erhöhten Spiegels an PGF_2α gekennzeichnet. Alternativ dazu kann die Herzhypertrophie durch Myokardinfarkt induziert werden, worin vorzugsweise die Verabreichung von PRO-Polypeptid innerhalb von 48 Stunden, noch bevorzugter innerhalb von 24 Stunden, nach Myokardinfarkt initiiert wird.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der kardiovaskulären, endothelialen oder angiogenen Erkrankung um Herzhypertrophie, und das PRO-Polypeptid wird zusammen mit einem kardiovaskulären, endothelialen oder angiogenen Mittel verabreicht. Das bevorzugte kardiovaskuläre, endotheliale oder angiogene Mittel für diesen Zweck ist aus der aus einem blutdrucksenkenden Arzneimittel, einem ACE-Hemmer, einem Endothelin-Rezeptorantagonisten und einem thrombolytischen Mittel bestehenden Gruppe ausgewählt. Wenn ein thrombolyti sches Mittel verabreicht wird, wird das PRO-Polypeptid vorzugsweise nach Verabreichung eines solchen Mittels verabreicht. Noch bevorzugter ist das thrombolytische Mittel ein rekombinanter menschlicher Gewebsplasminogenaktivator.
In einem anderen bevorzugten Aspekt handelt es sich bei der kardiovaskulären, endothelialen oder angiogenen Erkrankung um Herzhypertrophie, und das PRO-Polypeptid wird nach primärer Angioplastie zur Behandlung von akutem Myokardinfarkt verabreicht, vorzugsweise worin das Säugetier weiter Angioplastie oder einem kardiovaskulären, endothelialen oder angiogenen Mittel ausgesetzt wird.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist die kardiovaskuläre, endotheliale oder angiogene Erkrankung eine Krebsart, und das PRO-Polypeptid wird in Kombination mit einem chemotherapeutischem Mittel, einem wachstumshemmenden Mittel oder einem zytotoxischen Mittel verabreicht.
In einer weiteren Ausführungsform, wie in den Ansprüchen definiert, betrifft die Erfindung Mittel zur Behandlung einer kardiovaskulären, endothelialen oder angiogenen Erkrankung bei einem Säugetier durch Verabreichen einer wirksamen Menge eines Agonisten eines PRO-Polypetpids an das Säugetier. Vorzugsweise ist die kardiovaskuläre, endotheliale oder angiogene Erkrankung Herzhypertrophie, Trauma, eine Form von Krebs oder eine altersbedingte Makuladegeneration. Ebenso wird es bevorzugt, wenn das Säugetier ein Mensch ist und wenn eine wirksame Menge eines angiogenen oder angiostatischen Mittels zusammen mit dem Agonisten verabreicht wird.
In dieser Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Behandlung einer kardiovaskulären, endothelialen oder angiogenen Erkrankung bei einem Säugetier, umfassend die Verabreichung einer wirksamen Menge eines Anti-PRO-Antikörpers an das Säugetier. Vorzugsweise ist die kardiovaskuläre, endotheliale oder angiogene Erkrankung Herzhypertrophie, Trauma, eine Form von Krebs oder altersbedingte Makuladegeneration. Ebenso wird es bevorzugt, wenn das Säugetier ein Mensch ist und wenn eine wirksame Menge eines angiogenen oder angiostatischen Mittels zusammen mit dem Antikörper verabreicht wird.
In noch weiteren Ausführungsformen, wie in den Ansprüchen definiert, stellt die Erfindung Mittel zur Behandlung einer kardiovaskulären, endothelialen oder angiogenen Erkrankung bei einem Säugetier bereit, das unter dieser leidet, und zwar durch Verabreichung eines Nucleinsäuremoleküls an das Säugetier, das für ein PRO-Polypeptid kodiert. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Säugetier ein Mensch. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird das Gen durch eine Ex-vivo-Gentherapie verabreicht. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das Gen innerhalb eines Vektors enthalten, noch bevorzugter in einem adenoviralen, adenoassoziierten viralen, lentiviralen oder retroviralen Vektor.
In noch einem weiteren Aspekt, wie in den Ansprüchen definiert, stellt die Erfindung ein rekombinantes retrovirales Partikel bereit, umfassend einen retroviralen Vektor, der im Wesentlichen aus einem Promotor, einer Nucleinsäure, die für ein PRO-Polypeptid kodiert, und einer Signalsequenz für die zelluläre Sekretion des Polypeptids besteht, worin der retrovirale Vektor sich in Assoziation mit retroviralen Strukturproteinen befindet. Bevorzugterweise stammt die Signalsequenz von einem Säugetier, wie z. B. von einem nativen PRO-Polypeptid.
In noch einer weiteren Ausführungsform, wie in den Ansprüchen definiert, stellt die Erfindung eine Ex-vivo-Produktionszelle bereit, umfassend ein Nucleinsäurekonstrukt, das retrovirale Strukturproteine exprimiert und auch einen retroviralen Vektor umfasst, der im Wesentlichen aus einem Promotor, einer Nucleinsäure, die für ein PRO-Polypeptid kodiert, und einer Signalsequenz für die zelluläre Sekretion des Polypeptids besteht, worin die Produktionszelle den retroviralen Vektor in Assoziation mit den Strukturproteinen verpackt, um rekombinante retrovirale Partikel zu produzieren.
In noch einer weiteren Ausführungsform, wie in den Ansprüchen definiert, stellt die Erfindung Mittel zum Inhibieren des endothelialen Zellwachstums bei einem Säuge tier bereit, und zwar durch Verabreichung eines PRO1002-Polypeptids oder eines Agonisten davon an das Säugetier, worin das endotheliale Zellwachstum bei diesem Säugetier inhibiert wird.
In noch einer weiteren Ausführungsform, wie in den Ansprüchen definiert, stellt die Erfindung Mittel zum Inhibieren der Angiogenese bei einem Säugetier bereit, und zwar durch Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge an PRO198-, PRO877-, PRO1002- oder PRO1304-Polypeptid an das Säugetier, worin die Angiogenese inhibiert wird.
B. Zusätzliche Ausführungsformen
In anderen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung stellt die Erfindung, wie in den Ansprüchen definiert, ein isoliertes Nucleinsäuremolekül bereit, umfassend eine Nucleotidsequenz, die für ein PRO-Polypeptid kodiert.
In einem Aspekt umfasst das isolierte Nucleinsäuremolekül eine Nucleotidsequenz mit zumindest etwa 80% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 81% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 82% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 83% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 84% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 85% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 86% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 87% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 88% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 89% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 90% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 91% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 92% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 93% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 94% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 95% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 96% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 97% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 98% Nucleinsäuresequenzidentität und alternativ dazu zumindest etwa 99% Nucleinsäuresequenzidentität, mit (a) einem DNA-Molekül, das für ein PRO-Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz voller Länge, wie hierin offenbart, eine Aminosäuresequenz, der das Signalpeptid fehlt, wie hierin offenbart, eine extrazelluläre Domäne eines Transmembranproteins, mit oder ohne Signalpeptid, wie hierin offenbart, oder ein beliebiges anderes spezifisch definiertes Fragment der Aminosäuresequenz voller Länge, wie hierin offenbart, kodiert, oder (b) dem Komplement des DNA-Moleküls aus (a).
In anderen Aspekten umfasst das isolierte Nucleinsäuremolekül eine Nucleotidsequenz mit zumindest etwa 80% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 81% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 82% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 83% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 84% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 85% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 86% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 87% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 88% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 89% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 90% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 91% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 92% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 93% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 94% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 95% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 96% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 97% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 98% Nucleinsäuresequenzidentität und alternativ dazu zumindest etwa 99% Nucleinsäuresequenzidentität, mit (a) einem DNA-Molekül, umfassend die kodierende Sequenz einer PRO-Polypeptid-cDNA voller Länge, wie hierin offenbart, der kodierenden Sequenz eines PRO-Polypeptids, dem das Signalpeptid fehlt, wie hierin offenbart, der kodierenden Sequenz einer extrazellulären Domäne eines Transmembran-PRO-Polypeptids, mit oder ohne Signalpeptid, wie hierin offenbart, oder der kodierenden Sequenz eines beliebigen anderen spezifisch definierten Fragments der Aminosäuresequenz voller Länge, wie hierin offenbart, oder (b) dem Komplement des DNA-Moleküls aus (a).
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein isoliertes Nucleinsäuremolekül, umfassend eine Nucleotidsequenz mit zumindest etwa 80% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 81% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 82% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 83% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 84% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 85% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 86% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 87% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 88% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 89% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 90% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 91% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 92% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 93% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 94% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 95% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 96% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 97% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 98% Nucleinsäuresequenzidentität und alternativ dazu zumindest etwa 99% Nucleinsäuresequenzidentität, mit (a) einem DNA-Molekül, das für dasselbe reife Polypeptid kodiert, für das eine beliebige der menschlichen Protein-cDNAs kodiert, die bei der ATCC hinterlegt sind, wie hierin offenbart, oder (b) dem Komplement des DNA-Moleküls aus (a).
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt ein isoliertes Nucleinsäuremolekül bereit, umfassend eine Nucleotidsequenz, die für ein PRO-Polypeptid kodiert, das entweder Transmembrandomänen-deletiert oder Transmembrandomäneninaktiviert ist, oder komplementär zu solch einer kodierenden Nucleotidsequenz ist, worin die Transmembrandomäne(n) dieses Polypeptids hierin offenbart ist/sind. Daher werden lösliche extrazelluläre Domänen des hierin beschriebenen PRO-Polypeptids in Betracht gezogen.
In einem bestimmten Aspekt, wie in den Ansprüchen definiert, betrifft die Erfindung ein isoliertes PRO-Polypeptid, umfassend eine Aminosäuresequenz mit zumindest etwa 80% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 81% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 82% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 83% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 84% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 85% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 86% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 87% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 88% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 89% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 90% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 91% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 92% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 93% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 94% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 95% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 96% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 97% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 98% Aminosäuresequenzidentität und alternativ dazu zumindest etwa 99% Aminosäuresequenzidentität, mit einem PRO-Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz voller Länge, wie hierin offenbart, einer Aminosäuresequenz, der das Signalpeptid fehlt, wie hierin offenbart, einer extrazellulären Domäne eines Transmembranproteins, mit oder ohne Signalpeptid, wie hierin offenbart, oder einem beliebigen anderen spezifisch definierten Fragment der Aminosäuresequenz voller Länge, wie hierin offenbart.
In einem weiteren Aspekt, wie in den Ansprüchen definiert, betrifft die Erfindung ein isoliertes PRO-Polypeptid, umfassend eine Aminosäuresequenz mit zumindest etwa 80% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 81% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 82% Aminosäuresequenzidentitat, alternativ dazu zumindest etwa 83% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 84% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 85% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 86% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 87% Aminosäuresequenz identität, alternativ dazu zumindest etwa 88% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 89% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 90% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 91% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 92% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 93% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 94% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 95% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 96% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 97% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 98% Aminosäuresequenzidentität und alternativ dazu zumindest etwa 99% Aminosäuresequenzidentität, mit einer Aminosäuresequenz, für die eine beliebige der menschlichen Protein-cDNAs kodiert, die bei der ATCC hinterlegt sind, wie hierin offenbart.
In einem spezifischen Aspekt, wie in den Ansprüchen definiert, stellt die Erfindung ein isoliertes PRO-Polypeptid ohne die N-terminale Signalsequenz und/oder das initiierende Methionin bereit und wird von einer Nucleotidsequenz kodiert, die für solch eine Aminosäuresequenz kodiert, wie hierin zuvor beschrieben. Es werden auch Verfahren zur Produktion desselben hierin beschrieben, worin diese Verfahren das Züchten einer Wirtszelle, umfassend einen Vektor, der das geeignete kodierende Nucleinsäuremolekül umfasst, und zwar unter Bedingungen, die für die Expression des PRO-Polypeptids geeignet sind, sowie das Gewinnen des PRO-Polyepeptids aus der Zellkultur umfassen.
In einem anderen Aspekt der Erfindung, wie in den Ansprüchen definiert, wird ein isoliertes PRO-Polypeptid bereitgestellt, das entweder Transmembrandomänen-deletiert oder Transmembrandomänen-inaktiviert ist. Verfahren zur Produktion desselben werden hierin ebenfalls beschrieben, worin diese Verfahren das Züchten einer Wirtszelle, umfassend einen Vektor, der das geeignete kodierende Nucleinsäuremolekül umfasst, und zwar unter Bedingungen, die für die Expression des PRO-Polypeptids geeignet sind, sowie das Gewinnen des PRO-Polyepeptids aus der Zellkultur umfassen.
In einer anderen Ausführungsform, wie in den Ansprüchen definiert, betrifft die Erfindung Agonisten eines nativen PRO-Polypeptids, wie hierin definiert, das ein Anti-PRO-Antikörper ist.
In einer anderen Ausführungsform, wie in den Ansprüchen definiert, betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Identifikation von Antagonisten für ein PRO-Polypeptid, umfassend das Kontaktieren des PRO-Polypeptids mit einem Kandidatenmolekül sowie das Beobachten einer biologischen Aktivität, die durch das PRO-Polypeptid vermittelt wird. Vorzugsweise ist das PRO-Polypeptid ein natives PRO-Polypeptid.
In noch einer weiteren Ausführungsform, wie in den Ansprüchen definiert, betrifft die Erfindung eine Zusammensetzung an Material, umfassend ein PRO-Polypeptid oder einen Agonisten eines PRO-Polypeptids, wie hierin beschrieben, in Kombination mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger.
Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, wie in den Ansprüchen definiert, zielt auf die Verwendung eines PRO-Polypeptids oder eines Agonisten davon, wie hierin zuvor beschrieben, ab, und zwar für die Herstellung eines Medikaments, das für die Behandlung eines Zustands von Nutzen ist, der auf das PRO-Polypeptid oder einen Agonisten davon reagiert.
In zusätzlichen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, wie in den Ansprüchen definiert, stellt die Erfindung Vektoren bereit, umfassend DNA, die für beliebige der hierin beschriebenen Polypeptide kodiert. Wirtszellen, die für einen beliebigen solchen Vektor kodieren, werden ebenfalls bereitgestellt. Als Beispiel können die Wirtszellen z. B. CHO-Zellen, E.-coli-Zellen, Hefe-Zellen oder Baculovirus-infizierte Insekten-Zellen sein. Ein Verfahren zur Produktion beliebiger der hierin beschriebenen Polypeptide wird weiters bereitgestellt und umfasst das Züchten der Wirtszellen unter Bedingungen, die für die Expression des gewünschten Polypeptids geeignet sind, sowie das Gewinnen des gewünschten Polypeptids aus der Zellkultur.
In wiederum einer anderen Ausführungsform, wie in den Ansprüchen definiert, stellt die Erfindung einen Antikörper bereit, der spezifisch an beliebige der oben oder unten stehenden Polypeptide bindet. Gegebenenfalls handelt es sich bei dem Antikörper um einen monoklonalen Antikörper, einen humanisierten Antikörper, ein Antikörperfragment oder einen Einzelketten-Antikörper.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
1 zeigt eine Nucleotidsequenz (Seq.-ID Nr. 1) einer Nativsequenz-PRO1002-cDNA, worin Seq.-ID Nr. 1 ein Klon ist, der hierin als „DNA59208-1373" bezeichnet wird.
2 zeigt die Aminosäuresequenz (Seq-ID Nr. 2), die von der kodierenden Sequenz aus Seq.-ID Nr. 1 abstammt, dargestellt in 1.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
I. Definitionen
Die Ausdrücke „kardiovaskuläre, endotheliale und angiogene Erkrankung", „kardiovaskuläre, endotheliale und angiogene Dysfunktion", „kardiovaskuläre, endotheliale oder angiogene Erkrankung" und „kardiovaskuläre, endotheliale oder angiogene Dysfunktion" werden austauschbar verwendet und beziehen sich teilweise auf systemische Erkrankungen, die Gefäße betreffen, wie z. B. Diabetes mellitus, sowie Erkrankungen der Gefäße selbst, wie z. B. der Arterien, Kapillaren, Venen und/oder Lymphgefäße. Dies umfasst Anzeichen, die Angiogenese und/oder Kardiovaskularisierung stimulieren, und jene, die Angiogenese und/oder Kardiovaskularisierung hemmen. Solche Erkrankungen umfassen z. B. arterielle Erkrankungen, wie z. B. Atheroskierose, Hypertonie, entzündliche Vaskulitiden, Reynaud-Erkrankung und Reynaud-Phänomen, Aneurysmen und arterielle Restenose; venöse und lymphatische Erkrankungen, wie z. B. Thrombophiebitis, Lymphangitis und Lymphödem, und andere Gefäßerkrankungen, wie z. B. periphere Gefäßerkrankung, Krebs, wie z. B. Gefäßtumo ren, z. B. Hämangiom (kapillar und kavernös), Glomustumoren, Teleangiektasien, bazilläre Angiomatose, Hämangioendotheliom, Angiosarkom, Hämangiopericytom, Kaposi-Sarkom, Lymphangiom, und Lymphangiosarkom, Tumorangiogenese, Traumata, wie z. B. Wunden, Verbrennungen und anderes verletztes Gewebe, Transplantatfixierung, Vernarbung, Ischämie-Reperfusions-Verletzung, rheumatoide Arthritis, zerebrovaskuläre Erkrankung, Nierenerkrankung, wie z. B. akute Niereninsuffizienz, und Osteoporose. Dies umfasst auch Angina, Myokardinfarkte, wie z. B. akute Myokardinfarkte, Herzhypertrophie und Herzinsuffizienz, wie z. B. CHF.
„Hypertrophie" wird wie hierin verwendet als Anstieg der Masse eines Organs oder einer Struktur unabhängig von natürlichem Wachstum definiert, das keine Tumorbildung umfasst. Hypertrophie eines Organs oder Gewebes ist entweder auf einen Anstieg der Masse der individuellen Zellen (wahre Hypertrophie) oder einen Anstieg der Zahl der Zellen zurückzuführen, die das Gewebe ausmachen (Hyperplasie), oder beides. Bestimmte Organe, wie z. B. das Herz, verlieren kurz nach der Geburt ihre Fähigkeit, sich zu teilen. Dementsprechend wird „Herzhypertrophie" als Anstieg der Herzmasse definiert, die bei Erwachsenen durch einen Anstieg der Myozytenzellgröße und des kontraktilen Proteingehalts ohne gleichzeitige Zellteilung gekennzeichnet ist. Der Charakter der Belastung, die für das Stimulieren der Hypertrophie verantwortlich ist (z. B. erhöhte Vorbeladung, erhöhte Nachbeladung, Verlust an Myozyten, wie bei Myokardinfarkt, oder primäre Depression von Kontraktilität), scheint eine wichtige Rolle in der Bestimmung des Wesens der Reaktion zu spielen. Das frühe Stadium der Herzhypertrophie ist üblicherweise morphologisch durch Anstiege der Größe der Myofibrillen und Mitochondrien gekennzeichnet sowie durch eine Vergrößerung der Mitochondrien und Nuklei. In diesem Stadium, während die Muskelzellen größer als normal sind, ist die Zellorganisation großteils konserviert. In einem fortgeschritteneren Stadium von Herzhypertrophie gibt es einen vorteilhaften Anstieg der Größe oder Zahl von spezifischen Organellen, wie z. B. Mitochondrien, und neue kontraktile Elemente werden in lokalisierten Bereichen der Zellen auf unregelmäßige Art und Weise hinzugefügt. Zellen, die einer lang anhaltenden Hypertrophie unterworfen werden, zeigen offensichtlichere Unterbrechungen der Zellorganisation, einschließlich deutlich markierter vergrößerter Nuklei mit höchst feingelappten Membranen, die angrenzende Myofibrillen ersetzen und einen Zusammenbruch von normaler Z-Bandenregistrierung verursachen. Der Ausdruck „Herzhypertrophie" wird dazu verwendet, alle Stadien des Fortschreitens dieses Leidens zu umfassen, das durch verschiedene Grade an strukturellem Schaden des Herzmuskels gekennzeichnet ist, unabhängig von der zugrunde liegenden Herzerkrankung. Daher umfasst der Begriff auch physiologische Leiden, die zur Entwicklung von Herzhypertrophie beitragen, wie z. B. erhöhter Blutdruck, Aortenstenose oder Myokardinfarkt.
„Herzinsuffizienz" bezeichnet eine Anomalie von Herzfunktion, wo das Herz kein Blut in der nötigen Geschwindigkeit für die Anforderungen von metabolisierenden Geweben pumpt. Die Herzinsuffizienz kann durch eine Reihe von Faktoren verursacht sein, einschließlich ischämischer, angeborener, rheumatischer oder idiopathischer Formen.
„Kongestive Herzinsuffizienz" (CHF) ist ein progressiver pathologischer Zustand, wo das Herz zunehmend nicht in der Lage ist, adäquate Herzleistung bereitzustellen (das Blutvolumen, das vom Herz über einen gewissen Zeitraum ausgepumpt wird), um das sauerstoffangereicherte Blut in periphere Gewebe zu transportieren. Mit Fortschreiten von CHF treten strukturelle und hämodynamische Schäden auf. Während diese Schäden sich durch eine Reihe an Symptomen äußern können, ist ein charakteristisches Symptom ventrikuläre Hypertrophie. CHF ist ein übliches Endergebnis einer Reihe von verschiedenen Herzerkrankungen.
„Myokardinfarkt" resultiert im Allgemeinen aus Arteriosklerose der Koronararterien, oft mit überlagernder Koronarthrombose. Dieser kann in zwei Hauptformen unterteilt sein: transmurale Infarkte, bei welchen Myokardnekrose die gesamte Dicke der Gefäßwand umfasst, und subendokardiale (nicht-transmurale) Infarkte, bei welchen die Nekrose das Subendokard, das intramurale Myokard oder beide umfasst, ohne sich vollständig durch die Ventrikelwand zum Epikard zu erstrecken. Myokardinfarkt soll sowohl eine Veränderung der hämodynamischen Wirkungen als auch eine Änderung der Struktur in beschädigten und gesunden Bereichen des Herzens verursachen. Daher reduziert Myokardinfarkt zum Beispiel die maximale Herzleistung und das Herzschlagvolumen. Mit dem Myokardinfarkt ist auch eine Stimulation der DNA-Synthese verbunden, die im Zwischenraum auftritt, sowie ein Anstieg der Bildung von Collagen in den nicht betroffen Bereichen des Herzens.
Als Folge der erhöhten Belastung oder Beanspruchung, die das Herz bei lang andauernder Hypertonie belastet, zum Beispiel aufgrund der erhöhten Gesamtperipherresistenz, ist Herzhypertrophie lange mit „Hypertonie" assoziiert worden. Eine Eigenschaft des Ventrikels, das als Folge von chronischer Drucküberladung hypertrophisch wird, ist eine gestörte diastolische Leistung. Fouad et al., J. Am. Coll. Cardiol. 4, 1500–1506 (1984), Smith et al., J. Am. Coll. Cardiol. 5, 869–874 (1985). Eine lang andauernde Entspannung des linken Ventrikels ist bei früher wesentlicher Hypertonie detektiert worden, trotz normaler oder supranormaler systolischer Funktion. Hartford et al., Hypertension 6, 329–338 (1984). Jedoch gibt es keine engen Parallelen zwischen Blutdruckspiegeln und Herzhypertrophie. Obwohl von einer Verbesserung der Funktion des linken Ventrikels als Reaktion auf Therapie mit Antihypertensiva beim Menschen berichtet worden ist, haben Patienten, die mehrfach mit einem Diuretikum (Hydrochlorthiazid), einem β-Blocker (Propranolol) oder einem Kalziumkanalblocker (Diltiazem) behandelt wurden, Umkehr der Hypertrophie des linken Ventrikels gezeigt, ohne Verbesserung der diastolischen Funktion. Inouye et al., Am. J. Cardiol. 53, 1583–7 (1984).
Eine andere komplexe Herzerkrankung, die mit Herzhypertrophie assoziiert ist, ist „hypertrophische Kardiomyopathie". Dieses Leiden ist durch eine große Vielfalt an morphologischen, funktionellen und klinischen Eigenschaften gekennzeichnet [Maron et al., N. Engl. J. Med. 316, 780–789 (1987), Spirito et al., N. Engl. J. Med. 320, 749–755 (1989), Louie and Edwards, Prog. Cardiovasc. Dis. 36, 275–308 (1994), Wigle et al., Circulation 92, 1680–1692 (1995)], die Heterogenität davon wird durch die Tatsache hervorgehoben, dass sie Patienten in allen Altersgruppen betrifft. Spirito et al., N. Engl. J. Med. 336, 775–785 (1997). Die verursachenden Faktoren von hypertrophischer Kardiomyopathie sind ebenfalls vielfältig und kaum verstanden. Im Allgemeinen sind Mutationen in Genen, die für Sarkomer-Proteine kodieren, mit hypertrophi scher Kardiomyopathie assoziiert. Jüngste Daten lassen vermuten, dass β-Myosin-Schwerkettenmutationen etwa 30 bis 40 Prozent der Fälle familiärer hypertrophischer Kardiomyopathie ausmachen können. Watkins et al., N. Engl. J. Med. 326, 1108–1114 (1992), Schwartz et al., Circulation 91, 532–540 (1995), Marian und Roberts, Circulation 92, 1336–1347 (1995), Thierfelder et al., Cell 77, 701–712 (1994), Watkins et al., Nat. Gen. 11, 434–437 (1995). Neben β-Myosin-Schwerkette umfassen andere Stellen genetischer Mutationen Herz-Troponin-T, Alpha-Topomyosin, Herz-Myosin-Bindungsprotein-C, essentielle Myosinleichtkette und regulierende Myosinleichtkette. Siehe Malik und Watkins, Curr. Opin. Cardiol. 12, 295–302 (1997).
Supravalvuläre „Aortenstenose" ist eine erbliche Gefäßerkrankung, die durch Verengung der Aorta ascendens gekennzeichnet ist, aber andere Arterien, einschließlich Lungenarterien, können ebenfalls betroffen sein. Unbehandelte Aortenstenose kann zu erhöhtem intrakardialem Druck führen, der zu Myokardhypertrophie und letztlich zu Herzinsuffizienz und Tod führt. Die Pathogenese dieser Erkrankung ist nicht völlig verstanden, aber Hypertrophie und mögliche Hyperplasie von medialer glatter Muskulatur sind vorherrschende Eigenschaften dieser Erkrankung. Es ist berichtet worden, dass Molekülvarianten des Elastingens in die Entwicklung und Pathogenese von Aortenstenose involviert sind. US-Patent Nr. 5.650.282 , ausgegeben am 22. Juli 1997.
„Klappenregurgitation" tritt als Folge von Herzerkrankungen auf, die zu Störungen der Herzklappen führen. Verschiedene Erkrankungen, wie rheumatisches Fieber, können das Schrumpfen oder Wegziehen des Klappenorificiums verursachen, während andere Erkrankungen zu Endokarditis, einer Entzündung des Endokards oder der umgebenden Membran der atrioventrikulären Orifizien und Operation des Herzens führen können. Defekte wie die Verengung der Klappenstenose oder der defekte Verschluss der Klappe führen zu einer Akkumulation von Blut in der Herzhöhle oder Regurgitation von Blut aus der Klappe. Wenn dies nicht korrigiert wird, kann andauernde Klappenstenose oder Insuffizienz zu Herzhypertrophie und assoziiertem Schaden am Herzmuskel führen, was letztlich das Ersetzen der Klappe erforderlich machen kann.
Die Behandlung all dieser und anderer kardiovaskulärer, endothelialer und angiogener Erkrankungen, die von Herzhypertrophie begleitet sein können oder nicht, ist in der vorliegenden Erfindung enthalten.
Die Begriffe „Krebs", „kanzerös" und „bösartig" beziehen sich auf oder beschreiben das physiologische Leiden bei Säugetieren, das typischerweise durch nicht-reguliertes Zellwachstum gekennzeichnet ist. Beispiele für Krebs umfassen unter anderem, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, Karzinom, einschließlich Adenokarzinom, Lymphom, Blastom, Melanom, Sarkom und Leukämie. Noch speziellere Beispiele für solche Krebsformen umfassen Plattenepithelkarzinom, kleinzelligen Lungenkrebs, nicht-kleinzelligen Lungenkrebs, Gastrointestinalkrebs, Hodgkin- und Non-Hodgkin-Lymphom, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Glioblastom, Cervixkrebs, Ovarialkrebs, Leberkrebs, wie beispielsweise hepatisches Karzinom und Hepatom, Blasenkrebs, Brustkrebs, Kolonkrebs, Kolorektalkrebs, Endometriumkarzinom, Speicheldrüsenkarzinom, Nierenkrebs, wie z. B. Nierenzellenkarzinom und Wilms-Tumoren, Basalzellkarzinom, Melanom, Prostatakrebs, Vulvakarzinom, Schilddrüsenkarzinom, Hodenkrebs, Speiseröhrenkrebs und verschiedene Formen von Kopf- und Nackenkrebs. Die bevorzugten Krebsarten zur hierin beschriebenen Behandlung sind Brust-, Colon-, Lungen-, Melanom-, Ovarial- und andere Tumoren, einschließlich der oben angeführten Gefäßtumoren.
Der Begriff „zytotoxisches Mittel" wie hierin verwendet bezeichnet eine Substanz, welche die Funktion von Zellen hemmt oder vermeidet und/oder Zellzerstörung verursacht. Der Begriff soll radioaktive Isotope (z. B. ¹³¹I ¹²⁵I ⁹⁰Y und ¹⁸⁶Re), chemotherapeutische Mittel und Toxine, wie z. B. enzymatisch aktive Toxine von bakteriellem, Pilz-, pflanzlichem oder tierischem Ursprung oder Fragmente davon umfassen.
Ein „chemotherapeutisches Mittel" ist eine chemische Verbindung, die in der Behandlung von Krebs nützlich ist. Beispiele für solche chemotherapeutische Mittel umfas sen Alkylierungsmittel, Folsäureantagonisten, Antimetabolite von Nucleinsäuremetabolismus, Antibiotika, Pyrimidinanaloga, 5-Fluoruracil, Cisplatin, Purinnucleoside, Amine, Aminosäuren, Triazolnucleoside oder Corticosteroide. Spezifische Beispiele umfassen Adriamycin, Doxorubicin, 5-Fluoruracil, Cytosinarabinosid („Ara-C"), Cyclophosphamid, Thiotepa, Busulfan, Cytoxin, Taxol, Toxoter, Methotrexat, Cisplatin, Melphalan, Vinblastin, Bleomycin, Etoposid, Ifosfamid, Mitomycin-C, Mitoxantron, Vincristin, Vinorelbin, Carboplatin, Teniposid, Daunomycin, Carminomycin, Aminopterin, Dactinomycin, Mitomycine, Esperamicine (siehe US-Patent Nr. 4.675.187 ), Melphalan und andere verwandte Stickstoff-Lostverbindungen. Es sind in dieser Definition auch hormonelle Mittel enthalten, die wirken, um Hormonwirkung auf Tumoren zu regulieren oder zu hemmen, wie z. B. Tamoxifen und Onapriston.
Ein „wachstumshemmendes Mittel" bezeichnet, wie hierin verwendet, eine Verbindung oder Zusammensetzung, die das Wachstum einer Zelle, wie z. B. einer Wnt-überexprimierenden Krebszelle, entweder in vitro oder in vivo hemmt. Daher ist das wachstumshemmende Mittel eines, das den Prozentsatz von malignen Zellen in 5-Phase signifikant reduziert. Beispiele für wachstumshemmende Mittel umfassen Mittel, die die Zellzyklusprogression (an einer anderen Stelle als die S-Phase) blockieren, wie z. B. Mittel, die G1-Arretierungen und M-Phasen-Arretierung induzieren. Klassische M-Phasenblocker umfassen die Vincas (Vincristin und Vinblastin), Taxol und Topo-II-Inhibitoren, wie z. B. Doxorubicin, Daunorubicin, Etoposid und Bleomycin. Diese Mittel, die G1 arretieren, laufen auch in die S-Phasenarretierung über, z. B. DNA-Alkylierungsmittel, wie z. B. Tamoxifen, Prednison, Dacarbazin, Mechlorethamin, Cisplatin, Methotrexat, 5-Fluoruracil und Ara-C. Weitere Information ist in The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn und Israel, Hrsg., Kapitel 1, genannt „Cell cyle regulation, oncogenes and antineoplastic drugs", von Murakami et al. (WB Saunders, Philadelphia (1995)), insbesondere S. 13, zu finden. Weitere Beispiele umfassen Tumornekrosefaktor (TNF), einen Antikörper, der in der Lage ist, die angiogene Aktivität von saurem oder basischem FGF oder Hepatozytenwachstumsfaktor (HGF) zu hemmen oder zu neutralisieren, einen Antikörper, der in der Lage ist, die koagulierenden Aktivitäten des Gewebefaktors, Protein C oder Protein S (siehe WO 91/01753 , veröffentlicht am 21. Februar 1991) zu hemmen oder zu neutralisieren, oder einen Antikörper, der in der Lage ist, sich an den HER2-Rezeptor zu binden ( WO 89/06692 ), wie z. B. der 4D5-Antikörper (und funktionelle Äquivalente davon) (z. B. WO 92/22653 ).
„Behandlung" ist eine Intervention, die mit der Absicht durchgeführt wird, die Pathologie einer kardiovaskulären, endothelialen oder angiogenen Erkrankung zu ändern oder deren Entwicklung zu vermeiden. Der Begriff der Behandlung wird im weitesten Sinn verwendet und umfasst insbesondere die Prävention (Prophylaxe), Linderung, Reduktion und Heilung von kardiovaskulären, endothelialen und angiogenen Erkrankungen in jedem Stadium. Demgemäß bezieht sich „Behandlung" auf sowohl therapeutische Behandlung und prophylaktische oder präventive Maßnahmen, worin das Ziel ist, eine kardiovaskuläre, endotheliale und angiogene Erkrankung, wie z. B. Hypertrophie, zu verhindern oder zu verlangsamen (zu lindern). Jene, die eine Behandlung benötigen, umfassen jene, die schon eine Erkrankung aufweisen, sowie jene, die für diese Erkrankung anfällig sind, oder jene, bei welchen die Erkrankung vermieden werden soll. Die Erkrankung kann aus einer beliebigen Ursache resultieren, einschließlich idiopathischer, kardiotropher oder myotropher Ursachen oder Ischämie oder ischämischer Angriffe, wie z. B. Myokardinfarkt.
„Chronische" Verabreichung bezeichnet Verabreichung von Mittel(n) in einer kontinuierlichen Weise im Vergleich zum akuten Modus, um die anfängliche Wirkung, wie z. B. eine antihypertrophische Wirkung, über einen längeren Zeitraum aufrechtzuerhalten.
„Säugetier" für Behandlungszwecke bezeichnet ein beliebiges Tier, das als Säugetier klassifiziert wird, einschließlich Menschen, Haus- und Nutztiere und Zoo-, Sport- oder Haustiere, wie z. B. Hunde, Pferde, Katzen, Kühe, Schafe, Schweine etc. Vorzugsweise ist das Säugetier ein Mensch.
Verabreichung „in Kombination mit" einem oder mehreren weiteren therapeutischen Mitteln umfasst die gleichzeitige (simultane) und konsekutive Verabreichung in beliebiger Reihenfolge.
Der Begriff „kardiovaskuläres, endotheliales oder angiogenes Mittel" betrifft im Allgemeinen ein beliebiges Arzneimittel, das wirkt, um kardiovaskuläre, endotheliale oder angiogene Erkrankungen zu behandeln. Beispiele für kardiovaskuläre Mittel sind jene, die Gefäßhomöostase durch Modulation von Blutdruck, Herzrate, Herzkontraktilität und endotheliale und Glattmuskelbiologie fördern, wovon alle Faktoren eine Rolle in kardiovaskulärer Erkrankung spielen. Spezifische Beispiele dafür umfassen Angiotensin-II-Rezeptor-Antagonisten, Endothelin-Rezeptorantagonisten, wie z. B. BOSENTAN^TM und MOXONODIN^TM, Interferon-gamma (IFN-γ), des-Aspartat-Angiotensin-I, thrombolytische Mittel, z. B. Streptokinase, Urokinase, t-PA, und eine t-PA-Variante, die speziell entworfen ist, um eine längere Halbwertszeit und sehr hohe Fibrinspezifität aufzuweisen, TNK t-PA (eine T103N, N117Q, KHRR (296–299)AAAA t-PA-Variante, Keyt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 3670–3674 (1994)), inotrope oder hypertensive Mittel, wie z. B. Digoxigenin und β-adrenerge rezeptorblockierende Mittel, z. B. Propranolol, Timolol, Tertalol, Carteolol, Nadolol, Betaxolol, Penbutolol, Acetobutolol, Atenolol, Metoprolol, und Carvedilol, angiotensinkonvertierende Enzym-(ACE-)Inhibitoren, z. B. Quinapril, Captopril, Enalapril, Ramipril, Benazepril, Fosinopril und Lisinopril, Diuretika, z. B. Chlorthiazid, Hydrochlorthiazid, Hydroflumethazid, Methylchlorthiazid, Benzthiazid, Dichlorphenamid, Acetazolamid und Indapamid, und Kalziumkanalblocker, z. B. Diltiazem, Nifedipin, Verapamil, Nicardipin. Eine bevorzugte Kategorie für diesen Typ ist ein therapeutisches Mittel, das zur Behandlung von Herzhypertrophie oder einem physiologischen Leiden verwendet wird, das für die Entwicklung von Herzhypertrophie wesentlich ist, wie z. B. erhöhter Blutdruck, Aortenstenose oder Myokardinfarkt.
„Angiogene Mittel" und „endotheliale Mittel" sind aktive Mittel, die Angiogenese und/oder endotheliales Zellwachstum oder, wenn anwendbar, Vaskulogenese fördern. Dies umfasst Faktoren, die Wundheilung beschleunigen, wie z. B. Wachstumshormon, insulinähnlicher Wachstumsfaktor-I (IGF-I), VEGF, VIGF, PDGF, Epidermiswachstumsfaktor (EGF), CTGF und Elemente seiner Familie, FGF und TGF-α und TGF-β.
„Angiostatische Mittel” sind Wirkstoffe, die Angiogenese oder Vaskulogenese hemmen oder aber das Wachstum von Krebszellen auf andere Art und Weise hemmen oder verhindern. Beispiele umfassen Antikörper oder andere Antagonisten zu angiogenen Mitteln wie oben definiert, wie z. B. Antikörper zu VEGF. Sie umfassen außerdem cytotherapeutische Mittel, wie z. B. zytotoxische Mittel, chemotherapeutische Mittel, wachstumshemmende Mittel, apoptotische Mittel und andere Mittel zur Behandlung von Krebs, wie z. B. Anti-HER-2, Anti-CD20 und andere bioaktive und organische chemische Mittel.
In einem pharmakologischen Sinn im Kontext der vorliegenden Erfindung bezeichnet eine „therapeutisch wirksame Menge" eines aktiven Mittels, wie z. B. eines PRO-Polypeptids oder Agonisten oder Antagonisten dazu oder eines Anti-PRO-Antikörpers, eine Menge, die in der Behandlung einer kardiovaskulären, endothelialen oder angiogenen Erkrankung bei einem Säugetier wirksam ist und empirisch bestimmt werden kann.
Wie hierin verwendet, bezieht sich eine „wirksame Menge" eines aktiven Mittels, wie z. B. eines PRO-Polypeptids oder Agonisten oder Antagonisten dagegen oder eines Anti-PRO-Antikörpers, auf eine wirksame Menge für die Durchführung eines erklärten Ziels, worin diese Mengen für die gewünschte Wirkung empirisch bestimmt werden können.
Die Begriffe „PRO-Polypeptid" und „PRO" beziehen sich bei Verwendung hierin und, wenn sie unmittelbar von einer numerischen Bezeichnung gefolgt werden, auf verschiedene Polypeptide, worin sich die vollständige Bezeichnung (d. h. PRO/Nr.) auf spezifische Polypeptidsequenzen bezieht, wie hierin beschrieben. Die Begriffe „PRO/Nr.-Polypeptid" und „PRO/Nr.", worin der Begriff „Nr." als eine tatsächliche numerische Bezeichnung bereitgestellt wird, wie hierin verwendet, umfassen Nativsequenzpolypeptide und Polypeptidvarianten (die hierin näher definiert sind). Die hierin beschriebenen PRO-Polypeptide können aus einer Reihe an Quellen isoliert werden, z. B. aus menschlichen Gewebetypen oder aus einer anderen Quelle, oder sie können durch Rekombinations- oder Syntheseverfahren hergestellt werden.
Ein „Nativsequenz-PRO-Polypeptid" umfasst ein Polypeptid mit derselben Aminosäuresequenz wie das entsprechende PRO-Polypeptid, das aus der Natur stammt. Solche Nativsequenz-PRO-Polypeptide können aus der Natur isoliert werden oder durch rekombinante oder synthetische Mittel produziert werden. Der Begriff „Nativsequenz-PRO-Polypeptid" umfasst insbesondere natürlich auftretende trunkierte oder sekretierte Formen des spezifischen PRO-Polypeptids (z. B. eine extrazelluläre Domänensequenz), natürlich auftretende Variantenformen (z. B. alternativ gespleißte Formen) und natürlich auftretende Allelvarianten des Polypeptids. In verschiedenen Ausführungsformen der Erfindung sind die Nativsequenz-PRO-Polypeptide, die hierin offenbart sind, reife Nativsequenzpolypeptide oder Nativsequenzpolypeptide voller Länge, umfassend die Aminosäuresequenzen voller Länge, die in den begleitenden Figuren gezeigt werden. Start- und Stopcodons werden in den Figuren in fettgedruckter Schrift und unterstrichen dargestellt. Obgleich das PRO-Polypeptid, das in den begleitenden Zeichnungen offenbart ist, als mit Methioninresten beginnend gezeigt wird, hierin als Aminosäureposition 1 in den Fig. bezeichnet, ist es denkbar und möglich, dass andere Methioninreste, die sich entweder stromauf oder stromab von der Aminosäureposition 1 in den Fig. befinden, als Start-Aminosäurerest für die PRO-Polypeptide verwendet werden können.
Die „extrazelluläre Domäne" oder „ECD" des PRO-Polypeptids bezieht sich auf eine Form des PRO-Polypeptids, die im Wesentlichen frei von Transmembran- und cytoplasmatischen Domänen ist. Üblicherweise wird eine PRO-Polypeptid-ECD weniger als 1% solcher Transmembran- und/oder cytoplasmatischen Domänen aufweisen und vorzugsweise weniger als 0,5% solcher Domänen. Es versteht sich, dass eine beliebige Transmembrandomäne, die für die PRO-Polypeptide der vorliegenden Erfindung identifiziert wurde, nach den Kriterien identifiziert wird, die routinemäßig im Fachgebiet verwendet werden, um die Form von hydrophober Domäne zu identifizieren. Die exakten Grenzen einer Transmembrandomäne können variieren, aber am wahrscheinlichsten um nicht mehr als etwa 5 Aminosäuren an beiden Enden der Domäne wie anfänglich identifiziert. Gegebenenfalls kann daher eine extrazelluläre Domäne eines PRO-Polypeptids von etwa 5 oder weniger Aminosäuren auf jeder Seite der Transmembrandomäne/extrazellulären Domänengrenze enthalten, wie in den Beispielen oder der Beschreibung identifiziert, und solche Polypeptide, mit oder ohne dem/das assoziierte(n) Signalpeptid, und die Nucleinsäure, die dafür kodiert, werden von der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen.
Die ungefähre Position der „Signalpeptide" der verschiedenen PRO-Polypeptide, die hierin offenbart sind, wird in der vorliegenden Beschreibung und/oder den begleitenden Figuren gezeigt. Es ist jedoch anzumerken, dass die C-terminale Grenze eines Signalpeptids variieren kann, jedoch mit größter Wahrscheinlichkeit um nicht mehr als etwa 5 Aminosäuren auf jeder Seite der C-terminalen Signalpeptid-Grenze, wie anfänglich hierin identifiziert, worin die C-terminale Grenze des Signalpeptids nach Kriterien identifiziert wird, die routinemäßig im Fachgebiet verwendet werden, um die Form von Aminosäuresequenz-Element zu identifizieren (z. B. Nielsen et al., Prot. Eng. 10, 1–6 (1997), und von Heinje et al., Nucl. Acids Res. 14, 4683–4690 (1986)). Weiters wird ebenfalls anerkannt, dass in manchen Fällen die Spaltung einer Signalsequenz von einem sekretierten Polypeptid nicht vollkommen einheitlich erfolgt, was zu mehr als einer sekretierten Spezies führt. Diese reifen Polypeptide, bei denen das Signalpeptid innerhalb von weniger als etwa 5 Aminosäuren auf jeder Seite der C-terminalen Grenze des Signalpeptids gespalten wird, wie hierin identifiziert, sowie die Polynucleotide, die für diese kodieren, werden von der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen.
„PRO-Polypeptid-Variante" bedeutet ein aktives PRO-Polypeptid, wie oben stehend oder unten stehend definiert, mit zumindest etwa 80% Aminosäuresequenzidentität mit einer Nativsequenz-PRO-Polypeptidsequenz voller Länge, wie hierin offenbart, einer PRO-Polypeptidsequenz, der das Signalpeptid fehlt, wie hierin offenbart, einer extrazellulären Domäne eines PRO-Polypeptids, mit oder ohne Signalpeptid, wie hierin offenbart, oder einem beliebigen anderen Fragment einer PRO-Polypeptidsequenz voller Länge, wie hierin offenbart. Solche PRO-Polypeptidvarianten umfassen z. B. PRO-Polypeptide, worin ein oder mehrere Aminosäurerest(e) am N- oder C-Terminus der Nativ-Aminosäuresequenz voller Länge hinzugefügt oder deletiert wird/werden. Normalerweise weist eine PRO-Polypeptidvariante zumindest etwa 80% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 81% Aminosäure sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 82% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 83% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 84% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 85% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 86% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 87% Aminosäuresequenzidentitat, alternativ dazu zumindest etwa 88% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 89% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 90% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 91% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 92% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 93% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 94% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 95% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 96% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 97% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 98% Aminosäuresequenzidentität und alternativ dazu zumindest etwa 99% Aminosäuresequenzidentität, mit einer Nativsequenz-PRO-Polypeptidsequenz voller Länge auf, wie hierin offenbart, einer PRO-Polypeptidsequenz, der das Signalpeptid fehlt, wie hierin offenbart, einer extrazellulären Domäne eines PRO-Polypeptids, mit oder ohne Signalpeptid, wie hierin offenbart, oder einem beliebigen anderen spezifisch definierten Fragment einer PRO-Polypeptidsequenz voller Länge, wie hierin offenbart. Normalerweise sind PRO-Polypeptidvarianten zumindest etwa 10 Aminosäuren lang, alternativ dazu zumindest etwa 20 Aminosäuren lang, alternativ dazu zumindest etwa 30 Aminosäuren lang, alternativ dazu zumindest etwa 40 Aminosäuren lang, alternativ dazu zumindest etwa 50 Aminosäuren lang, alternativ dazu zumindest etwa 60 Aminosäuren lang, alternativ dazu zumindest etwa 70 Aminosäuren lang, alternativ dazu zumindest etwa 80 Aminosäuren lang, alternativ dazu zumindest etwa 90 Aminosäuren lang, alternativ dazu zumindest etwa 100 Aminosäuren lang, alternativ dazu zumindest etwa 150 Aminosäuren lang, alternativ dazu zumindest etwa 200 Aminosäuren lang, alternativ dazu zumindest etwa 300 Aminosäuren lang oder mehr.
