JP2003524599A - 血管新生と心血管新生の促進又は阻害 - Google Patents

血管新生と心血管新生の促進又は阻害

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Abstract

(57)【要約】 ヒトを含む哺乳動物の血管形成又は新血管新生を刺激又は阻害する組成物又は方法を開示する。製薬用組成物は一又は複数のこれらの用途が同定されているポリペプチド又はそのアンタゴニストをベースにする。ここの組成物により診断、防止又は治療可能な疾患には、腫瘍、例えば傷、種々のガン及びアテローム性動脈硬化及び心肥大を含む管の疾患が含まれる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 (発明の背景) (発明の分野) 本発明は、かかる生物学的効果を必要とする哺乳動物において血管形成及び／
又は心血管新生を促進し又は阻害するために有用な組成物及び方法に関する。
【０００２】 (背景の記載) Ａ． 心疾患と因子 約５００万人のアメリカ人が心不全を患っており、心不全の新しい患者は毎年
約４０００００にのぼる。これは、アメリカ合衆国における６５歳以上の人々の
、最も頻出の入院原因である。急性心筋梗塞を含む急性心臓疾患の治療技術にお
ける最近の進歩により、慢性の心不全が発症した患者数が拡大する結果となった
。１９７９年から１９９５年まで、鬱血性心不全(ＣＨＦ)により入院した患者は
、３７７,０００から８７２,０００まで増加し(１３０パーセントの増加)、ＣＨ
Ｆによる死亡は１１６パーセント増加した。 ＣＨＦは、左心室の機能不全、運動耐性(exercise tolerance)の低下、生活水
準の悪化、顕著な寿命の低下により特徴付けられる症候群である。心不全の必須
条件は、体組織の代謝必要量を満たすのに十分な速度で血液を押し出すことに心
臓が不能であることである(換言すれば、心拍出量の不足である)。
【０００３】 末梢血管収縮、心拍数の増加、心収縮性の増加、血漿容量の増加を含む、少な
くとも４種の主要な補償メカニズムが心不全の場合に活性化される。これらの効
果は、交感神経系とレニン-アンギオテンシン系により主に媒介される。Eichhor
n, American Journal of Medicine, 140：163-169(1998)を参照されたい。交感
神経系からの出力の増加は、血管緊張、心拍数及び収縮性を増加させる。アンギ
オテンシンＩＩは、１)血管平滑筋収縮を直接刺激し、２)アルドステロンと抗利
尿ホルモン分泌を刺激することにより血漿容量の拡大を促進させ、３)交感神経
媒介血管緊張を刺激し、４)血管拡張とナトリウム利尿活性を有するブラジキニ
ンの変性を触媒することにより、血圧を上昇させる。BrownとVaughan. Circulat
ion, 97：1411-1420(1998)による概説を参照されたい。以下に記載するように、
アンギオテンシンＩＩは、筋細胞壊死(心収縮機能を害する)及び心臓内線維症(
心拡張とある場合には心収縮機能を害する)を促進することにより、心臓への直
接的に有害な影響を持つものである。Weber, Circulation, 96：4065-4082(1998
)を参照されたい。
【０００４】 鬱血性心不全(ＣＨＦ)の共通した特徴は心肥大、つまり機械的及びホルモン刺
激の双方により活性化され、心臓を心拍出量の増加に適合させる心臓の拡大であ
る。MorganとBaker. Circulation, 83：13-25(1991)。この肥大応答は、多くの
場合、高血圧、大動脈弁狭窄症、心筋梗塞、心筋症、弁閉鎖不全、及び心臓内短
絡等の多様な別の病状を伴い、これらは全て慢性的な血行動態過負荷となる。
【０００５】 肥大は、腫瘍形成を含まない、自然の成長と関係のない器官又は構造の大きさ
の増加として一般に定義されている。心肥大は、個々の細胞(ミオサイト)の質量
の増加、又は組織を形成する細胞数の増加(過形成)のいずれか、又はその両方に
よる。 胎児の心臓の拡大度合いは、ミオサイト数(誕生のすぐ後まで続く)の増
加に依存し、出生後の心臓のミオサイトはその増殖能を失う。さらなる成長は個
々の細胞の肥大を通して生じる。
【０００６】 成体ミオサイト肥大は、個々の筋繊維への負荷の減少を可能にすることにより
、障害性心機能に対しては短時間の応答として最初は有益である。しかし、過酷
で長時間の過負荷を受けると、肥大細胞は劣化し始め、死亡する。Katz, "Heart
Failure"：Katz A.M.編, Physiology of the Heart(New York：Raven Press. 1
992)pp.638-668。心肥大は、心不全の臨床過程において死亡率と罹患率の両方に
対してかなりの危険因子である。Katz, Trends Cardiovasc. Med., 5：37-44(19
95)。心肥大の原因と病状のさらなる詳細については、例えばHeart Disease, A
Textbook of Cardiovascular Medicine, Braunwald, E.編(W.B. Saunders Co.,
1988), 14章, "Pathophysiology of Heart Failure"を参照されたい。
【０００７】 細胞レベルでは、心臓はミオサイトと包括的に非ミオサイトを呼ばれる周囲の
支持細胞からなる。非ミオサイトは主として線維芽細胞／間葉細胞であるが、そ
れらは内皮及び平滑筋細胞も含む。実際、ミオサイトは成人心筋質量の大部分を
形成するが、それらは心臓に存在する全細胞数の約３０％を占めるにすぎない。
ホルモン的、生理学的、血行力学的及び病理学的刺激に反応して、成体心室筋細
胞は肥大化プロセスの活性化を通して仕事量の増加に適合することができる。こ
の反応は、心房性ナトリウム利尿ペプチド(ＡＮＰ)に対する遺伝子を含む胎性遺
伝子の活性化と細胞分割が付随することのない、個々の心筋細胞の収縮性タンパ
ク質の含有量とミオサイトの細胞サイズの増加により特徴付けられる。Chienら,
FASEB J., 5：3037-3046(1991)：Chienら, Annu. Rev. Physiol., 55：75-95(1
993)。心筋内冠動脈の周りと細胞外マトリクス内の間質性コラーゲンの蓄積に関
連したミオサイトサイズの増大の結果としての心筋質量の増大が、ヒトにおける
圧負荷の次の左心室肥大において記載されている。Caspariら, Cardiovasc. Res
., 11：554-558(1977)；Schwarzら, Am. J. Cardiol., 42：895-903(1978)：Hes
sら, Circulation, 63：360-371(1981)；Pearlmanら, Lab. Invest., 46：158-1
64(1982)。
【０００８】 非ミオサイト支持細胞により産生されるパラ分泌因子が、心肥大の発生にまた
関与していることも示唆されており、白血球阻害因子(ＬＩＦ)及びエンドセリン
等の様々な非ミオサイト由来肥大因子が同定されている。Metcalf, Growth Fact
ors, 7：169-173(1992)；Kurzrockら, Endocrine Reviews, 12：208-217(1991)
；Inoueら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86：2863-2867(1989)；Yanagisawa及
びMasaki, Trends Pharm. Sci., 10：374-378(1989)；米国特許第5,573,762号(1
996年11月12日発行)。心肥大の潜在性な媒介物として同定されているさらなる例
示的因子には、カルジオトロフィン(cardiotrophin)-１(ＣＴ-１)(Pennicaら, P
roc. Nat. Acad. Sci. USA, 92：1142-1146(1995))、カテコールアミン類、副腎
皮質ステロイド類、アンギオテンシン及びプロスタグランジン類が含まれる。
【０００９】 現在、心肥大の治療法は、その根本にある心臓疾患に応じて異なる。肥大の潜
在性な媒介物として同定されている因子としては、カテコールアミン類、副腎皮
質ステロイド類、アンギオテンシン、プロスタグランジン類、ＬＩＦ、エンドセ
リン[エンドセリン-１、-２及び-３、及び大エンドセリン(big endothelin)を含
む]及びＣＴ-１が挙げられる。例えば、β-アドレナリン様レセプターブロック
剤(β-ブロッカー、例えばプロプラノロール、チモロール、タータロロール(ter
talolol)、カルテオロール、ナドロール、ベタキソロール、ペンブトロール、ア
セトブトロール(acetobutolol)、アテノロール、メトプロロール、カルベジルロ
ール等)及びベラパミルが、肥大心筋症の治療に広く使用されている。徴候(胸の
痛み)及び運動耐性に対するβ-ブロッカーの有益な効果は、主として、結果とし
て心拡張の延長と受動的心室充満の増加が伴う心拍数の低下による。Thompsonら
, Br. Heart J., 44：488-98(1980)；Harrisonら, Circulation, 29：84-98(196
4)。ベラパミルは心室充満を改善し、おそらく心筋虚血を低減させることが記載
されている。Bonowら, Circulation, 72：853-64(1985)。
【００１０】 ニフェジピンとジルチアゼムもまた、時折、肥大心筋症の治療に使用される。
Lorellら, Circulation, 65：499-507(1982)；Betocchiら, Am. J. Cardiol.,78
：451-457(1996)。しかしながら、その強力な血管拡張性のために、ニフェジピ
ンは、特に流出閉塞症の患者にとっては有害になるおそれもある。ジソピラミド
が負の筋収縮性による徴候を緩和するのに使用されている。Pollick, N. Engl.
J. Med., 307：997-999(1982)。しかし、多くの患者において、当初の恩恵は時
間と共に低減する。Wigleら, Circulation, 92：1680-1692(1995)。抗高血圧薬
による治療は、血圧の上昇に伴う心肥大において有益な効果があることが報告さ
れている。抗高血圧治療において単独で又は組み合わせて使用される薬物の例と
しては、カルシウムアンタゴニスト、例えばニトレンジピン；アドレナリン様レ
セプターブロック剤、例えば上に列挙したもの；アンギオテンシン転換酵素(Ａ
ＣＥ)インヒビター、例えばキナプリル、カプトプリル、エナラプリル、ラミプ
リル、ベナゼプリル、フォシノプリル及びリシノプリル；利尿薬、例えばクロロ
チアジド、ヒドロクロロチアジド、ヒドロフルメタジド、メチルクロチアジド(m
ethylchlothiazide)、ベンズチアジド、ジクロロフェナミド、アセタゾラミド、
及びインダパミド；及びカルシウムチャンネルブロッカー、例えばジルチアゼム
、ニフェジピン、ベラパミル及びニカルジピンが挙げられる。
【００１１】 例えば、ジルチアゼム及びカプトプリルを用いた高血圧の治療は、左心室筋肉
質量の低減を示しているが、心拡張機能のドップラー指数は正常にはならなかっ
た。Szlachcicら, Am. J. Cardiol., 63：198-201(1989)；Shahiら, Lancet, 33
6：458-461(1990)。これらの知見は、過度の量の間質性コラーゲンが左心室肥大
の緩解後に残るであろうことを示していると解釈される。Rossiら, Am. Heart J
., 124：700-709(1992)。上掲のRossiらは、実験用ラットにおける、圧負荷心肥
大における心筋細胞肥大と間質性線維症の防止と退行に対するカプトプリルの効
果を研究した。
【００１２】 心収縮性を直接増大させる薬剤(変力剤)は、短期間で心拍出量を改善するため
に当初は心不全の患者にとっては有益であると考えられていた。しかし、ジゴキ
シゲニンを除く全ての陽性変力剤は、心臓性能の短期間の改善にもかかわらず、
長期間では死亡率が増加する結果になることが見出されている。Massie, Curr.
Op. in Cardiology, 12：209-217(1997)；Reddyら, Curr. Opin. Cardiol., 12
：233-241(1997)。近年、β-アドレナリン様レセプターブロッカーの心不全への
使用が支持されている。臨床試験の証拠によれば、心機能の改善が死亡率を増加
させることなく達成可能であることが示唆されるが、患者生存率の改善は今だ証
明されていない。また、ＣＨＦの治療におけるインシュリン様成長因子-Ｉ及び
／又は成長ホルモン、又はカルジオトロピン-１又はそのアンタゴニストの使用
に関しては米国特許第5,935,924号；同5,624,806号；同5,661,122号；同5,610,1
34号；及び国際公開第95/28173号を参照されたい。他の治療様式は心臓移植であ
るが、これはドナーの心臓の入手可能性により制限される。
【００１３】 エンドセリンは、ブタ動脈のエンドセリン培養上清から単離され、構造的に決
定された、２１のアミノ酸を含む血管収縮化ペプチドである。Yanagisawaら,Nat
ure, 332,：411-415(1988)。後になって、エンドセリンは種々の作用を示すこと
が見出され、エンドセリンアンタゴニストのようなエンドセリン抗体は、心筋梗
塞、腎不全、及び他の病気に治療に有効であることが証明されている。エンドセ
リンは生体内に存在していて、血管収縮作用を示すために、循環系の調節に関与
している内因性因子であることが予想され、高血圧、心疾患、例えば心筋梗塞、
及び腎臓病、例えば急性腎不全と関連があるであろうの存在が予期される。エン
ドセリンアンタゴニストは、例えば米国特許第5,773,414号；日本国特許公開第3
130299/1991号、欧州特許第457,195号；欧州特許第460,679号；及び欧州特許第5
52,489号に記載されている。エンドセリンレセプターアンタゴニストを同定する
ための新規なエンドセリンＢレセプターは米国特許第5,773,223号に記載されて
いる。
【００１４】 心不全の現在の治療は、主として、アンギオテンシン転換酵素(ＡＣＥ)インヒ
ビター、例えばカプトプリル、及び利尿薬を使用することに向けられている。こ
れらの薬物は血行動態特性と運動耐性を改善し、ＣＨＦ患者の羅患率及び死亡率
を低減させる。Kramerら, Circulation, 67(4)：807-816(1983)；Captopril Mul
ticenter Research Group, J.A.C.C., 2(4)：755-763(1983)；The CONSENSUS Tr
ial Study Group, N. Engl. J. Med., 316(23)：1429-1435(1987)；The SOLVD I
nvestigators, N. Engl. J. Med., 325(5)：293-302(1991)。さらに、それらは
、高血圧、左心室機能不全、アテローム性動脈硬化症、糖尿病腎障害の治療に有
用である。Brown及びVaughan, 上掲。しかしながら、効能が証明されているにも
かかわらず、ＡＣＥインヒビターに対する反応性は限られている。例えば、心不
全の場合に生存を延ばすが、ＡＣＥインヒビターは末期心不全への進行を遅延さ
せるようであり、ＡＣＥインヒビターを用いた患者のかなりの数が機能クラスＩ
ＩＩの心不全を有している。
【００１５】 さらに、機能的能力と運動時間の改善性は僅かで、死亡率は低減はするが高い
ままである。The CONSENSUS Trial Study Group, N. Engl. J. Med., 316(23)：
1429-1453(1987)；The SOLVD Investigators, N. Engl. J. Med., 325(5)：293-
302(1991)；Cohnら, N. Engl. J. Med., 325(5)：303-310(1991)；The Captopri
l-Digoxin Multicenter Research Group, JAMA, 259(4)：539-544(1988)。この
ため、ＡＣＥインヒビターにより、いつも６０％以上の心不全患者において徴候
を緩和することができず、心不全による死亡率を約１５-２０％も低減させるこ
とはできないようである。さらなる好ましくない効果は 上掲のBrown及びVaugha
nを参照されたい。
【００１６】 また、ＡＣＥインヒビターの代替物は特定のＡＴ１レセプターアンタゴニスト
である。臨床研究では、心臓血管及び腎臓の病気の治療における、２つの様式の
効能を比較することが計画されている。しかしながら、動物モデルのデータでは
、ＡＣＥ／ＡｎｇＩＩ経路は、心肥大に明らかに関与しているが、唯一のもので
はなく、あるいはこの役割に活性な主要経路でさえないことを示唆している。こ
のような一つのモデルにおいては、ＡｎｇＩＩに対する主要な心臓レセプター、
ＡＴｓｕｂ１Ａが遺伝学的に欠失されており；これらのマウスは、ＡｎｇＩＩが
実験的に付与された場合に肥大を発現しない(ＡｎｇＩＩに二次的な肥大の消滅
におけるモデルの基本的な成功を確認する)。しかしながら、これらの動物(高血
圧の心臓ストレスのモデル)において大動脈を収縮させた場合、心臓はなおも肥
大性になる。このことは、このレセプター(ＡＴサブ１Ａ)に無関係な別のシグナ
ル伝達経路が高血圧において活性化されていることを示唆している。おそらく、
ＡＣＥインヒビターはこれらの経路を阻害することはできないであろう。Harada
ら, Circulation, 97：1952-1959(1998)を参照されたい。また、心肥大のプロセ
スとメカニズムに関連した謎については、Homcy, Circulation, 97：1890-1892(
1998)を参照されたい。
【００１７】 毎年約７５００００人の患者が急性心筋梗塞(ＡＭＩ)を患っており、アメリカ
合衆国における全死亡の約４分の１がＡＭＩによるものである。近年、血栓溶解
剤、例えばストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、特に組織プラスミノーゲンアク
チベータ(ｔ-ＰＡ)が、心筋梗塞を患っている患者の生存率をかなり増加させた
。１．５〜４時間、連続して静脈注入として投与した場合、ｔ-ＰＡは治療した
患者の６９％〜９０％において９０分で冠動脈を開通させる。Topolら, Am. J.
Cardiol., 61, 723-728(1988)；Neuhausら, J. Am. Coll. Cardiol., 12：581-5
87(1988)；Neuhausら, J. Am. Coll. Cardiol., 14：1566-1569(1989)。最も高
い開存率が高用量又は加速投薬療法で報告されている。Topol, J. Am. Coll. Ca
rdiol., 15：922-924(1990)。またｔ-ＰＡは一回の大量瞬時投与として投与して
もよく、半減期は比較的短いが、注入治療により適している。Tebbeら, Am. J.
Cardiol., 64：448-453(1989)。特に長い半減期と非常に高いフィブリン特異性
を有するように設計されたｔ-ＰＡ変異体、ＴＮＫ-ｔ-ＰＡ(Ｔ１０３Ｎ、Ｎ１１
７Ｑ、ＫＨＲＲ(296-299)ＡＡＡＡｔ-ＰＡ変異体, Keytら, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 91：3670-3674(1994))が大量瞬時投与に特に適している。しかしなが
ら、これらのあらゆる進歩にもかかわらず、患者の生存率の長期間の予後は、梗
塞後のモニタリングと患者の治療に大きく依存しており、それは心肥大のモニタ
リングと治療を含まなければならない。
【００１８】 Ｂ． 成長因子 種々の天然に生じるポリペプチドは内皮細胞の増殖を誘発すると報告されてい
る。これらのポリペプチドとしては、塩基性及び酸性の線維芽細胞増殖因子(Ｆ
ＧＦ)(Burgess及びMaciag, Annual Rev. Biochem., 58：575(1989))、血小板誘
導内皮細胞成長因子(ＰＤ-ＥＣＧＦ)(Ishikawaら, Nature, 338：557(1989))、
及び血管内皮成長因子(ＶＥＧＦ)を挙げることができる。Leungら, Science, 24
6：1306(1989)；Ferrara及びHenzel, Biochem. Biophys. Res. Commun., 161：8
51(1989)；Tischerら, Biochem. Biophys. Res. Commun., 165：1198(1989)；19
96年7月31日に許可されたEP471,754B。
【００１９】 ヒトＶＥＧＦ(ｈＶＥＧＦ)ｃＤＮＡが形質移入された細胞により馴化された培
地においては、毛管内皮細胞の増殖は促進されるが、これに対し、対照細胞はそ
うではなかった。Leungら, Science, 246：1306(1989)。ｈＶＥＧＦの１２１-、
１８９-及び２０６-アミノ酸イソ型(また集合的にｈＶＥＧＦ関連タンパク質と
称される)をコードする、いくつかの付加的なｃＤＮＡがヒトｃＤＮＡライブラ
リにおいて同定されている。１２１-アミノ酸タンパク質はｈＶＥＧＦにおける
残基１１６と１５９との間の４４アミノ酸が欠失している点でｈＶＥＧＦとは異
なる。１８９-アミノ酸タンパク質は、ｈＶＥＧＦにおける残基１１６における
２４のアミノ酸の挿入によりｈＶＥＧＦとは異なり、ヒト血管浸透因子(ｈＶＰ
Ｆ)と明らかに同一である。２０６-アミノ酸タンパク質はｈＶＥＧＦの残基１１
６における４１アミノ酸の挿入によりｈＶＥＧＦとは異なる。Houckら, Mol. En
docrin., 5：1806(1991)；Ferraraら, J. Cell. Biochem., 47：211(1991)；Fer
raraら, Endocrine Reviews, 13：18(1992)；Keckら, Science, 246：1309(1989
)；Connollyら, J. Biol. Chem., 264：20017(1989)；1990年5月30日に公開され
た欧州特許第370,989号。
【００２０】 現在では、先在する内皮からの新規な血管の形成に関連した血管新生が、種々
の疾病の病原に関与していることが明確に確立されている。これらには固形腫瘍
及び転移、アテローム性動脈硬化、水晶体後方線維増殖症、血管腫、慢性炎症、
眼新血管新生症候群、例えば増殖性網膜症、例えば糖尿病網膜症、加齢関連性斑
変性(ＡＭＤ)、新血管新生緑内障、移植角膜組織及び他の組織の免疫拒絶、慢性
関節リウマチ、及び乾癬が含まれる。Folkmanら, J. Biol. Chem., 267：10931-
10934(1992)；Klagsbrunら, Annu. Rev. Physiol., 53：217-239(1991)；及びGa
rner A, "Vascular diseases"。Pathobiology of Ocular Disease. A Dynamic A
pproach, Garner A. Klintworth GK, eds., 2nd Edition(Marcel Dekker, NY,19
94) 1625-1710頁。
【００２１】 腫瘍成長の場合では、血管形成は、過形成から新生組織形成への変化、及び固
形腫瘍の成長用の滋養物の提供に非常に重要であると思われる。Folkmanら, Nat
ure, 339：58(1989)。新血管新生により、腫瘍細胞が正常細胞と比較して成長有
利性と増殖自律性を獲得する。従って、腫瘍部位の微小血管密度と乳癌並びに幾
つかの他の腫瘍における患者の生存率との間には相関関係が見出されている。We
idnerら, N. Engl. J. Med. 324：1-6(1991)；Horakら, Lancet, 340：1120-112
4(1992)；Macchiarini.ら, Lancet, 340：145-146(1992)。
【００２２】 血管形成の正の調節因子の探索により、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＴＧＦ-α、Ｈ
ＧＦ、ＴＮＦ-α、ＴＧＦ-β、アンジオゲニン、ＩＬ-８等を含む多くの候補薬
が得られている。上掲のFolkmanら, J.B.C.,及び上掲のKlagsbrunら。これまで
に同定されている負の調節因子には、トロンボスポンジン(Goodら, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA., 87：6624-6628(1990))、プロラクトンの１６-キロダルトン
のＮ-末端フラグメント(Clappら, Endocrinology, 133：1292-1299(1993))、ア
ンギオスタチン(angiostatin)(O'Reillyら, Cell, 79：315-328(1994))及びエン
ドスタチン(endostatin)が含まれる。O'Reillyら, Cell, 88：277-285(1996)。
【００２３】 最近の数年間にわたってなされた研究で、血管内皮細胞の増殖を刺激するだけ
でなく、血管の浸透性及び血管形成を誘発する点においてもＶＥＧＦの重要な役
割が確立されている。Ferraraら, Endocr. Rev., 18：4-25(1997)。一つのＶＥ
ＧＦ対立遺伝子さえ喪失すると胎児死亡に至るという知見は、血管系の発達と分
化におけるこの因子が担っている代替のない役割を示している。さらに、ＶＥＧ
Ｆは腫瘍及び眼内疾患に関連した新血管新生の重要な媒介物であることが示され
ている。Ferraraら, Endocr. Rev., 上掲。ＶＥＧＦｍＲＮＡは検査した多くの
ヒト腫瘍で過剰発現している。Berkmanら, J. Clin. Invest., 91：153-159(199
3)；Brownら, Human Pathol., 26：89-91(1995)；Brownら, Cancer Res., 53：4
727-4735(1993)；Matternら, Brit. J. Cancer, 73：931-934(1996)；Dvorakら,
Am. J. Pathol., 146：1029-1039(1995)。
【００２４】 また、眼の流体中のＶＥＧＦの濃度レベルは、糖尿病及び他の虚血関連網膜症
を有する患者における血管の活性増殖の存在性と高い相関関係がある。Aielloら
, N. Engl. J. Med., 331：1480-1487(1994)。さらに、近年の研究により、ＡＭ
Ｄの影響を受けている患者の脈絡膜新生血管膜にＶＥＧＦが局在化していること
が示されている。Lopezら, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 37：855-868(1996
)。
【００２５】 抗-ＶＥＧＦ中和抗体は、ヌードマウスにおいて、様々なヒト腫瘍株化細胞の
成長を抑制し(Kimら, Nature, 362：841-844(1993)；Warrenら, J. Clin. Inves
t., 95：1789-1797(1995)；Borgstromら, Cancer Res., 56：4032-4039(1996)；
Melnykら, Cancer Res., 56：921-924(1996))、また虚血性網膜疾患における眼
内血管形成を阻害する。Adamisら, Arch. Ophthalmol., 114：66-71(1996)。よ
って、抗-ＶＥＧＦモノクローナル抗体又はＶＥＧＦ作用に対する他のインヒビ
ターは、固形腫瘍及び種々の眼内新血管疾患の治療用の候補薬とされている。こ
のような抗体は、例えば1998年1月14日に公開されたEP817,648及び1998年4月3日
に出願されたPCT/US98/06724に記載されている。
【００２６】 ある種の細胞により発現する遺伝子の複合体を素早く誘導することができる、
トランスフォーミング発ガン遺伝子を含む、いくつかの他の成長因子及び分裂促
進因子が存在する。Lau及びNathans. Molecular Aspects of Cellular Regulati
on, 6：165-202(1991)。前初期遺伝子又は初期反応遺伝子と命名されているこれ
らの遺伝子は、デノボタンパク質合成と無関係に、成長因子又は分裂促進因子と
接触後数分間で転写的に活性化される。これらの前初期遺伝子のグループは、分
化及び増殖、再生、及び傷治療等の複雑な生物学的プロセスを調整するのに必要
な、分泌性の細胞外タンパク質をコードする。Ryseckら, Cell Growth Differ.,
2：235-233(1991)。
【００２７】 このグループに属する高度関連タンパク質には、ｃｅｆ１０(Simmonsら, Proc
. Natl. Acad. Sci. USA, 86：1178-1182(1989))、血清-又は血小板誘導成長因
子(ＰＤＧＦ)により素早く活性化されるｃｙｒ６１(O'Brienら, Mol. Cell. Bio
l., 10：3569-3577(1990))、トランスフォーミング成長因子β(ＴＧＦ-β)によ
る活性化後に高レベルでヒト血管内皮細胞により分泌され、ＰＤＧＦ様の生物学
的及び免疫学的活性を示し、特定の細胞表面レセプターに対してＰＤＧＦと競合
するヒト結合組織成長因子(ＣＴＧＦ)(Bradhamら, J. Cell. Biol., 114：1285-
1294(1991))、ｆｉｓｐ-１２(Ryseckら, Cell Growth Differ., 2：235-233(199
1))、ヒト血管ＩＢＰ-様成長因子(ＶＩＧＦ)(WO96/17931)、及び通常は成人腎臓
細胞に静止され、骨髄芽球-関連-ウイルスＩ型誘発腎芽細胞腫において過剰発現
することが見出されているｎｏｖが含まれる。Joloitら, Mol. Cell. Biol., 12
：10-21(1992)。
【００２８】 これらの前初期遺伝子の発現は、成長因子により誘発される事象のカスケード
における「第３のメッセンジャー」として作用する。また、それらは複雑な生物
学的プロセス、例えば分化及び細胞増殖が通常の事象である傷治療を統合及び調
整するのに必要であると考えられている。 付加的な分裂促進因子として、インシュリン様成長因子結合タンパク質(ＩＧ
ＦＢＰｓ)が、インシュリン様成長因子(ＩＧＦ)との複合体において、線維芽細
胞及び平滑筋細胞表面レセプターへのＩＧＦの結合性を増加させるように刺激す
ることが示されている。Clemmonsら., J. Clin. Invest., 77: 1548(1986)。様
々なインビトロでのＩＧＦ作用に対するＩＧＦＢＰの阻害効果は、脂肪細胞によ
るグルコース輸送の刺激、軟骨細胞によるサルフェートの取り込み、及び線維芽
細胞中へのチミジン人の取り込みを含む。Zapfら, J. Clin. Invest., 63：1077
(1979)。さらに、正常な細胞での、成長因子媒介性分裂促進因子活性におけるＩ
ＧＦＢＰの阻害効果が示されている。
【００２９】 Ｃ． さらなる治療の必要性 多くの病気及び疾患における血管内皮細胞の成長及び血管形成の役割に鑑みる
と、これらのプロセスに起因する一又は複数の生物学的影響を低減又は抑制する
手段を有していることが好ましい。また、正常及び病気の状態、特にガンにおい
て病原性ポリペプチドの存在を検査する手段を有していることも望ましい。さら
に、特定の側面では、心肥大の治療には一般的に適用できる治療法がないので、
心臓ミオサイト肥大を防止又は低減可能な因子を同定することは、病態生理学的
な心臓成長を阻害するための新規な治療方策の開発において非常に重要である。
様々な心臓血管及び発ガン遺伝子疾患のためのいくつかの治療様式が存在するが
、さらなる治療的アプローチがなお必要とされている。
【００３０】 (発明の概要) 従って、本発明は、哺乳類における血管形成及び／又は心血管新生を促進又は
阻害するための組成物及び方法に関する。本発明は、ある種の生物学的活性の促
進又は阻害度合いを試験する種々の心血管アッセイにおいて陽性をテストするタ
ンパク質の同定に基づく。従って、血管形成の促進又は阻害、血管内皮細胞成長
の阻害又は刺激、血管内皮細胞の成長又は増殖の刺激、腫瘍成長の阻害、血管形
成依存性組織成長の阻害、血管形成依存性組織成長の刺激、心肥大の阻害、及び
心肥大の刺激、例えば鬱血性心不全の治療等の効果が望まれているところでは、
本タンパク質は疾患の診断及び／又は治療(予防を含む)に有用な薬剤であると考
えられる。
【００３１】 一実施態様において、本発明は製薬的に許容可能な担体との混合物において、
ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドを遺伝子組成物を提
供する。一態様では、組成物は治療的有効量のポリペプチドを含有する。他の態
様では、組成物はさらなる活性成分、すなわち、心血管、内皮又は血管形成剤又
はアンジオスタティック(angiostatic)剤、好ましくは血管形成又はアンジオス
タティック剤を含有する。好ましくは組成物は滅菌されている。ＰＲＯ２３０、
ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドは、液状の製薬調製物の形態で投与
することができ、これは、貯蔵安定性が延びるように保存できる。保存された液
状の製薬調製物は複数回投与用のＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２
ポリペプチドを含有していてもよく、よって繰り返し使用に適している。
【００３２】 さらなる実施態様において、本発明は、製薬的に許容可能な担体と、治療的有
効量のＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドとの混合物を
含有する、心血管、内皮又は血管形成疾患の治療に有用なこのような組成物の調
製方法を提供する。 他の実施態様において、本発明は、製薬的に許容可能な担体との混合物に、Ｐ
ＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドのアゴニスト又はアン
タゴニストを含有する組成物を提供する。一態様では、組成物はさらなる活性成
分、すなわち、心血管、内皮又は血管形成剤又はアンジオスタティック剤、好ま
しくは血管形成又はアンジオスタティック剤を含有する。好ましくは組成物は滅
菌されている。ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドのア
ゴニスト又はアンタゴニストは、貯蔵時の安定性の延長が達成されるように防腐
されていてもよく、液状の製薬調製物の形態で投与されうる。防腐処理された液
状の製薬調製物は多量のＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプ
チドのアゴニスト又はアンタゴニストを含有していてもよく、よって繰り返し使
用に適している。 さらなる実施態様において、本発明は、製薬的に許容可能な担体と、ＰＲＯ２
３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニ
ストとの混合物を含有する、心血管、内皮又は血管形成疾患の治療に有用なこの
ような組成物の調製方法を提供する。
【００３３】 また他の実施態様において、本発明は、製薬的に許容可能な担体との混合物に
、抗ＰＲＯ２３０、抗ＰＲＯ２１６又は抗ＰＲＯ３０２抗体を含有する組成物に
関する。一態様において、組成物は治療的有効量の抗体を含有する。他の態様に
おいて、組成物はさらなる活性成分、すなわち、心血管、内皮又は血管形成剤又
はアンジオスタティック剤、好ましくは血管形成又はアンジオスタティック剤を
含有する。好ましくは組成物は滅菌されている。組成物は、貯蔵時の安定性の延
長が達成されるように防腐されていてもよく、液状の製薬調製物の形態で投与さ
れうる。防腐処理された液状の製薬調製物は多量の抗ＰＲＯ２３０、抗ＰＲＯ２
１６又は抗ＰＲＯ３０２抗体を含有していてもよく、よって繰り返し使用に適し
ている。好ましい実施態様において、抗体はモノクローナル抗体、抗体フラグメ
ント、ヒト化抗体又は単鎖抗体である。 さらなる実施態様において、本発明は製薬的に許容可能な担体と、治療的有効
量抗ＰＲＯ２３０、抗ＰＲＯ２１６又は抗ＰＲＯ３０２抗体との混合物を含有す
る、心血管、内皮又は血管形成疾患の治療に有用なこのような組成物の調製方法
を提供する。
【００３４】 またさらなる態様において、本発明は： (ａ)治療的有効量のＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチド
を含有する物質の組成物； (ｂ)該組成物を収容する容器；及び (ｃ)該容器に添付されるラベル、又は心血管、内皮又は血管形成疾患の治療にお
ける該ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドの使用を記し
た該製薬品に含まれる包装挿入物； を含有する製造品を提供する。 他の態様において、本発明は： (ａ)治療的有効量のＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチド
のアゴニスト又はアンタゴニストを含有する物質の組成物； (ｂ)該組成物を収容する容器；及び (ｃ)該容器に添付されるラベル、又は心血管、内皮又は血管形成疾患の治療にお
ける該ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドのアゴニスト
又はアンタゴニストの使用を記した該製薬品に含まれる包装挿入物； を含有する製造品を提供する。 また他の態様では、本発明は： (ａ)治療的有効量の抗ＰＲＯ２３０、抗ＰＲＯ２１６又は抗ＰＲＯ３０２抗体を
含有する物質の組成物； (ｂ)該組成物を収容する容器；及び (ｃ)該容器に添付されるラベル、又は心血管、内皮又は血管形成疾患の治療にお
ける該抗ＰＲＯ２３０、抗ＰＲＯ２１６又は抗ＰＲＯ３０２抗体の使用を記した
該製薬品に含まれる包装挿入物； を含有する製造品を提供する。
【００３５】 他の実施態様において、本発明は： (ａ)細胞と試験化合物とを接触させ、ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３
０２ポリペプチドにより正常に誘発される、細胞反応の誘発に適した条件下でス
クリーニングし；さらに (ｂ)該細胞反応の誘発は、該試験化合物が有効なアゴニストであることを示して
いるため、該細胞反応の誘発を測定して、試験化合物が有効なアゴニストである
か否かを決定する； ことを含む、ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドのアゴ
ニストを同定する方法を提供する。 他の実施態様において、本発明は： (ａ)細胞と試験化合物とを接触させ、ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３
０２ポリペプチドによる細胞増殖の刺激に適した条件下でスクリーニングし；さ
らに (ｂ)細胞増殖の刺激は、該試験化合物が有効なアゴニストであることを示してい
るため、該細胞の増殖を測定して、試験化合物が有効なアゴニストであるか否か
を決定する； ことを含む、ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドのアゴ
ニストを同定する方法を提供する。
【００３６】 他の実施態様において、本発明は、試験化合物とポリペプチドとの相互作用が
可能となる条件下及び十分時間、試験化合物とＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又は
ＰＲＯ３０２ポリペプチドを接触させ、ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ
３０２ポリペプチドの活性が阻害されるか否かを測定することを含む、ＰＲＯ２
３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドの活性を阻害する化合物を同
定する方法を提供する。特に好ましい態様では、試験化合物又はＰＲＯ２３０、
ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドのいずれかは固体支持体上に固定さ
れている。他の好ましい態様では、非固定化成分は検出可能な標識を担持する。 好ましい態様では、この方法は次の工程： (ａ)細胞と試験化合物とを接触させ、ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３
０２ポリペプチドにより正常に誘発される、細胞反応の誘発に適した条件で、Ｐ
ＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドの存在下スクリーニン
グし；さらに (ｂ)該細胞反応の誘発を測定して、試験化合物が有効なアンタゴニストであるか
否かを決定する； ことを含む。 他の好ましい態様では、この方法は次の工程： (ａ)細胞と試験化合物とを接触させ、ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３
０２ポリペプチドによる細胞増殖の刺激に適した条件で、ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ
２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドの存在下スクリーニングし；さらに (ｂ)該細胞の増殖を測定して、試験化合物が有効なアンタゴニストであるか否か
を決定する； ことを含む。
【００３７】 他の実施態様において、本発明は、ポリペプチドが正常に発現している細胞に
おいて、ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドの発現を阻
害する化合物を同定する方法を提供し、ここで、該方法は、細胞と試験化合物を
接触させ、ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドの発現が
阻害されるか否かを測定することを含む。好ましい態様では、この方法は次の工
程： (ａ)細胞と試験化合物とを接触させ、ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３
０２ポリペプチドの発現に適した条件下でスクリーニングし；さらに (ｂ)該ポリペプチドの発現の阻害度合いを測定する； ことを含む。 また、さらなる実施態様では、本発明は、前掲の４つの方法により同定された
化合物等の、ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドの発現
を阻害する化合物を提供する。
【００３８】 本発明の他の態様は、前掲の方法により同定されていてもよいＰＲＯ２３０、
ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストを
指向する。 ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドの一又は複数の機
能又は活性を阻害するＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチ
ドのアンタゴニストの一種は抗体である。このため、他の態様では、本発明はＰ
ＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドに結合する単離された
抗体を提供する。好ましい態様において、抗体はモノクローナル抗体であり、好
ましくは非ヒト相補性決定領域(ＣＤＲ)残基及びヒトフレームワーク領域(ＦＲ)
酸基を有する。抗体は標識されても固体支持体上に固定化されてもよい。更なる
態様では、抗体は抗体フラグメント、単鎖抗体、又はヒト化抗体である。好まし
くは、抗体はポリペプチドに特異的に結合する。
【００３９】 さらなる側面において、本発明は： (ａ)宿主から得られるサンプルから、ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３
０２ポリペプチドをコードする核酸配列を単離し； (ｂ)ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドの核酸配列にお
ける変異の有無を測定する； ことを含む、ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドコード
化核酸配列の変異に関連する病気又は病気への感染性の診断方法を提供し、ここ
では、該変異の有無が、病気又は病気へ感染したことを示す。 さらに他の態様では、本発明は、(ａ)哺乳動物から得られた組織細胞のテスト
用サンプルと(ｂ)同じ細胞型の既知の正常な組織細胞の対照サンプル中で、ＰＲ
Ｏ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドをコードする遺伝子の発
現のレベルを分析することを含んでなる、哺乳動物における心血管、内皮又は血
管形成疾患の診断方法を提供し、ここで、対照サンプルと比較して、テスト用サ
ンプルの高い又は低い発現レベルが、該哺乳動物中に心血管、内皮又は血管形成
疾患が存在することを示す。ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリ
ペプチドをコードする遺伝子の発現は、対照サンプルと比較して、テスト用サン
プル中のｍＲＮＡ又はポリペプチドのレベルを測定することにより達成される。
【００４０】 さらなる態様において、本発明は、前記哺乳動物から得られた組織細胞のテス
ト用サンプル中の、ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチド
の有無を検出することを含んでなる、哺乳動物における心血管、内皮又は血管形
成疾患の診断方法を提供し、ここで、該テスト用サンプル中の該ＰＲＯ２３０、
ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドの有無が、該哺乳動物中に心血管、
内皮又は血管形成疾患が存在することを示す。 また他の実施態様では、本発明は、(ａ)哺乳動物から得られた組織細胞のテス
ト用サンプルに抗ＰＲＯ２３０、抗ＰＲＯ２１６又は抗ＰＲＯ３０２抗体を接触
させ、(ｂ)テスト用サンプル中における抗体とＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又は
ＰＲＯ３０２ポリペプチドの間の複合体の生成を検出することを含んでなる、哺
乳動物における心血管、内皮又は血管形成疾患の診断方法を提供し、ここで、前
記複合体の形成が、哺乳動物中に心血管、内皮又は血管形成疾患が存在すること
を示す。検出は定量的とも定性的ともしえ、同じ細胞型の既知の正常な組織細胞
の対照サンプルにおける複合体の生成をモニターして比較しながらなされる。テ
スト用サンプル中に形成された多量又は少量の複合体が、テスト用組織細胞が得
られた哺乳動物中に心血管、内皮又は血管形成疾患が存在することを示す。抗体
は好ましくは検出可能な標識を担持する。複合体生成は、例えば光学顕微鏡、フ
ローサイトメトリー、蛍光定量法、あるいは他の既知の技術よりモニターするこ
とができる。テスト用サンプルは通常は心血管、内皮又は血管形成疾患を有する
疑いのある個人から得られる。
【００４１】 他の実施態様では、本発明は、抗ＰＲＯ２３０、抗ＰＲＯ２１６又は抗ＰＲＯ
３０２抗体に、ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドを含
有すると推測されるサンプルを暴露し、該サンプルの成分と該抗体の結合性を測
定することを含んでなる、該サンプル中のＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲ
Ｏ３０２ポリペプチドの存在を測定する方法を提供する。特定の態様において、
サンプルはＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドを含有す
ると推測される細胞を有し、抗体は細胞に結合する。抗体は好ましくは検出可能
に標識され、及び／又は固体支持体上に結合される。
【００４２】 他の態様において、本発明は、抗ＰＲＯ２３０、抗ＰＲＯ２１６又は抗ＰＲＯ
３０２抗体と担体を適当な包装中に含んでなる心血管、内皮又は血管形成疾患の
診断キットを提供する。好ましくはキットはＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰ
ＲＯ３０２ポリペプチドの存在を検出するために抗体を使用するための指示を含
む。好ましくは、担体は例えばバッファーである。好ましくは心血管、内皮又は
血管形成疾患は癌である。
【００４３】 さらなる実施態様において、本発明は、 容器； 容器上のラベル；及び 容器内に含まれるＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドを
含有する組成物を含んでなる製造品を提供し、容器上のラベルには、組成物が心
血管、内皮又は血管形成疾患の治療に使用可能であることが示される。 さらなる実施態様において、本発明は、 容器； 容器上のラベル；及び 容器内に含まれるＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドの
アゴニスト又はアンタゴニストを含有する組成物を含んでなる製造品を提供し、
容器上のラベルには、組成物が心血管、内皮又は血管形成疾患の治療に使用可能
であることが示される。 さらなる実施態様において、本発明は、 容器； 容器上のラベル；及び 容器内に含まれる抗ＰＲＯ２３０、抗ＰＲＯ２１６又は抗ＰＲＯ３０２抗体を含
有する組成物を含んでなる製造品を提供し、容器上のラベルには、組成物が心血
管、内皮又は血管形成疾患の治療に使用可能であることが示される。
【００４４】 また他の実施態様において、本発明は有効量のＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又
はＰＲＯ３０２ポリペプチドを哺乳動物に投与することを含んでなる、哺乳動物
の心血管、内皮又は血管形成疾患の治療方法を提供する。好ましくは、疾患は心
肥大、外傷、例えば傷及び火傷、又は癌である。さらなる態様において、心血管
、内皮又は血管形成疾患が癌であるならば、哺乳動物は、アンギオプラスティー
(angioplasty)、又は心血管、内皮又は血管形成疾患を治療するための薬剤、例
えばＡＣＥインヒビター、又は化学治療薬にさらに暴露される。好ましくは哺乳
動物はヒト、好ましくは心肥大を起こす危険性のあるヒト、より好ましくは心筋
梗塞を患っているヒトである。
【００４５】 他の好ましい態様において、心肥大は、上昇したレベルのＰＧＦ２α’が存在
することにより特徴付けられる。また別に、心肥大は心筋梗塞により誘発され、
ここで、好ましくはＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチド
の投与は、心筋梗塞を起こして４８時間、好ましくは２４時間以内に開始される
。 他の好ましい実施態様において、心血管、内皮又は血管形成疾患心肥大であり
、前記ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドは心血管、内
皮又は血管形成剤と共に投与される。この目的において好ましい心血管、内皮又
は血管形成剤は、抗高血圧薬、ＡＣＥインヒビター、エンドセリンレセプターア
ンタゴニスト及び血栓溶解剤からなる群から選択される。血栓溶解剤が投与され
る場合、好ましくは、ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチ
ドはこのような薬剤の投与後に投与される。より好ましくは、血栓溶解剤は組換
えヒト組織プラスミノーゲン活性化因子である。
【００４６】 他の好ましい態様において、心血管、内皮又は血管形成疾患は心肥大であり、
ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドは急性心筋梗塞の治
療様の主たるアンギオプラスティーに続いて投与され、ここで好ましくは、哺乳
動物はアンギオプラスティー又は心血管、内皮又は血管形成剤にさらに暴露され
る。 他の好ましい実施態様において、心血管、内皮又は血管形成疾患は癌であり、
ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドは化学治療薬、成長
阻害薬又は細胞毒性薬と組合せて投与される。
【００４７】 さらなる実施態様において、本発明は、有効量のＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６
又はＰＲＯ３０２ポリペプチドのアゴニストを哺乳動物に投与することを含んで
なる、哺乳動物の心血管、内皮又は血管形成疾患の治療方法に関する。好ましく
は、心血管、内皮又は血管形成疾患は心肥大、外傷、癌、又は年齢関連性斑変性
である。また好ましくは哺乳動物はヒトであり、有効量の血管形成又はアンジオ
スタティック剤はアゴニストと共に投与される。 さらなる実施態様において、本発明は、有効量のＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６
又はＰＲＯ３０２ポリペプチドのアンタゴニストを哺乳動物に投与することを含
んでなる、哺乳動物の心血管、内皮又は血管形成疾患の治療方法に関する。好ま
しくは、心血管、内皮又は血管形成疾患は心肥大、外傷、癌、又は年齢関連性斑
変性である。また好ましくは哺乳動物はヒトであり、有効量の血管形成又はアン
ジオスタティック剤はアンタゴニストと共に投与される。 さらなる実施態様において、本発明は、有効量の抗ＰＲＯ２３０、抗ＰＲＯ２
１６又は抗ＰＲＯ３０２抗体を哺乳動物に投与することを含んでなる、哺乳動物
の心血管、内皮又は血管形成疾患の治療方法に関する。好ましくは、心血管、内
皮又は血管形成疾患は心肥大、外傷、癌、又は年齢関連性斑変性である。また好
ましくは哺乳動物はヒトであり、有効量の血管形成又はアンジオスタティック剤
は抗体と共に投与される。
【００４８】 さらなる実施態様において、本発明は、(ａ)ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又は
ＰＲＯ３０２ポリペプチド、(ｂ)ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２
ポリペプチドのアゴニスト、又は(ｃ)ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３
０２ポリペプチドのアンタゴニストのいずれかをコードする核酸分子を哺乳動物
に投与することを含んでなる、心血管、内皮又は血管形成疾患を患っている哺乳
動物の心血管、内皮又は血管形成疾患の治療方法を提供し、ここで該アゴニスト
又はアンタゴニストは抗ＰＲＯ２３０、抗ＰＲＯ２１６又は抗ＰＲＯ３０２抗体
であってよい。好ましい実施態様において、哺乳動物はヒトである。他の好まし
い実施態様において、遺伝子は、ex vivo遺伝子治療を介して投与される。さら
なる好ましい実施態様において、遺伝子はベクター、さらに好ましくはアデノウ
イルス、アデノ関連ウイルス、レンチウイルス、又はレトロウイルスのベクター
内に包含される。
【００４９】 また、他の態様において、本発明は、プロモータ、(ａ)ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ
２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチド、(ｂ)ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰ
ＲＯ３０２ポリペプチドのアゴニストポリペプチド、又は(ｃ)ＰＲＯ２３０、Ｐ
ＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドのアンタゴニストポリペプチドをコー
ドする核酸分子、及びポリペプチドの細胞分泌のためのシグナル配列から本質的
になるレトロウイルスベクターを含有する、組換えレトロウイルス粒子を提供し
、ここでレトロウイルスベクターはレトロウイルス構造タンパク質と関連してい
る。好ましくは、シグナル配列は哺乳動物、例えば天然ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２
１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドからのものである。
【００５０】 また、さらなる実施態様において、本発明は、レトロウイルス構造タンパク質
を発現する核酸構造体を含有し、プロモータ、(ａ)ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６
又はＰＲＯ３０２ポリペプチド、(ｂ)ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３
０２ポリペプチドのアゴニストポリペプチド、又は(ｃ)ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２
１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドのアンタゴニストポリペプチドをコードする
核酸分子、及びポリペプチドの細胞分泌のためのシグナル配列から本質的になる
レトロウイルスベクターをさらに含有するex vivo発生細胞(producer cell)を提
供し、ここで該発生細胞は、組換えレトロウイルス粒子を生産させる構造タンパ
ク質と関連したレトロウイルスベクターを包装する。
【００５１】 また他の実施態様において、本発明は(ａ)ＰＲＯ２１６ポリペプチド、(ｂ)Ｐ
ＲＯ２１６ポリペプチドのアゴニスト、(ｃ)ＰＲＯ２１６ポリペプチドのアンタ
ゴニスト、又は(ｄ)抗ＰＲＯ２１６抗体を哺乳動物に投与することを含んでなる
、哺乳動物の内皮細胞の成長を阻害する方法を提供し、ここで該哺乳動物の内皮
細胞の成長は阻害される。好ましくは、哺乳動物はヒトであり、内皮細胞の成長
は腫瘍又は網膜症に関連している。 また他の実施態様において、本発明は(ａ)ＰＲＯ２３０ポリペプチド、(ｂ)Ｐ
ＲＯ２３０ポリペプチドのアゴニスト、(ｃ)ＰＲＯ２３０ポリペプチドのアンタ
ゴニスト、又は(ｄ)抗ＰＲＯ２３０抗体を哺乳動物に投与することを含んでなる
、哺乳動物の内皮細胞の成長を刺激する方法を提供し、ここで該哺乳動物の内皮
細胞の成長は刺激される。好ましくは、哺乳動物はヒトである。 また他の実施態様では、本発明は哺乳動物に治療的有効量の抗ＰＲＯ３０２抗
体を投与することを含んでなる、哺乳動物においてＰＲＯ３０２ポリペプチドに
より誘発される血管形成の阻害方法を提供する。
【００５２】 (発明の詳細な記載) １． 定義 「心血管、内皮及び血管形成疾患」、「心血管、内皮及び血管形成機能不全」
、「心血管、内皮又は血管形成疾患」及び「心血管、内皮又は血管形成機能不全
」という用語は相互交換可能に使用され、並びに血管、例えば動脈、毛細管、静
脈、及び／又はリンパ管それ自体の病気の一部を称する。これには、血管形成及
び／又は心血管新生を刺激する徴候、及び血管形成及び／又は心血管新生を阻害
する徴候が含まれている。このような疾患には、例えば動脈の病気、例えばアテ
ローム性動脈硬化、高血圧、炎症性脈管炎、レーノー病及びレーノー現象、動脈
瘤、及び動脈再狭窄；静脈及びリンパ管の疾患、例えば血栓静脈炎、リンパ管炎
、及びリンパ浮腫；及び他の血管疾患、例えば末梢血管病、癌、例えば血管腫瘍
、例えば血管腫(毛細管及び海綿状)、グロムス腫瘍、毛細管拡張症、細菌性血管
腫症、血管内皮腫、血管肉腫、血管外皮細胞腫、カポジ肉腫、リンパ管腫、及び
リンパ管肉腫、腫瘍血管形成、外傷、例えば傷、火傷、及び他に損傷を被った組
織、移植固定、瘢痕化、虚血再潅流傷害、慢性関節リュウマチ、脳血管の病気、
腎臓病、例えば急性腎不全、及び骨粗鬆症が含まれる。また、アンギナ、心筋梗
塞、例えば急性心筋梗塞、心肥大、及び心不全、例えばＣＨＦも含まれる。
【００５３】 ここで使用される場合の「肥大」とは、腫瘍形成に関与しない正常な成長と無
関係に組織又は構造体の大きさが増加することとして定義される。器官又は組織
の肥大は個々の細胞の大きさの増加(真性肥大)、又は組織を形成する細胞数の増
加(過形成)、又はその両方のいずれかによる。ある種の器官、例えば心臓は誕生
後、短い期間で分割能力を失う。従って、「心肥大」は心臓の大きさが増加する
ものとして定義され、成人においては、細胞分割が付随することなのない、収縮
性タンパク質の含有量とミオサイトの細胞サイズの増加により特徴付けられる。
肥大を刺激する原因となるストレスの特徴(例えば、プレロードの増加、アフタ
ーロードの増加、心筋梗塞の場合と同様のミオサイトの損失、収縮性の一次低下
)が、反応の性質の決定において重要な役割を担っていることは明らかである。
心肥大の初期段階は、通常、ミオフィブリルとミトコンドリアのサイズの増加、
並びにミトコンドリアと核の拡大により形態学的に特徴付けられる。この段階に
おいて、筋細胞は正常なものよりもより大きくなり、細胞組織はかなり保存され
る。心肥大の段階がさらに進行すると、特定のオルガネラ、例えばミトコンドリ
アの数及びサイズが優先的に増加し、新規の収縮エレメントは不規則な方法で、
細胞の局在領域に添加される。長年にわたって肥大を被っている細胞は、隣接す
るミオフィブリルを置換し、正常なＺ膜レジストレーションの破壊を引き起こす
、高度に分葉された膜を有する、かなり拡大した核を含む、細胞組織体における
より明らかな分裂を示す。「心肥大」という用語は、根底にある心疾患に関係な
く、心筋の種々の度合いの構造的ダメージにより特徴付けられる病状の進行にお
ける全ての段階を含むように使用される。この故に、その用語は、心肥大の発達
における生理学的病状、例えば血圧の上昇、大動脈狭窄、又は心筋梗塞も含まれ
る。
【００５４】 「心不全」は、心臓が代謝中の組織の要求が必要とする速さで血液を送らない
心機能の異常を指す。心不全は虚血、先天的、リュウマチ性又は特発的形態を含
む、種々の因子が原因となり得る。 「鬱血性心不全」(ＣＨＦ)は、末梢組織まで酸素化された血液を送達させるた
めに、十分な心拍出量(経時的に心臓により押し出される血液量)を供給すること
のできない心臓の進行性の病状である。 ＣＨＦが進行すると、構造的及び血行
力学的ダメージが生じる。これらのダメージは色々と現れ、一つの特徴的徴候は
心室肥大である。ＣＨＦは多くの心疾患の共通した終末結果である。
【００５５】 「心筋梗塞」は、しばしば多重冠動脈血栓症を伴う、冠動脈のアテローム性動
脈硬化に結果であると一般的にされている。それは、心室壁の全厚みにわたって
心筋壊死がある壁内梗塞、及び心室壁を通って心外膜に至る全ての経路に伸長す
ることなく、壊死が内皮下層、心筋壁内、又はその両方にある副心内膜(非壁内)
梗塞２つのタイプに分けることができる。心筋梗塞は血行力学的影響の変化と心
臓のダメージを受けた、及び健康な領域における構造の変化の両方に原因がある
ことが知られている。よって、例えば心筋梗塞により心臓の最大流出量及び心臓
鼓動容量が低減する。また、心筋梗塞に関連して、間隙に生じるＤＮＡ合成が刺
激され、影響をう受けていない心臓領域におけるコラーゲンの形成が増加する。
【００５６】 長期間にわたる高血圧において、心臓のストレス及び圧力が増加する結果、例
えば全末梢耐性が増加して、心肥大は長期間「高血圧」を付随するようになる。
慢性的に圧力が加わる結果で肥大した心室の特徴は、心拡張の実行が損なわれる
ことである。Fouadら, J. Am. Coll. Cardiol., 4：1500-1506(1984)；Smithら
, J. Am. Coll. Cardiol., 5：869-874(1985)。長期間にわたる左心室の弛緩に
は、心収縮機能が正常又は通常ではないのにかかわらず、早くに本能性高血圧が
みられた。Hartfordら，Hypertension, 6: 329-338(1984)。しかし、血圧レベル
と心肥大との間は平行して近接していない。ヒトにおいて、抗高血圧治療に応じ
て左心室機能の改善は繰り返されるが、利尿薬(ヒドロクロロチアジド)、β-ブ
ロッカー(プレパノロール)、又はカルシウムチャンネルブロッカー(ジルチアゼ
ム)で治療している患者は、心拡張機能が改善されることなく左心室肥大への逆
戻りがみられる。Inouyeら, Am. J. Cardiol., 53：1583-7(1984)。
【００５７】 心肥大に関連した他の複合的心疾患は「肥大性心筋症」である。この病状は形
態学的、機能的及び臨床的特性が非常に多様であること(Maronら, N. Engl. J.
