KR20010085792A

KR20010085792A - 혈관형성 및 심혈관형성의 촉진 또는 억제

Info

Publication number: KR20010085792A
Application number: KR1020017003239A
Authority: KR
Inventors: 셔만 퐁; 메리 이. 제리트슨; 오드리 고다르드; 오스틴 엘. 거니; 케네쓰 제이. 힐란; 피. 미키 윌리암스; 윌리암 아이. 우드
Original assignee: 제넨테크, 인크.
Priority date: 1998-09-14
Filing date: 1999-09-13
Publication date: 2001-09-07
Also published as: AU5920099A; IL141537A0; WO2000015792A3; JP2003524599A; MXPA01002546A; WO2000015792A2; ZA200101453B; CA2341767A1; EP1112361A2

Abstract

본 발명은 인간을 포함한 포유동물에서 혈관형성 및(또는) 심혈관형성을 촉진 또는 억제하기 위한 조성물 및 방법을 개시하고 있다. 제약 조성물은 한 가지 이상의 상기 용도를 위한 동정된 폴리펩티드 또는 그의 길항제에 기초한다. 본원의 조성물에 의해 진단, 예방 또는 치료되는 질환에는 상처와 같은 외상, 여러가지 암 및 아테롬성경화증 및 심비대증과 같은 혈관 질환이 포함된다.

Description

혈관형성 및 심혈관형성의 촉진 또는 억제 {Promotion or Inhibition of Angiogenesis and Cardiovascularization}

A. 심장 질환 및 인자

심부전증은 5백만 가량의 미국인에게 영향을 주고 있으며 심부전증의 새로운 환자가 매년 약 400,000 명에 이른다. 미국 내 65세 이상의 입원 환자 중 단일 원인으로서 가장 빈번하게 나타나고 있다. 급성 심근 경색증을 비롯한 급성 심장 질환 치료법의 최근 진보는 결국에는 만성 심부전증으로 발전하는 환자 수를 증가시켰다. 1979년에서 1995년 사이에 울혈성 심부전증 (CHF)에 의한 입원이 377,000건에서 872,000건 (130% 증가)으로 증가하였으며, CHF 사망은 116% 증가하였다.

CHF는 좌심실 부전증, 운동허용능의 감소, 삶의 질의 저하 및 수명의 큰 감소를 특징으로 하는 증후군이다. 심부전증의 필수 조건은 심장이 신체 조직의 대사 요구량을 만족시킬 정도의 충분한 속도로 혈액을 공급하지 못하는 것 (즉, 불충분한 심박출량)이다.

심부전 증세 발생시 말초 혈관 수축을 비롯하여 심박출량, 심박수 증가, 심수축성 증가 및 혈장의 부피 증가를 촉진하기 위해 4가지 이상의 주요 보상 기전이 활성화된다. 이러한 효과는 교감 신경계 및 레닌-안지오텐신계에 의해 주로 매개된다 [Eichhorn,American Journal of Medicine,104: 163-169 (1998)]. 교감신경계에 의한 박출량의 증가는 혈관긴장도, 심박수 및 수축성을 증가시킨다. 안지오텐신 II는 1) 혈관 평활근 수축의 직접적인 자극, 2) 알도스테론 및 항이뇨 호르몬 분비의 자극에 의한 혈장 부피 증가의 촉진, 3) 교감신경 매개된 혈관긴장도의 자극 및 4) 혈관 확장 및 나트륨이뇨 활성을 갖는 브래디키닌 분해를 촉매함으로써 혈압을 상승시킨다 [Brown and Vaughan.Circulation,97:1411-1420 (1998)]. 하기에 지적되겠지만, 안지오텐신 II는 또한 근세포 괴사 (심장 수축 기능의 손상) 및 심내 섬유증 (심장 확장 및 경우에 따라 수축 기능 손상)을 촉진함으로써 심장에 직접적으로 유해한 효과를 줄 수도 있다 [Weber,Circulation,96, 4065-4082 (1998)].

울혈성 심부전증 (CHF)의 일관된 특징은 기계적 자극 및 호르몬 자극 모두에 의해 활성화되고 심박출량 증가에 대한 요구에 심장이 적응할 수 있도록 하는 심장 확대, 즉 심비대증이다 [Morgan and Baker,Circulation,83: 13-25 (1991)]. 이러한 심비대 반응은 흔히 다양하고 상이한 병리 질환, 예를 들어 고혈압, 대동맥 협착증, 심근 경색증, 심근병증, 판역류 및 심내 단락과 관련되며, 이들은 모두 만성 혈역학 과부하를 유발한다.

비대는 통상 종양 형성을 수반하지 않는 자연 성장과는 무관한 기관 또는 구조의 크기 증가로서 정의한다. 심비대는 각 세포 (근세포) 크기의 증가 또는 조직을 구성하는 세포수의 증가 (과형성) 또는 두가지 모두에 기인한다. 태아의 심장 확대는 주로 근세포 수의 증가 (출생 직후까지 지속됨)에 기인하는 반면, 출생후 심근세포는 그의 증식능을 상실한다. 이후의 성장은 각 세포의 비대를 통해 일어난다.

성인의 근세포 비대는 각각의 근섬유에 대한 부하를 감소시킴으로서 손상된 심기능에 대한 단기간 반응으로서 초기에는 유리하다. 그러나, 장기 지속되는 심한 과부하로 인해 비대 세포는 악화되기 시작하여 사멸한다 [Katz, "Heart Failure". in A.M.ed.,Physiology of the Heart(New York : Raven Press, 1992) pp 638-668]. 심비대는 심부전증의 임상 경로에서 사망율과 이환율 모두에 중요한 위험 인자이다 [Katz, Trends Cardiovasc. Med., 5: 37-44 (1995)]. 심부전증의 원인 및 병리학에 대한 보다 상세한 내용은 문헌 [예,Heart Deisease, A Textbook of Cardiovascular Medicine, Braunwald, E. ed (W.B. Saunders Co., 1998), Chapter 14, "Pathophysiology of Heart Failure"]을 참조한다.

세포 수준에서, 심장은 근세포와 주변 지지 세포, 소위 비-근세포로 구성된다. 비-근세포는 주로 섬유아세포/간엽세포이면서, 내피 및 평활근세포를 포함한다. 실제로, 근세포는 성인 심근 부피의 대부분을 구성하지만, 심장에 존재하는 전체 세포수의 약 30%에 불과한다. 호르몬, 생리학적, 혈역학적 및 병리학적 자극에 반응하여, 성인 심실근세포는 비대 과정의 활성화를 통해 작업부하의 증가에 적응할 수 있다. 상기 반응은 부수적인 세포 분열, 및 심방 나트륨이뇨 펩티드 (ANP) 유전자를 비롯한 태아 유전자의 활성화없이 심세포 크기 및 각각의 심근 세포의 수축성 단백질 함량을 증가시키는 특징을 갖는다 [Chien et al.,FASEQ J.,5: 3037-3046 (1991), Chien et al.,Annu. Rev. Physiol,55: 77-95 (1993)]. 인간에서 압력 과부하로 인한 좌심실 비대에서 세포외 기질내 및 심근내 관상동맥 주변의 간질 콜라겐의 축적과 관련된 근세포 크기의 증가로 인한 심근 전체의 부피 증가가 개시되었다 [Caspari et al.,Cadiovasc. Res.,11: 554-558 (1977), Schwarz et al.,Am. J. Cardiol.,42: 895-903 (1978), Hess et al.,Circulation,63: 360-371 (1981), Pearlman et al.,Lab. Invest.,46: 158-164 (1982)].

또한, 비-근세포 지지 세포에 의해 생산되는 측분비 인자는 또한 심비대의 발생과 관련될 수 있다는 것이 제시되었으며, 다양한 비-근세포 유도된 비대 인자, 예를 들어 백혈구 억제 인자 (LIF) 및 엔도텔린이 확인되었다 [Metcalf,Growth Factors,7: 169-173 (1992), Kurzrock et al.,Endocrine Reviews,12: 208-217 (1991), Inoue et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,86: 2863-2867 (1989), Yanagisawa and Masaki,Trends Pharm. Sci.,10: 374-378 (1989), US 특허 제 5,573,762호 (1996년 11월 12일 허여)]. 또한, 심비대의 효능있는 매개체로서 확인된 대표적인 인자에는 카디오트로핀-1 (CT-1) [Pennica et al.,Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 92: 1142-1146 (1995)], 카테콜아민, 아드레노코르티코스테로이드, 안지오텐신 및 프로스타글란딘이 포함된다.

현재, 심비대의 치료법은 기본 심장 질환에 따라 다양하다. 카테콜아민, 아드레노코르티코스테로이드, 안지오텐신, 프로스타글란딘, LIF, 엔도텔린 (엔도텔린 1, 2 및 3, 거대 엔도텔린 포함) 및 CT-1이 비대의 효능있는 매개체로서 확인된 인자이다. 예를 들어, 베타 아드레날린성 수용체 차단 약물 (베타 차단제, 예를 들어 프로프라놀올, 티몰올, 테르탈롤올, 카르테올올, 나돌올, 베탁솔올, 펜부톨올, 아세토부톨올, 아테놀올, 메토프롤올, 카르베딜올 등) 및 베라파밀이 비대성 심근병증의 치료에 광범위하게 사용되어 왔다. 증상 (예, 흉통) 및 운동허용능에 대한 베타 차단제의 유익한 효과는 계속되는 확장 연장 및 수동적 심실 충만의 증가로 인한 심박수의 감소에 기인한다 [Thompson et al.,Br. Heart J.,44: 488-98 (1980), Harrison et al.,Circulation,29: 84-98 (1964)]. 베라파밀은 심실 충만과 가능하게는 심근 허혈증의 감소를 개선시키는 것으로 기재되었다 [Bonow et al.,Circulation.72: 853-64 (1985)].

또한, 니페디핀 및 딜티아젬은 경우에 따라 비대성 심근병증의 치료에 사용되어 왔다 [Lorell et al.,Circulation,65: 499-507 (1982), Betocchi et al.,Am. J. Cardiol.,78: 451-457 (1996)]. 그러나, 니페디핀은 혈관을 강하게 확장시키는 성질 때문에, 특히 방수유출 장애 환자에게 유해할 수 있다. 디소피라미드는 수축력 감소성을 통해 증세를 완화시키는데 사용되어 왔다 [Pollick,N. Engl. J. Med.,307;, 997-999 (1982)]. 그러나, 많은 환자에서 초기의 이점은 시간이 지남에 따라 감소된다 [Wigle et al.,Circulation, 92:1680-1692 (1995)]. 항고혈압 약물 치료법은 혈압 상승과 관련된 심비대증에 대해 유효하다는 것이 보고되었다. 항고혈압 치료법에 사용되는 약물로는 칼슘 길항제 (예, 니트렌디핀), 아드레날린성 수용체 차단제 (예, 상기 기재된 것), 안지오텐신 전환 효소 (ACE) 억제제 (예, 퀴나프릴, 카프토프릴, 에날라프릴, 라미프릴, 베나제프릴, 포시노프릴 및 리시노프릴), 이뇨제 (예, 클로로티아지드, 히드로클로로티아지드, 히드로플루메타지드, 메틸클로티아지드, 벤즈티아지드, 디클로르펜아미드, 아세타졸아미드 및 인다파미드) 및 칼슘 채널 차단제 (예, 딜티아젬, 니페디핀, 베라파밀 및 니카르디핀)를 예로 들 수 있으며, 이들은 단독 또는 조합하여 사용한다.

예를 들어, 딜티아젬 및 카프토프릴을 이용한 고혈압 치료는 좌심실 근육의 부피 증가를 보였으나, 확장 기능의 도플러 지수는 정상화되지 않았다 [Szlachcic et al.,Am. J. Cardiol.,63: 198-201 (1989). Shahi et al.,Lancet, 336: 458-461 (1990)]. 이러한 발견은 과량의 간질 콜라겐이 좌심실 비대증의 퇴행후에 잔류할 수 있다는 것을 나타내는 것으로 해석되었다 [Am. Heart J.,124: 700-709 (1992)]. 상기 문헌 (Rossi et al.)은 실험 랫트에서 심근 세포 비대증 및 압력 과부하된 심비대의 간질 섬유증 예방 및 퇴행에 대한 카프토프릴의 효과를 조사하였다.

심장 수축성을 직접적으로 증가시키는 제제 (수축제)는 초기에는 단기간에 심박출량을 증가시키기 때문에 심부전증 환자에 유익할 것으로 판단되었다. 그러나, 디그옥시제닌을 제외한 모든 수축증가제는 심장 수행능을 단기간 내에 향상시키지만 장기간 사망율은 증가시키는 것으로 밝혀졌다 [Massie,Curr. Op. in Cardiology, 12:209-217 (1997), Reddy et al.,Curr. Opin. Cardiol.,12: 233-241 (1997)]. 베타 아드레날린성 수용체 차단제의 심부전증에 대한 사용이 최근에 추천되고 있다. 환자 생존율의 향상이 아직 문헌으로 증명되지는 않았지만, 임상 시험은 사망율의 증가 없이 심장 기능이 향상되었음을 입증하였다. 또한, CHF의 치료에 있어 카르디오트로핀-1 또는 그의 길항제 또는 성장 호르몬 및(또는) 인슐린 유사 성장 인자-1의 사용에 관해서 미국 특허 제 5,935,924호, 제 5,624,806호, 제5,661,122호 및 제5,610,134호 및 WO 95/28173을 참조한다. 또다른 치료 방법으로는 심장 이식이 있으나 이는 공여 심장의 이용가능성에 의해 제한된다.

엔도텔린은 돼지 동맥의 내피 배양 상등액으로부터 단리되어 구조가 결정된 21개의 아미노산으로 구성된, 혈관을 수축하는 펩티드이다 [Yanagisawa et al.,Nature, 332: 411-415 (1988)]. 이후에 엔도텔린은 여러 작용을 나타내는 것으로 확인하였으며, 엔도텔린 길항제로서 엔도텔린 항체는 심근 경색증, 신부전증 및 다른 질환의 치료에 효과적임이 입증되었다. 엔도텔린은 생체 내에 존재하면서 혈관 수축 작용을 보이기 때문에 순환계의 조절에 관련된 내재성 인자일 것으로 예상되며, 고혈압, 심혈관 질환 (예, 심근 경색증) 및 신장 질환 (예, 급성 신부전증)과 관련될 수 있다. 엔도텔린 길항제는 예를 들어 미국 특허 제 5,773,414호, 일본 특허 공개 제 3130299/1991호, EP 457,195, EP 460,697 및 EP 552,489에 개시되어 있다. 엔도텔린 수용체 길항제를 동정하기 위한 신규 엔도텔린 B 수용체는 미국 특허 제5,773,233호에 기재되어 있다.

심부전증의 최근 치료법은 주로 안지오텐신 전환 효소 (ACE) 억제제 (예, 카프토프릴) 및 이뇨제에 관한 것이다. 상기 약물은 혈역학 프로필 및 운동허용능을향상시키고 CHF 환자의 이환율 및 사망을 감소시킨다 [Kramer et al.,Circulation. 67(4): 807-816 (1983), Captopril Multicenter Research Group,J.A.C.C.,2(4): 755-763 (1983), The CONSENSUS Trial Study Group,N.Engl.J. Med.,316(23): 1429-1435 (1987), The SOLVD Investigators,N.Engl.J.Med.,325(5): 293-302 (1991)]. 또한, 상기 약물은 고혈압, 좌심실 기능장애, 아테롬성경화성 혈관 질환 및 당뇨성 신병증 치료에도 유용하다 [Brown and Vaughan, 상기 문헌]. 그러나, 효능이 입증되었지만 ACE 억제제에 대한 반응은 제한되어 왔다. 예를 들어 ACE 억제제는 심부전증 환자의 생존을 연장시키면서 말기 심부전증으로의 진행을 지연시키는 것으로 보이지만, ACE 억제제에 대해 실질적으로 많은 환자들이 기능 클래스 III 심부전증을 갖는다.

또한, 기능 및 운동 시간은 단지 적은 정도로 향상시키고, 사망율은 감소되기는 하나 높게 유지된다 [The CONSENSUS Trial Study Group,N. Engl. J. Med.,316(23):1429-1453 (1987): The SOLVD Investigators,N.Engl.J. Med.,325(5): 293-302 (1991), Cohn et al.,N. Engl. J. Med.,325(5): 303-310 (1991), The Captopril-Digoxin Multicenter Research Group,JAMA,259(4): 539-544 (1988)]. 따라서, ACE 억제제는 60%를 초과하는 심부전 환자에서 증상을 일관되게 완화시킬 수 없는 것으로 보이며, 심부전증의 사망율을 단지 약 15 내지 20% 정도 감소시킨다. 다른 부작용에 대해서는 문헌 (Brouwn and Vaughan, 상기 문헌)을 참조한다.

ACE 억제제의 대안으로 특이적인 AT1 수용체 길항제가 제시되었다. 임상 연구에서 심혈관 및 신장 질환의 치료에 있어 이들 두 방법의 효능을 비교하고자 하였다. 그러나, 동물 모델 데이타는 ACE/AngII 경로가 심비대와 관련되는 것이 명백하지만 상기 기능에 있어 유일하지도, 주요 경로도 아니라는 것을 시사한다. 마우스 유전자 "녹아웃" 모델이 경로의 각 성분을 시험하기 위해 제작되었다. 상기의 한 모델에서, AngII, AT 아형 1A의 주요한 심장 수용체가 유전적으로 결실되었다. 상기 마우스는 Ang II를 실험적으로 공급할 때에도 비대증으로 발전하지 않는다 (Ang II에 의한 비대증을 제거하는 모델의 기초적인 성공을 확인함). 그러나, 상기 모델에서 대동맥이 수축될 때 (고혈압성 심장 스트레스 모델), 심장은 여전히 비대하게 된다. 이는 상기 수용체 (AT 아형 1A)와 별개의 시그날전달 경로가 고혈압에 의해서 활성화된다는 것을 시사한다. ACE 억제제는 아마도 이 경로를 억제할 수 없을 것이다 [Harada et al.,Circulation, 97: 1952-1959 (1998)]. 심비대 과정 및 기전과 관련된 문제에 관해서는 문헌 [Homcy,Circulation, 97: 1890-1892 (1998)]을 참조한다.

약 750,000 명의 환자가 해마다 급성 심근 경색증 (AMI)을 앓고 있으며 미국내 전체 사망의 약 1/4이 AMI에 기인한다. 최근, 혈전용해제, 예를 들어 스트렙토키나제, 유로키나제 및 특히 조직 플라스미노겐 활성화제 (t-PA)가 심근 경색증 환자의 생존율을 크게 증가시켰다. 1.5 내지 4시간에 걸쳐 계속적인 정맥내 주입으로 투여되는 경우, t-PA는 치료 환자의 69% 내지 90%에서 90분에서 관상 개방을 유발하였다 [Topol et al.,Am. J. Cardiol.,61, 723-728 (1988), Neuhaus et al.,J. Am. Coll. Cardiol.,12: 581-587 (1988), Nehaous et al.,J. Am. Coll. Cardiol.,14:1566-1569 (1989)]. 최고의 개방율은 높은 투여량 또는 투여량 증가요법에서 보고되었다 [Topol.J. Am. Coll. Cardiol.,15: 922-924 (1990)]. 또한, t-PA는 단일 볼러스로서 투여될 수 있으나, 비교적 짧은 반감기때문에 주입 치료법이 더 적합하다 [Tebb et al.,Am. J. Cardiol.,64:448-453 (1989)]. 특히 반감기가 보다 길고 피브린 특이성이 매우 높도록 제작된 t-PA 변이체인 TNK t-PA (T103N, N117Q, KHRR(296-299)AAAAt-PA 변이체) [Keyt et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91:3670-3674(1994)]는 특히 볼러스 투여가 적합하다. 그러나, 이러한 모든 진보에도 불구하고, 생존 환자의 장기간의 예후는 심비대증의 모니터링 및 심비대증을 포함한 경색후 모니터링 및 치료에 크게 의존한다.

B. 성장 인자

다양한 천연 폴리펩티드는 내피 세포의 증식을 유도하는 것으로 보고되고 있다. 이들 폴리펩티드에는 염기성 및 산성의 섬유아세포 성장 인자 (FGF) [Burgess and Maciag,Annual Rev. Biochem.,58: 575(1989)], 혈소판 유래 내피 성장 인자 (PD-ECGF) [Ishikawa et al.,Nature,338: 557 (1989)] 및 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) [Leung et al.,Science,246: 1306 (1989), Ferrara and Henzel,Biochem. Biophys. Res. Commun.,161: 851 (1989), Tischer et al.,Biochem. Biophys. Res. Commun.,165: 1198(1989), EP 471,754B (1996년 7월 31일자로 허여)]가 있다.

인간 VEGF (hVEGF) cDNA로 트랜스펙션된 세포에 의해 조건화된 배지는 모세 혈관 내피 세포의 증식을 촉진하였다 [Leung et al.,Science,246: 1306 (1989)]. 121, 189 및 206개의 아미노산 이소형 (isoform) (총체적으로 hVEGF 관련 단백질로지칭)을 코딩하는 여러개의 추가 cDNA는 인간 cDNA 라이브러리에서 동정하였다. 121개의 아미노산 단백질은 hVEGF의 116 내지 159 번의 잔기 사이의 44개의 아미노산의 결실로 인해 hVEGF와 상이하다. 189개의 아미노산 단백질은 hVEGF의 116번 잔기에 24개의 아미노산이 삽입되어 hVEGF와 상이하고, 인간 혈관 투과성 인자 (hVPF)와 동일한 것으로 보인다. 206개의 아미노산 단백질은 hVEGF의 116번 잔기에 41개의 아미노산이 삽입되어 hVEGF와 상이하다 [Houck et al.,Mol. Endocrin.,5: 1806 (1991), Ferrara et al.,J. Cell Biochem., 47: 211 (1991), Ferrara et al.,Endocrine Reviews,13: 18 (1992), Keck et al.,Science,246: 1309 (1989), Connolly et al.,J. Biol. Chem.,264: 20017 (1989), EP 370,989 (1990년 5월 30일자 공개)].

기존의 내피로부터 신생 혈관의 형성과 관련된 혈관형성이 여러가지 질병의 발병기전과 관련된다는 것은 잘 입증되어 있다. 상기 질병에는 충실성 종양 및 전이, 아테롬경화증, 수정체 후부섬유증식증, 혈관종, 만성 염증, 안내 신생혈관 증후군, 예를 들어 증식 망막병증 (예, 당뇨성 망막병증), 노화 관련 황반 변성 (AMD), 신생 혈관 녹내장, 이식된 각막 조직 및 다른 조직의 면역 거부반응, 류마티스성 관절염 및 건선이 포함된다 [Folkman et al.,J. Biol. Chem.,267: 10931-10934 (1992), Klagsbrun et al.,Annu. Rev. Physiol.,53: 217-239 (1991) 및 Garner A, "Vascular diseases". In:Pathobiology of Ocular Diseas. A Dynamic Approach, Garner A. Klintworth GK, eds., 2nd Edition (Marcel Dekker. NY. 1994), pp1625-1710].

종양 성장의 경우, 혈관형성은 과형성에서 종양으로의 전이 및 성장하는 충실성 종양으로의 영양 공급에 중요한 것으로 보인다 [Folkman et al.,Nature,339: 58 (1989)]. 신생혈관형성은 종양세포가 정상 세포에 비해 성장의 이점 및 증식 자율성을 획득하도록 한다. 따라서, 유방암 및 여러 다른 종양에서 종양 절편의 미소혈관과 환자의 생존 사이에 상호관계를 확인하였다 [Weidner et al., N.Engl. J. Med,324: 1-6 (1991), Horak et al.,Lancet,340: 1120-1124 (1992), Macchiarini et al.,Lancet,340: 145-146 (1992)].

혈관생성의 양성 조절자의 검색으로 aFGF, bFGF, TGF-α, TGF-β, HGF, TNF-α, 안지오제닌, IL-8 등을 포함한 많은 후보자를 찾아냈다 [Folkman et al.,J.B.C., 상기 문헌 및 Klagsbrun et al., 상기 문헌]. 현재까지 확인된 음성 조절자에는 트롬보스폰딘 [Good et al.,Proc. Natl. Acd. Sci USA.,87: 6624-6628 (1990)], 16 킬로달톤의 프로락틴 N-말단 단편 [Clapp et al.,Endocrinology, 133: 1292-1299 (1993)], 안지오스타틴 (O'Reilly et al.,Cell,79: 315-328 (1994)] 및 엔도스타틴 [O'Reilly et al.,Cell,88: 277-285 (1996)]이 포함된다.

수년에 걸쳐 수행된 연구는 혈관 내피 세포 증식의 자극, 혈관 투과성 및 혈관형성의 유도에 있어서 VEGF의 중요 기능을 확인하였다 [Ferrara et al.,Endocr. Rev., 18: 4-25 (1997)]. VEGF의 단일 대립유전자의 손실조차도 태아 치사를 일으킨다는 발견은 혈관계의 발생 및 분화에 있어 상기 인자의 대신할 수 없는 기능을 지적하고 있다. 또한, VEGF는 종양 및 안내 질환과 관련된 신생혈관형성의 중요한 매개체이다 [Ferrara et al., 상기 문헌]. VEGF mRNA는 조사된 대부분의 인간 종양에서 과발현되었다 [Berkman et al.,J. Clin. Invest.,91: 153-159 (1993), Brown et al.,J. Clin. Invest.,91: 153-159 (1993), Brown et al.,Human Pathol.,26: 86-91 (1995), Brown et al.,Cancer Res.,53: 4727-2735 (1993), Mattern et al.,Brit. J. Cancer,73:931-934 (1996). Dvorak et al., Am. J. Pathol., 146: 1029-1039 (1995)].

또한, 눈물 내의 VEGF의 수준은 당뇨병 및 다른 허혈성 관련 망막병증을 갖는 환자의 혈관의 활성적인 증식의 존재와 매우 밀접하다 [Aiello et al.,N. Engl. J. Med. 331: 1480-1487 (1994)]. 또한, 최근 연구는 AMD 환자의 맥락막 신생 혈관막에서 VEGF의 분포를 증명하였다 [Lopez et al.,Invest. Ophthalmol. Vis. Sci.,37:855-868 (1996)].

항 VEGF 중화 항체는 누드 마우스에서 다양한 인간 종양 세포주의 성장을 억제하였으며 [Kim et al.,Nature,362: 841-844 (1993), Warren et al.,J. clin.Invest.,95: 1789-1797 (1993), Borgstrom et al.,Cancer Res.,56: 4032-4039 (1996), Melnyk et al.,Cancer Res.,56:921-924 (1996)], 또한 허혈성 망막 질환 모델에서 안내 혈관형성을 억제하였다 [Adamis et al.,Arch. Ophthalmol.,114: 66-71 (1996)]. 따라서, 항 VEGF 모노클로날 항체 또는 VEGF 작용의 다른 억제제는 충실성 종양 및 여러 안내 신생혈관질환 치료의 유망한 후보 물질이다. 상기 항체는 예를 들어 EP 817,648 (1998년 1월 14일자 공개) 및 PCT/US98/06724 (1998년 4월 3일자 출원)에 개시되어 있다.

특정 세포에서 발현되는 유전자 복합체 형성을 신속하게 유도할 수 있는 형질전환 종양 유전자를 비롯한 여러가지 다른 성장 인자 및 분열촉진 물질이 존재한다 [Lau and Nathans,Molecular Aspects of Cellular Regulation, 6: 165-202 (1991)]. 조기 또는 초기 반응 유전자로 지칭되는 이들 유전자는 신규 단백질 합성과 무관하게 성장 인자 또는 분열 촉진 인자와의 접촉후 수 분내에 전사가 활성화된다. 이들 조기 유전자군은 분화 및 증식, 재생 및 상처 치유와 같은 복합적인 생물학적 과정의 균형에 필요한 분비, 세포외 단백질을 코딩한다 [Reyseck et al.,Cell Growth Differ.,2: 235-233 (1991)].

상기 군에 속하는 매우 연관성이 높은 단백질에는 cef 10 [Simmons et al.,Proc. natl. Acad. Sci. USA,86: 1178-1182 (1989)], 혈청 또는 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF)에 의해 신속하게 활성화되는 cyr 61 [O'Brien et al.,Mol. Cell Biol.,10: 3569-3577 (1990)], 형질전환 성장 인자 베타 (TGF -β)에 의한 활성화후 인간 혈관 내피세포에서 높은 수준으로 분비되며 PDGF 유사 생물학적 및 면역학적 활성을 나타내고 특정 세포 표면 수용체의 PDGF와 경쟁하는 인간 결합조직 성장 인자 (CTGF) [Bradham et al.,J. Cell. Biol.,114: 1285-1294 (1991)], fisp-12 [Ryseck et al.,Cell Growth Differ.,2: 235-233 (1991)], 인간 혈관 IBP 유사 성장 인자 (VIGF) (WO96/17931), 및 골수아세포증 관련 바이러스 타입-1 유도된 신모세포종에서 과발현되는 것으로 밝혀지고 성인 신장 세포에서는 정상적으로 정지되는 nov [Joloit et al.,Mol. Cell. Biol.,12: 10-21 (1992)]가 포함된다.

상기 조기 유전자의 발현은 성장 인자에 의해 유도되는 현상의 캐스캐이드에서 "제3의 전달자"로서 작용한다. 또한, 이들은 복합적인 생물학적 과정, 예를 들어 세포 증식이 일반적으로 일어나는 분화 및 상처 치유을 통합하고 균형을 이루는데 필요하다.

다른 분열 촉진 인자로서, 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 (IGFBP)이 인슐린 유사 성장인자 (IGF)와 복합체를 형성하여 IGF의 섬유아세포 및 평활근 세포 표면 수용체과의 결합의 증가를 촉진한다는 것이 밝혀졌다 [Clemmons et al.,J. Clin. Invest.,77: 1548 (1986)]. 시험관 내에서 여러 IGF 작용에 대한 IGFBP의 억제 효과에는 지방세포에 의한 글루코스 운반, 연골세포에 의한 인산 결합 및 섬유아세포에서 티미딘 결합의 촉진이 포함된다 [Zapf et al.,J. Clin. Invest.,63: 1077 (1979)]. 또한, 정상세포 내에서 성장 인자 매개된 분열 촉진 인자의 활성에 대한 IGFBP의 억제 효과가 제시되었다.

C. 다른 치료법의 필요성

많은 질환 및 질병에 있어서 혈관 내피 세포 성장 및 혈관형성의 역할의 관점에서, 이들 과정을 일으키는 하나 이상의 생물학적 효과를 감소시키거나 억제하는 수단을 갖는 것이 바람직하다. 또한, 정상 및 이환된 조건, 특히 암에서 병원성 폴리펩티드의 존재를 분석하기 위한 수단을 갖는 것이 바람직하다. 또한, 상세한 양태에서, 심비대증의 치료를 위한 일반적으로 적용가능한 치료법이 존재하지 않기 때문에 심근세포 비대를 예방하거나 감소시킬 수 있는 인자를 동정하는 것이 병리생리학적 심장의 성장에 대한 신규 치료법의 개발에 있어 가장 중요하다. 여러 심혈관 및 종양성 질환의 치료 방법이 존재하지만, 또다른 치료 방법에 대한 요구가 여전히 존재한다.

<발명의 요약>

따라서, 본 발명은 포유동물에서 혈관형성 및(또는) 심혈관형성을 촉진 또는 억제하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 본 발명은 특정 생물학적 활성의 촉진 또는 억제를 시험하는 여러가지 심혈관 분석법에서 양성으로 시험되는 단백질의 동정에 기초한다. 따라서, 상기 단백질은 상기 효과, 예를 들어 혈관형성의 촉진 또는 억제, 혈관 내피 세포 성장의 억제 또는 자극, 혈관 내피 세포의 성장 또는 증식의 자극, 종양 성장의 억제, 혈관형성 의존성 조직 성장의 억제, 혈관형성 의존성 조직 성장의 자극, 심비대의 억제 및 심비대의 자극을 요하는 질환의 진단 및(또는) 치료 (예방 포함)를 위한, 예를 들어 울혈성 심부전의 치료에 유용한 약물일 것으로 생각된다.

한 실시태양에서, 본 발명은 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드를제약적으로 허용 가능한 담체와 함께 포함하는 조성물을 제공한다. 한 양태에서, 조성물은 치료 유효량의 상기 폴리펩티드를 포함한다. 다른 양태에서, 조성물은 추가의 활성 성분, 즉 심혈관제, 내피제, 혈관형성제 또는 혈관형성 억제제, 바람직하게는 혈관형성제 또는 혈관형성 억제제를 더 포함한다. 바람직하게, 조성물은 멸균상태이다. PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드는 연장된 저장 안정성을 달성하기 위해 방부처리될 수 있는 액상 제약 제제 형태로 투여될 수 있다. 방부처리된 액상 제약 제제는 다중 투여량의 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드를 포함함으로써 반복 사용에 적합할 수 있다.

또다른 실시태양에서, 본 발명은 치료 유효량의 PRO230, PRO216 또는 PRO302폴리펩티드를 제약적으로 허용가능한 담체와 함께 포함하는, 심혈관, 내피 또는 혈관형성 질환의 치료에 유용한 상기 조성물을 제조하는 방법을 제공한다.

또다른 실시태양에서, 본 발명은 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드의 아고니스트 또는 길항제를 제약적으로 허용 가능한 담체와 함께 포함하는 조성물을 제공한다. 한 양태에서, 조성물은 치료 유효량의 상기 아고니스트 또는 길항제를 포함한다. 다른 양태에서, 조성물은 추가의 활성 성분, 즉 심혈관제, 내피제, 혈관형성제 또는 혈관형성 억제제, 바람직하게는 혈관형성제 또는 혈관형성 억제제를 더 포함한다. 바람직하게, 조성물은 멸균상태이다. PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드 아고니스트 또는 길항제는 연장된 저장 안정성을 달성하기 위해 방부처리될 수 있는 액상 제약 제제 형태로 투여될 수 있다. 방부처리된 액상 제약 제제는 다중 투여량의 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드 아고니스트 또는 길항제를 포함함으로써 반복 사용에 적합할 수 있다.

또다른 실시태양에서, 본 발명은 치료 유효량의 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드 아고니스트 또는 길항제를 제약적으로 허용가능한 담체와 함께 포함하는, 심혈관, 내피 또는 혈관형성 질환의 치료에 유용한 상기 조성물을 제조하는 방법을 제공한다.

또다른 실시태양에서, 본 발명은 항 PRO230, 항 PRO216 또는 항 PRO302 항체를 제약적으로 허용 가능한 담체와 함께 포함하는 조성물을 제공한다. 한 양태에서, 조성물은 치료 유효량의 상기 항체를 포함한다. 다른 양태에서, 조성물은 추가의 활성 성분, 즉 심혈관제, 내피제, 혈관형성제 또는 혈관형성 억제제, 바람직하게는 혈관형성제 또는 혈관형성 억제제를 더 포함한다. 바람직하게, 조성물은 멸균상태이다. 항 PRO230, 항 PRO216 또는 항 PRO302 항체는 연장된 저장 안정성을 달성하기 위해 방부처리될 수 있는 액상 제약 제제 형태로 투여될 수 있다. 방부처리된 액상 제약 제제는 다중 투여량의 항 PRO230, 항 PRO216 또는 항 PRO302 항체를 포함으로써 반복 사용에 적합할 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 항체는 모노클로날 항체, 항체 단편, 인간화 항체 또는 단쇄 항체이다.

또다른 실시태양에서, 본 발명은 치료 유효량의 항 PRO230, 항 PRO216 또는 항 PRO302 항체를 제약적으로 허용가능한 담체와 함께 포함하는, 심혈관, 내피 또는 혈관형성 질환의 치료에 유용한 상기 조성물을 제조하는 방법을 제공한다.

또다른 양태에서, 본 발명은

(a) 치료 유효량의 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드를 포함하는 조성물,

(b) 상기 조성물을 함유하는 용기 및

(c) 상기 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드의 심혈관, 내피 또는 혈관형성 질환의 치료에 있어서의 용도를 언급하는, 상기 용기에 부착된 라벨 또는 상기 제약품 내에 포함되는 포장 삽입물

을 포함하는 제품을 제공한다.

또다른 양태에서, 본 발명은

(a) 치료 유효량의 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드 아고니스트 또는 길항제를 포함하는 조성물,

(b) 상기 조성물을 함유하는 용기 및

(c) 상기 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드 아고니스트 또는 길항제의 심혈관, 내피 또는 혈관형성 질환의 치료에 있어서의 용도를 언급하는, 상기 용기에 부착된 라벨 또는 상기 제약품 내에 포함되는 포장 삽입물

을 포함하는 제품을 제공한다.

또다른 양태에서, 본 발명은

(a) 치료 유효량의 항 PRO230, 항 PRO216 또는 항 PRO302 항체를 포함하는 조성물,

(b) 상기 조성물을 함유하는 용기 및

(c) 상기 항 PRO230, 항 PRO216 또는 항 PRO302 항체의 심혈관, 내피 또는 혈관형성 질환의 치료에 있어서의 용도를 언급하는, 상기 용기에 부착된 라벨 또는 상기 제약품 내에 포함되는 포장 삽입물

을 포함하는 제품을 제공한다.

또다른 실시태양에서, 본 발명은

(a) PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드에 의해 정상적으로 유도되는 세포 반응의 유도에 적합한 조건 하에서 세포를 스크리닝되는 시험 화합물과 접촉시키는 단계 및

(b) 시험 화합물이 효과적인 아고니스트임을 나타내는 상기 세포 반응의 유도를 측정하여 상기 시험 화합물이 효과적인 아고니스트임을 결정하는 단계

를 포함하는, PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드의 아고니스트를 동정하는 방법을 제공한다.

또다른 실시태양에서, 본 발명은

(a) PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드에 의한 세포 증식의 자극에 적합한 조건 하에서 세포를 스크리닝되는 시험 화합물과 접촉시키는 단계 및

(b) 시험 화합물이 효과적인 아고니스트임을 나타내는 상기 세포 증식의 자극을 측정하여 상기 시험 화합물이 효과적인 아고니스트임을 결정하는 단계

또다른 실시태양에서, 본 발명은 시험 화합물과 폴리펩티드가 상호작용하기에 충분한 조건 및 시간 하에서 시험 화합물을 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드와 접촉시키는 단계 및 상기 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드 활성의 억제를 측정하는 단계를 포함하는, 상기 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드의 활성을 억제하는 화합물을 동정하는 방법을 제공한다. 바람직한 특정 양태에서, 시험화합물 또는 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드가 고상 지지체 상에 고정된다. 또다른 바람직한 양태에서, 비고정화 성분은 검출가능한 표지를 포함한다. 바람직한 양태에서, 상기 방법은

(a) PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드에 의해 정상적으로 유도되는 세포 반응의 유도에 적합한 조건 하에 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드 존재 하에서 세포를 스크리닝되는 시험 화합물과 접촉시키는 단계 및

(b) 상기 세포 반응의 유도를 측정하여 시험 화합물이 효과적인 길항제임을결정하는 단계

를 포함한다.

또다른 양태에서, 상기 방법은

(a) PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드에 의한 세포 증식의 자극에 적합한 조건 하에 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드 존재 하에서 세포를 스크리닝되는 시험 화합물과 접촉시키는 단계 및

(b) 상기 세포 증식을 측정하여 시험 화합물이 효과적인 길항제임을 결정하는 단계를 포함한다.

또다른 실시 태양에서, 본 발명은 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드를 정상적으로 발현하는 세포를 시험 화합물과 접촉시키는 단계 및 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드의 발현 억제를 측정하는 단계를 포함하는, 상기 세포에서 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드의 발현을 억제하는 화합물을 동정하는 방법을 제공한다. 바람직한 양태에서, 상기 방법은

(a) PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드 발현에 적합한 조건 하에서 세포를 시험 화합물과 접촉시키는 단계 및

(b) 상기 폴리펩티드의 발현 억제를 측정하는 단계를 포함한다.

또다른 실시태양에서, 본 발명은 상기한 방법에 의해 동정된 화합물과 같이 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드의 발현을 억제하는 화합물을 제공한다.

본 발명의 또다른 양태는 상기에 기재된 방법에 의해 임의로 동정될 수 있는 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드의 아고니스트 또는 길항제에 관한 것이다.

PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드의 하나 이상의 기능 또는 활성을 억제하는 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드 길항제의 한 형태는 항체이다. 따라서, 다른 양태에서, 본 발명은 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드에 결합하는 단리된 항체를 제공한다. 바람직한 양태에서, 항체는 바람직하게는 비인간 상보성 결정 영역 (CDR) 잔기 및 인간 프레임워크 영역 (FR) 잔기를 갖는 모노클로날 항체이다. 항체는 표지될 수 있으며, 고상 지지체 상에 고정화될 수 있다. 또다른 양태에서, 항체는 항체 단편, 단쇄 항체 또는 인간화 항체이다. 바람직하게, 항체는 폴리펩티드에 특이적으로 결합한다.

또다른 양태에서, 본 발명은

(a) 숙주에서 유래된 시료로부터 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 단리하는 단계 및

(b) PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드 핵산 서열 내의 돌연변이의 존재 또는 부재를 결정하는 단계

를 포함하고, 상기 돌연변이의 존재 또는 부재가 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드 코딩 핵산 서열 내의 상기 돌연변이와 관련된 질병 또는 질병에 대한 감수성의 존재를 나타내는, 상기 돌연변이와 관련된 질병 또는 질병에 대한 감수성의 진단 방법을 제공한다.

또다른 양태에서, 본 발명은 (a) 포유동물로부터 얻은 조직 세포의 시험 시료 및 (b) 공지된 동일한 세포형의 정상 조직 세포의 대조 시료에서 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 분석하는 것을포함하고, 대조 시료에 비해 시험 시료의 발현 수준이 높거나 낮은 것이 상기 포유동물에서 심혈관, 내피 또는 혈관형성 질환의 존재를 나타내는, 상기 포유동물의 심혈관, 내피 또는 혈관형성 질환의 진단 방법을 제공한다. PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 발현은 시험 시료 내의 mRNA 또는 폴리펩티드의 수준을 대조 시료와 비교 측정하여 임의로 수행할 수 있다.

또다른 실시태양에서, 본 발명은 포유동물로부터 얻은 조직 세포의 시험 시료에서 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드의 존재 또는 부재를 검출하는 것을 포함하고, 상기 시험 시료에서 상기 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드의 존재 또는 부재가 상기 포유동물에서 심혈관, 내피 또는 혈관형성 질환의 존재를 나타내는, 상기 포유동물의 심혈관, 내피 또는 혈관형성 질환의 진단 방법을 제공한다.

또다른 실시태양에서, 본 발명은 (a) 항 PRO230, 항 PRO216 또는 항 PRO302 항체를 포유동물로부터 얻은 조직 세포의 시험 시료와 접촉시키는 단계 및 (b) 시험 시료 내에서 항 PRO230, 항 PRO216 또는 항 PRO302 항체와 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드 사이의 복합체의 형성을 검출하는 단계를 포함하며, 상기 복합체의 형성이 상기 포유동물 내의 심혈관, 내피 또는 혈관형성 질환의 존재를 나타내는, 상기 포유동물의 심혈관, 내피 또는 혈관형성 질환의 진단 방법을 제공한다. 검출은 정성 또는 정량적일 수 있으며, 동일한 세포형의 공지된 정상 조직 세포의 대조 시료에서 복합체의 형성을 모니터링하여 비교함으로써 수행될 수 있다. 시험 시료 내에 형성된 보다 많거나 작은 양의 복합체는 시험 조직 세포가 수득된 포유동물 내에 심혈관, 내피 또는 혈관형성 부전증이 존재함을 나타낸다. 항체는 바람직하게는 검출가능한 표지를 포함한다. 복합체 형성은 예를 들어 광학현미경, 유동 세포측정법, 형광측정법 또는 당업계에 공지된 다른 기술에 의해 모니터할 수 있다. 시험 시료는 통상 심혈관, 내피 또는 혈관형성 질환의 보유자로 추측되는 개체로부터 수득한다.

또다른 실시태양에서, 본 발명은 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드를 함유하는 것으로 예상되는 시료를 항 PRO230, 항 PRO216 또는 항 PRO302 항체에 노출시키는 단계 및 상기 항체와 상기 시료의 성분과의 결합을 측정하는 단계를 포함하는, 시료에서 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드의 존재를 결정하는 방법을 제공한다. 특정 양태에서, 시료는 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드를 포함하는 것으로 추정되는 세포를 포함하고 항체는 세포에 결합한다. 항체는 바람직하게는 검출가능하게 표지하고/하거나 고상 지지체에 결합한다.

또다른 양태에서, 본 발명은 적합한 포장 내에 항 PRO230, 항 PRO216 또는 항 PRO302 항체 및 담체를 포함하는, 심혈관, 내피 또는 혈관형성 질환 진단 키트를 제공한다. 바람직하게, 상기 키트는 상기 항체를 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드의 존재를 검출하는 데 사용하기 위한 지시서를 더 포함한다. 바람직하게, 담체는 예를 들어 완충액이다. 바람직하게, 심혈관, 내피 또는 혈관형성 질환은 암이다.

다른 실시양태에서, 본 발명은

용기,

조성물이 심혈관, 내피 또는 혈관형성 질환의 치료용으로 사용될 수 있다는 것을 지시하는 상기 용기에 부착된 라벨 및

용기 내에 포함된 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드를 포함하는 조성물

을 포함하는 제품을 제공한다.

다른 실시양태에서, 본 발명은

용기,

용기 내에 포함된 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드 아고니스트 또는 길항제를 포함하는 조성물

을 포함하는 제품을 제공한다.

다른 실시양태에서, 본 발명은

용기,

용기 내에 포함된 항 PRO230, 항 PRO216 또는 항 PRO302 항체를 포함하는 조성물

을 포함하는 제품을 제공한다.

또다른 실시태양에서, 본 발명은 유효량의 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드를 포유동물에 투여하는 것을 포함하는, 포유동물의 심혈관, 내피 또는 혈관형성 질환의 치료 방법을 제공한다. 바람직하게는, 질환은 심비대증, 외상 (예, 상처 또는 화상) 또는 암의 형태이다. 또다른 양태에서, 포유동물은 혈관 성형술, 또는 심혈관, 내피 또는 혈관형성 질환을 치료하는 약물, 예를 들어 ACE 억제제, 또는 심혈관, 내피 또는 혈관형성 질환이 암의 형태인 경우 화학치료제를 추가로 적용한다. 바람직하게, 포유동물은 인간, 바람직하게는 심비대가 발생할 위험이 있는 사람, 보다 바람직하게는 심근경색증을 갖는 사람이다.

또다른 바람직한 형태에서, 심비대는 PGF_2α수준이 상승된다는 특징을 갖는다. 별법으로, 심비대는 심근 경색증에 의해 유도될 수 있으며, PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드의 투여는 심근 경색후 48시간, 보다 바람직하게는 24시간 내에 개시되는 것이 바람직하다.

또다른 바람직한 실시태양에서, 심혈관, 내피 또는 혈관형성 질환은 심비대증이고, 상기 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드는 심혈관제, 내피제 또는 혈관형성제와 함께 투여된다. 상기 목적을 위해 바람직한 심혈관제, 내피제 또는 혈관형성제는 항고혈압 약물, ACE 억제제, 엔도텔린 수용체 길항제 및 혈전 용해제로 이루어진 군으로부터 선택된다. 혈전 용해제가 투여되는 경우, PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드는 상기 제제의 투여 후에 투여되는 것이 바람직하다. 보다 바람직하게, 혈전용해재는 재조합 인간 조직 플라스미노겐 활성화제이다.

또다른 바람직한 실시태양에서, 심혈관, 내피 또는 혈관형성 질환은 심비대증이고, PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드는 급성 심근 경색증 치료를 위한 1차 혈관성형술 후에 투여하며, 바람직하게는 포유동물을 혈관 성형술 또는 심혈관제, 내피제 또는 혈관형성제에 적용시킨다.

또다른 바람직한 실시태양에서, 심혈관, 내피 또는 혈관형성 질환은 암이고, PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드가 화학치료제, 성장억제제 또는 세포독성제와 함께 투여된다.

또다른 실시태양에서, 본 발명은 유효량의 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드 아고니스트를 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서의 심혈관, 내피 또는 혈관형성 질환의 치료 방법에 관한 것이다. 바람직하게는, 심혈관, 내피 또는 혈관형성 질환은 심비대증, 외상, 암 또는 노화 관련된 황반 변성이다. 포유동물이 인간이고, 유효량의 혈관형성제 또는 혈관형성 억제제를 아고니스트와 함께 투여하는 것이 바람직하다.

또다른 실시태양에서, 본 발명은 유효량의 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드 길항제를 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서의 심혈관, 내피 또는 혈관형성 질환의 치료 방법에 관한 것이다. 바람직하게는, 심혈관, 내피 또는 혈관형성 질환은 심비대증, 외상, 암 또는 노화 관련된 황반 변성이다. 포유동물이 인간이고, 유효량의 혈관형성제 또는 혈관형성 억제제를 길항제와 함께 투여하는 것이 바람직하다.

