KR20010085915A - 신생 세포 성장을 억제하기 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 신생 세포 성장을 억제를 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 종양 치료를 위한 항종양 조성물 및 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 성장 억제, 예를 들어 항종양 화합물을 동정하기 위한 스크리닝 방법에 관한 것이다.

Description

신생 세포 성장을 억제하기 위한 방법 및 조성물 {Methods and Compositions for Inhibiting Neoplastic Cell Growth}
악성 종양 (암)은 심장 질환 다음으로 미국 내의 제2의 주요 사망 원인이 되고 있다 [Boring et al.,CA Cancel J. Clin. 43:7 (1993)].
암은 증식하여 종양 덩어리를 형성하는 정상 세포로부터 유래된 비정상 또는 신생 세포수의 증가, 상기 신생 종양 세포에 의한 인접 조직의 침윤 및 혈액 또는 림프계를 통해 국부 림프절 및 말단으로 결국 퍼지는 악성 세포의 생성 (전이)의 특징을 갖는다. 암 단계에서 세포는 정상 세포가 성장하지 않는 조건하에서 성장한다. 암은 다른 정도의 침윤 및 침습성의 특징을 갖는 다양한 형태로 나타난다.
최근의 암 치료법의 진보에도 불구하고, 신생 세포 성장을 억제할 수 있는 신규 치료제가 크게 요구되고 있다. 따라서, 본 발명의 목적은 신생 세포, 예를 들어 암세포의 성장을 억제할 수 있는 화합물을 동정하는 것이다.
<발명의 요약>
본 발명은 신생 세포 성장을 억제하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 포유동물 환자, 바람직하게는 인간에서 암, 예를 들어 유방암, 전립선암, 결장암, 폐암, 난소암, 신장암 및 중추신경계암, 백혈병, 흑색종 등을 포함한 종양 치료를 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다.
한 양태에서, 본 발명은 유효량의 본원에서 정의된 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드 또는 그의 아고니스트를 제약적으로 허용 가능한 담체와 함께 포함하는, 신생 세포 성장의 억제에 유용한 조성물에 관한 것이다. 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 조성물은 성장 억제량의 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드 또는 그의 아고니스트를 포함한다. 또다른 바람직한 실시태양에서, 조성물은 세포 독성량의 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드 또는 그의 아고니스트를 포함한다. 임의로, 본 발명의 조성물은 한가지 이상의 성장 억제제 및(또는) 세포독성제 및(또는) 화학요법제를 더 포함할 수 있다.
또다른 양면에서, 본 발명은 치료 유효량의 본원에서 정의된 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드 또는 그의 아고니스트를 포함하는, 포유동물에서 종양 치료에 유용한 조성물에 관한 것이다. 종양은 바람직하게는 암이다.
또다른 양면에서, 본 발명은 유효량의 본원에서 정의된 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드 또는 그의 아고니스트를 세포에 노출시키는 것을 포함하는, 종양 세포 성장의 억제 방법에 관한 것이다. 특정 실시태양에서, 아고니스트는 항 PRO211, 항 PRO228, 항 PRO538, 항 PRO172 또는 항 PRO182 아고니스트 항체이다. 또다른 실시태양에서, 아고니스트는 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드의 생물학적 활성을 모방하는 작은 분자이다. 본 방법은 시험관 내 또는 생체 내에서 수행될 수 있다.
또다른 실시태양에서, 본 발명은 용기 및 용기 내에 함유된 활성 물질을 포함하는 조성물을 포함하는 제품에 관한 것이다. 여기서, 조성물은 신생 세포 성장, 예를 들어 종양 세포 성장에 효과적이며, 조성물 내의 활성 물질은 본원에서 정의된 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드 또는 그의 아고니스트이다. 특정 실시태양에서, 아고니스트는 항 PRO211, 항 PRO228, 항 PRO538, 항 PRO172 또는 항 PRO182 아고니스 항체이다. 또다른 실시태양에서, 아고니스트는 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드의 생물학적 활성을 모방하는 작은 분자이다. 본원에서 정의된 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드 또는 그의 아고니스트를 종양 치료 유효량으로 포함하는 유사한 제품도 또한 본원의 범위 내에 있다. 또한, 본원에서 정의된 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드 또는 그의 아고니스트, 및 추가의 성장 억제제, 세포독성제 또는 화학요법제를 포함하는 제품도 본 발명의 범위 내에 있다.
본 발명은 신생 세포 성장을 억제하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 항종양 조성물 및 종양의 치료 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 성장 억제, 즉 항종양 화합물을 동정하기 위한 스크리닝 방법에 관한 것이다.
도 1은 천연 서열 PRO211 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 1)을 도시하며, 여기서 서열 1은 본원에서 "DNA32292-1131"로 명명된 클론이다.
도 2는 도 1에 나타낸 서열 1의 코딩 서열로부터 유도된 아미노산 서열 (서열 2)이다.
도 3a 및 3b는 천연 서열 PRO228 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 6)을 도시하며, 여기서 서열 6은 본원에서 "DNA33092-1202"로 명명된 클론이다.
도 4는 도 3a 및 3b에 나타낸 서열 6의 코딩 서열로부터 유도된 아미노산 서열 (서열 7)이다.
도 5는 천연 서열 PRO538 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 15)을 도시하며, 여기서 서열 15는 본원에서 "DNA48613-1268"로 명명된 클론이다.
도 6은 도 5에 나타낸 서열 15의 코딩 서열로부터 유도된 아미노산 서열 (서열 16)이다.
도 7a 및 7b는 천연 서열 PRO172 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 20)을 도시하며, 여기서 서열 20은 본원에서 "DNA35916-1161"로 명명된 클론이다.
도 8은 도 7a 및 7b에 나타낸 서열 20의 코딩 서열로부터 유도된 아미노산 서열 (서열 21)이다.
도 9는 천연 서열 PRO182 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 25)을 도시하며, 여기서 서열 25는 본원에서 "DNA27865-1091"로 명명된 클론이다.
도 10은 도 9에 나타낸 서열 25의 코딩 서열로부터 유도된 아미노산 서열 (서열 26)이다.
본원에서 사용된 용어 "PRO211", "PRO228", "PRO538", "PRO172" 또는 "PRO182" 폴리펩티드 또는 단백질은 천연 서열의 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172및 PRO182의 변이체 (본원에서 정의됨)를 포함한다. PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드는 다양한 공급원, 예를 들어 인간 조직 형태 또는 다른 공급원으로부터 단리되거나 재조합 및(또는) 합성 방법에 의해 제조될 수 있다.
"천연 서열의 PRO211", "천연 서열의 PRO228", "천연 서열의 PRO538", "천연 서열의 PRO172" 또는 "천연 서열의 PRO182"는 자연으로부터 유도된 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드와 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 상기 천연 서열의 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드는 자연으로부터 단리할 수 있거나 재조합 또는 합성 방법에 의해 제조할 수 있다. 용어 "천연 서열"의 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드는 구체적으로는 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드의 자연발생적으로 말단이 절단된 (truncated) 또는 분비되는 형태 (예를 들어 세포외 도메인 서열), 상기 폴리펩티드의 자연발생적 변이체 형태 (교대 스플라이싱된 형태) 및 자연발생적 대립 유전자 변이체를 포함한다. 본 발명의 한 실시태양에서, 천연 서열의 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드는 각각 도 2 (서열 2), 도 4 (서열 7), 도 6 (서열 16), 도 8 (서열 21) 또는 도 10 (서열 26)에 나타낸 성숙 또는 전장의 천연 서열 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드이다. 또한, 도 2 (서열 2), 도 4 (서열 7), 도 6 (서열 16), 도 8 (서열 21) 및 도 10 (서열 26)에 각각 나타낸 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 및 PRO182 폴리펩티드는 아미노산 위치 1로 표시된 메티오닌 잔기로 개시되는 것을 보여주지만, 도 2 (서열 2), 도 4 (서열 7), 도 6 (서열 16), 도 8 (서열 21) 또는 도 10 (서열 26) 각각에서 아미노산 위치 1로부터 상류 또는 하류에 위치한 또다른 메티오닌 잔기가 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드의 개시 아미노산 잔기로서 이용될 수 있다는 것은 생각할 수 있으며 가능하다.
본원에 개시된 폴리펩티드의 "세포외 도메인" 또는 "ECD"는 막횡단 및 세포질 도메인이 필수적으로 존재하지 않는 폴리펩티드 형태를 언급한다. 통상, 폴리펩티드 ECD는 상기 막횡단 및(또는) 세포질 도메인을 약 1% 미만으로 갖는 것이며, 바람직하게는 상기 도메인을 약 0.5% 미만으로 갖는다. 본 발명의 폴리펩티드에 대해 확인된 임의의 막횡단 도메인(들)은 당업계에서 소수성 도메인의 형태를 확인하기 위해 통상 사용되는 기준에 따라 확인된다는 것을 이해할 것이다. 막횡단 도메인의 정확한 경계는 다양할 수 있으나, 처음에 확인되고 첨부된 도면에 도시된 바와 같이 도메인의 어느 한 말단의 단지 약 5개 이내의 아미노산일 것 같다. 마찬가지로, 본 발명의 한 실시태양에서, 본 발명의 폴리펩티드의 세포외 도메인은 성숙 아미노산 서열의 아미노산 1 내지 아미노산 X를 포함하며, 여기서 X는 세포외 도메인/막횡단 도메인 경계의 어느 한쪽의 5개 이내의 임의의 아미노산이다.
본원에서 개시된 여러 PRO 폴리펩티드의 "시그날 펩티드"의 대략적인 위치는 첨부된 도면에 도시되어 있다. 그러나, 시그날 펩티드의 C 말단 경계는 다양할 수 있으나 본원에서 처음에 확인된 시그날 펩티드 C 말단 경계의 어느 한쪽의 단지 약 5개 이내의 아미노산일 것이며, 여기서 시그날 펩티드의 C 말단 경계는 당업계에서아미노산 서열 인자의 형태를 확인하기 위해 통상 사용되는 기준에 따라 확인될 수 있다는 것을 알아야 한다 [예, Nielson et al.,Prot. Eng.,10:1-6 (1997) 및 von Heinje et al.,Nucl. Acids. Res.,14:4683-4690 (1986)]. 또한, 몇몇 경우에 분비된 폴리펩티드로부터 시그날 서열의 절단이 완전히 일치하지 않기 때문에 단지 한가지 이상의 분비 형태를 생성시킨다는 것도 알아야 한다. 본원에서 확인된 바와 같이, 시그날 펩티드가 시그날 펩티드의 C 말단 경계의 어느 한쪽에 단지 약 5개 이내의 아미노산에서 절단된 성숙 폴리펩티드 및 이들을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 본 발명에서 포함된다.
"PRO211 변이체 폴리펩티드"는 (a) 도 2 (서열 2)의 PRO211 폴리펩티드의 잔기 1 또는 약 25 내지 353의 아미노산 서열, (b) 도 2 (서열 2)의 PRO211 폴리펩티드의 X 내지 353의 아미노산 서열 (여기서, X는 도 2 (서열 2)의 20 내지 29의 임의의 아미노산 잔기임) 또는 (c) 특이적으로 유도된 도 2 (서열 2)의 아미노산 서열의 임의의 단편의 아미노산 서열과 약 80% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는, 하기에 정의되는 활성 PRO211 폴리펩티드 (천연 서열의 PRO211 폴리펩티드 제외)를 의미한다.
"PRO228 변이체 폴리펩티드"는 (a) 도 4 (서열 7)의 PRO228 폴리펩티드의 잔기 1 또는 약 20 내지 690의 아미노산 서열, (b) 도 4 (서열 7)의 PRO228 폴리펩티드의 X 내지 690의 아미노산 서열 (여기서, X는 도 4 (서열 7)의 15 내지 24의 임의의 아미노산 잔기임), (c) 도 4 (서열 7)의 1 또는 약 20 내지 X의 아미노산 서열 (여기서, X는 도 4 (서열 7)의 아미노산 425 내지 아미노산 434의 임의의 아미노산임) 또는 (d) 특이적으로 유도된 도 4 (서열 7)의 아미노산 서열의 임의의 단편의 아미노산 서열과 약 80% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는, 하기에 정의되는 활성 PRO228 폴리펩티드 (천연 서열의 PRO228 폴리펩티드 제외)를 의미한다.
"PRO538 변이체 폴리펩티드"는 (a) 도 6 (서열 16)의 PRO538 폴리펩티드의 잔기 1 또는 약 27 내지 400의 아미노산 서열, (b) 도 6 (서열 16)의 PRO538 폴리펩티드의 X 내지 400의 아미노산 서열 (여기서, X는 도 6 (서열 16)의 22 내지 31의 임의의 아미노산 잔기임), (c) 도 6 (서열 16)의 1 또는 약 27 내지 X의 아미노산 서열 (여기서, X는 도 6 (서열 16)의 아미노산 374 내지 아미노산 383의 임의의 아미노산임) 또는 (d) 특이적으로 유도된 도 6 (서열 16)의 아미노산 서열의 임의의 단편의 아미노산 서열과 약 80% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는, 하기에 정의되는 활성 PRO538 폴리펩티드 (천연 서열의 PRO538 폴리펩티드 제외)를 의미한다.
"PRO172 변이체 폴리펩티드"는 (a) 도 8 (서열 21)의 PRO172 폴리펩티드의 잔기 1 또는 약 22 내지 723의 아미노산 서열, (b) 도 8 (서열 21)의 PRO172 폴리펩티드의 X 내지 723의 아미노산 서열 (여기서, X는 도 8 (서열 21)의 17 내지 26의 임의의 아미노산 잔기임), (c) 도 8 (서열 21)의 1 또는 약 22 내지 X의 아미노산 서열 (여기서, X는 도 8 (서열 21)의 아미노산 543 내지 아미노산 552의 임의의 아미노산임) 또는 (d) 특이적으로 유도된 도 8 (서열 21)의 아미노산 서열의 임의의 단편의 아미노산 서열과 약 80% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는, 하기에 정의되는 활성 PRO172 폴리펩티드 (천연 서열의 PRO172 폴리펩티드 제외)를 의미한다.
"PRO182 변이체 폴리펩티드"는 (a) 도 10 (서열 26)의 PRO182 폴리펩티드의 잔기 1 또는 약 19 내지 135의 아미노산 서열, (b) 도 10 (서열 26)의 PRO182 폴리펩티드의 X 내지 135의 아미노산 서열 (여기서, X는 도 10 (서열 26)의 14 내지 23의 임의의 아미노산 잔기임) 또는 (c) 특이적으로 유도된 도 10 (서열 26)의 아미노산 서열의 임의의 단편의 아미노산 서열과 약 80% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는, 하기에 정의되는 활성 PRO182 폴리펩티드 (천연 서열의 PRO182 폴리펩티드 제외)를 의미한다.
상기 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 및 PRO182 변이체 폴리펩티드에는 예를 들어 천연 서열의 N 말단 또는 C 말단에서뿐만 아니라 하나 이상의 내부 도메인 내의 하나 이상의 아미노산 잔기가 부가되거나 결실된 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 및 PRO182 폴리펩티드가 포함된다.
통상, PRO211 변이체 폴리펩티드는 (a) 도 2 (서열 2)의 PRO211 폴리펩티드의 잔기 1 또는 약 25 내지 353, (b) 도 2 (서열 2)의 PRO211 폴리펩티드의 X 내지 353 (여기서, X는 도 2 (서열 2)의 20 내지 29의 임의의 아미노산 잔기임) 또는 (c) 특이적으로 유도된 도 2 (서열 2)의 아미노산 서열의 임의의 단편과의 아미노산 서열 동일성이 약 80% 이상, 더 바람직하게는 약 81 % 이상, 더 바람직하게는 약 82 % 이상, 더 바람직하게는 약 83 % 이상, 더 바람직하게는 약 84 % 이상, 더 바람직하게는 약 85 % 이상, 더 바람직하게는 약 86 % 이상, 더 바람직하게는 약 87 % 이상, 더 바람직하게는 약 88 % 이상, 더 바람직하게는 약 89 % 이상, 더 바람직하게는 약 90% 이상, 더 바람직하게는 약 91 % 이상, 더 바람직하게는 92 % 이상, 더 바람직하게는 약 93 % 이상, 더 바람직하게는 약 94 % 이상, 더 바람직하게는 약 95% 이상, 더 바람직하게는 약 96 % 이상, 더 바람직하게는 약 97 % 이상, 더 바람직하게는 약 98 % 이상, 더 바람직하게는 약 99 % 이상이다.
통상, PRO228 변이체 폴리펩티드는 (a) 도 4 (서열 7)의 PRO228 폴리펩티드의 잔기 1 또는 약 20 내지 690, (b) 도 4 (서열 7)의 PRO228 폴리펩티드의 X 내지 690 (여기서, X는 도 4 (서열 7)의 15 내지 24의 임의의 아미노산 잔기임), (c) 도 4 (서열 7)의 PRO228 폴리펩티드의 1 또는 약 20 내지 X (여기서, X는 도 4 (서열 7)의 아미노산 425 내지 아미노산 434의 임의의 아미노산임) 또는 (d) 특이적으로 유도된 도 4 (서열 7)의 아미노산 서열의 임의의 단편과의 아미노산 서열 동일성이 약 80% 이상, 더 바람직하게는 약 81 % 이상, 더 바람직하게는 약 82 % 이상, 더 바람직하게는 약 83 % 이상, 더 바람직하게는 약 84 % 이상, 더 바람직하게는 약 85 % 이상, 더 바람직하게는 약 86 % 이상, 더 바람직하게는 약 87 % 이상, 더 바람직하게는 약 88 % 이상, 더 바람직하게는 약 89 % 이상, 더 바람직하게는 약 90% 이상, 더 바람직하게는 약 91 % 이상, 더 바람직하게는 92 % 이상, 더 바람직하게는 약 93 % 이상, 더 바람직하게는 약 94 % 이상, 더 바람직하게는 약 95% 이상, 더 바람직하게는 약 96 % 이상, 더 바람직하게는 약 97 % 이상, 더 바람직하게는 약 98 % 이상, 더 바람직하게는 약 99 % 이상이다.
통상, PRO538 변이체 폴리펩티드는 (a) 도 6 (서열 16)의 PRO538 폴리펩티드의 잔기 1 또는 약 27 내지 400, (b) 도 6 (서열 16)의 PRO538 폴리펩티드의 X 내지 400 (여기서, X는 도 6 (서열 16)의 22 내지 31의 임의의 아미노산 잔기임), (c) 도 6 (서열 16)의 PRO538 폴리펩티드의 1 또는 약 27 내지 X (여기서, X는 도 6 (서열 16)의 아미노산 374 내지 아미노산 383의 임의의 아미노산임) 또는 (d) 특이적으로 유도된 도 6 (서열 16)의 아미노산 서열의 임의의 단편과의 아미노산 서열 동일성이 약 80% 이상, 더 바람직하게는 약 81 % 이상, 더 바람직하게는 약 82 % 이상, 더 바람직하게는 약 83 % 이상, 더 바람직하게는 약 84 % 이상, 더 바람직하게는 약 85 % 이상, 더 바람직하게는 약 86 % 이상, 더 바람직하게는 약 87 % 이상, 더 바람직하게는 약 88 % 이상, 더 바람직하게는 약 89 % 이상, 더 바람직하게는 약 90% 이상, 더 바람직하게는 약 91 % 이상, 더 바람직하게는 92 % 이상, 더 바람직하게는 약 93 % 이상, 더 바람직하게는 약 94 % 이상, 더 바람직하게는 약 95% 이상, 더 바람직하게는 약 96 % 이상, 더 바람직하게는 약 97 % 이상, 더 바람직하게는 약 98 % 이상, 더 바람직하게는 약 99 % 이상이다.
통상, PRO172 변이체 폴리펩티드는 (a) 도 8 (서열 21)의 PRO172 폴리펩티드의 잔기 1 또는 약 22 내지 723, (b) 도 8 (서열 21)의 PRO172 폴리펩티드의 X 내지 723 (여기서, X는 도 8 (서열 21)의 17 내지 26의 임의의 아미노산 잔기임), (c) 도 8 (서열 21)의 PRO172 폴리펩티드의 1 또는 약 22 내지 X (여기서, X는 도 8 (서열 21)의 아미노산 543 내지 아미노산 552의 임의의 아미노산임) 또는 (d) 특이적으로 유도된 도 8 (서열 21)의 아미노산 서열의 임의의 단편과의 아미노산 서열 동일성이 약 80% 이상, 더 바람직하게는 약 81 % 이상, 더 바람직하게는 약 82 % 이상, 더 바람직하게는 약 83 % 이상, 더 바람직하게는 약 84 % 이상, 더 바람직하게는 약 85 % 이상, 더 바람직하게는 약 86 % 이상, 더 바람직하게는 약 87 % 이상, 더 바람직하게는 약 88 % 이상, 더 바람직하게는 약 89 % 이상, 더 바람직하게는 약 90% 이상, 더 바람직하게는 약 91 % 이상, 더 바람직하게는 92 % 이상, 더 바람직하게는 약 93 % 이상, 더 바람직하게는 약 94 % 이상, 더 바람직하게는 약 95% 이상, 더 바람직하게는 약 96 % 이상, 더 바람직하게는 약 97 % 이상, 더 바람직하게는 약 98 % 이상, 더 바람직하게는 약 99 % 이상이다.
통상, PRO182 변이체 폴리펩티드는 (a) 도 10 (서열 26)의 PRO182 폴리펩티드의 잔기 1 또는 약 19 내지 135, (b) 도 10 (서열 26)의 PRO182 폴리펩티드의 X 내지 135 (여기서, X는 도 10 (서열 26)의 14 내지 23의 임의의 아미노산 잔기임) 또는 (c) 특이적으로 유도된 도 10 (서열 26)의 아미노산 서열의 임의의 단편과의 아미노산 서열 동일성이 약 80% 이상, 더 바람직하게는 약 81 % 이상, 더 바람직하게는 약 82 % 이상, 더 바람직하게는 약 83 % 이상, 더 바람직하게는 약 84 % 이상, 더 바람직하게는 약 85 % 이상, 더 바람직하게는 약 86 % 이상, 더 바람직하게는 약 87 % 이상, 더 바람직하게는 약 88 % 이상, 더 바람직하게는 약 89 % 이상, 더 바람직하게는 약 90% 이상, 더 바람직하게는 약 91 % 이상, 더 바람직하게는 92 % 이상, 더 바람직하게는 약 93 % 이상, 더 바람직하게는 약 94 % 이상, 더 바람직하게는 약 95% 이상, 더 바람직하게는 약 96 % 이상, 더 바람직하게는 약 97 % 이상, 더 바람직하게는 약 98 % 이상, 더 바람직하게는 약 99 % 이상이다.
통상적으로, PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 및 PRO182 변이체 폴리펩티드는 그 길이가 약 10개 이상의 아미노산, 흔히 약 20개 이상의 아미노산, 더 흔히는약 30개 이상의 아미노산, 더 흔히는 약 40개 이상의 아미노산, 더 흔히는 약 50개 이상의 아미노산, 더 흔히는 약 60개 이상의 아미노산, 더 흔히는 약 70 개 이상의 아미노산, 더 흔히는 약 80 개 이상의 아미노산, 더 흔히는 약 90 개 이상의 아미노산, 더 흔히는 약 100 개 이상의 아미노산, 더 흔히는 약 150 개 이상의 아미노산, 더 흔히는 약 200 개 이상의 아미노산, 더 흔히는 약 250개 이상의 아미노산, 더 흔히는 약 300 개 이상의 아미노산 또는 그 이상이다.
하기의 표 1은 ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램에 대한 전체 소스 코드를 제공한다. 이 소스 코드는 ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램을 제공하기 위해 UNIX 운영 시스템 상에서의 사용에 일상적으로 적용할 수 있다.
또한, 표 2a 및 2b는 ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램을 이용하여 아미노산 서열 동일성 (%) (표 2a 및 2b)과 핵산 서열 동일성 (%) (표 2c 및 2d)을 측정하는 후술되는 방법을 이용하기 위한 가설의 예시이며, 여기서 "PRO"는 관심있는 가정의 PEACH 폴리펩티드의 아미노산 서열을 나타내고, "비교 단백질"은 관심있는 "PRO" 폴리펩티드와 비교되는 폴리펩티드의 아미노산 서열을 나타낸다. "PRO-DNA"는 관심있는 가정의 PROXXX 서열 또는 PROXXX 코딩 핵산 서열을 나타내며, "비교 DNA"는 관심있는 "PRO-DNA" 핵산 분자와 비교되는 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열을 나타내며, "X", "Y" 및 "Z"는 각각 상이한 가정의 아미노산 잔기를 나타내며, "N", "L" 및 "V"는 각각 상이한 가정의 뉴클레오티드를 나타낸다.
본원에서 동정된 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 및 PRO182 폴리펩티드 서열에 대한 "아미노산 서열 동일성 (%)"은 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 서열과 후보 서열을 정렬하고, 필요한 경우 최대치의 서열 동일성 (%)을 얻기 위해 갭을 도입한 후 어떠한 보존적 치환도 서열 동일성의 일부로서 간주하지 않은 상태에서 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드 서열의 아미노산 잔기와 동일한, 후보 서열의 아미노산 잔기의 비율로서 정의된다. 아미노산 서열 동일성 (%)을 측정하기 위한 정렬은 당업계에 공지된 다양한 방법, 예를 들어 BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공개적으로 이용 가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 달성할 수 있다. 당업자는 비교되는 서열들의 전체 길이에 걸쳐 최대로 정렬시키기 위해 필요한 임의의 알고리즘을 비롯하여 정렬을 측정하기에 적합한 파라미터를 정할 수 있다. 그러나, 본원의 목적상 아미노산 서열 동일성 값(%)은 하기에 기재된 바와 같이 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 이용하여 얻을 수 있으며, 상기 ALIGN-2 프로그램에 대한 완전한 소스 코드는 표 1에 제시되어 있다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨텍, 인크사가 개발하였으며, 표 1에 나타낸 소스 코드는 미국 저작권청 (20559 워싱톤 D.C. 소재)의 사용자 문서로 보관되어 있는데, 상기 코드는 미국 저작권 등록 제TXU510087호 하에 등록되어 있다. ALIGN-2 프로그램은 제넨텍, 인크사 (캘리포니아주 사우스 샌 프란시스코 소재)를 통해 공개적으로 이용가능하거나, 표 1에 제시된 소스 코드로부터 편집될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 UNIX 작동 시스템, 바람직하게는 디지탈 UNIX V4.0D에서 편집되어 이용될 수 있다. 모든 서열 비교파라미터는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되고 변하지 않는다.
본원의 목적상, 주어진 아미노산 서열 B에, B와, 또는 B에 대한 주어진 아미노산 서열 A의 아미노산 서열 동일성 (%) (주어진 아미노산 서열 B에, B와, 또는 B에 대한 일정한 아미노산 서열 동일성 (%)을 갖거나 포함하는 주어진 아미노산 서열 A로 달리 표현할 수 있음)은 하기와 같이 계산한다:
X/Y ×100
여기서, X는 A와 B의 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의해 동일하게 매치되는 것으로 기록되는 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B에서 아미노산 잔기의 총수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 같지 않는 경우, B에 대한 A의 아미노산 서열 동일성 (%)은 A에 대한 B의 아미노산 서열 동일성 (%)과 같지 않음을 인지할 것이다. 이 방법을 이용한 아미노산 서열 동일성 (%) 계산의 예로서, 표 2a 및 2b는 "PRO"로 나타낸 아미노산 서열에 대한 "비교 단백질"로 나타낸 아미노산 서열의 아미노산 서열 동일성 (%)을 계산하는 방법을 나타낸 것이다.
상세한 다른 언급이 없는 경우, 본원에서 사용된 모든 아미노산 서열 동일성 (%) 값은 ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램을 이용하여 상기 기재된 바와 같이 얻는다. 그러나, 아미노산 서열 동일성 (%)은 서열 비교 프로그램 NCBI-BLAST-2를 이용하여 계산할 수도 있다 [Altschul et al.,Nucleic Acids Res.25: 3389-3402 (1997)]. 상기 NCBI-BLAST-2 서열 비교 프로그램은 웹 사이트 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov.)로부터 다운로드 받을 수 있다. NCBI-BLAST-2는여러 가지 검색 파라미터를 이용하는데, 이러한 모든 검색 파라미터는 예를 들어, 언마스크 = 예, 가닥 = 모두, 기대 발생 = 10, 최소 저복합성 길이 = 15/5, 다중-통과 e-값 = 0.01, 다중-통과에 대한 상수 = 25, 최종 갭 정렬에 대한 드롭오프 = 25 및 점수 매트릭스 = BLOSUM62를 포함하는 디폴트값으로 설정된다.
NCBI-BLAST-2가 아미노산 서열 비교에 사용되는 경우, 주어진 아미노산 서열 B에, B와, 또는 B에 대한 주어진 아미노산 서열 A의 아미노산 서열 동일성 (%) (주어진 아미노산 서열 B에, B와, 또는 B에 대한 일정한 아미노산 서열 동일성 (%)을 갖거나 포함하는 주어진 아미노산 서열 A로 달리 표현할 수 있음)은 하기와 같이 계산한다.
X/Y ×100
여기서, X는 서열 정렬 프로그램 NCBI-BLAST-2의 A와 B 정렬에서 서열 정렬 프로그램 NCBI-BLAST-2에 의해 동일하게 매치되는 것으로 기록되는 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B의 총 아미노산 잔기수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 같지 않는 경우, B에 대한 A의 아미노산 서열 동일성 (%)은 A에 대한 B의 아미노산 서열 동일성 (%)과 같지 않음을 인지할 것이다.
또한, 아미노산 서열 동일성 값 (%)은 WU-BLAST-2 컴퓨터 프로그램 [Altschul et al.,Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)]를 이용하여 얻을 수 있다. WU-BLAST-2 검색 파라미터의 대부분은 디폴트값으로 설정된다. 디폴트값으로 설정하지 않은 것들, 즉 조정가능한 파라미터는 다음 값으로 설정된다: 오버랩 스팬 = 1, 오버랩 분획 = 0.125, 워드 한계 (T) = 11, 및 점수 매트릭스 =BLOSUM62. 본원의 목적을 달성하기 위해 아미노산 서열 동일성 값 (%)은, 천연 PRO 폴리펩티드로부터 유도된 서열을 갖는 목적 PRO 폴리펩티드의 아미노산 서열과 비교되는 목적 아미노산 서열 (즉, 목적 PRO 폴리펩티드와 비교되는 서열로서 PRO 변이체 폴리펩티드일 수 있음)과의 사이에 매치되는 동일한 아미노산 잔기의 수를 WU-BLAST-2로 결정하여, 이를 목적 PRO 폴리펩티드의 총 아미노산 잔기수로 나누어 결정한다. 예를 들어, 아미노산 서열 B와 80% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열 A를 포함하는 폴리펩티드"라는 말에서, 아미노산 서열 A는 비교되는 목적 아미노산 서열이고, 아미노산 서열 B는 목적 PRO 폴리펩티드의 아미노산 서열이다.
"PRO211 변이체 폴리뉴클레오티드" 또는 "PRO211 변이체 핵산 서열"은 (a) 도 2 (서열 2)의 PRO211 폴리펩티드의 잔기 1 또는 약 25 내지 353를 코딩하는 핵산 서열, (b) 도 2 (서열 2)의 PRO211 폴리펩티드의 X 내지 353의 아미노산 (여기서, X는 도 2 (서열 2)의 20 내지 29의 임의의 아미노산 잔기임)을 코딩하는 핵산 서열 또는 (c) 특이적으로 유도된 도 2 (서열 2)의 아미노산 서열의 임의의 단편을 코딩하는 핵산 서열과 약 80% 이상의 핵산 서열 동일성을 갖는, 하기에 정의되는 활성 PRO211 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 의미한다. 통상, PRO211 변이체 폴리뉴클레오티드는 (a) 도 2 (서열 2)의 PRO211 폴리펩티드의 잔기 1 또는 약 25 내지 353를 코딩하는 핵산 서열, (b) 도 2 (서열 2)의 PRO211 폴리펩티드의 X 내지 353의 아미노산 (여기서, X는 도 2 (서열 2)의 20 내지 29의 임의의 아미노산 잔기임)을 코딩하는 핵산 서열 또는 (c) 특이적으로 유도된 도 2 (서열 2)의 아미노산서열의 임의의 단편을 코딩하는 핵산 서열과의 핵산 서열 동일성이 약 80 % 이상, 더 바람직하게는 약 81 % 이상, 더 바람직하게는 약 82 % 이상, 더 바람직하게는 약 83 % 이상, 더 바람직하게는 약 84 % 이상, 더 바람직하게는 약 85 % 이상, 더 바람직하게는 약 86 % 이상, 더 바람직하게는 약 87 % 이상, 더 바람직하게는 약 88 % 이상, 더 바람직하게는 약 89 % 이상, 더 바람직하게는 약 90 % 이상, 더 바람직하게는 약 91 % 이상, 더 바람직하게는 약 92 % 이상, 더 바람직하게는 약 93 % 이상, 더 바람직하게는 약 94 % 이상, 더 바람직하게는 약 95 % 이상, 더 바람직하게는 약 96 % 이상, 더 바람직하게는 약 97 % 이상, 더 바람직하게는 약 98 % 이상, 더 바람직하게는 약 99 % 이상일 것이다. PRO211 폴리뉴클레오티드 변이체들은 천연 PRO211 뉴클레오티드 서열 전체를 포괄하지는 않는다.
"PRO228 변이체 폴리뉴클레오티드" 또는 "PRO228 변이체 핵산 서열"은 (a) 도 4 (서열 7)의 PRO228 폴리펩티드의 잔기 1 또는 약 20 내지 690을 코딩하는 핵산 서열, (b) 도 4 (서열 7)의 PRO228 폴리펩티드의 잔기 X 내지 690의 아미노산 (여기서, X는 도 4 (서열 7)의 15 내지 24의 임의의 아미노산 잔기임)을 코딩하는 핵산 서열, (C) 도 4 (서열 7)의 1 또는 약 20 내지 X의 아미노산 (여기서, X는 도 4 (서열 7)의 아미노산 425 내지 아미노산 434의 임의의 아미노산임)을 코딩하는 핵산 서열 또는 (d) 특이적으로 유도된 도 4 (서열 7)의 아미노산 서열의 임의의 단편을 코딩하는 핵산 서열과 약 80% 이상의 핵산 서열 동일성을 갖는, 하기에 정의되는 활성 PRO228 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 의미한다. 통상, PRO228 변이체 폴리뉴클레오티드는 (a) 도 4 (서열 7)의 PRO228 폴리펩티드의 잔기 1 또는약 20 내지 690을 코딩하는 핵산 서열, (b) 도 4 (서열 7)의 PRO228 폴리펩티드의 잔기 X 내지 690의 아미노산 (여기서, X는 도 4 (서열 7)의 15 내지 24의 임의의 아미노산 잔기임)을 코딩하는 핵산 서열, (c) 도 4 (서열 7)의 PRO228 폴리펩티드의 1 또는 약 20 내지 X의 아미노산 (여기서, X는 도 4 (서열 7)의 아미노산 425 내지 아미노산 434의 임의의 아미노산임)을 코딩하는 핵산 서열 또는 (d) 특이적으로 유도된 도 4 (서열 7)의 아미노산 서열의 임의의 단편을 코딩하는 핵산 서열과의 핵산 서열 동일성이 약 80 % 이상, 더 바람직하게는 약 81 % 이상, 더 바람직하게는 약 82 % 이상, 더 바람직하게는 약 83 % 이상, 더 바람직하게는 약 84 % 이상, 더 바람직하게는 약 85 % 이상, 더 바람직하게는 약 86 % 이상, 더 바람직하게는 약 87 % 이상, 더 바람직하게는 약 88 % 이상, 더 바람직하게는 약 89 % 이상, 더 바람직하게는 약 90 % 이상, 더 바람직하게는 약 91 % 이상, 더 바람직하게는 약 92 % 이상, 더 바람직하게는 약 93 % 이상, 더 바람직하게는 약 94 % 이상, 더 바람직하게는 약 95 % 이상, 더 바람직하게는 약 96 % 이상, 더 바람직하게는 약 97 % 이상, 더 바람직하게는 약 98 % 이상, 더 바람직하게는 약 99 % 이상일 것이다. PRO228 폴리뉴클레오티드 변이체들은 천연 PRO228 뉴클레오티드 서열 전체를 포괄하지는 않는다.
"PRO538 변이체 폴리뉴클레오티드" 또는 "PRO538 변이체 핵산 서열"은 (a) 도 6 (서열 16)의 PRO538 폴리펩티드의 잔기 1 또는 약 27 내지 400을 코딩하는 핵산 서열, (b) 도 6 (서열 16)의 PRO538 폴리펩티드의 X 내지 400의 아미노산 (여기서, X는 도 6 (서열 16)의 22 내지 31의 임의의 아미노산 잔기임)을 코딩하는 핵산서열, (c) 도 6 (서열 16)의 1 또는 약 27 내지 X의 아미노산 (여기서, X는 도 6 (서열 16)의 아미노산 374 내지 아미노산 383의 임의의 아미노산임)을 코딩하는 핵산 서열 또는 (d) 특이적으로 유도된 도 6 (서열 16)의 아미노산 서열의 임의의 단편을 코딩하는 핵산 서열과 약 80% 이상의 핵산 서열 동일성을 갖는, 하기에 정의되는 활성 PRO538 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 의미한다. 통상, PRO538 변이체 폴리뉴클레오티드는 (a) 도 6 (서열 16)의 PRO538 폴리펩티드의 잔기 1 또는 약 27 내지 400을 코딩하는 핵산 서열, (b) 도 6 (서열 16)의 PRO538 폴리펩티드의 X 내지 400의 아미노산 (여기서, X는 도 6 (서열 16)의 22 내지 31의 임의의 아미노산 잔기임)을 코딩하는 핵산 서열, (c) 도 6 (서열 16)의 1 또는 약 27 내지 X의 아미노산 (여기서, X는 도 6 (서열 16)의 아미노산 374 내지 아미노산 383의 임의의 아미노산임)을 코딩하는 핵산 서열 또는 (d) 특이적으로 유도된 도 6 (서열 16)의 아미노산 서열의 임의의 단편을 코딩하는 핵산 서열과의 핵산 서열 동일성이 약 80 % 이상 이상, 더 바람직하게는 약 81 % 이상, 더 바람직하게는 약 82 % 이상, 더 바람직하게는 약 83 % 이상, 더 바람직하게는 약 84 % 이상, 더 바람직하게는 약 85 % 이상, 더 바람직하게는 약 86 % 이상, 더 바람직하게는 약 87 % 이상, 더 바람직하게는 약 88 % 이상, 더 바람직하게는 약 89 % 이상, 더 바람직하게는 약 90 % 이상, 더 바람직하게는 약 91 % 이상, 더 바람직하게는 약 92 % 이상, 더 바람직하게는 약 93 % 이상, 더 바람직하게는 약 94 % 이상, 더 바람직하게는 약 95 % 이상, 더 바람직하게는 약 96 % 이상, 더 바람직하게는 약 97 % 이상, 더 바람직하게는 약 98 % 이상, 더 바람직하게는 약 99 % 이상일 것이다. PRO538 폴리뉴클레오티드 변이체들은 천연 PRO538 뉴클레오티드 서열 전체를 포괄하지는 않는다.