Med., 316：780-789(1987)；Spiritoら, N. Engl. J. Med., 320：749-755(198
9)；Louie及びEdwards, Prog. Cardiovasc. Dis., 36：275-308(1994)；Wigleら
, Circulation, 92：1680-1692(1995))、全年齢の患者を悩ます事実により強調
される異種性により特徴付けられる。Spiritoら, N. Engl. J. Med., 336：775-
785(1997)。また、肥大心筋症の原因となる要因は多様であり、ほとんど理解さ
れていない。一般的に、サルコメアタンパク質をコードする遺伝子における変異
が肥大性心筋症に関与している。近年のデータでは、β-ミオシン重鎖変異が、
家族性肥大性心筋症の原因の約３０から４０パーセントであると計測されている
ことを示唆している。Watkinsら, N. Engl. J. Med., 326：1108-1114(1992)；S
chwartzら Circulation, 91：532-540(1995)；Marian及びRoberts, Circulatio
n, 92：1336-1347(1995)；Thierfelderら, Cell, 77：701-712(1994)；Watkins
ら, Nat. Gen., 11：434-437(1995)。β-ミオシン重鎖の他にも、他の位置の遺
伝子変異に、心臓トロポニンＴ、アルファトポミオシン、心臓ミオシン結合プロ
テインＣ、必須ミオシン軽鎖、及び調節性ミオシン軽鎖が含まれる。Malik及びW
atkins, Curr. Opin. Cardiol., 12：295-302(1997)を参照されたい。
【００５８】 上弁「大動脈狭窄」は、上行大動脈が狭くなることにより特徴付けられる遺伝
性血管疾患であるが、肺動脈を含む他の動脈もさらに影響をうけるおそれがある
。未治療の大動脈狭窄では、心内圧力が増加し、結果として心肥大が生じ、実際
には心不全及び死に至る。この疾患の病因は十分には理解されていないが、中間
平滑筋の過形成可能性及び肥大はこの疾患の顕著な特徴である。エラスチン遺伝
子の分子変異体が大動脈狭窄の発現の病因に関与していることが、1997年7月22
日公開の米国特許第5,650,282号に報告されている。
【００５９】 「心臓弁逆流」は心臓弁の疾患の結果による心臓病の結果として生じる。リュ
ウマチ熱のような種々の病気は、弁オリフィスの収縮又は引っ張りを引き起こす
ものであるが、他の病気は、心内膜炎、心内膜又は心房オリフィスの内側の膜の
炎症、及び心臓の手術になる。欠損、例えば弁狭窄又は弁の欠損近接により、心
臓腔における血液の蓄積、又は弁を通過しての血液の逆流が生じる。弁狭窄又は
不全を長期間治癒しないと、心肥大や心筋に関連したダメージを被る結果となり
、最終的には弁の交換が必要となる。
【００６０】 これら全て、及び心肥大が付随してもしなくてもよい他の心血管、内皮及び血
管形成疾患の治療が本発明に含まれる。
【００６１】 用語「癌」、「癌性」及び「悪性」は、典型的には調節されない細胞成長を特
徴とする、哺乳動物における生理学的状態を指すか記述する。癌の例には、これ
らに限定されるものではないが、腺癌、リンパ腫、芽細胞腫、黒色腫、肉腫、及
び白血病が含まれる。このような癌のより特定の例には、扁平上皮細胞癌、小細
胞肺癌、非小細胞肺癌、胃癌、ホジキン及び非ホジキンリンパ腫、膵臓癌、神経
膠芽細胞腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、例えば肝癌(hepatic carcinoma)及び
肝細胞腫(hepatoma)、膀胱癌、乳癌、大腸癌、結腸直腸癌、子宮体癌、唾液腺癌
、腎細胞癌及びウィルムス腫瘍等の腎臓癌、基底細胞癌、黒色腫、前立腺癌、産
卵口癌、甲状腺癌、精巣癌、食道癌、及び様々な種類の頭部及び頸部の癌が含ま
れる。ここでの治療に好適な癌は乳癌、大腸癌、肺癌、黒色腫、卵巣癌及び上述
に記した血管腫瘍に係るものである。
【００６２】 ここで用いられる「細胞毒性薬」という用語は、細胞の機能を阻害又は阻止し
及び／又は細胞破壊を生ずる物質を指す。この用語は、放射性同位体（例えば、 131 Ｉ、125Ｉ、90Ｙ及び186Ｒｅ）、化学治療薬、及び細菌、真菌、植物又は動
物起源の酵素活性毒素等の毒素、又はそれらのフラグメントを含むことを意図す
る。
【００６３】 「化学治療薬」は、癌の治療に有用な化学化合物である。化学治療薬の例には
、アルキル化剤、葉酸アンタゴニスト、核酸代謝の代謝産物、抗生物質、ピリミ
ジン類似物、５-フルオロウラシル、シスプラチン、プリンヌクレオシド、アミ
ン類、アミノ酸、トリアゾールヌクレオシド、又はコルチコステロイド類が含ま
れる。特定の例には、アドリアマイシン、ドキソルビシン、５-フルオロウラシ
ル、シトシンアラビノシド（「Ａｒａ-Ｃ」）、シクロホスファミド、チオテパ
、ブスルファン、サイトキシン、タキソール、トキソテア、メトトレキセート、
シスプラチン、メルファラン、ビンブラスチン、ブレオマイシン、エトポシド、
イフォスファミド、マイトマイシンＣ、ミトキサントン、ビンクリスチン、ビノ
レルビン、カルボプラチン、テニポシド、ダウノマイシン、カルミノマイシン、
アミノプテリン、ダクチノマイシン、マイトマイシン、エスペラマイシン（米国
特許第4,675,187号参照）、メルファラン及び関連するナイトロジェンマスター
ドを含む。また、タモキシフェン及びオナプリストン等の腫瘍に対するホルモン
作用を調節又は阻害するように機能するホルモン薬もこの定義に含まれる。
【００６４】 「成長阻害薬」は、ここで用いられる場合、インビトロ又はインビボで、細胞
、例えばＷｎｔ-過剰発現癌細胞の成長を阻害する化合物又は組成物を称する。
即ち、成長阻害薬は、Ｓ相における悪性細胞のパーセンテージをかなり低減させ
るものである。成長阻害薬の例は、細胞周期の進行を（Ｓ相以外の位置で）阻止
する薬剤、例えば、Ｇ１停止及びＭ相停止を誘発する薬剤を含む。古典的なＭ相
ブロッカーは、ビンカス（ビンクリスチン及びビンブラスチン）、タキソール、
及びトポＩＩ阻害剤、例えばドキソルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、及
びブレオマイシンを含む。Ｇ１停止させるこれらの薬剤は、Ｓ相停止にも波及し
、例えば、ＤＮＡアルキル化剤、例えばタモキシフェン、プレドニソン、ダカル
バジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、５-フルオロウラ
シル及びＡｒａ-Ｃである。さらなる情報は、The Molecular Basis of Cancer,
Mendelsohn及びIsrael,編集, Chapter 1, Murakamiらによる表題「Cell cycle r
egulation, oncogenes, and antineoplastic drugs」（WB Saunders: Philadelp
hia, 1995）、特に13頁に見出される。さらなる例には、腫瘍壊死因子(ＴＮＦ)
、酸性又は塩基性ＦＧＦ又は肝実質細胞成長因子(ＨＧＦ)の血管形成活性を阻害
又は中和可能な抗体、組織因子の凝固活性を阻害又は中和可能な抗体、プロテイ
ンＣ又はプロテインＳ(1991年2月21日に公開されたWO91/01753を参照されたい)
、又はＨＥＲ２レセプターに結合可能な抗体(WO89/06692)、例えば４Ｄ５抗体(
及びそれらの機能的等価物)(例えばWO92/22653)が含まれる。
【００６５】 「治療」とは、心血管、内皮及び血管形成疾患の病的状態の進行又は改変の防
止を意図して行われる。治療の概念は最も広い意味に使用され、任意の段階の心
血管、内皮及び血管形成疾患の防止(予防)、緩和、低減、及び治癒を特に含む。
従って、「治療」は治癒的処置、及び予防的又は防止的手段の両方を称し、患者
は心血管、内皮及び血管形成疾患を防止又は遅延化させられる。治療が必要なも
のとは、既に疾患に罹っているもの、並びに疾患に罹りやすいもの又は疾患が防
止されているものを含む。疾患は、特発症、心栄養性（cardiotrophic）、又は
筋栄養性の原因、又は虚血又は虚血発作、例えば心筋梗塞を含む、任意の原因の
結果によるものである。 「慢性」投与とは、急性様式とは異なり連続的な様式での薬剤を投与し、初期
の治療効果、例えば抗肥大効果を長時間に渡って維持することを称する。 治療の目的のための「哺乳動物」は、ヒト、家庭及び農業用動物、動物園、ス
ポーツ、又はペット動物、例えばイヌ、ウマ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ブタなどを
含む哺乳類に分類される任意の動物を称する。好ましくは、哺乳動物はヒトであ
る。 一又は複数のさらなる治療薬と「組み合わせた」投与とは、同時（同時期）及
び任意の順序での連続した投与を含む。
【００６６】 「心血管、内皮及び血管形成剤」なる用語は、一般的に、心血管、内皮及び血
管形成疾患の治療に作用する任意の薬剤を称する。心血管剤の例は、血圧、心拍
数、心収縮、及び内皮及び平滑筋の生物学を調節する血管ホメオスタシスを促進
するもので、全因子は心血管病における役割を有している。これらの特定の例に
は、アンギオテンシン-ＩＩレセプターアンタゴニスト：エンドセリンレセプタ
ーアンタゴニスト、例えばBOSENTANＴＭ及びMOXONODINＴＭ、インターフェロン-
ガンマ(ＩＦＮ-γ)；デス-アスパラタート-アンギオテンシンＩ：血栓溶解剤、
例えばストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、ｔ-ＰＡ、及び半減期がより長く、
非常に高いフィブリン特異性を有するように設計されたｔ-ＰＡ変異体、ＴＮＫ-
ｔ-ＰＡ(Ｔ１０３Ｎ、Ｎ１１７Ｑ、ＫＨＲＲ(296-299)ＡＡＡＡｔ-ＰＡ変異体,
Keytら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91：3670-3674(1994))：等方又は過敏剤
、例えばジゴキシゲニン、及びβ-アドレナリン様レセプターブロック剤、例え
ばプロプラノロール、チモロール、タータロロール、カルテオロール、ナドロー
ル、ベタキソロール、ペンブトロール、アセトブトロール、アテノロール、メト
プロロール、及びカーベジルロール：アンギオテンシン転換酵素(ＡＣＥ)インヒ
ビター、例えばクイナピリル、カプトプリル、エナラプリル、ラミプリル、ベナ
ゼプリル、フォシノプリル及びリシノプリル；ジウレティクス、例えばクロロチ
アザイド、ヒドロクロロチアザイド、ヒドロフルメタザイド、メチルクロチアザ
イド、ベンズチアザイド、ジクロロフェナミド、アセタゾラミド、及びインダパ
ミド；及びカルシウムチャンネルブロッカー、例えばジルチアゼム、ニフェジピ
ン、ベラパミル及びニカルジピンが含まれる。この種の好ましい一カテゴリーは
、心肥大、又は心肥大の進行におけつ生理学的状態、例えば血圧の上昇、大動脈
狭窄又は心筋梗塞の治療に使用される治療薬である。
【００６７】 「血管形成剤」及び「内皮剤」は、血管形成及び／又は内皮細胞の成長、又は
適切であるならば血管形成を促進する活性剤である。これには、傷の治癒を促進
する因子、例えば成長ホルモン、インシュリン様成長因子-Ｉ(ＩＧＦ-Ｉ)、ＶＥ
ＧＦ、ＶＩＧＦ、ＰＤＧＦ、表皮成長因子(ＥＧＦ)、ＣＴＧＦ及びそのファミリ
ーのメンバー、ＦＧＦ、及びＴＧＦ-α及びＴＧＦ-βが含まれる。 「アンジオスタティック剤」は血管形成又は管形成を阻害、又は癌細胞の成長
を阻害又は防止する活性剤である。例には、上述した血管形成剤の抗体又は他の
アンタゴニスト、例えばＶＥＧＦに対する抗体が含まれる。さらに、細胞治療薬
、例えば細胞毒性薬、化学治療薬、成長阻害、アポトーシス薬、及び癌を治療す
る他の薬剤、例えば抗-ＨＥＲ-２、抗-ＣＤ２０、及び生物活性及び有機化学薬
が含まれる。
【００６８】 本発明における薬理学的意味で、活性剤、例えばＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６
又はＰＲＯ３０２ポリペプチド、又はそれらのアゴニスト又はアンタゴニスト、
又は抗ＰＲＯ２３０、抗ＰＲＯ２１６又は抗ＰＲＯ３０２抗体の「治療的有効量
」とは、哺乳動物の心血管、内皮及び血管形成疾患の治療に有効な量を称するも
のであり、経験的に決定することができる。 ここで使用される場合、活性剤、例えばＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲ
Ｏ３０２ポリペプチド、又はそれらのアゴニスト又はアンタゴニスト、又は抗Ｐ
ＲＯ２３０、抗ＰＲＯ２１６又は抗ＰＲＯ３０２抗体の「有効量」とは記載した
目的の実行に有効な量を称するものであり、このような量は、所望する効果に応
じて経験的に決定することができる。
【００６９】 用語「ＰＲＯ２３０」、「ＰＲＯ２１６」及び「ＰＲＯ３０２」「ＰＲＯ２３
０ポリペプチド」、「ＰＲＯ２１６ポリペプチド」又は「ＰＲＯ３０２ポリペプ
チド」は、ここで用いる場合、天然配列ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ
３０２ポリペプチ及びＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチ
ド変異体（ここで更に定義する）を含む。ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲ
Ｏ３０２ポリペプチドは、ヒト組織型等の種々の供給源から、又は他の供給源か
ら単離しても、組換え及び／又は合成方法により調製してもよい。
【００７０】 「天然配列」ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドは、
天然由来のＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドと同一の
アミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでいる。このような天然配列ＰＲＯ２
３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドは、自然から単離することも
できるし、組換え及び／又は合成手段により生産することもできる。「天然配列
」ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドという用語には、
特に、ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドの自然に生じ
る切断又は分泌形態(例えば細胞外ドメイン配列)、自然に生じる変異形態(例え
ば、選択的にスプライシングされた形態)及び自然に生じる対立遺伝子変異体が
含まれる。本発明の一実施態様において、天然配列ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６
又はＰＲＯ３０２ポリペプチドは、図２(配列番号：２)のアミノ酸配列、図４(
配列番号：７)又は図６(配列番号：１２)をそれぞれ含有する成熟又は全長天然
配列ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドである。限定す
るものではないが、ここでそれぞれの天然ポリペプチドのフラグメントには、天
然Ｎ末端シグナル配列が完全であるか、又は部分的に欠失しているか他の配列及
び、そのような切断（分泌）型が天然に生じるかどうかに無関係に、各天然配列
の細胞外ドメインで置換されたポリペプチド変異体が含まれる。断片は好ましく
は対応する天然の「ＰＲＯ」ポリペプチドに特異的に結合する抗体の産生に十分
な長さである。
【００７１】 「ＰＲＯ２３０変異体ポリペプチド」とは、以下に定義されるように、(ａ)図
２（配列番号：２）に示したＰＲＯ２３０ポリペプチドの残基１又は約２２から
１６４、(ｂ)図２（配列番号：２）に示したＰＲＯ２３０ポリペプチドのＸから
１６４、ここでＸは図２(配列番号：２)の１７から２６の任意のアミノ酸残基で
あり、又は(ｃ)図２(配列番号：２)のアミノ酸配列の他の特異的に誘導されたフ
ラグメントのアミノ酸配列と、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有す
る活性ＰＲＯ２３０ポリペプチド(天然配列ＰＲＯ２３０ポリペプチド以外)を意
味する。 「ＰＲＯ２１６変異体ポリペプチド」とは、以下に定義されるように、(ａ)図
４（配列番号：７）に示したＰＲＯ２１６ポリペプチドの残基１から４２１、(
ｂ)図４(配列番号：７)に示したアミノ酸配列の他の特異的に誘導されたフラグ
メントのアミノ酸配列と、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有する活
性ＰＲＯ２１６ポリペプチド(天然配列ＰＲＯ２１６ポリペプチド以外)を意味す
る。 「ＰＲＯ３０２変異体ポリペプチド」とは、以下に定義されるように、(ａ)図
６（配列番号：１２）に示したＰＲＯ３０２ポリペプチドの残基１又は約２６か
ら４５２、(ｂ)図６（配列番号：１２）に示したＰＲＯ３０２ポリペプチドのＸ
から４５２、ここでＸは図６(配列番号：１２)の２１から３０の任意のアミノ酸
残基であり、又は(ｃ)図６(配列番号：１２)に示したアミノ酸配列の他の特異的
に誘導されたフラグメントのアミノ酸配列と、少なくとも約８０％のアミノ酸配
列同一性を有する活性ＰＲＯ３０２ポリペプチド(天然配列ＰＲＯ３０２ポリペ
プチド以外)を意味する。 このようなＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２変異体ポリペプチド
には、例えば、ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドが含
まれ、ここで一又は複数のアミノ酸残基では図２(配列番号：２)、図４(配列番
号：７)又は図６(配列番号：１２)の配列のＮ-又はＣ-末端、並びにその内部に
おいて、一又は複数の内部ドメインが付加、もしくは欠失している。
【００７２】 通常、ＰＲＯ２３０変異体ポリペプチドは、(ａ)図２(配列番号：２)に示した
ＰＲＯ２３０ポリペプチドの残基１又は約２２から１６４、(ｂ)図２(配列番号
：２)に示したＰＲＯ２３０ポリペプチドのＸから１６４、ここでＸは図２(配列
番号：２)の１７から２６の任意のアミノ酸残基であり、又は(ｃ)図２(配列番号
：２)に示したアミノ酸配列の他の特異的に誘導されたフラグメントと、少なく
とも約８０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８１％のアミ
ノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８２％のアミノ酸配列同一性、よ
り好ましくは少なくとも約８３％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なく
とも約８４％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８５％のアミ
ノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８６％のアミノ酸配列同一性、よ
り好ましくは少なくとも約８７％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なく
とも約８８％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８９％のアミ
ノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、よ
り好ましくは少なくとも約９１％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なく
とも約９２％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９３％のアミ
ノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９４％のアミノ酸配列同一性、よ
り好ましくは少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なく
とも約９６％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９７％のアミ
ノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９８％のアミノ酸配列同一性、ま
たさらにより好ましくは少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有するであ
ろう。
【００７３】 通常、ＰＲＯ２１６変異体ポリペプチドは、(ａ)図４(配列番号：７)に示した
ＰＲＯ２１６ポリペプチドの残基１から４２１、又は(ｂ)図４(配列番号：７)に
示したアミノ酸配列の他の特異的に誘導されたフラグメントと、少なくとも約８
０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８１％のアミノ酸配列
同一性、より好ましくは少なくとも約８２％のアミノ酸配列同一性、より好まし
くは少なくとも約８３％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８
４％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８５％のアミノ酸配列
同一性、より好ましくは少なくとも約８６％のアミノ酸配列同一性、より好まし
くは少なくとも約８７％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８
８％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８９％のアミノ酸配列
同一性、より好ましくは少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、より好まし
くは少なくとも約９１％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９
２％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９３％のアミノ酸配列
同一性、より好ましくは少なくとも約９４％のアミノ酸配列同一性、より好まし
くは少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９
６％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９７％のアミノ酸配列
同一性、より好ましくは少なくとも約９８％のアミノ酸配列同一性、またさらに
より好ましくは少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有するであろう。
【００７４】 通常、ＰＲＯ３０２変異体ポリペプチドは、(ａ)図６(配列番号：１２)に示し
たＰＲＯ３０２ポリペプチドの残基１又は約２６から４５２、(ｂ)図６(配列番
号：１２)に示したＰＲＯ３０２ポリペプチドのＸから４５２、ここでＸは図６(
配列番号：１２)の２１から３０の任意のアミノ酸残基であり、又は(ｃ)図６(配
列番号：１２)に示したアミノ酸配列の他の特異的に誘導されたフラグメントと
、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８１
％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８２％のアミノ酸配列同
一性、より好ましくは少なくとも約８３％のアミノ酸配列同一性、より好ましく
は少なくとも約８４％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８５
％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８６％のアミノ酸配列同
一性、より好ましくは少なくとも約８７％のアミノ酸配列同一性、より好ましく
は少なくとも約８８％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８９
％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％のアミノ酸配列同
一性、より好ましくは少なくとも約９１％のアミノ酸配列同一性、より好ましく
は少なくとも約９２％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９３
％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９４％のアミノ酸配列同
一性、より好ましくは少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性、より好ましく
は少なくとも約９６％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９７
％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９８％のアミノ酸配列同
一性、またさらにより好ましくは少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有
するであろう。
【００７５】 変異体には、天然ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチド
配列は含まれない。通常、ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２変異体
ポリペプチドは、少なくとも約１０アミノ酸長、多くの場合は少なくとも約２０
アミノ酸長、より多くの場合は少なくとも約３０アミノ酸長、より多くの場合は
少なくとも約４０アミノ酸長、より多くの場合は少なくとも約５０アミノ酸長、
より多くの場合は少なくとも約６０アミノ酸長、より多くの場合は少なくとも約
７０アミノ酸長、より多くの場合は少なくとも約８０アミノ酸長、より多くの場
合は少なくとも約９０アミノ酸長、より多くの場合は少なくとも約１００アミノ
酸長、より多くの場合は少なくとも約１５０アミノ酸長、より多くの場合は少な
くとも約２００アミノ酸長、より多くの場合は少なくとも約３００アミノ酸長で
ある。
【００７６】 ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６及びＰＲＯ３０２ポリペプチド配列に対してここ
で同定されている「パーセント(％)アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、
最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、如何なる保
存的置換も配列同一性の一部と考えないとした、ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又
はＰＲＯ３０２配列のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパ
ーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のた
めのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばBLAST、B
LAST-2、ALIGN、ALIGN-2又はMegalign(DNASTAR)ソフトウエアのような公に入手
可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者
であれば、比較される配列の全長に対して最大のアラインメントを達成するため
に必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパ
ラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、％アミノ
酸配列同一性値は、配列コンピュータプログラムALIGN-2を使用し、以下に記載
するようにして得られ、ここでALIGN-2プログラムのコンピュータソースコード
は図８Ａ-Ｑに提供している。ALIGN-2配列比較コンピュータプログラムは、ジェ
ネンテク社の著作によるもので、図８Ａ-Ｑに示すソースコードはユーザー資料
と共に米国著作権協会、Washington D.C., 20559に提出されており、米国著作権
登録番号第TXU510087で登録されている。ALIGN-2プログラムはジェネンテク社、
South San Francisco, Californiaから公に入手可能であるか、又は図８Ａ-Ｑに
て提供されたソースコードからコンパイラー作成してもよい。ALIGN-2はUNIX（
登録商標）操作システム、好ましくはデジタルUNIX V4.0Dを使用してコンパイラ
ー作成されるべきである。全ての配列比較パラメータはALIGN-2プログラムによ
りセットされ、変わらない。
【００７７】 この目的において、付与されたアミノ酸配列Ｂに対する、Ｂとの、又はＢに対
抗する付与されたアミノ酸配列Ａの％アミノ酸配列同一性(別に、付与されたア
ミノ酸配列Ａが、付与されたアミノ酸配列Ｂに対する、Ｂとの、又はＢに対抗す
る所定の％アミノ酸配列を有するか、又はこれを含むものとしても呼称すること
ができる)は、次の式： 分率Ｘ／Ｙの１００倍 により算出され、ここで、Ｘは、Ａ及びＢのプログラム整列において、配列整列
プログラムALIGN-2に同一符合するとスコアされたアミノ酸残基の数であり、Ｙ
はＢのアミノ酸残基の全数である。アミノ酸配列Ａの長さはアミノ酸配列Ｂの長
さとは等しくなく、Ｂに対するＡの％アミノ酸配列同一性は、Ａに対するＢの％
アミノ酸配列同一性とは等しくないと認識されるであろう。％アミノ酸配列同一
性の算出例としては、図７Ａ-Ｂには、「ＰＲＯ」と称されるアミノ酸配列に対
する、「比較タンパク質」と称されるアミノ酸配列の％アミノ酸配列同一性の算
出方法を示している。
【００７８】 特に記載しない場合は、ここで使用される全％アミノ酸配列同一性値は、ALIG
N-2配列比較コンピュータプログラムを使用して上述したようにして得られる。
しかしながら、％アミノ酸配列同一性は、配列比較プログラムNCBI-BLAST2(Alts
chulら, Nucleic Acids Res., 25：3389-3402(1997))を使用して決定することも
できる。NCBI-BLAST2配列比較プログラムは、http://www.ncbi.nlm.nih.govから
ダウンロードすることができる。NCBI-BLAST2はいくつかのサーチプログラムを
使用しており、その全てのサーチパラメータは、例えばアンマスク＝yes、スト
ランド＝all、予測発生値＝１０、最低複雑長さ＝１５／５、マルチパス ｅ値＝
０．０１、マルチパス定数＝２５、最終間隙アラインメントのドロップオフ＝２
５、スコアリングマトリクス＝BLOSUM62を含むデフォルト値に設定される。
【００７９】 アミノ酸配列比較においてNCBI-BLAST2が使用される状況では、付与されたア
ミノ酸配列Ｂに対する、Ｂとの、又はＢに対抗する付与されたアミノ酸配列Ａの
％アミノ酸配列同一性(別に、付与されたアミノ酸配列Ａが、付与されたアミノ
酸配列Ｂに対する、Ｂとの、又はＢに対抗する所定の％アミノ酸配列を有するか
、又はこれを含むものとしても呼称することができる)は、次の式： フラクションＸ／Ｙの１００倍 により算出され、ここで、Ｘは、Ａ及びＢのプログラム整列において、配列整列
プログラムNCBI-BLAST2に同一符合するとスコアされたアミノ酸残基の数であり
、ＹはＢのアミノ酸残基の全数である。アミノ酸配列Ａの長さはアミノ酸配列Ｂ
の長さとは等しくなく、Ｂに対するＡの％アミノ酸配列同一性は、Ａに対するＢ
の％アミノ酸配列同一性とは等しくないと認識されるであろう。
【００８０】 さらに、％アミノ酸配列同一性はWU-BLAST-2コンピュータプログラム（Altsch
ul等, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)）を使用して決定すること
もできる。殆どのWU-BLAST-2サーチパラメータは初期値に設定される。初期値に
設定されない、即ち調節可能なパラメータは以下の値に設定する：オーバーラッ
プスパン＝１、オーバーラップフラクション＝０．１２５、ワード閾値（Ｔ）＝
１１、及びスコアリングマトリクス＝BLOSUM62。ここでの目的のために、％アミ
ノ酸配列同一性値は、（ａ）天然ＰＲＯポリペプチドから誘導された配列を有す
る関心あるＰＲＯポリペプチドのアミノ酸配列と、関心ある比較アミノ酸配列（
即ち、関心あるＰＲＯポリペプチドが比較されるＰＲＯポリペプチド変異体であ
ってもよい配列）との間の、WU-BLAST-2で決定された一致する同一アミノ酸残基
の数を、（ｂ）関心あるＰＲＯポリペプチドの残基の総数で割ることにより決定
される。例えば、「アミノ酸配列Ｂに対して少なくとも８０％のアミノ酸配列同
一性を有する又は有しているアミノ酸配Ａを含有するポリペプチド」という表示
は、アミノ酸配列Ａが関心ある比較アミノ酸配列であり、アミノ酸配列Ｂが関心
あるＰＲＯポリペプチドのアミノ酸配列である。
【００８１】 「ＰＲＯ２３０変異体ポリヌクレオチド」又は「ＰＲＯ２３０変異体核酸配列
」とは、下記に定義されるように、活性ＰＲＯ２３０ポリペプチドをコードする
核酸分子を意味し、(ａ)図２(配列番号：２)に示したＰＲＯ２３０ポリペプチド
の残基１又は約２２から１６４をコードする核酸配列、(ｂ)図２(配列番号：２)
に示したＰＲＯ２３０ポリペプチドのアミノ酸Ｘから１６４をコードする核酸配
列で、ここでＸは図２(配列番号：２)の１７から２６の任意のアミノ酸残基であ
り、又は(ｃ)図２(配列番号：２)に示したアミノ酸配列の他の特異的に誘導され
たフラグメントをコードする核酸配列のいずれかと少なくとも８０％の核酸配列
同一性を有する。通常は、ＰＲＯ２３０変異体ポリヌクレオチドは、(ａ)図２(
配列番号：２)に示したＰＲＯ２３０ポリペプチドの残基１又は約２２から１６
４をコードする核酸配列、(ｂ)図２(配列番号：２)に示したＰＲＯ２３０ポリペ
プチドのアミノ酸Ｘから１６４をコードする核酸配列で、ここでＸは図２(配列
番号：２)の１７から２６の任意のアミノ酸残基であり、又は(ｃ)図２(配列番号
：２)に示したアミノ酸配列の他の特異的に誘導されたフラグメントをコードす
る核酸配列のいずれかと、少なくとも約８０％の核酸配列同一性、より好ましく
は少なくとも約８１％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８２％の
核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８３％の核酸配列同一性、より好
ましくは少なくとも約８４％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８
５％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８６％の核酸配列同一性、
より好ましくは少なくとも約８７％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくと
も約８８％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８９％の核酸配列同
一性、より好ましくは少なくとも約９０％の核酸配列同一性、より好ましくは少
なくとも約９１％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９２％の核酸
配列同一性、より好ましくは少なくとも約９３％の核酸配列同一性、より好まし
くは少なくとも約９４％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９５％
の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９６％の核酸配列同一性、より
好ましくは少なくとも約９７％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約
９８％の核酸配列同一性、そして、より好ましくは少なくとも約９９％の核酸配
列同一性を有している。ＰＲＯ２３０ポリヌクレオチド変異体は、天然ＰＲＯ２
３０ヌクレオチド配列を含まない。
【００８２】 「ＰＲＯ２１６変異体ポリヌクレオチド」又は「ＰＲＯ２１６変異体核酸配列
」とは、下記に定義されるように、活性ＰＲＯ２１６ポリペプチドをコードする
核酸分子を意味し、(ａ)図４(配列番号：７)に示したＰＲＯ２１６ポリペプチド
の残基１から４２１をコードする核酸配列、又は(ｂ)図４(配列番号：７)に示し
たアミノ酸配列の他の特異的に誘導されたフラグメントをコードする核酸配列の
いずれかと少なくとも８０％の核酸配列同一性を有する。通常は、ＰＲＯ２１６
変異体ポリヌクレオチドは、(ａ)図４(配列番号：７)に示したＰＲＯ２１６ポリ
ペプチドの残基１から４２１をコードする核酸配列、又は(ｂ)図４(配列番号：
７)に示したアミノ酸配列の他の特異的に誘導されたフラグメントをコードする
核酸配列のいずれかと、少なくとも約８０％の核酸配列同一性、より好ましくは
少なくとも約８１％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８２％の核
酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８３％の核酸配列同一性、より好ま
しくは少なくとも約８４％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８５
％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８６％の核酸配列同一性、よ
り好ましくは少なくとも約８７％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも
約８８％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８９％の核酸配列同一
性、より好ましくは少なくとも約９０％の核酸配列同一性、より好ましくは少な
くとも約９１％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９２％の核酸配
列同一性、より好ましくは少なくとも約９３％の核酸配列同一性、より好ましく
は少なくとも約９４％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９５％の
核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９６％の核酸配列同一性、より好
ましくは少なくとも約９７％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９
８％の核酸配列同一性、そして、より好ましくは少なくとも約９９％の核酸配列
同一性を有している。ＰＲＯ２１６ポリヌクレオチド変異体は、天然ＰＲＯ２１
６ヌクレオチド配列を含まない。
【００８３】 「ＰＲＯ３０２変異体ポリヌクレオチド」又は「ＰＲＯ３０２変異体核酸配列
」とは、下記に定義されるように、活性ＰＲＯ３０２ポリペプチドをコードする
核酸分子を意味し、(ａ)図６(配列番号：１２)に示したＰＲＯ３０２ポリペプチ
ドの残基１又は約２６から４５２をコードする核酸配列、(ｂ)図６(配列番号：
１２)に示したＰＲＯ３０２ポリペプチドのアミノ酸Ｘから４５２をコードする
核酸配列で、ここでＸは図６(配列番号：１２)の２１から３０の任意のアミノ酸
残基であり、又は(ｃ)図６(配列番号：１２)に示したアミノ酸配列の他の特異的
に誘導されたフラグメントをコードする核酸配列のいずれかと少なくとも８０％
の核酸配列同一性を有する。通常は、ＰＲＯ３０２変異体ポリヌクレオチドは、
(ａ)図６(配列番号：１２)に示したＰＲＯ３０２ポリペプチドの残基１又は約２
６から４５２をコードする核酸配列、(ｂ)図６(配列番号：１２)に示したＰＲＯ
３０２ポリペプチドのアミノ酸Ｘから４５２をコードする核酸配列で、ここでＸ
は図６(配列番号：１２)の２１から３０の任意のアミノ酸残基であり、又は(ｃ)
図６(配列番号：１２)に示したアミノ酸配列の他の特異的に誘導されたフラグメ
ントをコードする核酸配列のいずれかと、少なくとも約８０％の核酸配列同一性
、より好ましくは少なくとも約８１％の核酸配列同一性、より好ましくは少なく
とも約８２％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８３％の核酸配列
同一性、より好ましくは少なくとも約８４％の核酸配列同一性、より好ましくは
少なくとも約８５％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８６％の核
酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８７％の核酸配列同一性、より好ま
しくは少なくとも約８８％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８９
％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の核酸配列同一性、よ
り好ましくは少なくとも約９１％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも
約９２％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９３％の核酸配列同一
性、より好ましくは少なくとも約９４％の核酸配列同一性、より好ましくは少な
くとも約９５％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９６％の核酸配
列同一性、より好ましくは少なくとも約９７％の核酸配列同一性、より好ましく
は少なくとも約９８％の核酸配列同一性、そして、より好ましくは少なくとも約
９９％の核酸配列同一性を有している。ＰＲＯ３０２ポリヌクレオチド変異体は
、天然ＰＲＯ３０２ヌクレオチド配列を含まない。
【００８４】 通常は、ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６及びＰＲＯ３０２変異体ポリヌクレオチ
ドは、少なくとも約３０ヌクレオチド長、より多くは少なくとも約６０ヌクレオ
チド長、より多くは少なくとも約９０ヌクレオチド長、より多くは少なくとも約
１２０ヌクレオチド長、より多くは少なくとも約１５０ヌクレオチド長、より多
くは少なくとも約１８０ヌクレオチド長、より多くは少なくとも約２１０ヌクレ
オチド長、より多くは少なくとも約２４０ヌクレオチド長、より多くは少なくと
も約２７０ヌクレオチド長、より多くは少なくとも約３００ヌクレオチド長、よ
り多くは少なくとも約４５０ヌクレオチド長、より多くは少なくとも約６００ヌ
クレオチド長、より多くは少なくとも約９００ヌクレオチド長、又はそれ以上で
ある。
【００８５】 ここで同定されているＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６及びＰＲＯ３０２ポリペプ
チドコード化核酸配列に関する「パーセント(％)核酸配列同一性」は、配列を整
列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入した、
ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドコード化核酸配列の
ヌクレオチドと同一である候補配列中のヌクレオチドのパーセントとして定義さ
れる。パーセント核酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当
業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばBLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2又
はMegalign(DNASTAR)ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフト
ウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列
の全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズ
ムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することが
できる。しかし、ここでの目的のためには、％核酸配列同一性値は、配列比較コ
ンピュータプログラムALIGN-2を使用し、以下に記載するようにして得られ、こ
こでALIGN-2プログラムのコンピュータソースコードは図８Ａ-Ｑに提供している
。ALIGN-2配列比較コンピュータプログラムは、ジェネンテク社の著作によるも
ので、図８Ａ-Ｑに示すソースコードはユーザー資料と共に米国著作権協会、Was
hington D.C., 20559に提出されており、米国著作権登録番号第TXU510087で登録
されている。ALIGN-2プログラムはジェネンテク社、South San Francisco, Cali
forniaから公に入手可能であるか、又は図８Ａ-Ｑにて提供されたソースコード
からコンパイラー作成してもよい。ALIGN-2はUNIX操作システム、好ましくはデ
ジタルUNIX V4.0Dを使用してコンパイラー作成されるべきである。全ての配列比
較パラメータはALIGN-2プログラムによりセットされ、変わらない。
【００８６】 この目的において、付与された核酸配列Ｄに対する、Ｄとの、又はＤに対抗す
る付与された核酸配列Ｃの％核酸配列同一性(別に、付与された核酸配列Ｃが、
付与された核酸配列Ｄに対する、Ｄとの、又はＤに対抗する所定の％核酸配列を
有するか、又はこれを含むものとしても呼称することができる)は、次の式： 分率Ｗ／Ｚの１００倍 により算出され、ここで、Ｗは、Ｃ及びＤのプログラム整列において、配列整列
プログラムALIGN-2に同一符合するとスコアされたヌクレオチドの数であり、Ｚ
はＤのヌクレオチドの全数である。核酸配列Ｃの長さは核酸配列Ｄの長さとは等
しくなく、Ｄに対するＣの％核酸配列同一性は、Ｃに対するＤの％核酸配列同一
性とは等しくないと認識されるであろう。％核酸配列同一性の算出例としては、
図７Ｃ-Ｄには、「ＰＲＯ-ＤＮＡ」と称される核酸配列に対する、「比較ＤＮＡ
」と称される核酸配列の％核酸配列同一性の算出方法を示している。
【００８７】 特に記載しない場合は、ここで使用される全％核酸配列同一性値は、ALIGN-2
配列比較コンピュータプログラムを使用して上述したようにして得られる。しか
しながら、％核酸配列同一性は、配列比較プログラムNCBI-BLAST2(Altschulら,
Nucleic Acids Res., 25：3389-3402(1997))を使用して決定することもできる。
NCBI-BLAST2配列比較プログラムは、http://www.ncbi.nlm.nih.govからダウンロ
ードすることができる。NCBI-BLAST2はいくつかのサーチプログラムを使用して
おり、その全てのサーチパラメータは、例えばアンマスク＝yes、ストランド＝a
ll、予測発生値＝１０、最低複雑長さ＝１５／５、マルチパス ｅ値＝０．０１
、マルチパス定数＝２５、最終間隙アラインメントのドロップオフ＝２５、スコ
アリングマトリクス＝BLOSUM62を含むデフォルト値に設定される。
【００８８】 配列比較においてNCBI-BLAST2が使用される状況では、付与された核酸配列Ｄ
に対する、Ｄとの、又はＤに対抗する付与された核酸配列Ｃの％アミノ酸配列同
一性(別に、付与された核酸配列Ｃが、付与された核酸配列Ｄに対する、Ｄとの
、又はＤに対抗する所定の％核酸配列を有するか、又はこれを含むものとしても
呼称することができる)は、次の式： フラクションＷ／Ｚの１００倍 により算出され、ここで、Ｗは、Ｃ及びＤのプログラム整列において、配列整列
プログラムNCBI-BLAST2に同一符合するとスコアされたヌクレオチドの数であり
、ＺはＤのヌクレオチドの全数である。核酸配列Ｃの長さは核酸配列Ｄの長さと
は等しくなく、Ｄに対するＣの％核酸配列同一性は、Ｃに対するＤの％核酸配列
同一性とは等しくないと認識されるであろう。
【００８９】 さらに、％核酸配列同一性はWU-BLAST-2コンピュータプログラム（Altschul等
, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)）を使用して算出することもで
きる。殆どのWU-BLAST-2サーチパラメータは初期値に設定される。初期値に設定
されない、即ち調節可能なパラメータは以下の値に設定する：オーバーラップス
パン＝１、オーバーラップフラクション＝０．１２５、ワード閾値（Ｔ）＝１１
、及びスコアリングマトリクス＝BLOSUM62。ここでの目的のために、％核酸配列
同一性値は、（ａ）天然配列ＰＲＯポリペプチド-コード化核酸分子から誘導さ
れた配列を有する関心あるＰＲＯポリペプチド-コード化核酸分子の核酸配列と
、関心ある比較核酸分子（即ち、関心あるＰＲＯポリペプチド-コード化核酸が
比較される変異体ＰＲＯポリヌクレオチドであってもよい配列）との間の、WU-B
LAST-2で決定された一致する同一ヌクレオチドの数を、（ｂ）関心あるＰＲＯポ
リペプチド-コード化核酸分子のヌクレオチド総数で割ることにより決定される
。
【００９０】 一実施態様では、ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６及びＰＲＯ３０２変異体ポリヌ
クレオチドは、活性ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチド
をコードし、好ましくは緊縮性ハイブリッド形成及び洗浄条件下で、図２(配列
番号：２)、図４(配列番号：７)又は図６(配列番号：１２)に示した全長ＰＲＯ
２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドをコードするヌクレオチド
配列にハイブリッド形成する核酸分子であり、ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６及び
ＰＲＯ３０２変異体ポリペプチドは、ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３
０２変異体ポリヌクレオチドにコードされるものであってもよい。
【００９１】 「陽性（ポジティブ）」という用語は、上記のように実施されたアミノ酸配列
同一性比較の中で、比較された配列において同一ではないが類似の特性を有して
いるアミノ酸残基を含む。関心あるアミノ酸残基に対して陽性値がスコアされた
アミノ酸残基は、関心あるアミノ酸残基と同一であるか、又は関心あるアミノ酸
残基が好ましく置換(以下の表１に定義)されたものである。
【００９２】 この目的において、付与されたアミノ酸配列Ｂに対する、Ｂとの、又はＢに対
抗する付与されたアミノ酸配列Ａのポジティブ％値(別に、付与されたアミノ酸
配列Ａが、付与されたアミノ酸配列Ｂに対する、Ｂとの、又はＢに対抗する所定
の％ポジティブを有するか、又はこれを含むものとしても呼称することができる
)は、次の式： 分率Ｘ／Ｙの１００倍 により算出され、ここで、Ｘは、Ａ及びＢのプログラム整列において、配列整列
プログラムALIGN-2によりポジティブ値がスコアされたアミノ酸残基の数であり
、ＹはＢのアミノ酸残基の全数である。アミノ酸配列Ａの長さはアミノ酸配列Ｂ
の長さとは等しくなく、Ｂに対するＡの％ポジティブは、Ａに対するＢの％ポジ
ティブとは等しくないと認識されるであろう。
【００９３】 「単離された」とは、ここで開示された種々のポリペプチドを記述するために
使用するときは、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収され
たポリペプチドを意味する。好ましくは、単離されたポリペプチドは、自然に結
合する全ての成分と結合していない。その自然環境の汚染成分とは、そのポリペ
プチドの診断又は治療への使用を典型的には妨害する物質であり、酵素、ホルモ
ン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態
様において、ポリペプチドは、(１)スピニングカップシークエネーターを使用す
ることにより、少なくとも１５残基のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列を得るの
に充分なほど、あるいは、(２)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用
いた非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥによる均一性まで精製され
る。単離されたポリペプチドには、ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０
２ポリペプチドの自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないため、組換え細
胞内のインサイツのタンパク質が含まれる。しかしながら、通常は、単離された
ポリペプチドは少なくとも１つの精製工程により調製される。
【００９４】 ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドをコード化した「
単離された」核酸分子、又は抗ＰＲＯ２３０、抗ＰＲＯ２１６又は抗ＰＲＯ３０
２抗体をコード化した「単離された」核酸分子は、同定され、ＰＲＯ２３０-、
ＰＲＯ２１６-又はＰＲＯ３０２-コード化核酸の天然源、又は抗ＰＲＯ２３０-
、抗ＰＲＯ２１６-又は抗ＰＲＯ３０２-コード化核酸の天然源に通常付随してい
る少なくとも１つの汚染核酸分子から分離された核酸分子である。好ましくは、
単離された核酸分子は、自然に結合する全ての汚染物質と結合していない。単離
されたＰＲＯ２３０-、ＰＲＯ２１６-又はＰＲＯ３０２-コード化核酸分子又は
単離された抗ＰＲＯ２３０-、抗ＰＲＯ２１６-又は抗ＰＲＯ３０２-コード化核
酸分子は、天然に見出される形態あるいは設定以外のものである。ゆえに、単離
された核酸分子は、天然の細胞中に存在するＰＲＯ２３０-、ＰＲＯ２１６-又は
ＰＲＯ３０２-コード化核酸分子又は抗ＰＲＯ２３０-、抗ＰＲＯ２１６-又は抗
ＰＲＯ３０２-コード化核酸分子とは区別される。しかし、ＰＲＯ２３０、ＰＲ
Ｏ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドをコードする単離された核酸分子、又は
抗ＰＲＯ２３０、抗ＰＲＯ２１６又は抗ＰＲＯ３０２抗体をコードする単離され
た核酸分子は、例えば、核酸分子が天然細胞のものとは異なった染色体位置にあ
るＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチド、又は抗ＰＲＯ２
３０、抗ＰＲＯ２１６又は抗ＰＲＯ３０２抗体を通常発現する細胞に含まれるＰ
ＲＯ２３０-、ＰＲＯ２１６-又はＰＲＯ３０２-核酸分子、又は抗ＰＲＯ２３０-
、抗ＰＲＯ２１６-又は抗ＰＲＯ３０２-核酸分子を含む。
【００９５】 「コントロール配列」という用語は、特定の宿主生物において作用可能に結合
したコード配列を発現するために必要なＤＮＡ配列を指す。例えば原核生物に好
適なコントロール配列は、プロモーター、場合によってはオペレータ配列、及び
リボソーム結合部位を含む。真核生物の細胞は、プロモーター、ポリアデニル化
シグナル及びエンハンサーを利用することが知られている。
【００９６】 核酸は、他の核酸配列と機能的な関係にあるときに「作用可能に結合し」てい
る。例えば、プレ配列あるいは分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に
参画するプレタンパク質として発現されているなら、そのＰＲＯ２３０、ＰＲＯ
２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドのＤＮＡに作用可能に結合している；プロ
モーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼすならば、コード配列に
作用可能に結合している；又はリボソーム結合部位は、もしそれが翻訳を容易に
するような位置にあるなら、コード配列と作用可能に結合している。一般的に、
「作用可能に結合している」とは、結合したＤＮＡ配列が近接しており、分泌リ
ーダーの場合には近接していて読みフェーズにあることを意味する。しかし、エ
ンハンサーは必ずしも近接している必要はない。結合は簡便な制限部位でのライ
ゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、従来の手法
に従って、合成オリゴヌクレオチドアダプターあるいはリンカーが使用される。
【００９７】 ハイブリッド形成反応の「緊縮性」は、当業者によって容易に決定され、一般
的にプローブ長、洗浄温度、及び塩濃度に依存する経験的な計算である。一般に
、プローブが長くなると適切なアニーリングのための温度が高くなり、プローブ
が短くなると温度は低くなる。ハイブリッド形成は、一般的に、相補的ストラン
ドがその融点より低い環境に存在する場合における変性ＤＮＡの再アニールする
能力に依存する。プローブとハイブリッド形成可能な配列との間の所望の相同性
の程度が高くなると、使用できる相対温度が高くなる。その結果、より高い相対
温度は、反応条件をより緊縮性にするが、低い温度は緊縮性を低下させる。ハイ
ブリッド形成反応の緊縮性の更なる詳細及び説明は、Ausubel等, Current Proto
cols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995)を参照の
こと。
