KR100524041B1 - 신규 침팬지 에리쓰로포이에틴 (chepo) 폴리펩티드 및 이를 코딩하는 핵산 - Google Patents

신규 침팬지 에리쓰로포이에틴 (chepo) 폴리펩티드 및 이를 코딩하는 핵산 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신규 침팬지 에리쓰로포이에틴 폴리펩티드 및 이들 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 본원에서는 상기 핵산 서열을 포함하는 벡터 및 숙주 세포, 이종 폴리펩티드 서열에 융합된 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 키메라 폴리펩티드 분자, 본 발명의 폴리펩티드에 결합하는 항체, 및 본 발명의 폴리펩티드를 제조하는 방법도 제공된다.

Description

신규 침팬지 에리쓰로포이에틴 (ＣＨＥＰＯ) 폴리펩티드 및 이를 코딩하는 핵산 {Novel Chimpanzee Erythropoietin (CHEPO) Polypeptides and Nucleic Acids Encoding the Same}
본 발명은 일반적으로 신규 침팬지 에리쓰로포이에틴 폴리펩티드 및 이 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자의 확인과 단리 및 이들 폴리펩티드의 재조합 생산에 관한 것이다.
적혈구조혈 (Erythropoiesis), 즉 적혈구의 생성은 세포 파괴를 벌충하기 위해 인간에서 일생 동안 지속적으로 일어난다. 적혈구조혈은 적절한 조직 산소화에는 충분하지만 혈액 순환을 방해하지 않을 정도로 많은 적혈구가 혈액 내에 존재하도록 매우 정확히 조절되는 생리학적 기작이다. 적혈구의 형성은 골수에서 에리쓰로포이에틴이라는 호르몬의 조절하에 일어난다.
에리쓰로포이에틴은 분자량이 약 34,000 달톤인 산성 당단백질로서 3가지 형태, 즉 알파, 베타 및 아시알로 (asialo) 형태로 생성될 수 있다. 탄수화물 성분에서 약간 다른 알파 및 베타 형태의 효능, 생물학적 활성 및 분자량은 동일하다. 아시알로 형태는 말단 탄수화물 (시알산)이 제거된 알파 또는 베타 형태이다. 에리쓰로포이에틴은 신체가 건강한 상태일 때 (조직이 현존하는 수의 적혈구로부터 충분한 산소공급을 받는 상태일 때) 매우 낮은 농도로 혈장에 존재한다. 이 정상적인 낮은 농도는 노화를 통해 정상적으로 사라지는 적혈구의 교체를 자극하기에 충분하다.
순환계에 존재하는 에리쓰로포이에틴의 양은 순환계에 존재하는 혈구에 의한 산소 전달이 감소될 경우 저산소증의 상태하에서 증가된다. 저산소증은 출혈, 방사선에의 과다한 노출에 의한 적혈구의 파괴, 고소 또는 장기간의 무의식 상태로 인한 산소 섭취의 감소, 또는 다양한 형태의 빈혈을 통한 다량의 혈액 손실에 의해 발생할 수 있다. 에리쓰로포이에틴은 저산소성 스트레스를 받는 조직에 반응하여 원시 전구세포가 골수에서 전구적혈구모세포 (proerythroblast; 나중에 성숙하여 헤모글로빈을 합성하고 적혈구로서 순환계로 방출됨)로 전환되는 것을 자극시킴으로써 적혈구 생성을 증가시킬 것이다. 순환계 중의 적혈구 세포의 수가 정상 조직의 산소 요구량에 필요한 수보다 더 많은 경우, 순환계 중의 에리쓰로포이에틴은 감소된다.
에리쓰로포이에틴은 적혈구 형성의 과정에 필수적이기 때문에, 이 호르몬은 적혈구의 생성이 적거나 결핍된 것을 특징으로 하는 혈액 질환의 진단 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다 [Pennathur-Das, et al., Blood 63 (5): 1168-71 (1984) and Haddy, Am. Jour. Ped. Hematol. Oncol., 4: 191-196 (1982) (겸상적혈구 질환을 치료할 수 있는 치료법에서의 에리쓰로포이에틴에 대한 것), and Eschbach et al., J. Clin. Invest.74 (2): 434-441 (1984) (에리쓰로포이에틴이 많은 혈장 관주에 대한 생체내 반응을 기초로 한 요독증 양에 대한 치료법을 기재하고 있고, 만성 신부전과 관련된 유형의 빈혈의 치료량으로서 15-40일동안 하루에 10 U EOP/kg의 투여량을 제안함) 참조]. 문헌 (Krane, Henry Ford Hosp. Med. J., 31 (3): 177-181 (1983))도 참조할 수 있다.
본원에서 본 발명자들은 침팬지로부터 유래된 신규 에리쓰로포이에틴 폴리펩티드 (본원에서 CHEPO로 지칭함)의 확인 및 특징규명을 기재한다.
<발명의 요약>
본원에서 "CHEPO"로 지칭한 신규 침팬지 에리쓰로포이에틴 폴리펩티드를 코딩하며 인간 에리쓰로포이에틴을 코딩하는 핵산과 상동성이 있는 cDNA 클론을 찾았다.
한 실시양태에서, 본 발명은 CHEPO 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자를 제공한다.
한 측면에서, 단리된 핵산 분자는 (a) 도 3 (서열 2 및 5)의 아미노산 잔기 약 1 또는 약 28 내지 약 193의 서열을 갖는 CHEPO 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 분자, 또는 (b) (a) DNA 분자의 상보체와의 핵산 서열 동일성이 약 80% 이상, 또는 약 81% 이상, 또는 약 82% 이상, 또는 약 83% 이상, 또는 약 84% 이상, 또는 약 85% 이상, 또는 약 86% 이상, 또는 약 87% 이상, 또는 약 88% 이상, 또는 약 89% 이상, 또는 약 90% 이상, 또는 약 91% 이상, 또는 약 92% 이상, 또는 약 93% 이상, 또는 약 94% 이상, 또는 약 95% 이상, 또는 약 96% 이상, 또는 약 97% 이상, 또는 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상인 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
또다른 측면에서, 단리된 핵산 분자는 (a) 도 3 (서열 2 및 5)의 아미노산 잔기 약 1 또는 약 28 내지 약 193의 서열을 갖는 CHEPO 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 또는 (b) (a)의 뉴클레오티드 서열의 상보체를 포함한다.
한 측면에서, 단리된 핵산 분자는 (a) 도 2 (서열 3)의 뉴클레오티드 약 1 또는 약 82 내지 약 579의 서열을 갖는 DNA 분자, 또는 (b) (a) DNA 분자의 상보체와의 핵산 서열 동일성이 약 80% 이상, 또는 약 81% 이상, 또는 약 82% 이상, 또는 약 83% 이상, 또는 약 84% 이상, 또는 약 85% 이상, 또는 약 86% 이상, 또는 약 87% 이상, 또는 약 88% 이상, 또는 약 89% 이상, 또는 약 90% 이상, 또는 약 91% 이상, 또는 약 92% 이상, 또는 약 93% 이상, 또는 약 94% 이상, 또는 약 95% 이상, 또는 약 96% 이상, 또는 약 97% 이상, 또는 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상인 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
또다른 측면에서, 단리된 핵산 분자는 (a) 도 2 (서열 3)의 약 1 또는 약 82 내지 약 579의 뉴클레오티드 서열, 또는 (b) (a)의 뉴클레오티드 서열의 상보체를 포함한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 도 3 (서열 2 및 5)의 아미노산 1 또는 약 28 내지 약 193을 코딩하는 핵산 서열의 상보체와 혼성화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하며 하기 정의된 활성 CHEPO 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산 분자에 관한 것이다. 바람직하게는 혼성화는 엄격한 혼성화 및 세척 조건 하에서 일어난다.
또다른 측면에서, 본 발명은 도 2 (서열 3)의 뉴클레오티드 약 1 또는 약 82 내지 약 579의 핵산 서열의 상보체와 혼성화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하며 하기 정의된 활성 CHEPO 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산 분자에 관한 것이다. 바람직하게는, 혼성화는 엄격한 혼성화 및 세척 조건 하에서 일어난다.
추가 측면에서, 본 발명은, 시험 DNA 분자가 (a) 도 3 (서열 2 및 5)의 아미노산 잔기 약 1 또는 약 28 내지 약 193의 서열을 갖는 CHEPO 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 분자, 또는 (b) (a) DNA 분자의 상보체와의 핵산 서열 동일성이 약 80% 이상, 또는 약 81% 이상, 또는 약 82% 이상, 또는 약 83% 이상, 또는 약 84% 이상, 또는 약 85% 이상, 또는 약 86% 이상, 또는 약 87% 이상, 또는 약 88% 이상, 또는 약 89% 이상, 또는 약 90% 이상, 또는 약 91% 이상, 또는 약 92% 이상, 또는 약 93% 이상, 또는 약 94% 이상, 또는 약 95% 이상, 또는 약 96% 이상, 또는 약 97% 이상, 또는 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상이면, 시험 DNA 분자를 엄격한 조건 하에서 (a) 또는 (b)와 혼성화시키고, 상기 시험 DNA 분자를 단리함으로써 얻은 단리된 핵산 분자에 관한 것이다.
또다른 측면에서, 본 발명은 (a) 도 3 (서열 2 및 5)의 아미노산 잔기 약 1 또는 약 28 내지 약 193의 아미노산 서열과 비교할 때 약 80% 이상, 또는 약 81% 이상, 또는 약 82% 이상, 또는 약 83% 이상, 또는 약 84% 이상, 또는 약 85% 이상, 또는 약 86% 이상, 또는 약 87% 이상, 또는 약 88% 이상, 또는 약 89% 이상, 또는 약 90% 이상, 또는 약 91% 이상, 또는 약 92% 이상, 또는 약 93% 이상, 또는 약 94% 이상, 또는 약 95% 이상, 또는 약 96% 이상, 또는 약 97% 이상, 또는 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상의 양성을 기록하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 또는 (b) (a) 뉴클레오티드 서열의 상보체를 포함하는 단리된 핵산 분자에 관한 것이다.
특정 측면에서, 본 발명은 N-말단 신호 서열 및(또는) 개시 메티오닌이 없는 CHEPO 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 포함하는 단리된 핵산 분자, 또는 이러한 코딩 핵산 분자에 상보적인 단리된 핵산 분자를 제공한다. 도 3 (서열 2 및 5)의 서열에서 아미노산 위치 약 1부터 아미노산 위치 약 27까지 걸쳐 있는 신호 펩티드를 잠정적으로 찾았다. 그러나, 신호 펩티드의 C-말단 경계는 다양할 수 있지만, 본원에서 처음 확인된 신호 펩티드 C-말단 경계의 각 측면 상에 약 5개 이하의 아미노산이 존재할 가능성이 매우 크다는 것을 인지해야 하는데, 상기 신호 펩티드의 C-말단 경계는 이러한 유형의 아미노산 서열 요소를 찾기 위해 당분야에서 통상적으로 이용하는 기준에 따라 확인할 수 있다 (예를 들어, Nielsen et al., Prot. Eno. 10: 1-6 (1997) and von Heinje et al., Nucl. Acids. Res. 14: 4683-4690 (1986)). 또한, 몇몇 경우, 분비되는 폴리펩티드의 신호 서열의 절단이 전체적으로 일정하지 않아 하나 이상의 분비종이 생성된다는 것도 인식해야 한다. 이들 폴리펩티드, 및 이들을 코딩하는 폴리뉴클레오티드도 본 발명에 포함된다. 따라서, 본원의 목적 위해, 도 3 (서열 2 및 5)에 나타낸 CHEPO 폴리펩티드의 신호 서열은 도 3 (서열 2 및 5)의 아미노산 1부터 X까지 걸쳐 있는데, 여기서, X는 도 3 (서열 2 및 5)의 23 내지 32에 있는 임의의 아미노산이다. 따라서, 본 발명에 포함되는 성숙한 형태의 CHEPO 폴리펩티드는 도 3 (서열 2 및 5)의 아미노산 X 내지 193을 포함하는 폴리펩티드 및 하기에 기재한 그의 변이체를 포함하는데, 여기서, X는 도 3 (서열 2 및 5)의 23 내지 32에 있는 임의의 아미노산이다. 이들 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산 분자도 포함된다.
또다른 실시양태는 예컨대, 혼성화 프로브로서 사용할 수 있는 CHEPO 폴리펩티드 코딩 서열, 또는 임의로 항-CHEPO 항체에 대한 결합 부위를 포함하는 폴리펩티드의 단편을 코딩하는, CHEPO 폴리펩티드 코딩 서열의 단편에 관한 것이다. 이러한 핵산 단편의 길이는 통상적으로 약 20 뉴클레오티드 이상, 또는 약 30 뉴클레오티드 이상, 또는 약 40 뉴클레오티드 이상, 또는 약 50 뉴클레오티드 이상, 또는 약 60 뉴클레오티드 이상, 또는 약 70 뉴클레오티드 이상, 또는 약 80 뉴클레오티드 이상, 또는 약 90 뉴클레오티드 이상, 또는 약 100 뉴클레오티드 이상, 또는 약 110 뉴클레오티드 이상, 또는 약 120 뉴클레오티드 이상, 또는 약 130 뉴클레오티드 이상, 또는 약 140 뉴클레오티드 이상, 또는 약 150 뉴클레오티드 이상, 또는 약 160 뉴클레오티드 이상, 또는 약 170 뉴클레오티드 이상, 또는 약 180 뉴클레오티드 이상, 또는 약 190 뉴클레오티드 이상, 또는 약 200 뉴클레오티드 이상, 또는 약 250 뉴클레오티드 이상, 또는 약 300 뉴클레오티드 이상, 또는 약 350 뉴클레오티드 이상, 또는 약 400 뉴클레오티드 이상, 또는 약 450 뉴클레오티드 이상, 또는 약 500 뉴클레오티드 이상, 또는 약 600 뉴클레오티드 이상, 또는 약 700 뉴클레오티드 이상, 또는 약 800 뉴클레오티드 이상, 또는 약 900 뉴클레오티드 이상, 또는 약 1000 뉴클레오티드 이상이고, 이 내용에서 용어 "약'은 언급된 뉴클레오티드 서열 길이의 플러스 또는 마이너스 10%의 길이를 말한다. 바람직한 실시양태에서 뉴클레오티드 서열 단편은 도 1 (서열 1)에 나타낸 뉴클레오티드 서열의 임의의 코딩 영역으로부터 유래된다. 다수의 잘 공지된 서열 정렬 프로그램을 이용하여 CHEPO 폴리펩티드-코딩 뉴클레오티드 서열을 다른 공지된 뉴클레오티드 서열과 정렬하고 어떤 CHEPO 폴리펩티드-코딩 뉴클레오티드 서열 단편(들)이 신규한지를 결정함으로써 CHEPO 폴리펩티드-코딩 뉴클레오티드 서열의 신규 단편을 통상적인 방식으로 결정할 수 있다는 것을 알아야 한다.
이러한 모든 CHEPO 폴리펩티드-코딩 뉴클레오티드 서열은 본원에 포함되고 과도한 실험 없이 결정할 수 있다. 또한, 이들 뉴클레오티드 분자 단편에 의해 코딩되는 CHEPO 폴리펩티드 단편, 바람직하게는 항-CHEPO 항체에 대한 결합 부위를 포함하는 CHEPO 폴리펩티드 단편도 본원에 포함된다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 CHEPO 또는 그의 변이체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터를 제공한다. 이 벡터는 위에서 확인된 임의의 단리된 핵산 분자를 포함할 수 있다.
이러한 벡터를 포함하는 숙주 세포도 제공한다. 예컨대, 숙주 세포는 CHO 세포, 이. 콜라이 (E. coli) 또는 효모일 수 있다. 숙주 세포를 CHEPO의 발현에 적합한 조건 하에서 배양하고 세포 배양물로부터 CHEPO를 회수하는 것을 포함하는 CHEPO 폴리펩티드의 생산 방법도 제공한다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 위에서 확인된 임의의 단리된 핵산 서열에 의해 코딩되는 단리된 CHEPO 폴리펩티드를 제공한다.
특정 측면에서, 본 발명은 일부 실시양태에서 도 3 (서열 2 및 5)의 아미노산 잔기 약 1 또는 약 28 내지 약 193을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 단리된 천연 서열 CHEPO 폴리펩티드를 제공한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 도 3 (서열 2 및 5)의 아미노산 잔기 약 1 또는 약 28 내지 약 193의 서열과의 아미노산 서열 동일성이 약 80% 이상, 또는 약 81% 이상, 또는 약 82% 이상, 또는 약 83% 이상, 또는 약 84% 이상, 또는 약 85% 이상, 또는 약 86% 이상, 또는 약 87% 이상, 또는 약 88% 이상, 또는 약 89% 이상, 또는 약 90% 이상, 또는 약 91% 이상, 또는 약 92% 이상, 또는 약 93% 이상, 또는 약 94% 이상, 또는 약 95% 이상, 또는 약 96% 이상, 또는 약 97% 이상, 또는 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상인 아미노산 서열을 포함하는 단리된 CHEPO 폴리펩티드에 관한 것이다.
추가 측면에서, 본 발명은 도 3 (서열 2 및 5)의 아미노산 잔기 약 1 또는 약 28 내지 약 193의 아미노산 서열과 비교할 때 약 80% 이상, 또는 약 81% 이상, 또는 약 82% 이상, 또는 약 83% 이상, 또는 약 84% 이상, 또는 약 85% 이상, 또는 약 86% 이상, 또는 약 87% 이상, 또는 약 88% 이상, 또는 약 89% 이상, 또는 약 90% 이상, 또는 약 91% 이상, 또는 약 92% 이상, 또는 약 93% 이상, 또는 약 94% 이상, 또는 약 95% 이상, 또는 약 96% 이상, 또는 약 97% 이상, 또는 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상의 양성을 기록하는 아미노산 서열을 포함하는 단리된 CHEPO 폴리펩티드에 관한 것이다.
특정 측면에서, 본 발명은 N-말단 신호 서열 및(또는) 개시 메티오닌이 없으며 상기 아미노산 서열과 같은 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 단리된 CHEPO 폴리펩티드를 제공한다. 적당한 코딩 핵산 분자를 함유하는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 CHEPO 폴리펩티드의 발현에 적합한 조건 하에서 배양하고, 세포 배양물로부터 CHEPO 폴리펩티드를 회수하는 것을 포함하는, CHEPO 폴리펩티드의 생산 방법도 본원에 기재되어 있다.
또다른 측면에서, 본 발명은 도 3 (서열 2 및 5)의 아미노산 잔기 약 1 또는 약 28 내지 약 193의 서열, 또는 생물학적으로 활성 상태이거나 항-CHEPO 항체에 대한 결합 부위를 제공하기에 충분한 상기 서열의 단편을 포함하는 단리된 CHEPO 폴리펩티드에 관한 것으로, 여기서, 생물학적으로 활성을 나타내거나 항-CHEPO 항체에 대한 결합 부위를 제공하는 CHEPO 폴리펩티드 단편은 당분야에 잘 공지된 기술을 이용하여 통상적인 방식으로 확인할 수 있다. 바람직하게는, CHEPO 단편은 천연 CHEPO 폴리펩티드의 정성적인 생물학적 활성을 보유한다.
추가 측면에서, 본 발명은 i) 시험 DNA 분자가 (a) 도 3 (서열 2 및 5)의 아미노산 잔기 약 1 또는 약 28 내지 약 193의 서열을 갖는 CHEPO 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 분자, 또는 (b) (a) DNA 분자의 상보체와의 핵산 서열 동일성이 약 80% 이상, 또는 약 81% 이상, 또는 약 82% 이상, 또는 약 83% 이상, 또는 약 84% 이상, 또는 약 85% 이상, 또는 약 86% 이상, 또는 약 87% 이상, 또는 약 88% 이상, 또는 약 89% 이상, 또는 약 90% 이상, 또는 약 91% 이상, 또는 약 92% 이상, 또는 약 93% 이상, 또는 약 94% 이상, 또는 약 95% 이상, 또는 약 96% 이상, 또는 약 97% 이상, 또는 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상이면, 시험 DNA 분자를 엄격한 조건 하에서 (a) 또는 (b)와 혼성화시키고, ii) 시험 DNA 분자를 포함하는 숙주 세포를 CHEPO 폴리펩티드의 발현에 적합한 조건 하에서 배양하고, iii) 세포 배양물로부터 CHEPO 폴리펩티드를 회수함으로써 수득한 CHEPO 폴리펩티드를 제공한다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 이종 폴리펩티드 또는 아미노산 서열과 융합된 CHEPO 폴리펩티드를 포함하는 키메라 분자를 제공하는데, 여기서, CHEPO 폴리펩티드는 상기 임의의 CHEPO 폴리펩티드, 그의 변이체 또는 단편을 포함할 수 있다. 이러한 키메라 분자의 예로는 에피토프 태그 서열 또는 이뮤노글로불린의 FC 영역에 융합된 CHEPO 폴리펩티드가 있다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 위에 기재된 바와 같이 CHEPO 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 하기 정의된 항체를 제공한다. 임의로, 상기 항체는 모노클로날 항체, 항체 단편 또는 단일쇄 항체이다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 아래 정의된 천연 CHEPO 폴리펩티드의 아고니스트 및 길항제에 관한 것이다. 구체적인 실시양태에서, 아고니스트 또는 길항제는 항-CHEPO 항체 또는 소분자이다.
추가 실시양태에서, 본 발명은 CHEPO 폴리펩티드를 후보 분자와 접촉시키고 상기 CHEPO 폴리펩티드에 의해 매개되는 생물학적 활성을 관찰하는 것을 포함하는, CHEPO 폴리펩티드에 대한 아고니스트 또는 길항제의 확인 방법에 관한 것이다. 바람직하게는, CHEPO 폴리펩티드는 천연 CHEPO 폴리펩티드이다.
추가 실시양태에서, 본 발명은 담체와 함께 CHEPO 폴리펩티드, 본원에 기재된 CHEPO 폴리펩티드의 아고니스트 또는 길항제, 또는 항-CHEPO 항체를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 임의로, 상기 담체는 제약학적으로 허용가능한 담체이다.
본 발명의 또다른 실시양태는 CHEPO 폴리펩티드, 그의 아고니스트 또는 길항제, 또는 항-CHEPO 항체에 반응하는 증상의 치료에 유용한 약제의 제조를 위한, CHEPO 폴리펩티드, 본원에 기재된 그의 아고니스트 또는 길항제, 또는 항-CHEPO 항체의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 또다른 실시양태는 천연 서열 CHEPO 폴리펩티드와 비교할 때 CHEPO 폴리펩티드의 하나 이상의 영역, 바람직하게는 도 3 (서열 2 및 5)에 나타낸 CHEPO 아미노산 서열의 아미노산 위치 84를 둘러싸고 있고(있거나) 포함하는 영역의 글리코실화 패턴이 바뀐 CHEPO 폴리펩티드에 관한 것이다. 다양한 실시양태에서, CHEPO 폴리펩티드 서열의 아미노산 위치 84에서, 또는 이 근처에서 N- 또는 O-결합된 글리코실화 부위를 생성하기 위해 잘 공지된 기술을 이용하여 CHEPO 변이체 폴리펩티드를 제조한다. 예를 들어, 본 발명에 포함되는 CHEPO 폴리펩티드로는 (a) 도 3 (서열 2 및 5)에 나타낸 CHEPO 아미노산 서열의 아미노산 81-84 (즉, Met-Glu-Val-Arg; 서열 6)가 아미노산 서열 Asn-X-Ser-X (서열 7) 또는 Asn-X-Thr-X (서열 8) (여기서, X는 Pro를 제외한 임의의 아미노산임)로 바뀌거나; (b) 도 3 (서열 2 및 5)에 나타낸 CHEPO 아미노산 서열의 아미노산 82-85 (즉, Glu-Val-Arg-Gln; 서열 9)가 아미노산 서열 Asn-X-Ser-X (서열 7) 또는 Asn-X-Thr-X (서열 8) (여기서, X는 Pro를 제외한 임의의 아미노산임)로 바뀌거나; (c) 도 3 (서열 2 및 5)에 나타낸 CHEPO 아미노산 서열의 아미노산 81-84 (즉, Val-Arg-Gln-Gln; 서열 6)가 아미노산 서열 Asn-X-Ser-X (서열 7) 또는 Asn-X-Thr-X (서열 8) (여기서, X는 Pro를 제외한 임의의 아미노산임)로 바뀌거나; 또는 (d) 도 3 (서열 2 및 5)에 나타낸 CHEPO 아미노산 서열의 아미노산 81-84 (즉, Arg-Gln-Gln-Ala; 서열 6)가 아미노산 서열 Asn-X-Ser-X (서열 7) 또는 Asn-X-Thr-X (서열 8) (여기서, X는 Pro를 제외한 임의의 아미노산임)로 바뀜으로써 N-글리코실화 부위가 이들 아미노산 위치에 생성된 CHEPO 폴리펩티드가 있다. 이들 변이체 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, 이 핵산을 포함하는 벡터 및 숙주 세포도 본원에 포함된다.
도 1A-C는 천연 서열 CHEPO를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 (뉴클레오티드 134-146, 667-812, 1071-1157, 1760-1939 및 2074-2226, 나머지는 제외함)을 포함하는 단리된 게놈 DNA 분자의 뉴클레오티드 서열 (서열 1)을 나타낸다. 또한, 서열 1의 코딩 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열 (서열 2) 뿐만 아니라 개시 코돈, 엑손 및 인트론의 위치도 게놈 서열에 존재한다.
도 2는 CHEPO 분자의 cDNA 서열 (서열 3) 및 그에 의해 코딩되는 아미노산 서열 (서열 2)을 나타낸다.
도 3은 인간의 에리쓰로포이에틴 아미노산 서열 (인간) (서열 4)과 본원에 기재된 침팬지의 에리쓰로포이에틴 (CHEPO) 아미노산 서열의 비교를 나타내는 도면으로, 여기서, CHEPO 서열의 아미노산 위치 142에 있는 X로 표시된 아미노산은 글루타민 (서열 2) 또는 라이신 (서열 5)이다.
<바람직한 실시양태의 상세한 설명>
1. 정의
용어 "CHEPO 폴리펩티드", "CHEPO 단백질" 및 "CHEPO"는 본원에 사용될 때 천연 서열 CHEPO 및 CHEPO 폴리펩티드 변이체 (이 변이체는 본원에서 더 정의됨)를 포함한다. CHEPO 폴리펩티드는 인간 조직 또는 다른 공급원과 같은 다양한 공급원으로부터 단리할 수 있거나, 재조합 및(또는) 합성 방법으로 제조할 수 있다.
"천연 서열 CHEPO"는 아미노산 서열이 천연 CHEPO와 동일한 폴리펩티드를 포함한다. 이러한 천연 서열 CHEPO는 침팬지로부터 단리할 수 있거나 재조합 및(또는) 합성 방법으로 제조할 수 있다. 용어 "천연 서열 CHEPO"는 특히, 자연적으로 발생하는 말단-절단된 형태 또는 분비된 형태 (예컨대, 세포외 도메인 서열), 자연-발생 변이체 형태 (예를 들어, 얼터네이티브-스플라이싱된 형태) 및 CHEPO의 자연-발생적 대립유전자 변이체를 포함한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 천연 서열 CHEPO는 도 3 (서열 2 및 5)의 아미노산 1 내지 193을 포함하는 성숙 또는 전장 천연 서열 CHEPO이다. 또한, 도 3 (서열 2 및 5)에 개시된 CHEPO 폴리펩티드는 본원에서 아미노산 위치 1이라 지칭한 메티오닌 잔기로 시작되지만, 도 3 (서열 2 및 5)에서 아미노산 위치 1로부터 상류 또는 하류에 위치한 또다른 메티오닌 잔기가 CHEPO 폴리펩티드의 개시 아미노산 잔기로 사용될 수도 있다.