"PRO172 변이체 폴리뉴클레오티드" 또는 "PRO172 변이체 핵산 서열"은 (a) 도 8 (서열 21)의 PRO172 폴리펩티드의 잔기 1 또는 약 22 내지 723을 코딩하는 핵산 서열, (b) 도 8 (서열 21)의 PRO172 폴리펩티드의 X 내지 723의 아미노산 (여기서, X는 도 8 (서열 21)의 17 내지 26의 임의의 아미노산 잔기임)을 코딩하는 핵산 서열, (c) 도 8 (서열 21)의 1 또는 약 22 내지 X의 아미노산 (여기서, X는 도 8 (서열 21)의 아미노산 543 내지 아미노산 552의 임의의 아미노산임)을 코딩하는 핵산 서열 또는 (d) 특이적으로 유도된 도 8 (서열 21)의 아미노산 서열의 임의의 단편을 코딩하는 핵산 서열과 약 80% 이상의 핵산 서열 동일성을 갖는, 하기에 정의되는 활성 PRO172 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 의미한다. 통상, PRO172 변이체 폴리뉴클레오티드는 (a) 도 8 (서열 21)의 PRO172 폴리펩티드의 잔기 1 또는 약 22 내지 723을 코딩하는 핵산 서열, (b) 도 8 (서열 21)의 PRO172 폴리펩티드의 X 내지 723의 아미노산 (여기서, X는 도 8 (서열 21)의 17 내지 26의 임의의 아미노산 잔기임)을 코딩하는 핵산 서열, (c) 도 8 (서열 21)의 1 또는 약 22 내지 X의 아미노산 (여기서, X는 도 8 (서열 21)의 아미노산 543 내지 아미노산 552의 임의의 아미노산임)을 코딩하는 핵산 서열 또는 (d) 특이적으로 유도된 도 8 (서열 21)의 아미노산 서열의 임의의 단편을 코딩하는 핵산 서열과의 핵산 서열 동일성이 약 80 % 이상 이상, 더 바람직하게는 약 81 % 이상, 더 바람직하게는 약 82 % 이상, 더 바람직하게는 약 83 % 이상, 더 바람직하게는 약 84 % 이상, 더 바람직하게는 약 85 % 이상, 더 바람직하게는 약 86 % 이상, 더 바람직하게는 약 87 % 이상, 더바람직하게는 약 88 % 이상, 더 바람직하게는 약 89 % 이상, 더 바람직하게는 약 90 % 이상, 더 바람직하게는 약 91 % 이상, 더 바람직하게는 약 92 % 이상, 더 바람직하게는 약 93 % 이상, 더 바람직하게는 약 94 % 이상, 더 바람직하게는 약 95 % 이상, 더 바람직하게는 약 96 % 이상, 더 바람직하게는 약 97 % 이상, 더 바람직하게는 약 98 % 이상, 더 바람직하게는 약 99 % 이상일 것이다. PRO172 폴리뉴클레오티드 변이체들은 천연 PRO172 뉴클레오티드 서열 전체를 포괄하지는 않는다.
"PRO182 변이체 폴리뉴클레오티드" 또는 "PRO182 변이체 핵산 서열"은 (a) 도 10 (서열 26)의 PRO182 폴리펩티드의 잔기 1 또는 약 19 내지 135을 코딩하는 핵산 서열, (b) 도 10 (서열 26)의 PRO182 폴리펩티드의 X 내지 135의 아미노산 (여기서, X는 도 10 (서열 26)의 14 내지 23의 임의의 아미노산 잔기임)을 코딩하는 핵산 서열 또는 (c) 특이적으로 유도된 도 10 (서열 26)의 아미노산 서열의 임의의 단편을 코딩하는 핵산 서열과 약 80% 이상의 핵산 서열 동일성을 갖는, 하기에 정의되는 활성 PRO182 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 의미한다. 통상, PRO182 변이체 폴리뉴클레오티드는 (a) 도 10 (서열 16)의 PRO182 폴리펩티드의 잔기 1 또는 약 19 내지 135을 코딩하는 핵산 서열, (b) 도 10 (서열 26)의 PRO182 폴리펩티드의 X 내지 135의 아미노산 (여기서, X는 도 10 (서열 26)의 14 내지 23의 임의의 아미노산 잔기임)을 코딩하는 핵산 서열 또는 (c) 특이적으로 유도된 도 10 (서열 26)의 아미노산 서열의 임의의 단편을 코딩하는 핵산 서열과의 핵산 서열 동일성이 약 80 % 이상 이상, 더 바람직하게는 약 81 % 이상, 더 바람직하게는 약 82 % 이상, 더 바람직하게는 약 83 % 이상, 더 바람직하게는 약 84 % 이상, 더 바람직하게는 약 85 % 이상, 더 바람직하게는 약 86 % 이상, 더 바람직하게는 약 87 % 이상, 더 바람직하게는 약 88 % 이상, 더 바람직하게는 약 89 % 이상, 더 바람직하게는 약 90 % 이상, 더 바람직하게는 약 91 % 이상, 더 바람직하게는 약 92 % 이상, 더 바람직하게는 약 93 % 이상, 더 바람직하게는 약 94 % 이상, 더 바람직하게는 약 95 % 이상, 더 바람직하게는 약 96 % 이상, 더 바람직하게는 약 97 % 이상, 더 바람직하게는 약 98 % 이상, 더 바람직하게는 약 99 % 이상일 것이다. PRO182 폴리뉴클레오티드 변이체들은 천연 PRO182 뉴클레오티드 서열 전체를 포괄하지는 않는다.
통상 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 및 PRO182 변이체 폴리뉴클레오티드는 그 길이가 약 30개 이상의 뉴클레오티드, 더 흔히는 약 60 개 이상의 뉴클레오티드, 더 흔히는 약 90 개 이상의 뉴클레오티드, 더 흔히는 약 120 개 이상의 뉴클레오티드, 더 흔히는 약 150 개 이상의 뉴클레오티드, 더 흔히는 약 180 개 이상의 뉴클레오티드, 더 흔히는 약 210 개 이상의 뉴클레오티드, 더 흔히는 약 240 개 이상의 뉴클레오티드, 더 흔히는 약 270 개 이상의 뉴클레오티드, 더 흔히는 약 300 개 이상의 뉴클레오티드, 더 흔히는 약 450 개 이상의 뉴클레오티드, 더 흔히는 약 600 개 이상의 뉴클레오티드, 더 흔히는 약 900 개 이상의 뉴클레오티드 또는 그 이상이다.
본원에서 동정된 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드 코딩 핵산 서열에 대한 "핵산 서열 동일성 (%)"은 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드 코딩 핵산 서열과 후보 서열을 정렬시키고, 필요한 경우최대치의 서열 동일성 (%)을 얻기 위해 갭을 도입한 후 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 핵산 서열의 뉴클레오티드와 동일한, 후보 서열의 뉴클레오티드의 비율로서 정의된다. 핵산 서열 동일성 (%)을 측정하기 위한 정렬은 당업계에 공지된 다양한 방법, 예를 들어 BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 달성할 수 있다. 당업자는 비교되는 서열들의 전체 길이에 걸쳐 최대로 정렬시키기 위해 필요한 임의의 알고리즘을 비롯하여 정렬을 측정하기에 적합한 파라미터를 정할 수 있다. 그러나, 본원의 목적을 달성하기 위해, 핵산 서열 동일성 값 (%)은 후술되는 바와 같이 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 이용하여 얻을 수 있는데, 상기 ALIGN-2 프로그램에 대한 완전한 소스 코드는 표 1a 내지 1q에 기재되어 있다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨텍, 인크사가 개발하였으며, 표 1a 내지 1q에 나타낸 소스 코드는 미국 저작권청 (20559 워싱톤 D.C. 소재)의 사용자 문서로 보관되어 있으며, 상기 코드는 미국 저작권 등록 제 TXU510087호 하에 등록되어 있다. ALIGN-2 프로그램은 제넨텍, 인크사 (캘리포니아주 사우스 샌 프란시스코 소재)를 통해 공개적으로 이용가능하거나, 표 1a 내지 1q에 기재된 소스 코드로부터 편집될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 UNIX 작동계, 바람직하게는 디지탈 UNIX V4.0D에서 편집되어 이용될 수 있다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되고 변하지 않는다.
본원의 목적상, 주어진 핵산 서열 D에, D와, 또는 D에 대한 주어진 핵산 서열 C의 핵산 서열 동일성 (%)(주어진 핵산 서열 D에, D와, 또는 D에 대한 일정한핵산 서열 동일성 (%)을 갖거나 포함하는 주어진 핵산 서열 C로 달리 표현할 수 있음)은 하기와 같이 계산한다:
W/Z ×100
여기서, W는 C와 D의 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2의 정렬에서 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의해 동일하게 매치되는 것으로 기록되는 뉴클레오티드의 수이고, Z는 D의 총 뉴클레오티드수이다. 핵산 서열 C의 길이가 핵산 서열 D의 길이와 같지 않는 경우, D에 대한 C의 핵산 서열 동일성 (%)은 C에 대한 D의 핵산 서열 동일성 (%)과 같지 않음을 인지할 것이다. 핵산 서열 동일성 (%) 계산의 예로서, 표 2c 및 2d는 "PRO-DNA"로 지칭된 핵산 서열에 대한 "비교 DNA"로 지칭된 핵산 서열의 핵산 서열 동일성 (%)을 계산하는 방법을 나타낸다.
달리 구체적으로 언급하지 않는 한, 본원에 이용된 모든 핵산 서열 동일성 값 (%)은 상기에 기재된 바와 같이 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 이용하여 얻는다. 그러나, 핵산 서열 동일성 (%)은 서열 비교 프로그램 NCBI-BLAST-2를 이용하여 계산할 수도 있다 [Altschul et al.,Nucleic Acids Res.25: 3389-3402 (1997)]. 상기 NCBI-BLAST-2 서열 비교 프로그램은 웹 사이트 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov.)로부터 다운로드 받을 수 있다. NCBI-BLAST-2는 여러 가지 검색 파라미터를 이용하는데, 이러한 모든 검색 파라미터는 예를 들어, 언마스크 = 예, 가닥 = 모두, 기대 발생 = 10, 최소 저복합성 길이 = 15/5, 다중-통과 e-값 = 0.01, 다중-통과에 대한 상수 = 25, 최종 갭 정렬에 대한 드롭오프 = 25 및 점수 매트릭스 = BLOSUM62를 포함하는 디폴트값으로 설정된다.
NCBI-BLAST-2가 핵산 서열 비교에 사용되는 경우, 주어진 핵산 서열 D에, D와, 또는 D에 대한 주어진 핵산 서열 C의 핵산 서열 동일성 (%)(주어진 핵산 서열 D에, D와, 또는 D에 대한 일정한 핵산 서열 동일성 (%)을 갖거나 포함하는 주어진 핵산 서열 C로 달리 표현할 수 있음)은 하기와 같이 계산한다:
W/Z ×100
여기서, W는 C와 D의 NCBI-BLAST-2 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램 NCBI-BLAST-2에 의해 동일하게 매치되는 것으로 기록되는 뉴클레오티드의 수이고, Z는 D의 총 뉴클레오티드수이다. 핵산 서열 C의 길이가 핵산 서열 D의 길이와 같지 않는 경우, D에 대한 C의 핵산 서열 동일성 (%)은 C에 대한 D의 핵산 서열 동일성 (%)과 같지 않음을 인지할 것이다.
또한, 핵산 서열 동일성 값 (%)은 WU-BLAST-2 컴퓨터 프로그램 [Altschul et al.,Methods in Enzymology 266: 460-80 (1996)]을 이용하여 얻는다. WU-BLAST-2 검색 파라미터 대부분은 디폴트값으로 설정한다. 디폴트값으로 설정되지 않은, 즉 조정가능한 파라미터는 다음 값으로 설정되었다: 오버랩 스팬 = 1, 오버랩 분획 = 0.125, 워드 한계 (T) = 11, 및 점수 매트릭스 = BLOSUM62. 본원의 목적을 달성하기 위해, 핵산 서열 동일성 값 (%)은 (a) 천연 PRO 폴리펩티드-코딩 핵산으로부터 유도된 서열을 갖는 목적 PRO 폴리펩티드 코딩 핵산 분자의 핵산 서열과 비교되는 핵산 분자 (즉, 목적 PRO 폴리펩티드 코딩 핵산 분자와 비교되는 서열로서 PRO 변이체 폴리뉴클레오티드일 수 있음)과의 사이에 매치되는 동일한 뉴클레오티드의 수를 WU-BLAST-2로 얻은 후, 이를 (b) 목적 PRO 폴리펩티드 코딩 핵산 분자의 총 뉴클레오티드수로 나누어 얻는다. 예를 들어, 핵산 서열 B와 80% 이상의 핵산 서열 동일성을 갖는 핵산 서열 A를 포함하는 단리된 핵산 분자"라는 말에서, 핵산 서열 A는 비교하는 목적 핵산 분자의 서열이고 핵산 서열 B는 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 목적 핵산 분자의 핵산 서열이다.
다른 실시태양에서 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 변이체 폴리뉴클레오티드는 도 2 (서열 2)의 전장 PRO211 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열, 도 4 (서열 7)의 전장 PRO228 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열, 도 6 (서열 16)의 전장 PRO538 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열, 도 8 (서열 21)의 전장 PRO172 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열 또는 도 10 (서열 26)의 전장 PRO182 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 바람직하게는 엄격한 혼성화 및 세척 조건에서 혼성화할 수 있는, 활성 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드를 각각 코딩하는 핵산 분자이다. PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 변이체 폴리펩티드는 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 변이체 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 것일 수 있다.
상기한 바와 같이 수행되는 아미노산 서열 동일성 비교와 관련하여, 용어 "양성"은 동일한 것뿐만 아니라 유사한 특성을 갖는 비교되는 서열의 아미노산 잔기를 포함한다. 목적 아미노산 잔기의 양성 값을 기록한 아미노산 잔기는 목적 아미노산 잔기와 동일하거나 목적 아미노산 잔기가 바람직하게 치환 (하기 표 3에 정의됨)된 것이다.
본원의 목적상, 주어진 아미노산 서열 B에, B와, 또는 B에 대한 주어진 아미노산 서열 A의 양성값 (%)(주어진 아미노산 서열 B에, B와, 또는 B에 대한 일정한 양성값 (%)을 갖거나 포함하는 주어진 아미노산 서열 A로 달리 표현할 수 있음)은 하기와 같이 계산한다:
X/Y ×100
여기서, X는 A와 B의 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2의 정렬에서 상기에서 정의된 양성값을 기록하는 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B의 아미노산 잔기의 총수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 같지 않는 경우, B에 대한 A의 양성값 (%)은 A에 대한 B의 양성값 (%)과 같지 않음을 인지할 것이다.
본원에 개시된 다양한 폴리펩티드를 기술하기 위해 사용된 "단리된"은 폴리펩티드가 동정되고, 그 자연 환경 요소로부터 분리 및(또는) 회수되었음을 의미한다. 바람직하게, 단리된 폴리펩티드는 자연 상태에서 결합된 모든 성분과 결합되지 않은 상태이다. 폴리펩티드의 자연 환경의 오염 요소는 이 폴리펩티드의 진단 또는 치료적 사용을 일반적으로 방해하는 물질로서, 효소, 호르몬 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질 등이 포함될 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 폴리펩티드는 (1) 스피닝 컵 서열분석기를 사용하여 N 말단 또는 내부 아미노산 서열의 15개 이상의 잔기를 얻기에 충분한 정도로 정제되거나, 또는 (2) 쿠마시 블루 또는 바람직하게는 은 염색을 사용하여 비환원 또는 환원 조건 하에 SDS-PAGE에서 하나의 밴드만 나타날 정도로 정제될 수 있다. PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드 자연 환경의 요소가 하나 이상 존재하지 않을 것이기 때문에 단리된 폴리펩티드는 재조합 세포 내의 계내에 존재하는 폴리펩티드를 포함한다. 그러나, 통상 단리된 폴리펩티드는 하나 이상의 정제 단계에 의해 얻어질 것이다.
PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드 코딩하는 "단리된" 핵산 분자 또는 항 PRO211, 항 PRO228, 항 PRO538, 항 PRO172 또는 항 PRO182 항체를 코딩하는 "단리된" 핵산 분자는 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 코딩 핵산 또는 항 PRO211, 항 PRO228, 항 PRO538, 항 PRO172 또는 항 PRO182 항체 코딩 핵산의 천연 출처에서 통상적으로 결합되는 하나 이상의 오염 핵산 분자로부터 동정 및 분리된 핵산 분자라는 의미이다. 바람직하게, 단리된 핵산은 자연 상태에서 결합된 모든 성분과 결합되지 않은 상태이다. 단리된 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 코딩 핵산 분자 또는 항 PRO211, 항 PRO228, 항 PRO538, 항 PRO172 또는 항 PRO182 항체 코딩 핵산 분자는 자연에서 발견되는 형태 또는 상태와 다르게 존재한다. 따라서, 단리된 핵산 분자는 천연 세포에 존재하는 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 코딩 핵산 분자 또는 항 PRO211, 항 PRO228, 항 PRO538, 항 PRO172 또는 항 PRO182 항체 코딩 핵산 분자와 구별된다. 그러나, 예를 들어, 천연 세포와 상이한 염색체 위치에 존재하며 통상적으로 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드 또는 항 PRO211, 항 PRO228, 항 PRO538, 항 PRO172 또는 항 PRO182 항체를 발현하는 세포에 함유된 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 코딩 핵산 분자 또는 항 PRO211, 항 PRO228, 항 PRO538, 항 PRO172 또는 항 PRO182 항체 코딩 핵산 분자는 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산 분자 또는 항 PRO211, 항 PRO228, 항 PRO538, 항 PRO172 또는 항 PRO182 항체를 코딩하는단리된 코딩 핵산 분자에 포함된다.
용어 "조절 서열"이란 특정 숙주 유기체에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필요한 DNA 서열이다. 원핵생물에 적절한 조절 서열로는 예컨데 프로모터, 경우에 따라 오퍼레이터 서열, 및 리보솜 결합 부위를 들 수 있다. 진핵세포는 프로모터, 폴리아데닐화 시그날 및 인핸서를 이용하는 것으로 알려져 있다.
핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결"된다. 예를 들면, 전서열 또는 분비 리더 (leader)의 DNA는 해당 폴리펩티드가 분비되기 전의 형태인 전구단백질로서 발현되는 경우 폴리펩티드의 DNA에 작동가능하게 연결되고, 프로모터 또는 인핸서는 폴리펩티드 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되며, 리보솜 결합 부위는 번역을 촉진하도록 배치될 때 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로 "작동가능하게 연결된"은 연결될 DNA 서열들이 인접하여 위치함을 의미하며, 분비 리더의 경우 인접하여 위치할 뿐만 아니라 동일한 리딩 프레임 내에 존재하는 것을 의미한다. 그러나 인핸서는 인접하여 위치할 필요가 없다. 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션에 의해 달성된다. 이러한 부위가 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커를 통상적인 방법에 따라 사용한다.
용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되며, 구체적으로는 단일의 항 PRO211, 항 PRO228, 항 PRO538, 항 PRO172 및 항 PRO182 모노클로날 항체 (아고니스트 항체 포함), 폴리에피토프 특이성을 갖는 항 PRO211, 항 PRO228, 항 PRO538, 항 PRO172 및 항 PRO182 항체 조성물, 단쇄의 항 PRO211, 항 PRO228, 항 PRO538, 항 PRO172및 항 PRO182 항체, 및 항 PRO211, 항 PRO228, 항 PRO538, 항 PRO172 및 항 PRO182 항체의 단편 (하기 참조)을 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 동종 항체들의 집단으로부터 얻은 항체, 즉, 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연발생적 돌연변이를 제외한, 한 집단을 이루는 동일한 개별 항체를 의미한다.
혼성화 반응의 "엄격도"는 당업자가 용이하게 결정할 수 있으며, 일반적으로 프로브 길이, 세척 온도, 염 농도에 따라 달라지는 실험적 계산값이다. 일반적으로 보다 긴 프로브일수록 적절한 어닐링에 보다 높은 온도를 필요로하며, 보다 짧은 프로브일수록 보다 낮은 온도를 필요로 한다. 혼성화는 일반적으로 상보적 가닥이 자신들의 용융 온도보다 낮은 환경에 존재할 때 변성된 DNA의 재어닐링 능력에 따라 달라진다. 프로브와 혼성화가능한 서열 사이의 원하는 상동성의 정도가 높을수록, 사용할 수 있는 상대적인 온도가 높아진다. 따라서, 상대적 온도가 높아질수록 반응 조건은 더욱 엄격해지는 반면, 상대적 온도가 낮을수록 반응조건은 덜 엄격해진다. 혼성화 반응의 엄격도와 관련한 더 자세한 정보 및 설명은 문헌 [Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers (1995)]을 참조한다.
본원에서 정의되는 "엄격 조건" 또는 "고엄격 조건"이란 (1) 세척시 이온 세기가 낮고 온도가 높은 조건, 예를 들면 50℃에서 0.015 M 염화나트륨/0.0015 M 시트르산나트륨/0.1 % 소듐 도데실 술페이트를 사용하는 조건, 또는 (2) 혼성화시에 포름아미드, 예를 들어 42 ℃, 750 mM 염화나트륨, 75 mM 시트르산나트륨이 함유된 50 mM 인산나트륨 완충액 (pH 6.5)/0.1 % 소혈청 알부민/0.1 % 피콜/0.1 % 폴리비닐피롤리돈으로 제조한 50 % (부피/부피) 포름아미드와 같은 변성제를 사용하는 조건, (3) 50 % 포름아미드, 5 x SSC (0.75 M NaCl, 0.075 M 시트르산나트륨), 50 mM 인산나트륨 (pH 6.8), 0.1 % 피로인산 나트륨, 5 x Denhardt 용액, 초음파처리된 연어 정자 DNA (50 ㎍/ml), 0.1 % SDS, 및 10 % 덱스트란 술페이트를 42 ℃에서 사용하고, 42 ℃에서 0.2 x SSC (염화나트륨/시트르산나트륨), 그리고 55 ℃에서 50 % 포름아미드로 세척하며, 55 ℃에서 EDTA가 함유된 0.1 x SSC를 이용한 고엄격 세척을 수행하는 것이다.
"중등도의 엄격 조건"이란 문헌 [Sambrook et al.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press (1989)]에 기재된 바와 같고, 상기한 것보다 엄격성이 낮은 혼성화 조건 (예를 들어 온도, 이온 세기 및 %SDS)의 이용을 포함한다. 중등도의 엄격 조건의 예는 20% 포름아미드, 5 x SSC (150 mM 염화나트륨, 15 mM 시트르산삼나트륨), 50 mM 인산나트륨 (pH 7.6), 5 x Denhardt 용액, 10% 덱스트란 술페이트 및 20 mg/ml의 파쇄된 연어 정액 변성 DNA를 포함하는 용액 중에서 37℃로 밤새 인큐베이션한 후 필터를 약 37 내지 50℃에서 1 x SSC로 세척하는 조건이다. 당업자는 프로브 길이 등과 같은 인자에 맞추기 위해 필요한 온도, 이온 세기 등을 조절하는 방법을 잘 알 것이다.
본원에 사용된 용어 "에피토프 태그가 부가된"은 "태그 폴리펩티드"에 융합된 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드를 포함하는 키메라 폴리펩티드를 지칭한다. 태그 폴리펩티드는 항체가 만들어질 수 있을 정도의 에피토프를 제공하기에 충분한 잔기를 갖지만 융합되는 폴리펩티드의 활성을 방해하지 않을 정도로 충분히 짧다. 태그 폴리펩티드는 아주 독특해서 자신에 대한 항체가 다른 에피토프와는 실질적으로 교차반응하지 않는 것이 바람직하다. 적절한 태그 폴리펩티드는 일반적으로 6개 이상의 아미노산 잔기를 가지며, 통상 약 8 내지 50개의 아미노산 잔기 (바람직하게는 약 10 내지 20개의 아미노산 잔기)를 갖는다.
본원에 사용된 용어 "면역어드헤신"은 면역글로불린 불변 도메인의 이펙터 기능과 이종 단백질 ("어드헤신")의 결합 특이성을 겸비한 항체 유사 분자를 지칭한다. 구조적으로 보면 면역어드헤신은 항체의 항원 인식 및 결합 부위가 아닌(즉, 이종의), 원하는 결합 특이성을 갖는 아미노산 서열과 면역글로불린 불변 도메인 서열의 융합체를 포함한다. 면역어드헤신 분자의 어드헤신 부분은 전형적으로 적어도 수용체 또는 리간드의 결합 부위를 포함하는 인접 아미노산 서열이다. 면역어드헤신 중 면역글로불린 불변 도메인 서열은 IgG-1, IgG-2, IgG-3, IgG-4 서브타입, IgA (IgA-1 및 IgA-2 포함), IgE, IgD 또는 IgM과 같은 임의의 면역글로불린으로부터 얻을 수 있다.
본원에서 사용된 "활성의" 또는 "활성"은 천연 또는 자연 발생 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드의 생물학적 및(또는) 면역학적 활성을 보유하는 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182의 형태(들)을 언급한다. 여기서 "생물학적" 활성이란 천연 또는 자연발생의 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182가 갖는 항원성 에피토프에 대해 항체의 생산을 유도하는 능력을 제외한 천연 또는 자연 발생의 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182에의한 생물학적 기능 (억제 또는 자극)을 의미하고, "면역학적 활성"은 천연 또는 자연발생의 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182가 갖는 항원성 에피토프에 대해 항체의 생산을 유도하는 능력을 언급하는데 사용된다.
본원에 개시된 스크리닝 분석법에 의해 동정될 수 있는 항체 또는 또다른 아고니스트에 있어서 "생물학적 활성"이란 "치료 유효량"의 정의와 함께 본원에 열거된 하나 이상의 효과를 유발할 수 있는 상기 분자의 능력을 언급하는 데 사용된다. 특정 실시태양에서, "생물학적 활성"은 신생 세포 성장 또는 증식을 억제하는 능력이다. 바람직한 생물학적 활성은 표적 종양 (예, 암) 세포의 성장을 지연 또는 완전한 정지를 포함하는 억제이다. 바람직한 또다른 생물학적 활성은 표적 종양 (예. 암) 세포의 사망을 유발하는 세포독성 활성이다. 또다른 생물학적 활성은 표적 종양 (예, 암) 세포의 세포 사멸의 유도이다.
용어 "면역학적 활성"은 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드의 하나 이상의 에피토프와의 면역학적 교차 반응성을 의미한다.
본원에서 사용되는 "면역학적 교차 반응성"은 후보 폴리펩티드가 공지된 활성 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드에 대해 생성된 폴리클로날 항혈청과 상기 활성을 갖는 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드의 정량적인 생물학적 활성을 경쟁적으로 억제할 수 있다는 것을 의미한다. 상기 항혈청은 염소 또는 토끼를 예를 들어 완전 프로인드 보조제 내에 공지된 활성의 유사체와 함께 피하주사하고 분완전 프로인드 내의 복강내 또는 피하 주사로 부스팅함으로써 통상의 방법으로 제조된다. 면역학적 교차반응성은 바람직하게는 "특이적"이며, 이는 면역학적으로 교차반응성의 동정된 분자 (예, 항체)의 대응하는 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드에 대한 결합 친화도가 임의의 공지된 다른 분자의 결합 친화도에 비해 유의하게 높다 (바람직하게는 약 2배이상, 보다 바람직하게는 약 4배 이상, 보다 바람직하게는 약 6배 이상, 가장 바람직하게는 약 8배 이상)는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 "종양"은 악성 또는 양성 및 모든 전암성 및 암성 세포 및 조직의 모든 신생 세포 성장 및 증식을 언급한다.
"암" 및 "암성"이란 비조절된 세포 성장이라는 전형적 특징을 갖는 포유동물의 생리 상태를 언급하거나 정의한다. 암의 예로는 암종, 임파종, 아세포종, 육종 및 백혈병이 있으나 이에 한정되지는 않는다. 상기 암의 보다 구체적인 예로는 유방암, 전립선암, 결장암, 편평세포암, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 난소암, 자궁경부암, 위장암, 췌장암, 신경교아종, 간암, 방광암, 간종양, 결장직장암, 자궁내막암, 타액선암종, 신장암, 외음부암, 갑상선암, 간암종 및 여러 종류의 두부 및 경부암이 있다.
"치료"란 질병의 발생을 예방하거나 질병의 병리를 변화시키기 위해 수행하는 처치를 의미한다. 따라서, "치료"는 치료 처치 및 억제 또는 예방 조치 모두를 가리킨다. 치료를 요하는 사람은 이미 질병에 걸린 사람 뿐만 아니라 질병을 예방해야하는 사람을 포함한다. 종양 (예, 암) 치료에서, 치료제는 암 세포의 병리를 직접 감소시킬 수 있거나, 다른 치료제, 예를 들어, 방사선 및(또는) 화학요법제에 의한 처리에 종양 세포를 보다 감수성을 갖도록 할 수 있다.
암의 "병리"란 환자의 건강에 손상을 주는 모든 현상이 포함된다. 여기에는는 비정상 또는 조절될 수 없는 세포 성장, 전이, 인접 세포의 정상 기능 방해, 사이토카인 또는 다른 분비물의 비정상적 수준의 분비, 염증 또는 면역 반응의 억제 또는 악화 등이 포함되나 이에 한정되지 않는다.
신생 세포 성장의 억제와 관련하여 본원에 개시된 폴리펩티드 또는 그의 아고니스트의 "유효량"은 표적 세포의 성장을 어느 정도까지 억제할 수 있는 양이다. 이 용어에는 표적 세포의 성장 억제, 세포 억제 및(또는) 세포독성 효과 및(또는) 세포사멸이 포함된다. 신생 세포 성장을 억제하기 위한 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드 또는 그의 아고니스트의 "유효량"은 경험적으로 통상의 방식으로 결정할 수 있다.
종양의 치료와 관련하여 "치료 유효량"이란 하나 이상의 다음 효과, 즉 (1) 종양 성장의 지연 및 완전한 성장 정지를 비롯하여 종양 성장의 어느 정도까지의 억제, (2) 종양 세포수의 감소, (3) 종양 크기의 감소, (4) 주위 기관으로의 종양 세포 침윤의 억제 (즉, 감소, 지연 또는 완전한 정지), (5) 전이의 억제 (즉, 감소, 지연 또는 완전한 정지), (6) 종양의 퇴화 또는 거부를 일으킬 수 있는 (반드시 일으킬 필요는 없음) 항종양 면역 반응의 증진 및(또는) (7) 질환과 관련된 하나 이상의 증상의 어느 정도까지의 경감을 일으킬 수 있는 양이다. 종양 치료를 위한 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드 또는 그의 아고니스트의 "치료 유효량"은 경험적으로 통상의 방식으로 결정할 수 있다.
PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드 또는 그의 아고니스트의 "성장 억제량"은 세포, 특히 종양 세포, 예를 들어 암세포의 성장을 생체외 또는 생체내에서 억제할 수 있는 양이다. 신생 세포 성장을 억제하기 위한 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드 또는 그의 아고니스트의 "성장 억제량"은 경험적으로 통상의 방식으로 결정할 수 있다.
PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드 또는 그의 아고니스트의 "세포독성량"은 세포, 특히 종양, 예를 들어 암세포의 파괴를 생체외 또는 생체내에서 일으킬 수 있는 양이다. 신생 세포 성장을 억제하기 위한 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드 또는 그의 아고니스트의 "세포독성량"은 경험적으로 통상의 방식으로 결정할 수 있다.
본원에 사용된 "세포독성제"는 세포의 기능을 저해하거나 억제하고(하거나) 세포를 파괴시키는 물질을 말한다. 이 용어는 방사성 동위원소 (예를 들어 I131, I125, Y90및 Re186), 화학요법제 및 독소, 예를 들어 세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소 활성을 갖는 독소 또는 그의 단편을 포함하는 것을 말한다.
"화학요법제"는 종양, 예를 들어 암 치료에 유용한 화학적 화합물이다. 화학요법제의 예에는 아드리아마이신, 독소루비신, 에피루비신, 5-플루오로우라실, 시토신 아라비노시드 ("Ara-C"), 시클로포스파미드, 티오테파, 부술판, 시톡신, 탁소이드, 예를 들어 파클리탁셀 (상표명 탁솔(Taxol), 미국 뉴저지주 프린스톤 소재 브리스톨마이어스 스퀴브 온콜로지사 제품) 및 독세탁셀 (상표명 탁소테레(Taxotere), 프랑스 안토니 소재 롱플랑 로레아사 제품), 톡소테레, 메토트렉세이트, 시스플라틴, 멜팔란, 빈블라스틴, 블레오마이신, 에토포시드, 이포스파미드, 미토마이신 C, 미톡산트론, 빈크리스틴, 비노렐빈, 카르보플라틴, 테니포시드, 다우노마이신, 카르미노마이신, 아미노프테린, 닥티노마이신, 미토마이신, 에스페라미신 (미국 특허 제4,675,187호 참조), 멜팔란 및 다른 관련 질소 머스타드가 있다. 또한, 타목시펜 및 오나프리스톤과 같은 종양에 대한 호르몬 작용을 조절하거나 억제하는 호르몬 제제도 상기 화학요법제의 정의에 포함된다.
본원에 사용된 "성장 억제제"는 세포, 특히 종양, 예를 들어 암세포의 시험관내 또는 생체내 성장을 억제하는 화합물 또는 조성물을 말한다. 따라서, 성장 억제제는 S기의 표적 세포 비율을 크게 감소시키는 물질이다. 성장 억제제의 예에는 세포 주기 진행을 (S기 이외의 시기에서) 차단하는 물질, 예를 들어 G1 정지 및 M기 정지를 유도하는 물질이 포함된다. 전형적인 M기 차단제로는 빈카스 (빈크리스틴 및 빈블라스틴), 탁솔, 및 토포 II 억제제, 예를 들어 독소루비신, 에피루비신, 다우노루비신, 에토포시드 및 블레오마이신이 있다. 또한, G1을 정지시키는 물질, 예를 들어 DNA 알킬화제, 예를 들어 타목시펜, 프레드니손, 다카르바진, 메클로레타민, 시스플라틴, 메톡트렉세이트, 5-플루오로우라실 및 아라-C는 S기 정지에도 작용한다. 추가 정보는 문헌 [Murakami et al.,The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, eds., "Cell cycle regulation, oncogens, and antineoplastic drugs" (WB Saunders: Philadelphia, 1995), Chapter 1, 특히 13면]에 기재되어 있다.
"사이토카인"이란 하나의 세포 군집에 의해 방출되는, 세포간 매개제로서 다른 세포에 대해 작용하는 단백질의 일반명이다. 사이토카인의 예로는 림포카인, 모노카인 및 전형적인 폴리펩티드 호르몬이다. 사이토카인에는 성장 호르몬, 예를 들어, 인간 성장 호르몬, N-메티오닐 인간 성장 호르몬 및 소 성장 호르몬, 부갑상선 호르몬, 티록신, 인슐린, 프로인슐린, 릴락신, 프로렐락신, 소낭 자극 호르몬(FSH), 티로이드 자극 호르몬(TSH) 및 황체 형성화 호르몬(LH) 등의 당단백질 호르몬, 간 성장 인자, 섬유아세포 성장 인자, 프롤락틴, 태반 락토젠, 종양 괴사 인자-α및 -β, 뮬러리안 억제 물질, 생쥐 성선자극세포 관련 펩티드, 인히빈, 액티빈, 혈관 내피 성장 인자, 인테그린, 트롬보포이에틴 (TPO), 신경 성장 인자, 예를 들어 NGF-β; 혈소판 성장 인자; 형질전환 세포 성장 인자 (TGF), 예를 들어, TGF-α및 -β, 인슐린 유사 성장 인자-1 및 -Π, 에리트로포이에틴 (EPO), 골유도 인자, 인터페론, 예를 들어 인터페론-α, -β및 -γ, 콜로니 자극 인자 (CSF), 예를 들어 대식세포-CSF (M-CSF), 과립세포-대식세포-CSF (GM-CSF) 및 과립세포-CSF (G-CSF), 인터루킨(IL), 예를 들어 IL-1, IL-1α, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12; 종양 괴사 인자, 예를 들어, TNF-α또는 TNF-β; 및 LIF 및 키트 리간드 (KL)를 비롯한 다른 폴리펩티드 인자가 포함된다. 본원에서 사용되는 용어 사이토카인은 천연 공급원 또는 재조합 세포 배양물로부터의 단백질 및 천연 서열 사이토카인의 생물학적 활성 동등물을 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "전구약물"이란 모약물에 비해 종양 세포에 대한 세포독성이 적으며 효소적으로 활성화되거나 활성이 더 큰 모형태로 전환될 수 있는 제약 활성 물질의 전구체 또는 유도체형을 말한다 [Wilman, "Prodrugs in CancerChemotherapy",Biochemical Society Transactions,14:375-382, 615th Meeting Belfast (1986) 및 Stella et al., "Prodrugs :A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery,"Directed Drug Deliver,Borchardt et al., (ed.), pp. 247-276, Humana Press (1985) 참조]. 본 발명의 전구약물로는 포스페이트 함유 전구약물, 티오포스페이트 함유 전구약물, 글리코실화된 전구약물 또는 임의로 치환된 페닐아세트아미드 함유 전구약물, 5-플루오로시토신 및 다른 5-플루오로유리딘 전구약물이 포함되나 이에 한정되지는 않는다. 본 발명에 사용하기 위한 전구약물로 유도체화될 수 있는 세포독성 약물로는 상기된 화학요법제가 포함되나 이에 한정되지 않는다.