【００９８】 ここで定義される「緊縮性条件」又は「高度の緊縮性条件」は、（１）洗浄の
ために低イオン強度及び高温度、例えば、５０℃において０．０１５Ｍの塩化ナ
トリウム／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のドデシル硫酸ナト
リウムを用いるもの；（２）ハイブリッド形成中にホルムアミド等の変性剤、例
えば、４２℃において５０％（v/v）ホルムアミドと０．１％ウシ血清アルブミ
ン／０．１％フィコール／０．１％のポリビニルピロリドン／５０ｍＭのｐＨ６
．５のリン酸ナトリウムバッファー、及び７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍ
Ｍクエン酸ナトリウムを用いるもの；（３）４２℃における５０％ホルムアミド
、５ｘＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム）、
５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％のピロリン酸ナトリウム
、５ｘデンハード液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％
ＳＤＳ、及び１０％のデキストラン硫酸と、４２℃における０．２ｘＳＳＣ（塩
化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中の洗浄及び５５℃での５０％ホルムアミ
ド、次いで５５℃におけるＥＤＴＡを含む０．１ｘＳＳＣからなる高緊縮性洗浄
を用いるものによって同定される。 「中程度の緊縮性条件」は、Sambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory
Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)に記載されて
いるように同定され、上記の緊縮性より低い洗浄溶液及びハイブリッド形成条件
（例えば、温度、イオン強度及び％ＳＤＳ）の使用を含む。中程度の緊縮性条件
は、２０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエ
ン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５ｘデンハー
ド液、１０％デキストラン硫酸、及び２０ｍｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡ
を含む溶液中の３７℃での終夜インキュベーション、次いで１ｘＳＳＣ中３７−
５０℃でのフィルターの洗浄といった条件である。当業者であれば、プローブ長
などの因子に適合させる必要に応じて、どのようにして温度、イオン強度等を調
節するかを認識するであろう。
【００９９】 「エピトープタグ」なる修飾詞は、ここで用いられるときは、「タグポリペプ
チド」に融合したＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドを
含んでなるキメラポリペプチドを指す。タグポリペプチドは、その抗体が産生さ
れ得るエピトープを提供するに十分な数の残基を有しているが、その長さは融合
するポリペプチドの活性を阻害しないよう充分に短い。また、タグポリペプチド
は、好ましくは、抗体が他のエピトープと実質的に交差反応をしないようにかな
り独特である。適切なタグポリペプチドは、一般に、少なくとも６のアミノ酸残
基、通常は約８〜５０のアミノ酸残基(好ましくは約１０〜約２０のアミノ酸残
基)を有する。
【０１００】 ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２変異体における「活性な」及び
「活性」とは、天然又は天然発生ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２
ポリペプチドの生物学的及び／又は免疫学的活性を保持するＰＲＯ２３０、ＰＲ
Ｏ２１６又はＰＲＯ３０２タンパク質の形態を称する。 ここで開示されているスクリーニングアッセイにより同定可能なＰＲＯ２３０
、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドに拮抗する分子(例えば、有機又
は無機小分子、ペプチド等)における「生物学的活性」とは、ここで同定された
ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドに結合又は複合体化
、又は他の細胞タンパク質とＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリ
ペプチドとの相互作用を干渉、又はＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０
２ポリペプチドの転写又は翻訳を阻害する分子の能力を称するときに使用される
。特に好ましい生物学的活性には、血管に影響を及ぼす全身疾患、例えば真性糖
尿病、並びに動脈、毛細管、静脈及び／又はリンパ管の病気、及び癌に作用する
心肥大活性が含まれる。
【０１０１】 「アンタゴニスト」なる用語は最も広い意味で用いられ、ここに開示した天然
ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドの一又は複数の生物
学的活性、例えば適切であるならば、その分裂促進又は血管形成活性を阻止、阻
害、又は中和する任意の分子を含む。ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３
０２ポリペプチドのアンタゴニストは、ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ
３０２ポリペプチドの細胞レセプターへの結合に干渉する、ＰＲＯ２３０、ＰＲ
Ｏ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドにより活性化される細胞を無力化又は死
亡させる、又はＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドが細
胞レセプターに結合した後に血管内皮細胞の活性化に干渉することにより作用す
る。ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドアンタゴニスト
による仲介のこのような点の全ては、この発明の目的と等しいと考えられる。ア
ンタゴニストは、分裂促進、血管形成、又はＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰ
ＲＯ３０２ポリペプチドの他の生物学的活性を阻害し、よって、腫瘍、特に固形
悪性腫瘍、慢性関節リュウマチ、乾癬、アテローム性動脈硬化、糖尿病、他の網
膜症、水晶体後繊維増殖症、年齢関連性斑変性、新血管新生緑内障、移植角膜組
織及び他の組織の免疫拒絶、慢性関節リウマチ、血管新生緑内障、血管腫、甲状
腺過形成(グレイブス病)、角膜及び他の組織の移植、及び慢性炎症を含む、所望
しない過度の新血管新生により特徴付けられる病気又は疾患の治療に有用である
。また、アンタゴニストは、所望しない過度の血管浸透性により特徴付けられる
病気又は疾患、例えば脳腫瘍に関連した浮腫、悪性腫瘍に関連した腹水症、メー
グス症候群、肺炎、ネフローゼ症候群、心外膜液(例えば心膜炎に関連したもの)
、胸膜滲出の治療に有用である。同様に「アゴニスト」なる用語は最も広い意味
で用いられ、ここに開示した天然ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２
ポリペプチドの生物学的活性を模倣する任意の分子を含む。好適なアゴニスト又
はアンタゴニスト分子は特に、アゴニスト又はアンタゴニスト抗体又は抗体フラ
グメント、天然ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドのフ
ラグメント又はアミノ酸配列変異体、ペプチド、有機小分子等を含む。
【０１０２】 「小分子」とは、ここでは約５００ダルトン以下の分子量を有するものを定義
する。 ここで使用される場合の「ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリ
ペプチドレセプター」なる用語は、ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０
２ポリペプチドの細胞レセプター、通常は血管内皮細胞に見出される細胞表面レ
セプター、並びにＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドに
結合する能力を保持しているそれらの変異体を称する。
【０１０３】 「抗体」(Ａｂｓ)と「免疫グロブリン」(Ｉｇｓ)は同じ構造的特徴を有する糖
タンパク質である。抗体は特定の抗原に対して結合特異性を示すものであるが、
免疫グロブリンは、抗体と抗原特異性を欠く他の抗体様分子の両方を含むもので
ある。後者の種類のポリペプチドは、例えばリンパ系により低レベルで、骨髄腫
により増加したレベルで産生される。「抗体」という用語は最も広い意味におい
て使用され、限定するものではないが、特に無傷のモノクローナル抗体、ポリク
ローナル抗体、少なくとも２つの無傷の抗体から形成された多重特異性抗体(例
えば二重特異性抗体)、及びそれらが所望の生物活性を示す限り抗体フラグメン
トも含む。 「天然抗体」及び「天然免疫グロブリン」は、通常、２つの同一の軽(Ｌ)鎖及
び２つの同一の重(Ｈ)鎖からなる、約１５００００ダルトンのヘテロ四量体糖タ
ンパク質である。各軽鎖は一つの共有ジスルフィド結合により重鎖に結合してお
り、ジスルフィド結合の数は、異なった免疫グロブリンアイソタイプの重鎖の中
で変化する。また各重鎖と軽鎖は、規則的に離間した鎖間ジスルフィド結合を有
している。各重鎖は、多くの定常ドメインが続く可変ドメイン(ＶＨ)を一端に有
する。各軽鎖は、一端に可変ドメイン(ＶＬ)を、他端に定常ドメインを有し；軽
鎖の定常ドメインは重鎖の第一定常ドメインと整列し、軽鎖の可変ドメインは重
鎖の可変ドメインと整列している。特定のアミノ酸残基が、軽鎖及び重鎖可変ド
メイン間の界面を形成すると考えられている。
【０１０４】 「可変」という用語は、可変ドメインのある部位が、抗体の中で配列が広範囲
に異なっており、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合性及び特異性に使
用されているという事実を称する。しかしながら、可変性は抗体の可変ドメイン
にわたって一様には分布していない。軽鎖及び重鎖の可変ドメインの両方の高頻
度可変領域又は相補性決定領域(ＣＤＲ)と呼ばれる３つのセグメントに濃縮され
る。可変ドメインのより高度に保持された部分はフレームワーク領域(ＦＲ)と呼
ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、βシート構造を結合し、ある場
合にはその一部を形成するループ結合を形成する、３つのＣＤＲにより連結され
たβシート配置を主にとる４つのＦＲ領域をそれぞれ含んでいる。各鎖のＣＤＲ
は、ＦＲにより近接して結合せしめられ、他の鎖のＣＤＲと共に、抗体の抗原結
合部位の形成に寄与している。Kabatら, NIH Publ. No.91-3242, Vol.I, 647-66
9頁[1991]を参照のこと。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関連して
いるものではないが、種々のエフェクター機能、例えば抗体依存性細胞障害活性
への抗体の関与を示す。
【０１０５】 「抗体フラグメント」には、無傷の抗体の一部、好ましくは無傷の抗体の抗原
結合又は可変領域が含まれる。抗体フラグメントの例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、
Ｆ(ａｂ')２及びＦｖフラグメント；ダイアボディー(diabodies)；直鎖状抗体(Z
apataら, Protein Eng. 8(10):1057-1062[1995])；単鎖抗体分子；及び抗体フラ
グメントから形成される多重特異性抗体が含まれる。 抗体のパパイン消化により、各々が単一の抗原結合部位を有する「Ｆａｂ」フ
ラグメントと呼ばれる２つの同一の抗原結合フラグメントと、その名称が容易に
結晶化する能力を表す、残りの「Ｆｃ」フラグメントが産生される。ペプシン処
理により、２つの抗原結合部位を有し、更に抗原を架橋させ得るＦ(ａｂ')２フ
ラグメントが得られる。
【０１０６】 「Ｆｖ」は、完全な抗原認識及び抗原結合部位を含む最小抗体フラグメントで
ある。この領域は、堅固な非共有結合をなした一つの重鎖及び一つの軽鎖可変ド
メインの二量体からなる。この配置において、各可変ドメインの３つのＣＤＲは
相互に作用してＶＨ-ＶＬ二量体表面に抗原結合部位を形成する。集合的に、６
つのＣＤＲが抗体に抗原結合特異性を付与する。しかし、単一の可変ドメイン(
又は抗原に対して特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分)でさえ、全結合
部位よりも親和性が低くなるが、抗原を認識して結合する能力を有している。 またＦａｂフラグメントは、軽鎖の定常ドメインと重鎖の第一定常領域(ＣＨ
１)を有する。Ｆａｂ'フラグメントは、抗体ヒンジ領域からの一又は複数のシス
テインを含む重鎖ＣＨ１領域のカルボキシ末端に数個の残基が付加している点で
Ｆａｂフラグメントとは異なる。Ｆａｂ'-ＳＨは、定常ドメインのシステイン残
基が遊離チオール基を担持しているＦａｂ'に対するここでの命名である。Ｆ(ａ
ｂ')２抗体フラグメントは、間にヒンジシステインを有するＦａｂ'フラグメン
トの対として生産された。抗体フラグメントの他の化学結合も知られている。
【０１０７】 任意の脊椎動物種からの抗体(免疫グロブリン)の「軽鎖」には、その定常ドメ
インのアミノ酸配列に基づいて、カッパ(κ)及びラムダ(λ)と呼ばれる２つの明
確に区別される型の一つが割り当てられる。 重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは異なるクラス
に割り当てることができる。免疫グロブリンには５つの主たるクラス：ＩｇＡ、
ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがあり、それらのいくつかは更にサブクラス
(アイソタイプ)、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４、ＩｇＡ及
びＩｇＡ２に分割される。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ド
メインは、それぞれα、σ、ε、γ及びμと呼ばれる。異なるクラスの免疫グロ
ブリンのサブユニット構造及び３次元構造はよく知られている。
【０１０８】 ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体
の集団から得られる抗体を指す、すなわち、集団を構成する個々の抗体が、少量
で存在しうる自然に生じる可能な突然変異を除いて同一である。モノクローナル
抗体は高度に特異的であり、一つの抗原部位に対している。更に、異なる決定基
(エピトープ)に対する異なる抗体を典型的には含む通常の(ポリクローナル)抗体
と比べて、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基を対するものである
。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の免疫グロブリンによって汚
染されていないハイブリドーマ培養から合成される点で有利である。「モノクロ
ーナル」との修飾詞は、実質的に均一な抗体集団から得られているという抗体の
特徴を示し、抗体を何か特定の方法で生産しなければならないことを意味するも
のではない。例えば、本発明において使用されるモノクローナル抗体は、最初に
Kohlerら, Nature 256, 495 (1975)により開示されたハイブリドーマ法によって
作ることができ、あるいは組換えＤＮＡ法によって作ることができる(例えば、
米国特許第4,816,567号参照)。また「モノクローナル抗体」は、例えばClackson
ら, Nature 352:624-628(1991)、及びMarksほか, J. Mol. Biol. 222:581-597(1
991)に記載された技術を用いてファージ抗体ライブラリから単離することもでき
る。 ここで、モノクローナル抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が特定の種由来の
抗体あるいは特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同
一であるか相同であり、鎖の残りの部分が他の種由来の抗体あるいは他の抗体ク
ラスあるいはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか相同である
「キメラ」抗体(免疫グロブリン)、並びにそれが所望の生物的活性を有する限り
それら抗体のフラグメントを特に含む(米国特許第4,816,567号; Morrisonほか,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855[1984])。
【０１０９】 非ヒト(例えばマウス)抗体の「ヒト化」形とは、キメラ免疫グロブリン、免疫
グロブリン鎖あるいはそれらのフラグメント(例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ
(ａｂ')２あるいは抗体の他の抗原結合サブ配列)であって、非ヒト免疫グロブリ
ンに由来する最小配列を含むものである。大部分においてヒト化抗体はレシピエ
ントのＣＤＲの残基が、マウス、ラット又はウサギのような所望の特異性、親和
性及び能力を有する非ヒト種(ドナー抗体)のＣＤＲの残基によって置換されたヒ
ト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。ある場合には、ヒト免疫グロブリ
ンのＦｖフレームワーク領域残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。
更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたＣＤＲもしくはフレー
ムワーク配列にも見出されない残基を含んでもよい。これらの修飾は抗体の特性
を更に洗練し、最適化するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、全てあるい
はほとんど全てのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てある
いはほとんど全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリン配列のものである、少なくと
も１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、
最適には免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定
常領域の少なくとも一部を含んでなる。更なる詳細は、Jonesら, Nature 321, 5
22-525(1986)；Reichmannら, Nature 332, 323-329(1988)；及びPresta, Curr.
Op. Struct. Biol. 2, 593-596(1992)を参照のこと。ヒト化抗体は、抗体の抗原
結合領域が、関心のある抗原でマカクザルを免疫化することにより生産された抗
体から由来するプリマタイズした(PRIMATIZEDTM)抗体を含む。 「単鎖Ｆｖ」すなわち「ｓＦｖ」抗体フラグメントは、抗体のＶＨ及びＶＬド
メインを含有するもので、これらのドメインはポリペプチド単鎖に存在する。好
ましくは、Ｆｖポリペプチドは、ｓＦｖが抗原結合に対する所望の構造を形成で
きるようにするポリペプチドリンカーをＶＨとＶＬドメインの間に更に含んでい
る。ｓＦｖのレビューには、例えば、Pluckthun, The Pharmacology of Monoclo
nal Antibodies, vol.113, Rosenburg及びMoore編(Springer-Verlag, New York,
1994)pp.269-315を参照されたい。
【０１１０】 「ダイアボディー」という用語は、２つの抗原結合部位を有する小さな抗体フ
ラグメントを意味するもので、フラグメントは軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)に結合し
た重鎖可変ドメイン(ＶＨ)を同じポリペプチド鎖(ＶＨ-ＶＬ)に含有する。同じ
鎖上での二つのドメイン間の対合が許されないほど短いリンカーを使用すること
により、ドメインが、他の鎖の相補的ドメインとの対合を強いられ、二つの抗原
結合部位をつくりだす。ダイアボディーは、例えば、欧州特許第404,097号；国
際公開93/11161号；及びHollingerら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6
448 (1993)に更に詳しく記載されている。
【０１１１】 「単離された」抗体は、その自然環境の成分から同定され分離及び／又は回収
されたものである。その自然環境の汚染成分とは、その抗体の診断又は治療への
使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タン
パク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様において、抗体は、（１）ローリ法
(Lowry method)で測定した場合９５％を越える抗体、最も好ましくは９９重量％
を越えるまで、(２)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、
少なくとも１５残基のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列を得るのに充分なほど、
あるいは、(３)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元ある
いは還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥによる均一性まで精製される。単離された
抗体には、抗体の自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないため、組換え細
胞内のインサイツの抗体が含まれる。しかしながら、通常は、単離された抗体は
少なくとも１つの精製工程により調製される。
【０１１２】 「標識」なる語は、ここで用いられる場合、抗体に直接又は間接的に抱合して
「標識」抗体を生成する検出可能な化合物又は組成物を称する。標識は、それ自
身検出可能でもよく（例えば、放射性標識又は蛍光標識）、又は酵素標識の場合
、検出可能な基質化合物又は組成物の化学変換を触媒してもよい。 「固相」とは、本発明の抗体がそれに付着することのできる非水性マトリクス
を意味する。ここに含まれる固相の例は、部分的又は全体的に、ガラス（例えば
、孔制御ガラス）、多糖類（例えばアガロース）、ポリアクリルアミド、ポリス
チレン、ポリビニルアルコール及びシリコーンから形成されたものを含む。或る
種の実施態様では、内容に応じて、固相はアッセイプレートのウェルを構成する
ことができ；その他では精製カラム（例えばアフィニティクロマトグラフィーカ
ラム）とすることもできる。また、この用語は、米国特許第4,275,149号に記載
されたような、別個の粒子の不連続な固相も包含する。
【０１１３】 「リポソーム」は、種々の型の脂質、リン脂質及び／又は界面活性剤からなる
小型の小胞であり、哺乳動物への薬物（ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ
３０２ポリペプチド又はここに開示されているそれらの抗体など）の輸送に有用
である。リポソームの成分は、通常は生体膜の脂質配列に類似する二層形式に配
列させる。 ここで用いられる「イムノアドヘシン」なる用語は、異種タンパク質（「アド
ヘシン」）の結合特異性と免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター機能とを
結合した抗体様分子を指す。構造的には、イムノアドヘシンは、所望の結合特異
性を持ち、抗体の抗原認識及び結合部位以外である（即ち「異種の」）アミノ酸
配列と、免疫グロブリン定常ドメイン配列との融合物を含む。イムノアドヘシン
分子のアドへシン部分は、典型的には少なくともレセプター又はリガンドの結合
部位を含む隣接アミノ酸配列である。イムノアドヘシンの免疫グロブリン定常ド
メイン配列は、ＩｇＧ-１、ＩｇＧ-２、ＩｇＧ-３又はＩｇＧ-４サブタイプ、Ｉ
ｇＡ（ＩｇＡ-１及びＩｇＡ-２を含む）、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭなどの任意
の免疫グロブリンから得ることができる。
【０１１４】 ＩＩ. 本発明の組成物と方法 Ａ． ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６及びＰＲＯ３０２変異体 ここに記載した全長天然配列ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６及びＰＲＯ３０２ポ
リペプチドに加えて、ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６及びＰＲＯ３０２変異体も調
製できると考えられる。ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６及びＰＲＯ３０２変異体は
、ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ＤＮＡに適当なヌクレオチド変
化を導入することにより、及び／又は所望のＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰ
ＲＯ３０２ポリペプチドを合成することにより調製できる。当業者は、グリコシ
ル化部位の数又は位置の変化あるいは膜固着特性の変化などのアミノ酸変化がＰ
ＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２の翻訳後プロセスを変えうることと
評価されるであろう。 天然全長配列ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２又はここに記載し
たＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２の種々のドメインにおける変異
は、例えば、米国特許第5,364,934号に記載されている保存的及び非保存的変異
についての任意の技術及び指針を用いてなすことができる。変異は、結果として
天然配列ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２と比較してＰＲＯ２３０
、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２のアミノ酸配列が変化するＰＲＯ２３０、ＰＲ
Ｏ２１６又はＰＲＯ３０２をコードする一又は複数のコドンの置換、欠失又は挿
入であってよい。場合によっては、変異は少なくとも１つのアミノ酸のＰＲＯ２
３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２の一又は複数のドメインの任意の他のアミ
ノ酸による置換である。いずれのアミノ酸残基が所望の活性に悪影響を与えるこ
となく挿入、置換又は欠失されるかの指針は、ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又は
ＰＲＯ３０２の配列を相同性の知られたタンパク質分子の配列と比較し、相同性
の高い領域内でなされるアミノ酸配列変化を最小にすることによって見出される
。アミノ酸置換は、一のアミノ酸の類似した構造及び／又は化学特性を持つ他の
アミノ酸での置換、例えばロイシンのセリンでの置換、即ち保存的アミノ酸置換
の結果とすることができる。挿入及び欠失は、場合によっては１から５のアミノ
酸の範囲内とすることができる。許容される変異は、配列においてアミノ酸の挿
入、欠失又は置換を系統的に作成し、得られた変異体を全長又は成熟天然配列に
より示される活性について試験することにより決定される。
【０１１５】 特別の実施態様では、関心のある保存的置換を、好ましい置換を先頭にして表
１に示す。このような置換が生物学的活性の変化をもたらす場合、表１に例示的
置換を示し又は以下にアミノ酸分類でさらに記載するように、より置換的な変化
が導入され生成物がスクリーニングされる。 表１ 元の残基 例示的置換 好ましい置換 Ala(A) val; Leu; ile val Arg(R) lys; gln; asn lys Asn(N) gln; his; lys; arg gln Asp(D) glu glu Cys(C) ser ser Gln(Q) asn ans Gln(E) asp asp Gly(G) pro; ala ala His(H) asn; gln; lys; arg arg Ile(I) leu; val; met; ala; phe; ノルロイシン leu Leu(L) ノルロイシン; ile; val; met; ala; phe ile Lys(K) arg; gln; asn arg Met(M) leu; phe; ile leu Phe(F) leu; val; ile; ala; tyr leu Pro(P) ala ala Ser(S) thr thr Thr(T) ser ser Trp(W) tyr; phe tyr Tyr(Y) trp; phe; thr; ser phe Val(V) ile; leu; met; phe; ala; ノルロイシン leu
【０１１６】 ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドの機能及び免疫学
的同一性の置換的修飾は、（ａ）置換領域のポリペプチド骨格の構造、例えばシ
ート又は螺旋配置、（ｂ）標的部位の分子の電荷又は疎水性、又は（ｃ）側鎖の
嵩を維持しながら、それらの効果において実質的に異なる置換基を選択すること
により達成される。天然発生残基は共通の側鎖特性に基づいてグループに分ける
ことができる： （１）疎水性：ノルロイシン, met, ala, val, leu, ile; （２）中性の親水性：cys, ser, thr; （３）酸性：asp, glu; （４）塩基性：asn, gln, his, lys, arg; （５）鎖配向に影響する残基：gly, pro; 及び （６）芳香族：trp, tyr, phe。 非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを
必要とするであろう。また、そのように置換された残基は、保存的置換部位、好
ましくは残された（非保存）部位に導入されうる。
【０１１７】 変異は、オリゴヌクレオチド媒介（部位特異的）突然変異誘発、アラニンスキ
ャンニング、及びＰＣＲ突然変異誘発等の当該技術において公知の技術を使用し
て作成することができる。部位指向性突然変異誘発［Carter等, Nucl. Acids Re
s., 13: 4331 (1986); Zoller等, Nucl. Acids Res., 10: 6487 (1987)］、カセ
ット突然変異誘発［Wells等, Gene, 34: 315 (1985)］、制限選択突然変異誘発
［Wells等, Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317: 415 (1986)］又は他の
周知の技術が、ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２変異体ＤＮＡを製
造するために、クローン化されたＤＮＡに実施できる。 また、隣接配列に沿って一又は複数のアミノ酸を同定するのにスキャンニング
アミノ酸分析を用いることができる。好ましいスキャンニングアミノ酸は比較的
小さく、中性のアミノ酸である。そのようなアミノ酸は、アラニン、グリシン、
セリン、及びシステインを含む。アラニンは、ベータ炭素を越える側鎖を排除し
変異体の主鎖構造を変化させにくいので、この群の中で典型的に好ましいスキャ
ンニングアミノ酸である［Cunningham及びWells, Science, 244：1081-1085(198
9)］。また、アラニンは最もありふれたアミノ酸であるため典型的には好ましい
。さらに、それは埋もれた及び露出した位置の両方に見られることが多い［Crei
ghton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol.,
150: 1 (1976)］。アラニン置換が十分な量の変異体を生じない場合は、アイソ
テリック(isoteric)アミノ酸を用いることができる。
【０１１８】 Ｂ． ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６及びＰＲＯ３０２の修飾 ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６及びＰＲＯ３０２の共有結合的修飾は本発明の範
囲内に含まれる。共有結合的修飾の一型は、ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰ
ＲＯ３０２ポリペプチドの標的とするアミノ酸残基を、ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２
１６又はＰＲＯ３０２の選択された側鎖又はＮ又はＣ末端残基と反応できる有機
誘導体化試薬と反応させることである。二官能性試薬での誘導体化が、例えばＰ
ＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２を水不溶性支持体マトリクスあるい
は抗ＰＲＯ２３０、抗ＰＲＯ２１６又は抗ＰＲＯ３０２抗体の精製方法又はその
逆で用いるための表面に架橋させるのに有用である。通常用いられる架橋剤は、
例えば、１，１-ビス（ジアゾアセチル）-２-フェニルエタン、グルタルアルデ
ヒド、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば４-アジドサリチル酸、３
，３’-ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）等のジスクシンイミジ
ルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル、ビス-Ｎ-マレイミド-１，８-オ
クタン等の二官能性マレイミド、及びメチル-３-[(ｐ-アジドフェニル)-ジチオ
］プロピオイミダート等の試薬を含む。 他の修飾は、グルタミニル及びアスパラギニル残基の各々対応するグルタミル
及びアスパルチルへの脱アミノ化、プロリン及びリシンのヒドロキシル化、セリ
ル又はトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニン、及び
ヒスチジン側鎖のα-アミノ基のメチル化[T.E. Creighton, Proteins: Structur
e and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp.79-86
(1983)]、Ｎ末端アミンのアセチル化、及び任意のＣ末端カルボキシル基のアミ
ド化を含む。
【０１１９】 本発明の範囲内に含まれるＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリ
ペプチドの共有結合的修飾の他の型は、ポリペプチドの天然グリコシル化パター
ンの変更を含む。「天然グリコシル化パターンの変更」とは、ここで意図される
のは、天然配列ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２に見られる一又は
複数の炭水化物部分の欠失（存在するグリコシル化部位の除去又は化学的及び／
又は酵素的手段によるグリコシル化の削除のいずれかによる）、及び／又は天然
配列ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２に存在しない一又は複数のグ
リコシル化部位の付加を意味する。さらに、この文節は、存在する種々の炭水化
物部分の性質及び割合の変化を含む、天然タンパク質のグリコシル化における定
性的変化を含む。 ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドへのグリコシル化
部位の付加はアミノ酸配列の変更を伴ってもよい。この変更は、例えば、一又は
複数のセリン又はトレオニン残基の天然配列ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰ
ＲＯ３０２（Ｏ-結合グリコシル化部位）への付加、又は置換によってなされて
もよい。ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２アミノ酸配列は、場合に
よっては、ＤＮＡレベルでの変化、特に、ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲ
Ｏ３０２ポリペプチドをコードするＤＮＡを予め選択された塩基において変異さ
せ、所望のアミノ酸に翻訳されるコドンを生成させることを通して変更されても
よい。
【０１２０】 ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチド上に炭水化物部分
の数を増加させる他の手段は、グリコシドのポリペプチドへの化学的又は酵素的
結合による。このような方法は、この技術分野において、例えば、1987年9月11
日に発行されたWO 87/05330、及びAplin及びWriston, CRC Crit. Rev. Biochem.
, pp. 259-306 (1981)に記載されている。 ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチド上に存在する炭水
化物部分の除去は、化学的又は酵素的に、あるいはグルコシル化の標的として提
示されたアミノ酸残基をコードするコドンの変異的置換によってなすことができ
る。化学的脱グリコシル化技術は、この分野で知られており、例えば、Hakimudd
in等, Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987)により、及びEdge等, Anal. Bi
ochem., 118: 131 (1981)により記載されている。ポリペプチド上の炭水化物部
分の酵素的切断は、Thotakura等, Meth. Enzymol. 138:350 (1987)に記載されて
いるように、種々のエンド及びエキソグリコシダーゼを用いることにより達成さ
れる。 本発明のＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２の共有結合的修飾の他
の型は、ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドの、種々の
非タンパク質様ポリマー、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリ
コール、又はポリオキシアルキレンの一つへの、米国特許第4,640,835号；第4,4
96,689号；第4,301,144号；第4,670,417号；第4,791,192号又は第4,179,337号に
記載された方法での結合を含む。
【０１２１】 また、本発明のＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２は、他の異種ポ
リペプチド又はアミノ酸配列に融合したＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ
３０２を含むキメラ分子を形成する方法で修飾してもよい。 一実施態様では、このようなキメラ分子は、抗タグ抗体が選択的に結合できる
エピトープを提供するタグポリペプチドとＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲ
Ｏ３０２との融合を含む。エピトープタグは、一般的にはＰＲＯ２３０、ＰＲＯ
２１６又はＰＲＯ３０２のアミノ又はカルボキシル末端に位置する。このような
ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２のエピトープタグ形態の存在は、
タグポリペプチドに対する抗体を用いて検出することができる。また、エピトー
プタグの提供は、抗タグ抗体又はエピトープタグに結合する他の型の親和性マト
リクスを用いたアフィニティ精製によってＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲ
Ｏ３０２を容易に精製できるようにする。種々のタグポリペプチド及びそれら各
々の抗体はこの分野で良く知られている。例としては、ポリ−ヒスチジン（poly
-his）又はポリ−ヒスチジン−グリシン（poly-his-gly）タグ；flu HAタグポリ
ペプチド及びその抗体１２ＣＡ５［Field等, Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (
1988)］；c-mycタグ及びそれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７及
び９Ｅ１０抗体［Evan等, Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (198
5)］；及び単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（gD）タグ及びその抗体［Pabo
rsky等, Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)］を含む。他のタグポリペ
プチドは、フラッグペプチド［Hopp等, BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)］
；ＫＴ３エピトープペプチド［Martin等, Science, 255:192-194 (1992)］；α-
チューブリンエピトープペプチド［Skinner等, J. Biol. Chem., 266:15163-151
66 (1991)］；及びＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチドタグ［Lutz-Freyermuth等
, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990)］を含む。 それに換わる実施態様では、キメラ分子はＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰ
ＲＯ３０２と免疫グロブリン又は免疫グロブリンの特定領域との融合体を含んで
もよい。キメラ分子の二価形態（「イムノアドヘシン」とも呼ばれる）について
は、そのような融合体はＩｇＧ分子のＦｃ領域であり得る。Ｉｇ融合体は、好ま
しくはＩｇ分子内の少なくとも１つの可変領域に換えてＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２
１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドの可溶化（膜貫通ドメイン欠失又は不活性化
）形態を含む。特に好ましい実施態様では、免疫グロブリン融合体は、ＩｇＧ１
分子のヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３、又はヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３領域
を含む。免疫グロブリン融合体の製造については、1995年6月27日発行の米国特
許第5,428,130号を参照のこと。
【０１２２】 Ｃ． ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６及びＰＲＯ３０２ポリペプチドの調製 本発明は、本出願においてＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２と称
される、新規に同定及び単離されたヌクレオチド配列コード化ポリペプチドを提
供するものである。特に、ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペ
プチドをコードするｃＤＮＡは、以下の実施例にさらなる詳細が開示されている
ようにして、同定され単離される。分離発現環状部に生産されるタンパク質は、
異なるＰＲＯ番号が付与されるが、ＵＮＱ番号は任意の付与されるＤＮＡ及びコ
ード化タンパク質で唯一であり、変わることはないであろう。しかしながら、簡
単にする目的で、本出願においては、ＤＮＡ３３２２３-１１３６、ＤＮＡ３３
０８７-１１５８又はＤＮＡ４０３７０-１２１７にコードされるタンパク質、さ
らなる天然相同体、及びＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２の先の定
義に含まれる変異体は、由来又は調製方法に無関係に、それぞれ「ＰＲＯ２３０
、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２」と称される。 以下の説明は、主として、ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリ
ペプチドをコードする核酸を含むベクターで形質転換又は形質移入された細胞を
培養することによりＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチド
を生産する方法に関する。もちろん、当該分野においてよく知られている他の方
法を用いてＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２を調製することができ
ると考えられる。例えば、ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペ
プチド配列、又はその一部は、固相技術を用いた直接ペプチド合成によって生産
してもよい。例えば、Stewart等, Solid-Phase Peptide Synthesis,(W.H. Freem
an Co., San Francisco, CA 1969)；Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-
2154 (1963)参照。手動技術又は自動によるインビトロタンパク質合成を行って
もよい。自動合成は、例えば、アプライド・バイオシステムズ・ペプチド合成機
（Foster City, CA）を用いて、製造者の指示により実施してもよい。ＰＲＯ２
３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２の種々の部分は、別々に化学的に合成され
、化学的又は酵素的方法を用いて結合させて全長ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又
はＰＲＯ３０２ポリペプチドを生産してもよい。
【０１２３】 ｉ． ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２をコードするＤＮＡの単離 ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドをコードするＤＮ
Ａは、ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２をコードするｍＲＮＡを保
有していてそれを検出可能なレベルで発現すると考えられる組織から調製された
ｃＤＮＡライブラリから得ることができる。従って、ヒトＰＲＯ２３０、ＰＲＯ
２１６又はＰＲＯ３０２をコードするＤＮＡは、実施例に記載されるように、ヒ
トの組織から調製されたｃＤＮＡライブラリから簡便に得ることができる。また
ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドをコードする遺伝子
は、ゲノムライブラリから又はオリゴヌクレオチド合成により得ることもできる
。 ライブラリは、対象となる遺伝子あるいはそれによりコードされるタンパク質
を同定するために設計されたプローブ(ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ
３０２ポリペプチドに対する抗体又は少なくとも約２０−８０塩基のオリゴヌク
レオチド等)によってスクリーニングできる。選択されたプローブによるｃＤＮ
Ａ又はゲノムライブラリのスクリーニングは、例えばSambrook等, 上掲に記載さ
れている標準的な手順を使用して実施することができる。所望のＰＲＯ２３０、
ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２をコードする遺伝子を単離する他の方法はＰＣＲ
法を使用するものである。Sambrook等,上掲；Dieffenbach等, PCR Primer：A La
boratory Manual(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)。
【０１２４】 下記の実施例には、ｃＤＮＡライブラリのスクリーニング技術を記載している
。プローブとして選択されたオリゴヌクレオチド配列は、充分な長さで、疑陽性
が最小化されるよう充分に明瞭でなければならない。オリゴヌクレオチドは、ス
クリーニングされるライブラリ内のＤＮＡとのハイブリッド形成時に検出可能で
あるように標識されていることが好ましい。標識化の方法は当該分野において良
く知られており、３２Ｐ標識されたＡＴＰのような放射線標識、ビオチン化ある
いは酵素標識の使用が含まれる。中程度の厳密性及び高度の厳密性を含むハイブ
リッド形成条件は、上掲のSambrook等に与えられている。 このようなライブラリースクリーニング法において同定された配列は、Genban
k等の公共データベース又は個人の配列データベースに寄託され公衆に利用可能
とされている周知の配列と比較及びアラインメントすることができる。分子の決
定された領域内又は全長配列に渡っての（アミノ酸又は核酸レベルのいずれかで
の）配列同一性は、相同性を測定する種々のアルゴリズムを使用する、コンピュ
ータソフトウエアプログラム、例えばALIGN、DNAstar及びINHERITにより決定す
ることができる。 タンパク質コード化配列を有する核酸は、初めてここで開示された推定アミノ
酸配列を使用し、また必要ならば、ｃＤＮＡに逆転写されなかったｍＲＮＡの生
成中間体及び先駆物質を検出する上掲のSambrook等に記述されているような従来
のプライマー伸展法を使用し、選択されたｃＤＮＡ又はゲノムライブラリをスク
リーニングすることにより得られる。
【０１２５】 ｉｉ． 宿主細胞の選択及び形質転換 宿主細胞を、ここに記載したＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２生
産のための発現又はクローニングベクターで形質移入又は形質転換し、プロモー
ターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅
するために適当に変性された常套的栄養培地で培養する。培養条件、例えば培地
、温度、ｐＨ等々は、過度の実験をすることなく当業者が選ぶことができる。一
般に、細胞培養の生産性を最大にするための原理、プロトコール、及び実用技術
は、Mammalian Cell Biotechnology: A Practical Approach, M.Butler編 (IRL
Press, 1991)及びSambrook等, 上掲に見出すことができる。 形質移入の方法、例えば、ＣａＰＯ４処理及びエレクトロポレーションは当業
者に知られている。用いられる宿主細胞に応じて、その細胞に対して適した標準
的な方法を用いて形質転換はなされる。前掲のSambrook等に記載された塩化カル
シウムを用いるカルシウム処理又はエレクトロポレーションは、原核生物又は実
質的な細胞壁障壁を含む他の細胞に対して一般に用いられる。アグロバクテリウ
ム・トゥメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)による感染が、Shaw等, G
ene, 23: 315 (1983)及び1989年6月29日公開の国際特許出願第ＷＯ89/05859号に
記載されたように、ある種の植物細胞の形質転換に用いられる。このような細胞
壁のない哺乳動物の細胞に対しては、Graham及びvan der Eb, Virology, 52: 45
6-457 (1978)のリン酸カルシウム沈降法が用いられる。哺乳動物細胞の宿主系形
質転換の一般的な態様は米国特許第4,399,216号に記載されている。酵母中への
形質転換は、典型的には、Van solingen等, J. Bact., 130: 946 (1977)及びHsi
ao等, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76:3829 (1979)の方法に従って実施され
る。しかしながら、ＤＮＡを細胞中に導入する他の方法、例えば、核マイクロイ
ンジェクション、エレクトロポレーション、無傷の細胞、又はポリカチオン、例
えばポリブレン、ポリオルニチン等を用いる細菌プロトプラスト融合もまた用い
ることができる。哺乳動物細胞を形質転換するための種々の技術については、Ke
own等, Methods in Enzymology, 185: 527-537 (1990)及び Mansour等, Nature,
336: 348-352 (1988)を参照のこと。
【０１２６】 ここに記載のベクターにＤＮＡをクローニングあるいは発現するために適切な
宿主細胞は、原核生物、酵母菌、又は高等真核生物細胞を含む。適切な原核生物
は、限定するものではないが、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物
体、例えば大腸菌のような腸内細菌科を含む。種々の大腸菌株が公衆に利用可能
であり、例えば、大腸菌Ｋ１２株ＭＭ２９４（ATCC31,446）；大腸菌Ｘ１７７６
（ATCC31,537）；大腸菌株Ｗ３１１０（ATCC27,325）及びＫ５７７２（ATCC53,6
35）である。他の好ましい原核動物宿主細胞は、大腸菌、例えば、E. coli、エ
ンテロバクター、エルビニア(Erwinia)、クレブシエラ(Klebsiella)、プロテウ
ス(Proteus)、サルモネラ、例えば、ネズミチフス菌、セラチア、例えば、セラ
チアマルセサンス(Serratia marcescans) 、及び赤痢菌、並びに桿菌、例えばバ
シリスブチリス(B. subtilis)及びバシリリチェニフォルミス(B. licheniformis
)（例えば、1989年4月12日発行のDD 266,710に記載されたバシリリチェニフォル
ミス４１Ｐ）、シュードモナス、例えば緑膿筋及びストレプトマイセスなどの腸
内細菌科を含む。これらの例は限定ではなく例示である。株Ｗ３１１０は、組換
えＤＮＡ生産発行のための共通の宿主株であるので一つの特に好ましい宿主又は
親宿主である。好ましくは、宿主細胞は最小量のタンパク質分解酵素を分泌する
。例えば、株Ｗ３１１０は、宿主に外来のタンパク質をコードする遺伝子におけ
る遺伝子変異をするように修飾してもよく、そのような宿主の例としては、完全
な遺伝子型ｔｏｎＡを有する大腸菌Ｗ３１１０株１Ａ２；完全な遺伝子型ｔｏｎ
Ａ ｐｔｒ３を有する大腸菌Ｗ３１１０株９Ｅ４；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ ｐ
ｒｔ３ ｐｈｏＡ Ｅ１５ (ａｒｇＦ-ｌａｃ)１６９ ｄｅｇＰ ｏｍｐＴｋ
ａｎrを有する大腸菌Ｗ３１１０株２７Ｃ７（ATCC 55,244）；完全な遺伝子型ｔ
ｏｎＡ ｐｔｒ３ ｐｈｏＡ Ｅ１５ (ａｌｇＦ-ｌａｃ)１６９ ｄｅｇＰ
ｏｍｐＴ ｒｂｓ７ｉｌｖＧｋａｎrを有する大腸菌Ｗ３１１０株３７Ｄ６；非
カナマイシン耐性ｄｅｇＰ欠失変異を持つ３７Ｄ６株である大腸菌Ｗ３１１０株
４０Ｂ４；及び1990年8月7日発行の米国特許第4,946,783号に開示された変異周
辺質プロテアーゼを有する大腸菌株を含む。あるいは、クローニングのインビト
ロ法、例えばＰＣＲ又は他の核酸ポリメラーゼ反応が好ましい。
【０１２７】 原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、ＰＲＯ２３０、
ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２コード化ベクターのための適切なクローニング又
は発現宿主である。サッカロミセス・セレヴィシアは、通常用いられる下等真核
生物宿主微生物である。他に、シゾサッカロミセスプロンブ(Schizosaccharomyc
es prombe)（Beach及びNurse, Nature, 290: 140 [1981]; 1985年5月2日発行のE
P 139,383）；クルベロミセスホスツ(Kluveromyces hosts)（米国特許第4,943,5
29号; Fleer等, Bio/Technology, 9: 968-975 (1991)）、例えばケーラクチス(K
. lactis)（MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt等, J. Bacteriol. 737 [1
983]）、ケーフラギリス(K. fragilis)（ATCC 12,424）、ケーブルガリクス(K.