"CHEPO 변이체 폴리펩티드"는 (a) 도 3 (서열 2 및 5)에 나타낸 CHEPO 폴리펩티드의 잔기 1 또는 약 28 내지 193, (b) 도 3 (서열 2 및 5)에 나타낸 CHEPO 폴리펩티드의 잔기 X 내지 193 (여기서, X는 도 3 (서열 2 및 5)의 아미노산 잔기 23 내지 32 중 어느 하나임), 또는 (c) 도 3 (서열 2 및 5)에 나타낸 아미노산 서열로부터 유래된 또다른 특정 단편의 아미노산 서열과의 아미노산 서열 동일성이 약 80% 이상인 하기 정의된 활성 CHEPO 폴리펩티드를 의미한다. 이러한 CHEPO 변이체 폴리펩티드로는 예컨대, 하나 이상의 아미노산 잔기가 도 3 (서열 2 및 5) 서열의 N- 및(또는) C-말단 뿐만 아니라 하나 이상의 내부 도메인에 부가되거나 결실된 CHEPO 폴리펩티드가 있다. 통상적으로, CHEPO 변이체 폴리펩티드는 (a) 도 3 (서열 2 및 5)에 나타낸 CHEPO 폴리펩티드의 잔기 1 또는 약 28 내지 193, (b) 도 3 (서열 2 및 5)에 나타낸 CHEPO 폴리펩티드의 잔기 X 내지 193 (여기서, X는 도 3 (서열 2 및 5)의 아미노산 잔기 23 내지 32 중 어느 하나임), 또는 (c) 도 3 (서열 2 및 5)에 나타낸 아미노산 서열로부터 유래된 또다른 특정 단편의 아미노산 서열과의 아미노산 서열 동일성이 약 80% 이상, 또는 약 81% 이상, 또는 약 82% 이상, 또는 약 83% 이상, 또는 약 84% 이상, 또는 약 85% 이상, 또는 약 86% 이상, 또는 약 87% 이상, 또는 약 88% 이상, 또는 약 89% 이상, 또는 약 90% 이상, 또는 약 91% 이상, 또는 약 92% 이상, 또는 약 93% 이상, 또는 약 94% 이상, 또는 약 95% 이상, 또는 약 96% 이상, 또는 약 97% 이상, 또는 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상일 것이다.
CHEPO 변이체 폴리펩티드는 천연 CHEPO 폴리펩티드 서열을 포함하지 않는다. 통상적으로, CHEPO 변이체 폴리펩티드의 길이는 약 10개 아미노산 이상, 약 20개 아미노산 이상, 또는 약 30개 아미노산 이상, 또는 약 40개 아미노산 이상, 또는 약 50개 아미노산 이상, 또는 약 60개 아미노산 이상, 또는 약 70개 아미노산 이상, 또는 약 80개 아미노산 이상, 또는 약 90개 아미노산 이상, 또는 약 100개 아미노산 이상, 또는 약 150개 아미노산 이상, 또는 약 200개 아미노산 이상, 또는 약 300개 아미노산 이상 또는 그 이상이다.
본원에서 확인된 CHEPO 폴리펩티드 서열에 대한 "아미노산 서열 동일성(%)"은 서열을 정렬하고, 필요하다면, 최대 서열 동일성(%)을 얻기 위해 갭 (gap)을 도입한 후 임의의 보존적인 치환을 서열 동일성의 일부로서 고려하지 않은 상태에서 CHEPO 서열의 아미노산 잔기와 동일한, 후보 서열의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다.
아미노산 서열 동일성(%)을 결정하기 위한 정렬은 당분야의 기술에 속하는 다양한 방법, 예컨대, BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 또는 메갈린 (Megalign; DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 달성할 수 있다. 당업자는 비교될 전장 서열의 최대 정렬을 달성하는 데 필요한 임의의 알고리즘을 비롯하여 정렬 측정에 적합한 파라미터를 결정할 수 있다. 그러나, 본원의 목적을 위해, 아미노산 서열 동일성(%)은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2을 이용하여 아래에 기재된 바와 같이 얻는데, 여기서, ALIGN-2 프로그램용 완전 원시 코드는 하기 표 1에 기재되어 있다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨텍, 인크사에 의해 개발되었고, 표 1에 나타낸 원시 코드는 미국 저작권청 (Washington D. C., 20559)에 사용자 문서로 등록되어 있고, 미국 저작권 등록번호는 TXU510087이다. ALIGN-2 프로그램은 제넨텍, 인크사 (South San Francisco, California)를 통해 공개적으로 이용가능하거나, 표 1에 기재된 원시 코드로부터 번역할 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 UNIX 작업 시스템, 바람직하게는 디지탈 UNIX V4.0D 상에서 번역되어 사용될 수 있다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되고 변하지 않는다.
본원의 목적상, 해당 아미노산 서열 B에, B와, 또는 B에 대한 해당 아미노산 서열 A의 아미노산 서열 동일성 (%)(해당 아미노산 서열 B에, B와, 또는 B에 대한 일정한 아미노산 서열 동일성 (%)을 갖거나 포함하는 해당 아미노산 서열 A로 달리 표현할 수 있음)은 하기와 같이 계산한다.
X/Y ×100
여기서, X는 A와 B의 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의해 동일하게 매치되는 것으로 기록되는 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B에서 아미노산 잔기의 총 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 같지 않는 경우, B에 대한 A의 아미노산 서열 동일성 (%)은 A에 대한 B의 아미노산 서열 동일성 (%)과 같지 않음을 인지해야 할 것이다. 아미노산 서열 동일성 계산의 예로서, 하기 표 2 및 3은 PRO로 지칭되는 아미노산 서열에 대한 비교 단백질로 지칭되는 아미노산 서열의 아미노산 서열 동일성 (%)을 계산하는 방법을 나타낸다.
달리 명시하지 않는 한, 모든 아미노산 서열 동일성(%)은 ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램을 사용하여 상기와 같이 얻을 수 있다. 그러나, 아미노산 서열 동일성 (%)은 서열 비교 프로그램 NCBI-BLAST2를 이용하여 계산할 수도 있다 (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402 (1997)). 상기 NCBI-BLAST2 서열 비교 프로그램은 웹 사이트 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov.)로부터 다운로드 받을 수 있다. NCBI-BLAST2는 여러 가지 검색 파라미터를 이용하는데, 이러한 모든 검색 파라미터는 예를 들어, 언마스크 = 예, 가닥 = 모두, 기대 발생 = 10, 최소 저복합성 길이 = 15/5, 다중-통과 e-값 = 0.01, 다중-통과에 대한 상수 = 25, 최종 갭 정렬에 대한 드롭오프 = 25 및 점수 매트릭스 = BLOSUM62를 포함하는 디폴트값으로 설정된다.
NCBI-BLAST2가 아미노산 서열 비교에 사용되는 경우, 해당 아미노산 서열 B에, B와, 또는 B에 대한 해당 아미노산 서열 A의 아미노산 서열 동일성 (%)(해당 아미노산 서열 B에, B와, 또는 B에 대한 일정한 아미노산 서열 동일성 (%)을 갖거나 포함하는 해당 아미노산 서열 A로 달리 표현할 수 있음)은 하기와 같이 계산한다.
X/Y ×100
여기서, X는 NCBI-BLAST2 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램 NCBI-BLAST2에 의해 동일하게 매치되는 것으로 기록되는 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B에서 아미노산 잔기의 총 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 같지 않는 경우, B에 대한 A의 아미노산 서열 동일성 (%)은 A에 대한 B의 아미노산 서열 동일성 (%)과 같지 않음을 인지해야 할 것이다.
"CHEPO 변이체 폴리뉴클레오티드" 또는 "CHEPO 변이체 핵산 서열"은 아래 정의된 바와 같은 활성 CHEPO 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자로서, (a) 도 3 (서열 2 및 5)에 나타낸 CHEPO 폴리펩티드의 잔기 1 또는 약 28 내지 193을 코딩하는 핵산 서열, (b) 도 3 (서열 2 및 5)에 나타낸 CHEPO 폴리펩티드의 잔기 X 내지 193을 코딩하는 핵산 서열 (여기서, X는 도 3 (서열 2 및 5)의 잔기 23 내지 32 중 임의의 아미노산 잔기임) 또는 (c) 도 3 (서열 2 및 5)에 나타낸 아미노산 서열로부터 유래된 또다른 특정 단편을 코딩하는 핵산 서열과의 핵산 서열 동일성이 약 80 % 이상인 핵산 분자이다. 보통 CHEPO 변이체 폴리뉴클레오티드는 (a) 도 3 (서열 2 및 5)에 나타낸 CHEPO 폴리펩티드의 잔기 1 또는 약 28 내지 193을 코딩하는 핵산 서열, (b) 도 3 (서열 2 및 5)에 나타낸 CHEPO 폴리펩티드의 잔기 X 내지 193을 코딩하는 핵산 서열 (여기서, X는 도 3 (서열 2 및 5)의 잔기 23 내지 32 중 임의의 아미노산 잔기임) 또는 (c) 도 3 (서열 2 및 5)에 나타낸 아미노산 서열로부터 유래된 또다른 특정 단편을 코딩하는 핵산 서열과의 핵산 서열 동일성이 약 80 % 이상, 또는 약 81 % 이상, 또는 약 82 % 이상, 또는 약 83 % 이상, 또는 약 84 % 이상, 또는 약 85 % 이상, 또는 약 86 % 이상, 또는 약 87 % 이상, 또는 약 88 % 이상, 또는 약 89 % 이상, 또는 약 90 % 이상, 또는 약 91 % 이상, 또는 약 92 % 이상, 또는 약 93 % 이상, 또는 약 94 % 이상, 또는 약 95 % 이상, 또는 약 96 % 이상, 또는 약 97 % 이상, 또는 약 98 % 이상, 또는 약 99 % 이상일 것이다. CHEPO 폴리뉴클레오티드 변이체들은 천연 CHEPO 뉴클레오티드 서열을 포함하지 않는다.
보통 CHEPO 변이체 폴리뉴클레오티드는 그 길이가 약 30개 이상의 뉴클레오티드, 또는 약 60 개 이상의 뉴클레오티드, 또는 약 90 개 이상의 뉴클레오티드, 또는 약 120 개 이상의 뉴클레오티드, 또는 약 150 개 이상의 뉴클레오티드, 또는 약 180 개 이상의 뉴클레오티드, 또는 약 210 개 이상의 뉴클레오티드, 또는 약 240 개 이상의 뉴클레오티드, 또는 약 270 개 이상의 뉴클레오티드, 또는 약 300 개 이상의 뉴클레오티드, 또는 약 450 개 이상의 뉴클레오티드, 또는 약 600 개 이상의 뉴클레오티드, 또는 약 900 개 이상의 뉴클레오티드 또는 그 이상이다.
본원에서 확인된 CHEPO 폴리펩티드 코딩 핵산 서열과 관련하여 "핵산 서열 동일성 (%)"은 CHEPO 폴리펩티드 코딩 핵산 서열과 후보 서열을 정렬시키고, 필요한 경우 서열 동일성의 최대치를 얻기 위해 갭을 도입한 후 CHEPO 폴리펩티드 코딩 핵산 서열의 뉴클레오티드와 동일한, 후보 서열의 뉴클레오티드의 백분율로서 정의된다. 핵산 서열 동일성 (%)을 측정하기 위한 정렬은 당업계에 공지된 다양한 방법, 예를 들어 BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 또는 메갈린 (DNASTAR) 소프트웨어와 같은 쉽게 구할 수 있는 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 달성할 수 있다. 당업자는 비교할 전장 서열에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는 데 필요한 임의의 알고리즘을 비롯하여 정렬을 측정하는 데 적합한 파라미터를 결정할 수 있다. 그러나, 본원의 목적상, 핵산 서열 동일성 값 (%)은 하기에 기재된 바와 같이 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2을 이용하여 얻는데, 상기 ALIGN-2 프로그램에 대한 완전한 원시 코드는 하기 표 1에 기재되어 있다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨텍, 인크사가 개발하였으며, 표 1에 나타낸 원시 코드는 미국 저작권청 (20559 워싱톤 D.C.에 소재)의 사용자 문서로 보관되어 있는데, 상기 코드는 미국 저작권 등록 제TXU510087호 하에 등록되어 있다. ALIGN-2 프로그램은 제넨텍, 인크사 (캘리포니아주 사우스 샌 프란시스코 소재)를 통해 쉽게 구할 수 있거나, 표 1에 기재된 원시 코드로부터 번역될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 UNIX 작동계, 바람직하게는 디지탈 UNIX V4.0D에서 번역되어 이용될 수 있다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램으로 설정하고 변하지 않는다.
본원의 목적상, 해당 핵산 서열 D에, D와, 또는 D에 대한 해당 핵산 서열 C의 핵산 서열 동일성 (%)(해당 핵산 서열 D에, D와, 또는 D에 대한 일정한 핵산 서열 동일성 (%)을 갖거나 포함하는 해당 핵산 서열 C로 달리 표현할 수 있음)은 하기와 같이 계산한다.
W/Z ×100
여기서, W는 C와 D의 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의해 동일하게 매치되는 것으로 기록되는 뉴클레오티드의 수이고, Z는 D에서 뉴클레오티드의 총 수이다. 핵산 서열 C의 길이가 핵산 서열 D의 길이와 같지 않는 경우, D에 대한 C의 핵산 서열 동일성 (%)은 C에 대한 D의 핵산 서열 동일성 (%)과 같지 않음을 인지해야 할 것이다. 핵산 서열 동일성 계산의 예로서, 표 4 및 5는 PRO-DNA로 지칭하는 핵산 서열에 대한 비교 DNA로 지칭하는 핵산 서열의 핵산 서열 동일성 (%)을 계산하는 방법을 나타낸다.
달리 명시하지 않는 한, 본원에 사용된 모든 핵산 서열 동일성 (%)은 ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램을 이용하여 상기와 같이 얻는다. 그러나, 핵산 서열 동일성 (%)은 서열 비교 프로그램 NCBI-BLAST2 (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997))을 이용하여 측정할 수도 있다. 상기 NCBI-BLAST2 서열 비교 프로그램은 웹 사이트 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov.)로부터 다운로드 받을 수 있다. NCBI-BLAST2는 여러 가지 검색 파라미터를 이용하는데, 이러한 모든 검색 파라미터는 예를 들어, 언마스크 = 예, 가닥 = 모두, 기대 발생 = 10, 최소 저복합성 길이 = 15/5, 다중-통과 e-값 = 0.01, 다중-통과에 대한 상수 = 25, 최종 갭 정렬에 대한 드롭오프 = 25 및 점수 매트릭스 = BLOSUM62를 포함하는 디폴트값으로 설정된다.
NCBI-BLAST2가 핵산 서열 비교에 사용되는 경우, 해당 핵산 서열 D에, D와, 또는 D에 대한 해당 핵산 서열 C의 핵산 서열 동일성 (%)(해당 핵산 서열 D에, D와, 또는 D에 대한 일정한 핵산 서열 동일성 (%)을 갖거나 포함하는 해당 핵산 서열 C로 달리 표현할 수 있음)은 하기와 같이 계산한다.
W/Z ×100
여기서, W는 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램 NCBI-BLAST2에 의해 동일하게 매치되는 것으로 기록되는 뉴클레오티드의 수이고, Z는 D에서 뉴클레오티드의 총 수이다. 핵산 서열 C의 길이가 핵산 서열 D의 길이와 같지 않는 경우, D에 대한 C의 핵산 서열 동일성 (%)은 C에 대한 D의 핵산 서열 동일성 (%)과 같지 않음을 인지해야 할 것이다.
다른 실시양태에서 CHEPO 변이체 폴리뉴클레오티드는 본원에 개시된 전장 CHEPO 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 혼성화할 수 있는 (바람직하게는 엄격한 혼성화 및 세척 조건에서) 활성 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자이다. CHEPO 변이체 폴리펩티드는 CHEPO 변이체 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 것일 수 있다.
상기한 바와 같이 수행되는 서열 비교와 관련하여 "양성"이란 용어는 동일할 뿐만 아니라 성질이 유사한 비교될 서열의 잔기를 의미한다. 관심있는 아미노산 잔기에 대해 양성값을 기록하는 아미노산 잔기는 관심있는 아미노산 잔기와 동일한 잔기이거나 관심있는 아미노산 잔기의 바람직한 치환체 (하기 표 6에 정의되어 있음)인 아미노산 잔기이다.
본원의 목적상, 해당 아미노산 서열 B에, B와, 또는 B에 대한 해당 아미노산 서열 A의 양성값 (%)(해당 아미노산 서열 B에, B와, 또는 B에 대한 일정한 양성값 (%)을 갖거나 포함하는 해당 아미노산 서열 A로 달리 표현할 수 있음)은 하기와 같이 계산한다.
X/Y ×100
여기서, X는 A와 B의 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의해 상기에서 정의된 양성값을 기록하는 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B에서 아미노산 잔기의 총 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 같지 않는 경우, B에 대한 A의 양성값 (%)은 A에 대한 B의 양성값 (%)과 같지 않음을 인지해야 할 것이다.
본원에 개시된 다양한 폴리펩티드를 기술하기 위해 사용된 "단리된"은 폴리펩티드가 확인되고, 그 자연 환경 요소로부터 분리 및(또는) 회수되었음을 의미한다. 바람직하게는, 단리된 폴리펩티드는 자연적으로 결합되어 있는 모든 성분이 결합되어 있지 않는 상태이다. 폴리펩티드의 자연 환경의 오염 요소는 이 폴리펩티드의 진단 또는 치료적 사용을 일반적으로 방해하는 물질로서, 효소, 호르몬 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질 등이 있을 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 (1) 스피닝컵 서열분석기를 사용하여 N 말단 또는 내부 아미노산 서열의 15개 이상의 잔기를 얻기에 충분한 정도로 정제되거나, 또는 (2) 쿠마시 블루 또는 바람직하게는 은 염색을 사용하여 비환원 또는 환원 조건 하에 SDS-PAGE에서 하나의 밴드만 나타날 정도로 정제될 수 있다. CHEPO의 천연 환경 요소가 하나 이상 존재하지 않을 것이기 때문에 단리된 폴리펩티드는 재조합 세포 내에 존재하는 폴리펩티드를 포함한다. 그러나, 통상 단리된 폴리펩티드는 하나 이상의 정제 단계에 의해 얻어질 것이다.
CHEPO 폴리펩티드를 코딩하는 "단리된" 핵산이란 CHEPO 폴리펩티드 핵산의 천연 출처에서 통상적으로 결합되는 하나 이상의 오염 핵산 분자로부터 확인 및 분리된 핵산 분자라는 의미이다. 바람직하게는, 단리된 핵산은 자연적으로 결합되어 있는 모든 성분이 결합되어 있지 않는 상태이다. 단리된 CHEPO 코딩 핵산 분자는 자연에서 발견되는 형태 또는 상태와 다르게 존재한다. 따라서, 단리된 CHEPO 코딩 핵산 분자는 천연 세포에 존재하는 특정 CHEPO 코딩 핵산 분자와 구별된다. 그러나, 예를 들어, 천연 세포와 상이한 염색체 위치에 존재하며 통상적으로 CHEPO를 발현하는 세포에 함유된 폴리펩티드 핵산 분자는 단리된 CHEPO 코딩 핵산 분자에 포함된다.
용어 "조절 서열"이란 특정 숙주 유기체에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필요한 DNA 서열이다. 원핵생물에 적절한 조절 서열로는 예컨데 프로모터, 경우에 따라 오퍼레이터 서열, 및 리보솜 결합 부위를 들 수 있다. 진핵세포는 프로모터, 폴리아데닐화 신호 및 인핸서를 이용하는 것으로 알려져 있다.
핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결"된다. 예를 들면, 전서열 또는 분비 리더 (leader)의 DNA는 해당 폴리펩티드가 분비되기 전의 형태인 전단백질로서 발현되는 경우 그 폴리펩티드의 DNA에 작동가능하게 연결되고, 프로모터 또는 인핸서는 폴리펩티드 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되며, 리보솜 결합 부위는 번역을 촉진하도록 배치될 때 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로 "작동가능하게 연결된"은 연결될 DNA 서열들이 인접하여 위치함을 의미하며, 분비 리더의 경우 인접하여 위치할 뿐만 아니라 동일한 리딩 프레임 내에 존재하는 것을 의미한다. 그러나 인핸서는 인접하여 위치할 필요가 없다. 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션에 의해 달성된다. 이러한 부위가 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커를 통상적인 관행에 따라 사용한다.
용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되며, 구체적으로는 하나의 항-CHEPO 폴리펩티드 모노클로날 항체 (아고니스트, 길항제 및 중화 항체 등), 폴리에피토프 특이성이 있는 항-CHEPO 항체 조성물, 단쇄 항-CHEPO 항체 및 항-CHEPO 항체의 단편 (하기 참조) 등을 통칭한다. 본원에서 사용되는 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 동종 항체들의 집단으로부터 얻은 항체, 즉, 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연발생적 돌연변이를 제외한, 한 집단을 이루는 동일한 개별 항체를 의미한다.
혼성화 반응의 "엄격도"는 당업자가 용이하게 결정할 수 있으며, 일반적으로 프로브 길이, 세척 온도, 염 농도에 따라 달라지는 실험적 계산값이다. 일반적으로 보다 긴 프로브일수록 적절한 어닐링에 보다 높은 온도를 필요로하며, 보다 짧은 프로브일수록 보다 낮은 온도를 필요로 한다. 혼성화는 일반적으로 상보적 가닥이 자신들의 용융 온도보다 낮은 환경에 존재할 때 재어닐링되는 변성된 DNA의 능력에 따라 달라진다. 프로브와 혼성화가능한 서열 사이의 원하는 상동성의 정도가 높을수록, 사용할 수 있는 상대적인 온도가 높아진다. 따라서, 상대적 온도보다 높아질수록 반응 조건은 더욱 엄격해지는 반면, 상대적 온도가 낮을수록 반응조건은 덜 엄격해진다. 혼성화 반응의 엄격도와 관련한 더 자세한 정보 및 설명은 문헌 (Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers (1995))을 참조한다.
본원에서 정의되는 "엄격 조건" 또는 "엄격도가 높은 조건"이란 (1) 세척시 이온 세기가 낮고 온도가 높은 조건, 예를 들면 50 ℃에서 0.015 M 염화나트륨/0.0015 M 시트르산나트륨/0.1 % 소듐 도데실 술페이트를 사용하는 조건, 또는 (2) 혼성화시에 포름아미드, 예를 들어 42 ℃, 750 mM 염화나트륨, 75 mM 시트르산나트륨이 함유된 50 mM 인산나트륨 완충액 (pH 6.5)/0.1 % 소혈청 알부민/0.1 % 피콜/0.1 % 폴리비닐피롤리돈으로 제조한 50 % (부피/부피) 포름아미드와 같은 변성제를 사용하는 조건, (3) 50 % 포름아미드, 5 x SSC (0.75 M NaCl, 0.075 M 시트르산나트륨), 50 mM 인산나트륨 (pH 6.8), 0.1 % 피로인산 나트륨, 5 x Denhardt's 용액, 초음파처리된 연어 정자 DNA (50 ㎍/ml), 0.1 % SDS, 및 10 % 덱스트란 술페이트를 42 ℃에서 사용하고, 42 ℃에서 0.2 x SSC (염화나트륨/시트르산나트륨), 그리고 55 ℃에서 50 % 포름아미드로 세척하며, 55 ℃에서 EDTA가 함유된 0.1 x SSC를 이용한 고엄격 세척을 수행하는 것이다.
"중간정도의 엄격 조건"이란 문헌 (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press 1989)에 기재된 바와 같고, 상기한 것보다 엄격성이 낮은 혼성화 조건 (예를 들어 온도, 이온 세기 및 %SDS)의 이용을 말한다. 중간정도의 엄격 조건의 예는 20% 포름아미드, 5 x SSC (150 mM 염화나트륨, 15 mM 시트르산삼나트륨), 50 mM 인산나트륨 (pH 7.6), 5 x Denhardt 용액, 10% 덱스트란 술페이트 및 20 mg/ml의 잘린 연어 정액 변성 DNA를 포함하는 용액 중에서 37℃로 밤새 인큐베이션한 후 필터를 약 37 내지 50℃에서 1 x SSC로 세척하는 조건이다. 당업계의 숙련가는 프로브 길이 등과 같은 인자에 맞추기 위해 필요한 온도, 이온 세기 등을 조절하는 방법을 잘 알 것이다.
본원에 사용된 "에피토프 태그를 붙인"란 용어는 "태그 폴리펩티드"에 융합된 CHEPO 폴리펩티드를 포함하는 키메라 폴리펩티드를 지칭한다. "태그 폴리펩티드"가 만들어질 수 있을 정도의 에피토프를 제공하기에 충분한 잔기를 갖지만 융합되는 CHEPO 폴리펩티드의 활성을 방해하지 않을 정도로 충분히 짧다. 태그 폴리펩티드는 아주 독특해서 자신에 대한 항체가 다른 에피토프와는 실질적으로 가교반응하지 않는 것이 바람직하다. 적절한 태그 폴리펩티드는 일반적으로 6개 이상의 아미노산 잔기를 가지며, 통상 약 8 내지 50개의 아미노산 잔기를 갖는다 (바람직하게는 약 10 내지 20개의 잔기).
본원에 사용된 용어 "이뮤노어드헤신"은 이뮤노글로불린 불변 도메인의 이펙터 기능과 이종 단백질 (어드헤신)의 결합 특이성을 겸비한 항체 유사 분자를 지칭한다. 구조적으로 보면 이뮤노어드헤신은 항체의 항원 인식 및 결합 부위가 아닌, 원하는 결합 특이성을 갖는 아미노산 서열과 이뮤노글로불린 불변 도메인 서열의 융합체를 포함한다. 이뮤노어드헤신 분자의 어드헤신 부분은 전형적으로 적어도 수용체 또는 리간드의 결합 부위를 포함하는 인접 아미노산 서열이다. 이뮤노어드헤신 중 이뮤노글로불린 불변 도메인 서열은 IgG-1, IgG-2, IgG-3, IgG-4 서브타입, IgA (IgA-1 및 IgA-2 포함), IgE, IgD 또는 IgM과 같은 임의의 이뮤노글로불린으로부터 얻을 수 있다.
본원에서 사용된 "활성의" 또는 "활성"은 천연 또는 자연발생 CHEPO 폴리펩티드의 생물학적 및(또는) 면역학적 활성을 보유하는 CHEPO 폴리펩티드의 형태(들)을 말하는데, 여기서 "생물학적" 활성이란 천연 또는 자연발생 CHEPO에 있는 항원성 에피토프에 대한 항체 생성을 유도하는 능력이 아니라, 천연 또는 자연발생 CHEPO에 의한 생물학적 기능 (억제 또는 촉진능)을 말하며, "면역학적" 활성이란 천연 또는 자연발생 CHEPO에 있는 항원성 에피토프에 대한 항체 생성을 유도하는 능력을 말한다. 바람직한 생물학적 활성으로는 예를 들어, 적혈구 생성을 조절하는 능력, 골수 및(또는) 기타 조혈 조직의 관련 전구세포의 표면 상의 수용체와 결합하는 능력, 및(또는) 적혈구의 증식 및(또는) 말기 성숙을 유도하는 능력이 있다.
용어 "길항제"는 가장 넓은 의미로 사용되며, 본원에 개시된 천연 CHEPO 폴리펩티드의 생물학적 활성을 부분적으로 또는 완전히 차단, 억제 또는 중화시키는 모든 분자를 통칭한다. 이와 비슷하게 용어 "아고니스트"도 가장 넓은 의미로 사용되며, 본원에 개시된 천연 CHEPO 폴리펩티드의 생물학적 활성을 흉내내는 모든 분자를 통칭한다. 적절한 아고니스트 또는 길항제 분자로는 구체적으로 아고니스트 또는 길항제의 항체 또는 항체의 단편, 천연 CHEPO 폴리펩티드의 단편 또는 아미노산 서열 변이체, 펩티드, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 작은 유기분자 등을 들 수 있다. CHEPO 폴리펩티드의 아고니스트 또는 길항제를 확인하는 방법은 CHEPO 폴리펩티드를 후보 아고니스트 분자나 후보 길항제 분자와 접촉시키고, CHEPO 폴리펩티드와 정상적으로 관련된 하나 이상의 생물학적 활성에서 검출가능한 변화를 측정하는 것을 포함할 수 있다.
"치료"는 표적 병태나 질병을 예방하거나 늦추기 (완화하기) 위한 목적으로 수행되는 치료와 예방 또는 방지 조치를 나타낸다. 치료를 요하는 대상은 이미 질병을 앓고 있는 대상 뿐만 아니라 질병에 걸리기 쉬운 대상 또는 질병을 예방하고자 하는 대상을 포함한다.