또다른 실시태양에서, 본 발명은 유효량의 항 PRO230, 항 PRO216 또는 항 PRO302 항체를 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서의 심혈관, 내피 또는 혈관형성 질환의 치료 방법에 관한 것이다. 바람직하게는, 심혈관, 내피 또는 혈관형성 질환은 심비대증, 외상, 암 또는 노화 관련된 황반 변성이다. 포유동물이 인간이고, 유효량의 혈관형성제 또는 혈관형성 억제제를 항체와 함께 투여하는 것이 바람직하다.

또다른 실시태양에서, 본 발명은 (a) PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드, (b) PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드의 아고니스트 또는 (c) PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드의 길항제를 코딩하는 핵산 분자를 포유동물에게 투여하는 것을 포함하고, 상기 아고니스트 또는 길항제가 항 PRO230, 항 PRO216 또는 항 PRO302일 수 있는, 포유동물에서의 심혈관, 내피 또는 혈관형성 질환의 치료 방법을 제공한다. 바람직한 실시태양에서, 포유동물은 인간이다. 바람직한 다른 실시태양에서, 유전자는 생체외 유전자 치료법으로 투여된다. 또다른 바람직한 실시태양에서, 유전자는 벡터 내, 보다 바람직하게는 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 렌티바이러스 또는 레트로바이러스 벡터 내에 포함된다.

또다른 형태에서, 본 발명은 프로모터, (a) PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드, (b) PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드의 아고니스트 폴리펩티드, 또는 (c) PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드의 길항제 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, 및 폴리펩티드의 세포 분비를 위한 시그날 서열을 주성분으로 포함하는 레트로바이러스 벡터를 레트로바이러스 구조 단백질과 함께 포함하는 재조합 레트로바이러스 입자를 제공한다. 바람직하게, 시그날 서열은 포유동물, 예를 들어 천연 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드에서 유래된다.

또다른 실시태양에서, 본 발명은 레트로바이러스 구조 단백질을 발현하고, 프로모터, (a) PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드, (b) PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드의 아고니스트 폴리펩티드, 또는 (c) PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드의 길항제 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, 및 폴리펩티드의 세포 분비를 위한 시그날 서열을 주성분으로 포함하는 레트로바이러스 벡터를 포함하는 핵산 구조물을 포함하고, 레트로바이러스 벡터를 구조 단백질과 함께 패키징하여 재조합 레트로바이러스 입자를 생산하는 생체외 (ex vivo) 생산 세포를 제공한다.

다른 실시태양에서, 본 발명은 (a) PRO216 폴리펩티드, (b) PRO216 폴리펩티드의 아고니스트, (c) PRO216 폴리펩티드의 길항제 또는 (d) 항 PRO216 항체를 내피 세포 성장이 억제되는 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 포유동물의 내피 세포 성장을 억제하는 방법을 제공한다. 바람직하게는 포유동물은 인간이고, 내피 세포 성장은 종양 또는 망막 질환과 관련된다.

또다른 실시태양에서, 본 발명은 (a) PRO230 폴리펩티드, (b) PRO230 폴리펩티드의 아고니스트, (c) PRO230 폴리펩티드의 길항제 또는 (d) 항 PRO230 항체를 내피 세포 성장이 자극되는 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물의 내피 세포 성장을 자극하는 방법을 제공한다. 바람직하게, 포유동물은 인간이다.

또다른 실시태양에서, 본 발명은 치료 유효량의 항 PRO302 항체를 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물의 PRO302 폴리펩티드에 의해 유도되는 혈관형성의 억제 방법을 제공한다. 바람직하게, 포유동물은 인간이고, 보다 바람직하게는 포유동물은 종양 또는 망막 질환을 갖는다.

본 발명은 혈관형성 및(또는) 심혈관형성의 촉진 또는 억제의 생물학적 효과를 필요로 하는 포유동물 내에서 혈관형성 및(또는) 심혈관형성의 촉진 또는 억제에 유용한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 본 발명은 심혈관 질환 및 종양 질환의 진단 및 치료를 포함한다.

도 1a 및 1b는 천연 서열 PRO230 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 1)을 도시하며, 여기서 서열 1은 본원에서 "DNA33223-1136"으로 명명된 클론이다.

도 2는 도 1a 및 1b에 나타낸 서열 1의 코딩 서열로부터 유도된 아미노산 서열 (서열 2)이다.

도 3은 천연 서열 PRO216 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 6)을 도시하며, 여기서 서열 6은 본원에서 "DNA33087"로 명명된 클론이다.

도 4는 도 3에 나타낸 서열 6의 코딩 서열로부터 유도된 아미노산 서열 (서열 7)이다.

도 5는 천연 서열 PRO302 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 11)을 도시하며, 여기서 서열 11은 본원에서 "DNA40370-1217"로 명명된 클론이다.

도 6은 도 5에 나타낸 서열 11의 코딩 서열로부터 유도된 아미노산 서열 (서열 12)이다.

도 7a 내지 7d는 ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램을 이용하여 아미노산 서열 동일성 (%) (도 7a 및 7b)과 핵산 서열 동일성 (%) (도 7c 및 7d)을 측정하는 후술되는 방법을 이용하기 위한 가설의 예이며, 여기서 "PRO"는 관심있는 가정의 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드의 아미노산 서열을 나타내고, "비교 단백질"은 관심있는 "PRO" 폴리펩티드와 비교되는 폴리펩티드의 아미노산 서열을 나타낸다. "PRO-DNA"는 관심있는 가정의 PRO230, PRO216 또는 PRO302 코딩 핵산 서열을 나타내며, "비교 DNA"는 관심있는 "PRO-DNA" 핵산 분자와 비교되는 핵산 분자의뉴클레오티드 서열을 나타내며, "X", "Y" 및 "Z"는 각각 상이한 가정의 아미노산 잔기를 나타내며, "N", "L" 및 "V"는 각각 상이한 가정의 뉴클레오티드를 나타낸다.

도 8a 내지 8q는 ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램에 대한 전체 소스 코드를 제공한다. 이 소스 코드는 ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램을 제공하기 위해 UNIX 운영 시스템 상에서의 사용에 일상적으로 적용할 수 있다.

I. 정의

용어 "심혈관, 내피 및 혈관형성 질환", "심혈관, 내피 및 혈관형성의 기능장애", "심근, 내피 또는 혈관형성 질환 및 "심혈관, 내피 또는 혈관형성의 기능장애"는 상호 교환가능하게 사용되며, 부분적으로 혈관에 영향을 주는 전신성 질환, 예를 들어 당뇨병, 및 혈관 자체 질환, 예를 들어 동맥, 모세혈관, 정맥 및(또는) 림프관의 질환을 나타낸다. 이들은 혈관형성 및(또는) 심혈관형성을 자극하는 증상과 혈관형성 및(또는) 심혈관 형성을 억제하는 증상을 포함한다. 상기 질환에는, 예를 들어 동맥 질환, 예를 들어 아테롬성경화증, 고혈압, 염증성 혈관염, 레이노병 및 레이노 현상, 동맥류 및 동맥 협착증, 정맥 및 림프관 질환, 예를 들어 혈전정맥염, 림프관염 및 림프부종, 및 다른 혈관 질환, 예를 들어 말초혈관 질환, 암, 예를 들어 혈관종 (모세혈관 및 혈관), 사구종양, 모세혈관 확장증, 세균성 혈관종증, 혈관내피종, 맥관육종, 혈관주위세포종, 카포시 육종, 림프관종 및 림프관육종, 종양혈관형성, 외상, 예를 들어 상처, 화상 및 다른 손상 조직, 이식편 고정, 흉터형성, 허혈성 재관류 손상, 류마티스성 관절염, 뇌혈관 질환, 신장 질환, 예를 들어 급성 신부전증, 및 골다공증이 포함된다. 또한, 협심증, 심근 경색증 (예, 급성 심근 경색증), 심비대증 및 심부전증 (예, CHF)이 포함된다.

본원에서 사용된 "비대"는 종양 형성을 수반하지 않는 자연 성장과 무관한 기관 또는 구조물의 부피 증가로서 정의된다. 기관 또는 조직의 비대는 각 세포의 부피 증가 (진성 비대) 또는 조직을 구성하는 세포수의 증가 (과형성) 또는 두가지 모두에 기인한다. 특정 기관, 예를 들어 심장은 출생 직후 분열능을 상실한다. 따라서, "심비대"는 심장의 부피 증가로서 정의되며, 성인에서는 근세포의 크기 증가 및 수반되는 세포 분열없이 수축성 단백질의 함량 증가라는 특징을 갖는다. 비대를 자극하는 스트레스 (예, 심근 경색에서 전부하의 증가, 후부하의 증가, 근세포의 손실, 또는 1차 수축성 억제)의 특성은 반응의 특징 결정에 중요한 역할을 한다. 심비대의 초기 단계에서 근섬유질 및 미토콘드리아의 크기 증가 및 미토콘드리아 및 핵이 확대되는 일반적인 형태학적 특징을 갖는다. 본 단계에서 근세포는 정상세포보다 커지나, 세포 소기관은 거의 보존된다. 보다 진전된 심비대 단계에서는 특정 세포소기관 (예, 미토콘드리아)의 크기 또는 수가 우선적으로 증가하고 새로운 수축성 인자가 세포의 국소 영역에 비정상적으로 축적된다. 장기간 비대가 지속된 세포는 매우 분엽된 막을 갖는 크게 확장된 핵을 비롯하여 세포 구조의 뚜렷한 붕괴를 나타내어, 인접한 근섬유질을 대체하고 정상의 Z-밴드 형태의 붕괴를 유발한다. 용어 "심비대"는 기본 심장 질환과 무관하게 심근의 다양한 정도의 구조적인 손상의 특징을 갖는 상기 질환의 진행의 모든 단계를 포함하여 사용된다.따라서, 상기 용어는 또한 혈압상승, 대동맥 협착증 또는 심근 경색증과 같은 심비대증의 발생에 있어 도움이 되는 생리학적 상태를 포함한다.

"심부전증"은 대사 조직이 요구하는 속도로 혈액을 공급하지 못하는 심장 기능의 비정상을 의미한다. 심부전증은 허혈성, 선천성, 류마티스성 또는 특발성 형태를 포함하는 여러 인자에 의해 유발될 수 있다.

"울혈성 심부전증 (CHF)"는 심장이 산소화된 혈액을 주변 조직으로 전달하기에 적합한 심박출량 (시간에 걸쳐 심장에 의해 공급되는 혈액 부피)을 점점 더 공급하지 못하는 진행성 병리학적 질환이다. CHF가 진행됨에 따라, 구조 및 혈역학 손상이 발생한다. 이러한 손상은 다수의 증상을 가지며, 한가지 특징적인 증상은 심실 비대이다. CHF는 다수의 다양한 심장 질환의 공통적인 결과이다.

"심근 경색증"은 통상 관상동맥 혈전증과 함께 관상 동맥의 아테롬성경화증에 의해 유발된다. 심근 경색증은 2가지 주요 형태로 분리된다. 즉, 모든 심근 괴사가 심실벽의 전체층에 수반되는 전층 경색증, 심실벽을 통해 심근 외막으로 모든 경로를 확장시키지 않으면서 괴사가 심내막하, 벽내 심근, 또는 두가지 모두에 수반되는 심내막하 (비전층) 경색증으로 분류될 수 있다. 심근 경색증은 심장의 손상 대역 및 건강 대역에서 혈역학 효과의 변화 및 구조의 변화 모두를 유발하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 예를 들어 심근 경색증이 최대 심박출량 및 심고동 부피를 감소시킨다. 또한, 이환되지 않은 심장 영역 내에 콜라겐 형성의 증가 및 간질내에서 발생하는 DNA 합성의 촉진도 심근 경색과 관련된다.

예를 들어 전체 주변 저항의 증가로 인한 장기화된 고혈압에서 심장에 가해지는 스트레스 또는 긴장이 증가한 결과로서, 심비대는 오래전부터 "고혈압"과 관련되어 왔다. 만성 압력 과부하로 인한 비대성 심실의 특성은 심장 확장능의 손상이다 [Fauad et al.,J. Am. Coll. Cardiol.,4: 1500-1506 (1984), Smith et al., J.Am. Coll. Cardiol.,5: 869-874 (1985)]. 장기화된 좌심실의 이완은 정상 또는 비정상의 심장 수축능에도 불구하고 초기의 필수적인 고혈압에서 발견되었다 [Hartford et al.,Hypertension,6: 329-338 (1984)]. 그러나, 혈압 수준과 심비대 사이에 밀접한 평행관계가 존재하지는 않는다. 항고혈압 치료법에 대해 좌심실 기능의 향상이 인간에서 보고되었지만, 이뇨제(히드로클로로티아지드), β-차단제(프로판놀올) 또는 칼슘 채널 차단제 (딜티아젬)로 다양하게 치료된 환자는 심장 확장능의 향상 없이 좌심실 비대의 반전을 나타내었다 [Inouye et al.,Am. J. Cardiol. 53:1583-7 (1984)].

심비대증과 관련된 또다른 심장 합병증은 "비대성 심근병증"이다. 상기 질환은 형태학적, 기능적 및 임상적으로 매우 다양한 특성 [Maron et al.,N. Engl. J. Med.,316: 780-789 (1987), Spirito et al.,N. Engl. J. Med.,320: 749-755 (1989), Louie and Edwards,Prog. Cardiovasc. Dis.,36: 275-308 91994), Wigle et al.,Circulation 92: 1680-1692 (1995)], 모든 연령층의 환자를 이환시킴으로써 두드러지는 이종성 [Spirito et al.,N. Engl. J. Med.,336: 775-785 (1997)]을 갖는다는 특징을 보인다. 비대성 심근병증의 원인으로 작용하는 인자는 또한 다양하며 거의 이해되지 않고 있다. 일반적으로 육종 단백질을 코딩하는 유전자의 돌연변이가 비대성 심근병증과 관련된다. 최근 데이타는 β-미오신 중쇄 돌연변이가 가족성 비대성 심근병증의 약 30 내지 40 퍼센트의 원인이 될 수 있다는 것을 시사한다 [Watkins et al.,N. Engl. J. Med.,326: 1108-1114 (1992), Schwartz et al.,Circulation 91: 532-540 (1995), Marian and Roberts,Circulation,92: 1336-1347 (1995), Thierfelder et al.,Cell,77: 701-712 (1994), Watkins et al.,Nat. Gen.,11: 434-437 (1995)]. β-미오신 중쇄 외에, 유전자 돌연변이의 위치에는 심장 트로포닌 T, 알파 토포미오신, 심장 미오신 결합 단백질 C, 필수 미오신 경쇄 및 조절 미오신 경쇄가 포함된다 [Malik and Watkins, Curr. Opin. Cardiol., 12:295-302 (1997)].

판상부 "대동맥 협착증"은 상승 대동맥의 협착이라는 특징을 갖는 유전적 혈관 질환이지만, 폐동맥을 포함하는 다른 동맥도 이환될 수 있다. 치료되지 않은 대동맥 협착증은 심내 압력을 증가시켜 심근 비대증, 결국에는 심부전증 및 사망을 유발할 수 있다. 상기 질환의 발병 기전은 완전히 이해되지 않았으나 내측 평활근의 비대증 및 가능한 과형성이 상기 질환의 두드러진 특징이다. 엘라스틴 유전자의 분자 변이체가 대동맥 협착증의 발생 및 발병 기전에 관련된다고 보고되었다 [미국 특허 제 5,659,282호 (1997원 7월 22일 허여)].

"판역류"는 심장 판막 질환을 유발하는 심장 질환에 의해 발생한다. 류마티스열과 같은 여러 질환은 판막 입구를 수축시키거나 떨어뜨릴 수 있는 반면, 다른 질환은 심내막염, 심내막 또는 방실 입구의 피막의 염증 및 심장 작동을 유발할 수 있다. 판막 협착증의 협착과 같은 결함 또는 판막의 폐쇄 결함은 심강내의 혈액의 축적 또는 판막을 통과하는 혈액의 재역류를 유발한다. 교정되지 않는 경우 장기화된 판막 협착증 또는 부전증은 심장 비대증 및 심근에 관련된 손상을 일으키고 결국 심장 판막 대체가 불가피하게 될 수 있다.

심비대증이 수반되거나 수반되지 않는 상기 모두 및 다른 심혈관, 내피 및 혈관형성 질환은 본 발명에 포함될 수 있다.

용어 "암," "암성의" 및 "악성의"는 통상 비조절된 세포 성장의 특징을 갖는 포유동물의 생리학적 상태를 의미하거나 설명한다. 암의 예로는 선암, 림프종, 아세포종, 흑색종, 육종 및 백혈병을 포함하는 암종이 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 그러한 암의 보다 구체적인 예로는 편평상피 세포암, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 위암, 호즈킨스 및 비-호즈킨스 림프종, 췌장암, 신경교아종, 자궁경부암, 난소암, 간암 (예, 간암종 및 간세포암), 방광암, 유방암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막암, 타액선암, 신장암 (예, 신세포암 및 윌름 종양), 기저세포암, 흑색종, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 고환암, 식도암 및 각종 유형의 두부암 및 목암을 들 수가 있다. 본 발명 치료에 바람직한 암은 유방암, 결장암, 폐암, 흑색종, 난소암 및 기타 상기에 지적한 소포성암과 관련된 암이다.

본원에서 사용되는 용어 "세포 독성제"는 세포의 기능을 억제 또는 방해하거나 및(또는) 세포의 파괴를 유발하는 물질을 나타낸다. 용어는 방사성 동위원소 (예,¹³¹I,¹²⁵I,⁹⁰Y 및¹⁸⁶Re), 화학 치료제 및 독소, 예를 들어 세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적으로 활성인 독소 또는 그의 단편을 포함하도록 의도된다.

"화학치료제"는 암 치료에 유용한 화학 화합물이다. 화학치료제의 예로는알킬화제, 폴린산 길항제 및 핵산 대사의 항대사물질, 항생제, 피리미딘 유사체, 5-플루오로우라실, 시스플라틴, 푸린 뉴클레오시드, 아민, 아미노산, 트리아졸 뉴클레오시드 또는 코르티코스테로이드가 포함된다. 구체적인 예로는 아드리아마이신, 독소루비신, 에피루비신, 5-플루오로우라실, 사이토신 아라비노시드 ("Ara-C"), 시클로포스파미드, 티오테파, 부술판, 사이톡신, 택솔, 톡소테레, 메토트렉세이트, 시스플라틴, 멜팔란, 빈블라스틴, 블레오마이신, 에토포시드, 이포스파미드, 미토마이신 C, 미톡산트론, 빈크리스틴, 비노렐빈, 카르보플라틴, 테니포시드, 다우노마이신, 카르미노마이신, 아미노프테린, 닥티노마이신, 미토마이신, 에스페라미신 (미국 특허 제4,675,187호 참조), 멜팔란 및 다른 관련 질소 머스타드가 포함한다. 또한, 이 정의에 타목시펜 및 오나프리스톤과 같이 종양에 대한 호르몬 활성을 조절 또는 억제하는 기능을 하는 호르몬제도 포함된다.

본원에서 사용되는 "성장 억제제"는 시험관 내 또는 생체 내에서 세포, 예를 들어 Wnt-과잉생산하는 암세포의 성장을 억제하는 화합물 또는 조성물을 의미한다. 따라서, 성장 억제제는 S 단계에서 악성 세포의 비율을 크게 감소시킨다. 성장억제제의 예에는 G1 정지 및 M기 정지를 유도하는 제제와 같은 세포 주기(S 단계를 제외) 진행을 차단하는 제제가 포함된다. 전형적인 M기 차단제로 빈카스 (빈크리스틴 및 빈블라스틴), 택솔 및 토포 II 억제제 (독소루비신, 다우노루비신, 에토포시드 및 블레오마이신)가 포함된다. G1을 정지시키는 제제는 또한 S기 정지를 유도하는데, 그 예로는, 타목시펜, 프레드니손, 다카르바진, 메클로레타민, 시스라틴, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실 및 아라-C와 같은 DNA 알킬화제가 있다.더 많은 정보는 문헌 [Murakami et al.,The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, eds. Chapter 1, "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" 제목의 , Chapter 1 (WB Saunders:Philadelphia, 1995), 특히 p13)]에서 얻을 수 있다. 또다른 예에는 종양 괴상 인자 (TNF), 산성 또는 염기성 FGF 또는 간세포 성장 인자 (HGF)의 혈관형성 활성을 억제 또는 중화할 수 있는 항체, 조직인자, 단백질 C 또는 단백질 S의 응고 활성을 억제 또는 중화할 수 있는 항체 (1991년 2월 21일에 공개된 WO91/01753 참조), 또는 HER2 수용체에 결합할 수 있는 항체, 예를 들어 4D5 항체(및 그의 기능적 균등물) (예, WO92/22653)이다.

"처치"는 심혈관, 내피 및 혈관형성 질환 발생의 억제 및 병리의 변화를 목적으로 수행되는 행위이다. 처치의 개념은 넓은 의미로 사용되며, 특히 임의의 단계의 심혈관, 내피 및 혈관형성 질환의 방지 (예방), 중재, 감소 및 치유를 포함한다. 따라서, "처치"는 치료 조치와 예방 또는 방지 조치를 모두 나타내며, 여기서 목적은 심혈관, 내피 및 혈관형성 질환, 예를 들어 비대를 방지 또는 지연 (감소)시키는 것이다. 처치를 요하는 대상은 이미 질환을 갖고 있는 대상 및 질환을 예방하고자 하는 대상을 포함한다. 상기 질환은 특발성, 심위축성 또는 근육위축성 원인 또는 허혈증 또는 허혈성 간질, 예를 들어 심근 경색증에 의해 발생한다.

"만성" 투여란 급성 방식과 반대로 연속 방식으로 작용제(들)를 투여하여, 초기 치료 효과, 예를 들어 항-비대 효과를 장기간 동안 유지하는 것을 말한다.

처치를 위한 "포유동물"은 인간, 가축과 사육 동물, 동물원용, 경기용 또는애완용 동물, 예를 들면, 개, 말, 고양이, 소 양, 돼지 등을 포함하는 포유동물로서 분류되는 모든 동물을 의미한다. 바람직하게는 포유류는 인간이다.

한 가지 이상의 치료제와 "조합하여" 투여하는 것은 동시 및 일정 순서의 연속 투여를 포함한다.

용어 "심혈관제, 내피제 또는 혈관형성제"는 일반적으로 심혈관, 내피 및 혈관형성 질환의 치료시에 작용하는 임의의 약물을 의미한다. 심혈관제의 예에는 혈압, 심박수, 심장 수축성 및 내피 및 평활근 생물학을 조절함으로써 혈관 항상성을 촉진하는 것이며, 이들 모든 인자는 심혈관 질환에 기능을 한다. 이들의 특정 예에는 안지오텐신 II 수용체 길항제, 엔도텔린 수용체 길항제, 예를 들어 BOSENTAN^TM및 MOXONODIN^TM, 인터페론-γ(INF-γ), 데스-아스파르테이트-안지오텐신 I, 혈전 용해제, 예를 들어 스트렙토키나제, 유로키나제, t-PA, 및 반감기 보다 길고 피브린 특이성이 매우 높도록 특별히 제작된 t-PA 변이체인 TNK t-PA (T103N, N117Q, KHRR(196-299)AAAA t-PA 변이체) [Keyt et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 3670-3674 (1994)], 수축 또는 고혈압제, 예를 들어 디그옥시제닌, 및 β-아드레날린성 수용체 차단제, 예를 들어 프로프라놀올, 티몰올, 테르칼롤올, 카르테올올, 나돌올, 베탁솔올, 펜부톨올, 아세토부톨올, 아테놀올, 메토프롤올 및 카르베딜올, 안지오텐신 전환 효소 (ACE) 억제제, 예를 들어 퀴나프릴, 카프토프릴, 에날라프릴, 라미프릴, 베나제프릴, 포시노프릴 및 리시노프릴, 이뇨제, 예를 들어 클로로티아지드, 히드로클로로티아지드, 히드로플루메타지드, 메틸클로티아지드, 벤즈티아지드, 디클로르펜아미드, 아세타졸아미드 및 인다파미드, 및 칼슘 채널 차단제, 예를 들어 딜티아젬, 니페디핀, 베라파밀, 니카르디핀이 포함된다. 이들 형태의 바람직한 한 종류는 심비대, 또는 심비대증의 발생에 관련된 생리학적 질병, 예를 들어 혈압 상승, 대동맥 협착증 또는 심근 경색증의 치료에 유용한 치료제이다.

"혈관형성제" 및 "내피제"는 혈관형성 및(또는) 내피 세포 성장 또는 적용가능한 경우 혈관생성을 촉진하는 활성제이다. 여기에는 상처 치유의 촉진 인자, 예를 들어 성장 호르몬, 인슐린 유사 성장 인자-I (IGF-I), VEGF, VIGF, PDGF, 표피 성장 인자 (EGF), CTGF 및 그의 패밀리의 일원인 FGF 및 TGF-α 및 TGF-β가 포함된다.

"혈관형성 억제제"는 혈관형성 또는 혈관생성을 억제하며, 그외에 암 세포의 성장을 억제 또는 예방하는 활성제이다. 예로는 상기에 정의된 혈관형성제의 항체 또는 길항제, 예를 들어 VEGF에 대한 항체가 포함된다. 이들은 또한 세포독성제, 화학 치료제, 성장 억제제, 세포사멸제와 같은 세포 치료제 및 다른 암치료제 (예, 항 HER-2, 항 CD-20) 및 다른 생활성 및 유기 화학제가 포함된다.

약학적인 의미에서, 본 발명의 본문에서 "치료 유효량"의 활성제, 예를 들어 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드 또는 그의 아고니스트 또는 길항제 또는 항 PRO230, 항 PRO216 또는 항 PRO302 항체는 포유동물내의 심혈관, 내피 또는 혈관형성 질환의 치료에 효과적인 양을 의미하며, 실험적으로 결정될 수 있다.

본원에서 사용된 활성성분, 예를 들어 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드 또는 그의 아고니스트 및 길항제 또는 항 PRO230, 항 PRO216 또는 항 PRO302항체의 "유효량"은 원하는 효과를 위해 실험적으로 결정될 수 있는 상기 목적을 수행하기에 효과적인 양을 의미한다.

본원에서 사용된 용어 "PRO230", "PRO216", "PRO302", "PRO230 폴리펩티드", "PRO216 폴리펩티드", "PRO302 폴리펩티드"는 천연 서열의 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드 및 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드 변이체 (본원에서 추가로 정의될 것임)을 포함한다. PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드는 다양한 공급원, 예를 들어 인간 조직 형태 또는 다른 공급원으로부터 단리되거나 재조합 및(또는) 합성 방법에 의해 제조될 수 있다.

"천연 서열"의 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드는 자연으로부터 유도된 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드와 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 상기 천연 서열 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드는 자연으로부터 단리할 수 있거나 재조합 또는 합성 방법에 의해 제조할 수 있다. 용어 "천연 서열" PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드는 구체적으로는 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드의 자연발생의 말단이 절단 (truncated) 또는 분비되는 형태 (예를 들어 세포외 도메인 서열), 상기 폴리펩티드의 자연발생 변이체 (교대 스프라이싱된 형태) 및 자연발생 대립 변이체를 포함한다. 본 발명의 특정 실시태양에서, 천연 서열 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드는 도 2 (서열 2), 도 4 (서열 7) 또는 도 6 (서열 12)의 아미노산을 포함하는 성숙 또는 전장의 천연 서열 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드이다. 본원에서 각각의 천연 폴리펩티드 단편은 천연에서 말단이 절단된 (분비되는) 형태로 존재하는 것에 상관없이 천연 N 말단 시그날 서열이 완전하거나, 부분적으로 결실되거나 다른 서열 및 각 천연 서열의 세포외 도메인에 의해 치환된 폴리펩티드 변이체를 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 단편은 대응하는 천연 "PRO" 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 생산에 충분한 길이인 것이 바람직한다.

"PRO230 변이체 폴리펩티드"는 (a) 도 2(서열 2)의 PRO230 폴리펩티드의 잔기 1 또는 약 22 내지 164의 아미노산 서열, (b) 도 2 (서열 2)의 PRO230 폴리펩티드의 X 내지 164의 아미노산 서열 (X는 도 2 (서열 2)의 17 내지 26의 임의의 아미노산 잔기) 또는 (c) 특이적으로 유도된 도 2 (서열 2)의 아미노산 서열의 임의의 단편과 약 80% 이상의 아미노산 서열 상동성을 갖는 하기에 정의되는 (천연 서열의 PRO230 폴리펩티드를 제외한) 활성의 PRO230 폴리펩티드를 의미한다.

"PRO216 변이체 폴리펩티드"는 (a) 도 4 (서열 7)의 PRO216 폴리펩티드의 잔기 1 내지 421의 아미노산 서열, (b) 특이적으로 유도된 도 4 (서열 7)의 아미노산 서열의 임의의 단편과 약 80% 이상의 아미노산 서열 상동성을 갖는 하기에 정의되는 (천연 서열의 PRO216 폴리펩티드를 제외한) 활성의 PRO216 폴리펩티드를 의미한다.

"PRO302 변이체 폴리펩티드"는 (a) 도 6 (서열 12)의 PRO302 폴리펩티드의 잔기 1 또는 약 26 내지 452의 아미노산 서열, (b) 도 6 (서열 12)의 PRO302 폴리펩티드의 X 내지 452의 아미노산 서열 (X는 도 6 (서열 12)의 21 내지 30의 임의의 아미노산 잔기) 또는 (c) 특이적으로 유도된 도 6 (서열 12)의 아미노산 서열의 임의의 단편과 약 80% 이상의 아미노산 서열 상동성을 갖는 하기에 정의되는 바와 같이 (천연 서열의 PRO302 폴리펩티드를 제외한) 활성의 PRO302 폴리펩티드를 의미한다.

상기 PRO230, PRO216 또는 PRO302 변이체 폴리펩티드에는 예를 들어 도 2 (서열 2), 도 4 (서열 70 또는 도6 (서열 12)의 각각의 서열의 N 말단 및(또는) C 말단 및 하나 이상의 내부 도메인에 하나 이상의 아미노산 잔기가 부가되거나 결실된 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드가 포함된다.

통상, PRO230 변이체 폴리펩티드는 (a) 도 2 (서열 2)의 PRO230 폴리펩티드의 잔기 1 또는 약 22 내지 164의 아미노산 서열, (b) 도 2 (서열 2)의 PRO230 폴리펩티드의 X 내지 164의 아미노산 서열 (X는 도 2 (서열 2)의 17 내지 26의 임의의 아미노산 잔기) 또는 (c) 특이적으로 유도된 도 2 (서열 2)의 아미노산 서열의 임의의 단편과의 아미노산 서열 동일성이 약 80% 이상, 바람직하게는 약 81 % 이상, 더 바람직하게는 약 82 % 이상, 더 바람직하게는 약 83 % 이상, 더 바람직하게는 약 84 % 이상, 더 바람직하게는 약 85 % 이상, 더 바람직하게는 약 86 % 이상, 더 바람직하게는 약 87 % 이상, 더 바람직하게는 약 88 % 이상, 더 바람직하게는 약 89 % 이상, 더 바람직하게는 약 90% 이상, 더 바람직하게는 약 91 % 이상, 더 바람직하게는 92 % 이상, 더 바람직하게는 약 93 % 이상, 더 바람직하게는 약 94 % 이상, 더 바람직하게는 약 95% 이상, 더 바람직하게는 약 96 % 이상, 더 바람직하게는 약 97 % 이상, 더 바람직하게는 약 98 % 이상, 가장 바람직하게는 약 99 % 이상이다.

통상, PRO216 변이체 폴리펩티드는 (a) 도 4 (서열 7)의 PRO216 폴리펩티드의 잔기 1 내지 421의 아미노산 서열, (b) 특이적으로 유도된 도 4 (서열 7)의 아미노산 서열의 임의의 단편과의 아미노산 서열 동일성이 약 80% 이상, 바람직하게는 약 81 % 이상, 더 바람직하게는 약 82 % 이상, 더 바람직하게는 약 83 % 이상, 더 바람직하게는 약 84 % 이상, 더 바람직하게는 약 85 % 이상, 더 바람직하게는 약 86 % 이상, 더 바람직하게는 약 87 % 이상, 더 바람직하게는 약 88 % 이상, 더 바람직하게는 약 89 % 이상, 더 바람직하게는 약 90% 이상, 더 바람직하게는 약 91 % 이상, 더 바람직하게는 92 % 이상, 더 바람직하게는 약 93 % 이상, 더 바람직하게는 약 94 % 이상, 더 바람직하게는 약 95% 이상, 더 바람직하게는 약 96 % 이상, 더 바람직하게는 약 97 % 이상, 더 바람직하게는 약 98 % 이상, 가장 바람직하게는 약 99 % 이상이다.

통상, "PRO302 변이체 폴리펩티드"는 (a) 도 6 (서열 12)의 PRO302 폴리펩티드의 잔기 1 또는 약 26 내지 452의 아미노산 서열, (b) 도 6 (서열 12)의 PRO302 폴리펩티드의 X 내지 452의 아미노산 서열 (X는 도 6 (서열 12)의 21 내지 30의 임의의 아미노산 잔기) 또는 (c) 특이적으로 유도된 도 6 (서열 12)의 아미노산 서열의 임의의 단편과의 아미노산 서열 동일성이 약 80% 이상, 바람직하게는 약 81 % 이상, 더 바람직하게는 약 82 % 이상, 더 바람직하게는 약 83 % 이상, 더 바람직하게는 약 84 % 이상, 더 바람직하게는 약 85 % 이상, 더 바람직하게는 약 86 % 이상, 더 바람직하게는 약 87 % 이상, 더 바람직하게는 약 88 % 이상, 더 바람직하게는 약 89 % 이상, 더 바람직하게는 약 90% 이상, 더 바람직하게는 약 91 % 이상, 더 바람직하게는 92 % 이상, 더 바람직하게는 약 93 % 이상, 더 바람직하게는 약94 % 이상, 더 바람직하게는 약 95% 이상, 더 바람직하게는 약 96 % 이상, 더 바람직하게는 약 97 % 이상, 더 바람직하게는 약 98 % 이상, 가장 바람직하게는 약 99 % 이상이다.

변이체는 천연 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드 서열을 포함하지 않는다. 통상적으로, PRO230, PRO216 또는 PRO302 변이체 폴리펩티드는 그 길이가 약 10개 이상의 아미노산, 흔히 약 20개 이상의 아미노산, 더 흔히는 약 30개 이상의 아미노산, 더 흔히는 약 40개 이상의 아미노산, 더 흔히는 약 50개 이상의 아미노산, 더 흔히는 약 60개 이상의 아미노산, 더 흔히는 약 70 개 이상의 아미노산, 더 흔히는 약 80 개 이상의 아미노산, 더 흔히는 약 90 개 이상의 아미노산, 더 흔히는 약 100 개 이상의 아미노산, 더 흔히는 약 150 개 이상의 아미노산, 더 흔히는 약 200 개 이상의 아미노산, 더 흔히는 약 300 개 이상의 아미노산 또는 그 이상이다.

본원에서 확인된 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드 서열에 대한 "아미노산 서열 동일성 (%)"은 PRO230, PRO216 또는 PRO302 서열과 후보 서열을 정렬하고, 필요한 경우 최대치 (%)의 서열 동일성을 얻기 위해 갭을 도입한 후 어떠한 보존적 치환도 서열 동일성의 일부로서 간주하지 않은 상태에서 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드 서열의 아미노산 잔기와 동일한, 후보 서열의 아미노산 잔기의 비율로서 정의된다. 아미노산 서열 동일성 (%)을 측정하기 위한 정렬은 당업계에 공지된 다양한 방법, 예를 들어 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공개적으로 이용 가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 달성할수 있다. 당업계의 숙련가는 비교되는 서열들의 전체 길이에 걸쳐 최대로 정렬시키기 위해 필요한 임의의 알고리즘을 비롯하여 정렬을 측정하기에 적합한 파라미터를 정할 수 있다. 그러나, 본원의 목적상 아미노산 서열 동일성 값(%)은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 이용하여 얻을 수 있는데, 상기 ALIGN-2 프로그램에 대한 완전한 원시 코드는 도 8a 내지 8q에 제시되어 있다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨텍, 인크사가 개발하였으며, 도 8a 내지 8q에 나타낸 원시 코드는 미국 저작권청 (20559 워싱톤 D.C. 소재)의 사용자 문서로 보관되어 있는데, 상기 코드는 미국 저작권 등록 제TXU510087호 하에 등록되어 있다. ALIGN-2 프로그램은 제넨텍, 인크사 (캘리포니아주 사우스 샌 프란시스코 소재)를 통해 공개적으로 이용가능하거나, 도 8a 내지 8q에 제시된 원시 코드로부터 편집될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 UNIX 작동 시스템, 바람직하게는 디지탈 UNIX V4.0D에서 편집되어 이용될 수 있다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램으로 설정하고 변하지 않다.

본원의 목적상, 주어진 아미노산 서열 B에, B와, 또는 B에 대한 주어진 아미노산 서열 A의 아미노산 서열 동일성 (%) (주어진 아미노산 서열 B에, B와, 또는 B에 대한 일정한 아미노산 서열 동일성 (%)을 갖거나 포함하는 주어진 아미노산 서열 A로 달리 표현할 수 있음)은 하기와 같이 계산한다:

X/Y ×100

여기서, X는 A와 B의 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의해 동일하게 매치되는 것으로 기록되는 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B에서 아미노산잔기의 총 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 같지 않는 경우, B에 대한 A의 아미노산 서열 동일성 (%)은 A에 대한 B의 아미노산 서열 동일성 (%)과 같지 않음을 인지해야 할 것이다. 이 방법을 이용한 아미노산 서열 동일성 계산의 예로서, 도 7a 및 7b는 "PRO"로 나타낸 아미노산 서열에 대한 "비교 단백질"로 나타낸 아미노산 서열의 아미노산 서열 동일성 (%)을 계산하는 방법을 나타낸다.

상세한 다른 언급이 없는 경우, 본원에서 사용된 모든 아미노산 서열 동일성 (%) 값은 ALIGN-2 서열 비교 프로그램을 이용하여 상기 기재된 바와 같이 얻는다. 그러나, 아미노산 서열 동일성 (%)은 서열 비교 프로그램 NCBI-BLAST2를 이용하여 계산할 수도 있다 [Altschul et al.,Nucleic Acids Res.25: 3389-3402 (1997)]. 상기 NCBI-BLAST2 서열 비교 프로그램은 웹 사이트 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov.)로부터 다운로드 받을 수 있다. NCBI-BLAST2는 여러 가지 검색 파라미터를 이용하는데, 이러한 모든 검색 파라미터는 예를 들어, 언마스크 = 예, 가닥 = 모두, 기대 발생 = 10, 최소 저복합성 길이 = 15/5, 다중-통과 e-값 = 0.01, 다중-통과에 대한 상수 = 25, 최종 갭 정렬에 대한 드롭오프 = 25 및 점수 매트릭스 = BLOSUM62를 포함하는 디폴트값으로 설정된다.

NCBI-BLAST2가 아미노산 서열 비교에 사용되는 경우, 주어진 아미노산 서열 B에, B와, 또는 B에 대한 주어진 아미노산 서열 A의 아미노산 서열 동일성 (%) (주어진 아미노산 서열 B에, B와, 또는 B에 대한 일정한 아미노산 서열 동일성 (%)을 갖거나 포함하는 주어진 아미노산 서열 A로 달리 표현할 수 있음)은 하기와 같이계산한다.

X/Y ×100

여기서, X는 NCBI-BLAST2 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램 NCBI-BLAST2에 의해 동일하게 매치되는 것으로 기록되는 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B에서 총 아미노산 잔기수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 같지 않는 경우, B에 대한 A의 아미노산 서열 동일성 (%)은 A에 대한 B의 아미노산 서열 동일성 (%)과 같지 않음을 인지해야 할 것이다.

또한, 아미노산 서열 동일성 값(%)은 WU-BLAST-2 컴퓨터 프로그램 [Altschul et al.,Methods in Enzymology 266: 460-80 (1996)]를 이용하여 얻는다. WU-BLAST-2 검색 파라미터 대부분은 디폴트값으로 설정된다. 디폴트값으로 설정하지 않은 것들 즉, 조정가능한 파라미터는 다음 값으로 설정된다: 오버랩 스팬 = 1, 오버랩 분획 = 0.125, 워드 한계 (T) = 11, 및 점수 매트릭스 = BLOSUM62. 본원의 목적을 달성하기 위해 아미노산 서열 동일성 값(%)은, 천연 PRO 폴리펩티드로부터 유도된 서열을 갖는 당해 PRO 폴리펩티드의 아미노산 서열과 비교되는 당해 아미노산 서열 (즉, 당해 PRO 폴리펩티드와 비교되는 서열로서 PRO 변이체 폴리펩티드일 수 있음)과의 사이에 매치되는 동일한 아미노산 잔기의 수를 WU-BLAST-2로 결정하여, 이를 당해 PRO 폴리펩티드의 총 아미노산 잔기수로 나누어 결정한다. 예를 들어, 아미노산 서열 B와 80% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열 A를 포함하는 폴리펩티드"라는 말에서, 아미노산 서열 A는 비교하는 당해 아미노산 서열이고 아미노산 서열 B는 당해 PRO 폴리펩티드의 아미노산 서열이다.

"PRO230 변이체 폴리뉴클레오티드" 또는 "PRO230 변이체 핵산 서열"은 (a) 도 2 (서열 2)의 PRO230 폴리펩티드의 잔기 1 또는 약 22 내지 164의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열, (b) 도 2 (서열 2)의 PRO230 폴리펩티드의 X 내지 164의 아미노산 서열 (X는 도 2 (서열 2)의 17 내지 26의 임의의 아미노산 잔기)을 코딩하는 핵산 서열 또는 (c) 특이적으로 유도된 도 2 (서열 2)의 아미노산 서열의 임의의 단편을 코딩하는 핵산 서열과 약 80% 이상의 핵산 서열 상동성을 갖는 하기에 정의되는 활성의 PRO230 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 의미한다. 통상, (a) 도 2 (서열 2)의 PRO230 폴리펩티드의 잔기 1 또는 약 22 내지 164의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열, (b) 도 2 (서열 2)의 PRO230 폴리펩티드의 X 내지 164의 아미노산 서열 (X는 도 2 (서열 2)의 17 내지 26의 임의의 아미노산 잔기)을 코딩하는 핵산 서열 또는 (c) 특이적으로 유도된 도 2 (서열 2)의 아미노산 서열의 임의의 단편을 코딩하는 핵산 서열과의 핵산 서열 동일성이 약 80 % 이상, 바람직하게는 약 81 % 이상, 더 바람직하게는 약 82 % 이상, 더 바람직하게는 약 83 % 이상, 더 바람직하게는 약 84 % 이상, 더 바람직하게는 약 85 % 이상, 더 바람직하게는 약 86 % 이상, 더 바람직하게는 약 87 % 이상, 더 바람직하게는 약 88 % 이상, 더 바람직하게는 약 89 % 이상, 더 바람직하게는 약 90 % 이상, 더 바람직하게는 약 91 % 이상, 더 바람직하게는 약 92 % 이상, 더 바람직하게는 약 93 % 이상, 더 바람직하게는 약 94 % 이상, 더 바람직하게는 약 95 % 이상, 더 바람직하게는 약 96 % 이상, 더 바람직하게는 약 97 % 이상, 더 바람직하게는 약 98 % 이상, 가장 바람직하게는 약 99 % 이상일 것이다. 변이체들은 천연 뉴클레오티드 서열 전체를포괄하지는 않는다.

"PRO216 변이체 폴리뉴클레오티드" 또는 "PRO216 변이체 핵산 서열"은 (a) 도 4 (서열 7)의 PRO230 폴리펩티드의 잔기 1 내지 421의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열, (b) 특이적으로 유도된 도 4 (서열 7)의 아미노산 서열의 임의의 단편을 코딩하는 핵산 서열과 약 80% 이상의 핵산 서열 상동성을 갖는 하기에 정의되는 활성의 PRO230 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 의미한다. 통상, "PRO216 변이체 폴리뉴클레오티드" 또는 "PRO216 변이체 핵산 서열"은 (a) 도 4 (서열 7)의 PRO230 폴리펩티드의 잔기 1 내지 421의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열, (b) 특이적으로 유도된 도 4 (서열 7)의 아미노산 서열의 임의의 단편을 코딩하는 핵산 서열과의 핵산 서열 동일성이 약 80 % 이상, 바람직하게는 약 81 % 이상, 더 바람직하게는 약 82 % 이상, 더 바람직하게는 약 83 % 이상, 더 바람직하게는 약 84 % 이상, 더 바람직하게는 약 85 % 이상, 더 바람직하게는 약 86 % 이상, 더 바람직하게는 약 87 % 이상, 더 바람직하게는 약 88 % 이상, 더 바람직하게는 약 89 % 이상, 더 바람직하게는 약 90 % 이상, 더 바람직하게는 약 91 % 이상, 더 바람직하게는 약 92 % 이상, 더 바람직하게는 약 93 % 이상, 더 바람직하게는 약 94 % 이상, 더 바람직하게는 약 95 % 이상, 더 바람직하게는 약 96 % 이상, 더 바람직하게는 약 97 % 이상, 더 바람직하게는 약 98 % 이상, 가장 바람직하게는 약 99 % 이상일 것이다. 변이체들은 천연 뉴클레오티드 서열 전체를 포괄하지는 않는다.

"PRO302 변이체 폴리뉴클레오티드" 또는 "PRO302 변이체 핵산 서열"은 (a) 도 6 (서열 12)의 PRO302 폴리펩티드의 잔기 1 또는 약 26 내지 452의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열, (b) 도 6 (서열 12)의 PRO302 폴리펩티드의 X 내지 452의 아미노산 서열 (X는 도 6 (서열 12)의 21 내지 30의 임의의 아미노산 잔기)을 코딩하는 핵산 서열 또는 (c) 특이적으로 유도된 도 6 (서열 12)의 아미노산 서열의 임의의 단편을 코딩하는 핵산 서열과 약 80% 이상의 핵산 서열 상동성을 갖는 하기에 정의되는 활성의 PRO230 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 의미한다. 통상, (a) 도 6 (서열 12)의 PRO302 폴리펩티드의 잔기 1 또는 약 26 내지 452의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열, (b) 도 6 (서열 12)의 PRO302 폴리펩티드의 X 내지 452의 아미노산 서열 (X는 도 6 (서열 12)의 21 내지 30의 임의의 아미노산 잔기)을 코딩하는 핵산 서열 또는 (c) 특이적으로 유도된 도 6 (서열 12)의 아미노산 서열의 임의의 단편을 코딩하는 핵산 서열과의 핵산 서열 동일성이 약 80 % 이상 이상, 바람직하게는 약 81 % 이상, 더 바람직하게는 약 82 % 이상, 더 바람직하게는 약 83 % 이상, 더 바람직하게는 약 84 % 이상, 더 바람직하게는 약 85 % 이상, 더 바람직하게는 약 86 % 이상, 더 바람직하게는 약 87 % 이상, 더 바람직하게는 약 88 % 이상, 더 바람직하게는 약 89 % 이상, 더 바람직하게는 약 90 % 이상, 더 바람직하게는 약 91 % 이상, 더 바람직하게는 약 92 % 이상, 더 바람직하게는 약 93 % 이상, 더 바람직하게는 약 94 % 이상, 더 바람직하게는 약 95 % 이상, 더 바람직하게는 약 96 % 이상, 더 바람직하게는 약 97 % 이상, 더 바람직하게는 약 98 % 이상, 가장 바람직하게는 약 99 % 이상일 것이다. 변이체들은 천연 뉴클레오티드 서열 전체를 포괄하지는 않는다.

통상 PRO230, PRO216 또는 PRO302 변이체 폴리뉴클레오티드는 그 길이가 약30개 이상의 뉴클레오티드, 더 흔히는 약 60 개 이상의 뉴클레오티드, 더 흔히는 약 90 개 이상의 뉴클레오티드, 더 흔히는 약 120 개 이상의 뉴클레오티드, 더 흔히는 약 150 개 이상의 뉴클레오티드, 더 흔히는 약 180 개 이상의 뉴클레오티드, 더 흔히는 약 210 개 이상의 뉴클레오티드, 더 흔히는 약 240 개 이상의 뉴클레오티드, 더 흔히는 약 270 개 이상의 뉴클레오티드, 더 흔히는 약 300 개 이상의 뉴클레오티드, 더 흔히는 약 450 개 이상의 뉴클레오티드, 더 흔히는 약 600 개 이상의 뉴클레오티드, 더 흔히는 약 900 개 이상의 뉴클레오티드 또는 그 이상이다.