bulgaricus)（ATCC 16,045）、ケーウィケラミイ(K. wickeramii)（ATCC 24,178
）、ケーワルチイ(K. waltii)（ATCC 56,500）、ケードロソフィラルム(K. dros
ophilarum)（ATCC 36,906; Van den Berg等, Bio/Technology, 8: 135 (1990)）
、ケーテモトレランス(K. themotolerans)及びケーマルキシアナス(K. marxianu
s)；ヤロウィア(yarrowia)（EP 402,226）；ピッチャパストリス(Pichia pastor
is)（EP 183,070; Sheekrishna等, J. Basic Microbiol, 28: 265-278 [1988]）
；カンジダ；トリコデルマレーシア(reesia)（EP 244,234）；アカパンカビ（Ca
se等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 5259-5263 [1979]）；シュワニオマイ
セス(schwanniomyces)、例えばシュワニオマイセスオクシデンタリス(occidenta
lis)（1990年10月31日発行のEP 394,538）；及び糸状真菌、例えば、ニューロス
ポラ、ペニシリウム、トリポクラジウム(Tolypocladium)（1991年1月10日発行の
WO 91/00357）；及びコウジ菌、例えば偽巣性コウジ菌（Ballance等, Biochem.
Biophys. Res. Commun., 112: 284-289 [1983]; Tilburn等, Gene, 26: 205-221
[1983]; Yelton等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1470-1474 [1984]）及
びクロカビ（Kelly及びHynes, EMBO J., 4: 475-479 [1985]）が含まれる。ここ
で好ましいメチロトロピック(methylotropic)酵母は、これらに限られないが、
ハンセヌラ(Hansenula)、カンジダ、クロエケラ(Kloeckera)、ピチア(Pichia)、
サッカロミセス、トルロプシス(Torulopsis)、及びロドトルラ(Rhodotorula)か
らなる属から選択されるメタノールで成長可能な酵母を含む。この酵母の分類の
例示である特定の種のリストは、C. Anthony, The Biochemistry of Methylotro
phs, 269 (1982)に記載されている。
【０１２８】 グリコシル化ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２をコードする核酸
の発現に適切な宿主細胞は、多細胞生物から誘導される。無脊椎動物細胞の例と
しては、ショウジョウバエＳ２及びスポドスペラＳｆ９等の昆虫細胞並びに植物
細胞が含まれる。有用な哺乳動物宿主株化細胞の例は、チャイニーズハムスター
卵巣（ＣＨＯ）及びＣＯＳ細胞を含む。より詳細な例は、ＳＶ４０によって形質
転換されたサル腎臓ＣＶ１株 (COS-7, ATCC CRL 1651);ヒト胚腎臓株（293又は
懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された293細胞、Graham等, J. Gen Vi
rol., 36:59 (1977)）;チャイニーズハムスター卵巣細胞／-ＤＨＦＲ(CHO, Urla
ub及びChasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980));マウスのセルト
リ細胞（TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)）；ヒト肺細胞 (W13
8, ATCC CCL 75); ヒト肝細胞 (Hep G2, HB 8065); 及びマウス乳房腫瘍細胞 (M
MT 060562, ATTC CCL51)を含む。適切な宿主細胞の選択は、この分野の技術常識
内にある。
【０１２９】 ｉｉｉ． 複製可能なベクターの選択及び使用 ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２をコードする核酸(例えば、ｃ
ＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ)は、クローニング(ＤＮＡの増幅)又は発現のために複
製可能なベクター内に挿入される。様々なベクターが公的に入手可能である。ベ
クターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子、又はファージの形態
とすることができる。適切な核酸配列が、種々の手法によってベクターに挿入さ
れる。一般に、ＤＮＡはこの分野で周知の技術を用いて適当な制限エンドヌクレ
アーゼ部位に挿入される。ベクター成分としては、一般に、これらに制限される
ものではないが、配列が分泌されるならば、一又は複数のシグナル配列、複製開
始点、一又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、
及び転写終結配列を含む。これらの成分の一又は複数を含む適当なベクターの作
成には、当業者に知られた標準的なライゲーション技術を用いる。 ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２は直接的に組換え手法によって
生産されるだけではなく、シグナル配列あるいは成熟タンパク質あるいはポリペ
プチドのＮ-末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドである異種性ポリ
ペプチドとの融合ペプチドとしても生産される。一般に、シグナル配列はベクタ
ーの成分であるか、ベクターに挿入されるＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲ
Ｏ３０２をコードするＤＮＡの一部である。シグナル配列は、例えばアルカリホ
スファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐあるいは熱安定性エンテロトキシンIIリ
ーダーの群から選択される原核生物シグナル配列であってよい。酵母の分泌に関
しては、シグナル配列は、酵母インベルターゼリーダー、アルファ因子リーダー
(酵母菌属(Saccharomyces)及びクルイベロマイシス(Kluyveromyces)α因子リー
ダーを含み、後者は米国特許第5,010,182号に記載されている)、又は酸ホスフォ
ターゼリーダー、白体(C.albicans)グルコアミラーゼリーダー(1990年4月4日発
行のEP362179)、又は1990年11月15日に公開されたWO 90/13646に記載されている
シグナルであり得る。哺乳動物細胞の発現においては、哺乳動物シグナル配列は
、同一あるいは関連ある種の分泌ポリペプチド由来のシグナル配列並びにウイル
ス分泌リーダーのようなタンパク質の直接分泌に使用してもよい。
【０１３０】 発現及びクローニングベクターは共に一又は複数の選択された宿主細胞におい
てベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。そのような配列は多くの細菌、
酵母及びウイルスに対してよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２に由来す
る複製開始点は大部分のグラム陰性細菌に好適であり、２μプラスミド開始点は
酵母に適しており、様々なウイルス開始点(ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイ
ルス、ＶＳＶ又はＢＰＶ)は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用
である。 発現及びクローニングベクターは、典型的には、選択可能マーカーとも称され
る選択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、(a)アンピシリン、ネオマイシン
、メトトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒
素に耐性を与え、(b)栄養要求性欠陥を補い、又は(c)例えばバシリに対する遺伝
子コードＤ-アラニンラセマーゼのような、複合培地から得られない重要な栄養
素を供給するタンパク質をコードする。 哺乳動物細胞に適切な選択可能マーカーの例は、ＤＨＦＲあるいはチミジンキ
ナーゼのように、ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２をコードする核
酸を取り込むことのできる細胞成分を同定することのできるものである。野生型
ＤＨＦＲを用いた場合の好適な宿主細胞は、Urlaub 等により, Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA, 77:4216 (1980)に記載されているようにして調製され増殖された
ＤＨＦＲ活性に欠陥のあるＣＨＯ株化細胞である。酵母菌中での使用に好適な選
択遺伝子は酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である。Stinchco
mb等, Nature, 282：39(1979)；Kingman等, Gene, 7：141(1979)；Tschemper等,
Gene, 10：157(1980)。ｔｒｐ１遺伝子は、例えば、ＡＴＣＣ番号４４０７６あ
るいはＰＥＰ４-１のようなトリプトファン内で成長する能力を欠く酵母菌の突
然変異株に対する選択マーカーを提供する。Jones, Genetics, 85:12 (1977)。
【０１３１】 発現及びクローニングベクターは、通常、ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰ
ＲＯ３０２をコードする核酸配列に作用可能に結合し、ｍＲＮＡ合成を制御する
プロモーターを含む。種々の可能な宿主細胞により認識される好適なプロモータ
ーが知られている。原核生物宿主での使用に好適なプロモーターはβ-ラクタマ
ーゼ及びラクトースプロモーター系［Cahng等, Nature, 275:615 (1978)； Goed
del等, Nature, 281:544 (1979)］、アルカリホスファターゼ、トリプトファン(
trp)プロモーター系［Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); EP 36,77
6］、及びハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃプロモーター［deBoer 等,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)］を含む。細菌系で使用するプ
ロモータもまたＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２をコードするＤＮ
Ａと作用可能に結合したシャイン・ダルガーノ(S.D.)配列を有する。 酵母宿主と共に用いて好適なプロモーター配列の例としては、３-ホスホグリ
セラートキナーゼ［Hitzeman 等, J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)］又は他の
糖分解酵素［Hess 等, J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968)；Holland, Biochem
istry, 17：4900(1987)］、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド-３-リン酸
デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフ
ルクトキナーゼ、グルコース-６-リン酸イソメラーゼ、３-ホスホグリセレート
ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコー
スイソメラーゼ、及びグルコキナーゼが含まれる。 他の酵母プロモーターとしては、成長条件によって転写が制御される付加的効
果を有する誘発的プロモーターであり、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチ
トクロムＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝と関連する分解性酵素、メタロチオネ
イン、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、及びマルトース及びガ
ラクトースの利用を支配する酵素のプロモーター領域がある。酵母菌での発現に
好適に用いられるベクターとプロモータはEP 73,657に更に記載されている。
【０１３２】 哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰ
ＲＯ３０２核酸の転写は、例えば、ポリオーマウィルス、伝染性上皮腫ウィルス
(1989年7月5日公開のUK 2,211,504)、アデノウィルス(例えばアデノウィルス２)
、ウシ乳頭腫ウィルス、トリ肉腫ウィルス、サイトメガロウィルス、レトロウィ
ルス、Ｂ型肝炎ウィルス及びサルウィルス４０(SV40)のようなウィルスのゲノム
から得られるプロモーター、異種性哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロ
モーター又は免疫グロブリンプロモーター、及び熱衝撃プロモーターから得られ
るプロモーターによって、このようなプロモーターが宿主細胞系に適合し得る限
り制御される。 より高等の真核生物による所望のＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０
２をコードするＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入すること
によって増強され得る。エンハンサーは、通常は約１０から３００塩基対で、プ
ロモーターに作用してその転写を増強するＤＮＡのシス作動要素である。哺乳動
物遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている(グロビン、エラス
ターゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン及びインスリン)。しかしながら、典
型的には、真核細胞ウィルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例とし
ては、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー(１００−２７０塩基対)、サイ
トメガロウィルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオー
マエンハンサー及びアデノウィルスエンハンサーが含まれる。エンハンサーは、
ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２をコードする配列の５’又は３’
位でベクター中にスプライシングされ得るが、好ましくはプロモーターから５’
位に位置している。 また真核生物宿主細胞(酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多細
胞生物由来の有核細胞)に用いられる発現ベクターは、転写の終結及びｍＲＮＡ
の安定化に必要な配列も含む。このような配列は、真核生物又はウィルスのＤＮ
Ａ又はｃＤＮＡの通常は５’、時には３’の非翻訳領域から取得できる。これら
の領域は、ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２をコードするｍＲＮＡ
の非翻訳部分にポリアデニル化フラグメントとして転写されるヌクレオチドセグ
メントを含む。 組換え脊椎動物細胞培養でのＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２の
合成に適応化するのに適切な他の方法、ベクター及び宿主細胞は、Gething等, N
ature, 293:620-625 (1981); Mantei等, Nature, 281:40-46 (1979); EP 117,06
0; 及びEP 117,058に記載されている。
【０１３３】 ｉｖ． 遺伝子増幅／発現の検出 遺伝子の増幅及び／又は発現は、ここで提供された配列に基づき、適切に標識
されたプローブを用い、例えば、従来よりのサザンブロット法、ｍＲＮＡの転写
を定量化するノーザンブロット法［Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,77:52
01-5205 (1980)］、ドットブロット法(ＤＮＡ分析)、又はインサイツハイブリッ
ド形成法によって、直接的に試料中で測定することができる。あるいは、ＤＮＡ
二本鎖、ＲＮＡ二本鎖及びＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二本鎖又はＤＮＡ-タン
パク二本鎖を含む、特異的二本鎖を認識することができる抗体を用いることもで
きる。次いで、抗体を標識し、アッセイを実施することができ、ここで二本鎖は
表面に結合しており、その結果二本鎖の表面での形成の時点でその二本鎖に結合
した抗体の存在を検出することができる。 あるいは、遺伝子の発現は、遺伝子産物の発現を直接的に定量する免疫学的な
方法、例えば細胞又は組織切片の免疫組織化学的染色及び細胞培養又は体液のア
ッセイによって測定することもできる。試料液の免疫組織化学的染色及び／又は
アッセイに有用な抗体は、モノクローナルでもポリクローナルでもよく、任意の
哺乳動物で調製することができる。簡便には、抗体は、天然配列ＰＲＯ２３０、
ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドに対して、又はここで提供されるＤ
ＮＡ配列をベースとした合成ペプチドに対して、又はＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１
６又はＰＲＯ３０２をコードするＤＮＡに融合し特異的抗体エピトープをコード
する外因性配列に対して調製され得る。
【０１３４】 ｖ． ポリペプチドの精製 ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドの形態は、培地又
は宿主細胞の溶菌液から回収することができる。膜結合性であるならば、適切な
洗浄液(例えばトリトン-ＸＴＭ１００)又は酵素的切断を用いて膜から引き離す
ことができる。ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドの発
現に用いられる細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破壊、又は細胞
溶解剤などの種々の化学的又は物理的手段によって破壊することができる。 ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドを、組換え細胞タ
ンパク又はポリペプチドから精製することが望ましい。適切な精製手順の例であ
る次の手順により精製される：すなわち、イオン交換カラムでの分画；エタノー
ル沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカ又はカチオン交換樹脂、例えばＤＥＡＥによるク
ロマトグラフィー；クロマトフォーカシング；ＳＤＳ-ＰＡＧＥ；硫酸アンモニ
ウム沈殿；例えばセファデックスＧ-７５を用いるゲル濾過;ＩｇＧのような汚染
物を除くプロテインＡセファロースカラム；及びＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又
はＰＲＯ３０２ポリペプチドのエピトープタグ形態を結合させる金属キレート化
カラムである。この分野で知られ、例えば、Deutcher, Methodes in Enzymology
, 182 (1990)；Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, (Sp
ringer-Verlag, New York 1982)に記載された多くのタンパク質精製方法を用い
ることができる。選ばれる精製過程は、例えば、用いられる生産方法及び特に生
産される特定のＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２の性質に依存する
。
【０１３５】 Ｄ． ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドの用途 ｉ． 心血管、内皮及び血管形成活性のアッセイ 種々のアッセイがここで記載されたポリペプチドの心血管、内皮及び血管形成
活性をテストするために使用可能である。 米国特許第5,773,414号に開示されているエンドセリンアンタゴニスト活性を
テストするアッセイには、レセプターアッセイにおけるポリペプチドのヨード化
エンドセリン-Ｉ結合を阻害する能力をテストするラット心室結合アッセイ、ウ
サギ腎動脈平滑筋細胞を使用し、放射能標識されたエンドセリン-Ｉの無傷細胞
結合性をテストするエンドセリンレセプタ結合アッセイ、機能活性が第２のメッ
セッンジャーの細胞内レベルを測定することにより、Ｒａｔ-Ｉ細胞内で測定さ
れるイノシトールホスファート蓄積アッセイ、雄のニュージーランドウサギの内
皮を使用するインビボ(単離された管)研究、及びＳＤラットを使用するインビト
ロ研究において、添加化合物の、培養血管平滑筋内に放出されるエンドセリン刺
激アラキドン酸を低減させる能力を測定するアラキドン酸放出アッセイが含まれ
る。
【０１３６】 組織生成活性のアッセイには、限定するものではないが、WO95/16035(骨、軟
骨、腱)、；WO95/05846(神経、ニューロン)、及びWO91/07491(皮膚、内皮)に記
載されているものが含まれる。 傷治癒活性のアッセイには、例えば、Eaglstein及びMertz, J. Invest. Derm
atol., 71：382-384(1978)の論文で改変されている、Winter, Epidermal Wound
Healing, Maibach, HI及びRovee, DT,編(Year Book Medical Publishers. In
c., Chicago),pp71-112に記載されているものが含まれる。 エンドセリンＢ１(ＥＴＢ１)レセプターポリペプチドに結合し、シグナル変換
活性を調節するＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドに関
連したテスト用分子のスクリーニングアッセイは、米国特許第5,773,223号に記
載されたようにして、エンドセリンＢ１レセプターポリペプチドをコードするＤ
ＮＡで形質転換した宿主細胞を提供し、テスト用候補薬に細胞を曝露し、エンド
セリンＢ１レセプターシグナル変換活性を測定する。
【０１３７】 心肥大アッセイにはいくつかある。インビトロアッセイには、成体ラット心臓
ミオサイトの拡散の誘導が含まれる。このアッセイにおいて、心室ミオサイトは
、Piperら,「Adult ventricular rat heart muscle cells」, Cell Culture Te
chniques in Heart and Vessel Research. H.M. Piper. ed(Berlin：Springer-V
erlag,1990),pp.36-60により詳細に記載されている手順を改変したものに本質的
に従って、単一の(雄のＳＤ)ラットから単離される。この手順により、成長心室
ミオサイトの単離、及び桿体フェノタイプ細胞の長期間にわたる培養が可能にな
る。フェニレフリンとプロスタグランジンＦ２α(ＰＧＦ２α)は、これら成長細
胞の転移反応を誘発することが示されている。種々の心肥大の潜在的インヒビタ
ーによる、ＰＧＦ２α又はＰＧＦ２α類似体(例えばフルプロステノール)及びフ
ェニレフリンにより誘発されるミオサイト転移阻害をついでテストする。
【０１３８】 インビボアッセイの一例は、インビボにおけるフルプロステノールにより誘発
される心肥大の阻害をテストすることである。この薬理学的モデルは、フルプロ
ステノール(ＰＧＦ２αのアゴニスト類似体)の皮下注射によりラット(例えば、
雄のWistar又はＳＤ)に誘発された心肥大を阻害するＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１
６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドの能力をテストするものである。心筋梗塞に誘
発される病的な心肥大のあるラットにおいて、心筋内のＰＧＦ２αが検出可能な
レベルまで慢性的に上昇していることが知られている。Laiら, Am. J. Physiol
.(Heart Circ. Physiol.), 271：H2197-H2208(1996)。従って、インビボでの心
筋成長におけるフルプロステノールの影響を阻害可能な因子は、心肥大の治療に
有用である可能性がある。心肥大におけるＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲ
Ｏ３０２ポリペプチドの効力は、ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２
ポリペプチドを受容しないフルプロステノール処理されたラットに対する、心臓
、心室及び左心室(体重により正規化)の重量を測定することにより決定される。
【０１３９】 インビボアッセイの他の例は、圧力負荷心肥大アッセイである。インビボテス
トにおいて、テスト用動物の腹部大動脈の収縮による圧力負荷心肥大を誘発する
ことは共通している。典型的なプロトコルにおいて、ラット(例えば雄のWistar
又はＳＤ)は麻酔処理され、各ラットの腹部大動脈を横隔膜の真下まで狭窄する
。Beznak M., Can. J. Biochem. Physiol., 33：985-94(1955)。 大動脈を外科
的切開により曝露し、短い太針を管の隣におく。大動脈を針周囲に絹糸で結紮し
て収縮させ、すぐに除去し、針の直径まで大動脈の管腔を低減させる。このアプ
ローチは、例えばRossiら, Am. Heart J., 124：700-709(1992)及びO'Rourke及
びReibel, P.S.E.M.B., 200：95-100(1992)に記載されている。
【０１４０】 また他のインビボアッセイにおいて、心肥大、続いて実験的に誘発された心筋
梗塞(ＭＩ)における効果を測定する。ラットにおいて、急性ＭＩを左冠動脈結紮
にて誘発し、さらにこれを心電図試験で確認する。また動物の擬似操作グループ
を対照動物として用意する。初期のデータには、心肥大はＭＩを有するグループ
に存在することが示され、体重に対し心臓重量は１８％増加していることが明ら
かとなった。Laiら, 上掲。心肥大の候補ブロッカー、例えばＰＲＯ２３０、Ｐ
ＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドでこれらの動物を治療し、テストした
候補薬の治療可能性についての貴重な情報を提供する。ＳＤラットを使用する、
心肥大の誘発におけるさらなるアッセイテストは米国特許第5,773,415号に開示
されている。
【０１４１】 癌において、腫瘍の病原及び進行におけるここで同定された遺伝子の役割をさ
らに理解し、天然ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドの
抗体及び他のアンタゴニスト、例えば小分子アンタゴニストを含む治療用候補薬
の効力をテストするために、種々のよく知られた動物モデルを使用することがで
きる。このようなモデルのインビボの性質は、ヒト患者に前兆となる反応を特に
起こさせるものである。腫瘍及び癌(乳癌、結腸癌、前立腺癌、肺癌等)の動物モ
デルには、非組換え及び組換え(トランスジェニク)動物が含まれる。非組換え動
物モデルには、例えば齧歯動物、例えばネズミモデルが含まれる。このようなモ
デルは標準的な技術、例えば皮下注射、尾静脈注射、脾臓移植、腹膜移植、腎嚢
下移植、又はオルソピン(orthopin)移植、例えば結腸組織に移植された結腸癌細
胞を使用し、同系のマウスに腫瘍細胞を移入することにより作成することができ
る。例えば、1997年9月18日に公開されたPCT公開番号WO97/33551を参照されたい
。
【０１４２】 おそらくは癌遺伝子の研究に最も頻繁に使用される動物種は、免疫欠損マウス
、特にヌードマウスである。胸腺刺激／形成不全を有するヌードマウスがヒト腫
瘍異種移植片用の宿主として成功裡に作用するという知見はこの目的への広範な
使用に導いた。常染色体劣性ｎｕ遺伝子は、例えばＡＳＷ、Ａ／Ｈｅ、ＢＡＬＢ
／ｃ、Ｂ１０、ＬＰ、Ｃ１７、ＣＨ３、Ｃ５７ＢＬ、Ｃ５７、ＣＢＡ、ＤＢＡ、
ＤＤＤ、Ｉ／ｓｔ、ＮＣ、ＮＦＲ、ＮＦＳ、ＮＦＳ／Ｎ、ＮＺＢ、ＮＺＣ、ＮＺ
Ｗ、Ｐ、ＲＩＩＩ及びＳＪＬを含む、非常に多数の明確に同族のヌードマウスに
導入される。さらに、ヌードマウス以外に免疫学的欠損を受け継いだ広範囲の他
の動物を育て、腫瘍異種移植片のレシピエントとして使用する。さらなる詳細は
、The Nude Mouse in Oncology Research, E. Boven及びB. Winograd. eds.(CRC
Press, Inc., 1991)を参照されたい。 このような動物に導入された細胞は周知の腫瘍／癌細胞、例えば上述にて列挙
した任意の腫瘍細胞系、例えばＢ１０４-１細胞系(ｎｅｕ原腫瘍遺伝子で形質移
入された安定ＮＩＨ-３Ｔ３細胞系)；Ｃａｃｏ-２(ＡＴＣＣ ＨＴＢ-３７)；又
は中程度に分化したグレードＩＩヒト結腸腺癌細胞系、ＨＴ-２９(ＡＴＣＣ Ｈ
ＴＢ-３８)、又は腫瘍及び癌からのものを誘導可能である。腫瘍又は癌細胞のサ
ンプルは凍結及び液体窒素での保管等を含む標準的な状態で使用され、外科手術
により患者から得ることができる。Karmaliら, Br. J. Cancer. 48：689-696(19
83)。
【０１４３】 腫瘍細胞は種々の手順によりヌードマウス等の動物に導入することができる。
腫瘍の移植には、マウスの皮下(s.c.)空間が非常に適している。腫瘍は、固体ブ
ロックとして、例えばトロカールの使用による針バイオプシー、又は細胞懸濁液
を移植することもできる。固体ブロック又はトロカール移植用に適した大きさの
腫瘍組織フラグメントが皮下空間に導入される。細胞懸濁液は一次腫瘍又は安定
腫瘍細胞系から新鮮に調製され、皮下注射される。また、腫瘍細胞は皮下移植と
して注射することもできる。この位置において、移植片は真皮結合組織の下部と
皮下組織との間に付与される。
【０１４４】 乳癌の動物モデルは、Drebinら, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 83：9129-913
3(1986)に記載されたようにして、例えばラット神経芽細胞(当初単離されたｎｅ
ｕ癌遺伝子からのもの)、又はｎｅｕ-形質転換ＮＩＨ-３Ｔ３細胞を、ヌードマ
ウスに移植することにより作成することができる。 同様に、結腸癌の動物モデルは、動物、例えばヌードマウスに結腸癌細胞を通
過させ、これらの動物に腫瘍を出現せしめることにより作成することができる。
ヌードマウスにおけるヒト結腸癌の同所移植モデルは、例えばWangら, Cancer R
esearch, 54：4726-4728(1994)及びTooら, Cancer Research, 55：681-684(1995
)により記載されている。このモデルはAntiCancer,Inc.,(San Diego, Californi
a)から販売されている、いわゆる「METAMOUSEＴＭ」に基づく。
【０１４５】 動物内で生じた腫瘍は除去され、インビトロで培養することができる。ついで
、インビトロ培養からの細胞を動物に継代させる。このような腫瘍はさらなるテ
スト又は薬剤スクリーニングを目的となりうる。あるいは、継代により得られた
腫瘍は単離可能で、継代前細胞及び一又は複数の継代段階の後に単離された細胞
のＲＮＡは、関心のある遺伝子の差次的発現用に分析される。このような継代技
術は、任意の周知の腫瘍又は癌細胞系で行うことができる。 例えば、Ｍｅｔｈ Ａ、ＣＭＳ-４、ＣＭＳ５、ＣＭＳ２１及びＷＥＨＩ-１６
４はＢＡＬＢ／ｃ雌マウス(DeLeoら, J. Exp. Med., 146：720(1977))の繊維肉
腫を化学的に誘発し、種々の薬剤の抗腫瘍活性を研究する高度に制御されたモデ
ル系を提供する。Palladinoら, J. Immunol., 138：4023-4032(1987)。簡単に言
えば、腫瘍細胞は細胞培養におけるインビトロで増殖される。動物に注射をする
前に細胞系を洗浄し、１０ｘ１０６から１０ｘ１０７細胞／ｍｌの細胞密度でバ
ッファーに懸濁させる。ついで、動物に１０から１００μｌの細胞懸濁液を皮下
注射すると、１から３週間で腫瘍が出現する。 さらに、最も詳細に研究されている試験用腫瘍の一つであるマウスのルイス肺
(３ＬＬ)癌腫を研究用腫瘍モデルとして使用することができる。この腫瘍モデル
の効力は、肺の小細胞癌腫(ＳＣＣＬ)と診断されたヒト患者における好ましい効
果と相関している。この腫瘍は、病気になったマウス、又は培養されている細胞
からの腫瘍フラグメントを注射することで、正常なマウスに導入することができ
る。Zupiら, Br. J. Cancer, 41：suppl. 4. 30(1980)。腫瘍が単一細胞の注射
から出発して、感染した細胞がかなりの高割合で生存しているという証拠が示さ
れた。この腫瘍モデルについてのさらなる情報は、Zacharski, Haemostasis, 16
：300-320(1986)を参照されたい。
【０１４６】 移植腫瘍を有する動物モデルにおける試験化合物の効力を評価する方法の一つ
は、治療前又は後の腫瘍の大きさを測定することである。伝統的に、移植腫瘍の
大きさは２又は３次元のスライドカリパスで測定される。２次元に限定する測定
は腫瘍の大きさを正確に反映せず；よって通常は数学的公式を使用し、対応する
量に転換する。しかし、腫瘍サイズの測定は非常に不正確である。候補薬の治療
効果は治療誘発性の成長が遅れ、特定の成長が遅れた場合に、より良好であると
記載することができる。腫瘍成長の記載における他の重要な変数は腫瘍量が２倍
になる時間である。また、腫瘍成長の算出及び記載のためのコンピュータプログ
ラム、例えばRygaard及びSpang-Thomsen, Proc. 6th Int. Workshop on Immune-
Deficient Animals. Wu及びSheng. eds.(Basel. 1989), p.301により報告されて
いるプログラムを入手することができる。しかし、治療後の壊死及び炎症反応は
、実際には少なくとも当初には腫瘍サイズの増加の結果となり得ることに留意さ
れるべきである。よって、これらの変化は形態計測とフローサイトメトリー分析
を組み合わせて、注意深く監視する必要がある。 さらに、組換え(トランスジェニック)動物モデルは、ここで同定されたＰＲＯ
２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２遺伝子のコード化部位を、関心のある動
物のゲノムに導入し、トランスジェニック動物を作成するための標準的な技術を
使用して加工することができる。トランスジェニック操作の標的として提供可能
な動物には、限定するものではないが、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、
ヒツジ、ヤギ、ブタ、及び非ヒト霊長類、例えばヒヒ、チンパンジー及びサルが
含まれる。このような動物に導入遺伝子を導入するための、当該技術における周
知の技術には、前核のミクロ注射(米国特許第4,873,191号)；胚へのレトロウイ
ルス媒介性遺伝子移動(例えば、Van der Puttenら, Proc. Nat. Acad. Sci. USA
, 82：6148-615(1985))；胚幹細胞における遺伝子を標的化(Thompsonら, Cell,
56：312-321(1989))；胚のエレクトロポレーション(Lo, Mol. Cell. Biol., 3：
1803-1814(1983))；及び精子媒介性遺伝子移動が含まれる。Lavitranoら, Cell,
57：717-73(1989)。レビューには、例えば米国特許第4,736,866号を参照された
い。
【０１４７】 本発明の目的において、トランスジェニック動物にはそれらの細胞の一部のみ
に導入遺伝子を担持するもの(「モザイク動物」)が含まれる。導入遺伝子は、単
一の導入遺伝子として、又は鎖状体で組み込むことができ、例えば、ヘッド対ヘ
ッド又はヘッド対テイルのタンデムで組み込むことができる。また特定の細胞系
への導入遺伝子の選択的導入は、例えばLaskoら, Proc. Nat. Acad. Sci. USA,
89：6232-636(1992)の技術に続いて可能である。 トランスジェニック動物における導入遺伝子の発現は通常の技術により監視可
能である。例えば、サザンブロット分析又はＰＣＲ増幅を導入遺伝子の統合を証
明するために使用することができる。ついで、ｍＲＮＡの発現レベルはインシト
ゥーハイブリッド形成、ノーザンブロット分析、ＰＣＲ又は免疫細胞化学等の技
術を使用して分析することができる。動物は腫瘍又は癌進行の徴候のためにさら
に試験される。
【０１４８】 また、動物の胚性細胞に導入されたＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３
０２ポリペプチドをコードする変更ゲノムＤＮＡと、ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１
６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドをコードする内在性遺伝子との間の相同的組換
えによって、ここで同定されるＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポ
リペプチドをコードする欠陥又は変更遺伝子を有する「ノックアウト」動物を構
成することができる。例えば、ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポ
リペプチドをコードするｃＤＮＡは、確立された技術に従い、該ポリペプチドを
コードするゲノムＤＮＡのクローニングに使用できる。特定のＰＲＯ２３０、Ｐ
ＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡの一部を欠
失したり、組み込みを監視するために使用する選択可能なマーカーをコードする
遺伝子等の他の遺伝子で置換することができる。典型的には、ベクターは無変化
のフランキングＤＮＡ(５’と３’末端の両方)を数キロベース含む。例えば、相
同的組換えベクターについてはThomas及びCapecchi, Cell, 51:503(1987)を参照
のこと。ベクターは胚性幹細胞に(例えばエレクトロポレーションによって)導入
し、導入されたＤＮＡが内在性ＤＮＡと相同的に組換えられた細胞が選択される
。例えば、Li等, Cell, 69:915(1992)参照。選択された細胞は次に動物(例えば
マウス又はラット)の胚盤胞内に注入されて集合キメラを形成する。例えば、Bra
dley, Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E
. J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), pp. 113-152参照。その後、キメラ
性胚を適切な偽妊娠の雌性乳母に移植し、期間をおいて「ノックアウト」動物を
つくり出す。胚細胞に相同的に組換えられたＤＮＡを有する子孫は標準的な技術
により同定され、それらを利用して動物の全細胞が相同的に組換えられたＤＮＡ
を含む動物を繁殖させることができる。ノックアウト動物は、ＰＲＯ２３０、Ｐ
ＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドが不在であることによるある種の病理
的状態及びその病理的状態の進行に対する防御能力によって特徴付けられる。
【０１４９】 ここで同定されたＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチド
に特異的に結合する抗体、及び他の候補薬の効果は、自発的動物腫瘍の治療にお
いてさらにテストすることができる。この研究のための適切な標的はネコ口部扁
平上皮細胞癌腫(ＳＣＣ)である。ネコ口部ＳＣＣは侵入性が高く、この悪性腫瘍
はネコにおいて最も一般的な口部悪性腫瘍とされ、口部腫瘍の６０％以上がこの
種において繰り返されると計測されている。それは遠くの部位にはめったに転移
しないが、転移の発生率が低いのは、この腫瘍を有するネコの生存期間が短いこ
とに反映されている。これらの腫瘍は、主としてネコの口腔の解剖学的構造によ
り、通常外科手術により処理することができない。現在では、この腫瘍に対する
効果的な治療はない。この研究に入る前に、各々のネコを完全な臨床実験用のバ
イオプシーとし、コンピュータＸ線断層撮影(ＣＴ)によりスキャンする。舌下口
部扁平上皮細胞腫瘍であると診断されたネコはこの研究から除外する。舌はこの
ような腫瘍の結果として麻痺し、治療により腫瘍が死亡しても、動物は自分自身
で食餌することができない。各々のネコを長期間繰り返し治療する。治療期間中
、腫瘍の写真を毎日取り、続いて再チェックする。治療後、各ネコを他のＣＴス
キャンにかける。ＣＴスキャンと胸部放射線写真を、その後８週間毎に評価する
。データは、対照グループに対し、生存率、反応性及び毒性において異なってい
ると評価した。ポジティブ反応は、好ましくは生存の質の改善及び／又はライフ
スパンの増加を伴う腫瘍退行の証拠を必要とする。 さらに、イヌ、ネコ及びヒヒ他の自発的動物腫瘍、例えば繊維肉腫、腺癌、リ
ンパ腫、軟骨腫、又は平滑筋肉腫もテストすることができる。もちろん、イヌ及
びネコの乳房腺癌は好ましいモデルであり、その外観及び性質はヒトのものと非
常に似ている。しかし、このモデルの使用は動物におけるこの種の腫瘍の発生率
により制限される。 また、当該技術で周知の他のインビトロ及びインビボ心血管、内皮及び血管形
成テストもここで適切である。
【０１５０】 ｉｉ． 組織分布 さらなる研究、例えば種々のヒト組織におけるｍ反応発現を測定することによ
り、ここで心血管、内皮及び血管形成アッセイの結果を証明することができる。 上述したように、種々の組織における遺伝子の増幅及び／又は発現は、ここで
提供された配列に基づき、適切に標識されたプローブを用い、例えば、従来より
のサザンブロット法、ｍＲＮＡの転写を定量化するノーザンブロット法(Thomas,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA,77:5201-5205 (1980))、ドットブロット法(ＤＮ
Ａ分析)、又はインサイツハイブリッド形成法によって測定することができる。
あるいは、ＤＮＡ二本鎖、ＲＮＡ二本鎖及びＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二本鎖
又はＤＮＡ-タンパク二本鎖を含む、特異的二本鎖を認識することができる抗体
を用いることもできる。 あるいは、種々の組織における遺伝子の発現は、遺伝子産物の発現を直接的に
定量する免疫学的な方法、例えば組織切片の免疫組織化学的染色及び細胞培養又
は体液のアッセイによって測定することもできる。試料液の免疫組織化学的染色
及び／又はアッセイに有用な抗体は、モノクローナルでもポリクローナルでもよ
く、任意の哺乳動物で調製することができる。簡便には、抗体は、天然配列ＰＲ
Ｏ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドに対して、又はここで提
供されるＤＮＡ配列をベースとした合成ペプチドに対して、又はＰＲＯ２３０、
ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ＤＮＡに融合し特異的抗体エピトープをコードす
る外因性配列に対して調製され得る。抗体生産のための一般的な技術、及びイン
シトゥーハイブリッド形成のための特定のプロトコルは以下に提供する。
【０１５１】 ｉｉｉ． 抗体結合性の研究 心血管、内皮及び血管形成アッセイに使用される内皮細胞又は他の細胞におけ
るＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドの効果を阻害する
抗ＰＲＯ２３０、抗ＰＲＯ２１６又は抗ＰＲＯ３０２抗体の能力をテストする、
心血管、内皮及び血管形成研究の結果は、抗体結合性を研究することで証明する
ことができる。抗体の例としては、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、
二重特異性及びヘテロ抱合体抗体が含まれ、その調製は以下に記載する。 抗体結合性の研究は任意の周知のアッセイ方法、例えば競合結合アッセイ、直
接及び間接サンドウィッチアッセイ、及び免疫沈降アッセイ等で行われうる。Zo
la, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, (CRC Press, Inc. 1987
)pp. 147-158 。 競合結合アッセイは、有限量の抗体との結合における、テスト用サンプルに対
して競合する標識された標準体の能力による。テスト用サンプル中の標的タンパ
ク質の量は、抗体が結合する標準体の量に対して逆比例する。結合する標準体の
量の測定を容易にするため、好ましくは抗体は競合の前後に不溶化され、抗体に
結合する分析物及び標準体は、便宜上、結合しないで残存する標準体及び分析物
から分離する。 サンドイッチアッセイでは、検出される互いに異なる免疫原部分、又はエピト
ープ、又はタンパク質に結合可能な２つの抗体が使用される。サンドイッチアッ
セイにおいて、分析されるテスト用サンプルは、固体支持体に固定化された第１
の抗体に結合し、その後、第２の抗体が分析物に結合し、よって不溶性の３部位
複合体が形成される。例えば、米国特許第4,376,100号を参照されたい。第２の
抗体は検出可能な部分で、それ自身がラベルされてもよく(直接サンドイッチア
ッセイ)、又は検出可能な部分でラベルされた抗免疫グロブリン抗体を使用して
測定してもよい(間接サンドイッチアッセイ)。例えば、一方の種類のサンドイッ
チアッセイはＥＬＩＳＡアッセイであり、この場合、検出可能な部分は酵素であ
る。 免疫組織化学において、組織サンプルは新鮮なものであるか凍結されていても
よく、パラフィンに埋設されていてもよく、防腐剤、例えばホルマリンで固定さ
れていてもよい。
【０１５２】 ｉｖ． 細胞ベースの腫瘍アッセイ 心血管、内皮及び血管形成疾患、例えば腫瘍のための細胞ベースのアッセイ及
び動物モデルは、ここで心血管、内皮及び血管形成アッセイの発見を証明し、さ
らに、ここで同定された遺伝子と所望しない心血管、内皮及び血管形成細胞成長
の進行及び病因との関係を理解するために使用可能である。所望しない心血管、
内皮及び血管形成細胞成長、例えば腫瘍の進行及び病因におけるここで同定され
た遺伝子産物の役割は、ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプ
チドにより刺激又は阻害されると同定された細胞又は細胞系を使用してテストす
ることができる。このような細胞には、例えば以下の実施例に示すものが含まれ
る。 異なるアプローチにおいて、特定の心血管、内皮及び血管形成疾患に係る周知
の細胞種の細胞を、ｃＤＮＡを用いて形質移入し、これらのｃＤＮＡが過度の成
長を誘発するか、又は成長を阻害する能力を分析する。心血管、内皮及び血管形
成疾患が癌である場合、適切な腫瘍細胞には、例えば安定腫瘍細胞系、例えばＢ
１０４-１細胞系(ｎｅｕ原腫瘍遺伝子で形質移入された安定ＮＩＨ-３Ｔ３細胞
系)及びｒａｓ-形質移入ＮＩＨ-３Ｔ３細胞が含まれ、これらは所望する遺伝子
を形質移入することができ、腫瘍形成成長を監視することができる。ついで、こ
のような形質移入細胞系を使用し、ポリ-又はモノクローナル抗体又は抗体組成
物が、形質移入細胞の成長における細胞増殖抑制又は細胞毒性活性を働かせるこ
とによる、又は抗体-依存性細胞性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を媒介することによる
腫瘍形成細胞成長を阻害する能力をテストする。さらに、ここで同定された遺伝
子のコード化配列で形質移入された細胞を、心血管、内皮及び血管形成疾患、例
えば癌の治療用の候補薬を同定するのに使用することができる。 さらに、トランスジェニック動物の腫瘍から得られた一次培養体(上述に記載)
を細胞ベースのアッセイに使用することができるが、安定細胞系が好ましい。ト
ランスジェニック動物から一定の細胞系を誘導するための技術は当該技術におい
てよく知られている。例えばSmallら, Mol. Cell. Biol., 5：642-648(1985)を
参照されたい。
【０１５３】 ｖ． 遺伝子治療 ここで、ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチド、及びポ
リペプチジルアゴニスト及びアンタゴニストは、それらのペプチドを、しばしば
遺伝子治療と呼ばれるインビトロでの発現により本発明に従って用いてもよい。 核酸（場合によってはベクター内に含まれたもの）を患者の細胞に入れるため
に：インビボ及びエキソビボという２つの主要な方法がある。インビボ送達では
、核酸は、通常はＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドが
必要とされている部位、すなわちＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２
ポリペプチドの合成部位、もし知られているならばＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６
又はＰＲＯ３０２ポリペプチドの生物学的活性が必要とされる部位(例えば傷)に
、患者に直接注入される。エキソビボ処理では、患者の細胞を取り出し、核酸を
これらの単離された細胞に導入し、修飾された細胞を患者に、直接、又は例えば
患者に埋め込まれる多孔性膜にカプセル化して投与する（米国特許第4,892,538
号及び第5,283,187号参照）。核酸を生細胞に導入するために利用可能な種々の
技術がある。これらの技術は、核酸が培養された細胞にインビトロで移入される
か、又は対象とする宿主にインビボで移入されるかに依る。哺乳動物細胞にイン
ビトロで核酸を移入するのに適した技術は、リポソーム、エレクトロポレーショ
ン、マイクロインジェクション、形質導入、細胞融合、ＤＥＡＥ-デキストラン
、リン酸カルシウム沈降法などを含む。形質導入は、複製欠陥、組換えウイルス
（好ましくはレトロウイルス）粒子の細胞レセプターとの結合、次いで粒子に含
まれる核酸の細胞への導入を含む。遺伝子のエキソビボ送達に通常用いられるベ
クターはレトロウイルスである。
【０１５４】 現在インビボ核酸移入技術で好ましいのは、ウイルス又は非ウイルスベクター
（アデノウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスＩウイルス、又はアデノ関連
ウイルス（ＡＡＶ））、及び脂質ベースの系（遺伝子の脂質媒介移入に有用な脂
質は、例えば、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ、及びＤＣ-Ｃｈｏｌである；例えば、Ton
kinson等, Cancer Investigation, 14(1): 54-65 (1996) 参照）での形質移入を
含む。遺伝子治療で使用するために最も好ましいベクターはウイルス、最も好ま
しくはアデノウイルス、ＡＡＶ、レンチウイルス、又はレトロウイルスである。
レトロウイルスベクター等のウイルスベクターは、少なくとも１つの転写プロモ
ーター／エンハンサー又は位置決定因子、あるいは選択的スプライシング、核Ｒ
ＮＡ輸出、又はメッセンジャーの翻訳後修飾などの他の手段により遺伝子発現を
制御する他の因子を含む。さらに、レトロウイルスベクター等のウイルスベクタ
ーは、ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドをコードする
遺伝子の存在下で転写されたとき、それに作用可能に結合し、翻訳開始配列とし
て機能する核酸分子を含む。このようなベクター作成物はまた、用いるウイルス
に適したパッケージングシグナル、末端反復配列（ＬＴＲ）又はその一部、及び
ポジティブ及びネガティブストランドプライマー結合部位を含む（これらがウイ
ルスベクターに既に存在しない場合）。さらに、これらのベクターは、典型的に
は、それらが配置される宿主細胞からＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３
０２ポリペプチドを分泌させるシグナル配列を含む。好ましくは、この目的のた
めのシグナル配列は哺乳動物シグナル配列、最も好ましくはＰＲＯ２３０、ＰＲ
Ｏ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドのための天然シグナル配列である。場合
によっては、ベクター作成物は、ポリアデニル化並びに一又は複数の制限部位を
指向するシグナル及び翻訳終結配列も含む。例として、このようなベクターは典
型的には５’ＬＴＲ、ｔＲＮＡ結合部位、パッケージングシグナル、第二鎖ＤＮ
Ａ合成の開始点、及び３’ＬＴＲ又はその一部を含む。非ウイルスの他のベクタ
ー、例えばカチオン性脂質、ポリリシン、及びデンドリマーを用いることもでき
る。
【０１５５】 幾つかの状況では、核酸供給源を標的細胞をターゲティングする試薬、例えば
細胞表面膜タンパク質に特異的な抗体又は標的細胞、標的細胞上のレセプターの
リガンドなどとともに提供するのが望ましい。リポソームが用いられる場合、エ
ンドサイトーシスを伴って細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質が、ター
ゲティング及び／又は取り込みの促進のために用いられ、例えば、特定の細胞型
向性のキャプシドタンパク質又はそのフラグメント、サイクリングにおいて内部
移行を受けるタンパク質の抗体、及び細胞内局在化をターゲティングし細胞内半
減期を向上させるタンパク質である。レセプター媒介エンドサイトーシスの技術
は、例えば、Wu等, J. Biol. Chem., 262:4429-4432 (1987)及びWagner等, Proc
. Natl. Acad. Sci., 87: 3410-3414 (1990)に記載されている。現在知られてい
る遺伝子標識化及び遺伝子治療プロトコールの概説については、Anderson等, Sc
ience, 256:808-813 (1992)を参照のこと。また、WO 93/25673及びそこに引用さ
れた参考文献も参照。 好適な遺伝子治療及びレトロウイルス粒子及び構造タンパク質の作成方法は、
米国特許第5,681,746号に見出される。
【０１５６】 ｖｉ． 診断法としての遺伝子の用途 また本発明は、診断法としてのＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２
ポリペプチドをコードする遺伝子の用途に関する。ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６
又はＰＲＯ３０２ポリペプチド中の変異体は腫瘍の原因であるため、変異した形
態のＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドの検出は、心血
管、内皮及び血管形成疾患、又は心血管、内皮及び血管形成疾患、例えば腫瘍へ
の感染性の診断を可能にする。 ヒトＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドをコードする
遺伝子に変異体を担持する個人は、種々の技術でＤＮＡレベルが検出される。診
断用の核酸は患者の細胞、例えば血液、尿、唾液、組織バイオプシー、及び検屍
物質から得ることができる。ゲノムＤＮＡは、分析の前にＰＣＲを使用して酵素
的に増幅させる(Saikiら, Nature, 324：163-166(1986))か、又は直接検出に使
用することができる。ＲＮＡ又はｃＤＮＡは同じ目的のために使用することがで
きる。例として、ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドを
コードする核酸に相補的なＰＣＲプライマーを、ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又
はＰＲＯ３０２ポリペプチド変異体の同定及び分析に使用することができる。例
えば、欠失及び挿入は正常な遺伝子型と比較した増幅産物の大きさの変化により
検出することができる。点変異(point mutations)は、ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２
１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドをコードする放射能標識されたＲＮＡ、又は
ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドをコードする放射能
標識されたアンチセンスＤＮＡ配列に対し、増幅ＤＮＡをハイブリッド形成させ
ることにより同定することができる。好ましい適合配列はＲＮアーゼＡ消化又は
溶解温度の相違により非適合二重鎖と区別することができる。
【０１５７】 ＤＮＡ配列の相違に基づく遺伝子テストは、変性剤を用いるか用いないで、ゲ
ル中のＤＮＡフラグメントの電気泳動移動性の変化を検出することにより達成さ
れる。小配列の欠失及び挿入は高解像度のゲル電気泳動により可視化することが
できる。異なる配列のＤＮＡフラグメントは、変性ホルムアミジン勾配ゲルにお
いて区別され、異なるＤＮＡフラグメントの移動は、特定の溶解又は部分的な溶
解温度により、ゲルの異なる位置で阻害される。例えば、Myersら, Science, 23
0：1242(1985)。 また特定の位置における配列変化はヌクレアーゼ保護アッセイ、例えばＲＮア
ーゼ及びＳＩ保護、又は化学的切断方法、例えばCottonら, Proc. Nat. Acad.