"만성" 투여란 급성 방식과 반대로 연속 방식으로 작용제(들)를 투여하여, 초기 치료 효과 (활성)를 장기간 동안 유지하는 것을 말한다. "간헐적" 투여는 중단없이 계속해서 행하는 것이 아니라 성질상 주기적으로 이루어지는 처치를 의미한다.
치료에 맞는 "포유동물"은 인간, 가축과 사육 동물, 및 동물원용, 경기용 또는 애완용 동물, 예를 들면, 개, 고양이, 소, 말, 양, 돼지, 염소, 토끼 등을 포함하는 포유동물로서 분류되는 모든 동물을 말한다. 바람직한 포유동물은 인간이다.
하나 이상의 다른 치료제와 "병행하여" 투여된다는 것은 동시에 (동시다발적으로) 투여하거나 어떤 순서로든 연속하여 투여하는 것을 포괄한다.
본원에서 사용되는 "담체"는 사용되는 투여량 및 농도에 노출되는 세포 또는 포유동물에 무독성인 제약상 허용되는 담체, 부형제, 또는 안정화제를 포함한다. 생리학상 허용되는 담체는 pH 완충 수용액이다. 생리학상 허용되는 담체의 예는 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산과 같은 완충액; 아스코르브산을 포함한 항산화제; 저분자량 (약 10 잔기 미만) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들어 혈청 알부민, 젤라틴 또는 이뮤노글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 라이신; 단당류, 이당류 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 비롯한 기타 탄수화물; 킬레이팅제, 예를 들어 EDTA; 당 알콜, 예를 들어 만니톨 또는 소르비톨; 염 형성 카운터 이온, 예를 들어 나트륨; 및(또는) 비이온계 계면활성제, 예를 들어 TWEEN, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 및 PLURONICS를 포함한다.
"항체 단편"은 온전한 항체의 일부, 바람직하게는 온전한 항체의 항원 결합 영역 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예로는 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편; 디아바디; 선형 항체 (Zapata et al., Protein Eng. 8 (10):1057-1062 (1995); 단쇄 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이성 항체 등이 있다.
항체를 파파인 (Papain) 분해하면 2개의 동일한 항원 결합 단편, 즉 단일 항원 결합 부위가 있는 각 "Fab" 단편, 및 쉽게 결정화되는 능력을 반영하여 이름 붙여진 나머지 "Fc" 단편이 생성된다. 펩신을 처리하면, 2개의 항원 결합 부위가 있으며 여전히 항원에 교차결합할 수 있는 F(ab')2 단편이 생성된다.
"Fv"는 완전한 항원 인식 및 항원 결합 부위를 포함하는 최소 항체 단편이다. 이 영역은 단단하게 비공유결합된 하나의 중쇄 가변 도메인과 하나의 경쇄 가변 도메인으로 이루어진 이량체로 구성된다. 이 구조에서는 각 가변 도메인의 CDR 3개가 상호작용하여 VH-VL 이량체의 표면에 항원 결합 부위를 형성한다. 결론적으로 보면, 6개의 CDR이 항체에 항원 결합 특이성을 부여한다. 그러나, 단일 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 단지 3개의 CDR만을 포함하는 Fv의 절반) 조차도 전체 결합 부위보다 친화성은 낮지만 항원을 인식하여 항원에 결합하는 능력을 갖는다.
또한, Fab 단편은 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인(CH1)을 함유한다. Fab 단편은 항체 힌지 (Hinge) 영역으로부터 유래한 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카르복시 말단에 몇 개의 잔기가 첨가되었다는 점에서 Fab 단편은 Fab' 단편과 상이하다. 본원에서 Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)이 유리 티올기를 보유하는 Fab'를 지칭한다. F(ab')2 항체 단편은 본래 그들 사이에 힌지 시스테인이 있는 몇쌍의 Fab' 단편으로 생성되었다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링도 공지되었다.
임의의 척추동물종으로부터 유래한 항체(이뮤노글로불린)의 "경쇄"는 그의 불변 도메인의 아미노산 서열을 기초로 하여 카파(κ) 및 람다(λ)로 불리는 2개의 명백하게 상이한 타입 중의 하나로 분류될 수 있다.
이뮤노글로불린은 그의 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라 상이한 클래스로 분류될 수 있다. 이뮤노글로불린에는 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM의 5개 주요 클래스가 있고, 이들 중 몇 개는 서브클래스(이소타입), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA 및 IgA2로 더 분류될 수 있다.
"단일쇄 Fv" 또는 "sFv" 항체 단편은 단일 폴리펩티드 사슬에 존재하는 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함한다. 바람직하게는, Fv 폴리펩티드는 sFv가 항원 결합에 필요한 구조를 형성하도록 하는 VH 및 VL 도메인 사이의 폴리펩티드 링커도 포함한다(sFv에 관해서는 문헌 (Pluckthan in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg 및 Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)) 참조).
용어 "디아바디 (diabody)"는 동일한 폴리펩티드 사슬 (VH-VL) 내에 경쇄 가변 도메인(VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함하는, 2개의 항원 결합 부위가 있는 작은 항체 단편을 말한다. 동일한 사슬에 있는 2개의 도메인을 페어링시키기에는 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 도메인을 다른 사슬의 상보성 도메인과 강제로 페어링시켜 2개의 항원 결합 부위를 생성시킨다. 디아바디는 예를 들어 EP 404,097, WO93/11611 및 Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)에 보다 상세하게 기재되어 있다.
"단리된" 항체란 자신의 천연 환경의 요소로부터 확인 및 분리 및(또는) 회수된 항체이다. 그의 천연 환경의 오염 요소는 항체의 진단 또는 치료적 사용을 방해하는 물질로서, 효소, 호르몬 및 다른 단백성 또는 비단백성 용질을 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 항체는 (1) 로우리(Lowry) 방법에 의해 측정시 95 중량% 초과, 가장 바람직하게는 99 중량% 초과의 항체로, 또는 (2) 스피닝 컵(spinning cup) 서열분석기를 사용하여 N 말단 또는 내부 아미노산의 잔기 15개 이상을 수득하기에 충분한 정도로, 또는 (3) 쿠마시 블루, 또는 바람직하게는 은 염색을 사용하여 환원 또는 비환원 조건 하에 SDS-PAGE에 의해 하나의 밴드로 정제될 것이다. 단리된 항체는 그 항체의 천연 환경의 하나 이상의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문에, 재조합 세포 내의 원위치에서의 항체를 포함한다. 그러나, 단리된 항체는 일반적으로 하나 이상의 정제 단계에 의해 정제될 것이다.
"표지 (label)"는 이 명세서에 사용될 때, 항체에 직간접적으로 접합되어 "표지된" 항체를 생성시키는 검출가능한 화합물 또는 조성물을 말한다. 표지는 그 자체로 (방사성동위원소 표지 또는 형광 표지) 검출될 수 있거나, 효소 표지인 경우에는 검출가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변경을 촉매할 수 있다.
"고상 (solid phase)"은 본 발명의 항체가 부착될 수 있는 비수성 매트릭스를 의미한다. 고상의 예는 부분적으로 또는 완전하게 형성된 유리 (예를 들어 세공 조절된 유리), 폴리사카라이드 (예를 들어 아가로스), 폴리아크릴아미드, 폴리스티렌, 폴리비닐 알콜 및 실리콘 등이 있다. 특정 실시양태에서, 내용에 따라 고상은 분석 플레이트의 웰을 포함할 수 있으며, 다른 실시양태에서 고상은 정제 컬럼 (예를 들어 친화 크로마토그래피 컬럼)이다. 이 용어는 또한 미국 특허 제4,275,149호에 기재된 것과 같은 별개 입자의 비연속적 고상도 포함한다.
"리포좀"은 약물 (예를 들어 PRO 폴리펩티드 또는 이에 대한 항체)을 포유동물에게 전달하는 데 유용한 여러 형태의 지질, 인지질 및(또는) 계면활성제로 이루어진 작은 베지클 (vesicle)이다. 리포좀의 성분들은 통상적으로 생체막의 지질 정렬과 유사하게 이중층 형태로 정렬된다.
"소분자 (작은 분자)"는 본원에서 분자량이 약 500 달톤 이하인 것으로 정의된다.
<표 1>
<표 2>
<표 3>
<표 4>
<표 5>
II. 본 발명의 조성물 및 방법
A. 전장 CHEPO 폴리펩티드
본 발명은 본원에서 CHEPO 폴리펩티드로 언급된 폴리펩티드를 코딩하는 새로이 확인되고 단리된 뉴클레오티드 서열에 관한 것이다. 특히, 하기 실시예에 보다 상세히 기재된 바와 같이, CHEPO 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA를 확인하고 단리하였다.
B. CHEPO 변이체
본원에서 설명되는 전장 천연 서열 CHEPO 폴리펩티드 외에, CHEPO 변이체를 제조할 수 있는 것으로 생각된다. CHEPO 변이체는 적합한 뉴클레오티드 변화를 CHEPO DNA에 도입하고(하거나) 목적 CHEPO 폴리펩티드를 합성하여 제조할 수 있다. 당업자라면 글리코실화 부위의 수 또는 위치의 변경 또는 멤브레인 앵커링 특성의 변화와 같은 아미노산 변화가 RPO의 번역후 프로세싱을 변경시킬 수 있다는 것을 이해할 것이다.
본원에서 설명되는 전장 천연 서열 CHEPO 또는 CHEPO의 여러 도메인에서의 변이는 예를 들어 미국 특허 제5,364,934호에 개시된 보존적 및 비보존적 돌연변이 기술 및 지침을 사용하여 제조할 수 있다. 변이는 천연 서열 CHEPO와 비교되는 것으로 CHEPO의 아미노산 서열이 변화된 CHEPO를 코딩하는 하나 이상의 코돈의 치환, 결실 또는 삽입일 수 있다. 임의로, 변이는 하나 이상의 CHEPO 도메인에서 하나 이상의 아미노산을 임의 다른 아미노산으로 치환함으로써 생성된다. 목적 활성에 유해한 효과를 주지 않으면서 삽입, 치환 또는 결실될 수 있는 아미노산 잔기는 CHEPO의 서열을 공지의 상동 단백질 분자의 서열과 비교하고 상동성이 높은 영역에서 생성된 아미노산 서열 변화의 수를 최소화함으로써 결정할 수 있다. 아미노산 치환은 하나의 아미노산을 유사한 구조 및(또는) 화학적 특성을 갖는 다른 아미노산으로 치환, 예를 들어 루이신의 세린으로의 치환, 즉 아미노산의 보존적 치환의 결과일 수 있다. 삽입 또는 결실은 임의로 약 1 내지 5개의 아미노산에서 발생할 수 있다. 허용되는 변이는 서열 내에 아미노산을 체계적으로 삽입, 결실 또는 치환시키고, 전장 또는 성숙 천연 서열에 의해 나타나는 생성된 변이체의 활성을 시험함으로써 정할 수 있다.
본원은 CHEPO 폴리펩티드 단편들을 제공한다. 예를 들어 전장 천연 단백질과 비교하는 경우, 이 단편들은 N-말단 또는 C-말단이 잘릴 수 있으며 내부 잔기가 결손될 수 있다. 몇몇 단편은 본 발명의 CHEPO 폴리펩티드의 목적 생물학적 활성에 필수적이지 않은 아미노산 잔기가 결손되어 있다.
CHEPO 단편은 많은 통상의 기술 중 임의 기술에 의해 제조할 수 있다. 목적 펩티드 단편은 화학적으로 합성할 수 있다. 다른 방법은 효소적 분해 방법, 예를 들어 이 단백질을 특정 아미노산 잔기에 의해 정해진 부위에서 단백질을 자르는 것으로 알려진 효소로 처리하거나 또는 이 DNA를 적합한 제한 효소로 잘라냄으로써 CHEPO 단편을 생성하고 이 목적 단편을 단리하는 것을 포함한다. 그러나, 또다른 적합한 기술은 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 목적 폴리펩티드 단편을 코딩하는 DNA 단편을 단리하고 증폭하는 것을 포함한다. DNA 단편의 목적 말단부를 정하는 올리고뉴클레오티드는 PCR에서 5' 및 3' 프라이머로 사용된다. 바람직하게는, CHEPO 폴리펩티드 단편은 도 3 (서열 2 및 5)에 나타낸 천연 CHEPO 폴리펩티드와 한가지 이상의 생물학적 및(또는) 면역학적 활성을 공유한다.
구체적인 실시태양에서, 목적물의 보존적 치환은 바람직한 치환이라는 표제로 표 6에 나타내었다. 이러한 치환에 의해 생물학적 활성이 변화하는 경우, 하기 표 6에서 치환예로서 명명되거나 아미노산 종류에 대해서 하기에서 보다 상세하게 설명된 보다 실질적인 변화를 도입하고 생성물을 스크리닝하였다.
<표 6>
CHEPO 폴리펩티드의 기능 또는 면역학적 동일성의 실질적인 변형은 (a) 치환 영역에서의 폴리펩티드 백본의 구조를, 예를 들어 시트 또는 나선 형태로서 유지하거나, (b) 표적 부위에서의 분자의 하전 또는 소수성을 유지하거나, 또는 (c) 대부분의 측쇄를 유지하는 그의 효과를 상당히 변경시키는 치환을 선택함으로써 수행된다. 자연 발생 잔기는 공통적인 측쇄 특성에 따라 다음과 같은 군으로 구분된다:
(1) 소수성: norleucine, met, ala, val, leu, ile;
(2) 중성 친수성: cys, ser, thr;
(3) 산성: asp, glu;
(4) 염기성: asn, gln, his, lys, arg;
(5) 사슬 배향에 영향을 미치는 잔기: gly, pro; 및
(6) 방향족; trp, tyr, phe.
비보존적 치환은 상기 한 종류의 구성 성분을 다른 종류의 것으로 교환시킬 것이다. 또한, 이렇게 치환되는 잔기는 보존적 치환 부위에 도입될 수 있거나 또는 보다 바람직하게는 나머지 (비보존) 부위에 도입될 수 있다.
변이는 올리고뉴클레오티드 매개 (위치 지정) 돌연변이 유발법, 알라닌 스캐닝법 및 PCR 돌연변이 유발법과 같은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제조할 수있다. 위치 지정 돌연변이 유발법 [Carter et al., Nucl. Acids Res.,13:4331 (1986); Zoller et al., Nucl. Acids Res.,10:6487 (1987)], 카세트 돌연변이 유발법 [Wells et al., Gene,34:315 (1985)], 제한 선택 돌연변이 유발법 [Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA,317:415 (1986)] 또는 다른 공지의 기술을 클로닝된 DNA에 실시하여 본 발명의 CHEPO 폴리펩티드 변이체 DNA를 제조할 수 있다.
또한, 스캐닝 아미노산 분석법을 사용하여 인접 서열을 따라 하나 이상의 아미노산을 확인할 수 있다. 바람직한 스캐닝 아미노산은 비교적 작은 중성 아미노산이다. 이러한 아미노산은 알라닌, 글리신, 세린 및 시스테인을 포함한다. 통상적으로, 알라닌은 베타-탄소 밖의 측쇄를 제거하고 변이체의 주쇄 배열을 변경시킬 가능성이 적기 때문에 바람직한 스캐닝 아미노산이다[Cunningham and Wells, Science, 244: 1081-1085 (1989)]. 또한, 알라닌은 통상적으로 가장 흔한 아미노산이기 때문에 바람직하다. 또한, 알라닌은 파묻힌 위치 및 노출된 위치 모두에서 빈번하게 발견된다 [Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150:1 (1976)]. 알라닌 치환이 적당한 양의 변이체를 생성시키지 않으면, 동배체(isoteric) 아미노산을 사용할 수 있다.
C. CHEPO의 변형
CHEPO의 공유결합 변형은 본 발명의 범위에 포함된다. 공유결합 변형의 한 형태는 CHEPO의 선택된 측쇄 또는 N 말단 또는 C 말단 잔기와 반응할 수 있는 유기 유도체화제와 CHEPO 폴리펩티드의 표적 아미노산 잔기를 반응시키는 것을 포함한다. 이관능성 작용제를 사용한 유도체화는 예를 들어 항-CHEPO 폴리펩티드 항체 정제 방법에 사용하기 위한 수불용성 지지체 매트릭스 또는 표면에 CHEPO를 가교결합시키거나 그 반대로 가교결합시키는데 유용하다. 통상 사용되는 가교결합제는 예를 들어 1,1-비스(디아조아세틸)-2-페닐에탄, 글루타르알데히드, N-히드록시숙신이미드 에스테르, 예를 들어 4-아지도살리실산과의 에스테르, 3,3'-디티오비스(숙신이미딜프로피오네이트)와 같은 디숙신이미딜 에스테르를 포함하는 동종이관능성 이미도에스테르, 비스-N-말레이미도-1,8-옥탄과 같은 이관능성 말레이미드 및 메틸-3-[(p-아지도페닐)디티오]프로피오이미데이트와 같은 물질을 포함한다.
다른 변형은 글루타미닐 및 아스파라기닐 잔기의 각각 대응하는 글루타밀 및 아스파르틸 잔기로의 탈아미드화, 프롤린 및 리신의 히드록실화, 세릴 또는 트레오닐 잔기의 히드록실기의 인산화, 리신, 아르기닌 및 히스티딘 측쇄의 알파-아미노기의 메틸화[T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86(1983)], N-말단 아민의 아세틸화 및 C-말단 카르복실기의 아미드화를 포함한다.
본 발명의 범위 내에 포함되는 CHEPO 폴리펩티드의 공유결합 변형의 다른 유형은 폴리펩티드의 천연 글리코실화 패턴의 변화를 포함한다. 본원에서 "천연 글리코실화 패턴의 변화"는 천연 서열 CHEPO에서 발견되는 하나 이상의 탄수화물 잔기의 결실(잠재적인 글리코실화 부위를 제거하거나 화학적 및(또는) 효소적 방법에 의해 글리코실화를 결실시킴으로써) 및(또는) 천연 서열 CHEPO에 존재하지 않는 하나 이상의 글리코실화 부위의 부가를 의미한다. 또한, 이 용어는 존재하는 다양한 탄수화물 잔기의 특성 및 비율의 변화를 비롯한 천연 단백질의 글리코실화에 있어 질적 변화를 포함한다.
CHEPO 폴리펩티드에 대한 글리코실화 부위의 부가는 아미노산 서열의 변화에 의해 달성될 수 있다. 변화는 예를 들어 천연 서열 CHEPO에 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기의 부가 또는 치환에 의해 이루어질 수 있다 (O-연결 글리코실화 부위의 경우). CHEPO 아미노산 서열은 특히 목적 아미노산으로 번역되는 코돈을 생성시키도록 CHEPO 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 미리 선택된 염기에서 돌연변이시킴으로써 DNA 수준에서의 변화를 통하여 임의로 변화시킬 수 있다.
CHEPO 폴리펩티드 상의 탄수화물 잔기의 수를 증가시키는 다른 수단은 글리코시드를 폴리펩티드에 화학적으로 또는 효소에 의해 커플링시키는 것이다. 이러한 방법은 예를 들어 1987년 9월 11일 공개된 WO 87/05330 및 문헌 [Aplin and Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981)]에 기재되어 있다.
CHEPO 폴리펩티드에 존재하는 탄수화물 잔기의 제거는 화학적으로 또는 효소에 의해 또는 글리코실화 표적으로 기능하는 아미노산 잔기를 코딩하는 코돈의 돌연변이에 의한 치환에 의해 달성될 수 있다. 화학적 탈글리코실화 기술은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Hakimuddin, et al., Arch. Biochem. Biophys., 259:52(1987) 및 Edge et al., Anal. Biochem., 118:131(1981)]에 기재되어 있다. 폴리펩티드 상의 탄수화물 잔기의 효소에 의한 절단은 다양한 엔도글리코시다제 및 엑소글리코시다제를 사용하여 달성할 수 있다 [Thotakura et al., Meth. Enzymol., 138:350(1987)].
CHEPO의 공유결합 변형의 다른 종류는 미국 특허 제4,640,835호, 동 제4,496,689호, 동 제4,301,144호, 동 제4,670,417호, 동 제4,791,192호 또는 동 제4,179,337호에 기재된 방식으로 다양한 비단백질성 중합체, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리프로필렌 글리콜 또는 폴리옥시알킬렌 중의 하나에 CHEPO 폴리펩티드를 연결시키는 것을 포함한다.
또한, 본 발명의 CHEPO는 다른 이종 폴리펩티드 또는 아미노산 서열에 융합된 CHEPO를 포함하는 키메라 분자를 형성하는 방식으로 변형될 수 있다.
본 발명의 한 실시태양에서, 이러한 키메라 분자는 항-태그 항체가 선택적으로 결합할 수 있는 에피토프를 제공하는 태그 폴리펩티드와 CHEPO의 융합체를 포함한다. 에피토프 태그는 일반적으로 CHEPO의 아미노 또는 카르복실 말단에 위치한다. 상기 에피토프 태그를 갖는 형태의 CHEPO의 존재는 태그 폴리펩티드에 대한 항체를 사용하여 검출할 수 있다. 또한, 에피토프 태그를 도입하면 항-태그 항체 또는 에피토프 태그에 결합하는 다른 종류의 친화성 매트릭스를 사용한 친화성 정제에 의해 CHEPO를 용이하게 정제할 수 있다. 다양한 태그 폴리펩티드 및 이들 각각의 항체는 당업계에 공지되어 있다. 그 예로는 폴리-히스티딘(poly-his) 또는 폴리-히스티딘-글리신 (poly-his-gly) 태그, flu HA 태그 폴리펩티드 및 그의 항체 12CA5 [Field et al., Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)], c-myc 태그 및 이에 대한 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 및 9E10 항체 [Evan et al., Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3636 (1985)], 및 단순포진 바이러스 당단백질 D (gD) 태그 및 그의 항체 [Paborsky et al., Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)]를 들 수 있다. 다른 태그 폴리펩티드는 Flag-펩티드 [Hopp et al., BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)], KT3 에피토프 펩티드 [Martin et al., Science, 255:192-194 (1992)], 알파-튜불린 에피토프 펩티드 [Skinner et al., J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)] 및 T7 유전자 10 단백질 태그 [Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990)]를 포함한다.
다른 한 실시태양에서, 키메라 분자는 CHEPO와 이뮤노글로불린 또는 이뮤노글로불린의 특정 영역의 융합체를 포함할 수 있다. 키메라 분자의 2가 형태("면역어드헤신"으로 언급하기도 함)의 경우, 융합체는 IgG 분자의 Fc 영역일 수 있다. 이 Ig 융합체는 바람직하게는 Ig 분자내 1개 이상의 가변성 영역의 부위를 CHEPO 폴리펩티드의 가용성(결실 또는 실활화된 막횡단 도메인) 형태로 치환한 것을 포함한다. 특히 바람직한 한 실시태양에서, 이뮤노글로불린 융합체는 IgG1 분자의 힌지, CH2 및 CH3, 또는 힌지, CH1, CH2 및 CH3 영역을 포함한다. 이뮤노글로불린 융합체를 생산하는 방법으로는, 1995년 6월 27일 간행된 미국 특허 제5,428,130호를 참조한다.
D. CHEPO의 제조
이하에 설명되는 내용은 주로 CHEPO 핵산을 함유하는 벡터로 형질전환 또는 형질감염된 세포를 배양함으로써 CHEPO를 제조하는 방법에 관한 것이다. 물론, 당업계에 공지된 다른 방법을 사용하여 CHEPO를 제조할 수 있다. 예를 들어, CHEPO 서열 또는 그의 단편은 고상 기술을 사용하는 직접 펩티드 합성법에 의해 제조할 수 있다 [문헌 (Stewart et al., Solid -Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963))을 참조한다]. 시험관 내 단백질 합성은 수동 방법 또는 자동 방법에 의해 수행될 수 있다. 자동 합성법은 예를 들어 어플라이드 바이오시스템즈 펩티드 합성기( Applied Biosystems Peptide Synthesizer)(미국 캘리포니아주 포스터시티 소재)를 제조사의 지시에 따라 사용하여 수행할 수 있다. CHEPO의 상이한 단편을 별도로 화학적으로 합성하고 화학적 또는 효소적 방법을 사용하여 조합함으로써 전장 CHEPO를 제조할 수 있다.
1. CHEPO를 코딩하는 DNA의 단리
CHEPO를 코딩하는 DNA는 CHEPO mRNA를 보유하여 그를 검출가능한 수준으로 발현할 것으로 생각되는 조직으로부터 제조한 cDNA 라이브러리로부터 수득할 수 있다. 따라서, 인간 CHEPO DNA는 실시예에서 설명되는 바와 같이 인체 조직으로부터 제조된 cDNA 라이브러리로부터 편리하게 수득할 수 있다. CHEPO 코딩 유전자는 또한 게놈 라이브러리로부터 수득하거나 또는 공지된 합성 방법(예를 들어, 자동 핵산 합성 방법)에 의해 수득할 수 있다.
라이브러리는 목적 유전자 또는 이 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 확인하기 위해 고안된 프로브 (예를 들어, 목적하는 CHEPO에 대한 항체 또는 약 20 내지 80개 이상의 염기로 구성된 올리고뉴클레오티드)를 사용하여 스크리닝할 수 있다. 선택된 프로브를 사용한 cDNA 또는 게놈 라이브러리의 스크리닝은 예를 들어 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Haror Laboratory Press, 1989)]에 기재된 바와 같은 표준 방법을 사용하여 수행할 수 있다. CHEPO를 코딩하는 유전자를 단리하는 다른 수단은 PCR 방법을 사용하는 것이다 [Sambrook et al., 상기 문헌; Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laboratory Manual (Cold Spring Haror Laboratory Press, 1995)].
하기 실시예는 cDNA 라이브러리를 스크리닝하는 기술을 설명한다. 프로브로서 선택된 올리고뉴클레오티드 서열은 가양성 결과를 최소화하기 위해서 충분한 길이를 갖고 충분히 분명한 서열이어야 한다. 올리고뉴클레오티드는 스크리닝되는 라이브러리에서 DNA에 혼성화시에 검출될 수 있도록 표지되는 것이 바람직하다. 표지 방법은 당업계에 공지되어 있고, 32P-표지된 ATP와 같은 방사성 표지, 비오티닐화 또는 효소 표지의 사용을 포함한다. 중간정도 엄격성 및 높은 엄격성을 포함하는 혼성화 조건은 문헌 (Sambrook et al., 상기 문헌)에서 제공된다.
상기 라이브러리 스크리닝 방법에서 확인된 서열은 GenBank와 같은 공용 데이타베이스 또는 다른 독점 서열 데이타베이스에 기탁되고 입수될 수 있는 다른 공지의 서열과 비교하여 정렬시킬 수 있다. 분자의 한정된 영역 내 또는 전장 서열에 걸친 서열 동일성 (아미노산 또는 뉴클레오티드 수준에서)은 선행 기술 공지된 방법 및 본원에서 설명된 방법을 이용하여 결정할 수 있다.
단백질 코딩 서열을 갖는 핵산은 먼저 본원에서 개시된 추정 아미노산 서열을 사용하고 필요하다면 전구체를 검출하기 위해 문헌 (Sambrook et al., 상기 문헌)에 기재된 통상의 프라이머 신장 방법을 사용하여, 선택된 cDNA 또는 게놈 라이브러리를 스크리닝하고, cDNA로 역전사되지 않은 mRNA의 중간체를 프로세싱함으로써 수득할 수 있다.
2. 숙주 세포의 선택 및 형질전환
숙주 세포는 CHEPO 생산을 위해 본원에서 설명한 발현 또는 클로닝 벡터로 형질감염 또는 형질전환되고 프로모터 유도, 형질전환체 선택 또는 목적 서열을 코딩하는 유전자 증폭에 적합하게끔 개질된 통상의 영양 배지 중에서 배양된다. 당업자라면 불필요한 실험을 수행하지 않고서도 배지, 온도, pH 등과 같은 배양 조건을 선택할 수 있다. 일반적으로, 세포 배양물의 생산성을 최대화하기 위한 원칙, 프로토콜 및 실시되는 기술은 문헌 [Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991) 및 Sambrook et al., 상기 문헌]에서 찾을 수 있다.