본원에서 확인된 PRO230, PRO216 또는 PRO302 코딩 핵산 서열에 대한 "핵산 서열 동일성 (%)"은 특정 PRO 핵산 서열과 후보 서열을 정렬시키고, 필요한 경우 최대치(%)의 서열 동일성을 얻기 위해 갭을 도입한 후 PRO230, PRO216 또는 PRO302 핵산 서열의 뉴클레오티드와 동일한, 후보 서열의 뉴클레오티드의 비율로서 정의된다. 핵산 서열 동일성 (%)을 측정하기 위한 정렬은 당업계에 공지된 다양한 방법, 예를 들어 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 달성할 수 있다. 그러나, 본원의 목적을 달성하기 위해, 핵산 서열 동일성 값 (%)은 후술되는 바와 같이 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 이용하여 얻을 수 있는데, 상기 ALIGN-2 프로그램에 대한 완전한 원시 코드는 도 8a 내지 8q에 기재되어 있다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨텍, 인크사가 개발하였으며, 도 8a 내지 8q에 나타낸 원시 코드는 미국 저작권청 (20559 워싱톤 D.C. 소재)의 사용자 문서로 보관되어 있는데, 상기 코드는 미국 저작권 등록 제 TXU510087호 하에 등록되어 있다. ALIGN-2프로그램은 제넨텍, 인크사 (캘리포니아주 사우스 샌 프란시스코 소재)를 통해 공개적으로 이용가능하거나, 도 8a 내지 8q에 기재된 원시 코드로부터 편집될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 UNIX 작동계, 바람직하게는 디지탈 UNIX V4.0D에서 편집되어 이용될 수 있다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램으로 설정하고 변하지 않는다.

본원의 목적상, ALIGN-2가 핵산 서열 비교를 위해 사용되는 경우, 주어진 핵산 서열 D에, D와, 또는 D에 대한 주어진 핵산 서열 C의 핵산 서열 동일성 (%)(주어진 핵산 서열 D에, D와, 또는 D에 대한 일정한 핵산 서열 동일성 (%)을 갖거나 포함하는 주어진 핵산 서열 C로 달리 표현할 수 있음)은 하기와 같이 계산한다:

W/Z ×100

여기서, W는 C와 D의 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의해 동일하게 매치되는 것으로 기록되는 뉴클레오티드의 수이고, Z는 D에서 총 뉴클레오티드수이다. 핵산 서열 C의 길이가 핵산 서열 D의 길이와 같지 않는 경우, D에 대한 C의 핵산 서열 동일성 (%)은 C에 대한 D의 핵산 서열 동일성 (%)과 같지 않음을 인지해야 할 것이다. 핵산 서열 동일성 계산의 예로서, 도 7c 및 7d는 "PRO-DNA"로 지칭하는 핵산 서열에 대한 "비교 DNA"로 지칭하는 핵산 서열의 핵산 서열 동일성 (%)을 계산하는 방법을 나타낸다.

달리 구체적으로 언급하지 않는 한, 본원에 이용된 모든 핵산 서열 동일성 값 (%)은 바로 앞선 단락에 기재된 바와 같이 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 이용하여 얻는다. 그러나, 핵산 서열 동일성 (%)은 서열 비교 프로그램 NCBI-BLAST2를 이용하여 계산할 수도 있다 [Altschul et al.,Nucleic Acids Res.25: 3389-3402 (1997)]. 상기 NCBI-BLAST2 서열 비교 프로그램은 웹 사이트 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov.)로부터 다운로드 받을 수 있다. NCBI-BLAST2는 여러 가지 검색 파라미터를 이용하는데, 이러한 모든 검색 파라미터는 예를 들어, 언마스크 = 예, 가닥 = 모두, 기대 발생 = 10, 최소 저복합성 길이 = 15/5, 다중-통과 e-값 = 0.01, 다중-통과에 대한 상수 = 25, 최종 갭 정렬에 대한 드롭오프 = 25 및 점수 매트릭스 = BLOSUM62를 포함하는 디폴트값으로 설정된다.

NCBI-BLAST2가 핵산 서열 비교에 사용되는 경우, 주어진 핵산 서열 D에, D와, 또는 D에 대한 주어진 핵산 서열 C의 핵산 서열 동일성 (%)(주어진 핵산 서열 D에, D와, 또는 D에 대한 일정한 핵산 서열 동일성 (%)을 갖거나 포함하는 주어진 핵산 서열 C로 달리 표현할 수 있음)은 하기와 같이 계산한다:

W/Z ×100

여기서, W는 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램 NCBI-BLAST2에 의해 동일하게 매치되는 것으로 기록되는 뉴클레오티드의 수이고, Z는 D에서 총 뉴클레오티드수이다. 핵산 서열 C의 길이가 핵산 서열 D의 길이와 같지 않는 경우, D에 대한 C의 핵산 서열 동일성 (%)은 C에 대한 D의 핵산 서열 동일성 (%)과 같지 않음을 인지해야 할 것이다.

또한, 핵산 서열 동일성 값(%)은 WU-BLAST-2 컴퓨터 프로그램 [Altschul et al.,Methods in Enzymology 266: 460-80 (1996)]을 이용하여 얻는다. WU-BLAST-2 검색 파라미터 대부분은 디폴트값으로 설정한다. 디폴트값으로 설정되지 않은, 즉조정가능한 파라미터는 다음 값으로 설정되었다: 오버랩 스팬 = 1, 오버랩 분획 = 0.125, 워드 한계 (T) = 11, 및 점수 매트릭스 = BLOSUM62. 본원의 목적을 달성하기 위해, 핵산 서열 동일성 값(%)은 (a) 천연 PRO 폴리펩티드-코딩 핵산으로부터 유도된 서열을 갖는 당해 PRO 폴리펩티드 코딩 핵산 분자의 핵산 서열과 비교되는 핵산 분자 (즉, 당해 PRO 폴리펩티드 코딩 핵산 분자와 비교되는 서열로서 PRO 변이체 폴리뉴클레오티드일 수 있음)과의 사이에 매치되는 동일한 뉴클레오티드의 수를 WU-BLAST-2로 얻은 후 이를 (b) 당해 PRO 폴리펩티드 코딩 핵산 분자의 총 뉴클레오티드수로 나누어 얻는다. 예를 들어, 핵산 서열 B와 80% 이상의 핵산 서열 동일성을 갖는 핵산 서열 A를 포함하는 단리된 핵산 분자"라는 말에서, 핵산 서열 A는 비교하는 당해 핵산 분자의 서열이고 핵산 서열 B는 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 당해 핵산 분자의 핵산 서열이다.

다른 실시태양에서 PRO230, PRO216 또는 PRO302 변이체 폴리뉴클레오티드는 도 2 (서열 2), 도 4 (서열 7) 또는 도 6 (서열 12)의 전장의 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 혼성화할 수 있는 (바람직하게는 엄격한 혼성화 및 세척 조건에서) 활성 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자이다. PRO230, PRO216 또는 PRO302 변이체 폴리펩티드는 PRO 변이체 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 것일 수 있다.

상기한 바와 같이 수행되는 아미노산 서열 상동성 비교와 관련하여, 용어 "양성"은 동일하지는 않으나 성질이 유사한 성질을 갖는 비교되는 서열의 잔기를 의미한다. 당해 아미노산 잔기의 양성 값을 기록한 아미노산 잔기는 당해 아미노산잔기와 동일하거나 목적 아미노산 잔기가 바람직한 치환 (표 1 참조에 정의됨)된 것이다.

본원의 목적상, 주어진 아미노산 서열 B에, B와, 또는 B에 대한 주어진 아미노산 서열 A의 양성값 (%)(주어진 아미노산 서열 B에, B와, 또는 B에 대한 일정한 양성값 (%)을 갖거나 포함하는 주어진 아미노산 서열 A로 달리 표현할 수 있음)은 하기와 같이 계산한다:

X/Y ×100

여기서, X는 A와 B의 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의해 상기에서 정의된 양성값을 기록하는 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B에서 아미노산 잔기의 총 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 같지 않는 경우, B에 대한 A의 양성값 (%)은 A에 대한 B의 양성값 (%)과 같지 않음을 인지해야 할 것이다.

본원에 개시된 다양한 폴리펩티드를 기술하기 위해 사용된 "단리된"은 폴리펩티드가 동정되고, 그 자연 환경 요소로부터 분리 및(또는) 회수되었음을 의미한다. 바람직하게, 단리된 폴리펩티드는 자연에 결합된 모든 성분과 결합되지 않은 상태이다. 폴리펩티드의 자연 환경의 오염 요소는 이 폴리펩티드의 진단 또는 치료적 사용을 일반적으로 방해하는 물질로서, 효소, 호르몬 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질 등이 포함될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 (1) 스피닝컵 서열분석기를 사용하여 N 말단 또는 내부 아미노산 서열의 15개 이상의 잔기를 얻기에 충분한 정도로 정제되거나, 또는 (2) 쿠마시 블루 또는 바람직하게는 은 염색을 사용하여 비환원 또는 환원 조건 하에 SDS-PAGE에서 하나의 밴드만 나타날 정도로 정제될 수 있다. PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드 자연 환경의 요소가 하나 이상 존재하지 않을 것이기 때문에 단리된 폴리펩티드는 재조합 세포 내에 존재하는 폴리펩티드를 포함한다. 그러나, 통상 단리된 폴리펩티드는 하나 이상의 정제 단계에 의해 얻어질 것이다.

"단리된" PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드 코딩 핵산 또는 "단리된" 항 PRO230, 항 PRO216 또는 항 PRO302 항체 코딩 핵산이란 PRO230, PRO216 또는 PRO302 코딩 핵산의 천연 출처에서 통상적으로 결합되는 하나 이상의 오염 핵산 분자로부터 동정 및 분리된 핵산 분자라는 의미이다. 단리된 PRO230, PRO216 또는 PRO302 코딩 핵산 분자 또는 항 PRO230, 항 PRO216 또는 항 PRO302 코딩 핵산 분자는 자연에서 발견되는 형태 또는 상태와 다르게 존재한다. 따라서, 단리된 핵산 분자는 천연 세포에 존재하는 PRO230, PRO216 또는 PRO302 코딩 핵산 분자 또는 항 PRO230, 항 PRO216 또는 항 PRO302 코딩 핵산 분자와 구별된다. 그러나, 예를 들어, 천연 세포와 상이한 염색체 위치에 존재하며 통상적으로 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드 또는 항 PRO230, 항 PRO216 또는 항 PRO302 항체를 발현하는 세포에 함유된 PRO230, PRO216 또는 PRO302 코딩 핵산 분자 또는 항 PRO230, 항 PRO216 또는 항 PRO302 코딩 핵산 분자는 단리된 단리된 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드 코딩 핵산 분자 또는 항 PRO230, 항 PRO216 또는 항 PRO302 항체 코딩 핵산 분자에 포함된다.

용어 "조절 서열"이란 특정 숙주 유기체에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필요한 DNA 서열이다. 원핵생물에 적절한 조절 서열로는 예컨데 프로모터, 경우에 따라 오퍼레이터 서열, 및 리보솜 결합 부위를 들 수 있다. 진핵세포는 프로모터, 폴리아데닐화 시그날 및 인핸서를 이용하는 것으로 알려져 있다.

핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결"된다. 예를 들면, 전서열 또는 분비 리더 (leader)의 DNA는 해당 폴리펩티드가 분비되기 전의 형태인 전단백질로서 발현되는 경우 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드의 DNA에 작동가능하게 연결되고, 프로모터 또는 인핸서는 폴리펩티드 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되며, 리보솜 결합 부위는 번역을 촉진하도록 배치될 때 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로 "작동가능하게 연결된"은 연결될 DNA 서열들이 인접하여 위치함을 의미하며, 분비 리더의 경우 인접하여 위치할 뿐만 아니라 동일한 리딩 프레임 내에 존재하는 것을 의미한다. 그러나 인핸서는 인접하여 위치할 필요가 없다. 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션에 의해 달성된다. 이러한 부위가 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커를 통상적인 관행에 따라 사용한다.

혼성화 반응의 "엄격도"는 당업자가 용이하게 결정할 수 있으며, 일반적으로 프로브 길이, 세척 온도, 염 농도에 따라 달라지는 실험적 계산값이다. 일반적으로 보다 긴 프로브일수록 적절한 어닐링에 보다 높은 온도를 필요로하며, 보다 짧은 프로브일수록 보다 낮은 온도를 필요로 한다. 혼성화는 일반적으로 상보적 가닥이 자신들의 용융 온도보다 낮은 환경에 존재할 때 재어닐링되는 변성된 DNA의 능력에 따라 달라진다. 프로브와 혼성화가능한 서열 사이의 원하는 상동성의 정도가 높을수록, 사용할 수 있는 상대적인 온도가 높아진다. 따라서, 상대적 온도보다 높아질수록 반응 조건은 더욱 엄격해지는 반면, 상대적 온도가 낮을수록 반응조건은 덜 엄격해진다. 혼성화 반응의 엄격도와 관련한 더 자세한 정보 및 설명은 문헌 [Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers (1995)]을 참조한다.

본원에서 정의되는 "엄격 조건" 또는 "엄격도가 높은 조건"이란 (1) 세척시 이온 세기가 낮고 온도가 높은 조건, 예를 들면 50 ℃에서 0.015 M 염화나트륨/0.0015 M 시트르산나트륨/0.1 % 소듐 도데실 술페이트를 사용하는 조건, 또는 (2) 혼성화시에 포름아미드, 예를 들어 42 ℃, 750 mM 염화나트륨, 75 mM 시트르산나트륨이 함유된 50 mM 인산나트륨 완충액 (pH 6.5)/0.1 % 소혈청 알부민/0.1 % 피콜/0.1 % 폴리비닐피롤리돈으로 제조한 50 % (부피/부피) 포름아미드와 같은 변성제를 사용하는 조건, (3) 50 % 포름아미드, 5 x SSC (0.75 M NaCl, 0.075 M 시트르산나트륨), 50 mM 인산나트륨 (pH 6.8), 0.1 % 피로인산 나트륨, 5 x Denhardt's 용액, 초음파처리된 연어 정자 DNA (50 ㎍/ml), 0.1 % SDS, 및 10 % 덱스트란 술페이트를 42 ℃에서 사용하고, 42 ℃에서 0.2 x SSC (염화나트륨/시트르산나트륨), 그리고 55 ℃에서 50 % 포름아미드로 세척하며, 55 ℃에서 EDTA가 함유된 0.1 x SSC를 이용한 고엄격 세척을 수행하는 것이다.

"중간정도의 엄격 조건"이란 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press (1989)]에 기재된 바와 같고, 상기한 것보다 엄격성이 낮은 혼성화 조건 (예를 들어 온도, 이온 세기 및%SDS)의 이용을 말한다. 중간정도의 엄격 조건의 예는 20% 포름아미드, 5 x SSC (150 mM 염화나트륨, 15 mM 시트르산삼나트륨), 50 mM 인산나트륨 (pH 7.6), 5 x Denhardt 용액, 10% 덱스트란 술페이트 및 20 mg/ml의 잘린 연어 정액 변성 DNA를 포함하는 용액 중에서 37℃로 밤새 인큐베이션한 후 필터를 약 37 내지 50℃에서 1 x SSC로 세척하는 조건이다. 당업계의 숙련가는 프로브 길이 등과 같은 인자에 맞추기 위해 필요한 온도, 이온 세기 등을 조절하는 방법을 잘 알 것이다.

본원에 사용된 "에피토프 태그가 부가된"란 용어는 "태그 폴리펩티드"에 융합된 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드를 포함하는 키메라 폴리펩티드를 지칭한다. "태그 폴리펩티드"가 만들어질 수 있을 정도의 에피토프를 제공하기에 충분한 잔기를 갖지만 융합되는 폴리펩티드의 활성을 방해하지 않을 정도로 충분히 짧다. 태그 폴리펩티드는 아주 독특해서 자신에 대한 항체가 다른 에피토프와는 실질적으로 가교반응하지 않는 것이 바람직하다. 적절한 태그 폴리펩티드는 일반적으로 6개 이상의 아미노산 잔기를 가지며, 통상 약 8 내지 50개의 아미노산 잔기를 갖는다 (바람직하게는 약 10 내지 20개의 잔기).

본원에서 사용된 "활성의" 또는 "활성"은 천연 또는 자연발생 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드의 생물학적 및(또는) 면역학적 활성을 보유하는 PRO230, PRO216 또는 PRO302 단백질의 형태(들)을 언급한다.

본원에 개시된 스크리닝 분석법에 의해 확인된 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드를 길항하는 분자 (예, 유기 또는 무기의 소분자, 펩티드 등)에 있어서 "생물학적" 활성이란 본원에서 동정된 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드에결합하거나 복합체를 형성하는 상기 분자가 다른 세포 단백질과 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드의 상호작용을 방해하거나, PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드의 전사 또는 번역을 억제할 수 있는 능력을 언급하는데 사용된다. 특히, 바람직한 생물학적 활성에는 심비대증, 혈관에 영향을 주는 전신성 질환, 예를 들어 동맥, 모세혈관 정맥 및(또는) 림프관 질환 및 암에 작용하는 활성이 포함된다.

용어 "길항제"는 가장 넓은 의미로 사용되며, 본원에 개시된 천연 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드의 하나 이상의 생물학적 활성, 예를 들어 적용 가능한 경우 분열촉진 또는 혈관형성 활성을 부분적으로 또는 완전히 차단, 억제 또는 중화시키는 모든 분자를 통칭한다. PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드의 길항제는 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드의 세포 수용체에 대한 결합을 방해하거나, PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드에 의해 활성화되는 세포를 불활성화 또는 사멸시키거나, PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드의 세포 수용체와의 결합 후 혈관 내피 세포 활성화를 방해함으로써 작용을 할 수 있다. PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드의 길항제에 의한 모든 개입은 본 발명의 목적에 해당하는 것으로 간주될 것이다. 길항제는 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드의 분열촉진, 혈관형성 또는 다른 생물학적 활성을 억제하고, 이에 따라 바람직하지 않은 과도한 신생 혈관형성의 특징을 갖는 질병 및 질환, 예를 들어 종양, 특히 충실성 악성 종양, 류마티스성 관절염, 건선, 아테롬성경화증, 당뇨성 및 다른 망막병증, 수정체 후부섬유증식증, 노화 관련 황반 변성, 신생 혈관 녹내장, 혈관종, 갑상선 과형성 (그레이브병 포함), 각막 및 기타 조직의 이식 및 만성 염증의 치료에 유용하다. 또한, 길항제는 바람직하지 않은 과도한 혈관 투과성의 특징을 갖는 질병 또는 질환, 예를 들어 뇌종양과 관련된 부종, 악성 종양과 관련된 복수증, 메이그 증후군, 폐렴, 신증후군, 심낭삼출 (예를 들어, 심낭염과 관련) 및 심막삼출의 치료에 유용하다. 이와 비슷하게 용어 "아고니스트"도 가장 넓은 의미로 사용되며, 천연 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드의 생물학적 활성을 모방하는 모든 분자를 통칭한다. 적절한 아고니스트 또는 길항제 분자로는 구체적으로 아고니스트 또는 길항제의 항체 또는 항체의 단편, 천연 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드의 단편 또는 아미노산 서열 변이체, 펩티드, 작은 유기분자 등을 들 수 있다.

"소분자 (작은 분자)"는 본원에서 분자량이 약 500 달톤 이하인 것으로 정의된다.

본원에서 사용되는 용어 "PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드 수용체"는 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드에 대한 세포 수용체, 혈관 내피 세포에서 통상적으로 발견되는 세포 표면 수용체 및 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드에 결합할 수 있는 그의 변이체를 언급한다.

"항체(Ab) 및 면역노글로불린(Ig)"은 동일한 구조 특성을 갖는 당단백질이다. 항체는 특이 항원에 특이적으로 결합하는 반면, 면역글로불린은 항체 및 항원 특이성이 없는 다른 항체 유사 분자 모두를 포함한다. 면역글로불린 등의 폴리펩티드는 예를 들어 림프계에 의해 낮은 수준으로 생성되며 골수종에 의해 수준이 증가한다. 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되며, 구체적으로는 완전한 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 2개 이상의 완전한 항체에 의해 형성되는 다중특이성 항체 (예를 들어, 이중특이성 항체) 및 목적하는 생물학적 활성을 나타낸다면 항체 단편까지 어떠한 제한없이 포함한다.

"천연 항체" 및 "천연 면역글로불린"은 일반적으로 2개의 동일한 경쇄(L) 및 2개의 동일한 중쇄(H)로 구성되는 약 150,000 달톤의 헤테로테트라머의 당단백질이다. 각각의 경쇄는 하나의 디술피드 공유결합에 의해 중쇄에 연결되고, 디술피드 결합의 개수는 중쇄의 상이한 면역글로불린 이소형에 따라 다르다. 또한, 각각의 중쇄 및 경쇄는 규칙적 간격으로 쇄내의 디술피드 결합을 갖는다. 각각의 중쇄는 한 말단에 가변 도메인(V_H) 및 이 도메인에 연결되는 다수의 불변 도메인을 갖는다. 각각의 경쇄는 한 말단에 가변 도메인 (V_L) 및 다른 말단에 불변 도메인을 갖고, 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 제1 불변 도메인과 일렬로 배열되고, 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 일렬로 배열된다. 특정 아미노산 잔기들이 경쇄와 중쇄 가변 도메인 사이의 계면을 형성하는 것으로 생각된다.

용어 "가변"은 항체들 간에 가변 도메인의 특정 부분의 서열이 크게 상이하고 특정 항원에 대한 각각의 특정 항체의 결합 및 특이성에 사용되는 것으로 생각된다. 그러나, 가변성은 항체의 가변 도메인 전체에 균일하게 분포되지 않는다. 가변성은 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 모두의 상보성 결정 영역 (CDR) 또는 과가변 영역으로 불리는 3개의 세그먼트에 집중된다. 가변 도메인에서 보존도가 매우 높은 부분은 프레임워크 영역 (FR)이라 지칭한다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 β-시트 구조를 연결하거나 경우에 따라 그 구조의 일부를 형성하는 루프를 형성하는 3개의 CDR에 의해, 주로 β-시트의 배열를 선택하는 4개의 프레임워크 영역을 포함한다. 각 쇄 내의 CDR은 FR 영역에 의해 서로 매우 근접하게 유지되고, 다른 쇄의 CDR과 함께 항체의 항원 결합 부위의 형성에 기여한다 (Kabat et al.,NIH Publ. No. 91-3242, Vol. I, pages 647-669 (1991) 참조). 불변 도메인은 항체의 항원 결합시에 직접 관여하지 않지만, 여러 이펙터 기능, 예를 들어 항체 의존성 세포독성에서 항체의 관여하는 기능을 보인다.

"항체 단편"은 완전한 항체의 일부, 바람직하게는 완전한 항체의 항원 결합 영역 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예로는 Fab, Fab', F(ab')₂및 Fv 단편, 디아바디, 선형 항체 [Zapata et al.,Protein Eng.8(10): 1057-1062 (1995)] 단일쇄 항체 분자 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이성 항체 등이 있다.

항체를 파파인 분해하면 2개의 동일한 항원 결합 단편, 즉 항원 결합 부위를 하나씩 갖는 "Fab" 단편, 및 쉽게 결정화되는 능력을 반영하여 이름 붙여진 나머지 "Fc" 단편이 생성된다. 펩신을 처리하면, 2개의 항원 결합 부위를 가지며 여전히 항원에 교차결합할 수 있는 F(ab')₂단편이 생성된다.

"Fv"는 완전한 항원 인식 및 항원 결합 부위를 포함하는 최소 항체 단편이다. 이 영역은 단단하게 비공유결합된 하나의 중쇄 가변 도메인과 하나의 경쇄 가변 도메인으로 이루어진 이량체로 구성된다. 결론적으로 보면, 6개의 CDR이 항체에 항원 결합 특이성을 부여한다. 그러나, 단일 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 단지 3개의 CDR만을 포함하는 Fv의 절반) 조차도 전체 결합 부위보다 친화성은 낮지만 항원을 인식하여 항원에 결합하는 능력을 갖는다.

또한, Fab 단편은 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인(CH1)을 함유한다. Fab 단편은 항체 힌지 (Hinge) 영역으로부터 유래한 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카르복시 말단에 몇 개의 잔기가 첨가되었다는 점에서 Fab 단편은 Fab' 단편과 상이하다. 본원에서 Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)이 유리 티올기를 보유하는 Fab'를 지칭한다. F(ab')₂항체 단편은 본래 그들 사이에 힌지 시스테인이 있는 몇쌍의 Fab' 단편으로 생성되었다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링도 공지되었다.

임의의 척추동물종으로부터 유래한 항체 (면역글로불린)의 "경쇄"는 그의 불변 도메인의 아미노산 서열을 기초로 하여 카파 (κ) 및 람다 (λ)로 지칭되는 2개의 명백하게 상이한 타입 중의 하나로 분류될 수 있다.

중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 면역글로불린은 상이한 클래스로 분류될 수 있다. 면역글로불린에는 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM의 5개의 주요 클래스가 존재하고, 이들 중 몇 개는 서브클래스(이소형), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA 및 IgA2로 추가 분류될 수 있다. 면역글로불린의 상이한 클래스에 해당하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 지칭된다. 상이한 면역글로불린의 서브유닛 구조 및 3차원 배열은 공지되어 있다.

본원에서 사용되는 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 동종 항체들의 집단으로부터 얻은 항체, 즉, 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연발생적 돌연변이를 제외한, 한 집단을 이루는 동일한 개별 항체를 의미한다. 모노클로날 항체는 매우 특이적이며 단일 항원 부위에 대한 것이다. 또한, 통상적으로 다른 결전인자 (에피토프)에 대한 다른 항체를 포함하는 통상의 항체 (폴리클로날 항체) 제조와는 반대로, 각 모노클로날 항체는 항원에 대한 단일 결정인자에 대한 것이다. 이들에 대한 특이성 외에도, 모노클로날 항체는 하이브리도마 배양에 의해 합성되며, 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않는다는 장점을 갖는다. 수식어 "모노클로날"은 실질적으로 동종의 항체군으로부터 수득된 폴리펩티드 사슬 (V_H-V_L)인 항체의 특성을 나타낸다. 예를 들어, 본 발명에서 사용된 모노클로날 항체는 문헌 [Kohler et al.,Nature,256: 495 (1975)]에 최초로 기재된 하이브리도마법 또는 재조합 DNA 방법 [미국 특허 제 4,816,567호]에 의해 제조될 수 있다. 또한, "모노클로날 항체"는 예를 들어 문헌 [Clackwon et all.,Nature,352: 624-628 (1991) 및 Marks et al.,J. Mol. Biol.,222: 581-597 (1991)]에 개재된 기술을 이용하여 파아지 항체 라이브러리로부터 단리할 수 있다.

본원에서의 모노클로날 항체는 구체적으로, 목적하는 활성을 발휘한다면 중쇄 및(또는) 경쇄의 일부분은 특별한 종으로부터 유래된 항체 또는 특별한 항체군 또는 서브클래스에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 유사하지만, 쇄(들)의 나머지는 다른 종으로부터 유래된 항체 또는 다른 항체군 또는 서브클래스에 속하는 항체 또는 그러한 항체의 단편과 동일하거나 유사한 "키메라" 항체(면역글로불린)를 포함한다 [미국 특허 제4, 816, 567호; Morrison et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,81: 6851-6855 (1984)].

비-인간 (예를 들어, 쥐과 동물) 항체의 "인간화" 형태는 비-인간 면역글로불린으로부터 유도된 최소 서열을 포함하는 키메라 면역글로불린, 면역글로불린 쇄 또는 그의 단편 (예를 들어, Fv, Fab, Fab', F(ab')₂또는 항체의 다른 항원 결합 작은 서열)이다. 대부분의 경우 인간화 항체는 수여자의 상보성 결정 영역 (CDR)의 잔기를 원하는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 마우스, 랫트 또는 토끼와 같은 인간 이외의 종 (공여자 항체)의 CDR로부터의 잔기로 치환시킨 인간 면역글로불린 (수용자 항체)을 포함한다. 몇몇 경우에, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 잔기는 대응하는 비-인간 잔기에 의해 치환된다. 또한, 인간화 항체는 수여 항체에서도 또는 도입되는 CDR 또는 프레임워크 서열에서도 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 하나 이상, 일반적으로 둘 이상의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역은 비-인간 면역글로불린의 영역에 대응하며, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 면역글로불린 컨센서스 서열의 영역에 해당한다. 또한, 인간화 항체는 면역글로불린 불변 영역 (Fc)의 적어도 일부, 일반적으로 인간 면역글로불린 영역의 적어도 일부를 포함할 것이다 [Jones et al.,Nature,321: 522-525 (1986); Riechmann et al.,Nature,332: 323-329 (1988); 및 Presta,Curr. Op. Struct.Biol. 2: 593-596 (1992)]. 인간화 항체는 항체의 항원 결합 영역이 짧은 꼬리 원숭이를 원하는 항원으로 면역시켜 생산된 항체로부터 유도된 PRIMATIZED^TM항체를 포함한다.

"단일 쇄 Fv" 또는 "sFv" 항체 단편은 단일 폴리펩티드 쇄에 존재하는 항체의 V_H및 V_L도메인을 포함한다. 바람직하게는, Fv 폴리펩티드는 sFv가 항원 결합에 필요한 구조를 형성하도록 하는 V_H및 V_L도메인 사이에 폴리펩티드 링커도 포함한다. sFv에 관해서는 문헌 [Pluckthun inThe Pharmacology of Monoclonal Antibodies,vol. 113, Rosenburg 및 Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)]을 참조한다.

"디아바디(diabody)"라 함은 동일한 폴리펩티드 쇄 (V_H-V_L) 내에 경쇄 가변 도메인(V_L)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (V_H)을 포함하는, 2개의 항원 결합 부위가 있는 작은 항체 단편을 말한다. 동일한 쇄에 있는 2개의 도메인을 페어링시키기에는 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 도메인을 다른 쇄의 상보성 도메인과 강제로 페어링시켜 2개의 항원 결합 부위를 생성시킨다. 디아바디는 예를 들어, 유럽 특허 제404,097호, 국제 공개 제93/11611호 및 Hollinger et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,90: 6444-6448 (1993)에 보다 상세하게 기재되어 있다.

"단리된" 항체란 자신의 천연 환경의 요소로부터 확인 및 분리 및(또는) 회수된 항체이다. 그의 천연 환경의 오염 요소는 항체의 진단 또는 치료적 사용을방해하는 물질로서, 효소, 호르몬 및 다른 단백성 또는 비단백성 용질을 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 항체는 (1) 로우리(Lowry) 방법에 의해 측정시 95 중량% 초과, 가장 바람직하게는 99 중량% 초과의 항체로, 또는 (2) 스피닝 컵(spinning cup) 서열분석기를 사용하여 N 말단 또는 내부 아미노산의 잔기 15개 이상을 수득하기에 충분한 정도로, 또는 (3) 쿠마시 블루, 또는 바람직하게는 은 염색을 사용하여 환원 또는 비환원 조건 하에 SDS-PAGE에 의해 하나의 밴드로 정제될 것이다. 단리된 항체는 그 항체의 천연 환경의 하나 이상의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문에, 재조합 세포 내의 원위치에서의 항체를 포함한다. 그러나, 단리된 항체는 일반적으로 하나 이상의 정제 단계에 의해 정제될 것이다.

"표지 (label)"는 이 명세서에 사용될 때, 항체에 직간접적으로 접합되어 "표지된" 항체를 생성시키는 검출가능한 화합물 또는 조성물을 말한다. 표지는 그 자체로 (방사성동위원소 표지 또는 형광 표지) 검출될 수 있거나, 효소 표지인 경우에는 검출가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변경을 촉매할 수 있다.

"고상 (solid phase)"은 본 발명의 항체가 부착될 수 있는 비수성 매트릭스를 의미한다. 고상의 예는 부분적으로 또는 완전하게 형성된 유리 (예를 들어 세공 조절된 유리), 폴리사카라이드 (예를 들어 아가로스), 폴리아크릴아미드, 폴리스티렌, 폴리비닐 알콜 및 실리콘 등이 있다. 특정 실시양태에서, 내용에 따라 고상은 분석 플레이트의 웰을 포함할 수 있으며, 다른 실시양태에서 고상은 정제 컬럼 (예를 들어 친화 크로마토그래피 컬럼)이다. 이 용어는 또한 미국 특허 제4,275,149호에 기재된 것과 같은 별개 입자의 비연속적 고상도 포함한다.

"리포좀"은 약물 (예를 들어 본원에서 개시된 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드 또는 이에 대한 항체)을 포유동물에게 전달하는 데 유용한 여러 형태의 지질, 인지질 및(또는) 계면활성제로 이루어진 작은 베지클 (vesicle)이다. 리포좀의 성분들은 통상적으로 생체막의 지질 정렬과 유사하게 이중층 형태로 정렬된다.

본원에 사용된 용어 "면역어드헤신"은 면역글로불린 불변 도메인의 이펙터 기능과 이종 단백질 ("어드헤신")의 결합 특이성을 겸비한 항체 유사 분자를 지칭한다. 구조적으로 보면 면역어드헤신은 항체의 항원 인식 및 결합 부위가 아닌(즉, 이종의), 원하는 결합 특이성을 갖는 아미노산 서열과 면역글로불린 불변 도메인 서열의 융합체를 포함한다. 면역어드헤신 분자의 어드헤신 부분은 전형적으로 적어도 수용체 또는 리간드의 결합 부위를 포함하는 인접 아미노산 서열이다. 면역어드헤신 중 면역글로불린 불변 도메인 서열은 IgG-1, IgG-2, IgG-3, IgG-4 서브타입, IgA (IgA-1 및 IgA-2 포함), IgE, IgD 또는 IgM과 같은 임의의 면역글로불린으로부터 얻을 수 있다.

II. 본 발명의 조성물 및 방법

A. PRO230, PRO216 또는 PRO302 변이체

본원에서 설명되는 전장 천연 서열 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드 외에, PRO 변이체를 제조할 수 있는 것으로 생각된다. PRO230, PRO216 또는 PRO302 변이체는 적합한 뉴클레오티드 변화를 PRO230, PRO216 또는 PRO302 DNA에 도입하고(하거나) 목적 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드의 합성에 의해 제조할 수 있다. 당업자라면 글리코실화 부위의 수 또는 위치의 변경 또는 멤브레인 앵커링 특성의 변화와 같은 아미노산 변화가 RPO의 번역후 프로세싱을 변경시킬 수 있다는 것을 이해할 것이다.

본원에서 설명되는 전장 천연 서열 PRO230, PRO216 또는 PRO302 또는 PRO230, PRO216 또는 PRO302의 여러 도메인에서의 변이는 예를 들어 미국 특허 제5,364,934호에 개시된 보존적 및 비보존적 돌연변이 기술 및 지침을 사용하여 제조할 수 있다. 변이는 천연 서열 PRO와 비교시에 PRO230, PRO216 또는 PRO302의 아미노산 서열을 변화시키는, PRO230, PRO216 또는 PRO302를 코딩하는 하나 이상의 코돈의 치환, 결실 또는 삽입일 수 있다. 임의로, 변이는 PRO230, PRO216 또는 PRO302의 하나 이상의 도메인 내의 하나 이상의 아미노산을 임의 다른 아미노산으로 치환함으로써 생성된다. 목적 활성에 유해한 효과를 주지 않으면서 삽입, 치환 또는 결실될 수 있는 아미노산 잔기는 PRO230, PRO216 또는 PRO302의 서열을 공지의 상동 단백질 분자의 서열과 비교하고 상동성이 높은 영역에서 생성된 아미노산 서열 변화의 수를 최소화함으로써 결정할 수 있다. 아미노산 치환은 하나의 아미노산을 유사한 구조 및(또는) 화학적 특성을 갖는 다른 아미노산으로 치환, 예를 들어 루이신의 세린으로의 치환, 즉 아미노산의 보존적 치환의 결과일 수 있다. 삽입 또는 결실은 임의로 약 1 내지 5개의 아미노산에서 발생할 수 있다. 허용되는 변이는 서열 내에 아미노산을 체계적으로 삽입, 결실 또는 치환시키고, 전장 또는 성숙 천연 서열에 의해 나타나는 생성된 변이체의 활성을 시험함으로써 정할 수 있다.

구체적인 실시태양에서, 목적물의 보존적 치환은 바람직한 치환이라는 표제로 표 1에 나타내었다. 이러한 치환에 의해 생물학적 활성이 변화하는 경우, 하기 표 1에서 치환예로서 명명되거나 아미노산 종류에 대해서 하기에서 보다 상세하게 설명된 보다 실질적인 변화를 도입하고 생성물을 스크리닝하였다.

원래 잔기	치환체 예	바람직한 치환체
Ala (A)	val, leu, ile	val
Arg (R)	lys, gln, asn	lys
Asn (N)	gln, his, lys, arg	gln
Asp (D)	glu	glu
Cys (C)	ser	ser
Gln (Q)	asn	asn
Glu (E)	asp	asp
Gly (G)	pro, ala	ala
His (H)	asn, gln, lys, arg	arg
Ile (I)	leu, val, met, ala, phe,norleucine	leu
Leu (L)	norleucine, ile, valmet, ala, phe	Ile
Lys (K)	arg, gln, asn	arg
Met (M)	leu, phe, ile	leu
Phe (F)	leu, val, ile, ala, tyr	leu
Pro (P)	ala	ala
Ser (S)	thr	thr
Thr (T)	ser	ser
Trp (W)	tyr, phe	tyr
Tyr (Y)	trp, phe, thr, ser	phe
Val (V)	ile, leu, met, phe,ala, norleucine	leu

PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드의 기능 또는 면역학적 동일성의 실질적인 변형은 (a) 치환 영역에서의 폴리펩티드 백본의 구조를, 예를 들어 시트 또는 나선 형태로서 유지하거나, (b) 표적 부위에서의 분자의 하전 또는 소수성을 유지하거나, 또는 (c) 대부분의 측쇄를 유지하는 그의 효과를 상당히 변경시키는 치환을 선택함으로써 수행된다. 자연 발생 잔기는 공통적인 측쇄 특성에 따라 다음과 같은 군으로 구분된다:

(1) 소수성: norleucine, met, ala, val, leu, ile,

(2) 중성 친수성: cys, ser, thr,

(3) 산성: asp, glu,

(4) 염기성: asn, gln, his, lys, arg,

(5) 사슬 배향에 영향을 미치는 잔기: gly, pro 및

(6) 방향족; trp, tyr, phe.

비보존적 치환은 상기 한 종류의 구성 성분을 다른 종류의 것으로 교환시킬 것이다. 또한, 이렇게 치환되는 잔기는 보존적 치환 부위에 도입될 수 있거나 또는 보다 바람직하게는 나머지 (비보존) 부위에 도입될 수 있다.

변이는 올리고뉴클레오티드 매개 (위치 지정) 돌연변이 유발법, 알라닌 스캐닝법 및 PCR 돌연변이 유발법과 같은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제조할 수있다. 위치 지정 돌연변이 유발법 [Carter et al.,Nucl. Acids Res.,13: 4331 (1986); Zoller et al.,Nucl. Acids Res.,10: 6487 (1987)], 카세트 돌연변이 유발법 [Wells et al.,Gene,34:315 (1985)], 제한 선택 돌연변이 유발법 [Wells et al.,Philos. Trans. R. Soc. London SerA,317:415 (1986)] 또는 다른 공지의 기술을 클로닝된 DNA에 실시하여 본 발명의 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드 변이체 DNA를 제조할 수 있다.

또한, 스캐닝 아미노산 분석법을 사용하여 인접 서열을 따라 하나 이상의 아미노산을 확인할 수 있다. 바람직한 스캐닝 아미노산은 비교적 작은 중성 아미노산이다. 이러한 아미노산은 알라닌, 글리신, 세린 및 시스테인을 포함한다. 통상적으로, 알라닌은 베타-탄소 밖의 측쇄를 제거하고 변이체의 주쇄 배열을 변경시킬 가능성이 적기 때문에 바람직한 스캐닝 아미노산이다 [Cunningham and Wells,Science,244: 1081-1085 (1989)]. 또한, 알라닌은 통상적으로 가장 흔한 아미노산이기 때문에 바람직하다. 또한, 알라닌은 파묻힌 위치 및 노출된 위치 모두에서 빈번하게 발견된다 [Creighton,The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia,J. Mol. Biol.,150:1 (1976)]. 알라닌 치환이 적당한 양의 변이체를 생성시키지 않으면, 동배체(isoteric) 아미노산을 사용할 수 있다.

B. PRO230, PRO216 또는 PRO302의 변형

PRO230, PRO216 또는 PRO302의 공유결합 변형은 본 발명의 범위에 포함된다. 공유결합 변형의 한 형태는 PRO230, PRO216 또는 PRO302의 선택된 측쇄 또는 N 말단 또는 C 말단 잔기와 반응할 수 있는 유기 유도체화제와 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드의 표적 아미노산 잔기를 반응시키는 것을 포함한다. 이관능성 작용제를 사용한 유도체화는 예를 들어 항 PRO230, 항 PRO216 또는 항 PRO302 항체 정제 방법에 사용하기 위한 수불용성 지지체 매트릭스 또는 표면에 PRO230, PRO216 또는 PRO302를 가교결합시키거나 그 반대로 가교결합시키는데 유용하다. 통상 사용되는 가교결합제는 예를 들어 1,1-비스(디아조아세틸)-2-페닐에탄, 글루타르알데히드, N-히드록시숙신이미드 에스테르, 예를 들어 4-아지도살리실산과의 에스테르, 3,3'-디티오비스(숙신이미딜프로피오네이트)와 같은 디숙신이미딜 에스테르를 포함하는 동종이관능성 이미도에스테르, 비스-N-말레이미도-1,8-옥탄과 같은 이관능성 말레이미드 및 메틸-3[(p-아지도페닐)디티오]프로피오이미데이트와 같은 물질을 포함한다.

다른 변형은 글루타미닐 및 아스파라기닐 잔기의 각각 대응하는 글루타밀 및 아스파르틸 잔기로의 탈아미드화, 프롤린 및 리신의 히드록실화, 세릴 또는 트레오닐 잔기의 히드록실기의 인산화, 리신, 아르기닌 및 히스티딘 측쇄의 알파-아미노기의 메틸화[T.E. Creighton,Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86(1983)], N-말단 아민의 아세틸화 및 C-말단 카르복실기의 아미드화를 포함한다.

본 발명의 범위 내에 포함되는 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드의 공유결합 변형의 다른 유형에는 폴리펩티드의 천연 글리코실화 패턴의 변화를 포함한다. "천연 글리코실화 패턴의 변화"는 천연 서열 PRO230, PRO216 또는 PRO302에서 발견되는 하나 이상의 탄수화물 잔기의 결실(잠재적인 글리코실화 부위를 제거하거나 화학적 및(또는) 효소적 방법에 의해 글리코실화를 결실시킴으로써) 및(또는) 천연 서열 PRO230, PRO216 또는 PRO302에 존재하지 않는 하나 이상의 글리코실화 부위의 부가를 의미한다. 또한, 이 용어는 존재하는 다양한 탄수화물 잔기의 특성 및 비율의 변화를 비롯한 천연 단백질의 글리코실화에 있어 질적 변화를 포함한다.

PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드에 대한 글리코실화 부위의 부가는 아미노산 서열의 변화에 의해 달성될 수 있다. 변화는 예를 들어 천연 서열 PRO230, PRO216 또는 PRO302에 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기의 부가 또는 치환에 의해 이루어질 수 있다 (O-연결 글리코실화 부위의 경우). PRO230, PRO216또는 PRO302 아미노산 서열은 특히 목적 아미노산으로 번역되는 코돈을 생성시키도록 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 미리 선택된 염기에서 돌연변이시킴으로써 DNA 수준에서의 변화를 변화를 통하여 임의로 변화시킬 수 있다.

PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드 상의 탄수화물 잔기의 수를 증가시키는 다른 수단은 글리코시드를 폴리펩티드에 화학적으로 또는 효소에 의해 커플링시키는 것이다. 이러한 방법은 예를 들어 1987년 9월 11일 공개된 WO 87/05330 및 문헌 [Aplin and Wriston,CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981)]에 기재되어 있다.

PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드에 존재하는 탄수화물 잔기의 제거는 화학적으로 또는 효소에 의해 또는 글리코실화 표적으로 기능하는 아미노산 잔기를 코딩하는 코돈의 돌연변이에 의한 치환에 의해 달성될 수 있다. 화학적 탈글리코실화 기술은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Hakimuddin, et al.,Arch. Biochem. Biophys.,259:52 (1987) 및 Edge et al.,Anal. Biochem.,118:131(1981)]에 기재되어 있다. 폴리펩티드 상의 탄수화물 잔기의 효소에 의한 절단은 다양한 엔도글리코시다제 및 엑소글리코시다제를 사용하여 달성할 수 있다 [Thotakura et al.,Meth. Enzymol.,138: 350(1987)].

PRO230, PRO216 또는 PRO302의 공유결합 변형의 다른 종류는 미국 특허 제 4,640,835호, 제 4,496,689호, 제 4,301,144호, 제 4,670,417호, 제 4,791,192호 또는 제 4,179,337호에 기재된 방식으로 다양한 비단백질성 중합체, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리프로필렌 글리콜 또는 폴리옥시알킬렌 중의 하나에 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드를 연결시키는 것을 포함한다.

또한, 본 발명의 PRO230, PRO216 또는 PRO302는 다른 이종성 폴리펩티드 또는 아미노산 서열에 융합된 PRO230, PRO216 또는 PRO302를 포함하는 키메라 분자를 형성하는 방식으로 변형될 수 있다.

다른 실시태양에서, 이러한 키메라 분자는 항-태그 항체가 선택적으로 결합할 수 있는 에피토프를 제공하는 태그 폴리펩티드와 PRO230, PRO216 또는 PRO302의 융합체를 포함한다. 에피토프 태그는 일반적으로 PRO230, PRO216 또는 PRO302의 아미노 또는 카르복실 말단에 위치한다. 상기 에피토프 태그가 부가된 형태의 PRO의 존재는 태그가 부가된 폴리펩티드에 대한 항체를 사용하여 검출할 수 있다. 또한, 에피토프 태그를 도입하면 항-태그 항체 또는 에피토프 태그에 결합하는 다른 종류의 친화도 매트릭스를 사용한 친화도 정제에 의해 PRO230, PRO216 또는 PRO302를 용이하게 정제할 수 있다. 다양한 태그 폴리펩티드 및 이들의 각각의 항체는 당업계에 공지되어 있다. 그 예로는 폴리-히스티딘(poly-his) 또는 폴리-히스티딘-글리신 (poly-his-gly) 태그, flu HA 태그 폴리펩티드 및 그의 항체 12CA5 [Field et al.,Mol. Cell. Biol.,8:2159-2165 (1988)], c-myc 태그 및 이에 대한 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 및 9E10 항체 [Evan et al.,Molecular and Cellular Biology,5:3610-3636 (1985)], 및 단순포진 바이러스 당단백질 D (gD) 태그 및 그의 항체 [Paborsky et al.,Protein Engineering,3(6):547-553 (1990)]을 들 수 있다. 다른 태그 폴리펩티드는 Flag-펩티드 [Hopp et al.,BioTechnology,6:1204-1210 (1988)], KT3 에피토프 펩티드 [Martin et al.,Science,255:192-194 (1992)], 알파-튜불린 에피토프 펩티드 [Skinner et al.,J. Biol. Chem.,266:15163-15166 (1991)] 및 T7 유전자 10 단백질 태그 [Lutz-Freyermuth et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,87:6393-6397 (1990)]을 포함한다.

다른 실시태양에서, 키메라 분자는 PRO230, PRO216 또는 PRO302와 면역글로불린 또는 면역글로불린의 특정 영역의 융합체를 포함한다. 키메라 분자의 2가 형태 ("면역어드헤신"으로 언급하기도 함)의 경우, 융합체는 IgG 분자의 Fc 영역일 수 있다. 이 Ig 융합체는 바람직하게는 Ig 분자내 1개 이상의 가변성 영역의 부위를 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드의 가용성(결실 또는 실활화된 막횡단 도메인) 형태로 치환한 것을 포함한다. 특히 바람직한 실시태양에서, 면역글로불린 융합체는 IgG1 분자의 힌지, CH2 및 CH3, 또는 힌지, CH1, CH2 및 CH3 영역을 포함한다. 면역글로불린 융합체를 생산하는 방법으로는, 1995년 6월 27일 간행된 미국 특허 제5,428,130호를 참조한다.