Sci. USA, 85：4397-4401(1985)により明らかになる。 よって、特定のＤＮＡ配列の欠失はハイブリッド形成、ＲＮアーゼ保護、化学
的切断、直接ＤＮＡ配列化、又は制限酵素、例えば制限フラグメント長のポリモ
ルフィズム(ＲＦＬＰ)の使用、及びゲノムＤＮＡのサザンブロット等の方法によ
り達成することができる。
【０１５８】 ｖｉｉ． 検出ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドレベ
ルの用途 より便宜的なゲル電気泳動及びＤＮＡ配列化に加えて、変異はインサイツ分析
で検出することもできる。 ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドをコードする核酸
の発現は、腫瘍形成に関連した血管の病気、又は新血管新生に連動している。Ｐ
ＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドがシグナル配列を有し
ている場合は、ｍＲＮＡは平滑筋細胞での少ない広がりに対して、内皮細胞では
高度に発現しており、このことはＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２
ポリペプチドが血清中に存在していることを示している。従って、ＰＲＯ２３０
、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドの変更レベルが腫瘍形成に関連し
た血管の病気、又は新血管新生であることを示しているために、抗ＰＲＯ２３０
、抗ＰＲＯ２１６又は抗ＰＲＯ３０２抗体は、このような疾患の診断に使用する
ことができる。 ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドに特異的な抗体を
固体支持体上に取り付け、標識されたＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３
０２ポリペプチド及び宿主から誘導されたサンプルを固体支持体に通過させる競
合アッセイを使用することもでき、固体支持体に取り付けた検出されるレベルの
量はサンプル中のＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドの
量と相関関係がある。
【０１５９】 ｖｉｉｉ． 染色体マッピング また、本発明の配列は染色体同定において重要である。配列は特異的に標的と
され、個人のヒト染色体の特定の位置にハイブリッド形成させることができる。
さらに、染色体の特定の部位を同定するために、現在必要である。実際の配列デ
ータ(反復多形性)に基づいたいくつかの染色体マーキング試薬は、現在、染色体
位置のマーキングのために入手可能である。本発明の染色体のＤＮＡマッピング
は、病気に関連した遺伝子を有する配列を相関させるために、重要な第１段階で
ある。 簡単に言えば、配列はｃＤＮＡからＰＣＲプライマー(好ましくは１５−２５
塩基対)を調製することにより、染色体にマッピングすることができる。３'-非
翻訳領域のコンピュータ分析を使用すると、ゲノムＤＮＡの一エクソン以上のス
パンではないプライマーが素早く選択され、よって増幅プロセスがより複雑にな
る。これらのプライマーを、次に、個々のヒト染色体を遺伝子を含有する体細胞
ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングに使用する。プライマーに対応するヒト遺
伝子を含有するハイブリッドのみが、増幅フラグメントを作成するであろう。 体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピングは、特定の染色体に特定のＤＮＡを割
り当てるための急速な手順である。同様のオリゴヌクレオチドプライマーを本発
明で使用すると、サブ局部限定を、類似した方法で、大きなゲノムクローンのプ
ール又は特定の染色体からのフラグメントのパネルで達成することができる。同
様に、その染色体へのマッピングに使用可能な他のマッピング方法には、インサ
イツハイブリッド形成、標識されたフローソート染色体を用いたプレスクリーニ
ング、及び染色体特異性ｃＤＮＡライブラリを組み立てるためのハイブリッド形
成によるプレ選択が含まれる。
【０１６０】 中期染色体展開へのｃＤＮＡクローンの蛍光インサイツハイブリッド形成(Ｆ
ＩＳＨ)を、一工程で厳密な染色体位置を提供するために使用することができる
。この技術は５００又は６００塩基と短いｃＤＮＡで使用することができるが；
２０００塩基対を越える長さのクローンは、単純な検出に対して十分なシグナル
強さを有する独特の染色体位置に結合する見込みが高い。ＦＩＳＨには、ＰＲＯ
２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドをコードする遺伝子を誘導
するクローンの使用が必要であり、長くなればなる程良好になる。例えば、２０
００塩基対で良好であり、４０００塩基対でより好ましく、４０００を越えても
、時間の合理的なパーセンテージの良好な結果を得るのには、おそらく必要では
ない。この技術のレビューについては、Vermaら, Human Chromosomes；a Manual
of Basic Techniques(Pergamon Press, New York. 1988)を参照されたい。 一度、配列を厳密な染色体位置にマッピングすると、染色体上の配列の物理的
位置は遺伝子地図データと相関可能である。このようなデータは、例えば、V. M
cKusick, Mendelian Inheritance in Man(Johns Hopkins University Welch Med
ical Library)に見出される。次に、同じ染色体領域にマッピングされる遺伝子
と病気の関係を連鎖アッセイにより同定する(物理的に隣接する遺伝子の共同相
続)。 次に、病気になった又は病気にならなかった個人との間のｃＤＮＡ又はゲノム
配列における差異を測定する必要がある。変異が病気になった個人の数人又は全
員み見出され、正常な個人で見出されない場合、変異は病気の原因であると思わ
れる。 物理的マッピング及び遺伝子マッピング技術の現在の解像度によれば、病気に
関連した染色体領域に厳密に位置するｃＤＮＡは、５０と５００潜在的原因遺伝
子の間の一つである(このことは、１メガベースのマッピング解像度で、２０ｋ
ｂ当たり１遺伝子であると仮定している)。
【０１６１】 ｉｘ． 候補薬のスクリーニングアッセイ 本発明は、ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドに類似
する（アゴニスト）又はＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプ
チドの効果を阻害する（アンタゴニスト）ものを同定するための化合物のスクリ
ーニング方法も包含する。アンタゴニスト候補薬のスクリーニングアッセイは、
ここに同定した遺伝子にコードされるＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３
０２ポリペプチドと結合又は複合体形成する化合物、又は他にコード化ポリペプ
チドと他の細胞性タンパク質との相互作用を阻害する化合物を同定するために設
計される。このようなスクリーニングアッセイは、それを特に小分子候補薬の同
定に適したものにする、化学的ライブラリの高スループットスクリーニングに適
用可能なアッセイを含む。 このアッセイは、タンパク質−タンパク質結合アッセイ、生化学的スクリーニ
ングアッセイ、イムノアッセイ、及び細胞ベースのアッセイで、この分野で知ら
れたものを含む種々の方式で実施される。 アンタゴニストについての全てのアッセイは、それらが候補薬をここで同定さ
れた核酸にコードされるＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプ
チドと、これら２つの成分が相互作用するのに十分な条件下及び時間で接触させ
ることを必要とすることにおいて共通する。
【０１６２】 結合アッセイにおいて、相互作用は結合であり、形成された複合体は単離され
るか、又は反応混合物中で検出される。特別な実施態様では、ここに同定された
遺伝子にコードされるＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチ
ド又は候補薬が、共有又は非共有結合により固相、例えばミクロタイタープレー
トに固定化される。非共有結合は、一般的に固体表面をＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２
１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドの溶液で被覆し乾燥させることにより達成さ
れる。あるいは、固定化されるＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポ
リペプチドに特異的な固定化抗体、例えばモノクローナル抗体を、それを固体表
面に固着させるために用いることができる。アッセイは、固定化成分、例えば固
着成分を含む被覆表面に、検出可能な標識で標識されていてもよい非固定化成分
を添加することにより実施される。反応が完了したとき、未反応成分を例えば洗
浄により除去し、固体表面に固着した複合体を検出する。最初の非固定化成分が
検出可能な標識を有している場合、表面に固定化された標識の検出は複合体形成
が起こったことを示す。最初の非固定化成分が標識を持たない場合は、複合体形
成は、例えば、固定化された複合体に特異的に結合する標識抗体によって検出で
きる。
【０１６３】 候補化合物が相互作用するがここに同定した遺伝子にコードされる特定のＰＲ
Ｏ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチに結合しない場合、そのポ
リペプチドとの相互作用は、タンパク質−タンパク質相互作用を検出するために
良く知られた方法によってアッセイすることができる。そのようなアッセイは、
架橋、同時免疫沈降、及び勾配又はクロマトグラフィカラムを通す同時精製など
の伝統的な手法を含む。さらに、タンパク質−タンパク質相互作用は、、Chevra
y及びNathans［Proc.Natl. Acad. Sci. USA 89, 5789-5793 (1991)］に開示され
ているようにして、Fields及び共同研究者等［Fiels及びSong, Nature(London)
340, 245-246 (1989); Chien等, Proc.Natl. Acad. Sci. USA 88, 9578-9582 (1
991)］に記載された酵母菌ベースの遺伝子系を用いることにより監視することが
できる。酵母菌ＧＡＬ４などの多くの転写活性化剤は、２つの物理的に別個のモ
ジュラードメインからなり、一方はＤＮＡ結合ドメインとして作用し、他方は転
写活性化ドメインとして機能する。以前の文献に記載された酵母菌発現系（一般
に「２-ハイブリッド系」と呼ばれる）は、この特性の長所を利用して、２つの
ハイブリッドタンパク質を用い、一方では標的タンパク質がＧＡＬ４のＤＮＡ結
合ドメインに融合し、他方では、候補となる活性化タンパク質が活性化ドメイン
に融合している。ＧＡＬ１-ｌａｃＺリポーター遺伝子のＧＡＬ４活性化プロモ
ーターの制御下での発現は、タンパク質-タンパク質相互作用を介したＧＡＬ４
活性の再構成に依存する。相互作用するポリペプチドを含むコロニーは、β-ガ
ラクトシダーゼに対する色素生産性物質で検出される。２-ハイブリッド技術を
用いた２つの特定なタンパク質間のタンパク質-タンパク質相互作用を同定する
ための完全なキット（MATCHMAKER(商品名)）は、Clontechから商業的に入手可能
である。この系は、特定のタンパク質相互作用に含まれるタンパク質ドメインの
マッピング、並びにこの相互作用にとって重要なアミノ酸残基の特定にも拡張す
ることができる。
【０１６４】 ここで同定されたＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチド
をコードする遺伝子と細胞内又は細胞外成分との相互作用を阻害する化合物は、
次のように試験できる：通常は反応混合物は、遺伝子産物と細胞外又は細胞内成
分を、それら２つの生成物が相互作用及び結合する条件下及び時間で含むように
調製される。候補化合物が結合を阻害する能力を試験するために、反応は試験化
合物の不存在及び存在下で実施される。さらに、プラシーボを第３の反応混合物
に添加してポジティブ対照を提供してもよい。混合物中に存在する試験化合物と
細胞内又は細胞外成分との結合（複合体形成）は上記のように監視される。試験
化合物を含有する反応混合物ではなく対照反応における複合体の形成は、試験化
合物が試験化合物とその結合パートナーとの相互作用を阻害することを示す。
【０１６５】 ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドが共有糸分裂促進
物質ＣｏｎＡの存在下で内皮細胞の増殖を刺激する能力を有している場合、スク
リーニング方法の一例では、この能力の利点が利用される。特に、増殖アッセイ
において、ヒト臍帯静脈内皮細胞を得、９６-ウェル平底培養皿(Costar, Cambri
dge, MA)で培養し、細胞の増殖を容易にするのに適切な反応混合物を補い、該混
合物はＣｏｎ-Ａ(Calbiochem, La Jolla, CA)を含有している。Ｃｏｎ-Ａ及びス
クリーニングされる化合物を添加し、３７℃でインキュベートした後、培養物を ３− Ｈチミジンで標識し、ガラス繊維フィルター上に収集する(ｐｈＤ；Cambrid
ge Technology, Watertown, MA)。３媒体の平均３−Ｈチミジン取り込み(cpm)
を、液体シンチレーション計測器を使用して測定する(Beckman Instruments. Ir
vine. CA)。有意な３−(Ｈ)チミジン混入率が内皮細胞の刺激において示された
。
【０１６６】 アンタゴニストを検定するために、上述したアッセイを行うが、このアッセイ
において、ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドはスクリ
ーニングされる化合物とともに添加してよく、ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又は
ＰＲＯ３０２ポリペプチド存在下での３−(Ｈ)チミジン導入を阻害する化合物の
能力が、化合物がＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドの
アンタゴニストであることを示す。あるいは、アンタゴニストは、ＰＲＯ２３０
、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチド及び膜結合ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ
２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドレセプター又は組換えレセプターを持つ潜
在的アンタゴニストを、競合的阻害アッセイに適した条件下で結合させることに
より検出してもよい。ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチ
ドは、放射活性等で標識でき、レセプターに結合したＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１
６又はＰＲＯ３０２ポリペプチド分子の数を潜在的アンタゴニストの有効性を決
定するのに使用できる。レセプターをコードする遺伝子は、当業者に知られた多
くの方法、例えばリガンドパンニング及びＦＡＣＳソートにより同定できる。Co
ligan等, Current Protocols in Immun., 1(2): Chapter 5 (1991)。好ましくは
、発現クローニングが用いられ、ポリアデニル化ＲＮＡがＰＲＯ２３０、ＰＲＯ
２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドに反応性の細胞から調製され、このＲＮＡ
から生成されたｃＤＮＡライブラリがプールに分配され、ＣＯＳ細胞又はＰＲＯ
２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチド反応性でない他の細胞の形
質移入に使用される。スライドガラスで成長させた形質移入細胞を標識したＰＲ
Ｏ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドに暴露する。ＰＲＯ２３
０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドは、ヨウ素化又は部位特異的タ
ンパク質キナーゼの認識部位の包含を含む種々の手段で標識できる。固定及びイ
ンキュベーションの後、スライドにオートラジオグラフィ分析を施す。ポジティ
ブプールを同定し、相互作用サブプール化及び再スクリーニング工程を用いてサ
ブプールを調製して再形質移入し、結果的に推定レセプターをコードする単一の
クローンを生成する。
【０１６７】 レセプター同定の代替的方法として、標識下ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又は
ＰＲＯ３０２ポリペプチドをレセプター分子を発現する細胞膜又は抽出調製物に
光親和性結合させることができる。架橋材料はＰＡＧＥに溶解させ、Ｘ線フィル
ムに暴露する。レセプターを含む標識複合体を励起し、ペプチドフラグメントに
分離し、タンパク質マイクロ配列決定を施すことができる。マイクロ配列から得
たアミノ酸配列は、推定レセプターをコードする遺伝子を同定するｃＤＮＡライ
ブラリをスクリーニングする分解性オリゴヌクレオチドプローブの組の設計に用
いられる。 アンタゴニストの他の検定では、レセプターを発現する哺乳動物細胞又は膜調
製物を、候補化合物の存在下で標識ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０
２ポリペプチドとともにインキュベートする。次いで、この相互作用を促進又は
阻止する化合物の能力を測定する。 心血管、内皮及び血管形成疾患の治療に有用な組成物には、限定するものでは
ないが、標的遺伝子産物の活性及び／又は発現を阻害する抗体、小有機及び無機
分子、ペプチド、リンペプチド、アンチセンス及びリボザイム分子、トリプルへ
リックス分子が含まれる。
【０１６８】 潜在的なアンタゴニストのより特別な例は、免疫グロブリンとＰＲＯ２３０、
ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドとの融合体に結合するオリゴヌクレ
オチド、特に、限られないが、ポリ-及びモノクローナル抗体及び抗体フラグメ
ント、単鎖抗体、抗-イディオタイプ抗体、及びこれらの抗体又はフラグメント
のキメラ又はヒト化形態、並びにヒト抗体及び抗体フラグメントを含む抗体を含
んでいる。あるいは、潜在的アンタゴニストは、密接に関連したタンパク質、例
えば、レセプターを認識するが効果を与えず、従ってＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１
６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドの作用を競合的に阻害するＰＲＯ２３０、ＰＲ
Ｏ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドの変異形態であってもよい。 他の潜在的なＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドアン
タゴニストは、アンチセンス技術を用いて調製されたアンチセンスＲＮＡ又はＤ
ＮＡ作成物であり、例えば、アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡは、標的ｍＲＮＡに
ハイブリッド形成してタンパク質翻訳を妨害することによりｍＲＮＡの翻訳を直
接阻止するように作用する。アンチセンス技術は、トリプルへリックス形成又は
アンチセンスＤＮＡ又はＲＮＡを通して遺伝子発現を制御するのに使用でき、そ
れらの方法はともに、ポリヌクレオチドのＤＮＡ又はＲＮＡへの結合に基づく。
例えば、ここでの成熟ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチ
ドをコードするポリペプチドヌクレオチド配列の５’コード化部分は、約１０か
ら４０塩基対長のアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドの設計に使用される。
ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に含まれる遺伝子の領域に相補的であるよう
に設計され（トリプルへリックス−Lee等, Nucl, Acid Res., 6: 3073 (1979);
Cooney等, Science, 241: 456 (1988); Dervan等, Science, 251: 1360 (1991)
参照）、それによりＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチド
の転写及び生成を防止する。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドはインビボ
でｍＲＮＡにハイブリッド形成してｍＲＮＡ分子のＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６
又はＰＲＯ３０２ポリペプチドへの翻訳を阻止する（アンチセンス−Okano, Neu
rochem., 56: 560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors o
f Gene Expression (CRC Press: Boca Raton, FL, 1988)）。上記のオリゴヌク
レオチドは、細胞に輸送され、アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡをインビボで発現
させて、ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドの生産を阻
害することもできる。アンチセンスＤＮＡが用いられる場合、翻訳開始部位、例
えば標的遺伝子ヌクレオチド配列の−１０から＋１０位置の間から誘導されるオ
リゴデオキシリボヌクレオチドが好ましい。
【０１６９】 アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡ分子は、一般的に少なくとも約５塩基長、約１
０塩基長、約１５塩基長、約２０塩基長、約２５塩基長、約３０塩基長、約３５
塩基長、約４０塩基長、約４５塩基長、約５０塩基長、約５５塩基長、約６０塩
基長、約６５塩基長、約７０塩基長、約７５塩基長、約８０塩基長、約８５塩基
長、約９０塩基長、約９５塩基長、約１００塩基長、又はそれ以上である。 潜在的アンタゴニストは、ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリ
ペプチドの活性部位、レセプター結合部位、又は成長因子又は他の関連結合部位
に結合し、それによりＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２リペプチド
の正常な生物学的活性を阻止する小分子を含む。小分子の例は、これらに限られ
ないが、小型ペプチド又はペプチド様分子、好ましくは可溶性ペプチド、及び合
成非ペプチド有機又は無機化合物を含む。
【０１７０】 リボザイムは、ＲＮＡの特異的切断を触媒できる酵素的ＲＮＡ分子である。リ
ボザイムは、相補的標的ＲＮＡへの配列特異的ハイブリッド形成、次いでヌクレ
オチド鎖切断的切断により作用する。潜在的ＲＮＡ標的内の特異的リボザイム切
断部位は、既知の技術で同定できる。更なる詳細は、例えば、Rossi, Current B
iology 4: 469-471 (1994)及びＰＣＴ公報、番号WO 97/33551（1997年9月18日発
行）を参照されたい。 転写阻害に用いられるトリプルヘリックス形成における核酸分子は一本鎖でデ
オキシヌクレオチドからなる。これらのオリゴヌクレオチドの基本組成は、フー
グスチン塩基対則を介するトリプルヘリックス形成を促進するように設計され、
それは一般に二重鎖の一方の鎖上のプリン又はピリミジンのサイズ変更可能な伸
展を必要とする。さらなる詳細は、例えば、ＰＣＴ公報、番号WO 97/33551, 上
掲を参照されたい。 これらの小分子は、上記で議論したスクリーニングアッセイの一又は複数の任
意のものにより及び／又は当業者に良く知られた他の任意のスクリーニング技術
により同定できる。
【０１７１】 ｘ． 治療される心血管、内皮及び血管形成疾患の種類 ここで記載された心血管、内皮及び血管形成アッセイにおいて活性を有し、及
び／又はそれらの遺伝子産物が心血管形に位置することが見出されているＰＲＯ
２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチド又はそれらのアゴニスト又
はアンタゴニストは、血管に影響を及ぼす全身疾患、例えば真性糖尿病を含む種
々の心血管、内皮及び血管形成疾患において治療用途を有していると思われる。
それらの治療有効性は、動脈、毛細管、静脈、及び／又はリンパ管の病気を含み
うる。以下治療例には、筋肉消耗病治療、骨粗鬆症治療、移植周囲の細胞成長を
刺激するための移植固定補助、よってその意図する部位への結合を容易にするも
の、組織又は血清中のＩＧＦ安定性の増加、適切であるならば、ＩＧＦレセプタ
ーへの結合性の増加(ＩＧＦがヒト骨髄赤血球及び顆粒球原種細胞の成長を高め
ることが、インビトロで示されているため)が含まれる。 また、ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチド又はそのア
ゴニスト又はアンタゴニストは、赤血球生成又は顆粒球生成を刺激し、傷の治癒
及び組織の再生を刺激し、組織、例えば結合組織、皮膚、骨、軟骨、筋肉、肺又
は腎臓の再成長に関連した治療に関連し、内皮細胞の移動を刺激又は阻害するた
めに使用することができる。ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリ
ペプチド又はアンタゴニストにより媒介される血管形成の増加は、虚血組織、心
臓の側枝冠動脈、続いて冠動脈狭窄に有益である。アンタゴニストはこのような
ポリペプチドの作用を阻害し、例えば傷の治癒又は胚線維症の間に、過度の結合
組織の生成を制限するために使用される。これには急性心筋梗塞及び心不全が含
まれる。
【０１７２】 さらに、本発明は原因にかかわらず、治療的有効量のＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２
１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチド、又はそれらのアゴニスト又はアンタゴニス
トを投与することによる、心肥大の治療に関する。目的がヒト患者の治療である
場合、ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドは、好ましく
は組換えヒトＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチド(ｒｈ
ＰＲＯ２３０、ｒｈＰＲＯ２１６又はｒｈＰＲＯ３０２ポリペプチド)である。
心肥大の治療は、心筋梗塞、高血圧、肥大性心筋症、及び心臓弁逆流を含む、多
種多様な病状の結果おける、その種々の段階の任意において行うことができる。
治療は、根本にある心疾患にかかわらず、心筋の構造的ダメージを有するか又は
有さない、心肥大の進行の全ての段階に広げることができる。 分子のアンタゴニストに対抗する場合、特定の指示に対し、分子それ自身又は
そのアゴニストを使用するか否かの決定は、主として、分子が新血管新生、内皮
細胞の発生、又は血管形成を促進する、又はこれらの病状を阻害するか否かに依
存する。例えば、分子が血管形成を促進する場合は、そのアンタゴニストは血管
形成の制限又は防止が所望されている疾患の治療に有用である。このような疾病
の例には、血管腫瘍、例えば血管腫、腫瘍血管形成、網膜の新血管新生、糖尿病
性網膜症又は時期尚早の幼児性網膜症又は黄斑変性及び増殖性硝子体網膜症に関
連した脈絡膜、慢性関節リュウマチ、クローン病、アテローム性動脈硬化、卵巣
過剰刺激、乾癬、新血管新生に関連した子宮内膜症、気球血管形成が続く再狭窄
、瘢痕組織過剰生成、例えば外科手術の後の形成されるケロイドのようなもの、
心筋梗塞の後の線維症、又は胚線維症に関連した線維症障害が含まれる。 しかし、分子が血管形成を阻害するならば、上述した病状の治療に直接使用さ
れることが予期される。
【０１７３】 他方、分子が血管形成を刺激する場合、指示に対し、それ自体を所望する血管
形成、例えば末梢血管病、高血圧、血管炎、レーノー病及びレーノー現象、動脈
瘤、及び動脈再狭窄、血栓静脈炎、リンパ管炎、リンパ浮腫、創傷治癒及び組織
の修復、虚血再潅流傷害、アンギナ、心筋梗塞、例えば急性心筋梗塞、慢性心疾
患、心不全、例えば鬱血性心不全、及び骨粗鬆症等に使用される。 しかし、分子が血管形成を阻害するならば、そのアンタゴニストは血管形成が
所望される病状の治療に使用される。
【０１７４】 特定の種類の病気は以下に記載され、ここでのＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又
はＰＲＯ３０２ポリペプチド又はそのアンタゴニストは疾患の予防、又は治療の
ための治療標的として、又は標的とする血管放出剤に有用なものとして提供され
る。アテローム性動脈硬化は、体液の蓄積、平滑筋細胞の増殖、及び動脈壁内の
繊維組織の形成により、動脈内の厚みが増した脈管内膜にプラークが蓄積するこ
とにより特徴付けられる病気である。病気は、任意の器官において大、中及び小
動脈を襲う。内皮及び血管平滑筋細胞機能の変化は、これらのプラークの蓄積及
び緩和を調節する、重要な役割を担っていることが知られている。
【０１７５】 高血圧は全身性動脈、肺動脈、又は門脈系において血圧が上昇することにより
特徴付けられる。上昇した血圧は、欠陥のある内皮機能及び／又は血管病に帰着
するか、又はこれらに起因する。 血管炎には、巨大細胞動脈炎、タカヤス動脈炎、多発性動脈nodosa(細小血管
障害形態を含む)、カワサキ病、微小多発性血管炎、ウェゲナー肉芽腫症、種々
の感染症関連の血管疾患(Henoch-Schonlein prupuraを含む)が含まれる。変更内
皮細胞機能はこれらの病気において重要であることが示されている。 レーノー病は及びレーノー現象は、冷気にさらされた手足を通って、循環の間
欠性異常欠陥により特徴付けられるものである。変更内皮細胞機能がこれらの病
気において重要であることが示されている。 動脈瘤は、変更内皮細胞及び／又は血管平滑筋細胞に関連した動脈又は静脈樹
状分の嚢状又は紡錘状拡張症である。 動脈再狭窄(動脈壁再狭窄)は、内皮及び血管平滑筋細胞の増殖及び機能の変更
の結果によるもので、続いて血管形成を生じる。 血栓静脈炎は及びリンパ管炎は静脈及びリンパ管の炎症性疾患であり、それぞ
れ内皮細胞機能の変更に帰着するか、及び／又は起因する。同様に、リンパ浮腫
は内皮細胞機能からのリンパ管の欠陥に関連した病状である。
【０１７６】 良性及び悪性血管腫瘍のファミリーは、血管系の細胞エレメントの異常な増殖
及び成長により特徴付けられる。例えば、リンパ管腫は、先天的で、しばしば膀
胱のリンパ系の良性腫瘍、通常新生児に生じるリンパの奇形である。膀胱腫瘍は
隣接した組織内で成長する傾向にある。膀胱腫瘍は、通常、子宮頸部及び腋か領
域に生じる。また、それらは四肢の軟組織でも生じる。主たる徴候は膨張であり
、時折、網状に構造化されたリンパ及びリンパ球(lymphocyst)は結合組織に囲ま
れている。リンパ管腫は、胎性リンパ管又はそれらの欠失に不適当に結合するこ
とに起因すると仮定されている。結果は局所的にリンパドレナージを害している
。Grienerら, Lymphology, 4: 140-144 (1971)。
【０１７７】 ここでのＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチド又はその
アンタゴニストの他の用途は、成長及び／又は転移可能な腫瘍の血管新生に関与
する腫瘍血管形成にある。このプロセスは新しい血管の成長に依存する。新生物
及び腫瘍血管形成に係る関連した病状の例には、乳癌腫、肺癌腫、胃癌腫、食道
癌腫、結腸直腸癌腫、肝臓癌腫、卵巣癌腫、テコーマ、男性胚腫、子宮頸部癌腫
、子宮内膜癌腫、子宮内膜過形成、子宮内膜症、繊維肉腫、絨毛癌、頭部及び首
部の癌、鼻咽腔癌腫、喉頭癌腫、肝臓芽腫、カポジ肉腫、黒色腫、皮膚癌腫、血
管腫、海面性血管腫、血管芽腫、膵臓癌腫、網膜癌腫、星状細胞腫、膠芽腫、シ
ュワン細胞腫、乏突起膠細胞腫、髄芽腫、神経芽腫、横紋筋肉腫、骨原性肉腫、
平滑筋肉腫、尿路肉腫、甲状腺癌腫、ウィルムス腫瘍、腎細胞癌腫、前立腺癌腫
、phakomatosesに関連した異常な血管増殖、浮腫(例えば脳腫瘍に関連したもの)
、及びMeigs症候群が含まれる。 年齢関連性斑変性(ＡＭＤ)は年輩者の集団における、ひどい視覚損失に至る原
因である。ＡＭＤの滲出形態は脈絡膜新血管新生及び網膜色素内皮細胞剥離によ
り特徴付けられる。脈絡膜新血管新生が予後の動的低下に関連しているため、Ｐ
ＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチド又はそれらのアンタゴ
ニストは、重度のＡＭＤを低減させるのに有用であることが予期される。
【０１７８】 また、外傷の治癒、例えば傷の治癒及び組織の修復は、ここでのＰＲＯ２３０
、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチド又はそれらのアンタゴニストが目
的とする用途である。新しい血管の形成及び緩和は、本質的に組織の治癒及び修
復である。この範疇には、骨、軟骨、腱、靱帯、及び／又は神経組織の成長又は
再生、並びに傷の治癒及び組織の再生及び交換、及び火傷、切断、及び潰瘍の治
療が含まれる。骨が正常に形成されない環境で軟骨及び／又は骨の成長を誘発す
るＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチド又はそのアンタゴ
ニストは、骨折及び軟骨のダメージ、又はヒト及び他の動物の欠損の治療に適用
される。ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドまたはその
アンタゴニストを使用するこのような調製物は、骨折の低減及び人工関節の固定
の改善において予防的に使用される。骨形成剤により誘発される新たな骨の形成
は、先天的、外傷誘発性、又は腫瘍学的、切除誘発性頭蓋欠損の修復に寄与し、
また美容形成外科においても有用である。
【０１７９】 さらに、ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチド又はその
アンタゴニストは、限定するものではないが、圧迫潰瘍、血管不全に関連した潰
瘍、外科的又は外傷的な傷等を含む治癒していない傷を、より良好により早く閉
塞させることを促進させるのに有用である。 またさらに、ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチド又は
そのアンタゴニストは、他の組織、例えば器官(例えば、膵臓、肝臓、腸、腎臓
、配列又は内皮を含む)、筋肉(平滑筋、骨格筋又は心筋)、及び血管(血管内皮を
含む)組織の生成又は再生、又はこのような組織を含む細胞成長の促進活性を示
し得る。所望の効果の一部は、線維性瘢痕化を阻害又は調節して、正常な組織を
再生することである。 またここでのＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチド又は
そのアンタゴニストは、全身的サイトカインダメージからの病状、及び種々の組
織における傷の再灌流、肺又は肝臓線維症の治療、及び再生又は保護に有用であ
る。また、ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチド又はその
アンタゴニストは、先駆組織又は細胞からの上述した組織の分化を促進又は阻害
、又は上述した組織の成長を阻害するのに有用である。 さらに、ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチド又はその
アンタゴニストは歯周病の治療及び他の歯修復プロセスに使用することができる
。このような薬剤は骨形成細胞を誘引し、骨形成細胞の成長を刺激し、又は骨形
成細胞の原種の分化を誘発する環境で提供される。ここでのＰＲＯ２３０、ＰＲ
Ｏ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチド又はそのアンタゴニストは、血管が、骨
の回転及び成長の調節において重要な役割を担っているため、骨粗鬆症又は骨関
節症の、例えば骨及び／又は軟骨修復を刺激、又は炎症プロセスにより媒介され
る組織破壊(コラゲナーセ活性、破骨細胞等)のプロセス又は炎症をブロックする
ことによる治療に有用である。
【０１８０】 ここでのＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチド又はその
アンタゴニストにあるとされる組織再生活性の他の範疇は、腱／靱帯形成である
。組織が通常形成されない環境での腱／靱帯様組織又は他の組織形成を誘発する
タンパク質は、ヒト及び他の動物の腱又は靱帯の裂け目、奇形、及びの腱又は靱
帯の欠損の治癒に適用される。このような調製物は、腱又は靱帯組織へのダメー
ジの予防、並びに腱又は靱帯の骨又は他の組織への固定の改善、及び腱又は靱帯
組織の欠損の修復において予防的に使用される。ここでのＰＲＯ２３０、ＰＲＯ
２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチド又はそのアンタゴニストの組成物により誘
発される新しい腱／靱帯様組織形成は、先天的、外傷誘発性、又は他の由来によ
る腱又は靱帯のたの欠損の修復に寄与し、また腱又は靱帯の取り付け又は修復の
ための美容形成外科においても有用である。ここでの組成物は、腱-又は靱帯-形
成細胞を誘引、腱-又は靱帯-形成細胞の成長を刺激、腱-又は靱帯-形成細胞原種
の分化を誘発、又はイクスビボでの回復インビボでの組織修復効果における腱／
靱帯細胞又は原種の成長を誘発する環境で提供される。また、ここでの組成物は
、腱炎、手根管症候群、及び他の腱又は靱帯欠損にも有用である。さらに組成物
は、当該技術でよく知られている担体と同じ適切なマトリクス及び／又は金属イ
オン封鎖剤の含む。
【０１８１】 ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチド又はそのアンタゴ
ニストは神経細胞の増殖、及び神経及び脳組織の再生、すなわち神経細胞又は神
経組織の変性、死亡又は外傷に関与する中枢及び末梢神経系の病気及び神経障害
、並びに機械的又は外傷的疾患の治療に有用である。特に、ＰＲＯ２３０、ＰＲ
Ｏ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチド又はそのアンタゴニストは、末梢神経系
の病気、例えば末梢神経損傷、末梢神経障害及び局所的神経障害、及び中枢神経
系の病気、例えばアルツハイマー病、パーキンソン病、ハンティングドン病、筋
萎縮性側索硬化症、及びシャイ・ドレーガー症候群の治療に使用される。本発明
で治療されるさらなる病状には、機械的又は外傷的疾患、例えば脊髄疾患、頭部
外傷及び脳血管疾患、例えば脳卒中が含まれる。また、化学療法又は他の医学的
療法の結果による末梢神経障害も、ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０
２ポリペプチド又はそのアンタゴニストを使用しての治療が可能である。 虚血-再潅流傷害は他の徴候である。内皮細胞機能不全は虚血-再潅流傷害が続
いて生じる事象の後遺症の開始及び調節の両方において重要である。 慢性関節リュウマチはさらなる徴候である。血管成長及び脈管構造を通過する
炎症細胞の標的は、関節炎のリュウマチ様及び血清ネガティブの形態の病因の重
要な要因である。
【０１８２】 また、ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチド又はそのア
ンタゴニストは、病状の進行の防止、無症候性の患者の死を含む急死の回避のた
めに、心肥大を有する患者に予防的に投与される。このような予防的治療は大き
な左心室心肥大(成人においては最大壁厚が３５ｍｍ又はそれ以上、又は子供に
おいてはそれに匹敵する値)のケース、又は心臓における血管腫の負荷が特に強
くなった場合の例において、特に正当である。 さらにＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチド又はそのア
ンタゴニストは、肥大性心筋症と診断された患者のかなりの部分に発現する、心
房細動の治療に有用である。 さらなる徴候には、アンギナ、心筋梗塞、例えば急性心筋梗塞、及び心不全、
例えば鬱血性心不全が含まれる。さらなる、非新生物病状には乾癬、糖尿病、及
び時期尚早の網膜症、水晶体後方繊維増殖症、新血管緑内障を含む他の増殖性網
膜症、甲状腺過形成(グレーブス病を含む)、角膜及び他の組織の移植、慢性的炎
症、肺炎、ネフローゼ症候群、子癇前症、心膜滲出(例えば心膜炎に関連するも
の)、及び胸膜滲出が含まれる。 上述した観点から、内皮細胞機能、増殖及び／又は形態を変更又はこれに衝撃
を与えると示されている、ここで記載されたＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰ
ＲＯ３０２ポリペプチド、又はそのアゴニスト又はアンタゴニストは、上述した
多くの又は全ての疾患の原因及び病因において重要な役割を担っており、これら
の疾患を標的とする血管関連剤、又はこれらのプロセスを増大又は阻害するため
の治療標的として提供可能であると思われる。
【０１８３】 ｘｉ． 投与プロコトール、スケジュール、用量及び調製 ここに記載された分子及びそれらのアゴニスト及びアンタゴニストは、上述し
た種々の疾患及び病気の予防及び治療薬として製薬的に有用である。 ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチド又はアゴニスト又
はアンタゴニストの治療用組成物は、適当な純度を持つ所望の分子を任意の製薬
的に許容可能な担体、賦形剤、又は安定化剤（Remington's Pharmaceutical Sci
ences, 16th edition, Osol, A.編, (1980)）と、凍結乾燥した製剤又は水溶液
の形態で混合することにより調製することができる。許容可能な担体、賦形剤、
又は安定化剤は、好ましくは用いられる投与量及び濃度で受容者に非毒性であり
、リン酸塩、クエン酸炎、及び他の有機酸などのバッファー；アスコルビン酸及
びメチオニンを含む酸化防止剤；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモ
ニウムクロライド；ヘキサメトニウムクロライド；ベンザルコニウムクロライド
；ベンゼトニウムクロライド；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；メ
チル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール
；シクロヘキサノール；３-ペンタノール；及びｍ-クレゾール）；低分子量（約
１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン
等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタ
ミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリシン等のアミノ酸；グル
コース、マンノース、又はデキストランを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化
物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース又はソ
ルビトール等の糖；ナトリウム等の塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ-
タンパク質錯体）；及び／又はＴＷＥＥＮＴＭ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭ又はポ
リエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤を含む。
【０１８４】 このような担体の更なる例は、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミ
ニウム、レシチン、血清アルブミン、例えばヒト血清アルブミン、緩衝物質、例
えばリン酸塩、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物脂肪酸の
部分的グリセリド混合物、水、塩、又は電解質、例えば硫酸プロタミン、リン酸
水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイダル
シリカ、マグネシウムトリシリケート、ポリビニルピロリドン、セルロースベー
スの物質、及びプロピレングリコールである。局所用の担体又はゲルベースの形
態は、ナトリウムカルボキシメチルセルロース又はメチルセルロース等の多糖類
、ポリビニルピロリドン、ポリアクリレート、ポリオキシエチレン−ポリオキシ
プロピレンブロックコポリマー、ポリエチレングリコール、及びモクロウアルコ
ールを含む。あらゆる投与について、従来のデポー形態が好適に用いられる。こ
のような形態は、例えば、マイクロカプセル、ナノ-カプセル、リポソーム、硬
膏剤、吸入形態、鼻スプレー、舌下状錠剤、及び除放性製剤を含む。ＰＲＯ２３
０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチド又はアゴニスト又はアンタゴニ
ストは、典型的にはそのような媒体中に約０．１ｍｇ／ｍｌから１００ｍｇ／ｍ
ｌの濃度で処方される。
【０１８５】 他の調製物は、形成された製品中に、ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ
３０２ポリペプチド又はそれらのアンタゴニストを導入して含有される。このよ
うな製品は内皮細胞の成長及び血管形成の調節に使用することができる。加えて
、腫瘍侵入及び転移をこれらの製品で調節してよい。 インビボ投与に用いられるＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリ
ペプチド又はアンタゴニストは無菌でなければならない。これは、凍結乾燥及び
再形成の前又は後の滅菌濾過膜を通した濾過によって容易に達成される。ＰＲＯ
２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドは通常は凍結乾燥形態又は
全身投与される場合には溶液中に貯蔵される。凍結乾燥形態にある場合、ＰＲＯ
２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチド又はアゴニストは典型的に
は使用時の適当な希釈剤を含む他の成分と組み合わせて処方される。ＰＲＯ２３
０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチド又はアンタゴニストの液体製剤
の例は、無菌の、透明な、無色の生鮮溶液で、皮下注射用の１回投与バイアルに
充填されている。繰り返し使用に適切な防腐製薬組成物は、例えばポリペプチド
の種類及び指示に主として依存し、 ａ）ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチド又はそれらのア
ゴニスト又はアンタゴニスト； ｂ）溶液中のポリペプチド又は他の分子の安定性を最大にする範囲内のｐＨ、好
ましくは約４-８のｐＨを維持可能なバッファー； ｃ）主として、撹拌誘発性集合体に対しポリペプチド又は分子を安定化させる洗
浄剤／界面活性剤； ｄ）等張剤； ｅ）フェノール、ベンジルアルコール及びベンゼトニウムハロゲン化物、例えば
塩化物の群から選択される防腐剤；及び ｆ）水； を含有し得る。
【０１８６】 使用される洗浄剤が非イオン性であるならば、それは、例えばポリソルベート
(例えば、POLYSORBATEＴＭ(TWEENＴＭ)２０、８０等)、ポロキサマー(例えば、P
OLOXAMERＴＭ１８８等)であってよい。非イオン性界面活性剤を使用することに
より、タンパク質の変性を引き起こすことなく、表面応力の剪断に調製物をさら
すことができる。さらに、このような界面活性剤含有調製物は、エアゾール装置
、例えば静脈投与、及びニードレスジェッ注入ガンに使用されるものにおいて、
使用され得る(例えば、EP257,956を参照されたい)。 等張剤は、ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチド又はそ
のアゴニスト又はアンタゴニストの液体組成物を確実に等浸透圧とするために存
在し、多価糖アルコール、好ましくは３価又は高級糖アルコール、例えばグリセ
リン、エリトリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール及びマンニ
トールが含まれる。これらの糖アルコールは、単独で、又は組合せて使用するこ
ともできる。また、塩化ナトリウム又は他の適切な塩を、溶液を等にするために
使用してもよい。