용어 "아고니스트"는 가장 넓은 의미로 사용되며, 천연 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드의 생물학적 활성을 모방하는 모든 분자를 통칭한다. 적합한 아고니스트 분자로는 구체적으로 아고니스트 항체 또는 항체의 단편, 천연 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드의 단편 또는 아미노산 서열 변이체, 펩티드, 작은 유기분자 등을 들 수 있다. PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드의 아고니스트를 동정하는 방법은 후보 아고니스트와 종양 세포를 접촉시키는 단계 및 종양 세포 성장의 억제를 측정하는 단계를 포함할 수 있다.
"만성" 투여는 급성 투여와 반대 의미로서, 장기간 동안 초기 치료 효과 (활성)을 유지하도록 연속적인 형태로 제제를 투여하는 것을 언급한다. "간헐적" 투여는 중단없이 연속적으로 행해지지 않는, 오히려 실질적으로 주기적인 치료이다.
치료 목적의 "포유동물"은 인간, 가축 및 사육 동물, 및 동물원용, 경기용 또는 애완용 동물, 예를 들어 개, 고양이, 소, 말, 양, 돼지, 염소, 토끼 등을 비롯하여 포유동물로 분류되는 모든 동물을 말한다. 바람직한 포유동물은 인간이다.
하나 이상의 다른 치료제와 "조합하여" 투여한다는 것은 동시에 (동시다발적으로) 투여하거나 어떤 순서로든 연속하여 투여하는 것이 포함된다.
본원에서 사용된 "담체"라 함은 사용되는 투여량 및 농도에 노출되는 세포 또는 포유동물에 무독성인 제약적으로 허용가능한 담체, 부형제, 또는 안정화제가 있다. 생리학상 허용되는 담체는 종종 pH 완충 수용액이다. 생리상 허용가능한 담체의 예로는 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산과 같은 완충액, 아스코르브산을 비롯한 산화방지제, 저분자량 (약 10 잔기 미만) 폴리펩티드, 단백질, 예를 들어 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어 폴리비닐피롤리돈, 아미노산, 예를 들어 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 라이신, 단당류, 이당류 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 비롯한 기타 탄수화물, 킬레이트화제, 예를 들어 EDTA, 당 알콜, 예를 들어 만니톨 또는 소르비톨, 염 형성 카운터 이온, 예를 들어 나트륨, 및(또는) 비이온계 계면활성제, 예를 들어 트윈 (TWEEN, 상표명), 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 및 플루로닉스(PLURONICS, 상표명)이 있다.
"천연 항체" 및 "천연 면역글로불린"은 일반적으로 2개의 동일한 경쇄(L) 및 2개의 동일한 중쇄(H)로 구성되는 약 150,000 달톤의 헤테로테트라머의 당단백질이다. 각각의 경쇄는 하나의 디술피드 공유결합에 의해 중쇄에 연결되고, 디술피드결합의 개수는 중쇄의 상이한 면역글로불린 이소형에 따라 다르다. 또한, 각각의 중쇄 및 경쇄는 규칙적 간격으로 쇄내의 디술피드 결합을 갖는다. 각각의 중쇄는 한 말단에 가변 도메인(VH) 및 이 도메인에 연결되는 다수의 불변 도메인을 갖는다. 각각의 경쇄는 한 말단에 가변 도메인 (VL) 및 다른 말단에 불변 도메인을 갖고, 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 제1 불변 도메인과 일렬로 배열되고, 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 일렬로 배열된다. 특정 아미노산 잔기들이 경쇄와 중쇄 가변 도메인 사이의 공유영역을 형성하는 것으로 생각된다.
용어 "가변"은 항체들 간에 가변 도메인의 특정 부분의 서열이 크게 상이하고 특정 항원에 대한 각각의 특정 항체의 결합 및 특이성에 사용되는 것으로 생각된다. 그러나, 가변성은 항체의 가변 도메인 전체에 균일하게 분포되지 않는다. 가변성은 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 모두의 상보성 결정 영역 (CDR) 또는 과가변 영역으로 불리는 3개의 세그먼트에 집중된다. 가변 도메인에서 보존도가 매우 높은 부분은 프레임워크 영역 (FR)이라 지칭한다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 β-시트 구조를 연결하거나 경우에 따라 그 구조의 일부를 형성하는 루프를 형성하는 3개의 CDR에 의해, 주로 β-시트의 배열를 선택하는 4개의 프레임워크 영역을 포함한다. 각 쇄 내의 CDR은 FR 영역에 의해 서로 매우 근접하게 유지되고, 다른 쇄의 CDR과 함께 항체의 항원 결합 부위의 형성에 기여한다 (Kabat et al.,NIH Publ. No. 91-3242, Vol. I, pages 647-669 (1991) 참조). 불변 도메인은 항체의 항원 결합시에 직접 관여하지 않지만, 여러 이펙터 기능, 예를 들어 항체 의존성세포독성에서 항체의 관여하는 기능을 보인다.
본원에 사용되는 "과가변 영역"이란 항원 결합에 중요한 기능을 하는 항체의 아미노산 잔기를 말한다. 과가변 영역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"의 잔기(즉, 경쇄 가변 도메인 내의 잔기 24 내지 34 (L1), 50 내지 56 (L2) 및 89 내지 97 (L3) 및 중쇄 가변 도메인 내의 잔기 31 내지 35 (H1), 50 내지 65 (H2) 및 95 내지 102 (H3)의 아미노산 잔기) [Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interests, 5th Ed. Public Health Services, National Institute of Health, Bethesda, MD. (1990)] 및(또는) "과가변 루프" (즉, 경쇄 가변 도메인 내의 잔기 26 내지 32 (L1), 50 내지 52 (L2) 및 91 내지 96 (L3) 및 중쇄 가변 영역에서의 잔기 26 내지 32 (H1), 53 내지 55 (H2) 및 96 내지 101 (H3)의 아미노산 잔기)[Clothia and Lesk,J. Mol. Biol.,196:901-917 (1987)]를 포함한다. "프레임워크" 또는 "FR" 잔기는 상기 정의된 과가변 영역 잔기이외의 다른 영역 잔기이다.
"항체 단편"은 완전한 항체의 일부, 바람직하게는 완전한 항체의 항원 결합 영역 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예로는 Fab, Fab', F(ab')2및 Fv 단편, 디아바디, 선형 항체 [Zapata et al.,Protein Eng.8(10): 1057-1062 (1995)], 단일쇄 항체 분자 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이성 항체 등이 있다.
항체를 파파인 분해하면 2개의 동일한 항원 결합 단편, 즉 항원 결합 부위를하나씩 갖는 소위 "Fab" 단편, 및 쉽게 결정화되는 능력을 반영하여 이름 붙여진 나머지 "Fc" 단편이 생성된다. 펩신을 처리하면, 2개의 항원 결합 부위를 가지며 여전히 항원에 교차결합할 수 있는 F(ab')2단편이 생성된다.
"Fv"는 완전한 항원 인식 및 항원 결합 부위를 포함하는 최소 항체 단편이다. 이 영역은 단단하게 비공유결합된 하나의 중쇄 가변 도메인과 하나의 경쇄 가변 도메인의 이량체로 구성된다. 이러한 구성으로 각 가변 도에인의 3개의 CDR은 상호작용하여 VH-VL이량체의 표면 상에 항원 결합 부위를 한정한다. 전체적으로, 6개의 CDR이 항체에 항원 결합 특이성을 부여한다. 그러나, 단일 가변 도메인 (또는 단지 3개의 항원에 특이적인 CDR만을 포함하는 Fv의 절반)도 전체 결합 부위보다 친화성은 낮지만 항원을 인식하여 항원에 결합할 수 있다.
또한, Fab 단편은 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인(CH1)을 함유한다. Fab 단편은 항체 힌지 (Hinge) 영역으로부터 유래한 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카르복시 말단에 몇 개의 잔기가 첨가되었다는 점에서 Fab 단편은 Fab' 단편과 상이하다. 본원에서 Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)이 유리 티올기를 보유하는 Fab'를 지칭한다. F(ab')2항체 단편은 본래 그들 사이에 힌지 시스테인이 있는 몇쌍의 Fab' 단편으로 생성되었다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링도 공지되어 있다.
임의의 척추동물종으로부터 유래한 항체 (면역글로불린)의 "경쇄"는 그의 불변 도메인의 아미노산 서열을 기초로 하여 카파 (κ) 및 람다 (λ)로 지칭되는 2개의 명백하게 상이한 타입 중의 하나로 분류될 수 있다.
중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 면역글로불린은 상이한 클래스로 분류될 수 있다. 면역글로불린에는 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM의 5개의 주요 클래스가 존재하고, 이들 중 몇 개는 서브클래스(이소형), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA 및 IgA2로 더 분류될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 동종 항체들의 집단으로부터 얻은 항체, 즉, 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연발생적 돌연변이를 제외한, 한 집단을 이루는 동일한 개별 항체를 의미한다. 모노클로날 항체는 매우 특이적이며 단일 항원 부위에 대한 것이다. 또한, 통상적으로 다른 결정인자 (에피토프)에 대한 다른 항체를 포함하는 통상의 항체 (폴리클로날 항체) 제조와는 반대로, 각 모노클로날 항체는 항원에 대한 단일 결정인자에 대한 것이다. 이들에 대한 특이성 외에도, 모노클로날 항체는 하이브리도마 배양에 의해 합성되며, 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않는다는 장점을 갖는다. 수식어 "모노클로날"은 실질적으로 동종의 항체군으로부터 수득된 항체의 특성을 나타내며, 임의의 특정 방법으로 항체 생산을 요구하는 것으로 해석되지 않는다. 예를 들어, 본 발명에서 사용된 모노클로날 항체는 문헌 [Kohler et al.,Nature,256: 495 (1975)]에 최초로 기재된 하이브리도마법 또는 재조합 DNA 방법 [미국 특허 제 4,816,567호]에 의해 제조될 수 있다. 또한, "모노클로날 항체"는 예를 들어 문헌 [Clackson et al.,Nature,352: 624-628 (1991) 및 Marks et al.,J. Mol. Biol.,222: 581-597 (1991)]에 개시된 기술을 이용하여 파아지 항체 라이브러리로부터 단리할 수 있다.
본원에서의 모노클로날 항체는 구체적으로, 목적하는 활성을 나타낸다면 중쇄 및(또는) 경쇄의 일부분은 특정 종으로부터 유래된 항체 또는 특정 항체군 또는 서브클래스에 속하는 항체에 대응하는 서열과 동일하거나 상동성을 갖고, 쇄(들)의 나머지는 또다른 종으로부터 유래된 항체 또는 또다른 항체군 또는 서브클래스에 속하는 항체 또는 그러한 항체의 단편과 동일하거나 상동성을 갖는 "키메라" 항체 (면역글로불린)를 포함한다 [미국 특허 제4,816,567호; Morrison et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,81: 6851-6855 (1984)].
비-인간 (예를 들어, 쥐과 동물) 항체의 "인간화" 형태는 비-인간 면역글로불린으로부터 유도된 최소 서열을 포함하는 키메라 면역글로불린, 면역글로불린 쇄 또는 그의 단편 (예를 들어, Fv, Fab, Fab', F(ab')2또는 항체의 다른 항원 결합 작은 서열)이다. 대부분의 경우 인간화 항체는 수여자의 상보성 결정 영역 (CDR)의 잔기를 원하는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 마우스, 랫트 또는 토끼와 같은 인간 이외의 종 (공여자 항체)의 CDR로부터의 잔기로 치환시킨 인간 면역글로불린 (수용자 항체)을 포함한다. 몇몇 경우에, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 잔기는 대응하는 비-인간 잔기에 의해 치환된다. 또한, 인간화 항체는 수여 항체에서도 또는 도입되는 CDR 또는 프레임워크 서열에서도 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 항체 수행능을 개량하고 최대화하도록 만든다. 일반적으로, 인간화 항체는 하나 이상, 일반적으로 둘 이상의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역은 비-인간 면역글로불린의 영역에 대응하며, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 면역글로불린 컨센서스 서열의 영역에 해당한다. 또한, 인간화 항체는 면역글로불린 불변 영역 (Fc)의 적어도 일부, 일반적으로 인간 면역글로불린 영역의 적어도 일부를 최적으로 포함할 것이다 [Jones et al.,Nature,321: 522-525 (1986); Riechmann et al.,Nature,332: 323-329 (1988); 및 Presta,Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992)]. 인간화 항체는 항체의 항원 결합 영역이 짧은 꼬리 원숭이를 원하는 항원으로 면역시켜 생산된 항체로부터 유도된 PRIMATIZED (상표명) 항체를 포함한다.
"단일 쇄 Fv" 또는 "sFv" 항체 단편은 단일 폴리펩티드 쇄에 존재하는 항체의 VH및 VL도메인을 포함한다. 바람직하게는, Fv 폴리펩티드는 sFv가 항원 결합에 필요한 구조를 형성하도록 하는 VH및 VL도메인 사이에 폴리펩티드 링커도 포함한다. sFv에 관해서는 문헌 [Pluckthun inThe Pharmacology of Monoclonal Antibodies,vol. 113, Rosenburg 및 Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)]을 참조한다.
용어 "디아바디(diabody)"는 동일한 폴리펩티드 쇄 (VH-VL) 내에 경쇄 가변 도메인(VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함하는, 2개의 항원 결합 부위가 있는 작은 항체 단편을 말한다. 동일한 쇄에 있는 2개의 도메인을 페어링시킬 수 없을 정도로 짧은 링커를 사용함으로써, 도메인을 다른 쇄의 상보성 도메인과 강제로 페어링시켜 2개의 항원 결합 부위를 생성시킨다. 디아바디는 예를 들어, 유럽특허 제404,097호, 국제 공개 제93/11611호 및 Hollinger et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,90: 6444-6448 (1993)에 보다 상세하게 기재되어 있다.
"단리된" 항체란 자신의 천연 환경의 요소로부터 확인 및 분리 및(또는) 회수된 항체이다. 그의 천연 환경의 오염 요소는 항체의 진단 또는 치료적 사용을 방해하는 물질로서, 효소, 호르몬 및 다른 단백성 또는 비단백성 용질을 포함할 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 항체는 (1) 로우리(Lowry) 방법에 의해 측정시 95 중량% 초과, 가장 바람직하게는 99 중량% 초과의 항체로, 또는 (2) 스피닝 컵(spinning cup) 서열분석기를 사용하여 N 말단 또는 내부 아미노산의 잔기 15개 이상을 수득하기에 충분한 정도로, 또는 (3) 쿠마시 블루, 또는 바람직하게는 은 염색을 사용하여 환원 또는 비환원 조건 하에 SDS-PAGE에 의해 하나의 밴드로 정제될 것이다. 단리된 항체는 그 항체의 천연 환경의 하나 이상의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문에, 재조합 세포 내의 계내의 항체를 포함한다. 그러나, 단리된 항체는 일반적으로 하나 이상의 정제 단계에 의해 정제될 것이다.
"표지 (label)"는 이 명세서에 사용될 때, 항체에 직간접적으로 접합되어 "표지된" 항체를 생성시키는 검출가능한 화합물 또는 조성물을 말한다. 표지는 그 자체로 (방사성동위원소 표지 또는 형광 표지) 검출될 수 있거나, 효소 표지인 경우에는 검출가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변경을 촉매할 수 있다.
"고상 (solid phase)"은 본 발명의 항체가 부착될 수 있는 비수성 매트릭스를 의미한다. 고상의 예는 부분적으로 또는 완전하게 형성된 유리 (예를 들어 세공 조절된 유리), 폴리사카라이드 (예, 아가로스), 폴리아크릴아미드, 폴리스티렌,폴리비닐 알콜 및 실리콘 등이 있다. 특정 실시태양에서, 내용에 따라 고상은 분석 플레이트의 웰을 포함할 수 있으며, 다른 실시태양에서 고상은 정제 컬럼 (예를 들어 친화 크로마토그래피 컬럼)이다. 이 용어는 또한 미국 특허 제4,275,149호에 기재된 것과 같은 별개 입자의 비연속적 고상도 포함한다.
"리포좀"은 약물 (예를 들어 본원에서 개시된 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드 또는 이에 대한 항체)을 포유동물에게 전달하는 데 유용한 여러 형태의 지질, 인지질 및(또는) 계면활성제로 이루어진 작은 베지클 (vesicle)이다. 리포좀의 성분들은 통상적으로 생체막의 지질 정렬과 유사하게 이중층 형태로 정렬된다.
"소분자 (작은 분자)"는 본원에서 분자량이 약 500 달톤 이하인 것으로 정의된다.
II. 본 발명의 조성물 및 방법
A. 전장 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드
본 발명은 본원에서 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 및 PRO182로 언급되는 폴리펩티드를 코딩하는 새로이 동정하고 단리한 뉴클레오티드 서열에 관한 것이다. 특히, 하기 실시예에 보다 상세히 기재된 바와 같이, PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 및 PRO182 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA를 동정하고 단리하였다.
하기 실시예에 기재된 바와 같이, PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 및 PRO182 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA 클론을 ATCC에 기탁하였다. 당업자라면 당업계의 일반적인 방법을 이용하여 기탁된 클론의 서열을 분석함으로써 상기 클론의실제 뉴클레오티드 서열을 쉽게 결정할 수 있다. 일반적인 기술을 사용하여 뉴클레오티드 서열로부터 예상된 아미노산 서열을 결정할 수 있다. 본원에 기재된 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 및 PRO182 폴리펩티드 및 이를 코딩하는 핵산의 경우, 본 발명자들은 당시 이용할 수 있었던 서열 정보를 사용하여 가장 잘 확인할 수 있는 리딩 프레임으로 여겨지는 것을 확인하였다.
B. PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 및 PRO182 변이체
본원에서 설명되는 전장 천연 서열 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 및 PRO182 폴리펩티드 외에, PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 및 PRO182 폴리펩티드 변이체를 제조할 수 있는 것으로 생각된다. PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 및 PRO182 변이체는 적합한 뉴클레오티드 변화를 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 DNA에 도입하고(하거나) 목적 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드의 합성에 의해 제조할 수 있다. 당업자라면 글리코실화 부위의 수 또는 위치의 변경 또는 멤브레인 앵커링 특성의 변화와 같은 아미노산 변화가 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182의 번역후 프로세싱을 변경시킬 수 있다는 것을 이해할 것이다.
본원에서 설명되는 전장 천연 서열 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 또는 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182의 여러 도메인에서의 변이는 예를 들어 미국 특허 제5,364,934호에 개시된 보존적 및 비보존적 돌연변이 기술 및 지침을 사용하여 제조할 수 있다. 변이는 천연 서열 PRO와 비교시에 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182의 아미노산 서열을 변화시키는,PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182를 코딩하는 하나 이상의 코돈의 치환, 결실 또는 삽입일 수 있다. 임의로, 변이는 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182의 하나 이상의 도메인 내의 하나 이상의 아미노산을 임의 다른 아미노산으로 치환함으로써 생성된다. 목적 활성에 유해한 효과를 주지 않으면서 삽입, 치환 또는 결실될 수 있는 아미노산 잔기는 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182의 서열을 공지의 상동 단백질 분자의 서열과 비교하고 동일성이 높은 영역에서 생성된 아미노산 서열 변화의 수를 최소화함으로써 결정할 수 있다. 아미노산 치환은 하나의 아미노산을 유사한 구조 및(또는) 화학적 특성을 갖는 다른 아미노산으로 치환, 예를 들어 루이신의 세린으로의 치환, 즉 아미노산의 보존적 치환의 결과일 수 있다. 삽입 또는 결실은 임의로 약 1 내지 5개의 아미노산에서 발생할 수 있다. 허용되는 변이는 서열 내에 아미노산을 체계적으로 삽입, 결실 또는 치환시키고, 전장 또는 성숙 천연 서열에 의해 나타나는 생성된 변이체의 활성을 시험함으로써 정할 수 있다.
본원은 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 및 PRO182 폴리펩티드 단편들을 제공한다. 예를 들어 전장 천연 단백질과 비교하는 경우, 이 단편들은 N-말단 또는 C-말단이 잘릴 수 있으며 내부 잔기가 결손될 수 있다. 몇몇 단편은 본 발명의 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드의 목적하는 생물학적 활성에 필수적이지 않은 아미노산 잔기가 결손되어 있다.
PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 및 PRO182 단편은 많은 통상의 기술 중 임의 기술에 의해 제조할 수 있다. 목적 펩티드 단편은 화학적으로 합성할 수 있다.다른 방법은 효소적 분해 방법, 예를 들어 이 단백질을 특정 아미노산 잔기에 의해 정해진 부위에서 단백질을 자르는 것으로 알려진 효소로 처리하거나 또는 이 DNA를 적합한 제한 효소로 잘라냄으로써 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 및 PRO182 단편을 생성하고 이 목적 단편을 단리하는 것을 포함한다. 그러나, 또다른 적합한 기술은 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 목적 폴리펩티드 단편을 코딩하는 DNA 단편을 단리하고 증폭하는 것을 포함한다. DNA 단편의 목적 말단부를 정하는 올리고뉴클레오티드는 PCR에서 5' 및 3' 프라이머로 사용된다. 바람직하게는, PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드 단편은 도 2 (서열 2), 도 4 (서열 7), 도 6 (서열 16), 도 8 (서열 21) 및 도 10 (서열 26)의 각각의 천연 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 및 PRO182 폴리펩티드와 한가지 이상의 생물학적 및(또는) 면역적 활성을 공유한다.
구체적인 실시태양에서, 목적물의 보존적 치환은 바람직한 치환체라는 표제로 표 3에 나타내었다. 이러한 치환에 의해 생물학적 활성이 변화하는 경우, 하기 표 3에서 치환예로서 명명되거나 아미노산 종류에 대해서 하기에서 보다 상세하게 설명된 보다 실질적인 변화를 도입하고 생성물을 스크리닝하였다.
원래 잔기 치환체 예 바람직한 치환체
Ala (A) val, leu, ile val
Arg (R) lys, gln, asn lys
Asn (N) gln, his, lys, arg gln
Asp (D) glu glu
Cys (C) ser ser
Gln (Q) asn asn
Glu (E) asp asp
Gly (G) pro, ala ala
His (H) asn, gln, lys, arg arg
Ile (I) leu, val, met, ala, phe,norleucine leu
Leu (L) norleucine, ile, valmet, ala, phe Ile
Lys (K) arg, gln, asn arg
Met (M) leu, phe, ile leu
Phe (F) leu, val, ile, ala, tyr leu
Pro (P) ala ala
Ser (S) thr thr
Thr (T) ser ser
Trp (W) tyr, phe tyr
Tyr (Y) trp, phe, thr, ser phe
Val (V) ile, leu, met, phe,ala, norleucine leu
PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드의 기능 또는 면역학적 동일성의 실질적인 변형은 (a) 치환 영역에서의 폴리펩티드 주쇄의 구조를, 예를 들어 시트 또는 나선 형태로서 유지하거나, (b) 표적 부위에서의 분자의 하전 또는 소수성을 유지하거나, 또는 (c) 대부분의 측쇄를 유지하는 그의 효과를 상당히 변경시키는 치환을 선택함으로써 수행된다. 자연 발생 잔기는 공통적인 측쇄 특성에 따라 다음과 같은 군으로 구분된다:
(1) 소수성: norleucine, met, ala, val, leu, ile,
(2) 중성 친수성: cys, ser, thr,
(3) 산성: asp, glu,
(4) 염기성: asn, gln, his, lys, arg,
(5) 사슬 배향에 영향을 미치는 잔기: gly, pro 및
(6) 방향족; trp, tyr, phe.
비보존적 치환은 상기 한 종류의 구성 성분을 다른 종류의 것으로 교환시킬 것이다. 또한, 이렇게 치환되는 잔기는 보존적 치환 부위에 도입될 수 있거나 또는 보다 바람직하게는 나머지 (비보존) 부위에 도입될 수 있다.
변이는 올리고뉴클레오티드 매개 (위치 지정) 돌연변이 유발법, 알라닌 스캐닝법 및 PCR 돌연변이 유발법과 같은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제조할 수있다. 위치 지정 돌연변이 유발법 [Carter et al.,Nucl. Acids Res.,13: 4331 (1986); Zoller et al.,Nucl. Acids Res.,10: 6487 (1987)], 카세트 돌연변이 유발법 [Wells et al.,Gene,34:315 (1985)], 제한 선택 돌연변이 유발법 [Wells et al.,Philos. Trans. R. Soc. London SerA,317:415 (1986)] 또는 다른 공지의 기술을 클로닝된 DNA에 실시하여 본 발명의 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드 변이체 DNA를 제조할 수 있다.
또한, 스캐닝 아미노산 분석법을 사용하여 인접 서열을 따라 하나 이상의 아미노산을 확인할 수 있다. 바람직한 스캐닝 아미노산은 비교적 작은 중성 아미노산이다. 이러한 아미노산은 알라닌, 글리신, 세린 및 시스테인을 포함한다. 통상적으로, 알라닌은 베타-탄소 밖의 측쇄를 제거하고 변이체의 주쇄 배열을 변경시킬 가능성이 적기 때문에 바람직한 스캐닝 아미노산이다 [Cunningham and Wells,Science,244: 1081-1085 (1989)]. 또한, 알라닌은 통상적으로 가장 흔한 아미노산이기 때문에 바람직하다. 또한, 알라닌은 파묻힌 위치 및 노출된 위치 모두에서빈번하게 발견된다 [Creighton,The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia,J. Mol. Biol.,150:1 (1976)]. 알라닌 치환이 적당한 양의 변이체를 생성시키지 않으면, 동배체(isoteric) 아미노산을 사용할 수 있다.
C. PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 및 PRO182의 변형
PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 및 PRO182의 공유결합 변형은 본 발명의 범위에 포함된다. 공유결합 변형의 한 형태는 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182의 선택된 측쇄 또는 N 말단 또는 C 말단 잔기와 반응할 수 있는 유기 유도체화제와 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드의 표적 아미노산 잔기를 반응시키는 것을 포함한다. 이관능성 작용제를 사용한 유도체화는 예를 들어 항 PRO230, 항 PRO216 또는 항 PRO302 항체 정제 방법에 사용하기 위한 수불용성 지지체 매트릭스 또는 표면에 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182를 가교결합시키거나 그 반대로 교차결합시키는데 유용하다. 통상 사용되는 가교결합제는 예를 들어 1,1-비스(디아조아세틸)-2-페닐에탄, 글루타르알데히드, N-히드록시숙신이미드 에스테르, 예를 들어 4-아지도살리실산과의 에스테르, 3,3'-디티오비스(숙신이미딜프로피오네이트)와 같은 디숙신이미딜 에스테르를 포함하는 동종이관능성 이미도에스테르, 비스-N-말레이미도-1,8-옥탄과 같은 이관능성 말레이미드 및 메틸-3[(p-아지도페닐)디티오]프로피오이미데이트와 같은 물질을 포함한다.
다른 변형은 글루타미닐 및 아스파라기닐 잔기의 각각 대응하는 글루타밀 및 아스파르틸 잔기로의 탈아미드화, 프롤린 및 리신의 히드록실화, 세릴 또는 트레오닐 잔기의 히드록실기의 인산화, 리신, 아르기닌 및 히스티딘 측쇄의 알파-아미노기의 메틸화[T.E. Creighton,Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86(1983)], N-말단 아민의 아세틸화 및 C-말단 카르복실기의 아미드화를 포함한다.
본 발명의 범위 내에 포함되는 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드의 공유결합 변형의 다른 유형에는 폴리펩티드의 천연 글리코실화 패턴의 변화를 포함한다. "천연 글리코실화 패턴의 변화"는 천연 서열 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182에서 발견되는 하나 이상의 탄수화물 잔기의 결실(잠재적인 글리코실화 부위를 제거하거나 화학적 및(또는) 효소적 방법에 의해 글리코실화를 결실시킴으로써) 및(또는) 천연 서열 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182에 존재하지 않는 하나 이상의 글리코실화 부위의 부가를 의미한다. 또한, 이 용어는 존재하는 다양한 탄수화물 잔기의 특성 및 비율의 변화를 비롯한 천연 단백질의 글리코실화에 있어 질적 변화를 포함한다.
PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드에 대한 글리코실화 부위의 부가는 아미노산 서열의 변화에 의해 달성될 수 있다. 변화는 예를 들어 천연 서열 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182에 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기의 부가 또는 치환에 의해 이루어질 수 있다 (O-연결 글리코실화 부위의 경우). PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 아미노산 서열은 특히 목적 아미노산으로 번역되는 코돈을 생성시키도록 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 미리 선택된 염기에서 돌연변이시킴으로써 DNA 수준에서의 변화를 통하여 임의로 변화시킬 수 있다.
PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드 상의 탄수화물 잔기의 수를 증가시키는 다른 수단은 글리코시드를 폴리펩티드에 화학적으로 또는 효소에 의해 커플링시키는 것이다. 이러한 방법은 예를 들어 1987년 9월 11일 공개된 WO 87/05330 및 문헌 [Aplin and Wriston,CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981)]에 기재되어 있다.
PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드에 존재하는 탄수화물 잔기의 제거는 화학적으로 또는 효소에 의해 또는 글리코실화 표적으로 기능하는 아미노산 잔기를 코딩하는 코돈의 돌연변이에 의한 치환에 의해 달성될 수 있다. 화학적 탈글리코실화 기술은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Hakimuddin, et al.,Arch. Biochem. Biophys.,259:52 (1987) 및 Edge et al.,Anal. Biochem.,118:131(1981)]에 기재되어 있다. 폴리펩티드 상의 탄수화물 잔기의 효소에 의한 절단은 다양한 엔도글리코시다제 및 엑소글리코시다제를 사용하여 달성할 수 있다 [Thotakura et al.,Meth. Enzymol.,138: 350(1987)].
PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182의 공유결합 변형의 다른 종류는 미국 특허 제 4,640,835호, 제 4,496,689호, 제 4,301,144호, 제 4,670,417호, 제 4,791,192호 또는 제 4,179,337호에 기재된 방식으로 다양한 비단백질성 중합체, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리프로필렌 글리콜 또는 폴리옥시알킬렌 중의 하나에 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드를 연결시키는 것을 포함한다.
또한, 본 발명의 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드는다른 이종성 폴리펩티드 또는 아미노산 서열에 융합된 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182를 포함하는 키메라 분자를 형성하는 방식으로 변형될 수 있다.
다른 실시태양에서, 이러한 키메라 분자는 항-태그 항체가 선택적으로 결합할 수 있는 에피토프를 제공하는 태그 폴리펩티드와 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드의 융합체를 포함한다. 에피토프 태그는 일반적으로 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드의 아미노 또는 카르복실 말단에 위치한다. 상기 에피토프 태그가 부가된 형태의 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드의 존재는 태그가 부가된 폴리펩티드에 대한 항체를 사용하여 검출할 수 있다. 또한, 에피토프 태그를 도입하면 항-태그 항체 또는 에피토프 태그에 결합하는 다른 종류의 친화도 매트릭스를 사용한 친화도 정제에 의해 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드를 용이하게 정제할 수 있다. 다양한 태그 폴리펩티드 및 이들의 각각의 항체는 당업계에 공지되어 있다. 그 예로는 폴리-히스티딘(poly-his) 또는 폴리-히스티딘-글리신 (poly-his-gly) 태그, flu HA 태그 폴리펩티드 및 그의 항체 12CA5 [Field et al.,Mol. Cell. Biol.,8:2159-2165 (1988)], c-myc 태그 및 이에 대한 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 및 9E10 항체 [Evan et al.,Molecular and Cellular Biology,5:3610-3636 (1985)], 및 단순포진 바이러스 당단백질 D (gD) 태그 및 그의 항체 [Paborsky et al.,Protein Engineering,3(6):547-553 (1990)]을 들 수 있다. 다른 태그 폴리펩티드는 Flag-펩티드 [Hopp et al.,BioTechnology,6:1204-1210 (1988)], KT3 에피토프 펩티드 [Martin et al.,Science,255:192-194 (1992)], 알파-튜불린 에피토프 펩티드 [Skinner et al.,J. Biol. Chem.,266:15163-15166 (1991)] 및 T7 유전자 10 단백질 태그 [Lutz-Freyermuth et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,87:6393-6397 (1990)]을 포함한다.
다른 실시태양에서, 키메라 분자는 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182와 면역글로불린 또는 면역글로불린의 특정 영역의 융합체를 포함한다. 키메라 분자의 2가 형태 ("면역어드헤신"으로 언급하기도 함)의 경우, 융합체는 IgG 분자의 Fc 영역일 수 있다. 이 Ig 융합체는 바람직하게는 Ig 분자내 1개 이상의 가변성 영역의 부위를 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드의 가용성(결실 또는 실활화된 막횡단 도메인) 형태로 치환한 것을 포함한다. 특히 바람직한 실시태양에서, 면역글로불린 융합체는 IgG1 분자의 힌지, CH2 및 CH3, 또는 힌지, CH1, CH2 및 CH3 영역을 포함한다. 면역글로불린 융합체를 생산하는 방법으로는, 1995년 6월 27일 간행된 미국 특허 제5,428,130호를 참조한다.
D. PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 및 PRO182의 제조
이하에 설명되는 내용은 주로 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 및 PRO182 폴리펩티드 코딩 핵산을 함유하는 벡터로 형질전환 또는 트랜스펙션된 세포를 배양함으로써 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드를 제조하는 방법에 관한 것이다. 물론, 당업계에 공지된 다른 방법을 사용하여 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드 서열 또는 그의 단편을 제조할 수 있다. 예를 들어, PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182의 상기 정의에서 포함된 서열 또는 그의 단편은 고상 기술을 사용하는 직접 펩티드 합성법에 의해 제조할수 있다 [Stewart et al.,Solid -Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969), Merrifield,J. Am. Chem. Soc.,85:2149-2154 (1963)]. 시험관 내 단백질 합성은 수동 방법 또는 자동 방법에 의해 수행될 수 있다. 자동 합성법은 예를 들어 Applied Biosystems Peptide Synthesizer (미국 캘리포니아주 포스터시티 소재)를 제조사의 지시에 따라 사용하여 수행할 수 있다. 다양한 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드 단편은 별도로 화학적으로 합성되어 화학적 또는 효소적 방법을 사용하여 조합함으로써 전장 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드를 제조할 수 있다.
1. PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182를 코딩하는 DNA의 단리
PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드 코딩 DNA는 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 코딩 mRNA를 보유하여 그를 검출가능한 수준으로 발현할 것으로 생각되는 조직으로부터 제조한 cDNA 라이브러리로부터 수득할 수 있다. 따라서, 인간 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 코딩 DNA는 실시예에서 설명되는 바와 같이 인체 조직으로부터 제조된 cDNA 라이브러리로부터 편리하게 수득할 수 있다. PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 코딩 유전자는 또한 게놈 라이브러리로부터 또는 공지된 합성 방법 (자동화된 핵산 합성)에 의해 수득할 수 있다.
라이브러리는 목적 유전자 또는 이 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 확인하기 위해 고안된 프로브 (예를 들어 목적하는 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드에 대한 항체 또는 약 20 내지 80개의 염기로 구성된 올리고뉴클레오티드)를 사용하여 스크리닝할 수 있다. 선택된 프로브를 사용한 cDNA 또는 게놈 라이브러리의 스크리닝은 예를 들어 문헌 [Sambrook et al.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual(New York: Cold Spring Haror Laboratory Press, 1989)]에 기재된 바와 같은 표준 방법을 사용하여 수행할 수 있다. PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 코딩 유전자를 단리하는 다른 수단은 PCR 방법을 사용하는 것이다 [Sambrook et al.,상기 문헌; Dieffenbach et al.,PCR Primer: A Laboratory Manual(Cold Spring Haror Laboratory Press, 1995)].
하기 실시예는 cDNA 라이브러리를 스크리닝하는 기술을 설명한다. 프로브로서 선택된 올리고뉴클레오티드 서열은 가양성 결과를 최소화하기 위해서 충분한 길이를 갖고 충분히 분명한 서열이어야 한다. 올리고뉴클레오티드는 스크리닝되는 라이브러리에서 DNA에 혼성화시에 검출될 수 있도록 표지되는 것이 바람직하다. 표지 방법은 당업계에 공지되어 있고,32P 표지된 ATP와 같은 방사성 표지, 비오티닐화 또는 효소 표지의 사용을 포함한다. 중간정도 엄격성 및 높은 엄격성을 포함하는 혼성화 조건은 문헌 (Sambrook et al.,상기 문헌)에서 제공된다.
상기 라이브러리 스크리닝 방법에서 확인된 서열은 GenBank와 같은 공용 데이타 베이스 또는 다른 독점 데이타 베이스에 기탁되고 입수할 수 있는 다른 공지의 서열과 비교하여 정렬시킬 수 있다. 분자의 한정된 영역 내 또는 전장 서열에 걸친 서열 동일성 (아미노산 또는 뉴클레오티드 수준에서)은 당해 분야에 공지되었고 본원에 개시된 방법을 이용하여 결정할 수 있다.