C. PRO230, PRO216 또는 PRO302의 제조

본 발명은 본 출원에서 PRO230, PRO216 또는 PRO302로 명명된 폴리펩티드를 코딩하는 새로이 동정되고 단리된 뉴클레오티드 서열을 제공한다. PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA는 하기 실시예에서 상세한 설명에서 기재에 따라 동정되고 단리되었다. 별개의 발현 과정에서 생산된 단백질에 다른 PRO 번호를 부여할 수 있으나 UNQ 번호는 주어진 임의의 DNA에 대해 고유하며 변경되지않을 것이다. 그러나, 간편성을 위해 본 명세서에서 DNA33223-1136, DNA33087-1158 또는 DNA 40370-1217에 의해 코딩되는 단백질 및 PRO230, PRO216 또는 PRO302의 상기 정의에서 포함된 천연의 모든 상동체 및 변이체는 그의 출처 또는 제조 방법에 상관없이 "PRO230, PRO216 또는 PRO302"로 언급된다.

이하에 설명되는 내용은 주로 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드 코딩 핵산을 함유하는 벡터로 형질전환 또는 트랜스펙션된 세포를 배양함으로써 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드를 제조하는 방법에 관한 것이다. 물론, 당업계에 공지된 다른 방법을 사용하여 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드 서열 또는 그의 단편을 제조할 수 있다. 예를 들어, PRO230, PRO216 또는 PRO302의 상기 정의에서 포함된 서열 또는 그의 단편은 고상 기술을 사용하는 직접 펩티드 합성법에 의해 제조할 수 있다 [Stewart et al.,Solid -Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969), Merrifield,J. Am. Chem. Soc.,85:2149-2154 (1963)]. 시험관 내 단백질 합성은 수동 방법 또는 자동 방법에 의해 수행될 수 있다. 자동 합성법은 예를 들어 Applied Biosystems Peptide Synthesizer (미국 캘리포니아주 포스터시티 소재)를 제조사의 지시에 따라 사용하여 수행할 수 있다. 다양한 PRO230, PRO216 또는 PRO302 단편은 별도로 화학적으로 합성되어 화학적 또는 효소적 방법을 사용하여 조합함으로써 전장 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드를 제조할 수 있다.

1. PRO230, PRO216 또는 PRO302를 코딩하는 DNA의 단리

PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드 코딩 DNA는 PRO230, PRO216 또는PRO302 코딩 mRNA를 보유하여 그를 검출가능한 수준으로 발현할 것으로 생각되는 조직으로부터 제조한 cDNA 라이브러리로부터 수득할 수 있다. 따라서, 인간 PRO230, PRO216 또는 PRO302 코딩 DNA는 실시예에서 설명되는 바와 같이 인체 조직으로부터 제조된 cDNA 라이브러리로부터 편리하게 수득할 수 있다. PRO230, PRO216 또는 PRO302 코딩 유전자는 또한 게놈 라이브러리로부터 수득할 수 있다.

라이브러리는 목적 유전자 또는 이 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 확인하기 위해 고안된 프로브 (예를 들어 목적하는 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드에 대한 항체 또는 약 20 내지 80개의 염기로 구성된 올리고뉴클레오티드)를 사용하여 스크리닝할 수 있다. 선택된 프로브를 사용한 cDNA 또는 게놈 라이브러리의 스크리닝은 예를 들어 문헌 [Sambrook et al.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual(New York: Cold Spring Haror Laboratory Press, 1989)]에 기재된 바와 같은 표준 방법을 사용하여 수행할 수 있다. PRO230, PRO216 또는 PRO302 코딩 유전자를 단리하는 다른 수단은 PCR 방법을 사용하는 것이다 [Sambrook et al.,상기 문헌; Dieffenbach et al.,PCR Primer: A Laboratory Manual(Cold Spring Haror Laboratory Press, 1995)].

하기 실시예는 cDNA 라이브러리를 스크리닝하는 기술을 설명한다. 프로브로서 선택된 올리고뉴클레오티드 서열은 가양성 결과를 최소화하기 위해서 충분한 길이를 갖고 충분히 분명한 서열이어야 한다. 올리고뉴클레오티드는 스크리닝되는 라이브러리에서 DNA에 혼성화시에 검출될 수 있도록 표지되는 것이 바람직하다.표지 방법은 당업계에 공지되어 있고,³²P 표지된 ATP와 같은 방사성 표지, 비오티닐화 또는 효소 표지의 사용을 포함한다. 중간정도 엄격성 및 높은 엄격성을 포함하는 혼성화 조건은 문헌 (Sambrook et al.,상기 문헌)에서 제공된다.

상기 라이브러리 스크리닝 방법에서 확인된 서열은 GenBank와 같은 공용 데이타 베이스 또는 다른 독점 데이타 베이스에 기탁되고 입수할 수 있는 다른 공지의 서열과 비교하여 정렬시킬 수 있다. 분자의 한정된 영역 내 또는 전장 서열에 걸친 서열 동일성 (아미노산 또는 뉴클레오티드 수준에서)은 상동성 측정하기 위한 여러 알고리즘을 이용하는 ALIGN, DNAstar 및 INHERIT와 같은 컴퓨터 소프트웨어 프록렘을 이용하여 결정할 수 있다.

단백질 코딩 서열을 갖는 핵산은 먼저 본원에서 개시된 추정 아미노산 서열 및 필요한 경우 전구체를 검출하기 위해 문헌 (Sambrook et al.,상기 문헌)에 기재된 통상의 프라이머 신장 방법을 사용하여 선택된 cDNA 또는 게놈 라이브러리를 스크리닝하고, cDNA로 역전사되지 않은 mRNA의 중간체를 프로세싱함으로써 수득할 수 있다.

2. 숙주 세포의 선택 및 형질전환

숙주 세포는 PRO230, PRO216 또는 PRO302 생산을 위해 본원에서 설명한 발현 또는 클로닝 벡터로 트랜스펙션 또는 형질전환되고 프로모터 유도, 형질전환체 선택 또는 목적 서열을 코딩하는 유전자 증폭에 적합하게끔 개질된 통상의 영양 배지 중에서 배양된다. 당업자라면 불필요한 실험을 수행하지 않고서도 배지, 온도, pH등과 같은 배양 조건을 선택할 수 있다. 일반적으로, 세포 배양물의 생산성을 최대화하기 위한 원칙, 프로토콜 및 실시되는 기술은 문헌 [Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991) 및 Sambrook et al.,상기 문헌]에서 찾을 수 있다.

진핵세포 트랜스펙션 방법 및 원핵세포 형질전환 방법, 예를 들어 CaPO₄, 리포솜-매개 방법 및 일렉트로포레이션은 당업계의 숙련가에게 공지되어 있다. 사용되는 숙주 세포에 따라, 형질전환은 상기 세포에 적합한 표준 기술을 사용하여 수행된다. 문헌 (Sambrook et al.,상기 문헌)에 기재된 염화칼슘법을 이용하는 칼슘 처리 또는 일렉트로포레이션은 일반적으로 원핵세포에 대해 사용된다. 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)를 사용한 트랜스펙션은 문헌 [Shaw et al.,Gene,23:315(1983) 및 1989년 6월 29일 공개된 WO 89/05859]에 기재된 바와 같이 특정 식물 세포의 형질전환에 사용된다. 상기 세포벽이 없는 포유동물 세포의 경우, 문헌 [Graham and van der Eb,Virology,52:456-457 (1978)]의 인산칼슘 침전법을 사용할 수 있다. 포유동물 세포 숙주 시스템 형질전환의 일반적인 특징은 미국 특허 제4,399,216호에 기재되어 있다. 효모 내로의 형질전환은 일반적으로 문헌 [Van Solingen et al.,J. Bact.,130:949(1977) 및 Hsiao et al.,Proc. Natl. Acad. Sci.(USA),76:3829(1979)]의 방법에 따라 수행된다. 그러나, 세포 내로 DNA를 도입하는 다른 방법, 예를 들어 핵내 미세주입, 일렉트로포레이션, 원형 세포와 세균 원형질체 융합, 또는 다원양이온(polycation), 예를 들어 폴리브렌, 폴리오르니틴도 사용할 수 있다. 포유동물 세포의 형질전환을 위한 여러 기술에 대해서는 문헌 [Keown et al.,Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990) 및 Mansour et al.,Nature, 336:348-352 (1988)]을 참조한다.

본원에서 벡터 내의 DNA를 클로닝 또는 발현하기에 적합한 숙주 세포는 원핵세포, 효모 또는 고등 진핵세포이다. 적합한 원핵세포는 진정세균, 예를 들어 그람 음성 또는 그람 양성 생물, 예를 들어 엔테로박테리아세애 (Enterobacteriaceae), 예를 들어 이. 콜라이를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 다양한 이. 콜라이 균주, 예를 들어 이. 콜라이 K12 균주 MM294 (ATCC 31,446), 이. 콜라이 X1776 (ATCC 31,537), 이. 콜라이 균주 W3110 (ATCC 27,325) 및 K5 772 (ATCC 53,635)는 용이하게 입수할 수 있다. 다른 적합한 원핵생물 숙주 세포는 에셔리키아(Eshcerichia), 예를 들어 이. 콜라이, 엔테로박터 (Enterobacter), 에르위니아 (Erwinia), 클렙시엘라 (Klebsiella), 프로테우스 (Proteus), 살모넬라 (Salmonella), 예를 들어 살모넬라 티피무리움 (typhimurium), 세라티아 (Serratia), 예를 들어 세라티아 마르세스칸스 (marcescans) 및 시겔라 (Shigella), 및 바실러스 (Bacillus), 예를 들어 비. 서브틸리스 (subtilis) 및 비. 리체니포르미스 (licheniformis) (예를 들어 1989년 4월 12일자로 공고된 DD 266,710호에 기재된 비. 리체니포르미스 41P), 슈도모나스 (Pseudomonas), 예를 들어 피. 아에루기노사 (aeruginosa) 및 스트렙토마이세스 (Streptomyces)를 포함한다. 이러한 예는 단지 예시적인 것으로서 이에 제한되는 것은 아니다. 균주 W3110은 재조합 DNA 산물 발효에 공통적인 숙주 균주이기 때문에 특히 바람직한 숙주 또는 모 숙주이다. 바람직하게는, 숙주 세포는 최소량의 단백질 분해 효소를 분비한다. 예를 들어, 균주 W3110은 숙주의 내생 단백질을 코딩하는 유전자의 돌연변이를 초래하도록 변형될 수 있고, 이러한 숙주의 예는 완전한 유전자형 tonA를 갖는 이. 콜라이 W3110 균주 1A2, 완전한 유전자형 tonA ptr3을 갖는 이. 콜라이 W3110 균주 9E4, 완전한 유전자형 tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT kan^r를 갖는 이. 콜라이 W3110 균주 27C7 (ATCC 55,244), 완전한 유전자형 tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT rbs7 ilvG kan^r를 갖는 이. 콜라이 W3110 균주 37D6, 비-카나마이신 내성 degP 결실 돌연변이를 갖는 균주 37D6인 이. 콜라이 W3110 균주 40B4 및 1990년 8월 7일 부여된 미국 특허 제4,946,783호에 개시된 페리플라즘 프로테아제 변이체를 갖는 이. 콜라이 균주를 포함한다. 별법으로, 시험관내 클로닝 방법, 예를 들어 PCR 또는 다른 핵산 폴리머라제 반응이 적합하다.

원핵세포 외에, 섬유상 진균 또는 효모와 같은 진핵 미생물이 PRO 코딩 벡터의 클로닝 또는 발현 숙주로서 적합하다. 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae)가 일반적으로 사용되는 하등 진핵 숙주 미생물이다. 다른 미생물에는 시조사카로마이세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe) (Beach and Nurse,Nature, 290: 140 [1989]; 1985년 5월 2일 공고된 EP 139,383); 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 숙주 (미국 특허 제4,943,529호; Fleer et al.,Bio/Technology, 9:968-975 (1991)), 예를 들어 케이. 락티스 (lactis) (MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt et al.,J. Baceriol., 737 [1983]), 케이. 프라길리스 (fragilis) (ATCC 12,424), 케이. 불가리쿠스 (bulgaricus) (ATCC 16,045), 케이. 위케라미 (wickeramii) (ATCC 24,178), 케이. 왈티이 (waltii) (ATCC 56,500), 케이. 드로소필라룸 (drosophilarum) (ATCC 36,906; Van den Berg et al.,Bio/Technology, 8:135(1990)), 케이. 테르모톨레란스 (thermotolerans) 및 케이. 막시아누스 (marxianus); 야로위아 (yarrowia) (EP 402,226); 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris) (EP 183,070; Sreekrishna et al.,J. Basic Microbiol., 28:265-278 [1988]); 칸디다 (Candida); 트리코데르마 레에시아 (EP 244,234); 뉴로스포라 크라사 (Neurospora crassa; Case et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:5259-5263 [1979]); 시와니오마이세스 (Schwanniomyces), 예를 들어 시와니오마이세스 옥시덴탈리스 (occidentalis) (1990년 10월 31일 공고된 EP 394,538); 및 섬유상 진균, 예를 들어 뉴로스포라, 페니실리움 (Penicillium), 톨리포클라디움 (Tolypocladium) (1991년 1월 10일 공고된 WO 91/00357) 및 아스퍼길러스 (Aspergillus) 숙주, 예를 들어 에이. 니둘란스 (Nidulans) (Ballance et al,,Biochem. Biophys. Res. Commun., 112:284-289 [1983]; Tilburn et al.,Gene, 26:205-221 [1983]; Yelton et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1470-1474 [1984]) 및 에이. 니게르 (niger) (Kelly and Hynes,EMBO J., 4: 475-479 [1985])가 포함된다. 메틸 영양 요구성 효모가 적합하고, 한세눌라 (Hansenula), 칸디다 (Candida), 클로엑케라 (Kloeckera), 피치아, 카라로마이세스, 토룰롭시스(Torulopsis) 및 로도토룰라(Rhodotorula)로 이루어지는 속으로부터 선택된, 메탄올 상에서 성장할 수 있는 효모를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 이들 종류의 효모의 예인 구체적인 종의 목록은 문헌 [C. Anthony,The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982)]에 기재되어 있다.

글리코실화된 PRO230, PRO216 또는 PRO302 코딩 핵산의 발현에 적합한 숙주 세포는 다세포 생물로부터 유래한다. 무척추동물 세포의 예는 드로소필라 S2 및 스포도프테라 Sf9와 같은 곤충 세포 및 식물 세포이다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 예는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 및 COS 세포를 포함한다. 보다 구체적인 예는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 라인 (COS-7, ATCC CRL 1651), 인간 배아 신장 라인 (293 세포 또는 현탁 배양액 중의 성장을 위해 서브클로닝된 293 세포, Graham et al.,J. Gen Virol., 36:59(1997)), 차이니즈 햄스터 난소 세포/-DHFR (CHO, Urlaub and Chasin,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)), 마우스 세르톨리 세포 (TM4, Mather,Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)), 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75), 인간 간세포 (Hep G2, HB 8065) 및 마우스 유방 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51)을 포함한다. 당업계의 숙련가라면 적합한 숙주 세포를 용이하게 선택할 수 있다.

3. 복제가능 벡터의 선택 및 사용

PRO230, PRO216 또는 PRO302 코딩 핵산 (예를 들어, cDNA 또는 게놈 DNA)은 클로닝 (DNA의 증폭) 또는 발현을 위한 복제가능 벡터에 삽입된다. 다양한 벡터를 용이하게 구할 수 있다. 예를 들어, 벡터는 플라스미드, 코스미드, 바이러스 입자 또는 파지의 형태로 존재할 수 있다. 적합한 핵산 서열은 다양한 방법에 의해 벡터 내에 삽입될 수 있다. 일반적으로, 당업계에 공지된 기술을 사용하여 DNA를 적합한 제한 엔도뉴클레아제 부위(들) 내에 삽입한다. 벡터 성분은 일반적으로 시그날 서열, 복제 기점, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 성분, 프로모터 및 전사 종결 서열을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 하나 이상의 상기 성분을 포함하는 적합한 벡터의 제조는 당업계의 숙련가에게 공지된 표준 라이게이션 기술을 사용한다.

PRO230, PRO216 또는 PRO302는 직접 재조합 방법에 의해 생산될 수 있을 뿐만 아니라 성숙 단백질 또는 폴리펩티드의 N 말단에서 특이적 절단 부위를 갖는 다른 폴리펩티드 또는 시그날 서열일 수 있는 이종 폴리펩티드와의 융합 폴리펩티드로서 생산될 수 있다. 일반적으로, 시그날 서열은 벡터의 성분일 수 있거나 벡터 내로 삽입된 PRO230, PRO216 또는 PRO302 코딩 DNA의 일부일 수 있다. 시그날 서열은 예를 들어 알칼리 포스파타제, 페니실리나제, lpp 또는 열안정성 엔테로톡신 II 리더의 군으로부터 선택되는 원핵생물 시그날 서열일 수 있다. 효모 분비를 위해, 시그날 서열은 예를 들어 효모 인버타제 리더, α 인자 리더 (사카로마이세스 (Saccharomyces) 및 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces) α-인자 리더 (미국 특허 제5,010,182호)) 또는 산 포스파타제 리더, 씨. 알비칸스 (C. albicans) 글루코아밀라제 리더 (1990년 4월 4일 공고된 EP 362,179) 또는 1990년 11월 15일 공개된 WO 90/13646에 기재된 시그날 서열일 수 있다. 포유동물 세포 발현에서, 포유동물 시그날 서열, 예를 들어 동일하거나 관련된 종의 분비되는 폴리펩티드로부터의 시그날 서열 및 바이러스 분비 리더를 사용하여 단백질의 분비를 지시할 수 있다.

발현 및 클로닝 벡터 모두는 벡터가 1종 이상의 선택된 숙주 세포에서 복제할 수 있도록 만드는 핵산 서열을 함유한다. 이러한 서열은 다양한 세균, 효모 및 바이러스에 대해 공지되어 있다. 플라스미드 pBR322로부터의 복제 기점은 대부분의 그람 음성 세균에 적합하고, 2μ 플라스미드 기점은 효모에 적합하고, 다양한 바이러스 기점 (SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, VSV 또는 BPV)은 포유동물 세포에서 벡터를 클로닝하는데 유용하다.

발현 및 클로닝 벡터는 통상적으로 선택가능한 마커로도 불리우는 선택 유전자를 함유할 것이다. 대표적인 선택 유전자, 예를 들어 바실러스 (Bacillus)의 경우 D-알라닌 라세마제를 코딩하는 유전자는 (a) 항생제 또는 다른 독소, 예를 들어 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트 또는 테트라싸이클린에 내성을 부여하는 단백질, (b) 영양요구성 결함을 보완하는 단백질 또는 (c) 복합 배지로부터 이용할 수 없는 중요한 영양물질을 공급하는 단백질을 코딩한다.

포유동물 세포에 적합한 선택가능한 마커의 예는 PRO230, PRO216 또는 PRO302 코딩 핵산을 수용할 수 있는 세포의 동정을 가능하게 하는 것, 예를 들어 DHFR 또는 티미딘 키나제이다. 야생형 DHFR이 이용될 경우, 적합한 숙주 세포는 DHFR 활성이 결여된 CHO 세포주이고, 문헌 [Urlaub et al,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)]에 기재된 바와 같이 제조 및 증식된다. 효모에 사용하는데 적합한 선택 유전자는 효모 플라스미드 YRp7에 존재하는 trp1 유전자이다 [Stinchcomb et al.,Nature, 282: 39 (1979), Kingsman et al.,Gene, 7: 141 (1979), Tschemper et al.,Gene, 10: 157 (1980)]. trp1 유전자는 트립토판으로의 성장능이 결여된 효모의 변이주 (예를 들어 ATCC 44076 또는 PEP4-1)에 대한 선택 마커를 제공한다 [Jones,Genetics, 85: 12 (1977)].

발현 및 클로닝 벡터는 mRNA 합성을 지시하는, PRO230, PRO216 또는 PRO302 코딩 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 함유한다. 다양한 잠재적인 숙주 세포에 의해 인식되는 프로모터는 공지되어 있다. 원핵생물 숙주에 사용하기에 적합한 프로모터는 β-락타마제 및 락토스 프로모터 시스템 [Chang et al.,Nature, 275:615 (1978); Goeddel et al.,Nature, 281:544 (1979)], 알칼리 포스파타제, 트립토판 (trp) 프로모터 시스템 [Goeddel,Nucleic acid Res., 8:4057 (1980); EP 36,776], 및 하이브리드 프로모터, 예를 들어 tac 프로모터 [deBoer et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)]를 포함한다. 또한, 세균계에서 사용되는 프로모터는 PRO230, PRO216 또는 PRO302를 코딩하는 DNA에 작동가능하게 연결된 샤인-달가노 (S.D.) 서열을 함유할 것이다.

효모 숙주에 사용하기 적합한 프로모터 서열의 예는 3-포스포글리세레이트 키나제 [Hitzeman et al.,J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)] 또는 다른 당분해 효소 [Hess et al.,J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968); Holland,Biochemistry, 17:4900 (1978)], 예를 들어 에놀라제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 디히드로게나제, 헥소키나제, 피루베이트 디카르복실라제, 포스포프룩토키나제, 글루코스-6-포스페이트 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 뮤타제, 피루베이트 키나제, 트리오스포스페이트 이소머라제, 포스포글루코스 이소머라제 및 글루코키나제에 대한 프로모터를 포함한다.

성장 조건에 의해 조절되는 추가의 전사 잇점을 갖는 유도가능한 프로모터인다른 효모 프로모터는 알코올 디히드로게나제 2, 이소시토크롬 C, 산 포스파타제, 질소 대사에 관련된 분해 효소, 메탈로티오네인, 글리세르알데히드-3-포스페이트 디히드로게나제, 및 말토스 및 갈락토스 이용에 작용하는 효소에 대한 프로모터 영역이다. 효모 발현에 사용하기에 적합한 벡터 및 프로모터는 추가로 EP 제73,657호에 기재되어 있다.

포유동물 숙주 세포에서의 벡터로부터의 PRO230, PRO216 또는 PRO302 핵산 전사는 바이러스, 예를 들어 폴리오마 바이러스, 계두 바이러스 (1989년 7월 5일 공고된 UK 2,211,504호), 아데노바이러스 (예를 들어, 아데노바이러스 2), 소 유두종 바이러스, 조류 육종 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스 및 원숭이 바이러스 40 (SV40)의 게놈으로부터, 이종 포유동물 프로모터, 예를 들어 액틴 프로모터 또는 면역글로불린 프로모터로부터, 열-충격 프로모터로부터 얻어진, 숙주 세포계에 적합성인 프로모터에 의해 조절된다.

고등 진핵세포에 의한 PRO230, PRO216 또는 PRO302를 코딩하는 DNA의 전사는 인핸서 서열을 벡터에 삽입함으로써 증가될 수 있다. 인핸서는 일반적으로 전사를 증가시키기 위해 프로모터에 대해 작용하는, 약 10 내지 300 bp의 DNA의 시스-액팅 성분이다. 많은 인핸서 서열은 포유동물 유전자 (글로빈, 엘라스타제, 알부민, α-페토단백질 및 인슐린)로부터 유래하는 것으로 알려져 있다. 그러나, 통상적으로 진핵세포 바이러스로부터 유래한 인핸서를 사용할 것이다. 그 예는 복제 기점의 뒷부분 상의 SV40 인핸서 (bp 100-270), 사이토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 기점의 뒷부분 상의 폴리오마 인핸서, 및 아데노바이러스 인핸서를포함한다. 인핸서는 PRO230, PRO216 또는 PRO302 코딩 서열에 5' 또는 3' 위치에서 벡터에 스플라이싱될 수 있지만, 프로모터로부터 5' 부위에 위치하는 것이 바람직하다.

또한, 진핵 숙주 세포 (효모, 진균, 곤충, 식물, 동물, 인간 또는 다른 다세포 생물로부터 유래한 다핵 세포)에 사용되는 발현 벡터는 전사 종결 및 mRNA 안정화에 필요한 서열을 포함할 수 있을 것이다. 그러한 서열은 통상적으로 진핵세포, 또는 바이러스 DNA 또는 cDNA의 5' 및 때로는 3' 비번역 영역으로부터 확보된다. 이들 영역은 PRO230, PRO216 또는 PRO302 코딩 mRNA의 비번역 부분에서 폴리아데닐화 단편으로서 전사되는 뉴클레오티드 단편을 함유한다.

재조합 척추동물 세포 배양에서 PRO230, PRO216 또는 PRO302의 합성에 적용하는데 적합한 다른 방법, 벡터 및 숙주 세포는 문헌 [Gething et al.,Nature, 293:620-625 (1981); Mantei et al.,Nature, 281:40-46 (1979); EP 117,060 및 EP 117,058]에 기재되어 있다.

4. 유전자 증폭/발현의 검출

유전자 증폭 및(또는) 발현은 예를 들어 통상의 서던 블로팅, mRNA의 전사를 정량하기 위한 노던 블로팅 [Thomas,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 (1980)], 도트 블로팅 (DNA 분석) 또는 본원에서 제공된 서열을 기초로 하여 적절하게 표지된 프로브를 사용한 in situ 혼성화에 의해 시료에서 직접 측정할 수 있다. 별법으로, DNA 이중쇄, RNA 이중쇄 및 DNA-RNA 혼성 이중쇄 또는 DNA-단백질 이중쇄를 포함하여 특정 이중쇄를 인식할 수 있는 항체를 사용할 수 있다. 바꾸어말하면, 항체를 표지하고, 상기 이중쇄를 표면에 결합시키고, 표면 상에 이중쇄가 형성될 때 이중쇄에 결합한 항체의 존재를 검출할 수 있는 분석을 수행할 수 있다.

별법으로, 유전자 발현은 세포 또는 조직 절편의 면역조직화학적 염색과 같은 면역학적 방법 및 유전자 산물의 발현을 직접 정량하기 위한 세포 배양액 또는 체액의 분석에 의해 측정할 수 있다. 면역조직화학적 염색 및(또는) 시료 유체의 분석에 유용한 항체는 모노클로날 또는 폴리클로날 항체일 수 있고, 임의 포유동물에서 제조할 수 있다. 편리하게는, 천연 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드 또는 본원에서 제공되는 DNA 서열을 기초로 한 합성 펩티드 또는 PRO230, PRO216 또는 PRO302 코딩 DNA에 융합되고 특정 항체 에피토프를 코딩하는 외인성 서열에 대한 항체를 제조할 수 있다.

5. 폴리펩티드의 정제

PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드의 형태는 배양 배지 또는 숙주 세포 용균액으로부터 회수될 수 있다. 멤브레인에 결합하는 경우, 적합한 세제 용액 (예를 들어 Triton-X 100)을 사용하거나 효소의 절단에 의해 멤브레인으로부터 방출될 수 있다. PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드 코딩 핵산의 발현에 사용된 세포는 동결-해동 싸이클, 초음파 처리, 기계적 분쇄 또는 세포 용균제와 같은 다양한 물리적 또는 화학적 수단에 의해 분쇄시킬 수 있다.

재조합 세포 단백질 또는 폴리펩티드로부터 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드를 정제하는 것이 바람직할 수 있다. 적합한 정제 방법의 예는 이온 교환 컬럼 상에서의 분획화, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 또는 양이온 교환 수지,예를 들어 DEAE 상에서의 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE, 황산암모늄 침전, 예를 들어 Sephadex G-75를 사용한 겔 여과, IgG와 같은 오염물질을 제거하기 위한 단백질 A 세파로스 컬럼 및 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드의 에피토프 태그가 부가된 형태를 결합시키기 위한 금속 킬레이팅 컬럼이다. 다양한 단백질 정제 방법을 사용할 수 있으며, 이러한 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌 [Deutscher,Methods in Enzymology, 182 (1990); Scopes,Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982)]에 기재되어 있다. 선택되는 정제 단계(들)은 예를 들어 사용되는 생산 방법 및 생산되는 특정 PRO230, PRO216 또는 PRO302의 특성에 따라 결정될 것이다.

D. PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드의 용도

1. 심혈관, 내피 및 혈관형성 활성의 분석

본원의 폴리펩티드의 심혈관, 내피 및 혈관형성 활성에 대한 시험에 여러가지 분석법이 사용될 수 있다. 상기 분석법은 하기 실시예에 제공되어 있다.

미국 특허 제 5,773,414호에 개시된 바와 같이 엔도텔린 길항제 활성을 시험하기 위한 분석법에는 폴리펩티드를 수용체 분석법으로 요오드화된 엔도텔린-1 결합 억제능을 시험하는 랫트 심장의 심실 결합 분석법, 토끼 신동맥 혈관 평활근 세포를 이용한 방사성 표지된 엔도텔린-1의 온전한 세포 결합을 시험하는 엔도텔린 수용체 결합 분석법, 2차 메신저의 세포내 수준을 측정함으로써 Rat-1 세포에서 기능적 활성을 측정하는 이노시톨 포스페이트 축적 분석법, 배양된 혈관 평활근에서 엔도텔린 자극된 아라키돈산 분비를 감소시키는 첨가 화합물의 능력을 측정하는 아라키돈산 분비 분석법, 뉴질랜드 숫토끼로부터의 내피를 이용한 시험관 내 (단리된 혈관) 연구, 및 스프래그 돌리 랫트 수컷을 이용한 생체내 연구가 포함된다.

조직 재생 활성 분석법에는 WO 95/16035 (뼈, 연골, 건), WO 95/05846 (신경, 신경세포성)에 기재되어 있는 방법이 포함되나 이에 한정되지는 않는다.

상처 치유 활성 분석법에는 예를 들어 문헌 [Eaglstein and Mertz,J. Invest. Dermatol.,71: 382-384 (1978)]에서 변형된 문헌 [Winter,Epidermal Wound Healing, Maibach, HI and Rovee, DT, eds. (Year Book Medical Publishers, Inc., Chicago), pp71-112]에 기재된 방법이 포함된다.

미국 특허 제 5,773,223호에 기재된 바와 같은 엔도텔린 B₁(ETB₁) 수용체 폴리펩티드에 결합하고 시그날전달 활성을 조절하는 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드에 관한 시험 분자를 스크리닝하기 위한 분석법은 엔도텔린 B₁수용체 폴리펩티드를 코딩하는 DNA로 형질전환된 숙주세포를 제공하는 단계, 세포를 시험 후보물질에 노출시키는 단계 및 엔도텔린 B₁수용체 시그날전달 활성을 측정하는 단계를 포함한다.

여러가지 심비대증 분석법이 존재한다. 시험관내 분석법에는 성숙 랫트의 심근세포의 확산 유도법이 포함된다. 본 분석법에서, 문헌 [Piper et al., "Adult ventricular rat heart muscle cells" inCell Culture Techniques in Heart and Vessel Research, H.M. Piper. ed (Berlin: Springer-Verlag, 1990), pp36-60]에 상세하게 기재된 실험방법의 변형법을 따라 심실 근세포는 단일 (수컷 스프래그 돌리) 랫트로부터 단리한다. 본 방법은 성숙 랫트의 심실 근세포의 단리 및 간상의 표현형으로 상기 세포의 장기간 배양을 가능하게 한다. 페닐에프린 및 프로스타글란딘 F_2α(PGF_2α)는 상기 성숙 랫트 세포의 확산 반응을 유도하는 것을 보였다. PGF_2α또는 PGF_2α유사체 (예, 플루프로스테놀) 및 페닐에프린에 의해 유도되는 근세포 확산의 억제를 여러가지 효능있는 심비대증 억제제에 의해 시험한다.

생체내 분석법의 한 예는 생체내 플루프로스테놀에 의해 유도된 심비대를 억제하기 위한 시험이다. 본 약리학적 모델은 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드의 랫트 (예, 위스터 또는 스프래그 돌리)에서 유도된 심비대의 억제능을 플루프로스테놀 (PGF_2α아고니스트 유사체)을 피하주사하여 시험한다. 심근 경색증에 의해 유도되는 병리학적 심비대증을 갖는 랫트는 만성적으로 심근에서 추출가능한 PGF_2α의 수준의 상승을 보인다고 알려졌다 [Lai et al.,Am. J. Physiol.(Heart Circ. Physiol.)271: H2197-H2208 (1996)]. 따라서, 생체내에서 심근 성장에 대한 플루프로스테놀의 효과를 억제할 수 있는 인자는 심비대증 치료에 유용할 것이다. PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드의 심비대증에 대한 효과는 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드가 투여되지 않으면서 플루프로스테놀 처리된 랫트에 비해 심장, 심실 및 좌심실의 (체중에 의해 표준화된) 무게를 측정함으로써 결정된다.

생체내 분석법의 다른 예는 압력 과부하 심비대 분석법이다. 생체내 시험의 경우, 시험 동물의 위동맥의 수축에 의해 압력 과부하된 심비대를 유도하는 것이일반적이다. 통상의 실험 방법에서, 랫트 (예, 수컷 위스터 또는 스프래그 돌리)를 마취 처리하고 각 랫트의 위동맥을 횡경막 바로 아래로 협착시킨다 [Benzak M.,Can. J. Biochem. Physiol.,33: 985-94 (1955)]. 동맥을 절개하여 노출시키고 굵은 바늘을 혈관 옆에 놓는다. 동맥을 바늘 주위에 명주실 올가미로 수축시키고, 바늘을 즉시 제거하여 동맥 구경을 바늘 직경으로 감소시킨다. 이 방법은 예를 들어 문헌 [Rossi et al.,Am. Heart. J.,124: 700-709 (1992) and O'Rourke and Reibel,P.S.E.M.B.,200: 95-100 (1992)]에 기재되어 있다.

또다른 생체내 분석법에서는, 실험적으로 유도된 심근 경색증 (MI)에 따른 심비대증의 효과를 측정한다. 급성 MI는 랫트에서 관상 좌동맥의 결찰에 의해 유도하며 심전도 검사로 확인한다. 또한, 대조 동물로 모의 수술한 동물군을 준비한다. 초기 결과는 체중에 대한 심장 중량의 비율의 18% 증가로 입증된 바와 같이 MI를 갖는 동물군에서 심비대가 존재한다는 것을 확인하었다 [Lai et al., 상기 문헌]. 심비대증 차단제 후보물질, 예를 들어 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드의 상기 동물 처리는 시험 후보물질의 치료 가능성에 대한 의미있는 정보를 제공한다. 심비대증의 유도를 위한 또다른 상기 분석 시험은 스프래그 돌리 랫트를 이용한 미국 특허 제 5,773,415호에 개시되어 있다.

암의 경우, 공지된 다양한 동물 모델이 종양 발생 및 발병기전에 있어 본원에서 확인된 유전자의 역할을 이해하고, 천연 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드의 항체 및 다른 길항제, 예를 들어 소분자 길항제를 포함한 후보 치료제의 효능 검사에 사용될 수 있다. 상기 모델의 생체내 특성은 특히 인간 환자에서 상기치료제의 반응을 예측가능하게 한다. 종양 및 암 (예, 유방암, 결장암, 전립선암, 폐암 등)의 동물 모델은 비재조합 및 재조합 (트랜스제닉) 동물을 모두 포함한다. 비재조합 동물 모델에는 예를 들어 설치류, 예를 들어 쥐 모델이 포함된다. 상기 모델은 표준 기술, 예 피하 주사, 꼬리 정맥 주사, 비장 이식, 복강내 이식, 부신하 이식 또는 오르토핀 이식, 예를 들어 결장 조직에 이식된 결장 암세포를 이용하여 종양세포를 동종의 마우스에 유도함으로써 제조될 수 있다 [PCT 공개 WO97/33351 (1997년 9월 18일 공개)].

종양 연구에 가장 흔히 사용되는 동물은 면역결핍 마우스, 특히 누드 마우스이다. 흉선저형성증을 갖는 누드 마우스는 인간 종양 이종이식을 위한 숙주로서 성공적으로 작용한다는 발견에 의해 상기 목적을 위해 광범위하게 사용되었다. 열성의 상염색체 nu 유전자는 다른 유사유전형의 많은 누드 마우스 종, 예를 들어 ASW, A/He, AKR, BALB/c, B10, LP, C17, C3H, C57BL, C57, CBA, DBA, DDD, I/st, NC, NFR, NFS, NFS/N, NZB, NZC, NZW, P, RIII 및 SJL에 도입되었다. 또한, 누드 마우스 외에 유전된 면역학적인 결함을 갖는 다른 다양한 동물도 교배하여 종양 이종 이식의 수여자로서 사용하였다. 더 상세한 내용은 문헌 [예, The Nude Mouse in Oncology Research, E. Boven and B. Winograd, eds. (CRC Press, Inc., 1991)]을 참고한다.

상기 동물로 유도된 세포는 공지된 종양/암 세포주, 예를 들어 상기에 열거된 임의의 종양 세포주 및 예를 들어 B104-1-1 세포주 (nu 원종양유전자로 트랜스펙션된 안정한 NIH-3T3 세포주), ras 트랜스펙션된 NIH-3T3 세포, Caco-2 (ATCCHTB-37) 또는 중간정도로 잘 분화된 단계 II 인간 결장 선암종 세포주 HT-29 (ATCC HTB-38), 또는 종양 및 암으로부터 유래될 수 있다. 종양 또는 암의 시료는 표준 방법을 이용하여 환자로부터 외과적으로 수득하여 냉동하여 액체 질소 내에 저장할 수 있다 [Karmali et al.,Br. J. Cancer, 48: 689-696 (1983)].

종양 세포는 여러 방법으로 누드 마우스와 같은 동물에 도입될 수 있다. 마우스의 피하 (s.c.) 공간은 종양 이식에 매우 적합하다. 종양은 고체 블록, 투관침을 이용한 생검침 또는 세포 현탁액으로서 피하로 이식할 수 있다. 고체 블록 또는 투관침 이식의 경우, 적합한 크기의 종양 조직 단편은 피하 공간으로 도입한다. 세포 현탁액은 1차 종양 또는 안정한 종양 세포주로부터 제조하여 피하 이식으로 주입한다. 또한, 종양세포는 피하 이식편으로 주입할 수 있다. 상기 위치에서 접종물은 피부 결합 조직의 하부와 피하 조직 사이에 침착한다.

유방암의 동물모델은 예를 들어 랫트 신경모세포종 (neu 종양 유전자가 처음 단리된 세포) 또는 neu 형질전환된 NIH-3T3 세포를 문헌 [Drebin et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,83: 9129-9133 (1986)]의 기재에 따라 누드 마우스에 이식함으로써 제조될 수 있다.

유사하게, 결장암 동물 모델은 동물, 예를 들어 누드 마우스에서 동물 내 결장암 세포를 계대배양으로 제조하여 상기 동물 내에 종양 발현을 유도할 수 있다. 누드 마우스에서 인간 결장암의 동소 이식 모델은 예를 들어 문헌 [Wang et al.,Cancer Research,54: 4726-4728 (1994) and Too et al.,Cancer Rearch,55: 681-684 (1995)]에 기재되어 있다. 상기 모델은 시판되는 AntiCancer Inc.(미국 캘리포니아주 샌디에고 소재) 제품의 소위 메타마우스(METAMOUSE^TM)를 기초로 하였다.

동물 모델에서 유도된 종양은 제거하여 시험관내에서 배양할 수 있다. 이어서, 시험관내 배양액으로부터의 세포는 동물에 계대접종된다. 상기 종양은 추가의 시험 또는 약물 스크리닝을 위한 표적으로 이용될 수 있다. 또한, 계대접종에 의해 유도된 종양은 단리할 수 있고, 예비 계대접종 세포로부터의 RNA 및 1 주기 이상의 계대접종후에 단리된 세포를 관심있는 유전자의 차등적 발현에 대해 분석한다. 상기 계대접종 기술은 공지된 임의의 종양 또는 암 세포에서든지 수행할 수 있다.

예를 들어 Meth A, CMS4, CMS5, CMS21 및 WEHI-164는 BALB/c 마우스 암컷의 화학적으로 유도된 섬유육종으로서 여러 제제의 항 종양활성을 연구하기 위해 조절가능한 모델 시스템을 제공한다 [Palladino et al.,J. Immunol. 138: 4023-4032 (1987)]. 간략하게, 종양 세포는 시험관에서 세포 배양으로 증식된다. 동물주사전에 세포주를 세척하고 10 X 10⁶내지 10 X 10⁷세포/㎖의 세포 밀도로 완충액에 재현탁시킨다. 이어서 동물에 10 내지 100 ㎕의 세포 현탁액을 피하주사하여 종양이 생기도록 1 내지 3주를 방치한다.

또한, 가장 완전하게 연구된 실험 종양인 마우스의 루이스 폐 (3LL) 암종은 종양 연구 모델로서 이용될 수 있다. 이 종양 모델의 효능은 폐 소세포암 (SCLL)으로 진단된 인간 환자의 치료에서 유리한 효과와 관련이 있다. 이 종양은 이환된 마우스 또는 배양에서 유지된 세포로부터의 종양 단편을 주사하여 정상 마우스에유도될 수 있으며 [Zupi et al.,Br. J. Cancer 41: suppl. 4, 309 (1980)], 종양은 심지어 단일 세포의 주사로부터 시작될 수 있으며 감염된 종양세포의 많은 부분이 생존하는 것을 나타내는 증거가 된다. 이 종양 모델의 추가적인 정보는 문헌 [Zacharski,Haemostasis 16: 300-320 (1986)]참조한다.

동물 모델에서 시험 화합물의 효능을 평가하는 한 방법은 처리 전후의 이식된 종양의 크기를 측정하는 것이다. 전형적으로, 이식된 종양의 크기는 2 또는 3차원으로 슬라이드 캘리퍼스로 측정한다. 이차원으로 한정된 측정은 종양의 정확한 크기를 반영하지 못하므로 일반적으로 수학적 수식을 이용하여 해당하는 부피로 환산된다. 그러나, 종양 크기의 측정은 매우 비정확하다. 약물 후보 물질의 치료 효과는 처리시 유도된 성장 지연 및 특이적 성장 지연으로 더 잘 나타낼 수 있다. 종양 성장을 나타내는 또다른 중요한 변수는 종양 부피 배가 시간이다. 문헌 [Rygaard and Spang-Thomson,Proc. 6th Int. Workshop on Immune-Deficient Animals, Wu and Sheng eds.(Basel, 1989, 301)]에 보고된 프로그램과 같이 종양 성장의 계산 및 표시를 위한 컴퓨터 프로그램 이용이 가능하다. 그러나, 치료에 따른 괴사 및 염증 반응은 실제로 적어도 초기에 종양 크기의 증가를 가져온다. 그러므로 이러한 변화는 형태 측정 방법 및 유동 세포측정법을 조합하여 주의있게 모니터하여야 한다.

재조합(트랜스제닉) 동물 모델은 트랜스제닉 동물을 생산하기 위한 표준 기술을 이용하여 본원에서 동정된 유전자의 코딩 부위를 목적하는 동물의 게놈에 도입시킴으로써 조작될 수 있다. 트랜스제닉 조작을 위한 표적으로 마우스, 랫트,토끼, 기니아 피그, 양, 염소, 돼지 및 비인간 영장류, 즉 개코 원숭이, 침팬지 및 원숭이 등에 제한없이 사용될 수 있다. 트랜스진을 상기의 동물에 도입하는 공지된 기술은 전핵 미세주입법 (미국 특허 제 4,873,191호), 배주로의 레트로 바이러스 매개된 유전자 전달법 [예, Van der Putten et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,82: 6148-615(1985)], 배간세포에서의 유전자 표적법 [Thompson et al.,Cell,56: 313-32 (1989)], 배의 일렉트로포레이션 [Lo,Mol. Cell. Biol.,3: 1803-1814 (1983)]; 정자 매개된 유전자 전달법 [Lavitrano et al.,Cell. 57: 717-73 (1989)]가 포함된다. 더 많은 정보를 위해서 예를 들어 미국 특허 제 4,736,866호를 참조한다.

본 발명의 목적을 위해, 트랜스제닉 동물은 세포의 일부에만 트랜스진을 지니고 있는 동물 ("모자이크 동물")을 포함한다. 트랜스진은 단일 트랜스진 또는 콘카타머, 즉 머리-머리 또는 머리-꼬리 배열로 통합될 수 있다. 트랜스진의 특정 세포종으로의 선택적인 도입은 예를 들어 Lasko등 [Proc. Natl. Acd. Sci. USA. 89: 6232-636 (1992)]의 기술에 의해 또한 가능하다.

트랜스제닉 동물 내에서 트랜스진의 발현은 표준 기술에 의해 모니터될 수 있다. 예를 들어 서던 블롯 분석 또는 PCR 증폭이 트랜스진의 융합을 확인하는 데 사용될 수 있다. 이어서 mRNA 발현 수준은 계내 혼성화, 노던 블롯 분석, PCR 또는 면역세포화학과 같은 기술을 이용하여 분석될 수 있다. 또한 동물들은 종양 또는 암의 발생의 징후에 대해 조사될 수 있다.

또한, 본원에서 동정된 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드 코딩하는 내재 유전자와 동물의 배 세포로 도입된 동일한 폴리펩티드를 코딩하는 변형된 게놈 DNA의 상동 재조합의 결과로 생성되는, 본원에서 동정된 폴리펩티드를 코딩하는 결함이 있거나 변형된 유전자를 갖는 "녹 아웃(knock-out)" 동물이 제조될 수 있다. 예를 들어, 특정 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA는 확립된 기술에 따라 그 폴리펩티드를 코딩하는 게놈 DNA를 클로닝하는데 이용될 수 있다. 특정 폴리펩티드를 코딩하는 게놈 DNA의 일부는 결실되거나 또는 다른 유전자, 예를 들어 통합을 모니터하는 데 사용될 수 있는 선택 마커를 코딩하는 유전자로 치환될 수 있다. 일반적으로, 수천개의 염기의 비변형된 플랭킹 DNA (5' 및 3' 말단 모두에서)가 벡터에 포함된다 [예를 들어 상동성 재조합 벡터에 대해서는 Thomas and Capecchi, Cell, 51:503 (1987) 참조]. 벡터는 배 간세포주 (예를 들어 일렉트로포레이션에 의해)에 도입되고, 도입된 DNA가 내인성 DNA와 상동 재조합된 세포가 선택된다 (Li et al., Cell, 69:915 (1992) 참조). 선택된 세포는 이어서 동물 (예를 들어 마우스 또는 래트)의 포배낭에 주입되어 응집 키메라를 형성한다 (예, Bradley, inTeratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach,E.J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), pp. 113-152). 이어서, 키메라 배를 적합한 가임신 대리모 동물에 이식하여 "녹 아웃" 동물을 생성시켰다. 생식세포 내에 상동 재조합 DNA를 보유하는 자손체를 표준 기술로 확인하여 동물의 모든 세포가 상동성 재조합 DNA를 함유하는 동물의 번식에 사용할 수 있다. 녹 아웃 동물은 예를 들어 특정 병리학적 상태에 대한 방어 능력 및 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드의 부재에 의한 병리학적 상태의 발생에 대해 특성화할 수 있다.

본원에서 동정한 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 및 다른 후보 약물의 효능은 또한 자연발생적 동물 종양의 처치에서 시험될 수 있다. 이같은 연구의 적합한 표적은 고양이의 구강 편평상피 세포암 (SCC)이다. 고양이 구강 SCC는 이 종에서 보고된 구강 종양의 60%를 차지하는 것이 설명해 주듯이 가장 흔한 고양이의 구강 악성 종양으로 매우 공격적이고, 악성 종양이다. 낮은 전이 발생률은 단지 이 종양을 갖는 고양이의 생존 기간이 짧은 것을 반영한다고 하더라도, 이것은 원발 부위로 거의 전이되지 않는다. 주로 고양이 구강의 해부로 인해 이들 종양에 대해 일반적으로 외과 수술을 실시할 수 없다. 현재, 이 종양의 효과적인 치료법은 없다. 연구에 도입하기에 앞서, 각 고양이는 완벽한 임상 검사, 생체 검사를 하고 컴퓨터 단층 촬영 (CT)한다. 설하 구강 편평상피 세포 종양으로 진단된 고양이는 연구에서 제외한다. 이같은 종양으로 혀가 마비될 수 있으며 처치로 종양을 제거한다고 해도 동물은 스스로 음식을 섭취할 수가 없다. 각 고양이를 반복적으로 오랜 기간에 걸쳐 처치한다. 치료 기간 동안 매일 및 이후의 재검토시에 종양의 사진을 촬영한다. 치료후 각 고양이를 컴퓨터 단층 촬영하고, 그 후 8주마다 컴퓨터 단층 촬영 및 흉부 라디오그램을 평가한다. 자료를 대조군과 비교하여 생존, 반응 및 독성에 있어서 차이에 대해 평가한다. 양성 반응은 바람직하게는 삶의 질의 향상 및(또는) 증가된 수명의 증가와 함께 종양의 퇴화의 증거를 필요로 한다.

또한, 다른 자연 발생 동물 종양, 예를 들어 개, 고양이 및 비비의 섬유육종, 선암, 림프종, 연공종, 평활근육종이 실험될 수 있다. 이들 포유류 중에 개 및 고양이의 유선암은 인간과 매우 비슷한 형태와 반응을 보이기 때문에 바람직한 모델이다. 그러나, 이들 모델의 사용은 동물에서 이 종류의 종양의 드문 발생으로 제한된다.