【０１８７】 バッファーは、所望するｐＨに応じて、アセタート、シタラート、スクシナー
ト又はホスファートバッファーであってよい。本発明の液状調製物の一種類のｐ
Ｈは、約４から８、好ましくはほぼ生理学的ｐＨの範囲に緩衝される。 防腐剤、フェノール、ベンジルアルコール及びベンゼトニウムハロゲン化物、
例えば塩化物は、使用可能な周知の抗菌薬である。 治療用ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチド組成物は、
一般的に無菌のアクセスポートを具備する容器、例えば、静脈内溶液バッグ又は
皮下注射針で穿孔可能なストッパーを具備するバイアルに配される。製剤は、好
ましくは静脈内（ｉ．ｖ．）、皮下（ｓ．ｃ．）、又は筋肉内（ｉ．ｍ．）の繰
り返し注射として、あるいは鼻内又は肺内送達に適したエアロゾル製剤として投
与される（肺内送達については、例えばEP 257,956参照）。
【０１８８】 また、ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドは持続放出
製剤の形態で投与することもできる。持続放出製剤の好適な例は、タンパク質を
含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、当該マトリクスは成形物、
例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態である。持続放出マトリクスの例は
、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、Langer等, J. Biomed. Mater. Res., 15
: 167-277 (1981)及びLanger, Chem. Tech., 12: 98-105 (1982)に記載されたよ
うなポリ(２-ヒドロキシエチル-メタクリレート)、又はポリ(ビニルアルコール)
）、ポリアクチド（米国特許第3,773,919号、EP 58,481）、Ｌ-グルタミン酸及
びガンマエチル-Ｌ-グルタメートのコポリマー（Sidman等, Biopolymers, 22: 5
47-556 (1983)）、非分解性エチレン−酢酸ビニル（Langer等, 上掲）、分解性
乳酸−グリコール酸コポリマー、例えばLupron DepotＴＭ（乳酸−グリコール酸
コポリマ及び酢酸ロイプロリドからなる注射可能な微小球）、及びポリ-Ｄ-(−)
-３-ヒドロキシブチル酸（EP 133,988）を含む。 エチレン−酢酸ビニルや乳酸−グリコール酸等の重合体は１００日以上分子を
放出できるが、特定のヒドロゲルはより短い時間タンパク質を放出する。カプセ
ル化タンパク質は、長時間体内に残存すると、３７℃で水分に曝されることで、
変性又は凝集し、生理活性の喪失や免疫原生の変化のおそれがある。かかる機構
によって安定性を得るための合理的な処置が考えられる。例えば、凝集機構がチ
オ−ジスルフィド交換による分子間Ｓ―Ｓ結合であることが分かったら、スルフ
ヒドリル残基を変更し、酸性溶液から凍結乾燥し、水分量を調整し、適当な添加
物を使用し、特定の重合体マトリクス化合物を開発することで安定性を保証する
ことができる。、 ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドの持続放出組成物
は、リポソーム的に包括されたＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポ
リペプチドを含む。ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチド
を含有するリポソームは、それ自体周知である方法、例えば、DE 3,218,121、Ep
steinほか, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688-3692 (1985)、Hwangほか, P
roc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4030-4034 (1980)、EP 52,322、EP 36,676、EP
88,046、EP 143,949、EP 142,641、特願昭58-118008、米国特許第4,485,045号
及び第4,544,545号、及びEP 102,324等による方法によって調製する。通常、リ
ポソームは、脂質含有量が約３０モル％以上コレステロールであり、選択される
割合が最適な治療法に対して調整された微小（約２００-８００オングストロー
ム）な単層状のものである。
【０１８９】 ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチド又はそのアンタゴ
ニストの治療的有効量は、当然のことながら、治療すべき病理学的状態(予防を
含む)、投与方法、治療に用いられる化合物の型、包含される任意の同時治療、
患者の年齢、体重、一般的な医学的状態、医学的履歴などの要因によって変化し
、それは担当する医師の技量の範囲内で良好に決定される。従って、治療者は、
最大の治療効果が得られるように、投与量を滴定し投与経路を修正する必要があ
る。ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドが限られた範囲
の宿主を有しているならば、ヒトの患者の治療には、ヒトＰＲＯ２３０、ＰＲＯ
２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチド、より好ましくは天然配列ヒトＰＲＯ２３
０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドを含有する調製物であることが
好ましい。臨床医は投与量が当該病状の治療において所望する効果が得られるま
で、ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドを投与するであ
ろう。例えば、目的がＣＨＦの治療である場合、この病状に関連した進行性心肥
大を阻害する量とされる。この治療及び進行状況は、エコーカルジオグラフィー
により容易に監視される。同様に、肥大性心筋症の患者には、経験に基づいてＰ
ＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドを投与することができ
る。 上記の指針では、有効投与量は、一般的に約０．００１から約１．０ｍｇ／ｋ
ｇ、好ましくは約０．０１−１．０ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは約０．０１−０
．１ｍｇ／ｋｇの範囲内である。
【０１９０】 成人の高血圧の治療におけ非経口用途では、注射の形態で、体重１ｋｇ当たり
約０．０１から５０ｍｇ、好ましくは約０．０５から２０ｍｇ、最も好ましくは
１から２０ｍｇのＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドを
、静脈内注射により１日に１から３回投与するのが有利である。経口投与では、
ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドをベースとする分子
を、好ましくは体重１ｋｇ当たり約５ｍｇから１ｇ、好ましくは約１０から１０
０ｍｇ、１日に１から３回投与する。内毒素汚染物質、安全レベルの最小量、例
えば０．５ｎｇ／ｍｇタンパク質未満に保持すべきである。さらにヒト投与では
、調製物は好ましくは滅菌され、発熱性であり、一般的に安全で、FDA Office a
nd biologics standardsで要求されるようにして精製される。 組織再生に使用されるＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプ
チドを含有する製薬組成物の用量は、ポリペプチドの作用を変える種々の要因、
例えばを、形成が望まれる組織(例えば骨)の重量、患者の年齢、性別、食餌、感
染症の重傷度、投与時間、及び他の臨床的要因を考慮して、担当する医師により
決定されるであろう。用量は、再構成に使用されるマトリクスの種類、製薬組成
物の他のタンパク質含有物により変わり得る。例えば、他の周知の成長因子、例
えばＩＧＦ−Ｉを最終組成物に添加すると、さらに用量に影響を与える。進行状
況は組織／骨の成長及び／又は修復を、例えばＸ線、組織形態測定(histomorpho
metric determinations)及びテトラサイクリン標識化により、定期的にひょかす
ることにより監視可能である。
【０１９１】 ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチド又はアンタゴニス
ト又はアゴニスト投与の経路は周知の方法に従い、例えば静脈内、筋肉内、脳内
、腹腔内、脳脊髄内、皮下、眼内、関節内、滑膜内、包膜内、経口、局所又は吸
入経路による注射又は注入、あるいは以下に記載する持続放出系による。またＰ
ＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチド又はそれらのアンタゴ
ニストは腫瘍内、腫瘍周辺、病巣内、又は病巣周辺経路で好適に投与され、局所
的並びに全身に治療効果を発揮する。腹腔内経路は、例えば卵巣腫瘍の治療に特
に有用であることが予期されている。
【０１９２】 ペプチド又は小分子がアンタゴニスト又はアゴニストとして使用される場合、
好ましくは、液体又は固体の形態で経口的又は非経口的に哺乳動物に投与される
。 塩の形態であり、下記において有用な分子の薬理学的に許容可能な塩類の例に
は、アルカリ金属塩(例えばナトリウム塩、カリウム塩)、アルカリ土類金属塩(
例えばカルシウム塩、マグネシウム塩)、アンモニウム塩、有機塩基塩(例えばピ
リジン塩、トリエチルアミン塩)、無機酸塩(例えば塩酸、硫酸塩、硝酸塩)及び
有機酸塩(例えば酢酸塩、シュウ酸塩、ｐ-トルエンスルホン酸塩)が含まれる。
【０１９３】 ここで記載され、骨、軟骨、腱、又は靱帯再生に有用な組成物における治療方
法には、移植又は装置としての、局所的(topically)、全身的又は局部的(locall
y)な組成物の投与が含まれる。投与した場合、有用な治療用組成物は、発熱物質
を含有しない生理学的に許容可能形態である。さらに組成物は、骨、軟骨又は組
織のダメージ部位に送達される粘性のある形態で注射されるかカプセル化される
ことが望ましい。局所的投与は傷の治癒及び組織の修復に適している。好ましく
は、骨及び／又は軟骨の形成のためには、組成物は、骨及び／又は軟骨のダメー
ジ部位にタンパク質含有組成物を送達せしめ、好ましくは体内に再吸収可能な骨
及び軟骨を発育する構造体を提供することのできるマトリクスを含む。このよう
なマトリクスは他の移植医療用途に使用される材料で作成される。 マトリクス材料の選択は、生物学的融和性、生物分解性能、機械的特性、美容
的外観、及び界面活性に基づく。組成物の特定の用途は、適切な処方により定義
される。組成物の潜在的マトリクスは生物分解性であり、化学的に定義される硫
酸カルシウム、リン酸三カルシウム、ヒドロキシアパタイト、ポリ乳酸、ポリグ
リコール酸、及びポリ無水物であってよい。他の潜在的マトリクスは生物分解性
で生物学的に明確に定義された、例えば骨又は真皮コラーゲンである。さらなる
マトリクスは純粋タンパク質又は細胞外マトリクス成分からなる。他の潜在的マ
トリクスは、非生物分解性であり、化学的に定義された、例えば焼結ヒドロキシ
アパタイト、生体ガラス、アルミナート、又は他のセラミックスである。マトリ
クスは上述した任意の種類の材料、例えばポリ乳酸とヒドロキシアパタイト又は
コラーゲンとリン酸三カルシウムの組合せからなるものであってもよい。生物セ
ラミックは組成において、例えばカルシウム-アルミナート-ホスファートに変え
てもよく、孔サイズ、粒子サイズ及び生物分解性能を変更するためのプロセスが
施されていてもよい。
【０１９４】 特定の一実施態様では、乳酸とグリコール酸が５０：５０(モル重量)のコポリ
マーであり、１５０から１８０ミクロンの範囲の直径を有する多孔質粒子の形態
である。いくつかの用途において、金属イオン封鎖剤、例えばカルボキシメチル
セルロース、又は自己移植血塊を利用し、マトリクスからの分離から組成物を保
護するのに有用である。 一好適なファミリーの金属イオン封鎖剤は、セルロース材料、例えばメチルセ
ルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピ
ルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース及びカルボキシメチルセル
ロースを含むアルキルセルロース(ヒドロキシアルキルセルロースを含む)であり
、好ましくはカルボキシメチルセルロース(ＣＭＣ)のカチオン塩である。他の好
ましい金属イオン封鎖剤には、ヒアルロン酸、アルギニン酸ナトリウム、ポリ(
エチレングリコール)、ポリオキシエチレンオキシド、カルボキシビニルポリマ
ー、及びポリ(ビニルアルコール)が含まれる。ここで有用な金属イオン封鎖剤の
量は、調製物の全量に基づき、０．５−２０重量％、好ましくは１−１０重量％
であり、ポリマトリクスからのポリペプチド(又はそのアンタゴニスト)の脱着を
防止し、組成物に適切な操作性を付与し、さらに原細胞のマトリクスへの浸透を
防止し、よって、ポリペプチドに原細胞の骨形成活性を助長する機会を付与する
のに必要な量である。
【０１９５】 ｘｉｉ． 組合せ治療 当問題となる疾患の防止又は治療におけるＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰ
ＲＯ３０２ポリペプチド、アミンそのアゴニスト又はアンタゴニストの効力は、
同じ組成物又は別個の組成物において、これらの目的のために有効な他の薬剤と
組合せるか、又は活性剤を連続して投与することにより改善される。 例えば、心肥大の治療のためには、ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３
０２ポリペプチド治療は、周知の心筋ミオサイト肥大因子のインヒビター、例え
ばフェニレフリン等のα-アドレナリンアゴニストのインヒビター；エンドセリ
ン-Ｉインヒビター、例えばBOSENTANＴＭ及びMOXONODINＴＭ；ＣＴ-１に対する
インヒビター(米国特許第5,679,545号)；ＬＩＦに対するインヒビター；ＡＣＥ
インヒビター；デス-アスパラタート-アンギオテンシンＩインヒビター(米国特
許第5,773,415号)及びアンギオテンシンＩＩインヒビターの投与を組合せること
ができる。 高血圧に関連した心肥大の治療のためには、ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又は
ＰＲＯ３０２ポリペプチドを、β-アドレナリン様レセプターブロック剤、例え
ばプロプラノロール、チモロール、タータロロール、カルテオロール、ナドロー
ル、ベタキソロール、ペンブトロール、アセトブトロール、アテノロール、メト
プロロール、又はカーベジルロール；ＡＣＥインヒビター、例えばクイナピリル
、カプトプリル、エナラプリル、ラミプリル、ベナゼプリル、フォシノプリル又
はリシノプリル；ジウレティクス、例えばクロロチアザイド、ヒドロクロロチア
ザイド、ヒドロフルメタザイド、メチルクロチアザイド、ベンズチアザイド、ジ
クロロフェナミド、アセタゾラミド、又はインダパミド；及び／又はカルシウム
チャンネルブロッカー、例えばジルチアゼム、ニフェジピン、ベラパミル又はニ
カルジピンと組合せて投与することができる。一般名によりここで同定された治
療薬を遺伝子製薬用組成物は市販されており、用量、投与方法、副作用、禁忌等
の製造者の使用説明書に従い投与される。例えば、Physicians'Desk Reference(
Medical Economics Data Production Co.：Montvale, N.J., 1997), 51th版を参
照されたい。
【０１９６】 心肥大の治療における組合せ治療用の好ましい候補薬は、β-アドレナリン様
レセプターブロック剤(プロプラノロール、チモロール、タータロロール、カル
テオロール、ナドロール、ベタキソロール、ペンブトロール、アセトブトロール
、アテノロール、メトプロロール、又はカーベジルロール）、ベラパミル、ジフ
ェジピン、又はジルチアゼムである。高血圧を伴う肥大の治療には、カルシウム
チャンネルブロッカー、例えばジルチアゼム、ニフェジピン、ベラパミル及びニ
カルジピン；β-アドレナリン様レセプターブロック剤；ジウレティクス、例え
ばクロロチアザイド、ヒドロクロロチアザイド、ヒドロフルメタザイド、メチル
クロチアザイド、ベンズチアザイド、ジクロロフェナミド、アセタゾラミド、又
はインダパミド；及び／又はＡＣＥインヒビター、例えばクイナピリル、カプト
プリル、エナラプリル、ラミプリル、ベナゼプリル、フォシノプリル又はリシノ
プリルを使用する、抗高血圧治療薬の使用が必要である。
【０１９７】 他の徴候のために、ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチ
ド又はそれらのアンタゴニストは、当該問題における骨及び／又は軟骨欠損、傷
又は組織の治療に有用な他の薬剤と組合せてもよい。このような薬剤には、種々
の成長因子、例えばＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ-α又はＴＧＦ-β、ＩＧＦ、ＦＧ
Ｆ、及びＣＴＧＦが含まれる。 加えて、癌の治療に使用されるＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２
ポリペプチド又はそれらのアンタゴニストは、上述にて同定したような細胞毒性
薬、化学治療薬又は成長阻害薬と組合せられる。また癌の治療のために、ＰＲＯ
２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチド又はそのアンタゴニストは
適切に連続投与されるか、又は、放射活性物質の照射又は投与を含んでも含まな
くても、放射線学的治療と組合せられる。 ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチド又はそのアンタゴ
ニストと組合せて投与される治療薬の有効量は、医師又は獣医の裁量による。投
与量とその調節は処理される病状に最大の治療効果が達成されるようになされる
。例えば、高血圧の治療においては、これらの量は、理想的にはジウレティクス
又はデジタルの使用、及び高血圧又は低血圧、腎損傷等を考慮に入れる。用量は
、治療される特定の患者及び使用される治療薬の種類等の因子に依存する。典型
的には、使用される量は、治療薬をＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０
２ポリペプチドと共に投与しない場合と同じ用量である。
【０１９８】 ｘｉｉｉ． 製造品 上述した疾患の診断又は治療に有用なＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ
３０２ポリペプチド又はそのアンタゴニストを含むキットのような製造品は、少
なくとも１つの容器及びラベルを具備する。適切な容器には、例えばボトル、バ
イアル、シリンジ及び試験管が含まれる。容器はガラス又はプラスチックのよう
な種々の物質から形成できる。容器は、状態の診断又は治療に有効な組成物を収
容し、無菌のアクセスポートを有し得る（例えば、容器は皮下注射針で穿孔可能
なストッパーを具備する静脈内バッグ又はバイアルであってよい）。組成物中の
活性剤はＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチド又はそのア
ゴニスト又はアンタゴニストである。容器上又は添付されるラベルには、組成物
が選択した状態の診断又は治療に使用されることが示されている。この製造品は
、製薬的に許容可能なバッファー、例えばリン酸緩衝塩水、リンガー液、及びデ
キストロース溶液を収容した第２の容器をさらに具備してもよい。さらに、他の
バッファー、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、及び使用説明書を備えた包装
挿入物を含む、商業的及び使用者の立場から望ましい他の材料を具備してもよい
。また、この製造品は、上述の他の活性剤を収容した第２又は第３の容器を具備
してもよい。
【０１９９】 Ｃ． 抗体 本発明の多くの有用な候補薬のいくつかは、ここで同定された遺伝子の生成、
又は遺伝子生成物を阻害、及び／又は遺伝子生成物の活性を低減する抗体及び抗
体フラグメントである。 ｉ． ポリクローナル抗体 ポリクローナル抗体の調製方法は当業者に知られている。哺乳動物においてポ
リクローナル抗体は、例えば免疫化剤、及び所望するのであればアジュバントを
、一又は複数回注射することで発生させることができる。典型的には、免疫化剤
及び／又はアジュバントを複数回皮下又は腹腔内注射により、哺乳動物に注射す
る。免疫化剤は、ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチド又
はその融合タンパク質を含みうる。免疫化剤を免疫化された哺乳動物において免
疫原性が知られているタンパク質に抱合させるのが有用である。このような免疫
原タンパク質の例は限られないが、キーホールリンペットヘモシアニン、血清ア
ルブミン、ウシサイログロブリン及び大豆トリプシンインヒビターが含まれる。
使用され得るアジュバントの例には、フロイント完全アジュバント及びＭＰＬ-
ＴＤＭアジュバント(モノホスホリル脂質Ａ、合成トレハロースジコリノミコラ
ート)が含まれる。免疫化プロトコールは、過度の実験なく当業者により選択さ
れるであろう。
【０２００】 ｉｉ． モノクローナル抗体 あるいは、抗ＰＲＯ２３０、抗ＰＲＯ２１６又は抗ＰＲＯ３０２抗体はモノク
ローナル抗体であってもよい。モノクローナル抗体は、Kohler及びMilstein, Na
ture, 256:495 (1975)に記載されているようなハイブリドーマ法を使用すること
で調製することができる。ハイブリドーマ法では、マウス、ハムスター又は他の
適切な宿主動物を典型的には免疫化剤により免疫化することで、免疫化剤に特異
的に結合する抗体を生成するかあるいは生成可能なリンパ球を誘発する。また、
リンパ球をインビトロで免疫化することもできる。 免疫化剤は、典型的には対象とするＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３
０２ポリペプチド又はその融合タンパク質を含む。一般にヒト由来の細胞が望ま
れる場合には末梢血リンパ球(「ＰＢＬ」)が使用され、あるいは非ヒト哺乳動物
源が望まれている場合は、脾臓細胞又はリンパ節細胞が使用される。次いで、ポ
リエチレングリコール等の適当な融合剤を用いてリンパ球を不死化株化細胞と融
合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する。Goding, Monoclonal Antibodies: Pri
nciples and Practice,(New York；Academic Press, 1986) pp. 59-103。不死化
株化細胞は、通常は、形質転換した哺乳動物細胞、特に齧歯動物、ウシ、及びヒ
ト由来の骨髄腫細胞である。通常、ラット又はマウスの骨髄腫株化細胞が使用さ
れる。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは、未融合の不死化細胞の生存又は成長
を阻害する一又は複数の物質を含有する適切な培地で培養される。例えば、親細
胞が、酵素のヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRT
又はHPRT)を欠いていると、ハイブリドーマの培地は、典型的には、ヒポキサチ
ン、アミノプチリン及びチミジンを含み(「ＨＡＴ培地」)、この物質がＨＧＰＲ
Ｔ欠乏性細胞の増殖を阻止する。
【０２０１】 好ましい不死化株化細胞は、効率的に融合し、選択された抗体生成細胞による
安定した高レベルの抗体発現を支援し、ＨＡＴ培地のような培地に対して感受性
である。より好ましい不死化株化細胞はマウス骨髄腫株であり、これは例えばカ
リフォルニア州サンディエゴのSalk Institute Cell Distribution Centerやバ
ージニア州マナサスのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションより入手
可能である。ヒトモノクローナル抗体を生成するためのヒト骨髄腫及びマウス-
ヒト異種骨髄腫株化細胞も開示されている。Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1
984)、Brodeur等, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applicati
ons, (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987) pp. 51-63。 次いでハイブリドーマ細胞が培養される培養培地を、ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２
１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドに対するモノクローナル抗体の存在について
検定する。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって生成されたモノクローナル
抗体の結合特異性は免疫沈降又はラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)や酵素結合免疫
測定法(ＥＬＩＳＡ)等のインビトロ結合検定法によって測定する。このような技
術及びアッセイは、当該分野において公知である。モノクローナル抗体の結合親
和性は、例えばMunson及びPollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980)によるス
キャッチャード分析法によって測定することができる。
【０２０２】 所望のハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンを制限希釈工程によりサ
ブクローニングし、標準的な方法で成長させることができる。Goding, 上掲。こ
の目的のための適当な培地には、例えば、ダルベッコの改変イーグル培地及びＲ
ＰＭＩ-１６４０倍地が含まれる。あるいは、ハイブリドーマ細胞は哺乳動物に
おいてインビボで腹水として成長させることもできる。 サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ
−セファロース法、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー法、ゲル電気泳
動法、透析法又はアフィニティークロマトグラフィー等の従来の免疫グロブリン
精製方法によって培養培地又は腹水液から単離又は精製される。
【０２０３】 また、モノクローナル抗体は、組換えＤＮＡ法、例えば米国特許第4,816,567
号に記載された方法により作成することができる。本発明のモノクローナル抗体
をコードするＤＮＡは、常套的な方法を用いて(例えば、マウス抗体の重鎖及び
軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを使
用して)、容易に単離し配列決定することができる。本発明のハイブリドーマ細
胞はそのようなＤＮＡの好ましい供給源となる。ひとたび単離されたら、ＤＮＡ
は発現ベクター内に配することができ、これが宿主細胞、例えばサルＣＯＳ細胞
、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、あるいは免疫グロブリンタンパク
質を生成等しない骨髄腫細胞内に形質移入され、組換え宿主細胞内でモノクロー
ナル抗体の合成をすることができる。また、ＤＮＡは、例えば相同マウス配列に
換えてヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード配列を置換することにより（米国
特許第4,816,567号；Morrison等, 上掲)、又は免疫グロブリンコード配列に非免
疫グロブリンポリペプチドのコード配列の一部又は全部を共有結合することによ
り修飾することができる。このような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明
の抗体の定常ドメインに置換でき、あるいは本発明の抗体の１つの抗原結合部位
の可変ドメインに置換でき、キメラ性二価抗体を生成する。 抗体は一価抗体であってもよい。一価抗体の調製方法は当該分野においてよく
知られてる。例えば、一つの方法は免疫グロブリン軽鎖と修飾重鎖の組換え発現
を含む。重鎖は一般的に、重鎖の架橋を防止するようにＦｃ領域の任意の点で切
断される。あるいは、関連するシステイン残基を他のアミノ酸残基で置換するか
欠失させて架橋を防止する。 一価抗体の調製にはインビトロ法がまた適している。抗体の消化による、その
フラグメント、特にＦａｂフラグメントの生成は、当該分野において知られてい
る慣用的技術を使用して達成できる。
【０２０４】 ｉｉｉ． ヒト及びヒト化抗体 抗ＰＲＯ２３０、抗ＰＲＯ２１６又は抗ＰＲＯ３０２抗体は、さらにヒト化抗
体又はヒト抗体を含む。非ヒト(例えばマウス)抗体のヒト化形とは、キメラ免疫
グロブリン、免疫グロブリン鎖あるいはそのフラグメント(例えばＦｖ、Ｆａｂ
、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')２あるいは抗体の他の抗原結合サブ配列)であって、非ヒ
ト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むものである。ヒト化抗体はＣＤＲの
残基が、マウス、ラット又はウサギのような所望の特異性、親和性及び能力を有
する非ヒト種(ドナー抗体)のＣＤＲの残基によって置換されたヒト免疫グロブリ
ン(レシピエント抗体)を含む。幾つかの例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレ
ームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。また、ヒト化
抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたＣＤＲもしくはフレームワーク配列
にも見出されない残基を含んでいてもよい。一般に、ヒト化抗体は、全てあるい
はほとんど全てのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てある
いはほとんど全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものであ
る、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒ
ト化抗体は、最適には免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒトの免疫グ
ロブリンの定常領域の少なくとも一部を含んでなる。Jones等, Nature, 321:522
-525 (1986); Riechmann等, Nature, 332:323-329 (1988); 及びPresta, Curr.
Op Struct. Biol., 2:593-596 (1992)。
【０２０５】 非ヒト抗体をヒト化する方法はこの分野でよく知られている。一般的に、ヒト
化抗体には非ヒトを源にする一又は複数のアミノ酸残基が導入される。これら非
ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる
「移入」残基と称される。ヒト化は基本的に齧歯動物のＣＤＲ又はＣＤＲ配列で
ヒト抗体の該当する配列を置換することによりウィンター(winter)及び共同研究
者［Jones等, Nature, 321:522-525 (1986)；Riechmann等, Nature, 332:323-32
7 (1988)；Verhoeyen等, Science, 239:1534-1536 (1988)］の方法に従って、齧
歯類ＣＤＲ又はＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列に置換することにより実施
される。よって、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実
質的に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体(米国特
許第4,816,567号)である。実際には、ヒト化抗体は典型的には幾つかのＣＤＲ残
基及び場合によっては幾つかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似する部位からの残基
によって置換されたヒト抗体である。 また、ヒト抗体は、ファージ表示ライブラリを含むこの分野で知られた種々の
方法を用いて作成することもできる。Hoogenboom及びWinter, J. Mol. Biol., 2
27:381 (1992)；Marks等, J. Mol. Biol., 222:581 (1991)。また、Cole等及びB
oerner等の方法も、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用することができる。Co
le等, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss. p.77(1985)
及びBoerner等, J. Immunol., 147(1)：86-95(1991) 。同様に、ヒト抗体はヒト
免疫グロブリン座位をトランスジェニック動物、例えば内在性免疫グロブリン遺
伝子は部分的又は完全に不活性化されたマウスに導入することにより産生するこ
とができる。投与の際に、遺伝子再配列、組立、及び抗体レパートリーを含むあ
らゆる観点においてヒトに見られるものに非常に類似しているヒト抗体の生産が
観察される。このアプローチは、例えば米国特許第5,545,807号；同第5,545,806
号；同第5,569,825号；同第5,625,126号；同第5,633,425号；同第5,661,016号、
及び次の科学文献：Marks等, Bio/Technology 10, 779-783 (1992); Lonberg等,
Nature 368 856-859 (1994); Morrison, Nature 368, 812-813 (1994); Fishwi
ld等, Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotech
nology 14, 826 (1996); Lonberg及びHuszar, Intern. Rev. Immunol. 13 65-93
(1995)に記載されている。
【０２０６】 ｉｖ． 二重特異性抗体 二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有する
モノクローナル抗体、好ましくはヒトもしくはヒト化抗体である。本ケースの場
合において、結合特異性の一方はＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２
ポリペプチドに対してであり、他方は任意の他の抗原、好ましくは細胞表面タン
パク質又はレセプター又はレセプターサブユニットに対してである。 二重特異性抗体を作成する方法は当該技術分野において周知である。伝統的に
は、二重特異性抗体の組換え生産は、二つの重鎖が異なる特異性を持つ二つの免
疫グロブリン重鎖／軽鎖対の同時発現に基づく。Milstein及びCuello, Nature,
305:537-539 (1983)。免疫グロブリンの重鎖と軽鎖を無作為に取り揃えるため、
これらハイブリドーマ(クアドローマ)は１０種の異なる抗体分子の潜在的混合物
を生成し、その内一種のみが正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精製
は、アフィニティークロマトグラフィー工程によって通常達成される。同様の手
順が1993年5月13日公開のWO 93/08829、及びTraunecker等, EMBO J.,10:3655-36
56 (1991)に開示されている。 所望の結合特異性(抗体-抗原結合部位)を有する抗体可変ドメインを免疫グロ
ブリン定常ドメイン配列に融合できる。融合は、好ましくは少なくともヒンジ部
、ＣＨ２及びＣＨ３領域の一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとのもの
である。少なくとも一つの融合には軽鎖結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常
領域(ＣＨ１)が存在することが望ましい。免疫グロブリン重鎖融合をコードする
ＤＮＡ、及び望むのであれば免疫グロブリン軽鎖を、別々の発現ベクターに挿入
し、適当な宿主生物に同時形質移入する。二重特異性抗体を作成するための更な
る詳細については、例えばSuresh等, Methods in Enzymology, 121:210(1986)を
参照されたい。
【０２０７】 ｖ． ヘテロ抱合抗体 ヘテロ抱合抗体は、２つの共有結合した抗体からなる。このような抗体は、例
えば、免疫系細胞を不要な細胞に対してターゲティングさせるため(米国特許第4
,676,980号)及びＨＩＶ感染の治療のために（WO 91/00360; WO 92/200373; EP 0
3089)提案されている。この抗体は、架橋剤に関連したものを含む合成タンパク
化学における既知の方法を使用して、インビトロで調製することができると考え
られる。例えば、ジスルフィド交換反応を使用するか又はチオエーテル結合を形
成することにより、免疫毒素を作成することができる。この目的に対して好適な
試薬の例には、イミノチオレート及びメチル-４-メルカプトブチリミデート、及
び例えば米国特許第4,6767,980号に開示されているものが含まれる。
【０２０８】 ｖｉ． エフェクター機能の加工 本発明の抗体をエフェクター機能について改変し、例えば癌治療における抗体
の有効性を向上させるのが望ましい。例えば、システイン残基をＦｃ領域に導入
し、それにより、この領域に鎖間ジスルフィド結合を形成させるようにしてもよ
い。そのようにして生成された同種二量体抗体は、向上した内部移行能力及び／
又は増加した補体媒介細胞殺傷及び抗体-依存性細胞性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を
有しうる。Caron等, J. Exp. Med. 176: 1191-1195 (1992)及びShopes, B. J. I
mmunol. 148: 2918-2922 (1992)参照。向上した抗腫瘍活性を持つ同種二量体抗
体はまた、Wolff等, Cancer research 53: 2560-2565 (1993)に記載されたよう
な異種二官能性架橋を用いても調製しうる。あるいは、抗体は、２つのＦｃ領域
を有するように加工して、それにより補体溶解及びＡＤＣＣ能力を向上させるこ
ともできる。Stevenson等, Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230 (1989)参照。
【０２０９】 ｖｉｉ． 免疫抱合体 本発明はまた、化学治療薬、毒素（例えば、細菌、真菌、植物又は動物由来の
酵素活性毒素、又はそのフラグメント）などの細胞毒性薬、あるいは放射性同位
体（即ち、放射性抱合）に抱合された抗体を含む免疫抱合体にも関する。 このような免疫複合体の生成に有用な化学治療薬は上記した。用いることので
きる酵素活性毒素及びそのフラグメントは、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の
非結合活性フラグメント、（緑膿菌からの）外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリン
Ａ鎖、モデクシン(modeccin)Ａ鎖、アルファ-サルシン、アレウリテス・フォー
ディ(Aleurites fordii)タンパク質、ジアンチン(dianthin)タンパク質、フィト
ラカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ
、及びＰＡＰ-Ｓ）、モモルディカ・チャランチア(momordica charantia)インヒ
ビター、クルシン(curcin)、クロチン(crotin)、サパオナリア・オフィシナリス
(sapaonaria oficinalis)インヒビター、ゲロニン(gelonin)、ミトゲリン(mitog
ellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン(phenomycin)、エノ
マイシン(enomycin)及びトリコテセン(tricothecene)を含む。様々な放射性ヌク
レオチドが放射性抱合抗体の生成に利用可能である。例として、２１２Ｂｉ、１ ３１ Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ及び１８６Ｒｅを含む。
【０２１０】 抗体及び細胞毒性薬の抱合体は、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、
例えば、Ｎ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオール)プロピオネート（Ｓ
ＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（ジメチ
ルアジピミデートＨＣＬ等）、活性エステル（ジスクシンイミジルスベレート等
）、アルデヒド（グルタルアルデヒド等）、ビス-アジド化合物（ビス(ｐ-アジ
ドベンゾイル)ヘキサンジアミン等）、ビス-ジアゾニウム誘導体（ビス-(ｐ-ジ
アゾニウムベンゾイル)-エチレンジアミン等）、ジイソシアネート（トリエン２
，６-ジイソシアネート等）、及びビス-活性フッ素化合物（１，５-ジフルオロ-
２，４-ジニトロベンゼン等）を用いて作成できる。例えば、リシン免疫毒素は
、Vitetta等, Science 238: 1098 (1987)に記載されたように調製することがで
きる。カーボン-１４-標識１-イソチオシアナトベンジル-３-メチルジエチレン
トリアミン五酢酸（ＭＸ-ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドの抗体への抱合の
ためのキレート剤の例である。WO 94/11026参照。 他の実施態様では、腫瘍の予備標的化で使用するために、抗体は「レセプター
」（ストレプトアビジン等）に抱合されてもよく、抗体-レセプター複合体は患
者に投与され、次いで清澄化剤を用いて未結合複合体を循環から除去し、次に細
胞毒性薬（例えば、放射性ヌクレオチド等）に抱合された「リガンド」（アビジ
ン等）を投与する。
【０２１１】 ｖｉｉｉ． 免疫リポソーム また、ここに開示する抗体は、免疫リポソームとして調製してもよい。抗体を
含むリポソームは、Epstein等, Proc. Natl. acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985)
; Hwang等, Proc. natl. Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); 及び米国特許第4,
485,045号及び第4,544,545号に記載されたような、この分野で知られた方法で調
製される。向上した循環時間を持つリポソームは、米国特許第5,013,556号に開
示されている。 特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール及びＰＥＧ
-誘導ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ-ＰＥ）を含む脂質組成物での逆
相蒸発法によって生成される。リポソームは、所定サイズの孔のフィルターを通
して押し出され、所望の径を有するリポソームが生成される。本発明の抗体のＦ
ａｂ’フラグメントは、Martin等, J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982)に記載
されているように、ジスルフィド交換反応を介してリポソームに抱合され得る。
化学治療薬（ドキソルビシン等）は、場合によってはリポソーム内に包含される
。Gabizon等, J. National Cancer Inst. 81(19) 1484 (1989)参照。
【０２１２】 ｉｘ． 抗体の製薬組成物 ここで同定されるＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチド
に特異的に結合する抗体、並びに上記に開示したスクリーニングアッセイで同定
された他の分子は、上記及び下記に記した種々の疾患の治療のために、製薬組成
物の形態で投与することができる。 ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドが細胞内であり、
全抗体が阻害剤として用いられる場合、内在化抗体が好ましい。しかし、リポフ
ェクション又はリポソームも抗体、又は抗体フラグメントを細胞に導入するのに
使用できる。抗体フラグメントが用いられる場合、標的タンパク質の結合ドメイ
ンに特異的に結合する最小阻害フラグメントが好ましい。例えば、抗体の可変領
域配列に基づいて、標的タンパク質配列に結合する能力を保持したペプチド分子
が設計できる。このようなペプチドは、化学的に合成でき、及び／又は組換えＤ
ＮＡ技術によって生成できる。例えば、Marasco等, Proc. Natl. Acad. Sci. US
A 90, 7889-7893 (1993)参照。 ここでの製剤は、治療すべき特定の徴候に必要な場合に１以上の活性化合物、
好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を持つものも含んでよい。ある
いは、又はそれに加えて、組成物は、細胞毒性薬、サイトカイン又は成長阻害剤
を含んでもよい。これらの分子は、適切には、意図する目的に有効な量の組み合
わせで存在する。 また、活性成分は、例えばコアセルベーション技術により又は界面重合により
調製されたマイクロカプセル、例えば、各々ヒドロキシメチルセルロース又はゼ
ラチン-マイクロカプセル及びポリ（メタクリル酸メチル）マイクロカプセル中
、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミン小球、マイクロエマ
ルション、ナノ粒子及びナノカプセル）中、又はマイクロエマルション中に包括
されていてもよい。これらの技術は、Remington's Pharmaceutical Science, 上
掲に開示されている。
【０２１３】 インビボ投与に使用される製剤は無菌でなけらばならない。これは、滅菌濾過
膜を通した濾過により容易に達成される。 持続放出製剤を調製してもよい。持続放出製剤の好適な例は、抗体を含有する
固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、このマトリクスは成形された物
品、例えばフィルム、又はマイクロカプセルの形状である。持続放出性マトリク
スの例は、ポリエステルヒドロゲル（例えば、ポリ(２-ヒドロキシエチル-メタ
クリレート)又はポリ(ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第3,773,
919号）、Ｌ-グルタミン酸及びγ-エチル-Ｌ-グルタメートのコポリマー、非分
解性エチレン-酢酸ビニル、LUPRON DEPOT(商品名)（乳酸-グリコール酸コポリマ
ーと酢酸リュープロリドの注射可能な小球）などの分解性乳酸-グリコール酸コ
ポリマー、ポリ-(Ｄ)-３-ヒドロキシブチル酸を含む。エチレン-酢酸ビニル及び
乳酸-グリコール酸などのポリマーは分子を１００日に渡って放出することがで
きるが、ある種のヒドロゲルはより短時間でタンパク質を放出してしまう。カプ
セル化された抗体が身体内に長時間残ると、それらは３７℃の水分に露出される
ことにより変性又は凝集し、その結果、生物学的活性の低下及び起こりうる免疫
原性の変化をもたらす。合理的な方法は、含まれる機構に依存する安定化につい
て工夫することができる。例えば、凝集機構がチオ−ジスルフィド交換を通した
分子間Ｓ−Ｓ結合形成であると発見された場合、安定化はスルフヒドリル残基の
修飾、酸性溶液からの凍結乾燥、水分含有量の制御、適切な添加剤の付加、及び
特異的ポリマーマトリクス組成物の開発によって達成されうる。
【０２１４】 ｘ． 抗体を使用する治療方法 ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドに対する抗体を上
述した種々の心血管、内皮及び血管形成病の治療に使用できることが予期されて
いる。 抗体は、哺乳動物、好ましくはヒトに、周知の方法、例えば、ボーラスとして
又は所定時間に渡る連続注入による静脈内投与、筋肉内、腹膜内、脳脊髄内、皮
下、関節間、滑膜内、鞘内、経口、局所、又は吸入経路などにより投与される。
抗体の静脈内投与が好ましい。 他の治療的養生法を例えば本発明の抗体の投与と組み合わせてもよい。例えば
、抗体で癌の治療をする場合は、このような抗体で治療される患者は放射線治療
を受けてもよい。あるいは、又はそれに加えて、患者に化学治療薬を投与しても
よい。このような化学治療薬の調製法及び用量スケジュールは、製造者の指示に
従って使用されるか、熟練した実務者により経験的に決定される。そのような化
学治療に対する調製法及び用量スケジュールはまたChemotherapy Service M.C.