단백질 코딩 서열을 갖는 핵산은 먼저 본원에서 개시된 추정 아미노산 서열 및 필요한 경우 전구체를 검출하기 위해 문헌 (Sambrook et al.,상기 문헌)에 기재된 통상의 프라이머 신장 방법을 사용하여 선택된 cDNA 또는 게놈 라이브러리를 스크리닝하고, cDNA로 역전사되지 않은 mRNA의 중간체를 프로세싱함으로써 수득할 수 있다.
2. 숙주 세포의 선택 및 형질전환
숙주 세포는 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 생산을 위해 본원에서 설명한 발현 또는 클로닝 벡터로 트랜스펙션 또는 형질전환되고 프로모터 유도, 형질전환체 선택 또는 목적 서열을 코딩하는 유전자 증폭에 적합하게끔 개질된 통상의 영양 배지 중에서 배양된다. 당업자라면 불필요한 실험을 수행하지 않고서도 배지, 온도, pH 등과 같은 배양 조건을 선택할 수 있다. 일반적으로, 세포 배양물의 생산성을 최대화하기 위한 원칙, 프로토콜 및 실시되는 기술은 문헌 [Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991) 및 Sambrook et al.,상기 문헌]에서 찾을 수 있다.
진핵세포 트랜스펙션 방법 및 원핵세포 형질전환 방법, 예를 들어 CaCl2, CaPO4, 리포솜-매개 방법 및 일렉트로포레이션은 당업계의 숙련가에게 공지되어 있다. 사용되는 숙주 세포에 따라, 형질전환은 상기 세포에 적합한 표준 기술을 사용하여 수행된다. 문헌 (Sambrook et al.,상기 문헌)에 기재된 염화칼슘법을 이용하는 칼슘 처리 또는 일렉트로포레이션은 일반적으로 원핵세포에 대해 사용된다.아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)를 사용한 감염은 문헌 [Shaw et al.,Gene,23:315(1983) 및 1989년 6월 29일 공개된 WO 89/05859]에 기재된 바와 같이 특정 식물 세포의 형질전환에 사용된다. 상기 세포벽이 없는 포유동물 세포의 경우, 문헌 [Graham and van der Eb,Virology,52:456-457 (1978)]의 인산칼슘 침전법을 사용할 수 있다. 포유동물 세포 숙주 시스템 트랜스펙션의 일반적인 특징은 미국 특허 제4,399,216호에 기재되어 있다. 효모 내로의 형질전환은 일반적으로 문헌 [Van Solingen et al.,J. Bact.,130:949(1977) 및 Hsiao et al.,Proc. Natl. Acad. Sci.(USA),76:3829(1979)]의 방법에 따라 수행된다. 그러나, 세포 내로 DNA를 도입하는 다른 방법, 예를 들어 핵내 미세주입, 일렉트로포레이션, 원형 세포와 세균 원형질체 융합, 또는 다원양이온 (polycation), 예를 들어 폴리브렌, 폴리오르니틴도 사용할 수 있다. 포유동물 세포의 형질전환을 위한 여러 기술에 대해서는 문헌 [Keown et al.,Methods in Enzymology,185:527-537 (1990) 및 Mansour et al.,Nature,336:348-352 (1988)]을 참조한다.
본원에서 벡터 내의 DNA를 클로닝 또는 발현하기에 적합한 숙주 세포는 원핵세포, 효모 또는 고등 진핵세포이다. 적합한 원핵세포는 진정세균, 예를 들어 그람 음성 또는 그람 양성 생물, 예를 들어 엔테로박테리아세애 (Enterobacteriaceae), 예를 들어 이. 콜라이 (E. coli)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 다양한 이. 콜라이 균주, 예를 들어 이. 콜라이 K12 균주 MM294 (ATCC 31,446), 이. 콜라이 X1776 (ATCC 31,537), 이. 콜라이 균주 W3110 (ATCC 27,325) 및 K5 772 (ATCC 53,635)는 용이하게 입수할 수 있다. 다른 적합한 원핵생물 숙주세포는 에셔리키아 (Eshcerichia), 예를 들어 이. 콜라이, 엔테로박터 (Enterobacter), 에르위니아 (Erwinia), 클렙시엘라 (Klebsiella), 프로테우스 (Proteus), 살모넬라 (Salmonella), 예를 들어 살모넬라 티피무리움 (typhimurium), 세라티아 (Serratia), 예를 들어 세라티아 마르세스칸스 (marcescans) 및 시겔라 (Shigella), 및 바실러스 (Bacillus), 예를 들어 비. 서브틸리스 (subtilis) 및 비. 리체니포르미스 (licheniformis) (예를 들어 1989년 4월 12일자로 공고된 DD 266,710호에 기재된 비. 리체니포르미스 41P), 슈도모나스 (Pseudomonas), 예를 들어 피. 아에루기노사 (aeruginosa) 및 스트렙토마이세스 (Streptomyces)를 포함한다. 이러한 예는 단지 예시적인 것으로서 이에 제한되는 것은 아니다. 균주 W3110은 재조합 DNA 산물 발효에 공통적인 숙주 균주이기 때문에 특히 바람직한 숙주 또는 모 숙주이다. 바람직하게는, 숙주 세포는 최소량의 단백질 분해 효소를 분비한다. 예를 들어, 균주 W3110은 숙주의 내생 단백질을 코딩하는 유전자의 돌연변이를 초래하도록 변형될 수 있고, 이러한 숙주의 예는 완전한 유전자형tonA를 갖는 이. 콜라이 W3110 균주 1A2, 완전한 유전자형tonA ptr3을 갖는 이. 콜라이 W3110 균주 9E4, 완전한 유전자형tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT kan r 를 갖는 이. 콜라이 W3110 균주 27C7 (ATCC 55,244), 완전한 유전자형tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT rbs7 ilvG kan r 를 갖는 이. 콜라이 W3110 균주 37D6, 비-카나마이신 내성degP결실 돌연변이를 갖는 균주 37D6인 이. 콜라이 W3110 균주 40B4 및 1990년 8월 7일 부여된 미국 특허제4,946,783호에 개시된 페리플라즘 프로테아제 변이체를 갖는 이. 콜라이 균주를 포함한다. 별법으로, 시험관내 클로닝 방법, 예를 들어 PCR 또는 다른 핵산 폴리머라제 반응이 적합하다.
원핵세포 외에, 섬유상 진균 또는 효모와 같은 진핵 미생물이 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드 코딩 벡터의 클로닝 또는 발현 숙주로서 적합하다. 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae)가 일반적으로 사용되는 하등 진핵 숙주 미생물이다. 다른 미생물에는 시조사카로마이세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe) (Beach and Nurse,Nature, 290: 140 [1989]; 1985년 5월 2일 공고된 EP 139,383); 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 숙주 (미국 특허 제4,943,529호; Fleer et al.,Bio/Technology, 9:968-975 (1991)), 예를 들어 케이. 락티스 (lactis) (MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt et al.,J. Baceriol., 737 [1983]), 케이. 프라길리스 (fragilis) (ATCC 12,424), 케이. 불가리쿠스 (bulgaricus) (ATCC 16,045), 케이. 위케라미 (wickeramii) (ATCC 24,178), 케이. 왈티이 (waltii) (ATCC 56,500), 케이. 드로소필라룸 (drosophilarum) (ATCC 36,906; Van den Berg et al.,Bio/Technology, 8:135(1990)), 케이. 테르모톨레란스 (thermotolerans) 및 케이. 막시아누스 (marxianus); 야로위아 (yarrowia) (EP 402,226); 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris) (EP 183,070; Sreekrishna et al.,J. Basic Microbiol., 28:265-278 [1988]); 칸디다 (Candida); 트리코데르마 레에시아 (EP 244,234); 뉴로스포라 크라사 (Neurospora crassa; Case et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:5259-5263 [1979]); 시와니오마이세스 (Schwanniomyces), 예를 들어 시와니오마이세스 옥시덴탈리스 (occidentalis) (1990년 10월 31일 공고된 EP 394,538); 및 섬유상 진균, 예를 들어 뉴로스포라, 페니실리움 (Penicillium), 톨리포클라디움 (Tolypocladium) (1991년 1월 10일 공고된 WO 91/00357) 및 아스퍼길러스 (Aspergillus) 숙주, 예를 들어 에이. 니둘란스 (Nidulans) (Ballance et al,,Biochem. Biophys. Res. Commun., 112:284-289 [1983]; Tilburn et al.,Gene, 26:205-221 [1983]; Yelton et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1470-1474 [1984]) 및 에이. 니게르 (niger) (Kelly and Hynes,EMBO J., 4: 475-479 [1985])가 포함된다. 메틸 영양 요구성 효모가 적합하고, 한세눌라 (Hansenula), 칸디다 (Candida), 클로엑케라 (Kloeckera), 피치아, 카라로마이세스, 토룰롭시스(Torulopsis) 및 로도토룰라(Rhodotorula)로 이루어지는 속으로부터 선택된, 메탄올 상에서 성장할 수 있는 효모를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 이들 종류의 효모의 예인 구체적인 종의 목록은 문헌 [C. Anthony,The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982)]에 기재되어 있다.
글리코실화된 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 코딩 핵산의 발현에 적합한 숙주 세포는 다세포 생물로부터 유래한다. 무척추동물 세포의 예는 드로소필라 S2 및 스포도프테라 Sf9와 같은 곤충 세포 및 식물 세포이다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 예는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 및 COS 세포를 포함한다. 보다 구체적인 예는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 라인 (COS-7, ATCC CRL 1651), 인간 배아 신장 라인 (293 세포 또는 현탁 배양액 중의 성장을위해 서브클로닝된 293 세포, Graham et al.,J. Gen Virol., 36:59(1997)), 차이니즈 햄스터 난소 세포/-DHFR (CHO, Urlaub and Chasin,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)), 마우스 세르톨리 세포 (TM4, Mather,Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)), 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75), 인간 간세포 (Hep G2, HB 8065) 및 마우스 유방 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51)을 포함한다. 당업계의 숙련가라면 적합한 숙주 세포를 용이하게 선택할 수 있다.
3. 복제가능 벡터의 선택 및 사용
PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 코딩 핵산 (예를 들어, cDNA 또는 게놈 DNA)은 클로닝 (DNA의 증폭) 또는 발현을 위한 복제가능 벡터에 삽입된다. 다양한 벡터를 용이하게 구할 수 있다. 예를 들어, 벡터는 플라스미드, 코스미드, 바이러스 입자 또는 파지의 형태로 존재할 수 있다. 적합한 핵산 서열은 다양한 방법에 의해 벡터 내에 삽입될 수 있다. 일반적으로, 당업계에 공지된 기술을 사용하여 DNA를 적합한 제한 엔도뉴클레아제 부위(들) 내에 삽입한다. 벡터 성분은 일반적으로 시그날 서열, 복제 기점, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 성분, 프로모터 및 전사 종결 서열을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 하나 이상의 상기 성분을 포함하는 적합한 벡터의 제조는 당업계의 숙련가에게 공지된 표준 라이게이션 기술을 사용한다.
PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182는 직접 재조합 방법에 의해 생산될 수 있을 뿐만 아니라 성숙 단백질 또는 폴리펩티드의 N 말단에서 특이적 절단 부위를 갖는 다른 폴리펩티드 또는 시그날 서열일 수 있는 이종 폴리펩티드와의 융합 폴리펩티드로서 생산될 수 있다. 일반적으로, 시그날 서열은 벡터의 성분일 수 있거나 벡터 내로 삽입된 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 코딩 DNA의 일부일 수 있다. 시그날 서열은 예를 들어 알칼리 포스파타제, 페니실리나제, lpp 또는 열안정성 엔테로톡신 II 리더의 군으로부터 선택되는 원핵생물 시그날 서열일 수 있다. 효모 분비를 위해, 시그날 서열은 예를 들어 효모 인버타제 리더, α 인자 리더 (사카로마이세스 (Saccharomyces) 및 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces) α-인자 리더 (미국 특허 제5,010,182호)) 또는 산 포스파타제 리더, 씨. 알비칸스 (C. albicans) 글루코아밀라제 리더 (1990년 4월 4일 공고된 EP 362,179) 또는 1990년 11월 15일 공개된 WO 90/13646에 기재된 시그날 서열일 수 있다. 포유동물 세포 발현에서, 포유동물 시그날 서열, 예를 들어 동일하거나 관련된 종의 분비되는 폴리펩티드로부터의 시그날 서열 및 바이러스 분비 리더를 사용하여 단백질의 분비를 지시할 수 있다.
발현 및 클로닝 벡터 모두는 벡터가 1종 이상의 선택된 숙주 세포에서 복제할 수 있도록 만드는 핵산 서열을 함유한다. 이러한 서열은 다양한 세균, 효모 및 바이러스에 대해 공지되어 있다. 플라스미드 pBR322로부터의 복제 기점은 대부분의 그람 음성 세균에 적합하고, 2μ 플라스미드 기점은 효모에 적합하고, 다양한 바이러스 기점 (SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, VSV 또는 BPV)은 포유동물 세포에서 벡터를 클로닝하는데 유용하다.
발현 및 클로닝 벡터는 통상적으로 선택가능한 마커로도 불리우는 선택 유전자를 함유할 것이다. 대표적인 선택 유전자, 예를 들어 바실러스 (Bacillus)의 경우 D-알라닌 라세마제를 코딩하는 유전자는 (a) 항생제 또는 다른 독소, 예를 들어 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트 또는 테트라싸이클린에 내성을 부여하는 단백질, (b) 영양요구성 결함을 보완하는 단백질 또는 (c) 복합 배지로부터 이용할 수 없는 중요한 영양물질을 공급하는 단백질을 코딩한다.
포유동물 세포에 적합한 선택가능한 마커의 예는 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 코딩 핵산을 수용할 수 있는 세포의 동정을 가능하게 하는 것, 예를 들어 DHFR 또는 티미딘 키나제이다. 야생형 DHFR이 이용될 경우, 적합한 숙주 세포는 DHFR 활성이 결여된 CHO 세포주이고, 문헌 [Urlaub et al,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)]에 기재된 바와 같이 제조 및 증식된다. 효모에 사용하는데 적합한 선택 유전자는 효모 플라스미드 YRp7에 존재하는 trp1 유전자이다 [Stinchcomb et al.,Nature, 282: 39 (1979), Kingsman et al.,Gene, 7: 141 (1979), Tschemper et al.,Gene, 10: 157 (1980)]. trp1 유전자는 트립토판으로의 성장능이 결여된 효모의 변이주 (예를 들어 ATCC 44076 또는 PEP4-1)에 대한 선택 마커를 제공한다 [Jones,Genetics, 85: 12 (1977)].
발현 및 클로닝 벡터는 mRNA 합성을 지시하는, PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 코딩 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 함유한다. 다양한 잠재적인 숙주 세포에 의해 인식되는 프로모터는 공지되어 있다. 원핵생물 숙주에 사용하기에 적합한 프로모터는 β-락타마제 및 락토스 프로모터 시스템 [Chang et al.,Nature, 275:615 (1978); Goeddel et al.,Nature, 281:544 (1979)], 알칼리 포스파타제, 트립토판 (trp) 프로모터 시스템 [Goeddel,Nucleicacid Res., 8:4057 (1980); EP 36,776], 및 하이브리드 프로모터, 예를 들어 tac 프로모터 [deBoer et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)]를 포함한다. 또한, 세균계에서 사용되는 프로모터는 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182를 코딩하는 DNA에 작동가능하게 연결된 샤인-달가노 (S.D.) 서열을 함유할 것이다.
효모 숙주에 사용하기 적합한 프로모터 서열의 예는 3-포스포글리세레이트 키나제 [Hitzeman et al.,J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)] 또는 다른 당분해 효소 [Hess et al.,J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968); Holland,Biochemistry, 17:4900 (1978)], 예를 들어 에놀라제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 디히드로게나제, 헥소키나제, 피루베이트 디카르복실라제, 포스포프룩토키나제, 글루코스-6-포스페이트 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 뮤타제, 피루베이트 키나제, 트리오스포스페이트 이소머라제, 포스포글루코스 이소머라제 및 글루코키나제에 대한 프로모터를 포함한다.
성장 조건에 의해 조절되는 추가의 전사 잇점을 갖는 유도가능한 프로모터인 다른 효모 프로모터는 알코올 디히드로게나제 2, 이소시토크롬 C, 산 포스파타제, 질소 대사에 관련된 분해 효소, 메탈로티오네인, 글리세르알데히드-3-포스페이트 디히드로게나제, 및 말토스 및 갈락토스 이용에 작용하는 효소에 대한 프로모터 영역이다. 효모 발현에 사용하기에 적합한 벡터 및 프로모터는 추가로 EP 제73,657호에 기재되어 있다.
포유동물 숙주 세포에서의 벡터로부터의 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 전사는 바이러스, 예를 들어 폴리오마 바이러스, 계두 바이러스 (1989년 7월 5일 공고된 UK 2,211,504호), 아데노바이러스 (예를 들어, 아데노바이러스 2), 소 유두종 바이러스, 조류 육종 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스 및 원숭이 바이러스 40 (SV40)의 게놈으로부터, 이종 포유동물 프로모터, 예를 들어 액틴 프로모터 또는 면역글로불린 프로모터로부터, 열-충격 프로모터로부터 얻어진, 숙주 세포계에 적합성인 프로모터에 의해 조절된다.
고등 진핵세포에 의한 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182를 코딩하는 DNA의 전사는 인핸서 서열을 벡터에 삽입함으로써 증가될 수 있다. 인핸서는 일반적으로 전사를 증가시키기 위해 프로모터에 대해 작용하는, 약 10 내지 300 bp의 DNA의 시스-액팅 성분이다. 많은 인핸서 서열은 포유동물 유전자 (글로빈, 엘라스타제, 알부민, α-페토단백질 및 인슐린)로부터 유래하는 것으로 알려져 있다. 그러나, 통상적으로 진핵세포 바이러스로부터 유래한 인핸서를 사용할 것이다. 그 예는 복제 기점의 뒷부분 상의 SV40 인핸서 (bp 100-270), 사이토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 기점의 뒷부분 상의 폴리오마 인핸서, 및 아데노바이러스 인핸서를 포함한다. 인핸서는 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 코딩 서열에 5' 또는 3' 위치에서 벡터에 스플라이싱될 수 있지만, 프로모터로부터 5' 부위에 위치하는 것이 바람직하다.
또한, 진핵 숙주 세포 (효모, 진균, 곤충, 식물, 동물, 인간 또는 다른 다세포 생물로부터 유래한 다핵 세포)에 사용되는 발현 벡터는 전사 종결 및 mRNA 안정화에 필요한 서열을 포함할 수 있을 것이다. 그러한 서열은 통상적으로 진핵세포,또는 바이러스 DNA 또는 cDNA의 5' 및 때로는 3' 비번역 영역으로부터 확보된다. 이들 영역은 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 코딩 mRNA의 비번역 부분에서 폴리아데닐화 단편으로서 전사되는 뉴클레오티드 단편을 함유한다.
재조합 척추동물 세포 배양에서 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182의 합성에 적용하는데 적합한 다른 방법, 벡터 및 숙주 세포는 문헌 [Gething et al.,Nature, 293:620-625 (1981); Mantei et al.,Nature, 281:40-46 (1979); EP 117,060 및 EP 117,058]에 기재되어 있다.
4. 유전자 증폭/발현의 검출
유전자 증폭 및(또는) 발현은 본원에서 제공된 서열을 기초로 하여 적절하게 표지된 프로브를 사용하여, 예를 들어 통상의 서던 블로팅, mRNA의 전사를 정량하기 위한 노던 블로팅 [Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 (1980)], 도트 블로팅 (DNA 분석) 또는 계내 혼성화에 의해 시료에서 직접 측정할 수 있다. 또한, DNA 이중체, RNA 이중체 및 DNA-RNA 하이브리드 이중체 또는 DNA-단백질 이중체를 포함하여 특정 이중체를 인식할 수 있는 항체를 사용할 수 있다. 바꾸어 말하면, 항체를 표지하고, 상기 이중체를 표면에 결합시켜 표면 상에 이중체가 형성될 때 이중체에 결합한 항체의 존재를 검출할 수 있는 분석을 수행할 수 있다.
또한, 유전자 발현은 유전자 산물을 직접 정량하기 위한 세포 또는 조직 절편의 면역조직화학적 염색 및 세포 배양액 또는 체액의 분석과 같은 면역학적 방법에 의해 측정할 수 있다. 시료액의 면역조직화학적 염색 및(또는) 분석법에 유용한 항체는 모노클로날 또는 폴리클로날 항체일 수 있고, 임의의 포유동물에서 제조할 수 있다. 편리하게는, 천연 서열의 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드 또는 본원에서 제공되는 DNA 서열을 기초로 한 합성 펩티드 또는 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 코딩 DNA에 융합되고 특정 항체 에피토프를 코딩하는 외인성 서열에 대한 항체를 제조할 수 있다.
5. 폴리펩티드의 정제
PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드의 형태는 배양 배지 또는 숙주 세포 용균액으로부터 회수될 수 있다. 멤브레인에 결합하는 경우, 적합한 세제 용액 (예를 들어 Triton-X 100)을 사용하거나 효소의 절단에 의해 멤브레인으로부터 방출될 수 있다. PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드 코딩 핵산의 발현에 사용된 세포는 동결-해동 싸이클, 초음파 처리, 기계적 분쇄 또는 세포 용균제와 같은 다양한 물리적 또는 화학적 수단에 의해 분쇄시킬 수 있다.
재조합 세포 단백질 또는 폴리펩티드로부터 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182를 정제하는 것이 바람직할 수 있다. 적합한 정제 방법의 예는 이온 교환 컬럼 상에서의 분획화, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 또는 양이온 교환 수지, 예를 들어 DEAE 상에서의 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE, 황산암모늄 침전, 예를 들어 Sephadex G-75를 사용한 겔 여과, IgG와 같은 오염물질을 제거하기 위한 단백질 A 세파로스 컬럼 및 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드의 에피토프 태그가 부가된 형태를 결합시키기 위한 금속 킬레이팅 컬럼이다. 다양한 단백질 정제 방법을 사용할 수 있으며, 이러한 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌 [Deutscher,Methods in Enzymology, 182 (1990); Scopes,Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982)]에 기재되어 있다. 선택되는 정제 단계(들)은 예를 들어 사용되는 생산 방법 및 생산되는 특정 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182의 특성에 따라 결정될 것이다.
E. 항체
본 발명의 조성물 및 방법에 사용되기 위한 약물 후보물질의 일부는 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드의 생물학적 활성을 모방하는 항체 및 항체 단편이다.
1.폴리클로날 항체
폴리클로날 항체의 제조 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 폴리클로날 항체는 예를 들어 면역화제 및 필요한 경우 보조제를 1회 이상 주사함으로써 포유동물에서 생성시킬 수 있다. 일반적으로, 면역화제 및(또는) 보조제는 피하 또는 복강내 수회 주사에 의해 포유동물에 주사될 것이다. 면역화제는 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드 또는 그의 융합 단편을 포함할 수 있다. 면역처리되는 포유동물에서 면역원성으로 공지된 단백질에 면역화제를 접합시키는 것이 유용할 수 있다. 상기 면역원성 단백질의 예로는 키홀 림펫 헤모시아닌, 혈청 알부민, 소 티로글로불린 및 대두 트립신 저해제를 들 수 있다. 사용될 수 있는 보조제의 예는 프로인드 완전 보조제 및 MPL-TDM 보조제 (모노포스포릴 지질 A,합성 트레할로스 디코리노미콜레이트)를 포함한다. 면역처리 방법은 불필요한 실험 없이도 당업계의 숙련가에 의해 선택될 수 있다.
2. 모노클로날 항체
또한, 항체는 모노클로날 항체일 수 있다. 모노클로날 항체는 문헌 [Kohler and Milstein,Nature,256:495 (1975)]에 기재된 바와 같은 하이브리도마 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 하이브리도마 방법에서, 마우스, 햄스터 또는 다른 적절한 숙주 동물을 통상적으로 면역화제로 면역처리하여 면역화제에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하거나 생산할 수 있는 림프구를 유도한다. 또한, 림프구는 시험관 내에서 면역처리될 수 있다.
면역화제는 통상 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드 또는 그의 융합 단백질을 포함할 것이다. 일반적으로, 인간 기원의 세포를 원하는 경우 말초 혈액 림프구 ("PBL")가 사용되나, 비인간 포유동물 공급원을 원하는 경우에는 비장 세포 또는 림프절 세포가 사용된다. 이어서, 폴리에틸렌 글리콜과 같은 적합한 융합제를 사용하여 림프구와 불멸화된 세포주를 융합시켜 하이브리도마 세포를 형성시킨다 [Goding,Monoclonal Antibodies: Principle and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103]. 불멸화된 세포주는 대체로 형질전환된 포유동물 세포, 특히 설치류, 소 및 인간 기원의 골수종 세포이다. 일반적으로, 쥐 또는 마우스 골수종 세포주가 사용된다. 하이브리도마 세포는 바람직하게는 비융합된 불멸화된 세포의 성장 또는 생존을 억제시키는 1종 이상의 물질을 함유하는 적합한 배양 배지에서 배양시킬 수 있다. 예를 들면, 모세포가 하이포잔틴 구아닌포스포리보실 트랜스퍼라제 (HGPRT 또는 HPRT) 효소가 결핍된 경우, 하이브리도마용 배양 배지는 전형적으로 하이포잔틴, 아미노프테린 및 티미딘 ("HAT 배지")을 포함할 것이며, 이들 물질은 HGPRT-결핍 세포의 성장을 억제시킨다.
바람직한 불멸화된 세포주는 효율적으로 융합하고, 선택된 항체-생산 세포에 의한 항체의 높은 수준의 안정한 생산을 지지하며, HAT 배지와 같은 배지에 감수성이 있는 것이다. 보다 바람직한 불멸화된 세포주는 예를 들어 솔크 인스티튜트 셀 디스트리뷰션 센터 (Salk Institute Cell Distribution Center, 미국 캘리포니아주 샌디에고) 및 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (American Type Culture Collection, 미국 버지니아주 마나사스)으로부터 입수가능한 쥐과 골수종 세포주이다. 또한, 인간 골수종 세포주 및 마우스-인간 헤테로골수종 세포주가 인간 모노클로날 항체의 생산에 대해 기술되었다 [Kozbor,J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al.,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63].
이어서, 하이브리도마 세포를 배양하는 배양 배지에서 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182에 대한 모노클로날 항체의 존재를 분석할 수 있다. 바람직하게는, 하이브리도마 세포에 의해 생산된 모노클로날 항체의 결합 특이성은 시험관내 결합 분석법, 예를 들어 방사선면역분석법 (RIA) 또는 효소 결합된 면역흡착 분석법 (ELISA)에 의한 면역 침전법에 의해 측정하였다. 상기 기술 및 분석법은 당업계에 공지되어 있다. 모노클로날 항체의 결합 친화도는 예를 들어 스캐차드 분석 [Munson and Pollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980)]에 의해 결정하였다.
원하는 하이브리도마 세포를 확인한 후, 제한 희석법에 의해 클론을 서브클로닝시키고 표준 방법 [Goding,상기문헌]으로 배양시켰다. 이러한 목적에 적합한 배양 배지에는 예를 들면, 둘베코 개질 이글 배지 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 또는 RPMI-1640 배지를 포함된다. 또한, 하이브리도마 세포는 동물에서 복수종양으로서 생체내 배양시킬 수 있다.
서브클론에 의해 분비된 모노클로날 항체는 예를 들면, 단백질 A-세파로스 (Sepharose), 히드록실아파티트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화도 크로마토그래피와 같은 통상의 면역글로불린 정제 방법에 의해 배양 배지 또는 복수액으로부터 단리 및 정제시킬 수 있다.
또한, 모노클로날 항체는 미국 특허 제4,816,567호에 기재된 것과 같은 재조합 DNA 방법에 의해 제조할 수 있다. 본 발명의 모노클로날 항체를 코딩하는 DNA는 통상의 방법 (예를 들면, 쥐과 동물 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용함으로써)을 이용하여 용이하게 단리하고 서열 분석할 수 있다. 본 발명의 하이브리도마 세포는 이러한 DNA의 바람직한 공급원으로서 작용한다. 일단 단리되면, DNA는 발현 벡터 내로 삽입한 후, 면역글로불린 단백질을 생산하지 않는 원숭이 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, 또는 골수종 세포와 같은 숙주 세포 내로 트랜스펙션시켜 재조합 숙주 세포에서 모노클로날 항체를 합성시킬 수 있다. 또한, DNA는 예를 들어 쥐과 동물의 상동 서열 대신에 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인에 대한 코딩 서열을치환시키거나(미국 특허 제4,816,567호; Morrison et al.,상기 문헌), 또는 비-면역글로불린 폴리펩티드에 대한 코딩 서열의 전체 또는 일부를 면역글로불린 코딩 서열에 공유 결합시킴으로써 변형시킬 수 있다. 그러한 비면역글로불린 폴리펩티드는 본 발명의 항체의 불변 도메인에 대해 치환되거나, 본 발명의 항체의 한 항원-결합 부위의 가변 도메인에 대해 치환되어 키메라 2가 항체를 생성시킬 수 있다.
항체는 1가 항체일 수 있다. 1가 항체를 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어 한 방법은 면역글로불린 경쇄 및 변형 중쇄의 재조합 발현을 포함한다. 중쇄 교차결합을 방지하기 위해서 중쇄는 일반적으로 Fc 영역의 임의의 지점에서 말단이 절단된다. 별법으로, 관련 시스테인 잔기는 가교결합을 방지하기 위해서 다른 아미노산 잔기로 치환되거나 결실된다.
또한, 시험관내 방법도 1가 항체의 제조에 적합하다. 항체 단편, 특히 Fab 단편을 제조하기 위한 항체의 분해는 당업계에 통상적으로 알려진 기술을 사용하여 수행할 수 있다.
3. 인간 항체 및 인간화 항체
또한, 본 발명의 항체는 인간화 항체 또는 인간 항체를 포함할 수 있다. 비-인간 (예를 들어, 쥐과 동물) 항체의 인간화 형태는 키메라 면역글로불린, 비-인간 면역글로불린으로부터 유래한 최소 서열을 포함하는 면역글로불린 사슬 또는 그의 단편 (예를 들어, Fv, Fab, Fab', F(ab')2또는 항체의 다른 항원 결합 서열)이다. 인간화 항체는, 수용체의 상보성 결정 영역 (CDR)의 잔기를 원하는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 마우스, 쥐 또는 토끼와 같은 비-인간 종 (공여 항체)의 CDR의 잔기로 치환시킨 인간 면역글로불린 (수용 항체)을 포함한다. 몇몇 경우에, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 잔기는 대응하는 비-인간 잔기로 치환된다. 또한, 인간화 항체는 수용 항체 또는 도입되는 CDR 또는 프레임워크 서열에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 하나 이상, 통상 둘 이상의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역이 비-인간 면역글로불린의 영역에 대응하고 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역이 인간 면역글로불린 컨센서스 서열의 영역에 대응한다. 또한, 인간화 항체는 면역글로불린 불변 영역 (Fc), 통상적으로 인간 면역글로불린의 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 것이다 [Jones et al.,Nature,321: 522-525 (1986); Riechmann et al.,Nature,332: 323-327 (1988); 및 Presta,Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)].
비인간 항체의 인간화 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 비인체 기원으로부터의 그에 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이들 비-인간 아미노산 잔기는 종종 "임포트(import)" 잔기로 부르며, 통상적으로 "임포트" 가변 도메인으로부터 얻어진다. 인간화는 인간 항체의 대응하는 서열 대신 설치류 CDR 또는 CDR 서열로 치환함으로써 본질적으로 윈터 (Winter) 등의 방법 [Jones et al.,Nature,321: 522-525 (1986); Riechmann et al.,Nature,332: 323-329 (1988); Verhoeyen et al.,Science,239: 1534-1536 (1988)]에 따라수행할 수 있다. 따라서, 이러한 "인간화" 항체는 실질적으로 완전한 인간 가변 도메인보다 적은 부분이 비-인간 종 유래의 대응하는 서열에 의해 치환된 키메라 항체 (미국 특허 제4,816,567호)이다. 실제, 인간화 항체는 통상적으로 일부 CDR 잔기 및 가능하게는 일부 FR 잔기를 설치류 항체에서 유사한 부위의 잔기로 치환시킨 인간 항체이다.
또한, 인간 항체는 파지 디스플레이 라이브러리를 포함하는 당업계에 공지된 여러 기술을 사용하여 제조할 수 있다 [Hoogenboom and Winter,J. Mol. Biol.,227: 381 (1991), Marks et al.,J. Mol. Biol.,222: 581 (1991)]. 또한, 코울 등 및 보에르너 등의 기술도 인간 모노클로날 항체의 제조에 사용할 수 있다 (Cole et al.,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985) and Boerner et al.,J. Immunol.,147(1): 86-95 (1991)]. 마찬가지로, 유전자도입 동물, 예를 들어 내인성 면역글로불린 유전자가 부분 또는 전체가 불활성화된 마우스에 인간 면역글로불린 유전자좌를 도입함으로써 인간 항체를 제조할 수 있다. 항원투여 후에, 인간 항체 생산이 관찰되었는데, 이는 유전자 재배열, 어셈블리 및 항체 목록을 비롯한 모든 점에서 인간에서 관찰되는 항체와 매우 유사하였다. 상기 사항은 예를 들어 문헌 (미국 특허 제 5,545,807호, 제 5,545,806호, 제 5,569,825호, 제 5,625,126호, 제 5,633,425호, 제 5,661,016호) 및 과학 문헌 [Marks et al.,Bio/Technology 10, 779-783 (1992), Lonberg et al.,Nature 368, 856-859 (1994), Morrison,Nature 368, 812-13 (1994), Fishwild et al.,Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996), Neuberger,Nature Biotechnology 14, 826(1996), Lonberg and Huszar,Intern. Rev. Immunol. 1365-93 (1995))에 기재되어 있다.
4. 이중특이적 항체
중특이적 항체는 상이한 두 가지 이상의 항원에 대해 결합 특이성을 갖는 모노클로날 항체, 바람직하게는 인간 또는 인간화 항체이다. 본원에서, 결합 특이성 중 하나는 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182에 대한 것이고, 다른 하나는 임의의 다른 항원, 바람직하게는 세포 표면 단백질, 수용체 또는 수용체 서브유닛에 대한 것이다.
이중특이적 항체를 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 통상적으로, 이중 특이적 항체의 재조합 생산은 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄/경쇄-중쇄 쌍의 동시발현에 기초하며, 여기에서, 2개의 중쇄는 상이한 특이성을 갖는다 [Millstein and Cuello,Nature,305: 537-539 (1983)]. 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위 배열로 인해, 이들 하이브리도마 (쿼드로마)는 10개의 상이한 항체 분자의 가능한 혼합물을 생산하며, 이중 하나만이 정확한 이중특이적 구조를 갖는다. 정확한 분자의 정제는 일반적으로 친화 크로마토그래피 단계로 수행된다. 유사한 방법이 WO 제93/08829호(1993년 5월 13일에 공개됨) 및 문헌 [Traunecker et al.,EMBO J.,10: 3655-3659 (1991)]에 기재되어 있다.
원하는 결합 특이성을 갖는 항체의 가변 도메인 (항체-항원 결합 부위)을 면역글로불린 불변 도메인 서열에 융합시킨다. 융합은 바람직하게는 힌지, CH2 및 CH3 영역의 적어도 일부를 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 도메인 내에서 이루어진다. 경쇄 결합을 위해 필수적인 부위를 포함하는 제1 중쇄 불변 영역 (CH1)이 융합체의 적어도 하나에 존재하는 것이 바람직하다. 면역글로불린 중쇄 융합체, 및 원한는 경우 면역글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA를 별개의 발현 벡터에 삽입하고, 적당한 숙주 생물체로 동시 형질감염시킨다. 이중특이적 항체를 생산하기 위한 보다 상세한 내용은 예를 들어, 문헌 [Suresh et al.,Methods in Enzymology,121: 210(1986)]을 참조한다.
WO 제96/27011호에 개시된 다른 방법에 따르면, 한쌍의 항체 분자사이의 공유 영역을 조작하여 재조합 세포 배양으로부터 회수되는 헤테로다이머의 비율을 최대화할 수 있다. 바람직한 공유 영역은 항체 불변 도메인의 CH3 영역의 적어도 일부를 포함한다. 이 방법에서, 제1 항체 분자의 공유 영역로부터 1개 이상의 작은 아미노산 측쇄를 보다 큰 측쇄 (예를 들어, 티로신 또는 트립토판)로 대체하였다. 큰 아미노산 측쇄를 작은 아미노산 측쇄 (예를 들어, 알라닌 또는 트레오닌)로 대체함으로써 큰 측쇄에 대해 동일하거나 유사한 크기의 상보적인 "공간 (cavity)"을 제2 항체 분자의 공유 영역에 생성시켰다. 이는 헤테로다이머의 수율을 호모다이머와 같은 다른 원치 않는 최종-생성물보다 높게 증가시키는 메카니즘을 제공한다.
이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편(예를 들어, F(ab')2이중특이적 항체)으로 제조할 수 있다. 항체 단편으로부터 이중특이적 항체를 생성하는 기술은 문헌에 기재되어 있다. 예를 들어, 화학 결합을 사용하여 이중특이적 항체를 제조할 수 있다. 문헌 [Brennan et al., Science 229:81 (1985)]에는 온전한 항체를 단백질 가수분해에 의해 절단하여 F(ab')2단편을 생성하는 방법이 기재되어 있다. 이러한 단편은 디티올 착화제인 소듐 아르세니트의 존재하에 환원되어 근처 디티올을 안정화하고 분자간 디술피드 결합의 형성을 방지한다. 그 후에, 생성된 Fab' 단편을 티오니트로벤조에이트(TNB) 유도체로 전환시켰다. 그 후에, Fab'-TNB 유도체 중 하나를 머캅토에틸아민을 사용하여 환원시킴으로써 Fab'-티올로 재전환시키고 등몰량의 다른 Fab'-TNB 유도체와 혼합하여 이중특이적 항체를 형성시켰다. 생성된 이중특이적 항체는 효소의 선택적 고정화를 위한 물질로 사용할 수 있다.