또한, 당업계에 공지된 다른 시험관내 및 생체내 심혈관, 내피 및 혈관형성 시험도 본원에 적합하다.

2. 조직 분포

본원에서 유전자 증폭 분석법의 결과는 추가적인 연구, 예를 들어 여러 인간 조직에서 mRNA 발현을 측정함으로써 확인될 수 있다.

상기에서 지적했듯이, 여러 조직 내에서 유전자 증폭 및(또는) 유전자 발현은 본원에서 제공하는 서열을 기초로 하여 적합하게 표지된 프로브를 이용하여 통상적인 서던 블롯팅, mRNA 전사를 정량화하기 위한 노던 블롯팅 [Thomas,Proc, Natl. Acad. Sci. USA,77: 5201-5205 (1980)], 도트 블롯팅(DNA 분석) 또는 계내 혼성화에 의해 측정될 수 있다. 별법으로 DNA 이중체, RNA 이중체 및 DNA-RNA 혼성 이중체 또는 DNA-단백질 이중체를 포함하는 특이적 이중체를 인지할 수 있는 항체를 이용할 수 있다.

별법으로, 여러 조직 내의 유전자 발현은 직접적으로 유전자 산물의 발현을 정량화하는 면역학적 방법, 예를 들어 조직 절편의 면역조직화학적 염색 및 세포 배양 또는 체액의 분석법에 의해 측정될 수 있다. 면역조직화학적 염색 및(또는) 시료액의 분석법에 유용한 항체는 모노클로날 또는 폴리클로날 항체이며 임의의 동물에서 제조될 수 있다. 용이하게, 항체는 천연 서열 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드 또는 본원에서 제공하는 DNA 서열을 기초한 합성 펩티드 또는 PRO230, PRO216 또는 PRO302 DNA에 융합되고 특정 항체 에피토프를 코딩하는 외인성 서열에 대해서 제조될 수 있다. 항체를 생산하기 위한 일반적 기술 및 노던 블롯팅 및 계내 혼성화를 위한 특별한 실험방법은 본원의 하기에 제공된다.

3. 항체 결합 연구

또한, 유전자 증폭 연구의 결과는 종양(암) 세포에 대한 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드의 효과를 억제하는 항 PRO230, 항 PRO216 또는 항 PRO302 항체의 능력을 시험하는 항체 결합 연구에 의해 확인될 수 있다. 전형적인 항체에는 후술되는 폴리클로날, 모노클로날, 인간화, 이중특이적 및 이종융합 항체등이 포함된다.

항체 결합 연구는 공지의 분석법, 예를 들어 경쟁적 결합 분석, 직접 및 간접 샌드위치 분석법 및 면역침전 분석법에 수행될 수 있다 [Zola,Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques(CRC Press, Inc. 1987), pp. 147-158].

경쟁적 결합 분석은 제한된 양의 항체와 결합하기 위해 피검 시료 분석물과 경쟁하는 표지된 표준물질의 능력에 좌우된다. 피검 시료 내의 표적 단백질(종양세포내에서 증폭되는 유전자에 의해 코딩된)의 양은 항체에 결합되는 표준물질의 양에 반비례한다. 결합하게 되는 표준물질의 양의 결정을 용이하게 하기 위하여, 항체는 일반적으로 경쟁 전후에 불용화된다. 그 결과, 항체에 결합되는 표준물질과 피검 시료는 결합되지 않고 남아있는 표준물질과 피검 시료로부터 편리하게 분리될 수 있다.

샌드위치 분석법은 검출될 단백질의 상이한 면역원성 부분 또는 에피토프에 각각 결합할 수 있는 2개의 항체의 사용을 수반한다. 샌드위치 분석법에서, 분석될 피검 시료는 고상 지지체 상에 고정된 제1 항체에 의해 결합되고, 이어서 제2 항체는 피검 시료에 결합하여 불용성 3부분 복합체를 형성하게 된다 (미국 특허 제4,376,110호 참조). 제2 항체 자체는 검출가능한 잔기로 표지될 수 있거나 (직접 샌드위치 분석) 또는 검출가능한 잔기로 표지된 항-면역글로블린 항체를 사용하여 측정될 수 있다 (간접 샌드위치 분석). 예를 들어, 샌드위치 분석의 한 종류는 ELISA 분석법으로서, 이 경우 검출가능한 잔기는 효소이다.

면역조직 화학에서, 종양 시료는 신선하거나 또는 동결될 수 있으며, 또는 파라핀에 함침되어 방부제, 예를 들어 포르말린에 고정될 수 있다.

4. 세포 기초 종양 분석법

종양에 대한 세포 기초 종양 분석법 및 동물 모델은 유전자 증폭 분석법의 발견을 확인하는 데 이용될 수 있으며, 또한 본원에서 동정된 유전자와 종양 세포 성장의 발달, 및 심혈관, 내피 및 혈관형성 세포 성장의 병인 사이의 관계를 이해하는 데도 이용될 수 있다. 바람직하지 않은 심혈관, 내피 및 혈관형성 세포 성장, 예를 들어 종양 세포의 발생 및 병리에 있어 본원에서 확인된 유전자 산물의 기능은 본원의 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드에 의해 자극 또는 억제되는 것으로 확인된 세포 또는 세포주를 이용하여 검사할 수 있다. 이같은 세포는 예를 들어 하기 실시예에서 열거되는 세포 또는 세포주를 포함한다.

다른 접근법으로, 특정 심혈관, 내피 및 혈관형성 질환에 관련된다고 공지된 종류의 세포를 본원의 cDNA로 형질 감염시켜, 이들 cDNA의 과다 성장 유도능 또는 억제능을 분석한다. 심혈관, 내피 및 혈관형성 질환인 암인 경우, 적합한 세포에, 예를 들어 B104-1-1 세포주 (neu 전발암유전자로 형질 감염된 안정한 NIH-3T3 세포주) 및 목적하는 유전자로 형질 감염되어 종양원성 성장이 모니터될 수 있는 ras-형질 감염된 NIH-3T3 세포가 포함된다. 이어서, 상기의 형질 감염된 세포주는 형질 전환된 세포의 성장에 대한 세포증식 억제성 또는 세포 독성 활성을 나타내거나 항체 의존적 세포의 세포독성 (ADCC)을 매개함으로써 종양원성의 세포성장을 억제하는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체 또는 항체 조성물의 능력을 시험하는 데에 사용될 수 있다. 또한, 본원에서 동정된 유전자의 코딩 서열로 트랜스펙션된 세포느 암과 같은 심혈관, 내피 및 혈관 형성 질환의 치료를 위한 약물 후보물질의 동정에도 또한 사용될 수 있다.

또한, 안정한 세포주가 바람직하지만, 트랜스제닉(transgenic) 동물(후술되는)의 종양으로부터 유래된 1차 배양물을 본원의 세포 기초 종양 분석법에 이용할 수 있다. 트랜스제닉 동물로부터 연속되는 세포주를 유도하는 기술은 업계에 공지되어 있다 [Small et al.Mol. Cell. Biol.5, 642-648(1985)].

5. 유전자 치료법

본원의 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드 및 폴리펩티드 아고니스트 및 길항제는 상기 폴리펩티드의 생체내 발현에 의해 본 발명에 따라 사용될 수 있으며, 이는 대개 유전자 치료법으로 언급된다.

핵산 (경우에 따라 벡터에 포함된 핵산)을 환자 세포에 삽입하는 두가지 주요 접근법으로 생체내, 생체외 방법이 있다. 생체내 전달법의 경우 통상 환자의 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드를 필요로 하는 부위, 즉 공지된 경우 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드가 합성되는 부위 및 PRO230, PRO216 또는 PRO302의 생물학적 활성을 필요로 하는 부위 (예, 상처)에 직접 주입한다. 생체외 치료법의 경우, 환자의 세포를 얻어, 핵산을 상기의 단리된 세포에 주입하고, 변형된 세포를 환자에게 직접 또는 예를 들어 환자에 이식되는 다공성 막내에 봉입시켜 투여한다 (예, 미국 특허 제 4,892,538호 및 제 5,283,187호). 다양한 기술이 핵산을 생세포 내에 도입하는 데에 이용가능하다. 이 기술은 핵산이 시험관내에서 배양세포로 도입되는 지 또는 생체내에서 원하는 숙주 세포로 도입되는 지에 따라 상이하다. 핵산을 포유동물 세포에 시험관내에서 전달하기에 적합한 기술에는 리포솜, 일렉트로포레이션, 미세주사법, 형질도입, 세포 융합, DEAE-덱스트란, 인산칼슘 침전법 등이 포함된다. 형질도입은 복제 결함의 재조합 바이러스 (바람직하게는 레트로바이러스) 입자와 세포 수용체의 결합, 입자에 함유된 핵산의 세포내 도입을 수반한다. 유전자의 생체외 전달을 위해 통상 사용되는 벡터는 레트로바이러스이다.

현재 바람직한 생체내 핵산 전달 기술에는 바이러스 또는 비-바이러스 벡터 (예, 아데노바이러스, 렌티바이러스, 단순 포진 바이러스 I 또는 아데노 관련 바이러스 (AVV)) 및 지질 기재 시스템 [유전자의 지질 매개된 전달법에 유용한 지질은 예를 들어 DOTMA, DOPE 및 DC-Chol임; Tonkinson et al.,Cancer Investigation 14(1): 54-65 (1996)]를 사용한 트랜스펙션이 포함된다. 유전자 치료법에 사용되는 벡터로는 바이러스, 가장 바람직하게는 아데노바이러스, AAV, 렌티바이러스 또는 레트로바이러스가 가장 바람직하다. 레트로바이러스와 같은 바이러스 벡터는 한가지 이상의 전사 프로모터/인핸서 또는 위치 결정 인자, 또는 교대 스플라이싱, 핵 RNA의 세포질로의 이동 또는 메신저의 번역후 변형과 같은 다른 수단에 의해 유전자 발현을 조절하는 다른 인자를 포함한다. 또한, 레트로바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터는 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드 코딩 유전자의 존재하에서 전사될 때 상기 유전자에 작동가능하게 연결되거나 번역 개시 서열로 작용하는 핵산 분자를 포함한다. 또한, 상기 벡터 구조물은 패키징 시그날, 긴 말단 반복체 (LTR) 또는 그의 일부분 및 사용된 바이러스에 적합한 양성 및 음성 가닥의 프라이머 결합 부위 (바이러스 벡터 내에 이미 존재하지 않는 경우)를 포함한다. 또한, 상기 벡터는 통상 숙주 세포로부터 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드를 분비하기 위한 시그날 서열을 포함한다. 바람직하게는 상기 목적을 위한 시그날 서열은 포유동물의 시그날 서열, 가장 바람직하게는 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드의 천연 시그날 서열이다. 임의로, 벡터 구조물은 또한 폴리아데닐화 시그날 및 하나 이상의 제한 부위 및 번역 종료 서열을 포함할 수 있다. 실시예에서, 상기 벡터는 통상 5'LTR, tRNA 결합 부위, 패키징 시그날, 제2 가닥의 DNA 합성 기점 및 3'LTR 또는 그의 일부분을 포함할 것이다. 다른 벡터로서 비-바이러스, 예를 들어 양이온 지질, 폴리리신 및 덴드리머가 사용될 수 있다.

경우에 따라서, 표적 세포를 표적으로 하는 물질, 예를 들어 세포 표면 막단백질 또는 표적 세포에 특이적인 항체, 표적 세포 상의 수용체 리간드 등을 핵산 공급원에 제공하는 것이 바람직하다. 리포좀이 이용되는 경우 엔도시토시스와 관련된 세포 표면 막 단백질에 결합하는 단백질, 예를 들어 특정 세포형에 반응하는 캡시드 단백질 또는 그의 단편, 순환중에 내재화되는 단백질에 대한 항체, 세포내 위치를 표적하고 세포내 반감기를 향상시키는 단백질이 표적화 및(또는) 수용의 촉진을 위해 사용될 수 있다. 수용체 매개된 엔도시토시스 기술은 예를 들어 문헌 [Wu et al.,J. Biol. Chem.262: 4429-4432 (1982), Wagner et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,87: 3410-34113 (1990)]에 기재되어 있다. 현재 공지된 유전자 마킹법 및 유전자 치료법은 문헌 [Anderson et al.,Science,256: 808-813 (1992)]을 참고한다. 또한, WO 93/25673 및 본원에 열거된 참고 문헌을 참고한다.

레트로바이러스 입자 및 구조 단백질을 제조하기 위한 적합한 유전자 치료법 및 방법은 예를 들어 미국 특허 제 5,681,764호에서 찾아볼 수 있다.

6. 진단제로서의 유전자의 용도

또한, 본 발명은 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드 코딩 유전자의 진단제로서의 용도에 관한 것이다. PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드의 돌연변이는 종양을 유발할 수 있기 때문에 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드의 돌연변이 형태의 검출은 심혈관, 내피 및 혈관 형성 질환 또는 심혈관, 내피 및 혈관 형성 질환, 예를 들어 종양에 대한 감수성의 진단을 가능하게 한다.

인간 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드 코딩 유전자내에 돌연변이를 갖는 개체는 다양한 기술에 의해 DNA 수준에서 검출될 수 있다. 진단용 핵산은 환자의 세포, 예를 들어 혈액, 뇨, 침, 조직 생검 및 검시 물질로부터 얻을 수 있다. 게놈 DNA는 검출에 직접 사용되거나 분석전에 PCR에 의해 효소적으로 증폭될 수 있다 [Saiki et al.,Nature,324: 163-166 (1986)]. 또한, RNA 또는 cDNA도 동일한 목적으로 사용될 수 있다. 예로서, PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드 코딩 핵산에 상보적인 PCR 프라이머는 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드 돌연변이를 확인하고 분석하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 결실 및 삽입은 정상 유전형에 대한 증폭 산물의 크기 변화에 의해 검출될 수 있다. 점 돌연변이는 증폭된 DNA를 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드를 코딩하는 방사성 표지된 RNA 또는 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드를 코딩하는 방사성 표지된 안티센스 DNA와 혼성화하여 확인될 수 있다. 완전하게 일치되는 서열은 RNAase A 절단 또는 융점의 차이에 의해 미스매치된 이중나선체와 구별될 수 있다.

DNA 서열 차이에 기초한 유전자 시험은 변성제 존재 또는 부재하에서 DNA 단편의 전기 영동 이동도의 변화를 검출함으로써 달성된다. 서열의 작은 결실 및 삽입은 고해상도의 겔 전기 영동에 의해 가시화될 수 있다. 상이한 서열의 DNA 단편은 변성 포름아미딘 구배 겔 상에서 구별되며, 상기 겔에서 상이한 DNA 단편의 이동은 그의 비융점 또는 부분적인 융점에 따라 상이한 위치에서 지체된다 [Myers et al.,Science 230: 1242 (1985)].

또한, 특정 위치에서의 서열 변화는 RNAase 및 S1 보호와 같은 뉴클리아제 보호 분석법 또는 화학적 절단법에 의해 밝힐 수 있다 [Proc. Natl. Acad. USA,85: 4397-4401 (1985)].

따라서, 특정 DNA 서열의 검출은 혼성화, RNA 보호법, 화학적 절단볍, DNA 직접 서열 분석법 또는 제한 효소의 이용, 예를 들어 제한 단편 길이 다형성(RFLP) 및 게놈 DNA의 서던 블롯팅을 이용하여 달성될 수 있다.

7. PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드 수준의 검출 용도

보다 통상적인 겔 전기영동법 및 DNA 서열분석법 외에도, 돌연변이는 계내 분석법에 의해 검출될 수 있다.

PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 발현은 혈관 질환 또는 종양 형성과 관련된 신생 혈관생성과 관련된다. PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드가 시그날 서열을 갖고, mRNA가 내피 세포에서 높은 수준으로 발현되고 평활근에서 보다 낮은 수준으로 발현된다면, 이것은 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드가 혈청에 존재한다는 것을 나타낸다. 따라서, PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드 수준 변화는 상기 질환의 지표가 되기 때문에 항 PRO230, 항 PRO216 또는 항 PRO302 폴리펩티드 항체는 혈관 질환 또는 종양 형성과 관련된 신생 혈관형성의 진단에 사용될 수 있다.

경쟁 분석법이 이용될 수 있으며, PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드에 특이적 항체를 고상 지지체에 부착시키고 표지된 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드 및 숙주에서 유래된 시료를 고상 지지체 상에 놓고 고상 지지체에 부착된 표지 검출양이 시료 내의 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드의 양과 관련될 수 있다.

8. 염색체 맵핑

또한, 본 발명의 서열은 염색체 확인에도 유용한다. 서열은 각 인간 염색체 상에 특정 위치를 특이적으로 표적화하고 특정 위치와 혼성화할 수 있다. 또한, 현재 염색체 상의 특정 부위의 확인이 요구되고 있다. 실제 서열 데이타 (반복 다형성)에 기초한 몇몇 염색체 마킹제가 현재 염색제 위치의 마킹에 이용가능하다. 본 발명에 따라 염색체에 대한 DNA 맵핑은 이들 서열을 질병과 관련된 유전자와 연관시키는 중요한 첫 단계이다.

간략하게 서열을 cDNA로부터 PCR 프라이머 (바람직하게는 15 내지 25 bp)를 제조함으로써 염색체에 맵핑할 수 있다. 3'-비번역 영역에 대한 컴퓨터 분석은 게놈 DNA 내의 단지 하나의 엑손에 걸친 프라이머를 신속하게 선별하는데 사용하며, 따라서 증폭 과정을 복잡하게 만든다. 이어서, 이들 프라이머는 각 인간의 염색체를 함유하는 체세포 하이브리드의 PCR 스크리닝에 사용한다. 프라이머에 대응하는 인간 유전자를 함유하는 하이브리드만이 증폭 단편을 생성할 것이다.

체세포 하이브리드의 PCR 맵핑은 특정 DNA를 특정 염색체에 대응시키는 신속한 방법이다. 동일한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용한 본 발명을 사용하여 특정 염색체로부터의 단편 또는 유사한 방법으로 큰 게놈 클론의 풀을 이용하여 세부 위치를 지정할 수 있다. 유사하게 염색체에 맵핑하는 데 이용될 수 있는 다른 맵핑 방법에는 계내 혼성화, 표지된 유동 분류된 염색체를 이용한 예비 스크리닝 및 염색체 특이적 cDNA 라이브러리를 제작하기 위한 혼성화 예비 선별법이 포함된다.

중기 염색체 스프레드에 대한 cDNA 클론의 형광 계내 혼성화 (FISH)는 한 단계로 정확한 염색체 위치를 제공하는 데 사용할 수 있다. 본 기술은 500 또는 600개의 염기 길이의 짧은 cDNA를 사용하여 이용할 수 있다. 그러나, 2000 bp보다 큰 클론은 간단한 검출을 위해 충분한 시그날 강도로 고유 염색체 위치에 결합할 가능성이 높다. FISH는 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 유래된 클론의 사용을 필요로 하며, 유전자의 길이가 길수록 더 바람직하다. 예를 들어 2000 bp가 바람직하며, 4000 bp가 보다 바람직하며, 4000을 초과하는 것은 시간에 합당한 퍼센트의 우수한 결과를 얻는 데에는 필수적이지는 않을 것처럼 보인다. 본 기술에 대해 문헌 [Verma et al., Human Chromosomes:a Manual of Basic Techniques(Pergamon Press. New York. 1988)]을 참고한다.

서열이 정확한 염색체 위치에 맵핑되면, 염색체 상의 서열의 물리적 위치는 유전자 지도 데이타와 연관될 수 있다. 상기 데이타는 예를 들어 문헌 (V. McKusick Mendelian Inheritance in Man - John Hopkins University Welch Medical Library를 통해 온라인으로 이용가능)에서 확인된다. 동일한 염색체 영역에 맵핑된 유전자와 질병 사이의 관계는 연관 분석을 통해 확인한다 (물리적으로 인접한 유전자의 동시 유전성).

이어서, 이환 개체와 비이환 개체 사이의 cDNA 또는 게놈 서열에서의 차이점을 결정하는 것이 필요하다. 돌연변이가 이환된 개체의 일부 또는 전체에서 발견되고 정상 개체에서는 발견되지 않을 경우, 돌연변이가 질병의 원인이 될 것이다.

물리적 맵핑 및 유전자 맵핑 기술의 최근 분석능에 따르면, 질병과 관련된 염색체 영역에 정확하게 위치 지정된 cDNA는 50 내지 500개의 가능한 원인 유전자중 하나가 될 수 있다 (이는 1 메가베이스 맵핑 분석능 및 20 kb 당 한개의 유전자를 추정함).

9. 약물 후보물질의 스크리닝 분석법

본 발명은 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드를 모방하는 화합물 (아고니스트)을 확인하고 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드의 영향을 방지하는 화합물 (길항제)을 스크리닝하는 방법을 포함한다. 길항제 약물 후보에 관한 스크리닝 분석법을 설계하여 본원에서 확인된 유전자에 의해 코딩된 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드와 결합하거나 복합체를 이루거나, 또는 코딩된 폴리펩티드와 다른 세포내 단백질의 상호작용을 방해하는 화합물을 확인하였다. 이러한 스크리닝 분석법은 화학 물질 라이브러리에 대해 고처리 스크리닝할 수 있는 분석법을 포함하며, 이는 작은 분자의 약물 후보를 확인하는데 특히 적합할 것이다.

상기 분석법은 당업계에서 잘 특성화된 단백질-단백질 결합 분석법, 생화학적 스크리닝 분석법, 면역분석법 및 세포계 분석법을 비롯한 다양한 포맷으로 수행할 수 있다.

길항제에 관한 모든 분석법의 공통점은 상호작용하기에 충분한 조건 및 시간 동안 약물 후보와 본원에서 확인된 핵산에 의해 코딩된 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드의 접촉을 요구하는 점이다.

결합 분석법에서, 상호작용은 결합하는 것이며, 형성된 복합체는 단리하거나 반응 혼합물에서 검출할 수 있다. 특정 실시태양에서, 본원에서 확인된 유전자에 의해 코딩된 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드 또는 약물 후보는 공유적 부착 또는 비공유적 부착에 의해 고체상, 예를 들어 마이크로타이터 플레이트에 고정된다. 비공유적 부착은 일반적으로 고체 표면을 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드 용액으로 코팅하고 건조함으로써 달성된다. 별법으로, 고정화 항체, 예를 들어 고정된 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드에 특이적인 모노클로날 항체를 사용하여 그를 고체 표면에 앵커링할 수 있다. 이 분석은 검출가능한 표지로 표지될 수 있는 비고정 성분을 고정 성분, 예를 들어 앵커링된 성분을 포함하는 코딩 표면에 부가함으로써 수행할 수 있다. 반응이 종결되었을 때, 반응하지 않은 성분은 예를 들어 세척에 의해 제거되며, 고체 표면에 앵커링된 복합체가 검출된다. 본래 고정되지 않은 성분이 검출가능한 표지를 포함하는 경우, 표면에 고정된 표지의 검출은 복합체 형성 반응이 일어났음을 나타낸다. 본래 고정되지 않은 성분이 표지를 포함하지 않는 경우, 예를 들어 고정된 복합체와 특이적으로 결합하는 표지된 항체를 사용하여 복합체 형성 반응을 검출할 수 있다.

후보 화합물이 본원에서 확인된 유전자에 의해 코딩된 특정 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드와 상호작용하지만 결합하지 않는 경우, 후보 화합물과 이 폴리펩티드의 상호작용은 단백질-단백질 상호작용을 검출하는 잘 알려진 방법에 의해 분석할 수 있다. 이러한 분석법에는 통상의 방법, 예를 들어 가교형성법, 공동면역침전법, 및 구배 또는 크로마토그래피 컬럼을 통한 공동정제법이 포함된다. 또한, 단백질-단백질 상호작용은 문헌 [Fields and co-workers (Fields and Song,Nature(London), 340:245-246 (1989), Chien et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:9578-9582 (1991)) as disclosed by Chevray and Nathans,Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 89:5789-5793 (1991)]에 기재된 효모류 유전자 시스템을 사용하여 모니터링할 수 있다. 많은 전사 활성자, 예를 들어 효모 GAL4는 물리적으로 구별되는 2개의 모듈형 도메인으로 이루어져 있는데, 한 도메인은 DNA-결합 도메인으로 작용하고, 나머지 한 도메인은 전사-활성 도메인으로 작용한다. 상기 문헌에 기재된 효모 발현계 (일반적으로, "2-하이브리드계"로 언급됨)는 이러한 특성을 이용하며, 2가지 하이브리드 단백질을 사용하는데, 이 중 하나는 표적 단백질이 GAL4의 DNA-결합 도메인과 융합된 것이며, 다른 하나는 후보 활성 단백질이 활성 도메인과 융합된 것이다. GAL4-활성 프로모터의 조절하에 GAL1-lacZ 리포터 유전자의 발현은 단백질-단백질 상호작용을 통한 GAL4 활성의 재구성에 따라 좌우된다. 상호작용 폴리펩티드를 포함하는 콜로니는 β-갈락토시다제에 대한 색소생산성 기질을 사용하여 검출한다. 2-하이브리드 기술을 사용하여 2종의 특이적인 단백질사이의 단백질-단백질 상호작용을 확인하는 완성형 킷트 (MATCHMAKER, 등록상표)는 클론테크사에서 구입할 수 있다. 또한, 이 시스템을 확장하여 특이적 단백질 상호작용에 관여하는 단백질 도메인을 매핑할 수 있을뿐 아니라, 이러한 상호작용에 결정적인 아미노산 잔기의 위치를 정확하게 나타낼 수 있다.

하기의 방법으로, 본원에서 동정된 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드를 코딩하는 유전자와 다른 세포내 또는 세포외 성분의 상호작용을 방해하는 화합물을 시험할 수 있다. 유전자 산물과 세포내 또는 세포외 성분을 포함하는 반응 혼합물을 두 생성물의 상호작용 및 결합을 허용하는 조건 및 시간하에 제조하였다. 결합을 저해하는 후보 화합물의 능력을 시험하기 위해, 시험 화합물의 존재 및 부재하에 반응을 수행하였다. 또한, 양성 대조군 역할을 하는 제3의 반응 혼합물에 위약을 첨가할 수 있다. 혼합물에 존재하는 시험 화합물과 세포내 또는 세포외 성분사이의 결합(복합체 형성)을 상기 기재된 바와 같이 모니터링하였다. 대조 반응물에서는 복합체가 형성되었으나 시험 화합물을 포함하는 반응 혼합물에서 복합체가 형성되지 않은 것은 시험 화합물이 시험 화합물과 그의 반응 대응물의 상호작용을 방해한다는 사실을 나타낸다.

PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드가 동시 분열 촉진제, ConA의 존재하에서 내피 세포의 증식을 자극능을 갖는 경우, 스크리닝 방법의 한 예는 상기 활성에 잇점을 갖는다. 구체적으로, 증식 분석법에서, 인간 제대 동맥 내피 세포를 얻어 96웰 편평 바닥 배양 플레이트 (Costar, Cambridge, MA)에서 배양하고 세포의 증식을 용이하게하기에 적합한 반응 혼합물을 , Con-A (Calbiochem, La Jolla, CA)를 함유하는 혼합물을 보충하였다. Con-A 및 스크리닝되는 화합물을첨가하고 37℃에서 인큐베이션한 후 배양액을 3H-티미딘으로 펄스를 준 후 유리 섬유 필터 (phD, Cambridge Technology, Watertown, MA) 상에 회수하였다. 3개의 배양액의 티미딘 결합량의 평균 (cpm)을 액체 신틸레이션 카운터 (Beckman Instruments, Ivine, CA)로 측정하였다. 3(H)티미딘의 유의한 결합량은 엔도텔린 세포 증식의 자극을 나타낸다.

길항제를 분석하기 위해, PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드를 화합물과 함께 세포에 첨가하여 특정 활성을 스크리닝할 수 있었으며, PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드의 존재하에 목적 활성을 저해하는 화합물의 능력은 이 화합물이 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드에 대한 길항제임을 나타내었다. 별법으로, 경쟁적 저해 분석을 위해 적절한 조건하에 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드 및 잠재적인 길항제를 막-결합 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드 수용체 또는 재조합 수용체와 함께 결합시킴으로써 길항제를 검출할 수 있었다. PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드를 예를 들어 방사 활성 동위원소로 표지하여, 수용체와 결합하는 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드 분자의 수를 이용하여 잠재적인 길항제의 효과를 결정할 수 있었다. 당업자에게 공지된 여러 방법, 예를 들어 리간드 패닝법 및 FACS 분류법 (Coligan et al.,Current Protocols in Immun., 1(2): Chapter 5 (1991))에 의해 수용체를 코딩하는 유전자를 확인할 수 있었다. 바람직하게는, 발현 클로닝법이 사용되는데, 여기서 폴리아데닐화 RNA는 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드에 대해 반응성인 세포로부터 제조되며, 이 RNA로부터 생성된 cDNA 라이브러리는 푸울로 분류되어 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드에 대해 비반응성인 COS 세포 또는 다른 세포를 트랜스펙션시키는데 사용된다. 글래스 슬라이드에서 증식하는 트랜스펙션된 세포는 표지된 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드에 노출된다. 부위-특이적 단백질 키나제에 관한 인식 부위의 요오드화 또는 봉입화를 비롯한 여러 방법에 의해 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드를 표지할 수 있었다. 고정화하고 인큐베이션한 다음, 슬라이드를 오토라디오그래피법으로 분석하였다. 양성 푸울을 동정하여 서브-푸울을 제조하고, 상호작용 서브-푸울링 및 재스크리닝 방법을 이용하여 재트랜스펙션시킴으로써, 결국 추정의 수용체를 코딩하는 단일 클론을 산출하였다.

수용체를 확인하는 다른 방법으로, 표지된 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드를 세포막 또는 수용체 분자를 발현시키는 추출물 시료와 함께 광친화성-연결할 수 있었다. PAGE에 의해 가교 물질을 분석하고 엑스선 필름에 노출시켰다. 수용체를 포함하는 표지 복합체를 자르고 펩티드 단편으로 분해하여 단백질 마이크로-시퀀싱처리할 수 있었다. 마이크로-시퀀싱으로부터 얻어진 아미노산 서열을 사용하여 축퇴 올리고뉴클레오티드 프로브 한 세트를 설계함으로써 cDNA 라이브러리를 스크리닝하고 추정의 수용체를 코딩하는 유전자를 확인할 수 있었다.

다른 길항제 분석 방법으로, 후보 화합물의 존재하에 수용체를 발현하는 포유류 세포 또는 막 시료를 표지된 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드와 함께 인큐베이션하였다. 그 후에, 상기 상호작용을 강화 또는 차단하는 화합물의 능력을 측정할 수 있었다.

심혈관, 내피 및 혈관 형성 질환의 치료에 유용한 조성물에는 예를 들어 표적 유전자의 발현 및(또는) 활성을 억제하는 항체, 작은 유기 및 무기 분자, 펩티드, 포스포펩티는, 안티센스 및 리보자임 분자, 삼중나선 분자 등이 포함되나 이에 한정되지는 않는다.

효능적인 길항제의 보다 구체적인 예에는 면역글로불린과 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드의 융합체, 및 특히 폴리- 및 모노클로날 항체, 및 항체 단편, 측쇄 항체, 항-유전자형 항체, 및 이러한 항체 또는 그의 단편의 키메라 형태 또는 인간화 형태, 및 인간 항체 및 항체 단편을 비롯한 항체 (이에 한정되지는 않음)와 결합하는 올리고뉴클레오티드이다. 또는, 효능적인 길항제는 밀접하게 관련된 단백질, 예를 들어 수용체를 인식하지만 영향을 주지는 않으며, 따라서 PRO 폴리펩티드의 작용을 경쟁적으로 저해하는 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드의 변이된 형태일 수 있다.

또다른 효능적인 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드 길항제는 안티센스 기술을 사용하여 제조한 안티센스 RNA 또는 DNA 작제물인데, 여기서 안티센스 RNA 또는 DNA 분자는 표적 mRNA와 혼성화하여 단백질 번역을 방지함으로써 mRNA의 번역을 직접 차단하는 작용을 한다. 안티센스 기술을 사용하여 삼중나선 형성 또는 안티센스 DNA 또는 RNA를 통한 유전자 발현을 조절할 수 있는데, 이 방법들은 모두 폴리뉴클레오티드와 DNA 또는 RNA의 결합을 토대로 한다. 예를 들어, 본원에서 성숙 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열의 5'코딩 부분을 사용하여 염기쌍 약 10 내지 40개 길이의 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드를 설계할 수 있다. DNA 올리고뉴클레오티드는 전사에 관여하는 유전자 영역에 대해 상보적이도록 설계하여 [삼중나선-Lee et al.,Nucl. Acids Res., 6: 3073 (1979), Cooney et al,,Science, 241: 456 (1988), Dervan et al.,Science, 251: 1360 (1991) 참조) 전사 및 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드의 생산을 방지하였다. 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드는 생체내에서 그의 mRNA와 혼성화하여 mRNA 분자의 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드로의 번역을 차단하였다 [안티센스 - Okano,Neurochem., 56: 560 (1991),Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression(CRC Press: Boca Raton, FL, 1988) 참조]. 또한, 상기 기재된 올리고뉴클레오티드를 세포에 전달하여 안티센스 RNA 또는 DNA를 생체내에서 발현시킴으로써 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드의 생산을 억제할 수 있었다. 안티센스 DNA가 사용되는 경우, 전사-개시 부위, 예를 들어 표적 유전자 뉴클레오티드 서열의 약 -10 내지 +10 위치로부터 유도된 올리고데옥시리보뉴클레오티드가 바람직하였다.

안티센스 RNA 또는 DNA의 길이는 통상 약 5개 이상의 염기, 약 15개 이상의 염기, 약 20개 이상의 염기, 약 25개 이상의 염기, 약 30개 이상의 염기, 약 40개 이상의 염기, 약 45개 이상의 염기, 약 50개 이상의 염기, 약 55개 이상의 염기, 약 60개 이상의 염기, 약 65개 이상의 염기, 약 70개 이상의 염기, 약 75개 이상의 염기, 약 80개 이상의 염기, 약 85개 이상의 염기, 약 90개 이상의 염기, 약 100 개 이상의 염기, 또는 그 이상의 염기이다.

효능적인 길항제에는 활성 부위, 수용체 결합 부위와 결합하는 작은 분자, 또는 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드의 증식 인자 또는 다른 관련 결합 부위와 결합하여 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드의 정상적인 생물학적 활성을 차단하는 작은 분자가 포함된다. 작은 분자의 예에는 작은 펩티드 또는 펩티드계 분자, 바람직하게는 가용성 펩티드, 및 합성 비펩티딜 유기 또는 무기 화합물이 포함되나 이에 한정되지 않는다.

리보자임은 RNA의 특이적인 절단을 촉매할 수 있는 효소 RNA 분자이다. 리보자임은 그와 상보적인 표적 RNA와 서열-특이적 혼성화한 다음, 엔도누클레아제에 의해 절단됨으로써 작용한다. 공지된 기술로 효능적인 RNA 표적내의 특이적인 리보자임 절단 부위를 확인할 수 있었다. 보다 자세한 사항은 예를 들어 문헌(Rossi,Current Biology, 4:469-471 (1994) 및 PCT publication No. WO 97/33551(published September 18, 1997))을 참조한다.

전사를 억제하는데 사용되는 삼중나선 형태의 핵산 분자는 단일-가닥이어야하며, 데옥시뉴클레오티드로 이루어져야 한다. 이러한 올리고뉴클레오티드의 염기 조성은 그가 Hoogsteen 염기쌍 규칙을 통해 삼중나선 형성을 촉진하게끔 설계되어 있는데, 삼중나선 형성에는 일반적으로 이중쇄 중 한 쇄에 상당한 크기의 퓨린 또는 피리미딘 스트레치가 있어야 한다. 보다 자세한 사항은 예를 들어 문헌 (PCT publication No. WO 97/33551, supra.)을 참조한다.

상기 작은 분자들은 상기 기재된 임의 한가지 이상의 스크리닝 분석법 및(또는) 당업자에게 잘 알려진 임의 다른 스크리닝 기술에 의해 확인할 수 있다.

10. 치료되는 심혈관, 내피 및 혈관형성 질환의 유형

본원에서 기재된 심혈관, 혈관형성 및 내피 분석법에 활성을 갖고/갖거나, 유전자 산물이 심혈관계에 분포하는 것으로 확인된 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드 또는 그의 아고니스트 또는 길항제는 혈관에 영향을 주는 전신성 질환, 예를 들어 당뇨병을 포함하여 여러가지 심혈관, 내피 및 혈관형성 질환에 있어 치료 용도를 갖을 것으로 보인다. 이들의 치료 용도에는 동맥, 모세혈관, 정맥 및(또는) 림프관 질환이 포함된다. 이것에 의한 치료에는 근육 소모병의 치료, 골다공증의 치료, 이식편 고정시 이식편 주변 세포의 성장을 자극함으로써 의도된 부위에 대한 부착이 용이하도록 돕고, 조직 내 또는 혈청내 IGF 안정성을 증가시키고, IGF 수용체와의 결합을 증가시키는 것을 포함한다 (IGF는 시험관 내에서 인간 골수적혈구 및 과립구 기원 세포 성장을 향상시키기 때문에).

또한, PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드 또는 그의 아고니스트 또는 길항제는 적혈구형성 또는 과립구생성의 자극, 상처 치유 또는 조직 재생 및 그와 관련된 조직 (예, 결합 조직, 피부, 뼈, 연골, 근육, 폐 또는 신장)의 재성장에 관한 치료법의 자극, 혈관형성의 자극, 내피 세포 이동의 자극 또는 억제, 혈관 평활근의 성장 및 내피 세포 생산의 증가에 사용될 수 있다. PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드 또는 길항제에 의해 매개되는 혈관형성의 증가는 허혈성 조직 및 관상 협착에 이은 심장내 측부 관상 발생에 유익할 것이다. PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드가 결합 조직의 생성을 촉진하는 경우, 길항제는 상기 작용을 억제하기 위해, 예를 들어 상기 폴리펩티드의 상치 치유 또는 폐섬유증 발생시 과도한 결합 조직의 생성을 제한하기 위해 사용된다. 이는 급성 심근 경색증 및 심부전증의 치료를 포함한다.

또한, 본 발명은 치료 유효량의 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드 또는 그의 아고니스트 또는 길항제를 투여함으로써 기본적인 병인과 무관하게 심비대증의 치료에 관한 것이다. 인간 환자의 치료를 목적으로 하는 경우, PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드는 재조합 인간 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드 (rhPRO230, rhPRO216 또는 rhPRO302 폴리펩티드)가 바람직하다. 심비대증의 치료는 심근 경색증, 고혈압, 비대성 심근병증 및 판역류를 비롯한 여러가지 다양한 병리학적 질환으로부터 유발되는 그의 여러 단계에서 수행될 수 있다. 치료는 기본적인 심질환과 무관하게 심근의 구조적인 손상과 함께 또는 손상없이 심비대증의 모든 진행 단계에 미친다.

본 발명에 따른 분자의 길항제와는 반대로 임의의 특정 증세에 대한 분자 자체 또는 그의 아고니스트를 이용할 지를 결정하는 것은 주로 본원의 분자가 심혈관 형성, 내피 세포의 형성 또는 혈관 형성을 촉진하거나 상기 질환을 억제하는 가에 따라 결정된다. 예를 들어, 분자가 혈관형성을 촉진하는 경우, 그의 길항제는 혈관형성의 제한 또는 예방을 필요로 하는 질환의 치료에 유용하다. 상기 질환의 예로는 혈관종, 종양 혈관생성, 당뇨성 망막병증 또는 미성숙 영아의 막막병증 또는 황반 변성과 관련된 망막, 맥락막, 각막에서의 신생 혈관형성, 및 증식 유리체 망막병증, 류마티스성 관절염, 크론병, 아테롬성경화증, 난소 과자극, 건선, 신생 혈관형성과 관련된 자궁내칵증, 풍성 혈관성형술 후 재발협착증, 예를 들어 수술후 형성되는 켈로이드성으로 보이는 흉터조직 과발현, 심근 경색 후 섬유증 또는 폐섬유증과 관련된 섬유 손상이 포함된다.

그러나, 분자가 혈관형성을 억제하는 경우 상기 질환의 치료에 직접 이용될 것으로 기대된다.

반면, 분자가 혈관형성을 자극하는 경우 혈관형성을 필요로 하는 증세, 예를 들어 주변 혈관 질환, 고혈압, 염증성 혈관염, 레이노병 및 레이노 현상, 동맥류, 동맥 재발협착증, 혈전성 정맥염, 림프관염, 림프부종, 상치 치유 및 조직 손상, 허혈성 재관류 손상, 협심증, 심근 경색증 (예, 급성 심근 경색증), 만성 심장 질환, 심부전증 (예, 울혈성 심부전증) 및 골다공증에 대해 그 자체로 (또는 그의 아고니스트)가 사용할 것이다.

그러나, 분자가 혈관형성을 억제하는 경우, 그의 길항제는 혈관생성이 요구되는 질환의 치료에 유용할 것이다.

질병의 상세한 형태는 후술되어 있으며, 본원의 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드 또는 그의 길항제는 혈관 관련 약물 표적화에 유용하며 질환의 치료 및 예방의 치료 표적으로서 작용한다. 아테롬성 경화증은 지질의 축적, 평활근 세포의 증식 및 대동맥 혈관벽 섬유 조직의 형성으로 인한 동맥 내막 비후 플라크가 축적하는 특성을 갖는다. 질환은 임의의 기관의 대형동맥, 중형동맥 및 소동맥에 영향을 줄 수 있다. 내피 및 혈관 평활근 세포 기능의 변화는 상기 플라크의 축적 및 퇴화를 조절하는 데 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.

고혈압은 체동맥, 폐동맥 또는 문맥 정맥계의 혈압 상승의 특징을 갖는다. 혈압상승은 손상된 내피 기능 및(또는) 혈관 질환으로부터 유발되거나, 이를 유발시킨다.

염증성 혈관염은 거대 세포성 대동맥염, 타카야수 동맥염, 결정성다발 동맥염 (미세혈관병성 형태 포함), 가와사키병, 현미경적 다발성 혈관염, 베게너 육아종 및 여러 감염 관련 혈관 질환 (헤노호 자반병 포함)이 포함된다. 내피세포 기능의 변화는 상기 질환에 중요한 것으로 보인다.

레이노병 및 레이노 현상은 추위에 노출된 사지를 통한 순환의 간헐성 비정상적 손상의 특성을 갖는다. 내피세포 기능의 변화는 상기 질환에 중요한 것으로 보인다.

동맥류는 내피 세포 및(또는) 평활근 혈관 세포의 기능 변화와 관련된 동맥또는 정맥계의 낭상 또는 방추형 확장이다.

동맥 협착증 (동맥벽 협착증)은 혈관 성형술 후에 내피 및 혈관 평활근 세포의 기능 및 증식에 있어서의 변화의 결과로서 발생된다.

혈전성 정맥염 및 림프관염은 정맥 및 림프관 각각의 염증 질환으로 내피 세포 기능의 변화를 유발하거나 이로 인해 유발된다. 유사하게, 림프부종은 내피 세포 기능 변화로 인한 림프관 손상과 관련된 질병이다.

양성 및 악성 혈관 종양군은 혈관계의 세포 인자의 비정상적 증식 및 성장의 특성을 갖는다. 예를 들어, 림프관종은 신생아에서 통상 발생하는 림프관의 선천성 흔히 낭성 기형인 림프계 양성 종양이다. 낭종성 종양은 통상 경부 및 겨드랑 부위에서 발생한다. 또한, 이들은 사지의 연조직에서 발생할 수 있다. 주요 증상은 팽창되고, 경우에 따라 망상 구조의 림프관 및 결합조직에 의해 둘러싸인 림프 낭종이다. 림프관종은 부적절하게 결합된 태아 림프관 또는 림프관의 결손에 의해 유발되는 것으로 보인다. 결과는 손상된 국부의 림프 배출이다 [Griener et la., Lymphology, 4:140-144 (1971)].

본원의 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드 또는 그의 길항제의 또다른 용도는 종양의 성장 및(또는) 전이를 가능하게 하는 종양의 혈관신성과 관련된 종양 혈관형성의 예방이다. 상기 과정은 신생 혈관의 성장에 의존한다. 종양 혈관형성을 수반하는 신생 종양 및 관련 질환에는 유방암, 폐암, 위암, 식도암, 결장직장암, 간암, 난소암, 난포막종, 남성배종, 자궁경부암, 자궁내막암, 자궁내막 과형성, 자궁내막증, 섬유육종, 융모암, 머리 및 목암, 비인강암, 후두암, 간모세포종,카포시육종, 흑색종, 피부암, 혈관종, 해면혈관종, 혈관세포종, 췌장암, 망막모세포종, 성상세포종, 교모세포종, 슈반종, 핍지교종, 수모세포종, 신경모세포종, 횡문근육종, 골원성육종, 평활근육종, 요도암, 갑상선암, 윌름스종양, 신세포암, 전립선암, 모반증 관련된 혈관의 비정상 증식, 부종 (예, 뇌종양과 관련된 부종) 및 메이그 증후군이 포함된다.

노화 관련 황반 변성 (AMD)는 노인의 심각한 시력 상실의 주된 원인이다. AMD의 삼출형태는 맥락 신생 혈관형성 및 망막 색소 내피 세포 박리의 특성을 갖는다. 맥락 신생 혈관은 예후의 극적인 악화와 관련되기 때문에 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드 또는 그의 길항제가 AMD의 중증도를 감소시키는데 유용할 것으로 예상된다.

또한, 상처 치유 및 조직 복구와 같은 외상 치유도 본원의 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드 또는 그의 길항제의 표적화된 용도이다. 신생 혈관의 형성 및 퇴화는 조직 치유 및 복구에 필수적이다. 본 용도에는 뼈, 연골, 건, 인대 및(또는) 신경조직 성장 또는 재생, 및 상처 치유 및 조직 복구 및 대체, 및 화상, 절개 및 궤양의 치료가 포함된다. 뼈가 정상적으로 형성되지 않는 환경에서 연골 및(또는) 뼈의 성장을 유도하는 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드 또는 그의 길항제는 인간 및 다른 동물에서 골절 및 연골 손상 또는 결함에 있어 용도를 갖는다. PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드 또는 그의 길항제를 이용하는 상기 제제는 폐쇄 및 개방 골절 감소 및 인공 관절의 고정의 향상에 있어 예방적 용도를 갖는다. 골형성제에 의해 유도되는 신규 뼈형성은 유전적 외상 유도된, 종양성,절제 유도된 두개안면 결함의 복구에 기여하며, 또한 성형수술에 유용하다.

또한, PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드 또는 그의 길항제는 압력궤양, 혈관 부전증과 관련된 궤양, 외과 및 외상성 상처 등을 포함하는 (이에 한정되지는 않음) 비치유 상처의 보다 우수하고 신속한 봉합을 촉진하는 데 유용할 수 있다.

또한, PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드 또는 그의 길항제가 조직 (예, 췌장, 간, 장, 신장, 피부 또는 내피), 근육 (평활근, 골격근, 또는 심근 포함) 및 혈관(혈관 내피 포함) 조직의 형성 또는 재생, 및 상기 조직을 포함하는 세포의 성장 촉진에 대한 활성을 나타낼 수 있는 것으로 예상된다. 원하는 일부 효과는 정상 조직이 재생되도록 섬유성 상처의 억제 또는 조절에 의할 수 있다.

또한, 본원의 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드 또는 그의 길항제는 장관 보호, 또는 폐 또는 간섬유증의 재생, 여러 조직에서의 재관류 손상, 및 전신성 싸이토카인 손상으로 인한 질병의 치료에 유용할 수 있다.

또한, 본원의 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드 또는 그의 길항제는 전구 조직 또는 세포로부터 상기한 조직의 발생을 촉진 또는 억제하거나, 상기한 조직의 성장을 억제하는 데 유용할 수 있다.

또한, PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드 또는 그의 길항제는 치주 질환의 치료 및 다른 치아 복구 과정에 유용할 수 있다. 상기 제제는 골형성 세포를 유인하고, 골형성 세포 성장을 촉진하고 골형성 세포의 기원세포의 분화를 유도하는 환경을 제공할 수 있다. 혈관은 뼈의 교환율 및 성장의 조절에 중요한 역할을하기 때문에 본원의 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드 또는 그의 길항제는 뼈 및 (또는) 연골 복구의 자극, 또는 염증 또는 염증 과정에 의해 매개되는 조직 파괴 (콜라게나제 활성, 파골세포 활성 등) 과정을 차단함으로써 골다공증 또는 골관절염의 치료에 유용할 수 있다.