Perry編, (Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 1992)にも記載されている
。化学治療薬は、抗体の投与に先立って、又は続いて投与してもよく、あるいは
それらと同時に投与してもよい。抗体は、タモキシフェン又はEVISTＴＭ等の抗
エストロゲン化合物又はオナプリストンなどの抗プロゲステロン（EP 616812参
照）の、それらの分子について知られた用量と組み合わせてもよい。
【０２１５】 また、抗体を癌の治療に使用する場合、他の腫瘍関連抗原に対する抗体、例え
ば一又は複数のＥｒｂＢ２、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、又はＶＥＧＦ
レセプターに結合する抗体を投与することも好ましい。また、上述した薬剤も含
む。抗体は適切に連続投与されるか、又は、放射活性物質の照射又は投与を含ん
でも含まなくても、放射線学的治療と組合せられる。あるいは、又はそれに加え
て、ここで開示されており、同じか、又は二又はそれ以上の異なる抗原に対して
結合する二又はそれ以上の抗体を、患者に同時投与してもよい。ときどきは、患
者に一又は複数のサイトカインを投与することも有利である。好ましい実施態様
では、ここの抗体は、成長阻害剤と同時投与される。例えば、まず成長阻害剤を
投与し、続いて本発明の抗体を投与する。しかしながら、同時投与、又は本発明
の抗癌剤を最初に投与することも考えられる。成長阻害剤についての適切な用量
は現在用いられている量であるが、成長阻害剤とこの抗体との組み合わせ（相乗
）効果により減少させ得る。 好ましい実施態様において、腫瘍の血管新生は、組合せ治療に攻撃される。抗
ＰＲＯ２３０、抗ＰＲＯ２１６又は抗ＰＲＯ３０２抗体及び他の抗体(例えば抗-
ＶＥＧＦ)は、例えば腫瘍又は転移病巣の壊死がみられるように決定された治療
的有効量で、腫瘍を有する患者に投与される。この治療は、好ましい効果が観察
されるか、又は腫瘍又は任意の転移病巣の痕跡がなくなるまで続けられる。つい
で、ＴＮＦを、補助剤、例えばアルファ-、ベータ-又はガンマ-インターフェロ
ン、抗-ＨＥＲ２抗体、ヘレグリン(heregulin)、抗ヘレグリン抗体、Ｄ-因子、
インターロイキン-１(ＩＬ-１)、インターロイキン-２(ＩＬ-２)、顆粒球-マク
ロファージコロニー刺激因子(ＧＭ-ＣＳＦ)、又は腫瘍中の微細血管凝固促進剤
、例えば抗-プロテインＣ抗体、抗-プロテインＳ抗体、又はＣ４ｂ結合プロテイ
ン(1991年2月21日公開のWO91/01753)。 補助剤はその有効性に応じて変わり、便宜的な方式でスクリーニングされるマ
トリクスにより、腫瘍における影響力と比較することが望ましい。抗ＰＲＯ２３
０、抗ＰＲＯ２１６又は抗ＰＲＯ３０２抗体及びＴＮＦの投与は、所望する臨床
効果が達成されるまで繰り返される。また、抗ＰＲＯ２３０、抗ＰＲＯ２１６又
は抗ＰＲＯ３０２抗体は、ＴＮＦ、場合によっては補助剤と共に投与される。固
形腫瘍が、四肢又は一般的な循環器からの単離が可能な他の位置で見出される例
では、ここに記載される治療薬は単離された腫瘍又は器官に投与される。他の実
施態様において、ＦＧＦ又はＰＤＧＦアンタゴニスト、例えば抗-ＦＧＦ又は抗-
ＰＤＧＦ中和剤は、抗ＰＲＯ２３０、抗ＰＲＯ２１６又は抗ＰＲＯ３０２抗体と
共に患者に投与される。抗ＰＲＯ２３０、抗ＰＲＯ２１６又は抗ＰＲＯ３０２抗
体を用いた治療は、好ましくは傷の治癒又は所望する新血管新生の期間中は中止
する。
【０２１６】 心血管、内皮及び血管形成疾患の防止又は治療のための、ここでの抗体の適切
な用量は、上記で定義したような治療される疾患の型、疾患の重篤さ及び経過、
防止又は治療目的で薬剤が投与されるか否か、従前の治療、患者の臨床履歴及び
抗体に対する反応、及び主治医の裁量に依存する。抗体は、適切には患者に一回
又は一連の治療に渡って適切に投与される。 例えば、疾患の型及び重篤さに応じて、約１μｇ／ｋｇから５０ｍｇ／ｋｇ（
例えば、０．１−２０ｍｇ／ｋｇ）の抗体が、例えば、１又はそれ以上の別々の
投与あるいは連続注入のいずれにしても、患者に投与するための最初の候補用量
である。典型的な１日の用量は、上記の要因に応じて、約１μｇ／ｋｇから１０
０ｍｇ／ｋｇ又はそれ以上であろう。数日以上に渡る繰り返し投与のためには、
状態に応じて、疾患の徴候に所望の抑制が現れるまで治療が続けられる。しかし
ながら、他の用量計画が有用であることもある。この治療の進行は、従来の技術
及びアッセイ、例えばＸ線腫瘍イメージングによって容易に監視される。
【０２１７】 ｘｉ． 製造品 また、抗体を収容する容器とラベルを含む製造品を提供する。このような製造
品は上述しており、ここで活性剤は抗ＰＲＯ２３０、抗ＰＲＯ２１６又は抗ＰＲ
Ｏ３０２抗体である。
【０２１８】 ｘｉｉ． 抗体を使用する腫瘍の診断及び予知 抗体が使用される徴候が癌である場合、或る種の腫瘍で過剰発現される成長レ
セプター等の細胞表面タンパク質は候補薬剤又は腫瘍（例えば、癌）治療の優れ
た標的であるが、ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドと
同じタンパク質は腫瘍の診断及び予知におけるさらなる用途が見出されている。
例えば、ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドに対して指
向する抗体は腫瘍の診断及び予知に使用することができる。 例えば、抗体フラグメントを含む抗体は、ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰ
ＲＯ３０２ポリペプチドをコードする遺伝子を含む遺伝子の発現の定性的又は定
量的検出に用いることができる。抗体は、好ましくは検出可能な、例えば蛍光標
識を備え、結合は光学顕微鏡、フローサイトメトリー、フルオロメトリー、又は
この分野で知られた他の技術によって監視できる。このような結合アッセイは、 マーカー遺伝子産物に結合する抗体のインサイツ検出は、例えば、免疫蛍光又
は免疫電子顕微鏡によって実施できる。この目的のために、組織学的試料を患者
から取り出し、好ましくは生物学的試料に抗体を被せることにより、標識抗体を
それに適用する。この手法はまた、試験される組織におけるマーカー遺伝子産物
の分布も決定できるようにする。当業者には、インサイツ検出のために広範な組
織学的方法が容易に利用できることは明らかであろう。
【０２１９】 以下の実施例は例示するためにのみ提供されるものであって、本発明の範囲を
決して限定することを意図するものではない。 本明細書で引用した全ての特許及び文献の全体を、出典明示によりここに取り
込む。 （実施例） 実施例で言及されている市販試薬は、特に示さない限りは製造者の使用説明に
従い使用した。ＡＴＣＣ登録番号により以下の実施例及び明細書全体を通して特
定されている細胞の供給源はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、
マナッサス、ＶＡである。特に記さない限り、本発明は上記及び以下の教科書に
記載されたもののような組換えＤＮＡ技術の標準的な手法を用いた：上掲のSamb
rook等; Ausubel等, Current Protocols in Molecular Biology（Green Publish
ing Associates and Wiley Interscience, N.Y., 1989）; Innis等, PCR Protoc
ols: A Guide to Methods and Applications（Academic Press, Inc.; N.Y.., 1
990); Harlow等, Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Pres
s: Cold Spring Harbor 1988); Gait, Oligonucleotide synthesis（IRL Press,
Oxford, 1984）; Freshney, Animal Cell Culture, 1987; Coligan等, Current
Protocols in Immunology, 1991。
【０２２０】 実施例１ ヒトＰＲＯ２３０（管状間質性腎炎抗原相同体）をコードするｃＤＮＡクローン
の単離 Swiss-Prot公的データベースからの約９５０の既知の分泌タンパク質からの細
胞外ドメイン（ＥＣＤ）配列（必要ならな、分泌シグナル配列を含む）を、ＥＳ
Ｔデータベースの検索に使用した。ＥＳＴデータベースは、公的データベース（
例えば、Dayhoff、GenBank）及び企業のＥＳＴデータベース（LIFESEQ(登録商標
)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA）を含む。検索は、コンピュータプ
ログラムBLAST又はBLAST2［Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460-480
(1996)］を用いて、ＥＣＤタンパク質配列のＥＳＴ配列の６フレーム翻訳との比
較として実施した。既知のタンパク質をコードせず、Ｂｌａｓｔスコア７０（９
０の場合もある）又はそれ以上を持つ比較は、プログラム「phrap」（Phil Gree
n, University of Washington, Seattle, Washington）でクラスター形成してコ
ンセンサスＤＮＡ配列に構築した。 上述したphrapを用いて他の同定されたＥＳＴ配列に対してコンセンサスＤＮ
Ａ配列を構築した。このコンセンサス配列をここでＤＮＡ３０８５７と命名する
。ジェネンテクの企業のＥＳＴをコンセンサス構築に用いて、ここでＤＮＡ２０
０８８と命名する。ある場合には、コンセンサス配列は、BLAST及びphrapの繰り
返しサイクルを用いて伸長した中間のコンセンサスＤＮＡ配列から誘導し、その
中間コンセンサス配列を上で議論したＥＳＴ配列の供給源を用いて可能な限り伸
長させた。 ＤＮＡ３０８５７コンセンサス配列に基づいて、１）対象とする配列を含むｃ
ＤＮＡライブラリをＰＣＲにより同定するために、そして２）ＰＲＯ２３０につ
いての全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するため、オ
リゴヌクレオチドを合成した。正方向及び逆方向ＰＣＲプライマーは一般的に２
０から３０ヌクレオチドの範囲であり、しばしば約１００−１０００ｂｐ長のＰ
ＣＲ産物を与えるように設計される。プローブ配列は典型的には４０−５５ｂｐ
長である。ある場合には、コンセンサス配列が約１−１．５ｋｂｐより大きいと
き、更なるオリゴヌクレオチドを合成する。全長クローンについて幾つかのライ
ブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを上掲のAusubel
等, Current Protocols in Molecular Biologyに従って、ＰＣＲプライマー対で
のＰＣＲ増幅によりスクリーニングした。次いでポジティブライブラリを、プロ
ーブオリゴヌクレオチド及びプライマー対の一方を用いた興味ある遺伝子をコー
ドするクローンの単離に使用した。
【０２２１】 ＰＣＲプライマー（正及び逆）を合成した： 正方向ＰＣＲプライマー： 5'-TTCGAGGCCTCTGAGAAGTGGCCC-3'(配列番号：３) 逆方向ＰＣＲプライマー： 5'-GGCGGTATCTCTCTGGCCTCCC-3'(配列番号：４) また、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブを、次のヌクレオチド
配列を持つコンセンサスＤＮＡ３０８５７配列から作成した： ハイブリッド形成プローブ： 5'-TTCTCCACAGCAGCTGTGGCATCCGATCGTGTCTCAATCCATTCTCTGGG-3'(配列番号：５) ｃＤＮＡライブライの作成のためのＲＮＡはヒト胎児肺組織から単離した。ｃ
ＤＮＡクローンを単離するために用いたｃＤＮＡライブラリーは、Invitrogen,
San Diego, CA からのもの等の市販試薬を用いて標準的方法によって形成した。
ｃＤＮＡは、ＮｏｔＩ部位を含むオリゴｄＴでプライムし、ＳａｌＩヘミキナー
ゼアダプターの平滑末端で結合させ、ＮｏｔＩで切断し、ゲル電気泳動で適当に
サイズ分割をし、定まった方向で適当なクローニングベクター（ｐＲＫＢ又はｐ
ＲＫＤ等；ｐＲＫ５Ｂは、ＳｆｉＩ部位を持たないｐＲＫ５Ｄの前駆体である；
Holmes等, Science, 253:1278-1280 (1991)を参照されたい）に独特のＸｈｏｌ
及びＮｏｔＩ部位においてクローン化した。 上述のようにして単離されたクローンのＤＮＡ配列決定により、全長ＰＲＯ２
３０ポリペプチドに対する全長ＤＮＡ配列（ここでＤＮＡ３３２２３−１１３６
[図１Ａ−１Ｂ、配列番号：１]と命名）及びそのＰＲＯ２３０ポリペプチドに対
する誘導タンパク質配列が得られた。 上記の同定された全長クローンは、単一のオープンリーディングフレームを含
み、ヌクレオチド位置１００−１０２に見かけの翻訳開始部位を、ヌクレオチド
位置５９２−５９４に停止シグナルを有していた（図１Ａ−１Ｂ；配列番号：１
）。予測されるポリペプチド前駆体は１６４アミノ酸長であり［図２；(配列番
号：２)］、約１８，３５９ダルトンの算定分子量と約７．４５の推定ｐＩを有
する。図２（配列番号：２）に示した全長ＰＲＯ２３０配列の分析は、図２に示
されたような重要なポリペプチドドメインの存在を証明し、ここで、その重要な
ポリペプチドドメインに対して与えられた位置は上述のようにおよそのものであ
る。全長ＰＲＯ２３０配列（図２、配列番号：２）の分析は次のものの存在を実
証した：約アミノ酸１から約アミノ酸２１のシグナルペプチド；約アミノ酸７８
から約アミノ酸８２のＮ結合グリコシル化部位；約アミノ酸８０から約アミノ酸
８４、約アミノ酸１１７から約アミノ酸１２１、約アミノ酸１２６から約アミノ
酸１３０及び約アミノ酸１３７から約アミノ酸１４１のカゼインキナーゼＩＩリ
ン酸化部位；約アミノ酸２１から約アミノ酸２７、約アミノ酸３９から約アミノ
酸４５、約アミノ酸４４から約アミノ酸５０及び約アミノ酸１０４から約アミノ
酸１１０のＮ-ミリストイル化部位；及び約アミノ酸２６から約アミノ酸３０の
アミド化部位。クローンＤＮＡ３３２２３−１１３６は、１９９７年９月１６日
にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９２６４が付与されている。 図２（配列番号：２）に示した全長配列のALIGN-2配列アラインメント分析を
用いたDayhoffデータベース（version 35.45 SwissProt 35）の分析は、ＰＲＯ
２３０アミノ酸配列と管状間質性腎炎抗原との間の配列同一性を証明した。
【０２２２】 実施例２ ヒトＰＲＯ２１６（オステオモジュリン／フィブロモジュリン相同体）をコード
するｃＤＮＡクローンの単離 Swiss-Prot公的データベースからの約９５０の既知の分泌タンパク質からの細
胞外ドメイン（ＥＣＤ）配列（必要ならな、分泌シグナル配列を含む）を、ＥＳ
Ｔデータベースの検索に使用した。ＥＳＴデータベースは、公的データベース（
例えば、Dayhoff、GenBank）及び企業のＥＳＴデータベース（LIFESEQ(登録商標
)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA）を含む。検索は、コンピュータプ
ログラムBLAST又はBLAST2［Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460-480
(1996)］を用いて、ＥＣＤタンパク質配列のＥＳＴ配列の６フレーム翻訳との比
較として実施した。既知のタンパク質をコードせず、Ｂｌａｓｔスコア７０（９
０の場合もある）又はそれ以上を持つ比較は、プログラム「phrap」（Phil Gree
n, University of Washington, Seattle, Washington）でクラスター形成してコ
ンセンサスＤＮＡ配列に構築した。 ＤＮＡ３３０８７の完全ｃＤＮＡ配列は登録番号AB000114_1及びAB009589_1（
ヒトオステオモジュリン）でGenBankに開示されている。関連しているが、おそ
らくは異なったタンパク質である角膜ケラチンサルフェートはFunderburgh等, J
. Biol. Chem., 271:31432-31436 (1996)に開示されている。 上述したphrapを用いて他の同定されたＥＳＴ配列に対してコンセンサスＤＮ
Ａ配列を構築した。このコンセンサス配列をここでＤＮＡ２８７５４と命名する
。ある場合には、コンセンサス配列は、BLAST及びphrapの繰り返しサイクルを用
いて伸長した中間のコンセンサスＤＮＡ配列から誘導し、その中間コンセンサス
配列を上で議論したＥＳＴ配列の供給源を用いて可能な限り伸長させた。 ＤＮＡ２８７５４コンセンサス配列に基づいて、１）対象とする配列を含むｃ
ＤＮＡライブラリをＰＣＲにより同定するために、そして２）ＰＲＯ２１６につ
いての全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するため、オ
リゴヌクレオチドを合成した。正方向及び逆方向ＰＣＲプライマーは一般的に２
０から３０ヌクレオチドの範囲であり、しばしば約１００−１０００ｂｐ長のＰ
ＣＲ産物を与えるように設計される。プローブ配列は典型的には４０−５５ｂｐ
長である。ある場合には、コンセンサス配列が約１−１．５ｋｂｐより大きいと
き、更なるオリゴヌクレオチドを合成する。全長クローンについて幾つかのライ
ブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを上掲のAusubel
等, Current Protocols in Molecular Biologyに従って、ＰＣＲプライマー対で
のＰＣＲ増幅によりスクリーニングした。次いでポジティブライブラリを、プロ
ーブオリゴヌクレオチド及びプライマー対の一方を用いた興味ある遺伝子をコー
ドするクローンの単離に使用した。
【０２２３】 ＰＣＲプライマー（正及び逆）を合成した： 正方向ＰＣＲプライマー： 5'-TCACGATGATCCTGACAATGC-3'(配列番号：８) 逆方向ＰＣＲプライマー： 5'-AATAATGAAGGTCAAAGTGCCCTT-3'(配列番号：９) また、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブを、次のヌクレオチド
配列を持つコンセンサスＤＮＡ２８７５４配列から作成した： ハイブリッド形成プローブ： 5'-TGCTCCTTCTTGTTCTGGGCTCTCATG-3'(配列番号：１０) ｃＤＮＡライブライの作成のためのＲＮＡはヒト胎児腎臓組織から単離した。
ｃＤＮＡクローンを単離するために用いたｃＤＮＡライブラリーは、Invitrogen
, San Diego, CA からのもの等の市販試薬を用いて標準的方法によって形成した
。ｃＤＮＡは、ＮｏｔＩ部位を含むオリゴｄＴでプライムし、ＳａｌＩヘミキナ
ーゼアダプターの平滑末端で結合させ、ＮｏｔＩで切断し、ゲル電気泳動で適当
にサイズ分割をし、定まった方向で適当なクローニングベクター（ｐＲＫＢ又は
ｐＲＫＤ等；ｐＲＫ５Ｂは、ＳｆｉＩ部位を持たないｐＲＫ５Ｄの前駆体である
；Holmes等, Science, 253:1278-1280 (1991)を参照されたい）に独特のＸｈｏ
ｌ及びＮｏｔＩ部位においてクローン化した。 上述のようにして単離されたクローンのＤＮＡ配列決定により、全長ＰＲＯ２
１６ポリペプチドに対する全長ＤＮＡ配列（ここでＤＮＡ３３０８７[図３、配
列番号：６]と命名）及びそのＰＲＯ２１６ポリペプチドに対する誘導タンパク
質配列が得られた。 上記の同定された全長クローンは、単一のオープンリーディングフレームを含
み、ヌクレオチド位置２６８−２７０に見かけの翻訳開始部位を、ヌクレオチド
位置１５３１−１５３３に停止シグナルを有していた（図３、配列番号：６）。
予測されるポリペプチド前駆体は４２１アミノ酸長であり［図４；(配列番号：
７)］、約４９，４９２ダルトンの算定分子量と約５．５１の推定ｐＩを有する
。図４（配列番号：７）に示した全長ＰＲＯ２１６配列の分析は、図４に示され
たような重要なポリペプチドドメインの存在を証明し、ここで、その重要なポリ
ペプチドドメインに対して与えられた位置は上述のようにおよそのものである。
全長ＰＲＯ２１６配列（図４、配列番号：７）の分析は次のものの存在を実証し
た：約アミノ酸１１３から約アミノ酸１１７、約アミノ酸１２１から約アミノ酸
１２５、約アミノ酸１８７から約アミノ酸１９１、約アミノ酸２４２から約アミ
ノ酸２４６及び約アミノ酸３１６から約アミノ酸３２０のＮ結合グリコシル化部
位；約アミノ酸１８９から約アミノ酸１９３及び約アミノ酸２４７から約アミノ
酸２５１のカゼインキナーゼＩＩリン酸化部位；約アミノ酸２６８から約アミノ
酸２７５及び約アミノ酸３００から約アミノ酸３０７のチロシンキナーゼリン酸
化部位；約アミノ酸２３０から約アミノ酸２３６のN-ミリストイル化部位；及び
約アミノ酸１４６から約アミノ酸１６８及び約アミノ酸２１７から約アミノ酸２
３９のロイシンジッパーパターン。クローンＤＮＡ３３０８７は１９９７年１０
月１６日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９３８１が付与されてい
る。 このクローンは、１９９６年１２月２６日にGenBankにI. Ohnoにより提出され
（AB000114_1）、１９９７年１２月５日にGenBankにI. Ohnoにより提出された（
AB009589-1）ヒトオステオモジュリンと同じである。
【０２２４】 実施例３ ヒトＰＲＯ３０２（卵黄形成カルボキシペプチダーゼ相同体）をコードするｃＤ
ＮＡクローンの単離 Swiss-Prot公的データベースからの約９５０の既知の分泌タンパク質からの細
胞外ドメイン（ＥＣＤ）配列（必要ならな、分泌シグナル配列を含む）を、ＥＳ
Ｔデータベースの検索に使用した。ＥＳＴデータベースは、公的データベース（
例えば、Dayhoff、GenBank）及び企業のＥＳＴデータベース（LIFESEQ(登録商標
)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA）を含む。検索は、コンピュータプ
ログラムBLAST又はBLAST2［Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460-480
(1996)］を用いて、ＥＣＤタンパク質配列のＥＳＴ配列の６フレーム翻訳との比
較として実施した。既知のタンパク質をコードせず、Ｂｌａｓｔスコア７０（９
０の場合もある）又はそれ以上を持つ比較は、プログラム「phrap」（Phil Gree
n, University of Washington, Seattle, Washington）でクラスター形成してコ
ンセンサスＤＮＡ配列に構築した。 上述したphrapを用いて他の同定されたＥＳＴ配列に対してコンセンサスＤＮ
Ａ配列を構築した。このコンセンサス配列をここでＤＮＡ３５９５３と命名する
。ある場合には、コンセンサス配列は、BLAST及びphrapの繰り返しサイクルを用
いて伸長した中間のコンセンサスＤＮＡ配列から誘導し、その中間コンセンサス
配列を上で議論したＥＳＴ配列の供給源を用いて可能な限り伸長させた。 ＤＮＡ３５９５３コンセンサス配列に基づいて、１）対象とする配列を含むｃ
ＤＮＡライブラリをＰＣＲにより同定するために、そして２）ＰＲＯ３０２につ
いての全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するため、オ
リゴヌクレオチドを合成した。正方向及び逆方向ＰＣＲプライマーは一般的に２
０から３０ヌクレオチドの範囲であり、しばしば約１００−１０００ｂｐ長のＰ
ＣＲ産物を与えるように設計される。プローブ配列は典型的には４０−５５ｂｐ
長である。ある場合には、コンセンサス配列が約１−１．５ｋｂｐより大きいと
き、更なるオリゴヌクレオチドを合成する。全長クローンについて幾つかのライ
ブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを上掲のAusubel
等, Current Protocols in Molecular Biologyに従って、ＰＣＲプライマー対で
のＰＣＲ増幅によりスクリーニングした。次いでポジティブライブラリを、プロ
ーブオリゴヌクレオチド及びプライマー対の一方を用いた興味ある遺伝子をコー
ドするクローンの単離に使用した。
【０２２５】 ＰＣＲプライマー（正及び逆）を合成した： 正方向ＰＣＲプライマー１： 5'-GTCCGCAAGGATGCCTACATGTTC-3'(配列番号：１３) 正方向ＰＣＲプライマー２： 5'-GCAGAGGTGTCTAAGGTTG-3'(配列番号：１４) 逆方向ＰＣＲプライマー： 5'-AGCTCTAGACCAATGCCAGCTTCC-3'(配列番号：１５) また、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブを、次のヌクレオチド
配列を持つコンセンサスＤＮＡ３５９５３配列から作成した： ハイブリッド形成プローブ： 5'-GCCACCAACTCCTGCAAGAACTTCTCAGAACTGCCCCTGGTCATG-3'(配列番号：１６) ｃＤＮＡライブライの作成のためのＲＮＡはヒト胎児腎臓組織（LIB228）から
単離した。ｃＤＮＡクローンを単離するために用いたｃＤＮＡライブラリーは、
Invitrogen, San Diego, CA からのもの等の市販試薬を用いて標準的方法によっ
て形成した。ｃＤＮＡは、ＮｏｔＩ部位を含むオリゴｄＴでプライムし、Ｓａｌ
Ｉヘミキナーゼアダプターの平滑末端で結合させ、ＮｏｔＩで切断し、ゲル電気
泳動で適当にサイズ分割をし、定まった方向で適当なクローニングベクター（ｐ
ＲＫＢ又はｐＲＫＤ等；ｐＲＫ５Ｂは、ＳｆｉＩ部位を持たないｐＲＫ５Ｄの前
駆体である；Holmes等, Science, 253:1278-1280 (1991)を参照されたい）に独
特のＸｈｏｌ及びＮｏｔＩ部位においてクローン化した。 上述のようにして単離されたクローンのＤＮＡ配列決定により、全長ＰＲＯ３
０２ポリペプチドに対する全長ＤＮＡ配列（ここでＤＮＡ４０３７０−１２１７
[図５、配列番号：１１]と命名）及びそのＰＲＯ３０２ポリペプチドに対する誘
導タンパク質配列が得られた。 上記の同定された全長クローンは、単一のオープンリーディングフレームを含
み、ヌクレオチド位置３４−３６に見かけの翻訳開始部位を、ヌクレオチド位置
１３９０−１３９２に停止シグナルを有していた（図５、配列番号：１１）。予
測されるポリペプチド前駆体は４５２アミノ酸長であり［図６；(配列番号：１
２)］、約５０，８３１ダルトンの算定分子量と約５．７４の推定ｐＩを有する
。図６（配列番号：１２）に示した全長ＰＲＯ３０２配列の分析は、図６に示さ
れたような重要なポリペプチドドメインの存在を証明し、ここで、その重要なポ
リペプチドドメインに対して与えられた位置は上述のようにおよそのものである
。全長ＰＲＯ３０２配列（図６、配列番号：１２）の分析は次のものの存在を実
証した：約アミノ酸１から約アミノ酸２５のシグナルペプチド；約アミノ酸６４
から約アミノ酸６８、約アミノ酸１２６から約アミノ酸１３０及び約アミノ酸３
６２から約アミノ酸３６６のＮ結合グリコシル化部位；約アミノ酸１０１から約
アミノ酸１０５のｃＡＮＰ及びｃＧＭＰ依存性プロテインキナーゼリン酸化部位
；約アミノ酸２０４から約アミノ酸２０８、約アミノ酸２２０から約アミノ酸２
２４、約アミノ酸２８０から約アミノ酸２８４、約アミノ酸２８４から約アミノ
酸２８８、約アミノ酸３５１から約アミノ酸３５５及び約アミノ酸４４９から約
アミノ酸４５３のカゼインキナーゼＩＩリン酸化部位；及び約アミノ酸２２から
約アミノ酸２８、約アミノ酸７６から約アミノ酸８２、約アミノ酸７９から約ア
ミノ酸８５、約アミノ酸８０から約アミノ酸８６、約アミノ酸１１９から約アミ
ノ酸１２５、約アミノ酸１６９から約アミノ酸１７５、約アミノ酸１８７から約
アミノ酸１９３、約アミノ酸１９５から約アミノ酸２０１、約アミノ酸３３１か
ら約アミノ酸３３７、約アミノ酸３３２から約アミノ酸３３８及び約アミノ酸３
６０から約アミノ酸３６６のN-ミリストイル化部位。クローンＤＮＡ４０３７０
−１２１７は１９９７年１１月２１日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号
２０９４８５が付与されている。 図６（配列番号：１２）に示した全長配列のALIGN-2配列アラインメント分析
を用いたDayhoffデータベース（version 35.45 SwissProt 35）の分析は、ＰＲ
Ｏ３０２アミノ酸配列と卵黄形成カルボキシペプチダーゼとの間の配列同一性を
証明した。
【０２２６】 実施例４ 内皮管形成の刺激 このアッセイは、Davis及びCamarillo, Experimental Cell Research, 224:39
-51 (1996)に記載されたアッセイ、又はそれを次のように変形したものに従う：
プロトコール：ヒト静脈臍静脈内皮細胞（HUVEC, Cell Systems）（初生から８
未満の継代数）をＩ型ラット尾のコラーゲンと混合して、最終濃度２．６ｍｇ／
ｍｌ、密度６ｘ１０５細胞／ｍｌとし、９６ウェルプレートにウェル当たり５０
μｌで蒔いた。ゲルを３７℃で１時間の間、固化させ、１％のＦＢＳとＰＲＯ２
３０ポリペプチド試料（それぞれ１％、０．１％、及び０．０１％の希釈度）を
補填したウェル当たり５０μｌのＭ１９９培地を、形成の間に空胞を染色する１
μＭの６-ＦＡＭ-ＦＩＴＣ染料と共に加えた。細胞を２３７℃／５％ＣＯ２で４
８時間インキュベートし、室温で１０分間３．７％のホルマリンで固定し、ＰＢ
Ｓで５回洗浄し、ついで４℃で終夜、Ph-Phalloidinで染色し、４μＭのＤＡＰ
Ｉで核染色を行った。 １．アポトーシスアッセイ このアッセイは外因性成長因子（ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦでＰＭＡなし）の存在下
で３次元マトリックス中で細胞生存を容易にする因子を同定する。 正の結果は１に等しいか１より少ない。０＝アポトーシスなし、１＝細胞の２
０％未満がアポトーシスであり、２＝細胞の５０％未満がアポトーシスであり、
３＝５０％を越える細胞がアポトーシスである。この系におけるアポトーシスの
刺激剤はアポトーシス因子であると期待され、阻害剤はアポトーシスを防止する
か減少させると期待される。 ２．空胞アッセイ このアッセイはｂＦＧＦ及びＶＥＧＦ（４０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で内皮空胞
形成及び管腔形成を刺激する因子を同定する。 正の結果は２に等しいか２より大きい。１＝２０％未満の細胞に空胞が存在、
２＝２０−５０％の細胞に空胞が存在、３＝５０％を越える細胞に空胞が存在。
このアッセイは、飲細胞作用、イオンポンピング、透過性、接合部形成を刺激す
ることに関与する因子を同定するように設計された。 ３．管形成アッセイ このアッセイは３次元マトリックス中で内皮管形成を刺激する因子を同定する
ものである。このアッセイは内皮細胞を刺激して外因性成長因子（ＶＥＧＦ、ｂ
ＦＧＦ）の存在下で３次元マトリックス中で管様構造に分化させる因子を同定す
る。 正の結果は２に等しいか２より大きい。１＝細胞は全て丸い、２＝細胞は長い
、３＝細胞は幾つかの結合で管を形成している、４＝細胞は複雑な管状網目を形
成している。このアッセイは５０％を越える細胞に空胞が存在。このアッセイは
、輸送、走化性、又は内皮形状変化を刺激することに慣用する因子を同定する。 結果は、１％希釈度でのバッファー対照（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ／０．１４Ｍ
のＮａＣｌ／４％のマンニトール、ｐＨ６．８）と比較して、より複雑な管形成
が１％の希釈度のＰＲＯ２３０-ＩｇＧ及びＰＲＯ２３０-ポリ-Ｈｉｓ試料で生
じることを明らかに証明している。
【０２２７】 実施例５ 内皮細胞におけるｃ-ｆｏｓの誘導 このアッセイはＰＲＯ２１６（ヒトオステオモジュリン）が内皮細胞において
ｃ-ｆｏｓを誘導する能力を示すかどうかを決定するためのものである。 成長培地（５０％ハムのＦ１２ｗ／ｏＧＨＴ：低グルコース、及びグリシンな
しの５０％ＤＭＥＭ：ＮａＨＣＯ３、１％グルタミン、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、
１０％のＦＢＳ、１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ）中のヒト静脈臍静脈内皮細胞（HU
VEC, Cell Systems）を１ｘ１０４細胞／ウェルの細胞密度で９６ウェルマクロ
タイタープレートにプレーティングした。プレーティングの次の日、成長培地を
除き、細胞を１００μｌ／ウェルの試験試料と対照（正の対照：成長培地；負の
対照：１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１４０ｍＭのＮａＣｌ、４％（w/v）マンニトー
ル、ｐH6.8）で処理することにより、細胞を飢餓させた。細胞を５％ＣＯ２中で
３７℃で３０分間インキュベートした。試料を取り除いて、ＤＮＡキットプロト
コール（Chiron Diagnostics, cat.#6005-037）の最初の部分に従った。以下の
各大文字の試薬／バッファーはキットから利用できた。 簡単には、試験に必要なＴＭ溶菌バッファー(TM Lysis Buffer)及びプローブ
の量を製造者により提供された情報に基づいて計算した。適当な量の解凍プロー
ブをＴＭ溶菌バッファーに添加した。捕獲ハイブリッド形成バッファー(Capture
Hybridization Buffer)を室温まで温めた。ｂＤＮＡ条片を金属条片ホルダーに
セットアップし、１００μｌの捕獲ハイブリッド形成バッファーを必要な各ｂ-
ＤＮＡウェルに添加し、少なくとも３０分インキュベートした。細胞内の試験プ
レートをインキュベーターから取り除き、真空マニフォールドを使用して培地を
穏やかに除いた。マイクロタイタープレートの各ウェルに１００μｌのプローブ
を伴う溶菌ハイブリッド形成バッファーを各ｂ-ＤＮＡウェルにピペットで素早
く添加した。ついで、プレートを１５分間５５℃でインキュベートした。インキ
ュベーターからの取り出し、マイクロタイターアダプターヘッドを備えたボルテ
ックスミキサーにプレートを配し、１分の間、＃２セッティングでボルテックス
した。８０μｌのライセートを取り除き、捕獲ハイブリッド形成バッファーを含
むｂＤＮＡウェルに添加し、ピペットで上下して混合した。プレートを少なくと
も１６時間の間５３℃でインキュベートした。
【０２２８】 次の日に、ｂＤＮＡキットプロトコールの第２の部分に従った。すなわち、プ
レートをインキュベーターから取り除き、ベンチに配置して１０分間冷却した。
必要な添加の容積は製造者により適用された情報に基づいて計算した。ＡＬハイ
ブリッド形成バッファー中に１：１００の希釈のアンプリファイアー濃縮物（Am
plifier Concentrate）（２０ｆｍ／μｌ）を作成することにより５０μｌのア
ンプリファイアー作用液を調製した。ついで、プレートをインキュベーターから
取り除いて１０分間冷却した。標識プローブ作用液を、ＡＬハイブリッド形成バ
ッファー中に１：１００の希釈で標識濃縮物（４０ｐｍｏｌｅｓ／μｌ）を作成
することにより調製した。１０分の冷却期間後、アンプリファイアーハイブリッ
ド形成混合物を除去し、プレートを洗浄剤Ａで２回洗浄した。５０μｌの標識プ
ローブ作用液を各ウェルに添加し、ウェルを５３℃で１５分間インキュベートし
た。１０分間の冷却後、基質を室温まで温めた。アッセイに必要な各モルの基質
に３μｌの基質エンハンサーを添加して、プレートを１０分間冷却し、標識ハイ
ブリッド形成混合物を取り除き、プレートを洗浄剤Ａで２回、洗浄剤Ｄで３回洗
浄した。５０μｌのエンハンサーを伴う基質溶液を各ウェルに添加した。プレー
トを３７℃で３０分間インキュベートし、ＲＬＵを適当な照度計で読みとった。 複製を平均化し変動係数を決定した。負の対照（上述のＨＥＰＥＳバッファー
）値に対する増加倍数の活性の測定は化学発光単位（ＲＬＵ）によって示された
。負の対照値に対して少なくとも２倍の値を示す試料は正と考えられた。 ＰＲＯ２１６は２回「正」と検定された： （１）負の対照＝４．１８ＲＬＵ 正の対照＝１４．９５ＲＬＵ ０．０１％のＰＲＯ２１６＝１０．３３ＲＬＵ （２）負の対照＝６．３５ＲＬＵ 正の対照＝３０．４６ＲＬＵ ０．０１％のＰＲＯ２１６＝１３．３７ＲＬＵ
【０２２９】 実施例６ モルモット血管漏洩 このアッセイはＰＲＯ３０２ポリペプチドが血管透過性を誘導する能力を示す
かどうかを決定するためのものである。 ３５０ｇ又はそれ以上の無毛モルモットにケタミン（７０−８０ｍｇ／ｋｇ）
と５ｍｇ／ｋｇのキシラジンを筋肉内投与して麻酔をかけた。ＲＯ３０２ポリペ
プチド又は試験ポリペプチドを含まない生理緩衝液を含む試験試料を、注射部位
当たり１００μｌで試験動物の背の皮膚に皮内注射した。動物当たりおよそ１６
−２４の注射部位があった。ついで１ｍｌのエバンスブルー染料（ＰＢＳ中１％
）を心臓内注射した。化合物に対する皮膚血管透過性応答（すなわち、注射部位
の斑点）について、試験動物の投与１及び６時間後に注射部位からの青色の漏出
の直径（ｍｍ）を測定することで視覚によりスコアをつけた。注射部位の青さの
ｍｍ直径を観察し、血管漏出の重症度と共に記録した。少なくとも５ｍｍの直径
の斑点は、精製タンパク質を試験する場合はアッセイでは正であると考えられ、
血管漏出又は透過性を誘導する能力を示している。０．１μｇ／１００μｌのヒ
トＶＥＧＦが正の対照として使用され、１５−２３ｍｍ直径の応答を誘導した。 結果を以下の表２に示す。 表２ PRO名 注射後の時間 mm青さ(直径) PRO302 1.0 9.0 PRO302 6.0 9.0
【０２３０】 実施例７ インサイツハイブリッド形成 インサイツハイブリッド形成は、細胞又は組織調製物内での核酸配列の検出及
び局在化のための強力で多用途の技術である。それは、例えば、遺伝子発現部位
の同定、転写物の組織分布の分析、ウイルス感染の同定と局在化、特定のｍＲＮ
Ａ合成における変化の追跡及び染色体マッピングにおける補助に有用である。 インサイツハイブリッド形成は、Lu及びGillett, Cell Vision 1: 169-176 (1
994)のプロトコールの最適化バージョンに従って、ＰＣＲ生成３３Ｐ-標識リボ
プローブを用いて実施される。簡単には、ホルマリン固定、パラフィン包埋ヒト
組織を切片化し、脱パラフィンし、プロテイナーゼＫ（20g/ml）で１５分間３７
℃で脱タンパクし、さらに上掲のLu及びGillettに記載されたようにインサイツ
ハイブリッド形成する。(３３-Ｐ)ＵＴＰ-標識アンチセンスリボプローブをＰＣ
Ｒ産物から生成し、５５℃で終夜ハイブリッド形成する。スライドをKodak NTB2 TM 核トラックエマルションに浸漬して４週間露出する。 ３３Ｐ-リボプローブ合成 6.0μl（125mCi）の３３Ｐ-ＵＴＰ（Amersham BF 1002, SA＜2000 Ci/mmol）
をスピード真空乾燥させた。乾燥３３Ｐ-ＵＴＰを含む各管に以下の成分を添加
した： 2.0μlの5ｘ転写バッファー 1.0μlのＤＴＴ（100mM） 2.0μlのＮＴＰ混合物（2.5mM: 各10μlの10mM GTP, CTP及びATP+10μlのH2O
） 1.0μlのＵＴＰ（50μM） 1.0μlのＲＮＡｓｉｎ 1.0μlのＤＮＡテンプレート（1μg） 1.0μlのＨ２Ｏ 1.0μlのＲＮＡポメラーゼ（ＰＣＲ産物についてT3＝AS, T7=S,通常） 管を３７℃で１時間インキュベートし、1.0μlのRQ1 ＤＮａｓｅを添加し、次
いで３７℃で１５分間インキュベートした。90μlのＴＥ（10mMトリスpH7.6／1m
MのＥＤＴＡpH8.0）を添加し、混合物をDE81紙にピペットした。残りの溶液をMi
crocon-50限外濾過ユニットに負荷し、プログラム１０を用いてスピンさせた（6
分間）。濾過ユニットを第２の管に変換し、プログラム２を用いてスピンさせた
（3分間）。最終回収スピンの後、100μlのＴＥを添加した。1μlの最終生成物
をDE81紙にピペットし6mlのBIOFLUOR IITMで数えた。 プローブをＴＢＥ／尿素ゲル上で走らせた。1-3μlのプローブ又は5μlのＲＮ
Ａ ＭｒｋＩＩＩを3μlの負荷バッファーに添加した。加熱ブロック上で９５℃
に３分間加熱した後、ゲルを即座に氷上に置いた。ゲルのウェルをフラッシング
し、試料を負荷し、180-250ボルトで45分間走らせた。ゲルをサランラップでラ
ップし、−７０℃冷凍機内で補強スクリーンを持つＸＡＲフィルムに１時間から
終夜露出した。
【０２３１】 ３３Ｐ-ハイブリッド形成 Ａ．凍結切片の前処理 スライドを冷凍機から取り出し、アルミニウムトレイに配置して室温で５分間
解凍した。トレイを５５℃のインキュベータに５分間配置して凝結を減らした。
スライドを蒸気フード内において4%パラホルムアルデヒド中で５分間固定し、0.