„Prozentuelle (%) Aminosäuresequenzidentität" hinsichtlich der hierin identifizierten PRO-Polypeptid-Sequenzen wird als Prozentsatz der Aminosäurereste in einer Kan didatensequenz definiert, die mit den Aminosäureresten in einer PRO-Sequenz identisch sind, nach Anordnung der Sequenzen und Einführung von Lücken, wenn notwendig, um die maximale prozentuelle Sequenzidentität zu erreichen, wobei beliebige konservative Substitutionen als Teil der Sequenzidentität nicht berücksichtigt werden. Anordnung zum Zwecke der Bestimmung von prozentueller Aminosäuresequenzidentität kann auf verschiedene Arten erreicht werden, die im Fachgebiet liegen, z. B. unter Verwendung öffentlich erhältlicher Computer-Software, wie z. B. BLAST-, BLAST-2-, ALIGN-, ALIGN-2- oder Megalign-(DNASTAR-)Software. Ein Fachmann kann geeignete Parameter zur Messung von Anordnung bestimmen, einschließlich Algorithmen, die notwendig sind, um maximale Anordnung über die verglichenen Volllängen-Sequenzen zu erreichen. Für hierin angeführte Zwecke werden prozentuelle Aminosäuresequenzidentitätswerte, wie unten stehend beschrieben, unter Verwendung des Sequenzvergleichscomputerprogramms ALIGN-2 erhalten, wobei der vollständige Quellcode für das ALIGN-2-Programm in Tabelle 1 bereitgestellt wird. Das ALIGN-2-Sequenz-Vergleichscomputerprogramm wurde von Genentech, Inc., geschrieben, und der in Tabelle 1 gezeigte Quellcode ist mit Benutzerdokumentation im US Copyright Office, Washington DC 20559, hinterlegt worden, registriert unter der US Copyright Registrierungs-Nr. TXU510087. Das ALIGN-2-Programm ist öffentlich über Genentech, Inc., South San Francisco, Kalifornien, erhältlich oder kann aus dem in Tabelle 1 bereitgestellten Quellcode kompiliert werden. Das ALIGN-2-Programm sollte zur Verwendung auf einem UNIX-Betriebssystem kompiliert werden, vorzugsweise digital UNIX V4.0D. Alle Sequenzvergleichsparameter sind vom ALIGN-2-Programm festgelegt und variieren nicht.
Für die hierin angeführten Zwecke wird der Prozentsatz (%) der Aminosäuresequenzidentität einer bestimmten Aminosäuresequenz A zu, mit oder gegen eine(r) bestimmte(n) Aminosäuresequenz B (was alternativ dazu als eine bestimmte Aminosäuresequenz A beschrieben werden kann, die einen gewissen Prozentsatz (%) der Aminosäuresequenzidentität zu, mit oder gegen eine(r) bestimmte(n) Aminosäuresequenz B aufweist oder umfasst) folgendermaßen berechnet:
100 mal der Bruch X/Y
worin X die Anzahl an Aminosäureresten ist, die als identische Übereinstimmungen durch das Sequenzanordnungs-Programm ALIGN-2 in der Anordnung dieses Programms von A und B bewertet werden, und worin Y die Gesamtanzahl der Aminosäurereste in B ist. Man weiß es zu schätzen, dass in Fällen, in denen die Länge der Aminosäuresequenz A nicht gleich der Länge der Aminosäuresequenz B ist, die %-Aminosäuresequenzidentität von A zu B nicht gleich der %-Aminosäuresequenzidentität von B zu A ist. Als Beispiel der Berechnungen der %-Aminosäuresequenzidentität zeigen die Tabellen 2A–2B, wie die %-Aminosäuresequenzidentität der als „Vergleichsprotein" bezeichneten Aminosäuresequenz zu der als „PRO" bezeichneten Aminosäuresequenz zu berechnen ist.
Falls nicht spezifisch anders angegeben, werden alle hierin verwendeten %-Aminosäuresequenzidentitäts-Werte wie oben stehend beschrieben unter Verwendung des ALIGN-2-Sequenzvergleichs-Computerprogramms erhalten. Die %-Aminosäuresequenzidentität kann jedoch auch unter Verwendung des Sequenzvergleichsprogramms NCBI-BLAST2 bestimmt werden (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25, 3389–3402 (1997)). Das NCBI-BLAST2-Sequenzvergleichsprogramm kann von der Seite http://www.ncbi.nlm.nih.gov heruntergeladen werden oder andernfalls vom National Institute of Health, Bethesda, MD, erhalten werden. NCBI-BLAST2 verwendet mehrere Suchparameter, worin alle dieser Suchparameter auf Standardwerte eingestellt sind, umfassend z. B. unmask = yes, strand = all, expected occurrences = 10, minimum low complexity length = 15/5, multipass e-value = 0,01, constant for multipass = 25, dropoff for final gapped alignment = 25 und scoring matrix = BLOSUM62.
In Situationen, in denen NCBI-BLAST2 für Aminosäuresequenz-Vergleiche verwendet wird, wird die %-Aminosäuresequenzidentität einer bestimmten Aminosäuresequenz A zu, mit oder gegen eine(r) bestimmte(n) Aminosäuresequenz B (was alternativ dazu als eine bestimmte Aminosäuresequenz A beschrieben werden kann, die einen gewissen Prozentsatz (%) der Aminosäuresequenzidentität zu, mit oder gegen eine(r) bestimmte(n) Aminosäuresequenz B aufweist oder umfasst) folgendermaßen berechnet:
100 mal der Bruch X/Y
worin X die Anzahl an Aminosäureresten ist, die als identische Übereinstimmungen durch das Sequenzanordnungs-Programm NCBI-BLAST2 in der Anordnung dieses Programms von A und B bewertet werden, und worin Y die Gesamtanzahl der Aminosäurereste in B ist. Man weiß es zu schätzen, dass in Fällen, in denen die Länge der Aminosäuresequenz A nicht gleich der Länge der Aminosäuresequenz B ist, die %-Aminosäuresequenzidentität von A zu B nicht gleich der %-Aminosäuresequenzidentität von B zu A ist.
Zusätzlich dazu kann die %-Aminosäuresequenzidentität auch unter Verwendung des WU-BLAST-2-Computerprogramms bestimmt werden (Altschul et al., Methods in Enzymology 266, 460–480 (1996)). Die meisten der WU-BLAST-2-Suchparameter sind auf die Standardwerte eingestellt. Jene, die nicht auf Standardwerte eingestellt sind, d. h. die anpassbaren Parameter, sind mit folgenden Werten eingestellt: overlap span = 1, overlap fraction = 0,125, Word threshold (T) = 11 und scoring matrix = BLOSUM62. Für die Zwecke hierin wird der %-Aminosäuresequenzidentitäts-Wert bestimmt, und zwar durch Teilen von (a) der Anzahl übereinstimmender identischer Aminosäurereste zwischen der Aminosäuresequenz des PRO-Polypeptids von Interesse mit einer Sequenz, die vom nativen PRO-Polypeptid abstammt, und der Vergleichs-Aminosäuresequenz von Interesse (d. h. die Sequenz, gegen die das PRO-Polypeptid von Interesse verglichen wird, die eine PRO-Polypeptidvariante sein kann), wie von WU-BLAST2 bestimmt, durch (b) die Gesamtanzahl der Aminosäurereste des PRO-Polypeptids von Interesse. Z. B. ist in der Aussage „ein Polypeptid, umfassend eine Aminosäuresequenz A, die zumindest 80% Aminosäuresequenzidentität mit der Aminosäuresequenz B aufweist", die Aminosäuresequenz A die Vergleichs-Aminosäuresequenz von Interesse und die Aminosäuresequenz B die Aminosäuresequenz des PRO-Polypeptids von Interesse.
„PRO-Polynucleotid-Variante" oder „PRO-Nucleinsäuresequenz-Variante" bedeutet ein Nucleinsäuremolekül, das für ein aktives PRO-Polypeptid kodiert, wie unten stehend definiert, und das zumindest etwa 80% Nucleinsäuresequenzidentität mit einer Nucleinsäuresequenz aufweist, die für eine Nativsequenz-PRO-Polypeptidsequenz voller Länge, wie hierin offenbart, eine Nativsequenz-PRO-Polypeptidsequenz voller Länge, der das Signalpeptid fehlt, wie hierin offenbart, eine extrazelluläre Domäne eines PRO-Polypeptids, mit oder ohne Signalpeptid, wie hierin offenbart, oder ein beliebiges anderes Fragment einer PRO-Polypeptidsequenz voller Länge, wie hierin offenbart, kodiert. Normalerweise weist eine PRO-Polynucleotidvariante zumindest etwa 80% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 81% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 82% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 83% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 84% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 85% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 86% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 87% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 88% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 89% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 90% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 91% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 92% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 93% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 94% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 95% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 96% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 97% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 98% Nucleinsäuresequenzidentität und alternativ dazu zumindest etwa 99% Nucleinsäuresequenzidentität, mit einer Nucleinsäuresequenz auf, die für eine Nativsequenz-PRO-Polypeptidsequenz voller Länge, wie hierin offenbart, eine Nativsequenz-PRO-Polypeptidsequenz voller Länge, der das Signalpeptid fehlt, wie hierin offenbart, eine extrazelluläre Domäne eines PRO-Polypeptids, mit oder ohne Signalsequenz, wie hierin offenbart, oder ein beliebiges anderes Fragment einer PRO-Polypeptidsequenz voller Länge, wie hierin offenbart, kodiert. Varianten umfassen die native Nucleotidsequenz nicht.
Normalerweise sind PRO-Polynucleotidvarianten zumindest etwa 30 Nucleotide lang, alternativ dazu zumindest etwa 60 Nucleotide lang, alternativ dazu zumindest etwa 90 Nucleotide lang, alternativ dazu zumindest etwa 120 Nucleotide lang, alternativ dazu zumindest etwa 150 Nucleotide lang, alternativ dazu zumindest etwa 180 Nucleotide lang, alternativ dazu zumindest etwa 210 Nucleotide lang, alternativ dazu zumindest etwa 240 Nucleotide lang, alternativ dazu zumindest etwa 270 Nucleotide lang, alternativ dazu zumindest etwa 300 Nucleotide lang, alternativ dazu zumindest etwa 450 Nucleotide lang, alternativ dazu zumindest etwa 600 Nucleotide lang, alternativ dazu zumindest etwa 900 Nucleotide lang oder mehr.
„Prozentuelle (%) Nucleinsäuresequenzidentität" hinsichtlich der hierin identifizierten PRO-Polypeptid-kodierenden Nucleinsäuresequenzen ist als Prozentsatz der Nucleotide in einer Kandidatensequenz definiert, die mit den Nucleotiden in einer PRO-Polypeptid-kodierenden Nucleinsäuresequenz identisch sind, nach Anordnung der Sequenzen und Einführung von Lücken, wenn notwendig, um die maximale prozentuelle Sequenzidentität zu erreichen. Anordnung zum Zwecke der Bestimmung von prozentueller Nucleinsäuresequenzidentität kann auf verschiedene Arten erreicht werden, die im Fachgebiet liegen, z. B. unter Verwendung öffentlich erhältlicher Computer-Software, wie z. B. BLAST-, BLAST-2-, ALIGN-, ALIGN-2- oder Megalign-(DNASTAR-)Software. Ein Fachmann kann geeignete Parameter zur Messung von Anordnung bestimmen, einschließlich Algorithmen, die notwendig sind, um maximale Anordnung über die verglichenen Volllängen-Sequenzen zu erreichen. Für die Zwecke hierin werden jedoch prozentuelle Nucleinsäuresequenzidentitätswerte, wie unten stehend beschrieben, unter Verwendung des Sequenzvergleichscomputerprogramms ALIGN-2 erhalten, wobei der vollständige Quellcode für das ALIGN-2-Programm in Tabelle 1 bereitgestellt wird. Das ALIGN-2-Sequenz-Vergleichscomputerprogramm wurde von Genentech, Inc., geschrieben, und der in Tabelle 1 gezeigte Quellcode ist mit Benutzerdokumentation im US Copyright Office, Washington DC 20559, hinterlegt worden, registriert unter der US Copyright Registrierungs-Nr. TXU510087. Das ALIGN-2-Programm ist öffentlich über Genentech, Inc., South San Francisco, Kalifornien, erhältlich oder kann aus dem in Tabelle 1 bereitgestellten Quellcode kompiliert werden. Das ALIGN-2-Programm sollte zur Verwendung auf einem UNIX-Betriebssystem kompiliert werden, vorzugsweise digital UNIX V4.0D. Alle Sequenzvergleichsparameter sind vom ALIGN-2-Programm festgelegt und variieren nicht.
Für die Zwecke hierin wird der Prozentsatz (%) der Nucleinsäuresequenzidentität einer bestimmten Nucleinsäuresequenz C zu, mit oder gegen eine(r) bestimmte(n) Nucleinsäuresequenz D (was alternativ dazu als eine bestimmte Nucleinsäuresequenz C beschrieben werden kann, die einen gewissen Prozentsatz (%) der Nucleinsäuresequenzidentität zu, mit oder gegen eine(r) bestimmte(n) Nucleinsäuresequenz D aufweist oder umfasst) folgendermaßen berechnet:
100 mal der Bruch W/Z
worin W die Anzahl an Nucleotiden ist, die als identische Übereinstimmungen durch das Sequenzanordnungs-Programm ALIGN-2 in der Anordnung dieses Programms von C und D bewertet werden, und worin Z die Gesamtanzahl an Nucleotiden in D ist. Man weiß es zu schätzen, dass in Fällen, in denen die Länge der Nucleinsäuresequenz C nicht gleich der Länge der Nucleinsäuresequenz D ist, die %-Nucleinsäuresequenzidentität von C zu D nicht gleich der %-Nucleinsäuresequenzidentität von D zu C ist. Als Beispiel der Berechnungen der %-Nucleinsäuresequenzidentität zeigen die Tabellen 2C–2D, wie die %-Nucleinsäuresequenzidentität der als „Vergleichs-DNA" bezeichneten Nucleinsäuresequenz zu der als „PRO-DNA" bezeichneten Nucleinsäuresequenz zu berechnen ist.
Falls nicht spezifisch anders angegeben, werden alle hierin verwendeten %-Nucleinsäuresequenzidentitäts-Werte wie oben stehend beschrieben unter Verwendung des ALIGN-2-Sequenzvergleichs-Computerprogramms erhalten. Die %-Nucleinsäuresequenzidentität kann jedoch auch unter Verwendung des Sequenzvergleichsprogramms NCBI-BLAST2 bestimmt werden (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25, 3389–3402 (1997)). Das NCBI-BLAST2-Sequenzvergleichsprogramm kann von der Seite http://www.ncbi.nlm.nih.gov heruntergeladen werden oder andernfalls vom National Institute of Health, Bethesda, MD, erhalten werden. NCBI-BLAST2 verwendet mehrere Suchparameter, worin alle dieser Suchparameter auf Standard werte eingestellt sind, umfassend z. B. unmask = yes, strand = all, expected occurrences = 10, minimum low complexity length = 15/5, multipass e-value = 0,01, constant for multi-pass = 25, dropoff for final gapped alignment = 25 und scoring matrix = BLOSUM62.
In Situationen, in denen NCBI-BLAST2 für Sequenz-Vergleiche verwendet wird, wird die %-Nucleinsäuresequenzidentität einer bestimmten Nucleinsäuresequenz C zu, mit oder gegen eine(r) bestimmte(n) Nucleinsäuresequenz D (was alternativ dazu als eine bestimmte Nucleinsäuresequenz C beschrieben werden kann, die einen gewissen Prozentsatz (%) der Nucleinsäuresequenzidentität zu, mit oder gegen eine(r) bestimmte(n) Nucleinsäuresequenz D aufweist oder umfasst) folgendermaßen berechnet:
100 mal der Bruch W/Z
worin W die Anzahl an Nucleotiden ist, die als identische Übereinstimmungen durch das Sequenzanordnungs-Programm NCBI-BLAST2 in der Anordnung dieses Programms von C und D bewertet werden, und worin Z die Gesamtanzahl an Nucleotiden in D ist. Man weiß es zu schätzen, dass in Fällen, in denen die Länge der Nucleinsäuresequenz C nicht gleich der Länge der Nucleinsäuresequenz D ist, die %-Nucleinsäuresequenzidentität von C zu D nicht gleich der %-Nucleinsäuresequenzidentität von D zu C ist.
Zusätzlich dazu können die %-Nucleinsäuresequenzidentitäts-Werte auch unter Verwendung des WU-BLAST-2-Computerprogramms bestimmt werden (Altschul et al., Methods in Enzymology 266, 460–480 (1996)). Die meisten der WU-BLAST-2-Suchparameter sind auf die Standardwerte eingestellt. Jene, die nicht auf Standardwerte eingestellt sind, d. h. die anpassbaren Parameter, sind mit folgenden Werten eingestellt: overlap span = 1, overlap fraction = 0,125, Word threshold (T) = 11 und scoring matrix = BLOSUM62. Für die Zwecke hierin wird ein %-Nucleinsäuresequenzidentitäts-Wert bestimmt, und zwar durch Teilen von (a) der Anzahl übereinstimmender identischer Nucleotide zwischen der Nucleinsäuresequenz des PRO- Polypeptid-kodierenden Nucleinsäuremoleküls von Interesse mit einer Sequenz, die von der Nativsequenz-PRO-Polypeptid-kodierenden Nucleinsäure abstammt, und dem Vergleichs-Nucleinsäuremolekül von Interesse (d. h. die Sequenz, gegen die das PRO-Polypeptid-kodierende Nucleinsäuremolekül von Interesse verglichen wird, die eine PRO-Polynucleotidvariante sein kann), wie von WU-BLAST2 bestimmt, durch (b) die Gesamtanzahl an Nucleotiden des PRO-Polypeptid-kodierenden Nucleinsäuermoleküls von Interesse. Z. B. ist in der Aussage „ein isoliertes Nucleinsäuremolekül, umfassend eine Nucleinsäuresequenz A, die zumindest 80% Nucleinsäuresequenzidentität mit der Nucleinsäuresequenz B aufweist", die Nucleinsäuresequenz A das Vergleichs-Nucleinsäuremolekül von Interesse und die Nucleinsäuresequenz B die Nucleinsäuresequenz des PRO-Polypeptid-kodierenden Nucleinsäuremoleküls von Interesse.
In anderen Ausführungsformen sind PRO-Polynucleotid-Varianten Nucleinsäuremoleküle, die für ein aktives PRO-Polypeptid kodieren und die in der Lage sind, vorzugsweise unter stringenten Hybridisierungs- und Waschbedingungen an Nucleotidsequenzen zu hybridisieren, die für das PRO-Polypeptid voller Länge kodieren, wie in der Beschreibung und den begleitenden Figuren hierin dargestellt. PRO-Polypeptid-Varianten können jene sein, die von einer PRO-Polynucleotid-Variante kodiert werden.
Der Ausdruck „Positive" im Kontext der wie oben stehend beschrieben durchgeführten Aminosäuresequenzidentitäts-Vergleiche umfasst Aminosäurereste in den verglichenen Sequenzen, die nicht nur identisch sind, sondern auch jene, die ähnliche Eigenschaften haben. Aminosäurereste, die einen positiven Wert zu einem Aminosäurerest von Interesse erzielen, sind jene, die entweder mit dem Aminosäurerest von Interesse identisch sind oder die eine bevorzugte Substitution (wie in Tabelle 3 unten stehend definiert) des Aminosäurerests von Interesse sind.
Für die Zwecke hierin wird der Prozentsatz (%) der Positiven einer bestimmten Aminosäuresequenz A zu, mit oder gegen eine(r) bestimmte(n) Aminosäuresequenz B (was alternativ dazu als eine bestimmte Aminosäuresequenz A beschrieben werden kann, die einen gewissen Prozentsatz (%) an Positiven zu, mit oder gegen eine(r) bestimmte(n) Aminosäuresequenz B aufweist oder umfasst) folgendermaßen berechnet:
100 mal der Bruch X/Y
worin X die Anzahl an Aminosäureresten ist, die durch einen positiven Wert durch das Sequenzanordnungs-Programm ALIGN-2 in der Anordnung dieses Programms von A und B bewertet werden, und worin Y die Gesamtanzahl der Aminosäurereste in B ist. Man weiß es zu schätzen, dass in Fällen, in denen die Länge der Aminosäuresequenz A nicht gleich der Länge der Aminosäuresequenz B ist, der %-Wert der Positiven von A zu B nicht gleich dem %-Wert der Positiven von B zu A ist.
„Isoliert", sofern verwendet, um die verschiedenen, hierin offenbarten Polypeptide zu beschreiben, bezeichnet ein Polypeptid, das identifiziert und aus einer Komponente aus seiner natürlichen Umgebung getrennt und/oder gewonnen wurde. Vorzugsweise ist das isolierte Polypeptid frei von Assoziierung mit allen Komponenten, mit denen es natürlich assoziiert ist. Verunreinigende Komponenten seiner natürlichen Umgebung sind Materialien, die typischerweise diagnostische oder therapeutische Verwendungen für das Polypeptid stören würden, und können Enzyme, Hormone und andere proteinartige oder nicht-proteinartige Gelöststoffe einbinden. In bevorzugten Ausführungsformen wird das Polypeptid (1) bis zu einem ausreichenden Grad, um zumindest 15 Reste von N-terminaler oder innerer Aminosäuresequenz zu erhalten, durch Verwendung eines Zentrifugenröhrchensequenzierers gereinigt oder (2) durch SDS-PAGE unter nicht-reduzierenden oder reduzierenden Bedingungen mittels Coomassie-Blau- oder, vorzugsweise, Silberfärbung bis zur Homogenität gereinigt. Isoliertes Polypeptid schließt Polypeptid in situ innerhalb rekombinanter Zellen ein, da zumindest eine Komponente der natürlichen Umgebung des PRO nicht vorhanden ist. Üblicherweise wird isoliertes Polypeptid durch zumindest einen Reinigungsschritt hergestellt.
Ein „isoliertes", für ein PRO-Polypeptid kodierendes Nucleinsäuremolekül oder ein „isoliertes", für einen Anti-PRO-Antikörper kodierendes Nucleinsäuremolekül ist ein Nucleinsäuremolekül, das aus zumindest einem verunreinigenden Nucleinsäuremolekül identifiziert und getrennt wird, mit dem es normalerweise in der natürlichen Quelle der für das PRO kodierenden Nucleinsäure oder der natürlichen Quelle der Anti-PRO-kodierenden Nucleinsäure assoziiert ist. Vorzugsweise ist das isolierte Polypeptid frei von Assoziierung mit allen Komponenten, mit denen es natürlich assoziiert ist. Ein isoliertes PRO-kodierendes Nucleinsäuremolekül oder ein isoliertes Anti-PRO-kodierendes Nucleinsäuremolekül liegt in einer anderen Form oder Beschaffenheit vor, als es in der Natur zu finden ist. Isolierte Nucleinsäuremoleküle werden daher von dem PRO-kodierenden Nucleinsäuremolekül oder von dem Anti-PRO-kodierenden Nucleinsäuremolekül unterschieden, wie es in natürlichen Zellen existiert. Ein isoliertes Nucleinsäuremolekül, das für ein PRO-Polypeptid kodiert, oder ein isoliertes Nucleinsäuremolekül, das für einen Anti-PRO-Antikörper kodiert, schließt jedoch PRO-Nucleinsäuremoleküle oder Anti-PRO-Nucleinsäuremoleküle mit ein, die in Zellen enthalten sind, welche üblicherweise PRO-Polypeptide oder Anti-PRO-Antikörper exprimieren, wobei sich beispielsweise das Nucleinsäuremolekül an einer anderen chromosomalen Stelle befindet als in natürlichen Zellen.
Die Bezeichnung „Kontrollsequenzen" bezieht sich auf DNA-Sequenzen, die zur Expression einer operabel gebundenen Kodiersequenz in einem bestimmten Wirtsorganismus erforderlich sind. Die Kontrollsequenzen, die beispielsweise für Prokaryoten geeignet sind, schließen einen Promotor, gegebenenfalls eine Operatorsequenz und eine Ribosombindungsstelle ein. Eukaryotische Zellen sind bekannt dafür, Promotoren, Polyadenylierungssignale und Enhancer zu verwenden.
Nucleinsäure ist „operabel gebunden", wenn sie in eine funktionelle Beziehung mit einer anderen Nucleinsäuresequenz gebracht wird. Beispielsweise ist DNA für eine Präsequenz oder einen Sekretionsleader operabel an DNA für ein PRO-Polypeptid gebunden, wenn sie als ein Präprotein exprimiert wird, das an der Sekretion des Polypeptids teilnimmt; ein Promotor oder ein Enhancer ist operabel an eine Kodiersequenz gebunden, wenn er die Transkription der Sequenz beeinflusst; oder eine Ri bosombindungsstelle ist operabel an eine Kodiersequenz gebunden, wenn sie so positioniert ist, dass sie Translation erleichtert. Im Allgemeinen bedeutet „operabel gebunden", dass die DNA-Sequenzen, die verbunden sind, zusammenhängend sind und, im Fall eines Sekretionsleaders, zusammenhängend und in Lesephase sind. Enhancer müssen jedoch nicht zusammenhängend sein. Bindung erfolgt durch Ligation an passenden Restriktionsstellen. Bestehen solche Stellen nicht, so werden die synthetischen Oligonucleotidadaptoren oder Linker gemäß herkömmlichen Praktiken verwendet.
„Stringenz" von Hybridisierungsreaktionen können Fachleute leicht bestimmen und beruht im Allgemeinen auf einer empirischen Berechnung, die von Sondenlänge, Waschtemperatur und Salzkonzentration abhängt. Im Allgemeinen erfordern längere Sonden höhere Temperaturen für korrektes Anellieren, während kürzere Sonden niedrigere Temperaturen erfordern. Hybridisierung im Allgemeinen hängt von der Fähigkeit denaturierter DNA ab, neuerlich zu anellieren, wenn komplementäre Stränge in einer Umgebung unter ihrer Schmelztemperatur vorhanden sind. Je höher der Grad an erwünschter Homologie zwischen der Sonde und der hybridisierbaren Sequenz ist, desto höher ist auch die relative Temperatur, die verwendet werden kann. Als Resultat folgt, dass höhere relative Temperaturen dazu neigen würden, die Reaktionsbedingungen stringenter zu gestalten, während niedrigere Temperaturen dies weniger verlangen würden. Für zusätzliche Details und Erklärungen zur Stringenz von Hybridisierungsreaktionen siehe Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers (1995).
„Stringente Bedingungen" oder „Bedingungen hoher Stringenz" wie hierin definiert können als jene Bedingungen identifiziert werden, die: (1) geringe Ionenstärke und hohe Temperaturen für das Waschen verwenden, beispielsweise 0,015 M Natriumchlorid/0,0015 M Natriumcitrat/0,1% Natriumdodecylsulfat bei 50°C; (2) während der Hybridisierung ein denaturierendes Mittel verwenden, wie beispielsweise Formamid, z. B. 50 Vol.-% Formamid mit 0,1% Rinderserumalbumin/0,1% Ficoll/0,1% Polyvinylpyrrolidon/50 mM Natriumphosphatpuffer bei pH 6,5 mit 750 mM Natriumchlorid, 75 mM Natriumcitrat bei 42°C; oder (3) 50% Formamid, 5 × SSC (0,75 M NaCl, 0,075 M Natriumcitrat), 50 mM Natriumphosphat (pH 6,8), 0,1% Natriumpyrophosphat, 5 × Denhardts Lösung, beschallte Lachssperma-DNA (50 μg/ml), 0,1% SDS und 10% Dextransulfat bei 42°C verwenden, mit Waschschritten bei 42°C in 0,2 × SSC (Natriumchlorid/Natriumcitrat) und 50% Formamid bei 55°C, gefolgt von einem Waschschritt bei hoher Stringenz bestehend aus 0,1 × SSC, das EDTA enthält, bei 55°C.
„Moderat stringente Bedingungen" können wie von Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laborstory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press (1989), beschrieben definiert werden und schließen die Verwendung von Waschlösung und Hybridisierungsbedingungen (z. B. Temperatur, Ionenstärke und % SDS) ein, die weniger stringent sind als jene, die zuvor beschrieben wurden. Ein Beispiel für moderat stringente Bedingungen ist Übernacht-Inkubation bei 37°C in einer Lösung, umfassend: 20% Formamid, 5 × SSC (150 mM NaCl, 15 mM Trinatriumcitrat), 50 mM Natriumphosphat (pH 7,6), 5 × Denhardts Lösung, 10% Dextransulfat und 20 mg/ml denaturierte gescherte Lachssperma-DNA; gefolgt von Waschen der Filter in 1 × SSC bei etwa 37–50°C. Fachleute werden erkennen, wie Temperatur, Ionenstärke usw. nach Erfordernis einzustellen sind, um Faktoren wie Sondenlänge und dergleichen Rechnung zu tragen.
Die Bezeichnung „epitopmarkiert", wenn hierin verwendet, bezieht sich auf ein chimäres Polypeptid, das ein an ein „Markierungs-Polypeptid" fusioniertes PRO-Polypeptid umfasst. Das Markierungs-Polypeptid weist genug Reste auf, um ein Epitop bereitzustellen, gegen das ein Antikörper hergestellt werden kann, ist jedoch auch ausreichend kurz, dass es die Aktivität des Polypeptids, an das es fusioniert ist, nicht stört. Das Markierungs-Polypeptid ist vorzugsweise auch eher einmalig, sodass der Antikörper mit anderen Epitopen im Wesentlichen nicht kreuzreagiert. Geeignete Markierungs-Polypeptide haben im Allgemeinen zumindest sechs Aminosäurenreste und üblicherweise zwischen etwa 8 und 50 Aminosäurereste (vorzugsweise zwischen etwa 10 und 20 Aminosäurereste).
„Aktiv” oder „Aktivität" im Kontext von PRO-Varianten bezieht sich auf Form(en) von PRO-Proteinen, die die biologischen und/oder immunologischen Aktivitäten von nativem oder natürlich auftretendem PRO-Polypeptid in sich tragen.
„Biologische Aktivität" im Kontext eines Moleküls, das ein PRO-Polypeptid antagonisiert, das durch die hierin offenbarten Screeningtests identifiziert werden kann (z. B. ein organisches oder anorganisches kleines Molekül, Peptid etc.), wird dazu verwendet, sich auf die Fähigkeit solcher Moleküle zu beziehen, sich an das PRO-Polypeptid, das hierin identifiziert wird, zu binden oder damit einen Komplex zu bilden oder aber die Wechselwirkung der PRO-Polypeptide mit anderen Zellproteinen auf eine andere Art und Weise zu stören oder auf andere Art und Weise die Transkription oder Translation des PRO-Polypeptids zu inhibieren. Besonders bevorzugte biologische Aktivität umfasst Herzhypertrophie, Aktivität, die auf systemische Erkrankungen, die Gefäße betreffen, wie z. B. Diabetes mellitus, sowie Erkrankungen der Arterien, Kapillaren, Venen und/oder Lymphgefäße und Krebs wirkt.
Die Bezeichnung „Antagonist" wird im weitesten Sinne verwendet und schließt jedes beliebige Molekül ein, das biologische Aktivitäten eines hierin offenbarten nativen PRO-Polypeptids teilweise oder gänzlich blockiert, hemmt oder neutralisiert, z. B., wenn anwendbar, seine mitogene oder angiogene Aktivität. Antagonisten eines PRO-Polypeptids können durch Eingreifen in die Bindung eines PRO-Polypeptids an einen Zellrezeptor wirken, durch Unfähigmachen oder Töten von Zellen, die von einem PRO-Polypeptid aktiviert worden sind, oder durch Eingreifen in die Gefäßendothelzellaktivierung nach Bindung von PRO-Polypeptid an einen Zellrezeptor. All diese Interventionspunkte durch einen PRO-Polypeptidantagonisten sollen als äquivalent für Zwecke dieser Erfindung betrachtet werden. Die Antagonisten hemmen die mitogene, angiogene oder andere biologische Aktivität von PRO-Polypeptiden und sind daher zur Behandlung von Erkrankungen oder Leiden nützlich, die durch nicht-erwünschte exzessive Neovaskularisierung gekennzeichnet sind, einschließlich beispielsweise Tumoren und insbesondere feste maligne Tumoren, rheumatoide Arthritis, Psoriasis, Atherosklerose, diabetische und andere Retinopathien, retrolentale Fibroplasie, altersbedingte Makuladegeneration, neovaskuläres Glaukom, Hämangi ome, Schilddrüsenhyperplasien (einschließlich Basedow-Krankheit), Hornhaut- und andere Gewebstransplantation und chronische Entzündung. Die Antagonisten sind ebenfalls zur Behandlung von Erkrankungen und Störungen nützlich, die durch unerwünschte exzessive Gefäßpermeabilität gekennzeichnet sind, wie z. B. Ödem assoziiert mit Gehirntumoren, Asziten, die mit Malignitäten assoziiert sind, Meigs-Syndrom, Lungenentzündung, nephrotisches Syndrom, Perikardeffusion (so wie jene, die mit Perikarditis assoziiert ist) und Pleuraeffusion. Auf ähnliche Weise wird der Begriff „Agonist" im weitesten Sinn verwendet und umfasst ein beliebiges Molekül, das eine biologische Aktivität eines nativen PRO-Polypepdtis, das hierin offenbart ist, nachahmt. Geeignete Agonisten- oder Antagonistenmoleküle umfassen insbesondere Agonisten- oder Antagonisten-Antikörper oder -Antikörperfragmente, Fragmente oder Aminosäuresequenzvarianten von nativen PRO-Polypeptiden, Peptiden, kleinen organischen Molekülen etc.
Ein „kleines Molekül" ist hierin als mit einem Molekulargewicht unter etwa 500 Dalton definiert.
Der Ausdruck „PRO-Polypeptid-Rezeptor" bezieht sich, wie hierin verwendet, auf einen zellulären Rezeptor für ein PRO-Polypeptid, normalerweise einen Zelloberflächen-Rezeptor, der auf Gefäßendothelzellen zu finden ist, sowie Varianten davon, welche die Fähigkeit beibehalten, ein PRO-Polypeptid zu binden.
„Antikörper" (Abs) und „Immunglobuline" (Igs) sind Glykoproteine, die dieselben strukturellen Eigenschaften aufweisen. Während Antikörper Bindungsspezifität an ein spezifisches Antigen zeigen, umfassen Immunglobuline sowohl Antikörper als auch andere antikörperähnliche Moleküle, denen Antigenspezifität fehlt. Polypeptide letzterer Art werden z. B. in geringeren Ausmaßen durch das Lymphsystem und in erhöhten Ausmaßen durch Myelome produziert. Der Begriff „Antikörper" wird im weitesten Sinn verwendet und umfasst insbesondere ohne Einschränkung intakte monoklonale Antikörper, polyklonale Antikörper, multispezifische Antikörper (z. B. bispezifische Antikörper), die aus zumindest zwei intakten Antikörpern gebildet werden, und Antikörperfragmente, solange sie die gewünschte biologische Aktivität zeigen.
„Native Antikörper” und „native Immunglobuline" sind üblicherweise heterotetramere Glykoproteine von etwa 150.000 Dalton, bestehend aus zwei identischen Leicht-(L-)Ketten und zwei identischen Schwer-(H-)Ketten. Jede Leichtkette ist an eine Schwerkette durch eine kovalente Disulfidbindung gebunden, während die Zahl der Disulfidbindungen unter den Schwerketten der verschiedenen Immunglobulinisotypen variiert. Jede Schwer- und Leichtkette weist auch regelmäßig beabstandete Intraketten-Disulfidbrücken auf. Jede Schwerkette weist an einem Ende eine variable Domäne (V_H) gefolgt von einigen konstanten Domänen auf. Jede Leichtkette weist an einem Ende eine variable Domäne (V_L) und eine konstante Domäne an ihrem anderen Ende auf; die konstante Domäne der Leichtkette ist mit der ersten konstanten Domäne der Schwerkette angeordnet, und die variable Leichtkettendomäne ist mit der variablen Domäne der Schwerkette angeordnet. Spezielle Aminosäurereste sollen eine Schnittfläche zwischen den variablen Leicht- und Schwerkettendomänen bilden.
Der Begriff „variabel" bezieht sich auf die Tatsache, dass bestimmte Abschnitte der variablen Domänen sich umfassend in der Sequenz zwischen Antikörpern unterscheiden und in der Bindung und Spezifität jedes bestimmten Antikörpers zu und für sein spezielles Antigen verwendet werden. Jedoch ist die Variabilität nicht gleichmäßig in den variablen Domänen von Antikörpern verteilt. Sie ist in drei Segmenten konzentriert, die komplementaritätsbestimmende Regionen (CDRs) oder hypervariable Regionen sowohl in den variablen Leichtketten- als auch Schwerkettendomänen genannt werden. Die stärker hochgradig konservierten Abschnitte der variablen Domänen werden Gerüstregionen (FR) genannt. Die variablen Domänen der nativen Schwer- und Leichtketten umfassen jeweils vier FR-Regionen, die großteils eine Beta-Faltblattkonfiguration annehmen, die durch drei CDRs verbunden ist, die Schleifen bilden, die die Beta-Faltblattstruktur verbinden und in manchen Fällen einen Teil davon bilden. Die CDRs in jeder Kette werden in enger Nähe durch die FR-Regionen zusammengehalten und tragen mit den CDRs aus den anderen Ketten zur Bildung der Antigenbindungsstelle von Antikörpern bei. Siehe Kabat et al., NIH Publ. Nr. 91–3242, Band 1, Seiten 647–669 (1991). Die konstanten Domänen sind nicht direkt in die Bindung eines Antikörpers an ein Antigen involviert, zeigen aber verschiedene Ef fektorfunktionen, wie z. B. Teilnahme des Antikörpers an antikörperabhängiger Zelltoxizität.
„Antikörperfragmente" umfassen einen Abschnitt eines intakten Antikörpers, vorzugsweise die Antigenbindungs- oder variable Region des intakten Antikörpers. Beispiele für Antikörperfragmente umfassen Fab-, Fab'-, F(ab')₂- und Fv-Fragmente; Diabodies; lineare Antikörper (Zapata et al., Protein Eng. 8(10), 1057–1062 (1995)); einkettige Antikörpermoleküle; und multispezifische Antikörper, gebildet aus Antikörperfragmenten.
Papainverdau von Antikörpern produziert zwei identische Antigenbindungsfragmente, genannt „Fab"-Fragmente, jeweils mit einer einzelnen Antigen-Bindungsstelle, und ein verbleibendes „Fc"-Fragment, eine Bezeichnung, die die Fähigkeit widerspiegelt, leicht zu kristallisieren. Pepsinbehandlung ergibt ein F(ab')2-Fragment, das zwei Antigen-kombinierende Stellen aufweist und dennoch zur Vernetzung von Antigen in der Lage ist.
„Fv" ist das minimale Antikörperfragment, das eine vollständige Antigenerkennungs- und -bindungsstelle aufweist. Diese Region besteht aus einem Dimer einer variablen Schwer- und einer variablen Leichtkettendomäne in enger, nicht-kovalenter Assoziation. In dieser Konfiguration erfolgt eine Wechselwirkung zwischen den drei CDRs jeder variablen Domäne zur Definition einer Antigen-Bindungsstelle an der Oberfläche des V_H-V_L-Dimers. Gemeinsam verleihen die sechs CDRs dem Antikörper Antigen-Bindungsspezifität. Jedoch weist sogar eine einzelne variable Domäne (oder die Hälfte eines Fv, das nur drei CDRs umfasst, die für ein Antigen spezifisch sind) die Fähigkeit auf, Antigen zu erkennen und zu binden, dies jedoch bei einer geringeren Affinität als die gesamte Bindungsstelle.
Das Fab-Fragment enthält auch die konstante Domäne der leichten Kette und die erste konstante Domäne (CH1) der schweren Kette. Fab'-Fragmente unterscheiden sich von Fab-Fragmenten durch die Addition einiger weniger Reste am Carboxy-Terminus der Schwerketten-CH1-Domäne, einschließlich eines oder mehrerer Cysteine aus der Antikörper-Gelenksregion. Fab'-SH ist hierin die Bezeichnung für Fab', in dem der/die Cysteinrest(e) der konstanten Domänen eine freie Thiolgruppe aufweist/aufweisen. F(ab')₂-Antikörperfragmente wurden ursprünglich als Paare von Fab'-Fragmenten produziert, die Gelenks-Cysteine zwischen sich aufwiesen. Auch andere chemische Bindungen von Antikörperfragmenten sind bekannt.
Die „leichten Ketten" von Antikörpern (Immunglobulinen) aus jeder beliebigen Wirbeltierspezies können einem von zwei eindeutig unterscheidbaren Typen, genannt kappa (κ) und lambda (λ), basierend auf den Aminosäuresequenzen ihrer konstanten Domänen, zugeordnet werden.
Je nach Aminosäuresequenz der konstanten Domäne ihrer schweren Ketten können Immunglobuline verschiedenen Klassen zugeordnet werden. Es gibt fünf Hauptklassen von Immunglobulinen: IgA, IgD, IgE, IgG und IgM, und mehrere von diesen können weiters in Unterklassen (Isotypen) unterteilt werden, z. B.: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA und IgA2. Die konstanten Schwerkettendomänen, die den verschiedenen Klassen von Immunglobulinen entsprechen, werden jeweils α, δ, ε, γ und μ genannt, Die Untereinheitsstrukturen und dreidimensionalen Konfigurationen von verschiedenen Klassen von Immunglobulinen sind bekannt.
Die Bezeichnung „monoklonaler Antikörper" wie hierin verwendet bezieht sich auf einen Antikörper, der aus einer Population von im Wesentlichen homogenen Antikörpern gewonnen wurde, d. h. dass die einzelnen Antikörper, aus denen die Population besteht, identisch sind, unter Ausnahme möglicher, natürlich vorkommender Mutationen, die in geringen Mengen vorhanden sein können. Monoklonale Antikörper sind höchst spezifisch und gegen eine einzelne Antigenstelle gerichtet. Weiters ist im Gegensatz zu herkömmlichen (polyklonalen) Antikörperformulierungen, die typischerweise verschiedene Antikörper umfassen, die gegen verschiedene Determinanten (Epitope) gerichtet sind, jeder monoklonale Antikörper gegen eine einzelne Determinante auf dem Antigen gerichtet. Zusätzlich zu ihrer Spezifität sind die monoklonalen Antikörper vorteilhaft, insofern als dass sie durch die Hybridomkultur synthetisiert werden, nicht-kontaminiert von anderen Immunglobulinen. Der Modifikator „monoklonal" gibt die Eigenschaft des Antikörpers an, dass er von einer im Wesentlichen homogenen Population von Antikörpern erhalten wird, und ist nicht so auszulegen, dass er Produktion des Antikörpers durch ein bestimmtes Verfahren erfordert. Zum Beispiel können die monoklonalen Antikörper, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, durch das Hybridomverfahren hergestellt werden, das zuerst von Kohler et al., Nature 256, 495 (1975), beschrieben ist, oder können durch DNA-Rekombinationsverfahren (siehe z. B. US-Patent Nr. 4.816.567 ) hergestellt werden. Die „monoklonalen Antikörper" können auch aus Phagenantikörperbibliotheken unter Verwendung der in Clackson et al., Nature 352, 624–628 (1991), und Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581–597 (1991), beschriebenen Verfahren isoliert werden.
Die hierin angeführten monoklonalen Antikörper umfassen insbesondere „chimäre" Antikörper (Immunglobuline), in welchen ein Abschnitt der Schwer- und/oder Leichtkette mit den entsprechenden Sequenzen in Antikörpern identisch ist oder zu ihnen homolog ist, die von einer besonderen Spezies abstammen oder einer besonderen Antikörperklasse oder -unterklasse angehören, während der Rest der Kette(n) mit entsprechenden Sequenzen in Antikörpern, die von einer anderen Spezies abstammen oder einer anderen Antikörperklasse oder -unterklasse angehören, identisch oder homolog sind, sowie Fragmente solcher Antikörper, solange sie die gewünschte biologische Aktivität zeigen. US-Patent Nr. 4.816.567 , Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851–6855 (1984).
„Humanisierte" Formen von nicht-menschlichen (z. B. Maus-)Antikörpern sind chimäre Immunglobuline, Immunglobulinketten oder Fragmente davon (wie z. B. Fv, Fab, Fab', F(ab')₂ oder andere Antigen-bindende Subsequenzen von Antikörpern), die eine Mindest-Sequenz, abgeleitet aus nicht-menschlichem Immunglobulin, enthalten. Humanisierte Antikörper umfassen meistens menschliche Immunglobuline (Empfängerantikörper), in denen Reste aus einer komplementaritätsbestimmenden Region (CDR) des Empfängers durch Reste aus einer CDR einer nicht-menschlichen Spezies (Spenderantikörper) wie Maus, Ratte oder Kaninchen mit der erwünschten Spezifität, Affinität und Kapazität ersetzt sind. In manchen Fällen sind Fv-FR-Reste des menschlichen Immunglobulins durch entsprechende nicht-menschliche Reste ersetzt. Humanisierte Antikörper können auch Reste umfassen, die weder im Empfängerantikörper noch in den importierten CDR- oder Gerüstsequenzen zu finden sind. Diese Modifikationen werden gemacht, um die Antikörperleistung weiter zu verfeinern und zu maximieren. Im Allgemeinen umfasst der humanisierte Antikörper im Wesentlichen die gesamte von zumindest einer, und typischerweise zwei, variablen Domänen, in denen alle oder im Wesentlichen alle der CDR-Regionen jenen eines nicht-menschlichen Immunglobulins entsprechen und alle oder im Wesentlichen alle der FR-Regionen jene einer menschlichen Immunglobulin-Sequenz sind. Die humanisierten Antikörper umfassen vorzugsweise auch zumindest einen Abschnitt einer konstanten Immunglobulinregion (Fc), typischerweise jenen eines menschlichen Immunglobulins. Für weitere Details siehe Jones et al., Nature 321, 522–525 (1986), Reichmann et al., Nature 332, 323–329 (1988), und Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2, 593–596 (1992). Der humanisierte Antikörper umfasst einen PRIMATIZED^TM-Antikörper, worin die Antigenbindungsregion des Antikörpers von einem Antikörper stammt, der durch Immunisierung von Makaken-Affen mit dem Antigen von Interesse stammt.
„Einkettige Fv"- oder „sFv"-Antikörperfragmente umfassen die V_H- und V_L-Domänen eines Antikörpers, worin diese Domänen in einer einzigen Polypeptidkette vorhanden sind. Vorzugsweise umfasst das Fv-Polypeptid weiters einen Polypeptidlinker zwischen den V_H- und V_L-Domänen, was dem sFv die Möglichkeit gibt, die erwünschte Struktur für Antigenbindung zu bilden. Einen Überblick zum Thema sFv liefert Pluckthun, in: The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Bd. 113, Rosenburg & Moore (Hrsg.), Springer-Verlag, New York, 269–315 (1994).
Die Bezeichnung „Diabodies" bezieht sich auf kleine Antikörperfragmente mit zwei Antigen-Bindungsstellen, worin die Fragmente eine variable Schwerkettendomäne (V_H) verbunden mit einer variablen Leichtkettendomäne (V_L) in derselben Polypeptidkette (V_H–V_L) umfassen. Unter Verwendung eines Linkers, der zu kurz ist, um Paarung zwischen den zwei Domänen an derselben Kette zu ermöglichen, werden die Domänen gezwungen, mit den komplementären Domänen einer anderen Kette Paare zu bilden und zwei Antigen-Bindungsstellen zu schaffen. Diabodies werden aus führlicher beispielsweise in der EP 404.097 ; der WO 93/11161 ; und in Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 6444–6448 (1993), beschrieben.
Ein „isolierter" Antikörper ist einer, der aus einer Komponente seiner natürlichen Umgebung identifiziert und getrennt und/oder gewonnen wurde. Verunreinigende Komponenten seiner natürlichen Umgebung sind Materialien, die diagnostische oder therapeutische Verwendungen für den Antikörper stören würden, und können Enzyme, Hormone und andere proteinartige oder nicht-proteinartige Gelöststoffe einbinden. In bevorzugten Ausführungsformen wird der Antikörper (1) zu einer Reinheit von über 95 Gew.-% des Antikörpers, bestimmt durch das Lowry-Verfahren, und am meisten bevorzugt zu einer Reinheit von über 99 Gew.-%, (2) zu einem ausreichenden Grad, um zumindest 15 Reste von N-terminaler oder innerer Aminosäuresequenz zu erhalten, mittels eines Zentrifugenröhrchensequenzierers oder (3) bis zur Homogenität mittels SDS-PAGE unter reduzierenden oder nichtreduzierenden Bedingungen mittels Coomassie-Blau- oder, vorzugsweise, Silberfärbung gereinigt. Isolierter Antikörper schließt den Antikörper in situ innerhalb rekombinanter Zellen ein, da zumindest eine Komponente der natürlichen Umgebung des Antikörpers nicht vorhanden ist. Üblicherweise wird ein isolierter Antikörper jedoch durch zumindest einen Reinigungsschritt hergestellt.
Das Wort „Markierung", sofern hierin verwendet, bezieht sich auf eine nachweisbare Verbindung oder andere Zusammensetzung, die direkt oder indirekt an den Antikörper konjugiert ist, um einen „markierten" Antikörper zu bilden. Die Markierung kann durch sich selbst nachweisbar sein (z. B. Radioisotopmarkierungen oder fluoreszierende Markierungen) oder kann, im Fall einer enzymatischen Markierung, chemische Änderung einer Substratverbindung oder -zusammensetzung, die nachweisbar ist, katalysieren. Radionuclide, die als detektierbare Markierungen dienen können, umfassen z. B. I-131, I-123, I-125, Y-90, Re-188, At-211, Cu-67, Bi-212 und Pd-109. Die Markierung kann auch eine nicht-detektierbare Einheit, wie z. B. ein Toxin, sein.
Unter „Festphase" wird eine nichtwässrige Matrix verstanden, an die ein Antikörper der vorliegenden Erfindung anhaften kann. Beispiele für Festphasen, die hierzu ge hören, schließen jene ein, die teilweise oder vollständig aus Glas (z. B. Controlled Pore Glass), Polysacchariden (z. B. Agarose), Polyacrylamiden, Polystyrol, Polyvinylalkohol und Silikonen gebildet sind. In bestimmten Ausführungsformen, je nach Kontext, kann die Festphase den Well einer Testplatte umfassen, in anderen ist sie eine Reinigungssäule (z. B. eine Affinitätschromatographiesäule). Diese Bezeichnung umfasst auch eine diskontinuierliche Festphase aus einzelnen Teilchen, wie z. B. jene, die um US-Patent Nr. 4.275.149 beschrieben werden.
Ein „Liposom" ist ein kleines Vesikel, das sich aus verschiedenen Typen an Lipiden, Phospholipiden und/oder Tensid zusammensetzt und zur Zufuhr eines Wirkstoffs (wie z. B. dem PRO-Polypeptid oder Antikörpern dazu, die hierin offenbart sind) zu einem Säugetier nützlich ist. Die Komponenten des Liposoms sind üblicherweise in einer zweischichtigen Formation angeordnet, ähnlich der Lipidanordnung biologischer Membranen.
Wie hierin verwendet beschreibt die Bezeichnung „Immunadhäsin" antikörperähnliche Moleküle, die die Bindungsspezifität eines heterologen Proteins (eines „Adhäsins") mit den Effektorfunktionen von konstanten Immunglobulindomänen kombinieren. Strukturell umfassen die Immunadhäsine eine Fusion einer Aminosäuresequenz mit der gewünschten Bindungsspezifität, die anders ist als die Antigenerkennung und Bindungsstelle eines Antikörpers (d. h. sie ist „heterolog"), und einer Sequenz einer konstanten Immunglobulindomäne. Der Adhäsinteil eines Immunadhäsinmoleküls ist typischerweise eine zusammenhängende Aminosäuresequenz, die zumindest die Bindungsstelle eines Rezeptors oder eines Liganden umfasst. Die Sequenz der konstanten Immunglobulindomäne im Immunadhäsin kann von einem beliebigen Immunglobulin erhalten werden, wie z. B. IgG-1-, IgG-2-, IgG-3- oder IgG-4-Subtypen, IgA (einschließlich IgA-1 und IgA-2), IgE, IgD oder IgM.
Wie unten stehend gezeigt, stellt Tabelle 1 den vollständigen Quellcode für das ALIGN-2-Sequenzvergleichs-Computerprogramm bereit. Dieser Quellcode kann routinemäßig für die Verwendung auf einem UNIX-Betriebssystem kompiliert werden, um das ALIGN-2-Sequenzvergleichs-Computerprogramm bereitzustellen.
Zusätzlich dazu zeigen die Tabellen 2A–2D hypothetische Beispiele zur Verwendung des unten stehend beschriebenen Verfahrens zur Bestimmung der %-Aminosäuresequenzidentität (Tabellen 2A–2B) und der %-Nucleinsäuresequenzidenität (Tabellen 2C–2D) unter Verwendung des ALIGN-2-Sequenzvergleichs-Computerprogramms, worin „PRO" die Aminosäuresequenz eines hypothetischen PRO-Polypeptids von Interesse darstellt, „Vergleichsprotein" die Aminosäuresequenz eines Polypeptids darstellt, mit dem das „PRO"-Polypeptid von Interesse verglichen wird, „PRO-DNA" eine hypothetische PRO-kodierende Nucleinsäuresequenz von Interesse darstellt, „Vergleichs-DNA" die Nucleotidsequenz eines Nucleinsäuremoleküls darstellt, mit dem das „PRO-DNA"-Nucleinsäuremolekül von Interesse verglichen wird, „X", „Y" und „Z" jeweils unterschiedliche hypothetische Aminosäurereste darstellen und „N", „L" und „V" jeweils unterschiedliche hypothetische Nucleotide darstellen. Tabelle 1
Tabelle 1 (Fortsetzung)
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Tabelle 1 (Fortsetzung)
Tabelle 1 (Fortsetzung)
Tabelle 2A