본원의 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드 또는 그의 길항제가 보유할 수 있는 재생 활성의 다른 용도는 건/인대 형성이다. 건/인대 유사 조직 또는 다른 조직이 정상적으로 형성되지 않는 조건에서 상기 조직 형성을 유도하는 단백질은 인간 및 다른 동물에서 인대 파열, 기형 및 다른 건 또는 인대 결함의 치료에 용도를 갖는다. 상기 제제는 건 또는 인대 조직에 대한 손상을 방지하는 예방적 용도 및 건 또는 인대의 뼈 또는 다른 조직으로의 고정의 향상 및 건 또는 인대 조직의 결함을 복구하는 데 있어서의 용도를 갖는다. 본원의 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드 또는 그의 길항제의 조성물에 의해 유도된 신생 건/인대 유사 조직의 형성은 유전적, 외상 유도되거나, 또는 다른 기원의 다른 건 또는 인대 복구에 기여하며, 또한 건 또는 인대의 부착 또는 복구를 위한 성형 수술에 유용하다. 본원의 조성물은 건 또는 인대 형성 세포를 유인하고, 건 또는 인대 형성 세포의 성장을 자극하고, 건 또는 인대 형성 세포의 기원세포의 분화를 유도하거나, 생체내 조직 복구에 유효한 복구를 위해 생체외 건/인대 세포 또는 기원세포의 성장을 유도하는 환경을 제공할 수 있다. 또한, 본원의 조성물은 건염, 수근관 증후군 및 다른 건 또는 인대 결함의 치료에 유용하다. 또한 조성물은 당업계에 공지된 담체로서 적합한 매트릭스 및 (또는) 결합제를 포함할 수 있다.

또한, PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드 또는 그의 길항제는 신경 세포의 증식 및 신경 및 뇌 조직의 재생, 즉 중추 및 말초 신경계 질환 및 신경병증 및 신경세포 또는 신경 조직에 퇴화, 사망 또는 외상을 수반하는 기계적 및 외상성 질환의 치료에 유용할 수 있다. 보다 상세하게는, PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드 또는 그의 길항제는 말초 신경계, 예를 들어 말초 신경 손상, 말초 신경병증, 국소 신경병증 및 중추 신경계 질환, 예를 들어 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 근위측성 측삭 경화증 및 샤이-드래거 증후군의 치료에 사용될 수 있다. 본 발명으로 치료될 수 있는 다른 질병에는 기계 및 외상 질환 (예, 척수 질환), 두부외상 및 뇌혈관질환 (예, 뇌졸증)을 포함한다. 또한, 화학요법 및 다른 치료법의 결과로 인한 말초 신경병증은 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드 또는 그의 길항제를 이용하여 치료가능할 수 있다.

허혈성 재관류 손상은 또다른 증상이다. 내피 세포 기능장애는 허혈성 재관류 손상에 이어 발생하는 후유증의 개시 및 조절에 있어 중요할 수 있다.

류마티스성 관절염은 또다른 증상이다. 혈관 세포 성장 및 혈관계를 통한 염증 세포의 표적화는 류마티스성 및 혈청반응 음성 관절염 형태의 발병기전에 있어 중요한 요소이다.

또한, PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드 또는 그의 길항제는 심비대 환자에게 질병의 진행을 예방하고 무증상 환자의 사망을 비롯한 급사를 방지하기 위해 예방적으로 투여될 수 있다. 상기 예방 치료법은 특히 좌심실 심비대증 (성인의 경우 최대 벽두께가 35 mm 이상이거나 어린이에서 유사한 값)으로 진단받은환자의 경우, 또는 심장에 혈역학적 하중이 특히 강한 경우에 허용된다.

또한, PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드 또는 그의 길항제는 비대성 심근병증으로 진단받은 환자의 상당한 부분에서 발생되는 동맥 세동의 치료에 유용할 수 있다.

또다른 증상에는 협심증, 심근 경색증 (예, 급성 심근 경색증) 및 심부전증 (예, 울혈성 심부전증)이 포함된다. 또다른 비-종양성 질환에는 건선, 당뇨 및 다른 증식 망막병증 (예, 미숙아 망막병증), 수정체 후부섬유증식증, 신생혈관 녹내장, 갑상선 과형성증 (예, 그레이브병), 각막 및 다른 조직 이식, 만성 염증, 폐렴, 신증후군, 자간전증, 복수증, 심낭삼출 (예, 심낭염과 관련된 경우) 및 흉막삼출이 포함된다.

상기를 고려하여, 내피 세포 기능, 증식 및(또는) 형성을 변화시키거나 영향을 주는 것으로 나타난 본원에 기재된 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드 또는 그의 아고니스트 또는 길항제는 상기의 모든 질환 또는 많은 질환의 병인과 발병기전에 있어 중요한 역할을 하는 것을 보이며, 이와 같이 상기 과정을 증가 또는 억제하거나, 또는 상기 질환에서 혈관 관련 약물 표적화를 위한 치료 표적으로 기능을 할 수 있다.

11. 투여 방법, 투여 계획, 투여량 및 제제화

본원의 분자 및 그의 아고니스트 및 길항제는 상기한 여러 질병 및 질환의 예방제 및 치료제로서 제약적으로 유용하다.

PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드 또는 아고니스트 또는 길항체의 치료 조성물은 적합한 정도의 순도를 갖는 원하는 분자를 임의의 생리적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제와 혼합함으로써 동결건조 제형 또는 수용액 형태의 보관용으로 제조된다 [Remington's Pharmaceutical Sciences16th edition, Osol, A. ed. (1980)]. 허용 가능한 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용되는 투여량과 농도에서 수용자에게 무독성이며, 인산염, 시트르산염 및 다른 유기산과 같은 완충제, 아스코르브산 및 메티오니 등의 항산화제, 방부제 (예, 옥타데실디메틸벤질 암모늄클로라이드, 헥사메토늄 클로라이드, 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드, 페놀, 부틸알콜, 벤질알콜, 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤, 카테콜, 레소르시놀, 시클로헥사놀, 3-펜타놀 및 m-크레졸), 저분자량 (약 10 개 잔기 미만의) 폴리펩티드, 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린 등의 단백질, 폴리비닐피롤리돈 등의 친수성 중합체, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신 등의 아미노산, 단당류, 이당류 및 그밖의 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린 등의 탄수화물, EDTA 등의 킬레이트제, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨 등의 당 알콜, 나트륨 등의 염-형성 반대이온, 금속 착화물 (예, Zn-단백질 복합체) 및(또는) 트윈 (Tween, 등록상표), 플루로닉스 (Pluronics, 등록상표) 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 등의 비이온성 계면활성제 등이 있다.

담체의 또다른 예에는 이온 교환체, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 혈청 단백질 (예, 인간 혈청 알부민), 완충 성분, 예를 들어 인산염, 글리신, 소르브산, 칼륨 소르베이트, 식물 포화 지방산의 부분적인 글리세린 혼합물, 물, 염 또는 전해질, 예를 들어 프로타민 설페이트, 인산일수소나트륨, 인산일수소칼륨, 염화나트륨, 아연염, 콜로이드성 실리카, 삼규산마그네슘, 폴리비닐 피롤리돈, 셀룰로스 기재 물질 및 폴리에틸렌 글리콜이 포함된다. 국소성 또는 겔-기재의 길항제 형태에는 다당류, 예를 들어 나트륨 카르복시메틸셀룰로스 또는 메틸셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 폴리아크릴레이트, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블록 중합체, 폴리에틸렌 글리콜 및 목재 왁스 알콜이 포함된다. 통상의 데포 제형이 모든 투여방법에 적합하게 사용된다. 상기 형태에는 예를 들어 마이크로캡슐, 나노캡슐, 리포솜, 반창고, 흡입 제형, 코 스프레이, 설하 정제 및 서방형 제제가 포함된다. PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드 또는 아고니스트 또는 길항제는 통상 약 0.1 mg/㎖ 내지 100 mg/㎖의 농도의 상기 비히클 내에 제제화될 것이다.

다른 제형에는 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드 또는 그의 길항제를 성형물 내에 결합시키는 것을 포함한다. 이러한 성형물은 내피 세포 성장 및 혈관형성의 조절에 사용될 수 있다. 또한, 종양 침윤 및 전이는 상기 성형물을 이용하여 조절될 수 있다.

생체내 투여에 사용되는 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드 또는 그의 길항제는 멸균처리되어야 한다. 이것은 동결건조 및 재구성 이전 또는 이후에 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 용이하게 수행된다. 통상 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드는 동결건조된 형태 또는 전신 투여의 경우 용액으로 저장될 것이다. 동결건조 형태인 경우 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드 또는 그의 길항제는 통상 사용시 적합한 희석제를 이용하여 재구성을 위해 다른 성분과 함께 제제화된다. PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드 또는 그의 길항제의 액상 제제의 예는 피하 주사용 단일 투여 바이알에 충전된 멸균의 투명 무색의 방부처리되지 않은 용액이다. 반복 사용에 적합한 방부처리된 제약 조성물은 예를 들어 주로 증세 및 폴리펩티드 형태에 따라 예를 들어

a) PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드 또는 그의 아고니스트 또는 길항제,

b) 용액내의 폴리펩티드 또는 다른 분자의 최대 안정도 범위의 pH, 바람직하게는 약 4 내지 8을 유지할 수 있는 완충제,

c) 교반으로 인한 응집에 대해 폴리펩티드 또는 분자를 1차적으로 안정화시키는 세제/계면활성제,

d) 등장제,

e) 페놀, 벤질알콜 및 벤즈에토늄 할로겐화물 (예, 염화물)의 군에서 선택된 방부제 및

f) 물

을 포함한다.

사용된 계면활성제가 비이온계인 경우, 예를 들어 폴리소르베이트 (예, POLYSORBATE^TM(TWEEN^TM) 20, 80 등) 또는 폴옥사머 (예, POLOXAMER^TM188)일 수 있다. 비이온계 계면활성제의 사용은 폴리펩티드의 변성을 일으키지 않으면서 제제가 전단 표면 스트레스에 노출되도록 한다. 또한, 이러한 계면활성제 함유 제제는 폐 투여 및 무주사바늘 제트 주입기 (예, EP257,956)에 사용되는 제제와 같은 에어로졸 기구에 사용될 수 있다.

등장제는 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드 또는 그의 길항제의 액체 조성물의 등장도를 확보하기 위해 존재할 수 있으며 다가 당알콜, 바라직하게는 삼가이상의 당알콜, 예를 들어 글리세린, 에리트리톨, 아라비톨, 자일리톨, 소르비톨 및 만니톨이 포함된다. 이들 당알콜은 단독 또는 조합하여 사용될 수 있다. 또한, 염화나트륨 또는 적합한 다른 무기염이 용액의 등장성으로 유지하는 데 사용될 수 있다.

완충액은 예를 들어 원하는 pH에 따라 아세트산염, 시트르산염, 숙신산염 또는 인산염 완충액일 수 있다. 본 발명의 액상 제제의 pH는 한 형태의 약 4 내지 8, 바람직하게는 약 생리 pH로 완충된다.

방부제인 페놀, 벤질 알콜 및 벤즈에토늄 할로겐화물 (예, 염화물)은 사용될 수 있는 공지된 항균제이다.

PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드 치료 조성물은 일반적으로 멸균 입구가 있는 용기, 예를 들면 정맥내 용액제 백 또는 피하 주사 바늘에 의해 관통될 수 있는 마개가 있는 바이알에 담을 수 있다. 제제는 정맥내 (i.v.), 피하 (s.c.), 근육내 (i.m.)로의 반복 투여, 또는 비내 또는 폐내 전달 (폐내 전달은 EP257,956 참조)에 적합한 에어로졸 제제로서 투여되는 것이 바람직하다.

또한, PRO230, PRO216 또는 PRO302는 서방성 제제로 제조될 수 있다. 서방성 제제의 적합한 예는 단백질을 함유하는 고체 소수성 중합체의 성형품, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐 형태의 반투과성 매트릭스를 포함한다. 서방성 매트릭스의 예에는 폴리에스테르, 히드로겔 (예를 들어, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알콜)) [Langer et al.,J. Biomed. Mater. Res.,15: 167-277 (1981) and Langer,Chem. Tech.,12: 98-105 (1982)], 폴리락티드 (미국 특허 제3,773,919호, EP 58,481), L-글루탐산과 감마 에틸-L-글루타메이트의 공중합체 [Sidman et al.,Biopolymers, 22: 547-556 (1983)], 비분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체[Langer et al., 상기문헌], 예를 들어 LUPRON DEPOT(등록상표)(락트산-글리콜산 공중합체 및 루프롤라이드 아세테이트로 구성된 주입가능한 마이크로스피어), 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산 (EP 133,988)이 있다.

에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산과 같은 중합체는 100일 이상 동안 분자를 방출시키지만, 어떤 히드로겔은 보다 짧은 기간 동안 단백질을 방출시킨다. 피막된 단백질이 장기간 체내에 남아있는 경우, 37 ℃에서 수분에 노출된 결과, 변성 또는 응집됨으로써 생물 활성을 감소시키고 면역원성을 변화시킬 수 있다. 안정화를 위해 관련 기전에 따라 합리적인 전략을 설계할 수 있다. 예를 들어, 응집 기전이 티오-디술피드 상호교환을 통한 분자내 S-S 결합 형성인 것으로 밝혀진다면, 술프히드릴 잔기의 변형, 산성 용액으로부터의 동결건조, 수분 함량 조절, 적절한 첨가제의 사용 및 특이적인 중합체 매트릭스 조성물의 개발에 의해 안정화를 달성할 수 있다.

또한, 서방성 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드 조성물은 리포좀에 함침된 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드를 포함한다. PRO230, PRO216 또는PRO302 폴리펩티드를 함유한 리포좀은 공지된 방법 [DE 3,219,121, Epstein et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,82: 3688-3692 (1985), Hwang et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,77: 4030-4034 (1980), EP 52,322, EP 36,676, EP 88,046, EP 143,949, EP 142,641, 일본 특허 출원 83-118008, 미국 특허 제 4,485,045호 및 제 4,544,545호 및 EP 102,324]을 이용하여 제조한다. 통상 리포좀은 지질 함량 (최적 치료법에 대해 선택비율을 조절함)이 약 30몰% 초과의 콜레스테롤인 작은 (약 200 내지 800 옹스트롬) 단층형이다.

치료 유효량의 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드 또는 그의 길항제는 물론 치료 (예방 포함)되는 병리학적 상태, 투여방법, 치료에 사용되는 화합물 형태, 수반되는 임의의 공동치료법, 환자의 연령, 체중, 전체적인 의학적 상태, 병력 등에 따라 다르며, 그의 결정방법은 의사의 재량에 따른다. 따라서, 최대 치료효과를 얻기에 필요한 투여량을 역가하고 투여 경로를 조절하는 치료 전문가가 필요할 것이다. PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드의 숙주 범위가 좁은 경우, 인간 환자의 치료를 위해서 인간 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드, 보다 바람직게는 천연 서열의 인간 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드를 포함하는 제제가 바람직하다. 임상의는 문제의 질병의 치료를 위해 요구하는 효과를 달성하는 투여량에 도달할 때까지 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드를 투여할 것이다. 예를 들어 CHF 치료가 목적인 경우, 상기 질병과 관련된 진행중인 심비대증을 억제하는 양이 될 것이다. 상기 치료법의 진행은 심초음파검사로 용이하게 모니터한다. 유사하게, 비대성 심근병증의 환자에서, PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드는 실험을 기초로하여 투여될 수 있다.

상기의 기준에 따라, 일반적인 유효량은 약 0.001 내지 약 1.0 mg/kg, 보다 바람직하게는 약 0.01 내지 1.0 mg/kg, 가장 바람직하게는 약 0.01 내지 0.1 mg/kg이다.

성인 고혈압 치료의 비경구 사용에서, PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드는 체중 1 kg당 약 0.01 내지 50 mg, 바람직하게는 약 0.05 내지 20 mg, 가장 바람직하게는 1 내지 20 mg으로 주사 형태로 정맥 주사에 의해 1일 1 내지 3회 투여하는 것이 바람직하다. 경구 투여의 경우, PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드 기재 분자는 체중 1 kg당 약 5 mg 내지 1 g, 바람직하게는 약 10 내지 100 mg으로 1일 1 내지 3회 투여하는 것이 바람직하다. 내독소 오염은 안전한 수준, 예를 들어 0.5 ng/mg(단백질) 미만으로 최소한으로 유지되어야 한다는 것을 인지해야 한다. 또한, 인간 투여의 경우, 조성물은 FDA 사무국 및 생물제제 기준에서 요구되는 멸균성, 발열원성, 일반적인 안정성 및 순도를 만족시켜야 한다.

조직 재생에 사용되는 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드를 함유하는 제약 조성물의 투여 계획은 담당 의사가 폴리펩티드의 작용을 변화시키는 여러 인자, 예를 들어 형성이 필요한 조직 중량, 손상 부위, 손상 조직의 상태, 상처의 크기, 손상 조직형 (예, 뼈), 환자의 연령, 성별 및 식이법, 임의의 감염의 중증도, 투여 회수 및 다른 임상 인자를 고려하여 결정할 것이다. 투여량은 재구성에 사용되는 매트릭스 형태 및 제약 조성물에 함유되는 다른 단백질의 봉입체에 따라 변화할 수 있다. 예를 들어 공지된 다른 성장 인자 (예, IGF)를 최종 조성물에 첨가하는 경우 투여량에 영향을 줄 수 있다. 진행 과정은 조직/뼈 성장 및(또는) 복구의 정기 검사, 예를 들어 X-선, 조직형태학적 측정법 및 테트라사이클린 표지에 의해 모니터 할 수 있다.

PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드 또는 길항제 또는 아고니스트의 투여 경로는 공지된 방법, 예를 들면 정맥내, 근육내, 뇌내, 복강내, 뇌척수내, 안내, 피하, 동맥내, 활액내, 수막강내, 경구, 국소 또는 흡입 경로 또는 후술되는 서방계에 의한 방법이 있다. 또한, PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드 또는 그의 길항제는 국부 또는 전신 치료 효과를 얻기 위해 종양내, 주변 종양, 손상내 또는 손상 주위 경로로 적합하게 투여한다. 복강내 경로는 예를 들어 난소 종양 치료에 특히 유용한 것으로 보인다.

펩티드 또는 소분자가 길항제 또는 아고니스트로 사용되는 경우, 포유동물에게 액체 또는 고체 형태로 경구 또는 비경구 투여되는 것이 바람직하다.

염을 형성하고 하기에 유용한 분자의 제약적으로 허용 가능한 염에는 알칼리 금속염 (예, 나트륨염, 칼륨염), 알칼리 토금속염 (예, 칼슘염, 마그네슘염), 암모늄염, 유기 염기염 (예, 피리딘염, 트리에틸아민염), 무기산염 (예, 염산염, 황상염, 질산염) 및 유기산염(예, 아세트산염, 옥살산염, p-톨루엔술폰산염)을 예로 들 수 있다.

뼈, 연골, 건 또는 인대 제생에 유용한 본원의 조성물인 경우, 치료 방법은 조성물을 국소, 전신, 또는 이식 또는 기구를 이용한 국부적으로 투여하는 것이다. 투여시, 사용할 치료 조성물은 발열원이 없는 생리적으로 허용 가능한 형태이다.또한, 조성물은 뼈, 연골, 도는 조직 손상 부위에 전달하기 위한 점성 형태로 피막하거나 주사하는 것이 바람직하다. 국소투여는 상처 치유 및 조직 복구에 적합할 수 있다. 바람직하게는, 뼈 및(또는) 연골 형성을 위한 조성물은 단백질 함유 조성물을 뼈 및(또는) 연골 부위로 전달할 수 있는 매트릭스를 포함함으로써 발생하는 뼈 및 연골을 위한 구조를 제공하고 체내로 바람직하게 재흡수될 수 있다. 상기 매트릭스는 이식된 다른 의학 용도를 위해 사용되는 물질로 제조될 수 있다.

매트릭스 물질의 선택은 생체적합성, 생체분해성, 기계적 특성, 미용적 외견 및 접속성에 기준한다. 조성물의 특정 용도는 적합한 제제를 한정한다. 조성물에 가능한 매트릭스는 생체 분해성이면서 화학적으로 한정되는 황산칼슘, 황산삼칼슘, 히드록시아파타이트, 폴리락트산, 폴리글리콜산 및 다가무수물일 수 있다. 가능한 다른 물질은 생체분해성이면 생물학적으로 한정되는, 예를 들어 뼈 또는 진피 콜라겐이다. 또다른 매트릭스는 순수한 단백질 또는 세포외 매트릭스 성분으로 구성된다. 가능한 다른 매트릭스는 생체비분해성이면서 화학적으로 한정되는, 예를 들어 소성된 히드록시아파타이트, 생유리, 알루미네이트 또는 다른 세라믹이다. 매트릭스는 상기한 물질, 예를 들어 폴리락트산 및 히드록시아파타이트 또는 콜라겐 및 인산삼칼슘의 임의의 조합으로 구성될 수 있다. 바이오세라믹은 조성물, 예를 들어 칼슘-알루미네이트-포스페이트 내에서 기공의 크기, 입자 크기, 입자 형태 및 생분해성을 변화시키는 공정으로 변형될 수 있다.

상세한 한 실시태양은 기공의 직경이 150 내지 800 미크론인 다공성 입자 형태의 락트산과 글리콜산의 50:50(몰중량) 공중합체이다. 일부 용도에서, 이들은폴리펩티드 조성물이 매트릭스로부터 분리되는 것을 방지하는 결합제, 예를 들어 카르복시메틸 셀룰로스, 자기유래 혈병을 이용하는 것이 바람직하다.

결합제의 적합한 군에는 알킬셀룰로스 (히드록시알킬셀룰로스 포함)와 같은 셀룰로스 물질, 예를 들어 메틸셀룰로스, 에틸셀룰로스, 히드록시에틸셀룰로스, 히드록시프로필셀룰로스, 히드록시프로필메틸셀룰로스, 및 카르복시메틸셀룰로스있으며, 바람직한 한 예는 카르복시메틸셀룰로스 (CMC)의 양이온염이다. 바람직한 다른 결합제에는 히알루론산, 나트륨 알지네이트, 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리옥시에틸렌 옥시드, 카르복시비닐 중합체 및 폴리(비닐 알콜)이 포함된다. 본원에서 유용한 결합제의 양은 전체 제제의 0.5 내지 20 중량%, 바람직하게는 1 내지 10 중량%이며, 이는 폴리펩티드 (또는 그의 길항제)의 중합체 매트릭스로부터의 분리를 방지하고 조성물을 적합한 취급을 가능하게 하지만 기원세포가 매트릭스를 침윤하는 것을 방지하는 않는 양이어서 폴리펩티드 (또는 그의 길항제)가 기원세포의 골형성 활성을 지원할 기회를 제공한다.

12. 조합 치료법

특정 질병의 예방 또는 치료에 있어서 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드 또는 그의 아고니스트 또는 길항제의 효과는 목적에 유효한 다른 물질과 동일한 조성물 또는 별개의 조성물로서 연속적으로 또는 조합하여 투여함으로써 향상시킬 수 있다.

예를 들어, 심비대증의 치료를 위해 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드 치료법은 공지된 심근세포 비대 인자 억제제, 예를 들어 α-아드레날린성 아고니스트 (예, 페닐에프린), 엔도텔린-1 억제제 (BOSENTAN^TM및 MOXONODIN^TM), CT-1 억제제 (미국 특허 제 5,679,545), LIF 억제제, ACE 억제제, 데스-아스파르테이트 안지오텐신 I 억제제 (미국 특허 제 5,773,415호) 및 안지오텐신 II 억제제의 투여와 조합될 수 있다.

고혈압과 관련된 심비대증의 치료의 경우, PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드는 β-아드레날린성 수용체 차단제 (예, 프로프라놀올, 티몰올, 테르탈롤올, 카르테올올, 나돌올, 베탁솔올, 펜부톨올, 아세토부톨올, 아테놀올, 메토프롤올, 카르베딜올), ACE 억제제 (예, 퀴나프릴, 카토프릴, 에날라프릴, 라미프릴, 베나제프릴, 포시노프릴 및 리시노프릴), 이뇨제 (예, 클로로티아지드, 히드로클로로티아지드, 히드로플루메타지드, 메틸클로티아지드, 벤즈티아지드, 디클로르펜아미드, 아세타졸아미드 및 인다파미드) 및(또는) 칼슘 채널 차단제 (예, 딜티아젬, 니페디핀, 베라파밀 및 니카르디핀)와 조합하여 투여될 수 있다. 본원에서 일반명으로 확인된 치료제를 포함하는 제약 조성물은 시판되고 있으며, 투여량, 투여방법, 부작용, 투약금기 등은 제조자의 지시에 따라 투여된다 [Physicians' Desk Reference(Medical Economics Data Production Co: Montvale, N.J., 1997) 5th Edition].

비대성 심근병증의 치료에 있어 조합 치료법의 후보물질로 β-아드레날린성 차단 약물 (예, 프로프라놀올, 티몰올, 테르탈올올, 카르테올올, 나돌올, 베탁솔올, 펜부톨올, 아세토부톨올, 아테놀올, 메토프롤올, 카르베딜올), 베라파닐, 디페디핀 또는 딜티아젬이 바람직하다. 고혈압과 관련된 비대증의 치료는 칼슘 채널차단제 (예, 딜티아젬, 니페디핀, 베라파밀 및 니카르디핀), β-아드레날린성 차단제, 이뇨제 (예, 클로로티아지드, 히드로클로로티아지드, 히드로플루메타지드, 메틸클로티아지드, 벤즈티아지드, 디클로르펜아미드, 아세타졸아미드 또는 인다파미드) 및(또는) ACE 억제제 (예, 퀴나프릴, 카토프릴, 에날라프릴, 라미프릴, 베나제프릴, 포시노프릴 및 리시노프릴)를 이용하는 항고혈압 약물 치료제의 사용을 필요로 할 수 있다.

다른 증상의 경우, PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드 또는 그의 길항제는 뼈 및(또는), 연골 결함, 상처 또는 문제의 조직에 유용한 다른 제제와 조합될 수 있다. 이들 제제에는 EGF, PDGF, TGF-α 또는 TGF-β, IGF, FGF 및 CTGF와 같은 여러 성장 인자가 포함된다.

또한, 암 치료에 사용되는 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드 또는 그의 길항제는 상기에 정의된 세포독성제, 화학치료제 또는 성장 억제제와 조합될 수 있다. 또한, 암치료를 위해 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드 또는 그의 길항제는 방사성 물질의 조사 또는 투여를 수반하는 방사선학 치료법과 연속적으로 또는 조합하여 적합하게 투여될 수 있다.

PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드 또는 그의 길항제와 함께 투여되는 유효량의 치료제는 의사 또는 수의사의 판단에 따를 것이다. 치료되는 질병의 최대한 조절하기 위해서 투여량을 투여하고 조정한다. 예를 들어 고혈압 치료의 경우 투여량은 이뇨제 또는 디지탈리스의 사용, 또는 저혈압 또는 고혈압, 신장 손상 등의 질병을 이상적으로 고려한다. 투여량은 또한 사용되는 치료제의 형태 및 치료받는 특정 환자와 같은 인자에 따를 것이다. 통상, 사용되는 양은 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드없이 투여되는 치료제의 투여량과 동일할 것이다.

13. 제품

상기에 기재된 질환을 진단 또는 치료에 유용한 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드 또는 그의 길항제를 함유하는 키트와 같은 제품은 적어도 용기 및 라벨을 포함한다. 적합한 용기는 예를 들어 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 물질로 형성될 수 있다. 용기는 질병의 진단 또는 치료에 유효한 조성물을 포함하고 멸균된 입구 (예를 들어, 용기는 정맥 용액 주머니 또는 피하주사 바늘이 관통될 수 있는 마개를 갖는 바이알일 수 있음)를 갖을 수 있다. 조성물 내의 활성제는 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드 또는 그의 아고니스트 또는 길항제이다. 용기상, 또는 용기와 관련된 라벨은 조성물이 선택한 질병의 진단 또는 치료에 유용하다는 것을 나타낸다. 제품은 또한 제약적으로 허용 가능한 완충액, 인산염 완충 식염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2 용기를 포함할 수 있다. 또한, 다른 완충액, 희석제, 필터, 바늘, 시린지 및 사용 지시서를 갖는 포장 삽입물을 포함하는 상업적 및 이용자의 입장에서 바람직한 다른 물질을 포함할 수 있다. 또한 제품은 상기에 기재된 다른 활성제를 갖는 제2 또는 제3의 용기를 포함할 수 있다.

C. 항체

본 발명에 따른 가장 유망한 약물 후보물질의 일부는 본원에서 확인된 유전자의 생산 또는 유전자 산물을 억제하고/하거나, 유전자 산물의 활성을 감소시킬수 있는 항체 및 항체 단편이다.

1.폴리클로날 항체

폴리클로날 항체의 제조 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 폴리클로날 항체는 예를 들어 면역화제 및 필요한 경우 보조제를 1회 이상 주사함으로써 포유동물에서 생성시킬 수 있다. 일반적으로, 면역화제 및(또는) 보조제는 피하 또는 복강내 수회 주사에 의해 포유동물에 주사될 것이다. 면역화제는 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드 또는 그의 융합 단편을 포함할 수 있다. 면역처리되는 포유동물에서 면역원성으로 공지된 단백질에 면역화제를 접합시키는 것이 유용할 수 있다. 상기 면역원성 단백질의 예로는 키홀 림펫 헤모시아닌, 혈청 알부민, 소 티로글로불린 및 대두 트립신 저해제를 들 수 있다. 사용될 수 있는 보조제의 예는 프로인드 완전 보조제 및 MPL-TDM 보조제 (모노포스포릴 지질 A, 합성 트레할로스 디코리노미콜레이트)를 포함한다. 면역처리 방법은 불필요한 실험 없이도 당업계의 숙련가에 의해 선택될 수 있다.

2. 모노클로날 항체

또한, 항 PRO230, 항 PRO216 또는 항 PRO302 항체는 모노클로날 항체일 수 있다. 모노클로날 항체는 문헌 [Kohler and Milstein,Nature,256:495 (1975)]에 기재되 바와 같은 하이브리도마 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 하이브리도마 방법에서, 마우스, 햄스터 또는 다른 적절한 숙주 동물을 통상적으로 면역화제로 면역처리되어 면역화제에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하거나 생산할 수 있는 임파구를 유도한다. 별법으로, 임파구는 시험관 내에서 면역처리될 수 있다.

면역화제는 일반적으로 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드 또는 그의 융합 단백질을 포함할 것이다. 일반적으로, 인체 기원의 세포를 원하는 경우 말초 혈액 임파구 ("PBL")가 사용되나, 비인간 포유동물 공급원을 원하는 경우에는 비장 세포 또는 임프절 세포가 사용된다. 이어서, 폴리에틸렌 글리콜과 같은 적합한 융합제를 사용하여 임파구와 불멸화된 세포주를 융합시켜 하이브리도마 세포를 형성시킨다 [Goding,Monoclonal Antibodies: Principle and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103]. 불멸화된 세포주는 대체로 형질전환된 포유동물 세포, 특히 설치류, 소 및 인체 기원의 골수종 세포이다. 일반적으로, 쥐 또는 마우스 골수종 세포주가 사용된다. 하이브리도마 세포는 바람직하게는 비융합된 불멸화된 세포의 성장 또는 생존을 억제시키는 1종 이상의 물질을 함유하는 적합한 배양 배지에서 배양시킬 수 있다. 예를 들면, 모세포가 하이포잔틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HGPRT 또는 HPRT) 효소가 결핍된 경우, 하이브리도마용 배양 배지는 전형적으로 하이포잔틴, 아미노프테린 및 티미딘 ("HAT 배지")을 포함할 것이며, 이들 물질은 HGPRT-결핍 세포의 성장을 억제시킨다.

바람직한 불멸화된 세포주는 효율적으로 융합하고, 선택된 항체-생산 세포에 의한 항체의 높은 수준의 안정한 생산을 지지하며, HAT 배지와 같은 배지에 감수성이 있는 것이다. 바람직한 불멸화된 세포주는 예를 들어 솔크 인스티튜트 셀 디스트리뷰션 센터 (Salk Institute Cell Distribution Center, 미국 캘리포니아주 샌디에고) 및 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (American Type Culture Collection, 미국 버지니아주 만사스)으로부터 입수가능한 쥐과 골수종 세포주이다. 또한, 인간 골수종 세포주 및 마우스-사람 헤테로골수종 세포주가 인간 모노클로날 항체의 생산에 대해 기술되었다 [Kozbor,J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al.,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63].

원하는 하이브리도마 세포를 확인한 후, 제한 희석 절차에 의해 클론을 서브클로닝시키고 표준 방법 [Goding,상기문헌]으로 배양시켰다. 이러한 목적에 적합한 배양 배지는 예를 들면, 둘베코 개질 이글 배지 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 또는 RPMI-1640 배지를 포함한다. 또한, 하이브리도마 세포는 동물에서 복수종양으로서 생체내 배양시킬 수 있다.

서브클론에 의해 분비된 모노클로날 항체는 예를 들면, 단백질 A-세파로스 (Sepharose), 히드록실아파티트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화도 크로마토그래피와 같은 통상의 면역글로불린 정제 절차에 의해 배양 배지 또는 복수액으로부터 단리 및 정제시킬 수 있다.

또한, 모노클로날 항체는 미국 특허 제4,816,567호에 기재된 것과 같은 재조합 DNA 방법에 의해 제조할 수 있다. 본 발명의 모노클로날 항체를 코딩하는 DNA는 통상의 절차 (예를 들면, 쥐과 동물 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용함으로써)를 이용하여 쉽게 단리하고 서열 분석할 수 있다. 본 발명의 하이브리도마 세포는 그러한 DNA의 바람직한 기원으로서 작용한다. 일단 단리되면, DNA는 발현 백터 내로 넣을 수 있고, 이어서, 그렇지 않으면 면역글로불린 단백질을 생산하지 않는 원숭이 COS세포, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, 또는 골수종 세포와 같은 숙주 세포 내로 트랜스펙션시켜 재조합 숙주 세포에서 모노클로날 항체를 합성시킬 수 있다. 또한, DNA는 예를 들어 상동성 쥐과 동물 서열 대신에 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인에 대한 코딩 서열을 치환함으로써 (미국 특허 제4,816,567호; Morrison et al.,상기 문헌), 또는 비-면역글로불린 폴리펩티드에 대한 코딩 서열의 전체 또는 일부를 면역글로불린 코딩 서열에 공유 결합시킴으로써 변형시킬 수 있다. 그러한 비면역글로불린 폴리펩티드는 본 발명의 항체의 불변 도메인에 대해 치환되거나, 본 발명의 항체의 한 항체-결합 부위의 가변 도메인에 대해 치환되어 키메라 2가 항체를 생성시킬 수 있다.

항체는 1가 항체일 수 있다. 1가 항체를 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어 한 방법은 면역글로불린 경쇄 및 변형 중쇄의 재조합 발현을 포함한다. 중쇄 가교결합을 방지하기 위해서 중쇄는 일반적으로 Fc 영역의 임의의 지점에서 말단이 절단된다. 별법으로, 관련 시스테인 잔기는 가교결합을 방지하기 위해서 다른 아미노산 잔기로 치환되거나 결실된다.

또한, 시험관내 방법도 1가 항체의 제조에 적합하다. 항체 단편, 특히 Fab 단편을 제조하기 위한 항체의 분해는 당업계에 통상적으로 알려진 기술을 사용하여 수행할 수 있다.

3. 인간 항체 및 인간화 항체

또한, 본 발명의 항 PRO230, 항 PRO216 또는 항 PRO302 항체는 인간화 항체 또는 인간 항체를 포함할 수 있다. 비-인간 (예를 들어, 쥐과 동물) 항체의 인간화 형태는 키메라 면역글로불린, 비-인간 면역글로불린으로부터 유래한 최소 서열을 포함하는 면역글로불린 사슬 또는 그의 단편 (예를 들어, Fv, Fab, Fab', F(ab')₂또는 항체의 다른 항원 결합 서열)이다. 인간화 항체는, 수용체의 상보성 결정 영역 (CDR)의 잔기를 원하는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 마우스, 쥐 또는 토끼와 같은 비-인간 종 (공여 항체)의 CDR의 잔기로 치환시킨 인간 면역글로불린 (수용 항체)을 포함한다. 몇몇 경우에, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 잔기는 대응하는 비-인간 잔기로 치환된다. 또한, 인간화 항체는 수용 항체 또는 도입되는 CDR 또는 프레임워크 서열에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 하나 이상, 일반적으로 둘 이상의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역이 비-인간 면역글로불린의 영역에 대응하고 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역이 인간 면역글로불린 컨센서스 서열의 영역에 대응한다. 또한, 인간화 항체는 면역글로불린 불변 영역 (Fc), 일반적으로 인간 면역글로불린의 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 것이다 [Jones et al.,Nature,321: 522-525 (1986); Riechmann et al.,Nature,332: 323-327 (1988); 및 Presta,Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)].

비인간 항체의 인간화 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 비인체 기원으로부터의 그에 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이들 비-인간 아미노산 잔기는 종종 "임포트(import)" 잔기로 부르며, 통상적으로 "임포트" 가변 도메인으로부터 얻어진다. 인간화는 인간 항체의 상응하는 서열 대신 설치류 CDR 또는 CDR 서열로 치환함으로써 본질적으로 윈터 (Winter) 등의 방법 [Jones et al.,Nature,321: 522-525 (1986); Riechmann et al.,Nature,332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al.,Science,239: 1534-1536 (1988)]에 따라 수행할 수 있다. 따라서, 그러한 "인간화" 항체는 실질적으로 보다 적은 무손상 인간 가변 도메인이 비-인간 종 유래의 상응하는 서열에 의해 치환된 키메라 항체 (미국 특허 제4,816,567호)이다. 실제, 인간화 항체는 통상적으로 일부 CDR 잔기 및 가능하게는 일부 FR 잔기를 설치류 항체에서 유사한 부위로부터의 잔기로 치환시킨 인간 항체이다.

인간 항체는 파지 디스플레이 라이브러리를 포함하는 당업계에 공지된 여러 기술을 사용하여 제조할 수도 있다 [Hoogenboom et al.,J. Mol. Biol.,227: 381 (1991), Marks et al.,J. Mol. Biol.,222: 581-597 (1991)]. 또한, 코울 등 및 보에르너 등의 기술도 인간 모노클로날 항체의 제조에 사용할 수 있다 (Cole et al.,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985) and Boerner et al.,J. Immunol.,147(1): 86-95 (1991)]. 마찬가지로, 유전자도입 동물, 예를 들어 마우스에 인간 면역글로불린 유전자좌를 도입함으로써 인간 항체를 제조할 수 있는데, 여기서 내부 면역글로불린 유전자는 부분 또는 전체가 실활화된다. 항원투여 후에, 인간 항체 생산이 관찰되었는데, 이는 유전자 재배열, 어셈블리 및 항체 목록을 비롯한 모든 점에서 인간에서 관찰되는 항체와 매우 유사하였다. 상기 사항은 예를 들어 문헌 (미국 특허 제 5,545,807호, 제 5,545,806호, 제 5,569,825호, 제 5,625,126호, 제 5,633,425호, 제 5,661,016호) 및 과학 문헌[Marks et al.,Bio/Technology 10, 779-783 (1992), Lonberg et al.,Nature 368, 856-859 (1994), Morrison,Nature 368, 812-13 (1994), Fishwild et al.,Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996), Neuberger,Nature Biotechnology 14, 826 (1996), Lonberg and Huszar,Intern. Rev. Immunol. 1365-93 (1995))에 기재되어 있다.

4. 이중특이적 항체

이중특이적 항체는 2개 이상의 상이한 항원에 대해 결합 특이성을 갖는 모노클로날, 바람직하게는 인간 또는 인간화 항체이다. 이 경우에, 결합 특이성 중의 하나는 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드에 대한 것이고, 다른 하나는 임의 다른 항원, 바람직하게는 세포 표면 단백질 또는 수용체 또는 수용체 서브유닛에 대한 것이다.

이중특이적 항체를 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 통상적으로, 이중 특이적 항체의 재조합 생산은 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄/경쇄-중쇄 쌍의 동시발현에 기초하며, 여기에서, 2개의 중쇄는 상이한 특이성을 갖는다 [Millstein and Cuello,Nature,305: 537-539 (1983)]. 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위 분류로 인해, 이들 하이브리도마 (쿼드로마)는 10개의 상이한 항체 분자의 가능한 혼합물을 생산하며, 이중 하나만이 정확한 이중특이적 구조를 갖는다. 정확한 분자의 정제는 일반적으로 친화도 크로마토그래피 단계로 수행된다. 유사한 절차가 WO 제93/08829호(1993년 5월 13일에 공개됨) 및 문헌 [Traunecker et al.,EMBO J., 10: 3655-3659 (1991)]에 기재되어 있다.

원하는 결합 특이성을 갖는 항체의 가변 도메인(항체-항원 결합 부위)을 면역글로불린 불변 도메인 서열에 융합시킨다. 이 융합은 바람직하게는 힌지, 적어도 일부, CH2 및 CH3 영역을 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 도메인과의 융합이다. 경쇄 결합을 위해 필요한 부위를 포함하는 제1 중쇄 불변 영역 (CH1)이 융합체의 적어도 하나에 존재하는 것이 바람직하다. 면역글로불린 중쇄 융합체, 및 원한다면 면역글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA를 별개의 발현 벡터에 삽입하고, 적당한 숙주 유기체로 공동 트랜스펙션시킨다. 이중특이적 항체를 생산하기 위한 보다 상세한 내용은 예를 들면, 문헌[Suresh et al.,Methods in Enzymmology,121: 210(1986)]을 참조한다.

5. 이종접합 항체

이종접합 항체도 본 발명의 범위에 포함된다. 이종접합 항체는 2개의 공유결합된 항체로 구성된다. 이러한 항체는 예를 들어 면역계 세포를 원하지 않는 세포에 표적화시키기 위해 (미국 특허 제4,676,980호), 및 HIV 감염의 치료를 위해 (WO 제91/00360호, 동 제92/200373호, 및 EP 제03089호) 제안되었다. 이종접합 항체는 가교결합제를 사용하는 방법을 포함하여 합성 단백질 화학에 공지된 방법을 이용하여 제조할 수 있는 것으로 생각된다. 예를 들어, 면역독소는 디술피드 교환 반응 또는 티오에테르 결합을 형성함으로써 제조할 수 있다. 상기 목적에 적합한 시약은 이미노티올레이트 및 메틸-4-메르캅토부티르이미데이트 및 미국 특허 제4,676,980호에 개시된 시약을 포함한다.

6. 효과기 기능 조작

효과기 기능에 대해 본 발명의 항체를 변형하여 예를 들어 암치료에 있어 항체의 효과를 증대하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 시스테인 잔기를 Fc 영역에 도입하여 이 영역내 쇄간 디술피드 결합을 형성시킬 수 있다. 이와 같이 생성된 호모다이머 항체는 내부화 능력을 향상시키고(시키거나) 보체-매개 세포 사멸 및 항체-의존성 세포내 세포독성(ADCC)을 증대시킨다 [Caron et al.,J. Exp Med., 176:1191-1195 (1992) 및 Shopes,J. Immunol., 148:2918-2922 (1992) 참조]. 또한, 문헌 [Wolff et al.Cancer Research,53: 2560-2565 (1993)]에 기재된 헤테로이관능성 가교를 사용하여 증대된 항-종양 활성을 지닌 호모다이머 항체를 제조할 수 있다. 또는, 이중의 Fc 영역을 갖는 항체를 조작하여 보체 용균성 및 ADCC 능력을 증대시킬 수 있다 [Stevenson et al.,Anti-Cancer Drug Design, 3:219-230 (1989) 참조].

7. 면역접합체

또한, 본 발명은 세포독성 물질, 예를 들어 화학치료제, 독소 (예를 들어, 효소적으로 활성인 박테리아, 진균, 식물 또는 동물성 독소, 또는 그의 단편) 또는 방사활성 동위원소 (즉, 방사성접합체)와 결합된 항체를 포함하는 면역접합체에 관한 것이다.

상기 면역접합체의 생성에 유용한 화학치료제는 상기에 기재되어 있다. 사용될 수 있는 효소적으로 활성인 독소 및 그의 단편에는 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 쇄 (슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa) 유래), 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디 (Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 피톨라카 아메리카나 (Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII 및 PAP-S), 쓴 멜론 (momordica charantia) 저해제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스 (sapaonaria officinalis) 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신, 및 트리코테세네스가 포함된다. 여러 방사성핵종을 방사접합체 항체의 제조에 이용할 수 있다. 예에는²¹²Bi,¹³¹I,¹³¹In,⁹⁰Y 및¹⁸⁶Re가 포함된다.

다양한 이관능성 단백질-연결 물질, 예를 들어 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올)프로피오네이트 (SPDP), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이관능성 유도체 (예를 들어, 디메틸 아디프이미데이트 HCL), 활성 에스테 르(예를 들어, 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드(예를 들어, 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예를 들어, 비스(p-아지도벤조일)헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체(예를 들어, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예를 들어, 톨리엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 플루오르 화합물 (예를 들어, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 항체와 세포독성 물질의 접합체를 만들 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Vitetta et al.,Science,238:1098 (1987)]에 기재된 바와 같이 리신 면역독소를 제조할 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산(MX-DTPA)은 방사성뉴클레오티드와 항체를 연결하는 전형적인 킬레이트제이다(WO 94/11026 참조).

또다른 실시태양으로, 항체와 종양 예비표적화에 이용되는 "수용체" (예를들어, 스트렙타비딘)를 연결할 수 있는데, 여기서 항체-수용체 접합체를 투여 대상에게 투여한 다음, 킬레이트제를 사용하여 순환으로부터 결합하지 않은 접합체를 제거하고 세포독성 물질 (예를 들어, 방사성뉴클레오티드)에 연결된 "리간드"(예를 들어, 아비딘)를 투여한다.

8. 면역리포좀

본원에서 개시된 항체를 면역리포좀으로 제제화할 수도 있다. 이 항체를 포함하는 리포좀은 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 문헌 [Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688 (1985), Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980) 및 미국 특허 제4,485,045호 및 동 제4,544,545호]에 기재된 방법으로 제조할 수 있다. 순환 시간이 증대된 리포좀은 문헌 (미국 특허 제5,013,556호)에 개시되어 있다.

특히 유용한 리포좀은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유도체화 포스파티딜에탄올아민(PEG-PE)을 함유하는 지질 조성물을 사용하여 역상 증발법에 의해 생성할 수 있다. 정해진 공극 크기의 필터를 통해 리포좀을 밀어내어 소정의 직경을 갖는 리포좀을 수득하였다. 문헌 (Martin et al.,J. Biol. Chem.,257:286-288 (1982))에 기재된 바와 같이 디술피드-상호교환 반응을 통해 본 발명의 항체의 Fab' 단편을 리포좀에 연결할 수 있다. 화학요법제 (예를 들어, 독소루비신 (Doxorubicin))은 임의로 리포좀내에 포함된다 [Gabizon et al.,J. National Cancer Inst.,81(19):1484 (1989) 참조].

9. 항체 제약 조성물

각종 질환을 치료하기 위해, 본원에서 동정된 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드와 특이적으로 결합하는 항체 및 상기 기재된 스크리닝 분석에 의해 확인된 다른 분자를 제약 조성물 형태로 투여할 수 있다.

PRORO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드가 세포내에 있고 항체 전부가 저해제로 사용되는 경우, 내부화 항체가 바람직하다. 그러나, 또한 리포펙션 또는 리포좀을 사용하여 항체 또는 항체 단편을 세포내에 전달할 수 있다. 항체 단편이 사용되는 경우, 표적 단백질의 결합 도메인에 특이적으로 결합하는 최소 저해성 단편이 바람직하다. 예를 들어, 항체의 가변-영역 서열을 토대로, 표적 단백질 서열과 결합하는 능력을 지닌 펩티드 분자를 설계할 수 있다. 이러한 펩티드는 화학적으로 합성하고(하거나) 재조합 DNA 기술에 의해 제조할 수 있다 [예, Marasco et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:7889-7893 (1993) 참조].

또한, 본원의 제형은 치료할 특정 증상에 있어 필요에 따라 1종 이상의 활성 화합물, 바람직하게는 서로 부작용을 주지 않는 상보적인 활성을 지닌 화합물을 포함할 수 있다. 별법으로, 또는 추가로, 이 조성물은 그의 기능을 증대시키는 물질, 예를 들어 세포독성 물질, 싸이토카인, 화학요법제, 또는 증식-억제제를 포함할 수 있다. 이러한 분자는 적합하게는 의도된 목적에 효과적인 양으로 배합된다.

활성 성분은 예를 들어 각각 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어 리포솜, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐) 또는 마크로에멀젼 중에서 예를 들어 코아세르베이션 (coacervation) 기술 또는 계면 중합, 예를 들어 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐에 의해 제조된 마이크로캡슐에 봉입될 수 있다. 상기 기술은 문헌 (Remington'sPharmaceutical Sciences, 상기 문헌)에 개시되어 있다.