5ｘＳＳＣで５分間室温で洗浄した（25ml 20xSSC + 975ml SQ H2O）。0.5μg/ml
のプロテイナーゼ中、３７℃で１０分間の脱タンパクの後（250mlの予備加熱Ｒ
Ｎａｓｅ無しＲＮａｓｅバッファー中の10mg/mlストック12.5μl）、切片を0.5
ｘＳＳＣで１０分間室温で洗浄した。切片を、70%、95%、100%エタノール中、各
2分間脱水した。 Ｂ．パラフィン包埋切片の前処理： スライドを脱パラフィンし、ＳＱ Ｈ２Ｏ中に配置し、2ｘＳＳＣで室温におい
て各々５分間２回リンスした。切片を20μg/mlのプロテイナーゼＫ（250ｍｌの
ＲＮａｓｅ無しＲＮａｓｅバッファー中10mg/mlを500μｌ；３７℃、１５分間）
−ヒト胚又は８ｘプロテイナーゼＫ（250mlのＲＮａｓｅバッファー中100μl、
３７℃、３０分間）−ホルマリン組織で脱タンパクした。続く0.5ｘＳＳＣでの
リンス及び脱水は上記のように実施した。 Ｃ．プレハイブリッド化： スライドをＢｏｘバッファー（4ｘＳＳＣ、50%ホルムアミド）−飽和濾紙で列
を作ったプラスチックボックスに並べた。組織を50μlのハイブリッド形成バッ
ファー（3.75gデキストラン硫酸＋6mlＳＱ Ｈ２Ｏ）で被覆し、ボルテックスし
、キャップを外して２分間マイクロ波で加熱した。氷上で冷却した後、18.75ml
のホルムアミド、3.75ｍｌの20ｘＳＳＣ及び9mlのＳＱ Ｈ２Ｏを添加し、組織を
良くボルテックスし、４２℃で1-4時間インキュベートした。 Ｄ．ハイブリッド形成： スライド当たり1.0ｘ10６cpmのプローブ及び1.0μlのｔＲＮＡ（50mg/mlスト
ック）を９５℃で３分間加熱した。スライドを氷上で冷却し、スライド当たり48
μlのハイブリッド形成バッファーを添加した。ボルテックスの後、50μlの３３
Ｐ混合物をスライド上のプレハイブリッド50μlに添加した。スライドを５５℃
で終夜インキュベートした。 Ｅ．洗浄： 洗浄は、2ｘ10分間、2ｘＳＳＣ、ＥＤＴＡで室温で実施し（400mlの20ｘSSC＋
16mlの0.25M EDTA、Ｖｆ＝４Ｌ）、次いでＲＮａｓｅＡ処理を３７℃で３０分間
行った（250mlＲＮａｓｅバッファー中10mg/mlを500μｌ＝20μg/ml）。スライ
ドを2ｘ10分間、ＥＤＴＡで室温において洗浄した。緊縮性洗浄条件は次の通り
：５５℃で２時間、0.1ｘＳＳＣ、ＥＤＴＡ（20mlの20ｘSSC＋16mlのEDTA、Ｖｆ ＝４Ｌ）。
【０２３２】 Ｆ．オリゴヌクレオチド ここに開示したＤＮＡ配列の二つについてインサイツ分析を実施した。これら
の分析に対して用いたオリゴヌクレオチドは次の通りである： （１）ＤＮＡ３３２２３−１１３６（ＰＲＯ２３０） 33223p1： 5'-GGATTCTAATACGACTCACTATAGGGCGGCGATGTCCACTGGGGCTAC-3'(配列番号：１７) 33223p2： 5'-CTATGAAATTAACCCTCACTAAAGGGACGAGGAAGATGGGCGGATGGT-3'(配列番号：１８) （２）ＤＮＡ３３０８７（ＰＲＯ２１６） 33087p1： 5'-GGATTCTAATACGACTCACTATAGGGCTGGATGGGCTAGTAAACTTGA-3'(配列番号：１９) 33087p2： 5'-CTATGAAATTAACCCTCACTAAAGGGACCCTTCTGCTCCTTCTTGTT-3'(配列番号：２０) Ｇ．結果 ここに開示した上記の２つのＤＮＡ配列についてインサイツ分析を実施した。
これらの分析からの結果は次の通りである： （１）ＤＮＡ３３２２３−１１３６（ＰＲＯ２３０） 切片は胎児の動脈及び静脈血管に付随した強いシグナルを示した。動脈では、
シグナルは平滑筋／周皮細胞に制限されているようにみえた。シグナルは毛細血
管と糸球体にもまた見られた。内皮細胞がこのｍＲＮＡを発現していたかどうか
明らかではなかった。発現はまた胎児水晶体の内皮細胞にも観察された。強い発
現がまた胎盤栄養膜絨毛内の細胞にも見られた；これらの細胞は胎盤とＨＧＦ未
定組織形成を発現する線維芽細胞様細胞の間にある。成人では発現の証拠はなく
、大動脈と殆どの血管の壁は陰性のようであった。しかし、発現は正常な前立腺
と胆嚢の内側の上皮の血管チャネルにわたって見られた。インシュアラー発現は
軟部組織肉腫と腎細胞ガンの血管に見られた。 要約すると、ＰＲＯ２３０は胎児並びに幾つかの成人の器官に比較的特異的な
血管発現を示す分子である。発現はまた胎児水晶体と成人胆嚢に観察された。 二次スクリーンでは、血管発現は上で観察されたものと同様に、胎児ブロック
で観察された。発現はまた内皮よりもむしろ血管平滑筋上であった。発現はまた
発育中の食道の平滑筋にも見られ、よってこの分子は血管特異的ではない。４つ
の肺及び４つの乳ガンにおいて発現が試験された。大幅な発現は４つの肺ガンの
うち少なくとも３つと４つの乳ガンのうち２つの血管平滑筋に見られた。また、
１つの乳ガンでは、未定組織形成（おそらくは筋線維芽細胞）の腫瘍周囲間質細
胞に発現が観察された。この実験では内皮細胞発現は観察されなかった。 （２）ＤＮＡ３３０８７（ＰＲＯ２１６） 切片は骨芽細胞中の内軟骨と骨膜の新骨形成の全ての部位で強い特異的発現を
示した。発現のさらなる部位には発育中の肺動脈及び大動脈幹を含んでいた。そ
の他、全ての検査した胎児組織は陰性であった。検査した胎児組織は、胎盤、臍
帯、脳、脊髄、眼、視神経、気管、肺、心臓、胸腺、肝臓、脾臓、食道、小腸、
膵臓、副腎、甲状腺、体壁、及び下肢を含んでいた。成人組織の全てが陰性であ
った。検査した成人組織は、肝臓、腎臓、副腎、心筋、大動脈、脾臓、リンパ節
、膵臓、肺及び皮膚を含んでいた。ＰＲＯ２１６は骨基質堆積及び／又は骨芽細
胞成長の制御に役割を有している可能性がある。複数ブロックの全ての成人組織
はβアクチンに対して陽性であった。
【０２３３】 実施例８ ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２のハイブリッド形成プローブとし
ての使用 以下の方法は、ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２をコードするヌ
クレオチド配列のハイブリッド形成プローブとしての使用を記述する。 （それぞれ図１Ａ−１Ｂ、３及び５、それぞれ配列番号：１、６及び１１に示
されたような）全長又は成熟ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２又は
その断片のコード化配列を含むＤＮＡは、ヒト組織ｃＤＮＡライブラリ又はヒト
組織ゲノムライブラリの同種ＤＮＡ（ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３
０２の天然発生変異体をコードするもの等）のスクリーニングのためのプローブ
として用いられ得る。 ハイブリッド形成及びいずれかのライブラリＤＮＡを含むフィルターの洗浄は
、以下の高緊縮性条件下で実施される。ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ
３０２ポリペプチドをコードしている遺伝子から誘導された放射標識プローブの
フィルターへのハイブリッド形成は、50%ホルムアミド、5x ＳＳＣ、0.1%ＳＤＳ
、0.1%ピロリン酸ナトリウム、50mMリン酸ナトリウム、pH6.8、2xデンハード液
、及び10%デキストラン硫酸の溶液中で４２℃で２０時間実施した。フィルター
の洗浄は、0.1xＳＳＣ及び0.1%ＳＤＳ水溶液中で、４２℃で実施した。 全長天然配列をコードするＤＮＡと所望の同一性を持つＤＮＡは、次いでこの
分野で知られた標準的技術を用いて同定できる。
【０２３４】 実施例９ 大腸菌におけるＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２の発現 この実施例は、大腸菌での組換え発現による非グリコシル化形態のＰＲＯ２３
０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２の調製を例示する。 ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２（それぞれ配列番号：１、６及
び１１）をコードするＤＮＡ配列を、選択したＰＣＲプライマーを用いて最初に
増幅した。プライマーは、選択された発現ベクターの制限酵素部位に対応する制
限酵素部位を持たなければならない。種々の発現ベクターが用いられる。好適な
ベクターの例は、ｐＢＲ３２２（大腸菌から誘導されたもの；Bolivar等, Gene,
2:95 (1977)参照）であり、アンピシリン及びテトラサイクリン耐性についての
遺伝子を含む。ベクターは、制限酵素で消化され脱リン酸される。ＰＣＲ増幅し
た配列は、次いでベクターに結合させる。ベクターは、好ましくは抗生物質耐性
遺伝子、ｔｒｐプロモーター、ポリｈｉｓリーダー（最初の６つのＳＴＩＩコド
ン、ポリｈｉｓ配列、及びエンテロキナーゼ切断部位を含む）、ＰＲＯ２３０、
ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２コード化領域、ラムダ転写終結区、及びａｒｇＵ
遺伝子を含む。 ライゲーション混合物は、次いで、上掲のSambrook等に記載された方法を用い
た選択した大腸菌の形質転換に使用される。形質転換体は、それらのＬＢプレー
トで成長する能力により同定され、次いで抗生物質耐性クローンが選択される。
プラスミドＤＮＡが単離され、制限分析及びＤＮＡ配列決定で確認される。 選択されたクローンは、抗生物質を添加したＬＢブロスなどの液体培地で終夜
成長させることができる。終夜培地は、続いて大規模培地の播種に用いられる。
次に細胞を最適密度で成長させ、その間に発現プロモーターが作動する。 更に数時間の培養の後、細胞を遠心分離により採集できる。遠心分離で得られ
た細胞ペレットは、この分野で知られた種々の試薬を用いて可溶化され、ついで
可溶化ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２タンパク質を金属キレート
化カラムを用いてタンパク質を緊密に結合させる条件下で精製できる。
【０２３５】 実施例１０ 哺乳動物細胞におけるＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２をコードす
る核酸のの発現 この実施例は、哺乳動物細胞での組換え発現による潜在的にグリコシル化形態
のＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２の調製を例示する。 発現ベクターとしてベクターｐＲＫ５（1989年3月15日発行のEP 307,247参照
）を用いた。場合によっては、ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２Ｄ
ＮＡを選択した制限酵素でｐＲＫ５に結合させ、上掲のSambrook等に記載された
ような結合方法を用いてＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２コードＤ
ＮＡの挿入を行う。得られたベクターは、ｐＲＫ５-(ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１
６又はＰＲＯ３０２コードＤＮＡ)と呼ばれる。 一実施態様では、選択された宿主細胞は２９３細胞とすることができる。ヒト
２９３細胞（ATCC CCL 1573）は、子ウシ胎児血清及び場合によっては滋養成分
又は抗生物質を添加したＤＭＥＭなどの媒質中で組織培養プレートにおいて成長
させて集密化した。約１０μｇのｐＲＫ５-(ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰ
ＲＯ３０２コードＤＮＡ)を約1μgのＶＡ ＲＮＡ遺伝子をコードするＤＮＡ［Th
immappaya等, Cell, 31:543 (1982))］と混合し、５００μｌの1mMトリス-ＨＣ
ｌ、0.1mMのＥＤＴＡ、0.227MのＣａＣｌ２に溶解させた。この混合物に、滴状
の、500μlの50mMのＨＥＰＥＳ（pH7.35）、280mmのＮａＣｌ、1.5mMのＮａＰＯ ４ を添加し、２５℃で10分間析出物を形成させた。析出物を懸濁し、２９３細胞
に加えて３７℃で約4時間定着させた。培養培地を吸引し、2mlのＰＢＳ中20%グ
リセロールを３０秒間添加した。２９３細胞は、次いで無血清培地で洗浄し、新
鮮な培地を添加し、細胞を約５日間インキュベートした。 形質移入の約２４時間後、培養培地を除去し、培養培地（のみ）又は200μCi/
mlの３５Ｓ-システイン及び200μCi/mlの３５Ｓ-メチオニンを含む培養培地で置
換した。１２時間のインキュベーションの後、条件培地を回収し、スピンフィル
ターで濃縮し、15%ＳＤＳゲルに添加した。処理したゲルを乾燥させ、ＰＲＯ２
３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドの存在を現す選択された時間
にわたってフィルムに暴露した。形質転換した細胞を含む培地は、更なるインキ
ュベーションを施し（無血清培地で）、培地を選択されたバイオアッセイで試験
した。 これに換わる技術では、ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２をコー
ドする遺伝子を、Somparyac等, Proc. Natl. Acad. Sci., 12:7575 (1981)に記
載されたデキストラン硫酸法を用いて２９３細胞に一過的に導入してもよい。２
９３細胞は、スピナーフラスコ内で最大密度まで成長させ、700μgのｐＲＫ５-(
ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２コードＤＮＡ)を添加する。細胞
は、まずスピナーフラスコから遠心分離によって濃縮し、ＰＢＳで洗浄した。Ｄ
ＮＡ−デキストラン沈殿物を細胞ペレット上で４時間インキュベートした。細胞
を20%グリセロールで90秒間処理し、組織培養培地で洗浄し、組織培養培地、5μ
ｇ/mlウシインシュリン及び0.1μg/mlウシトランスフェリンを含むスピナーフラ
スコに再度導入した。約４日後に、条件培地を遠心分離して濾過し、細胞及び細
胞片を除去した。次いでＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２をコード
する発現された遺伝子を含む試料を濃縮し、透析又はカラムクロマトグラフィー
等の選択した方法によって精製した。
【０２３６】 他の実施態様では、ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２をコードす
る遺伝子をＣＨＯ細胞で発現させることができる。ｐＲＫ５-(ＰＲＯ２３０、Ｐ
ＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２コードＤＮＡ)核酸は、ＣａＰＯ４又はＤＥＡＥ-デ
キストランなどの公知の試薬を用いてＣＨＯ細胞に形質移入することができる。
上記したように、細胞培地をインキュベートし、培地を培養培地（単独）又は３ ５ Ｓ-メチオニン等の放射性標識を含む培地に置換することができる。ＰＲＯ２
３０、ＰＲＯ１２６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドの存在を同定した後、培養培
地を無血清培地に置換してもよい。好ましくは、培地を約６日間インキュベート
し、次いで条件培地を収集する。次いで、発現されたＰＲＯ２３０、ＰＲＯ１２
６又はＰＲＯ３０２を含む培地を濃縮して、選択した方法にとって精製すること
ができる。 ＰＲＯ２３０とＰＲＯ２１６は上述した方法によりＣＨＯ細胞中で安定に発現
された。 また、ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドをコードし
ているエピトープタグ遺伝子を、宿主ＣＨＯ細胞において発現させてもよい。Ｐ
ＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２をコードしている遺伝子はｐＲＫ５
ベクターからサブクローニングしてもよい。サブクローン挿入物はＰＣＲ増幅を
受けてバキュロウイルス発現ベクター中にポリ-ｈｉｓタグ等の選択されたエピ
トープタグとインフレームで融合できる。ポリ-ｈｉｓタグＰＲＯ２３０、ＰＲ
Ｏ２１６又はＰＲＯ３０２をコードする遺伝子挿入物は、次いで、安定なクロー
ンの選択のためのＤＨＦＲ等の選択マーカーを含むＳＶ４０誘導ベクターにサブ
クローニングできる。最後に、ＣＨＯ細胞をＳＶ４０誘導ベクターで（上記のよ
うに）形質移入した。発現を確認するために、上記のように標識化を行ってもよ
い。発現されたポリ-ｈｉｓタグＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２
をコードする発現遺伝子を含む培地を次いで濃縮し、Ｎｉ２＋-キレートアフィ
ニティクロマトグラフィー等の選択された方法により精製できる。
【０２３７】 実施例１１ 酵母菌でのＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２をコードする核酸の発
現 以下の方法は、酵母菌中でのＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２を
コードする遺伝子の組換え発現を記載する。 第１に、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーターからのＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１
６又はＰＲＯ３０２の細胞内生産又は分泌のための酵母菌発現ベクターを作成す
る。ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２をコードするＤＮＡ及びプロ
モーターを選択したプラスミドの適当な制限酵素部位に挿入してＰＲＯ２３０、
ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２をコードする遺伝子の細胞内発現を指示する。分
泌のために、ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２をコードするＤＮＡ
を選択したプラスミドに、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーター、天然ＰＲＯ２３
０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２シグナルポリペプチド又は他の哺乳類シグナ
ルペプチドをコードするＤＮＡ、又は、例えば酵母菌アルファ因子分泌シグナル
／リーダー配列、及び（必要ならば）ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３
０２の発現のためのリンカー配列とともにクローニングすることができる。 酵母菌株ＡＢ１１０等の酵母菌は、次いで上記の発現プラスミドで形質転換し
、選択された発酵培地中で培養できる。形質転換した酵母菌上清は、１０％トリ
クロロ酢酸での沈降及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離で分析し、次いでクマシー
ブルー染色でゲルの染色をすることができる。 続いて組換えＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２は、発酵培地から
遠心分離により酵母菌細胞を除去し、次いで選択されたカートリッジフィルター
を用いて培地を濃縮することによって単離及び精製できる。ＰＲＯ２３０、ＰＲ
Ｏ２１６又はＰＲＯ３０２を含む濃縮物は、選択されたカラムクロマトグラフィ
ー樹脂を用いてさらに精製してもよい。
【０２３８】 実施例１２ バキュロウイルス感染昆虫細胞でのＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０
２をコードする核酸の発現 以下の方法は、バキュロウイルス感染昆虫細胞中における組換え発現を記載す
る。 ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２をコードする配列は、バキュロ
ウイルス発現ベクターに含まれるエピトープタグの上流に融合させた。このよう
なエピトープタグは、ポリ-ｈｉｓタグ及び免疫グロブリンタグ（ＩｇＧのＦｃ
領域など）を含む。ｐＶＬ１３９３（Navogen）などの市販されているプラスミ
ドから誘導されるプラスミドを含む種々のプラスミドを用いることができる。簡
単には、ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２又はＰＲＯ２３０、ＰＲ
Ｏ２１６又はＰＲＯ３０２の所定部分［膜貫通タンパク質の細胞外ドメインをコ
ードする配列など］が、５’及び３’領域に相補的なプライマーでのＰＣＲによ
り増幅される。５’プライマーは、隣接する（選択された）制限酵素部位を包含
していてもよい。生成物は、次いで、選択された制限酵素で消化され、発現ベク
ターにサブクローニングされる。 組換えバキュロウイルスは、上記のプラスミド及びBaculoGoldＴＭウイルスＤ
ＮＡ（Pharmingen）を、Spodoptera frugiperda（「Ｓｆ９」）細胞（ATCC CRL
1711）中にリポフェクチン（GIBCO-BRLから市販）を用いて同時形質移入するこ
とにより作成される。２８℃で４−５日インキュベートした後、放出されたウイ
ルスを回収し、更なる増幅に用いた。ウイルス感染及びタンパク質発現は、O'Re
illey等, Baculovirus expression vectors: A laboratory Manual, Oxford: Ox
ford University Press (1994)に記載されているように実施した。 次いで、発現されたポリ-ｈｉｓタグＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ
３０２は、例えば、Ｎｉ２＋-キレートアフィニティクロマトグラフィーにより
以下のように精製される。抽出物は、Rupert等, Nature, 362:175-179 (1993)に
記載されているように、ウイルス感染した組み換えＳｆ９細胞から調製した。簡
単には、Ｓｆ９細胞を洗浄し、超音波処理用バッファー（25mlのＨｅｐｅｓ、pH
7.9；12.5mMのＭｇＣｌ２；0.1mMのＥＤＴＡ；10%のグリセロール；0.1%のＮＰ-
４０；0.4MのＫＣｌ）中に再懸濁し、氷上で2回20秒間超音波処理した。超音波
処理物を遠心分離で透明化し、上清を負荷バッファー（50mMリン酸塩、300mMＮ
ａＣｌ、10%のグリセロール、pH7.8）で50倍希釈し、0.45μｍフィルターで濾過
した。Ｎｉ２＋-ＮＴＡアガロースカラム（Qiagenから市販）を5mlの総容積で調
製し、25mlの水で洗浄し、25mlの負荷バッファーで平衡させた。濾過した細胞抽
出物は、毎分0.5mlでカラムに負荷した。カラムを、分画回収が始まる点である
Ａ２８０のベースラインまで負荷バッファーで洗浄した。次に、カラムを、結合
タンパク質を非特異的に溶離する二次洗浄バッファー（50mMのリン酸塩；300mM
のＮａＣｌ、10%のグリセロール、pH6.0）で洗浄した。Ａ２８０のベースライン
に再度到達した後、カラムを二次洗浄バッファー中で0から500mMのイミダゾール
勾配で展開した。1mlの分画を回収し、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ及び銀染色又はアルカリ
ホスファターゼ（Qiagen）に複合したＮｉ２＋-ＮＴＡでのウェスタンブロット
で分析した。溶離したＨｉｓ１０−タグＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ
３０２を含む分画をプールし、負荷バッファーで透析した。 あるいは、ＩｇＧタグ（又はＦｃタグ）-ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰ
ＲＯ３０２の精製は、例えば、プロテインＡ又はプロテインＧカラムクロマトグ
ラフィーを含む公知のクロマトグラフィー技術を用いて実施できる。
【０２３９】 ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６は、バキュロウイルス感染したＳｆ９昆虫細胞で
発現された。発現は実際には0.5-2Lのスケールであったが、容易により大きな（
例えば8L）調製にスケールアップできる。タンパク質はＩｇＧ作成物（イムノア
ドヘシン）として発現され、そこではタンパク質細胞外領域がヒンジ、ＣＨ２及
びＣＨ３ドメイン及び／又はポリ-Ｈｉｓタグ形態を含むＩｇＧ１定常領域配列
に融合している。 ＰＣＲ増幅に続いて、対応するコード化配列をバキュロウイルス発現ベクター
（ＩｇＧ融合物に対するpb.PH.IgG及びポリＨｉｓタグに対するpb.PH.His.c）に
サブクローニングし、そのベクター及びBaculogold(登録商標)バキュロウイルス
ＤＮＡ（Pharmingen）を１０５スポドプテラグルヒペルダ（Spodoptera frugipe
rda）（「Ｓｆ９」）細胞（ATCC CRL 1711）にリポフェクチン（Gibco BRL）を
用いて同時形質移入した。pb.PH.IgG及びPH.His.cは、市販のバキュロウイルス
発現ベクターｐＶＬ１３９３（Pharmingen）の修飾物であり、Ｈｉｓ又はＦｃタ
グ配列を含むように修飾されたポリリンカー領域を持つ。細胞を、10%のＦＢＳ
（Hyclone）を添加したHinkのＴＮＭ-ＦＭ培地で成長させた。細胞は、２８℃で
５日間インキュベートした。上清を回収し、続いて10%ＦＢＳを添加したHinkの
ＴＮＭ-ＦＨ培地におけるＳｆ９細胞感染による約10の感染効率（ＭＯＩ）での
最初のウイルス増幅に用いた。細胞を２８℃で３日間インキュベートした。上清
を回収し、バキュロウイルス発現ベクターにおける作成物の発現を、1mlの上清
の25mLのヒスチジンタグタンパク質用のＮｉ２＋-ＮＴＡビーズ（QIAGEN）又は
ＩｇＧタグタンパク質用のプロテインＡセファロースCL-4Bビーズ（Pharmacia）
へのバッチ結合、次いでクマシーブルー染色により周知の濃度のタンパク質標準
と比較するＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により測定した。 第１の増幅ウイルス上清をＥＳＦ-９２１培地（Expression System LLC）で成
長させたＳｆ９細胞のスピナー培地（500ml）の約０．１のＭＯＩでの感染に使
用した。細胞は２８℃で３日間インキュベートした。上清を回収して濾過した。
バッチ結合及びＳＤＳ−ＰＡＧＥを、スピナー培地の発現が確認されるまで、必
要に応じて繰り返した。 形質移入細胞からの条件培地（0.5〜3L）を、遠心分離により細胞を除去し0.2
2ミクロンフィルターを通して濾過することにより回収した。ポリ-Ｈｉｓタグ作
成物については、配列を含むタンパク質をＮｉ２＋-ＮＴＡカラム（Qiagen）を
用いて精製した。精製前に、イミダゾールを条件培地に5mMの濃度まで添加した
。条件培地を、0.3MのＮａＣｌ及び5mMイミダゾールを含む20mMのＨｅｐｅｓ, p
H7.4バッファーで平衡化した6mlのNi2+-NTAカラムに4-5ml/分の流速で４℃にお
いてポンプ供給した。負荷後、カラムをさらに平衡バッファーで洗浄し、タンパ
ク質を0.25Mイミダゾールを含む平衡バッファーで溶離した。高度に精製された
タンパク質は、続いて10mMのＨｅｐｅｓ、0.14MのＮａＣｌ及び4%のマンニトー
ルを含む貯蔵バッファー, pH6.8中で25mlのG25 Superfine（Pharmacia）を用い
て脱塩し、−８０℃で貯蔵した。
【０２４０】 タンパク質のイムノアドヘシン（Ｆｃ含有）作成物を以下のようにして条件培
地から精製した。条件培地を、20mMのリン酸ナトリウムバッファー, pH6.8で平
衡化した5mlのプロテインＡカラム（Pharmacia）に負荷した。負荷後、カラムを
平衡バッファーで強く洗浄した後、100mMのクエン酸, pH3.5で溶離した。溶離し
たタンパク質は、1mlの画分を275mLの1Mトリスバッファー, pH9を含む管に回収
することにより即座に中性化した。高度に精製されたタンパク質は、続いてポリ
-Ｈｉｓタグタンパク質について上記した貯蔵バッファー中で脱塩した。タンパ
ク質の均一性はＳＤＳポリアクリルアミドゲル（ＰＥＧ）電気泳動及びエドマン
(Edman)分解によるＮ-末端アミノ酸配列決定により評価できる。 あるいは、修飾バキュロウイルス法をｈｉｇｈ５細胞取り込みに使用してもよ
い。この方法では、所望の配列をコードするＤＮＡは、Ｐｆｕ（Stratagene）等
の適当な系で増幅されても、又はバキュロウイルス発現ベクターの含まれるエピ
トープタグの上流（5'-）に融合させてもよい。このようなエピトープタグは、
ポリ-Ｈｉｓタグ及び免疫グロブリンタグ（ＩｇＧのＦｃ領域等）を含む。種々
のプラスミドを用いることができ、ｐＩＥ-１（Novagen）等の市販のプラスミド
から誘導されたプラスミドを含む。ｐＩＥ-１及びｐＩＥ-２ベクターは、安定に
形質転換された昆虫細胞におけるバキュロウイルスｉｅ１プロモーターからの組
換えタンパク質の構成的発現のために設計される。このプラスミドは複数のクロ
ーニング部位の方向においてのみ相違し、未感染昆虫細胞におけるｉｅ１媒介遺
伝子発現に重要であることが知られた全てのプロモーター配列並びにｈｒ５エン
ハンサー成分を含む。ｐＩＥ-１及びｐＩＥ-２はｉｅ翻訳開始部位を含み、融合
タンパク質の製造に使用できる。簡単には、所望の配列又は配列の所望の部分（
膜貫通タンパク質の細胞外ドメインをコードする配列など）を、５'及び３'領域
に相補的なプライマーでのＰＣＲにより増幅する。５'プライマーは隣接する（
選択された）制限酵素部位を導入してもよい。生成物は、次いで、選択された制
限酵素で消化して発現ベクターにサブクローニングされる。例えば、ｐＩＥｌ-
１の誘導体はヒトＩｇＧ（pb.PH.IgG）のＦｃ領域又は８ヒスチジン（pb.PH.His
）タグ下流（3'-）を含むことができる。好ましくは、ベクター作成物は確認の
ために配列決定される。
【０２４１】 Ｈｉｇｈ-５細胞は、２７℃、ＣＯ２無し、pen/strep無しの条件下で50%の集
密度まで成長させた。150mmプレート各々について、30μgのＰＲＯポリペプチド
を含むｐＩＥベースベクターを1mlのＥｘ-細胞培地（媒質：Ex-細胞401＋1/100
のL-Ｇｌｕ JRH Biosciences #14401-78P（注：この媒質は光感受性））と混合
し、別の管において、100μlのセルフェクチン（CellFECTIN(Gibco BRL #10362-
010)(ボルテックスで混合)）を1mlのＥｘ-細胞培地と混合した。２つの溶液を混
合し、室温で１５分間インキュベーションした。8mlのＥｘ-細胞培地を2mlのＤ
ＮＡ／セルフェクチン混合物に添加し、Ｅｘ-細胞培地で１回洗浄したＨｉ５細
胞上に層形成させた。次いでプレートを暗中室温でインキュベートした。次いで
ＤＮＡ／セルフェクチン混合物を吸引し、細胞をＥｘ-細胞で１回戦乗して過剰
のセルフェクチンを除去した。30mlの新鮮なＥｘ-細胞培地を添加し、細胞を２
８℃で３日間インキュベートした。上清を回収して、バキュロウイルス感染ベク
ターでのＰＲＯポリペプチドの発現を、1mlの上清の25mLのヒスチジンタグタン
パク質用のＮｉ２＋-ＮＴＡビーズ（QIAGEN）又はＩｇＧタグタンパク質用のプ
ロテインＡセファロースCL-4Bビーズ（Pharmacia）へのバッチ結合、次いでクマ
シーブルー染色により周知の濃度のタンパク質標準と比較するＳＤＳ−ＰＡＧＥ
分析により測定した。 形質移入細胞からの条件培地（0.5〜3L）を、遠心分離により細胞を除去し0.2
2ミクロンフィルターを通して濾過することにより回収した。ポリ-Ｈｉｓタグ作
成物については、タンパク質作成物をＮｉ２＋-ＮＴＡカラム（Qiagen）を用い
て精製した。精製前に、イミダゾールを条件培地に5mMの濃度まで添加した。条
件培地を、0.3MのＮａＣｌ及び5mMイミダゾールを含む20mMのＨｅｐｅｓ, pH7.4
バッファーで平衡化した6mlのNi2+-NTAカラムに4-5ml/分の流速で４８℃におい
てポンプ供給した。負荷後、カラムをさらに平衡バッファーで洗浄し、タンパク
質を0.25Mイミダゾールを含む平衡バッファーで溶離した。高度に精製されたタ
ンパク質は、続いて10mMのＨｅｐｅｓ、0.14MのＮａＣｌ及び4%のマンニトール
を含む貯蔵バッファー, pH6.8中で25mlのG25 Superfine（Pharmacia）を用いて
脱塩し、−８０℃で貯蔵した。 タンパク質のイムノアドヘシン（Ｆｃ含有）作成物を以下のようにして条件培
地から精製した。条件培地を、20mMのリン酸ナトリウムバッファー, pH6.8で平
衡化した5mlのプロテインＡカラム（Pharmacia）に負荷した。負荷後、カラムを
平衡バッファーで強く洗浄した後、100mMのクエン酸, pH3.5で溶離した。溶離し
たタンパク質は、1mlの画分を275mLの1Mトリスバッファー, pH9を含む管に回収
することにより即座に中性化した。高度に精製されたタンパク質は、続いてポリ
-Ｈｉｓタグタンパク質について上記した貯蔵バッファー中で脱塩した。ＰＲＯ
ポリペプチドの均一性はＳＤＳポリアクリルアミドゲル及びエドマン(Edman)分
解によるＮ-末端アミノ酸配列決定及び所望又は必要に応じて他の分析手法によ
り評価できる。 ＰＲＯ２１６及びＰＲＯ３０２は、ｈｉｇｈ５細胞を導入する上記の改変バキ
ュロウイルス法により成功裏に発現された。
【０２４２】 実施例１３ ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２に結合する抗体の調製 この実施例は、ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２に特異的に結合
できるモノクローナル抗体の調製を例示する。 モノクローナル抗体の生産のための技術は、この分野で知られており、例えば
、上掲のGodingに記載されている。用いられ得る免疫原は、ＰＲＯ２３０、ＰＲ
Ｏ２１６又はＰＲＯ３０２を含む精製ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３
０２融合タンパク質、細胞表面に組換えＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ
３０２をコードする遺伝子を発現する細胞を含む。免疫原の選択は、当業者が過
度の実験をすることなくなすことができる。 Ｂａｌｂ／ｃ等のマウスを、完全フロイントアジュバントに乳化して皮下又は
腹腔内に１−１００マイクログラムで注入したＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又は
ＰＲＯ３０２免疫原で免疫化する。あるいは、免疫原をＭＰＬ−ＴＤＭアジュバ
ント（Ribi Immunochemical Researh, Hamilton, MT）に乳化し、動物の後足蹠
に注入してもよい。免疫化したマウスは、次いで１０から１２日後に、選択した
アジュバント中に乳化した付加的免疫源で追加免疫する。その後、数週間、マウ
スをさらなる免疫化注射で追加免疫する。抗-ＰＲＯ２３０、抗-ＰＲＯ２１６又
は抗-ＰＲＯ３０２抗体の検出のためのＥＬＩＳＡアッセイで試験するために、
レトロオービタル出血からの血清試料をマウスから周期的に採取してもよい。 適当な抗体力価が検出された後、抗体に「ポジティブ」な動物に、ＰＲＯ２３
０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２の静脈内注射の最後の注入をすることができ
る。３から４日後、マウスを屠殺し、脾臓を取り出した。次いで脾臓細胞を（３
５％ポリエチレングリコールを用いて）、ＡＣＴＴから番号ＣＲＬ１５９７で入
手可能なＰ３Ｘ６３ＡｇＵ．１等の選択されたマウス骨髄腫細胞系に融合させた
。融合によりハイブリドーマ細胞が生成され、次いで、ＨＡＴ（ヒポキサンチン
、アミノプテリン、及びチミジン）培地を含む９６ウェル組織培養プレートに蒔
き、非融合細胞、骨髄腫ハイブリッド、及び脾臓細胞ハイブリッドの増殖を阻害
した。 ハイブリドーマ細胞は、ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２に対す
る反応性についてのＥＬＩＳＡでスクリーニングされる。所望のＰＲＯ２３０、
ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２に対するモノクローナル抗体を分泌する「ポジテ
ィブ」ハイブリドーマ細胞の決定は、技術常識の範囲内である。 ポジティブハイブリドーマ細胞を同系のＢａｌｂ／ｃマウスに腹腔内注入し、
抗-ＰＲＯ２３０、抗-ＰＲＯ２１６又は抗-ＰＲＯ３０２モノクローナル抗体を
含む腹水を生成させる。あるいは、ハイブリドーマ細胞を、組織培養フラスコ又
はローラーボトルで成長させることもできる。腹水中に生成されたモノクローナ
ル抗体の精製は、硫酸アンモニウム沈降、それに続くゲル排除クロマトグラフィ
−を用いて行うことができる。あるいは、抗体のプロテインＡ又はプロテインＧ
への親和性に基づくアフィニティクロマトグラフィーを用いることもできる。
【０２４３】 材料の寄託 次の細胞系をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション,10801 ユニバ
ーシティブールバール、マナッサス、ＶＡ20110-2209、米国(ATCC)に寄託した： 材料 ATCC寄託番号 寄託日 DNA33223-1136 209264 1997年9月16日 DNA33087 209381 1997年10月16日 DNA40370-1217 209485 1997年11月21日 この寄託は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条
約及びその規則(ブダペスト条約)の規定に従って行われた。これは、寄託の日付
から３０年間、寄託の生存可能な培養が維持されることを保証するものである。
寄託物はブダペスト条約の条項に従い、またジェネンテク社とＡＴＣＣとの間の
合意に従い、ＡＴＣＣから入手することができ、これは、どれが最初であろうと
も、関連した米国特許の発行時又は任意の米国又は外国特許出願の公開時に、寄
託培養物の後代を永久かつ非制限的に入手可能とすることを保証し、米国特許法
第１２２条及びそれに従う特許庁長官規則(特に参照番号８８６ＯＧ６３８の３
７ＣＦＲ第１．１４条を含む)に従って権利を有すると米国特許庁長官が決定し
た者に子孫を入手可能とすることを保証するものである。 本出願の譲受人は、寄託した培養物が、適切な条件下で培養されていた場合に
死亡もしくは損失又は破壊されたならば、材料は通知時に同一の他のものと即座
に取り替えることに同意する。寄託物質の入手可能性は、特許法に従いあらゆる
政府の権限下で認められた権利に違反して、本発明を実施するライセンスである
とみなされるものではない。 上記の文書による明細書は、当業者に本発明を実施できるようにするために十
分であると考えられる。寄託した態様は、本発明のある側面の一つの説明として
意図されており、機能的に等価なあらゆる作成物がこの発明の範囲内にあるため
、寄託された作成物により、本発明の範囲が限定されるものではない。ここでの
物質の寄託は、ここに含まれる文書による説明が、そのベストモードを含む、本
発明の任意の側面の実施を可能にするために不十分であることを認めるものでは
ないし、それが表す特定の例証に対して請求の範囲を制限するものと解釈される
ものでもない。実際、ここに示し記載したものに加えて、本発明を様々に改変す
ることは、前記の記載から当業者にとっては明らかなものであり、添付の請求の
範囲内に入るものである。
【図面の簡単な説明】
【Ｆｉｇ１Ａ−Ｂ】 図１Ａ−１Ｂは天然配列ＰＲＯ２３０ｃＤＮＡのヌク
レオチド配列（配列番号：１）を示し、ここで配列番号：１は「ＤＮＡ３３２２
３−１１３６」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ２】 図１Ａ−１Ｂに示した配列番号：１のコード化配列から誘導
されたアミノ酸配列（配列番号：２）を示す。
【Ｆｉｇ３】 天然配列ＰＲＯ２１６ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番
号：６）を示し、ここで配列番号：６は「ＤＮＡ３３０８７」と命名されるクロ
ーンである。
【Ｆｉｇ４】 図３に示した配列番号：６のコード化配列から誘導されたア
ミノ酸配列（配列番号：７）を示す。
【Ｆｉｇ５】 天然配列ＰＲＯ３０２ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番
号：１１）を示し、ここで配列番号：１１は「ＤＮＡ４０３７０−１２１７」と
命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ６】 図５に示した配列番号：１１のコード化配列から誘導された
アミノ酸配列（配列番号：１２）を示す。
【Ｆｉｇ７Ａ−Ｄ】 図７Ａ−７ＤはＡＬＩＧＮ-２配列比較コンピュータ
プログラムを使用し、％アミノ酸配列同一性(図７Ａ-Ｂ)と％核酸配列同一性(図
７Ｃ-Ｄ)を決定するための、以下に記載する方法を使用した仮説例を示し、ここ
で「ＰＲＯ」は関心ある仮定ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリ
ペプチドのアミノ酸配列を表し、「比較タンパク質」は関心ある「ＰＲＯ」ポリ
ペプチドと比較され、これに対するポリペプチドのアミノ酸配列を表す。「比較
ＤＮＡ」は関心ある「ＰＲＯ-ＤＮＡ」核酸分子と比較され、これに対する核酸
分子のヌクレオチド配列を表し、「Ｘ」、「Ｙ」及び「Ｚ」は、それぞれ異なる
仮定アミノ酸残基を表し、「Ｎ」、「Ｌ」及び「Ｖ」は、それぞれ異なる仮定ヌ
クレオチドを表す。
【Ｆｉｇ８Ａ−Ｑ】 図８Ａ−８ＱはＡＬＩＧＮ-２配列比較コンピュータ
プログラムの完全なソースコードを提供する。このソースコードはＡＬＩＧＮ-
２配列比較コンピュータプログラムを提供するために、ＵＮＩＸ操作システムに
おける使用用に上等的にコンパイルしてもよい。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 9/10 Ａ６１Ｐ 9/12 ４Ｈ０４５ 9/12 13/12 13/12 17/02 17/02 19/10 19/10 27/02 27/02 29/00 １０１ 29/00 １０１ 35/00 35/00 43/00 １０５ 43/00 １０５ Ｃ０７Ｋ 16/18 Ｃ０７Ｋ 16/18 Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｎ 5/06 Ｃ１２Ｑ 1/04 5/10 1/68 Ａ 7/00 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 15/09 ＺＮＡ 33/53 Ｄ Ｃ１２Ｑ 1/04 Ｃ１２Ｒ 1:91 1/68 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/53 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 5/06 Ｅ Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ， ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ， ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，Ｍ Ｇ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ， ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，Ｖ Ｎ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ゴッダード，オードリー アメリカ合衆国 カリフォルニア 94131， サン フランシスコ，コンゴ ストリート 110 (72)発明者 ガーニー，オースティン，エル． アメリカ合衆国 カリフォルニア 94002， ベルモント，デビー レーン １ (72)発明者 ヒラン，ケネス，ジェー． アメリカ合衆国 カリフォルニア 94114， サン フランシスコ， セワード スト リート 64 (72)発明者 ウィリアムズ，ピー．，ミッキー アメリカ合衆国 カリフォルニア 94019， ハーフ ムーン ベイ，アルト アヴェニ ュー 509 (72)発明者 ウッド，ウィリアム，アイ． アメリカ合衆国 カリフォルニア 94010， ヒルスボロー，サウスダウン コート 35 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA14 BA44 BA80 CA04 DA02 DA06 DA12 EA02 EA04 GA03 GA11 GA18 GA19 HA01 HA12 HA15 HA17 4B063 QA12 QA19 QQ42 QQ52 QR56 QR62 QS25 QS34 QS36 QX07 4B065 AA26X AA72X AA90X AA93X AA93Y AB01 AC14 BA02 BA25 CA24 CA31 CA44 CA46 4C084 AA02 AA13 AA17 BA01 BA07 BA22 CA53 CA56 CA59 ZA36 ZA42 ZA45 ZA81 ZA97 ZB15 ZB26 4C085 AA13 AA14 BB11 CC21 4H045 AA11 AA30 CA40 DA76 EA23 EA24 EA50 FA74 GA10 GA21

Claims (53)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 （ａ）ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペ
    プチド、（ｂ）ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドのア
    ゴニスト、又は（ｃ）ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチ
    ドのアンタゴニストを、製薬的に許容される担体と共に含有する組成物。
  2. 【請求項２】 （ａ）ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペ
    プチド、（ｂ）ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドのア
    ゴニスト、又は（ｃ）ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチ
    ドのアンタゴニストの治療的有効量を含んでなる請求項１に記載の組成物。
  3. 【請求項３】 アゴニストが抗ＰＲＯ２３０、抗ＰＲＯ２１６又は抗ＰＲＯ
    ３０２抗体である請求項１に記載の組成物。
  4. 【請求項４】 アンタゴニストが抗ＰＲＯ２３０、抗ＰＲＯ２１６又は抗Ｐ
    ＲＯ３０２抗体である請求項１に記載の組成物。
  5. 【請求項５】 心血管、内皮、血管新生又は血管抑制剤を更に含んでなる請
    求項１に記載の組成物。
  6. 【請求項６】 （ａ）ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペ
    プチド、（ｂ）ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドのア
    ゴニスト、又は（ｃ）ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチ
    ドのアンタゴニストを、製薬的に許容される担体と混合することを含んでなる請
    求項１に記載の組成物の調製方法。
  7. 【請求項７】 （ａ）（ａ）ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２
    ポリペプチド、（ｂ）ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチ
    ドのアゴニスト、又は（ｃ）ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリ
    ペプチドのアンタゴニストを、製薬的に許容される担体と混合されて含有する組
    成物； （ｂ）上記組成物を含有する容器；及び （ｃ）上記容器に取り付けられたラベル、又は該製薬品に含まれる包装挿入物で
    あって、上記（ａ）ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチド
    、（ｂ）ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドのアゴニス
    ト、又は（ｃ）ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドのア
    ンタゴニストの心血管、内皮、及び血管新生障害の治療における使用について言
    及するものを含んでなる製造品。
  8. 【請求項８】 上記アゴニストが抗ＰＲＯ２３０、抗ＰＲＯ２１６又は抗Ｐ
    ＲＯ３０２抗体である請求項７に記載の製造品。
  9. 【請求項９】 アンタゴニストが抗ＰＲＯ２３０、抗ＰＲＯ２１６又は抗Ｐ
    ＲＯ３０２抗体である請求項７に記載の製造品。
  10. 【請求項１０】 上記組成物が、上記（ａ）ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又
    はＰＲＯ３０２ポリペプチド、（ｂ）ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３
    ０２ポリペプチドのアゴニスト、又は（ｃ）ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰ
    ＲＯ３０２ポリペプチドのアンタゴニストの治療的有効量を、上記製薬的に許容
    可能な担体と混合されて含んでなる請求項７に記載の製造品。
  11. 【請求項１１】 ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチ
    ドのアゴニストを同定する方法において、 （ａ）ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドにより正常に
    誘導される細胞性応答の誘導に適した条件下でスクリーニングされる試験化合物
    と細胞を接触させ；及び （ｂ）上記細胞性応答の誘導を決定して、試験化合物が有効なアゴニストである
    かどうかを決定することを含んでなり、ここで上記細胞性応答が、上記試験化合
    物が有効なアゴニストであることを示す方法。
  12. 【請求項１２】 上記ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペ
    プチドにより正常に誘導される細胞性応答は細胞増殖の刺激である請求項１１に
    記載の方法。
  13. 【請求項１３】 ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチ
    ドの活性を阻害する化合物を同定する方法において、試験化合物をＰＲＯ２３０
    、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドと、試験化合物とポリペプチドが
    相互作用をするのに十分な条件と時間下で接触させ、上記ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ
    ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドの活性が阻害されるかどうかを決定するこ
    とを含んでなる方法。
  14. 【請求項１４】 ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチ
    ドの活性を阻害する化合物を同定する方法において、 （ａ）ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドにより正常に
    誘導される細胞性応答の誘導に適した条件下でＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又は
    ＰＲＯ３０２ポリペプチドの存在下でスクリーニングされる試験化合物と細胞を
    接触させ；及び （ｂ）上記細胞性応答の誘導を決定して、試験化合物が有効なアンタゴニストで
    あるかどうかを決定することを含んでなる方法。
  15. 【請求項１５】 上記ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペ
    プチドにより正常に誘導される細胞性応答が細胞増殖の刺激である請求項１４に
    記載の方法。
  16. 【請求項１６】 ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチ
    ドの発現を、該ポリペプチドを通常は発現する細胞中で阻害する化合物を同定す
    る方法において、上記ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチ
    ドの発現に適した条件下で試験化合物と細胞を接触させ、ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ
    ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドの発現が阻害されるかどうかを決定するこ
    とを含んでなる方法。
  17. 【請求項１７】 ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチ
    ドのアゴニスト。
  18. 【請求項１８】 ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチ
    ドのアンタゴニスト。
  19. 【請求項１９】 哺乳動物細胞におけるＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰ
    ＲＯ３０２ポリペプチドの発現を阻害する化合物。
  20. 【請求項２０】 上記化合物がアンチセンスオリゴヌクレオチドである請求
    項１９に記載の化合物。
  21. 【請求項２１】 ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチ
    ドに結合する抗体。
  22. 【請求項２２】 モノクローナル抗体である請求項２１に記載の抗体。
  23. 【請求項２３】 抗体断片である請求項２１に記載の抗体。
  24. 【請求項２４】 一本鎖抗体である請求項２１に記載の抗体。
  25. 【請求項２５】 ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチ
    ドコード核酸配列中の変異に関連した疾患又は疾患の可能性を診断する方法にお
    いて、 （ａ）宿主から得た試料から、ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポ
    リペプチドコード核酸配列を単離し；及び （ｂ）ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチド核酸配列中の
    上記変異の存在又は不存在を決定し、ここで上記変異の存在又は不存在が上記疾
    患の存在又は上記疾患の可能性を示す方法。
  26. 【請求項２６】 哺乳動物における心血管、内皮又は血管新生障害を診断す
    る方法において、（ａ）上記哺乳動物から得た組織細胞の試験試料中と、（ｂ）
    同じ細胞型の既知の正常な組織細胞の対照試料中とにおけるＰＲＯ２３０、ＰＲ
    Ｏ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドをコードする遺伝子の発現レベルを分析
    することを含んでなり、ここで、対照試料と比較して試験試料中の発現レベルが
    高いか低いかにより、上記哺乳動物中における心血管、内皮又は血管新生障害の
    存在が示される方法。
  27. 【請求項２７】 哺乳動物における心血管、内皮又は血管新生障害を診断す
    る方法において、上記哺乳動物から得た組織細胞の試験試料中のＰＲＯ２３０、
    ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドの存在又は不存在を検出することを
    含んでなり、ここで、上記試験試料中の上記ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰ
    ＲＯ３０２ポリペプチドの存在又は不存在が、上記哺乳動物中における心血管、
    内皮又は血管新生障害の存在を示している方法。
  28. 【請求項２８】 哺乳動物における心血管、内皮又は血管新生障害を診断す
    る方法において、（ａ）哺乳動物から得た組織細胞の試験試料に、抗ＰＲＯ２３
    ０、抗ＰＲＯ２１６又は抗ＰＲＯ３０２抗体を接触させ、（ｂ）試験試料中の抗
    ＰＲＯ２３０、抗ＰＲＯ２１６又は抗ＰＲＯ３０２抗体とＰＲＯ２３０、ＰＲＯ
    ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドの間の複合体の形成を検出することを含ん
    でなり、ここで、上記複合体の形成が、哺乳動物中における心血管、内皮又は血
    管新生障害の存在を示している方法。
  29. 【請求項２９】 試料中のＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポ
    リペプチドの存在を決定する方法において、ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰ
    ＲＯ３０２ポリペプチドを含んでいると思われる試料を、抗ＰＲＯ２３０、抗Ｐ
    ＲＯ２１６又は抗ＰＲＯ３０２抗体と接触させ、上記試料の成分に対する上記抗
    体の結合を決定することを含んでなる方法。
  30. 【請求項３０】 抗ＰＲＯ２３０、抗ＰＲＯ２１６又は抗ＰＲＯ３０２抗体
    と担体を適切な包装に含んでなる心血管、内皮又は血管新生障害診断キット。
  31. 【請求項３１】 上記抗体を用いてＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ
    ３０２ポリペプチドの存在を検出するためのインストラクションを更に含んでな
    る請求項３０に記載のキット。
  32. 【請求項３２】 （ａ）ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリ
    ペプチド、（ｂ）ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドの
    アゴニスト、又は（ｃ）ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプ
    チドのアンタゴニストの治療的有効量を哺乳動物に投与することを含んでなる、
    哺乳動物における心血管、内皮又は血管新生障害を治療する方法。
  33. 【請求項３３】 障害が心肥大、トラウマ、又はガンである請求項３２に記
    載の方法。
  34. 【請求項３４】 哺乳動物がヒトである請求項３２に記載の方法。
  35. 【請求項３５】 ヒトが心筋梗塞を煩っている請求項３４に記載の方法。
  36. 【請求項３６】 ヒトが心肥大、トラウマ、ガン、又は年齢関連黄斑変性症
    を持っている請求項３４に記載の方法。
  37. 【請求項３７】 心肥大が、ＰＧＦ２αのレベルの増加により特徴付けられ
    る請求項３６に記載の方法。
  38. 【請求項３８】 ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチ
    ドを、心血管、内皮又は血管新生剤と共に投与する請求項３２の方法。
  39. 【請求項３９】 ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチ
    ドが、一次血管形成術に続いて投与される請求項３６に記載の方法。
  40. 【請求項４０】 心血管、内皮又は血管新生障害がガンである請求項３２に
    記載の方法。
  41. 【請求項４１】 ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチ
    ドが、化学療法剤、成長阻害剤又は細胞傷害剤と共に投与される請求項４０の方
    法。
  42. 【請求項４２】 上記アゴニストが抗ＰＲＯ２３０、抗ＰＲＯ２１６又は抗
    ＰＲＯ３０２抗体である請求項３２に記載の方法。
  43. 【請求項４３】 上記アンタゴニストが抗ＰＲＯ２３０、抗ＰＲＯ２１６又
    は抗ＰＲＯ３０２抗体である請求項３２に記載の方法。
  44. 【請求項４４】 （ａ）ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリ
    ペプチド、（ｂ）ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドの
    アゴニスト、又は（ｃ）ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプ
    チドのアンタゴニストをコードする核酸分子を哺乳動物に投与することを含んで
    なる、哺乳動物における心血管、内皮又は血管新生障害を治療する方法。
  45. 【請求項４５】 上記アゴニストが抗ＰＲＯ２３０、抗ＰＲＯ２１６又は抗
    ＰＲＯ３０２抗体である請求項４４に記載の方法。
  46. 【請求項４６】 上記アンタゴニストが抗ＰＲＯ２３０、抗ＰＲＯ２１６又
    は抗ＰＲＯ３０２抗体である請求項４４に記載の方法。
  47. 【請求項４７】 哺乳動物がヒトである請求項４４に記載の方法。
  48. 【請求項４８】 核酸分子がエキソビボ遺伝子療法によって投与される請求
    項４４に記載の方法。
  49. 【請求項４９】 プロモーター、（ａ）ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰ
    ＲＯ３０２ポリペプチド、（ｂ）ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２
    ポリペプチドのアゴニストポリペプチド、又は（ｃ）ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１
    ６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドのアンタゴニストポリペプチドをコードする核
    酸、及びポリペプチドの細胞性分泌のためのシグナル配列から本質的になるレト
    ロウィルスベクターを含み、レトロウィルスベクターがレトロウィルス構造タン
    パク質と関連している組換えレトロウィルス粒子。
  50. 【請求項５０】 レトロウィルス構造タンパク質を発現し、またプロモータ
    ー、（ａ）ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチド、（ｂ）
    ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドのアゴニストポリペ
    プチド、又は（ｃ）ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチド
    のアンタゴニストポリペプチドをコードする核酸、及びポリペプチドの細胞性分
    泌のためのシグナル配列から本質的になるレトロウィルスベクターを含む核酸作
    成物を含んでなるエキソビボ産生細胞であって、組換えレトロウィルス粒子を産
    生するために構造タンパク質と組み合わせてレトロウィルスベクターを収容する
    産生細胞。
  51. 【請求項５１】 哺乳動物における内皮細胞成長を阻害する方法において、
    （ａ）ＰＲＯ２１６ポリペプチド、（ｂ）ＰＲＯ２１６ポリペプチドのアゴニス
    ト、（ｃ）ＰＲＯ２３０、ＰＲＯ２１６又はＰＲＯ３０２ポリペプチドのアンタ
    ゴニスト、又は（ｄ）抗ＰＲＯ２１６抗体を哺乳動物に投与し、哺乳動物におけ
    る内皮細胞成長を阻害する方法。
  52. 【請求項５２】 哺乳動物における内皮細胞成長を刺激する方法において、
    （ａ）ＰＲＯ２３０ポリペプチド、（ｂ）ＰＲＯ２３０ポリペプチドのアゴニス
    ト、（ｃ）ＰＲＯ２３０ポリペプチドのアンタゴニスト、又は（ｄ）抗ＰＲＯ２
    ３０抗体を哺乳動物に投与し、哺乳動物における内皮細胞成長を刺激する方法。
  53. 【請求項５３】 哺乳動物におけるＰＲＯ３０２ポリペプチドにより誘導さ
    れる血管新生を阻害する方法であって、治療的有効量の抗ＰＲＯ３０２抗体を哺
    乳動物に投与し、上記血管新生を阻害する方法。
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