PRO XXXXXXXXXXXXXXX (Länge = 15 Aminosäuren)

Vergleichsprotein XXXXXYYYYYYY (Länge = 12 Aminosäuren)

% Aminosäuresequenzidentität = (die Anzahl identisch übereinstimmender Aminosäurereste zwischen den zwei Polypeptidsequenzen, wie von ALIGN-2 bestimmt) dividiert durch (die Gesamtanzahl an Aminosäureresten des PRO-Polypeptids) = 5 dividiert durch 15 = 33,3%

PRO	XXXXXXXXXX	(Länge = 10 Aminosäuren)
Vergleichsprotein	XXXXXYYYYYYZZYZ	(Länge = 15 Aminosäuren)

% Aminosäuresequenzidentität = (die Anzahl identisch übereinstimmender Aminosäurereste zwischen den zwei Polypeptidsequenzen, wie von ALIGN-2 bestimmt) dividiert durch (die Gesamtanzahl an Aminosäureresten des PRO-Polypeptids) = 5 dividiert durch 10 = 50%

PRO-DNA	NNNNNNNNNNNNNN	(Länge = 14 Nucleotide)
Vergleichs-DNA	NNNNNNLLLLLLLLLL	(Länge = 16 Nucleotide)

% Nucleinsäuresequenzidentität = (die Anzahl identisch übereinstimmender Nucleotide zwischen den zwei Nucleinsäuresequenzen, wie von ALIGN-2 bestimmt) dividiert durch (die Gesamtanzahl an Nucleotiden der PRO-DNA-Nucleinsäuresequenz) = 6 dividiert durch 14 = 42,9%

PRO-DNA	NNNNNNNNNNNN	(Länge = 12 Nucleotide)
Vergleichs-DNA	NNNNLLLVV	(Länge = 9 Nucleotide)

% Nucleinsäuresequenzidentität = (die Anzahl identisch übereinstimmender Nucleotide zwischen den zwei Nucleinsäuresequenzen, wie von ALIGN-2 bestimmt) dividiert durch (die Gesamtanzahl an Nucleotiden der PRO-DNA-Nucleinsäuresequenz) = 4 dividiert durch 12 = 33,3%

II. Zusammensetzungen und Verfahren der Erfindung
A. PRO-Varianten
Zusätzlich zu den hierin beschriebenen Nativsequenz-PRO-Polypeptiden voller Länge versteht es sich, dass PRO-Varianten hergestellt werden können. PRO-Varianten können durch Einführung geeigneter Nucleotidänderungen in die PRO-DNA hergestellt werden und/oder durch Synthese des gewünschten PRO-Polypeptids. Fachleuten wird bekannt sein, dass Aminosäureänderungen posttranslationale Prozesse des PRO-Polypeptids verändern können, wie z. B. Ändern der Anzahl oder Position von Glykosylierungsstellen oder Ändern der Membranverankerungs-Eigenschaften.
Variationen im nativen Volllängensequenz-PRO-Polypeptid oder in verschiedenen Domänen des hierin beschriebenen PRO-Polypeptids können gemacht werden, beispielsweise unter Verwendung beliebiger Verfahren und Richtlinien für konservative und nicht-konservative Mutationen, die beispielsweise im US-Patent Nr. 5.364.934 beschrieben sind. Variationen können eine Substitution, Deletion oder Insertion von einem oder mehrerer Codons sein, die für das PRO-Polypeptid kodieren, die zu einer Änderung der Aminosäuresequenz des PRO-Polypeptids im Vergleich mit Nativsequenz-PRO-Polypeptid führen. Gegebenenfalls erfolgt diese Variation durch Substitution von zumindest einer Aminosäure mit jeder anderen Aminosäure in einer oder mehreren Domänen des PRO-Polypeptids. Hilfestellung bei der Bestimmung, welcher Aminosäurerest insertiert, substituiert oder deletiert werden kann, ohne die erwünschte Aktivität negativ zu beeinflussen, kann durch Vergleichen der Sequenz des PRO-Polypeptids mit jener von homologen bekannten Proteinmolekülen und durch Minimieren der Anzahl an Aminosäuresequenzänderungen in Regionen hoher Homologie gefunden werden. Aminosäuresubstitutionen können durch Ersetzen einer Aminosäure durch eine andere Aminosäure mit ähnlichen strukturellen und/oder chemischen Eigenschaften, beispielsweise durch Ersetzen eines Leucins mit einem Serin, d. h. durch konservative Aminosäureersetzungen, entstehen. Insertionen oder Deletionen können gegebenenfalls im Bereich von etwa 1 bis 5 Aminosäuren liegen. Die zugelassene Variation kann durch systematisches Durchführen von Insertionen, Deletionen oder Substitutionen von Aminosäuren in die Sequenz und Testen der resultierenden Varianten auf Aktivität bestimmt werden, die von der Nativsequenz voller Länge oder der reifen Nativsequenz gezeigt wird.

In bestimmten Ausführungsformen werden konservative Substitutionen von Interesse in Tabelle 3 unter der Überschrift „Bevorzugte Substitutionen" gezeigt. Falls solche Substitutionen zu einer Veränderung der biologischen Aktivität führen, so werden wesentlichere Veränderungen, die in Tabelle 3 als Beispiel-Substitutionen bezeichnet werden, oder wie unten stehend mit Verweis auf Aminosäureklassen weiter beschrieben, eingeführt und die Produkte gescreent. Tabelle 3

Original-Rest	Beispiel-Substitutionen	Bevorzugte Substitutionen
Ala (A)	val; leu; ile	val
Arg (R)	lys; gln; asn	lys
Asn (N)	gln; his; lys; arg	gln
Asp (D)	glu	glu
Cys (C)	ser	ser
Gln (Q)	asn	asn
Glu (E)	asp	asp
Gly (G)	pro; ala	ala
His (H)	asn; gln; lys; arg	arg
Ile (I)	leu; val; met; ala; phe; Norleucin	leu
Leu (L)	Norleucin; ile; val; met; ala; phe	ile
Lys (K)	arg; gln; asn	arg
Met (M)	leu; phe; ile	leu
Phe (F)	leu; val; ile; ala; tyr	leu
Pro (P)	ala	ala
Ser (S)	thr	thr
Thr (T)	ser	ser
Trp (W)	tyr; phe	tyr
Tyr (Y)	trp; phe; thr; ser	phe
Val (V)	ile; leu; met; phe; ala; Norleucin	leu

Wesentliche Modifikationen der Funktion oder der immunologischen Identität des PRO-Polypeptids werden durch Selektieren von Substitutionen erzielt, die sich wesentlich bezüglich ihrer Wirkung auf den Erhalt von (a) der Struktur der Polypeptid-Hauptkette im Bereich der Substitution, z. B. als Faltblatt- oder Helix-Konformation, (b) der Ladung oder Hydrophobie des Moleküls an der Targetstelle oder (c) der Sperrigkeit der Seitenkette unterscheiden. Natürlich auftretende Reste werden basierend auf gemeinsamen Seitenketten-Eigenschaften in Gruppen eingeteilt:

(1) hydrophob: Norleucin, met, ala, val, leu, ile;
(2) neutral hydrophil: cys, ser, thr;
(3) sauer: asp, glu;
(4) basisch: asn, gln, his, lys, arg;
(5) Reste, welche die Kettenausrichtung beeinflussen: gly, pro; und
(6) aromatisch: trp, tyr, phe.