체내 투여에 사용되는 제제는 멸균처리되어야 한다. 이것은 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 용이하게 수행된다.

서방성 제제도 제조될 수 있다. 서방성 제제의 적합한 예는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 성형품, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐 형태의 반투과성 매트릭스를 포함한다. 서방성 매트릭스의 예는 폴리에스테르, 히드로겔(예를 들어, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알콜)), 폴리락티드 (미국 특허 제3,773,919호), L-글루탐산과 γ 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예를 들어 LUPRON DEPOT(등록상표)(락트산-글리콜산 공중합체 및 루프롤라이드 아세테이트로 이루어진 주입가능한 마이크로스피어), 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산이 있다. 에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산과 같은 중합체는 100일 이상 동안 분자를 방출시키지만, 어떤 히드로겔은 보다 짧은 기간 동안 단백질을 방출시킨다. 피막된 항체가 장기간 체내에 남아있는 경우, 그는 37 ℃에서 습기에 노출된 결과, 변성 또는 응집되어 생물 활성을 감소시키고 면역원성을 변화시킬 수 있다. 안정화를 위해 관련된 메카니즘에 따라 합리적인 전략을 설계할 수 있다. 예를 들어, 응집 메카니즘이 티오-디술피드 상호교환을 통한 분재내 S-S 결합 형성인 것으로 밝혀진 다면, 술프히드릴 잔기의 변형, 산성 용액으로부터의 동결건조, 수분 함량 조절, 적절한 첨가제 사용 및 특이적인 중합체 매트릭스 조성물의 개발에 의해 안정화를 달성할 수 있다.

10. 항체를 이용한 치료 방법

PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드에 대한 항체는 상기에 언급된 여러 심혈관, 내피 및 혈관형성 질환의 치료에 사용할 수 있음이 고려될 수 있다.

항체는 예를 들어 볼루스로서의 정맥내 투여, 또는 근육내, 복강내, 뇌척수내, 피하내, 관절내, 활액내, 수막강내, 경구, 국소 또는 흡입 경로에 의한 장기간의 연속 주입과 같은 공지된 방법 의해 포유동물, 바람직하게는 인간에게 투여될 수 있다. 항체의 정맥내 투여가 바람직하다.

다른 치료법이 본 발명의 항체와 같은 항암제의 투여와 병행될 수 있다. 예를 들어, 이러한 항암제로 치료되는 환자는 또한 방사선 치료를 받을 수 있다. 별법으로, 또는 추가로, 환자에게 화학 요법 치료제를 투여할 수 있다. 이러한 화학 요법 치료제의 제조 및 투여 일정은 제조자의 지시를 따르거나 당업계 전문 숙련인에 의해 경험적으로 결정될 수 있다. 또한, 이러한 화학 요법 치료제의 제조 및 투여 일정은 문헌 [Chemotherapy Service Ed., M.C.Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992)]에 기재되어 있다. 화학 요법 치료제는 항체와 같은 항암제의 투여 전 또는 후에 투여되거나, 동시에 투여될 수 있다. 타목시펜과 같은 항-에스트로겐 화합물 또는 오나프리스톤과 같은 항-프로게스테론 화합물 (EP 제616812호 참조)에 대해 공지된 투여량의 상기 분자와 항체를 배합하여 투여할 수 있다.

또한, ErbB2, EGFR, ErbB3, ErbB4 또는 혈관 내피 인자(VEGF)에 결합하는 항체와 같은 기타 종양 관련 항체를 투여하는 것도 바람직하다. 별법으로, 또는 추가로, 본원에 개시된 동일하거나 2종 이상의 상이한 항원에 결합하는 2종 이상의 항체를 환자에 동시 투여할 수 있다. 때로는, 환자에 1종 이상의 싸이토카인을 투여하는 것도 유익할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 본원의 항체를 생장 억제제와 동시에 투여할 수 있다. 예를 들어, 우선 생장 억제제를 투여한 후에 본 발명의 항체를 투여할 수 있다. 그러나, 동시 투여나 본 발명의 항체를 먼저 투여하는 것도 고려할 수 있다. 생장 억제제의 적합한 투여량은 현재 사용되는 투여량이며, 생장 억제제와 본원 항체의 복합 작용(상승)으로 인하여 투여량을 저하시킬 수 있다.

한 실시태양에서, 종양의 혈관형성을 치료법과 함께 공격할 수 있다. 항 PRO230, 항 PRO216 또는 항 PRO302 폴리펩티드 및 다른 항체 (예, 항-VEGF)는 예를 들어 종양 괴사 또는 그의 전이성 부위가 존재하는 경우 이를 관찰함으로써 결정되는 치료 유효량으로 종양 환자에게 투여된다. 본 치료법은 유익한 효과가 관찰되지 않거나 임상 검사에 의해 종양 또는 어떤 전이성 부위의 흔적을 보이지 않을 때까지 계속된다. 이어서, TNF를 단독 또는 보조제, 예를 들어 알파, 베타 또는 감마 인터페론, 항 HER2 항체, 헤레굴린, 항 헤레굴린 항체, D-인자, 인터루킨-1 (IL-1), 인터루킨-2 (IL-2), 과립구-대식구 콜로니 자극 인자 (GM-CSF), 또는 종양에서 미소혈관 응고 촉진제, 예를 들어 항 단백질 C 항체, 항 단백질 S 항체, 또는 C4b 결합 단백질 (1991년 2월 21자 공개된 WO91/01753 참고), 또는 열 또는 방사선 조사와 함께 투여된다.

보조제는 그의 효능이 다양하기 때문에 통상의 방법으로 매트릭스 스크리닝에 의해 종양에 대한 효과를 비교하는 것이 바람직하다. 항 PRO230, 항 PRO216 또는 항 PRO302 폴리펩티드 항체 및 TNF의 투여는 원하는 임상 효과를 달성할 때까지 반복한다. 별법으로, 항 PRO230, 항 PRO216 또는 항 PRO302 폴리펩티드 항체는 TNF와, 임의로 보조제와 함께 투여된다. 충실성 종양이 사지 및 대순환으로부터 단리되기 쉬운 위체에서 발견되는 경우, 본원에서 기재된 치료제는 단리된 종양 또는 기관에 투여될 수 있다. 다른 실시태양에서, FGF 또는 PDFG 길항제, 예를 들어 항 FGF 또는 항 PDGF 중화 항체가 항 PRO230, 항 PRO216 또는 항 PRO302 폴리펩티드 항체와 함께 환자에게 투여될 수 있다. 항 PRO230, 항 PRO216 또는 항 PRO302 폴리펩티드 항체를 이용한 치료는 상처 치유 또는 바람직한 신생 혈관형성 기간 동안 유지되는 것이 바람직하다.

심혈관, 내피 및 혈관형성 질환의 예방 또는 치료를 위해, 본원의 항체와 같은 항암제의 적합한 투여량은 상기 정의한 바와 같이 치료되는 질환의 유형, 중증도 및 질환의 진행 과정, 투여되는 항암제가 예방 목적인지 치료 목적인지, 이전의 치료법, 환자의 임상 병력 및 약제에 대한 반응, 및 담당의의 재량에 따라 달라질 것이다. 이 약제는 일시에 또는 일련의 치료를 통해 환자에 적합하게 투여된다.

예를 들어, 질환의 유형 및 중증도에 따라, 약 1 ㎍/kg 내지 50 mg/kg (예를 들면, 0.1 내지 20 mg/kg)의 항체가 1회 이상의 개별 투여 또는 연속 주입으로 환자에 투여하기 위한 초기 후보 투여량이다. 통상적인 일일 투여량은 상기 언급한 인자에 따라 약 1㎍/kg 내지 100 mg/kg 또는 그 이상이다. 증상에 따라 수일 또는그 이상에 걸친 반복 투여의 경우, 치료는 질환 징후가 원하는 정도로 억제될 때까지 지속된다. 그러나, 다른 투여량 요법이 효과적일 수 있다. 이러한 치료법의 진행은 종래의 기술 및 분석에 의해 쉽게 모니터될 수 있다.

11. 제품

항체 및 라벨을 갖는 용기를 포함한 제품을 제공할 수 있다. 이러한 제품은 상기에 기재되어 있으며, 그 활성성분이 항 PRO230, 항 PRO216 또는 항 PRO302 항체이다.

12. 종양의 진단 및 예후

특정 종양에서 과다 발현되는 성장 수용체와 같은 세포 표면 단백질이 약물 후보 또는 종양(예를 들어, 암) 치료에 대한 우수한 표적인 반면, 상기 단백질은 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드와 함께 종양의 진단 및 예후에 부가적인 용도를 나타낸다. 예를 들어, PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드에 대한 항체는 종양 진단제 또는 예후제로서 사용할 수 있다.

예를 들면, 항체 단편을 포함하는 항체는 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드 코딩 유전자를 비롯한 유전자의 발현을 정성 또는 정량 검출하는데 사용할 수 있다. 항체는 형광 표지와 같이 검출 가능한 표지물이 부착되어 있는 것이 바람직하며, 항체의 결합은 광학현미경법, 유동 세포측정법, 형광측정법, 또는 당업계에 공지된 다른 기술에 의해 모니터될 수 있다. 이러한 결합 분석법은 상기에 기재된 바와 같이 수행된다.

계내에서 마커 유전자 산물에 대한 항체 결합의 검출은, 예를 들면 면역형광현미경법 또는 면역전자현미경법에 의해 수행될 수 있다. 이러한 목적을 위해, 환자로부터 조직학적 시료를 분리하여, 바람직하게는 상기 생물학적 샘플에 항체를 도포하여 표지된 항체를 반응시킨다. 또한, 이 방법으로 조사된 조직에서 마커 유전자 산물이 어떻게 분포하는지 결정하게 할 수 있다. 다양한 조직학적 방법을 계내 검출에 용이하게 사용할 수 있음은 당업계 숙련자들에게 명백할 것이다.

하기 실시예는 단지 예시적인 목적으로 제공되며, 어떤 방식으로든 본 발명의 범위를 제한하려는 것은 아니다.

본 명세서에 인용된 모든 특허 및 문헌은 그 전문이 본원에 참고문헌으로 포함된다.

실시예에서 언급한 시판 시약들은 달리 지시하지 않는 한 제조업자의 지시에 따라 사용하였다. 하기 실시예와 명세서 전반에서 ATCC 기탁 번호로 확인되는 세포들의 공급원은 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (American Type Culture Collection, 버지니아주 마나사스 소재)이다. 달리 명시되지 않는다면, 본 발명은 표준 재조합 DNA 기술 방법, 예를 들어 본원의 하기에 기재된 기술 및 참고서 [Sambrook et al., 상기 문헌, Ausubel et al.,Current Protocols: A Guide to Methods and Application(Academic Press, Inc.,N.Y., 1990), ,Harlow et al.,Anatibodies : A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Press: Cold Spring Harbor, 1988), Gait,Oligonucleotide Synthesis(IRL, Press: Oxford, 1984), Freshney,Animal Cell Culture, 1987: Coligan et al.,Current Protocols in Immunology, 1991]에기재된 기술을 사용한다.

실시예 1: 인간 PRO230 (세뇨관 간질 신염 항원 상동체)을 코딩하는 cDNA 클론의 단리

스위스-프롯 (Swiss-Prot) 공용 데이타베이스로부터 약 950개의 공지된 분비형 단백질로부터의 세포외 도메인 (ECD) 서열 (존재하는 경우 분비 시그날 서열 포함)을 사용하여 EST 데이타베이스를 조사하였다. EST 데이타베이스는 공용 데이타베이스 (예를 들면, 데이호프 (Dayhoff), 젠뱅크 (GenBank))와 독점 데이타베이스 (예를 들면, LIFESEQ™ (인사이트 파마슈티칼스 (Incyte Pharmaceuticals, 캘리포니아주 팔로 알토))를 포함한다. 조사는 EST 서열의 6개 프레임 번역에 대한 ECD 단백질 서열의 비교로서 컴퓨터 프로그램 BLAST 또는 BLAST-2 [Altschul et al.,Methods in Enzymology266: 460-480 (1996)]를 이용하여 수행하였다. 공지된 단백질을 코딩하지 않는 70 (또는 몇몇 경우 90) 이상의 블라스트(Blast) 스코어를 갖는 비교물을 클러스터시키고, 프로그램 "phrap" (Phil Green, University of Washington 워싱턴주 시애틀)을 사용하여 컨센서스 DNA 서열로 조립하였다.

상기한 바와 같이 phrap을 이용하여 다른 EST 서열에 대해 컨센서스 DNA 서열을 조립하였다. 상기 컨센서스 서열을 본원에서 DNA30857로 명명하였다. 제넨테크사 독점 EST를 사용하여 컨센서스 조립하여 본원에서 DNA20088로 명명하였다. 몇몇 경우에, 수득한 컨센서스 DNA 서열을 가능한 한 상기 논의한 EST 서열원을 사용하여 컨센서스 서열을 신장시키기 위해 BLAST와 phrap의 반복 사이클을 이용하여 신장시켰다.

이어서, 상기한 바와 같이 수득한 DNA30857 서열에 기준하여 올리고뉴클레오티드를 합성하여, 1) PCR에 의해 관심있는 서열을 포함하는 cDNA 라이브러리를 확인하기 위해 사용하고 2) PRO230 폴리펩티드에 대한 전장 코딩 서열의 클론을 단리시키기 위한 프로브로서 사용하였다. 전방향 및 역방향 PCR 프라이머는 일반적으로 20 내지 30개 뉴클레오티드 범위이고, 종종 약 100 내지 1000 bp 길이의 PCR 산물을 제공하기 위해 고안된다. 프로브 서열은 통상 40 내지 55 bp 길이이다. 몇몇 경우, 컨센서스 서열이 약 1 내지 1.5 kbp보다 큰 경우 추가의 올리고뉴클레오티드가 합성된다. 전장 클론을 위한 몇몇 라이브러리를 스크리닝하기 위해, 이들 라이브러리로부터의 DNA를 PCR 프라이머 쌍을 사용하여 문헌 (Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology,상기 문헌)에 따라 PCR 증폭에 의해 스크리닝하였다. 이어서, 양성 라이브러리를 사용하여 프로브 올리고뉴클레오티드 및 프라이머 쌍들 중 하나를 이용하여 관심있는 유전자를 코딩하는 클론을 단리시켰다.

한쌍의 PCR 프라이머 (전방향 및 역방향)를 합성하였다.

전방향 PCR 프라이머5'-TTCGAGGCCTCTGAGAAGTGGCCC-3' (서열 3) 및

역방향 PCR 프라이머5'-GGCGGTATCTCTCTGGCCTCCC-3' (서열 4)

추가로, 하기 뉴클레오티드 서열을 갖는 합성 올리고뉴클레오티드 혼성화 프로브를 DNA30857 서열로부터 제조하였다.

혼성화 프로브

5'-TTCTCCACAGCAGCTGTGGCATCCGATCGTGTCTCAATCCATTCTCTGGG-3' (서열 5)

cDNA 라이브러리의 제조를 위한 RNA를 인간 태아 폐조직으로부터 단리하였다. cDNA 클론을 단리하기 위해 사용된 cDNA 라이브러리는 시판 시약, 예를 들어 인비트로젠 (Invitrogen, San Diego, CA)사에서 구입한 시약을 사용한 표준 방법에 의해 제조하였다. NotI 부위를 포함하는 올리고 dT를 사용하여 cDNA를 프라이밍하고, 블런트로 SalI 헤미키나제화 어댑터와 연결하고, NotI으로 절단하여 겔 전기영동에 의해 적절한 크기로 분류하고 정해진 방향으로 적합한 클로닝 벡터 (예를 들어, pRKB 또는 pRKD; pRK5B는 SfiI 부위를 포함하지 않는 pRK5D의 전구체임; 문헌 (Holmes et al.,Science,253: 1278-1280 (1991)) 참조) 내의 유일한 XhoI 및 NotI 부위에 클로닝하였다.

상기 기재된 바와 같이 단리된 클론의 DNA 서열 분석은 전장 PRO230에 대한 전장 DNA 서열 및 이로부터 유도된 PRO230의 폴리펩티드 (본원에서 DNA33223-1136 (도 1, 서열 1)로 명명함) 단백질 서열을 제공한다.

상기에서 확인된 전장의 클론은 뉴클레오티드 위치 100 내지 102의 분명한 번역 개시 부위를 가지며 뉴클레오티드 위치 592 내지 594의 정지 코돈에서 종결하는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함한다 (도 1a 및 1b, 서열 1). 예상된 폴리펩티드 전구체는 164개의 아미노산 길이이며(도 2, 서열 2), 추정 분자량은 약 18,359 달톤이고 추정 pI는 약 7.45이다.

도 2에 도시된 전장의 PRO230의 서열을 분석한 결과, 도 2에 도시된 중요한 폴리펩티드 도메인의 존재를 입증하며, 상기 중요한 폴리펩티드 도메인에 대한 위치는 상기에 기재된 바와 같이 대략적이다. 전장의 PRO230 서열을 분석한 결과 (도 2, 서열 2), 약 아미노산 1 내지 약 아미노산 21의 시그날 펩티드, 약 아미노산 78 내지 약 아미노산 82의 N-연결된 글리코실화 부위, 약 아미노산 80 내지 약 아미노산 84, 약 아미노산 117 내지 약 아미노산 121, 약 아미노산 126 내지 약 아미노산 130 및 약 아미노산 137 내지 약 아미노산 141의 카제인 키나제 II 인산화 부위, 약 아미노산 21 내지 약 아미노산 27, 약 아미노산 39 내지 약 아미노산 45, 약 아미노산 44 내지 약 아미노산 50 및 약 아미노산 104 내지 약 아미노산 110의 N-미리스토일화 부위, 및 약 아미노산 26 내지 약 아미노산 30 부위의 아미드화 부위의 존재를 입증한다. 클론 DNA33223-1136은 1997년 9월 16일 자로 ATCC에 기탁하여 기탁 번호 209264를 배정받았다.

도 2 (서열 2)에 도시된 전장 서열의 ALIGN-2 서열 정열 분석을 이용한 데이호프 데이타베이스의 분석 (버전 35.45 스위스 프롯 35)은 PRO230 아미노산 서열과 세뇨관 간질 신염 항원 사이에 서열 동일성을 입증하였다.

실시예 2: 인간 PRO216 (오스테오모듈린/피브로모듈린 상동체)을 코딩하는 cDNA 클론의 단리

스위스-프롯 (Swiss-Prot) 공용 데이타베이스로부터 약 950개의 공지된 분비형 단백질로부터의 세포외 도메인 (ECD) 서열 (존재하는 경우 분비 시그날 서열 포함)을 사용하여 EST 데이타베이스를 조사하였다. EST 데이타베이스는 공용 데이타베이스 (예를 들면, 데이호프 (Dayhoff), 젠뱅크 (GenBank))와 독점 데이타베이스 (예를 들면, LIFESEQ™ (인사이트 파마슈티칼스 (Incyte Pharmaceuticals, 캘리포니아주 팔로 알토))를 포함한다. 조사는 EST 서열의 6개 프레임 번역에 대한 ECD단백질 서열의 비교로서 컴퓨터 프로그램 BLAST 또는 BLAST-2 [Altschul et al.,Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)]를 이용하여 수행하였다. 공지된 단백질을 코딩하지 않는 70 (또는 몇몇 경우 90) 이상의 블라스트(Blast) 스코어를 갖는 비교물을 클러스터시키고, 프로그램 "phrap" (Phil Green, University of Washington 워싱턴주 시애틀)을 사용하여 컨센서스 DNA 서열로 조립하였다.

DNA33087의 전체 cDNA 서열은 젠뱅크 승인 번호 제 AB000114_1 및 AB009589_1로 개시되어 있다. 관련되나, 상이할 것으로 보이는 단백질인 각막 케라틴 설페이트는 문헌 [Funderburgh et al.,J. Biol. Chem., 271: 31431-31436 (1996)]에 개시되어 있다.

상기한 바와 같이 phrap을 이용하여 다른 EST 서열에 대해 컨센서스 DNA 서열을 조립하였다. 상기 컨센서스 서열을 본원에서 DNA28754로 명명하였다. 몇몇 경우에, 수득한 컨센서스 DNA 서열을 가능한 한 상기 논의한 EST 서열원을 사용하여 컨센서스 서열을 신장시키기 위해 BLAST와 phrap의 반복 사이클을 이용하여 신장시켰다.

이어서, 상기한 바와 같이 수득한 DNA28754 서열에 기준하여 올리고뉴클레오티드를 합성하여, 1) PCR에 의해 관심있는 서열을 포함하는 cDNA 라이브러리를 확인하기 위해 사용하고 2) PRO216에 대한 전장 코딩 서열의 클론을 단리시키기 위한 프로브로서 사용하였다. 전방향 및 역방향 PCR 프라이머는 일반적으로 20 내지 30개 뉴클레오티드 범위이고, 종종 약 100 내지 1000 bp 길이의 PCR 산물을 제공하기 위해 고안된다. 프로브 서열은 통상 40 내지 55 bp 길이이다. 몇몇 경우, 컨센서스 서열이 약 1 내지 1.5 kbp보다 큰 경우 추가의 올리고뉴클레오티드가 합성된다. 전장 클론을 위한 몇몇 라이브러리를 스크리닝하기 위해, 이들 라이브러리로부터의 DNA를 PCR 프라이머 쌍을 사용하여 문헌 (Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology,상기 문헌)에 따라 PCR 증폭에 의해 스크리닝하였다. 이어서, 양성 라이브러리를 사용하여 프로브 올리고뉴클레오티드 및 프라이머 쌍들 중 하나를 이용하여 관심있는 유전자를 코딩하는 클론을 단리시켰다.

한쌍의 PCR 프라이머 (전방향 및 역방향)를 합성하였다.

전방향 PCR 프라이머5'-TCACGATGATCCTGACAATGC-3' (서열 8) 및

역방향 PCR 프라이머5'-AATAATGAAGGTCAAAGTGCCCTT-3' (서열 9)

추가로, 하기 뉴클레오티드 서열을 갖는 합성 올리고뉴클레오티드 혼성화 프로브를 DNA28754 서열로부터 제조하였다.

혼성화 프로브

5'-TGCTCCTTCTTGTTCTGGGCTCTCATG-3' (서열 10)

cDNA 라이브러리의 제조를 위한 RNA를 인간 태아 신장 조직으로부터 단리하였다. cDNA 클론을 단리하기 위해 사용된 cDNA 라이브러리는 시판 시약, 예를 들어 인비트로젠 (Invitrogen, San Diego, CA)사에서 구입한 시약을 사용한 표준 방법에 의해 제조하였다. NotI 부위를 포함하는 올리고 dT를 사용하여 cDNA를 프라이밍하고, 블런트로 SalI 헤미키나제화 어댑터와 연결하고, NotI으로 절단하여 겔 전기영동에 의해 적절한 크기로 분류하고 정해진 방향으로 적합한 클로닝 벡터 (예를 들어, pRKB 또는 pRKD; pRK5B는 SfiI 부위를 포함하지 않는 pRK5D의 전구체임;문헌 (Holmes et al.,Science,253: 1278-1280 (1991)) 참조) 내의 유일한 XhoI 및 NotI 부위에 클로닝하였다.

상기 기재된 바와 같이 단리된 클론의 DNA 서열 분석은 전장 PRO216 폴리펩티드에 대한 전장 DNA 서열 및 이로부터 유도된 PRO216의 폴리펩티드 (본원에서 DNA33087 (도 3, 서열 6)로 명명함) 단백질 서열을 제공한다.

상기에서 확인된 전장의 클론은 뉴클레오티드 위치 268 내지 270의 분명한 번역 개시 부위를 가지며 뉴클레오티드 위치 1531 내지 1533의 정지 코돈에서 종결하는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함한다 (도 3, 서열 6). 예상된 폴리펩티드 전구체는 421개 아미노산 길이이며 (도 4, 서열 7), 추정 분자량은 약 49,492 달톤이고 추정 pI는 약 5.51이다. 도 4에 도시된 전장의 PRO216의 서열을 분석한 결과, 도 4 (서열 7)에 도시된 중요한 폴리펩티드 도메인의 존재를 입증하며, 상기 중요한 폴리펩티드 도메인에 대한 위치는 상기에 기재된 바와 같이 대략적이다. 전장의 PRO216 서열을 분석한 결과 (도 4, 서열 7), 약 아미노산 113 내지 약 아미노산 117, 약 아미노산 121 내지 약 아미노산 125, 약 아미노산 187 내지 약 아미노산 191, 약 아미노산 242 내지 약 아미노산 246 및 약 아미노산 316 내지 약 아미노산 320의 N-연결된 글리코실화 부위, 약 아미노산 189 내지 약 아미노산 193, 약 아미노산 247 내지 약 아미노산 251의 카제인 키나제 II 인산화 부위, 약 아미노산 268 내지 약 아미노산 275 및 약 아미노산 300 내지 약 아미노산 307의 티로신 키나제 인산화 부위, 약 아미노산 230 내지 약 아미노산 236의 N-미리스토일화 부위, 및 약 아미노산 146 내지 약 아미노산 168 및 약 아미노산 217 내지 약 아미노산 239의 루이신 지퍼 부위의 존재를 입증한다. 클론 DNA33087은 1997년 10월 16일 자로 ATCC에 기탁하여 기탁 번호 209381을 배정받았다.

상기 클론은 아이. 오노 (I.Ohno)에 의해 젠 뱅크에 1996년 12원 26일 자로 제출 (AB000114_1) 및 아이. 오노에 의해 1997년 12월 5일 자로 제출 (AB009589-1)된 인간 오스테오모듈린과 동일하다.

실시예 3: 인간 PRO302 (난황형성 카르복시펩티다제 상동체)을 코딩하는 cDNA 클론의 단리

스위스-프롯 (Swiss-Prot) 공용 데이타베이스로부터 약 950개의 공지된 분비형 단백질로부터의 세포외 도메인 (ECD) 서열 (존재하는 경우 분비 시그날 서열 포함)을 사용하여 EST 데이타베이스를 조사하였다. EST 데이타베이스는 공용 데이타베이스 (예를 들면, 데이호프 (Dayhoff), 젠뱅크 (GenBank))와 독점 데이타베이스 (예를 들면, LIFESEQ™ (인사이트 파마슈티칼스 (Incyte Pharmaceuticals, 캘리포니아주 팔로 알토))를 포함한다. 조사는 EST 서열의 6개 프레임 번역에 대한 ECD 단백질 서열의 비교로서 컴퓨터 프로그램 BLAST 또는 BLAST-2 [Altschul et al.,Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)]를 이용하여 수행하였다. 공지된 단백질을 코딩하지 않는 70 (또는 몇몇 경우 90) 이상의 블라스트(Blast) 스코어를 갖는 비교물을 클러스터시키고, 프로그램 "phrap" (Phil Green, University of Washington 워싱턴주 시애틀)을 사용하여 컨센서스 DNA 서열로 조립하였다.

상기한 바와 같이 phrap을 이용하여 다른 EST 서열에 대해 컨센서스 DNA 서열을 조립하였다. 상기 컨센서스 서열을 본원에서 DNA35953으로 명명하였다. 몇몇경우에, 수득한 컨센서스 DNA 서열을 가능한 한 상기 논의한 EST 서열원을 사용하여 컨센서스 서열을 신장시키기 위해 BLAST와 phrap의 반복 사이클을 이용하여 신장시켰다.

이어서, 상기한 바와 같이 수득한 DNA35953 서열에 기준하여 올리고뉴클레오티드를 합성하여, 1) PCR에 의해 관심있는 서열을 포함하는 cDNA 라이브러리를 확인하기 위해 사용하고 2) PRO302에 대한 전장 코딩 서열의 클론을 단리시키기 위한 프로브로서 사용하였다. 전방향 및 역방향 PCR 프라이머는 일반적으로 20 내지 30개 뉴클레오티드 범위이고, 종종 약 100 내지 1000 bp 길이의 PCR 산물을 제공하기 위해 고안된다. 프로브 서열은 통상 40 내지 55 bp 길이이다. 몇몇 경우, 컨센서스 서열이 약 1 내지 1.5 kbp보다 큰 경우 추가의 올리고뉴클레오티드가 합성된다. 전장 클론을 위한 몇몇 라이브러리를 스크리닝하기 위해, 이들 라이브러리로부터의 DNA를 PCR 프라이머 쌍을 사용하여 문헌 (Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology, 상기 문헌)에 따라 PCR 증폭에 의해 스크리닝하였다. 이어서, 양성 라이브러리를 사용하여 프로브 올리고뉴클레오티드 및 프라이머 쌍들 중 하나를 이용하여 관심있는 유전자를 코딩하는 클론을 단리시켰다.

한쌍의 PCR 프라이머 (전방향 및 역방향)를 합성하였다.

전방향 PCR 프라이머 15'-GTCCGCAAGGATGCCTACATGTTC-3' (서열 13),

전방향 PCR 프라이머 25'-GCAGAGGTGTCTAAGGTTG-3' (서열 14) 및

역방향 PCR 프라이머5'-AGCTCTAGACCAATGCCAGCTTCC-3' (서열 15)

추가로, 하기 뉴클레오티드 서열을 갖는 합성 올리고뉴클레오티드 혼성화 프로브를 DNA35953 서열로부터 제조하였다.

혼성화 프로브

5'-GCCACCAACTCCTGCAAGAACTTCTCAGAACTGCCCCTGGTCATG-3' (서열 16)

cDNA 라이브러리의 제조를 위한 RNA를 인간 태아 신장 조직으로부터 단리하였다. cDNA 클론을 단리하기 위해 사용된 cDNA 라이브러리는 시판 시약, 예를 들어 인비트로젠 (Invitrogen, San Diego, CA)사에서 구입한 시약을 사용한 표준 방법에 의해 제조하였다. NotI 부위를 포함하는 올리고 dT를 사용하여 cDNA를 프라이밍하고, 블런트로 SalI 헤미키나제화 어댑터와 연결하고, NotI으로 절단하여 겔 전기영동에 의해 적절한 크기로 분류하고 정해진 방향으로 적합한 클로닝 벡터 (예를 들어, pRKB 또는 pRKD; pRK5B는 SfiI 부위를 포함하지 않는 pRK5D의 전구체임; 문헌 (Holmes et al.,Science,253: 1278-1280 (1991))을 참조한다) 내의 유일한 XhoI 및 NotI 부위에 클로닝하였다.

상기 기재된 바와 같이 단리된 클론의 DNA 서열 분석은 전장 PRO302에 대한 전장 DNA 서열 및 이로부터 유도된 PRO302의 폴리펩티드 (본원에서 DNA40370-1217 (도 5, 서열 11)로 명명함) 단백질 서열을 제공한다.

상기에서 확인된 전장의 클론은 뉴클레오티드 위치 34 내지 36의 분명한 번역 개시 부위를 가지며 뉴클레오티드 위치 1390 내지 1392의 정지 코돈에서 종결하는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함한다 (도 5, 서열 11). 예상된 폴리펩티드 전구체는 아미노산 452개 길이이 며(도 6, 서열 12), 추정 분자량은 약 50,831 달톤이고 추정 pI는 약 5.74이다. 도 6 (서열 12)에 도시된 전장의 PRO302의 서열을 분석한 결과, 도 6 (서열 12)에 도시된 중요한 폴리펩티드 도메인의 존재를 입증하며, 상기 중요한 폴리펩티드 도메인에 대한 위치는 상기에 기재된 바와 같이 대략적이다. 전장의 PRO302 서열을 분석한 결과(도 6, 서열 12), 약 아미노산 1 내지 약 아미노산 25의 시그날 펩티드, 약 아미노산 64 내지 약 아미노산 68, 약 아미노산 126 내지 약 아미노산 130 및 약 아미노산 362 내지 약 아미노산 366의 N-연결된 글리코실화 부위, 약 아미노산 101 내지 약 아미노산 105의 cAMP 및 cGMP 의존 단백질 키나제 인산화 부위, 약 아미노산 204 내지 약 아미노산 208, 약 아미노산 220 내지 약 아미노산 224 및 약 아미노산 280 내지 약 아미노산 284, 약 아미노산 284 내지 약 아미노산 288, 약 아미노산 351 내지 약 아미노산 355 및 약 아미노산 449 내지 약 아미노산 453의 카제인 II 키나제 인산화 부위, 약 아미노산 22 내지 약 아미노산 28, 약 아미노산 76 내지 약 아미노산 82, 약 아미노산 79 내지 약 아미노산 85, 약 아미노산 80 내지 약 아미노산 86, 약 아미노산 119 내지 약 아미노산 125, 약 아미노산 169 내지 약 아미노산 175, 약 아미노산 187 내지 약 아미노산 193, 약 아미노산 195 내지 약 아미노산 201, 약 아미노산 331 내지 약 아미노산 337, 약 아미노산 332 내지 약 아미노산 338 및 약 아미노산 360 내지 약 아미노산 366의 N-미리스토일화 부위의 존재를 입증한다. 클론 DNA40370-1217은 1997년 11월 21일 자로 ATCC에 기탁하여 기탁 번호 209485를 배정받았다.

도 6 (서열 12)에 도시된 전장 서열의 ALIGN-2 서열 정열 분석을 이용한 데이호프 데이타베이스의 분석은 PRO302 아미노산 서열과 난황세포 형성 카르복시펩티다제 사이에 서열 동일성을 입증하였다.

실시예 4 : 내피 관 형성의 자극

본 분석법은 다음과 같이 문헌 [Davis and Camarillo,Experimental Cell Research 224:39-51(1996)]가 기재한 방법 또는 그로부터 변형한 방법을 따랐다.

실험방법:

인간 제대 정맥 내피 (HUVE, Cell Systems) (1차로부터 8 미만의 계대)를 타입 I 랫트 꼬리 콜라겐과 혼합하여 6 x 10⁵세포/㎖의 밀도에 최종 농도 2.6 ㎎/㎖이 되도록 하여 96웰 플레이트에 웰 당 50 ㎕를 플레이팅하였다. 겔이 고체화되도록 37℃에서 1시간 동안 방치한 후 1% FBS 및 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드 시료 (각각 1%, 0.1% 및 0.01% 희석)가 보충된 M199 배양 배지를 웰당 50 ㎕씩 1 μM 6-FAM-FITC 염료와 함께 첨가하여 액포가 형성될 때 염색되도록 하였다. 세포를 37℃/5% CO₂에서 48 시간 동안 배양하고 상온에서 10분간 3.7% 포르말린으로 고정하고 PBS로 5차례 세척하였다. 이어서 Rh-팔로이딘으로 4℃에서 밤새 염색한 후 4 μM DAPI로 핵염색을 하였다.

1. 세포사멸 분석법

본 분석법은 외인성 성장 인자(VEGF, bFGF, PMA 부재) 존재시 3 차원 매트릭스에서 세포 생존을 촉진하는 인자를 확인하는 방법이다.

양성 결과는 1 이하이며, 0은 세포사멸이 없고, 1은 20% 미만의 세포가, 2는 50% 미만의 세포가, 3은 50% 이상의 세포가 사멸한 것이다. 이 시스템에서 세포사멸의 자극제가 사포사멸 인자일 것으로 예상되며 억제제는 세포사멸을 방지 또는감소시키는 것으로 예상된다.

2. 액포 분석법

이 분석법은 bFGF 및 VEGF(40 ng/㎖) 존재시 내피 액포 형성 및 내강 형성을 자극하는 인자를 확인하는 방법이다.

양성 결과는 2 이상인 경우이며, 1은 20% 미만의 세포, 2는 20 내지 50%의 세포, 3은 50% 초과의 세포에 액포가 존재한다. 본 분석법은 세포 흡수, 이온 펌핑, 투과성 및 접합부 형성을 자극하는데 관련된 인자를 확인하기 위한 것이다.

3. 관 형성 분석법

본 분석법은 3 차원 매트릭스에서 내피 관 형성을 자극하는 인자를 확인하기 위한 것이다. 본 분석법은 외인성 성장 인자 (VEGF, bFGF)의 존재시 3 차원 매트릭스 내에서 관 유사 구조로 분화되도록 내피세포를 자극하는 인자를 확인하는 것이다.

양성 결과는 2이상인 경우이고, 1은 세포가 모두 둥근 경우, 2는 세포가 모두 신장된 경우, 3은 세포가 일부 연결부와 함께 관을 형성한 경우, 4는 복잡한 관형 망상조직을 형성한 것이다. 본 분석법은 추적, 화학주성, 또는 내피 형태 변형을 자극하는 데 관련된 인자를 확인하는 것이다.

결과는 1% 희석된 완충액 대조군 (10 mM HEPES/0.14 M NaCl/4% 만니톨, pH 6.8)에 비해 1% 희석된 PRO230-IgG 및 PRO230-폴리-His 시료에서 더 많은 관형성이 발생한다는 것을 입증한다.

실시예 5 : 내피 세포에서 c-fos의 유도

본 분석법은 PRO216 (사람 오스테오모듈린) 폴리펩티드의 내피 세포에서의 c-fos 유도 능력을 보이는가를 확인하기 위한 것이다.

성장 배지 (50% Ham's F12 w/o GHT: 저농도 글루코오스 및 글리신 무첨가 50% DMEM: NaHCO₃, 1% 글루타민, 10 mM Hepes, 10% FBS, 10 ng/㎖ bFGF) 내의 인간 제대 정맥 내피세포 (HUVEC, Cell Systems)를 세포 농도가 1 x 10⁴세포/웰의 밀도가 되도록 96-웰 마이크로타이터 플레이트에 플레이팅하였다. 플레이팅한 다음날 성장 배지를 제거하고 100 ㎕/웰의 시험 시료 및 대조군 (양성 대조군:성장 배지; 음성 대조군:10 mM Hepes, 140 mM NaCl, 4%(w/v) 만니톨, pH 6.8)으로 처리하여 세포에 영양 공급을 중단하였다. 5% CO₂내에서 세포를 37℃에서 30분간 인큐베이션하였다. 시료를 회수하고 bDNA 키트 실험방법 (Chiron Diagnostics, cat. #6005-037)의 첫 부분을 실행하였다.

간략하게, 시험에 필요한 TM 용해 완충액 (TM Lysis Buffer) 및 프로브의 양은 제조자가 제공하는 정보를 근거로 하여 계산하였다. 프로브를 녹여 적절한 양을 TM 용해 완충액에 첨가하였다. 캡쳐 혼성화 완충액 (Capture Hybridization Buffer)를 실온으로 가온한다. bDNA 조각을 금속 스트립 용기에 놓고 100 ㎕의 캡쳐 혼성화 완충액을 각각의 필요한 b-DNA 웰에 첨가하고 30분 이상 인큐베이션하였다. 세포가 있는 시험 플레이트를 인큐베이터로부터 꺼내어 진공 분기관을 이용하여 배지를 부드럽게 제거하였다. 프로브를 포함하는 용해 혼성화 완충액 100 ㎕를 빠르게 각 마이크로 플레이트 웰에 피펫팅하였다. 이어서 플레이트를 55℃에서 15분간 인큐베이션하였다. 인큐베이터에서 꺼내어, 플레이트를 마이크로타이터 어댑터 헤드가 설치된 회전 믹서위에 놓고 #2에 맞추고 1분간 회전시켰다. 용해액 80 ㎕를 회수하여 캡쳐 혼성화 완충액을 포함하고 있는 bDNA 웰에 첨가하고 잘 섞이도록 위 아래로 피펫팅하였다. 플레이트를 53℃에서 16시간 이상 인큐베이션하였다.

다음날, bDNA 키트 실험방법의 두번째 부분을 실행하였다. 플레이트를 인큐베이터로부터 꺼내어 실험대 위에 10분간 두어 식혔다. 필요한 첨가물의 부피를 제조업자가 제공하는 정보에 따라 계산하였다. 증폭 작용 용액 (Amplification Working Solution)은 증폭 농축액 (Amplifier Concentrate, 20 fm/㎕)을 AL 혼성화 완충액 (AL Hybridization Buffer)으로 1:100 희석하여 준비하였다. 혼성화 혼합물을 플레이트로부터 제거하고 세척액 A(Wash A)로 두차례 세척하였다. 증폭 작용 용액 50㎕를 각 웰에 첨가하고 53℃에서 30분간 인큐베이션하였다. 이어서, 플레이트를 인큐베이터로부터 분리하여 10분 동안 냉각시켰다. 표지 프로브 작용 용액은 표지 농축액(Label Concentrate, 40 pmoles/㎕)을 AL 혼성화 완충액으로 1:100 희석하여 준비하였다. 10분 동안 냉각시킨 후, 증폭 혼성화 혼합물을 제거하고, 플레이트를 세척액 A로 두차례 세척하였다. 표지 프로브 작용 용액 50㎕를 각 웰에 첨가하고 53℃에서 30분간 인큐베이션하였다. 10분간 식힌 후 기질(Substrate)을 실온으로 가온시켰다. 분석에 필요한 기질 ㎖ 당 기질 인핸서 (Substrate Enhancer) 3 ㎕를 첨가하는 동안, 플레이트를 10분간 식히고, 표지 혼성화 혼합물(Label Hybridization Mixture)을 제거하고, 플레이트를 세척액 A로 두차례, 세척액 D로 세차례 세척하였다. 인핸서를 포함하는 기질 용액 50 ㎕를 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 30분간 인큐베이션하고 광도계로 RLU을 판독하였다.

각각에 대해 평균을 계산하고 편차 계수를 결정하였다. 음성 대조군 (상기 HEPES 완충액)의 측정값에 대한 활성의 증가배수의 측정치는 화학 발광 단위 (RLU)로 나타내었다. 음성 대조군에 비해 2배 이상의 측정값을 나타내는 시료를 양성으로 간주하였다.

2배의 "양성"으로 분석된 PRO216

(1) 음성 대조군 = 4.18 RLU

양성 대조군 = 14.95 RLU

0.01%의 PRO216 = 10.33 RLU

(2) 음성 대조군 = 6.35 RLU

양성 대조군 = 30.46 RLU

0.01%의 PRO216 = 13.37 RLU

실시예 6 : 기니아 피그 혈관 누출

본 분석법은 PRO302 폴리펩티드가 혈관 투과성을 유도할 수 있는 지를 결정하기 위한 것이다.

350 g 이상의 무모 기니아 피그를 케타민 (75 내지 80 ㎎/㎏)과 크실라진 (5 ㎎/㎏)의 근육내 주사로 마취하였다. PRO320 폴리펩티드를 함유하는 시험 시료 또는 시험 폴리펩티드를 함유하지 않은 생리 완충액을 시험 동물을 주사 부위당 100 ㎕로 등에 피내 주사하였다. 동물당 약 16 내지 24개의 부위에 주사하였다. 이어서, 에반스 블루 염색약 1 ㎖ (PBS에 1%)를 심장내 주사하였다. 시험 물질 주사후 1 및 6시간 후에 주사 부위로부터 새어 나오는 청색의 지름을 측정함으로써, 화합물에 대한 피부 혈관 투과성 반응 (즉, 주사 부위에서의 반점)을 가시적으로 측정하였다. 주사 부위에서의 청색 부분의 직경을 관찰하고 혈관의 누출 정도를 기록하였다. 정제된 단백질 시험시 혈관 누출 또는 투과성의 유도능의 지표인 직경이 5 mm 이상인 반점을 본 분석의 양성으로 간주하였다. 직경이 7 mm를 초과하는 반응은 조건화된 배지 시료에 대해 양성으로 간주하였다. 직경이 15 내지 23 mm인 반응을 유도하는 1 ㎕/100㎕의 사람 VEGF를 양성 대조군으로 사용하였다.

결과를 하기 표 2에 도시하였다.

PRO 종류	주사후 시간	반점 직경 (mm)
PRO302	1.0	9.0
PRO302	6.0	9.0

실시예 7 : 계내 혼성화

계내 혼성화는 세포 또는 조직 시료 내의 핵산의 검출 및 분포를 위한 강력하고 다양한 용도의 기술이다. 이는, 예를 들어 유전자 발현 부위의 확인, 전사의 조직 분포의 분석, 바이러스 감염의 확인 및 위치의 확인, 특정 mRNA 합성 변화의 추적 및 염색체 맵핑에 유용하다.

계내 혼성화는 PCR-합성된³³P 표지된 리보프로브를 이용한 최적화된 실험 방법[Lu and Gillett,Cell Vision 1: 169-176(1994)]에 따라 수행되었다. 간단히,포르말린 고정된 파라핀에 삽입된 인간 조직을 절편화하고, 파라핀을 제거하고, 프로테이나제 K (20 g/㎖)로 37℃에서 15분간 단백질을 제거한 후 상기 문헌 [Lu and Gillett(1994)]가 기재한 방법으로 계내 혼성화를 진행하였다. [³³P] UTP-표지 안티센스 리보프로브는 PCR 산물로부터 얻어 55℃에서 밤새 혼성화하였다. 슬라이드를 KODAK NTB2^TM뉴클리어 트랙 에멀전에 침지시키고 4주 동안 노출시켰다.

³³ P-리보프로브 합성

6.0 ㎕ (125 mCi)의³³P-UTP (Amersham BF 1002, SA < 2000 Ci/mmole)를 스피드 백에서 건조시켰다. 건조된³³P-UTP를 포함하는 각 튜브에 다음 성분들을 첨가하였다.

2.0 ㎕ 5 x 전사 완충액

1.0 ㎕ DTT (100 mM)

2.0 ㎕ NTP 혼합물 (2.5 mM:10μ;각각의 10 mM GTP, CTP & ATP + 10 ㎕ H₂O)

1.0 ㎕ UTP (50 μM)

1.0 ㎕ RNAsin

1.0 ㎕ DNA 주형 (1 ㎍)

1.0 ㎕ H₂O

1.0 ㎕ RNA 폴리머라아제 (일반적으로, PCR 산물용 T3=AS, T7=S)

튜브를 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 1.0 ㎕ RQ1 DNase를 첨가하고 혼합물을 37℃에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 90 ㎕ TE (10 mM Tris pH 7.6/1 mM EDTA pH 8.0)를 첨가하고 혼합물을 DE81 종이 위에 피펫으로 옮겼다. 남은 용액은 Microcon-50 한외여과 장치 (ultrafiltration unit)에 넣고 프로그램 10(6분)을 이용하여 회전시켰다. 여과 장치를 두 번째 튜브 상에 놓고 프로그램 2(3분)을 이용하여 회전시켰다. 최종적으로 회수하기 위해 회전시킨 후, 100 ㎕ TE를 첨가하였다. 최종 산물 1 ㎕를 DE81 종이 위에 피펫으로 옮기고 6 ㎖ 바이오플루오르 II(Biofluor II)에서 계수하였다.

프로브를 TBE/우레아 겔에서 전기영동시켰다. 프로브 1 내지 3 ㎕ 또는 RNA MrkIII 5 ㎕를 로딩 완충액 3 ㎕에 첨가하였다. 95℃ 가열 블록에서 3분간 가열한 후에 즉시 얼음에 넣었다. 겔의 웰을 세척하고 시료를 넣고 180 내지 250 V에서 45분간 전기영동하였다. 겔을 사란랩으로 싸고 -70℃ 냉동실에서 1시간 내지 밤새도록 강화 스크린이 있는 XAR 필름에 노출시켰다.

³³ P-혼성화

A. 냉동절편의 전처리

슬라이드를 냉동실에서 꺼내어 알루미늄 접시에 놓고 상온에서 5분간 녹였다. 응축을 감소시키기 위해 접시를 55℃ 배양기에서 5분간 두었다. 연기 배출기에서 빙상의 4% 파라포름알데하이드 내에 슬라이드를 10분간 고정시키고 나서 상온에서 5분간 0.5 x SSC (25 ㎖ 20 x SSC + 975 ㎖ SQ H₂O)로 세척하였다. 37℃에서 10분간 0.5 ㎍/㎖ 프로테이나제 K (250 ㎖의 미리 가온시킨 RNase 부재 RNAse 완충액 내의 10 ㎎/㎖ 원액 12.5 ㎕)로 단백질을 제거하고 나서 절편들을 상온에서 10분간 0.5 x SSC로 세척하였다. 절편은 70%, 95%, 100% 에탄올로 각각 2분간 탈수시켰다.

B. 파라핀에 삽입된 절편의 전처리

슬라이드에서 파라핀을 제거하고 SQ H₂O에 넣고, 상온에서 각각 2분간 2 x SSC로 두차례 세척하였다. 인간의 배의 경우 절편을 20 ㎍/㎖ 프로테아제 K (250 ㎖의 RNase 부재 RNAse 완충액 내의 10 ㎎/㎖의 500 ㎕, 37℃, 15분) 또는 포르말린 조직의 경우 8 x 프로테아제 K (250 ㎖ RNAse 완충액 내의 100 ㎕, 37℃, 30분)으로 단백질을 제거하였다. 이어서 절편들을 상기한 바와 같이 0.5 x SSC로 세척하고 탈수하였다.