진핵세포 형질감염 방법 및 원핵세포 형질전환 방법, 예를 들어 CaCl2, CaPO4, 리포솜-매개 방법 및 일렉트로포레이션은 당업계의 숙련가에게 공지되어 있다. 사용되는 숙주 세포에 따라, 형질전환은 상기 세포에 적합한 표준 기술을 사용하여 수행된다. 문헌 (Sambrook et al., 상기 문헌)에 기재된 염화칼슘법을 이용하는 칼슘 처리, 또는 일렉트로포레이션은 일반적으로 원핵세포에 대해 사용된다. 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)를 사용한 감염은 문헌 [Shaw et al., Gene, 23:315(1983) 및 1989년 6월 29일 공개된 WO 89/05859]에 기재된 바와 같이 특정 식물 세포의 형질전환에 사용된다. 상기 세포벽이 없는 포유동물 세포의 경우, 문헌 [Graham and van der Eb, Virology, 52:456-457 (1978)]의 인산칼슘 침전법을 사용할 수 있다. 포유동물 세포 숙주 시스템 형질감염의 일반적인 특징은 미국 특허 제4,399,216호에 기재되어 있다. 효모 내로의 형질전환은 일반적으로 문헌 [Van Solingen et al., J. Bact., 130:949(1977) 및 Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci.(USA), 76:3829(1979)]의 방법에 따라 수행된다. 그러나, 세포 내로 DNA를 도입하는 다른 방법, 예를 들어 핵내 미세주입, 일렉트로포레이션, 원형 세포와 세균 원형질체 융합, 또는 다원양이온(polycation), 예를 들어 폴리브렌, 폴리오르니틴도 사용할 수 있다. 포유동물 세포의 형질전환을 위한 여러 기술에 대해서는 문헌 [Keown et al., Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990) 및 Mansour et al., Nature, 336:348-352 (1988)]을 참조한다.
본원에서 벡터 내의 DNA를 클로닝 또는 발현하기에 적합한 숙주 세포에는 원핵세포, 효모 또는 고등 진핵세포가 포함된다. 적합한 원핵세포는 진정세균, 예를 들어 그람 음성 또는 그람 양성 생물, 예를 들어 엔테로박테리아세애(Enterobacteriaceae), 예를 들어 이. 콜라이를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 다양한 이. 콜라이 균주, 예를 들어 이. 콜라이 K12 균주 MM294 (ATCC 31,446), 이. 콜라이 X1776 (ATCC 31,537), 이. 콜라이 균주 W3110 (ATCC 27,325) 및 K5 772 (ATCC 53,635)는 용이하게 입수할 수 있다. 다른 적합한 원핵생물 숙주 세포는 에셔리키아(Eshcerichia), 예를 들어 이. 콜라이, 엔테로박터 (Enterobacter), 에르위니아 (Erwinia), 클렙시엘라 (Klebsiella), 프로테우스 (Proteus), 살모넬라 (Salmonella), 예를 들어 살모넬라 티피무리움 (typhimurium), 세라티아 (Serratia), 예를 들어 세라티아 마르세스칸스 (marcescans) 및 시겔라 (Shigella)와 같은 장내세균과(Enterobacteriaceae), 및 바실러스 (Bacillus), 예를 들어 비. 서브틸리스 (subtilis) 및 비. 리체니포르미스 (licheniformis) (예를 들어, 1989년 4월 12일자로 공고된 DD 266,710호에 기재된 비. 리체니포르미스 41P), 슈도모나스 (Pseudomonas), 예를 들어 피. 아에루기노사 (aeruginosa) 및 스트렙토마이세스 (Streptomyces)를 포함한다. 이러한 예는 단지 예시적인 것으로서 이에 제한되는 것은 아니다. 균주 W3110은 재조합 DNA 산물 발효에 공통적인 숙주 균주이기 때문에 특히 바람직한 숙주 또는 모 숙주이다. 바람직하게는, 숙주 세포는 최소량의 단백질 분해 효소를 분비한다. 예를 들어, 균주 W3110은 숙주의 내생 단백질을 코딩하는 유전자의 돌연변이를 초래하도록 변형될 수 있고, 이러한 숙주의 예는 완전한 유전자형 tonA를 갖는 이. 콜라이 W3110 균주 1A2, 완전한 유전자형 tonA ptr3을 갖는 이. 콜라이 W3110 균주 9E4, 완전한 유전자형 tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT kanr를 갖는 이. 콜라이 W3110 균주 27C7 (ATCC 55,244), 완전한 유전자형 tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT rbs7 ilvG kanr를 갖는 이. 콜라이 W3110 균주 37D6, 비-카나마이신 내성 degP 결실 돌연변이를 갖는 균주 37D6인 이. 콜라이 W3110 균주 40B4 및 1990년 8월 7일 공포된 미국 특허 제4,946,783호에 개시된 페리플라즘 프로테아제 변이체를 갖는 이. 콜라이 균주를 포함한다. 별법으로, 시험관내 클로닝 방법, 예를 들어 PCR 또는 다른 핵산 폴리머라제 반응이 적합하다.
원핵세포 외에, 섬유상 진균 또는 효모와 같은 진핵 미생물이 CHEPO-코딩 벡터의 클로닝 또는 발현 숙주로서 적합하다. 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae)가 일반적으로 사용되는 하등 진핵 숙주 미생물이다. 다른 미생물에는 시조사카로마이세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe) (Beach and Nurse, Nature, 290: 140 [1981]; 1985년 5월 2일 공고된 EP 139,383); 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 숙주 (미국 특허 제4,943,529호; Fleer et al., Bio/Technology, 9:968-975 (1991)), 예를 들어 케이. 락티스 (lactis) (MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt et al., J. Bacteriol., 737 [1983]), 케이. 프라길리스 (fragilis) (ATCC 12,424), 케이. 불가리쿠스(bulgaricus) (ATCC 16,045), 케이. 위케라미 (wickeramii) (ATCC 24,178), 케이. 왈티이 (waltii) (ATCC 56,500), 케이. 드로소필라룸 (drosophilarum) (ATCC 36,906; Van den Berg et al., Bio/Technology, 8:135(1990)), 케이. 테르모톨레란스 (thermotolerans) 및 케이. 막시아누스 (marxianus); 야로위아 (yarrowia) (EP 402,226); 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris) (EP 183,070; Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol., 28:265-278 [1988]); 칸디다 (Candida); 트리코데르마 레에시아(Trichoderma reesia)(EP 244,234); 뉴로스포라 크라사 (Neurospora crassa; Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:5259-5263 [1979]); 시와니오마이세스 (Schwanniomyces), 예를 들어 시와니오마이세스 옥시덴탈리스 (occidentalis) (1990년 10월 31일 공고된 EP 394,538); 및 섬유상 진균, 예를 들어 뉴로스포라, 페니실리움 (Penicillium), 톨리포클라디움 (Tolypocladium) (1991년 1월 10일 공고된 WO 91/00357) 및 아스퍼길러스 (Aspergillus) 숙주, 예를 들어 에이. 니둘란스 (nidulans) (Ballance et al,, Biochem. Biophys. Res. Commun., 112:284-289 [1983]; Tilburn et al., Gene, 26:205-221 [1983]; Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1470-1474 [1984]) 및 에이. 니게르 (niger) (Kelly and Hynes, EMBO J., 4: 475-479 [1985])가 포함된다. 메틸 영양 요구성 효모가 적합하고, 한세눌라 (Hansenula), 칸디다 (Candida), 클로엑케라 (Kloeckera), 피치아, 사카로마이세스, 토룰롭시스(Torulopsis) 및 로도토룰라(Rhodotorula)로 이루어지는 속으로부터 선택된, 메탄올 상에서 성장할 수 있는 효모를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 이들 종류의 효모의 예인 구체적인 종의 목록은 문헌 [C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982)]에 기재되어 있다.
글리코실화 CHEPO의 발현에 적합한 숙주 세포는 다세포 생물로부터 유래한다. 무척추동물 세포의 예에는 드로소필라 S2 및 스포도프테라 Sf9와 같은 곤충 세포 및 식물 세포가 포함된다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 예에는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 및 COS 세포가 포함된다. 보다 구체적인 예에는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 라인 (COS-7, ATCC CRL 1651), 인간 배아 신장 라인 (293 세포 또는 현탁 배양액 중의 성장을 위해 서브클로닝된 293 세포, Graham et al., J. Gen Virol., 36:59(1997)), 차이니즈 햄스터 난소 세포/-DHFR (CHO, Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)), 마우스 세르톨리 세포 (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)), 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75), 인간 간세포 (Hep G2, HB 8065) 및 마우스 유방 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51)이 포함된다. 당업계의 숙련가라면 적합한 숙주 세포를 선택할 수 있다.
3. 복제가능 벡터의 선택 및 사용
CHEPO를 코딩하는 핵산 (예를 들어, cDNA 또는 게놈 DNA)은 클로닝 (DNA의 증폭) 또는 발현을 위한 복제가능 벡터에 삽입할 수 있다. 다양한 벡터를 용이하게 구할 수 있다. 예를 들어, 벡터는 플라스미드, 코스미드, 바이러스 입자 또는 파지의 형태일 수 있다. 적합한 핵산 서열은 다양한 방법에 의해 벡터 내에 삽입될 수 있다. 일반적으로, 당업계에 공지된 기술을 사용하여 DNA를 적합한 제한 엔도뉴클레아제 부위(들) 내에 삽입한다. 벡터 성분은 일반적으로 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 성분, 프로모터 및 전사 종결 서열을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 성분을 하나 이상 포함하는 적합한 벡터의 제조는 당업계의 숙련가에게 공지된 표준 라이게이션 기술을 사용한다.
CHEPO는 직접 재조합 방법에 의해 생산될 수 있을 뿐만 아니라 성숙 단백질 또는 폴리펩티드의 N-말단에서 특이적 절단 부위를 갖는 다른 폴리펩티드 또는 신호 서열일 수 있는 이종 폴리펩티드와의 융합 폴리펩티드로서 생산될 수 있다. 일반적으로, 신호 서열은 벡터의 성분일 수 있거나 또는 벡터 내로 삽입된 CHEPO-코딩 DNA의 일부일 수 있다. 신호 서열은 예를 들어 알칼리 포스파타제, 페니실리나제, lpp 또는 열안정성 엔테로톡신 II 리더의 군으로부터 선택된 원핵생물 신호 서열일 수 있다. 효모 분비를 위해, 신호 서열은 예를 들어 효모 인버타제 리더, α 인자 리더 (사카로마이세스 및 클루이베로마이세스 α-인자 리더 (미국 특허 제5,010,182호)를 포함함) 또는 산 포스파타제 리더, 씨. 알비칸스 (C. albicans) 글루코아밀라제 리더 (1990년 4월 4일 공고된 EP 362,179) 또는 1990년 11월 15일 공개된 WO 90/13646에 기재된 신호 서열일 수 있다. 포유동물 세포 발현에서, 포유동물 신호 서열, 예를 들어 동일하거나 관련된 종의 분비 폴리펩티드로부터의 신호 서열 및 바이러스 분비 리더를 사용하여 단백질의 분비를 지시할 수 있다.
발현 및 클로닝 벡터 모두는 벡터가 선택된 1종 이상의 숙주 세포에서 복제할 수 있도록 만드는 핵산 서열을 함유한다. 이러한 서열은 다양한 세균, 효모 및 바이러스에 대해 공지되어 있다. 플라스미드 pBR322로부터의 복제 기점은 대부분의 그람 음성 세균에 적합하고, 2μ 플라스미드 기점은 효모에 적합하고, 다양한 바이러스 기점 (SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, VSV 또는 BPV)은 포유동물 세포에서 벡터를 클로닝하는데 유용하다.
발현 및 클로닝 벡터는 통상적으로 선택가능한 마커로도 불리우는 선택 유전자를 함유할 것이다. 대표적인 선택 유전자, 예를 들어 바실러스 (Bacillus)의 경우 D-알라닌 라세마제를 코딩하는 유전자는 (a) 항생제 또는 다른 독소, 예를 들어 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트 또는 테트라싸이클린에 내성을 부여하는 단백질, (b) 영양요구성 결함을 보완하는 단백질 또는 (c) 복합 배지로부터 이용할 수 없는 중요한 영양물질을 공급하는 단백질을 코딩한다.
포유동물 세포에 적합한 선택가능한 마커의 예는 CHEPO 코딩 핵산을 수용할 수 있는 세포의 동정을 가능하게 하는 것, 예를 들어 DHFR 또는 티미딘 키나제이다. 야생형 DHFR이 이용될 경우, 적합한 숙주 세포는 DHFR 활성이 결여된 CHO 세포주이고, 문헌 [Urlaub et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)]에 기재된 바와 같이 제조 및 증식된다. 효모에 사용하는데 적합한 선택 유전자는 효모 플라스미드 YRp7에 존재하는 trp1 유전자이다 [Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979); Kingsman et al., Gene, 7:141 (1979); Tschemper et al., Gene, 10:157 (1980)]. trp1 유전자는 트립토판으로의 성장능이 결여된 효모의 변이주 (예를 들어, ATCC 44076 또는 PEP4-1)에 대한 선택 마커를 제공한다 [Jones, Genetics, 85: 12 (1977)].
발현 및 클로닝 벡터는 일반적으로 mRNA 합성을 지시하는 CHEPO 코딩 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 함유한다. 다양한 잠재적인 숙주 세포에 의해 인식되는 프로모터는 공지되어 있다. 원핵생물 숙주에 사용하기에 적합한 프로모터에는 β-락타마제 및 락토스 프로모터 시스템 [Chang et al., Nature, 275:615 (1978); Goeddel et al., Nature, 281:544 (1979)], 알칼리 포스파타제, 트립토판 (trp) 프로모터 시스템 [Goeddel, Nucleic acid Res., 8:4057 (1980); EP 36,776], 및 하이브리드 프로모터, 예를 들어 tac 프로모터 [deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)]를 포함한다. 또한, 세균계에서 사용되는 프로모터는 CHEPO를 코딩하는 DNA에 작동가능하게 연결된 샤인-달가노 (S.D.) 서열을 함유할 것이다.
효모 숙주에 사용하기 적합한 프로모터 서열의 예는 3-포스포글리세레이트 키나제 [Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)] 또는 다른 당분해 효소 [Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968); Holland, Biochemistry, 17:4900 (1978)], 예를 들어 에놀라제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 디히드로게나제, 헥소키나제, 피루베이트 디카르복실라제, 포스포프룩토키나제, 글루코스-6-포스페이트 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 뮤타제, 피루베이트 키나제, 트리오스포스페이트 이소머라제, 포스포글루코스 이소머라제 및 글루코키나제에 대한 프로모터를 포함한다.
성장 조건에 의해 조절되는 전사의 추가의 이점을 갖는 유도가능한 프로모터인 다른 효모 프로모터는 알코올 디히드로게나제 2, 이소시토크롬 C, 산 포스파타제, 질소 대사에 관련된 분해 효소, 메탈로티오네인, 글리세르알데히드-3-포스페이트 디히드로게나제, 및 말토스 및 갈락토스 이용에 작용하는 효소에 대한 프로모터 영역이다. 효모 발현에 사용하기에 적합한 벡터 및 프로모터는 추가로 EP 제73,657호에 기재되어 있다.
포유동물 숙주 세포내의 벡터로부터의 CHEPO 전사는 바이러스, 예를 들어 폴리오마 바이러스, 계두 바이러스 (1989년 7월 5일 공고된 UK 2,211,504호), 아데노바이러스 (예를 들어, 아데노바이러스 2), 소 유두종 바이러스, 조류 육종 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스 및 원숭이 바이러스 40 (SV40)의 게놈으로부터 얻어진 프로모터, 이종 포유동물 프로모터, 예를 들어 액틴 프로모터 또는 이뮤노글로불린 프로모터 및 열-충격 프로모터로부터 얻어진, 숙주 세포계에 적합성인 프로모터에 의해 조절된다.
고등 진핵세포에 의한 CHEPO를 코딩하는 DNA의 전사는 인핸서 서열을 벡터에 삽입함으로써 증가될 수 있다. 인핸서는 일반적으로 전사를 증가시키기 위해 프로모터에 대해 작용하는, 약 10 내지 300 bp의 DNA의 시스-액팅 성분이다. 많은 인핸서 서열은 포유동물 유전자 (글로빈, 엘라스타제, 알부민, α-페토단백질 및 인슐린)로부터 유래하는 것으로 알려져 있다. 그러나, 통상적으로 진핵세포 바이러스로부터 유래한 인핸서를 사용할 것이다. 그 예는 복제 기점의 뒷부분 상의 SV40 인핸서 (bp 100-270), 사이토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 기점의 뒷부분 상의 폴리오마 인핸서, 및 아데노바이러스 인핸서를 포함한다. 인핸서는 CHEPO 코딩 서열에 5' 또는 3' 위치에서 벡터에 스플라이싱될 수 있지만, 프로모터로부터 5' 부위에 위치하는 것이 바람직하다.
또한, 진핵생물 숙주 세포 (효모, 진균, 곤충, 식물, 동물, 인간 또는 다른 다세포 생물로부터 유래한 다핵 세포)에 사용되는 발현 벡터는 전사 종결 및 mRNA 안정화에 필요한 서열을 포함할 수 있을 것이다. 그러한 서열은 통상적으로 진핵세포 또는 바이러스 DNA 또는 cDNA의 5' 및 때로는 3' 비번역 영역으로부터 확보된다. 이들 영역은 CHEPO를 코딩하는 mRNA의 비번역 부분에서 폴리아데닐화 단편으로서 전사되는 뉴클레오티드 단편을 포함한다.
재조합 척추동물 세포 배양에서 CHEPO의 합성에 적용하는데 적합한 다른 방법, 벡터 및 숙주 세포는 문헌 [Gething et al., Nature, 293:620-625 (1981); Mantei et al., Nature, 281:40-46 (1979); EP 117,060 및 EP 117,058]에 기재되어 있다.
4. 유전자 증폭/발현의 검출
유전자 증폭 및(또는) 발현은 예를 들어 통상의 서던 블로팅, mRNA의 전사를 정량하기 위한 노던 블로팅 [Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 (1980)], 도트 블로팅 (DNA 분석) 또는 본원에서 제공된 서열을 기초로 하여 적절하게 표지된 프로브를 사용한 in situ 혼성화에 의해 시료에서 직접 측정할 수 있다. 별법으로, DNA 이중쇄, RNA 이중쇄 및 DNA-RNA 혼성 이중쇄 또는 DNA-단백질 이중쇄를 비롯한 특정 이중쇄를 인식할 수 있는 항체를 사용할 수 있다. 바꾸어 말하면, 항체를 표지하고, 상기 이중쇄를 표면에 결합시켜, 표면 상에 이중쇄가 형성될 때 이중쇄에 결합한 항체의 존재를 검출할 수 있는 분석을 수행할 수 있다.
별법으로, 유전자 발현은 세포 또는 조직 절편의 면역조직화학적 염색과 같은 면역학적 방법 및 유전자 산물의 발현을 직접 정량하기 위한 세포 배양액 또는 체액의 분석에 의해 측정할 수 있다. 면역조직화학적 염색 및(또는) 시료 유체의 분석에 유용한 항체는 모노클로날 또는 폴리클로날 항체일 수 있고, 임의 포유동물에서 제조할 수 있다. 편리하게는, 천연 CHEPO 폴리펩티드 또는 본원에서 제공되는 DNA 서열을 기초로 한 합성 펩티드 또는 CHEPO DNA에 융합되고 특정 항체 에피토프를 코딩하는 외인성 서열에 대한 항체를 제조할 수 있다.
5. 폴리펩티드의 정제
CHEPO의 형태는 배양 배지 또는 숙주 세포 용균액으로부터 회수될 수 있다. 멤브레인에 결합하는 경우, 적합한 세제 용액 (예를 들어 Triton-X 100)을 사용하거나 효소의 절단에 의해 멤브레인으로부터 방출될 수 있다. CHEPO의 발현에 사용된 세포는 동결-해동 싸이클, 초음파 처리, 기계적 분쇄 또는 세포 용균제와 같은 다양한 물리적 또는 화학적 수단에 의해 분쇄시킬 수 있다.
재조합 세포 단백질 또는 폴리펩티드로부터 CHEPO를 정제하는 것이 바람직할 수 있다. 적합한 정제 방법의 예는 이온 교환 컬럼 상에서의 분획화, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 또는 양이온 교환 수지, 예를 들어 DEAE 상에서의 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE, 황산암모늄 침전, 예를 들어 Sephadex G-75를 사용한 겔 여과, IgG와 같은 오염물질을 제거하기 위한 단백질 A 세파로스 컬럼 및 CHEPO의 에피토프 태그 형태를 결합시키기 위한 금속 킬레이팅 컬럼이다. 다양한 단백질 정제 방법을 사용할 수 있으며, 이러한 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌 [Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982)]에 기재되어 있다. 선택되는 정제 단계(들)은 예를 들어 사용되는 생산 방법 및 생산되는 특정 CHEPO의 특성에 따라 결정될 것이다.
E. CHEPO의 용도
CHEPO를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 (또는 그의 상보체)는 혼성화 프로브로서의 용도를 비롯한 분자생물학 분야, 염색체 및 유전자 맵핑 및 안티센스 RNA 및 DNA의 제조에서 다양한 용도를 갖는다. 또한, CHEPO 코딩 핵산은 본원에서 설명되는 재조합 기술에 의한 CHEPO 폴리펩티드의 제조에도 유용할 것이다.
전장 천연 서열 CHEPO 유전자 또는 그의 단편은 본원에서 개시된 천연 CHEPO 서열과 목적하는 서열 동일성을 갖는 전장 CHEPO cDNA 또는 다른 cDNA (예를 들어 CHEPO의 자연 발생 변이체 또는 다른 종으로부터의 CHEPO를 코딩하는 유전자)를 단리하기 위한 cDNA 라이브러리에 대한 혼성화 프로브로서 사용할 수 있다. 임의로, 프로브의 길이는 약 20 내지 약 50개의 염기일 것이다. 혼성화 프로브는 전장 천연 뉴클레오티드 서열의 새로운 영역(여기서, 이 영역은 불필요한 실험 없이도 결정할 수 있음)의 적어도 일부 또는 천연 서열 CHEPO의 프로모터, 인핸서 성분 및 인트론을 포함하는 게놈 서열로부터 유도될 수 있다. 예를 들면, 스크리닝 방법은 약 40 염기의 선택된 프로브를 합성하기 위해서 공지의 DNA 서열을 사용하여 CHEPO 유전자의 코딩 영역을 단리하는 것을 포함할 것이다. 혼성화 프로브는 32P 또는 35S와 같은 방사성 뉴클레오티드 또는 아비딘/비오틴 커플링 시스템을 통하여 프로브에 커플링된 알칼리 포스파타제와 같은 효소 표지를 비롯한 다양한 표지에 의해 표지할 수 있다. 본 발명의 CHEPO 유전자와 상보적인 서열을 갖는 표지된 프로브를 사용하여 인간 cDNA, 게놈 DNA 또는 mRNA의 라이브러리를 스크리닝함으로써 프로브가 혼성화하는 상기 라이브러리의 구성원을 결정할 수 있다. 혼성화 기술은 하기 실시예에서 보다 상세하게 설명된다.
본원에 개시된 임의 EST 서열은 본원에서 설명된 방법을 사용하여 프로브로서 유사하게 사용될 수 있다.
다른 유용한 CHEPO 핵산의 단편에는 표적 CHEPO mRNA(센스) 또는 CHEPO DNA(안티센스) 서열과 결합할 수 있는 단일-가닥 핵산 서열(RNA 또는 DNA)을 포함하는 안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드가 포함된다. 본 발명에 따른 안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드는 CHEPO DNA의 코딩 영역의 단편을 포함한다. 이 단편은 일반적으로 약 14개 이상의 뉴클레오티드, 바람직하게는 약 14개 내지 30개의 뉴클레오티드를 포함한다. 해당 단백질을 코딩하는 cDNA 서열을 토대로 한 안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드를 유도하는 능력은 예를 들어 문헌 [Stein and Cohen(Cancer Res. 48:2659, 1988) 및 van der Krol et al. (BioTechniques 6:958, 1988)]에 기재되어 있다.
안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드와 표적 핵산 서열의 결합은 이중쇄의 강화된 분해, 전사 또는 번역의 조기 종결을 비롯한 여러 방법 또는 다른 방법 중 하나에 의해 표적 서열의 전사 또는 번역을 차단하는 이중쇄를 형성시킨다. 따라서, 안티센스 올리고뉴클레오티드를 사용하여 CHEPO 단백질의 발현을 차단할 수 있다. 또한, 안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드는 변형된 당-포스포디에스테르 백본 (또는 다른 당 연쇄, 예를 들어 WO 91/06629에 개시된 당 연쇄)을 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함하며, 여기서 이러한 당 연쇄는 내부 뉴클레아제에 대한 내성이 있다. 내성이 있는 당 연쇄를 갖는 이러한 올리고뉴클레오티드는 생체내에서 안정(즉, 효소 분해에 대해 내성이 있음)하지만, 표적 뉴클레오티드 서열과 결합할 수 있는 서열 특이성을 보유한다.
센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 다른 예에는 유기 잔기, 예를 들어 WO 90/10048에 개시된 잔기 및 표적 핵산 서열에 대한 올리고뉴클레오티드의 친화성을 증가시키는 다른 잔기, 예를 들어 폴리-(L-라이신)과 공유적으로 연결되는 올리고뉴클레오티드가 포함된다. 또한, 엘립티신과 같은 인터칼레이트제, 및 알킬화제 또는 금속 복합체를 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드에 연결하여 표적 뉴클레오티드 서열에 대한 안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드의 결합 특이성을 변화시킬 수 있다.
예를 들어, CaPO4-매개 DNA 형질감염법, 엘렉트로포레이션을 비롯한 임의 유전자 전달 방법에 의하거나 엡스타인-바(Epstein-Barr) 바이러스와 같은 유전자 전달 벡터를 사용함으로써 표적 핵산 서열을 포함하는 세포에 안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드를 도입할 수 있다. 바람직한 한 방법으로는, 안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드를 적합한 레트로바이러스 벡터에 삽입한다. 표적 핵산 서열을 포함하는 세포는 생체내 또는 생체외에서 재조합 레트로바이러스 벡터와 접촉한다. 적합한 레트로바이러스 벡터에는 쥐과 레트로바이러스 M-MuLV, N2(M-MuLV로부터 유도된 레트로바이러스), 또는 DCT5A, DCT5B 및 DCT5C(WO 90/13641을 참조한다)로 지칭되는 이중 카피 벡터로부터 유도된 벡터가 포함되나 이에 한정되지 않는다.
또한, WO 91/04753에 개시된 바와 같이, 리간드 결합 분자와 복합체를 형성함으로써 표적 뉴클레오티드 서열을 포함하는 세포에 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 도입할 수 있다. 적합한 리간드 결합 분자에는 세포 표면 수용체, 증식 인자, 다른 시토킨, 또는 세포 표면 수용체와 결합하는 다른 리간드가 포함되나 이에 한정되지 않는다. 바람직하게는, 리간드 결합 분자의 연결은, 리간드 결합 분자가 그의 상응하는 분자 또는 수용체와 결합하는 능력을 실제적으로 방해하지 않거나, 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 그의 복합체 형태의 세포내 진입을 차단하지 않는다.
별법으로, WO 90/10448에 개시된 바와 같이, 올리고뉴클레오티드-지질 복합체를 형성함으로써 표적 핵산 서열을 포함하는 세포내에 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 도입할 수 있다. 이러한 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드-지질 복합체는 바람직하게는 세포내에서 내부 리파제에 의해 분리된다.
또한, 상기 프로브를 PCR 기술에서 사용하여 밀접하게 관련된 CHEPO 코딩 서열의 확인을 위한 일군의 서열을 생성시킬 수 있다.
또한, CHEPO를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 사용하여 CHEPO를 코딩하는 유전자의 맵핑 및 유전 질환이 있는 개체의 유전자 분석을 위한 혼성화 프로브를 제조할 수 있다. 본원에서 제공되는 뉴클레오티드 서열은 in situ 혼성화, 공지의 염색체 마커에 대한 연결 분석 및 라이브러리를 사용한 혼성화 스크리닝과 같은 공지의 기술을 사용하여 염색체 및 염색체의 특정 영역에 맵핑시킬 수 있다.