Nicht-konservative Substitutionen umfassen den Austausch eines Mitglieds einer dieser Klassen für eine andere Klasse. Solche substituierten Reste können auch in die konservativen Substitutionsstellen oder noch bevorzugter in die verbleibenden (nicht-konservierten) Stellen eingeführt werden.
Die Variationen können unter Verwendung von fachbekannten Verfahren, wie z. B. oligonucleotidvermittelter (ortsspezifischer) Mutagenese, Alaninscanning und PCR-Mutagenese hergestellt werden. Ortsgerichtete Mutagenese [Carter et al., Nucl. Acids Res. 13, 4331 (1986), Zoller et al., Nucl. Acids Res. 10, 6487 (1987)], Kassettenmutagenese [Wells et al., Gene 34, 315 (1985)], Restriktionsselektionsmutagenese [Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA 317, 415 (1986)] oder andere bekannte Verfahren können auf der klonierten DNA durchgeführt werden, um die PRO-Varianten-DNA zu produzieren.
Scanning-Aminosäureanalyse kann ebenfalls verwendet werden, um eine oder mehrere Aminosäuren entlang einer zusammenhängenden Sequenz zu identifizieren. Unter den bevorzugten Scanning-Aminosäuren sind relativ kleine, neutrale Amino säuren. Solche Aminosäuren umfassen Alanin, Glycin, Serin und Cystein. Alanin ist typischerweise eine bevorzugte Scanning-Aminosäure in dieser Gruppe, da es die Seitenkette hinter dem Beta-Kohlenstoff eliminiert und es weniger wahrscheinlich ist, dass es die Hauptkettenkonformation der Variante ändert [Cunningham und Wells, Science 244, 1081–1085 (1989)]. Alanin wird typischerweise ebenfalls bevorzugt, weil es die häufigste Aminosäure ist. Weiters ist sie häufig sowohl in verborgenen als auch in freiliegenden Positionen zu finden [Creighton, The Proteins, W. H. Freeman & Co., N. Y; Chothia, J. Mol. Biol. 150, 1 (1976)]. Wenn Alaninsubstitution keine adäquaten Mengen an Varianten erbringt, kann eine isoterische Aminosäure verwendet werden.
B. Modifikationen von PRO-Polypeptiden
Kovalente Modifikationen von PRO-Polypeptiden sind im Schutzumfang dieser Erfindung enthalten. Eine Form von kovalenter Modifikation umfasst das Umsetzen von Aminosäureresten eines PRO-Polypeptids, auf das abgezielt wird, mit einem organischen Derivatisierungsmittel, das in der Lage ist, sich mit ausgewählten Seitenketten oder den N- oder C-terminalen Resten des PRO-Polypeptids umzusetzen. Derivatisierung mit bifunktionellen Mitteln ist z. B. zur Vernetzung des PRO-Polypeptids mit einer wasserunlöslichen Trägermatrix oder Oberfläche zur Verwendung im Verfahren zur Reinigung von Anti-PRO-Antikörpern und umgekehrt nützlich. Häufig verwendete Vernetzer umfassen z. B. 1,1-Bis(diazoacetyl)-2-phenylethan, Glutaraldehyd, N-Hydroxysuccinimidester, z. B. Ester mit 4-Azidosalicylsäure, homobifunktionelle Imidoester, einschließlich Disuccinimidylester wie z. B. 3,3'-Dithiobis(succinimidylpropionat), bifunktionelle Maleinimide wie z. B. Bis-N-maleinimido-1,8-octan und Mittel wie z. B. Methyl-3-[(p-azidophenyl)dithio]propioimidat.
Andere Modifikationen umfassen Desamidierung von Glutaminyl- und Asparaginylresten zu den entsprechenden Glutamyl- bzw. Aspartylresten, Hydroxylierung von Prolin und Lysin, Phosphorylierung von Hydroxygruppen von Seryl- oder Threonylresten, Methylierung der α-Aminogruppen von Lysin-, Arginin- und Histidin-Seitenketten [T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, 79–86 (1983)], Acetylierung des N-terminalen Amins und Amidierung jeder beliebigen C-terminalen Carboxygruppe.
Eine andere Art kovalenter Modifikation des PRO-Polypeptids, die in den Schutzumfang dieser Erfindung fällt, umfasst das Ändern des nativen Glykosylierungsmusters des Polypeptids. „Ändern des nativen Glykosylierungsmusters" bedeutet für die vorliegenden Zwecke die Deletion von einer oder mehreren Kohlenhydratgruppierungen, die im Nativsequenz-PRO-Polypeptid zu finden sind (entweder durch Entfernen der zu Grunde liegenden Glykosylierungsstelle oder durch Deletieren der Glykosylierung durch chemische und/oder enzymatische Mittel), und/oder das Addieren einer oder mehrerer Glykosylierungsstellen, die im Nativsequenz-PRO-Polypeptid nicht zu finden sind. Zusätzlich dazu umfasst der Ausdruck qualitative Veränderungen in der Glykosylierung der nativen Proteine, umfassend eine Veränderung des Wesens und der Anteile der verschiedenen vorhandenen Kohlenhydratgruppierungen.
Das Hinzufügen von Glykosylierungsstellen zum PRO-Polypeptid kann durch Ändern der Aminosäuresequenz erfolgen. Die Änderung kann beispielsweise durch die Addition von einem oder mehreren Serin- oder Threoninresten oder die Substitution durch einen oder mehrere Serin- oder Threoninreste zum oder am Nativsequenz-PRO-Polypeptid (für O-gebundene Glykosylierungsstellen) durchgeführt werden. Die PRO-Aminosäuresequenz kann gegebenenfalls durch Änderungen auf DNA-Niveau geändert werden, insbesondere durch Mutation der DNA, die für das PRO-Polypeptid kodiert, an präselektierten Basen, sodass Codons gebildet werden, die zu den gewünschten Aminosäuren translatieren.
Ein anderes Mittel zur Steigerung der Anzahl an Kohlenhydratgruppierungen am PRO-Polypeptid ist chemisches oder enzymatisches Binden von Glykosiden an das Polypeptid. Solche Verfahren werden auf dem Gebiet der Erfindung, z. B. in der WO 87/05330 , veröffentlicht am 11. September 1987, und in Aplin & Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., 259–306 (1981), beschrieben.
Das Entfernen von Kohlenhydratgruppierungen, die am PRO-Polypeptid vorhanden sind, kann chemisch oder enzymatisch oder durch Mutationssubstitution von Codons, die für Aminosäurereste kodieren, die als Targets für Glykosylierung dienen, durchgeführt werden. Chemische Deglykosylierungsverfahren sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und werden beispielsweise von Hakimuddin et al., Arch. Biochem. Biophys. 259, 52 (1987), und von Edge et al., Anal. Biochem. 118, 131 (1981), beschrieben. Enzymatische Spaltung von Kohlenhydratgruppierungen an Polypeptiden kann durch die Verwendung einer Vielzahl an Endo- und Exo-Glykosidasen erreicht werden, wie von Thotakura et al., Meth. Enzymol. 138, 350 (1987), beschrieben wird.
Eine andere Art von kovalenter Modifikation des PRO-Polypeptids umfasst das Binden des PRO-Polypeptids an eines einer Vielzahl nicht-proteinartiger Polymere, z. B. Polyethylenglykol (PEG), Polypropylenglykol oder Polyoxyalkylene, auf die Art und Weise, die in den US-Patenten Nr. 4.640.835 ; 4.496.689 ; 4.301.144 ; 4.670.417 ; 4.791.192 oder 4.179.337 beschrieben wird.
Das PRO-Polypeptid der vorliegenden Erfindung kann auch auf eine Art und Weise modifiziert werden, um ein chimäres Molekül zu bilden, umfassend das PRO-Polypeptid, das an ein anderes heterologes Polypeptid oder eine Aminosäuresequenz fusioniert ist.
In einer Ausführungsform umfasst solch ein chimäres Molekül eine Fusion des PRO-Polypeptids mit einem Markierungspolypeptid, das ein Epitop bereitstellt, an das ein Anti-Markierungsantikörper selektiv binden kann. Die Epitopmarkierung wird im Allgemeinen an den Amino- oder Carboxylterminus des PRO-Polypeptids platziert. Die Gegenwart solcher Epitop-markierten Formen des PRO-Polypeptids kann unter Verwendung eines Antikörpers gegen das Markierungs-Polypeptid nachgewiesen werden. Die Bereitstellung der Epitopmarkierung ermöglicht es somit auch, dass das PRO-Polypeptid leicht mittels Affinitätsreinigung unter Verwendung eines Anti-Markierungs-Antikörpers oder eines anderen Typs von Affinitätsmatrize, die sich an die Epitopmarkierung bindet, gereinigt werden kann. Verschiedene Markierungspoly peptide und ihre jeweiligen Antikörper sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Beispiele umfassen Poly-Histidin-(poly-his-) oder Poly-Histidin-Glycin-(poly-his-gly-)Markierungen; das flu-HA-Markierungspolypeptid und seinen Antikörper 12CA5 [Field et al., Mol. Cell. Biol. 8, 2159–2165 (1988)]; die c-myc-Markierung und die Antikörper 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 und 9E10 hierzu [Evan et al., Molecular and Cellular Biology 5, 3610–3616 (1985)]; und die Herpes-Simplex-Virus-Glykoprotein-D-(-gD-)Markierung und ihren Antikörper [Paborsky et al., Protein Engineering 3(6), 547–553 (1990)]. Andere Markierungspolypeptide umfassen das Flag-Peptid [Hopp et al., Bio-Technology 6, 1204–1210 (1988)]; das KT3-Epitoppeptid [Martin et al., Science 255, 192–194 (1992)]; ein α-Tubulinepitoppeptid [Skinner et al., J. Biol. Chem. 266, 15163–15166 (1991)]; und die T7-Gen-10-Proteinpeptidmarkierung [Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 6393–6397 (1990)].
In einer alternativen Ausführungsform kann das chimäre Molekül eine Fusion des PRO-Polypeptids mit einem Immunglobulin oder einer speziellen Region eines Immunglobulins umfassen. Für eine bivalente Form des chimären Moleküls (auch als ein „Immunoadhäsin" bezeichnet) kann eine solche Fusion an die Fc-Region eines IgG-Moleküls sein. Die Ig-Fusionen umfassen vorzugsweise die Substitution einer löslichen (Transmembrandomänen-deletierten oder -deaktivierten) Form eines PRO-Polypeptids an Stelle von zumindest einer variablen Region innerhalb eines Ig-Moleküls. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst die Immunglobulin-Fusion die Gelenk-, CH2- und CH3- oder die Gelenk-, CH1-, CH2- und CH3-Regionen eines IgG1-Moleküls. Für die Herstellung von Immunglobulin-Fusionen siehe auch US-Patent Nr. 5.428.130 , ausgegeben am 27. Juni 1995.
C. Herstellung des PRO-Polypeptids
Die vorliegende Erfindung stellt neu identifizierte und isolierte Nucleotidsequenzen bereit, die für Polypeptide kodieren, die in der vorliegenden Anmeldung als PRO-Polypeptide bezeichnet werden. Insbesondere wurden cDNAs, die für PRO-Polypeptide kodieren, identifiziert und isoliert, wie näher in den nachstehenden Beispielen offenbart wird. Es gilt anzumerken, dass Proteine, die in getrennten Expressionsdurch gängen produziert wurden, unterschiedliche PRO-Nummern verliehen bekommen können, dass jedoch die UNQ-Nummer für jede bestimmte DNA und das kodierte Protein einmalig ist und nicht geändert wird. Aus Gründen der Einfachheit wird jedoch in der vorliegenden Beschreibung das von der PRO-DNA kodierte Protein sowie alle weiteren nativen Homologe und Varianten, die in der vorangehenden Definition von PRO-Polypeptiden inkludiert sind, als „PRO" bezeichnet, unabhängig von ihrem Ursprung oder Herstellungsmodus.
Die nachstehende Beschreibung betrifft primär die Produktion von PRO-Polypeptiden durch Kultivierung von Zellen, die mit einem Vektor transformiert oder transfiziert wurden, der die Nucleinsäure enthält, die für PRO-Polypeptide kodiert. Es versteht sich natürlich, dass alternative Verfahren, die fachbekannt sind, verwendet werden können, um das PRO-Polypeptid herzustellen. Zum Beispiel kann die PRO-Polypeptidsequenz oder Abschnitte davon durch direkte Peptidsynthese unter Verwendung von Festphasenverfahren produziert werden. Siehe z. B. Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis (W. H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969), Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85, 2149–2154 (1963). In-vitro-Proteinsynthese kann unter Verwendung manueller Verfahren oder durch Automatisierung durchgeführt werden. Automatisierte Synthese kann erreicht werden, zum Beispiel mit einer Peptidsynthesevorrichtung von Applied Biosystems (Foster City, CA) unter Verwendung der Anweisungen des Herstellers. Verschiedene Abschnitte des PRO-Polypeptids können separat chemisch synthetisiert werden und unter Verwendung chemischer oder enzymatischer Verfahren kombiniert werden, um das Volllängen-PRO-Polypeptid zu produzieren.
i. Isolierung von DNA, die für PRO-Polypeptide kodiert
DNA, die für das PRO-Polypeptid kodiert, kann aus einer cDNA-Bibliothek gewonnen werden, die aus Gewebe hergestellt wird, von dem angenommen wird, dass es die für das PRO-Polypeptid kodierende mRNA aufweist und diese in einem nachweisbaren Ausmaß exprimiert. Demgemäß können DNAs, die für das menschliche PRO-Polypeptid kodieren, leicht aus cDNA-Bibliotheken gewonnen werden, die aus menschlichem Gewebe hergestellt werden, wie es auch in den Beispielen beschrie ben ist. Das für das PRO-Polypeptid kodierende Gen kann auch aus einer genomischen Bibliothek oder mittels Oligonucleotidsynthese gewonnen werden.
Bibliotheken können mit Sonden (wie Antikörpern gegen das PRO-Poyleptid oder Oligonucleotide mit zumindest etwa 20–80 Basen) gescreent werden, deren Zweck es ist, das Gen von Interesse oder das durch dieses Gen kodierte Protein zu identifizieren. Screening der cDNA- oder der genomischen Bibliothek mit der ausgewählten Sonde kann unter Verwendung von Standardverfahren durchgeführt werden, die z. B. in Sambrook et al., s. o., beschrieben sind. Ein alternatives Mittel zum Isolieren des für das PRO-Polypeptid kodierenden Gens ist die Verwendung der PCR-Methode. Sambrook et al., s. o.; Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laborstory Manual (New York, Cold Spring Harbor Laborstory Press (1995)).
Die nachstehenden Beispiele beschreiben Verfahren zum Screenen einer cDNA-Bibliothek. Die als Sonden ausgewählten Oligonucleotidsequenzen sollten eine ausreichende Länge aufweisen und ausreichend eindeutig sein, sodass falsche Positive minimiert werden. Das Oligonucleotid ist vorzugsweise so markiert, dass es durch Hybridisierung an DNA in der zu screenenden Bibliothek nachgewiesen werden kann. Markierungsverfahren sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und umfassen die Verwendung von radioaktiven Markierungen wie z. B. von ³²P-markiertem ATP, Biotinylierung oder Enzymmarkierung. Hybridisierungsbedingungen, einschließlich moderater Stringenz und hoher Stringenz, sind in Sambrook et al., s. o., beschrieben.
Sequenzen, die in solchen Bibliotheks-Screening-Verfahren identifiziert werden, können mit anderen bekannten Sequenzen, die in öffentlichen Datenbanken wie z. B. GenBank oder anderen privaten Sequenzdatenbanken hinterlegt und zugänglich sind, verglichen und abgeglichen werden. Sequenzidentität (entweder auf Niveau der Aminosäuren oder der Nucleotide) innerhalb definierter Regionen des Moleküls oder über die gesamte Volllängensequenz hinweg kann mittels Sequenzanordnung unter Verwendung von Computer-Softwareprogrammen wie z. B. ALIGN, DNAStar und INHERIT bestimmt werden, die verschiedene Algorithmen zur Messung der Homologie verwenden.
Nucleinsäure mit Protein-kodierender Sequenz kann durch Screenen ausgewählter cDNA- oder genomischer Bibliotheken unter Verwendung der hierin zum ersten Mal offenbarten, abgeleiteten Aminosäuresequenz und, sofern erforderlich, unter Verwendung herkömmlicher Primerextensionsverfahren wie in Sambrook et al., s. o., beschrieben gewonnen werden, um Vorläufer und Verarbeitungs-Zwischenprodukte von mRNA zu detektieren, die eventuell nicht in cDNA revers-transkribiert worden sind.
ii. Selektion und Transformation von Wirtszellen
Wirtszellen werden mit Expressions- oder Kloniervektoren, die hierin zur PRO-Polypeptid-Produktion beschrieben werden, transfiziert oder transformiert und in herkömmlichem Nährmedium kultiviert, das zum Induzieren von Promotoren, zur Selektion von Transformanten oder Amplifikation der Gene, die für die gewünschten Sequenzen kodieren, geeignet modifiziert ist. Die Kulturbedingungen, wie z. B. Medium, Temperatur, pH und dergleichen, können von Fachleuten ohne übermäßiges Experimentieren ausgewählt werden. Im Allgemeinen können Prinzipien, Arbeitsvorschriften und praktische Techniken zur Maximierung der Produktivität von Zellkulturen in Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M. Butler (Hrsg.), IRL Press (1991), und in Sambrook et al., s. o., gefunden werden.
Verfahren zur Transfektion sind durchschnittlichen Fachleuten bekannt, z. B. CaPO₄-Behandlung und Elektroporation. Je nach verwendeten Wirtszellen erfolgt die Transformation unter Verwendung von Standardverfahren, die für die entsprechenden Zellen geeignet sind. Die Calciumbehandlung mittels Calciumchlorid, wie in Sambrook et al., s. o., beschrieben, oder Elektroporation wird im Allgemeinen für Prokaryoten oder andere Zellen verwendet, die wesentliche Zellwandbarrieren enthalten. Infektion mit Agrobacterium tumefaciens wird zur Transformation bestimmter Pflanzenzellen verwendet, wie in Shaw et al., Gene 23, 315 (1983), und die WO 89/05859 , veröffentlicht am 29. Juni 1989, beschrieben. Für Säugetierzellen ohne solche fentlicht am 29. Juni 1989, beschrieben. Für Säugetierzellen ohne solche Zellwände kann das Calciumphosphat-Präzipitationsverfahren von Graham & van der Eb, Virology 52, 456–457 (1978), verwendet werden. Allgemeine Aspekte von Säugetierzellen-Wirtssystemtransformationen werden im US-Patent Nr. 4.399.216 beschrieben. Transformationen in Hefe werden typischerweise gemäß dem Verfahren von Van Solingen et al., J. Bact. 130, 946 (1977), und Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 76, 3829 (1979), durchgeführt. Es können jedoch auch andere Verfahren zum Einführen von DNA in Zellen, wie beispielsweise Kernmikroinjektion, Elektroporation, bakterielle Protoplastenfusion mit intakten Zellen, oder Polykationen, z. B. Polybren, Polyornithin, verwendet werden. Für verschiedene Verfahren zur Transformation von Säugetierzellen siehe Keown et al., Methods in Enzymology 185, 527–537 (1990), und Mansour et al., Nature 336, 348–352 (1988).
Geeignete Wirtszellen zum Klonieren oder Exprimieren der DNA in die bzw. den Vektoren hierin schließen Prokaryoten-, Hefe- oder höhere Eukaryotenzellen ein. Geeignete Prokaryoten umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Eubakterien, wie z. B. gram-negative oder gram-positive Organismen, beispielsweise Enterobacteriaceae wie z. B. E. coli. Verschiedene E.-coli-Stämme sind öffentlich erhältlich, wie z. B. E.-coli-K12-Stamm MM294 (ATCC 31.446), E. coli X1776 (ATCC 31.537), E.-coli-Stamm W3110 (ATCC 27.325) und K5 772 (ATCC 53.635). Andere geeignete prokaryotische Wirtszellen umfassen Enterobacteriaceae wie z. B. Escherichia, z. B. E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, z. B. Salmonella typhimurium, Serratia, z. B. Serratia marcescans, und Shigella sowie Bacilli, wie z. B. B. subtilis und B. licheniformis (z. B. B. licheniformis 41P, offenbart in DD 266.710 , veröffentlicht am 12. April 1989), Pseudomonas, wie z. B. P. aeruginosa, und Streptomyces. Diese Beispiele dienen der Veranschaulichung und nicht der Einschränkung. Stamm W3110 ist ein besonders bevorzugter Wirt oder Elternwirt, da dies ein gemeinsamer Wirtsstamm für Produktfermentationen rekombinanter DNA ist. Vorzugsweise sekretiert die Wirtszelle minimale Mengen an proteolytischen Enzymen. Der Stamm W3110 kann z. B. modifiziert werden, um eine genetische Mutation in den Genen durchzuführen, die für Proteine kodieren, die zum Wirt endogen sind, wobei Beispiele solcher Wirte Folgende umfassen: E.-coli-W3110-Stamm 1A2, der den vollständigen Genotyp tonA aufweist; E.-coli-W3110-Stamm 9E4, der den vollständigen Genotyp tonA ptr3 aufweist; E.-coli-W3110-Stamm 27C7 (ATCC 55.244), der den vollständigen Genotyp tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT kan^r aufweist; E.-coli-W3110-Stamm 37D6, der den vollständigen Genotyp tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT rbs7 ilvG kan^r aufweist; E.-coli-W3110-Stamm 4084, wobei es sich um den Stamm 37D6 mit einer nicht-kanamycinresistenten degP-Deletionsmutation handelt; und einen E.-coli-Stamm mit einer periplasmatischen Mutantenprotease, offenbart im US-Patent Nr. 4.946.783 , ausgegeben am 7. August 1990. Alternativ dazu sind In-vitro-Verfahren zum Klonieren, z. B. PCR oder andere Nucleinsäure-Polymerasereaktionen, geeignet.
Zusätzlich zu Prokaryoten sind eukaryotische Mikroben wie beispielsweise Fadenpilze oder Hefe geeignete Klonier- oder Expressionswirte für PRO-Polypeptidkodierende Vektoren. Saccharomyces cerevisiae ist ein üblicherweise verwendeter, nieder-eukaryotischer Wirtsmikroorganismus. Andere umfassen Schizosaccharomyces pombe (Beach und Nurse, Nature 290, 140 (1981); EP 139.383 , veröffentlicht am 2. Mai 1985); Kluyveromyces-Wirte ( US-Patent Nr. 4.943.529 ; Fleer et al., Bio/Technology 9, 968–975 (1991)), wie z. B. K. lactis (MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt et al., J. Bacteriol. 737 (1983)); K. fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045), K. wickeramii (ATCC 24.178), K. waltii (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906; Van den Berg et al., Bio/Technology 8, 135 (1990)); K. thermotolerans und K. marxianus; Yarrowia ( EP 402.226 ); Pichia pastoris ( EP 183.070 ; Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol. 28, 265–278 (1988)); Candida; Trichoderma reesia ( EP 244.234 ); Neurospora crassa (Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 5259–5263 (1979)); Schwanniomyces, wie z. B. Schwanniomyces occidentalis ( EP 394.538 , veröffentlicht am 31. October 1990); und Fadenpilze, wie z. B. Neurospora, Penicillium, Tolypocladium ( WO 91/00357 , veröffentlicht am 10. Jänner 1991), und Aspergillus-Wirte, wie z. B. A. nidulans (Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 112, 284–289 (1983); Tilburn et al., Gene 26, 205–221 (1983); Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1470–1474 (1984)) und A. niger (Kelly und Hynes, EMBO J. 4, 475–479 (1985)). Methylotrophe Hefearten sind hierin geeignet und umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, Hefe, die zu Wachstum auf Methanol in der Lage ist, ausgewählt aus den Genera, die aus Hansenula, Candida, Kloeckera, Pichia, Saccharomyces, Torulopsis und Rhodotorula bestehen. Eine Liste spezifischer Spezies, die als Beispiel für diese Klasse an Hefearten dienen, sind in C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs 269 (1982), zu finden.
Geeignete Wirtszellen für die Expression von Nucleinsäure, die für glykosylierte PRO-Polypeptide kodiert, werden von multizellulären Organismen abgeleitet. Beispiele für Wirbellosenzellen umfassen Insektenzellen wie z. B. Drosophila S2 und Spodoptera Sf9, sowie Pflanzenzellen. Beispiele für nützliche Säugetierwirtszelllinien umfassen Chinahamster-Eierstock-(CHO-) und COS-Zellen. Spezifischere Beispiele umfassen Affennieren-CV1-Linie, transformiert mit SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); menschliche embryonale Nierenlinie (293- oder 293-Zellen, subkloniert zum Wachstum in Suspensionskultur, Graham et al., J. Gen. Virol. 36, 59 (1977)); Chinahamster-Eierstockzellen/-DHFR (CHO, Urlaub & Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216 (1980)); Maus-Sertolizellen (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23, 243–251 (1980)); menschliche Lungenzellen (W138, ATCC CCL 75); menschliche Leberzellen (Hep G2, HB 8065); und Maus-Brusttumor (MMT 060562, ATCC CCL51). Es wird erachtet, dass die Auswahl der geeigneten Wirtszelle in das Gebiet der Erfindung fällt.
iii. Auswahl und Verwendung eines replizierbaren Vektors
Die Nucleinsäure (z. B. cDNA oder genomische DNA), die für das PRO-Polypeptid kodiert, kann zum Klonieren (Amplifikation der DNA) oder zur Expression in einen replizierbaren Vektor insertiert werden. Verschiedene Vektoren sind öffentlich erhältlich. Der Vektor kann beispielsweise in Form eines Plasmids, Cosmids, viralen Partikels oder Phagen vorliegen. Die geeignete Nucleinsäuresequenz kann in den Vektor mittels zahlreicher verschiedener Verfahren insertiert werden. Im Allgemeinen wird DNA in (eine) geeignete Restriktionsendonucleasestelle(n) mittels auf dem Gebiet der Erfindung bekannter Verfahren insertiert. Vektorkomponenten umfassen im Allgemeinen, sind jedoch nicht beschränkt auf, eine oder mehrere Signalsequenzen, wenn die Sequenz sekretiert werden soll, einen Replikationsursprung, ein oder mehrere Markergene, ein Enhancer-Element, einen Promotor und eine Transkriptionster minationssequenz. Bei der Konstruktion geeigneter Vektoren, die eine oder mehrere dieser Komponenten enthalten, werden herkömmliche Ligationsverfahren eingesetzt, die Fachleuten bekannt sind.
Das PRO-Polypeptid kann rekombinant nicht nur direkt, sondern auch als ein Fusionspolypeptid mit einem heterologen Polypeptid hergestellt werden, das eine Signalsequenz oder ein anderes Polypeptid mit einer spezifischen Spaltungsstelle am N-Terminus des reifen Proteins oder Polypeptids sein kann. Im Allgemeinen kann die Signalsequenz eine Komponente des Vektors oder kann ein Teil der für das PRO-Polypeptid kodierenden DNA sein, die in den Vektor insertiert wird. Die Signalsequenz kann eine prokaryotische Signalsequenz, ausgewählt beispielsweise aus der aus alkalischer Phosphatase, Penicillinase, Ipp oder wärmestabilen Enterotoxin-II-Leadern bestehenden Gruppe, sein. Zur Hefesekretion kann die Signalsequenz z. B. der Hefe-Invertaseleader, Alpha-Faktorleader (einschließlich Saccharomyces- und Kluyveromyces-α-Faktorleader, wobei Letzterer im US-Patent Nr. 5.010.182 beschrieben ist) oder saure Phosphataseleader, der C.-albicans-Glucoamylaseleader ( EP 362.179 , veröffentlicht am 4. April 1990) oder das in der WO 90/13646 , veröffentlicht am 15. November 1990, beschriebene Signal sein. Bei der Säugetierzellexpression können Säugetiersignalsequenzen verwendet werden, um Sekretion des Proteins zu steuern, wie beispielsweise Signalsequenzen aus sekretierten Polypeptiden derselben oder einer verwandten Spezies sowie virale Sekretionsleader.
Sowohl Expressions- als auch Kloniervektoren enthalten eine Nucleinsäuresequenz, die es ermöglicht, dass sich der Vektor in einer oder mehreren der ausgewählten Wirtszellen repliziert. Solche Sequenzen sind für zahlreiche verschiedene Bakterien, Hefen und Viren bekannt. Der Replikationsursprung aus dem Plasmid pBR322 ist für die meisten gram-negativen Bakterien geeignet, der 2μ-Plasmidursprung ist für Hefe geeignet, und verschiedene virale Ursprünge (SV40, Polyoma, Adenovirus, VSV oder BPV) sind für Kloniervektoren in Säugetierzellen nützlich.
Expressions- und Kloniervektoren enthalten typischerweise ein Selektionsgen, das auch als selektierbarer Marker bezeichnet wird. Typische Selektionsgene kodieren für Proteine, die (a) Resistenz gegenüber Antibiotika oder anderen Toxinen, z. B. Ampicillin, Neomycin, Methotrexat oder Tetracyclin, verleihen, (b) auxotrophe Mängel beheben oder (c) essenzielle Nährstoffe, die aus komplexem Medium nicht erhältlich sind, z. B. das für D-Alaninracemase für Bacilli kodierende Gen, zuführen.
Ein Beispiel für geeignete selektierbare Marker für Säugetierzellen sind jene, die die Identifikation von Zellen ermöglichen, die in der Lage sind, die für das PRO-Polypeptid kodierende Nucleinsäure aufzunehmen, wie z. B. DHFR oder Thymidinkinase. Eine geeignete Wirtszelle ist, sofern Wildtyp-DHFR verwendet wird, die CHO-Zelllinie, der DHFR-Aktivität fehlt und die wie von Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216 (1980), beschrieben hergestellt und vermehrt wird. Ein geeignetes Selektionsgen zur Verwendung in Hefe ist das trp1-Gen, das im Hefeplasmid YRp7 vorhanden ist. Stinchcomb et al., Nature 282, 39 (1979), Kingsman et al., Gene 7, 141 (1979), Tschemper et al., Gene 10, 157 (1980). Das trp1-Gen liefert einen Selektionsmarker für einen mutierten Hefestamm, dem die Fähigkeit fehlt, in Tryptophan zu wachsen, beispielsweise ATCC Nr. 44076 oder PEP4-1. Jones, Genetics 85, 12 (1977).
Expressions- und Kloniervektoren enthalten üblicherweise einen Promotor, der operabel an die für das PRO-Polypeptid kodierende Nucleinsäuresequenz gebunden ist, um mRNA-Synthese zu steuern. Promotoren, die durch zahlreiche verschiedene potenzielle Wirtszellen erkannt werden, sind bekannt. Promotoren, die zur Verwendung mit prokaryotischen Wirten geeignet sind, umfassen die β-Lactamase- und Lactose-Promotorsysteme [Chang et al., Nature 275, 615 (1978), Goeddel et al., Nature 281, 544 (1979)], alkalische Phosphatase, ein Tryptophan-(trp-)Promotorsystem [Goeddel, Nucleic Acids Res. 8, 4057 (1980), EP 36.776 ] und Hybridpromotoren wie z. B. den tac-Promotor [deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 21–25 (1983)]. Promotoren zur Verwendung in bakteriellen Systemen enthalten auch eine Shine-Dalgarno-(S. D.-)Sequenz, die operabel an die für das PRO-Polypeptid kodierende DNA gebunden ist.
Beispiele für geeignete Promotorsequenzen zur Verwendung mit Hefewirten umfassen die Promotoren für 3-Phosphoglyceratkinase [Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255, 2073 (1980)] oder andere glykolytische Enzyme [Ness et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7, 149 (1968), Holland, Biochemistry 17, 4900 (1978)], wie z. B. Enolase, Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase, Hexokinase, Pyruvatdecarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-6-phosphatisomerase, 3-Phosphoglyceratmutase, Pyruvatkinase, Triosephosphatisomerase, Phosphoglucoseisomerase und Glucokinase.
Andere Hefepromotoren, die induzierbare Promotoren sind und den zusätzlichen Vorteil haben, dass ihre Transkription durch Wachstumsbedingungen gesteuert wird, sind die Promotorregionen für Alkoholdehydrogenase 2, Isocytochrom C, saure Phosphatase, degradative Enzyme, die mit Stickstoffmetabolismus assoziiert sind, Metallothionein, Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase und Enzyme, die für Maltose- und Galactoseverwertung verantwortlich sind. Geeignete Vektoren und Promotoren zur Verwendung bei Hefeexpression sind näher in EP 73.657 beschrieben.
PRO-Nucleinsäure-Transkription aus Vektoren in Säugetier-Wirtszellen wird beispielsweise durch Promotoren, die aus den Genomen von Viren wie z. B. Polyomavirus, Geflügelpockenvirus ( UK 2.211.504 , veröffentlicht am 5. Juli 1989), Adenovirus (wie z. B. Adenovirus 2), Rinderpapillomavirus, Vogel-Sarkomvirus, Zytomegalie-Virus, einem Retrovirus, Hepatitis-B-Virus und Affenvirus 40 (SV40) gewonnen werden, durch heterologe Säugetierpromotoren, z. B. den Actinpromotor oder einen Immunglobulinpromotor, und durch Hitzeschock-Promotoren gesteuert, vorausgesetzt, solche Promotoren sind mit den Wirtszellsystemen kompatibel.
Transkription einer DNA, die für das PRO-Polypeptid kodiert, durch höhere Eukaryoten kann durch Insertieren einer Enhancersequenz in den Vektor gesteigert werden. Enhancer sind cis-wirkende Elemente von DNA, üblicherweise mit etwa 10 bis 300 bp, die auf einen Promotor so wirken, dass seine Transkription gesteigert wird. Zahlreiche Enhancersequenzen sind aus Säugetiergenen bekannt (Globin, Elastase, Albumin, α-Fetoprotein und Insulin). Typischerweise wird jedoch ein Enhancer aus einem eukaryotischen Zellvirus verwendet. Beispiele umfassen den SV40-Enhancer an der späten Seite des Replikationsursprungs (bpp 100–270), den frühen Zytomegalie-Virus-Promotorenhancer, den Polyoma-Enhancer an der späten Seite des Replikationsursprungs und Adenovirus-Enhancer. Der Enhancer kann in den Vektor an einer Position 5' oder 3' zur PRO-Polypeptid-Kodiersequenz gespleißt werden, wird jedoch vorzugsweise an einer Stelle 5' vom Promotor angeordnet.
Expressionsvektoren, die in eukaryotischen Wirtszellen (Hefe-, Pilz-, Insekten-, Pflanzen-, Tier-, Mensch- oder kernhaltigen Zellen aus anderen multizellulären Organismen) verwendet werden, enthalten auch Sequenzen, die zum Abschluss von Transkription und zur Stabilisierung der mRNA erforderlich sind. Solche Sequenzen sind üblicherweise aus den untranslatierten 5'-, und gegebenenfalls 3'-, Regionen eukaryotischer oder viraler DNAs oder cDNAs erhältlich. Diese Regionen enthalten Nucleotidsegmente, die als polyadenylierte Fragmente im untranslatierten Abschnitt der für das PRO-Polypeptid kodierenden mRNA transkribiert werden.
Weitere Verfahren, Vektoren und Wirtszellen, die zur Adaption an die Synthese des PRO-Polypeptids in rekombinanter Wirbeltierzellkultur geeignet sind, sind in Gething et al., Nature 293, 620–625 (1981), Mantel et al., Nature 281, 40–46 (1979), EP 117.060 ; und EP 117.058 beschrieben.
iv. Detektion von Genamplifikation/expression
Genamplifikation und/oder -expression kann in einer Probe direkt gemessen werden, z. B. durch herkömmliches Southern-Blotting, Northern-Blotting zur Quantifizierung der Transkription von mRNA [Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 5201–5205 (1980)], Dot-Blotting (DNA-Analyse) oder In-situ-Hybridisierung unter Verwendung einer geeigneten markierten Sonde, basierend auf den hierin bereitgestellten Sequenzen. Alternativ dazu können Antikörper verwendet werden, die spezifische Duplexe, einschließlich DNA-Duplexe, RNA-Duplexe und DNA-RNA-Hybridduplexe oder DNA-Protein-Duplexe, erkennen können. Die Antikörper wiederum können markiert sein, und der Test kann durchgeführt werden, wenn der Duplex an eine Oberflä che gebunden ist, sodass bei Bildung von Duplex an der Oberfläche die Gegenwart von Antikörper, der an den Duplex gebunden ist, nachgewiesen werden kann.
Genexpression kann alternativ dazu durch immunologische Verfahren, wie beispielsweise immunhistochemisches Färben von Zellen oder Gewebeschnitten und Tests von Zellkultur oder Körperflüssigkeiten, gemessen werden, um die Expression von Genprodukt direkt zu quantifizieren. Antikörper, die für immunhistochemisches Färben und/oder Testen von Probenflüssigkeiten nützlich sind, können entweder monoklonal oder polyklonal sein und können in jedem beliebigen Säugetier hergestellt werden. Auf einfache Weise können die Antikörper gegen ein Nativsequenz-PRO-Polypeptid oder gegen ein synthetisches Peptid, basierend auf den hierin bereitgestellten DNA-Sequenzen, oder gegen exogene Sequenz, fusioniert an für das PRO-Polypeptid und für ein spezifisches Antikörperepitop kodierende DNA, hergestellt werden.
v. Reinigung von PRO-Polypeptiden
Formen von PRO-Polypeptiden können aus Kulturmedium oder aus Wirtszelllysaten gewonnen werden. Sofern membrangebunden, kann es unter Verwendung einer geeigneten Tensidlösung (z. B. Triton-X^TM 100) oder durch enzymatische Spaltung aus der Membran freigesetzt werden. Zellen, die zur Expression von Nucleinsäure, die für das PRO-Polypeptid kodiert, verwendet werden, können mittels verschiedener physikalischer oder chemischer Mittel, wie z. B. Gefrier-Auftau-Zyklieren, Beschallung, mechanischer Aufbruch oder Zelllysemittel, aufgeschlossen werden. Es kann erwünscht sein, das PRO-Polypeptid aus rekombinanten Zellproteinen oder Polypeptiden zu reinigen. Die folgenden Verfahren sind Beispiele für geeignete Reinigungsverfahren: Fraktionierung an einer Ionenaustauschsäule; Ethanolfällung; Umkehrphasen-HPLC; Chromatographie an Siliciumdioxid oder an einem Kationenaustauschharz wie z. B. DEAE; Chromatofokussierung; SDS-PAGE; Ammoniumsulfatfällung; Gelfiltration unter Verwendung von beispielsweise Sephadex G-75; Protein-A-Sepharose-Säulen zur Entfernung von Verunreinigungen wie IgG; und Metallchelator-Säulen zur Bindung von Epitop-markierten Formen des PRO-Polypeptids. Ver schiedene Verfahren von Proteinreinigung können verwendet werden, und solche Verfahren sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und beispielsweise in Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982), beschrieben. Der/Die ausgewählte(n) Reinigungsschritt(e) hängt/hängen beispielsweise von der Beschaffenheit des verwendeten Herstellungsverfahrens und dem bestimmten hergestellten PRO-Polypeptid ab.
D. Verwendungen von PRO-Polypeptiden
i. Tests auf kardiovaskuläre, endotheliale und angiogene Aktivität
Verschiedene Tests können verwendet werden, um das hierin angeführte Polypeptid auf kardiovaskuläre, endotheliale und angiogene Aktivität zu testen. Solche Tests umfassen die in den nachstehenden Beispielen angeführten.
Tests zum Testen auf Endothelin-Antagonisten-Aktivität, wie in US-Patent Nr. 5.773.414 offenbart, umfassen einen Ratten-Herzventrikelbindungstest, wo das Polypeptid auf seine Fähigkeit getestet wird, iodierte Endothelin-1-Bindung in einem Rezeptortest zu hemmen, einen Endothelin-Rezeptorbindungstest auf intakte Zellbindung von radiomarkiertem Endothelin-1 unter Verwendung von Nierenarterien-Gefäßzellen glatter Muskulatur von Kaninchen, einen Inositolphosphatakkumulierungstest, wo funktionelle Aktivität in Rat-1-Zellen durch Messung von intrazellulären Werten zweiter Messenger bestimmt wird, einen Arachidonsäurefreisetzungstest, der die Fähigkeit von hinzugefügten Verbindungen misst, endothelinstimulierte Arachidonsäurefreisetzung in kultivierter glatter Muskulatur zu reduzieren, In-vitro-Studien (isoliertes Gefäß) unter Verwendung von Endothel aus männlichen Neuseeland-Kaninchen und In-vivo-Studien unter Verwendung von männlichen Sprague-Dawley-Ratten.
Tests auf Gewebsherstellungsaktivität umfassen unter anderem jene, die in WO 95/16035 (Knochen, Knorpel, Sehne), WO 95/05846 (Nerven, neuronal) und WO 91/07491 (Haut, Endothel) beschrieben sind.
Tests auf Wundheilungsaktivität umfassen z. B. jene, die in Winter, Epidermal Wound Healing, H. I. Maibach und D. T. Rovee, Hrsg., Year Book Medical Publishers, Inc., Chicago, 71–112, wie durch den Artikel von Eaglstein und Mertz, J. Invest. Dermatol. 71, 382–384 (1987), modifiziert, beschrieben sind.
Ein Test zum Screenen auf ein Testmolekül, das auf ein PRO-Polypeptid hinweist, das ein Endothelin-B₁-(ETB₁-)Rezeptorpolypeptid bindet und Signaltransduktionsaktivität moduliert, umfasst die Bereitstellung einer Wirtszelle, die mit einer DNA transfomiert ist, die für Endothelin-B₁-Rezeptorpolypeptid kodiert, das Exponieren der Zellen gegenüber der Testverbindung und Messen der Endothelin-B₁-Rezeptorsignaltransduktionsaktivität wie z. B. in US-Patent Nr. 5.773.223 beschrieben.
Es gibt mehrere Herzhypertrophietests. In-vitro-Tests umfassen Induktion der Verbreitung von erwachsenen Rattenherzmyozyten. In diesem Test werden Ventrikelmyozyten aus einer einzelnen (männlichen Sprague-Dawley-)Ratte isoliert, im Wesentlichen nach einer Modifikation des im Detail von Piper et al., „Adult ventricular rat heart muscle cells", in: Cell Culture Techniques in Heart and Vessel Research, H. M. Piper, Hrsg., Berlin, Springer-Verlag, 36–60 (1990), beschriebenen Verfahrens isoliert. Dieses Verfahren ermöglicht die Isolation von erwachsenen Ventrikelmyozyten und die langfristige Kultur dieser Zellen im stangenförmigen Phänotyp. Es hat sich gezeigt, dass Phenylephrin und Prostglandin-F_2α (PGF_2α) eine Verbreitungsreaktion in diesen erwachsenen Zellen induzieren. Die Hemmung von Myozytenverbreitung, die durch PGF_2α oder PGF_2α Analoga (z. B. Fluprostenol) und Phenylephrin induziert sind, durch verschiedene potenzielle Inhibitoren von Herzhypertrophie wird dann getestet.
Ein Beispiel für einen In-vivo-Test ist ein Test zur Hemmung von Herzhypertrophie, induziert durch Fluprostenol, in vivo. Dieses pharmakologische Modell testet die Fähigkeit des PRO-Polypeptids, Herzhypertrophie, die in Ratten (z. B. männliche Wistar- oder Sprague-Dawley-Ratten) durch subkutane Injektion von Fluprostenol (einem Agonistenanalogon von PGF_2α) induziert wird, zu hemmen. Es ist bekannt, dass Ratten mit pathologischer Herzhypertrophie, die durch Myokardinfarkt induziert ist, chronisch erhöhte Spiegel von extrahierbarem PGF_2α in ihrem Myokard aufweisen. Lai et al., Am. J. Physiol. (Heart Circ. Physiol.) 271, H2197–H2208 (1996). Dementsprechend sind Faktoren, die die Wirkungen von Fluprostenol auf Myokardwachstum in vivo hemmen können, potenziell zur Behandlung von Herzhypertrophie nützlich. Die Wirkungen des PRO-Polypeptids auf Herzhypertrophie werden durch Messung des Gewichts von Herz, Ventrikel und linkem Ventrikel (durch Körpergewicht normalisiert) im Vergleich zu fluprostenolbehandelten Ratten bestimmt, die das PRO-Polypeptid nicht erhalten.
Ein anderes Beispiel für einen In-vivo-Test ist der Drucküberlastungsherzhypertrophietest. Zum In-vivo-Testen ist es üblich, Drucküberlastungsherzhypertrophie durch Konstriktion der abdominalen Aorta von Testtieren zu induzieren. In einer typischen Vorschrift werden Ratten (z. B. männliche Wistar- oder Sprague-Dawley-Ratten) unter Anästhesie behandelt, und die abdominale Aorta jeder Ratte wird knapp unter dem Diaphragma verengt. M. Beznak, Can. J. Biochem. Physiol. 33, 985–94 (1955). Die Aorta wird dann durch eine chirurgische Inzision exponiert, und eine abgestumpfte Nadel wird neben das Gefäß platziert. Die Aorta wird dann mit einer Ligatur von Seidenfaden um die Nadel eingeschnürt, die unmittelbar entfernt wird und das Lumen der Aorta auf den Durchmesser der Nadel reduziert. Dieser Ansatz ist z. B. in Rossi et al., Am. Heart J. 124, 700–709 (1992), und O'Rourke und Reibel, P. S. E. M. B. 200, 95–100 (1992), beschrieben.
In wieder einem anderen In-vivo-Test wurde die Wirkung auf Herzhypertrophie nach experimentell induziertem Myokardinfarkt (MI) gemessen. Akuter MI wird in Ratten durch Ligation der linken Kororararterie induziert und durch eine elektrokardiographi sche Untersuchung nachgewiesen. Eine scheinoperierte Gruppe von Tieren wird auch als Kontrolltiere eingesetzt. Frühere Daten haben gezeigt, dass Herzhypertrophie in der Gruppe von Tieren mit MI gegenwärtig ist, wie durch einen 18%igen Anstieg des Herzgewicht-zu-Körpergewicht-Verhältnisses veranschaulicht wird. Lai et al., siehe oben. Behandlung dieser Tiere mit Kandidatenblockern von Herzhypertrophie, z. B. dem PRO-Polypeptid, stellt wertvolle Information über das therapeutische Potenzial der getesteten Kandidaten bereit. Ein weiterer solcher Test für die Induktion von Herzhypertrophie ist in US-Patent Nr. 5.773.415 unter Verwendung von Sprague-Dawley-Ratten offenbart.
Für Krebs kann eine Vielzahl von bekannten Tiermodellen verwendet werden, um die Rolle der hierin identifizierten Gene in der Entwicklung und Pathogenese von Tumoren besser zu verstehen und um die Wirksamkeit von therapeutischen Kandidatenmitteln, einschließlich Antikörpern und anderer Antagonisten nativer PRO-Polypeptide, wie z. B. Antagonisten in Form kleiner Moleküle, zu testen. Das In-vivo-Wesen solcher Modelle macht diese insbesondere für Reaktionen bei menschlichen Patienten prognostisch: Tiermodelle von Tumoren und Krebs (z. B. Brustkrebs, Colonkrebs, Prostatakrebs, Lungenkrebs etc.) umfassen sowohl nicht-rekombinante als auch rekombinante (transgene) Tiere. Nicht-rekombinante Tiermodelle umfassen z. B. Nagetiermodelle, z. B. Mausmodelle. Solche Modelle können durch Einführung von Tumorzellen in syngenetische Mäuse unter Verwendung von Standardverfahren, z. B. subkutane Injektion, Schwanzveneninjektion, Milzimplantation, intraperitoneale Implantation, Implantation unter der Nierenkapsel oder Orthopinimplanation, z. B. von Colon-Krebszellen, die in Colongewebe implantiert werden, erzeugt werden. Siehe z. B. PCT-Veröffentlichung Nr. WO 97/33551 , veröffentlicht am 18. September 1997. Die vermutlich am häufigsten verwendete Tierspezies in onkologischen Studien sind immundefiziente Mäuse und insbesondere Nacktmäuse. Die Beobachtung, dass die Nacktmaus mit Thymus-Hypoplasie/Aplasie erfolgreich als Wirt für menschliche Tumorxenotransplantate wirken kann, hat zu ihrer weit verbreiteten Verwendung für diesen Zweck geführt. Das autosomale rezessive nu-Gen ist in eine sehr große Zahl verschiedener kongener Stämme von Nacktmäusen eingeführt worden, einschließlich z. B. ASW, A/He, AKR, BALG/c, B10.LP, C17, C3H, C57BL, C57, CBA, DBA, DDD, I/st, NC, NFR, NFS, NFS/N, NZB, NZC, NZW, P, RIII und SJL. Zusätzlich dazu ist eine große Vielzahl an anderen Tieren mit vererbten immunologischen Defekten, die keine Nacktmäuse sind, gezüchtet und als Empfänger von Tumorxenotransplantaten verwendet worden. Für weitere Details siehe z. B. The Nude Mouse in Oncology Research, E. Boven und B. Winograd, Hrsg., CRC Press Inc. (1991).
Die in solche Tiere eingeführten Zellen können von bekannten Tumor-/Krebszelllinien, wie z. B. einer beliebigen der oben angeführten Tumorzelllinien, abstammen und z. B. von der B104-1-1-Zelllinie (stabile NIH-3T3-Zelllinie, transfiziert mit neu-Proto-Onkogen), ras-transfizierten NIH-3T3-Zellen, Caco-2 (ATCC HTB-37) oder einer mäßig gut differenzierten Grad-II-Zelllinie von menschlichem Colon-Adenokarzinom, HT-29 (ATCC HTB-38), oder aus Tumoren und Krebs abstammen. Proben von Tumor- oder Krebszellen können aus Patienten, die Chirurgie unterzogen werden, unter Verwendung von Standardbedingungen erhalten werden, die Gefrieren und Lagern in flüssigem Stickstoff umfassen. Karmali et al., Br. J. Cancer 48, 689–696 (1983).
Tumorzellen können durch eine Vielzahl von Verfahren in Tiere wie z. B. Nacktmäuse eingeführt werden. Der subkutane (s. c.) Raum in Mäusen ist für Tumorimplantation sehr geeignet. Tumoren können s. c. als feste Blöcke, als Nadelbiopsien durch die Verwendung eines Trokars oder als Zellsuspensionen transplantiert werden. Für Festblock- oder Trokarimplantation werden Tumorgewebsfragmente von geeigneter Größe in den s. c.-Raum eingeführt. Zellsuspensionen werden frisch aus primären Tumoren oder stabilen Tumorzelllinien hergestellt und subkutan injiziert. Tumorzellen können auch als subdermale Implantate injiziert werden. An dieser Stelle wird das Inokulum zwischen dem unteren Teil des Hautbindegewebes und des s. c.-Gewebes abgelagert.
Tiermodelle von Brustkrebs können z. B. durch Implantation von Ratten-Neuroblastom-Zellen (aus welchen anfänglich das neu-Onkogen isoliert wurde) oder neu-transformierten NIH-3T3-Zellen in Nacktmäuse, im Wesentlichen wie von Drebin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 9129–9133 (1986), beschrieben, erzeugt werden.
Ähnlich können Tiermodelle von Kolonkrebs bei Tieren, z. B. Nacktmäusen, durch Passagieren von Kolonkrebszellen erzeugt werden, was zum Auftreten von Tumoren in diesen Tieren führt. Ein orthotopes Transplantatmodell von menschlichem Colon-Krebs in Nacktmäusen ist beschrieben worden, z. B. von Wang et al., Cancer Research 54, 4726–4728 (1994), und Too et al., Cancer Research 55, 681–684 (1995). Dieses Modell basiert auf dem so genannten METAMOUSE^TM, das von AntiCancer Inc. (San Diego, Kalifornien) verkauft wird.
Tumoren, die bei Tieren auftreten, können entfernt und in vitro kultiviert werden. Zellen aus den In-vitro-Kulturen können dann in Tiere passagiert werden. Solche Tumoren können als Targets für weiteres Testen oder Arzneimittelscreening dienen. Alternativ dazu können die Tumoren, die aus der Passage resultieren, isoliert werden und RNA aus Zellen vor dem Passagieren und Zellen, die nach einer oder mehreren Passage-Runden isoliert wurden, auf differentielle Expression von Genen von Interesse getestet werden. Solche Passage-Verfahren können mit beliebigen bekannten Tumor- oder Krebszelllinien durchgeführt werden.
Zum Beispiel sind Meth A, CMS4, CMS5, CMS21 und WEHT-164 chemisch induzierte Fibrosarkome von weiblichen BALB/c-Mäusen (DeLeo et al., J. Exp. Med. 146, 720 (1977)), die ein höchst kontrollierbares Modellsystem zum Studium der Anti-Tumoraktivitäten von verschiedenen Mitteln bereitstellen. Palladino et al., J. Immunol. 138, 4023–4032 (1987). Kurz gesagt pflanzen sich Tumorzellen in Zellkultur in vitro fort. Vor Injektion in die Tiere werden die Zelllinien gewaschen und in Puffer bei einer Zelldichte von etwa 10 × 10⁶ bis 10 × 10⁷ Zellen/ml supendiert. Die Tiere werden dann subkutan mit 10 bis 100 μl der Zellsuspension infiziert, worauf in ein bis drei Wochen ein Tumor auftritt.
Zusätzlich dazu kann das Lewis-Lungenkarinom (3LL) von Mäusen, das einer der am ausgiebigsten studierten Versuchstumoren ist, als Untersuchungs-Tumormodell verwendet werden. Wirksamkeit in diesem Tumormodell ist mit vorteilhaften Wirkungen in der Behandlung von menschlichen Patienten verbunden gewesen, bei denen kleinzelliges Lungenkarzinom (SCCL) diagnostiziert wurde. Dieser Tumor kann in normale Mäuse durch Injektion von Tumorfragmenten von einer betroffenen Maus oder von Zellen eingeführt werden, die in Kultur aufrechterhalten werden. Zupi et al., Br. J. Cancer 41, Suppl. 4, 30 (1980). Beweise zeigen, dass Tumoren aus Injektion von sogar einer einzelnen Zelle gestartet werden können und dass ein sehr hoher Anteil an infizierten Tumorzellen überlebt. Für weitere Informationen über dieses Tumormodell siehe Zacharski, Haemostasis 16, 300–320 (1986).
Eine Form zur Beurteilung der Wirksamkeit einer Testverbindung in einem Tumormodell mit einem implantierten Tumor ist es, die Größe des Tumors vor und nach Behandlung zu messen. Traditionellerweise ist die Größe der implantierten Tumoren mit einer Schublehre in zwei oder drei Dimensionen gemessen worden. Das Maß, das auf zwei Dimensionen beschränkt ist, gibt die Größe des Tumors nicht richtig wieder; deshab wird es üblicherweise unter Verwendung einer mathematischen Formel in das entsprechende Volumen umgewandelt. Jedoch ist die Abmessung der Tumorgröße sehr ungenau. Die therapeutischen Wirkungen eines Arzneimittelkandidaten können besser als behandlungsinduzierte Wachstumsverzögerung und spezifische Wachstumsverzögerung beschrieben werden. Eine andere wichtige Variable in der Beschreibung von Tumorwachstum ist die Tumorvolumenverdopplungszeit. Computerprogramme zur Berechnung und Beschreibung von Tumorwachstum sind ebenfalls erhältlich, wie z. B. das Programm, von dem von Rygaard und Spang-Thomsen berichtet worden ist, Proc. 6th Int. Workshop an Immune-Deficient Animals, Wu und Sheng, Hrsg., Basel, 301 (1989). Es versteht sich jedoch, dass Nekrose und entzündliche Reaktionen nach Behandlung tatsächlich zu einem Anstieg der Tumorgröße führen, zumindest anfänglich. Deshalb müssen diese Veränderungen behutsam durch eine Kombination eines morphometrischen Verfahrens und durchflusszytometrischer Analyse überwacht werden.
Weiters können rekombinante (transgene) Tiermodelle erzeugt werden, indem der Kodierabschnitt des PRO-Gens, das hierin identifiziert wird, unter Verwendung von Standardverfahren zur Produktion von transgenen Tieren in das Genom von Tieren von Interesse eingeführt wird. Tiere, die als Target für transgene Manipulation dienen, umfassen ohne Einschränkung Mäuse, Ratten, Kaninchen, Meerschweinchen, Schafe, Ziegen, Schweine und nicht-menschliche Primaten, z. B. Paviane, Schimpansen und Affen. Verfahren, von denen im Fachgebiet bekannt ist, dass sie ein Transgen in solche Tiere einführen, umfassen Pronukleus-Mikroinjektion ( US-Patent Nr. 4.873.191 ), retrovirus-vermittelten Gentransfer in Keimbahnen (z. B. Van der Putten et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 6148–615 (1985)), Gen-Targeting in embryonale Stammzellen (Thompson et al., Cell 56, 313–321 (1989)), Elektroporation von Embryos (Lo, Mol. Cell Biol. 3, 1803–1814 (1983)) und spermavermittelten Gentransfer, Lavitrano et al., Cell 57, 717–73 (1989). Für einen Überblicksartikel siehe z. B. US-Patent Nr. 4.736.866 .
Zum Zwecke der vorliegenden Erfindung umfassen transgene Tiere jene Tiere, die das Transgen nur in einem Teil ihrer Zellen tragen („Mosaiktiere"). Das Transgen kann entweder als einzelnes Transgen oder in Concatameren, z. B. Kopf-zu-Kopf- oder Kopf-zu-Schwanz-Tandems, integriert werden. Selektive Einführung eines Transgens in einen besonderen Zelltyp ist beispielsweise auch durch folgendes Verfahren von Lasko et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 6232–636 (1992), möglich.
Die Expression des Transgens in transgenen Tieren kann durch Standardverfahren überwacht werden. Zum Beispiel können Southern-Blot-Analyse oder PCR-Amplifikation verwendet werden, um die Integration des Transgens zu verifizieren. Der Grad der mRNA-Expression kann dann unter Verwendung von Verfahren wie In-situ-Hybridisierung, Northern-Blot-Analyse, PCR oder Immunzytochemie analysiert werden. Die Tiere werden weiters auf Zeichen für Tumor- oder Krebsentwicklung untersucht.
Alternativ dazu können „Knock-out"-Tiere konstruiert werden, die ein defektes oder verändertes, für ein hierin identifiziertes PRO-Polypeptid kodierendes Gen als ein Resultat homologer Rekombination zwischen dem endogenen, für das PRO-Polypeptid kodierenden Gen und geänderter genomischer, für dasselbe Polypeptid kodierender DNA, eingeführt in eine embryonale Zelle des Tiers, aufweist. Beispielsweise kann für ein bestimmtes PRO-Polypeptid kodierende cDNA verwendet werden, um für das Polypeptid kodierende genomische DNA gemäß den bekannten Verfahren zu klonieren. Ein Abschnitt der genomischen, für ein bestimmtes PRO-Polypeptid kodierenden DNA kann deletiert oder durch ein anderes Gen ersetzt werden, wie beispielsweise durch ein Gen, das für einen selektierbaren Marker kodiert, der verwendet werden kann, um Integration zu überwachen. Typischerweise werden mehrere kb unveränderter flankierender DNA (sowohl an den 5'- als auch 3'-Enden) in den Vektor eingebunden. Siehe z. B. Thomas & Capecchi, Cell 51, 503 (1987), für eine Beschreibung homologer Rekombinationsvektoren. Der Vektor wird in eine embryonale Stammzellenlinie (z. B. durch Elektroporation) eingeführt, und Zellen, in denen sich die eingeführte DNA mit der endogenen DNA homolog rekombiniert hat, werden ausgewählt. Siehe z. B. Li et al., Cell 69, 915 (1992). Die ausgewählten Zellen werden dann in eine Blastozyste eines Tiers (z. B. einer Maus oder Ratte) injiziert, um Aggregationschimären zu bilden. Siehe z. B. Bradley, in: Teratocarcinomas and Embryonic Stern Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson (Hrsg.) (IRL, Oxford, 1987), 113–152. Ein chimärer Embryo kann dann in ein geeignetes, scheinschwangeres weibliches Ammentier implantiert werden und der Embryo ausgetragen werden, um ein „Knock-out"-Tier zu schaffen. Nachkommenschaft, die die homolog rekombinierte DNA in ihren Keimzellen trägt, kann mittels Standardverfahren identifiziert werden und kann verwendet werden, um Tiere zu züchten, in denen alle Zellen des Tiers die homolog rekombinierte DNA enthalten. Knockout-Tiere können beispielsweise durch ihre Fähigkeit, Abwehr gegen bestimmte pathologische Leiden aufzubauen, sowie durch ihre Entwicklung pathologischer Leiden wegen des fehlenden PRO-Polypeptids charakterisiert sein.
Die Wirksamkeit von Antikörpern, die sich spezifisch an die PRO-Polypeptide, die hierin identifiziert sind, und andere Arzneimittelkandidaten binden, können auch in der Behandlung von spontanen Tiertumoren getestet werden. Ein geeignetes Target für solche Studien ist das feline orale Plattenepithelkarzinom (SCC). Felines orales SCC ist ein höchst invasiver maligner Tumor, der die häufigste orale Malignität bei Katzen ist, die für über 60% der oralen Tumoren verantwortlich ist, von denen bei dieser Spezies berichtet wird. Es metastasiert selten an entfernten Stellen, obwohl diese geringe Inzidenz von Metastasen nur eine Reflektion der kurzen Überlebenszeiten für Katzen mit diesem Tumor sein kann. Diese Tumoren sind üblicherweise nicht der Chirurgie zugänglich, primär aufgrund der Anatomie der felinen oralen Kavitat. Derzeit gibt es keine wirksame Behandlung dieses Tumors. Vor Eintritt in die Studie wird jede Katze vollständiger klinischer Untersuchung und Biopsie unterzogen und durch Computertomographie (CT) untersucht. Katzen, bei denen sublinguale orale Plattenepithelzelltumoren diagnostiziert werden, sind aus dieser Studie ausgenommen. Die Zunge kann als Folge eines solchen Tumors paralysiert sein, und sogar wenn die Behandlung den Tumor tötet, ist es möglich, dass die Tiere nicht in der Lage sind, selbst Nahrung aufzunehmen. Jede Katze wird wiederholt über einen längeren Zeitraum behandelt. Es werden Fotografien der Tumoren während des Behandlungszeitraums täglich und zu jeder nachfolgenden wiederholten Überprüfung aufgenommen. Nach Behandlung wird jede Katze einem weiteren CT-Scan unterzogen. CT-Scans und Thoraxradiogramme werden danach alle 8 Wochen beurteilt. Die Daten werden auf Unterschiede im Überleben, in der Reaktion und Toxizität im Vergleich mit Kontrollgruppen beurteilt. Positive Reaktion kann Nachweis von Tumorregression erfordern, vorzugsweise mit einer Verbesserung der Lebensqualität und/oder erhöhter Lebensdauer.
Zusätzlich dazu können andere spontane Tiertumoren, wie z. B. Fibrosarkom, Adenokarzinom, Lymphom, Chondrom oder Leiomyosarkom, von Hunden, Katzen und Pavianen getestet werden. Von diesen ist Brustadenokarzinom bei Hunden und Katzen ein bevorzugtes Modell, da sein Auftreten und Verhalten sehr ähnlich jenem bei Menschen ist. Jedoch ist die Verwendung dieses Modells durch das seltene Auftreten dieser Form von Tumor bei Tieren eingeschränkt.
Andere fachbekannte kardiovaskuläre, endotheliale und angiogene In-vitro- und In-vivo-Tests sind hierin ebenfalls geeignet.
ii. Gewebsverteilung
Die Ergebnisse der kardiovaskulären, endothelialen und angiogenen Tests hierin können durch weitere Studien verifiziert werden, wie z. B. durch Bestimmung der mRNA-Expression in verschiedenen menschlichen Geweben.
Wie zuvor erwähnt, kann Genamplifikation und/oder Genexpression in verschiedenen Geweben durch herkömmliches Southern-Blotting, Northern-Blotting, um die Transkription von mRNA zu quantifizieren (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 5201–5205 (1980)), Dot-Blotting (DNA-Analyse) oder In-situ-Hybridisierung unter Verwendung einer geeignet markierten Sonde, basierend auf den hierin bereitgestellten Sequenzen, gemessen werden. Alternativ dazu können Antikörper verwendet werden, die spezifische Duplexe erkennen können, einschließlich DNA-Duplexe, RNA-Duplexe und DNA-RNA-Hybrid-Duplexe oder DNA-Protein-Duplexe.
Genexpression in verschiedenen Geweben kann alternativ dazu durch immunologische Verfahren getestet werden, wie z. B. immunhistochemisches Färben von Gewebsabschnitten und Test von Zellkultur oder Körperflüssigkeiten, um die Expression von Genprodukt direkt zu quantifizieren. Antikörper, die zur immunhistochemischen Färbung und/oder für Tests von Probenflüssigkeiten geeignet sind, können entweder monoklonal oder polyklonal sein und können in einem beliebigen Säugetier hergestellt werden. Auf herkömmliche Weise können die Antikörper gegen ein Nativsequenz-PRO-Polypeptid oder gegen ein synthetisches Peptid basierend auf den hierin bereitgestellten DNA-Sequenzen oder gegen eine exogene Sequenz bereitgestellt werden, die an PRO-DNA fusioniert ist und für ein spezifisches Antikörperepitop kodiert. Allgemeine Verfahren zur Herstellung von Antikörpern und spezielle Protokolle für In-situ-Hybridisierung sind hierin nachstehend bereitgestellt.
iii. Antikörperbindungsstudien