이. 콜라이로부터 Fab' 단편을 직접 회수하여 화학적으로 연결시켜 이중특이적 항체를 형성시켰다. 문헌 [Shalaby et al.,J. Exp. Med., 175:217-225 (1992))은 완전한 인간화 이중특이적 항체 F(ab')2분자의 제조를 개시하고 있다. 각각의 Fab' 단편은 이. 콜라이로부터 별도로 분비되었으며 시험관내에서 지시된 화학적 방법으로 커플링하여 이중특이적 항체를 형성하였다. 이와 같이 형성된 이중특이적 항체는 ErbB2 수용체를 과발현시키는 세포 및 정상적인 인간 T 세포와 결합할 수 있을뿐 아니라, 인간 유방암 표적에 대한 인간 세포독성 림프구의 용균 활성을 개시할 수 있었다.
또한, 재조합 세포 배양으로부터 직접 이중특이적 항체 단편을 제조하고 단리하는 여러 기술이 기재되어 있다. 예를 들어, 루이신 지퍼를 사용하여 이중 특이적 항체를 제조하였다 [Kostelny et al.,J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)]. 유전자 융합에 의해, Fos 및 Jun 단백질의 루이신 지퍼 펩티드를 2종의상이한 항체의 Fab' 부분에 연결하였다. 항체 호모다이머의 힌지 영역을 환원시켜 모노머를 형성한 후, 재산화시켜 항체 헤테로다이머를 형성시켰다. 또한, 이 방법은 항체 호모다이머를 생산하기 위한 방법으로 이용할 수 있다. 문헌 [Hollinger et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)]에 기재된 "디아바디(diabody)" 기술은 이중특이적 항체 단편을 만드는 다른 메카니즘을 제공한다. 이 단편은 링커에 의해 경쇄 가변 도메인(VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함하는데, 이 링커는 너무 짧아서 동일 쇄 상의 두 도메인이 서로 페어링할 수 없다. 따라서, 한 단편의 VH및 VL도메인은 다른 단편의 상보적인 VL및 VH도메인과 쌍을 이루게 되며, 그 결과 2개의 항원 결합 부위를 형성한다. 단일쇄 Fv(sFv) 이량체를 사용하여 이중특이적 항체 단편을 만드는 또다른 방법이 보고되었다 [문헌 (Gruber et al., J. Immunol. 152:5368 (1994)) 참조].
2가 이상의 결합가를 갖는 항체도 고려 대상이다. 예를 들어, 삼중특이적 항체를 만들 수 있다(Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991)).
전형적인 이중특이적 항체는 본원에 기재된 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드의 두 가지 상이한 에피토프와 결합할 수 있다. 또는, 특정 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드를 발현시키는 세포에 대한 세포내 방어 메카니즘에 초점을 맞추기 위해, 항 PRO211, 항 PRO228, 항 PRO538, 항 PRO172 또는 항 PRO182폴리펩티드 아암 (arm)을 백혈구 상의 유발 분자, 예를 들어 T-세포 수용체 분자 (예를 들어, CD2, CD3, CD28 또는 B7), 또는IgG의 Fc 수용체 (FcγR), 예를 들어 FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) 및 FcγRIII (CD16)와 결합하는 아암과 결합시킬 수 있다. 또한, 이중특이적 항체를 사용하여 특정 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드를 발현시키는 세포에 세포독성제를 국소화할 수 있다. 이러한 항체는 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드-결합 아암과 세포독성제 또는 방사성핵종 킬레이트제, 예를 들어 EOTUBE, DPTA, DOTA 또는 TETA와 결합하는 아암을 갖는다. 목적하는 또다른 이중특이적 항체는 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드와 결합하고, 또한 조직 인자(TF)와도 결합한다.
5. 이종접합 항체
이종접합 항체도 본 발명의 범위에 포함된다. 이종접합 항체는 2개의 공유결합된 항체로 구성된다. 이러한 항체는 예를 들어 면역계 세포를 원하지 않는 세포에 표적화시키기 위해 (미국 특허 제4,676,980호), 및 HIV 감염의 치료를 위해 (WO 제91/00360호, 동 제92/200373호, 및 EP 제03089호) 제안되었다. 이종접합 항체는 가교결합제를 사용하는 방법을 포함하여 합성 단백질 화학에 공지된 방법을 이용하여 제조할 수 있는 것으로 생각된다. 예를 들어, 면역독소는 디술피드 교환 반응을 이용하거나 또는 티오에테르 결합을 형성함으로써 제조할 수 있다. 상기 목적에 적합한 시약은 이미노티올레이트 및 메틸-4-메르캅토부티르이미데이트 및 예를 들어 미국 특허 제4,676,980호에 개시된 시약을 포함한다.
6. 효과기 기능 조작
효과기 기능에 대해 본 발명의 항체를 변형하여 예를 들어 암치료에 있어 항체의 효과를 증대하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 시스테인 잔기(들)를 Fc 영역에 도입함으로써 이 영역내 쇄간 디술피드 결합을 형성시킬 수 있다. 이와 같이 생성된 호모다이머 항체는 내부화 능력을 향상시키고(시키거나) 보체-매개 세포 사멸 및 항체-의존성 세포내 세포독성(ADCC)을 증대시킨다 [Caron et al.,J. Exp Med., 176:1191-1195 (1992) 및 Shopes,J. Immunol.,148:2918-2922 (1992) 참조]. 또한, 문헌 [Wolff et al.Cancer Research,53: 2560-2565 (1993)]에 기재된 헤테로이관능성 가교를 사용하여 증대된 항-종양 활성을 지닌 호모다이머 항체를 제조할 수 있다. 또는, 이중의 Fc 영역을 갖는 항체를 조작하여 보체 용균성 및 ADCC 능력을 증대시킬 수 있다 [Stevenson et al.,Anti-Cancer Drug Design,3:219-230 (1989) 참조].
7. 면역접합체
또한, 본 발명은 세포독성제, 예를 들어 화학요법제, 독소 (예를 들어, 효소적으로 활성인 박테리아, 진균, 식물 또는 동물성 독소, 또는 그의 단편) 또는 방사활성 동위원소 (즉, 방사성접합체)와 결합된 항체를 포함하는 면역접합체에 관한 것이다.
상기 면역접합체의 생성에 유용한 화학요법제는 상기에 기재되어 있다. 사용될 수 있는 효소적으로 활성인 독소 및 그의 단편에는 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 쇄 (슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa) 유래), 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디이 (Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 피톨라카 아메리카나(Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII 및 PAP-S), 쓴 멜론 (momordica charantia) 저해제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스 (sapaonaria officinalis) 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신, 및 트리코테세네스가 포함된다. 여러 방사성핵종을 방사접합체 항체의 제조에 이용할 수 있다. 예에는212Bi,131I,131In,90Y 및186Re가 포함된다.
다양한 이관능성 단백질 커플링제, 예를 들어 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올)프로피오네이트 (SPDP), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이관능성 유도체 (예를 들어, 디메틸 아디프이미데이트 HCL), 활성 에스테르(예를 들어, 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예를 들어, 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예를 들어, 비스(p-아지도벤조일)헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체(예를 들어, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예를 들어, 톨리엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 플루오르 화합물 (예를 들어, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 항체와 세포독성 물질의 접합체를 만들 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Vitetta et al.,Science,238:1098 (1987)]에 기재된 바와 같이 리신 면역독소를 제조할 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아나토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산(MX-DTPA)은 방사성뉴클레오티드와 항체의 접합을 위한 대표적인 킬레이트제이다 (WO 94/11026 참조).
또다른 실시태양으로, 항체와 종양 예비표적화에 이용되는 "수용체" (예를 들어, 스트렙타비딘)를 접합시킬 수 있는데, 여기서 항체-수용체 접합체를 환자에게 투여한 다음, 킬레이트제를 사용하여 순환으로부터 결합하지 않은 접합체를 제거하고 세포독성 물질 (예를 들어, 방사성뉴클레오티드)에 접합된 "리간드" (예를 들어, 아비딘)를 투여한다.
8. 면역리포좀
본원에서 개시된 항체를 면역리포좀으로 제제화할 수도 있다. 이 항체를 포함하는 리포좀은 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 문헌 [Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688 (1985), Hwang et al.,Proc. Natl Acad. Sci. USA,77: 4030 (1980) 및 미국 특허 제4,485,045호 및 동 제4,544,545호]에 기재된 방법으로 제조할 수 있다. 순환 시간이 증대된 리포좀은 문헌 (미국 특허 제5,013,556호)에 개시되어 있다.
특히 유용한 리포좀은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유도체화 포스파티딜에탄올아민(PEG-PE)을 함유하는 지질 조성물을 사용하여 역상 증발법에 의해 생성할 수 있다. 정해진 공극 크기의 필터를 통해 리포좀을 압출하여 소정의 직경을 갖는 리포좀을 수득하였다. 문헌[Martin et al.,J. Biol. Chem.,257:286-288 (1982)]에 기재된 바와 같이 디술피드-상호교환 반응을 통해 본 발명의 항체의 Fab' 단편을 리포좀에 연결할 수 있다. 화학요법제 (예를 들어, 독소루비신 (Doxorubicin))은 임의로 리포좀내에 포함된다 [Gabizon et al.,J. National Cancer Inst.,81(19):1484 (1989) 참조].
F.신생 세포 성장 또는 증식을 억제할 수 있는 단백질의 동정
본원에서 개시된 단백질을 국립 암 연구소 (National Cancer Institute,NCI)의 질환에 대한 시험관내 연구 약물 개발 스크리닝에 현재 사용되는 60개의 종양 세포주 패널에서 분석하였다. 본 스크리닝의 목적은 다른 형태의 종양에 대해 세포독성 및(또는) 세포억제 활성을 갖는 분자를 동정하는 것이다. NCI는 해마다 10,000개를 초과하는 신규 분자를 스크리닝해왔다 [Monks et al.,J. Natl Cancer Inst., 83:757-766 (1991), Boyd,Cancer: Princ. Pract. Oncol. Update,3(10):1-12(1989)]. 본 연구에 사용된 종양 세포주는 상기 문헌 (Monks et al.)에 기재되어 있다. 본원의 단백질에 의해 성장이 크게 억제된 세포주는 실시예에 열거하였다.
결과는 시험한 단백질이 다양한 암세포주에서 몇몇 경우 및 농도에서 세포 억제 및 세포독성 활성을 나타내었으며, 따라서 종양 치료법에 유용한 후보물질이 된다는 것을 보였다.
또한, 종양의 다른 세포 기초 분석법 및 동물 모델은 NCI 암 스크리닝 결과를 입증하고, 본원에서 동정된 단밸질과 신생 세포 성장의 발생 및 병인을 이해하는 데에도 사용될 수 있다. 안정한 세포주가 바람직하지만, 예를 들어 트랜스제닉 마우스 (하기에 기재됨)의 종양에서 유래된 1차 배양물은 본원의 세포 기초 분석법에 사용될 수 있다. 트랜스제닉 동물로부터의 연속성 세포주를 유도하는 기술은 당업계에 잘 공지되어 있다 [예, Small et al.,Mol. Cell. Biol.,5:642-648 (1985) 참조].
G.동물 모델
잘 공지되어 있는 각종 동물 모델은 종양의 발생 및 병인에 있어서 본원에서동정된 유전자의 역할을 더 이해하고, 항체를 비롯한 후보 치료제 및 작은 분자 아고니스트를 비롯한 천연 폴리펩티드의 다른 아고니스트의 효능을 시험하는데 사용할 수 있다. 상기 분자의 생체내 특성으로 인해 특히 인간 환자에서의 반응을 예측할 수 있다. 상기 모델의 생체내 특성은 특히 인간 환자에서 상기 치료제의 반응을 예측가능하게 한다. 종양 및 암 (예, 유방암, 결장암, 전립선암, 폐암 등)의 동물 모델은 비재조합 및 재조합 (트랜스제닉) 동물을 모두 포함한다. 비재조합 동물 모델에는 예를 들어 설치류, 예를 들어 쥐 모델이 포함된다. 상기 모델은 표준 기술, 예 피하 주사, 꼬리 정맥 주사, 비장 이식, 복강내 이식, 부신하 이식 또는 오르토핀 이식, 예를 들어 결장 조직에 이식된 결장암 세포를 이용하여 종양세포를 동종의 마우스에 유도함으로써 제조될 수 있다 [PCT 공개 WO97/33351 (1997년 9월 18일 공개)].
종양 연구에 가장 흔히 사용되는 동물은 면역결핍 마우스, 특히 누드 마우스이다. 흉선저형성증을 갖는 누드 마우스는 인간 종양 이종이식을 위한 숙주로서 성공적으로 작용한다는 발견에 의해 상기 목적을 위해 광범위하게 사용되었다. 열성의 상염색체 nu 유전자는 다른 유사유전형의 많은 누드 마우스 종, 예를 들어 ASW, A/He, AKR, BALB/c, B10.LP, C17, C3H, C57BL, C57, CBA, DBA, DDD, I/st, NC, NFR, NFS, NFS/N, NZB, NZC, NZW, P, RIII 및 SJL에 도입되었다. 또한, 누드 마우스 외에 유전된 면역학적인 결함을 갖는 다른 다양한 동물도 교배하여 종양 이종 이식의 수여자로서 사용하였다. 더 상세한 내용은 문헌 [예,The Nude Mouse in Oncology Research, E. Boven and B. Winograd, eds. (CRC Press, Inc., 1991)]을 참고한다.
상기 동물로 유도된 세포는 공지된 종양/암 세포주, 예를 들어 상기에 열거된 임의의 종양 세포주 및 예를 들어 B104-1-1 세포주 (nu 원종양유전자로 트랜스펙션된 안정한 NIH-3T3 세포주), ras 트랜스펙션된 NIH-3T3 세포, Caco-2 (ATCC HTB-37) 또는 중간정도로 잘 분화된 단계 II 인간 결장 선암종 세포주 HT-29 (ATCC HTB-38), 또는 종양 및 암으로부터 유래될 수 있다. 종양 또는 암의 시료는 표준 방법을 이용하여 환자로부터 외과적으로 수득하여 냉동하여 액체 질소 내에 저장할 수 있다 [Karmali et al.,Br. J. Cancer, 48: 689-696 (1983)].
종양 세포는 여러 방법으로 누드 마우스와 같은 동물에 도입될 수 있다. 마우스의 피하 (s.c.) 공간은 종양 이식에 매우 적합하다. 종양은 고체 블록, 투관침을 이용한 생검침 또는 세포 현탁액으로서 피하로 이식할 수 있다. 고체 블록 또는 투관침 이식의 경우, 적합한 크기의 종양 조직 단편은 피하 공간으로 도입한다. 세포 현탁액은 1차 종양 또는 안정한 종양 세포주로부터 제조하여 피하 이식으로 주입한다. 또한, 종양세포는 피하 이식편으로 주입할 수 있다. 상기 위치에서 접종물은 피부 결합 조직의 하부와 피하 조직 사이에 침착한다. 유방암의 동물모델은 예를 들어 랫트 신경모세포종 (neu 종양 유전자가 처음 단리된 세포) 또는 neu 형질전환된 NIH-3T3 세포를 문헌 [Drebin et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,83: 9129-9133 (1986)]의 기재에 따라 누드 마우스에 이식함으로써 제조될 수 있다.
유사하게, 결장암 동물 모델은 동물, 예를 들어 누드 마우스에서 동물 내 결장암 세포를 계대배양으로 제조하여 상기 동물 내에 종양 발현을 유도할 수 있다. 누드 마우스에서 인간 결장암의 동소 이식 모델은 예를 들어 문헌 [Wang et al.,Cancer Research,54: 4726-4728 (1994) and Too et al.,Cancer Rearch,55: 681-684 (1995)]에 기재되어 있다. 상기 모델은 시판되는 AntiCancer Inc.(미국 캘리포니아주 샌디에고 소재) 제품의 소위 메타마우스(METAMOUSE)를 기초로 하였다.
동물 모델에서 유도된 종양은 제거하여 시험관내에서 배양할 수 있다. 이어서, 시험관내 배양액으로부터의 세포는 동물에 계대접종된다. 상기 종양은 추가의 시험 또는 약물 스크리닝을 위한 표적으로 이용될 수 있다. 또한, 계대접종에 의해 유도된 종양은 단리할 수 있고, 예비 계대접종 세포로부터의 RNA 및 1 주기 이상의 계대접종후에 단리된 세포를 관심있는 유전자의 차등적 발현에 대해 분석한다. 상기 계대접종 기술은 공지된 임의의 종양 또는 암 세포에서든지 수행할 수 있다.
예를 들어 Meth A, CMS4, CMS5, CMS21 및 WEHI-164는 BALB/c 마우스 암컷의 화학적으로 유도된 섬유육종으로서 여러 제제의 항 종양활성을 연구하기 위해 조절가능한 모델 시스템을 제공한다 [Palladino et al.,J. Immunol. 138: 4023-4032 (1987)]. 간략하게, 종양 세포는 시험관에서 세포 배양으로 증식된다. 동물주사전에 세포주를 세척하고 10 X 106내지 10 X 107세포/㎖의 세포 밀도로 완충액에 재현탁시킨다. 이어서 동물에 10 내지 100 ㎕의 세포 현탁액을 피하주사하여 종양이 생기도록 1 내지 3주를 방치한다.
또한, 가장 완전하게 연구된 실험 종양인 마우스의 루이스 폐 (3LL) 암종은 종양 연구 모델로서 이용될 수 있다. 이 종양 모델의 효능은 폐 소세포암 (SCLL)으로 진단된 인간 환자의 치료에서 유리한 효과와 관련이 있다. 이 종양은 이환된 마우스 또는 배양에서 유지된 세포로부터의 종양 단편을 주사하여 정상 마우스에 유도될 수 있으며 [Zupi et al.,Br. J. Cancer 41: suppl. 4, 309 (1980)], 종양은 심지어 단일 세포의 주사로부터 시작될 수 있으며 감염된 종양세포의 많은 부분이 생존하는 것을 나타내는 증거가 된다. 이 종양 모델의 추가적인 정보는 문헌 [Zacharski,Haemostasis 16: 300-320 (1986)]참조한다.
동물 모델에서 시험 화합물의 효능을 평가하는 한 방법은 처리 전후의 이식된 종양의 크기를 측정하는 것이다. 전형적으로, 이식된 종양의 크기는 2 또는 3차원으로 슬라이드 캘리퍼스로 측정한다. 이차원으로 한정된 측정은 종양의 정확한 크기를 반영하지 못하므로 일반적으로 수학적 수식을 이용하여 해당하는 부피로 환산된다. 그러나, 종양 크기의 측정은 매우 비정확하다. 약물 후보 물질의 치료 효과는 처리시 유도된 성장 지연 및 특이적 성장 지연으로 더 잘 나타낼 수 있다. 종양 성장을 나타내는 또다른 중요한 변수는 종양 부피 배가 시간이다. 문헌 [Rygaard and Spang-Thomson,Proc. 6th Int. Workshop on Immune-Deficient Animals, Wu and Sheng eds.(Basel, 1989, 301)]에 보고된 프로그램과 같이 종양 성장의 계산 및 표시를 위한 컴퓨터 프로그램 이용이 가능하다. 그러나, 치료에 따른 괴사 및 염증 반응은 실제로 적어도 초기에 종양 크기의 증가를 가져온다. 그러므로 이러한 변화는 형태 측정 방법 및 유동 세포측정법을 조합하여 주의있게모니터하여야 한다.
재조합(트랜스제닉) 동물 모델은 트랜스제닉 동물을 생산하기 위한 표준 기술을 이용하여 본원에서 동정된 유전자의 코딩 부위를 목적하는 동물의 게놈에 도입시킴으로써 조작될 수 있다. 트랜스제닉 조작을 위한 표적으로 마우스, 랫트, 토끼, 기니아 피그, 양, 염소, 돼지 및 비인간 영장류, 즉 개코 원숭이, 침팬지 및 원숭이 등에 제한없이 사용될 수 있다. 트랜스진을 상기의 동물에 도입하는 공지된 기술은 전핵 미세주입법 (미국 특허 제 4,873,191호), 배주로의 레트로 바이러스 매개된 유전자 전달법 [예, Van der Putten et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,82: 6148-615(1985)], 배간세포에서의 유전자 표적법 [Thompson et al.,Cell,56: 313-32 (1989)], 배의 일렉트로포레이션 [Lo,Mol. Cell. Biol.,3: 1803-1814 (1983)]; 정자 매개된 유전자 전달법 [Lavitrano et al.,Cell. 57: 717-73 (1989)]가 포함된다. 더 많은 정보를 위해서 예를 들어 미국 특허 제 4,736,866호를 참조한다.
본 발명의 목적을 위해, 트랜스제닉 동물은 세포의 일부에만 트랜스진을 지니고 있는 동물 ("모자이크 동물")을 포함한다. 트랜스진은 단일 트랜스진 또는 콘카타머, 즉 머리-머리 또는 머리-꼬리 배열로 통합될 수 있다. 트랜스진의 특정 세포종으로의 선택적인 도입은 예를 들어 Lasko등 [Proc. Natl. Acd. Sci. USA. 89: 6232-636 (1992)]의 기술에 의해 또한 가능하다.
트랜스제닉 동물 내에서 트랜스진의 발현은 표준 기술에 의해 모니터될 수 있다. 예를 들어 서던 블롯 분석 또는 PCR 증폭이 트랜스진의 융합을 확인하는 데사용될 수 있다. 이어서 mRNA 발현 수준은 계내 혼성화, 노던 블롯 분석, PCR 또는 면역세포화학과 같은 기술을 이용하여 분석될 수 있다. 또한 동물들은 종양 또는 암의 발생의 징후에 대해 조사될 수 있다.
본원에서 동정한 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 및 다른 후보 약물의 효능은 또한 자연발생적 동물 종양의 처치에서 시험될 수 있다. 이같은 연구의 적합한 표적은 고양이의 구강 편평상피 세포암 (SCC)이다. 고양이 구강 SCC는 이 종에서 보고된 구강 종양의 60%를 차지하는 것이 설명해 주듯이 가장 흔한 고양이의 구강 악성 종양으로 매우 공격적이고, 악성 종양이다. 낮은 전이 발생률은 단지 이 종양을 갖는 고양이의 생존 기간이 짧은 것을 반영한다고 하더라도, 이것은 원발 부위로 거의 전이되지 않는다. 주로 고양이 구강의 해부로 인해 이들 종양에 대해 일반적으로 외과 수술을 실시할 수 없다. 현재, 이 종양의 효과적인 치료법은 없다. 연구에 도입하기에 앞서, 각 고양이는 완벽한 임상 검사, 생체 검사를 하고 컴퓨터 단층 촬영 (CT)한다. 설하 구강 편평상피 세포 종양으로 진단된 고양이는 연구에서 제외한다. 이같은 종양으로 혀가 마비될 수 있으며 처치로 종양을 제거한다고 해도 동물은 스스로 음식을 섭취할 수가 없다. 각 고양이를 반복적으로 오랜 기간에 걸쳐 처치한다. 치료 기간 동안 매일 및 이후의 재검토시에 종양의 사진을 촬영한다. 치료후 각 고양이를 컴퓨터 단층 촬영하고, 그 후 8주마다 컴퓨터 단층 촬영 및 흉부 라디오그램을 평가한다. 자료를 대조군과 비교하여 생존, 반응 및 독성에 있어서 차이에 대해 평가한다. 양성 반응은 바람직하게는 삶의 질의 향상 및(또는) 증가된 수명의 증가와 함께 종양의 퇴화의 증거를 필요로한다.
또한, 다른 자연 발생 동물 종양, 예를 들어 개, 고양이 및 비비의 섬유육종, 선암, 림프종, 연공종, 평활근육종이 실험될 수 있다. 이들 포유류 중에 개 및 고양이의 유선암은 인간과 매우 비슷한 형태와 반응을 보이기 때문에 바람직한 모델이다. 그러나, 이들 모델의 사용은 동물에서 이 종류의 종양의 드문 발생으로 제한된다.
H.약물 후보 물질의 스크리닝 분석법
약물 후보 물질의 스크리닝 분석법은 본원에서 동정된 폴리펩티드의 수용체(들)에 경쟁적으로 결합하거나 이들과 결합체를 형성하는 화합물, 또는 이러한 수용체를 통한 시그날을 동정하기 위한 것이다. 이러한 스크리닝 분석법은 화학 물질 라이브러리에 대해 고처리 스크리닝할 수 있는 분석법을 포함하며, 이는 작은 분자의 약물 후보를 동정하는데 특히 적합할 것이다. 고려되는 작은 분자에는 펩티드, 바람직하게는 가용성 펩티드, (폴리)펩티드-면역글로불린 융합체, 및 폴리클로날 항체 및 모노클로날 항체 및 항체 단편, 단일쇄 항체, 항-이디오타입 항체 및 키메라 항체 또는 상기 항체 또는 단편 및 인간 항체 및 항체 단편의 인간화 항체를 포함하는(이에 한정되지는 않음)는 항체를 포함하는 합성 유기 또는 무기 화합물이 포함된다. 분석법은 당업계에서 잘 특성화된 단백질-단백질 결합 분석법, 생화학적 스크리닝 분석법, 면역분석법 및 세포계 분석법을 비롯한 다양한 포맷으로 수행할 수 있다.
결합 분석법에서, 상호작용은 결합하는 것이며, 형성된 복합체는 단리하거나반응 혼합물에서 검출할 수 있다. 특정 실시태양에서, 본원에서 확인된 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 수용체 또는 약물 후보는 공유적 부착 또는 비공유적 부착에 의해 고체상, 예를 들어 마이크로타이터 플레이트에 고정된다. 비공유적 부착은 일반적으로 고체 표면을 용액으로 코팅하고 건조함으로써 달성된다. 별법으로, 고정화 항체, 예를 들어 고정된 폴리펩티드에 특이적인 모노클로날 항체를 사용하여 이를 고체 표면에 앵커링할 수 있다. 분석은 검출가능한 표지로 표지될 수 있는 비고정 성분을 고정 성분, 예를 들어 앵커링된 성분을 포함하는 코딩 표면에 부가함으로써 수행할 수 있다. 반응이 종결되었을 때, 반응하지 않은 성분은 예를 들어 세척에 의해 제거되며, 고체 표면에 앵커링된 결합체가 검출된다. 본래 고정되지 않은 성분이 검출가능한 표지를 포함하는 경우, 표면에 고정된 표지의 검출은 복합체 형성 반응이 일어났음을 나타낸다. 본래 고정되지 않은 성분이 표지를 포함하지 않는 경우, 예를 들어 고정된 복합체와 특이적으로 결합하는 표지된 항체를 사용하여 복합체 형성 반응을 검출할 수 있다.
후보 화합물이 특정 수용체와 상호작용하지만 결합하지 않는 경우, 후보 화합물과 이 폴리펩티드의 상호작용은 단백질-단백질 상호작용을 검출하기 위한 잘 알려진 방법에 의해 분석할 수 있다. 이러한 분석법에는 통상의 방법, 예를 들어 가교형성법, 공동면역침전법, 및 구배 또는 크로마토그래피 컬럼을 통한 공동정제법이 포함된다. 또한, 단백질-단백질 상호작용은 문헌 [Fields and co-workers (Fields and Song,Nature(London), 340:245-246 (1989), Chien et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:9578-9582 (1991)),문헌 (Chevray and Nathans,Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 89:5789-5793 (1991))에 기재된 바와 같음]에 기재된 효모 기재한 유전자 시스템을 사용하여 모니터링할 수 있다. 많은 전사 활성자, 예를 들어 효모 GAL4는 물리적으로 구별되는 2개의 모듈형 도메인으로 이루어져 있는데, 한 도메인은 DNA-결합 도메인으로 작용하고, 나머지 한 도메인은 전사-활성 도메인으로 작용한다. 상기 문헌에 기재된 효모 발현계 (일반적으로, "2-하이브리드계"로 언급됨)는 이러한 특성을 이용하며, 2가지 하이브리드 단백질을 사용하는데, 이 중 하나는 표적 단백질이 GAL4의 DNA-결합 도메인과 융합된 것이며, 다른 하나는 후보 활성 단백질이 활성 도메인과 융합된 것이다. GAL4-활성 프로모터의 조절하에 GAL1-lacZ 리포터 유전자의 발현은 단백질-단백질 상호작용을 통한 GAL4 활성의 재구성에 따라 좌우된다. 상호작용 폴리펩티드를 포함하는 콜로니는 β-갈락토시다제에 대한 색소생산성 기질을 사용하여 검출한다. 2-하이브리드 기술을 사용하여 2종의 특이적인 단백질사이의 단백질-단백질 상호작용을 확인하는 완성형 킷트 (MATCHMAKERTM)는 클론테크사에서 구입할 수 있다. 또한, 이 시스템을 확장하여 특이적 단백질 상호작용에 관여하는 단백질 도메인을 맵핑할 수 있을뿐 아니라, 이러한 상호작용에 결정적인 아미노산 잔기의 위치를 정확하게 나타낼 수 있다.
I.제약 조성물
본 발명의 폴리펩티드, 본원에서 동정된 단백질에 특이적으로 결합하는 아고니스트 항체 및 본원에서 개시된 스크리닝 분석법에 의해 동정된 다른 분자는 암을 포함하는 각종 질환을 치료하기 위해 제약 조성물 형태로 투여할 수 있다.
항체 단편이 사용되는 경우 표적 단백질의 결합 도메인에 특이적으로 결합하는 최소의 억제 단편이 바람직하다. 예를 들어, 항체의 가변-영역 서열을 기초로 하여, 표적 단백질 서열과 결합할 수 있는 펩티드 분자를 설계할 수 있다. 이러한 펩티드는 화학적으로 합성하고(하거나) 재조합 DNA 기술에 의해 제조할 수 있다 [예를 들어, 문헌 (Marasco et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,90:7889-7893 (1993)) 참조).
또한, 본원의 제제는 치료할 특정 징후에 필요한 1종 이상의 활성 화합물, 바람직하게는 서로 부작용을 일으키지 않는 상보적인 활성을 갖는 화합물을 포함할 수 있다. 별법으로, 또는 추가로 조성물은 그의 기능을 상승시키는 제제, 예를 들어 세포독성제, 사이토카인, 화학요법제, 또는 성장억제제를 포함할 수 있다. 상기 분자는 의도하는 목적에 효과적인 양으로 적합하게 존재한다.
본원에서 동정된 폴리펩티드의 치료 제제는 저장을 위해, 소정의 순도를 갖는 항체를 임의의 제약적으로 허용가능한 담체, 부형체 또는 안정화제 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. ed. (1980)]와 혼합하여 동결건조 제형 또는 수용액의 형태로 제조하였다. 제약적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제는 투여된 투여량 및 농도가 환자에 무독성이어야하며, 인산, 시트르산 및 기타 유기산의 완충액과 같은 완충액; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 산화방지제, 방부제 (예를 들어, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤; 카테콜;레소시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸), 저분자량 (약 10 잔기 미만) 폴리펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 소수성 중합체; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신과 같은 아미노산; 일당류, 이당류, 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함하는 기타 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트제; 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 솔비톨과 같은 당; 나트륨과 같은 염-형성 카운터 이온; 금속 착물(예를 들어, Zn-단백질 착물); 및(또는) TWEEN (상표명), PLURONICS (상표명) 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 비이온성 계면활성제가 포함된다.
또한, 본원의 제제는 치료할 특정 징후에 필요한 1종 이상의 활성 화합물, 바람직하게는 서로 부작용을 일으키지 않는 상보적인 활성을 갖는 화합물을 포함할 수 있다. 별법으로, 또는 추가로 조성물은 그의 기능을 상승시키는 제제, 예를 들어 세포독성제, 사이토카인, 화학요법제, 또는 성장억제제를 포함할 수 있다. 상기 분자는 의도하는 목적에 효과적인 양으로 적합하게 존재한다.
활성 성분은 예를 들어 각각 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어 리포솜, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐) 또는 마크로에멀젼 중에, 예를 들어 코아세르베이션(coacervation) 기술 또는 계면 중합, 예를 들어 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐에 의해 제조된 마이크로캡슐에 봉입될 수 있다. 상기 기술은 문헌 (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. ed. (1980))에 개시되어 있다.
체내 투여에 사용되는 제형은 멸균처리되어야 한다. 이것은 동결건조 및 재구성 전 또는 후에 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 용이하게 수행된다.
본원의 치료 조성물은 통상 멸균된 입구를 갖는 용기, 예를 들어 정맥주사 용액 주머니 또는 피하주사 바늘로 관통될 수 있는 마개를 갖는 바이알에 넣을 수 있다.
서방성 제형도 제조될 수 있다. 서방성 제형의 적합한 예에는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스가 포함되며, 이 매트릭스는 필름 또는 마이크로캡슐과 같은 성형품 형태이다. 서방성 매트릭스의 예에는 폴리에스테르, 히드로겔(예를 들어, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알콜)), 폴리락티드 (미국 특허 제3,773,919호), L-글루탐산과 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예를 들어 LUPRON DEPOT(상표명)(락트산-글리콜산 공중합체 및 루프롤라이드 아세테이트로 이루어진 주입가능한 마이크로스피어), 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산이 포함된다. 에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산과 같은 중합체는 100일 이상 동안 분자를 방출시키지만, 어떤 히드로겔은 보다 짧은 기간 동안 단백질을 방출시킨다. 캡슐화된 항체가 오랫 동안 체내에 남아있는 경우, 그는 37 ℃에서 습기에 노출된 결과, 변성 또는 응집되어 생물 활성을 감소시키고 면역원성을 변화시킬 수 있다. 안정화를 위해 관련된 메카니즘에 따라 합리적인 전략을 설계할 수 있다. 예를 들어, 응집 메카니즘이 티오-디술피드 상호교환을 통한 분자내 S-S 결합 형성인 것으로 밝혀진다면, 술프히드릴 잔기의 변형, 산성 용액으로부터의 동결건조, 수분 함량 조절, 적절한 첨가제 사용 및 특이적인 중합체 매트릭스 조성물의 개발에 의해 안정화시킬 수 있다.
J.치료 방법
본 발명의 폴리펩티드 및 항체, 펩티드 및 작은 분자 아고니스트를 포함한 이들의 아고니스트는 다양한 종양, 예를 들어 암의 치료에 사용될 수 있다. 치료되는 대표적인 질병에는 양성 또는 악성 종양 (예, 신세포암, 간암, 신장암, 방광암, 유방암, 위장암, 난소암, 결장직장암, 췌장암, 폐암, 외음부암, 갑상선암, 간암종, 육종, 교모세포종 및 여러 종류의 두부 및 경부암), 백혈병 및 림프암; 신경 질환, 신경교 질환, 성상세포 질환, 시상하부 질환, 및 기타 분비선 질환, 대식세포성 질환, 상피성 질환, 간질성 질환 및 포배강성 질환; 및 염증 질환, 혈관형성질환 및 면역 질환이 포함된다. 본 발명의 항종양제 (본원에 개시된 폴리펩티드 및 이들의 활성을 모방하는 아고니스트, 예를 들어 항체, 펩티드 및 작은 유기 분자)는 공지된 방법, 예를 들어 볼루스로서의 정맥내 투여, 또는 근육내, 복강내, 뇌척수내, 피하내, 관절내, 활액내, 수막강내, 경구, 국소 또는 흡입 경로에 의한 장기간의 연속 관주에 의해 포유동물, 바람직하게는 인간에게 투여될 수 있다. 항체의 정맥내 투여가 바람직하다.
다른 치료법이 본 발명의 항체와 같은 항암제의 투여와 병행될 수 있다. 예를 들어, 이러한 항암제로 치료되는 환자는 또한 방사선 치료를 받을 수 있다. 별법으로, 또는 추가로, 환자에게 화학요법제를 투여할 수 있다. 이러한 화학요법제의 제조 및 투여 일정은 제조자의 지시를 따르거나 당업계 전문 숙련인에 의해 경험적으로 결정될 수 있다. 또한, 이러한 화학 요법 치료제의 제조 및 투여 일정은 문헌 [Chemotherapy ServiceEd., M.C.Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD(1992)]에 기재되어 있다. 화학요법제는 본 발명의 항암제의 투여 전 또는 후에 투여되거나, 동시에 투여될 수 있다. 본 발명의 항암제는 타목시펜과 같은 항-에스트로겐 화합물 또는 오나프리스톤과 같은 항-프로게스테론 화합물 (EP 제616812호 참조)를 상기 분자의 공지된 투여량으로 조합하여 투여할 수 있다.
또한, ErbB2, EGFR, ErbB3, ErbB4 또는 혈관 내피 인자(VEGF)에 결합하는 항체와 같은 기타 종양 관련 항체를 투여하는 것도 바람직하다. 별법으로, 또는 추가로, 본원에 개시된 동일하거나 2종 이상의 상이한 항원에 결합하는 2종 이상의 항체를 환자에 동시 투여할 수 있다. 때로는, 환자에 1 종 이상의 사이토카인을 투여하는 것도 유익할 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 본원의 항체를 생장 억제제와 동시에 투여할 수 있다. 예를 들어, 우선 성장 억제제를 투여한 후에 본 발명의 항암제를 투여할 수 있다. 그러나, 동시 투여나 본 발명의 항암제를 먼저 투여하는 것도 고려할 수 있다. 생장 억제제의 적합한 투여량은 현재 사용되는 투여량이며, 생장 억제제와 본원의 항암제의 복합 작용(상승)으로 인하여 투여량을 저하시킬 수 있다.
질환의 예방 또는 치료를 위해, 본원의 항암제의 적합한 투여량은 상기 정의한 바와 같이 치료되는 질환의 유형, 중증도 및 질환의 진행 과정, 투여되는 항암제가 예방 목적인지 치료 목적인지, 이전의 치료법, 환자의 임상 병력 및 약제에 대한 반응, 및 재량 및 주치의에 따라 달라질 것이다. 제제는 일시에 또는 일련의치료를 통해 환자에 적합하게 투여된다. 동물실험은 인간 치료법에 유효량을 결정에 신뢰할 만한 지침을 제공한다. 종간의 유효량의 비율조정은 문헌 [Mordenti, J and Chappell, W. "The use of interspecies scaling in toxicokinetics" in Toxicokinetics and New Drug Development, Uacobi et al., eds., Pergamon Press, New York 1989, pp42-96].