C. 전혼성화

슬라이드를 박스 완충액 (4 x SSC, 50% 포름아마이드)-포화된 여과지로 충전된 플라스틱 박스에 슬라이드를 놓았다. 조직을 혼성화 완충액 50 ㎕ (3.75 g 덱스트란 설페이트 + 6 ㎖ SQ H₂O)로 덮고, 섞어준 후 마개를 느슨하게 하여 마이크로파로 2분간 가열하였다. 빙상에 냉각시킨 후, 18.75 ㎖ 포름아미드, 3.75 ㎖ 20 x SSC 및 9 ㎖ SQ H₂0 를 첨가하고 조직을 잘 섞어준 후 42℃에서 1 내지 4시간 동안 인큐베이션하였다.

D. 혼성화

슬라이드 당 1.0 x 10⁶cpm 프로브 및 1.0 ㎕ tRNA (50 ㎎/㎖ 원액)를 95℃에서 3분간 가열하였다. 슬라이드를 빙상에서 식히고 48 ㎕ 혼성화 완충액을 각 슬라이드에 첨가하였다. 잘 섞어준 후 50 ㎕³³P 혼합물을 슬라이드 상의 전혼성화물에 첨가하였다. 슬라이를 55℃에서 밤새 인큐베이션하였다.

E. 세척

2 x SSC, EDTA(400 ㎖ 20 x SSC +16 ㎖ 0.25 M EDTA, V_f=4L)로 상온에서 10분 동안 2회 세척하고, 37℃에서 30분간 RNAse A (250 ㎖ Rnase 완충액 내의 10 ㎎/㎖ 용액 500 ㎕ = 20 ㎍/㎖)를 처리하였다. 슬라이드를 2 x SSC, EDTA로 상온에서 10분간 2회 세척하였다. 엄격 세척 조건은 2시간, 55℃, 0.1 x SSC, EDTA(20 ㎖ 20 x SSC + 16 ㎖ EDTA, V_f=4L)이었다.

F. 올리고 뉴클레오티드

본원에서 개시된 두개의 DNA 서열에 대해 계내 분석을 수행하였다. 이용된 올리고뉴클레오티드는 다음과 같다.

(1) DNA33223-1136 (PRO230)

33223p1

5'-GGATTCTAATACGACTCACTATAGGGCGGCGATGTCCACTGGGGCTAC-3' (서열 17)

33223p2

5'-CTATGAAATTAACCCTCACTAAAGGGACGAGGAAGATGGGCGGATGGT-3' (서열 18)

(2) DNA33087 (PRO21)

33087p1

5'-GGATTCTAATACGACTCACTATAGGGCTGGATGGGCTAGTAAACTTGA-3' (서열 19)

33087p2

5'-CTATGAAATTAACCCTCACTAAAGGGACCCTTCTGCTCCTTCTTGTT-3' (서열 20)

G. 결과

본원에서 설명된 상기 2개의 DNA 서열에 대해 계내 분석을 수행하였다. 그 분석 결과를 이하에서 설명한다.

(1) DNA33223-1136 (PRO230)

절편은 태아의 동맥 및 정맥 혈관과 관련된 강한 시그날을 나타내었다. 동맥에서, 시그날은 평활근/혈관주위 세포에 한정되어 나타났다. 또한, 시그날은 모세혈관 및 사구체에서도 나타났다. 내피세포가 상기 mRNA를 발현하였는지는 명백하지 않았다. 태아 수정체의 내피 세포에서도 발현이 확인되었다. 또한, 태반의 영양세포 융모에서도 강한 발현이 확인되었으며, 이들 세포는 영양세포와 HGF-불특정 조직발생을 발현하는 섬유아세포 유사 세포 사이에 위치한다. 성인에서 발현은 입증되지 않았으며, 대동맥벽 및 대부분의 혈관에서 음성으로 나타났다. 그러나, 정상 전립선 및 담낭 내피벽에서 혈관 채널에 대해서는 발현이 확인되었다. 연조직 육종 및 신세포 암종의 혈관에서 발현이 확인되었다.

요약하여, PRO230은 일부 성인 기관 및 태아의 비교적 혈관에 특이적인 발현을 나타내는 분자이다. 또한, 태아의 수정체 및 성인 담낭에서도 발현이 확인되었다.

2차 스크리닝에서, 혈관 발현은 상기에서 확인된 바와 유사하게 태아 블록에서 확인되었다. 내피보다는 혈관의 평활근에서 발현되었다. 또한, 발현은 발생하는 식도에서도 확인되었으며, 이는 상기 분자가 혈관 특이적이지 않다는 것을 나타낸다. 4개의 폐암 및 4개의 유방암에서도 발현을 조사하였다. 실질적인 발현은 최소한 4개 중 3개의 폐암 및 4개 중 2개의 유방암의 혈관 평활근에서 확인되었다. 또한, 한 유방암종에서 불특정 조직 생성의 주변종양성 간질 세포 (아마도 근육 섬유아세포)에서 발현이 확인되었다. 본 연구에서 내피 세포 발현은 확인되지 않았다.

(2) DNA33087 (PRO216)

절편은 내연골 및 골막의 신생 골형성의 모든 부위의 골모세포에서 특이적으로 강한 발현을 나타내었다. 또다른 발현 부위는 발생하는 폐동맥 및 대동맥 줄기가 포함된다. 그외에 시험된 모든 태아 조직은 음성을 나타내었다. 조사된 태아 조직에는 태반, 제대, 뇌, 척수, 눈, 시신경, 기도, 폐, 심장, 흉선, 간, 비장, 식도, 소장, 췌장, 부신, 갑상선, 체벽 및 사지가 포함된다. 모든 성인 조직은 음성으로 나타났다. 조사된 성인 조직에는 간, 신장, 부신, 심근, 대동맥, 비장, 림프절, 췌장, 폐 및 피부가 포함된다. PRO216은 골기질 침착 및(또는) 골모세포 성장의 조절에서 기능을 할 것으로 추정된다. 다중블록의 모든 성인 조직은 베타-액틴에 대해 양성을 나타내었다.

실시예 8:혼성화 프로브로서 PRO230, PRO216 또는 PRO302의 용도

다음 방법은 PRO230, PRO216 또는 PRO302를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 혼성화 프로브로서의 용도를 기술한다.

본원에 기술한 바와 같이 전장 또는 성숙 PRO230, PRO216 또는 PRO302 코딩 서열 (각각, 도 1a, 1b, 3 및 5, 각각 서열 1, 6 및 11) 또는 그의 단편을 포함하는 DNA를 이용할 수 있거나, 인간 조직 cDNA 라이브러리 또는 인간 조직 게놈 라이브러리에서 상동성 DNA (예를 들면, PRO230, PRO216 또는 PRO302의 천연 변이체를 코딩하는 것)를 스크리닝하는 데 프로브로서 사용하였다.

이들 라이브러리 DNA를 포함하는 필터의 혼성화 및 세척을 다음 고엄격 조건 하에 수행하였다. 방사성 표지된 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드 유도된 방사성 표지된 프로브를 50% 포름아미드, 5×SSC, 0.1% SDS, 0.1% 피로인산나트륨, 50 mM 인산나트륨, pH 6.8, 2×덴하르트 (Denhardt's) 용액 및 10% 덱스트란 황산염의 용액 중에서 42℃에서 20시간 동안 혼성화를 수행하였다. 필터를 0.1×SSC 및 0.1% SDS의 수용액 중에서 42℃에서 세척하였다.

이어서, 전장 천연 서열을 코딩하는 DNA와 원하는 서열 동일성을 갖는 DNA를 당업계에 공지된 표준 방법으로 확인하였다.

실시예 9:이. 콜라이에서 PRO230, PRO216 또는 PRO302 코딩 핵산의 발현

본 실시예는 이. 콜라이 내의 재조합 발현으로 PRO230, PRO216 또는 PRO302의 비글리코실화된 형태를 제조하는 방법을 나타낸다.

처음에 PRO230, PRO216 또는 PRO302를 코딩하는 DNA 서열을 선택된 PCR 프라이머를 이용하여 증폭하였다. 프라이머는 선택된 발현 벡터 상의 제한 효소 부위에 해당하는 제한 효소 부위를 포함해야만 한다. 여러 발현 벡터가 사용될 수 있다. 적합한 벡터의 예로는 앰피실린 및 테트라사이클린 내성 유전자를 포함하는 pBR322[이. 콜라이에서 유래; Bolivar et al.,Gene 2: 95(1977)]가 있다. 벡터를 제한 효소로 절단하고 탈인산화시켰다. 이어서, PCR 증폭된 서열을 벡터에 라이게이션하였다. 벡터는 바람직하게는 항생제 내성 유전자, trp 프로모터, 폴리His 리더 (처음 6개의 STII 코돈, 폴리His 서열 및 엔테로키나제 절단 부위를 포함), PRO230, PRO216 또는 PRO302 코딩 부위, 람다 전사 터미네이터 및 argU 유전자를 코딩하는 서열을 포함할 것이다.

이어서, 라이게이션 혼합물을 Sambrook 등 (상기 문헌)이 기재한 방법을 이용하여 선택된 이. 콜라이 균주를 형질전환시키는데 사용하였다. LB 배지에서 성장할 수 있는 형질전환체를 확인하고 항생제 내성을 갖는 콜로니를 선택하였다. 플라스미드 DNA를 제한 분석법 및 DNA 서열 분석을 이용하여 단리, 확인하였다.

선택된 클론을 항생제가 보충된 LB 브로스와 같은 액체 배양 배지에서 밤새 배양하였다. 이 배양액을 더 큰 규묘의 배양 접종에 사용하였다. 이어서, 세포를 발현 프로모터가 작동되는 동안 원하는 광학 밀도까지 배양시켰다.

수시간 이상 동안 세포를 배양한 후에 원심분리로 세포를 회수할 수 있다. 원심분리로 얻어진 세포 펠렛을 당업계에 공지된 여러가지 시약을 이용하여 용해시키고, 단백질이 강하게 결합하는 조건 하에서 금속 킬레이팅 칼럼을 이용하여 용해된 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드를 정제하였다.

실시예 10: 포유동물 세포에서의 PRO230, PRO216 또는 PRO302의 발현

본 실시예는 포유동물 세포내의 재조합 발현으로 PRO230, PRO216 또는 PRO302의 가능한 글리코실화된 형태를 제조하는 방법을 예시한다.

벡터 pRK5 (1989. 3.15 공개된 EP 307,247 참조)를 발현 벡터로 사용하였다. 임의로, PRO230, PRO216 또는 PRO302 DNA를 선택된 제한 효소를 사용하여 Sambrook 등(상기 문헌)이 기재한 라이게이션 방법을 이용하여 pRK5에 라이게이션시켜, PRO230, PRO216 또는 PRO302 코딩 DNA를 삽입하였다. 생성 벡터를 pRK5-(PRO230, PRO216 또는 PRO302 코딩 DNA)로 명명하였다.

한 실시 태양에서, 숙주 세포로서 293 세포를 선택할 수 있다. 인간 293 세포 (ATCC CCL 1573)를 태아 송아지 혈청 및 임의로 영양소 및(또는) 항생제가 보충된 DMEM와 같은 배지에서 조직 배양 플레이트에 융합 (confluent)되도록 배양하였다. 약 10 ㎍ pRK5-(PRO230, PRO216 또는 PRO302 코딩 DNA)를 VA RNA 유전자를 코딩하는 DNA [Thimmappaya et al., Cell, 31: 543(1982)] 약 1 ㎍과 혼합하여, 500 ㎕의 1 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA 및 0.227 M CaCl₂에 용해시켰다. 이 혼합물에 500 ㎕의 50 mM HEPES(pH 7.35), 280 mM NaCl, 1.5 mM NaPO₄를 적가하여 25℃에서 10분간 침전물을 형성시켰다. 침전물을 현탁시키고 293 세포에 첨가하여 37℃에서 4시간 가량을 정치시켰다. 배지를 흡인 제거하고 PBS 내의 20% 글리세롤 2 ㎖를 30초 동안 첨가하였다. 이어서, 293세포를 혈청 무첨가 배지로 세척하고 새로운 배지를 첨가하고 약 5일간 세포를 배양하였다.

트랜스펙션 약 24시간 후에 배지를 제거하고 배지(만으로) 또는 200 μCi/㎖³⁵S-시스테인 및 200 μCi/㎖³⁵S-메티오닌을 포함하는 배지로 교체하였다. 12시간 배양 후, 조건화된 배지를 회수하고 회전 필터에서 농축시켜 15% SDS 겔에 로딩하였다. 처리된 겔을 건조시키고 일정 기간동안 필름에 노출시켜 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드의 존재를 확인하였다. 트랜스펙션된 세포를 포함하는 배양액을 (혈청 무첨가 배지에서) 추가로 배양시키고 , 배지를 선택된 생물분석법으로 시험하였다.

별법으로, 문헌 [Somparyrac et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,12: 7575 (1981)]이 기재한 덱스트란 술페이트 방법을 이용하여 PRO230, PRO216 또는 PRO302 코딩 유전자를 293 세포에 일시적으로 도입시킬 수 있었다. 293 세포는 회전 플라스크에서 최고 밀도가 되도록 배양하고 700 ㎍의 pRK5-(PRO230, PRO216 또는 PRO302 코딩 DNA)를 첨가하였다. 세포를 우선 원심분리하여 회전 플라스크로부터 농축하고 PBS로 세척하였다. DNA-덱스트란 침전물을 4시간 동안 세포 펠렛 상에서 인큐베이션하였다. 세포를 20% 글리세롤로 90초간 처리하고 조직 배양 배지로 세척한 후 다시 조직 배양 배지, 5 ㎍/㎖ 소의 인슐린 및 0.1 ㎍/㎖ 소의 트랜스페린을 포함하는 회전 플라스크에 넣었다. 약 4일 후에 조건화된 배지를 원심분리하고 여과시켜 세포와 파쇄물을 제거하였다. PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드를 코딩하는 발현된 DNA를 포함하는 시료를 농축시키고 임의의 선택된 방법, 예를 들어 투석 및(또는) 칼럼 크로마토그래피로 정제하였다.

다른 실시 태양으로, PRO230, PRO216 또는 PRO302 코딩 유전자를 CHO 세포에 발현시킬 수 있다. pRK5-(PRO230, PRO216 또는 PRO302 코딩 DNA)를 공지된 시약, 예를 들어 CaPO₄또는 DEAE 덱스트란을 이용하여 CHO 세포에 트랜스펙션시킬 수 있다. 상기에서 언급한 것과 같이, 세포를 배양하고, 배지만으로 또는³⁵S-메티오닌과 같은 방사성 표지를 포함하는 배지로 배양액을 교체하였다. 발현된 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드의 존재를 확인한 후, 배양 배지를 혈청 무첨가 배지로 교체하였다. 바람직하게는, 6일 가량 배양물을 인큐베이션하고 조건화된 배지를 회수하였다. 발현된 PRO230, PRO216 또는 PRO302를 함유하는 배지를 농축하여 임의의 선택된 방법으로 정제하였다. PRO230 및 PRO216은 상기 방법에 의해 CHO 세포내에서 안정하게 발현하였다.

또한, 에피토프 태그가 부가된 PRO230, PRO216 또는 PRO302은 CHO 숙주세포에서 발현될 수 있다. PRO230, PRO216 또는 PRO302 코딩 유전자는 pRK5로부터 서브클로닝할 수 있다. 서브클론의 삽입은 PCR을 통해 폴리-His 태그와 같은 선택된 에피토프 태그를 갖는 형태로 바큘로바이러스 발현 벡터에 융합될 수 있다. 폴리-His 태그가 부가된 PRO230, PRO216 또는 PRO302 코딩 유전자 삽입체는 안정한 클론을 선택하기 위해 DHFR과 같은 선택 마커를 포함하는 SV40 유도 벡터로 서브클로닝될 수 있다. 최종적으로, CHO 세포는 (상기에서와 같이) SV40 유도 벡터로 트랜스펙션될 수 있다. 발현을 확인하기 위해서 상기와 같은 방법으로 표지될 수 있다. 이어서, 발현된 폴리-His 태그된 PRO230, PRO216 또는 PRO302를 포함하는 배양 배지를 농축하여 Ni²⁺-킬레이트 친화도 크로마토그래피와 같이 선택된 방법으로 정제할 수 있다.

실시예 11: PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드의 효모에서의 발현

다음 방법은 효모에서 PRO230, PRO216 또는 PRO302 코딩 유전자의 재조합 발현을 기재하고 있다.

우선, ADH2/GAPDH 프로모터로부터 PRO230, PRO216 또는 PRO302의 세포내 생산 또는 분비를 위한 효모 발현 벡터를 제조하였다. PRO230, PRO216 또는 PRO302 코딩유전자의 직접적인 세포내 발현을 위해, PRO230, PRO216 또는 PRO302 코딩유전자 및 프로모터를 선택된 플라스미드의 적합한 제한 효소 부위에 삽입하였다. 분비의 경우, PRO230, PRO216 또는 PRO302 코딩유전자 발현을 위해 PRO230, PRO216 또는 PRO302를 코딩하는 DNA를 ADH2/GAPDH 프로모터, 천연 PRO230, PRO216 또는 PRO302 시그날 펩티드 또는 다른 포유동물의 시그날 펩티드, 예를 들어 효모 알파-인자 또는 인버타제 분비 시그날/리더 서열 및 링커 서열(필요한 경우)을 코딩하는 DNA와 함께 선택된 플라스미드에 클로닝할 수 있다.

이어서, 효모 세포, 예를 들어 효모 균주 AB110을 상기에서 기재된 발현 플라스미드로 형질전환 시키고 선택된 발효 배지에서 배양할 수 있다. 형질 전환된 효모 상등액을 10% 트리클로로아세트산으로 침전시키고 SDS-PAGE로 분리한 후 겔을 쿠마시 블루로 염색하여 분석할 수 있다.

계속해서, 원심분리에 의해 발효 배지로부터 효모 세포를 회수하고 선택된카트리지 필터를 이용하여 배지를 농축시켜 재조합 PPRO230, PRO216 또는 PRO302를 단리하고 정제할 수 있다. PRO230, PRO216 또는 PRO302를 함유하는 농축액을 선택된 칼럼 크로마토그래피 수지를 이용하여 추가로 정제할 수 있다.

실시예 12:바큘로바이러스 감염 곤충 세포 내에서 PRO230, PRO216 또는 PRO302의 발현

다음 방법은 바큘로바이러스 감염 곤충 세포 내에서 재조합 발현에 대하여 기재하고 있다.

PRO230, PRO216 또는 PRO302의 코딩 서열을 바큘로바이러스 발현 벡터에 포함된 에피토프 태그의 상류에 융합시켰다. 상기의 에피토프 태그는 폴리-His 태그 및 면역글로블린 태그 (IgG의 Fc 영역과 같이)를 포함한다. 시판되는 플라스미드, 예를 들어 pVL1393 (Novagen)에서 유도된 플라스미드를 포함하여 여러 플라스미드를 사용할 수 있다. 간략하게, PRO230, PRO216 또는 PRO302 코딩 서열 또는 PRO230, PRO216 또는 PRO302 코딩 서열의 원하는 부분, 예를 들어 막횡단 단백질의 세포외 도메인 또는 세포외 단백질인 경우 성숙 단백질 코딩하는 서열을 5' 및 3' 영역에 상보적인 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하였다. 5' 프라이머는 인접한 (선택된) 제한 효소 부위를 포함할 수 있다. 이어서 생산물을 선택된 제한 효소로 절단하여 발현 벡터에 서브클로닝하였다.

재조합 바큘로바이러스는 리포펙틴 (GIBCO-BRL로부터 구입)을 이용하여 상기의 플라스미드 및 BaculoGold™ 바이러스 DNA (Phamingen)를 스포돕테라 프루기페르다 ("Sf9") 세포 (ATCC CRL 1711)에 동시에 트랜스펙션시켜 생성되었다. 28℃에서 4 내지 5일 배양 후에, 방출된 바이러스를 회수하여 이후의 증폭에 사용하였다. 바이러스 감염 및 단백질 발현은 문헌 [O'Reilley et al.,Baculovirus Expression vectors: A laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994)]에 따라 수행하였다.

이어서, 발현된 폴리-his 태그된 PRO230, PRO216 또는 PRO302는 예를 들어 Ni²⁺-킬레이트 친화도 크로마토그래피로 다음과 같이 정제될 수 있다. 추출액을 문헌 [Rupert et al., Nature, 362: 175-179(1993)]에 따라 재조합 바이러스-감염된 Sf9 세포로부터 제조한다. 간략하게, Sf9 세포를 세척하여 초음파 처리 완충액 (25 ㎖ Hepes, pH 7.9; 12.5 mM MgCl₂; 0.1 mM EDTA; 10% 글리세롤; 0.1% NP-40; 0.4 M KCl)에 재현탁시키고 빙상에서 20초간 2회 초음파 처리하였다. 초음파 처리물을 원심분리로 제거하고 상등액을 로딩 완충액 (50 mM 인산, 300 mM NaCl, 10% 글리세롤, pH 7.8)에 50배 희석하여 0.45 ㎛ 필터로 여과시켰다. Ni²⁺-NTA 아가로즈 칼럼 (Quiagen으로부터 구입)을 5 ㎖ 충진 부피로 준비하여 물 25 ㎖로 세척하고 로딩 완충액 25 ㎖로 평형화시켰다. 여과시킨 세포 추출물을 분당 0.5 ㎖로 칼럼에 로딩하였다. 점 분획 회수를 개시할 때 칼럼을 로딩 완충액으로 A₂₈₀기준선까지 세척하였다. 다음으로, 2차 세척 완충액(50 mM 인산; 300 mM NaCl, 10% 글리세롤, pH 6.0)으로 칼럼을 세척하여 비특이적으로 결합된 단백질을 용출시켰다. A₂₈₀이 기준선에 다시 도달하면, 칼럼을 2차 세척 완충액에 0 내지 500 mM 이미다졸로구배로 전개시켰다. 1 ㎖ 분획을 회수하여 SDS-PAGE 및 은 염색 또는 알카리 포스파타제에 결합된 Ni²⁺-NTA(Qiagen)로 웨스턴 블롯팅하여 분석하였다. 용출된 His₁₀태그가 부가된 PRO230, PRO216 또는 PRO302를 포함하는 분획을 모아 로딩 완충액에 대해 투석하였다.

별법으로, IgG 태그가 부가된 (또는 Fc 태그가 부가된) PRO230, PRO216 또는 PRO302의 정제는 공지된 크로마토그래피 기술, 예를 들어 단백질 A 또는 단백질 G 칼럼 크로마토그래피를 이용하여 수행하였다.

PRO230 및 PRO216은 바큘로바이러스 감염된 Sf9 세포에서 발현되었다. 발현은 실제 0.5 내지 2ℓ 규모로 실시되었지만 더 큰 규모 (8ℓ)로 생산하기 위해 스케일 업시킬 수 있다. 단백질 세포외 영역이 힌지, CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 IgG1 불변 영역 서열에 융합된 IgG 구조체 (면역어드헤신)로서 발현되었다.

이어서 각각의 코딩 서열의 PCR 증폭 후에 바큘로바이러스 발현 벡터 (IgG 융합체의 경우 pb.PH.IgG 및 폴리-His 태그가 부가된 단백질의 경우 pb.PH.His.c)에 서브클로닝하였으며, 리포펙틴 (GIBCO-BRL)을 이용하여 벡터 및 BaculoGold™ 바이러스 DNA (Phamingen)를 105 스포돕테라 프르기페르다 (Sf9) 세포 (ATCC CRL 1711)에 동시에 트랜스펙션시켰다. pb.PH.IgG 및 pb.PH.His는 His 서열 또는 Fc 태그 서열을 포함하는 변형된 폴리링커 부위를 포함시킨 시판되는 바큘로바이러스 발현 벡터 pVL1393 (Pharmingen)의 변형이다. 세포를 10% FBS (Hyclone)가 보충된 Hink's TNM-FH 배지에서 세포를 배양하였다. 세포를 28℃에서 5일간 배양하였다.상등액을 회수하고 계속해서 10% FBS로 보충된 Hink's TNM-FH 배지 중의 Sf9 세포를 감염 배수(MOI)가 약 10이 되도록 감염시켜 제1 바이러스 증폭에 사용하였다. 세포를 28℃에서 3일간 배양하였다. 상등액을 회수하여, 히스티딘 태그가 부가된 단백질의 경우 25 ㎖의 Ni²⁺-NTA 비드 (QIAGEN) 또는 IgG 부가된 단백질의 경우 단백질 A 세파로스 CL-4B 비드 (Pharmacia)에 1 ㎖의 상등액을 배치 결합시킨 후 SDS-PAGE 분석을 실시하여 쿠마시 블루 염색으로 이미 공지된 농도의 표준 단백질과 비교하여 바큘로바이러스 발현 벡터 내의 구조물의 발현을 측정하였다.

제1 바이러스 증폭 상등액을 ESF-921 배지 (Expression Systems LLC)에서 MOI가 약 0.1이 되도록 배양된 Sf9 세포의 스피너 배양액 (500 ㎖)을 감염시키는데 사용하였다. 세포를 28℃에서 3일간 배양하였다. 상등액을 회수하여 여과하였다. 스피너 배양액의 발현이 확인될 때까지 필요한 만큼 배치 결합 및 SDS-PAGE 분석을 반복하였다.

트랜스펙션된 세포 (0.5 내지 3 ℓ)의 조건화된 배지를 원심분리하여 세포를 제거하고 0.22 ㎛ 필터로 여과하였다. 폴리-His 태그가 부가된 구조물은 Ni²⁺-NTA 칼럼 (Qiagen)을 이용하여 정제하였다. 정제하기 전에 이미다졸을 5 mM 농도가 되도록 조건화된 배지에 첨가하였다. 조건화된 배지를 0.3 M NaCl 및 5 mM 이미다졸을 함유하는 20 mM Hepes 완충액 (pH 7.4)으로 평형화된 6 ㎖ Ni²⁺-NTA 칼럼에 4℃에서 4 내지 5 ㎖/분의 유속으로 로딩하였다. 로딩 후에 칼럼을 추가의 평형 완충액으로 세척하고 단백질을 0.25 M 이미다졸을 포함하는 평형 완충액으로 용출하였다. 이어서 고도로 정제된 단백질을 25 ㎖의 G25 수퍼파인 (Pharmacia) 칼럼으로 10 mM Hepes, 0.14 M NaCl 및 4% 만니톨을 함유하는 저장 완충액 (pH6.8)에서 염을 제거하고 -80℃에서 보관하였다.

단백질의 면역어드헤신 (Fc 포함) 구조체는 다음과 같이 조건화된 배지로부터 정제하였다. 조건화된 배지를 20 mM 인산 나트륨 완충액 (pH 6.8)로 평형화된 5 ㎖의 단백질 A 칼럼 (Pharmacia)에 로딩하였다. 로딩후, 평형 완충액으로 세척하고 100 mM 시트르산 (pH 3.5)으로 용출하였다. 용출된 단백질을 275 ㎖의 1 M Tris 완충액 (pH 9)을 포함하는 튜브에 1 ㎖ 분획으로 회수하여 즉시 중화시켰다. 이어서 고도로 정제된 단백질을 상기에 기재된 폴리-His 태그가 부가된 단백질의 경우와 같이 저장 완충액에서 염을 제거하였다. 단백질의 균일성을 SDS-PAGE와 에드만 분해법으로 수행되는 N-말단 아미노산 서열 분석으로 확인하였다.

별법으로, 변형된 바큘로바이러스 방법은 high-5 세포에 사용될 수 있다. 본 방법에서, 원하는 서열을 코딩하는 DNA를 적합한 시스템, 예를 들어 Pfu (Stratagene)를 이용하여 증폭할 수 있거나, 또는 바큘로바이러스 발현 벡터에 함유된 에피토프 태그의 상류 (5')와 융합할 수 있다. 상기 에피토프 태그에는 폴리-His 태그 및 면역글로불린 태그 (IgG의 Fc 영역과 같이)가 포함된다. 시판되는 플라스미드, 예를 들어 pIE1-1 (Novagen)에서 유도된 플라스미드를 포함하여 여러 플라스미드를 사용할 수 있다. pIE1-1 및 pIE1-2 벡터는 안정하게 형질전환된 곤충 세포 내에서 바쿨로바이러스 ie1 프로모터로부터 재조합 단백질을 구성적으로 발현하도록 고안되었다. 두 플라스미드는 다중 클로닝 부위의 방향만이 상이하고비감염된 곤충 세포의 ie1 매개 유전자 발현에 중요한 것으로 알려진 모든 프로모터 서열 및 hr5 인핸서 성분을 포함한다. pIE1-1 및 pIE1-2는 번역 개시 부위를 포함하고 융합 단백질을 생산하는데 사용될 수 있다. 간략하게, 원하는 서열 또는 서열의 원하는 부분, 예를 들어 막횡단 단백질의 세포외 도메인 또는 세포외 단백질인 경우 성숙 단백질 코딩하는 서열을 5' 및 3' 영역에 상보적인 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하였다. 5' 프라이머는 인접한 (선택된) 제한 효소 부위를 포함할 수 있다. 이어서 생산물을 선택된 제한 효소로 절단하여 발현 벡터에 서브클로닝하였다. 예를 들어, pEI1-1의 유도체는 원하는 서열의 하류 (3')에 인간 IgG (pb.PH.IgG) 또는 8 히스티틴 (pb.PH.His) 태그를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 벡터 구조물은 확인하기 위해 서열분석된다.

High-5 세포는 CO₂, NO pen/strep 부재의 27℃의 조건 하에서 50%의 융합도 (confluency)로 배양하였다. 각 150 mm 플레이트에 대해, 30 μg의 서열을 함유하는 PIE 기재 벡터를 1 ㎖의 Ex-Cell 배지 (Ex-Cell 401 + 1/100 L-Glu JRH Biosciences #14401-78P, 감광성임에 주의)와 혼합하고, 별개의 시험관에서 100 ㎕의 셀펙틴 (CellFECTIN, GIBCO-BRL로부터 구입, 볼텍싱 혼합)을 1 ㎖의 Ex-Cell 배지와 혼합하였다. 두 용액을 혼합하여 실온에서 15분간 인큐베이션하였다. 8 ㎖의 Ex-Cell 배지를 2 ㎖의 DNA/셀펙틴 혼합물에 첨가하고 Ex-Cell 배지로 1회 세척한 high-5 세포 상을 덮었다. 이어서, 플레이트를 실온에서 1시간 동안 암실에서 인큐베이션하였다. 이어서, DNA/셀펙틴 혼합물을 제거하고 세포를 Ex-Cell로 1회세척하여 과잉의 셀펙틴을 제거하였다. 30 ㎖의 새로운 Ex-Cell 배지를 첨가하고 세포를 28℃에서 3일간 배양하였다. 상등액을 회수하여, 히스티딘 태그가 부가된 단백질의 경우 25 ㎖의 Ni²⁺-NTA 비드 (QIAGEN) 또는 IgG 부가된 단백질의 경우 단백질 A 세파로스 CL-4B 비드 (Pharmacia)에 1 ㎖의 상등액을 배치 결합시킨 후 SDS-PAGE 분석을 실시하여 쿠마시 블루 염색으로 이미 공지된 농도의 표준 단백질과 비교하여 바큘로바이러스 발현 벡터 내의 구조물의 발현을 측정하였다.

단백질의 면역어드헤신(Fc 포함) 구조체는 다음과 같이 조건화된 배지로부터 정제하였다. 조건화된 배지를 20 mM 인산 나트륨 완충액 (pH 6.8)로 평형화된 5 ㎖의 단백질 A 칼럼 (Pharmacia)에 로딩하였다. 로딩후, 평형 완충액으로세척하고 100 mM 시트르산 (pH 3.5)으로 용출하였다. 용출된 단백질을 275 ㎖의 1 M Tris 완충액 (pH 9)을 포함하는 튜브에 1 ㎖ 분획으로 회수하여 즉시 중화시켰다. 이어서 고도로 정제된 단백질을 상기에 기재된 폴리-His 태그가 부가된 단백질의 경우와 같이 저장 완충액에서 염을 제거하였다. 단백질의 균일성을 SDS-PAGE와 에드만 분해법으로 수행되는 N-말단 아미노산 서열 분석으로 확인하였다.

PRO216 및 PRO302를 high-5 세포를 사용하는 상기의 변형된 바큘로바이러스 방법에 의해 성공적으로 발현하였다.

실시예 13:PRO230, PRO216 또는 PRO302에 결합하는 항체의 제조

본 실시예는 PRO230, PRO216 또는 PRO302에 특이적으로 결합할 수 있는 모노클로날 항체를 제조하는 방법이다.

모노클로날 항체를 생산하는 기술은 당업계에 공지되어 있으며 예를 들어 상기의 문헌(Goding)에 기재되어 있다. 이용될 수 있는 면역원에는 본 발명의 정제된 PRO230, PRO216 또는 PRO302를 포함하는 PRO230, PRO216 또는 PRO302 융합 단백질 및 세포 표면에 재조합 리간드 상동체를 발현하는 세포를 포함한다. 숙련자는 불필요한 실험없이도 면역원을 선택할 수 있다.

마우스, 예를 들어 Balb/c를 프로인드 완전 보조액에 유화된 PRO230, PRO216 또는 PRO302 면역원 1 내지 100 ㎍을 피하 또는 복강내 주사하여 면역시켰다. 별법으로, 면역원을 MPL-TDM 보조액(Ribi Immunochemical Research, Hamilton, MT)에 유화시켜 동물의 뒷발바닥에 주사하여 면역화하였다. 이어서 면역된 마우스를 10 내지 12 일 후에 선택된 보조제 내에 유화된 추가의 면역원으로 부스팅하였다. 그이후, 수주 동안 마우스를 추가 면역 주사로 부스팅할 수 있다. 역회전 출혈법으로 마우스로부터 혈청 시료를 주기적으로 채취하여, ELISA 분석법을 시험하여 항 PRO230, 항 PRO216 또는 항 PRO302 항체를 검출하였다.

적합한 항체 역가가 검출되면, 항체에 대해 "양성"인 동물에게 PRO230, PRO216 또는 PRO302를 최종 정맥주사하였다. 3 내지 4일 후에 마우스를 희생시켜 비장 세포를 회수한다. 이어서, 비장 세포를 선택된 쥐의 골수종 세포주, 예를 들어 ATCC 번호 CRL 1597로부터 이용 가능한 P3X63AgU.1와 융합시켰다 (35% 폴리에틸렌 글리콜 이용). 융합체는 비 융합 세포, 골수종 하이브리드 및 비장세포 하이브리드의 증식을 억제하는 HAT(하이포잔틴, 아미노프테린 및 티미딘) 배지를 포함하는 96 웰 조직 배양 플레이트에 플레이팅될 수 있는 하이브리도마 세포를 생성하였다.

하이브리도마 세포를 PRO230, PRO216 또는 PRO302에 대한 반응성을 위한 ELISA로 스크리닝할 수 있다. PRO230, PRO216 또는 PRO302에 대한 목적하는 모노클로날 항체를 분비하는 "양성" 하이브리도마 세포를 결정하는 방법은 당업계의 숙련자에게 잘 알려져 있다.

양성 하이브리도마 세포는 동계의 Balb/c 마우스가 항 PRO230, 항 PRO216 또는 항 PRO302 모노클로날 항체를 포함하는 복수를 생산하도록 복강 내에 주사될 수 있다. 별법으로, 하이브리도마 세포는 조직 배양 플라스크 또는 롤러병에서 배양될 수 있다. 복수 내에서 생성된 모노클로날 항체는 황산암모늄 침전, 이어서 겔 배제 크로마토그래피를 이용하여 정제될 수 있다. 별법으로, 항체의 단백질 A또는 단백질 G 결합을 기초로 하는 친화도 크로마토그래피를 이용할 수도 있다.

물질의 기탁

다음 물질들은 미국 버지니아주 20110-2209 마나사스 유니버시티 불바드 10801에 소재하는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC)에 기탁되었다.

물질 ATCC 기탁번호 기탁일

DNA33223-1136 209264 1997. 9. 16.

DNA33087 209381 1997. 10. 16.

DNA40370-1217 209485 1997. 11. 21.

이들 기탁은 특허 절차상 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약 및 그의 규칙 (부다페스트 조약 (Budapest Treaty))의 규정 하에 이루어졌다. 이는 기탁일로부터 30년 동안 기탁물의 생존 배양물의 유지를 보장한다. 기탁물은 부다페스트 조약의 협약 하에 ATCC로부터 제넨테크 인크와 ATCC 사이 협정에 따라 분양될 것이며, 이는 관련 미국 특허의 허여시 또는 미국 또는 외국 특허 출원의 공개시 (이 중 먼저인 때) 공공에 대한 기탁물의 배양 프로제니의 영구적이고 비제한적인 분양을 보장하고, 미국 특허 및 상표청장에 의해 35 USC §122 및 그에 따른 미국 특허 및 상표청장의 규칙 (37 CFR §1.14 포함, 특히 886 OG 638 참조)에 따라 권리가 있는 것으로 결정한 이에게 프로제니의 분양을 보장한다.

본 출원의 양수인은 적합한 조건 하에 배양할 때 기탁 물질의 배양물이 사멸하거나 손실되거나 파손된 경우, 그 통지시 물질을 다른 동일한 물질로 즉시 교체할 것임을 동의하였다. 기탁 물질의 분양은 각국 정부의 권한으로 그 특허법에 따라 승인된 권리에 위배하여 본 발명을 실시하도록 허가하는 것으로서 해석되어서는 안된다.

앞서 기술한 명세서는 당업계의 숙련인이 본 발명을 실시할 수 있도록 하기에 충분한 것으로 생각된다. 본 발명은 기탁된 실시태양은 본 발명의 특정 측면의 한 예시로서 의도되는 것이므로 기탁된 구조물의 범위에 제한되지 않고, 기능적으로 동등한 임의의 구조물은 본 발명의 범위 내에 있다.

본원에서 물질의 기탁은 본원에 포함된 기재 내용이 본 발명의 최선의 양식을 포함한 임의의 측면을 실시하기에 부적절하다는 것을 의미하지는 않으며, 특허 청구 범위의 범위를 명세서에서 나타내는 구체적인 설명에 제한하려는 것으로 해석되어서는 안된다. 실제로, 앞서의 상세한 설명으로부터 본원에 나타내고 기술된 것 이외에 본 발명의 다양한 변형이 당업계의 숙련인에게는 명백하고, 이는 첨부된 특허 청구의 범위 내에 있을 것이다.

Claims

(a) PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드, (b) PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드의 아고니스트 또는 (c) PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드의 길항제를 제약적으로 허용 가능한 담체와 함께 포함하는 조성물.
제1항에 있어서, 치료 유효량의 (a) PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드, (b) PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드의 아고니스트 또는 (c) PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드의 길항제를 포함하는 조성물.
제1항에 있어서, 아고니스트가 항 PRO230, 항 PRO216 또는 항 PRO302 항체인 조성물.
제1항에 있어서, 길항제가 항 PRO230, 항 PRO216 또는 항 PRO302 항체인 조성물.
제1항에 있어서, 심혈관제, 내피제, 혈관형성제 또는 혈관형성 억제제를 더 포함하는 조성물.
(a) PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드, (b) PRO230, PRO216 또는PRO302 폴리펩티드의 아고니스트 또는 (c) PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드의 길항제를 제약적으로 허용 가능한 담체와 혼합하는 것을 포함하는 제1항의 조성물의 제조 방법.
(i) (a) PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드, (b) PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드의 아고니스트 또는 (c) PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드의 길항제를 제약적으로 허용 가능한 담체와 함께 조성물,

(ii) 상기 조성물을 함유하는 용기 및

(iii) 상기 (a) PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드, (b) PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드의 아고니스트 또는 (c) PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드의 길항제의 심혈관, 내피 및 혈관형성 질환의 치료에 있어서의 용도를 언급하는 상기 용기에 부착된 라벨 또는 상기 제약품 내에 포함되는 포장 삽입물

을 포함하는 제품.
제7항에 있어서, 상기 아고니스트가 항 PRO230, 항 PRO216 또는 항 PRO302 항체인 제품.
제7항에 있어서, 상기 길항제가 항 PRO230, 항 PRO216 또는 항 PRO302 항체인 제품.
제7항에 있어서, 상기 조성물이 치료 유효량의 상기 (a) PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드, (b) PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드의 아고니스트 또는 (c) PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드의 길항제를 상기 제약적으로 허용 가능한 담체와 함께 포함하는 것인 제품.
(a) PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드에 의해 정상적으로 유도되는 세포 반응의 유도에 적합한 조건 하에서 세포를 스크리닝되는 시험 화합물과 접촉시키는 단계 및

(b) 시험 화합물이 효과적인 아고니스트임을 나타내는 상기 세포 반응의 유도를 측정하여 상기 시험 화합물이 효과적인 아고니스트임을 결정하는 단계

를 포함하는, PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드의 아고니스트를 동정하는 방법.
제11항에 있어서, 상기 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드에 의해 정상적으로 유도되는 세포 반응이 세포 증식의 자극인 방법.
시험 화합물과 폴리펩티드가 상호작용하기에 충분한 조건 및 시간 하에서 시험 화합물을 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드와 접촉시키는 단계 및 상기 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드의 활성이 억제됨을 측정하는 단계를 포함하는, 상기 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드의 활성을 억제하는 화합물을 동정하는 방법.
(a) PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드에 의해 정상적으로 유도되는 세포 반응의 유도에 적합한 조건 하에 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드 존재 하에서 세포를 스크리닝되는 시험 화합물과 접촉시키는 단계 및

(b) 상기 세포 반응의 유도를 측정하여 시험 화합물이 효과적인 길항제임을 결정하는 단계

를 포함하는, PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드의 활성을 억제하는 화합물을 동정하는 방법.
제14항에 있어서, 상기 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드에 의해 정상적으로 유도되는 세포 반응이 세포 증식의 자극인 방법.
PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드 발현에 적합한 조건 하에서 상기 폴리펩티드를 정상적으로 발현하는 세포를 시험 화합물과 접촉시키는 단계 및 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드의 발현 억제를 측정하는 단계를 포함하는, 세포 내에서 상기 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드의 발현을 억제하는 화합물을 동정하는 방법.
PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드의 아고니스트.
PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드의 길항제.
포유동물 세포내에서 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드의 발현을 억제하는 화합물.
제19항에 있어서, 상기 화합물이 안티센스 올리고뉴클레오티드인 화합물.
PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드에 결합하는 항체.
제21항에 있어서, 모노클로날 항체인 항체.
제21항에 있어서, 항체 단편인 항체.
제21항에 있어서, 단쇄 항체인 항체.
(a) 숙주에서 유래된 시료로부터 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 단리하는 단계 및

(b) PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드 핵산 서열 내의 돌연변이의 존재 또는 부재를 결정하는 단계

를 포함하고, 상기 돌연변이의 존재 또는 부재가 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드 코딩 핵산 서열 내의 상기 돌연변이와 관련된 질병 또는 질병에 대한 감수성의 존재를 나타내는, 상기 돌연변이와 관련된 질병 또는 질병에 대한 감수성의 진단 방법.
(a) 포유동물로부터 얻은 조직 세포의 시험 시료 및 (b) 공지된 동일한 세포형의 정상 조직 세포의 대조 시료에서 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 분석하는 것을 포함하고, 대조 시료에 비해 시험 시료의 발현 수준이 높거나 낮은 것이 상기 포유동물에서 심혈관, 내피 또는 혈관형성 질환의 존재를 나타내는, 상기 포유동물에서 심혈관, 내피 또는 혈관형성 질환의 진단 방법.
포유동물로부터 얻은 조직 세포의 시험 시료에서 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드의 존재 또는 부재를 검출하는 것을 포함하고, 상기 시험 시료에서 상기 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드의 존재 또는 부재가 상기 포유동물에서 심혈관, 내피 또는 혈관형성 질환의 존재를 나타내는, 상기 포유동물에서 심혈관, 내피 또는 혈관형성 질환의 진단 방법.
(a) 항 PRO230, 항 PRO216 또는 항 PRO302 항체를 포유동물로부터 얻은 조직세포의 시험 시료와 접촉시키는 단계 및

(b) 시험 시료 내에서 항 PRO230, 항 PRO216 또는 항 PRO302 항체와 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드 사이의 복합체의 형성을 검출하는 단계를 포함하며, 상기 복합체의 형성이 상기 포유동물 내의 심혈관, 내피 또는 혈관형성 질환의 존재를 나타내는, 상기 포유동물에서 심혈관, 내피 또는 혈관형성 질환의 진단 방법.
PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드를 함유하는 것으로 예상되는 시료를 항 PRO230, 항 PRO216 또는 항 PRO302 항체와 접촉시키는 단계 및 상기 시료의 성분과 상기 항체의 상기 시료의 성분과의 결합을 측정하는 단계를 포함하는, 시료에서 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드의 존재를 결정하는 방법.
적합한 포장 내에 항 PRO230, 항 PRO216 또는 항 PRO302 항체 및 담체를 포함하는, 심혈관, 내피 또는 혈관형성 질환 진단 키트.
제30항에 있어서, 상기 항체를 PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드의 존재를 검출하는 데 사용하기 위한 지시서를 더 포함하는 키트.
치료 유효량의 (a) PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드, (b) PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드의 아고니스트, 또는 (c) PRO230, PRO216 또는PRO302 폴리펩티드의 길항제를 포유동물에 투여하는 것을 포함하는, 포유동물의 심혈관, 내피 또는 혈관형성 질환의 치료 방법.
제32항에 있어서, 상기 질환이 심비대, 외상 또는 암인 방법.
제32항에 있어서, 상기 포유동물인 인간인 방법.
제34항에 있어서, 인간이 심근경색증 환자인 방법.
제34항에 있어서, 인간이 심근경색증, 외상, 암 또는 노화 관련된 황반 변성을 갖는 것인 방법.
제36항에 있어서, 비대가 PGF_2α수준의 상승을 특징으로 하는 방법.
제32항에 있어서, PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드가 심혈관제, 내피제 또는 혈관형성제와 함께 투여되는 것인 방법.
제36항에 있어서, PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드가 1차 혈관성형술 후에 투여되는 것인 방법.
제32항에 있어서, 상기 심혈관, 내피 또는 혈관형성 질환이 암인 방법.
제40항에 있어서, PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드가 화학치료제, 성장억제제 또는 세포독성제와 함께 투여되는 것인 방법.
제32항에 있어서, 상기 아고니스트가 항 PRO230, 항 PRO216 또는 항 PRO302 항체인 방법.
제32항에 있어서, 상기 길항제가 항 PRO230, 항 PRO216 또는 항 PRO302 항체인 방법.
(a) PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드, (b) PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드의 아고니스트 또는 (c) PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드의 길항제를 코딩하는 핵산 분자를 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서의 심혈관, 내피 또는 혈관형성 질환의 치료 방법.
제44항에 있어서, 상기 아고니스트가 항 PRO230, 항 PRO216 또는 항 PRO302 항체인 방법.
제44항에 있어서, 상기 길항제가 항 PRO230, 항 PRO216 또는 항 PRO302 항체인 방법.
제44항에 있어서, 포유동물이 사람인 방법.
제44항에 있어서, 핵산 분자가 생체외 (ex vivo) 유전자 치료법을 통해 투여되는 것인 방법.
프로모터, (a) PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드, (b) PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드의 아고니스트 폴리펩티드, 또는 (c) PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드의 길항제 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, 및 폴리펩티드의 세포 분비를 위한 시그날 서열을 주성분으로 포함하는 레트로바이러스 벡터를 레트로바이러스 구조 단백질과 함께 포함하는 재조합 레트로바이러스 입자.
레트로바이러스 구조 단백질을 발현하고, 프로모터, (a) PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드, (b) PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드의 아고니스트 폴리펩티드, 또는 (c) PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드의 길항제 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, 및 폴리펩티드의 세포 분비를 위한 시그날 서열을 주성분으로 포함하는 레트로바이러스 벡터를 포함하는 핵산 구조물을 포함하고, 레트로바이러스 벡터를 구조 단백질과 함께 패키징하여 재조합 레트로바이러스 입자를 생산하는생체외 생산 세포.
(a) PRO216 폴리펩티드, (b) PRO216 폴리펩티드의 아고니스트, (c) PRO230, PRO216 또는 PRO302 폴리펩티드의 길항제 또는 (d) 항 PRO216 항체를 내피 세포 성장이 억제되는 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 포유동물의 내피 세포 성장을 억제하는 방법.
(a) PRO230 폴리펩티드, (b) PRO230 폴리펩티드의 아고니스트, (c) PRO230 폴리펩티드의 길항제 또는 (d) 항 PRO230 항체를 내피 세포 성장이 자극되는 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물의 내피 세포 성장을 자극하는 방법.
치료 유효량의 항 PRO302 항체 포함하는, 혈관형성이 억제되는 상기 포유동물에게 PRO302 폴리펩티드에 의해 유도되는 혈관형성의 억제 방법.