CHEPO에 관한 코딩 서열이 다른 단백질(예를 들어, 여기서 CHEPO는 수용체임)과 결합하는 단백질을 코딩하는 경우, CHEPO는 이러한 결합 상호작용에 관여하는 다른 단백질 또는 분자를 확인하기 위한 분석에 사용될 수 있다. 이 방법에 의해, 수용체/리간드 결합 상호작용의 저해제도 확인할 수 있다. 또한, 상기 결합 상호작용에 관여하는 단백질을 사용하여 펩티드 또는 결합 상호작용의 작은 분자 저해제 또는 아고니스트를 스크리닝할 수 있다. 또한, 수용체 CHEPO를 사용하여 유사한 리간드를 단리할 수 있다. 스크리닝 분석을 설계하여 천연 CHEPO 또는 CHEPO에 대한 수용체의 생물학적 활성을 모방하는 리드 화합물을 발견할 수 있다. 이러한 스크리닝 분석은 화학 물질 라이브러리에 대한 고처리 스크리닝 분석을 포함하며, 특히 작은 분자의 약물 후보물질을 확인하는데 적합할 것이다. 고려되는 작은 분자는 합성 유기 또는 무기 화합물을 포함한다. 분석은 당업계에 특성화된 단백질-단백질 결합 분석, 생화학적 스크리닝 분석, 면역분석 및 세포 기재 분석을 비롯한 다양한 포맷으로 수행될 수 있다.
또한, CHEPO 또는 그의 변이체를 코딩하는 핵산을 사용하여 유용한 치료제의 개발 및 스크리닝에 유용한 트랜스제닉 동물 또는 "녹 아웃(knock out)" 동물을 생성시킬 수 있다. 트랜스제닉(transgenic) 동물 (예를 들어, 생쥐 또는 쥐)은 형질도입유전자(transgene)를 포함하는 세포를 갖는 동물인데, 형질도입유전자는 태아기 예를 들어 배 단계에서 동물 또는 그 동물의 조상에 도입된다. 형질도입유전자는 세포의 게놈내에 통합되는 DNA이며, 이 세포로부터 트랜스제닉 동물이 발달한다. 한 실시태양에서, CHEPO를 코딩하는 cDNA를 사용하여 확립된 기술에 따라 CHEPO를 코딩하는 게놈 DNA를 클로닝할 수 있고, 이 게놈 서열을 사용하여 CHEPO를 코딩하는 DNA를 발현하는 세포를 포함하는 트랜스제닉 동물을 생성시킬 수 있다. 특히, 생쥐 또는 쥐와 같은 트랜스제닉 동물을 생성시키는 방법은 당업계에서 통상적인 방법이며, 예를 들어 미국 특허 제4,736,866호 및 동 제4,870,009호에 기재되어 있다. 통상적으로, 조직 특이적 인핸서를 갖춘 CHEPO 형질도입유전자의 도입에는 특정 세포가 표적이 된다. 배 단계에서 동물의 생식 라인에 도입된 CHEPO를 코딩하는 한 카피의 형질도입유전자를 포함하는 트랜스제닉 동물을 사용하여 CHEPO를 코딩하는 DNA의 발현 증가 효과를 조사할 수 있다. 이러한 동물은 예를 들어 CHEPO 폴리펩티드의 과다발현과 관련된 병리학적 증상으로부터 보호할 것으로 생각되는 시약에 대한 시험 동물로서 사용할 수 있다. 본 발명의 이러한 측면에 따라, 상기 시약으로 동물을 처리하면, 형질도입유전자를 보유하는 미처리 동물에 비해 병리학적 증상의 발생은 저하되며, 이는 상기 병리학적 증상에 대한 잠재적인 치료적 개입을 나타낸다.
별법으로, CHEPO의 비인간 동족체를 사용하여 CHEPO를 코딩하는 내인성 유전자와 이 동물의 배간세포에 도입된 CHEPO를 코딩하는 변형된 게놈 DNA 사이의 상동 재조합의 결과로서 CHEPO를 코딩하는 결함 또는 변형 유전자를 갖는 CHEPO "녹 아웃" 동물을 만드는데 사용할 수 있다. 예를 들어, CHEPO를 코딩하는 cDNA를 사용하여 확립된 기술에 따라 CHEPO를 코딩하는 게놈 DNA를 클로닝할 수 있다. CHEPO를 코딩하는 게놈 DNA의 일부는 결실되거나, 통합을 모니터하기 위해 사용될 수 있는 선택적 마커를 코딩하는 유전자와 같은 다른 유전자로 치환될 수 있다. 일반적으로, 수천개의 염기의 비변형된 플랭킹 DNA (5' 및 3' 말단 모두에서)가 벡터내에 포함된다 (예를 들어, 상동성 재조합 벡터에 대해서는 문헌 (Thomas and Capecchi, Cell, 51:503 (1987))을 참조한다). 이 벡터는 (예를 들어, 일렉트로포레이션에 의해) 배간세포주에 도입되고, 도입된 DNA와 내인성 DNA가 상동 재조합된 세포가 선택된다 (예를 들어, 문헌 (Li et al., Cell, 69:915 (1992))을 참조한다). 선택된 세포는 이어서 동물 (예를 들어, 생쥐 또는 쥐)의 배반포에 주입되어 응집 키메라를 형성한다 (예를 들어, 문헌(Bradley, Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E.J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), pp. 113-152)을 참조한다). 이어서, 키메라 배를 적합한 가임신 대리모 동물에 이식하여 "녹 아웃" 동물을 생성시켰다. 생식 세포 내에 상동 재조합 DNA를 보유하는 자손체를 표준 기술로 확인하고 그를 사용하여 동물의 모든 세포가 상동성 재조합 DNA를 함유하는 동물을 육종할 수 있다. 녹 아웃 동물은 예를 들어 특정 병리학적 증상에 대한 방어 능력 및 CHEPO 폴리펩티드의 부재로 인한 병리학적 증상의 발생을 특징으로 한다.
폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 유전자 치료법에도 사용될 수 있다. 유전자 치료법에 사용될 경우, 유전자는 치료상 유효한 유전자 산물의 생체내 합성을 달성하기 위해, 예를 들면 결함있는 유전자를 대체하기 위해 세포내로 도입된다. "유전자 치료법"은 단일 처치에 의해 지속 효과가 달성되는 전통적인 유전자 치료법 및 치료상 유효한 DNA 또는 mRNA의 일회 또는 반복 투여를 포함하는 유전자 치료제의 투여를 모두 포함한다. 안티센스 RNA 및 DNA는 생체내에서 특정 유전자의 발현을 차단하기 위한 치료제로서 사용될 수 있다. 세포막을 통한 짧은 안티센스 올리고뉴클레오티드의 흡수가 제한적이어서 이런 올리고뉴클레오티드의 세포내 농도가 낮음에도 불구하고, 이들이 세포내로 도입되면 저해제로 작용할 수 있음이 이미 밝혀져 있다 (Zamecnik et al., Proc. Natl. Acad., Sci. USA 83, 4143-4146 (1986)). 이러한 올리고뉴클레오티드는 변형, 예를 들어 이들의 음으로 대전된 포스포디에스테르기를 비대전 기로 치환함으로써 올리고뉴클레오티드의 흡수를 증대시킬 수 있다.
핵산을 살아있는 세포로 도입하는 데 사용될 수 있는 다양한 기술이 있다. 이 기술은 핵산이 시험관내에서 배양된 세포로 전달되는가 또는 생체내에서 목적하는 숙주의 세포로 전달되는가에 따라 달라진다. 시험관내 포유동물 세포로 핵산을 전달하는데 적합한 기술은 리포솜, 엘렉트로포레이션, 미세주입, 세포 융합, DEAE-덱스트란, 인산칼슘 침전법 등을 포함한다. 생체내 유전자 전이 기술로 현재 바람직한 것으로는 바이러스 (통상적으로, 레트로바이러스) 벡터를 사용한 형질감염 및 바이러스 코트 단백질-리포솜 매개 형질감염 등이 있다 (Dzau et al., Trends in Biotechnology 11, 205-210 (1993)). 어떤 경우에는, 표적 세포를 표적화하는 작용제, 예컨대 세포 표면 막 단백질 또는 표적 세포에 특이적인 항체, 표적 세포 상의 수용체에 대한 리간드 등을 핵산 공급원에 제공하는 것이 바람직하다. 리포솜이 사용되는 경우에는, 엔도사이토시스에 관련된 세포 표면 막 단백질과 결합하는 단백질을 표적화에 사용하고(하거나) 흡수를 촉진시킬 수 있는데, 그러한 단백질의 예로는, 특정 세포 유형에 향성(向性)이 있는 캡시드 단백질 또는 그의 단편, 순환시 내부화를 경험하는 단백질에 대한 항체, 세포내 위치를 표적화하고 세포내 반감기를 증대시키는 단백질 등이 있다. 수용체 매개 엔도사이토시스 기술은 예를 들면 문헌 (Wu et al., J. Biol. Chem. 262, 4429-4432 (1987), 및 Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3410-3414 (1990))에 기재되어 있다. 유전자 마킹 및 유전자 치료법 프로토콜의 검토를 위해서는, 문헌 (Anderson et al., Science 256, 808-813 (1992))을 참조한다.
본원에 개시된 CHEPO 폴리펩티드는 단백질 전기영동을 위한 분자량 마커로 사용할 수도 있다.
본원에 개시된 CHEPO 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자 또는 그의 단편은 염색체의 확인에 유용하다. 이 점에 대해서, 새로운 염색체 마커를 확인할 계속적인 필요가 있는데, 이는 실제 서열 데이타를 토대로 한 이용가능한 염색체 마킹 시약이 현재로서는 비교적 적기 때문이다. 본 발명의 CHEPO 핵산 분자 각각은 염색체 마커로 사용할 수 있다.
본 발명의 CHEPO 폴리펩티드 및 핵산 분자는 조직 유형화(tissue typing)에 사용할 수도 있으며, 여기서 본 발명의 CHEPO 폴리펩티드는 다른 조직에 비해 한 조직에서 차별적으로 발현될 수 있다. CHEPO 핵산 분자는 PCR, 노던 분석, 서던 분석 및 웨스턴 분석용 프로브를 생성하는데 사용될 것이다.
본원에 개시된 CHEPO 폴리펩티드를 치료제로 사용할 수도 있다. 공지된 방법에 따라 본 발명의 CHEPO 폴리펩티드를 제제화하여 제약상 유용한 조성물을 제조할 수 있는데, 여기서 이 CHEPO 생성물은 제약상 허용되는 담체 비이클과 배합된다. 치료 제형은 바람직한 순도를 갖는 활성 성분을 임의 생리적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제와 혼합함으로써 동결건조 제형 또는 수용액 형태의 보관용으로 제조된다 (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)). 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용되는 투여량과 농도에서 환자에게 무독성이며, 인산염, 시트르산염 및 다른 유기산, 아스코르브산 등의 항산화제, 저분자량 (약 10 개 잔기 미만의) 폴리펩티드, 혈청 알부민, 젤라틴 또는 이뮤노글로불린 등의 단백질, 폴리비닐피롤리돈 등의 친수성 중합체, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 라이신 등의 아미노산, 단당류, 이당류, 및 그밖에 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린을 포함하는 탄수화물, EDTA 등의 킬레이트제, 만니톨 또는 소르비톨 등의 당 알콜, 나트륨 등의 염-형성 카운터이온, 및(또는) 트윈 (Tween, 등록상표), 플루로닉스 (Pluronics, 등록상표) 또는 PEG 등의 비이온성 계면활성제 등이 있다.
생체내 투여에 사용되는 제제는 멸균처리되어야 한다. 이는 동결건조 및 재용해 (reconstitution) 전 또는 후에 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성된다.
본원의 치료 조성물은 일반적으로 멸균 접근 출입구가 있는 용기, 예를 들면 정맥내 용액제 백 또는 피하 주사 바늘에 의해 뚫을 수 있는 마개가 있는 바이알에 담을 수 있다.
투여 경로는 공지된 방법, 예를 들면 정맥내, 복강내, 뇌내, 근육내, 안내, 동맥내 또는 병소내 경로에 의한 주사 또는 주입, 국소 투여, 또는 서방계에 의한 방법이 있다.
본 발명의 제약 조성물의 투여량 및 목적하는 약물 농도는 계획된 특정 용도에 따라 변할 수 있다. 적합한 투여량 또는 투여 경로의 결정은 당업자라면 잘 아는 것이다. 동물 실험 결과는 인간 치료에 효과적인 투여량을 결정하는데 믿을만한 지침을 제공한다. 종간의 효과적인 투여량의 척도화는 문헌 (Mordenti, J. and Chappell, W. "The use of interspecies scaling in toxicokinetics" In Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi et al., Eds., Pergamon Press, New York 1989, pp. 42-96)의 원리에 따라 수행될 수 있다.
CHEPO 폴리펩티드 또는 아고니스트 또는 그의 길항제가 생체내에서 사용되는 경우, 일반적인 투여량은 투여 경로에 따라 좌우되며, 포유동물의 체중 1 kg당 약 10 ng 내지 100 mg, 또는 일당으로는 바람직하게는 약 1 ㎍/kg 내지 10 mg/kg일 수 있다. 특정 투여량 및 전달 방법에 대한 지침은 문헌, 예를 들어 미국 특허 제4,657,760호, 동 제5,206,344호 또는 동 제5,225,212호에 제시되어 있다. 다른 치료 화합물 및 다른 질환에 대해서는 다른 제제가 효과적일 수 있으며, 한가지 기관 또는 조직을 표적으로 하는 투여는 예를 들어 또다른 기관 또는 조직에 대한 투여와는 다른 방식으로의 전달을 필요로할 것으로 예상된다.
CHEPO 폴리펩티드의 서방성 투여가 CHEPO 폴리펩티드의 투여를 필요로 하는 특정 질병 또는 질환의 치료에 적합한 방출 특성을 갖는 제제에 요구되는 경우, CHEPO 폴리펩티드의 마이크로캡슐화가 고려된다. 지연 방출을 위한 재조합 단백질의 마이크로캡슐화는 인간 성장 호르몬 (rhGH), 인터페론 (rhIFN), 인터루킨-2 및 MN rgp120을 사용하여 성공적으로 수행되었다 (Johnson et al., Nat. Med., 2:795-799 (1996); Yasuda, Biomed. Ther., 27:1221-1223(1993); Hora et al., Bio/Technology, 8:755-758(1990); Cleland, "Design and Production of Single Immunization Vaccines Using Polyactide Polyglycolide Microsphere Systems," in Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach, Powell and Newman, eds, (Plenum Press: New York, 1995), pp. 439-462: WO 97/03692, WO 96/40072, WO 96/07399 및 미국 특허 제5,654,010호).
상기 단백질의 서방성 제제는 그의 생체적합성 및 광범위한 생분해성 특성으로 인해, 폴리-락트산-co-글리콜산 (PLGA) 중합체를 사용하여 개발되었다. PLGA의 분해 산물인 락트산 및 글리콜산은 인체내에서 신속하게 소실될 수 있다. 또한, 상기 중합체의 분해능은 그의 분자량 및 조성에 따라 수개월 내지 몇년으로 조정될 수 있다 (Lewis, "Controlled release of bioactive agents from lactide/glycolide polymer," in: M. Chasin and R. Langer (Eds.), Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems (Marcel Dekker: New York, 1990), pp. 1-41).
본 발명은 CHEPO 폴리펩티드를 모방한 화합물(아고니스트)을 확인하고 CHEPO 폴리펩티드의 영향을 방지하기 위한 화합물(길항제)을 스크리닝하는 방법을 포함한다. 길항제 약물 후보에 관한 스크리닝 분석법을 설계하여 본원에서 확인된 유전자에 의해 코딩된 CHEPO 폴리펩티드와 결합하거나 복합체를 이루거나, 또는 코딩된 폴리펩티드와 다른 세포내 단백질의 상호작용을 방해하는 화합물을 확인하였다. 이러한 스크리닝 분석법은 화학 물질 라이브러리에 대해 고처리 스크리닝할 수 있는 분석법을 포함하며, 이는 작은 분자 약물 후보를 확인하는데 특히 적합할 것이다.
상기 분석법은 당업계에서 특성화된 단백질-단백질 결합 분석법, 생화학적 스크리닝 분석법, 면역분석법 및 세포계 분석법을 비롯한 다양한 포맷으로 수행할 수 있다. 길항제에 관한 모든 분석법의 공통점은 상호작용하기에 충분한 조건 및 시간 동안 약물 후보와 본원에서 확인된 핵산에 의해 코딩된 CHEPO 폴리펩티드의 접촉을 요구하는 점이다.
결합 분석법에서, 상호작용은 결합하는 것이며, 형성된 복합체는 단리하거나 반응 혼합물에서 검출할 수 있다. 특정 실시태양에서, 본원에서 확인된 유전자에 의해 코딩된 CHEPO 폴리펩티드 또는 약물 후보는 공유적 부착 또는 비공유적 부착에 의해 고체상, 예를 들어 마이크로타이터 플레이트에 고정된다. 비공유적 부착은 일반적으로 고체 표면을 CHEPO 폴리펩티드 용액으로 코팅하고 건조함으로써 달성된다. 별법으로, 고정화 항체, 예를 들어 고정된 CHEPO 폴리펩티드에 특이적인 모노클로날 항체를 사용하여 그를 고체 표면에 앵커링할 수 있다. 이 분석은 검출가능한 표지로 표지될 수 있는 비고정 성분을 고정 성분, 예를 들어 앵커링된 성분을 포함하는 코딩 표면에 부가함으로써 수행된다. 반응이 종결되었을 때, 반응하지 않은 성분은 예를 들어 세척에 의해 제거되며, 고체 표면에 앵커링된 복합체는 검출된다. 본래 고정되지 않은 성분이 검출가능한 표지를 운반하는 경우, 표면에 고정된 표지의 검출은 복합화 반응이 일어났음을 나타낸다. 본래 고정되지 않은 성분이 표지를 운반하지 않는 경우, 예를 들어 고정된 복합체와 특이적으로 결합하는 표지된 항체를 사용하여 복합화 반응을 검출할 수 있다.
후보 화합물이 본원에서 확인된 유전자에 의해 코딩된 특정 CHEPO 폴리펩티드와 상호작용하지만 결합하지 않는 경우, 후보 화합물과 이 폴리펩티드의 상호작용은 단백질-단백질 상호작용을 검출하는 잘 알려진 방법에 의해 분석할 수 있다. 이러한 분석법에는 통상의 방법, 예를 들어 가교형성법, 공동면역침전법, 및 구배 또는 크로마토그래피 컬럼을 통한 공동정제법이 포함된다. 또한, 단백질-단백질 상호작용은 문헌 [Fields and co-workers(Fields and Song, Nature(London), 340:245-246 (1989); Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:9578-9582 (1991)) as disclosed by Chevray and Nathans, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5789-5793 (1991)]에 기재된 효모계 유전자 시스템을 사용하여 모니터링할 수 있다. 많은 전사 활성자, 예를 들어 효모 GAL4는 물리적으로 구별되는 2개의 모듈형 도메인으로 이루어져 있는데, 한 도메인은 DNA-결합 도메인으로 작용하고, 나머지 한 도메인은 전사-활성 도메인으로 작용한다. 상기 간행물에 기재된 효모 발현계(일반적으로, "2-하이브리드계"로 언급됨)는 이러한 특성을 이용하며, 2-하이브리드 단백질을 사용하는데, 이 중 하나는 표적 단백질이 GAL4의 DNA-결합 도메인과 융합된 것이며, 다른 하나는 후보 활성 단백질이 활성 도메인과 융합된 것이다. GAL4-활성 프로모터의 조절하에 GAL1-lacZ 리포터 유전자의 발현은 단백질-단백질 상호작용을 통한 GAL4 활성의 재구성에 따라 좌우된다. 상호작용 폴리펩티드를 포함하는 콜로니는 β-갈락토시다제에 대한 색소생산성 기질을 사용하여 검출한다. 2-하이브리드 기술을 사용하여 2종의 특이적인 단백질사이의 단백질-단백질 상호작용을 확인하는 완성형 킷트(MATCHMAKER, 등록상표)는 클론테크사에서 구입할 수 있다. 또한, 이 시스템을 확장하여 특이적 단백질 상호작용에 관여하는 단백질 도메인을 매핑할 수 있을뿐 아니라, 이러한 상호작용에 결정적인 아미노산 잔기의 위치를 정확하게 나타낼 수 있다.
하기의 방법으로, 본원에서 확인된 CHEPO 폴리펩티드를 코딩하는 유전자와 다른 세포내 또는 세포외 성분의 상호작용을 방해하는 화합물을 시험할 수 있다. CHEPO 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 산물과 세포내 또는 세포외 성분을 포함하는 반응 혼합물을 두 생성물의 상호작용 및 결합을 허용하는 조건 및 시간하에 제조하였다. 결합을 저해하는 후보 화합물의 능력을 시험하기 위해, 시험 화합물의 존재 및 부재하에 반응을 수행하였다. 또한, 양성 대조군 역할을 하는 제3의 반응 혼합물에 위약을 첨가할 수 있다. 혼합물에 존재하는 시험 화합물과 세포내 또는 세포외 성분사이의 결합(복합체 형성)을 상기 기재된 바와 같이 모니터링하였다. 대조 반응물에서는 복합체가 형성되었으나 시험 화합물을 포함하는 반응 혼합물에서 복합체가 형성되지 않은 것은 시험 화합물이 시험 화합물과 그의 반응 대응물의 상호작용을 방해한다는 사실을 나타낸다.
길항제를 분석하기 위해, CHEPO 폴리펩티드를 화합물과 함께 세포에 첨가하여 특정 활성을 스크리닝할 수 있었으며, CHEPO 폴리펩티드의 존재하에 목적 활성을 저해하는 화합물의 능력은 이 화합물이 CHEPO 폴리펩티드에 대한 길항제임을 나타내었다. 별법으로, 경쟁적 저해 분석을 위해 적절한 조건하에 CHEPO 폴리펩티드 및 잠재적인 길항제를 막-결합 CHEPO 폴리펩티드 수용체 또는 재조합 수용체와 함께 결합시킴으로써 길항제를 검출할 수 있었다. CHEPO 폴리펩티드를 예를 들어 방사 활성 동위원소로 표지하여, 수용체와 결합하는 CHEPO 폴리펩티드 분자의 수를 이용하여 잠재적인 길항제의 효과를 결정할 수 있었다. 당업자에게 공지된 여러 방법, 예를 들어 리간드 패닝법 및 FACS 분류법 (Coligan et al., Current Protocols in Immun., 1(2): Chapter 5 (1991))에 의해 수용체를 코딩하는 유전자를 확인할 수 있었다. 바람직하게는, 발현 클로닝법이 사용되는데, 여기서 폴리아데닐화 RNA는 CHEPO 폴리펩티드에 대해 반응성인 세포로부터 제조되며, 이 RNA로부터 생성된 cDNA 라이브러리는 푸울로 분류되어 CHEPO 폴리펩티드에 대해 비반응성인 COS 세포 또는 다른 세포를 형질감염시키는데 사용된다. 글래스 슬라이드에서 증식하는 형질감염된 세포는 표지된 CHEPO 폴리펩티드에 노출된다. 부위-특이적 단백질 키나제에 관한 인식 부위의 요오드화 또는 봉입화를 비롯한 여러 방법에 의해 CHEPO 폴리펩티드를 표지할 수 있었다. 고정화하고 인큐베이션한 다음, 슬라이드를 오토라디오그래피법으로 분석하였다. 양성 푸울을 동정하여 서브-푸울을 제조하고, 상호작용 서브-푸울링 및 재스크리닝 방법을 이용하여 재형질감염시킴으로써, 결국 추정의 수용체를 코딩하는 단일 클론을 산출하였다.
수용체를 확인하는 다른 방법으로, 표지된 CHEPO 폴리펩티드를 세포막 또는 수용체 분자를 발현시키는 추출물 시료와 함께 광친화성-연결할 수 있었다. PAGE에 의해 가교 물질을 분석하고 엑스선 필름에 노출시켰다. 수용체를 포함하는 표지 복합체를 자르고 펩티드 단편으로 분해하여 단백질 마이크로-시퀀싱처리할 수 있었다. 마이크로-시퀀싱으로부터 얻어진 아미노산 서열을 사용하여 축퇴 올리고뉴클레오티드 프로브 한 세트를 설계함으로써 cDNA 라이브러리를 스크리닝하고 추정의 수용체를 코딩하는 유전자를 확인할 수 있었다.
다른 길항제 분석 방법으로, 후보 화합물의 존재하에 수용체를 발현하는 포유류 세포 또는 막 시료를 표지된 CHEPO 폴리펩티드와 함께 인큐베이션하였다. 그 후에, 상기 상호작용을 강화 또는 차단하는 화합물의 능력을 측정할 수 있었다.
잠재적인 길항제의 보다 구체적인 예에는 이뮤노글로불린과 CHEPO 폴리펩티드의 융합체와 결합하는 올리고뉴클레오티드, 및 특히 폴리- 및 모노클로날 항체, 및 항체 단편, 측쇄 항체, 항-유전자형 항체, 및 이러한 항체 또는 그의 단편의 키메라 형태 또는 인간화 형태, 및 인간 항체 및 항체 단편을 비롯한 항체가 포함되나 이에 한정되지 않는다. 또는, 잠재적인 길항제는 밀접하게 관련된 단백질, 예를 들어 수용체를 인식하지만 영향을 주지는 않으며, 따라서 CHEPO 폴리펩티드의 작용을 경쟁적으로 저해하는 CHEPO 폴리펩티드의 변이된 형태일 수 있다.
또다른 잠재적인 CHEPO 폴리펩티드 길항제는 안티센스 기술을 사용하여 제조한 안티센스 RNA 또는 DNA 작제물인데, 여기서 안티센스 RNA 또는 DNA 분자는 표적 mRNA와 혼성화하여 단백질 번역을 방지함으로써 mRNA의 번역을 직접 차단하는 작용을 한다. 안티센스 기술을 사용하여 삼중나선 형성 또는 안티센스 DNA 또는 RNA를 통한 유전자 발현을 조절할 수 있는데, 이 방법들은 모두 폴리뉴클레오티드와 DNA 또는 RNA의 결합을 토대로 한다. 예를 들어, 본원에서 성숙 CHEPO 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열의 5'코딩 부분을 사용하여 염기쌍 약 10 내지 40개 길이의 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드를 설계한다. DNA 올리고뉴클레오티드는 전사에 관여하는 유전자 영역에 대해 상보적이게끔 설계하여(삼중나선-문헌(Lee et al., Nucl. Acids Res., 6:3073 (1979); Cooney et al,, Science, 241:456 (1988); Dervan et al., Science, 251:1360 (1991))을 참조한다) 전사 및 CHEPO 폴리펩티드의 생산을 방지하였다. 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드는 생체내에서 그의 mRNA와 혼성화하여 mRNA 분자의 CHEPO 폴리펩티드로의 번역을 차단하였다(antisense - Okano, Neurochem., 56:560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression(CRC Press: Boca Raton, FL, 1988)). 또한, 상기 기재된 올리고뉴클레오티드를 세포에 전달하여 안티센스 RNA 또는 DNA를 생체내에서 발현시킴으로써 CHEPO 폴리펩티드의 생산을 억제할 수 있었다. 안티센스 DNA가 사용되는 경우, 전사-개시 부위, 예를 들어 표적 유전자 뉴클레오티드 서열의 약 -10 내지 +10 위치 사이로부터 유도된 올리고데옥시리보뉴클레오티드가 바람직하였다.
잠재적인 길항제에는 활성 부위, 수용체 결합 부위, 또는 CHEPO 폴리펩티드의 증식 인자 또는 다른 관련 결합 부위와 결합하여 CHEPO 폴리펩티드의 정상적인 생물학적 활성을 차단하는 작은 분자가 포함된다. 작은 분자의 예에는 작은 펩티드 또는 펩티드-유사 분자, 바람직하게는 가용성 펩티드, 및 합성 비펩티딜 유기 또는 무기 화합물이 포함되나 이에 한정되지 않는다.