Die Ergebnisse der kardiovaskulären, endothelialen und angiogenen Studie können weiters durch Antikörperbindungsstudien verifiziert werden, bei welchen die Fähigkeit von Anti-PRO-Antikörpern, die Wirkung von PRO-Polypeptiden auf endotheliale Zellen oder andere Zellen, die in den kardiovaskulären, endothelialen und angiogenen Tests verwendet werden, zu hemmen, getestet wird. Beispielhafte Antikörper umfassen polyklonale, monoklonale, humanisierte, bispezifische und Heterokonjugatantikörper, deren Herstellung nachstehend beschrieben ist.
Antikörperbindungsstudien können in einem beliebigen bekannten Testverfahren durchgeführt werden, wie z. B. kompetitiven Bindungstests, direkten und indirekten Sandwichtests und Immunpräzipitationstests. Zola, Monoclonal Antibodies, A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., 147–158 (1987).
Kompetitive Bindungstests basieren auf der Fähigkeit eines markierten Standards, mit dem Testprobenanalyten um die Bindung mit einer beschränkten Menge von Antikörpern zu konkurrieren. Die Menge von Targetprotein in der Testprobe ist umgekehrt proportional zur Menge des Standards, die an die Antikörper gebunden wird. Um die Bestimmung der Menge von Standard zu erleichtern, die gebunden wird, werden die Antikörper vorzugsweise vor oder nach der Konkurrenz unlöslich gemacht, sodass der Standard und Analyt, die an die Antikörper gebunden sind, auf einfache Weise vom Standard und Analysten getrennt werden können, die ungebunden bleiben.
Sandwich-Tests umfassen die Verwendung von zwei Antikörpern, wobei jeder in der Lage ist, sich an einen anderen immunogenen Abschnitt oder ein anderes immunogene Epitop des zu detektierenden Proteins zu binden. In einem Sandwichtest ist der Testprobenanalyt durch einen ersten Antikörper gebunden, der an einem festen Träger immobilisiert ist, und danach bindet ein zweiter Antikörper an den Analyt, wodurch ein unlöslicher dreiteiliger Komplex gebildet wird. Siehe z. B. US-Patent Nr. 4.376.110 . Der zweite Antikörper kann selbst mit einer detektierbaren Gruppierung markiert sein (direkte Sandwichtests) oder kann unter Verwendung eines Anti-Immunglobulin-Antikörpers gemessen werden, der mit einer detektierbaren Gruppierung markiert ist (indirekter Sandwich-Test). Zum Beispiel ist eine Form von Sandwichtest ein ELISA-Test, in diesem Fall ist die detektierbare Gruppierung ein Enzym.
Für Immunhistochemie kann die Gewebsprobe frisch oder gefroren sein oder in Paraffin eingebettet sein und mit einem Konservierungsmittel, wie z. B. Formalin, fixiert sein.
iv. Zellbasierte Tumortests
Zellbasierte Tests und Tiermodelle für kardiovaskuläre, endotheliale und angiogene Erkrankungen, wie z. B. Tumoren, können verwendet werden, um die Ergebnisse eines hierin beschriebenen kardiovaskulären, endothelialen und angiogenen Tests zu verifizieren und die Beziehung zwischen den hierin identifizierten Genen und der Entwicklung und Pathogenese von unerwünschtem kardiovaskulärem, endothelialem und angiogenem Zellwachstum weiter zu verstehen. Die Rolle von Genprodukten, die hierin identifiziert sind, in der Entwicklung und Pathologie von unerwünschtem kardiovaskulärem, endothelialem, angiogenem Zellwachstum, z. B. Tumorzellen, kann unter Verwendung von Zellen oder Zelllinien getestet werden, die identifiziert wurden, dass sie durch das hierin beschriebene PRO-Polypeptid stimuliert oder gehemmt werden. Solche Zellen umfassen z. B. jene, die in den nachstehenden Beispielen dargelegt sind.
In einem anderen Ansatz werden Zellen eines Zelltyps, von denen bekannt ist, dass sie in eine bestimmte kardiovaskuläre, endotheliale und angiogene Erkrankung involviert sind, mit den hierin beschriebenen cDNAs transfiziert, und die Fähigkeit dieser cDNAs, exzessives Wachstum zu induzieren oder Wachstum zu hemmen, wird analysiert. Wenn die kardiovaskuläre, endotheliale und angiogene Erkrankung Krebs ist, umfassen geeignete Tumorzellen z. B. stabile Tumorzelllinien wie z. B. B104-1-1-Zelllinie (stabile NIH-3T3-Zelllinie, mit dem neu-Proto-Onkogen transfiziert) und ras-transfizierte NIH-3T3-Zellen, die mit dem gewünschten Gen transfiziert werden können und für Tumorwachstum überwacht werden können. Solche transfizierten Zelllinien können dann verwendet werden, um die Fähigkeit von poly- oder monoklonalen Antikörpern oder Antikörperzusammensetzungen zu testen, um tumorigenes Zellwachstum durch Ausübung zytostatischer oder zytotoxischer Aktivität auf das Wachstum von transformierten Zellen oder durch Vermittlung von antikörperabhängiger Zellzytotoxizität (ADCC) zu hemmen. Zellen, die mit den Kodiersequenzen der hierin identifizierten Gene transfiziert sind, können weiters verwendet werden, um Arzneimittelkandidaten zur Behandlung von kardiovaskulären, endothelialen und angiogenen Erkrankungen, wie z. B. Krebs, zu identifizieren.
Zusätzlich dazu können primäre Kulturen, die von Tumoren in transgenen Tieren (wie oben beschrieben) abstammen, in zellbasierten Tests hierin verwendet werden, obwohl stabile Zelllinien bevorzugt sind. Verfahren zur Ableitung von kontinuierlichen Zelllinien aus transgenen Tieren sind fachbekannt. Siehe z. B. Small et al., Mol. Cell. Biol. 5, 642–648 (1985).
v. Gentherapie
Die PRO-Polypeptide hierin und die Polypeptidylagonisten und -Antagonisten können gemäß der vorliegenden Erfindung durch Expression solcher Polypeptide in vivo verwendet werden, was oft als Gentherapie bezeichnet wird.
Es gibt zwei Hauptansätze, um die Nucleinsäure (gegebenenfalls in einem Vektor enthalten) in die Patientenzellen zu bringen: in vivo und ex vivo. Für In-vivo-Zufuhr wird die Nucleinsäure direkt in den Patienten injiziert, üblicherweise an den Stellen, wo das PRO-Polypeptid erforderlich ist, d. h. die Stelle der Synthese des PRO-Polypeptids, wenn bekannt, und die Stelle (z. B. Wunde), wo die biologische Aktivität des PRO-Polypeptids notwendig ist. Für Ex-vivo-Behandlung werden die Patientenzellen entfernt, die Nucleinsäure in diese isolierten Zellen eingeführt und die modifizierten Zellen dem Patienten entweder direkt oder z. B. eingekapselt in poröse Membranen verabreicht, die in den Patienten transplantiert werden (siehe z. B. US-Patent Nr. 4.892.538 und 5.283.187 ). Es gibt eine Vielzahl von Verfahren, die zur Einführung von Nucleinsäuren in lebensfähige Zellen erhältlich sind. Die Verfahren variieren abhängig davon, ob die Nucleinsäure in vitro in kultivierte Zellen transferiert wird oder in vivo in die Zellen des beabsichtigen Wirts transferiert wird. Geeignete Verfahren zum Transfer von Nucleinsäure in Säugetierzellen in vitro umfassen die Verwendung von Liposomen, Elektroporation, Mikroinjektion, Transfektion, Zellfusion, DEAE-Dextran, das Calciumphosphatfällungsverfahren etc. Transduktion umfasst die Assoziation eines replikationsdefekten, rekombinanten viralen (vorzugsweise retroviralen) Teilchens mit einem Zellrezeptor, gefolgt von der Einführung der Nucleinsäuren, die in dem Teilchen enthalten sind, in die Zelle. Ein häufig verwendeter Vektor für Ex-vivo-Zufuhr des Gens ist ein Retrovirus.
Die zur Zeit bevorzugten In-vivo-Nucleinsäuretransferverfahren umfassen Transfektion über virale oder nicht-virale Vektoren (wie z. B. Adenovirus, Lentivirus, Herpessimplex-I-Virus oder adenoassoziiertes Virus (AAV)) und lipidbasierte Systeme (nützliche Lipide für lipid-vermittelten Transfer des Gens sind z. B. DOTMA, DOPE und DC-Chol, siehe z. B. Tonkinson et al., Cancer Investigation 14(1), 54–65 (1996)). Die bevorzugtesten Vektoren zur Verwendung in Gentherapie sind Viren, am bevorzugtesten Adenoviren, AAV, Lentiviren oder Retroviren. Ein Virusvektor wie z. B. ein retroviraler Vektor umfasst zumindest einen Transkriptionspromotor/Enhancer oder lokusdefinierende/s Element(e) oder andere Elemente, die Genexpression durch andere Mittel, wie z. B. alternierendes Spleißen, Kern-RNA-Export oder Posttranslationsmodifikation von Messenger, kontrollieren. Zusätzlich dazu umfasst ein Virusvektor, wie z. B. ein retroviraler Vektor, ein Nucleinsäuremolekül, das, wenn es in Gegenwart eines Gens transkribiert wird, das für das PRO-Polypeptid kodiert, operabel daran gebunden ist und als Translationsinitiationssequenz wirkt. Solche Vektorkonstrukte umfassen auch ein Verpackungssignal, lange terminale Wiederholungen (LTRs) oder Abschnitte davon und Positiv- und Negativstrang-Primerbindungsstellen, die für das Virus geeignet sind, das verwendet wird (wenn diese nicht schon im Virusvektor gegenwärtig sind). Zusätzlich dazu umfasst ein solcher Vektor typischerweise eine Signalsequenz zur Sekretion des PRO-Polypeptids aus einer Wirtszelle, in welche es platziert wird. Vorzugsweise ist die Signalsequenz für diesen Zweck eine Säugetiersignalsequenz, am bevorzugtesten die native Signalsequenz für das PRO-Polypeptid. Gegebenenfalls kann das Vektorkonstrukt auch ein Signal, das Polyadenylierung steuert, sowie eine oder mehrere Restriktionsstellen und eine Translationsterminationssequenz umfassen. Beispielsweise umfassen solche Vektoren typischerweise eine 5'-LTR, eine tRNA-Bindungsstelle, ein Verpackungssignal, einen Ursprung einer Zweitstrang-DNA-Synthese und eine 3'-LTR oder einen Abschnitt davon. Andere Vektoren können verwendet werden, die nicht-viral sind, wie z. B. kationische Lipide, Polylysin und Dendrimere.
In manchen Situationen ist es wünschenswert, die Nucleinsäurequelle mit einem Mittel bereitzustellen, das auf die Targetzellen gerichtet ist, wie beispielsweise mit einem Antikörper, der für ein Zelloberflächenmembranprotein oder für die Targetzelle spezifisch ist, mit einem Liganden für einen Rezeptor auf der Targetzelle usw. Werden Liposomen verwendet, so können Proteine, die sich an ein mit Endozytose assoziiertes Zelloberflächenmembranprotein binden, zum Targeting und/oder zur Erleichterung der Aufnahme verwendet werden, z. B. Capsidproteine oder Fragmente davon, die für einen bestimmten Zelltyp tropisch sind, Antikörper für Proteine, die beim Kreislauf Internalisierung erfahren, und Proteine, die auf intrazelluläre Lokalisierung abzielen und intrazelluläre Halbwertszeit verlängern. Das Verfahren der rezeptorvermittelten Endozytose wird beispielsweise von Wu et al., J. Biol. Chem. 262, 4429–4432 (1987), und von Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3410–3414 (1990), beschrieben. Ein Überblick zu Genmarkierungs- und Gentherapie-Arbeitsvorschriften wird in Anderson et al., Science 256, 808–813 (1992), geliefert. Siehe auch WO 93/25673 und die dort zitierten Verweise.
Geeignete Gentherapie und Verfahren zur Herstellung von retroviralen Teilchen und strukturellen Proteinen sind z. B. in US-Patent Nr. 5.681746 beschrieben.
vi. Verwendung von Gen als diagnostisches Mittel
Diese Erfindung betrifft auch die Verwendung des Gens, das für das PRO-Polypeptid kodiert, als diagnostisches Mittel. Detektion einer mutierten Form des PRO-Polypeptids ermöglicht eine Diagnose einer kardiovaskulären, endothelialen und angiogenen Erkrankung oder einer Empfindlichkeit für eine kardiovaskuläre, endotheliale und angiogene Erkrankung, wie z. B. einen Tumor, da Mutationen im PRO-Polypeptid Tumoren verursachen können.
Individuen, die Mutationen in den Genen tragen, die für ein menschliches PRO-Polypeptid kodieren, können auf DNA-Ebene durch eine Vielzahl von Verfahren detektiert werden. Nucleinsäuren zur Diagnose können aus einer Patientenzelle erhalten werden, wie z. B. aus Blut, Urin, Speichel, Gewebsbiopsie und Autopsiematerial. Die genomische DNA kann direkt zur Detektion verwendet werden oder vor Analyse enzymatisch unter Verwendung von PCR amplifiziert werden (Saiki et al., Nature 324, 163–166 (1986)). RNA oder cDNA kann auch für denselben Zweck verwendet werden. Als Beispiel können PCR-Primer, die zur Nucleinsäure komplementär sind, die für das PRO-Polypeptid kodiert, verwendet werden, um die PRO-Polypeptidmutationen zu identifizieren und analysieren. Zum Beispiel können Deletionen und Insertionen durch eine Veränderung der Größe des amplifizierten Produkts im Vergleich zum normalen Genotyp detektiert werden. Punktmutationen können durch Hybridisierung von amplifizierter DNA an radiomarkierte RNA, die für das PRO-Polypeptid kodiert, oder alternativ dazu radiomarkierte Antisense-DNA-Sequenzen, die für das PRO-Polypeptid kodieren, identifiziert werden. Perfekt gepaarte Sequenzen können von fehlgepaarten Duplexen durch RNAse-A-Verdau oder durch Unterschiede in Schmelztemperaturen unterschieden werden.
Genetisches Testen basierend auf DNA-Sequenzunterschieden kann durch Detektion der Änderung der elektrophoretischen Mobilität von DNA-Fragmenten in Gelen mit oder ohne Denaturierungsmittel erreicht werden. Kleine Sequenzdeletionen und -insertionen können durch hochauflösende Gelektrophorese visualisiert werden. DNA-Fragmente verschiedener Sequenzen können auf denaturierenden Formamidin-Gradientengelen unterschieden werden, in welchen die Mobilitäten von verschiedenen DNA-Fragmenten an verschiedenen Positionen gemäß ihrer besonderen Schmelz- oder partiellen Schmelztemperaturen in Gel verzögert sind. Siehe z. B. Myers et al., Science 230, 1242 (1985).
Sequenzveränderungen an spezifischen Stellen können auch durch Nuclease-Schutztests, wie z. B. RNAse- und S1-Schutz, und/oder das chemische Spaltverfahren, z. B. Cotton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 4397–4401 (1985), enthüllt werden.
Daher kann die Detektion einer spezifischen DNA-Sequenz durch Verfahren, wie z. B. Hybridisierung, RNase-Schutz, chemische Spaltung, direkte DNA-Sequenzierung, oder die Verwendung von Restriktionsenzymen, z. B. Restriktionsfragmentlängenpolymorphismen (RFLP), und Southern-Blotting von genomischer DNA, erreicht werden.
vii. Verwendung zur Detektion von PRO-Polypeptidspiegeln
Zusätzlich zur herkömmlicheren Gelelektrophorese und DNA-Sequenzierung können Mutationen auch durch In-situ-Analyse detektiert werden.
Expression von Nucleinsäure, die für das PRO-Polypeptid kodiert, kann mit Gefäßerkrankung oder Neovaskularisierung verbunden sein, die mit Tumorbildung assoziiert ist. Wenn das PRO-Polypeptid eine Signalsequenz aufweist und die mRNA in Endothelzellen höchst exprimiert wird und in einem geringeren Grad in Zellen glatter Muskulatur, zeigt dies, dass das PRO-Polypeptid in Serum vorliegt. Dementsprechend kann ein Anti-PRO-Polypeptidantikörper verwendet werden, um Gefäßerkrankung oder Neovaskularisierung zu diagnostizieren, die mit Tumorbildung assoziiert ist, da ein geändertes Ausmaß dieses PRO-Polypeptids solche Erkrankungen anzeigen könnte.
Ein Konkurrenztest kann verwendet werden, worin Antikörper, die für das PRO-Polypeptid spezifisch sind, an einen festen Träger angeheftet werden, und das markierte PRO-Polypeptid und eine Probe, die von dem Wirt stammt, werden über den festen Träger geführt, und das Ausmaß der detektierten Markierung, die an den festen Träger angeheftet ist, kann mit einer Menge des PRO-Polypeptids in der Probe in Verbindung gebracht werden.
viii. Chromosomenkartierung
Die Sequenzen der vorliegenden Erfindung sind ebenfalls für Chromosomenidentifikation wertvoll. Die Sequenz ist spezifisch auf eine spezielle Stelle auf einem individuellen menschlichen Chromosom ausgerichtet und kann damit hybridisieren. Weiters gibt es derzeit Bedarf an der Identifikation von speziellen Stellen auf dem Chromosom. Wenige Chromosomenmarkierungsreagenzien, basierend auf den tatsächlichen Sequenzdaten (Wiederholungspolymorphsimen), sind derzeit für die Markierung von Chromosomenstellen erhältlich. Die Kartierung von DNAs mit Chromoso men gemäß der vorliegenden Erfindung ist ein wichtiger erster Schritt in der Korrelation jener Sequenzen mit Genen, die mit der Erkrankung assoziiert sind.
Kurz gesagt, Sequenzen können an Chromosomen kartiert werden, indem PCR-Primer (vorzugsweise 15–25 bp) aus der cDNA hergestellt werden. Computeranalyse für die nicht-translatierte 3'-Region wird verwendet, um rasch Primer auszuwählen, die sich über nicht mehr als ein Exon in der genomischen DNA erstrecken, wodurch das Amplifikationsverfahren kompliziert wird. Diese Primer werden dann zum PCR-Screening von somatischen Zellhybriden verwendet, die individuelle menschliche Chromosomen enthalten. Nur jene Hybride, die das menschliche Gen enthalten, das dem Primer entspricht, erbringen ein amplifiziertes Fragment.
PCR-Kartierung von Somazellhybriden ist ein rasches Verfahren zum Zuordnen einer besonderen DNA zu einem speziellen Chromosom. Unter Verwendung der vorliegenden Erfindung mit denselben Oligonucleotidprimern kann Sublokalisierung mit Tafeln von Fragmenten aus spezifischen Chromosomen oder Pools von großen genomischen Klonen auf analoge Art erreicht werden. Andere Kartierungsstrategien, die auf ähnliche Weise verwendet werden können, um ihr Chromosom zu kartieren, umfassen In-situ-Hybridisierung, Präscreening mit markierten durchfluss-sortierten Chromosomen und Präselektion durch Hybridisierung, um chromosomenspezifische cDNA-Bibliotheken herzustellen.
Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) eines cDNA-Klons zu einer Methaphasen-Chromosomenverbreitung kann verwendet werden, um eine präzise Chromosomenstelle in einem Schritt bereitzustellen. Dieses Verfahren kann mit cDNA verwendet werden, die 500 oder 600 Basen kurz ist, jedoch weisen Klone von mehr als 2.000 bp eine größere Wahrscheinlichkeit auf, sich an eine einzigartige Chromosomenstelle mit ausreichender Signalintensität für einfache Detektion zu binden. FISH erfordert die Verwendung von Klonen, von welchen das Gen, das für das PRO-Polypeptid kodiert, abgeleitet wurde, und je länger desto besser. Zum Beispiel sind 2.000 bp gut, 4.000 bp besser und mehr als 4.000 bp wahrscheinlich nicht notwendig, um in einem vernünftigen Prozentsatz der Zeit gute Ergebnisse zu erhalten. Für einen Überblick über dieses Verfahren siehe Verna et al., Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York (1988).
Sobald eine Sequenz an eine präzise Chromosomenstelle kartiert worden ist, kann die physikalische Position der Sequenz auf dem Chromosom mit Daten einer genetischen Karte in Verbindung gebracht werden. Solche Daten sind z. B. in V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man (online erhältlich über Johns Hopkins University Welch Medical Library), zu finden. Die Beziehung zwischen Genen und Erkrankungen, die auf derselben Chromosomenregion kartiert worden sind, wird dann durch Bindungsanalyse identifiziert (Co-Vererbung von physisch angrenzenden Genen).
Weiters ist es notwendig, die Unterschiede in der cDNA oder genomischen Sequenz zwischen betroffenen und nicht-betroffenen Individuen festzustellen. Wenn eine Mutation bei einigen oder allen betroffenen Individuen zu beobachten ist, aber nicht bei normalen Individuen, verursacht die Mutation wahrscheinlich die Erkrankung.
Mit derzeitiger Auflösung von physikalischen Kartierungs- und genetischen Katierungsverfahren kann eine cDNA, die auf einer Chromosomenregion exakt lokalisiert werden kann, die mit der Erkrankung assoziiert ist, eines zwischen 50 und 500 potenziell verursachenden Genen sein. (Dies geht von 1-Megabasen-Kartierungsauflösung und einem Gen pro 20 kb aus.)
ix. Screeningtests für Arzneimittelkandidaten
Diese Erfindung umfasst Verfahren zum Screenen von Verbindungen, um jene zu identifizieren, die das PRO-Polypeptid nachahmen (Agonisten) oder die Wirkung des PRO-Polypeptids unterbinden (Antagonisten). Screeningtests für Antagonisten-Arzneimittelkandidaten sind entworfen worden, um Verbindungen zu identifizieren, die sich an das PRO-Polypeptid, für die die hierin identifizierten Gene kodiert, binden oder mit ihnen Komplexe bilden oder die sonst die Wechselwirkung der kodierten Polypeptide mit anderen Zellproteinen stören. Solche Screeningtests umfassen Tests, die für Hochdurchsatzscreening von chemischen Bibliotheken zugänglich sind, wo durch sie sich besonders gut zur Identifikation niedermolekularer Arzneimittelkandidaten eignen.
Die Tests können in zahlreichen verschiedenen Formaten durchgeführt werden, einschließlich Protein-Protein-Bindungstests, biochemischer Screeningtests, Immuntests und zellbasierter Tests, die auf dem Gebiet der Erfindung eingehend beschrieben sind.
Alle Tests für Antagonisten gleichen sich darin, dass sie das Kontaktieren des Arzneimittelkandidaten mit einem PRO-Polypeptid, für das eine hierin identifizierte Nucleinsäure kodiert, unter Bedingungen und eine ausreichende Zeit lang erfordern, um diese zwei Komponenten in Wechselwirkung zu setzen.
Bei Bindungstests manifestiert sich die Wechselwirkung in Form einer Bindung, und der gebildete Komplex kann im Reaktionsgemisch isoliert oder nachgewiesen werden. In einer bestimmten Ausführungsform wird das durch das hierin identifizierte Gen kodierte PRO-Polypeptid oder der Arzneimittelkandidat an einer festen Phase, z. B. einer Mikrotiterplatte, durch kovalente oder nicht-kovalente Bindungen immobilisiert. Nicht-kovalente Bindung erfolgt im Allgemeinen durch Beschichten der festen Oberfläche mit einer Lösung des PRO-Polypeptids und Trocknen. Alternativ dazu kann ein immobilisierter Antikörper, z. B. ein monoklonaler Antikörper, der für das zu immobilisierende PRO-Polypeptid spezifisch ist, verwendet werden, um es an einer festen Oberfläche zu verankern. Der Test wird durch Zusetzen der nicht-immobilisierten Komponente, die mit einer nachweisbaren Markierung markiert sein kann, zur immobilisierten Komponente, z. B. der beschichteten Oberfläche, die die verankerte Komponente aufweist, durchgeführt. Sobald die Reaktion abgeschlossen ist, werden die nicht-umgesetzten Komponenten z. B. durch Waschen entfernt, und die an der festen Oberfläche verankerten Komplexe werden nachgewiesen. Trägt die ursprünglich nicht-immobilisierte Komponente eine nachweisbare Markierung, so weist die Detektion von an der Oberfläche immobilisierter Markierung darauf hin, dass Komplexbildung stattgefunden hatte. Trägt die ursprünglich nicht-immobilisierte Komponente keine Markierung, kann Komplexbildung beispielsweise durch Verwendung ei nes markierten Antikörpers, der den immobilisierten Komplex spezifisch bindet, nachgewiesen werden.
Zeigt die Kandidatenverbindung mit einem bestimmten PRO-Polypeptid, für das ein hierin identifiziertes Gen kodiert, Wechselwirkung, bindet sich jedoch nicht daran, so kann ihre Wechselwirkung mit diesem Polypeptid mittels zur Detektion von Protein-Protein-Wechselwirkungen bekannter Verfahren getestet werden. Solche Tests umfassen herkömmliche Ansätze, wie z. B. Vernetzung, Co-Immunfällung und Co-Reinigung mittels Gradienten oder chromatographischer Säulen. Darüber hinaus können Protein-Protein-Wechselwirkungen unter Verwendung eines auf Hefe basierenden genetischen Systems beobachtet werden, das von Fields & Mitarbeitern (Fields & Song, Nature (London) 340, 245–246 (1989); Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 9578–9582 (1991)), beschrieben wurde, wie von Chevray & Nathans, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 5789–5793 (1991), offenbart. Zahlreiche Transkriptionsaktivatoren, wie z. B. Hefe-GAL4, bestehen aus zwei physikalisch getrennten modularen Domänen, wobei die eine als die DNA-Bindungsdomäne und die andere als die Transkriptions-Aktivierungsdomäne agiert. Das in den obigen Veröffentlichungen beschriebene Hefeexpressionssystem (im Allgemeinen als das „Zweihybridsystem" bezeichnet) profitiert von dieser Eigenschaft und verwendet zwei Hybridproteine, eines, in dem das Targetprotein an die DNA-Bindungsdomäne von GAL4 fusioniert ist, und ein zweites, in dem Kandidaten-Aktivierungsproteine an die Aktivierungsdomäne fusioniert sind. Die Expression von einem GAL1-lacZ-Reportergen unter der Kontrolle eines GAL4-aktivierten Promotors hängt von der Wiederherstellung von GAL4-Aktivität über Protein-Protein-Wechselwirkung ab. Kolonien, die wechselwirkende Polypeptide enthalten, werden mit einem chromogenen Substrat für β-Galactosidase nachgewiesen. Ein vollständiges Set (MATCHMAKER^TM) zur Identifikation von Protein-Protein-Wechselwirkungen zwischen zwei spezifischen Proteinen unter Verwendung des Zweihybridverfahrens ist im Handel bei Clontech erhältlich. Dieses System kann auch ausgedehnt werden, um Proteindomänen zu kartieren, die in spezifische Protein-Wechselwirkungen involviert sind, sowie Aminosäurereste, die für diese Wechselwirkungen maßgeblich sind, genau zu lokalisieren.
Verbindungen, die die Wechselwirkung eines Gens, das für ein hierin identifiziertes PRO-Polypeptid kodiert, und anderer intra- oder extrazellulärer Komponenten stören, können wie folgt getestet werden: üblicherweise wird ein Reaktionsgemisch hergestellt, das das Produkt des Gens und die intra- oder extrazelluläre Komponente enthält, und zwar unter solchen Bedingungen und über eine bestimmte Zeitspanne hinweg, um Wechselwirkung und Bindung der zwei Produkte zu ermöglichen. Um die Fähigkeit einer Kandidatenverbindung zu testen, Bindung zu hemmen, wird die Reaktion in Abwesenheit und in Gegenwart der Testverbindung durchgeführt. Weiters kann ein Placebo zu einem dritten Reaktionsgemisch zugesetzt werden, das als positive Kontrolle dient. Die Bindung (Komplexbildung) zwischen der Testverbindung und der intra- oder extrazellulären Komponente, die im Gemisch vorhanden sind, wird wie zuvor beschrieben beobachtet. Die Bildung eines Komplexes in der/den Kontrollreaktion(en), jedoch nicht im Reaktionsgemisch, das die Testverbindung enthält, weist darauf hin, dass die Testverbindung die Wechselwirkung der Testverbindung und ihres Reaktionspartners stört.
Wenn das PRO-Polypeptid die Fähigkeit hat, die Proliferation von Endothelzellen in Gegenwart von Co-Mitogen ConA zu stimulieren, profitiert ein Beispiel für ein Screeningverfahren von dieser Fähigkeit. Insbesondere im Proliferationstest werden menschliche Nabelschnurvenen-Endothelzellen erhalten und in 96-Well-Flachboden-Kulturplatten (Costar, Cambridge, MA) kultiviert und mit einem Reaktionsgemisch ergänzt, das dazu geeignet ist, die Proliferation von Zellen zu erleichtern, wobei das Gemisch Con-A (Calbiochem, La Jolla, CA) enthält. Con-A und die zu screenende Verbindung werden hinzugefügt, und nach Inkubation bei 37°C werden die Kulturen mit ^3–H-Thymidin pulsiert und auf Glasfaserfiltern geerntet (phD; Cambridge Technology, Watertown, MA). Mittlere ³H-Thymidininkorporation (cpm) von Triplikatkulturen wird unter Verwendung eines Flüssigszintillationszählers bestimmt (Beckman Instruments, Irvine, CA). Signifikante ³(H)-Thymidininkorporation gibt die Stimulation von Endothelzellproliferation an.
Um auf Antagonisten zu testen, wird der oben beschriebene Test durchgeführt, jedoch wird in diesem Test das PRO-Polypeptid gemeinsam mit der zu screenenden Verbindung zugesetzt, und die Fähigkeit der Verbindung, ³(H)-Thymidininkorporation in Gegenwart des PRO-Polypeptids zu hemmen, weist darauf hin, dass die Verbindung ein Antagonist gegenüber dem PRO-Polypeptid ist. Alternativ dazu können Antagonisten durch Kombinieren des PRO-Polypeptids und eines potenziellen Antagonisten mit membrangebundenen PRO-Polypeptidrezeptoren oder rekombinanten Rezeptoren unter für einen Konkurrenzhemmungstest geeigneten Bedingungen nachgewiesen werden. Das PRO-Polypeptid kann markiert sein, beispielsweise durch Radioaktivität, sodass die Anzahl an PRO-Polypeptidmolekülen, die an den Rezeptor gebunden sind, verwendet werden kann, um die Wirksamkeit des potenziellen Antagonisten zu bestimmen. Das für den Rezeptor kodierende Gen kann durch zahlreiche verschiedene Verfahren, die Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, beispielsweise durch Liganden-Panning und FACS-Sortieren, identifiziert werden. Coligan et al., Current Protocols in Immun. 1(2), Kapitel 5 (1991). Vorzugsweise wird Expressionsklonieren verwendet, wobei polyadenylierte RNA aus einer Zelle hergestellt wird, die auf das PRO-Polypeptid reagiert, und eine cDNA-Bibliothek, die aus dieser RNA hergestellt wird, in Pools aufgeteilt und verwendet wird, um COS-Zellen oder andere Zellen zu transfizieren, die auf das PRO-Polypeptid nicht reagieren. Transfizierte Zellen, die auf Glasobjektträgern gezüchtet werden, werden markiertem PRO-Polypeptid ausgesetzt. Das PRO-Polypeptid kann durch zahlreiche verschiedene Mittel markiert sein, einschließlich Iodierung oder Einschluss einer Erkennungsstelle für eine ortsspezifische Proteinkinase. Nach Fixierung und Inkubation werden die Objektträger autoradiographischer Analyse unterzogen. Positive Pools werden identifiziert, und Sub-Pools werden unter Verwendung eines interaktiven Sub-Pooling- und Re-Screening-Verfahrens hergestellt und neu transfiziert, was schließlich einen einzelnen Klon ergibt, der für den mutmaßlichen Rezeptor kodiert.
Als ein alternativer Ansatz für Rezeptoridentifikation kann das markierte PRO-Polypeptid mittels Photoaffinität mit Zellmembran- oder mit Extraktpräparaten, die das Rezeptormolekül exprimieren, verbunden werden. Vernetztes Material wird durch PAGE aufgelöst, und ein Röntgenfilm wird damit belichtet. Der markierte Komplex, der den Rezeptor enthält, kann ausgeschnitten, in Peptidfragmente aufgelöst und Protein-Mikrosequenzieren unterzogen werden. Die mittels Mikrosequenzierens gewonnene Aminosäuresequenz würde dann verwendet werden, um eine Reihe von degenerierten Oligonucleotid-Sonden zu entwerfen, um eine cDNA-Bibliothek zu screenen und hierdurch das für den mutmaßlichen Rezeptor kodierende Gen zu identifizieren.
In einem anderen Test für Antagonisten werden Säugetierzellen oder ein Membranpräparat, das den Rezeptor exprimiert, mit dem markierten PRO-Polypeptid in Gegenwart der Kandidatenverbindung inkubiert. Die Fähigkeit der Verbindung, diese Wechselwirkung zu fördern oder zu blockieren, kann dann gemessen werden.
Die Zusammensetzungen, die in der Behandlung von kardiovaskulären, endothelialen und angiogenen Erkrankungen nützlich sind, umfassen ohne Einschränkung Antikörper, kleine organische und anorganische Moleküle, Peptide, Phosphopeptide, Antisense- und Ribozymmoleküle, Tripelhelixmoleküle etc., die die Expression und/oder Aktivität des Targetgenprodukts hemmen.
Spezifischere Beispiele für potenzielle Antagonisten umfassen ein Oligonucleotid, das sich an die Fusionen von Immunglobulin mit einem PRO-Polypeptid bindet, und insbesondere Antikörper einschließlich, ohne dadurch eine Einschränkung darzustellen, poly- und monoklonaler Antikörper und Antikörperfragmente, einkettiger Antikörper, anti-idiotypischer Antikörper und chimärer oder humanisierter Versionen solcher Antikörper oder Fragmente sowie menschlicher Antikörper und Antikörperfragmente.
Alternativ dazu kann ein potentieller Antagonist ein nahe verwandtes Protein, beispielsweise eine mutierte Form des PRO-Polypeptids, das den Rezeptor erkennt, jedoch keine Wirkung verleiht, sein und dabei die Wirkung des PRO-Polypeptids kompetitiv hemmen.
Ein anderer potenzieller PRO-Polypeptidantagonist oder -agonist ist ein Antisense-RNA- oder -DNA-Konstrukt, hergestellt unter Verwendung von Antisense-Technologie, worin z. B. ein Antisense-RNA- oder -DNA-Molekül so wirkt, dass es die Translation von mRNA durch Hybridisieren an Target-mRNA und Unterbinden von Prote intranslation direkt blockiert. Antisense-Technologie kann verwendet werden, um Genexpression durch Tripelhelix-Bildung oder durch Antisense-DNA oder -RNA zu steuern, wobei beide Verfahren auf Bindung eines Polynucleotids an DNA oder RNA basieren. Beispielsweise wird der 5'-Kodierabschnitt der Polynucleotidsequenz, die für die reifen PRO-Polypeptide hierin kodiert, verwendet, um ein Antisense-RNA-Oligonucleotid mit einer Länge von etwa 10 bis 40 Basenpaaren zu entwerfen. Ein DNA-Oligonucleotid wird so entworfen, dass es komplementär zu einer Region des Gens ist, das in Transkription eingebunden ist (Tripelhelix – siehe Lee et al., Nucl. Acids Res. 6, 3073 (1979); Cooney et al., Science 241, 456 (1988); Dervan et al., Science 251, 1360 (1991)), wodurch Transkription und die Produktion des PRO-Polypeptids unterbunden werden. Das Antisense-RNA-Oligonucleotid hybridisiert an die mRNA in vivo und blockiert Translation des mRNA-Moleküls zum PRO-Polypeptid (Antisense – Okano, Neurochem. 56, 560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, FL (1988)). Die zuvor beschriebenen Oligonucleotide können auch Zellen zugeführt werden, sodass die Antisense-RNA oder -DNA in vivo exprimiert werden kann, um Produktion des PRO-Polypeptids zu hemmen. Wird Antisense-DNA verwendet, so werden Oligodesoxyribonucleotide, die von der Translationsstartstelle, z. B. zwischen den Positionen von etwa –10 und +10 der Targetgen-Nucleotidsequenz, abstammen, bevorzugt.
Antisense-RNA- oder -DNA-Moleküle sind allgemein zumindest etwa 5 Basen lang, etwa 10 Basen lang, etwa 15 Basen lang, etwa 20 Basen lang, etwa 25 Basen lang, etwa 30 Basen lang, etwa 35 Basen lang, etwa 40 Basen lang, etwa 45 Basen lang, etwa 50 Basen lang, etwa 55 Basen lang, etwa 60 Basen lang, etwa 65 Basen lang, etwa 70 Basen lang, etwa 75 Basen lang, etwa 80 Basen lang, etwa 85 Basen lang, etwa 90 Basen lang, etwa 95 Basen lang, etwa 100 Basen oder mehr lang.
Potenzielle Antagonisten umfassen kleine Moleküle, die sich an die aktive Stelle, die Rezeptorbindungsstelle oder den Wachstumsfaktor oder eine andere relevante Bindungsstelle des PRO-Polypeptids binden, wodurch die normale biologische Aktivität des PRO-Polypeptids blockiert wird. Beispiele für kleine Moleküle umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, kleine Peptide oder peptidähnliche Moleküle, vorzugswei se lösliche Peptide, und synthetische, organische oder anorganische Nichtpeptidyl-Verbindungen.
Ribozyme sind enzymatische RNA-Moleküle, die in der Lage sind, die spezifische Spaltung von RNA zu katalysieren. Ribozyme wirken durch sequenzspezifische Hybridisierung an die komplementäre Target-RNA, gefolgt von endonucleolytischer Spaltung. Spezifische Ribozym-Spaltungsstellen innerhalb eines potenziellen RNA-Targets können durch bekannte Verfahren identifiziert werden. Für nähere Details siehe z. B. Rossi, Current Biology 5, 469–471 (1994), und die PCT-Veröffentlichung Nr. WO 97/33551 (veröffentlicht am 18. September 1997).
Nucleinsäuremoleküle in Tripelhelix-Anordnung, die verwendet werden, um Transkription zu hemmen, sollten einzelsträngig und aus Desoxynucleotiden zusammengesetzt sein. Die Basenzusammensetzung dieser Oligonucleotide ist so bestimmt, dass sie Tripelhelix-Bildung gemäß den Hoogsteen-Basenpaarungsregeln fördert, die im Allgemeinen relativ große Abschnitte mit Purinen oder Pyrimidinen an einem Strang eines Duplex erfordern. Für nähere Details siehe z. B. die PCT-Veröffentlichung Nr. WO 97/33551 , s. o.
Diese kleinen Moleküle können durch einen oder mehrere der Screeningtests, die hierin oben stehend erläutert werden, und/oder durch irgendein anderes Screeningverfahren, das Fachleuten bekannt ist, identifiziert werden.
x. Formen zu behandelnder kardiovaskulärer, endothelialer und angiogener Erkrankungen
Die PRO-Polypeptide oder Agonisten oder Antagonisten dazu, die in den hierin beschriebenen kardiovaskulären, angiogenen und endothelialen Tests Aktivität zeigen und/oder deren Genprodukt auf dem kardiovaskulären System lokalisiert war, zeigen wahrscheinlich therapeutische Anwendungen in einer Vielzahl von kardiovaskulären, endothelialen und angiogenen Ekrankungen, einschließlich systemischer Erkrankungen, die Gefäße betreffen, wie z. B. Diabetes mellitus. Ihre therapeutische Nützlich keit kann Erkrankungen der Arterien, Kapillaren, Venen und/oder Lymphgefäße umfassen. Beispiele für Behandlungen, die darunter fallen, umfassen die Behandlung von Muskelatrophie, Osteoporose, Unterstützung der Implantatfixierung, um das Wachstum von Zellen um das Implantat zu stimulieren und deshalb ihre Anheftung an die beabsichtigte Stelle zu erleichtern, die Verbesserung der IGF-Stabilität in Geweben oder in Serum, wenn anwendbar, und Erhöhung der Bindung an den IGF-Rezeptor (da sich gezeigt hat, dass IGF das Wachstum menschlicher Mark-Erythrozyten- und Granulozyten-Vorläuferzellen in vitro steigert).
Die PRO-Polypeptide oder Agonisten oder Antagonisten dazu können auch verwendet werden, um Erythropoese oder Granulopoese zu stimulieren, um Wundheilung oder Gewebsregeneration und assoziierte Therapien zu stimulieren, die sich mit erneutem Gewebswachstum, wie z. B. von Bindegewebe, Haut, Knochen, Knorpel, Muskel, Lunge oder Niere, befassen, um Angiogenese zu fördern, um Migration von Endothelzellen zu stimulieren oder zu hemmen und um das Wachstum von Gefäßglattmuskel und Endothelzellproduktion zu proliferieren. Der Anstieg der Angiogenese, die durch das PRO-Polypeptid oder den -Antagonist vermittelt wird, kann für ischämische Gewebe und kollaterale Koronarentwicklung im Herz nach Koronarstenose von Vorteil sein. Antagonisten werden verwendet, um die Wirkung solcher Polypeptide zu hemmen, z. B. um die Produktion von übermäßigem Bindegewebe während Wundheilung oder Lungenfibrose einzuschränken, wenn das PRO-Polypeptid eine solche Produktion fördert. Dies umfasst die Behandlung von akutem Myokardinfarkt und Herzinsuffizienz.
Weiters betrifft die vorliegende Erfindung die Behandlung von Herzhypertrophie, unabhängig von der zugrunde liegenden Ursache, durch Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Dosis des PRO-Polypeptids oder Agonisten oder Antagonisten dafür. Wenn das Ziel die Behandlung von menschlichen Patienten ist, ist das PRO-Polypeptid vorzugsweise rekombinantes menschliches PRO-Polypeptid (rhPRO-Polypeptid). Die Behandlung von Herzhypertrophie kann in jedem beliebigen ihrer verschiedenen Stadien durchgeführt werden, die aus einer Vielzahl von verschiedenen pathologischen Leiden resultieren können, einschießlich Myokardinfarkt, Hyper tonie, hypertrophischer Kardiomyopathie und Klappeninsuffizienz. Die Behandlung erstreckt sich über alle Stufen des Fortschreitens von Herzhypertrophie mit oder ohne strukturelle Schädigung des Herzmuskels, unabhängig von der zugrunde liegenden Herzerkrankung.
Die Entscheidung, ob das Molekül selbst oder ein Agonist davon für eine bestimmte Indikation eingesetzt werden soll, im Gegensatz zu einem Antagonisten zum Molekül, hängt hauptsächlich davon ab, ob das Molekül hierin Kardiovaskularisierung, Genese von Endothelzellen oder Angiogenese fördert oder diese Leiden hemmt. Zum Beispiel wenn das Molekül Angiogenese fördert, ist ein Antagonist davon zur Behandlung von Erkrankungen nützlich, wo es wünschenswert ist, Angiogenese einzuschränken oder zu vermeiden. Beispiele für solche Erkrankungen umfassen Gefäßtumoren, wie z. B. Hämangiom, Tumorangiogenese, Neovaskularisierung in der Retina, der Choroidea oder Hornhaut in Zusammenhang mit diabetischer Retinopathie oder Retinopathia praematurorum oder Makuladegeneration und proliferativer Vitreoretinopathie, rheumatoide Arthritis, Crohn-Erkrankung, Atherosklerose, Ovarialhyperstimulation, Psoriasis, Endometriose in Verbindung mit Neovaskularisierung, Restenose nach Ballonangioplastie, Überproduktion von Narbengewebe, die z. B. bei Keloid zu beobachten ist, das sich nach chirurgischen Eingriffen bildet, Fibrose nach Myokardinfarkt oder fibrotische Läsionen in Verbindung mit Lungenfibrose.
Wenn jedoch das Molekül Angiogenese hemmt, wird erwartet, dass es direkt zur Behandlung der obigen Leiden verwendet wird.
Wenn das Molekül Angiogenese stimuliert, wäre es andererseits selbst (oder ein Agonist davon) für Indikationen nützlich, wo Angiogenese wünschenswert ist, wie z. B. periphere Gefäßerkrankung, Hypertonie, entzündliche Vaskulitis, Reynaud-Erkrankung und Reynaud-Phänomen, Aneurysmen, arterielle Restenose, Thrombophlebitis, Lymphangitis, Lymphödem, Wundheilung und Gewebsreparatur, Ischämie-Reperfusions-Verletzung, Angina, Myokardinfarkte, wie z. B. akute Myokardinfarkte, chronische Herzerkrankungen, Herzinsuffizienz, wie z. B. CHF, und Osteoporose.
Wenn jedoch das Molekül Angiogenese hemmt, würde ein Antagonist davon zur Behandlung jener Leiden verwendet werden, wo Angiogenese erwünscht ist.
Spezifische Formen von Erkrankungen sind nachstehend beschrieben, wo sich das PRO-Polypeptid hierin oder Antagonisten davon als nützlich für gefäßverwandtes Arzneimitteltargeting erweisen oder als therapeutische Targets für die Behandlung oder Prävention der Erkrankungen dienen kann. Atherosklerose ist eine Ekrankung, die durch Akkumulation von Plaques von Intimaverdickung in Arterien gekennzeichnet ist, aufgrund von Akkumulation von Lipiden, Proliferation von Zellen glatter Muskulatur und Bildung von fibrösem Gewebe innerhalb der Arterienwand. Die Erkrankung kann große, mittlere und kleine Arterien in einem beliebigen Organ betreffen. Von Veränderungen der Funktion von Endothelzellen und Zellen glatter Muskulatur ist bekannt, dass sie eine wichtige Rolle in der Modulation der Akkumulation und Regression dieser Plaques spielen.
Hypertonie ist durch erhöhten Gefäßdruck in systemischen arteriellen, Lungenarterien- oder Pfortadersystemen gekennzeichnet. Erhöhter Druck kann aus geschädigter Endothelfunktion und/oder Gefäßerkrankung resultieren oder dazu führen.
Entzündliche Vaskulitis umfasst Riesenzellarteriitis, Takayasu-Krankheit, Polyarteriitis nodosa (einschließlich der mikroangiopathischen Form), Kawasaki-Erkrankung, mikroskopische Polyangiitis, Wegener-Granulomatose und eine Vielzahl von infektiös-verwandten Gefäßerkrankungen (einschließlich Purpurs Schoenlein-Henoch). Geänderte Endothelzellfunktion hat sich bei diesen Erkrankungen als wichtig erwiesen.
Reynaud-Erkrankung und Reynaud-Phänomen sind durch intermittierende abnorme Schädigung des Kreislaufs durch die Extremitäten bei Exposition gegenüber Kälte gekennzeichnet. Geänderte Endothelzellfunktion hat sich bei dieser Erkrankung als wichtig erwiesen.
Aneurysmen sind Sackdilatationen oder spindelförmige Dilatationen des arteriellen oder venösen Baums, die mit geänderten Endothelzellen und/oder Zellen glatter Gefäßmuskulatur assoziiert sind.
Arterielle Restenose (Restenose der Arterienwand) kann nach Angioplastie als Folge der Änderung der Funktion und Proliferation von Endothelzellen und Zellen glatter Gefäßmuskulatur auftreten.
Thrombophlebitis und Lymphangitis sind entzündliche Erkrankungen von Venen bzw. Lymphgefäßen, die aus geänderter Endothelzellfunktion resultieren und/oder dazu führen können. Auf ähnliche Weise ist Lymphödem ein Leiden, das geschädigte Lymphgefäße umfasst, die aus Endothelzellfunktion resultieren.
Die Familie gutartiger und bösartiger Gefäßtumoren ist durch abnorme Proliferation und Wachstum von Zellelementen des Gefäßsystems gekennzeichnet. Zum Beispiel sind Lymphangiome gutartige Tumoren des Lymphsystems, die angeborene, oft zystische, Fehlbildungen der Lymphgefäße sind, die üblicherweise bei Neugeborenen auftreten. Zystische Tumoren tendieren dazu, im angrenzenden Gewebe zu wachsen. Zystische Tumoren treten üblicherweise in der Cervix- und Achselregion auf. Sie können auch im Weichteilgewebe von Extremitäten auftreten. Die Hauptsymptome sind erweiterte, manchmal retikuläre, strukturierte Lymphgefäße und Lymphozysten, die von Bindegewebe umgeben sind. Lymphangiome sollen durch ungenau verbundene embryonale Lymphgefäße oder ihre Defizienz verursacht sein. Das Ergebnis ist eine gestörte lokale Lymphdrainage. Griener et al., Lymphology 4, 140–144 (1971).
Eine andere Verwendung für die hierin beschriebenen PRO-Polypeptide oder Antagonisten dazu ist die Prävention von Tumorangiogenese, die die Vaskularisierung eines Tumors umfasst, um ihm zu ermöglichen, zu wachsen und/oder zu metastasieren. Dieses Verfahren hängt vom Wachstum neuer Blutgefäße ab. Beispiele für Neoplasmen und verwandte Leiden, die Tumorangiogenese umfassen, umfassen Brustkarzinome, Lungenkarzinome, Magenkarzinome, Speiseröhrenkarzinome, kolorekta le Karzinome, Leberkarzinome, Ovarialkarzinome, Thekazelltumoren, Arrhenoblastome, Zervixkarzinome, Endometriumkarzinom, Endometriumhyperplasie, Endometriose, Fibrosarkome, Chorionkarzinome, Kopf- und Nackenkrebs, Nasopharyngealkarzinom, Larynxkarzinom, Hepatoblastom, Kaposi-Sarkom, Melanom, Hautkarzinome, Hämangiom, kavernöses Hämangiom, Hämangioblastom, Pankreaskarzinome, Retinoblastome, Astrozytome, Glioblastom, Schwannom, Oligodendrogliom, Medulloblastom, Neuroblastome, Rhabdomyosarkom, Osteosarkom, Leiomyosarkome, Harnwegskarzinome, Schilddrüsenkarzinome, Wilms-Tumor, Nierenzellkarzinom, Prostatakarzinom, abnorme Gefäßproliferation assoziiert mit Phakomatosen, Ödem (wie z. B. in Verbindung mit Gehirntumoren) und Meigs-Syndrom.
Altersbedingte Makuladegeneration (AMD) ist eine führende Ursache von schwerwiegendem Verlust des Augenlichts bei älteren Menschen. Die exsudative Form von AMD ist durch chorioidale Neovaskularisation und Retinapigment-Epithelzellenablösung gekennzeichnet. Da chorioidale Neovaskularisation mit einer dramatischen Verschlechterung der Prognose verbunden ist, wird erwartet, dass das PRO-Polypeptid oder Antagonisten dazu in der Reduktion der Schwere von AMD nützlich sind.
Heilung von Trauma, wie z. B. Wundheilung und Gewebsreparatur, ist auch ein Verwendungsbereich von PRO-Polypeptiden hierin oder ihrer Antagonisten, auf den abgezielt wird. Bildung und Regression neuer Blutgefäße ist für Gewebsheilung und -reparatur wesentlich. Diese Kategorie umfasst Knochen-, Knorpel-, Sehnen-, Band- und/oder Nervengewebswachstum oder -regeneration sowie Wundheilung und Gewebsreparatur und -ersatz und in der Behandlung von Verbrennungen, Inzisionen und Geschwüren. Ein PRO-Polypeptid oder Antagonist davon, der Knorpel- und/oder Knochenwachstum unter Umständen, unter welchen Knochen normalerweise nicht gebildet werden, induziert, findet Anwendung in der Heilung von Knochenfrakturen und Knorpelschäden oder -defekten bei Menschen und anderen Tieren. Ein solches Präparat, das ein PRO-Polypeptid oder einen Antagonisten davon verwendet, kann prophylaktische Anwendung in der Reduktion von geschlossenen und offenen Frakturen und in der verbesserten Fixierung von künstlichen Gelenken finden. De-novo- Knochenbildung, die durch ein knochenbildendes Mittel induziert wird, trägt zur Reparatur von angeborenen, traumainduzierten oder onkologischen, resektionsinduzierten kraniofazialen Defekten bei und ist auch in kosmetischer plastischer Chirurgie nützlich.
PRO-Polypeptide oder Antagonisten dazu können auch nützlich sein, um eine bessere oder schnellere Schließung von nicht-heilenden Wunden zu fördern, einschließlich unter anderem Druckulkus, Ulkus assoziiert mit Gefäßinsuffizienz, chirurgischer und traumatischer Wunden und dergleichen.
Es wird davon ausgegangen, dass ein PRO-Polypeptid oder ein Antagonist davon auch Aktivität für die Herstellung oder Regeneration von anderen Geweben, wie z. B. Organen (einschließlich z. B. Pankreas, Leber, Darm, Niere, Haut oder Endothel), Muskulatur (glatter, Skelett- oder Herzmuskulatur) und Gefäß-(einschließlich Gefäßendothel-)Gewebe, oder zur Förderung des Wachstums von Zellen, die solche Gewebe umfassen, zeigen kann. Ein Teil der gewünschten Wirkungen kann die Hemmung oder Modulation von fibrotischer Narbenbildung sein, um normalem Gewebe zu ermöglichen, sich zu regenerieren.
Ein PRO-Polypeptid hierin oder ein Antagonist dazu kann auch zum Schutz des Darms oder Regeneration und Behandlung von Lungen- oder Leberfibrose, Reperfusionsverletzung in verschiedenen Geweben und Leiden dienen, die aus systemischem Cytokinschaden resultieren. Das PRO-Polypeptid oder ein Antagonist dazu kann auch zur Förderung oder Hemmung der Differenzierung von Geweben, die oben beschrieben sind, aus Vorläufergeweben oder -zellen oder zur Hemmung des Wachstums von oben beschriebenen Geweben dienen.
Ein PRO-Polypeptid oder ein Antagonist dazu kann auch in der Behandlung von Parodontalerkrankungen und in anderen Zahnreparaturverfahren verwendet werden. Solche Mittel können eine Umgebung bereitstellen, um knochenbildene Zellen anzuziehen, Wachstum von knochenbildenden Zellen zu stimulieren oder Differenzierung von Vorläufern von knochenbildenden Zellen zu induzieren. Ein PRO-Polypeptid hier in oder ein Antagonist dazu kann auch in der Behandlung von Osteoporose oder Osteoarthritis nützlich sein, wie z. B. durch Stimulation von Knochen- und/oder Knorpelreparatur oder durch Blockieren von Entzündung oder Gewebszerstörungsprozessen (Collagenaseaktivität, Osteoklastenaktivität etc.), vermittelt durch entzündliche Prozesse, da Blutgefäße eine wichtige Rolle in der Regulation von Knochenleistung und -Wachstum spielen.
Eine andere Kategorie von Gewebsregenerationsaktivität, die dem hierin beschriebenen PRO-Polypeptid oder einem Antagonisten davon zugeschrieben werden kann, ist die Sehnen-/Bandbildung. Ein Protein, das sehnen-/bandähnliche Gewebe oder eine andere Gewebsbildung unter Umständen induziert, unter welchen ein solches Gewebe normalerweise nicht gebildet wird, findet in der Heilung von Sehnen- oder Bänderrissen, -missbildungen und anderen Sehnen- oder Bänderdefekten bei Menschen und anderen Tieren Anwendung. Ein solches Präparat kann prophylaktisch in der Prävention von Schäden an Sehnen- oder Bändergeweben dienen sowie in der verbesserten Fixierung von Sehne oder Band an Knochen oder anderen Geweben und in der Reparatur von Defekten an Sehnen- oder Bändergewebe verwendet werden. De-novo-Bildung von sehnen-/bänderähnlichem Gewebe, die durch eine Zusammensetzung des PRO-Polypeptids hierin oder eines Antagonisten dazu verursacht ist, trägt zur Reparatur von angeborenen, traumainduzierten oder anderen Sehnen- oder Bänderdefekten von anderem Ursprung bei und ist auch in kosmetischer plastischer Chirurgie zur Anheftung oder Reparatur von Sehnen oder Bändern nützlich. Die Zusammensetzungen hierin können eine Umgebung bereitstellen, um sehnen- oder bänderbildende Zellen anzuziehen, Wachstum von sehnen- oder bänderbildenden Zellen zu stimulieren, Differenzierung von Vorläufern von Sehnen oder bänderbildenden Zellen zu induzieren oder Wachstum von Sehnen-/Bänderzellen oder Vorläufern ex vivo zur Zufuhr in vivo zu induzieren, um Gewebsreparatur auszuüben. Die Zusammensetzungen hierin können auch in der Behandlung von Tendinitis, Karpaltunnelsyndrom und anderen Sehnen- oder Bänderdefekten nützlich sein. Die Zusammensetzungen können auch ein geeignetes Matrix- und/oder Sequestriermittel als Träger umfassen, wie auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannt ist.
Das PRO-Polypeptid oder sein Antagonist kann auch zur Proliferation von Nervenzellen und zur Regeneration von Nerven- und Gehirngewebe nützlich sein, d. h. zur Behandlung von Erkrankungen des zentralen und peripheren Nervensystems und von Neuropathien sowie mechanischen und traumatischen Störungen, die Degeneration, Tod oder Trauma von Nervenzellen oder Nervengewebe umfassen. Genauer gesagt kann ein PRO-Polypeptid oder sein Antagonist in der Behandlung von Erkrankungen des peripheren Nervensystems verwendet werden, wie z. B. Schäden am peripheren Nerv, peripherer Neuropathie und lokalisierter Neuropathien, und Erkrankungen des zentralen Nervensystems, wie z. B. Alzheimer-Krankheit, Parkinson-Syndrom, Huntington-Chores, amyotrophischer Lateralsklerose und Shy-Drager-Syndrom. Weitere Leiden, die gemäß der vorliegenden Erfindung behandelt werden können, umfassen mechanische und traumatische Leiden, wie z. B. Rückenmarkserkrankungen, Kopftrauma und zerebrovaskuläre Erkrankungen wie z. B. Schlaganfall. Periphere Neuropathien, die aus Chemotherapie oder anderen medizinischen Therapien resultieren, können auch unter Verwendung eines PRO-Polypeptids hierin oder eines Antagonisten dazu behandelt werden.
Ischämie-Reperfusions-Verletzung ist eine weitere Indikation. Endothelzelldysfunktion kann sowohl am Beginn als auch in der Regulation der Abfolge von Ereignissen wichtig sein, die nach Ischämie-Reperfusions-Verletzung auftreten.
Rheumatoide Arthritis ist eine weitere Indikation. Blutgefäßwachstum und Targeting von entzündlichen Zellen durch die Gefäße ist eine wichtige Komponente in der Pathogenese von rheumatoiden und sero-negativen Formen von Arthritis.
Ein PRO-Polypeptid oder sein Antagonist kann auch prophylaktisch an Patienten mit Herzhypertrophie verabreicht werden, um das Fortschreiten des Leidens zu verhindern und plötzlichen Tod zu vermeiden, einschließlich Tod von asymptomatischen Patienten. Eine solche Präventivtherapie ist insbesondere im Fall von Patienten gerechtfertigt, bei denen massive Herzhypertrophie des linken Ventrikels (maximale Wanddicke von 35 mm oder mehr bei Erwachsenen oder ein vergleichbarer Wert bei Kindern) diagnostiziert wird, oder in Fällen, wo die hämodynamische Last auf das Herz besonders stark ist.
Ein PRO-Polypeptid oder sein Antagonist kann auch in der Handhabung von Vorhofflimmern nützlich sein, das sich bei einem wesentlichen Teil von Patienten entwickelt, bei denen hypertrophische Kardiomyopathie diagnostiziert wird.
Weitere Indikationen umfassen Angina, Myokardinfarkte, wie z. B. akute Myokardinfarkte, und Herzinsuffizienz, wie z. B. Stauungsinsuffizienz. Weitere nicht-neoplastische Leiden umfassen Psoriasis, diabetische und andere proliferative Retinopathien, einschließlich Retinopathia praematurorum, retrolentale Fibroplasie, neovaskuläres Glaukom, Schilddrüsenhyperplasie (einschließlich Basedow-Krankheit), Hornhaut- und andere Gewebstransplantation, chronische Entzündung, Lungenentzündung, Nephrose, Präeklampsie, Ascites, Perikarderguss (wie jener, der mit Perikarditis assoziiert ist) und Pleuraerguss.
Angesichts des Obigen spielen die hierin beschriebenen PRO-Polypeptide oder Agonisten oder Antagonisten davon, die Endothelzellfunktion, -proliferation und/oder -form ändern oder beeinflussen sollen, wahrscheinlich eine wichtige Rolle in der Atiologie und Pathogenese vieler oder aller obigen Erkrankungen, und als solche können sie als therapeutische Targets zur Steigerung oder Hemmung dieser Prozesse oder für gefäß-assoziiertes Arzneimitteltargeting bei diesen Erkrankungen dienen.
xi. Verabreichungsprotokolle, Pläne, Dosen und Formulierungen
Die hierin offenbarten Moleküle und Agonisten und Antagonisten davon sind pharmazeutisch als prophylaktisches und therapeutisches Mittel für verschiedene Störungen und Erkrankungen, wie zuvor dargelegt, nützlich.
Therapeutische Zusammensetzungen der PRO-Polypeptide oder -Agonisten oder -Antagonisten werden zur Lagerung durch Vermischen des erwünschten Moleküls mit geeignetem Reinheitsgrad mit optionalen pharmazeutisch annehmbaren Trägern, Exzipienten oder Stabilisatoren (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. Auflage, A. Osol (Hrsg.) (1980)) in Form von lyophilisierten Formulierungen oder wässrigen Lösungen hergestellt. Annehmbare Träger, Exzipienten oder Stabilisatoren sind für Rezipienten bei den verwendeten Dosierungen und Konzentrationen nicht toxisch und umfassen Puffer wie z. B. Phosphat, Citrat und andere organische Säuren; Antioxidationsmittel einschließlich Ascorbinsäure und Methionin; Konservierungsmittel (wie z. B. Octadecyldimethylbenzylammoniumchlorid, Hexamethoniumchlorid; Benzalkoniumchlorid, Benzethoniumchlorid; Phenol, Butyl- oder Benzylalkohol; Alkylparabene, wie z. B. Methyl- oder Propylparaben; Katechol; Resorcin; Cyclohexanol; 3-Pentanol und m-Kresol); niedermolekulare Polypeptide (mit weniger als etwa 10 Resten); Proteine wie z. B. Serumalbumin, Gelatine oder Immunglobuline; hydrophile Polymere wie z. B. Polyvinylpyrrolidon; Aminosäuren, wie z. B. Glycin, Glutamin, Asparagin, Histidin, Arginin oder Lysin; Monosaccharide, Disaccharide und andere Kohlenhydrate einschließlich Glucose, Mannose oder Dextrine; Chelatbildner wie EDTA; Zucker, wie z. B. Saccharose, Mannit, Trehalose oder Sorbit; salzbildende Gegenionen, wie z. B. Natrium; Metallkomplexe (wie z. B. Zn-Protein-Komplexe); und/oder nichtionische Tenside wie TWEEN^TM, PLURONICS^TM oder Polyethylenglykol (PEG).
Zusätzliche Beispiele für solche Träger umfassen lonenaustauscher, Aluminiumoxid, Aluminiumstearat, Lecithin, Serumproteine, wie z. B. menschliches Serumalbumin, Puffersubstanzen, wie z. B. Phosphate, Glycin, Sorbinsäure, Kaliumsorbat, Gemische partieller Glyceride von gesättigten pflanzlichen Fettsäuren, Wasser, Salze oder Elektrolyte, wie z. B. Protaminsulfat, Dinatriumhydrogenphosphat, Kaliumhydrogenphosphat, Natriumchlorid, Zinksalze, kolloidale Kieselsäure, Magnesiumtrisilicat, Polyvinylpyrrolidon, Substanzen auf Cellulose-Basis und Polyethylenglykol. Träger für topische Formen des Antagonisten oder Formen auf Gel-Basis umfassen Polysaccharide, wie z. B. Natriumcarboxymethylcellulose oder Methylcellulose, Polyvinylpyrrolidon, Polyacrylate, Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Blockpolymere, Polyethylenglykol und Holzwachsalkohole. Für alle Verabreichungsformen können auf geeignete Weise herkömmliche Depotformen eingesetzt werden. Solche Formen umfassen beispielsweise Mikrokapseln, Nanokapseln, Liposomen, Pflaster, Inhalationsformen, Nasensprays, sublinguale Tabletten und Retardpräparate. Die PRO-Polypeptide oder -Agonisten oder -Antagonisten werden typischerweise in solchen Trägern in einer Konzentration von etwa 0,1 mg/ml bis 100 mg/ml formuliert.
Eine andere Formulierung umfasst das Integrieren eines PRO-Polypeptids oder Antagonisten davon in Formstücke. Solche Gegenstände können zur Modulation von Endothelzellwachstum und Angiogenese eingesetzt werden. Zusätzlich dazu können Tumorinvasion und Metastasenbildung unter Einsatz dieser Gegenstände moduliert werden.
PRO-Polypeptide oder -Antagonisten, die zur In-vivo-Verabreichung eingesetzt werden sollen, müssen steril sein. Dies wird leicht mittels Filtration durch sterile Filtrationsmembranen vor oder nach Gefriertrocknung und Wiederherstellung erreicht. PRO-Polypeptide werden bei systemischer Verabreichung herkömmlicherweise in gefriergetrockneter oder gelöster Form gelagert. Wenn PRO-Polypeptid oder -Antagonist in gefriergetrockneter Form vorliegen, sind sie typischerweise in Kombination mit anderen Inhaltsstoffen für die Wiederherstellung mit einem geeigneten Verdünnungsmittel zum Zeitpunkt des Einsatzes formuliert. Ein Beispiel für eine flüssige Formulierung eines PRO-Polypeptids oder -Antagonisten ist eine sterile, klare, farblose nicht konservierte Lösung, die für eine subkutane Injektion in eine Einfachdosis-Phiole gefüllt wird. Konservierte pharmazeutische Zusammensetzungen, die für den wiederholten Einsatz geeignet sind, können z. B. hauptsächlich in Abhängigkeit von der Indikation und der Art des Polypeptids Folgendes enthalten:

a) PRO-Polypeptid oder einen Agonisten oder Antagonisten davon;
b) einen Puffer, der in der Lage ist, den pH-Wert in einem Bereich maximaler Stabilität des Polypeptids oder anderer gelöster Moleküle zu halten, vorzugsweise in einem Bereich von etwa 4–8;
c) ein Detergens/Tensid, hauptsächlich zur Stabilisierung des Polypeptids oder Moleküls gegen durch Schütteln hervorgerufene Aggregation;
d) ein Isotonisierungsmittel;
e) ein Konservierungsmittel, das aus der aus Phenol, Benzylalkohol und Benethoniumhalogenid, z. B. -chlorid, bestehenden Gruppe ausgewählt ist, und
f) Wasser.

Wenn das verwendete Detergens nichtionisch ist, kann es sich beispielsweise um Polysorbate (z. B. POLYSORBAT^TM (TWEEN^TM) 20, 80 etc.) oder Poloxamere (z. B. POLOXAMER^TM 188) handeln. Die Verwendung von nichtionischen Tensiden ermöglicht, dass die Formulierung Scherbeanspruchung an der Oberfläche ausgesetzt werden kann, ohne dass es zu einer Denaturierung des Polypeptids kommt. Solche tensidhältigen Formulierungen können ferner in Aerosol-Vorrichtungen eingesetzt werden, wie z. B. in jenen, die für pulmonare Dosierungen und nadellose Jet-Injektionspistolen (siehe z. B. EP 257.956 ) verwendet werden.
Ein Isotonisierungsmittel kann vorhanden sein, um die Isotonie einer flüssigen Zusammensetzung des PRO-Polypeptids oder Antagonisten davon sicherzustellen, und umfasst mehrwertige Zuckeralkohole, vorzugsweise dreiwertige oder höherwertige Zuckeralkohole, wie z. B. Glycerin, Erythrit, Arabit, Xylit, Sorbit und Mannit. Diese Zuckeralkohole können einzeln oder in Kombination eingesetzt werden. Alternativ dazu können Natriumchlorid oder andere geeignete anorganische Salze eingesetzt werden, um die Lösungen isotonisch zu machen.
Bei dem Puffer kann es sich in Abhängigkeit von dem gewünschten pH beispielsweise um einen Acetat-, Citrat-, Succinat- oder Phosphatpuffer handeln. Der pH eines Typs einer flüssigen Formulierung der vorliegenden Erfindung wird im Bereich von etwa 4 bis 8, vorzugsweise etwa um den physiologischen pH, gepuffert.
Die Konservierungsmittel Phenol, Benzylalkohol und Benzethoniumhalogenide, z. B. -chlorid, sind bekannte antimikrobielle Mittel, die eingesetzt werden können.
Therapeutische PRO-Polypeptidzusammensetzungen werden im Allgemeinen in einen Behälter mit einer sterilen Zugangsöffnung gefüllt, beispielsweise in einen intravenösen Lösungsbeutel oder eine Phiole mit einem Stöpsel, der mit einer subkutanen Injektionsnadel durchstochen werden kann. Die Formulierungen werden vorzugsweise in Form von wiederholten intravenösen (i. v.), subkutanen (s. c.) oder in tramuskulären (i. m.) Injektionen oder in Form von Aerosolformulierungen, die zur intranasalen oder intrapulmonaren Zufuhr geeignet sind (in Bezug auf intrapulmonare Zufuhr siehe z. B. EP 257.956 ), verabreicht.
PRO-Polypeptide können auch in Form von Retardpräparaten verabreicht werden. Geeignete Beispiele für Retardpräparate umfassen semipermeable Matrizen von festen hydrophoben Polymeren, die das Protein enthalten, wobei die Matrizen in Form von Formstücken, z. B. in Form von Filmen oder Mikrokapseln, vorliegen. Beispiele für Retardmatrizen umfassen Polyester, Hydrogele (z. B. Poly(2-hydroxyethylmethacrylat), wie von Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 15, 167–277 (1981), und Langer, Chem. Tech. 12, 98–105 (1982), beschrieben, oder Poly(vinylalkohol)), Polylactide ( US-Patent Nr. 3.773.919 , EP 58.481 ), Copolymere von L-Glutaminsäure und γ-Ethyl-L-Glutamat (Sidman et al., Biopolymers 22, 547–556 (1983)), nicht abbaubares Ethylenvinylacetat (Langer et al., s. o.), abbaubare Milchsäure-Glykolsäure-Copolymere, wie z. B. Lupron Depot^TM (injizierbare Mikrokügelchen aus Milchsäure-Glykolsäure-Copolymer und Leuprolidacetat), und Poly-D-(–)-3-hydroxybuttersäure ( EP 133.988 ).
Während Polymere, wie z. B. Ethylenvinylacetat und Milchsäure-Glykolsäure, die Freisetzung von Molekülen über mehr als 100 Tage hinweg ermöglichen, setzen bestimmte Hydrogele Proteine über einen kürzeren Zeitraum hinweg frei. Wenn verkapselte Proteine eine lange Zeit über im Körper bleiben, können sie in Folge des Einflusses von Feuchtigkeit bei 37°C denaturieren oder aggregieren, was zu einem Verlust der biologischen Aktivität und zu möglichen Veränderungen der Immunogenität führt. Es können rationale Strategien zur Proteinstabilisierung in Abhängigkeit von dem beteiligten Mechanismus ausgearbeitet werden. Wenn beispielsweise festgestellt wird, dass es sich bei dem Aggregationsmechanismus um die Bildung von intermolekularen S-S-Bindungen durch Thio-Disulfid-Austausch handelt, kann eine Stabilisierung erzielt werden, indem die Sulfhydrylreste modifiziert werden, aus sauren Lösungen lyophilisiert wird, der Feuchtigkeitsgehalt gesteuert wird, geeignete Additive eingesetzt werden und spezifische Polymer-Matrix-Zusammensetzungen entwickelt werden.
PRO-Polypeptid-Retardzusammensetzungen umfassen auch in Liposomen eingeschlossene PRO-Polypeptide. Liposomen, die das PRO-Polypeptid enthalten, werden durch an sich bekannte Verfahren hergestellt: DE 3.218.121 ; Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 3688–3692 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4030–4034 (1980); EP 52.322 ; EP 36.676 ; EP 88.046 ; EP 143.949 ; EP 142.641 ; Japanische Patentanmeldung 83-118008 ; US-Patente Nr. 4.485.045 und 4.544.545 sowie EP 102.324 . Herkömmlicherweise gehören die Liposomen zu der kleinen (etwa 200–800 Ångström) unilamellaren Art, in der der Lipidgehalt mehr als etwa 30 Mol-% Cholesterin beträgt, wobei der ausgewählte Anteil für die optimale Therapie angepasst wird.
Die therapeutisch wirksame Dosis eines PRO-Polypeptids oder eines Antagonisten davon variiert selbstverständlich in Abhängigkeit von Faktoren, wie dem zu behandelnden pathologischen Zustand (einschließlich Prävention), dem Verabreichungsverfahren, der Art der zur Behandlung eingesetzten Verbindung, etwaigen Co-Therapien, dem Alter, Gewicht, dem allgemeinen Gesundheitszustand und der Krankengeschichte des Patienten etc., und kann von dem behandelnden Arzt bestimmt werden. Dementsprechend ist es erforderlich, dass der behandelnde Arzt die Dosierung titriert und den Verabreichungsweg nach Bedarf modifiziert, um eine maximale therapeutische Wirkung zu erzielen. Wenn das PRO-Polypeptid ein enges Wirtsspektrum aufweist, sind zur Behandlung von menschlichen Patienten Formulierungen, die menschliches PRO-Polypeptid enthalten, noch bevorzugter menschliches Nativsequenz-PRO-Polypeptid, zu bevorzugen. Der Arzt verabreicht das PRO-Polypeptid, bis eine Dosierung erreicht ist, die die gewünschte Wirkung zur Behandlung der jeweiligen Erkrankung erzielt. Wenn das Ziel beispielsweise in der Behandlung von CHF besteht, würde die zu verabreichende Menge jener Menge entsprechen, die die fortschreitende Herzhypertrophie, die mit dieser Erkrankung einhergeht, hemmt. Der Fortschritt dieser Therapie kann leicht mittels Echokardiographie überwacht werden. Auf ähnliche Weise kann Patienten mit hypertropher Kardiomyopathie das PRO-Polypeptid auf empirischer Basis verabreicht werden.
Unter Berücksichtigung der oben angeführten Richtlinien liegt die wirksame Dosis im Allgemeinen im Bereich von etwa 0,001 bis etwa 1,0 mg/kg, noch bevorzugter von etwa 0,01 bis 1,0 mg/kg und besonders bevorzugt von etwa 0,01 bis 0,1 mg/kg.
Für den nicht-oralen Einsatz zur Behandlung von Hypertonie bei erwachsenen Menschen wird das PRO-Polypeptid vorteilhafterweise in Form einer Injektion in einer Menge von etwa 0,01 bis 50 mg, vorzugsweise von etwa 0,05 bis 20 mg und besonders bevorzugt von 1 bis 20 mg, pro Kilogramm Körpergewicht 1- bis 3-mal täglich mittels intravenöser Injektionen verabreicht. Bei oraler Verabreichung wird ein Molekül auf PRO-Polypeptid-Basis vorzugsweise in einer Menge von etwa 5 mg bis 1 g, vorzugsweise von etwa 10 bis 100 mg, pro kg Körpergewicht 1- bis 3-mal täglich verabreicht. Es ist anzumerken, dass eine Verunreinigung durch Endotoxin minimal auf einem sicheren Niveau gehalten werden sollte, beispielsweise auf weniger als 0,5 ng/mg Protein. Bei Verabreichung an menschliche Patienten sollten die Formulierungen vorzugsweise weiters die Anforderungen in Bezug auf Sterilität, Pyrogenizität, allgemeine Sicherheit und Reinheit gemäß den „FDA Office and Biologics Standards" erfüllen.
Das Dosierungsschema einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die das PRO-Polypeptid enthält, das zur Gewebewiederherstellung eingesetzt werden soll, wird durch den behandelnden Arzt unter Berücksichtigung von verschiedenen Faktoren bestimmt, die die Wirkung des Polypeptids modifizieren, z. B. von dem Gewicht des Gewebes, das gebildet werden soll, der Stelle der Schädigung, dem Zustand des beschädigten Gewebes, der Größe einer Wunde, der Art des beschädigten Gewebes (z. B. Knochen), dem Alter, Geschlecht und der Ernährung des Patienten, der Schwere einer etwaigen Infektion, der Verabreichungszeit und anderer klinischer Faktoren. Die Dosierung kann in Abhängigkeit vom Typ der zur Wiederherstellung eingesetzten Matrix und der Integration anderer Proteine in der pharmazeutischen Zusammensetzung variieren. Die Zugabe anderer bekannter Wachstumsfaktoren, wie z. B. IGF-1, zu der endgültigen Zusammensetzung kann beispielsweise auch die Dosierung beeinflussen. Der Fortschritt kann durch regelmäßige Überprüfungen von Gewebe-/Knochenwachstum und/oder -reparatur beispielsweise unter Einsatz von Rönt genstrahlung, histomorphometrischen Bestimmungen und Tetrazyklin-Markierung überwacht werden.
Die Art der Verabreichung von PRO-Polypeptid oder -Antagonist oder -Agonist entspricht bekannten Verfahren, z. B. erfolgt die Verabreichung durch Injektion oder Infusion auf intravenösem, intramuskulärem, intrazerebralem, intraperitonealem, intracerebrospinalem, subkutanem, intraokularem, intraartikulärem, intrasynovialem, intrathekalem, oralem, topischem Weg oder auf dem Inhalationsweg oder mittels Retardsystemen, wie untenstehend beschrieben. Das PRO-Polypeptid oder Antagonisten davon werden auf geeignete Weise auch auf intratumoralem, peritumoralem, intraläsionalem oder periläsionalem Weg verabreicht, um eine lokale sowie systemische therapeutische Wirkung zu erzielen. Es wird erwartet, dass der intraperitoneale Weg besonders nützlich ist, beispielsweise zur Behandlung von Ovarialtumoren.
Wenn ein Peptid oder kleines Molekül als Antagonist oder Agonist eingesetzt wird, wird es Säugetieren vorzugsweise oral oder nicht oral in Form einer Flüssigkeit oder eines Feststoffs verabreicht.
Beispiele für pharmakologisch annehmbare Salze von Molekülen, die Salze bilden und hierin nützlich sind, umfassen Alkalimetallsalze (z. B. Natriumsalz, Kaliumsalz), Erdalkalimetallsalze (z. B. Calciumsalz, Magnesiumsalz), Ammoniumsalze, Salze organischer Basen (z. B. Pyridinsalz, Triethylaminsalz), Salze anorganischer Säuren (z. B. Hydrochlorid, Sulfat, Nitrat) und Salze von organischen Säuren (z. B. Acetat, Oxalat, p-Toluolsulfonat).
Für hierin offenbarte Zusammensetzungen, die nützlich zur Wiederherstellung von Knochen, Knorpel, Sehnen oder Bändern sind, umfasst das therapeutische Verfahren die topische, systemische oder lokale Verabreichung der Zusammensetzung in Form eines Implantats oder einer Vorrichtung. Bei der Verabreichung liegt die zu verwendende therapeutische Zusammensetzung in pyrogenfreier, physiologisch annehmbarer Form vor. Die Zusammensetzung kann ferner wünschenswerterweise verkapselt sein oder in viskoser Form zur Zufuhr zu der Stelle der Schädigung an Knochen, Knorpel oder Gewebe injiziert werden. Die topische Verabreichung kann zur Wundheilung und zur Gewebereparatur geeignet sein. Vorzugsweise umfasst die Zusammensetzung zur Bildung von Knochen und/oder Knorpel eine Matrix, die in der Lage ist, die proteinhältige Zusammensetzung zu der Stelle des Knochen- und/oder Knorpelschadens zuzuführen, wobei eine Struktur für den in der Entwicklung befindlichen Knochen und Knorpel bereitgestellt wird und die Matrix vorzugsweise wieder in den Körper resorbiert werden kann. Solche Matrizen können aus Materialien gebildet werden, die derzeit für andere implantierte medizinische Anwendungen eingesetzt werden.
Die Wahl des Matrixmaterials basiert auf Bioverträglichkeit, biologischer Abbaubarkeit, mechanischen Eigenschaften, kosmetischem Erscheinungsbild und Kontaktflächeneigenschaften. Die spezielle Anwendung der Zusammensetzungen definiert die geeignete Formulierung. Potentielle Matrizen für die Zusammensetzungen können biologisch abbaubare(s) und chemisch definierte(s) Calciumsulfat, Tricalciumphosphat, Hydroxyapatit, Polymilchsäure, Polyglykolsäure und Polyanhydride sein. Weitere potentielle Materialien sind biologisch abbaubar und biologisch gut definiert, wie z. B. Knochen- oder Hautkollagen. Weitere Matrizen bestehen aus reinen Proteinen oder extrazellulären Matrixkomponenten. Weitere potentielle Matrizen sind nicht biologisch abbaubar und chemisch definiert, wie z. B. gesinterter Hydroxyapatit, Bioglas, Aluminate oder andere Keramik. Matrizen können aus einer Kombination beliebiger der oben angeführten Materialtypen bestehen, wie z. B. Polymilchsäure und Hydroxyapatit oder Kollagen und Tricalciumphosphat. Die Zusammensetzung der Biokeramik kann verändert werden, wie z. B. in Calcium-Aluminat-Phosphat und einer Bearbeitung zur Veränderung der Porengröße, der Teilchengröße, der Teilchenform und der biologischen Abbaubarkeit.
Bei einer speziellen Ausführungsform handelt es sich um ein 50:50-Copolymer (Molekulargewicht) aus Milchsäure und Glykolsäure in Form poröser Teilchen mit Durchmessern im Bereich von 150 bis 800 μm. In einigen Anwendungen ist es nützlich, ein Maskierungsmittel, wie z. B. Carboxymethylcellulose oder ein autologes Blut gerinnsel, einzusetzen, um zu verhindern, dass sich die Polypeptidzusammensetzungen von der Matrix lösen.
Eine geeignete Familie von Maskierungsmitteln umfasst Cellulosematerialien, wie z. B. Alkylcellulosen (einschließlich Hydroxyalkylcellulosen), einschließlich Methylcellulose, Ethylcellulose, Hydroxyethylcellulose, Hydroxypropylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose und Carboxymethylcellulose, wobei kationische Salze von Carboxymethylcellulose (CMC) zu den bevorzugten gehören. Weitere bevorzugte Maskierungsmittel umfassen Hyaluronsäure, Natriumalginat, Poly(ethylenglykol), Polyoxyethylenoxid, Carboxyvinylpolymer und Poly(vinylalkohol). Die Menge an Maskierungsmittel, die hierin nützlich ist, beträgt, bezogen auf das Gesamtgewicht der Formulierung, 0,5 bis 20 Gew.-%, vorzugsweise 1–10 Gew.-%, was der Menge entspricht, die erforderlich ist, um die Desorption des Polypeptids (oder seines Antagonisten) von der Polymermatrix zu verhindern und eine angemessene Handhabbarkeit der Zusammensetzung bereitzustellen, wobei die Menge nicht so groß ist, dass verhindert wird, dass die Vorläuferzellen die Matrix infiltrieren, wodurch dem Polypeptid (oder seinem Antagonist) ermöglicht wird, die osteogene Aktivität der Vorläuferzellen zu unterstützen.
xii. Kombinationstherapien
Die Wirksamkeit des PRO-Polypeptids oder eines Agonisten oder Antagonisten davon zur Prävention oder Behandlung der jeweiligen Störung kann dadurch verbessert werden, dass der Wirkstoff seriell oder in Kombination mit einem anderen Mittel verabreicht wird, das zu diesem Zweck wirksam ist, entweder in derselben Zusammensetzung oder in Form von separaten Zusammensetzungen.
Zur Behandlung von Herzhypertrophie kann eine PRO-Polypeptidtherapie beispielsweise mit der Verabreichung von Inhibitoren bekannter Herzmyozytenhypertrophie-Faktoren kombiniert werden, z. B. Inhibitoren von α-adrenergen Agonisten, wie z. B. Phenylephrin; Enothelin-1-Inhibitoren, wie z. B. BOSENTAN^TM und MOXONODIN^TM; Inhibitoren für CT-1 ( US-Patent Nr. 5.679.545 ); Inhibitoren für LIF; ACE-Inhibitoren; Des-Aspartat-Angiotensin-I-Inhibitoren ( US-Patent Nr. 5.773.415 ) und Angiotensin-II-Inhibitoren.
Zur Behandlung von Herzhypertrophie in Zusammenhang mit Hypertonie können die PRO-Polypeptide in Kombination mit Blockiermitteln für β-adrenerge Rezeptoren, wie z. B. Propranolol, Timolol, Tertalolol, Carteolol, Nadolol, Betaxolol, Penbutolol, Acetobutolol, Atenolol, Metoprolol oder Carvedilol; mit ACE-Inhibitoren, z. B. Quinapril, Captopril, Enalapril, Ramipril, Benazepril, Fosinopril oder Lisinopril; mit Diuretika, wie z. B. Chlorthiazid, Hydrochlorthiazid, Hydroflumethazid, Methylchlothiazid, Benzthiazid, Dichlorphenamid, Acetazolamid oder Indapamid; und/oder mit Calciumkanalblockern, wie z. B. Dilitazem, Nifedipin, Verapamil oder. Nicardipin, verabreicht werden. Pharmazeutische Zusammensetzungen, die die hierin durch ihre generischen Bezeichnungen identifizierten therapeutischen Wirkstoffe umfassen, sind im Handel erhältlich und sind gemäß den Herstellerhinweisen in Bezug auf Dosierung, Verabreichung, Nebenwirkungen, Gegenanzeigen etc. zu verabreichen. Siehe z. B. Physicians' Desk Reference (51. Aufl.), Medical Economics Data Production Co., Montvale, NJ (1997).
Bevorzugte Kandidaten für eine Kombinationstherapie zur Behandlung von hypertropher Kardiomyopathie sind β-adrenerge Blockiermittel (z. B. Propranolol, Timolol, Tertalolol, Carteolol, Nadolol, Betaxolol, Penbutolol, Acetobutolol, Atenolol, Metoprolol oder Carvedilol), Verapamil, Difedipin oder Diltiazem. Die Behandlung von Hypertrophie in Zusammenhang mit hohem Blutdruck kann den Einsatz einer antihypersensitiven Arzneimitteltherapie unter Einsatz von Calciumkanalblockern, wie z. B. Diltiazem, Nifedipin, Verapamil oder Nicardipin; β-adrenergen Blockiermitteln; Diuretika, wie z. B. Chlorthiazid, Hydrochlorthiazid, Hydroflumethazid, Methylchlothiazid, Benzthiazid, Dichlorphenamid, Acetazolamid oder Indapamid; und/oder ACE-Inhibitoren, wie z. B. Quinapril, Captopril, Enalapril, Ramipril, Benazepril, Fosinopril oder Lisinopril, erfordern.
Bei anderen Indikationen können PRO-Polypeptide oder deren Antagonisten mit anderen Mitteln kombiniert werden, die nützlich für die Behandlung der betreffenden Knochen- und/oder Knorpelschäden, Wunden oder Gewebe sind. Diese Mittel umfassen verschiedene Wachstumsfaktoren, wie z. B. EGF, PDGF, TFG-α oder TGF-β, IGF, FGF und CTGF.
Zusätzlich dazu können PRO-Polypeptide oder deren Antagonisten, die zur Behandlung von Krebs eingesetzt werden, mit zytotoxischen, chemotherapeutischen oder wachstumshemmenden Mitteln, wie obenstehend identifiziert, kombiniert werden. Zur Krebsbehandlung werden das PRO-Polypeptid oder der Antagonist davon auf geeignete Weise seriell oder in Kombination mit radiologischen Behandlungen verabreicht, unabhängig davon, ob diese Bestrahlung oder die Verabreichung radioaktiver Substanzen beinhalten.
Die wirksamen Mengen der in Kombination mit dem PRO-Polypeptid oder Antagonisten davon verabreichten Wirkstoffe liegen im Ermessen des behandelnden Arztes oder Veterinärmediziners. Die Verabreichung und Anpassung der Dosierung erfolgt, um eine bestmögliche Behandlung der zu behandelnden Erkrankung zu erzielen. Zur Behandlung von Hypertonie werden bei der Bestimmung dieser Mengen idealerweise die Verwendung von Diuretika oder Digitalis sowie Erkrankungen, wie Hyper- oder Hypotonie, eine Beeinträchtigung der Nierenfunktion etc., berücksichtigt. Die Dosis hängt zusätzlich dazu von Faktoren wie der Art des einzusetzenden Wirkstoffs und dem zu behandelnden Patienten ab. Typischerweise entspricht die verwendete Menge derselben Dosis, die eingesetzt wird, wenn der jeweilige Wirkstoff ohne das PRO-Polypeptid verabreicht wird.
xiii. Fabrikate
Ein Fabrikat, wie z. B. ein Set, das das PRO-Polypeptid oder Agonisten oder Antagonisten davon umfasst und zur Diagnose oder Behandlung der oben beschriebenen Störungen geeignet ist, umfasst zumindest einen Behälter und ein Etikett. Geeignete Behälter umfassen beispielsweise Flaschen, Phiolen, Spritzen und Teströhrchen. Die Behälter können aus verschiedenen Materialien, wie z. B. Glas oder Kunststoff, bestehen. Der Behälter enthält eine Zusammensetzung, die zur Diagnose oder Behandlung der Erkrankung wirksam ist, und weist eine sterile Zugangsöffnung auf (bei dem Behälter kann es sich beispielsweise um einen intravenösen Lösungsbeutel oder eine Phiole mit einem Stöpsel, der mit einer subkutanen Injektionsnadel durchstochen werden kann, handeln). Bei dem Wirkstoff in der Zusammensetzung handelt es sich um das PRO-Polypeptid oder einen Agonisten oder Antagonisten davon. Das Etikett, das sich auf dem Behälter befindet oder mit diesem assoziiert ist, zeigt an, dass die Zusammensetzung zur Diagnose oder Behandlung der jeweiligen Erkrankung eingesetzt wird. Das Fabrikat kann ferner einen zweiten Behälter umfassen, der einen pharmazeutisch annehmbaren Puffer enthält, wie z. B. phosphatgepufferte Salzlösung, Ringersche Lösung und Dextroselösung. Es kann weiters andere Materialien umfassen, die aus kommerzieller Sicht sowie aus Sicht des Verbrauchers wünschenswert sind, einschließlich weitere Puffer, Verdünnungsmittel, Filter, Nadeln, Spritzen und Beipackzettel mit Hinweisen zur Verwendung. Das Fabrikat kann auch, wie oben beschrieben, einen zweiten oder dritten Behälter mit einem anderen Wirkstoff umfassen.
E. Antikörper
Bei einigen der vielversprechendsten erfindungsgemäßen Arzneimittelkandidaten handelt es sich um Antikörper und Antikörperfragmente, die die Produktion oder das Genprodukt der hierin identifizierten Gene inhibieren und/oder die Aktivität der Genprodukte reduzieren können.
i. Polyklonale Antikörper
Verfahren zur Herstellung von polyklonalen Antikörpern sind Fachleuten bekannt. Polyklonale Antikörper können in einem Säugetier, beispielsweise durch eine oder mehrere Injektionen eines immunisierenden Mittels und, sofern erwünscht, eines Adjuvans, gezüchtet werden. Typischerweise wird das immunisierende Mittel und/oder das Adjuvans dem Säugetier durch multiple subkutane oder intraperitoneale Injektio nen injiziert. Das immunisierende Mittel kann das PRO-Polypeptid oder ein Fusionsprotein davon umfassen. Es kann nützlich sein, das immunisierende Mittel an ein Protein zu konjugieren, das dafür bekannt ist, im zu immunisierenden Säugetier immunogen zu sein. Beispiele für solche immunogenen Proteine umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin, Serumalbumin, Rinderthyreoglobulin und Sojabohnentrypsininhibitor. Beispiele für Adjuvanzien, die verwendet werden können, umfassen komplettes Freundsches Adjuvans und MPL-TDM-Adjuvans (Monophosphoryl-Lipid A oder synthetisches Trehalosedicorynomycolat). Die Arbeitsvorschrift zur Immunisierung kann von Fachleuten ohne übermäßiges Experimentieren ausgewählt werden.
ii. Monoklonale Antikörper
Die Anti-PRO-Antikörper können alternativ dazu monoklonale Antikörper sein. Monoklonale Antikörper können unter Verwendung von Hybridomverfahren, wie beispielsweise jenen, die von Kohler & Milstein, Nature 356, 495 (1975), beschrieben werden, hergestellt werden. In einem Hybridomverfahren wird eine Maus, ein Hamster oder ein anderes geeignetes Wirtstier typischerweise mit einem immunisierenden Mittel immunisiert, um Lymphozyten hervorzubringen, die Antikörper produzieren oder zu produzieren in der Lage sind, die sich spezifisch an das immunisierende Mittel binden. Alternativ dazu können die Lymphozyten in vitro immunisiert werden.
Das immunisierende Mittel umfasst typischerweise das PRO-Polypeptid oder ein Fusionsprotein davon. Im Allgemeinen werden entweder Lymphozyten des peripheren Bluts („PBLs"), sofern Zellen menschlichen Ursprungs erwünscht sind, oder Milzzellen oder Lymphknotenzellen verwendet, sofern nicht-menschliche Säugetierquellen erwünscht sind. Die Lymphozyten werden dann mit einer sich unbegrenzt vermehrenden Zelllinie unter Verwendung eines geeigneten Fusionsmittels, wie z. B. Polyethylenglykol, fusioniert, um eine Hybridomzelle zu bilden [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, New York, 59–103 (1986)]. Sich unbegrenzt vermehrende Zelllinien sind üblicherweise transformierte Säugetierzellen, insbesondere Myelomzellen von Nagetieren, Rindern und Menschen. üblicherweise werden Ratten- oder Mausmyelomzelllinien verwendet. Die Hybridomzellen können in einem geeigneten Kulturmedium kultiviert werden, das vorzugsweise eine oder mehrere Substanzen enthält, die das Wachstum oder Überleben der nicht fusionierten, sich unbegrenzt vermehrenden Zellen hemmen. Fehlt beispielsweise den Ausgangszellen das Enzym Hypoxanthinguaninphosphoribosyltransferase (HGPRT oder HPRT), so umfasst das Kulturmedium für die Hybridome typischerweise Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin („HAT-Medium"), Substanzen, die das Wachstum von HGPRT-defizienten Zellen unterbinden.
Bevorzugte sich unbegrenzt vermehrende Zelllinien sind jene, die wirksam fusionieren, die stabile hochgradige Expression von Antikörper durch die ausgewählten, Antikörper produzierenden Zellen fördern und die auf ein Medium wie beispielsweise HAT-Medium empfindlich sind. Noch bevorzugtere, sich unbegrenzt vermehrende Zelllinien sind Maus-Myelomlinien, die beispielsweise beim Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Kalifornien, und bei der American Type Culture Collection, Manassas, Virginia, erhalten werden können. Menschliche Myelom- und Maus-Mensch-Heteromyelomzelllinien wurden auch für die Herstellung von menschlichen monoklonalen Antikörpern beschrieben [Kozbor, J. Immunol. 133, 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, 51–63 (1987)].
Das Kulturmedium, in dem die Hybridomzellen kultiviert werden, kann dann auf die Gegenwart von monoklonalen Antikörpern, die gegen das PRO-Polypeptid gerichtet sind, getestet werden. Vorzugsweise wird die Bindungsspezifität von monoklonalen Antikörpern, die durch die Hybridomzellen produziert werden, durch Immunfällung oder durch einen In-vitro-Bindungstest, wie beispielsweise Radioimmuntest (RIA) oder enzymgekoppelte Immunadsorptionsbestimmung (ELISA), bestimmt. Solche Verfahren und Tests sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Die Bindungsaffinität des monoklonalen Antikörpers kann beispielsweise durch die Scatchard-Analyse von Munson & Pollard, Anal. Biochem. 107, 220 (1980), bestimmt werden.
Nachdem die erwünschten Hybridomzellen identifiziert wurden, können die Klone durch Grenzverdünnungsverfahren subkloniert und mittels herkömmlicher Verfahren gezüchtet werden. Goding, s. o. Geeignete Kulturmedien für diesen Zweck umfassen beispielsweise Dulbecco's Modified Eagle's Medium und RPMI-1640-Medium. Alternativ dazu können die Hybridomzellen in vivo als Aszites in einem Säugetier gezüchtet werden.
Die monoklonalen Antikörper, die durch die Subklone sekretiert werden, können aus dem Kulturmedium oder der Ascitesflüssigkeit durch herkömmliche Immunglobulinreinigungsverfahren, wie beispielsweise Protein-A-Sepharose, Hydroxylapatitchromatographie, Gelelektrophorese, Dialyse oder Affinitätschromatographie, isoliert oder gereinigt werden.
Die monoklonalen Antikörper können auch durch DNA-Rekombinationsverfahren, wie jenen, die im US-Patent Nr. 4.816.567 beschrieben werden, hergestellt werden. DNA, die für die monoklonalen Antikörper der Erfindung kodiert, kann leicht isoliert und unter Verwendung herkömmlicher Verfahren (z. B. unter Verwendung von Oligonucleotidsonden, die in der Lage sind, sich spezifisch an Gene zu binden, die für die schweren und leichten Ketten von Maus-Antikörper kodieren) sequenziert werden. Die Hybridomzellen der Erfindung dienen als eine bevorzugte Quelle für solche DNA. Nachdem sie isoliert wurde, kann die DNA in Expressionsvektoren platziert werden, die dann in Wirtszellen wie beispielsweise Affen-COS-Zellen, Chinahamster-Eierstock-(CHO-)Zellen oder Myelomzellen transfiziert werden, die sonst kein Immunglobulinprotein produzieren, um die Synthese von monoklonalen Antikörpern in den rekombinanten Wirtszellen zu erreichen. Die DNA kann auch beispielsweise durch Substituieren der Kodiersequenz für menschliche Schwer- und Leichtketten-Konstantdomänen anstelle der homologen Maus-Sequenzen [ US-Patent Nr. 4.816.567 ; Morrison et al., s. o.] oder durch kovalentes Binden der gesamten oder eines Teils der Kodiersequenz für ein Nicht-Immunglobulin-Polypeptid an die Immunglobulin-Kodiersequenz modifiziert werden. Solch ein Nicht-Immunglobulin-Polypeptid kann anstelle der konstanten Domänen eines Antikörpers der Erfindung oder anstelle der variablen Domänen einer Antigen-Bindungsstelle eines Antikörpers der Erfindung eingesetzt werden, um einen zweiwertigen chimären Antikörper zu bilden.
Die Antikörper können einwertige Antikörper sein. Verfahren zur Herstellung einwertiger Antikörper sind auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannt. Beispielsweise umfasst ein Verfahren rekombinante Expression von Immunglobulin-Leichtkette und modifizierter -Schwerkette. Die Schwerkette ist im Allgemeinen an einem beliebigen Punkt in der Fc-Region trunkiert, sodass Schwerketten-Vernetzung unterbunden wird. Alternativ dazu werden die relevanten Cysteinreste durch einen anderen Aminosäurerest substituiert oder werden deletiert, um Vernetzung zu unterbinden.
In-vitro-Verfahren sind auch zur Herstellung einwertiger Antikörper geeignet. Verdau von Antikörpern zur Produktion von Fragmenten davon, vorzugsweise Fab-Fragmenten, kann gemäß herkömmlichen Verfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, durchgeführt werden.
iii. Menschliche und humanisierte Antikörper
Die Anti-PRO-Antikörper können weiters humanisierte Antikörper oder menschliche Antikörper umfassen. Humanisierte Formen von nicht-menschlichen (z. B. Maus-)Antikörpern sind chimäre Immunglobuline, Immunglobulinketten oder Fragmente davon (wie z. B. Fv, Fab, Fab', F(ab')₂ oder andere Antigen-bindende Subsequenzen von Antikörpern), die eine Mindest-Sequenz, abgeleitet aus nicht-menschlichem Immunglobulin, enthalten. Humanisierte Antikörper umfassen menschliche Immunglobuline (Rezipientenantikörper), in denen Reste aus einer CDR des Rezipienten durch Reste aus einer CDR einer nicht-menschlichen Spezies (Donorantikörper) wie Maus, Ratte oder Kaninchen mit der erwünschten Spezifität, Affinität und Kapazität ersetzt sind. In manchen Fällen sind Fv-Gerüstreste des menschlichen Immunglobulins durch entsprechende nicht-menschliche Reste ersetzt. Humanisierte Antikörper können auch Reste umfassen, die weder im Rezipientenantikörper noch in den importierten CDR- oder Gerüstsequenzen zu finden sind. Im Allgemeinen umfasst der humanisierte Antikörper im Wesentlichen die gesamte von zumindest einer, und typi scherweise zwei, variablen Domänen, in denen alle oder im Wesentlichen alle der CDR-Regionen jenen eines nicht-menschlichen Immunglobulins entsprechen und alle oder im Wesentlichen alle der FR-Regionen jene einer menschlichen Immunglobulin-Consensussequenz sind. Die humanisierten Antikörper umfassen vorzugsweise auch zumindest einen Abschnitt einer konstanten Immunglobulinregion (Fc), typischerweise jenen eines menschlichen Immunglobulins. Jones et al., Nature 321, 522–525 (1986); Riechmann et al., Nature 332, 323–329 (1988); und Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2, 593–596 (1992).
Verfahren zur Humanisierung nicht-menschlicher Antikörper sind auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannt. Im Allgemeinen weist ein humanisierter Antikörper einen oder mehrere Aminosäurereste auf, die in ihn aus einer Quelle eingeführt wurden, die nicht-menschlich ist. Diese nicht-menschlichen Aminosäurereste werden oft als „Import"-Reste bezeichnet, die typischerweise aus einer variablen „Import"-Domäne genommen werden. Humanisierung kann im Wesentlichen gemäß dem Verfahren von Winter und Mitarbeitern [Jones et al., Nature 321, 522–525 (1986); Riechmann et al., Nature 332, 323–327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239, 1534–1536 (1988)] durch Substituieren von Nagetier-CDRs- oder -CDR-Sequenzen anstelle der entsprechenden Sequenzen eines menschlichen Antikörpers durchgeführt werden. Demgemäß sind solche „humanisierten" Antikörper chimäre Antikörper ( US-Patent Nr. 4.816.567 ), worin wesentlich weniger als eine intakte menschliche variable Domäne durch die entsprechende Sequenz aus einer nicht-menschlichen Spezies substituiert wurde. In der Praxis sind humanisierte Antikörper typischerweise menschliche Antikörper, in denen manche CDR-Reste und möglicherweise manche FR-Reste durch Reste aus analogen Stellen in Nagetierantikörpern ersetzt sind.
Menschliche Antikörper können auch unter Verwendung verschiedener Techniken, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, einschließlich Phagendisplay-Bibliotheken [Hoogenboom & Winter, J. Mol. Biol. 227, 381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581 (1991)], hergestellt werden. Die Verfahren von Cole et al. und Boerner et al. sind auch zur Herstellung von menschlichen monoklonalen Antikörpern geeignet [Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, S. 77 (1985), und Boerner et al., J. Immunol. 147(1), 86–95 (1991)]. Auf ähnliche Weise können menschliche Antikörper durch Einführen menschlicher Immunglobulinloci in transgene Tiere, z. B. Mäuse, in denen die endogenen Immunglobulingene teilweise oder vollständig deaktiviert wurden, hergestellt werden. Bei Provokation wird menschliche Antikörperproduktion beobachtet, die jener in allen Aspekten sehr stark ähnlich ist, die in Menschen selbst beobachtet wurde, einschließlich Genneuanordnung, Anordnung und Antikörperrepertoire. Dieser Ansatz wird beispielsweise in den US-Patenten Nr. 5.545.807 ; 5.545.806 ; 5.569.825 ; 5.625.126 ; 5.633.425 ; 5.661.016 und den folgenden wissenschaftlichen Publikationen beschrieben: Marks et al., Bio/Technology 10, 779–783 (1992); Lonberg et al., Nature 368, 856–859 (1994); Morrison, Nature 368, 812–813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845–851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996); Lonberg & Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13, 65–93 (1995).
iv. Bispezifische Antikörper
Bispezifische Antikörper sind monoklonale, vorzugsweise menschliche oder humanisierte, Antikörper, die Bindungsspezifitäten für zumindest zwei verschiedene Antigene aufweisen. Im vorliegenden Fall ist eine der Bindungsspezifitäten für das PRO-Polypeptid, die andere ist für jedes beliebige andere Antigen und vorzugsweise für ein(en) Zelloberflächen-Protein oder -Rezeptor oder eine Rezeptoruntereinheit.
Verfahren zur Herstellung bispezifischer Antikörper sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Herkömmlicherweise basiert die rekombinante Produktion von bispezifischen Antikörpern auf der Co-Expression von zwei Immunglobulin-Schwerketten/Leichtketten-Paaren, worin die zwei schweren Ketten unterschiedliche Spezifitäten aufweisen [Milstein & Cuello, Nature 305, 537–539 (1983)]. Aufgrund der zufälligen Auswahl an Immunglobulinschwer- und -leichtketten produzieren diese Hybridome (Quadrome) ein potenzielles Gemisch von zehn verschiedenen Antikörpermolekülen, von denen nur eines die korrekte bispezifische Struktur aufweist. Die Reinigung des korrekten Moleküls erfolgt üblicherweise durch Affinitätschromatographie schritte. Ähnliche Verfahren sind in der WO 93/08829 , veröffentlicht am 13. Mai 1993, und in Traunecker et al., EMBO J. 10, 3655–3659 (1991), offenbart.
Variable Antikörperdomänen mit den erwünschten Bindungsspezifitäten (Antikörper-Antigen-Kombinationsstellen) können an Immunglobulinkonstantdomänen-Sequenzen fusioniert werden. Die Fusion erfolgt vorzugsweise mit einer Immunglobulin-Schwerkettenkonstantdomäne, umfassend zumindest einen Teil der Gelenks-, CH2- und CH3-Regionen. Es wird bevorzugt, dass die erste Schwerketten-Konstantregion (CH1) die Stelle enthält, die für Leichtkettenbindung, vorhanden in zumindest einer der Fusionen, erforderlich ist. DNAs, die für die Immunglobulin-Schwerkettenfusionen und, sofern erwünscht, für die Immunglobulin-Leichtkette kodieren, werden in getrennte Expressionsvektoren insertiert und werden in geeignete Wirtsorganismen co-transfiziert. Für nähere Details zur Herstellung von bispezifischen Antikörpern siehe beispielsweise Suresh et al., Methods in Enzymology 121, 210 (1986).
v. Heterokonjugierte Antikörper
Heterokonjugierte Antikörper setzen sich aus zwei kovalent gebundenen Antikörpern zusammen. Solche Antikörper wurden beispielsweise vorgeschlagen, um Immunsystemzellen auf unerwünschte Zellen zu richten [ US-Patent Nr. 4.676.980 ] sowie zur Behandlung von HIV-Infektion [ WO 91/00360 ; WO 92/200373 ; EP 03089 ]. Es wird erwogen, dass die Antikörper in vitro unter Verwendung von Verfahren, die auf dem Gebiet der synthetischen Proteinchemie bekannt sind, hergestellt werden können, einschließlich jener, die Vernetzungsmittel einbinden. Beispielsweise können Immunotoxine unter Verwendung einer Disulfid-Austauschreaktion oder durch Bildung einer Thioetherbindung konstruiert werden. Beispiele für geeignete Reagenzien für diesen Zweck umfassen Iminothiolat und Methyl-4-mercaptobutyrimidat sowie jene Reagenzien, die beispielsweise im US-Patent Nr. 4.676.980 offenbart sind.
vi. Effektorfunktionsbearbeitung
Es kann wünschenswert sein, den Antikörper der Erfindung hinsichtlich der Effektorfunktion zu modifizieren, um z. B. die Wirksamkeit des Antikörpers bei der Behandlung von Krebs zu steigern. Beispielsweise können ein oder mehrere Cysteinreste in die Fc-Region eingeführt werden, wodurch die Bildung von Disulfidbindungen zwischen den Ketten in dieser Region ermöglicht wird. Der so gebildete homodimere Antikörper kann verbesserte Internalisierungsfähigkeit und/oder gesteigertes komplementvermitteltes Zelltöten und antikörpervermittelte zelluläre Zytotoxizität (ADCC) aufweisen. Siehe Caron et al., J. Exp. Med. 176, 1191–1195 (1992), und Shopes, J. Immunol. 148, 2918–2922 (1992). Homodimere Antikörper mit gesteigerter Anti-Tumor-Aktivität können auch unter Verwendung heterobifunktioneller Vernetzer hergestellt werden, wie in Wolff et al., Cancer Research 53, 2560–2565 (1993), beschrieben wird. Alternativ dazu kann ein Antikörper so bearbeitet werden, dass er duale Fc-Regionen aufweist und dadurch über gesteigerte Komplementlyse- und ADCC-Fähigkeiten verfügen kann. Siehe Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3,219–230(1989).
vii. Immunkoniugate
Die Erfindung betrifft auch Immunkonjugate, die einen Antikörper umfassen, der an ein zytotoxisches Mittel wie beispielsweise ein chemotherapeutisches Mittel, Toxin (z. B. ein enzymatisch aktives Toxin bakteriellen, pflanzlichen oder tierischen Ursprungs oder auch von Pilzen oder Fragmente davon) oder an ein radioaktives Isotop konjugiert ist (d. h. ein Radiokonjugat).
Chemotherapeutische Mittel, die zur Herstellung solcher Immunkonjugate nützlich sind, wurden oben beschrieben. Enzymatisch aktive Toxine und Fragmente davon, die verwendet werden können, umfassen Diphtherie-A-Kette, nichtbindende aktive Fragmente von Diphtherietoxin, Exotoxin-A-Kette (aus Pseudomonas aeruginosa), Ricin-A-Kette, Abrin-A-Kette, Modeccin-A-Kette, alpha-Sarcin, Aleurites-fordii-Proteine, Dianthin-Proteine, Phytolaca-americana-Proteine (PAPI, PAPII und PAP-S), Momordica-charantia-Inhibitor, Curcin, Crotin, Sapaonaria-officinalis-Inhibitor, Gelonin, Mitogellin, Restrictocin, Phenomycin, Enomycin und die Tricothecene. Zahlreiche verschiedene Radionuclide sind zur Herstellung von radiokonjugierten Antikörpern erhältlich. Beispiele umfassen ²¹²Bi, ¹³¹I, ¹³¹In, ⁹⁰Y und ¹⁸⁶Re.
Konjugate des Antikörpers und des zytotoxischen Mittels werden unter Verwendung zahlreicher verschiedener bifunktioneller Proteinbindungsmittel wie z. B. N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithiol)propionat (SPDP), Iminothiolan (IT), bifunktionellen Derivaten von Imidoestern (wie z. B. Dimethyladipimidat-HCl), aktiver Ester (wie z. B. Disuccinimidylsuberat), Aldehyden (wie Glutaraldehyd), Bisazido-Verbindungen (wie z. B. Bis(p-azidobenzoyl)hexandiamin), Bisdiazonium-Derivaten (wie z. B. Bis(p-diazoniumbenzoyl)ethylendiamin), Diisocyanaten (wie Toluol-2,6-diisocyanat) und bis-aktiven Fluorverbindungen (wie z. B. 1,5-Difluor-2,4-dinitrobenzol) hergestellt. Beispielsweise kann ein Ricinimmunotoxin wie in Vitetta et al., Science 238, 1098 (1987), beschrieben hergestellt werden. C-14-markierte 1-Isothiocyanatobenzyl-3-methyldiethylentriaminpentaessigsäure (MX-DTPA) ist ein beispielhafter Chelatbildner zur Konjugation von Radionucleotid an den Antikörper. Siehe die WO 94/11026 .
In einer anderen Ausführungsform kann der Antikörper an einen „Rezeptor" (wie Streptavidin) zur Verwendung bei Tumor-Pretargeting konjugiert werden, worin das Antikörper-Rezeptor-Konjugat dem Patienten verabreicht wird, gefolgt von der Entfernung ungebundenen Konjugats aus dem Blutkreislauf unter Verwendung eines Klärungsmittels und der anschließenden Verabreichung eines „Liganden" (z. B. Avidin), der an ein zytotoxisches Mittel (z. B. ein Radionucleotid) konjugiert ist.
viii. Immunoliposomen
Die hierin offenbarten Antikörper können auch als Immunoliposomen formuliert werden. Liposomen, die den Antikörper enthalten, werden durch auf dem Gebiet der Erfindung bekannte Verfahren hergestellt, wie sie beispielsweise in Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4030 (1980); und den US-Patenten Nr. 4.485.045 und 4.544.545 beschrieben wer den. Liposomen mit gesteigerter Zirkulationsdauer sind im US-Patent Nr. 5.013.556 offenbart.
Besonders nützliche Liposomen können durch das Umkehrphasenverdampfungsverfahren mit einer Lipidzusammensetzung, die Phosphatidylcholin, Cholesterin und PEG-derivatisiertes Phosphatidylethanolamin (PEG-PE) umfasst, hergestellt werden. Liposomen werden durch Filter von definierter Porengröße extrudiert, um Liposomen mit dem erwünschten Durchmesser zu ergeben. Fab'-Fragmente des Antikörpers der vorliegenden Erfindung können an die Liposomen wie in Martin et al., J. Biol. Chem. 257, 286–288 (1982), beschrieben mittels einer Disulfid-Austauschreaktion konjugiert werden. Ein chemotherapeutisches Mittel (wie beispielsweise Doxorubicin) ist gegebenenfalls im Liposom enthalten. Siehe Gabizon et al., J. National Cancer Inst. 81(19), 1484 (1989).
ix. Pharmazeutische Zusammensetzungen von Antikörpern
Antikörper, die spezifisch an ein hierin identifiziertes PRO-Polypeptid binden, sowie andere Moleküle, die durch die zuvor offenbarten Screeningtests identifiziert wurden, können zur Behandlung von verschiedenen Erkrankungen in Form von pharmazeutischen Zusammensetzungen verabreicht werden, wie oben und unten stehend angeführt wird.
Ist das PRO-Polypeptid intrazellulär und werden ganze Antikörper als Inhibitoren verwendet, werden internalisierende Antikörper bevorzugt. Es können jedoch auch Lipofektionen oder Liposomen verwendet werden, um den Antikörper oder ein Antikörperfragment an Zellen abzugeben. Werden Antikörperfragmente verwendet, so wird das kleinste Inhibitionsfragment, das sich spezifisch an die Bindungsdomäne des Targetproteins bindet, bevorzugt. Beispielsweise können auf Grundlage der Sequenzen der variablen Regionen eines Antikörpers Peptidmoleküle entworfen werden, die die Fähigkeit beibehalten, die Target-Proteinsequenz zu binden. Solche Peptide können chemisch synthetisiert und/oder durch DNA-Rekombinationsver fahren hergestellt werden. Siehe z. B. Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 7889–7893 (1993).
Die Formulierung hierin kann auch mehr als nur eine aktive Verbindung als für die bestimmte zu behandelnde Indikation erforderlich ist enthalten, vorzugsweise jene mit komplementären Aktivitäten, die sich gegenseitig nicht negativ beeinflussen. Alternativ oder zusätzlich dazu kann die Zusammensetzung ein Mittel umfassen, das ihre Funktion steigert, wie beispielsweise ein zytotoxisches Mittel, Zytokin, ein chemotherapeutisches Mittel oder ein wachstumshemmendes Mittel. Solche Moleküle sind geeigneterweise in Kombination in Mengen vorhanden, die für die beabsichtigten Zwecke wirksam sind.
Die Wirkstoffe können auch in Mikrokapseln eingekapselt werden, beispielsweise durch Koazervierungsverfahren oder durch Grenzflächenpolymerisation, z. B. in Hydroxymethylcellulose- oder Gelatine-Mikrokapseln bzw. Poly(methylmethacrylat)-Mikrokapseln, in kolloidale Wirkstoffzufuhrsysteme (z. B. Liposomen, Albuminmikrokügelchen, Mikroemulsionen, Nanopartikeln und Nanokapseln) oder in Makroemulsionen. Solche Verfahren sind in Remington's Pharmaceutical Sciences, s. o., offenbart.
Die Formulierungen, die zur In-vivo-Verabreichung verwendet werden, müssen steril sein. Dies kann leicht mittels Filtration durch sterile Filtermembranen erreicht werden.
Es können Retardpräparate hergestellt werden. Geeignete Beispiele für Retardpräparate umfassen semipermeable Matrizen von festen hydrophoben Polymeren, die den Antikörper enthalten, wobei die Matrizen in Form von Formstücken, z. B. Filmen oder Mikrokapseln, vorliegen. Beispiele für Retard-Matrizen umfassen Polyester, Hydrogele (z. B. Poly(2-hydroxyethylmethacrylat) oder Poly(vinylalkohol)), Polylactide ( US-Patent Nr. 3.773.919 ), Copolymere von L-Glutaminsäure und γ-Ethyl-L-glutamat, nicht abbaubares Ethylenvinylacetat, abbaubare Milchsäure-Glykolsäure-Copolymere wie z. B. LUPRON DEPOT^TM (injizierbare Mikrokügelchen, zusammengesetzt aus Milchsäure-Glykolsäure-Copolymer und Leuprolidacetat) und Poly-D-(–)-3- hydroxybuttersäure. Während Polymere wie z. B. Ethylenvinylacetat und Milchsäure-Glykolsäure die Freisetzung von Molekülen über eine Zeitspanne von 100 Tagen ermöglichen, setzen bestimmte Hydrogele Proteine über kürzere Zeitspannen hinweg frei. Verbleiben eingekapselte Antikörper über eine längere Zeit im Körper, so können sie als ein Resultat von Aussetzung gegenüber Feuchtigkeit bei 37°C denaturieren oder aggregieren, was zu einem Verlust von biologischer Aktivität und möglichen Veränderungen der Immunogenität führen kann. Je nach vorliegendem Mechanismus können rationale Vorgehensweisen zur Stabilisierung entwickelt werden. Ist der gefundene Aggregationsmechanismus beispielsweise intermolekulare S-S-Bindungsbildung durch Thio-Disulfid-Austausch, so kann Stabilisierung durch Modifikation von Sulfhydrylresten, Lyophilisierung aus sauren Lösungen, Steuerung des Feuchtigkeitsgehalts, Verwendung geeigneter Additive und Entwicklung spezifischer Polymermatrizenzusammensetzungen erreicht werden.
x. Behandlungsverfahren unter Einsatz des Antikörpers
Es wird erwogen, dass die Antikörper für ein PRO-Polypeptid eingesetzt werden können, um, wie oben angeführt, verschiedene kardiovaskuläre, endotheliale und angiogene Erkrankungen zu behandeln.
Die Antikörper werden einem Säugetier, vorzugsweise einem Menschen, gemäß bekannten Verfahren, wie z. B. durch intravenöse Verabreichung in Form eines Bolus oder durch kontinuierliche Infusion über einen bestimmten Zeitraum hinweg, auf intramuskulärem, intraperitonealem, intracerebrospinalem, subkutanem, intraartikulärem, intrasynovialem, intrathekalem, oralem, topischem Weg oder auf dem Inhalationsweg verabreicht. Die intravenöse Verabreichung des Antikörpers ist zu bevorzugen.