예를 들어, 질환의 유형 및 심각성에 따라, 약 1㎍/kg 내지 15 mg/kg (예를 들어, 0.1 내지 20 mg/kg)의 항체가 1회 이상의 분리된 투여 또는 연속 관주에 의한 환자에의 투여에 대한 초기 후보 투여량이다. 통상적인 일일 투여량은 상기 언급한 인자에 의존하여 약 1 ㎍/kg 내지 100 mg/kg 이상이다. 증상에 따라 며칠 이상에 걸친 반복 투여의 경우, 치료는 원하는 질환 징후가 억제될 때까지 지속된다. 그러나, 다른 투여량이 효과적일 수도 있다. 이 치료법의 진행은 종래의 기술 및 분석에 의해 용이하게 모니터될 수 있다. 특정 투여량에 대한 지침 및 전달 방법은 문헌 (예, 미국 특허 제 4,657,760호, 제 5,206,344호 또는 5,225,212호 참조)에 제공되어 있다. 다른 제제는 다른 치료 화합물 및 다른 질병에 효과적일 수 있고, 한 기관 또는 조직을 표적하는 투여법은 예를 들어 또다른 기관 또는 조직과는 다른 방법의 전달법을 요구할 수 있을 것을 예상된다.
K.제품
본 발명의 또다른 실시태양에서, 상기에 기재된 질환의 진단 또는 치료에 유용한 물질을 함유하는 제품을 제공한다. 제품은 용기 및 라벨을 포함한다. 적합한 용기에는, 예를 들어 병, 바이알, 주사기 및 시험관이 포함된다. 용기는 유리또는 플라스틱과 같은 다양한 재료로 형성될 수 있다. 용기에는 질병의 진단 또는 치료에 효과적인 조성물이 들어 있으며, 멸균된 입구가 있을 수 있다 (예를 들어, 용기는 정맥 주사용액 주머니이거나, 피하 주사기 바늘이 관통될 수 있는 마개가 있는 바이알일 수 있음). 조성물의 활성 물질은 본 발명의 항종양제이다. 용기 위 또는 용기에 부착된 라벨은 조성물이 선택된 질병의 진단 또는 치료에 사용된다는 것을 지시한다. 제품은 또한 인산염 완충 식염수, 링거액 및 덱스트로스 용액과 같은 제약적으로 허용가능한 완충액을 포함하는 제2의 용기를 포함할 수 있다. 또한, 제품은 다른 완충액, 희석액, 필터, 바늘, 주사기, 및 사용 지시서가 들어있는 포장 삽입물을 포함하여 상업적 입장 및 사용자 입장에서 바람직한 다른 재료를 포함할 수 있다.
하기 실시예는 단지 예시적인 목적으로 제공되며, 어떤 방식으로든 본 발명의 범위를 제한하려는 것은 아니다.
본 명세서에 인용된 모든 특허 및 문헌은 그 전문이 본원에 참고문헌으로 포함된다.
실시예에서 언급한 시판 시약들은 달리 지시하지 않는 한 제조업자의 지시에 따라 사용하였다. 하기 실시예와 명세서 전반에서 ATCC 기탁 번호로 확인되는 세포들의 공급원은 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (American Type Culture Collection, 버지니아주 마나사스 소재)이다.
실시예 1: PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 및 PRO182를 코딩하는 cDNA 클론의 단리
(A)PRO211
스위스-프롯 (Swiss-Prot) 공용 데이타베이스로부터 약 950개의 공지된 분비형 단백질의 세포외 도메인 (ECD) 서열 (존재하는 경우 분비 시그날 서열 포함)을 사용하여 EST 데이타베이스를 조사하였다. EST 데이타베이스는 공용 EST 데이타베이스 (예를 들면, 진뱅크 (GenBank))와 독점 EST 데이타베이스 (예를 들면, LIFESEQ(등록상표)((인사이트 파마슈티칼스 (Incyte Pharmaceuticals, 캘리포니아주 팔로 알토))를 포함한다. 조사는 EST 서열의 6개 프레임 번역물과 ECD 단백질 서열의 비교로서 컴퓨터 프로그램 BLAST 또는 BLAST-2 [Altschul et al.,Methods in Enzymology,266: 460-480 (1996)]를 이용하여 수행하였다. 공지된 단백질을 코딩하지 않는 70 (또는 몇몇 경우 90) 이상의 블라스트(Blast) 스코어를 갖는 비교물을 클러스터시키고, 프로그램 "phrap" (Phil Green, University of Washington, 워싱턴주 시애틀)을 사용하여 컨센서스 DNA 서열로 어셈블링하였다.
상기한 바와 같이 phrap을 이용하여 다른 EST 서열에 대해 컨센서스 DNA 서열을 어셈블링하였다. 상기 컨센서스 서열을 본원에서 DNA28730으로 명명하였다. 몇몇 경우에, 컨센서스 서열은, 상기 논의한 EST 서열원을 사용하여 가능한 한 멀리 신장시키기 위해 BLAST와 phrap의 사이클을 반복하여 신장시킨 중간 컨센서스 DNA 서열로부터 유래한다.
이어서, DNA28730 컨센서스 서열에 기초하여 올리고뉴클레오티드를 합성하여, 1) 관심있는 서열을 포함하는 cDNA 라이브러리의 PCR에 의한 동정에 사용하고2) PRO211 폴리펩티드의 전장 코딩 서열의 클론을 단리시키기 위한 프로브로서 사용하였다. 전방향 및 역방향 PCR 프라이머는 일반적으로 20 내지 30개의 뉴클레오티드로 이루어지고, 종종 약 100 내지 1000 bp 길이의 PCR 산물을 제공하도록 고안된다. 프로브 서열은 통상 40 내지 55 bp 길이이다. 몇몇 경우, 컨센서스 서열이 약 1 내지 1.5 kbp보다 클 경우 추가의 올리고뉴클레오티드가 합성된다. 전장 클론을 위한 몇몇 라이브러리를 스크리닝하기 위해, 이들 라이브러리로부터의 DNA를 PCR 프라이머 쌍을 사용하여 문헌 (Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology,상기 문헌)에 따라 PCR 증폭에 의해 스크리닝하였다. 이어서, 양성 라이브러리를 사용하여 프로브 올리고뉴클레오티드 및 프라이머 쌍들 중 하나를 이용하여 관심있는 유전자를 코딩하는 클론을 단리시켰다.
PCR 프라이머 (전방향 및 역방향)를 합성하였다.
전방향 PCR 프라이머5'-AGAGTGTATCTCTGGCTACGC-3' (서열 3) 및
역방향 PCR 프라이머5'-TAAGTCCGGCACATTACAGGTC-3' (서열 4)
추가로, 하기 뉴클레오티드 서열을 갖는 합성 올리고뉴클레오티드 혼성화 프로브를 컨센서스 DNA28730 서열로부터 제조하였다.
혼성화 프로브
5'-AGGGAGCACGGACAGTGTGCAGATGTGGACGAGTGCTCACTAGCA-3' (서열 5)
cDNA 라이브러리의 제조를 위한 RNA를 인간 태아 폐조직으로부터 단리하였다. cDNA 클론을 단리하기 위해 사용된 cDNA 라이브러리는 시판 시약, 예를 들어 인비트로젠 (Invitrogen, San Diego, CA)사에서 구입한 시약을 사용하여 표준 방법에 의해 제조하였다. NotI 부위를 포함하는 올리고 dT를 사용하여 cDNA를 프라이밍하고, SalI 헤미키나제화 어댑터와 블런트로 연결하고, NotI으로 절단하여 겔 전기영동에 의해 적절한 크기로 분류하고 정해진 방향으로 적합한 클로닝 벡터 (예를 들어, pRKB 또는 pRKD; pRK5B는 SfiI 부위를 포함하지 않는 pRK5D의 전구체임; 문헌 (Holmes et al.,Science,253: 1278-1280 (1991)) 참조) 내의 유일한 XhoI 및 NotI 부위에 클로닝하였다.
상기 기재된 바와 같이 단리된 클론의 DNA 서열 분석은 전장 PRO211 폴리펩티드에 대한 전장 DNA 서열 (본원에서 DNA32292-1131 (도 1, 서열 1)로 명명함) 및 이로부터 유도된 PRO211 폴리펩티드의 단백질 서열을 제공한다.
상기에서 동정된 전장의 클론은 뉴클레오티드 위치 65 내지 67에 분명한 번역 개시 부위를 가지며 뉴클레오티드 위치 1124 내지 1126의 정지 코돈에서 종결하는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함한다 (도 1, 서열 1). 예상된 폴리펩티드 전구체는 353개의 아미노산 길이이며, 추정 분자량은 약 38,190 달톤이다. 도 2 (서열 2)에 도시된 전장 PRO211의 서열을 분석한 결과는 여러가지 중요한 폴리펩티드 도메인의 존재를 입증하며, 상기 중요한 폴리펩티드 도메인에 대한 위치는 상기에 기재된 바와 같이 대략적이다. 전장 PRO211 서열을 분석한 결과, 약 아미노산 1 내지 약 아미노산 24의 시그날 펩티드, 약 아미노산 190 내지 약 아미노산 194 및 약 아미노산 251 내지 약 아미노산 255의 N-글리코실화 부위, 약 아미노산 149 내지 약 아미노산 153 및 약 아미노산 155 내지 약 아미노산 159의 글리코사미노글리칸 부착 부위, 약 아미노산 26 내지 약 아미노산 30의 cAMP 및 cGMP 의존성 단백질 키나제 인산화 부위, 약 아미노산 58 내지 약 아미노산 62, 약 아미노산 66 내지 약 아미노산 70, 약 아미노산 86 내지 약 아미노산 90, 약 아미노산 197 내지 약 아미노산 201, 약 아미노산 210 내지 약 아미노산 214, 약 아미노산 255 내지 약 아미노산 259, 약 아미노산 295 내지 약 아미노산 299, 약 아미노산 339 내지 약 아미노산 343 및 약 아미노산 349 내지 약 아미노산 353의 카제인 키나제 II 인산화 부위, 약 아미노산 303 내지 약 아미노산 310의 티로신 키나제 인산화 부위, 약 아미노산 44 내지 약 아미노산 50, 약 아미노산 54 내지 약 아미노산 60, 약 아미노산 55 내지 약 아미노산 61, 약 아미노산 81 내지 약 아미노산 87, 약 아미노산 150 내지 약 아미노산 156, 약 아미노산 158 내지 약 아미노산 164, 약 아미노산 164 내지 약 아미노산 170, 약 아미노산 252 내지 약 아미노산 258 및 약 아미노산 313 내지 약 아미노산 319의 N-미리스토일화 부위, 약 아미노산 308 내지 약 아미노산 320의 아스파르트산 및 아스파라긴 수산화 부위, 약 아미노산 166 내지 약 아미노산 178의 EGF 유사 도메인 시스테인 형태 신호, 및 약 아미노산 94 내지 약 아미노산 116의 루이신 지퍼 형태의 존재를 입증한다.
클론 DNA32292-1131은 1997년 9월 16일자로 ATCC에 기탁하여 기탁 번호 209258을 배정받았다.
도 2 (서열 2)에 도시된 전장 서열의 WU-BLAST-2 서열 정렬 분석을 이용한 데이호프 데이타베이스 (버전 35.45 스위스 프롯 35)의 분석은 PRO211 아미노산 서열과 인간 EGF 사이에 서열 동일성을 입증하였다.
(B)PRO228
스위스-프롯 (Swiss-Prot) 공용 데이타베이스로부터 약 950개의 공지된 분비형 단백질로부터의 세포외 도메인 (ECD) 서열 (존재하는 경우 분비 시그날 서열 포함)을 사용하여 EST 데이타베이스를 조사하였다. EST 데이타베이스는 EST 공용 데이타베이스 (예를 들면, 진뱅크 (GenBank))와 독점 EST 데이타베이스 (예를 들면, LIFESEQ(등록상표) (인사이트 파마슈티칼스 (Incyte Pharmaceuticals, 캘리포니아주 팔로 알토))를 포함한다. 조사는 EST 서열의 6개 프레임 번역물과 ECD 단백질 서열의 비교로서 컴퓨터 프로그램 BLAST 또는 BLAST-2 [Altschul et al.,Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)]를 이용하여 수행하였다. 공지된 단백질을 코딩하지 않는 70 (또는 몇몇 경우 90) 이상의 블라스트(Blast) 스코어를 갖는 비교물을 클러스터시키고, 프로그램 "phrap" (Phil Green, University of Washington 워싱턴주 시애틀)을 사용하여 컨센서스 DNA 서열로 어셈블링하였다.
상기한 바와 같이 phrap을 이용하여 다른 EST 서열에 대해 컨센서스 DNA 서열을 어셈블링하였다. 상기 컨센서스 서열을 본원에서 DNA28758로 명명하였다. 본원에서 DNA21951로 명명된 제넨테크사 독점의 EST를 컨센서스 어셈블링에 사용하였다. 몇몇 경우에, 컨센서스 서열은, 상기 논의한 EST 서열원을 사용하여 가능한 한 멀리 신장시키기 위해 BLAST와 phrap의 사이클을 반복하여 신장시킨 중간 컨센서스 DNA 서열로부터 유래한다.
이어서, DNA28758 컨센서스 서열에 기초하여 올리고뉴클레오티드를 합성하여, 1) 관심있는 서열을 포함하는 cDNA 라이브러리의 PCR에 의한 동정에 사용하고 2) PRO228에 대한 전장 코딩 서열의 클론을 단리시키기 위한 프로브로서 사용하였다. 전방향 및 역방향 PCR 프라이머는 일반적으로 20 내지 30개의 뉴클레오티드로 이루어지고, 종종 약 100 내지 1000 bp 길이의 PCR 산물을 제공하도록 고안된다. 프로브 서열은 통상 40 내지 55 bp 길이이다. 몇몇 경우, 컨센서스 서열이 약 1 내지 1.5 kbp보다 큰 경우 추가의 올리고뉴클레오티드가 합성된다. 전장 클론을 위한 몇몇 라이브러리를 스크리닝하기 위해, 이들 라이브러리로부터의 DNA를 PCR 프라이머 쌍을 사용하여 문헌 (Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology,상기 문헌)에 따라 PCR 증폭에 의해 스크리닝하였다. 이어서, 양성 라이브러리를 사용하여 프로브 올리고뉴클레오티드 및 프라이머 쌍들 중 하나를 이용하여 관심있는 유전자를 코딩하는 클론을 단리시켰다.
PCR 프라이머 (전방향 및 역방향)를 합성하였다.
전방향 PCR 프라이머 15'-GGTAATGAGCTCCATTACAG-3' (서열 8)
전방향 PCR 프라이머 25'-GGAGTAGAAAGCGCATGG-3' (서열 9)
전방향 PCR 프라이머 35'-CACCTGATACCATGAATGGCAG-3' (서열 10)
역방향 PCR 프라이머 15'-CGAGCTCGAATTAATTCG-3' (서열 11)
역방향 PCR 프라이머 25'-GGATCTCCTGAGCTCAGG-3' (서열 12) 및
역방향 PCR 프라이머 35'-CCTAGTTGAGTGATCCTTGTAAG-3' (서열 13)
추가로, 하기 뉴클레오티드 서열을 갖는 합성 올리고뉴클레오티드 혼성화 프로브를 DNA28758 서열로부터 제조하였다.
혼성화 프로브
5'-ATGAGACCCACACCTCATGCCGCTGTAATCACCTGACACATTTTGCAATT-3' (서열 14)
cDNA 라이브러리의 제조를 위한 RNA를 인간 태아 신장 조직으로부터 단리하였다. cDNA 클론을 단리하기 위해 사용된 cDNA 라이브러리는 시판 시약, 예를 들어 인비트로젠 (Invitrogen, San Diego, CA)사에서 구입한 시약을 사용하여 표준 방법에 의해 제조하였다. NotI 부위를 포함하는 올리고 dT를 사용하여 cDNA를 프라이밍하고, SalI 헤미키나제화 어댑터와 블런트로 연결하고, NotI으로 절단하여 겔 전기영동에 의해 적절한 크기로 분류하고 정해진 방향으로 적합한 클로닝 벡터 (예를 들어, pRKB 또는 pRKD; pRK5B는 SfiI 부위를 포함하지 않는 pRK5D의 전구체임; 문헌 (Holmes et al.,Science,253: 1278-1280 (1991)) 참조) 내의 유일한 XhoI 및 NotI 부위에 클로닝하였다.
상기 기재된 바와 같이 단리된 클론의 DNA 서열 분석은 전장 PRO228 폴리펩티드에 대한 전장 DNA 서열 (본원에서 DNA33092-1202 (도 3a 및 3b, 서열 6)로 명명함) 및 이로부터 유도된 PRO228 폴리펩티드의 단백질 서열을 제공한다.
상기에서 동정된 전장의 클론은 뉴클레오티드 위치 24 내지 26에 분명한 번역 개시 부위를 가지며 뉴클레오티드 위치 2094 내지 2096의 정지 코돈에서 종결하는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함한다 (도 3a 및 3b, 서열 6). 예상된 폴리펩티드 전구체는 690개 아미노산 길이이다. 도 4 (서열 7)에 도시된 전장의 PRO228의 서열의 분석은 여러가지 중요한 폴리펩티드 도메인의 존재를 입증하며, 상기 중요한 폴리펩티드 도메인에 대한 위치는 상기에 기재된 바와 같이 대략적이다. 전장의 PRO228 서열을 분석한 결과는 약 아미노산 1 내지 약 아미노산 19의 시그날 펩티드, 약 아미노산 430 내지 약 아미노산 450, 약 아미노산 465 내지 약 아미노산486, 약 아미노산 499 내지 약 아미노산 513, 약 아미노산 535 내지 약 아미노산 549, 약 아미노산 573 내지 약 아미노산 593, 약 아미노산 619 내지 약 아미노산 636 및 약 아미노산 648 내지 약 아미노산 664의 막횡단 도메인, 약 아미노산 15 내지 약 아미노산 19, 약 아미노산 21 내지 약 아미노산 25, 약 아미노산 64 내지 약 아미노산 68, 약 아미노산 74 내지 약 아미노산 78, 약 아미노산 127 내지 약 아미노산 131, 약 아미노산 177 내지 약 아미노산 181, 약 아미노산 188 내지 약 아미노산 192, 약 아미노산 249 내지 약 아미노산 253, 약 아미노산 381 내지 약 아미노산 385 및 약 아미노산 395 내지 약 아미노산 399의 N-글리코실화 부위, 약 아미노산 49 내지 약 아미노산 53의 글리코사미노글리칸 부착 부위, 약 아미노산 360 내지 약 아미노산 364의 cAMP 및 cGMP 의존성 단백질 키나제 인산화 부위, 약 아미노산 54 내지 약 아미노산 58, 약 아미노산 68 내지 약 아미노산 72, 약 아미노산 76 내지 약 아미노산 80, 약 아미노산 94 내지 약 아미노산 98, 약 아미노산 135 내지 약 아미노산 139, 약 아미노산 150 내지 약 아미노산 154, 약 아미노산 155 내지 약 아미노산 159, 약 아미노산 161 내지 약 아미노산 165, 약 아미노산 181 내지 약 아미노산 185, 약 아미노산 190 내지 약 아미노산 194, 약 아미노산 244 내지 약 아미노산 248, 약 아미노산 310 내지 약 아미노산 314, 약 아미노산 325 내지 약 아미노산 329, 약 아미노산 346 내지 약 아미노산 350 및 약 아미노산 608 내지 약 아미노산 612의 카제인 키나제 II 인산화 부위, 약 아미노산 36 내지 약 아미노산 44 및 약 아미노산 670 내지 약 아미노산 677의 티로신 키나제 인산화 부위, 약 아미노산 38 내지 약 아미노산 44, 약 아미노산 50 내지 약 아미노산 56,약 아미노산 52 내지 약 아미노산 58, 약 아미노산 80 내지 약 아미노산 86, 약 아미노산 382 내지 약 아미노산 388, 약 아미노산 388 내지 약 아미노산 394, 약 아미노산 434 내지 약 아미노산 440, 약 아미노산 480 내지 약 아미노산 486 및 약 아미노산 521 내지 약 아미노산 527의 N-미리스토일화 부위, 및 약 아미노산 75 내지 약 아미노산 87의 아스파르트산 및 아스파라긴 수산화 부위의 존재를 입증한다.
클론 DNA33092-1202는 1997년 10월 28일자로 ATCC에 기탁하여 기탁 번호 209420을 배정받았다.
도 4 (서열 7)에 도시된 전장 서열의 WU-BLAST-2 서열 정렬 분석을 이용한 데이호프 데이타베이스(버전 35.45 스위스 프롯 35)의 분석은 PRO228 아미노산 서열과 세크레틴 관련 단백질 CD97 및 EMR1, 및 세크레틴 일원인 라트로필린 사이의 유의한 서열 동일성을 입증하였으며, 이는 PRO228이 세크레틴 관련 단백질의 신규 일원일 수 있음을 나타낸다.
(C)PRO538
발현된 서열 태그 (EST) DNA 데이타베이스 및 독점 EST 데이타베이스 (예를 들면, LIFESEQ (등록상표) (인사이트 파마슈티칼스 (Incyte Pharmaceuticals, 캘리포니아주 팔로 알토))를 조사하여 Incyte EST (INC3574209)가 쥐의 GFRα3와 61%의 서열 동일성을 갖는다는 것을 확인하였다.
cDNA 라이브러리의 제조를 위한 RNA를 인간 태아 폐조직으로부터 단리하였다. 인간 PRO538을 코딩하는 cDNA 클론을 단리하기 위해 사용된 cDNA 라이브러리는 시판 시약, 예를 들어 인비트로젠 (Invitrogen, San Diego, CA)사에서 구입한시약을 사용하여 표준 방법에 의해 제조하였다. NotI 부위를 포함하는 올리고 dT를 사용하여 cDNA를 프라이밍하고, SalI 헤미키나제화 어댑터와 블런트로 연결하고, NotI으로 절단하여 겔 전기영동에 의해 적절한 크기로 분류하고 정해진 방향으로 적합한 클로닝 벡터 (예를 들어, pRKB 또는 pRKD; pRK5B는 SfiI 부위를 포함하지 않는 pRK5D의 전구체임; 문헌 (Holmes et al.,Science,253: 1278-1280 (1991))을 참조한다) 내의 유일한 XhoI 및 NotI 부위에 클로닝하였다.
이어서, 상기한 EST 서열에 기초하여 올리고뉴클레오티드 프로브를 합성하여, 1) 관심있는 서열을 포함하는 cDNA 라이브러리의 PCR에 의한 동정에 사용하고 2) PRO538의 전장 코딩 서열의 클론을 단리시키기 위한 프로브로서 사용하였다. 전방향 및 역방향 PCR 프라이머는 일반적으로 20 내지 30개의 뉴클레오티드로 이루어지고, 종종 약 100 내지 1000 bp 길이의 PCR 산물을 제공하기 위해 고안된다. 프로브 서열은 통상 40 내지 55 bp 길이이다. 전장 클론을 위한 몇몇 라이브러리를 스크리닝하기 위해, 이들 라이브러리로부터의 DNA를 PCR 프라이머 쌍을 사용하여 문헌 (Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology, 상기 문헌)에 따라 PCR 증폭에 의해 스크리닝하였다. 이어서, 양성 라이브러리를 사용하여 프로브 올리고뉴클레오티드 및 프라이머 쌍들 중 하나를 이용하여 관심있는 유전자를 코딩하는 클론을 단리시켰다.
사용된 올리코뉴클레오티드 프로브는 다음과 같다.
전방향 PCR 프라이머5'-GCCTCTCGCAGCCGGAGACC-3' (서열 17),
역방향 PCR 프라이머5'-CAGGTGGGATCAGCCTGGCAC-3' (서열 18)
혼성화 프로브
5'-TCTCGCAGCCGGAGACCCCCTTCCCACAGAAAGCCGACTCA-3' (서열 19)
콜로니 정제 및 2차 스크리닝으로부터 순수한 양성 클론을 얻었다. 5개의 양성 클론을 동정하였다. 단리된 두개의 클론을 서열분석하였다. 이 cDNA 서열을 DNA48613-1268 및 DNA48614-1268로 명명하였다. DNA48613-1268의 전장 클론은 뉴클레오티드 위치 38 내지 40에 분명한 번역 개시 부위를 가지며 뉴클레오티드 위치 1238 내지 1240의 정지 코돈에서 종결하는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함한다 (도 5, 서열 15). 예상된 폴리펩티드 전구체는 아미노산 400개 길이이며, 추정 분자량은 약 44,511 달톤이고 추정 pI는 약 8.15이다. DNA48614-1268의 아미노산 서열은 DNA48613-1268의 아미노산 서열 (도 5, 서열 15)과 비교하여 30개의 아미노산 (개시 메티오닌으로부터 아미노산 127 내지 157)이 결실된 DNA48613-1268의 교대 스플라이싱 형태임을 확인하였다.
도 6 (서열 16)에 도시된 전장 PRO538 서열의 분석은 여러가지 중요한 폴리펩티드 도메인의 존재를 입증하며, 상기 중요한 폴리펩티드 도메인에 대한 위치는 상기에 기재된 바와 같이 대략적이다. 전장의 PRO538 서열을 분석한 결과, 약 아미노산 1 내지 약 아미노산 26의 시그날 펩티드, 약 아미노산 379 내지 약 아미노산 395의 막횡단 도메인, 약 아미노산 95 내지 약 아미노산 99, 약 아미노산 148 내지 약 아미노산 152 및 약 아미노산 309 내지 약 아미노산 313의 N-글리코실화 부위, 약 아미노산 231 내지 약 아미노산 235의 cAMP 및 cGMP 의존성 단백질 키나제 인산화 부위, 약 아미노산 134 내지 약 아미노산 138, 약 아미노산 170 내지 약아미노산 174 및 약 아미노산 202 내지 약 아미노산 206의 카제인 키나제 II 인산화 부위, 약 아미노산 279 내지 약 아미노산 285 및 약 아미노산 294 내지 약 아미노산 300의 N-미리스토일화 부위, 약 아미노산 306 내지 약 아미노산 317 및 약 아미노산 379 내지 약 아미노산 390의 원핵막 지단백질 지질 부착 부위의 존재를 입증한다.
클론 DNA48613-1268은 1998년 4월 7일자로 ATCC에 기탁하여 기탁 번호 209752를 배정받았다.
DNA48613-1268에 의해 코딩되는 도 6 (서열 16)에 도시된 전장 서열과 인간의 GFRα1 및 GFRα2 서열의 비교 결과는 인간 단백질이 GFRα수용체족의 신규 일원이고, 쥐의 GFRα3의 인간 상동체라는 것을 나타내었다. 따라서, DNA48163-1268은 인간 GFRα3으로 명명된 단백질을 코딩하고, DNA48614-1268은 그의 스플라이싱 변이체를 코딩한다.
도 6 (서열 16)에 도시된 PRO538의 전장 서열과 다른 GFRα족의 일원에 대한 BLAST-2 및 FastA 서열 정렬 분석을 이용한 데이호프 데이타베이스의 분석 결과는 표 4에 나타내었다.
GFRα족의 일원 사이의 서열 동일성
비교 단백질 동일성(%)
rGFRα1과 hGFRα1 92
rGFRα2와 hGFRα2 94
mGFRα3과 hGFRα3 77
hGFRα3과 hGFRα1 34
hGFRα3과 hGFRα2 34
hGFRα1과 hGFRα2 48
서열 비교 결과로부터, 인간 GFRα3 (PRO538)은 GFRα1 또는 GFRα2에 비해 쥐의 상동체와 연관성이 더 낮음을 알 수 있다. 또한, GFRα3 (PRO538)은 GFRα1과 GFRα2의 상호 연관성에 비해 GFRα1 및 GFRα2와 연관성이 더 먼 것으로 보인다.
(D)PRO172
스위스-프롯 (Swiss-Prot) 공용 데이타베이스로부터 약 950개의 공지된 분비형 단백질로부터의 세포외 도메인 (ECD) 서열 (존재하는 경우 분비 시그날 서열 포함)을 사용하여 EST 데이타베이스를 조사하였다. EST 데이타베이스는 공용 EST 데이타베이스 (예를 들면, 진뱅크 (GenBank))와 독점 EST 데이타베이스 (예를 들면, LIFESEQ(등록상표)(인사이트 파마슈티칼스 (Incyte Pharmaceuticals, 캘리포니아주 팔로 알토))를 포함한다. 조사는 EST 서열의 6개 프레임 번역물에 대한 ECD 단백질 서열의 비교로서 컴퓨터 프로그램 BLAST 또는 BLAST-2 [Altschul et al.,Methods in Enzymology266: 460-480 (1996)]를 이용하여 수행하였다. 공지된 단백질을 코딩하지 않는 70 (또는 몇몇 경우 90) 이상의 블라스트(Blast) 스코어를 갖는 비교물을 클러스터시키고, 프로그램 "phrap" (Phil Green, University of Washington 워싱턴주 시애틀)을 사용하여 컨센서스 DNA 서열로 어셈블링하였다.
상기한 바와 같이 phrap을 이용하여 다른 EST 서열에 대해 컨센서스 DNA 서열을 어셈블링하였다. 상기 컨센서스 서열을 본원에서 DNA28765로 명명하였다. 몇몇 경우에, 컨센서스 서열은, 상기 논의한 EST 서열원을 사용하여 가능한 한 멀리 신장시키기 위해 BLAST와 phrap의 사이클을 반복하여 신장시킨 중간 컨센서스DNA 서열로부터 유래한다.
이어서, 상기한 바와 같이 수득한 DNA28765 컨센서스 서열에 기초하여 올리고뉴클레오티드를 합성하여, 1) 관심있는 서열을 포함하는 cDNA 라이브러리의 PCR에 의한 동정에 사용하고 2), PRO1712의 전장 코딩 서열의 클론을 단리시키기 위한 프로브로서 사용하였다. 전방향 및 역방향 PCR 프라이머는 일반적으로 20 내지 30개의 뉴클레오티드로 이루어지고, 종종 약 100 내지 1000 bp 길이의 PCR 산물을 제공하도록 고안된다. 프로브 서열은 통상 40 내지 55 bp 길이이다. 몇몇 경우, 컨센서스 서열이 약 1 내지 1.5 kbp보다 큰 경우 추가의 올리고뉴클레오티드가 합성된다. 전장 클론을 위한 몇몇 라이브러리를 스크리닝하기 위해, 이들 라이브러리로부터의 DNA를 PCR 프라이머 쌍을 사용하여 문헌 (Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology,상기 문헌)에 따라 PCR 증폭에 의해 스크리닝하였다. 이어서, 양성 라이브러리를 사용하여 프로브 올리고뉴클레오티드 및 프라이머 쌍들 중 하나를 이용하여 관심있는 유전자를 코딩하는 클론을 단리시켰다.
PCR 프라이머 (전방향 및 역방향)를 합성하였다.
전방향 PCR 프라이머5'-GGATCTCGAGAACAGCTACTCC-3' (서열 22) 및
역방향 PCR 프라이머5'-TCGTCCACGTTGTCGTCACATG-3' (서열 23)
추가로, 하기 뉴클레오티드 서열을 갖는 합성 올리고뉴클레오티드 혼성화 프로브를 DNA28765 서열로부터 제조하였다.
혼성화 프로브
5'-AAATCTGTGAATTGAGTGCCATGGACCTGTTGCGGACGGCCCTTGCTT-3' (서열 24)
cDNA 라이브러리의 제조를 위한 RNA를 인간 태아 신장 조직으로부터 단리하였다. cDNA 클론을 단리하기 위해 사용된 cDNA 라이브러리는 시판 시약, 예를 들어 인비트로젠 (Invitrogen, San Diego, CA)사에서 구입한 시약을 사용하여 표준 방법에 의해 제조하였다. NotI 부위를 포함하는 올리고 dT를 사용하여 cDNA를 프라이밍하고, SalI 헤미키나제화 어댑터와 블런트로 연결하고, NotI으로 절단하여 겔 전기영동에 의해 적절한 크기로 분류하고 정해진 방향으로 적합한 클로닝 벡터 (예를 들어, pRKB 또는 pRKD; pRK5B는 SfiI 부위를 포함하지 않는 pRK5D의 전구체임; 문헌 (Holmes et al.,Science,253: 1278-1280 (1991)) 참조) 내의 유일한 XhoI 및 NotI 부위에 클로닝하였다.
상기 기재된 바와 같이 단리된 클론의 DNA 서열 분석은 전장 PRO172 폴리펩티드에 대한 전장 DNA 서열 (본원에서 DNA35916-1161 (도 7a 및 7b, 서열 20)로 명명함) 및 이로부터 유도된 PRO172 폴리펩티드의 단백질 서열을 제공한다.
상기에서 동정된 전장 클론은 뉴클레오티드 위치 38 내지 40에 분명한 번역 개시 부위를 가지며 뉴클레오티드 위치 2207 내지 2209의 정지 코돈에서 종결하는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함한다 (도 7a 및 7b, 서열 20). 예상된 폴리펩티드 전구체는 723개의 아미노산 길이다.
도 8 (서열 21)에 도시된 전장 PRO172의 서열을 분석한 결과는 여러가지 중요한 폴리펩티드 도메인의 존재를 입증하며, 상기 중요한 폴리펩티드 도메인에 대한 위치는 상기에 기재된 바와 같이 대략적이다. 전장의 PRO172 서열을 분석한 결과는 약 아미노산 1 내지 약 아미노산 21의 시그날 펩티드, 약 아미노산 548 내지약 아미노산 568의 막횡단 도메인, 약 아미노산 477 내지 약 아미노산 481의 N-글리코실화 부위, 약 아미노산 660 내지 약 아미노산 664의 cAMP 및 cGMP 의존성 단백질 키나제 인산화 부위, 약 아미노산 93 내지 약 아미노산 97, 약 아미노산 131 내지 약 아미노산 135, 약 아미노산 154 내지 약 아미노산 158, 약 아미노산 203 내지 약 아미노산 207, 약 아미노산 342 내지 약 아미노산 346, 약 아미노산 344 내지 약 아미노산 348, 약 아미노산 369 내지 약 아미노산 373, 약 아미노산 457 내지 약 아미노산 461, 약 아미노산 483 내지 약 아미노산 487, 약 아미노산 495 내지 약 아미노산 499, 약 아미노산 659 내지 약 아미노산 663, 약 아미노산 670 내지 약 아미노산 674, 약 아미노산 671 내지 약 아미노산 675 및 약 아미노산 698 내지 약 아미노산 702의 카제인 키나제 II 인산화 부위, 약 아미노산 176 내지 약 아미노산 185 및 약 아미노산 252 내지 약 아미노산 261의 티로신 키나제 인산화 부위, 약 아미노산 2 내지 약 아미노산 8, 약 아미노산 37 내지 약 아미노산 43, 약 아미노산 40 내지 약 아미노산 46, 약 아미노산 98 내지 약 아미노산 104, 약 아미노산 99 내지 약 아미노산 105, 약 아미노산 262 내지 약 아미노산 268, 약 아미노산 281 내지 약 아미노산 287, 약 아미노산 282 내지 약 아미노산 288, 약 아미노산 301 내지 약 아미노산 307, 약 아미노산 310 내지 약 아미노산 316, 약 아미노산 328 내지 약 아미노산 334, 약 아미노산 340 내지 약 아미노산 346, 약 아미노산 378 내지 약 아미노산 384, 약 아미노산 387 내지 약 아미노산 393, 약 아미노산 512 내지 약 아미노산 518, 약 아미노산 676 내지 약 아미노산 682, 약 아미노산 683 내지 약 아미노산 689 및 약 아미노산 695 내지 약 아미노산 701의 N-미리스토일화 부위, 약 아미노산 343 내지 약 아미노산 355, 약 아미노산 420 내지 약 아미노산 432 및 약 아미노산 458 내지 약 아미노산 480의 아스파르트산 및 아스파라긴 수산화 부위, 약 아미노산 552 내지 약 아미노산 563의 원핵막 지단백질 지질 부착 부위, 및 약 아미노산 243 내지 약 아미노산 255, 약 아미노산 274 내지 약 아미노산 286, 약 아미노산 314 내지 약 아미노산 326, 약 아미노산 352 내지 약 아미노산 364, 약 아미노산 391 내지 약 아미노산 403, 약 아미노산 429 내지 약 아미노산 441, 약 아미노산 467 내지 약 아미노산 479 및 약 아미노산 505 내지 약 아미노산 517의 EGF 유사 도메인 시스테인 형태 신호의 존재를 입증한다.
클론 DNA35916-1161은 1997년 10월 28일자로 ATCC에 기탁하여 기탁 번호 209419를 배정받았다.
도 8 (서열 21)에 도시된 전장 서열의 BLAST 및 FastA 서열 정렬 분석을 이용한 데이호프 데이타베이스 (버전 35.45 스위스 프롯 35)의 분석은 PRO172 아미노산 서열과 델타-1 마우스 단백질 사이에 89%의 서열 동일성을 입증하였다.
(E)PRO182
발현된 서열 태그 (EST) DNA 데이타베이스 및 독점 EST 데이타베이스 (LIFESEQ(등록상표)(인사이트 파마슈티칼스 (Incyte Pharmaceuticals, 캘리포니아주 팔로 알토))을 검색하여, 각각 릴렉신 핵산 서열의 영역과 약 40%의 상동성을 보이며 인슐린 유사 폴리펩티드의 유전자 내의 서열을 나타내는 두개의 EST 서열을 확인하였다 (Incyte EST INC2328985 및 Incyte EST INC778319). INC778319에 대응하는 EST를 전장 PRO182 유전자를 클로닝하는 데 사용하였다.
cDNA 라이브러리의 제조를 위한 RNA를 인간 자궁 조직으로부터 단리하였다. 인간 PRO182를 코딩하는 cDNA 클론을 단리하기 위해 사용된 cDNA 라이브러리는 시판 시약, 예를 들어 인비트로젠 (Invitrogen, San Diego, CA)사에서 구입한 시약을 사용하여 표준 방법에 의해 제조하였다. NotI 부위를 포함하는 올리고 dT를 사용하여 cDNA를 프라이밍하고, SalI 헤미키나제화 어댑터와 블런트로 연결하고, NotI으로 절단하여 겔 전기영동에 의해 적절한 크기로 분류하고, 정해진 방향으로 적합한 클로닝 벡터 (예를 들어, pRKB 또는 pRKD; pRK5B는 SfiI 부위를 포함하지 않는 pRK5D의 전구체임; 문헌 (Holmes et al.,Science,253: 1278-1280 (1991)) 참조) 내의 유일한 XhoI 및 NotI 부위에 클로닝하였다.