리보자임은 RNA의 특이적인 절단을 촉매할 수 있는 효소 RNA 분자이다. 리보자임은 그와 상보적인 표적 RNA와 서열-특이적 혼성화한 다음, 엔도누클레아제에 의해 절단됨으로써 작용한다. 공지된 기술로 잠재적인 RNA 표적내의 특이적인 리보자임 절단 부위를 확인할 수 있었다. 보다 자세한 사항은 예를 들어 문헌 (Rossi, Current Biology, 4:469-471 (1994) 및 PCT publication No. WO 97/33551(published September 18, 1997))을 참조한다.
전사를 억제하는데 사용되는 삼중나선 형태의 핵산 분자는 단일-가닥이어야하며, 데옥시뉴클레오티드로 이루어져야 한다. 이러한 올리고뉴클레오티드의 염기 조성은 그가 Hoogsteen 염기쌍 규칙을 통해 삼중나선 형성을 촉진하게끔 설계되어 있는데, 삼중나선 형성에는 일반적으로 이중쇄 중 한 쇄에 상당한 크기의 퓨린 또는 피리미딘 스트레치가 있어야 한다. 보다 자세한 사항은 예를 들어 문헌 (PCT publication No. WO 97/33551, supra.)을 참조한다.
상기 작은 분자들은 상기 기재된 임의 한가지 이상의 스크리닝 분석법 및(또는) 당업자에게 잘 알려진 임의 다른 스크리닝 기술에 의해 확인할 수 있다.
F. 항-CHEPO 항체
본 발명은 추가로 항-CHEPO 항체를 제공한다. 항체의 예는 폴리클로날, 모노클로날, 인간화, 이중특이적 및 이종접합(heteroconjugate) 항체를 포함한다.
1. 폴리클로날 항체
항-CHEPO 항체는 폴리클로날 항체를 포함할 수 있다. 폴리클로날 항체의 제조 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 폴리클로날 항체는 예를 들어 면역화제 및 필요한 경우 보조제를 1회 이상 주사함으로써 포유동물에서 생성시킬 수 있다. 일반적으로, 면역화제 및(또는) 보조제는 피하 또는 복강내 수회 주사하는 방법으로 포유동물에 주사될 것이다. 면역화제는 CHEPO 폴리펩티드 또는 그의 융합 단백질을 포함할 수 있다. 면역처리되는 포유동물에서 면역원성인 것으로 알려진 단백질에 면역화제를 접합시키는 것이 유용할 수 있다. 상기 면역원성 단백질의 예에는 키홀 림펫 헤모시아닌, 혈청 알부민, 소 티로글로불린 및 대두 트립신 저해제가 포함되나 이에 한정되지 않는다. 사용될 수 있는 보조제의 예는 프로이드 완전 보조제 및 MPL-TDM 보조제 (모노포스포릴 지질 A, 합성 트레할로스 디코리노미콜레이트)를 포함한다. 면역처리 방법은 불필요한 실험 없이도 당업계의 숙련가에 의해 선택될 수 있다.
2. 모노클로날 항체
항-CHEPO 항체는 별법으로 모노클로날 항체일 수 있다. 모노클로날 항체는 문헌 [Kohler and Milstein, Nature, 256:495 (1975)]에 기재되 바와 같은 하이브리도마 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 하이브리도마 방법에서, 생쥐, 햄스터 또는 다른 적절한 숙주 동물을 통상적으로 면역화제로 면역처리하여 면역화제에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하거나 생산할 수 있는 임파구를 유도한다. 별법으로, 임파구는 시험관 내에서 면역처리할 수 있다.
면역화제는 일반적으로 CHEPO 폴리펩티드 또는 그의 융합 단백질을 포함할 것이다. 일반적으로, 인체 기원의 세포를 원하는 경우 말초 혈액 임파구 ("PBL")가 사용되나, 인간 이외의 포유동물 공급원을 원하는 경우에는 비장 세포 또는 임프절 세포가 사용된다. 이어서, 폴리에틸렌 글리콜과 같은 적합한 융합제를 사용하여 임파구와 불멸화된 세포주를 융합시켜 하이브리도마 세포를 형성시킨다 [Goding, Monoclonal Antibodies: Principle and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103]. 불멸화된 세포주는 대체로 형질전환된 포유동물 세포, 특히 설치류, 소 및 인체 기원의 골수종 세포이다. 일반적으로, 쥐 또는 생쥐 골수종 세포주가 사용된다. 하이브리도마 세포는 바람직하게는 비융합된 불멸화된 세포의 증식 또는 생존을 억제하는 1종 이상의 물질을 함유하는 적합한 배양 배지에서 배양시킬 수 있다. 예를 들면, 모세포가 하이포잔틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HGPRT 또는 HPRT) 효소가 결핍된 경우, 하이브리도마용 배양 배지 ("HAT 배지")는 전형적으로 하이포잔틴, 아미노프테린 및 티미딘을 포함할 것이며, 이들 물질은 HGPRT-결핍 세포의 증식을 억제시킨다.
바람직한 불멸화된 세포주는 효율적으로 융합하고, 선택된 항체-생산 세포에 의한 항체의 생산을 높은 수준으로 안정하게 유지하며, HAT 배지와 같은 배지에 감수성이 있는 것이다. 보다 바람직한 불멸화된 세포주는 예를 들어 솔크 인스티튜트 셀 디스트리뷰션 센터 (Salk Institute Cell Distribution Center, 미국 캘리포니아주 샌디에고) 및 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (American Type Culture Collection, 미국 버지니아주 마나사스)으로부터 입수가능한 쥐과 골수종 세포주이다. 또한, 인간 골수종 세포주 및 생쥐-인간 헤테로골수종 세포주가 인간 모노클로날 항체의 생산에 대해 기술되었다 [Kozbor, J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63].
하이브리도마 세포가 배양되는 배양 배지를 CHEPO에 대해 지시된 모노클로날 항체의 존재에 대해 분석할 수 있다. 바람직하게는, 하이브리도마 세포에 의해 생산된 모노클로날 항체의 결합 특이성을 면역침전법에 의해, 또는 방사성면역분석법 (RIA) 또는 효소-결합 면역흡수 분석법 (ELISA)과 같은 시험관내 결합 분석에 의해 측정하였다. 이러한 기술 및 분석은 당업계에 공지되어 있다. 모노클로날 항체의 결합 친화도는 예를 들어 스카트카르트(Scatchard) 분석 (Munson and Pollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980))에 의해 측정할 수 있다.
원하는 하이브리도마 세포를 확인한 후, 제한 희석 절차에 의해 클론을 서브클로닝시키고 표준 방법 [Goding, 상기문헌]에 의해 배양시켰다. 이러한 목적에 적합한 배양 배지에는 예를 들면, 둘베코스 변형 이글 배지 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 또는 RPMI-1640 배지가 포함된다. 또는, 하이브리도마 세포는 포유류에서 복수종양으로서 생체내 배양시킬 수 있다.
서브클론에 의해 분비된 모노클로날 항체는 예를 들면, 단백질 A-세파로스, 히드록실아파티트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화성 크로마토그래피와 같은 통상의 이뮤노글로불린 정제 절차에 의해 배양 배지 또는 복수액으로부터 단리 및 정제시킬 수 있다.
또한, 모노클로날 항체는 미국 특허 제4,816,567호에 기재된 것과 같은 재조합 DNA 방법에 의해 제조할 수 있다. 본 발명의 모노클로날 항체를 코딩하는 DNA는 통상의 방법을 이용하여 (예를 들면, 쥐과 동물 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용함으로써) 쉽게 단리하여 시퀀싱할 수 있다. 본 발명의 하이브리도마 세포는 그러한 DNA의 바람직한 공급원으로서의 역할을 한다. 일단 단리되면, DNA는 발현 백터 내로 넣은 다음, 원숭이 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포 또는 다른 방법으로는 이뮤노글로불린 단백질을 생산하지 않는 골수종 세포와 같은 숙주 세포 내로 발현 벡터를 형질감염시켜 재조합 숙주 세포에서 모노클로날 항체를 합성시킬 수 있다. 또한, DNA는 예를 들어 상동성의 쥐과 동물 서열 부위를 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인에 대한 코딩 서열로 치환하거나 (미국 특허 제4,816,567호; Morrison et al., 상기 문헌), 또는 비-이뮤노글로불린 폴리펩티드에 대한 코딩 서열의 전체 또는 일부를 이뮤노글로불린 코딩 서열에 공유 결합시킴으로써 변형시킬 수 있다. 그러한 비-이뮤노글로불린 폴리펩티드로 본 발명의 항체의 불변 도메인을 치환하거나, 본 발명의 항체의 한 항체-결합 부위의 가변 도메인을 치환하여 키메라 2가 항체를 생성시킬 수 있다.
항체는 1가 항체일 수 있다. 1가 항체를 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어 한 방법은 이뮤노글로불린 경쇄 및 변형 중쇄의 재조합 발현을 포함한다. 중쇄 가교결합을 방지하기 위해서 중쇄는 일반적으로 Fc 영역의 임의의 지점에서 말단이 절단된다. 또는, 관련 시스테인 잔기는 가교결합을 방지하기 위해서 다른 아미노산 잔기로 치환되거나 결실된다.
또한, 시험관내 방법도 1가 항체의 제조에 적합하다. 항체 단편, 특히 Fab 단편을 제조하기 위한 항체의 분해는 당업계에 통상적으로 알려진 기술을 사용하여 수행할 수 있다.
3. 인간 항체 및 인간화 항체
또한, 본 발명의 항-CHEPO 항체는 인간화 항체 또는 인간 항체를 포함할 수 있다. 비-인간(예를 들어, 쥐과 동물) 항체의 인간화 형태는 키메라 이뮤노글로불린, 비-인간 이뮤노글로불린으로부터 유도된 최소 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 사슬 또는 그의 단편 (예를 들어, Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체의 다른 항원 결합 작은 서열)이다. 인간화 항체는, 수용체의 상보성 결정 영역 (CDR)의 잔기를 원하는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 생쥐, 쥐 또는 토끼와 같은 인간 이외의 종 (공여 항체)의 CDR로부터의 잔기로 치환시킨 인간 이뮤노글로불린 (수용 항체)을 포함한다. 몇몇 경우에, 인간 이뮤노글로불린의 Fv 프레임워크 잔기는 대응하는 비-인간 잔기에 의해 치환된다. 또한, 인간화 항체는 수용 항체에서도 또는 도입되는 CDR 또는 프레임워크 서열에서도 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 하나 이상, 일반적으로 둘 이상의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역은 비-인간 이뮤노글로불린의 영역에 대응하며, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 이뮤노글로불린 컨센서스 서열의 영역에 해당한다. 또한, 인간화 항체는 이뮤노글로불린 불변 영역 (Fc)의 적어도 일부, 일반적으로 인간 이뮤노글로불린 영역의 적어도 일부를 포함할 것이다 [Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-329 (1988); 및 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)].
비인간 항체를 인간화하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 비-인간 공급원으로부터의 그에 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이들 비-인간 아미노산 잔기는 흔히 "임포트(import)" 잔기로 언급되며, 통상적으로 "임포트" 가변 도메인으로부터 얻어진다. 인간화는 인간 항체의 상응하는 서열을 설치류 CDR 또는 CDR 서열로 치환함으로써 본질적으로 윈터 (Winter) 등의 방법 [Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988)]에 따라 수행할 수 있다. 따라서, 그러한 "인간화" 항체는 실질적으로 보다 적은 무손상 인간 가변 도메인이 비-인간 종 유래의 상응하는 서열에 의해 치환된 키메라 항체 (미국 특허 제4,816,567호)이다. 실제로, 인간화 항체는 통상적으로 일부 CDR 잔기 및 가능하게는 일부 FR 잔기를 설치류 항체에서 유사한 부위로부터의 잔기로 치환시킨 인간 항체이다.
인간 항체는 파지 디스플레이 라이브러리를 비롯한 당업계에 공지된 여러 기술을 사용하여 제조할 수도 있다 [Hoogenboom and Winter., J. Mol. Biol., 227: 381 (1991); Marks et al., J. Mol. Bio., 222: 581 (1991)]. 또한, 코울 등 및 보에르너 등의 기술도 인간 모노클로날 항체의 제조에 사용할 수 있다 (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985) and Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991)]. 마찬가지로, 유전자도입 동물, 예를 들어 생쥐에 인간 이뮤노글로불린 유전자좌를 도입함으로써 인간 항체를 제조할 수 있는데, 여기서 내부 이뮤노글로불린 유전자는 부분적으로 또는 완전히 실활화된다. 항원투여 후에, 인간 항체 생산이 관찰되었는데, 이는 유전자 재배열, 어셈블리 및 항체 목록을 비롯한 모든 점에서 인간에서 관찰되는 항체와 매우 유사하였다. 상기 사항은 예를 들어 문헌 (미국 특허 제5,545,807호, 동 제5,545,806호, 동 제5,569,825호, 동 제5,625,126호, 동 제5,633,425호, 동 5,661,016호) 및 과학 간행물 (Marks et al., Bio/Technology 10, 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368, 856-859 (1994), Morrison, Nature 368, 812-13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996); Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13 65-93 (1995))에 기재되어 있다.
4. 이중특이적 항체
이중특이적 항체는 2종 이상의 상이한 항원에 대해 결합 특이성을 갖는 모노클로날, 바람직하게는 인간 또는 인간화 항체이다. 이 경우에, 결합 특이성 중의 하나는 CHEPO에 대한 것이고, 다른 하나는 임의 다른 항원, 바람직하게는 세포 표면 단백질 또는 수용체 또는 수용체 서브유닛에 대한 것이다.
이중특이적 항체를 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 통상적으로, 이중 특이적 항체의 재조합 생산은 2개의 이뮤노글로불린 중쇄-경쇄/경쇄-중쇄 쌍의 동시발현에 기초하며, 여기에서, 2개의 중쇄는 상이한 특이성을 갖는다 [Millstein and Cuello, Nature, 305: 537-539 (1983)]. 이뮤노글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위 분류로 인해, 이들 하이브리도마 (쿼드로마)는 10가지 상이한 항체 분자의 가능한 혼합물을 생산하며, 이중 하나만이 정확한 이중특이적 구조를 갖는다. 정확한 분자의 정제는 일반적으로 친화성 크로마토그래피 단계에 의해 수행된다. 유사한 방법이 WO 제93/08829호(1993년 5월 13일에 공개됨) 및 문헌[Traunecker et al., EMBO J., 10: 3655-3659 (1991)]에 기재되어 있다.
원하는 결합 특이성을 갖는 항체의 가변 도메인(항체-항원 결합 부위)을 이뮤노글로불린 불변 도메인 서열에 융합시킬 수 있다. 이 융합은 힌지의 적어도 일부, CH2 및 CH3 영역을 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 불변 도메인과의 융합이 바람직하다. 경쇄 결합을 위해 필요한 부위를 포함하는 제1 중쇄 불변 영역 (CH1)이 융합체의 적어도 하나에 존재하는 것이 바람직하다. 이뮤노글로불린 중쇄 융합체, 및 원한다면 이뮤노글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA를 별도의 발현 벡터에 삽입하고, 적합한 숙주 유기체에 공동 형질감염시킨다. 이중특이적 항체를 생산하기 위한 보다 상세한 내용은 예를 들면, 문헌[Suresh et al., Methods in Enzymmology, 121: 210(1986)]을 참조한다.
WO 96/27011에 개시된 다른 방법에 따르면, 한쌍의 항체 분자사이의 인터페이스를 조작하여 재조합 세포 배양으로부터 회수되는 헤테로다이머의 백분율을 최대화할 수 있다. 바람직한 인터페이스는 항체 불변 도메인의 CH3 영역의 적어도 일부를 포함한다. 이 방법에서, 제1 항체 분자의 인터페이스로부터 1개 이상의 작은 아미노산 측쇄를 보다 큰 측쇄(예를 들어, 티로신 또는 트립토판)로 대체하였다. 큰 아미노산 측쇄를 작은 아미노산 측쇄(예를 들어, 알라닌 또는 트레오닌)로 대체함으로써 큰 측쇄에 대해 동일하거나 유사한 크기의 보충의 "공동(cavity)"을 제2 항체 분자의 인터페이스에 생성시켰다. 이는 헤테로다이머의 수율을 호모다이머와 같은 다른 원치 않는 최종-생성물의 수율 이상으로 증가시키는 메카니즘을 제공한다.
이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편(예를 들어, F(ab')2 이중특이적 항체)으로 제조할 수 있다. 항체 단편으로부터 이중특이적 항체를 생성하는 기술은 문헌에 기재되어 있다. 예를 들어, 화학적 연결을 이용하여 이중특이적 항체를 제조할 수 있다. 문헌 (Brennan et al., Science 229:81 (1985))에는 무손상 항체를 단백질 가수분해로 잘라서 F(ab')2 단편을 생성하는 방법이 기재되어 있다. 이러한 단편은 디티올 복합 물질인 소듐 아르세니트의 존재하에 환원되어 근처 디티올을 안정화하고 분재내 디술피드 형성을 방지한다. 그 후에, 생성된 Fab' 단편을 티오니트로벤조에이트(TNB) 유도체로 전환시켰다. 그 후에, Fab'-TNB 유도체 중 하나를 머캅토에틸아민을 사용하여 환원시킴으로써 Fab'-티올로 재전환시키고 등몰량의 다른 Fab'-TNB 유도체와 혼합하여 이중특이적 항체를 형성시켰다. 생성된 이중특이적 항체는 효소의 선택적 고정화를 위한 물질로 사용할 수 있다.
이. 콜라이로부터 Fab' 단편을 직접 회수하여 화학적으로 연결시킴으로써 이중특이적 항체를 형성시켰다. 문헌 (Shalaby et al., J. Exp. Med. 175:217-225 (1992))에는 완전한 인간화 이중특이적 항체 F(ab')2 분자가 개시되어 있다. 각각의 Fab' 단편은 이 콜라이로부터 별도로 분비되었으며 지시된 시험관내의 화학적 방법으로 연결하여 이중특이적 항체를 형성시켰다. 이와 같이 형성된 이중특이적 항체는 ErbB2 수용체를 과다발현시키는 세포 및 정상적인 인간 T 세포와 결합할 수 있을뿐 아니라, 인간 유방암 표적에 대한 인간 세포독성 림프구의 용해 활성을 개시할 수 있었다.
또한, 재조합 세포 배양으로부터 직접 이중특이적 항체 단편을 만들고 단리하는 여러 기술이 개시되어 있다. 예를 들어, 루신 지퍼를 사용하여 이중 특이적 항체를 제조하였다(Kostelny et al., J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)). 유전자 융합에 의해, Fos 및 Jun 단백질로부터의 루신 지퍼 펩티드를 2종의 상이한 항체의 Fab' 부분에 연결하였다. 항체 호모다이머의 힌지 영역을 환원시켜 단량체를 형성한 다음, 재산화시켜 항체 헤테로다이머를 형성시켰다. 또한, 이 방법은 항체 호모다이머를 생산하기 위한 방법으로 이용할 수도 있다. 문헌 (Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993))에 기재된 "디아바디(diabody)" 기술은 이중특이적 항체 단편을 만드는 다른 메카니즘을 제공한다. 이 단편은 링커에 의해 경쇄 가변 도메인(VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함하는데, 이 링커는 너무 짧아서 상기 두 도메인을 동일 쇄로 짝지을 수 없다. 따라서, 한 단편의 VH 및 VL 도메인은 다른 단편의 상보적인 VH 및 VL 도메인과 쌍을 이루게 되며, 2개의 항원 결합 부위를 형성한다. 단쇄 Fv(sFv) 이량체를 사용하여 이중특이적 항체 단편을 만드는 또다른 전략이 보고되었다(문헌 (Gruber et al., J. Immunol. 152:5368 (1994))을 참조한다). 2가 이상의 결합가를 갖는 항체도 고려 대상이다. 예를 들어, 삼중특이적 항체를 만들 수 있다(Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991)).
전형적인 이중특이적 항체는 본원에서 제공된 CHEPO 폴리펩티드의 2종의 상이한 에피톱과 결합할 수 있다. 또는, 특정 CHEPO 폴리펩티드를 발현시키는 세포에 대한 세포내 방어 메카니즘에 초점을 맞추기 위해, 항-CHEPO 폴리펩티드 팔을 백혈구 상 개시 분자, 예를 들어 T-세포 수용체 분자(예를 들어, CD2, CD3, CD28 또는 B7), 또는 IgG의 Fc 수용체(FcγR), 예를 들어 FcγRI(CD64), FcγRII(CD32) 및 FcγRIII(CD16)와 결합하는 팔과 연결할 수 있다. 또한, 이중특이적 항체를 사용하여 특정 CHEPO 폴리펩티드를 발현시키는 세포에 세포독성 물질을 국소화할 수 있다. 이러한 항체는 CHEPO-결합 팔과 세포독성 물질 또는 방사성핵종 킬레이트제, 예를 들어 EOTUBE, DPTA, DOTA 또는 TETA와 결합하는 팔을 가지고 있다. 목적하는 또다른 이중특이적 항체는 CHEPO 폴리펩티드와 결합하며 추가로 조직 인자(TF)와 결합한다.
5. 이종접합 항체
이종접합 항체도 본 발명의 범위에 포함된다. 이종접합 항체는 2개의 공유결합된 항체로 구성된다. 이러한 항체는 예를 들어 면역계 세포를 원하지 않는 세포에 표적화시키기 위해 (미국 특허 제4,676,980호), 및 HIV 감염의 치료를 위해 (WO 제91/00360호, 동 제92/200373호, 및 EP 제03089호) 제안되었다. 이종접합 항체는 가교결합제를 사용하는 방법을 포함하여 합성 단백질 화학에 공지된 방법을 이용하여 시험관내에서 제조할 수 있는 것으로 생각된다. 예를 들어, 면역독소는 디술피드 교환 반응 또는 티오에테르 결합을 형성함으로써 제조할 수 있다. 상기 목적에 적합한 시약은 이미노티올레이트 및 메틸-4-메르캅토부티르이미데이트 및 미국 특허 제4,676,980호에 개시된 시약을 포함한다.
6. 효과기 기능 조작
효과기 기능에 대해 본 발명의 항체를 변형하여 예를 들어 암치료에 있어 항체의 효과를 증대하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 시스테인 잔기를 Fc 영역에 도입하여 이 영역내 쇄간 디술피드 결합을 형성시킬 수 있다. 이와 같이 생성된 호모다이머 항체는 내부화 능력을 향상시키고(시키거나) 보체-매개 세포 사멸 및 항체-의존성 세포내 세포독성(ADCC)을 증대시킨다 (문헌 (Caron et al., J. Exp Med., 176:1191-1195 (1992) 및 Shopes, J. Immunol., 148:2918-2922 (1992))을 참조한다). 또한, 문헌 (Wolff et al. Cancer Research, 53: 2560-2565 (1993))에 기재된 헤테로이관능성 가교를 사용하여 증대된 항-종양 활성을 지닌 호모다이머 항체를 제조할 수 있다. 또는, 이중의 Fc 영역을 갖는 항체를 조작하여 보체 용균성 및 ADCC 능력을 증대시킬 수 있다 (문헌 (Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design, 3:219-230 (1989))을 참조한다).
7. 이뮤노컨쥬게이트
또한, 본 발명은 세포독성 물질, 예를 들어 화학치료제, 독소(예를 들어, 효소적으로 활성인 박테리아, 진균, 식물 또는 동물성 독소, 또는 그의 단편) 또는 방사활성 동위원소(즉, 방사성복합체)와 결합된 항체를 포함하는 이뮤노컨쥬게이트에 관한 것이다.
상기 이뮤노컨쥬의 생성에 유용한 화학치료제는 상기에 기재되어 있다. 사용될 수 있는 효소적으로 활성인 독소 및 그의 단편에는 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 쇄(슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa) 유래), 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 피톨라카 아메리카나(Phytolaca americana) 단백질(PAPI, PAPII 및 PAP-S), 쓴 멜론(momordica charantia) 저해제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스(sapaonaria officinalis) 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신, 및 트리코테세네스가 포함된다. 여러 방사성핵종을 방사복합체 항체의 제조에 이용할 수 있다. 예에는 212Bi, 131I, 131In, 90 Y 및 186Re가 포함된다.
다양한 이관능성 단백질-커플링제, 예를 들어 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올)프로피오네이트(SPDP), 이미노티올란(IT), 이미도에스테르의 이관능성 유도체(예를 들어, 디메틸 아디프이미데이트 HCL), 활성 에스테르(예를 들어, 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드(예를 들어, 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물(예를 들어, 비스(p-아지도벤조일)헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체(예를 들어, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트(예를 들어, 톨리엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 플루오르 화합물(예를 들어, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 항체와 세포독성 물질의 복합체를 만들 수 있다. 예를 들어, 문헌 (Vitetta et al., Science, 238:1098 (1987))에 기재된 바와 같이 리신 면역독소를 제조할 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산(MX-DTPA)은 방사성뉴클레오디드와 항체를 연결하는 전형적인 킬레이트제이다(WO 94/11026을 참조한다).
또다른 실시태양으로, 항체와 종양 예비표적화에 이용되는 "수용체"(예를 들어, 스트렙타비딘)를 연결할 수 있는데, 여기서 항체-수용체 복합체를 투여 대상에게 투여한 다음, 킬레이트제를 사용하여 순환으로부터 결합하지 않은 복합체를 제거하고 세포독성 물질(예를 들어, 방사성뉴클레오티드)에 연결된 "리간드"(예를 들어, 아비딘)를 투여한다.
8. 이뮤노리포좀
본원에서 개시된 항체를 이뮤노리포좀으로 제제화할 수도 있다. 이 항체를 포함하는 리포좀은 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 문헌 (Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77:4030 (1980); 및 미국 특허 제4,485,045호 및 동 제4,544,545호)에 기재된 방법으로 제조할 수 있다. 순환 시간이 증대된 리포좀은 문헌 (미국 특허 제5,013,556호)에 개시되어 있다.
특히 유용한 리포좀은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유도체화 포스파티딜에탄올아민(PEG-PE)을 함유하는 지질 조성물을 사용하여 역상 증발법에 의해 생성할 수 있다. 정해진 공극 크기의 필터를 통해 리포좀을 밀어내어 소정의 직경을 갖는 리포좀을 수득하였다. 문헌 (Martin et al., J. Biol. Chem., 257:286-288 (1982))에 기재된 바와 같이 디술피드-상호교환 반응을 통해 본 발명의 항체의 Fab' 단편을 리포좀에 연결할 수 있다. 화학요법제(예를 들어, 독소루비신(Doxorubicin))은 임의로 리포좀내에 포함된다(문헌 (Gabizon et al., J. National Cancer Inst., 81(19):1484 (1989))을 참조한다).
9. 항체 제약 조성물
각종 질환을 치료하기 위해, 본원에서 확인된 CHEPO 폴리펩티드와 특이적으로 결합하는 항체 및 상기 기재된 스크리닝 분석에 의해 확인된 다른 분자를 제약 조성물 형태로 투여할 수 있다.
CHEPO 폴리펩티드가 세포내에 있고 항체 전부가 저해제로 사용되는 경우, 내부화 항체가 바람직하다. 그러나, 또한 리포펙션 또는 리포좀을 사용하여 항체 또는 항체 단편을 세포내에 전달할 수 있다. 항체 단편이 사용되는 경우, 표적 단백질의 결합 도메인에 특이적으로 결합하는 최소 저해성 단편이 바람직하다. 예를 들어, 항체의 가변-영역 서열을 토대로, 표적 단백질 서열과 결합하는 능력을 지닌 펩티드 분자를 설계할 수 있다. 이러한 펩티드는 화학적으로 합성하고(하거나) 재조합 DNA 기술에 의해 제조할 수 있다(예를 들어, 문헌 (Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:7889-7893 (1993))을 참조한다). 또한, 본원의 제형은 치료할 특정 증상에 있어 필요에 따라 1종 이상의 활성 화합물, 바람직하게는 서로 악영향을 주지 않는 상보적인 활성을 지닌 화합물을 포함할 수 있다. 별법으로, 또는 추가로, 이 조성물은 그의 기능을 증대시키는 물질, 예를 들어 세포독성 물질, 시토킨, 화학요법제, 또는 증식-억제제를 포함할 수 있다. 이러한 분자는 적합하게는 의도된 목적에 효과적인 양으로 배합된다.