Weitere Therapieschemata können mit der Verabreichung von erfindungsgemäßen Antikörpern, wie oben angeführt, kombiniert werden. Wenn die Antikörper beispielsweise zur Behandlung von Krebs eingesetzt werden sollen, kann der Patient, der mit solchen Antikörpern behandelt werden soll, auch eine Bestrahlungstherapie erhalten.
Alternativ oder zusätzlich dazu kann dem Patienten auch ein chemotherapeutisches Mittel verabreicht werden. Die Herstellungs- und Dosierungspläne für solche chemotherapeutischen Mittel können gemäß den Herstellerhinweisen oder wie durch Fachleute auf empirischem Weg bestimmt eingesetzt werden. Die Herstellungs- und Dosierungsschemata für solche Chemotherapien werden auch in M. C. Perry (Hrsg.), Chemotherapy Service, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992), beschrieben. Das chemotherapeutische Mittel kann vor oder nach der Verabreichung des Antikörpers oder gleichzeitig mit diesem verabreicht werden. Der Antikörper kann mit einer Anti-Östrogen-Verbindung, wie z. B. Tamoxifen oder EVISTA^TM, oder einem Anti-Progesteron, wie z. B. Onapriston (siehe EP 616812 ), in für solche Moleküle bekannten Dosierungen kombiniert werden.
Wenn die Antikörper zur Behandlung von Krebs eingesetzt werden, kann es wünschenswert sein, auch Antikörper gegen andere tumorassoziierte Antigene zu verabreichen, wie z. B. Antikörper, die an einen oder mehrere der ErbB2-, EGFR-, ErbB3-, ErbB4- oder VEGF-Rezeptor(en) binden. Diese umfassen auch die oben angeführten Mittel. Der Antikörper wird auf geeignete Weise auch seriell oder in Kombination mit radiologischen Behandlungen verabreicht, unabhängig davon, ob es sich um eine Bestrahlung oder die Verabreichung von radioaktiven Substanzen handelt. Alternativ oder zusätzlich dazu können zwei oder mehrere Antikörper, die an dasselbe oder zwei oder mehrere verschiedene hierin offenbarte Antigene binden, dem Patienten gemeinsam verabreicht werden. Manchmal kann es nützlich sein, dem Patienten auch zwei oder mehrere Zytokine zu verabreichen. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Antikörper hierin gemeinsam mit einem wachstumshemmenden Mittel verabreicht. Das wachstumshemmende Mittel kann beispielsweise zuerst verabreicht werden, wonach ein Antikörper der vorliegenden Erfindung verabreicht wird. Die gleichzeitige Verabreichung oder die Verabreichung des Antikörpers der vorliegenden Erfindung vor dem wachstumshemmenden Mittel werden jedoch auch in Betracht gezogen. Geeignete Dosierungen für das wachstumshemmende Mittel entsprechen jenen, die derzeit eingesetzt werden, und können aufgrund der kombinierten Wirkung (Synergie) des wachstumshemmenden Mittels und des Antikörpers hierin gesenkt werden.
In einer Ausführungsform wird die Gefäßbildung von Tumoren durch eine Kombinationstherapie angegriffen. Der Anti-PRO-Polypeptid-Antikörper und ein anderer Antikörper (z. B. Anti-VEGF) werden Patienten, die an einem Tumor leiden, in therapeutisch wirksamen Dosierungen verabreicht, wie beispielsweise durch die Beobachtung der Nekrose des Tumors oder, bei Vorhandensein, der Metastasenherde bestimmt. Diese Therapie wird so lange fortgesetzt, bis keine weitere nützliche Wirkung mehr zu beobachten ist oder eine klinische Untersuchung keine Spur des Tumors oder etwaiger Metastasenherde mehr zeigt. Dann wird TNF verabreicht, allein oder in Kombination mit einem Hilfsmittel, wie z. B. α-, β- oder γ-Interferon, Anti-HER2-Antiköprer, Heregulin, Anti-Heregulin-Antikörper, D-Faktor, Interleukin-1 (IL-1), Interleukin-2 (IL-2), Granulozyten-Makrophagen-Kolonien-stimulierendem Faktor (GM-CSF) oder mit Mitteln, die die mikrovaskuläre Gerinnung in Tumoren fördern, wie z. B. Anti-Protein-C-Antikörper, Anti-Protein-S-Antikörper oder C4b-Bindungsprotein (siehe WO 91/01753 , veröffentlicht am 21. Februar 1991) oder mit Wärme oder Bestrahlung.
Da die Wirksamkeit der Hilfsmittel variiert, ist es wünschenswert, ihren Einfluss auf den Tumor durch Matrixscreening auf herkömmliche Weise zu vergleichen. Die Verabreichung von Anti-PRO-Polypeptid-Antikörper und TNF wird wiederholt, bis die erwünschte klinische Wirkung erzielt wurde. Alternativ dazu wird der Anti-PRO-Polypeptid-Antikörper gemeinsam mit TNF und gegebenenfalls mit einem Hilfsmittel/Hilfsmitteln verabreicht. Wenn feste Tumoren in den Gliedmaßen oder an anderen Orten vorhanden sind, die von dem Gesamtblutkreislauf isoliert werden können, werden die hierin beschriebenen Wirkstoffe dem isolierten Tumor oder Organ verabreicht. In anderen Ausführungsformen wird ein FGF- oder PDGF-Antagonist, wie z. B. ein neutralisierender Anti-FGF- oder ein Anti-PDGF-Antikörper, dem Patienten in Verbindung mit dem Anti-PRO-Polypeptid-Antikörper verabreicht. Die Behandlung mit Anti-PRO-Polypeptid-Antikörpern kann in Phasen der Wundheilung oder wünschenswerter Gefäßneubildung vorzugsweise ausgesetzt werden.
Zur Prävention oder Behandlung von kardiovaskulären, endothelialen und angiogenen Störungen hängt die geeignete Dosierung eines hierin offenbarten Antikörpers von der Art der wie oben definierten, zu behandelnden Störung, der Schwere und dem Verlauf der Erkrankung, von der Tatsache, ob der Antikörper zu Präventions- oder Therapiezwecken verabreicht wird, von vorhergehenden Therapien, der Krankengeschichte des Patienten und der Reaktion auf den Antikörper sowie dem Ermessen des behandelnden Arztes ab. Der Antikörper wird einem Patienten auf geeignete Weise auf einmal oder im Verlauf einer Behandlungsserie verabreicht.
In Abhängigkeit von der Art und Schwere der Störung handelt es sich beispielsweise bei etwa 1 μg/kg bis 50 mg/kg (z. B. 0,1–20 mg/kg) Antikörper um eine mögliche Anfangsdosis, die dem Patienten verabreicht wird, beispielsweise in Form einer oder mehrerer separater Verabreichungen oder durch kontinuierliche Infusion. Eine typische tägliche oder wöchentliche Dosierung kann in Abhängigkeit von den oben angeführten Faktoren im Bereich von etwa 1 μg/kg bis 100 mg/kg oder mehr liegen. Bei wiederholten Verabreichungen im Verlauf von mehreren Tagen oder mehr wird die Behandlung, in Abhängigkeit von der Erkrankung, wiederholt oder fortgeführt, bis eine gewünschte Hemmung von Symptomen der Störung eintritt. Andere Dosierungsschemata können jedoch auch nützlich sein. Die Fortschritte dieser Therapie können leicht durch herkömmliche Verfahren und Tests, wie z. B. durch radiographische Tumordarstellung, überwacht werden.
xi. Fabrikate mit Antikörpern
Ein Fabrikat, das einen Behälter mit dem Antikörper und ein Etikett umfasst, wird auch bereitgestellt. Solche Fabrikate werden obenstehend beschrieben, wobei es sich bei dem Wirkstoff um einen Anti-PRO-Antikörper handelt.
xii. Diagnose und Prognose von Tumoren unter Einsatz von Antikörpern
Wenn es sich bei der Indikation, für die die Antikörper eingesetzt werden, um Krebs handelt, finden Zelloberflächenproteine in Verbindung mit PRO-Polypeptiden zusätzliche Anwendung in der Diagnose und Prognose von Tumoren, während dieselben Proteine, wie z. B. Wachstumsrezeptoren, die in bestimmten Tumoren überexprimiert werden, hervorragende Ziele für Arzneimittelkandidaten oder Tumor-(z. B. Krebs-)behandlung sind. Gegen die PRO-Polypeptide gerichtete Antikörper können beispielsweise als Tumordiagnose- oder -prognosemittel eingesetzt werden.
Antikörper, einschließlich Antikörperfragmente, können beispielsweise qualitativ oder quantitativ eingesetzt werden, um die Expression von Genen zu detektieren, einschließlich des Gens, das für das PRO-Polypeptid kodiert. Der Antikörper ist vorzugsweise mit einer detektierbaren, z. B. fluoreszierenden, Markierung versehen, und die Bindung kann durch Lichtmikroskopie, Durchflusszytometrie, Fluorimetrie oder andere auf dem Gebiet der Erfindung bekannte Verfahren überprüft werden. Solche Bindungstests werden im Wesentlichen wie oben beschrieben durchgeführt.
Die In-situ-Detektion der Bindung von Antikörpern an die Markergenprodukte kann beispielsweise mittels Immunfluoreszenz- oder Immunelektronenmikroskopie erfolgen. Zu diesem Zweck wird eine histologische Probe aus dem Patienten entnommen, und ein markierter Antikörper wird auf diese angewandt, vorzugsweise indem der Antikörper über eine biologische Probe geschichtet wird. Dieses Verfahren ermöglicht auch die Bestimmung der Verteilung des Markergenprodukts in dem untersuchten Gewebe. Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung ist klar, dass viele verschiedene histologische Verfahren für die In-situ-Detektion zur Verfügung stehen.
Die folgenden Beispiele dienen ausschließlich der Veranschaulichung und sollen den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung auf keine Weise einschränken.
BEISPIELE
Im Handel erhältliche Reagenzien, auf die in den Beispielen verwiesen wird, wurden, außer anders angemerkt, gemäß den Vorschriften der Hersteller verwendet. Die Quelle jener Zellen, die in den folgenden Beispielen und in der gesamten Beschreibung durch ATCC-Zugriffsnummern identifiziert werden, ist die American Type Culture Collection, Manassas, VA. Wenn nicht anders angegeben, werden in der vorliegenden Erfindung herkömmliche Verfahren der DNA-Rekombinationstechnologie eingesetzt, wie z. B. die obenstehend und in folgenden Lehrbüchern beschriebenen: Sambrook et al., s. o.; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, NY (1989); Innis et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc., NY (1990); Harlow et al., Antibodies: A Laborstory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor (1988); Gait, Oligonucleotide Synthesis, IRL Press, Oxford (1984); Freshney, Animal Cell Culture (1987); Coligan et al., Current Protocols in Immunology (1991).
BEISPIEL 1
Homologiescreening extrazellulärer Domänen zur Identifikation neuer Polypeptide und dafür kodierender cDNA
Die Sequenzen der extrazellulären Domäne (ECD) (unter anderem die Sekretionssignalsequenz, falls vorhanden) von etwa 950 bekannten sekretierten Proteinen aus der öffentlichen Swiss-Prot-Datenbank wurden verwendet, um EST-Datenbanken zu durchsuchen. Die EST-Datenbanken umfassten öffentliche Datenbanken (z. B. Gen-Bank) und Datenbanken von Firmen (z. B. LIFESEQ^TM, Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA). Die Suche wurde unter Verwendung des Computerprogramms BLAST oder BLAST2 durchgeführt (Altschul et al., Methods in Enzymology 266, 460–480 (1996)) als Vergleich der ECD-Proteinsequenzen mit einer 6-Raster-Translation der EST-Sequenzen. Jene Vergleiche mit einem BLAST-Score von 70 (oder in manchen Fällen 90) oder mehr, die nicht für bekannte Proteine kodierten, wurden mit dem Programm „phrap" (Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington) zu Clustern zusammengefasst und zu Konsensus-DNA-Sequenzen angeordnet.
Unter Verwendung dieses Homologiescreenings extrazellulärer Domänen wurden Konsensus-DNA-Sequenzen im Verhältnis zu anderen identifizierten EST-Sequenzen unter Verwendung von phrap angeordnet. Zusätzlich dazu wurden die erhaltenen Konsensus-DNA-Sequenzen oftmals (jedoch nicht immer) unter Verwendung wiederholter Zyklen von BLAST und phrap verlängert, um die Konsensussequenz unter Verwendung der oben stehend beschriebenen EST-Sequenzen-Quellen so weit wie möglich zu verlängern.
Basierend auf der Konsensus-Sequenz, erhalten wie oben stehend beschrieben, wurden Oligonucleotide anschließend synthetisiert und verwendet, um mittels PCR eine cDNA-Bibliothek zu identifizieren, welche die Sequenz von Interesse enthielt, sowie zur Verwendung als Sonden zur Isolation eines Klons der Kodiersequenz voller Länge eines PRO-Polypeptids. Vorwärts- und Rückwärts-PCR-Primer weisen allgemein zwischen 20 und 30 Nucleotide auf und werden oftmals kreiert, um ein PCR-Produkt mit einer Länge von etwa 100–1000 bp zu ergeben. Die Sondensequenzen sind typischerweise 40–55 bp lang. In manchen Fällen werden zusätzliche Oligonucleotide synthetisiert, wenn die Konsensus-Sequenz größer als etwa 1–1,5 kbp ist. Um mehrere Bibliotheken auf einen Klon voller Länge zu screenen, wurde DNA aus den Bibliotheken mittels PCR-Amplifikation gescreent, wie in Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, s. o., beschrieben, und zwar mit dem PCR-Primer-Paar. Eine positive Bibliothek wurde anschließend verwendet, um unter Verwendung des Sonden-Oligonucleotids und eines der Primer-Paare Klone zu isolieren, die für das Gen von Interesse kodieren.
Die zur Isolation der cDNA-Klone verwendeten cDNA-Bibliotheken wurden durch Standardverfahren unter Verwendung von im Handel erhältlichen Reagenzien konstruiert, wie z. B. jenen von Invitrogen, San Diego, CA. Die cDNA wurde mit Oligo-dT, enthaltend eine NotI-Stelle, geprimt, mit dem stumpfen Ende an hemikinasierte SalI-Adaptoren gebunden, mit Not) gespalten, mittels Gelelektrophorese in die geeignete Größe gebracht und in einer definierten Ausrichtung in einen geeigneten Klonierungsvektor kloniert (wie z. B. pRKB oder pRKD; pRK5B ist ein Vorläufer von pRK5D, der die SfiI-Stelle nicht enthält; siehe Holmes et al., Science 253, 1278–1280 (1991)), und zwar in die einzigartigen XhoI- und NotI-Stellen.
BEISPIEL 2
Isolation von cDNA-Klonen unter Verwendung von Signal-Algorithmus-Analyse
Verschiedene polypeptidkodierende Nucleinsäuresequenzen wurden durch Anwenden eines privaten Signalsequenzfindungs-Algorithmus, entwickelt von Genentech, Inc. (South San Francisco, CA), auf ESTs sowie auf zu Clustern zusammengefass ten und angeordneten EST-Fragmenten aus öffentlichen (z. B. GenBank) und/oder privaten (z. B. LIFESEQ^TM, Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA) Datenbanken identifiziert. Der Signalsequenz-Algorithmus berechnet einen Sekretionssignal-Score basierend auf der Eigenschaft der DNA-Nucleotide, die das erste und gegebenenfalls das zweite Methionin-Codon (ATG) am 5'-Ende der Sequenz oder des Sequenzfragments, die/das in Betracht gezogen wird, umgeben. Die dem ersten ATG folgenden Nucleotide müssen für zumindest 35 unzweideutige Aminosäuren ohne etwaige Stopp-Codons kodieren. Falls das erste ATG die erforderlichen Aminosäuren aufweist, wird das zweite nicht untersucht. Falls keines die Anforderungen erfüllt, so erfolgt für die Kandidatensequenz kein Scoring. Um zu bestimmen, ob die EST-Sequenz eine authentische Signalsequenz enthält, erfolgt für die DNA und die entsprechenden Aminosäuresequenzen, die das ATG-Codon umgeben, unter Verwendung einer Gruppe von sieben Sensoren (Evaluationsparametern), von denen bekannt ist, dass sie mit Sekretionssignalen assoziiert sind, ein Scoring. Die Verwendung dieses Algorithmus führte zu der Identifikation zahlreicher polypeptidkodierender Nucleinsäuresequenzen.
BEISPIEL 3
Isolation von cDNA-Klonen, die für menschliches PRO1002 kodieren
Eine Consensus-DNA-Sequenz wurde im Verhältnis zu anderen EST-Sequenzen unter Einsatz von phrap, wie in Beispiel 1 oben stehend beschrieben, assembliert. Diese Consensussequenz wird hierin als „<Consen0257>" bezeichnet.
Der Incyte-Klon 197165 wurde identifiziert, und der Klon wurde basierend auf den hierin entdeckten Resultaten weiter sequenziert. Der 197165-Klon stammte aus einer Brusttumor-Gewebebibliothek, BRSTTUT13.
Die DNA-Sequenzierung des oben beschriebenen Klons ergab die DNA-Sequenz voller Länge für PRO1002 (hierin als UNQ486 bezeichnet (DNA59208-1373)) (Seq.-ID Nr. 1) und die abgeleitete Proteinsequenz für PRO1002.
Die gesamte Nucleotidsequenz von UNQ486 (DNA59208-1373) wird in 1 (Seq.-ID Nr. 1) dargestellt. Klon UNQ486 (DNA59208-1373) enthält einen einzelnen offenen Leseraster mit einer offensichtlichen Translationsinitiationsstelle an den Nucleotidpositionen 91–93, der am Stopp-Codon an den Nucleotidpositionen 766–768 endet (1). Der prognostizierte Polypeptidvorläufer ist 225 Aminosäuren lang (2; Seq.-ID Nr. 2). Das PRO1002-Protein voller Länge, das in 2 gezeigt wird, hat ein geschätztes Molekulargewicht von etwa 25.447 Dalton und einen pI von etwa 4,79. Klon UNQ486 (DNA59208-1373) wurde bei der ATCC am 20. Mai 1998 hinterlegt und es wurde ihm die ATCC-Hinterlegungsnr. 209881 zugewiesen. Hinsichtlich der Sequenz ist anzumerken, dass der hinterlegte Klon die korrekte Sequenz enthält und dass die hierin bereitgestellten Sequenzen auf bekannten Sequenzierungsverfahren basieren.
Eine Analyse der Aminosäuresequenz des PRO1002-Polypeptids voller Länge zeigt, dass Abschnitte davon eine signifikante Homologie mit MBP aufweisen, wodurch angezeigt wird, dass PRO1002 ein neues Cytostimulans und/oder Toxin sein kann.
Noch bezüglich der Analyse der Aminosäuresequenz aus Seq.-ID Nr. 2 ist zu sagen, dass sich das mutmaßliche Signalpeptid etwa an den Aminosäuren 1–17 der Seq.-ID Nr. 2 befindet. N-Myristoylierungsstellen sind etwa die Aminosäuren 13–19, 103–109, 134–140, 164–170, 180–186, 191–197, 194–200, 196–202 und 198–204. Die C-Typ-Lectin-Domäne befindet sich etwa an den Aminosäuren 200–224 der Seq.-ID Nr. 2. Die entsprechenden Nucleotide können angesichts der hierin bereitgestellten Sequenzen routinemäßig bestimmt werden.
BEISPIEL 4
Detektion von Endothelzellen-Apoptose (FACS) (Test Nr. 96)
Die Fähigkeit von PRO-Polypeptiden der vorliegenden Erfindung, Apoptose in Endothelzellen zu induzieren, wurde in menschlichen Nabelschnurvenen-Endothelzellen (HUVEC, Cell Systems) in gelatinisierten T175-Flaschen unter Verwendung von HUVEC-Zellen unter Passage 10 getestet. Von PRO-Polypeptiden, die bei diesem Test positiv getestet werden, wird erwartet, dass sie bei der therapeutischen Behandlung von Zuständen von Nutzen sind, bei denen die Apoptose von Endothelzellen von Vorteil wäre, umfassend beispielsweise die therapeutische Behandlung von Tumoren.
An Tag 1 wurden die Zellen aufgeteilt (420.000 Zellen pro gelatinisierten 6-cm-Schalen – (11 × 10³ Zellen/cm² Falcon, Primaria)) und in Medium, enthaltend Serum (CS-C, Cell System), über Nacht oder 16 bis 24 Stunden lang wachsen gelassen.
An Tag 2 wurden die Zellen 1 × mit 5 ml PBS gewaschen; 3 ml 0-%-Serummedium wurden mit VEGF (100 ng/ml) hinzugefügt, und 30 μl der PRO-Testverbindung (Endverdünnung 1%) oder 0% Serummedium (negative Kontrolle) wurden hinzugefügt. Die Gemische wurden vor der Ernte 48 Stunden lang inkubiert.
Die Zellen wurden anschließend zur FACS-Analyse geerntet. Das Medium wurde abgesaugt, und die Zellen wurden einmal mit PBS gewaschen. 5 ml 1-×-Trypsin wurden zu den Zellen in einer T-175-Flasche hinzugefügt, und die Zellen wurden stehen gelassen, bis sie aus der Platte freigesetzt wurden (etwa 5–10 Minuten). Die Trypsinisierung wurde durch Hinzufügen von 5 ml Wachstumsmedium gestoppt. Die Zellen wurden bei 1000 U/min 5 Minuten lang bei 4°C zentrifugiert. Das Medium wurde abgesaugt, und die Zellen wurden in 10 ml 10-%-serumkomplementiertem Medium (Cell Systems) resuspendiert, es wurden 5 μl Annexin-FITC (BioVison) hinzugefügt, und die gekühlten Röhrchen wurden einer FACS unterzogen. Ein positives Resultat wurde im Vergleich zu der negativen Kontrolle als eine verstärkte Apoptose in den PRO-Polypeptid-behandelten Proben bestimmt.
PRO1002 wurde in diesem Test als positiv getestet.
BEISPIEL 5
Verwendung von PRO1002 als Hybridisierungssonde
Das folgende Verfahren beschreibt die Verwendung einer Nucleotidsequenz, die für PRO1002 kodiert, als Hybridisierungssonde.
DNA, umfassend die kodierende Sequenz von PRO1002 voller Länge oder von reifem PRO1002 (wie in 1 dargestellt), oder ein Fragment davon wird als Sonde verwendet, um in menschlichen Gewebe-cDNA-Bibliotheken oder menschlichen genomischen Gewebe-Bibliotheken auf homologe DNAs zu screenen (wie z. B. jene, die für natürlich auftretende Varianten von PRO1002 kodieren).
Die Hybridisierung und das Waschen von Filtern, die eine der Bibliotheks-DNAs enthalten, wird unter den folgenden Bedingungen hoher Stringenz durchgeführt. Die Hybridisierung einer radiomarkierten Sonde, die von dem Gen abstammt, das für PRO1002-Polypeptid kodiert, an die Filter wird in einer Lösung aus 50% Formamid, 5 × SSC, 0,1% SDS, 0,1% Natriumpyrophosphat, 50 mM Natriumphosphat, pH 6,8, 2 × Denhardt-Lösung und 10% Dextransulfat bei 42°C für eine Zeitspanne von 20 Stunden durchgeführt. Das Waschen der Filter wird in einer wässrigen Lösung aus 0,1 × SSC und 0,1% SDS bei 42°C durchgeführt.
DNAs mit einer gewünschten Sequenzidentität mit der DNA, die für die native Sequenz voller Länge kodiert, können anschließend unter Verwendung von Standardverfahren, die nach dem Stand der Technik bekannt sind, identifiziert werden.
BEISPIEL 6
Expression von Nucleinsäure, die für PRO1002 kodiert, in E. coli
Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung einer unglykosylierten Form von PRO1002 durch rekombinante Expression in E. coli.
Die DNA-Sequenz, die für PRO1002 kodiert (Seq.-ID Nr: 1), wird anfänglich unter Verwendung ausgewählter PCR-Primer amplifiziert. Die Primer sollten Restriktionsenzymstellen enthalten, die den Restriktionsenzymstellen auf dem ausgewählten Expressionsvektor entsprechen. Es kann eine Reihe von Expressionsvektoren verwendet werden. Ein Beispiel eines geeigneten Vektors ist pBR322 (stammt von E. coli ab; siehe Bolivar et al., Gene 2, 95 (1977)), der Gene für eine Ampicillin- und Tetrazyklin-Resistenz enthält. Der Vektor wird mit Restriktionsenzym verdaut und dephosphoryliert. Die PCR-amplifizierten Sequenzen werden anschließend in den Vektor ligiert. Der Vektor umfasst vorzugsweise Sequenzen, die für ein Antibiotika-Resistenz-Gen kodieren, einen trp-Promotor, einen poly-His-Leader (umfassend die ersten sechs STII-Codons, Poly-His-Sequenz und Enterokinase-Spaltstellen), die Region, die für PRO1002 kodiert, den λ-Transkriptionsterminator und ein argU-Gen.
Das Ligationsgemisch wird anschließend verwendet, um einen ausgewählten E.-coli-Stamm unter Verwendung der in Sambrook et al., s. o., beschriebenen Verfahren zu transformieren. Transformanten werden durch ihre Fähigkeit, auf LB-Platten zu wachsen, identifiziert, und anschließend werden antibiotikaresistente Kolonien ausgewählt. Plasmid-DNA kann isoliert werden und durch Restriktionsanalyse und DNA-Sequenzierung bestätigt werden.
Ausgewählte Klone können über Nacht in Flüssigkulturmedium, wie z. B. LB-Nährlösung, mit Antibiotika ergänzt, gezüchtet werden. Die Übernacht-Kultur kann anschließend verwendet werden, um eine Kultur in größerem Ausmaß zu beimpfen. Die Zellen werden anschließend bis auf eine gewünschte optische Dichte gezüchtet, während derer der Expressionspromotor angeschaltet wird.
Nach dem Züchten der Zellen für mehrere weitere Stunden können die Zellen mittels Zentrifugierung geerntet werden. Das mittels Zentrifugierung erhaltene Zellpellet kann unter Verwendung verschiedener Mittel, die nach dem Stand der Technik bekannt sind, solubilisiert werden, und das solubilisierte PRO1002-Polypeptid kann anschließend unter Verwendung einer metallchelatierenden Säule unter Bedingungen gereinigt werden, die eine feste Bindung des Polypeptids ermöglichen.
In WO 00/73445 wurden gewisse Polypeptide erfolgreich in E. coli in einer poly-His-markierten Form durch das oben genannte Verfahren exprimiert.
BEISPIEL 7
Expression von Nucleinsäure, die für PRO1002 kodiert, in Säugetierzellen
Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung einer potentiell glykosylierten Form von PRO1002 durch rekombinante Expression in Säugetierzellen.
Der Vektor, pRK5 (siehe EP 307.247 , veröffentlicht am 15. März 1989), wird als Expressionsvektor verwendet. Gegebenenfalls wird die PRO1002-DNA in pRK5 mit ausgewählten Restriktionsenzymen ligiert, um die Insertion der DNA zu ermöglichen, die für PRO1002 kodiert, und zwar unter Verwendung von Ligationsverfahren, wie sie in Sambrook et al., s. o., beschrieben werden. Der resultierende Vektor wird pRK5-(DNA, die für PRO1002 kodiert) genannt.
In einer Ausführungsform sind die ausgewählten Wirtszellen 293-Zellen. Menschliche 293-Zellen (ATCC CCL 1537) werden bis zur Konfluenz in Gewebekulturplatten in Medium, wie z. B. DMEM, ergänzt mit fötalem Kälberserum und gegebenenfalls Nährstoffkomponenten und/oder Antibiotika, gezüchtet. Etwa 10 μg DNA von pRK5-(DNA, kodierend für PRO1002) wird mit etwa 1 μg DNA, kodierend für das VA-RNA-Gen (Thimmappaya et al., Cell 31, 543 (1982)), gemischt und in 500 μl 1 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, 0,227 M CaCl₂ aufgelöst. Zu diesem Gemisch werden tropfenweise 500 μl 50 mM HEPES (pH 7,35), 280 mM NaCl, 1,5 mM NaPO₄ hinzugefügt, und es wird die Bildung eines Präzipitats bei 25°C für eine Zeitspanne von 10 Minuten ermöglicht. Das Präzipitat wird suspendiert und zu den 293-Zellen hinzugefügt, und es wird bei 37°C für eine Zeitspanne von etwa vier Stunden absetzen gelassen. Das Kulturmedium wird abgesaugt, und 2 ml 20% Glycerin in PBS werden für eine Zeitspanne von 30 Sekunden hinzugefügt. Die 293-Zellen werden anschließend mit serumfreiem Medium gewaschen, frisches Medium wird hinzugefügt, und die Zellen werden für etwa 5 Tage inkubiert.
Etwa 24 Stunden nach den Transfektionen wird das Kulturmedium entfernt und mit (ausschließlich) Kulturmedium oder Kulturmedium, enthaltend 200 μCi/ml ³⁵S-Cystein und 200 μCi/ml ³⁵S-Methionin, ersetzt. Nach einer 12-Stunden-Inkubation wird das konditionierte Medium gesammelt, auf einem Spin-Filter konzentriert und auf ein 15-%-SDS-Gel konzentriert. Das bearbeitete Gel kann getrocknet werden und gegenüber einem Film für eine ausgewählte Zeitspanne ausgesetzt werden, um die Gegenwart des PRO1002-Polypeptids aufzuzeigen. Die Kulturen, die transfizierte Zellen enthalten, können einer weiteren Inkubation unterzogen werden (in serumfreiem Medium), und das Medium wird in ausgewählten Biotests getestet.
In einem alternativen Verfahren kann das für PRO1002 kodierende Gen in 293-Zellen vorübergehend unter Verwendung des Dextransulfatverfahrens, beschrieben von Somparyrac et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 12, 7575 (1981), eingeführt werden. 293-Zellen werden bis zu einer maximalen Dichte in einer Spinner-Flasche gezüchtet, und es werden 700 μg pRK5-(DNA, die für PRO1002 kodiert) hinzugefügt. Die Zellen werden zuerst aus der Spinner-Flasche mittels Zentrifugierung konzentriert und mit PBS gewaschen. Das DNA-Dextran-Präzipitat wird auf dem Zellpellet für eine Zeitspanne von vier Stunden inkubiert. Die Zellen werden mit 20% Glycerin 90 Sekunden lang behandelt, mit Gewebekulturmedium gewaschen und erneut in die Spinner-Flasche eingeführt, die Gewebekulturmedium, 5 μg/ml Rinder-Insulin und 0,1 μg/ml Rinder-Transferrin enthält. Nach etwa vier Tagen wird das konditionierte Medium zentrifugiert und filtriert, um Zellen und Trümmer zu entfernen. Die Probe, enthaltend das exprimierte Gen, das für das PRO1002-Polypeptid kodiert, kann anschließend durch jedes ausgewählte Verfahren, wie z. B. Dialyse und/oder Säulenchromatographie, konzentriert und gereinigt werden.
In einer anderen Ausführungsform kann das für PRO1002 kodierende Gen in CHO-Zellen exprimiert werden. Die pRK5-(DNA, die für PRO1002 kodiert)-Nucleinsäure kann unter Verwendung bekannter Reagenzien, wie z. B. CaPO₄ oder DEAE-Dextran, in CHO-Zellen transfiziert werden. Wie oben stehend beschrieben, können die Zellkulturen inkubiert werden und das Medium mit (ausschließlich) Kulturmedium oder Medium, enthaltend eine Radiomarkierung, wie z. B. ³⁵S-Methionin, ersetzt werden. Nach der Bestimmung der Gegenwart des PRO1002-Polypeptids kann das Kulturmedium mit serumfreiem Medium ersetzt werden. Vorzugsweise werden die Kulturen für etwa 6 Tage inkubiert, und anschließend wird das konditionierte Medium geerntet. Das Medium, enthaltend das exprimierte PRO1002, kann anschließend durch ein beliebiges ausgewähltes Verfahren konzentriert und gereinigt werden.
Ein epitopmarkiertes Gen, das für das PRO1002-Polypeptid kodiert, kann auch in Wirts-CHO-Zellen exprimiert werden. Das für PRO1002 kodierende Gen kann aus dem pRK5-Vektor subkloniert werden. Das Subklon-Insert kann einer PCR-Amplifikation unterzogen werden, um im Rahmen mit einer ausgewählten Epitop-Markierung, wie z. B. einer poly-His-Markierung, in einen Baculovirus-Expressionsvektor zu fusionieren. Das Gen-Insert, das für das poly-His-markierte PRO1002 kodiert, kann anschließend zur Selektion stabiler Klone in einem SV40-gesteuerten Vektor subkloniert werden, der einen Selektionsmarker, wie z. B. DHFR, enthält. Schlußendlich können die CHO-Zellen (wie oben stehend beschrieben) mit dem SV40-gesteuerten Vektor transfiziert werden. Die Markierung kann, wie oben stehend beschrieben, durchgeführt werden, um die Expression zu verifizieren. Das Kulturmedium, enthaltend das exprimierte Gen, das für das poly-His-markierte PRO1002 kodiert, kann anschließend durch ein beliebiges ausgewähltes Verfahren, wie z. B. durch Ni²⁺-Chelataffinitätschromatographie, konzentriert und gereinigt werden.
In WO 00/73445 wurden gewisse Polypeptide stabil in CHO-Zellen durch das oben genannte Verfahren exprimiert. Zusätzlich dazu wurden gewisse Polypeptide in CHO-Zellen durch ein vorübergehendes Verfahren exprimiert.
BEISPIEL 8
Expression von Nucleinsäure, die für PRO1002 kodiert, in Hefe
Das folgende Verfahren beschreibt die rekombinante Expression des Gens, das für PRO1002 kodiert, in Hefe.
Zuerst werden Hefe-Expressionsvektoren zur intrazellulären Produktion oder Sekretion von PRO1002 aus dem ADH2/GAPDH-Promotor konstruiert. DNA, die für PRO1002 kodiert, und der Promotor werden in geeignete Restriktionsenzymstellen in dem ausgewählten Plasmid insertiert, um die intrazelluläre Expression des Gens zu steuern, das für PRO1002 kodiert. Zur Sekretion kann DNA, die für PRO1002 kodiert, in das ausgewählte Plasmid kloniert werden, und zwar zusammen mit DNA, die für den ADH2/GAPDH-Promotor kodiert, einem nativen PRO1002-Signalpeptid oder einem anderen Säugetier-Signalpeptid oder z. B. einem Hefe-α-Faktor oder einer Invertase-Sekretions-Signal/Leader-Sequenz sowie Linker-Sequenzen (falls benötigt), um das Gen, das für PRO1002 kodiert, zu exprimieren.
Hefe-Zellen, wie z. B. Hefe-Stamm AB110, können anschließend mit den oben stehend beschriebenen Expressionsplasmiden transformiert werden und in ausgewählten Fermentationsmedien gezüchtet werden. Die transformierten Hefe-Überstände können durch Präzipitation mit 10% Trichloressigsäure und Trennung mittels SDS-PAGE analysiert werden, gefolgt von einer Färbung der Gele mit Coomassie-Blau-Farbstoff.
Rekombinantes PRO1002 kann anschließend durch Entfernung der Hefe-Zellen aus dem Fermentationsmedium durch Zentrifugierung und anschließendem Konzentrieren des Mediums unter Verwendung ausgewählter Kartuschenfiltern isoliert und gereinigt werden. Das Konzentrat, enthaltend PRO1002, kann unter Verwendung ausgewählter Säulenchromatographie-Harze weiter gereinigt werden.
BEISPIEL 9
Expression von Nucleinsäure, die für PRO1002 kodiert, in baculovirusinfizierten Insektenzellen
Das folgende Verfahren beschreibt die rekombinante Expression in baculovirusinfizierten Insektenzellen.
Die Sequenz, die für PRO1002 kodiert, wird stromauf einer Epitopmarkierung fusioniert, die in einem Baculovirus-Expressionsvektor enthalten ist. Solche Epitopmarkierungen umfassen poly-His-Markierungen und Immunglobulin-Markierungen (wie Fc-Regionen von IgG). Eine Reihe von Plasmiden kann verwendet werden, unter anderem Plasmide, die von im Handel erhältlichen Plasmiden, wie z. B. pVL1393 (Novagen), abstammen. Kurz gesagt wird die Sequenz, die für PRO1002 kodiert, oder der gewünschte Abschnitt der kodierenden Sequenz von PRO1002 (wie z. B. die Sequenz, die für die extrazelluläre Domäne eines Transmembranproteins kodiert, oder die Sequenz, die für das reife Protein kodiert, falls das Protein extrazellulär ist) durch PCR mit Primern amplifiziert, die zu den 5'- und 3'-Regionen komplementär sind. Der 5'-Primer kann flankierende (ausgewählte) Restriktionsenzymstellen inkorporieren. Anschließend wird das Produkt mit diesen ausgewählten Restriktionsenzymen verdaut und in den Expressionsvektor subkloniert.
Rekombinanter Baculovirus wird unter Verwendung von Lipofectin (im Handel bei GIBCO-BRL erhältlich) durch Co-Transfektion des oben stehenden Plasmids und BaculoGold^TM-Virus-DNA (Pharmingen) in Spodoptera-frugiperda-(„Sf9"-)Zellen (ATCC CRL 1711) erzeugt. Nach 4–5 Tagen Inkubation bei 28°C werden die freigesetzten Viren geerntet und für weitere Amplifikationen verwendet. Virale Infektion und Proteinexpression werden durchgeführt, wie von O'Reilley et al., Baculovirus Expression Vectors: A Laborstory Manual, Oxford University Press, Oxford (1994), beschrieben.
Exprimiertes poly-His-markiertes PRO1002 kann anschließend gereinigt werden, z. B. durch Ni²⁺-Chelataffinitätschromatographie, wie im Folgenden beschrieben. Extrakte werden aus rekombinanten virusinfizierten Sf9-Zellen hergestellt, wie von Rupert et al., Nature 362, 175–179 (1993), beschrieben. Kurz gesagt werden Sf9-Zellen gewaschen, in Beschallungspuffer (25 ml Hepes, pH 7,9, 12,5 mM MgCl₂, 0,1 mM EDTA, 10% Glycerin, 0,1% NP-40, 0,4 M KCl) resuspendiert und zwei Mal 20 Sekunden lang auf Eis beschallt. Die Sonikate werden mittels Zentrifugierung geklärt, und der Überstand wird 50fach in Ladungspuffer (50 mM Phosphat, 300 mM NaCl, 10% Gly cerin, pH 7,8) verdünnt und durch einen 0,45-μm-Filter filtriert. Eine Ni²⁺-NTA-Agarose-Säule (im Handel bei Qiagen erhältlich) wird mit einem Bettvolumen von 5 ml hergestellt, mit 25 ml Wasser gewaschen und mit 25 ml Ladungspuffer äquilibriert. Der filtrierte Zellextrakt wird mit 0,5 ml pro Minute auf die Säule geladen. Die Säule wird mit Ladungspuffer auf Grundlinie-A₂₈₀ gewaschen, zu welchem Zeitpunkt mit der Fraktionssammlung begonnen wird. Als Nächstes wird die Säule mit einem sekundären Waschpuffer gewaschen (50 mM Phosphat, 300 mM NaCl, 10% Glycerin, pH 6,0), wodurch nicht-spezifisch gebundenes Protein eluiert wird. Nachdem erneut die A₂₈₀-Grundlinie erreicht wird, wird die Säule mit einem 0-bis-500-mM-Imidazolgradienten in dem sekundären Waschpuffer entwickelt. Ein-ml-Fraktionen werden gesammelt und mittels SDS-PAGE und Silberfärbung oder Western-Blot mit Ni²⁺-NTA, konjugiert an alkalische Phosphatase (Qiagen), analysiert. Fraktionen, enthaltend das eluierte His₁₀-markierte PRO1002, werden gepoolt und gegen Ladungspuffer einer Dialyse unterzogen.
Alternativ dazu kann die Reinigung des IgG-markierten (oder Fc-markierten) PRO1002 unter Verwendung bekannter Chromatographieverfahren durchgeführt werden, umfassend z. B. Protein-A- oder Protein-G-Säulenchromatographie.
Während die Expression tatsächlich in einem Maßstab von 0,5–2 l durchgeführt wurde, kann sie jedoch leicht in größerem (z. B. 8-l-)Maßstab durchgeführt werden. Die Proteine werden als ein IgG-Konstrukt (Immunoadhäsin) exprimiert, bei dem die extrazelluläre Proteinregion an eine konstante IgG1-Regionssequenz fusioniert ist, enthaltend die Gelenks-, CH2- und CH3-Domänen, und/oder in poly-His-markierten Formen.
Nach der PCR-Amplifikation werden die jeweiligen kodierenden Sequenzen in einen Baculovirus-Expressionsvektor (pb.PH.IgG für IgG-Fusionen und pb.PH.His.c für poly-His-markierte Proteine) subkloniert, und der Vektor und BACULOGOLD^®-Baculovirus-DNA (Pharmingen) werden unter Verwendung von Lipofectin (GIBCO-BRL) in 105 Spodoptera-frugiperda-(„Sf9"-)Zellen (ATCC CRL 1711) co-transfiziert.
pb.PH.IgG und pb.PH.His sind Modifikationen des im Handel erhältlichen Baculovirus-Expressionsvektors pVL1393 (Pharmingen), wobei die modifizierten Polylinker-Regionen die His- oder Fc-Markierungssequenzen umfassen. Die Zellen werden in Hink-TNM-FH-Medium, ergänzt mit 10% FBS (Hyclone), gezüchtet. Zellen werden 5 Tage lang bei 28°C inkubiert. Der Überstand wird geerntet und wird anschließend für die erste virale Amplifikation durch Infektion von Sf9-Zellen in Hink-TNM-FH-Medium, ergänzt mit 10% FBS, bei einer geeigneten Infektionsmultiplizität (MOI) von 10 verwendet. Zellen werden 3 Tage lang bei 28°C inkubiert. Der Überstand wird geerntet, und die Expression der Konstrukte in dem Baculovirus-Expressionsvektor wird durch Chargenbindung von 1 ml Überstand an 25 ml Ni²⁺-NTA-Perlen (QIAGEN) für histidinmarkierte Proteine oder Protein-A-Sepharose-CL-4B-Perlen (Pharmacia) für IgG-markierte Proteine gefolgt von SDS-PAGE-Analyse bestimmt, die einen Vergleich mit einer bekannten Konzentration eines Protein-Standards mittels Coomassie-Blau-Färbung bereitstellt.
Der erste virale Amplifikationsüberstand wird verwendet, um eine Spinner-Kultur (500 ml) von Sf9-Zellen zu infizieren, die in ESF-921-Medium (Expression Systems LLC) mit einer ungefähren MOI von 0,1 gezüchtet wurden. Zellen werden 3 Tage lang bei 28°C inkubiert. Der Überstand wird geerntet und filtriert. Chargenbindungs- und SDS-PAGE-Analyse werden wiederholt, je nach Notwendigkeit, bis die Expression der Spinner-Kultur bestätigt ist.
Das konditionierte Medium aus den transfizierten Zellen (0,5 bis 3 l) wird mittels Zentrifugierung geerntet, um die Zellen zu entfernen, und durch 0,22-μm-Filter filtriert. Für die poly-His-markierten Konstrukte wird das Proteinkonstrukt unter Verwendung einer Ni²⁺-NTA-Säule (Qiagen) gereinigt. Vor der Reinigung wird Imidazol bis zu einer Konzentration von 5 mM zum konditionierten Medium hinzugefügt. Das konditionierte Medium wird bei einer Flussgeschwindigkeit von 4–5 ml/min bei 4°C auf eine 6-ml-Ni²⁺-NTA-Säule gepumpt, äquilibriert in 20 mM Hepes-Puffer, pH 7,4, enthaltend 0,3 M NaCl und 5 mM Imidazol. Nach dem Laden wird die Säule mit zusätzlichem Äquilibrierungspuffer gewaschen, und das Protein wird mit Äquilibrierungspuf fer, enthaltend 0,25 M Imidazol, eluiert. Das hochgradig gereinigte Protein wird anschließend in einen Lagerpuffer entsalzt, der 10 mM Hepes, 0,14 M NaCl und 4% Mannit, pH 6,8, enthält, und zwar mit einer 25-ml-G25-Superfine-Säule (Pharmacia), und schließlich bei –80°C gelagert.
Immunoadhäsin-Proteinkonstrukte (Fc-hältig) werden aus den konditionierten Medien folgendermaßen gereinigt. Die konditionierten Medien werden auf eine 5-ml-Protein-A-Säule (Pharmacia) gepumpt, die in 20 mM Na-Phosphatpuffer, pH 6,8, äquilibriert wurde. Nach dem Laden wird die Säule vor der Elution mit 100 mM Zitronensäure, pH 3,5, ausgiebig mit Äquilibrierungspuffer gewaschen. Das eluierte Protein wird sofort neutralisiert, indem 1-ml-Fraktionen in Röhrchen gesammelt werden, die 275 ml 1 M Tris-Puffer, pH 9, enthalten. Das hochgradig gereinigte Protein wird anschließend in Lagerpuffer wie oben stehend für die poly-His-markierten Proteine beschrieben entsalzt. Die Homogenität der Proteine wird mittels SDS-Polyacrylamidgel(PEG-)Eleketrophorese und N-terminaler Aminosäuresequenzierung mittels Edman-Abbau verifiziert.
In WO 00/73445 wurden gewisse Polypeptide durch das oben stehende Verfahren erfolgreich in baculovirusinfizierten Insekten-Sf9-Zellen exprimiert.
Alternativ dazu kann ein modifiziertes Baculovirus-Verfahren verwendet werden, das High-5-Zellen inkorporiert. Bei diesem Verfahren wird die DNA, die für die gewünschte Sequenz kodiert, mit geeigneten Systemen amplifiziert, wie z. B. Pfu (Stratagene), oder stromauf (5') einer Epitopmarkierung, die in einem Baculovirus-Expressionsvektor enthalten ist, fusioniert. Solche Epitopmarkierungen umfassen poly-His-Markierungen und Immunglobulin-Markierungen (wie Fc-Regionen von IgG). Es kann eine Reihe von Plasmiden verwendet werden, unter anderem Plasmide, die von im Handel erhältlichen Plasmiden abstammen, z. B. pIE1-1 (Novagen). Die pIE1-1- und pIE1-2-Vektoren sind für die konstitutive Expression rekombinanter Proteine aus dem Baculovirus-ie1-Promotor in stabil transformierten Insektenzellen geschaffen. Die Plasmide unterscheiden sich nur in der Ausrichtung der mehrfachen Klonierungsstellen und enthalten alle Promotorsequenzen, die bekanntermaßen für die ie1- vermittelte Genexpression in nicht infizierten Insektenzellen von Bedeutung sind, sowie das hr5-Enhancer-Element. pIE1-1 und pIE1-2 umfassen die Translationsinitiationsstelle und können verwendet werden, um Fusionsproteine zu produzieren. Kurz gesagt wird die gewünschte Sequenz oder der gewünschte Abschnitt der Sequenz (wie z. B. die für die extrazelluläre Domäne eines Transmembranproteins kodierende Sequenz) mittels PCR mit Primern amplifiziert, die komplementär zu den 5'- und den 3'-Regionen sind. Der 5'-Primer kann flankierende (ausgewählte) Restriktionsenzymstellen inkorporieren. Anschließend wird das Produkt mit diesen ausgewählten Restriktionsenzymen verdaut und in den Expressionsvektor subkloniert. Derivate von pIE1-1 können z. B. die Fc-Region von menschlichem IgG (pb.PH.IgG) oder eine 8-Histidin-(pb.PH.His-)Markierung stromab (3' von) der gewünschten Sequenz umfassen. Vorzugsweise wird das Vektorkonstrukt zur Bestätigung sequenziert.
High-5-Zellen werden unter den Bedingungen von 27°C, kein CO₂, kein Pen/Strep bis zu einer Konfluenz von 50% gezüchtet. Für jede 150-mm-Platte werden 30 μg pIE-basierter Vektor, enthaltend die Sequenz, mit 1 ml Ex-Cell-Medium gemischt (Medium: Ex-Cell 401 + 1/100 L-Glu JRH Biosciences Nr. 14401-78P (Anmerkung: Dieses Medium ist lichtempfindlich)), und in einem separaten Röhrchen werden 100 μl CellFectin (CellFECTIN (GibcoBRL Nr. 10362-010) (zum Mischen gevortext)) mit 1 ml Ex-Cell-Medium gemischt. Die zwei Lösungen werden kombiniert und bei Raumtemperatur für eine Zeitspanne von 15 Miinuten inkubieren gelassen. 8 ml Ex-Cell-Medium werden zu den 2 ml DNA/CellFECTIN-Gemisch hinzugefügt, und dieses wird auf High-5-Zellen, die einmal mit Ex-Cell-Medium gewaschen wurden, geschichtet. Die Platte wird anschließend in Dunkelheit 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert. Das DNA/CellFECTIN-Gemisch wird anschließend abgesaugt, und die Zellen werden einmal mit Ex-Cell gewaschen, um überschüssiges CellFECTIN zu entfernen, es werden 30 ml frisches Ex-Cell-Medium hinzugefügt, und die Zellen werden 3 Tage lang bei 28°C inkubiert. Der Überstand wird geerntet, und die Expression der Sequenz in dem Baculovirus-Expressionsvektor wird durch Chargenbindung von 1 ml Überstand an 25 ml Ni²⁺-NTA-Perlen (QIAGEN) für histidinmarkierte Proteine oder Protein-A-Sepharose-CL-4B-Perlen (Pharmacia) für IgG-markierte Proteine gefolgt von SDS-PAGE-Analyse bestimmt, die einen Vergleich mit einer bekannten Konzentration eines Protein-Standards mittels Coomassie-Blau-Färbung bereitstellt.
Das konditionierte Medium aus den transfizierten Zellen (0,5 bis 3 l) wird durch Zentrifugierung geerntet, um die Zellen zu entfernen, und durch 0,22-μm-Filter filtriert. Für die poly-His-markierten Konstrukte wird das Protein, das die Sequenz umfasst, unter Verwendung einer Ni²⁺-NTA-Säule (QIAGEN) gereinigt. Vor der Reinigung wird Imidazol zu dem konditionierten Medium in einer Konzentration von 5 mM hinzugefügt. Das konditionierte Medium wird mit einer Flussgeschwindigkeit von 4–5 ml/min bei 48°C auf eine 6-ml-Ni²⁺-NTA-Säule gepumpt, äquilibriert in 20 mM Hepespuffer, pH 7,4, enthaltend 0,3 M NaCl und 5 mM Imidazol. Nach dem Laden wird die Säule mit zusätzlichem Äquilibrierungspuffer gewaschen, und das Protein wird mit Äquilibrierungspuffer, enthaltend 0,25 M Imidazol, eluiert. Das hochgradig gereinigte Protein wird anschließend mit einer 25-ml-G25-Superfine-Säule (Pharmacia) in einen Lagerpuffer entsalzt, der 10 mM Hepes, 0,14 M NaCl und 4% Mannit, pH 6,8, enthält, und schließlich bei –80°C gelagert.
Immunoadhäsin-Proteinkonstrukte (Fc-hältig) werden aus den konditionierten Medien folgendermaßen gereinigt. Die konditionierten Medien werden auf eine 5-ml-Protein-A-Säule (Pharmacia) gepumpt, die in 20 mM Na-Phosphatpuffer, pH 6,8, äquilibriert wurde. Nach dem Laden wird die Säule vor der Elution mit 100 mM Zitronensäure, pH 3,5, ausgiebig mit Äquilibrierungspuffer gewaschen. Das eluierte Protein wird sofort neutralisiert, indem 1-ml-Fraktionen in Röhrchen gesammelt werden, die 275 ml 1 M Tris-Puffer, pH 9, enthalten. Das hochgradig gereinigte Protein wird anschließend in Lagerpuffer wie oben stehend für die poly-His-markierten Proteine beschrieben entsalzt. Die Homogenität der Sequenz wird mittels SDS-Polyacrylamidgelen und N-terminaler Aminosäuresequenzierung mittels Edman-Abbau und anderen analytischen Verfahren verifiziert, je nach Wunsch oder Notwendigkeit.
PRO1002 wurde in High-5-Zellen durch das oben stehend beschriebene Verfahren exprimiert.
BEISPIEL 10
Herstellung von Antikörpern, die PRO1002 binden
Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung monoklonaler Antikörper, die PRO1002 spezifisch binden können.
Verfahren zur Herstellung der monoklonalen Antikörper sind nach dem Stand der Technik bekannt und werden z. B. in Goding, s. o., beschrieben. Immunogene, die verwendet werden können, umfassen gereinigte PRO1002-Fusionsproteine, enthaltend PRO1002, sowie Zellen, die das Gen, das für PRO1002 kodiert, auf der Zelloberfläche exprimieren. Die Auswahl des Immunogenes kann vom Fachmann ohne übermäßige Experimente getroffen werden.
Mäuse, wie z. B. Balb/c-Mäuse, werden mit dem PRO1002-Immunogen immunisiert, das in vollständigem Freund-Adjuvans emulgiert ist und subkutan oder intraperitoneal in einer Menge von 1 bis 100 Mikrogramm injiziert wird. Alternativ dazu wird das Immunogen in MPL-TDM-Adjuvans (Ribi Immunochemical Research, Hamilton, MT) emulgiert und in die Ballen der Hinterpfoten des Tiers injiziert. Die immunisierten Mäuse werden anschließend 10 bis 12 Tage später mit zusätzlichem Immunogen, emulgiert in dem ausgewählten Adjuvans, geboostet. Daher können die Mäuse mehrere Wochen lang auch mit zusätzlichen Immunisierungsinjektionen geboostet werden. Serumproben können in periodischen Abständen von den Mäusen durch retroorbitale Blutentnahme zum Testen in ELISA-Tests erhalten werden, um Anti-PRO1002-Antikörper zu detektieren.
Nachdem ein geeigneter Antikörper-Titer detektiert wurde, können die auf Antikörper „positiv" getesteten Tiere eine Injektion einer finalen intravenösen Injektion an PRO1002 erhalten. Drei bis vier Tage später werden die Mäuse getötet und die Milzzellen entnommen. Die Milzzellen werden anschließend (unter Verwendung von 35% Polyethylenglykol) an eine ausgewählte murine Myelom-Zelllinie, wie z. B. P3X63AgU.1, erhältlich bei der ATCC, Nr. CRL 1597, fusioniert. Die Fusionen erzeugen Hybridom-Zellen, die anschließend in 96-Well-Gewebekulturplatten, enthaltend HAT-Medium, ausplattiert werden können, um die Proliferation nicht-fusionierter Zellen, von Myelom-Hybriden und Milzzellen-Hybriden zu inhibieren.
Die Hybridom-Zellen werden in einem ELISA-Test auf Reaktivität gegen PRO1002 gescreent. Die Bestimmung „positiver" Hybridom-Zellen, welche die gewünschten monoklonalen Antikörper gegen PRO1002 sekretieren, ist nach dem Stand der Technik bekannt.
Die positiven Hybridom-Zellen können intraperitoneal in syngenetische Balb/c-Mäuse injiziert werden, um Ascites zu produzieren, welche die monoklonalen Anti-PRO1002-Antikörper enthalten. Alternativ dazu können die Hybridom-Zellen in Gewebekulturflaschen oder Roller-Flaschen gezüchtet werden. Die Reinigung der monoklonalen Antikörper, die in den Ascites produziert werden, kann unter Verwendung einer Ammoniumsulfat-Präzipitation erfolgen, gefolgt von einer Gelausschluss-Chromatographie. Alternativ dazu kann eine Affinitätschromatographie basierend auf der Bindung von Antikörper an Protein A oder Protein G verwendet werden.
Hinterlegung von Material
Folgende Materialien wurden bei der American Type Culture Collection, 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110–22099, USA (ATCC), hinterlegt:

Material ATCC-Hinterlegungs-Nr. Hinterlegungsdatum

DNA59208-1373 209881 20. Mai 1998
Diese Hinterlegung erfolgte gemäß den Vorschriften des Budapester Vertrages über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren und den darunter gültigen Bestimmungen (Budapester Vertrag). Dies sichert die Erhaltung einer lebensfähigen Kultur der Hinterlegung 30 Jahre lang ab dem Zeitpunkt der Hinterlegung. Die Hinterlegungen werden von der ATCC gemäß den Bestimmungen des Budapester Vertrages und gemäß einem Abkommen zwischen Genentech, Inc., und ATCC verfügbar gemacht, das permanente und un eingeschränkte Verfügbarkeit der Nachkommenschaft der Kultur der Hinterlegung für die Öffentlichkeit bei Ausgabe des betreffenden US-Patents oder bei Offenlegung für die Öffentlichkeit entweder der US- oder einer ausländischen Patentanmeldung, je nachdem, was zuerst eintritt, garantiert und das die Verfügbarkeit der Nachkommenschaft für jemanden, der durch den Präsident des Patentamtes der Vereinigten Staaten hierzu gemäß 35 USC § 122 und den dazu gültigen Bestimmungen (einschließlich 37 CFR § 1.14 unter besonderem Verweis auf 886 OG 638) befugt ist, sicherstellt.
Der Abtretungsempfänger der vorliegenden Anmeldung hat sich einverstanden erklärt, dass, sofern eine Kultur der hinterlegten Materialien, die unter geeigneten Bedingungen kultiviert wurde, sterben oder verloren gehen oder zerstört werden sollte, die Materialien unverzüglich nach Benachrichtigung durch neue derselben Art ersetzt werden. Verfügbarkeit des hinterlegten Materials ist nicht als eine Lizenz zur Ausführung der Erfindung in Widerspruch mit den durch die Amtsgewalt einer Regierung gemäß ihren Patentgesetzen erteilten Rechte zu verstehen.
Die obige schriftliche Beschreibung wird als ausreichend erachtet, um Fachleuten die Möglichkeit zu geben, die Erfindung durchzuführen. Die vorliegende Erfindung soll in ihrem Schutzumfang durch das hinterlegte Konstrukt/die hinterlegten Konstrukte nicht als eingeschränkt gelten, da die hinterlegte(n) Ausführungsform(en) einzig als Veranschaulichung(en) bestimmter Aspekte der Erfindung zu verstehen ist (sind), und andere Konstrukte, die funktionell äquivalent sind, liegen ebenfalls im Schutzumfang dieser Erfindung, wie in den Ansprüchen definiert. Die Hinterlegung des hierin offenbarten Materials/der hierin offenbarten Materialien stellt weder ein Eingeständnis dar, dass die hierin enthaltene schriftliche Beschreibung unzureichend ist, um die praktische Durchführung irgendeines Aspektes der Erfindung, einschließlich der besten Ausführungsform davon, zu ermöglichen, noch ist sie als eine Einschränkung des Schutzumfangs der Ansprüche auf die spezifischen Veranschaulichungen, die sie darstellt, zu verstehen. Tatsächlich werden aus der vorangehenden Beschreibung für den Fachmann verschiedene Modifikationen zusätzlich zu jenen, die hierin gezeigt und beschrieben werden, ersichtlich und fallen in den Umfang der im Anhang befindlichen Ansprüche. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isoliertes Polypeptid zur Verwendung in einem medizinischen Behandlungsverfahren, wobei das Polypeptid: (i) die in 2 dargestellte Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 2) aufweist; (ii) die in 2 dargestellte Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 2) aufweist, der deren assoziiertes Signalpeptid fehlt; (iii) jene Aminosäuresequenz aufweist, für welche die kodierende Sequenz voller Länge des DNA-Inserts (DNA 59208-1373) kodiert, das in ATCC 209881 enthalten ist; (iv) eine Aminosäuresequenzidentität von zumindest 80% mit einem Polypeptid gemäß (i), (ii) oder (iii) aufweist, worin die Sequenzidentität unter Verwendung des ALIGN-2-Computerprogramms bestimmt wird, und worin das Polypeptid in der Lage ist, in Endothelzellen Apoptose zu induzieren.
Polypeptid nach Anspruch 1, worin das Signalpeptid die Aminosäuren 1 bis 17 ± 5 aus 2 (Seq.-ID Nr. 2) umfasst, zur Verwendung in einem medizinischen Behandlungsverfahren.
Polypeptid nach Anspruch 2, worin das Signalpeptid die Aminosäuren 1 bis 17 aus 2 (Seq.-ID Nr. 2) umfasst, zur Verwendung in einem medizinischen Behandlungsverfahren.
Polypeptid nach einem der vorangehenden Ansprüche zur Verwendung in der Behandlung einer kardiovaskulären, Endothel- oder angiogenen Störung.
Polypeptid nach Anspruch 4 zur Verwendung bei der Hemmung von Endothelzellwachstum oder Angiogenese.
Polypeptid nach Anspruch 5 zur Verwendung bei der Behandlung vaskulärer Tumoren, einschließlich Hämangiomen; Tumorangiogenese; Neovaskularisierung in der Retina, der Choroidea oder der Cornea, die mit diabetischer Retinopathie oder prämaturer Säuglingsretinopathie oder Makuladegeneration und proliferativer Vitreoretinopathie assoziiert ist; Gelenkrheumatismus; Morbus Crohn; Atherosklerose; ovarieller Hyperstimulation; Psoriasis; mit Neovaskularisierung assoziierter Endometriose; Restenose nach Ballonangioplastie; Überproduktion von Narbengewebe, einschließlich Keloid nach chirurgischen Eingriffen; Fibrose nach Myocardinfarkt; oder von fibrotischen Läsionen, die mit Lungenfibrose assoziiert sind.
Isolierte Nucleinsäure, die für ein in einem der Ansprüche 1 bis 3 definiertes Polypeptid kodiert, zur Verwendung in einem medizinischen Behandlungsverfahren.
Nucleinsäure nach Anspruch 7 zur Verwendung in einem medizinischen Behandlungsverfahren, die zur Verabreichung bei Ex-vivo-Gentherapie dient.
Nucleinsäure nach Anspruch 7 oder Anspruch 8, worin die Verwendung wie in einem der Ansprüche 4 bis 6 definiert ist.
Agonist eines in einem der Ansprüche 1 bis 3 definierten Polypeptids zur Verwendung in einem Behandlungsverfahren, worin der Agonist ein Agonistenantikörper ist, der das Polypeptid spezifisch bindet.
Agonist nach Anspruch 10 zur Verwendung wie in einem der Ansprüche 4 bis 6 definiert.
Agonist nach Anspruch 10 oder Anspruch 11, worin es sich bei dem Antikörper um einen monoklonalen Antikörper handelt, zur Verwendung in einem Behandlungsverfahren.
Agonist nach Anspruch 10 oder Anspruch 11, worin es sich bei dem Antikörper um ein Antikörperfragment handelt, zur Verwendung in einem Behandlungsverfahren.
Agonist nach Anspruch 10 oder Anspruch 11, worin es sich bei dem Antikörper um einen einkettigen Antikörper handelt, zur Verwendung in einem Behandlungsverfahren.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein Polypeptid, wie in einem der Ansprüche 1 bis 3 definiert, oder eine Nucleinsäure, wie in Anspruch 7 oder Anspruch 8 definiert, oder einen Agonisten, wie in einem der Ansprüche 10 und 12 bis 14 definiert, im Gemisch mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 15, weiters umfassend ein kardiovaskuläres, Endothel- oder angiostatisches Mittel.
Zusammensetzung nach Anspruch 15 oder Anspruch 16 zur Verwendung in einem Behandlungsverfahren.
Zusammensetzung nach Anspruch 17 zur Verwendung wie in einem der Ansprüche 4 bis 6 definiert.
Verwendung eines Polypeptids, wie in einem der Ansprüche 1 bis 3 definiert, oder einer Nucleinsäure, wie in Anspruch 7 oder Anspruch 8 definiert, oder eines Agonisten, wie in einem der Ansprüche 10 und 12 bis 14 definiert, bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer kardiovaskulären, Endothel- oder angiogenen Störung.
Verwendung nach Anspruch 19, worin die Behandlung wie in Anspruch 5 oder Anspruch 6 definiert ist.
Ex-vivo-Verfahren zum Identifizieren einer Verbindung, welche die Aktivität eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 3 hemmt, wobei das Verfahren das Kontaktieren einer Testverbindung mit dem Polypeptid unter Bedingungen und für eine Zeitspanne, die ausreichen, um eine Wechselwirkung der Testverbindung mit dem Polypeptid zu ermöglichen, sowie die Bestimmung umfasst, ob die Aktivität des Polypeptids gehemmt wird, worin die Aktivität in der Induktion von Apoptose in Endothelzellen besteht.
Ex-vivo-Verfahren zur Identifikation einer Verbindung, welche die Aktivität eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 3 hemmt, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst: (a) das Kontaktieren von Zellen und einer zu screenenden Testverbindung in Gegenwart des Polypeptids unter Bedingungen, die für die Induktion einer Zellantwort geeignet sind, die normalerweise vom Polypeptid induziert wird; sowie (b) die Bestimmung der Induktion der Zellantwort, um zu bestimmen, ob die Testverbindung ein wirksamer Antagonist ist, worin die Zellantwort in der Induktion von Apoptose von Endothelzellen besteht.
Verfahren zur Diagnose einer kardiovaskulären, Endothel- oder angiogenen Störung bei einem Säugetier, das die Analyse des Expressionsausmaßes eines Gens umfasst, das für ein Polypeptid kodiert, wie es in einem der Ansprüche 1 bis 3 definiert ist, und zwar (a) in einer Testprobe von Gewebezellen, die von dem Säugetier erhalten wurden, und (b) in einer Kontrollprobe bekannter, normaler Gewebezellen desselben Zelltyps, worin ein höheres oder niedrigeres Expressionsausmaß in der Testprobe im Vergleich zur Kontrollprobe ein Indikator für das Vorliegen einer kardiovaskulären, Endothel- oder angiogenen Störung bei dem Säugetier ist.
Verfahren zur Diagnose einer kardiovaskulären, Endothel- oder angiogenen Störung bei einem Säugetier, das den Nachweis der Gegenwart oder des Fehlens eines Polypeptids, wie es in einem der Ansprüche 1 bis 3 definiert ist, in einer Testprobe von Gewebezellen umfasst, die von dem Säugetier erhalten wurden, worin die Gegenwart oder das Fehlen des Polypeptids in der Testprobe ein Indikator für das Vorliegen einer kardiovaskulären, Endothel- oder angiogenen Störung bei dem Säugetier ist.
Verfahren zur Diagnose einer kardiovaskulären, Endothel- oder angiogenen Störung bei einem Säugetier, umfassend (a) das Kontaktieren eines Antikörpers, der spezifisch an ein in einem der Ansprüche 1 bis 3 definiertes Polypeptid bindet, mit einer Testprobe von Gewebezellen, die von dem Säugetier erhalten wurden, sowie (b) das Detektieren der Bildung eines Komplexes zwischen dem Antikörper und dem Polypeptid in der Testprobe, worin die Bildung des Komplexes ein Indikator für das Vorliegen einer kardiovaskulären, Endothel- oder angiogenen Störung bei dem Säugetier ist.
Rekombinantes retrovirales Partikel, umfassend einen retroviralen Vektor, der im Wesentlichen aus (1) einem Promotor, (2) einer Nucleinsäure, die für ein Polypeptid kodiert, wie es in einem der Ansprüche 1 bis 3 definiert ist, sowie (3) einer Signalsequenz zur zellulären Sekretion des Polypeptids besteht, worin der retrovirale Vektor mit retroviralen Strukturproteinen assoziiert ist, zur Verwendung in einem Behandlungsverfahren.
Ex-vivo-Produktionszelle, umfassend ein Nucleinsäurekonstrukt, das retrovirale Strukturproteine exprimiert und auch einen retroviralen Vektor umfasst, der im Wesentlichen aus (1) einem Promotor, (2) einer Nucleinsäure, die für ein Polypeptid kodiert, wie es in einem der Ansprüche 1 bis 3 definiert ist, sowie (3) einer Signalsequenz zur zellulären Sekretion des Polypeptids besteht, worin die Produktionszelle den retroviralen Vektor in Assoziation mit den Strukturproteinen verpackt, um rekombinante retrovirale Partikel zu produzieren, zur Verwendung in einem Behandlungsverfahren.
Antikörper, der ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 3 spezifisch bindet und der ein Agonist oder Antagonist der Aktivität des Polypeptids zur Induktion von Apoptose in Endothelzellen ist.
Antikörper nach Anspruch 28, der ein monoklonaler Antikörper ist.
Antikörper nach Anspruch 28, der ein Antikörperfragment ist.
Antikörper nach Anspruch 28, der ein einkettiger Antikörper ist.