이어서, 상기한 EST 서열에 기초하여 올리고뉴클레오티드 프로브를 합성하여, 1) 관심있는 서열을 포함하는 cDNA 라이브러리의 PCR에 의한 동정에 사용하고 2) PRO182의 전장 코딩 서열의 클론을 단리시키기 위한 프로브로서 사용하였다. 전방향 및 역방향 PCR 프라이머는 일반적으로 20 내지 30개의 뉴클레오티드로 이루어지고, 종종 약 100 내지 1000 bp 길이의 PCR 산물을 제공하도록 고안된다. 프로브 서열은 통상 40 내지 55 bp 길이이다. 전장 클론을 위한 몇몇 라이브러리를 스크리닝하기 위해, 이들 라이브러리로부터의 DNA를 PCR 프라이머 쌍을 사용하여 문헌 (Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology,상기 문헌)에 따라 PCR 증폭에 의해 스크리닝하였다. 이어서, 양성 라이브러리를 사용하여 프로브 올리고뉴클레오티드 및 프라이머 쌍들 중 하나를 이용하여 관심있는 유전자를 코딩하는 클론을 단리시켰다.
사용된 올리고뉴클레오티드 프로브는 다음과 같다.
5'-CACATTCAGTCCTCAGCAAAATGAA-3' (서열 27)
5'-GAGAATAAAAACAGAGTGAAAATGGAGCCCTTCATTTTGC-3' (서열 28)
5'-CTCAGCTTGCTGAGCTTGAGGGA-3' (서열 29)
DNA27865-1091의 전장 클론은 뉴클레오티드 위치 39 내지 41에 분명한 번역 개시 부위를 가지며 뉴클레오티드 위치 444 내지 446의 정지 코돈에서 종결하는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함한다 (도 9, 서열 25). 예상된 폴리펩티드 전구체는 135개 아미노산 길이이다.
도 10 (서열 26)에 도시된 전장 PRO182 서열의 분석 결과는 여러가지 중요한 폴리펩티드 도메인의 존재를 입증하며, 상기 중요한 폴리펩티드 도메인에 대한 위치는 상기에 기재된 바와 같이 대략적이다. 전장 PRO182 서열의 분석은 약 아미노산 1 내지 약 아미노산 18의 시그날 펩티드, 약 아미노산 107 내지 약 아미노산 111의 cAMP 및 cGMP 의존성 단백질 키나제 인산화 부위, 약 아미노산 88 내지 약 아미노산 92, 약 아미노산 113 내지 약 아미노산 117 및 약 아미노산 127 내지 약 아미노산 131의 카제인 키나제 II 인산화 부위, 약 아미노산 3 내지 약 아미노산 9, 약 아미노산 52 내지 약 아미노산 58, 약 아미노산 96 내지 약 아미노산 102 및 약 아미노산 125 내지 약 아미노산 131의 N-미리스토일화 부위, 및 약 아미노산 121 내지 약 아미노산 136의 인슐린족 신호의 존재를 입증한다.
클론 DNA27865-1091은 1997년 9월 23일자로 ATCC에 기탁하여 기탁 번호 209296을 배정받았다.
도 10 (서열 26)에 도시된 전장 서열의 WU-BLAST-2 서열 정렬 분석을 이용한 데이호프 데이타베이스(버전 35.45 스위스 프롯 35)의 분석은 PRO182 아미노산 서열과 인간 인슐린 유사 폴리펩티드 사이의 서열 동일성을 나타내며, 이는 PRO182가 신규한 인간 인슐린 유사 단백질임을 나타낸다.
실시예 2:이. 콜라이에서 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 코딩 핵산의 발현
본 실시예는 이. 콜라이 내의 재조합 발현으로 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182의 비글리코실화된 형태를 제조하는 방법을 나타낸다.
처음에 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182를 코딩하는 DNA 서열을 선택된 PCR 프라이머를 이용하여 증폭하였다. 프라이머는 선택된 발현 벡터 상의 제한 효소 부위에 해당하는 제한 효소 부위를 포함해야만 한다. 여러 발현 벡터가 사용될 수 있다. 적합한 벡터의 예로는 앰피실린 및 테트라사이클린 내성 유전자를 포함하는 pBR322[이. 콜라이에서 유래; Bolivar et al.,Gene 2: 95(1977)]가 있다. 벡터를 제한 효소로 절단하고 탈인산화시켰다. 이어서, PCR 증폭된 서열을 벡터에 라이게이션하였다. 벡터는 바람직하게는 항생제 내성 유전자, trp 프로모터, 폴리His 리더 (처음 6개의 STII 코돈, 폴리His 서열 및 엔테로키나제 절단 부위를 포함), PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 코딩 부위, 람다 전사 터미네이터 및 argU 유전자를 코딩하는 서열을 포함할 것이다.
이어서, 라이게이션 혼합물을 Sambrook 등 (상기 문헌)이 기재한 방법을 이용하여 선택된 이. 콜라이 균주를 형질전환시키는데 사용하였다. LB 배지에서 성장할 수 있는 형질전환체를 확인하고 항생제 내성을 갖는 콜로니를 선택하였다. 플라스미드 DNA를 제한 분석법 및 DNA 서열 분석을 이용하여 단리, 확인하였다.
선택된 클론을 항생제가 보충된 LB 브로스와 같은 액체 배양 배지에서 밤새 배양하였다. 이 배양액을 더 큰 규묘의 배양 접종에 사용하였다. 이어서, 세포를 발현 프로모터가 작동되는 동안 원하는 광학 밀도까지 배양시켰다.
수시간 이상 동안 세포를 배양한 후에 원심분리로 세포를 회수할 수 있다. 원심분리로 얻어진 세포 펠렛을 당업계에 공지된 여러가지 시약을 이용하여 용해시키고, 단백질이 강하게 결합하는 조건 하에서 금속 킬레이팅 칼럼을 이용하여 용해된 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드를 정제할 수 있다.
PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182는 하기 과정을 이용하여 이. 콜라이에서 폴리-His 태그가 부착된 형태로 성공적으로 발현되었다. 선택된 프라이머를 사용하여 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182를 코딩하는 DNA를 처음에 증폭하였다. 프라이머는 선택된 발현 벡터 상의 제한효소 부위에 해당하는 제한 효소 부위와 효율적이고 신뢰할 만한 번역 개시, 금속 킬레이트 컬럼에서 빠른 정제, 및 엔테로키나아제를 사용한 단백질 분해 제거를 제공하는 다른 유용한 서열을 포함하였다. 이어서 PCR 증폭된, 폴리-His 태그가 부착된 서열을 발현 벡터에 라이게이션시킨 후, 균주 52 (W3110 fuhA(tonA) lon galE rpoHts(htpRts) clpP (lacIq) 기재의 이. 콜라이 숙주를 형질전환 시키는데 사용하였다. 우선 형질전환체를 50 ㎎/㎖의 카르베니실린 (carbenicillin)을 포함하는 LB 배지에서O.D.600이 3 내지 5에 도달할 때까지 30℃에서 진탕 배양하였다. 이어서, 배양액을 CRAP 배지(물 500 ㎖ 중에 3.57 g (NH4)2SO4, 0.71 g 시트르산나트륨·2H2O, 1.07 g KCl, 5.36 g 디프코 (Difco) 효모 추출물, 5.36 g 쉐필드 히카아제 (Sheffield hycase) SF, 및 110 mM MPOS, pH 7.3, 0.55% (w/v) 글루코스 및 7 mM MgSO4를 혼합하여 제조)에 50 내지 100배로 희석하고, 약 20 내지 30시간 동안 30℃에서 진탕 배양하였다. 샘플을 분리하여 SDS-PAGE 분석법으로 발현을 확인하고 대량 배양액을 원심분리하여 세포를 펠릿으로 만들었다. 세포 펠릿을 정제 및 리폴딩시킬 때까지 냉동보관하였다.
0.5 내지 1L의 이. 콜라이 페이스트 발효액 (6 내지 10 g 펠릿)을 10배 부피(w/v)의 7 M 구아니딘, 20 mM Tris, pH 8 완충액에 재현탁시켰다. 고체 아황산나트륨 및 사티온산나트륨을 각각 최종 농도 0.1 M과 0.02 M이 되도록 가하고 용액을 4℃에서 밤새 교반하였다. 이 단계에서 아황산염화에 의해 모든 시스테인 잔기가 차단된 변성 단백질이 생성되었다. 이 용액을 베크만(Beckman) 한외원심분리기에서 40,000 rpm으로 30분간 원심분리하였다. 상층액을 3 내지 5 배 부피의 금속 킬레이트 컬럼 완충액(6 M 구아니딘, 20 mM Tris, pH 7.4)으로 희석하고 0.22 ㎛ 필터로 여과하여 투명하게하였다. 투명한 추출물을 금속 킬레이트 컬럼 완충액으로 평형화된 키아젠(Qiagen) Ni-NTA 금속 킬레이트 컬럼 5 ㎖에 로딩하였다. 50 mM 이미다졸 (Calbiochem, Utrol grade)을 함유하는 추가의 완충액 (pH 7.4)으로 컬럼을 세척하였다. 250 mM 이미다졸을 함유하는 완충액으로 단백질을 용출시키고, 원하는 단백질을 포함하는 분획을 모아 4℃에 보관하였다. 아미노산 서열에 따라 계산된 흡광 계수를 이용하여 280 nm에서의 흡광도로 단백질 농도를 측정하였다.
20 mM Tris, pH 8.6, 0.3 M NaCl, 2.5 M 우레아, 5 mM 시스테인, 20 mM 글리신 및 1 mM EDTA로 이루어진, 새로이 제조한 리폴딩 완충액에 샘플을 천천히 희석하여 단백질을 리폴딩시켰다. 리폴딩 부피는 최종 단백질 농도가 50 내지 100 ㎍/㎖가 되도록 정하였다. 리폴딩 용액을 4℃에서 12 내지 36시간 가량 서서히 교반하였다. 최종농도가 0.4% (약 pH 3)가 되도록 TFA를 가하여 리폴딩 반응을 정지시켰다. 추가로 단백질을 정제하기 전에, 용액을 0.22 ㎛ 필터로 여과하고 아세토니트릴을 최종 농도 2 내지 10%가 되도록 가하였다. 10 내지 80%의 아세토니트릴 농도 구배로 용출시키코 0.1% TFA의 이동 완충액을 이용하는 포로스 (Poros) R1/H 역상 컬럼 크로마토그래피에서 리폴딩된 단백질을 분석하였다. A280흡광도가 나타나는 분획의 분액을 SDS 폴리아크릴아미드 겔에서 분석하여 균질하게 리폴딩된 단백질을 포함하는 분획을 모았다. 통상, 적절하게 리폴딩된 단백질은 역상 수지와의 상호작용으로부터 보호되는 소수성의 내부 부분으로 가장 밀착되기 때문에, 대부분의 단백질에서 적절하게 리폴딩된 단백질 형태는 아세토니트릴의 가장 낮은 농도에서 용출된다. 응집된 단백질은 대개 높은 아세토니트릴 농도에서 용출된다. 역상 단계는 바람직한 형태의 단백질로부터 잘못 폴딩된 형태의 단백질을 분리할 뿐 아니라, 샘플로부터 내독소를 제거한다.
바람직하게 폴딩된 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 단백질을 포함하는 각각의 분획을 회수하여, 용액에 부드러운 질소 기류를 사용하여 아세토니트릴을 제거하였다. 투석법이나 제제화 완충액으로 평형화되고 멸균 여과된 G25 슈퍼파인 (Superfine, Pharmacia) 수지를 이용한 겔 여과법으로 0.14 M 염화나트륨 및 4% 만니톨이 함유된 20 mM Hepes, pH 6.8로 단백질을 제제화하였다.
실시예 3: 포유동물 세포에서의 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182의 발현
본 실시예는 포유동물 세포내의 재조합 발현으로 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182의 가능한 글리코실화된 형태를 제조하는 방법을 예시한다.
벡터 pRK5 (1989. 3.15 공개된 EP 307,247 참조)를 발현 벡터로 사용하였다. 임의로, PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 DNA를 선택된 제한 효소를 사용하여 Sambrook 등(상기 문헌)이 기재한 라이게이션 방법을 이용하여 pRK5에 라이게이션시켜, PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 코딩 DNA를 삽입하였다. 생성 벡터를 pRK5-(PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 코딩 DNA)로 명명하였다.
한 실시 태양에서, 숙주 세포로서 293 세포를 선택할 수 있다. 인간 293 세포 (ATCC CCL 1573)를 태아 송아지 혈청 및 임의로 영양소 및(또는) 항생제가 보충된 DMEM와 같은 배지에서 조직 배양 플레이트에 융합 (confluent)되도록 배양하였다. 약 10 ㎍ pRK5-(PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 코딩 DNA)를 VA RNA 유전자를 코딩하는 DNA [Thimmappaya et al., Cell, 31: 543(1982)] 약 1 ㎍과혼합하여, 500 ㎕의 1 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA 및 0.227 M CaCl2에 용해시켰다. 이 혼합물에 500 ㎕의 50 mM HEPES(pH 7.35), 280 mM NaCl, 1.5 mM NaPO4를 적가하여 25℃에서 10분간 침전물을 형성시켰다. 침전물을 현탁시키고 293 세포에 첨가하여 37℃에서 약 4시간 가량을 정치시켰다. 배지를 흡인 제거하고 PBS 내의 20% 글리세롤 2 ㎖를 30초 동안 첨가하였다. 이어서, 293세포를 혈청 무첨가 배지로 세척하고 새로운 배지를 첨가하고 약 5일간 세포를 배양하였다.
트랜스펙션한지 약 24시간 후에 배지를 제거하고 배지(만으로) 또는 200 μCi/㎖35S-시스테인 및 200 μCi/㎖35S-메티오닌을 포함하는 배지로 교체하였다. 12시간 배양 후, 조건화된 배지를 회수하고 회전 필터에서 농축시켜 15% SDS 겔에 로딩하였다. 처리된 겔을 건조시키고 선택된 일정 기간동안 필름에 노출시켜 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드의 존재를 확인하였다. 트랜스펙션된 세포를 포함하는 배양액을 (혈청 무첨가 배지에서) 추가로 배양시키고 , 배지를 선택된 생물분석법으로 시험하였다.
별법으로, 문헌 [Somparyrac et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,12: 7575 (1981)]에 기재된 덱스트란 술페이트 방법을 이용하여 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 코딩 유전자를 293 세포에 일시적으로 도입시킬 수 있었다. 293 세포는 회전 플라스크에서 최고 밀도가 되도록 배양하고 700 ㎍의 pRK5-(PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 코딩 DNA)를 첨가하였다. 세포를 우선 원심분리하여 회전 플라스크로부터 농축하고 PBS로 세척하였다. DNA-덱스트란 침전물을 4시간 동안 세포 펠렛 상에서 인큐베이션하였다. 세포를 20% 글리세롤로 90초간 처리하고 조직 배양 배지로 세척한 후 다시 조직 배양 배지, 5 ㎍/㎖ 소의 인슐린 및 0.1 ㎍/㎖ 소의 트랜스페린을 포함하는 회전 플라스크에 넣었다. 약 4일 후에 조건화된 배지를 원심분리하고 여과시켜 세포와 파쇄물을 제거하였다. PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드를 코딩하는 발현된 DNA를 포함하는 시료를 농축시키고 임의의 선택된 방법, 예를 들어 투석 및(또는) 칼럼 크로마토그래피로 정제하였다.
다른 실시 태양으로, PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 코딩 유전자를 CHO 세포에 발현시킬 수 있다. pRK5-(PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 코딩 DNA)를 공지된 시약, 예를 들어 CaPO4또는 DEAE 덱스트란을 이용하여 CHO 세포에 트랜스펙션시킬 수 있다. 상기에서 언급한 것과 같이, 세포를 배양하고, 배지만으로 또는35S-메티오닌과 같은 방사성 표지를 포함하는 배지로 배양액을 교체하였다. 발현된 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드의 존재를 확인한 후, 배양 배지를 혈청 무첨가 배지로 교체하였다. 바람직하게는, 6일 가량 배양물을 인큐베이션하고 조건화된 배지를 회수하였다. 발현된 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드를 함유하는 배지를 농축하여 임의의 선택된 방법으로 정제하였다.
또한, 에피토프 태그가 부가된 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182은 CHO 숙주세포에서 발현될 수 있다. PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는PRO182 코딩 유전자는 pRK5로부터 서브클로닝할 수 있다. 서브클론의 삽입은 PCR을 통해 폴리-His 태그와 같은 선택된 에피토프 태그를 갖는 형태로 바큘로바이러스 발현 벡터에 융합될 수 있다. 폴리-His 태그가 부가된 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 코딩 유전자 삽입체는 안정한 클론을 선택하기 위해 DHFR과 같은 선택 마커를 포함하는 SV40 유도 벡터로 서브클로닝될 수 있다. 최종적으로, CHO 세포는 (상기에서와 같이) SV40 유도 벡터로 트랜스펙션될 수 있다. 발현을 확인하기 위해서 상기와 같은 방법으로 표지될 수 있다. 이어서, 발현된 폴리-His 태그된 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182를 포함하는 배양 배지를 농축하여 Ni2+-킬레이트 친화도 크로마토그래피와 같이 선택된 방법으로 정제할 수 있다.
또한, PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182를 일시적 및 안정한 발현 방법에 의해 CHO 및(또는) COS 세포에서, 또는 또다른 안정한 발현 방법에 의해 COS 세포 내에서 발현시켰다.
하기 실험 과정을 이용하여 CHO 세포 내에서 안정하게 발현시켰다. 각 단백질의 가용성 형태의 코딩 서열이 힌지, CH2 및 CH2 도메인을 포함하는 IgG1 불변 영역 서열에 융합된 IgG 구조체 (이뮤노어드헤신)로서 발현 및(또는) 폴리-His 태그가 부착된 형태로 단백질이 발현되었다.
PCR 증폭에 이어 문헌 (Ausubel et al., Current Protocols of Molecular Biology, Unit 3.16, Johnn Wiley and Sons(1997))에 기재된 표준 방법을 이용하여각 DNA를 CHO 발현 벡터에 서브클로닝하였다. CHO 발현 벡터는 목적하는 DNA의 5' 및 3'에 적합한 제한 부위를 갖도록 제조되어 cDNA의 제한 부위가 편리하게 셔틀링될 수 있게 된다. CHO 세포에서의 발현에 사용되는 벡터는 문헌 [Lucas et al.,Nucl. Acids Res. 24:9 1774-1779(1996))에 기재된 바와 같으며, 목적하는 cDNA와 디히드로폴레이트 리덕타제(DHFR)를 발현시키기 위해 SV40 초기 프로모터/인핸서를 사용하였다. DHFR 발현으로 형질감염 후에 플라스미드의 안정하게 유지되는 세포를 선별할 수 있다.
시판되는 형질감염 시약인 슈퍼펙트 (등록상표)(Superfect, Qiagen), 도스퍼 (등록상표)(Dosper) 또는 퓨진 (등록상표)(Fugene, Boehringer Mannheim)을 이용하여, 원하는 플라스미드 DNA 12 ㎍을 약 1000만개의 CHO 세포에 도입하였다. 상기 문헌(Lucas et al.)에 기재된 방법에 따라 세포를 배양하였다. 추후에 세포를 배양 및 생산하기 위해 약 3 x 10-7세포를 하기 기재된 방법에 따라 앰플에 동결시켰다.
플라스미드 DNA를 포함하는 앰플을 수조에 넣어 녹인 후 볼텍싱하여 혼합하였다. 배지 10 ㎖를 포함하는 원심분리 튜브에 피펫으로 내용물을 넣고 1000 rpm으로 5분간 원심분리하였다. 상층액을 흡입 제거하고 세포를 10 ㎖ 선택 배지(0.2 ㎛ 투석 여과된 5% 소의 태 혈청을 포함하는, 0.2 ㎛ 여과지를 통해 여과된 PS20)에 재현탁시켰다. 선택 배지 90 ㎖를 포함하는 100 ㎖ 회전 플라스크에 세포를 분주하였다. 1 내지 2일 후, 선택 배지 150 ㎖로 채워진 250 ㎖ 회전 플라스크로 세포를 옮겨 37℃에서 배양하였다. 2 내지 3일 후에 250 ㎖, 500 ㎖ 및 2000 ㎖ 회전 플라스크에 ㎖당 3 x 105개의 세포를 접종하였다. 세포 배양액을 원심 분리하여 신선한 배지로 교환하고 생산 배지에 재현탁하였다. 임의의 적합한 CHO 배지를 사용할 수 있으나, 미국 특허 제5,122,469호 (1992년 6월 16일)에 기재된 생산 배지를 실제로 사용하였다. 3 L 생산 회전 플라스크에 1.2 x 106세포/㎖가 되도록 접종하였다. 제0일에 세포 수와 pH를 측정하였다. 제1일에 회전 플라스크에서 샘플을 취해 여과된 공기의 살포를 개시하였다. 제2일에 회전 플라스크에서 샘플을 취해 온도를 33℃로 바꾸고 500 g/L-글루코스 30 ㎖ 및 10% 소포제 0.6 ㎖(예를 들어, 35% 폴리디메틸 실록산 유상액, Dow Corning 365 의약 등급 유상액)을 가하였다. 전체 생산기 동안, 필요에 따라 pH를 약 7.2가 유지되도록 조절하였다. 10일 후 또는 생존률이 70% 미만으로 떨어질 즈음 세포 배양액을 원심분리로 회수하고 0.22 ㎛ 필터에 여과시켰다. 여과액을 4℃에 보관하거나 정제용 컬럼에 즉시 로딩하였다.
폴리-His 태그된 구조물의 경우, Ni-NTA 컬럼 (Qiagen)을 이용하여 단백질을 정제하였다. 정제하기 전에 이미다졸을 5 mM 농도로 조건화된 배지에 가하였다. 0.3 M NaCl 및 5 mM 이미다졸을 포함하는 20 mM Hepes, pH 7.4 완충액으로 평형화된 Ni-NTA 컬럼 6 ㎖에 4℃에서 4 내지 5 ㎖/분의 유속으로 조건화된 배지를 주입하였다. 로딩 후에 컬럼을 추가의 평형 완충액으로 세척하고, 0.25 M 이미다졸을 포함하는 평형 완충액으로 단백질을 용출하였다. 이어서, 고도로 정제된 단백질을25 ㎖의 G25 슈퍼파인(Pharmacia) 컬럼을 통해 10 mM Hepes, 0.14 M NaCl 및 4% 만니톨을 함유하는 저장 완충액(pH 6.8)중으로 염을 제거하고 -80℃에서 보관하였다.
조건화된 배지로부터 이뮤노어드헤신(Fc 포함) 구조물을 하기와 같이 정제하였다. 조건화된 배지를 20 mM 인산 나트륨 완충액(pH 6.8)으로 평형화된 단백질 A 컬럼(Pharmacia) 5 ㎖에 주입하였다. 로딩 후, 컬럼을 평형 완충액으로 세척하고 100 mM 시트르산(pH 3.5)으로 용출하였다. 용출된 단백질을 275 ㎕의 1 M Tris 완충액(pH 9)을 포함하는 튜브에 1 ㎖ 분획으로 회수하여 즉시 중화시켰다. 이어서, 고도로 정제된 단백질을 폴리-His 태그된 단백질의 경우에 대해 상기 기재된 바와 같이 저장 완충액(pH6.8) 중으로 염을 제거하였다. SDS-PAGE와 에드만 분해법으로 수행되는 N-말단 아미노산 서열 분석으로 단백질의 균일함을 확인하였다.
PRO211, PRO172 및 PRO182는 상기한 방법에 의해 CHO 세포에서 안정하게 발현되었다. 또한 PRO172는 일시적인 발현 방법에 의해 CHO 세포에서 발현되었다.
실시예 4: PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드의 효모에서의 발현
다음 방법은 효모에서 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 코딩 유전자의 재조합 발현을 기재하고 있다.
우선, ADH2/GAPDH 프로모터로부터 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182의 세포내 생산 또는 분비를 위한 효모 발현 벡터를 제조하였다. PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 코딩유전자의 직접적인 세포내 발현을 위해, PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 코딩유전자 및 프로모터를 선택된 플라스미드의 적합한 제한 효소 부위에 삽입하였다. 분비의 경우, PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 코딩유전자 발현을 위해 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182를 코딩하는 DNA를 ADH2/GAPDH 프로모터, 천연 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 시그날 펩티드 또는 다른 포유동물의 시그날 펩티드, 예를 들어 효모 알파-인자 또는 인버타제 분비 시그날/리더 서열 및 링커 서열(필요한 경우)을 코딩하는 DNA와 함께 선택된 플라스미드에 클로닝할 수 있다.
이어서, 효모 세포, 예를 들어 효모 균주 AB110을 상기에서 기재된 발현 플라스미드로 형질전환 시키고 선택된 발효 배지에서 배양할 수 있다. 형질 전환된 효모 상등액을 10% 트리클로로아세트산으로 침전시키고 SDS-PAGE로 분리한 후 겔을 쿠마시 블루로 염색하여 분석할 수 있다.
계속해서, 원심분리에 의해 발효 배지로부터 효모 세포를 회수하고 선택된 카트리지 필터를 이용하여 배지를 농축시켜 재조합 PPRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182를 단리하고 정제할 수 있다. PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182를 함유하는 농축액을 선택된 칼럼 크로마토그래피 수지를 이용하여 추가로 정제할 수 있다.
실시예 5:바큘로바이러스 감염 곤충 세포 내에서 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182의 발현
다음 방법은 바큘로바이러스 감염 곤충 세포 내에서 재조합 발현에 대하여 기재하고 있다.
PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182의 코딩 서열을 바큘로바이러스발현 벡터에 포함된 에피토프 태그의 상류에 융합시켰다. 상기의 에피토프 태그는 폴리-His 태그 및 면역글로블린 태그 (IgG의 Fc 영역과 같이)를 포함한다. 시판되는 플라스미드, 예를 들어 pVL1393 (Novagen)에서 유도된 플라스미드를 포함하여 여러 플라스미드를 사용할 수 있다. 간략하게, PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 코딩 서열 또는 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 코딩 서열의 원하는 부분, 예를 들어 막횡단 단백질의 세포외 도메인 또는 세포외 단백질인 경우 성숙 단백질 코딩하는 서열을 5' 및 3' 영역에 상보적인 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하였다. 5' 프라이머는 인접한 (선택된) 제한 효소 부위를 포함할 수 있다. 이어서 생산물을 선택된 제한 효소로 절단하여 발현 벡터에 서브클로닝하였다.
재조합 바큘로바이러스는 리포펙틴 (GIBCO-BRL로부터 구입)을 이용하여 상기의 플라스미드 및 BaculoGold™ 바이러스 DNA (Pharmingen)를 스포돕테라 프루기페르다 ("Sf9") 세포 (ATCC CRL 1711)에 동시에 트랜스펙션시켜 생성되었다. 28℃에서 4 내지 5일 배양 후에, 방출된 바이러스를 회수하여 이후의 증폭에 사용하였다. 바이러스 감염 및 단백질 발현은 문헌 [O'Reilley et al.,Baculovirus Expression vectors: A laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994)]에 따라 수행하였다.
이어서, 발현된 폴리-his 태그된 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182는 예를 들어 Ni2+-킬레이트 친화도 크로마토그래피로 다음과 같이 정제될 수있다. 추출액을 문헌 [Rupert et al.,Nature,362: 175-179(1993)]에 따라 재조합 바이러스-감염된 Sf9 세포로부터 제조한다. 간략하게, Sf9 세포를 세척하여 초음파 처리 완충액 (25 ㎖ Hepes, pH 7.9; 12.5 mM MgCl2; 0.1 mM EDTA; 10% 글리세롤; 0.1% NP-40; 0.4 M KCl)에 재현탁시키고 빙상에서 20초간 2회 초음파 처리하였다. 초음파 처리물을 원심분리로 제거하고 상등액을 로딩 완충액 (50 mM 인산염, 300 mM NaCl, 10% 글리세롤, pH 7.8)에 50배 희석하여 0.45 ㎛ 필터로 여과시켰다. Ni2+-NTA 아가로즈 칼럼 (Qiagen으로부터 구입)을 5 ㎖ 베드 부피로 준비하여 물 25 ㎖로 세척하고 로딩 완충액 25 ㎖로 평형화시켰다. 여과시킨 세포 추출물을 분당 0.5 ㎖로 칼럼에 로딩하였다. 점 분획 회수를 개시할 때 칼럼을 로딩 완충액으로 A280기준선까지 세척하였다. 다음으로, 2차 세척 완충액(50 mM 인산염; 300 mM NaCl, 10% 글리세롤, pH 6.0)으로 칼럼을 세척하여 비특이적으로 결합된 단백질을 용출시켰다. A280이 기준선에 다시 도달하면, 칼럼을 2차 세척 완충액에 0 내지 500 mM 이미다졸 구배로 전개시켰다. 1 ㎖ 분획을 회수하여 SDS-PAGE 및 은 염색 또는 알카리 포스파타제에 결합된 Ni2+-NTA(Qiagen)로 웨스턴 블롯팅하여 분석하였다. 용출된 His10태그가 부가된 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182를 포함하는 분획을 모아 로딩 완충액에 대해 투석하였다.
별법으로, IgG 태그가 부가된 (또는 Fc 태그가 부가된) PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182의 정제는 공지된 크로마토그래피 기술, 예를 들어 단백질 A 또는 단백질 G 칼럼 크로마토그래피를 이용하여 수행하였다.
이어서 각각의 코딩 서열의 PCR 증폭 후에 바큘로바이러스 발현 벡터 (IgG 융합체의 경우 pb.PH.IgG 및 폴리-His 태그가 부가된 단백질의 경우 pb.PH.His.c)에 서브클로닝하였으며, 리포펙틴 (GIBCO-BRL)을 이용하여 벡터 및 BaculoGold™ 바큘로 바이러스 DNA (Pharmingen)를 105 스포돕테라 프르기페르다 (Sf9) 세포 (ATCC CRL 1711)에 동시에 트랜스펙션시켰다. pb.PH.IgG 및 pb.PH.His는 His 서열 또는 Fc 태그 서열을 포함하는 변형된 폴리링커 부위를 포함시킨 시판되는 바큘로바이러스 발현 벡터 pVL1393 (Pharmingen)의 변형이다. 세포를 10% FBS (Hyclone)가 보충된 Hink's TNM-FH 배지에서 세포를 배양하였다. 세포를 28℃에서 5일간 배양하였다. 상등액을 회수하고 계속해서 10% FBS로 보충된 Hink's TNM-FH 배지 중의 Sf9 세포를 감염 배수(MOI)가 약 10이 되도록 감염시켜 제1 바이러스 증폭에 사용하였다. 세포를 28℃에서 3일간 배양하였다. 상등액을 회수하여, 히스티딘 태그가 부가된 단백질의 경우 25 ㎖의 Ni2+-NTA 비드 (QIAGEN) 또는 IgG 부가된 단백질의 경우 단백질 A 세파로스 CL-4B 비드 (Pharmacia)에 1 ㎖의 상등액을 배치 결합시킨 후 SDS-PAGE 분석을 실시하여 쿠마시 블루 염색으로 이미 공지된 농도의 표준 단백질과 비교하여 바큘로바이러스 발현 벡터 내의 구조물의 발현을 측정하였다.
제1 바이러스 증폭 상등액을 ESF-921 배지 (Expression Systems LLC)에서 MOI가 약 0.1이 되도록 배양된 Sf9 세포의 스피너 배양액 (500 ㎖)을 감염시키는데사용하였다. 세포를 28℃에서 3일간 배양하였다. 상등액을 회수하여 여과하였다. 스피너 배양액의 발현이 확인될 때까지 필요한 만큼 배치 결합 및 SDS-PAGE 분석을 반복하였다.
트랜스펙션된 세포 (0.5 내지 3 ℓ)의 조건화된 배지를 원심분리하여 세포를 제거하고 0.22 ㎛ 필터로 여과하였다. 폴리-His 태그가 부가된 구조물은 Ni2+-NTA 칼럼 (Qiagen)을 이용하여 정제하였다. 정제하기 전에 이미다졸을 5 mM 농도가 되도록 조건화된 배지에 첨가하였다. 조건화된 배지를 0.3 M NaCl 및 5 mM 이미다졸을 함유하는 20 mM Hepes 완충액 (pH 7.4)으로 평형화된 6 ㎖ Ni2+-NTA 칼럼에 4℃에서 4 내지 5 ㎖/분의 유속으로 로딩하였다. 로딩 후에 칼럼을 추가의 평형 완충액으로 세척하고 단백질을 0.25 M 이미다졸을 포함하는 평형 완충액으로 용출하였다. 이어서 고도로 정제된 단백질을 25 ㎖의 G25 수퍼파인 (Pharmacia) 칼럼으로 10 mM Hepes, 0.14 M NaCl 및 4% 만니톨을 함유하는 저장 완충액 (pH6.8)에서 염을 제거하고 -80℃에서 보관하였다.
단백질의 면역어드헤신 (Fc 포함) 구조체는 다음과 같이 조건화된 배지로부터 정제하였다. 조건화된 배지를 20 mM 인산 나트륨 완충액 (pH 6.8)로 평형화된 5 ㎖의 단백질 A 칼럼 (Pharmacia)에 로딩하였다. 로딩후, 평형 완충액으로 광범위하게 세척하고 100 mM 시트르산 (pH 3.5)으로 용출하였다. 용출된 단백질을 275 ㎖의 1 M Tris 완충액 (pH 9)을 포함하는 튜브에 1 ㎖ 분획으로 회수하여 즉시 중화시켰다. 이어서 고도로 정제된 단백질을 상기에 기재된 폴리-His 태그가 부가된단백질의 경우와 같이 저장 완충액에서 염을 제거하였다. 단백질의 균일성을 SDS-PAGE와 에드만 분해법으로 수행되는 N-말단 아미노산 서열 분석으로 확인하였다.
PRO228, PRO538 및 PRO172를 바큘로바이러스 감염된 Sf9 곤충세포에서 발현하였다.
별법으로, 변형된 바큘로바이러스 방법은 high-5 세포에 사용될 수 있다. 본 방법에서, 원하는 서열을 코딩하는 DNA를 적합한 시스템, 예를 들어 Pfu (Stratagene)를 이용하여 증폭할 수 있거나, 또는 바큘로바이러스 발현 벡터에 함유된 에피토프 태그의 상류 (5')와 융합할 수 있다. 상기 에피토프 태그에는 폴리-His 태그 및 면역글로불린 태그 (IgG의 Fc 영역과 같이)가 포함된다. 시판되는 플라스미드, 예를 들어 pIE1-1 (Novagen)에서 유도된 플라스미드를 포함하여 여러 플라스미드를 사용할 수 있다. pIE1-1 및 pIE1-2 벡터는 안정하게 형질전환된 곤충 세포 (1) 내에서 바쿨로바이러스 ie1 프로모터로부터 재조합 단백질을 구성적으로 발현하도록 고안되었다. 두 플라스미드는 다중 클로닝 부위의 방향만이 상이하고 비감염된 곤충 세포의 ie1 매개 유전자 발현에 중요한 것으로 알려진 모든 프로모터 서열 및 hr5 인핸서 성분을 포함한다. pIE1-1 및 pIE1-2는 번역 개시 부위를 포함하고 융합 단백질을 생산하는데 사용될 수 있다. 간략하게, 원하는 서열 또는 서열의 원하는 부분, 예를 들어 막횡단 단백질의 세포외 도메인을 코딩하는 서열을 5' 및 3' 영역에 상보적인 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하였다. 5' 프라이머는 인접한 (선택된) 제한 효소 부위를 포함할 수 있다. 이어서 생산물을 선택된 제한 효소로 절단하여 발현 벡터에 서브클로닝하였다. 예를 들어, pEI1-1의유도체는 원하는 서열의 하류 (3')에 인간 IgG (pb.PH.IgG)의 Fc 영역 또는 8 히스티틴 (pb.PH.His) 태그를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 벡터 구조물은 확인하기 위해 서열분석된다.
High-5 세포는 CO2, NO pen/strep 부재의 27℃의 조건 하에서 50%의 융합도 (confluency)로 배양하였다. 각 150 mm 플레이트에 대해, 30 μg의 서열을 함유하는 PIE 기재 벡터를 1 ㎖의 Ex-Cell 배지 (Ex-Cell 401 + 1/100 L-Glu JRH Biosciences #14401-78P, 감광성임에 주의)와 혼합하고, 별개의 시험관에서 100 ㎕의 셀펙틴 (CellFECTIN, GIBCO-BRL #10362-010로부터 구입, 볼텍싱 혼합)을 1 ㎖의 Ex-Cell 배지와 혼합하였다. 두 용액을 혼합하여 실온에서 15분간 인큐베이션하였다. 8 ㎖의 Ex-Cell 배지를 2 ㎖의 DNA/셀펙틴 혼합물에 첨가하고 Ex-Cell 배지로 1회 세척한 high-5 세포 상을 덮었다. 이어서, 플레이트를 실온에서 1시간 동안 암실에서 인큐베이션하였다. 이어서, DNA/셀펙틴 혼합물을 흡출기로 제거하고 세포를 Ex-Cell로 1회 세척하여 과잉의 셀펙틴을 제거하였다. 30 ㎖의 새로운 Ex-Cell 배지를 첨가하고 세포를 28℃에서 3일간 배양하였다. 상등액을 회수하여, 히스티딘 태그가 부가된 단백질의 경우 25 ㎖의 Ni2+-NTA 비드 (QIAGEN) 또는 IgG 부가된 단백질의 경우 단백질 A 세파로스 CL-4B 비드 (Pharmacia)에 1 ㎖의 상등액을 배치 결합시킨 후 SDS-PAGE 분석을 실시하여 쿠마시 블루 염색으로 이미 공지된 농도의 표준 단백질과 비교하여 바큘로바이러스 발현 벡터 내의 서열의 발현을 측정하였다.