활성 성분은 예를 들어 각각 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어 리포솜, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐) 또는 마크로에멀젼 중에서 예를 들어 코아세르베이션(coacervation) 기술 또는 계면 중합, 예를 들어 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐에 의해 제조된 마이크로캡슐에 봉입될 수 있다. 상기 기술은 문헌 (Remington's Pharmaceutical Sciences, 상기 문헌)에 개시되어 있다.
체내 투여에 사용되는 제제는 멸균처리되어야 한다. 이것은 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 용이하게 수행된다.
서방성 제제도 제조될 수 있다. 서방성 제제의 적합한 예는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 성형품, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐 형태의 반투과성 매트릭스를 포함한다. 서방성 매트릭스의 예는 폴리에스테르, 히드로겔(예를 들어, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알콜)), 폴리락티드 (미국 특허 제3,773,919호), L-글루탐산과 γ 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예를 들어 LUPRON DEPOT(등록상표)(락트산-글리콜산 공중합체 및 루프롤라이드 아세테이트로 이루어진 주입가능한 마이크로스피어), 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산이 있다. 에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산과 같은 중합체는 100일 이상 동안 분자를 방출시키지만, 어떤 히드로겔은 보다 짧은 기간 동안 단백질을 방출시킨다. 캡슐화된 항체가 오랫 동안 체내에 남아있는 경우, 그는 37 ℃에서 습기에 노출된 결과, 변성 또는 응집되어 생물 활성을 감소시키고 면역원성을 변화시킬 수 있다. 안정화를 위해 관련된 메카니즘에 따라 합리적인 전략을 설계할 수 있다. 예를 들어, 응집 메카니즘이 티오-디술피드 상호교환을 통한 분재내 S-S 결합 형성인 것으로 밝혀진 다면, 술프히드릴 잔기의 변형, 산성 용액으로부터의 동결건조, 수분 함량 조절, 적절한 첨가제 사용 및 특이적인 중합체 매트릭스 조성물의 개발에 의해 안정화를 달성할 수 있다.
G. 항-CHEPO 항체의 용도
본 발명의 항-CHEPO 항체는 다양한 유용성을 갖는다. 예를 들어, 항-CHEPO 항체는 CHEPO에 대한 진단 분석, 예를 들어 특정 세포, 조직 또는 혈청에서의 그의 발현의 검출에 사용될 수 있다. 당업계에 공지된 다양한 진단 분석 기술, 예를 들어 이종상 또는 동종상에서 수행되는 경쟁 결합 분석, 직접 또는 간접 샌드위치 분석 및 면역침전 분석[Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc. (1987) pp. 147-158]을 사용할 수 있다. 진단 분석에 사용되는 항체는 검출가능한 잔기로 표지될 수 있다. 검출가능한 잔기는 직접 또는 간접적으로 검출가능한 신호를 생성시킬 수 있어야 한다. 예를 들어, 검출가능한 잔기는 방사성 동위 원소, 예를 들어 3H, 14C, 32P, 35S 또는 125 I, 형광 또는 화학발광 화합물, 예를 들어 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민 또는 루시페린, 또는 효소, 예를 들어 알칼리 포스파타제, 베타-갈락토시다제 또는 양고추냉이 페록시다제일 수 있다. 문헌 [Hunter et al, Nature, 144:945(1962); David et al., Biochemistry, 13:1014 (1974); Pain et al., J. Immunol. Meth., 40:219 (1981); 및 Nygren, J. Histochem. and Cytochem., 30:407 (1982)]에 기재된 방법을 비롯하여 항체를 검출가능한 잔기에 결합시키기 위한 당업계에 공지된 임의 방법을 사용할 수 있다.
또한, 항-CHEPO 항체는 재조합 세포 배양액 또는 천연 공급원으로부터 CHEPO의 친화성 정제에도 유용하다. 이 과정에서, CHEPO에 대한 항체는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 세파덱스 수지 또는 여과지에 적합한 지지체에 고정된다. 그 후에, 고정된 항체는 정제될 CHEPO를 함유하는 시료와 접촉시킨 후, 고정된 항체에 결합한 CHEPO 폴리펩티드를 제외하고 시료 내의 모든 물질을 실질적으로 제거하기 위해 적합한 용매로 세척한다. 최종적으로, 지지체는 다른 적합한 용매로 세척하여 항체로부터 CHEPO 폴리펩티드를 방출시킨다.
다음의 실시예는 단지 예시를 목적으로 제공될 뿐이며, 어떤 식으로든 본 발명의 범위를 한정하려는 것이 아니다.
이 명세서에 인용된 모든 특허와 문헌의 내용은 본 명세서에 포함되는 것으로 한다.
실시예 1: CHEPO를 코딩하는 핵산의 단리
게놈 DNA는 퀴아젠 키트 (Qiagen kit; cat&num:10262)를 제조자의 지시에 따라 사용하여 두 종의 침팬지 세포주 (ATCC CRL1609 및 CRL1857)로부터 단리하였다. 이어서, 주형으로서 1 g의 게놈 DNA 및 하기 프라이머쌍을 사용한 PCR을 수행하여 3개의 단리된 단편으로서 침팬지 EPO 유전자를 수득하였다.
EPO.F: 5'-ACCGCGCCCCCTGGACAG-3' (서열 12)
EPO.INT1.R: 5'-CATCCACTTCTCCGGCCAAACTTCA-3' (서열 13)
EPO.INTlF: 5'-TTTGGCCGGAGAAGTGGATGC-3' (서열 14)
EPO.INT4R: 5'-TCACTCACTCACTCATTCATTCATTCATTCA-3' (서열 15)
EPO.INT4F: 5'-GTTGAATGAATGATTGAATGAATGAGTGA-3' (서열 16)
EPO.R: 5'-GCACTGGAGTGTCCATGGGACAG-3' (서열 17)
각 PCR 반응물은 총 부피가 50 ㎕가 되도록 10 X PCR 완충액 (Perkin Elmer) 5 ㎕, dNTP (20mM) 1 ㎕, 게놈 DNA 1 g, 각 프라이머 1 ㎕, 택 폴리머라제 (Clontech) 1 ㎕ 및 H2O를 함유하였다. 먼저, 반응물을 94℃에서 4분동안 변성한 후 94℃ 1분, 65 또는 66℃ 1분 및 72℃ 1분으로 구성된 주기를 40회 반복하여 증폭하였다. 마지막 익스텐션 단계를 72℃에서 5분동안 수행하였다. 그 다음, 이 반응물을 아가로스 겔 상에서 분석하였다. 각 PCR 생성물에 대해 500 bp, 1200 bp 및 750 bp의 PCR 생성물을 각각 관찰하였다. 이어서, 위자드 키트 (Wizard kit; Promega cat #: A7170)를 사용하여 PCR 반응물을 정제한 후 직접 시퀀싱하였다. PCR 생성물의 시퀀싱은 어플라이드 바이오시스템 377 DNA 시퀀서 (PEI Applied Biosystems, Foster City, CA)를 사용하여 수행하였다. 사용된 화학원리는 로다민 (dRodamine) 및 빅 다이 (BIG DYE) 터미네이터 (PEI Applied Biosystems, Foster City, CA)를 사용한 다이 터미네이터 사이클 시퀀싱이었다. 서열 어셈블리 및 번역은 시퀀처 소프트웨어 (Sequencher; Gene Codes, Ann Arbor, MI)를 이용하여 수행하였다.
인간 에리쓰로포이에틴 서열과의 상동성에 의해 5개의 코딩 엑손을 확인하였고 이 엑손을 예측된 전장 cDNA로 어셈블리하였다. CHEPO cDNA의 코딩 영역의 길이는 579개 뉴클레오티드 (도 1)이고 193개의 아미노산으로 된 예측 단백질 (도 3)을 코딩한다. 아미노산 잔기 22, 24 및 27 뒤에 에측된 3개의 잠정적 신호 절단 부위가 있다. 인간 EPO의 N-말단과 비교할 때, 침팬지 EPO의 절단 부위에 상응할 것 같은 말단이 있다. 27개의 아미노산으로 된 소수성 신호 펩티드 다음에 3개의 잠재적 N-글리코실화 부위를 함유하는, 166개의 아미노산으로 된 성숙 단백질이 있다. 단일 뉴클레오티드 폴리머피즘 (polymorphism)은 CRL 1609로부터 얻은 예측된 서열에 존재하고 아미노산 위치 142에서의 단백질 서열을 Q에서 K로 바꾼다. 인간 서열과 침팬지 EPO 단백질의 정렬은 아미노산 위치 84에 단일 변화가 있음을 보여 준다 (도 3).
실시예 2: 혼성화 프로브로서 CHEPO의 용도
다음 방법은 CHEPO를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 혼성화 프로브로서의 용도를 기술한다.
전장 또는 성숙 CHEPO (도 2, 서열 3에 나타낸 것과 같음)의 코딩 서열을 포함하는 DNA를 이용할 수 있거나, 인간 조직 cDNA 라이브러리 또는 인간 조직 게놈 라이브러리에서 상동성 DNA (예를 들면, CHEPO의 천연 변종을 코딩하는 것)를 스크리닝하는 데 프로브로서 사용하였다.
이들 라이브러리 DNA를 포함하는 필터의 혼성화 및 세척을 다음 고엄격 조건 하에 수행하였다. 방사선 표지된 CHEPO 유도 프로브를 50% 포름아미드, 5×SSC, 0.1% SDS, 0.1% 피로인산나트륨, 50 mM 인산나트륨, pH 6.8, 2×덴하르트(Denhardt's) 용액 및 10% 덱스트란 황산염의 용액 중에서 42℃에서 20시간 동안 혼성화를 수행하였다. 필터를 0.1×SSC 및 0.1% SDS의 수용액 중에서 42℃에서 세척하였다.
이어서, 전장 천연 서열 CHEPO를 코딩하는 DNA와 원하는 서열 동일성을 갖는 DNA를 당업계에 공지된 표준 방법으로 확인하였다.
실시예 3: 이. 콜라이에서 CHEPO의 발현
본 실시예는 이. 콜라이 내의 재조합 발현으로 CHEPO 폴리펩티드의 비글리코실화된 형태를 제조하는 방법을 나타낸다.
먼저, 원하는 CHEPO를 코딩하는 DNA 서열 (서열 3)을 선택된 PCR 프라이머를 이용하여 증폭하였다. 프라이머는 선택된 발현 벡터 상의 제한 효소 부위에 해당하는 제한 효소 부위를 포함해야만 한다. 여러 발현 벡터가 사용될 수 있다. 적합한 벡터의 예로는 앰피실린 및 테트라사이클린 내성 유전자를 포함하는 pBR322[이. 콜라이에서 유래; Bolivar et al., Gene 2:95(1977)]가 있다. 벡터를 제한 효소로 절단하고 탈인산화시켰다. 이어서, PCR 증폭된 서열을 벡터에 라이게이션하였다. 벡터는 바람직하게는 항생제 내성 유전자, trp 프로모터, 폴리his 리더(처음 6개의 STII 코돈, 폴리his 서열 및 엔테로키나제 절단 부위를 포함), CHEPO 코딩 부위, 람다 전사 터미네이터 및 argU 유전자를 코딩하는 서열을 포함할 것이다.
이어서, 라이게이션 혼합물을 Sambrook 등(상기 문헌)이 기재한 방법을 이용하여 선택된 이. 콜라이 균주를 형질전환시키는데 사용하였다. LB 배지에서 성장할 수 있는 형질전환체를 확인하고 항생제 내성을 갖는 콜로니를 선택하였다. 플라스미드 DNA를 제한 분석법 및 DNA 서열 분석을 이용하여 단리, 확인하였다.
선택된 클론을 항생제가 보충된 LB 브로스와 같은 액체 배양 배지에서 밤새 배양하였다. 이 배양액을 더 큰 규묘의 배양 접종에 사용하였다. 이어서, 세포를 발현 프로모터가 작동되는 동안 원하는 광학 밀도까지 배양시켰다.
수시간 이상 동안 세포를 배양한 후에 원심분리로 세포를 회수할 수 있다. 원심분리로 얻어진 세포 펠렛을 당업계에 공지된 여러가지 시약을 이용하여 용해시키고, 단백질이 강하게 결합하는 조건 하에서 금속 킬레이팅 칼럼을 이용하여 용해된 CHEPO 단백질을 정제하였다.
CHEPO는 다음 과정을 이용하여 이. 콜라이에서 폴리-His 태그가 부가된 형태로 발현될 수 있다. CHEPO를 코딩하는 DNA는 선택된 PCR 프라이머를 이용하여 초기에 증폭된다. 프라이머는 선택된 발현 벡터 상의 제한효소 부위에 해당하는 제한 효소 부위 및 효율적이고 신뢰할 만한 번역 개시, 금속 킬레이트 칼럼에서 빠른 정제, 엔테로키나제를 사용한 단백질 분해 제거를 제공하는 다른 유용한 서열을 포함하였다. 이어서 PCR 증폭된, 폴리-His 태그가 부가된 서열을 발현 벡터에 라이게이션시켜 이. 콜라이 숙주[균주 52(W3110fuhA(tonA) lon galE rpoHts(htpRts) clpP (lacIq)]를 형질전환 시키는 데 사용하였다. 우선 형질전환체를 50 ㎎/㎖의 카르베니실린 (carbenicillin)을 포함하는 LB 배지에서 O.D.600이 3 내지 5에 도달할 때까지 30℃에서 진탕 배양하였다. 이어서, 배양액을 CRAP 배지(물 500 ㎖ 내의 3.57 g (NH4)2SO4, 0.71 g 시트르산나트륨·2H2O, 1.07 g KCl, 5.36 g Difco 효모 추출물, 5.36 g Sheffield hycase SF, 또한 110 mM MPOS, pH 7.3, 0.55% (w/v) 글루코스 및 7 mM MgSO4를 혼합하여 준비)로 50 내지 100배로 희석하고 약 20 내지 30시간 동안 30℃에서 진탕 배양시켰다. 시료를 취해 SDS-PAGE 분석법으로 발현을 확인하고 대량 배양액을 원심분리하여 세포를 펠렛으로 만들었다. 세포 펠렛을 정제와 리폴딩시킬 때까지 냉동시켰다.
0.5 내지 1L 발효액으로부터 얻은 이. 콜라이 페이스트 (6 내지 10 g 펠렛)를 10배 부피(w/v)의 7 M 구아니딘, 20 mM Tris, pH 8 완충액에 재현탁시켰다. 고체 아황산나트륨 및 사티온산나트륨을 각각 최종 농도 0.1 M과 0.02 M이 되도록 첨가하고 용액을 4℃에서 밤새 교반하였다. 이 단계에서 아황산염화에 의해 모든 시스테인 잔기가 차단된 변성 단백질이 생성되었다. 이 용액을 Beckman 초원심 분리기에서 40,000 rpm에서 30분간 원심분리하였다. 상등액을 3 내지 5 배 부피의 금속 킬레이트 칼럼 완충액(6 M 구아니딘, 20 mM Tris, pH 7.4)으로 희석하고 0.22 마이크론 필터로 여과시켜 정화하였다. 정화된 추출물을 금속 킬레이트 칼럼 완충액으로 평형화된 5 ㎖ Qiagen Ni-NTA 금속 킬레이트 칼럼에 로딩하였다. 칼럼을 50 mM 이미다졸(Calbiochem, Utrol grade)을 포함하는 추가의 완충액(pH 7.4)으로 세척하였다. 단백질을 250 mM 이미다졸을 포함하는 완충액으로 용출시키고, 목적하는 단백질을 포함하는 분획을 모아 4℃에 보관하였다. 아미노산 서열에 따라 계산된 흡광 계수를 이용하여 280 nm 흡광도로 단백질 농도를 측정하였다.
시료를 20 mM Tris, pH 8.6, 0.3 M NaCl, 2.5 M 우레아, 5 mM 시스테인, 20 mM 글리신 및 1 mM EDTA로 구성된 새롭게 준비한 리폴딩 완충액으로 천천히 희석하여 단백질을 리폴딩시켰다. 리폴딩 부피는 최종 단백질 농도가 50 내지 100 ㎍/㎖가 되도록 정하였다. 리폴딩 용액을 4℃에서 12 내지 36시간 가량 서서히 교반하였다. 최종농도가 0.4% (약 pH 3)가 되도록 TFA를 첨가하여 리폴딩 반응을 정지시켰다. 추가로 단백질을 정제하기 전에, 용액을 0.22 마이크론 필터로 여과시키고 아세토니트릴을 최종 농도 2 내지 10%가 되도록 첨가하였다. 리폴딩된 단백질을 10 내지 80%의 아세토니트릴 농도 구배로 용출시키면서 0.1% TFA의 이동 완충액을 이용하는 Poros R1/H 역상 칼럼 크로마토그래피시켰다. A280 흡광도를 보이는 분획의 분액을 SDS 폴리아크릴아미드 겔에서 분석하여 균질하게 리폴딩된 단백질을 포함하는 분획을 회수하였다. 일반적으로, 리폴딩된 단백질은 역상 수지와의 상호작용으로부터 보호되는 소수성의 내부 부분과 가장 밀착되기 때문에, 대부분의 단백질에서 적절하게 리폴딩된 단백질 형태는 아세토니트릴의 가장 낮은 농도에서 용출된다. 응집된 단백질은 대개 높은 아세토니트릴 농도에서 용출된다. 역상 단계는 바람직한 형태의 단백질로부터 잘못 폴딩된 형태의 단백질을 분리할 뿐 아니라, 시료로부터 내독소를 제거한다.
폴딩된 CHEPO 폴리펩티드를 포함하는 분획을 회수하여 용액에 대해 질소 기류를 부드럽게 적용하여 아세토니트릴을 제거하였다. 투석법 또는 제제화 완충액으로 평형화되고 멸균 여과된 G25 Superfine(Pharmacia) 수지를 이용한 겔 여과법으로 0.14 M 염화나트륨 및 4% 만니톨을 포함하는 20 mM Hepes, pH 6.8으로 단백질을 제제화하였다.
실시예 4: 포유동물 세포에서의 CHEPO의 발현
본 실시예는 포유동물 세포내의 재조합 발현으로 CHEPO 폴리펩티드의 가능한 글리코실화된 형태를 제조하는 방법을 예시한다.
벡터 pRK5(1989. 3.15 공개된 EP 307,247 참조)를 발현 벡터로 사용하였다. 임의로, Sambrook 등(상기 문헌)이 기재한 라이게이션 방법을 이용하여 CHEPO DNA를 선택된 제한 효소를 사용하여 pRK5에 라이게이션시켜, CHEPO DNA를 삽입하였다. 생성 벡터를 pRK5-CHEPO 폴리펩티드로 지칭하였다.
한 실시 태양에서, 숙주 세포로서 293 세포를 선택할 수 있다. 인간 293 세포(ATCC CCL 1573)를 태아 송아지 혈청 및 임의로 영양소 및(또는) 항생제가 보충된 DMEM와 같은 배지에서 조직 배양 플레이트에 융합(confluent)되도록 배양하였다. 약 10 ㎍ pRK5-CHEPO DNA를 VA RNA 유전자를 코딩하는 DNA[Thimmappaya et al., Cell, 31: 543(1982)] 약 1 ㎍과 혼합하여, 500 ㎕의 1 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA 및 0.227 M CaCl2에 용해시켰다. 이 혼합물에 500 ㎕의 50 mM HEPES(pH 7.35), 280 mM NaCl, 1.5 mM NaPO4를 적가하여 25℃에서 10분간 침전물을 형성시켰다. 침전물을 현탁시키고 293 세포에 첨가하여 37℃에서 4시간 가량을 정치시켰다. 배지를 흡인 제거하고 PBS 내의 20% 글리세롤 2 ㎖를 30초 동안 첨가하였다. 이어서, 293세포를 혈청 무첨가 배지로 세척하고 새로운 배지를 첨가하고 5일간 세포를 배양하였다.
형질감염 약 24시간 후에 배양 배지를 제거하고 배지(만으로) 또는 200 μCi/㎖ 35S-시스테인 및 200 μCi/㎖ 35S-메티오닌을 포함하는 배지로 교체하였다. 12시간 배양 후, 조건화된 배지를 회수하고 회전 필터에서 농축시켜 15% SDS 겔에 로딩하였다. 처리된 겔을 건조시키고 일정 기간동안 필름에 노출시켜 CHEPO 폴리펩티드의 존재를 확인하였다. 형질감염된 세포를 포함하는 배양액을 추가로 배양시키고(혈청 무첨가 배지에서), 배지를 선택된 생물분석법으로 시험하였다.
별법으로, 문헌[Somparyrac et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 12:7575(1981)]이 기재한 덱스트란 술페이트 방법을 이용하여 CHEPO를 293 세포에 일시적으로 도입시킬 수 있었다. 293 세포는 회전 플라스크에서 최고 밀도가 되도록 배양하고 700 ㎍ pRK5-CHEPO DNA를 첨가하였다. 세포를 우선 원심분리하여 회전 플라스크로부터 농축하고 PBS로 세척하였다. DNA-덱스트란 침전물을 4시간 동안 세포 펠렛 상에서 인큐베이션하였다. 세포를 20% 글리세롤로 90초간 처리하고 조직 배양 배지로 세척한 후 다시 조직 배양 배지, 5 ㎍/㎖ 소의 인슐린 및 0.1 ㎍/㎖ 소의 트랜스페린을 포함하는 회전 플라스크에 넣었다. 약 4일 후에 조건화된 배지를 원심분리하고 여과시켜 세포와 파쇄물을 제거하였다. 발현된 CHEPO를 포함하는 시료를 농축시키고 선택된 방법, 예를 들어 투석 및(또는) 칼럼 크로마토그래피로 정제하였다.
다른 실시 태양으로, CHEPO를 CHO 세포에 발현시킬 수 있다. pRK5-CHEPO를 공지된 시약, 예를 들어 CaPO4 또는 DEAE 덱스트란을 이용하여 CHO 세포에 형질감염시킬 수 있다. 상기에서 언급한 것과 같이, 세포를 배양하고, 배지만으로 또는 35S-메티오닌과 같은 방사선 표지를 포함하는 배지로 배양액을 교체할 수 있다. 발현된 폴리펩티드의 존재를 확인하고 나서, 배양 배지를 혈청 무첨가 배지로 교체한다. 바람직하게는, 약 6일 가량 배양물을 인큐베이션 하고 조건화된 배지를 회수한다. 발현된 CHEPO를 포함하는 배지를 농축하여 선택된 방법으로 정제할 수 있다.
또한, 에피토프 태그가 부가된 CHEPO는 CHO 숙주세포에서 발현될 수 있다. CHEPO는 pRK5 벡터로부터 서브클로닝될 수 있다. 서브클론의 삽입은 PCR을 통해 폴리-his 태그와 같은 선택된 에피토프 태그를 갖는 형태로 바큘로바이러스 발현 벡터에 융합될 수 있다. 폴리-his 태그가 부가된 CHEPO 삽입체는 안정한 클론을 선택하기 위해 DHFR과 같은 선택 마커를 포함하는 SV40 유도 벡터로 서브클로닝될 수 있다. 최종적으로, CHO 세포는 (상기에서와 같이) SV40 유도 벡터로 형질감염될 수 있다. 발현을 확인하기 위해서 상기와 같은 방법으로 표지될 수 있다. 이어서, 발현된 폴리-His 태그된 CHEPO를 포함하는 배양 배지를 농축하여 Ni2+-킬레이트 친화도 크로마토그래피와 같이 선택된 방법으로 정제할 수 있다.
CHEPO는 또한 일시적인 발현 과정에 의해 CHO 및(또는) COS 세포에서 또는 다른 안정된 발현 방법에 의해서 CHO 세포 내에서 발현될 수 있다.
다음 실험 방법을 이용하여 CHO 세포 내에서 안정하게 발현되었다. 단백질은 각 단백질의 가용성 형태의 코딩 서열(예, 세포의 도메인)이 힌지, CH2 및 CH2 도메인을 포함하는 IgG1 불변 영역 서열에 융합된 IgG 구조체 (이뮤노어드헤신)로서 발현 및(또는) 폴리-His 태그가 부가된 형태로 발현되었다.
PCR 증폭에 이어 문헌 [Ausubel et al., Current Protocols of Molecular Biology, Unit 3.16, Johnn Wiley and Sons(1997)]에 의해 기재된 표준 방법을 이용하여 각 DNA를 CHO 발현 벡터에 서브클로닝 하였다. CHO 발현 벡터는 목적하는 DNA의 5' 및 3'에 적합한 제한 부위를 갖도록 제조되어 cDNA의 제한 위치가 편리하게 셔틀링될 수 있게 된다. CHO 세포에서 발현에 사용되는 벡터는 문헌[Lucas et al., Nucl. Acids Res. 24:9(1774-1779(1996)]에 의해 기재된 바와 같으며, 목적하는 cDNA와 디히드로폴레이트 리덕타제(DHFR)를 발현시키기 위해 SV40 초기 프로모터/인핸서를 사용하였다. DHFR 발현으로 형질감염된 플라스미드의 안정적 유지를 선별할 수 있다.
원하는 플라스미드 DNA 12 ㎍을 시판되는 형질감염 시약 Superfect(등록상표) (Qiagen), Dosper(등록상표) 또는 Fugene(등록상표)(Boehringer Mannheim)을 이용하여 약 1000만개의 CHO 세포에 도입하였다. 상기의 문헌(Lucas et al.)의 기재 방법에 따라 세포를 배양하였다. 추후에 세포를 배양 및 생산하기 위해 약 3 x 10-7 세포를 하기에 기재된 방법에 따라 앰플에 동결시켰다.
플라스미드 DNA를 포함하는 앰플을 수조에 넣어 녹인 후 볼텍싱하여 혼합하였다. 내용물을 배지 10 ㎖를 포함하는 원심분리 튜브에 피펫으로 넣고 1000 rpm에서 5분간 원심분리하였다. 상등액을 흡입해 내고 세포를 10 ㎖ 선택 배지(0.2 ㎛ 투석 여과된 5% 소 태아 혈청을 포함하는 0.2 ㎛ 여과된 PS20)에 재현탁시켰다. 세포를 90 ㎖ 선택 배지를 포함하는 100 ㎖ 스피너에 분주하였다. 1 내지 2일 후 세포를 150 ㎖ 선택 배지로 채워진 250 ㎖ 스피너로 옮겨 37℃에서 배양하였다. 2 내지 3일 후에 250 ㎖, 500 ㎖ 및 2000 ㎖ 스피너에 3 x 105 세포/㎖를 접종하였다. 세포 배양액을 원심 분리하여 신선한 배지로 교환하고 생산 배지에 재현탁하였다. 임의의 적합한 CHO 배지를 이용할 수 있으나, 공개 미국 특허 제5,122,469호 (1992. 6. 16)에 기재된 생산 배지를 실제로 이용하였다. 3 ℓ 생산 스피너에 1.2 x 106 세포/㎖가 되도록 접종하였다. 제0일에 세포 수와 pH를 측정하였다. 제1일에 스피너에서 시료를 취해 여과된 공기의 살포를 개시하였다. 제2일에 스피너에서 시료를 취해 온도를 33℃로 바꾸고 500 g/L-글루코스 30 ㎖ 및 10% 소포제 0.6 ㎖(예, 35% 폴리디메틸 실록산 유액, Dow Corning 365 의약 등급 유액)를 첨가하였다. 전체 생산기 동안, pH를 약 7.2에서 유지시켜야만 한다. 10일 후 또는 생존률이 70% 미만으로 떨어질 즈음 세포 배양액을 원심분리로 회수하고 0.22 ㎛ 필터에 여과시켰다. 여과액을 정제 칼럼에 로딩하기 전까지 4℃에 보관하였다.
폴리-his 태그된 구조물의 경우, Ni-NTA 칼럼(Qiagen)을 이용하여 단백질을 정제하였다. 정제하기 전에 이미다졸을 5 mM 농도로 조건화된 배지에 첨가하였다. 조건화된 배지를 0.3 M NaCl 및 5 mM 이미다졸을 포함하는 20 mM Hepes, pH 7.4 완충액으로 평형화된 6 ㎖ Ni-NTA 칼럼에 4℃에서 4 내지 5 ㎖/분의 유속으로 주입하였다. 로딩 후에 칼럼을 추가의 평형 완충액으로 세척하고 단백질을 0.25 M 이미다졸을 포함하는 평형 완충액으로 용출하였다. 이어서 정제된 단백질을 25 ㎖의 G25 수퍼파인 (Pharmacia) 칼럼으로 10 mM Hepes, 0.14 M NaCl 및 4% 만니톨을 함유하는 저장 완충액(pH 6.8)에서 염을 제거하고 -80℃에서 보관하였다.
이뮤노어드헤신(Fc 포함) 구조물은 조건화된 배지로부터 다음과 같이 정제되었다. 조건화된 배지를 20 mM 인산 나트륨 완충액(pH 6.8)으로 평형화된 5 ㎖ 단백질 A 칼럼(Pharmacia)에 주입하였다. 로딩후, 칼럼을 평형화 완충용액으로 세척하고 100 mM 시트르산(pH 3.5)으로 용출하였다. 용출된 단백질을 275 ㎕의 1 M Tris 완충액(pH 9)을 포함하는 튜브에 1 ㎖ 분획으로 회수하여 즉시 중화시켰다. 이어서 고도로 정제된 단백질을 폴리-His 태그된 단백질의 경우에 상기에 기재된 방법으로 저장 완충액으로 염을 제거하였다. 상동성을 SDS-폴리아크릴 아미드 겔 및 에드만 분해법으로 수행되는 N-말단 아미노산 서열 분석으로 확인하였다.
실시예 5: 효모에서의 CHEPO 폴리펩티드의 발현
다음 방법은 효모에서 원하는 CHEPO의 재조합 발현을 기재하고 있다.
우선, ADH2/GAPDH 프로모터로부터 CHEPO의 세포내 생산 또는 분비를 위한 효모 발현 벡터를 제조하였다. CHEPO 및 프로모터를 코딩하는 DNA를 CHEPO 폴리펩티드의 세포내 발현을 위해 선택된 플라스미드의 적합한 제한 효소 부위에 삽입하였다. 분비의 경우, CHEPO 발현을 위해 CHEPO를 코딩하는 DNA를 ADH2/GAPDH 프로모터, 천연 CHEPO 신호 펩티드 또는 다른 포유동물의 신호 펩티드, 예를 들어 효모 알파-인자 또는 인버타제 분비 신호/리더 서열 및 링커 서열(필요한 경우)을 코딩하는 DNA와 함께 선택된 플라스미드에 클로닝할 수 있다.
이어서, 효모 세포, 예를 들어 효모 균주 AB110을 상기에서 기재된 발현 플라스미드로 형질전환시키고 선택된 발효 배지에서 배양할 수 있다. 형질 전환된 효모 상등액을 10% 트리클로로아세트산으로 침전시키고 SDS-PAGE로 분리한 후 겔을 쿠마시 블루로 염색하여 분석할 수 있다.
계속해서, 원심분리에 의해 발효 배지로부터 효모 세포를 제거하고 선택된 카트리지 필터를 이용하여 배지를 농축시켜 재조합 CHEPO를 단리하고 정제할 수 있다. CHEPO를 함유하는 농축액을 선택된 칼럼 크로마토그래피 수지를 이용하여 추가로 정제할 수 있다.
실시예 6: 바큘로바이러스 감염 곤충 세포 내에서 CHEPO의 발현
다음 방법은 바큘로바이러스 감염 곤충 세포 내에서 CHEPO의 재조합 발현에 대하여 기재하고 있다.
CHEPO를 코딩하는 서열을 바큘로바이러스 발현 벡터에 포함된 에피토프 태그의 상류에 융합시켰다. 상기의 에피토프 태그는 폴리-his 태그 및 면역글로블린 태그(IgG의 Fc 영역과 같이)를 포함하고 있다. 시판되는 플라스미드, 예를 들어 pVL1393(Novagen)에서 유도된 플라스미드를 포함하여 여러 플라스미드를 사용할 수 있다. 간략하게, CHEPO 또는 CHEPO의 코딩 서열의 원하는 부분, 예를 들어 막횡단 단백질의 세포외 도메인을 코딩하는 서열 또는 성숙 단백질 코딩하는 서열을 5' 및 3' 영역에 상보적인 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하였다. 5' 프라이머는 인접한 (선택된) 제한 효소 부위를 포함할 수 있다. 이어서 생산물을 선택된 제한 효소로 절단하여 발현 벡터에 서브클로닝하였다.
재조합 바큘로바이러스는 리포펙틴(GIBCO-BRL로부터 구입)을 이용하여 상기의 플라스미드 및 BaculoGold(등록상표) 바이러스 DNA (Pharmingen)를 스포돕테라 프루기페르다 ("Sf9") 세포 (ATCC CRL 1711)에 동시에 형질감염시켜 생성되었다. 28℃에서 4 내지 5일 배양 후에, 방출된 바이러스를 회수하여 이후의 증폭에 사용한다. 바이러스 감염 및 단백질 발현은 문헌[O'Reilley et al., Baculovirus Expression vectors: A laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994)]에 따라 수행하였다.
이어서, 발현된 폴리-his 태그된 CHEPO는 예를 들어 Ni2+-킬레이트 친화도 크로마토그래피로 다음과 같이 정제될 수 있다. 추출액을 문헌[Rupert et al., Nature, 362: 175-179(1993)]에 따라 재조합 바이러스-감염된 Sf9 세포로부터 제조한다. 간략하게, Sf9 세포를 세척하여 초음파 처리 완충액 (25 ㎖ Hepes, pH 7.9; 12.5 mM MgCl2; 0.1 mM EDTA; 10% 글리세롤; 0.1% NP-40; 0.4 M KCl)에 재현탁시키고 빙상에서 20초간 두차례 초음파 처리하였다. 초음파 처리물을 원심분리로 제거하고 상등액을 로딩 완충액(50 mM 인산, 300 mM NaCl, 10% 글리세롤, pH 7.8)에 50배 희석하여 0.45 ㎛ 필터로 여과시켰다. Ni2+-NTA 아가로즈 칼럼(Quiagen으로부터 구입)을 5 ㎖ 충진 부피로 준비하여 물 25 ㎖로 세척하고 로딩 완충액 25 ㎖로 평형화시켰다. 여과시킨 세포 추출물을 분당 0.5 ㎖로 칼럼에 로딩하였다. 점 분획 회수를 개시할 때 칼럼을 로딩 완충액으로 A280 기준선까지 세척하였다. 다음으로, 2차 세척 완충액(50 mM 인산; 300 mM NaCl, 10% 글리세롤, pH 6.0)으로 칼럼을 세척하여 비특이적으로 결합된 단백질을 용출시켰다. A280이 기준선에 다시 도달하면, 칼럼을 2차 세척 완충액에 0 내지 500 mM 이미다졸로 구배로 전개시켰다. 1 ㎖ 분획을 회수하여 SDS-PAGE 및 은 염색 또는 알카리 포스파타제에 결합된 Ni2+-NTA(Qiagen)로 웨스턴 블롯팅하여 분석하였다. 용출된 His10 태그된 CHEPO를 포함하는 분획을 모아 로딩 완충액에 대해 투석하였다.
별법으로, IgG 태그된 (또는 Fc 태그된) CHEPO의 정제는 공지된 크로마토그래피 기술, 예를 들어 단백질 A 또는 단백질 G 칼럼 크로마토그래피를 이용하여 수행하였다.
실시예 7: CHEPO에 결합하는 항체의 제조
본 실시예는 CHEPO에 특이적으로 결합할 수 있는 단클론 항체를 제조하는 방법이다.
모노클로날 항체를 생산하는 기술은 당업계에 공지되어 있으며 예를 들어 상기의 문헌(Goding)에 기재되어 있다. 이용될 수 있는 면역원에는 본 발명의 정제된 CHEPO, CHEPO를 포함하는 융합 단백질 및 세포 표면에 재조합 CHEPO를 발현하는 세포를 포함한다. 숙련자는 불필요한 실험없이도 면역원을 선택할 수 있다.
생쥐, 예를 들어 Balb/c를 프로인드 완전 보조액에 유화된 CHEPO 면역원 1 내지 100 ㎍을 피하 또는 복강내 주사하여 면역시켰다. 별법으로, 면역원을 MPL-TDM 보조액(Ribi Immunochemical Research, Hamilton, MT)에 유화시켜 동물의 뒷발바닥에 주사하여 면역화하였다. 이어서 면역된 생쥐를 10 내지 12 일 후에 선택된 보조제 내에 유화된 추가의 면역원으로 부스팅하였다. 그 이후, 수주 동안 생쥐를 추가 면역 주사로 부스팅할 수 있다. 역회전 출혈법으로 생쥐로부터 혈청 시료를 주기적으로 채취하여, ELISA 분석법을 시험하여 항-CHEPO 폴리펩티드 항체를 검출하였다.
적합한 항체 역가가 검출되면, 항체에 대해 "양성"인 동물에게 CHEPO를 최종 정맥주사하였다. 3 내지 4일 후에 생쥐를 희생시켜 비장 세포를 회수한다. 이어서, 비장 세포를 선택된 쥐의 골수종 세포주, 예를 들어 ATCC 번호 CRL 1597로부터 이용 가능한 P3X63AgU.1와 융합시켰다 (35% 폴리에틸렌 글리콜 이용). 융합체는 비 융합 세포, 골수종 하이브리드 및 비장세포 하이브리드의 증식을 억제하는 HAT(하이포잔틴, 아미노프테린 및 티미딘) 배지를 포함하는 96 웰 조직 배양 플레이트에 플레이팅될 수 있는 하이브리도마 세포를 생성하였다.
하이브리도마 세포를 CHEPO에 대한 반응성을 위한 ELISA로 스크리닝할 수 있다. CHEPO 폴리펩티드에 대한 목적하는 단클론 항체를 분비하는 "양성" 하이브리도마 세포를 결정하는 방법은 당업계의 숙련자에게 잘 알려져 있다.
양성 하이브리도마 세포는 동계의 Balb/c 생쥐가 항-CHEPO 단클론 항체를 포함하는 복수를 생산하도록 복강 내에 주사될 수 있다. 별법으로, 하이브리도마 세포는 조직 배양 플라스크 또는 롤러병에서 배양될 수 있다. 복수 내에서 생성된 단클론 항체는 황산암모늄 침전, 이어서 겔 배제 크로마토그래피를 이용하여 정제될 수 있다. 별법으로, 항체의 단백질 A 또는 단백질 G 결합을 기초로 하는 친화도 크로마토그래피를 이용할 수도 있다.
실시예 8: 특이적 항체를 사용한 CHEPO 폴리펩티드의 정제
천연 또는 재조합 CHEPO 폴리펩티드를 단백질 정제 분야의 다양한 표준 기법으로 정제할 수 있다. 예를 들면, 프로(CHEPO)-CHEPO 폴리펩티드, 성숙 CHEPO 폴리펩티드 또는 프리(pre)-CHEPO 폴리펩티드를 목적 CHEPO 폴리펩티드에 특이적인 항체를 이용하는 면역친화성 크로마토그래피로 정제한다. 일반적으로, 면역친화성 칼럼은 항-CHEPO 폴리펩티드 항체를 활성화된 크로마토그래피 수지에 공유 결합적으로 커플링시킴으로써 제작된다.
폴리클론 이뮤노글로불린은 면역 혈청으로부터 황산암모늄으로 침전시키거나, 고정화 Protein A (Pharmacia LKB Biotechnology (뉴저지주 피츠카타웨이)) 상에서 정제하여 제조하였다. 유사하게, 단클론 항체는 생쥐 복수액으로부터 황산암모늄 침전법 또는 고정화 Protein A 상의 크로마토그래피에 의해 제조하였다. 부분적으로 정제된 이뮤노글로불린을 CnBr-활성화 SEPHAROSE™ (Pharmacia LKB Biotechnology)와 같은 크로마토그래피 수지에 공유적으로 부착시켰다. 항체를 수지에 커플링시키고, 수지를 블록킹시키고, 유도된 수지를 제조업자의 지시에 따라 세척하였다.
이러한 면역친화성 칼럼은 CHEPO 폴리펩티드를 가용성 형태로 포함하는 세포로부터 분획을 제조함으로써 CHEPO 폴리펩티드의 정제에 이용된다. 이 제제는 세제 첨가에 의해 또는 당업계에 잘 알려져 있는 다른 방법에 의한 전세포의 가용화 또는 차등 원심분리를 통해 수득한 세포하 분획의 가용화에 의해 유도된다. 별법으로, 신호 서열을 포함하는 가용성 CHEPO 폴리펩티드는 세포가 성장하는 배지 내로 유용한 양으로 분비될 수 있다.
가용성 CHEPO 폴리펩티드 함유 제제를 면역친화성 칼럼 상으로 통과시키고, 칼럼을 CHEPO 폴리펩티드의 차별적인 흡광도를 허용하는 조건 (예를 들면, 세제의 존재 하에 고이온 강도 완충액) 하에 세척하였다. 이어서, 칼럼을 항체/CHEPO 폴리펩티드 결합을 파괴시키는 조건 (예를 들면, 약 pH 2 내지 3과 같은 저 pH 완충액 또는 고농도의, 요소 또는 티오시아네이트 이온과 같은 카오트로프(chaotrope)) 하에 용출시키고, CHEPO 폴리펩티드를 회수하였다.
실시예 9: 약물 스크리닝
본 발명은 CHEPO 폴리펩티드 또는 그의 결합 단편을 사용하여 임의의 다양한 약물 스크리닝 기법으로 화합물을 스크리닝하기 위해 특히 유용하다. 이러한 시험에 사용된 CHEPO 폴리펩티드 또는 단편은 용액 중에 유리되어 있거나, 고상 지지체에 고착되거나, 세포 표면에서 유지되거나, 세포 내에 위치할 수 있다. 약물 스크리닝의 한 방법에서는 CHEPO 폴리펩티드 또는 단편을 발현하는 재조합 핵산을 사용하여 안정하게 형질전환된 진핵 또는 원핵 숙주 세포를 이용한다. 약물을 경쟁적 결합 분석으로 상기 형질전환된 세포에 대해 스크리닝하였다. 생존형 또는 고정형의 상기 세포는 표준 결합 분석을 위해 사용할 수 있다. 예를 들면, CHEPO 폴리펩티드 또는 단편과 시험되는 활성제 사이의 복합체 형성을 측정할 수 있다. 별법으로, 시험되는 활성제의 의해 유발된 CHEPO 폴리펩티드와 그의 표적 세포 또는 표적 수용체 사이의 복합체 형성의 감소를 검사할 수 있다.
따라서, 본 발명은 CHEPO 폴리펩티드-관련 질환 또는 장애에 영향을 끼칠 수 있는 약물 또는 임의의 다른 활성제를 스크리닝하기 위한 방법을 제공한다. 이들 방법은 그러한 활성제를 CHEPO 폴리펩티드 또는 그의 단편과 접촉시키고, 당업계에 잘 알려진 방법으로 (i) 활성제와 CHEPO 폴리펩티드 또는 단편 사이의 복합체의 존재 또는 (ii) CHEPO 폴리펩티드 또는 단편과 세포 사이의 복합체의 존재에 대해 분석하는 것을 포함한다. 이러한 경쟁적 결합 분석에서, CHEPO 폴리펩티드 또는 단편은 대개 표지화시킨다. 적합한 인큐베이션 후, 유리 CHEPO 폴리펩티드 또는 단편을 결합형으로 존재하는 것으로부터 분리시키며, 유리 또는 비복합된 표지의 양은 특정 활성제의 CHEPO 폴리펩티드에 결합하는 능력 또는 CHEPO 폴리펩티드/세포 복합체를 저해하는 능력의 척도이다.
또다른 약물 스크리닝 기법은 폴리펩티드에 적합한 결합 친화도를 갖는 화합물에 대한 고처리량 스크리닝을 제공하고, WO84/03564 (1984. 9. 13일자 공개)에 상세히 기재되어 있다. 간단히 서술하면, 다수의 상이한 작은 펩티드 시험 화합물을 플라스틱 핀 또는 몇몇 다른 표면과 같은 고상 기질 상에 합성한다. CHEPO 폴리펩티드에 적용시켜, 펩티드 시험 화합물을 CHEPO 폴리펩티드와 반응시키고 세척한다. 결합된 CHEPO 폴리펩티드는 당업계에 잘 공지된 방법으로 검출한다. 정제된 CHEPO 폴리펩티드는 또한 상기 언급한 약물 스크리닝 기법에 사용하기 위해 평판 상에 직접 코팅될 수 있다. 또한, 비중화 항체를 사용하여 펩티드를 포획하여 이를 고상 지지체 상에 고정시킬 수 있다.
본 발명은 또한 CHEPO 폴리펩티드에 결합할 수 있는 중화 항체가 CHEPO 폴리펩티드 또는 그의 단편에 결합하는데 있어서 시험 화합물과 특이적으로 경쟁하는 경쟁적 약물 스크리닝 분석의 이용을 고려한다. 이러한 방식으로, 항체를 CHEPO 폴리펩티드와 하나 이상의 항원 결정자를 공유하는 임의의 펩티드의 존재를 검출하는 데 사용할 수 있다.
실시예 10: 합리적인(Rational) 약물 디자인
합리적 약물 디자인의 목표는 관심있는 생물 활성 폴리펩티드 (즉, CHEPO 폴리펩티드) 또는 이들이 상호작용하는 작은 분자, 예를 들면, 아고니스트, 길항제 또는 억제제의 구조적 동족체를 생산하는 것이다. 이들 예 중 임의의 것들을 CHEPO 폴리펩티드의 보다 활성적이거나 보다 안정한 형태인 약물, 또는 생체 내 CHEPO 폴리펩티드의 기능을 강화하거나 저해하는 약물을 형성하기 위해 이용할 수 있다 (문헌[호지슨 (Hodgson), Bio/Technology, 9: 19-21 (1991)] 참조).
한 연구에서, CHEPO 폴리펩티드 또는 CHEPO 폴리펩티드-억제제 복합체의 3차원 구조를 x-선 결정법, 컴퓨터 모델링 또는 가장 전형적으로 상기 두 방법의 조합에 의해 결정한다. 분자의 구조를 밝히고 활성 부위(들)을 결정하기 위해 CHEPO 폴리펩티드의 형태와 전하 모두를 확인해야 한다. 더 적은 빈도이지만, CHEPO 폴리펩티드의 구조에 관한 유용한 정보는 상동성 단백질의 구조를 기준으로 모델링함으로써 얻을 수 있다. 두 경우 모두, 관련 구조 정보를 동족 CHEPO 폴리펩티드 유사 분자를 디자인하거나 유효한 억제제를 확인하기 위해 사용한다. 합리적 약물 디자인의 유용한 예는 문헌[브락스톤(Braxton) 및 웰스(Wells), Biochemistry, 31:7796-7801 (1992)]에 나타낸 바와 같이 활성 또는 안정성을 증진시킨 분자, 또는 문헌[아타우다 (Athauda) 등, J. Biochem., 113:742-746 (1993)]에 나타낸 바와 같이 천연 펩티드의 억제제, 아고니스트 또는 길항제로서 작용하는 분자를 포함할 수 있다.
기능 분석에 의해 선택된 표적-특이적 항체를 상기한 바와 같이 단리한 후 그의 결정 구조를 해석하는 것도 가능하다. 이 방법은 원칙적으로 후속적인 약물 디자인이 기준이 될 수 있는 파마코어(pharmacore)를 제공한다. 기능성 약리 활성 항체에 대한 항-유전형 항체 (항-id)를 생산함으로써 단백질 결정법을 생략하는 것도 가능하다. 거울상의 거울상으로서, 항-id의 결합 부위는 원래 수용체의 동족체일 것으로 기대될 것이다. 이어서, 항-id를 사용하여 화학적 또는 생물학적으로 생산된 펩티드 뱅크로부터 펩티드를 확인하고 단리시킬 수 있을 것이다. 이어서, 단리된 펩티드는 파마코어로서 작용할 것이다.
본 발명에 의해, x-선 결정법과 같은 분석적 연구를 수행하기 위해 충분한 양의 CHEPO 폴리펩티드를 이용가능하게 할 수 있다. 또한, 본원에 제공된 CHEPO 폴리펩티드 아미노산 서열 정보는 x-선 결정법 대신 또는 그에 덧붙여 컴퓨터 모델링 기법을 이용하는데 지침을 제공할 것이다.
앞서 기술한 명세서는 당업자가 청구된 본 발명을 실시하기에 충분한 것으로 생각된다. 앞서의 상세한 설명으로부터 본원에 나타내고 기술된 것 이외에 본 발명의 다양한 변형이 당업계의 숙련인에게는 명백하고, 이 변형도 첨부된 특허 청구의 범위 내에 있을 것이다.
<110> DeSauvage, Frederick Henner, Dennis, J. <120> Novel chimpanzee erythropoietin polypeptides and nucleic acids encoding the same <130> GENENT.057QPC <150> US 09/307307 <151> 1999-05-07 <160> 49 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 2329 <212> DNA <213> Pan troglodytes <400> 1 ccccctggac agccgccctc tcctccaggc ccgtggggct ggccctgcac cgccgagctt 60 cccgggatga gggcccccgg tgtggtcacc cggcgcgccc caggtcgctg agggaccccg 120 gccaggcgcg gagatggggg tgcacggtga gtactcgcgg gctgggcgct cccgcccgcc 180 cgggtccctg tttgagcggg gatttagcgc ccgggctatt ggccgggagg tggctgggtt 240 caaggaccgg cgacttgtca aggaccccgg aagggggagg ggggtggggc agcctccacg 300 tgccagcggg gacttggggg agtccttggg gatggcaaaa acctgacctg tgaaggggac 360 acagtttggg ggttgagggg aagaaggttt gggggttctg ctgtgccagt ggagaggaag 420 ctgataagct gataacctgg gcgctggagc caccacttat ctgccagagg gnnnntggta 480 gctgggggtg gggtgtgcac acggcagcag gattgaatga aggccaggga ggcagcacct 540 gagtgcttgc atggttgggg acaggaagga cgagctgggg cagagacgtg gggatgaagg 600 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<400> 37 Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu 1 5 10 15 Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu 20 25 30 Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu 35 40 45 Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu 50 55 60 Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg 65 70 75 80 Asn Xaa Thr Xaa Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu 85 90 95 Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser 100 105 110 Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly 115 120 125 Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Lys Lys Glu 130 135 140 Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile 145 150 155 160 Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu 165 170 175 Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp 180 185 190 Arg <210> 38 <211> 193 <212> PRT <213> Pan troglodytes <400> 38 Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu 1 5 10 15 Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu 20 25 30 Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu 35 40 45 Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu 50 55 60 Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg 65 70 75 80 Met Asn Xaa Ser Xaa Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu 85 90 95 Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser 100 105 110 Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly 115 120 125 Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu 130 135 140 Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile 145 150 155 160 Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu 165 170 175 Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp 180 185 190 Arg <210> 39 <211> 193 <212> PRT <213> Pan troglodytes <400> 39 Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu 1 5 10 15 Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu 20 25 30 Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu 35 40 45 Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu 50 55 60 Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg 65 70 75 80 Met Asn Xaa Ser Xaa Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu 85 90 95 Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser 100 105 110 Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly 115 120 125 Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Lys Lys Glu 130 135 140 Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile 145 150 155 160 Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu 165 170 175 Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp 180 185 190 Arg <210> 40 <211> 193 <212> PRT <213> Pan troglodytes <400> 40 Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu 1 5 10 15 Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu 20 25 30 Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu 35 40 45 Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu 50 55 60 Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg 65 70 75 80 Met Asn Xaa Thr Xaa Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu 85 90 95 Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser 100 105 110 Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly 115 120 125 Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu 130 135 140 Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile 145 150 155 160 Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu 165 170 175 Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp 180 185 190 Arg <210> 41 <211> 193 <212> PRT <213> Pan troglodytes <400> 41 Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu 1 5 10 15 Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala 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Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu 35 40 45 Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu 50 55 60 Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg 65 70 75 80 Met Glu Asn Xaa Ser Xaa Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu 85 90 95 Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser 100 105 110 Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly 115 120 125 Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu 130 135 140 Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile 145 150 155 160 Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu 165 170 175 Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp 180 185 190 Arg <210> 43 <211> 193 <212> PRT <213> Pan troglodytes <400> 43 Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu 1 5 10 15 Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu 20 25 30 Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu 35 40 45 Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu 50 55 60 Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg 65 70 75 80 Met Glu Asn Xaa Ser Xaa Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu 85 90 95 Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser 100 105 110 Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly 115 120 125 Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Lys Lys Glu 130 135 140 Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile 145 150 155 160 Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu 165 170 175 Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp 180 185 190 Arg <210> 44 <211> 193 <212> PRT <213> Pan troglodytes <400> 44 Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu 1 5 10 15 Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu 20 25 30 Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu 35 40 45 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Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu 50 55 60 Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg 65 70 75 80 Met Glu Asn Xaa Thr Xaa Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu 85 90 95 Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser 100 105 110 Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly 115 120 125 Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Lys Lys Glu 130 135 140 Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile 145 150 155 160 Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu 165 170 175 Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp 180 185 190 Arg <210> 46 <211> 193 <212> PRT <213> Pan troglodytes <400> 46 Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu 1 5 10 15 Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu 20 25 30 Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu 35 40 45 Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu 50 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Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg 65 70 75 80 Met Glu Val Asn Xaa Ser Xaa Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu 85 90 95 Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser 100 105 110 Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly 115 120 125 Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Lys Lys Glu 130 135 140 Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile 145 150 155 160 Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu 165 170 175 Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp 180 185 190 Arg <210> 48 <211> 193 <212> PRT <213> Pan troglodytes <400> 48 Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu 1 5 10 15 Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu 20 25 30 Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu 35 40 45 Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu 50 55 60 Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg 65 70 75 80 Met Glu Val Asn Xaa Thr Xaa Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu 85 90 95 Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser 100 105 110 Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly 115 120 125 Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu 130 135 140 Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile 145 150 155 160 Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu 165 170 175 Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp 180 185 190 Arg <210> 49 <211> 193 <212> PRT <213> Pan troglodytes <400> 49 Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu 1 5 10 15 Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu 20 25 30 Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu 35 40 45 Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu 50 55 60 Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg 65 70 75 80 Met Glu Val Asn 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  19. 이뮤노글로불린의 Fc 영역에 융합된 도2 (서열번호 2)의 아미노산 잔기 1 내지 193 또는 28 내지 193의 아미노산 서열을 갖는 침팬지 에리쓰로포이에틴 (CHEPO) 폴리펩티드를 갖는 키메라 분자.
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  32. 이뮤노글로불린의 Fc 영역에 융합된 도2 (서열번호 3)의 뉴클레오티드 1 내지 579 또는 82 내지 579에 의해 암호화되는 폴리펩티드 서열을 갖는 침팬지 에리쓰로포이에틴 (CHEPO) 폴리펩티드를 갖는 키메라 분자.
  33. 이뮤노글로불린의 Fc 영역에 융합된 하기 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열 (X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산임)을 갖는 침팬지 에리쓰로포이에틴 (CHEPO) 폴리펩티드를 갖는 키메라 분자.
  34. 이뮤노글로불린의 Fc 영역에 융합된 하기 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열 (X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산임)을 갖는 침팬지 에리쓰로포이에틴 (CHEPO) 폴리펩티드를 갖는 키메라 분자.
  35. 제19항 및 제32항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 침팬지 에리쓰로포이에틴 (CHEPO) 폴리펩티드가 상기 이뮤노글로불린 내의 가변성 영역에 치환되는 것인 키메릭 분자.
  36. 제35항에 있어서, 다이머인 키메릭 분자
  37. 제35항에 있어서, 상기 이뮤노글로불린이 IgG 분자인 키메릭 분자.
  38. 제35항에 있어서, 상기 이뮤노글로불린 Fc 영역이 IgG1 분자의 힌지, CH2 및 CH3 영역을 포함하는 것인 키메릭 분자.
  39. 제35항에 있어서, 상기 이뮤노글로불린 Fc 영역이 IgG1 분자의 힌지, CH1, CH2 및 CH3 영역을 포함하는 것인 키메릭 분자.
KR10-2001-7014133A 1999-05-07 2000-05-05 신규 침팬지 에리쓰로포이에틴 (chepo) 폴리펩티드 및 이를 코딩하는 핵산 KR100524041B1 (ko)

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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EP0410246A1 (de) * 1989-07-26 1991-01-30 BEHRINGWERKE Aktiengesellschaft Erythropoietin (EPO)-Peptide und dagegen gerichtete Antikörper
WO1994024160A2 (en) * 1993-04-21 1994-10-27 Brigham And Women's Hospital Erythropoietin muteins with enhanced activity

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