트랜스펙션된 세포 (0.5 내지 3 ℓ)의 조건화된 배지를 원심분리하여 세포를 제거하고 0.22 ㎛ 필터로 여과하였다. 폴리-His 태그가 부가된 구조물은 Ni2+-NTA 칼럼 (Qiagen)을 이용하여 서열을 포함하는 단백질을 정제하였다. 정제하기 전에 이미다졸을 5 mM 농도가 되도록 조건화된 배지에 첨가하였다. 조건화된 배지를 0.3 M NaCl 및 5 mM 이미다졸을 함유하는 20 mM Hepes 완충액 (pH 7.4)으로 평형화된 6 ㎖ Ni2+-NTA 칼럼에 4℃에서 4 내지 5 ㎖/분의 유속으로 로딩하였다. 로딩 후에 칼럼을 추가의 평형 완충액으로 세척하고 단백질을 0.25 M 이미다졸을 포함하는 평형 완충액으로 용출하였다. 이어서 고도로 정제된 단백질을 25 ㎖의 G25 수퍼파인 (Pharmacia) 칼럼으로 10 mM Hepes, 0.14 M NaCl 및 4% 만니톨을 함유하는 저장 완충액 (pH6.8)에서 염을 제거하고 -80℃에서 보관하였다.
단백질의 면역어드헤신(Fc 포함) 구조체는 다음과 같이 조건화된 배지로부터 정제하였다. 조건화된 배지를 20 mM 인산 나트륨 완충액 (pH 6.8)로 평형화된 5 ㎖의 단백질 A 칼럼 (Pharmacia)에 로딩하였다. 로딩후, 평형 완충액으로 광범위하게 세척하고 100 mM 시트르산 (pH 3.5)으로 용출하였다. 용출된 단백질을 275 ㎖의 1 M Tris 완충액 (pH 9)을 포함하는 튜브에 1 ㎖ 분획으로 회수하여 즉시 중화시켰다. 이어서 고도로 정제된 단백질을 상기에 기재된 폴리-His 태그가 부가된 단백질의 경우와 같이 저장 완충액에서 염을 제거하였다. 단백질의 균일성을 SDS 폴리아크릴아미드 겔과 에드만 분해법 및 원하는 경우 또는 필요한 경우 기타 분석 방법에 의해 수행되는 N-말단 아미노산 서열 분석으로 확인하였다.
PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 및 PRO302를 high-5 세포를 사용하는 상기의 변형된 바큘로바이러스 방법에 의해 발현하였다.
실시예 6:PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182에 결합하는 항체의 제조
본 실시예는 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182에 특이적으로 결합할 수 있는 모노클로날 항체를 제조하는 방법이다.
모노클로날 항체를 생산하는 기술은 당업계에 공지되어 있으며 예를 들어 상기의 문헌(Goding)에 기재되어 있다. 이용될 수 있는 면역원에는 본 발명의 정제된 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182, PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182를 포함하는 융합 단백질 및 세포 표면에 재조합 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182를 발현하는 세포를 포함한다. 숙련자는 불필요한 실험없이도 면역원을 선택할 수 있다.
마우스, 예를 들어 Balb/c를 프로인드 완전 보조액에 유화된 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 면역원 1 내지 100 ㎍을 피하 또는 복강내 주사하여 면역시켰다. 별법으로, 면역원을 MPL-TDM 보조액(Ribi Immunochemical Research, Hamilton, MT)에 유화시켜 동물의 뒷발바닥에 주사하여 면역화하였다. 이어서 면역된 마우스를 10 내지 12 일 후에 선택된 보조제 내에 유화된 추가의 면역원으로 부스팅하였다. 그 이후, 수주 동안 마우스를 추가 면역 주사로 부스팅할 수 있다. 역회전 출혈법으로 마우스로부터 혈청 시료를 주기적으로 채취하여, ELISA 분석법을 시험하여 항 PRO211, 항 PRO228, 항 PRO538, 항 PRO172 또는 항 PRO182 항체를 검출하였다.
적합한 항체 역가가 검출되면, 항체에 대해 "양성"인 동물에게 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182를 최종 정맥주사하였다. 3 내지 4일 후에 마우스를 희생시켜 비장 세포를 회수한다. 이어서, 비장 세포를 선택된 쥐의 골수종 세포주, 예를 들어 ATCC 번호 CRL 1597로부터 이용 가능한 P3X63AgU.1와 융합시켰다 (35% 폴리에틸렌 글리콜 이용). 융합체는 하이브리도마 세포를 생성하였으며, 이어서 이를 비 융합 세포, 골수종 하이브리드 및 비장세포 하이브리드의 증식을 억제하는 HAT(하이포잔틴, 아미노프테린 및 티미딘) 배지를 포함하는 96 웰 조직 배양 플레이트에 플레이팅시킬 수 있다.
하이브리도마 세포를 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182에 대한 반응성을 위한 ELISA로 스크리닝할 수 있다. PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182에 대한 목적하는 모노클로날 항체를 분비하는 "양성" 하이브리도마 세포를 결정하는 방법은 당업계의 숙련자에게 잘 알려져 있다.
양성 하이브리도마 세포는 동계의 Balb/c 마우스가 항 PRO211, 항 PRO228, 항 PRO538, 항 PRO172 또는 항 PRO182 모노클로날 항체를 포함하는 복수를 생산하도록 복강 내에 주사될 수 있다. 별법으로, 하이브리도마 세포는 조직 배양 플라스크 또는 롤러병에서 배양될 수 있다. 복수 내에서 생성된 모노클로날 항체는 황산암모늄 침전, 이어서 겔 배제 크로마토그래피를 이용하여 정제될 수 있다. 별법으로, 항체의 단백질 A 또는 단백질 G 결합을 기초로 하는 친화도 크로마토그래피를 이용할 수도 있다.
실시예 7: 특이적 항체를 사용한 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드의 정제
천연 또는 재조합 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드를 단백질 정제 분야의 다양한 표준 기법으로 정제할 수 있다. 예를 들면, 프로(pro)-PRO211, 프로-PRO228, 프로-PRO538, 프로-PRO172 또는 프로-PRO182 폴리펩티드, 성숙 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드 또는 프리(pre)-PRO211, 프리-PRO228, 프리-PRO538, 프리-PRO172 또는 프리-PRO182 폴리펩티드를 관심있는 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드에 특이적인 항체를 사용하는 면역친화성 크로마토그래피로 정제한다. 일반적으로, 면역친화성 칼럼은 항 PRO211, 항 PRO228, 항 PRO538, 항 PRO172 또는 항 PRO182 폴리펩티드 항체를 활성화된 크로마토그래피 수지에 공유 결합적으로 커플링시킴으로써 제작된다.
폴리클론 면역글로불린은 면역 혈청으로부터 황산암모늄으로 침전시키거나, 고정화 Protein A (Pharmacia LKB Biotechnology (뉴저지주 피츠카타웨이)) 상에서 정제하여 제조하였다. 유사하게, 모노클로날 항체는 생쥐 복수액으로부터 황산암모늄 침전법 또는 고정화 Protein A 상의 크로마토그래피에 의해 제조하였다. 부분적으로 정제된 면역글로불린을 CnBr-활성화 SEPHAROSE™ (Pharmacia LKB Biotechnology)와 같은 크로마토그래피 수지에 공유적으로 부착시켰다. 항체를 수지에 커플링시키고, 수지를 블록킹시키고, 유도된 수지를 제조업자의 지시에 따라 세척하였다.
이러한 면역친화성 칼럼은 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드를 가용성 형태로 포함하는 세포로부터 분획을 제조함으로써 PRO 폴리펩티드의 정제에 이용된다. 이 제제는 세제 첨가에 의해 또는 당업계에 잘 알려져 있는 다른 방법에 의한 완전세포의 가용화 또는 차등 원심분리를 통해 수득한 세포하 분획의 가용화에 의해 유도된다. 별법으로, 시그날 서열을 포함하는 가용형 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드가 유용한 양으로 세포가 성장하는 배지 내로 분비될 수 있다.
가용형 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드 함유 제제를 면역친화성 칼럼 상으로 통과시키고, 칼럼을 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드의 차별적인 흡수를 허용하는 조건 (예를 들면, 세제의 존재 하에 고이온 농도 완충액) 하에 세척하였다. 이어서, 칼럼을 항체/PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드 결합을 파괴시키는 조건 (예를 들면, 약 pH 2-3과 같은 저 pH 완충액 또는 고농도의, 요소 또는 티오시아네이트 이온과 같은 카오트로프(chaotrope)) 하에 용출시키고, PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드를 회수하였다.
실시예 8 : 약물 스크리닝
본 발명은 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드 또는 그의 결합 단편을 사용하여 임의의 다양한 약물 스크리닝 기법으로 화합물을 스크리닝하는데 특히 유용하다. 이러한 시험에 사용된 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드 또는 단편은 용액 중에 유리되어 있거나, 고상 지지체에 고착되거나, 세포 표면에서 유지되거나, 세포내에 위치할 수 있다. 약물 스크리닝의 한 방법에서는 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드 또는 단편을 발현하는 재조합 핵산을 사용하여 안정하게 형질전환된 진핵 또는 원핵 숙주 세포를 이용한다. 약물을 경쟁적 결합 분석으로 그러한 형질전환된 세포에 대해 스크리닝하였다. 생존형 또는 고정형의 그러한 세포는 표준 결합 분석을 위해 사용할 수 있다. 예를 들면, PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드 또는 단편과 시험되는 활성 물질 사이의 복합체 형성을 측정할 수 있다. 별법으로, 시험되는 활성 물질의 의해 유발된 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드와 그의 표적 세포 또는 표적 수용체 사이의 복합체 형성의 감소를 검사할 수 있다.
따라서, 본 발명은 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드-관련 질환 또는 장애에 영향을 끼칠 수 있는 약물 또는 임의의 다른 활성 물질을 스크리닝하기 위한 방법을 제공한다. 이들 방법은 그러한 활성 물질을 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드 또는 그의 단편과 접촉시키고, 당업계에 잘 알려진 방법으로 (i) 활성 물질와 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드 또는 단편 사이의 복합체의 존재 또는 (ii) PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드 또는 단편과 세포 사이의 복합체의 존재에 대해 분석하는 것을 포함한다. 이러한 경쟁적 결합 분석에서, PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드 또는 단편은 대개 표지화시킨다. 적합한 인큐베이션 후, 유리 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드 또는 단편을 결합형으로 존재하는 것으로부터 분리시키며, 유리또는 비복합된 표지의 양은 특정 활성 물질의 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드에 결합하는 능력 또는 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드/세포 복합체를 저해하는 능력의 척도이다.
다른 약물 스크리닝 기법은 폴리펩티드에 적합한 결합 친화도를 갖는 화합물에 대한 고처리량 스크리닝을 제공하고, WO84/03564 (1984. 9. 13일자 공개)에 상세히 기재되어 있다. 간단히 서술하면, 다수의 상이한 작은 펩티드 시험 화합물을 플라스틱 핀 또는 몇몇 다른 표면과 같은 고상 기질 상에 합성한다. PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드에 적용시켜, 펩티드 시험 화합물을 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드와 반응시키고 세척한다. 결합된 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드는 당업계에 잘 공지된 방법으로 검출한다. 정제된 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드는 또한 상기 언급한 약물 스크리닝 기법에 사용하기 위해 평판 상에 직접 코팅될 수 있다. 또한, 비중화 항체를 사용하여 펩티드를 포획하여 이를 고상 지지체 상에 고정시킬 수 있다.
본 발명은 또한 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드에 결합할 수 있는 중화 항체가 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드 또는 그의 단편에 결합하는데 있어서 시험 화합물과 특이적으로 경쟁하는 경쟁적 약물 스크리닝 분석의 이용을 고려한다. 이러한 방식으로, 항체를 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드와 하나 이상의 항원 결정자를 공유하는 임의의 펩티드의 존재를 검출하기 위해 사용할 수 있다.
실시예 9: 합리적인(rational) 약물 디자인
합리적 약물 디자인의 목표는 관심있는 생물 활성 폴리펩티드 (즉, PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드) 또는 이들이 상호작용하는 작은 분자, 예를 들면, 아고니스트, 길항제 또는 억제제의 구조적 동족체를 생산하는 것이다. 이들 예 중 임의의 것들을 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드의 보다 활성적이거나 보다 안정한 형태인 약물, 또는 생체내 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드의 기능을 강화하거나 저해하는 약물을 형성하기 위해 이용할 수 있다 (문헌[호드슨 (Hodgson),Bio/Technology,9: 1921 (1991)] 참조).
한 연구에서, PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드 또는 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드-억제제 복합체의 3차원 구조를 x-선 결정법, 컴퓨터 모델링 또는 가장 전형적으로 상기 두 방법의 조합에 의해 결정한다. 분자의 구조를 밝히고 활성 부위(들)을 결정하기 위해 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드의 형태와 전하 모두를 확인해야 한다. 덜 빈번하지만, PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드의 구조에 관한 유용한 정보는 동일성 단백질의 구조를 기준으로 모델링함으로써 얻을 수 있다. 두 경우 모두, 관련 구조 정보를 동족 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드 유사 분자를 디자인하거나 유효한 억제제를 확인하기 위해 사용한다. 합리적 약물 디자인의 유용한 예는 문헌[블락스톤(Braxton) 및 웰스(Wells),Biochemistry, 31:7796-7801 (1992)]에 나타낸 바와 같이 활성 또는안정성을 증진시킨 분자, 또는 문헌[아타우다(Athauda) 등,J. Biochem.,113:742-746 (1993)]에 나타낸 바와 같이 천연 펩티드의 억제제, 아고니스트 또는 길항제로서 작용하는 분자를 포함할 수 있다.
표적-특이적 항체를 단리하고, 상기한 바와 같이 기능 분석에 의해 선택한 다음, 그의 결정 구조를 해석하는 것도 가능하다. 이 방법으로 원칙적으로 후속적인 약물 디자인이 기준이 될 수 있는 파마코어(pharmacore)를 얻는다. 단백질 결정법 기능성 약리 활성 항체에 대한 항-유전형 항체 (항-id)를 생산함으로써 단백질 결정법을 모두 회피하는 것도 가능하다. 거울상의 거울상으로서, 항-id의 결합 부위는 원래 수용체의 동족체일 것으로 기대될 것이다. 이어서, 항-id를 사용하여 화학적 또는 생물학적으로 생산된 펩티드 뱅크로부터 펩티드를 확인하고 단리시킬 수 있을 것이다. 이어서, 단리된 펩티드는 파마코어로서 작용할 것이다.
본 발명에 의해, x-선 결정법과 같은 분석적 연구를 수행하기 위해 충분한 양의 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드를 이용가능하게 할 수 있다. 또한, 본원에 제공된 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드 아미노산 서열 지식은 x-선 결정법 대신 또는 그에 덧붙여 컴퓨터 모델링 기법을 이용하는데 지침을 제공할 것이다.
실시예 10: 시험관내 항종양 분석법
PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 및 PRO182 폴리펩티드의 항증식 활성은 문헌 [Skehan et al.,J. Natl. Cancer Inst.,82:1107-1112 (1990)]에 필수적으로 기재되어 있는 설포르호다민 B (SRB) 염료 결합 분석법을 이용하는, 국립 암 연구소 (NCI)의 질환에 대한 시험관내 항암 연구 약물 발견 분석법으로 측정하였다. 본 연구에 사용된 60 가지의 종양 세포주 ("NCI 패널") 및 이들 세포주의 유지 및 시험관내 배양 방법은 문헌 [Monks et al.,J. Natl. Cancer Inst.,83:757-766 (1991)]에 기재되어 있다. 본 스크리닝의 목적은 상이한 종양 형태에 대해 시험 화합물의 세포독성 및(또는) 세포억제 활성을 초기에 평가하기 위한 것이다 [Monks et al., 상기 문헌, Boyd,Cancer:Princ. Pract. Oncol. Update,3(10):1-12 (1989)].
대략 60 가지의 인간 종양 세포주의 세포를 트립신/EDTA (Gibco)으로 배양하고 1회 세척한 후 IMEM에 재현탁시켜 생존도를 측정하였다. 세포 현탁액을 각각의 96 웰 마이크로타이터 플레이트에 피펫으로 첨가하였다 (100 ㎕ 부피). 6일 인큐베이션한 후 세포 밀도가 2일 인큐베이션 후보다 낮도록 과증식을 억제시켰다. 접종물을 안정화시키기 위해 37℃에서 24시간 동안 예비인큐베이션하였다. 두배의 원하는 시험 농도 희석액을 웰 100 ㎕ 분취액으로 0시에 마이크로타이터 플레이트에 첨가하였다 (1:2 희석). 시험 화합물을 5개의 1/2 로그 희석 농도 (1000 내지 100,000 배)에서 평가하였다. 5% CO2분위기 및 100% 습도에서 2일 및 6일 인큐베이션하였다.
인큐베이션 후, 배지를 제거하고 세포를 40℃에서 10% 트리클로로아세트산 0.1 ㎖에 고정시켰다. 플레이트를 탈이온수로 5회 세척하고, 건조시켜 1% 아세트산중에 용해시킨 0.4% 설포르호다민 B 염료 (Sigma) 0.1 ㎖로 염색하고, 1% 아세트산으로 4회 헹구어 결합되지 않은 염료를 제거하고, 건조 후, 염색물을 10mM 트리스 염기 [트리스(히드록식메틸)아미노메탄] (pH 10.5) 0.1 ㎖로 5분간 추출하였다. 492 nm에서 설포르호다민 B의 흡광도 (OD)를 컴퓨터 조정된 96웰 마이크타이터 플레이터 리더를 사용하여 측정하였다.
시험 시료는 한 가지 이상의 농도에서 40% 이상의 성장 억제 효과를 나타내는 경우에 양성으로 간주하였다. 결과는 하기 표 5 내지 9에 나타내었으며, 종양 세포형의 약어에서 NSCL은 비소세포 폐암, CNS는 중추신경계를 나타낸다.
물질의 기탁
다음 물질들은 미국 버지니아주 20110-2209 마나사스 유니버시티 불바드 10801에 소재하는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC)에 기탁되었다.
물질 ATCC 기탁번호 기탁일
DNA32292-1131 209258 1997. 9. 16.
DNA33092-1202 209420 1997. 10. 28.
DNA48613-1268 209752 1998. 4. 7.
DNA35916-1161 209419 1997. 10. 28.
DNA27865-1091 209296 1997. 9. 23.
이들 기탁은 특허 절차상 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약 및 그의 규칙 (부다페스트 조약 (Budapest Treaty))의 규정 하에 이루어졌다. 이는 기탁일로부터 30년 동안 기탁물의 생존 배양물의 유지를 보장한다. 기탁물은 부다페스트 조약의 협약 하에 ATCC로부터 제넨테크 인크와 ATCC 사이 협정에 따라 분양될 것이며, 이는 관련 미국 특허의 허여시 또는 미국 또는 외국 특허 출원의 공개시 (이 중 먼저인 때) 공공에 대한 기탁물의 배양 프로제니의 영구적이고 비제한적인 분양을 보장하고, 미국 특허 및 상표청장에 의해 35 USC §122 및 그에 따른 미국 특허 및 상표청장의 규칙 (37 CFR §1.14 포함, 특히 886 OG 638 참조)에 따라 권리가 있는 것으로 결정한 이에게 프로제니의 분양을 보장한다.
본 출원의 양수인은 적합한 조건 하에 배양할 때 기탁 물질의 배양물이 사멸하거나 손실되거나 파손된 경우, 그 통지시 물질을 다른 동일한 물질로 즉시 교체할 것임을 동의하였다. 기탁 물질의 분양은 각국 정부의 권한으로 그 특허법에 따라 승인된 권리에 위배하여 본 발명을 실시하도록 허가하는 것으로서 해석되어서는 안된다.
앞서 기술한 명세서는 당업계의 숙련인이 본 발명을 실시할 수 있도록 하기에 충분한 것으로 생각된다. 본 발명은 기탁된 실시태양은 본 발명의 특정 측면의 한 예시로서 의도되는 것이므로 기탁된 구조물의 범위에 제한되지 않고, 기능적으로 동등한 임의의 구조물은 본 발명의 범위 내에 있다. 본원에서 물질의 기탁은 본원에 포함된 기재 내용이 본 발명의 최선의 양식을 포함한 임의의 양태를 실시하기에 부적절하다는 것을 의미하지는 않으며, 특허 청구 범위의 범위를 명세서에서 나타내는 구체적인 설명에 제한하려는 것으로 해석되어서는 안된다. 실제로, 앞서의 상세한 설명으로부터 본원에 나타내고 기술된 것 이외에 본 발명의 다양한 변형이 당업계의 숙련인에게는 명백하고, 이는 첨부된 특허 청구의 범위 내에 있을 것이다.

Claims (57)

  1. 유효량의 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드 또는 그의 아고니스트를 제약적으로 허용가능한 담체와 함께 포함하는, 신생 세포 성장의 억제에 유용한 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 성장 억제량의 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드 또는 그의 아고니스트를 포함하는 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 세포독성량의 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드 또는 그의 아고니스트를 포함하는 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 성장 억제제, 세포독성제 또는 화학요법제를 더 포함하는 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 PRO211 폴리펩티드가 (a) 도 2 (서열 2)의 PRO211 폴리펩티드의 잔기 1 또는 약 25 내지 353 또는 (b) 도 2 (서열 2)의 PRO211 폴리펩티드의 X 내지 353 (여기서, X는 도 2 (서열 2)의 20 내지 29의 임의의 아미노산 잔기임)과 약 80% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 것인 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 PRO211 폴리펩티드가 도 2 (서열 2)의 아미노산 서열을 포함하는 것인 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 PRO228 폴리펩티드가 (a) 도 4 (서열 7)의 PRO228 폴리펩티드의 잔기 1 또는 약 20 내지 690, (b) 도 4 (서열 7)의 PRO228 폴리펩티드의 X 내지 690 (여기서, X는 도 4 (서열 7)의 15 내지 24의 임의의 아미노산 잔기임) 또는 (c) 도 4 (서열 7)의 잔기 1 또는 약 20 내지 X (여기서, X는 도 4 (서열 7)의 아미노산 425 내지 아미노산 434의 임의의 아미노산임)와 약 80% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 것인 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 PRO228 폴리펩티드가 도 4 (서열 7)의 아미노산 서열을 포함하는 것인 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 PRO538 폴리펩티드가 (a) 도 6 (서열 16)의 PRO538 폴리펩티드의 잔기 1 또는 약 27 내지 400, (b) 도 6 (서열 16)의 PRO538 폴리펩티드의 X 내지 400 (여기서, X는 도 6 (서열 16)의 22 내지 31의 임의의 아미노산 잔기임) 또는 (c) 도 6 (서열 16)의 1 또는 약 27 내지 X (여기서, X는 도 6 (서열 16)의 아미노산 374 내지 아미노산 383의 임의의 아미노산임)와 약 80% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 것인 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 PRO538 폴리펩티드가 도 6 (서열 16)의 아미노산 서열을 포함하는 것인 조성물.
  11. 제1항에 있어서, 상기 PRO172 폴리펩티드가 (a) 도 8 (서열 21)의 PRO172 폴리펩티드의 잔기 1 또는 약 22 내지 723, (b) 도 8 (서열 21)의 PRO172 폴리펩티드의 X 내지 723 (여기서, X는 도 8 (서열 21)의 17 내지 26의 임의의 아미노산 잔기임) 또는 (c) 도 8 (서열 21)의 1 또는 약 22 내지 X (여기서, X는 도 8 (서열 21)의 아미노산 543 내지 아미노산 552의 임의의 아미노산임)와 약 80% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 것인 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 PRO172 폴리펩티드가 도 8 (서열 21)의 아미노산 서열을 포함하는 것인 조성물.
  13. 제1항에 있어서, 상기 PRO182 폴리펩티드가 (a) 도 10 (서열 26)의 PRO182 폴리펩티드의 잔기 1 또는 약 19 내지 135 또는 (b) 도 10 (서열 26)의 PRO182 폴리펩티드의 X 내지 135 (여기서, X는 도 10 (서열 26)의 14 내지 23의 임의의 아미노산 잔기임)과 약 80% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 것인 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 PRO182 폴리펩티드가 도 10 (서열 26)의 아미노산 서열을 포함하는 것인 조성물.
  15. 치료 유효량의 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드 또는 그의 아고니스트를 포함하는, 포유동물에서 종양 치료에 유용한 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 상기 종양이 암인 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 상기 암이 유방암, 난소암, 신장암, 직장결장암, 자궁암, 전립선암, 폐암, 방광암, 중추신경계암, 흑색종 및 백혈병으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 조성물.
  18. 제15항에 있어서, 상기 PRO211 폴리펩티드가 (a) 도 2 (서열 2)의 PRO211 폴리펩티드의 잔기 1 또는 약 25 내지 353 또는 (b) 도 2 (서열 2)의 PRO211 폴리펩티드의 X 내지 353 (여기서, X는 도 2 (서열 2)의 20 내지 29의 임의의 아미노산 잔기임)과 약 80% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 것인 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 상기 PRO211 폴리펩티드가 도 2 (서열 2)의 아미노산 서열을 포함하는 것인 조성물.
  20. 제15항에 있어서, 상기 PRO228 폴리펩티드가 (a) 도 4 (서열 7)의 PRO228 폴리펩티드의 잔기 1 또는 약 20 내지 690, (b) 도 4 (서열 7)의 PRO228 폴리펩티드의 X 내지 690 (여기서, X는 도 4 (서열 7)의 15 내지 24의 임의의 아미노산 잔기임) 또는 (c) 도 4 (서열 7)의 1 또는 약 20 내지 X (여기서, X는 도 4 (서열 7)의 아미노산 425 내지 아미노산 434의 임의의 아미노산임)와 약 80% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 것인 조성물.
  21. 제20항에 있어서, 상기 PRO228 폴리펩티드가 도 4 (서열 7)의 아미노산 서열을 포함하는 것인 조성물.
  22. 제15항에 있어서, 상기 PRO538 폴리펩티드가 (a) 도 6 (서열 16)의 PRO538 폴리펩티드의 잔기 1 또는 약 27 내지 400, (b) 도 6 (서열 16)의 PRO538 폴리펩티드의 X 내지 400 (여기서, X는 도 6 (서열 16)의 22 내지 31의 임의의 아미노산 잔기임) 또는 (c) 도 6 (서열 16)의 1 또는 약 27 내지 X (여기서, X는 도 6 (서열 16)의 아미노산 374 내지 아미노산 383의 임의의 아미노산임)와 약 80% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 것인 조성물.
  23. 제22항에 있어서, 상기 PRO538 폴리펩티드가 도 6 (서열 16)의 아미노산 서열을 포함하는 것인 조성물.
  24. 제15항에 있어서, 상기 PRO172 폴리펩티드가 (a) 도 8 (서열 21)의 PRO172폴리펩티드의 잔기 1 또는 약 22 내지 723, (b) 도 8 (서열 21)의 PRO172 폴리펩티드의 X 내지 723 (여기서, X는 도 8 (서열 21)의 17 내지 26의 임의의 아미노산 잔기임) 또는 (c) 도 8 (서열 21)의 1 또는 약 22 내지 X (여기서, X는 도 8 (서열 21)의 아미노산 543 내지 아미노산 552의 임의의 아미노산임)와 약 80% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 것인 조성물.
  25. 제24항에 있어서, 상기 PRO172 폴리펩티드가 도 8 (서열 21)의 아미노산 서열을 포함하는 것인 조성물.
  26. 제15항에 있어서, 상기 PRO182 폴리펩티드가 (a) 도 10 (서열 26)의 PRO182 폴리펩티드의 잔기 1 또는 약 19 내지 135 또는 (b) 도 10 (서열 26)의 PRO182 폴리펩티드의 X 내지 135 (여기서, X는 도 10 (서열 26)의 14 내지 23의 임의의 아미노산 잔기임)와 약 80% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 것인 조성물.
  27. 제26항에 있어서, 상기 PRO182 폴리펩티드가 도 10 (서열 26)의 아미노산 서열을 포함하는 것인 조성물.
  28. 유효량의 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드 또는 그의 아고니스트를 포유동물의 종양 세포에 노출시키는 단계를 포함하는, 상기 종양 세포의 성장을 억제하는 방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 PRO211 폴리펩티드가 (a) 도 2 (서열 2)의 PRO211 폴리펩티드의 잔기 1 또는 약 25 내지 353 또는 (b) 도 2 (서열 2)의 PRO211 폴리펩티드의 X 내지 353 (여기서, X는 도 2 (서열 2)의 20 내지 29의 임의의 아미노산 잔기임)과 약 80% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 것인 방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기 PRO211 폴리펩티드가 도 2 (서열 2)의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  31. 제28항에 있어서, 상기 PRO228 폴리펩티드가 (a) 도 4 (서열 7)의 PRO228 폴리펩티드의 잔기 1 또는 약 20 내지 690, (b) 도 4 (서열 7)의 PRO228 폴리펩티드의 X 내지 690 (여기서, X는 도 4 (서열 7)의 15 내지 24의 임의의 아미노산 잔기임) 또는 (c) 도 4 (서열 7)의 1 또는 약 20 내지 X (여기서, X는 도 4 (서열 7)의 아미노산 425 내지 아미노산 434의 임의의 아미노산임)와 약 80% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 것인 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 PRO228 폴리펩티드가 도 4 (서열 7)의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  33. 제28항에 있어서, 상기 PRO538 폴리펩티드가 (a) 도 6 (서열 16)의 PRO538폴리펩티드의 잔기 1 또는 약 27 내지 400, (b) 도 6 (서열 16)의 PRO538 폴리펩티드의 X 내지 400 (여기서, X는 도 6 (서열 16)의 22 내지 31의 임의의 아미노산 잔기임) 또는 (c) 도 6 (서열 16)의 1 또는 약 27 내지 X (여기서, X는 도 6 (서열 16)의 아미노산 374 내지 아미노산 383의 임의의 아미노산임)와 약 80% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 것인 방법.
  34. 제33항에 있어서, 상기 PRO538 폴리펩티드가 도 6 (서열 16)의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  35. 제28항에 있어서, 상기 PRO172 폴리펩티드가 (a) 도 8 (서열 21)의 PRO172 폴리펩티드의 잔기 1 또는 약 22 내지 723, (b) 도 8 (서열 21)의 PRO173 폴리펩티드의 X 내지 723 (여기서, X는 도 8 (서열 21)의 17 내지 26의 임의의 아미노산 잔기임) 또는 (c) 도 8 (서열 21)의 1 또는 약 22 내지 X (여기서, X는 도 8 (서열 21)의 아미노산 543 내지 아미노산 552의 임의의 아미노산임)와 약 80% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 것인 방법.
  36. 제35항에 있어서, 상기 PRO172 폴리펩티드가 도 8 (서열 21)의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  37. 제28항에 있어서, 상기 PRO182 폴리펩티드가 (a) 도 10 (서열 26)의 PRO182폴리펩티드의 잔기 1 또는 약 19 내지 135 또는 (b) 도 10 (서열 26)의 PRO182 폴리펩티드의 X 내지 135 (여기서, X는 도 10 (서열 26)의 14 내지 23의 임의의 아미노산 잔기임)과 약 80% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 것인 방법.
  38. 제37항에 있어서, 상기 PRO182 폴리펩티드가 도 10 (서열 26)의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  39. 제28항에 있어서, 상기 아고니스트가 항 PRO211, 항 PRO228, 항 PRO538, 항 PRO172 또는 항 PRO182 아고니스트 항체인 방법.
  40. 제28항에 있어서, 상기 아고니스트가 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드의 생물학적 활성을 모방하는 작은 분자인 방법.
  41. 제28항에 있어서, 상기 노출 단계가 시험관 내에서 수행하는 것인 방법.
  42. 제28항에 있어서, 상기 노출 단계가 생체 내에서 수행하는 것인 방법.
  43. 용기 및 용기 내에, PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드 또는 그의 아고니스트를 활성 물질로 포함하는 조성물을 포함하는 제품.
  44. 제43항에 있어서, 상기 PRO211 폴리펩티드가 (a) 도 2 (서열 2)의 PRO211 폴리펩티드의 잔기 1 또는 약 25 내지 353 또는 (b) 도 2 (서열 2)의 PRO211 폴리펩티드의 X 내지 353 (여기서, X는 도 2 (서열 2)의 20 내지 29의 임의의 아미노산 잔기임)과 약 80% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 것인 제품.
  45. 제44항에 있어서, 상기 PRO211 폴리펩티드가 도 2 (서열 2)의 아미노산 서열을 포함하는 것인 제품.
  46. 제43항에 있어서, 상기 PRO228 폴리펩티드가 (a) 도 4 (서열 7)의 PRO228 폴리펩티드의 잔기 1 또는 약 20 내지 690, (b) 도 4 (서열 7)의 PRO228 폴리펩티드의 X 내지 690 (여기서, X는 도 4 (서열 7)의 15 내지 24의 임의의 아미노산 잔기임) 또는 (c) 도 4 (서열 7)의 1 또는 약 20 내지 X (여기서, X는 도 4 (서열 7)의 아미노산 425 내지 아미노산 434의 임의의 아미노산임)와 약 80% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 것인 제품.
  47. 제46항에 있어서, 상기 PRO228 폴리펩티드가 도 4 (서열 7)의 아미노산 서열을 포함하는 것인 제품.
  48. 제43항에 있어서, 상기 PRO538 폴리펩티드가 (a) 도 6 (서열 16)의 PRO538 폴리펩티드의 잔기 1 또는 약 27 내지 400, (b) 도 6 (서열 16)의 PRO538 폴리펩티드의 X 내지 400 (여기서, X는 도 6 (서열 16)의 22 내지 31의 임의의 아미노산 잔기임) 또는 (c) 도 6 (서열 16)의 1 또는 약 27 내지 X (여기서, X는 도 6 (서열 16)의 아미노산 374 내지 아미노산 383의 임의의 아미노산임)와 약 80% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 것인 제품.
  49. 제48항에 있어서, 상기 PRO538 폴리펩티드가 도 6 (서열 16)의 아미노산 서열을 포함하는 것인 제품.
  50. 제43항에 있어서, 상기 PRO172 폴리펩티드가 (a) 도 8 (서열 21)의 PRO172 폴리펩티드의 잔기 1 또는 약 22 내지 723, (b) 도 8 (서열 21)의 PRO172 폴리펩티드의 X 내지 723 (여기서, X는 도 8 (서열 21)의 17 내지 26의 임의의 아미노산 잔기임) 또는 (c) 도 8 (서열 21)의 1 또는 약 22 내지 X (여기서, X는 도 8 (서열 21)의 아미노산 543 내지 아미노산 552의 임의의 아미노산임)와 약 80% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 것인 제품.
  51. 제50항에 있어서, 상기 PRO172 폴리펩티드가 도 8 (서열 21)의 아미노산 서열을 포함하는 것인 제품.
  52. 제43항에 있어서, 상기 PRO182 폴리펩티드가 (a) 도 10 (서열 26)의 PRO182 폴리펩티드의 잔기 1 또는 약 19 내지 135 또는 (b) 도 10 (서열 26)의 PRO182 폴리펩티드의 X 내지 135 (여기서, X는 도 10 (서열 26)의 14 내지 23의 임의의 아미노산 잔기임)과 약 80% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 것인 제품.
  53. 제52항에 있어서, 상기 PRO182 폴리펩티드가 도 10 (서열 26)의 아미노산 서열을 포함하는 것인 제품.
  54. 제43항에 있어서, 상기 아고니스트가 항 PRO211, 항 PRO228, 항 PRO538, 항 PRO172 또는 항 PRO182 아고니스트 항체인 제품.
  55. 제43항에 있어서, 상기 아고니스트가 PRO211, PRO228, PRO538, PRO172 또는 PRO182 폴리펩티드의 생물학적 활성을 모방하는 작은 분자인 제품.
  56. 제43항에 있어서, 상기 활성 물질이 포유동물에서 종양의 치료 유효량으로 존재하는 것인 제품.
  57. 제43항에 있어서, 상기 조성물이 성장 억제제, 세포독성제 또는 화학요법제를 더 포함하는 것인 제품.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7169906B2 (en) 1997-09-17 2007-01-30 Genentech, Inc. PRO211 polypeptides
US6974689B1 (en) 1997-09-18 2005-12-13 Genentech, Inc. Nucleic acid encoding PRO211 polypeptides
KR20020093053A (ko) * 2000-04-21 2002-12-12 다케다 야쿠힌 고교 가부시키가이샤 신규 인슐린/ｉｇｆ/릴랙신 패밀리 폴리펩티드 및 그의ｄｎａ
CA2710775A1 (en) * 2007-12-28 2009-07-09 Bioinvent International Ab Formulation

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ226799A (en) * 1987-11-06 1991-08-27 Oncogen Breast cancer inhibitory factor and method for inhibiting proliferation of neoplastic cells and compositions therefor
US5814307A (en) * 1989-04-10 1998-09-29 Bristol-Myers Squibb Company Method for regulating cell growth, leukocyte differentiation and tumor cell growth using Oncostatin M to stimulate synthesis of IL-6
US5416192A (en) * 1990-04-03 1995-05-16 Bristol-Myers Squibb Company Epithelins: novel cysteine-rich growth modulating proteins
WO1999014327A2 (en) * 1997-09-17 1999-03-25 Genentech, Inc. Genes amplified in tumours, antibodies against the proteins coded thereby, and their use in diagnosis and treatment of cancer
WO1999014328A2 (en) * 1997-09-17 1999-03-25 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same

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