JP3660880B2 - 新規なチンパンジーエリスロポエチン（ｃｈｅｐｏ）ポリペプチドおよびこれをコードする核酸 - Google Patents

Description

【０００１】
（発明の分野）
本発明は、一般には、新規チンパンジーエリスロポエチンポリペプチド、それらのポリペプチドをコードする核酸分子の同定および単離、ならびにそれらポリペプチドの組換え産生に関連する。
【０００２】
（発明の背景）
赤血球形成、すなわち、赤血球の産生は、細胞の相殺を補うためにヒトの生涯を通じて持続的に起こる。赤血球形成は、適切な組織酸素化のために血中に十分な、しかし細胞の循環を妨げるほど多くはない数の赤血球を利用可能にする、非常に正確に制御された生理的機構である。赤血球の形成は骨髄で起こり、そしてホルモンであるエリスロポエチンの制御下にある。
【０００３】
酸性糖タンパク質であるエリスロポエチンは、約３４，０００ダルトンの分子量であり、α、β、およびアシアロの３つの型で存在し得る。炭水化物成分がわずかに異なるα型およびβ型は、同じ有効性、生物学的活性、および分子量を有する。アシアロ型は、末端の炭水化物（シアル酸）が除去された、α型およびβ型である。エリスロポエチンは、体が健康な状態にある時には血漿中に非常に低い濃度で存在する。ここでは組織は存在する数の赤血球から十分な酸素化を受けている。この正常な低い濃度が、通常加齢によって失われる赤血球の置換を刺激するに十分である。
【０００４】
循環中のエリスロポエチン量は、循環中の血球による酸素輸送が減少したとき、低酸素状態下で増加する。低酸素は、出血による大量の血液の損失、照射への過剰曝露による赤血球の破壊、高い標高または長期化した意識不明状態による酸素取り込みの減少、または様々な形式の貧血によって起こり得る。低酸素ストレスを受けている組織へ応答して、エリスロポエチンは、骨髄の始原前駆体細胞の前赤芽球への変換を刺激することによって、赤血球の産生を増加させる。この前赤芽球は続いて成熟し、ヘモグロビンを合成し、そして赤血球として循環中に放出される。循環中の赤血球の数が正常な組織酸素必要量に必要なものよりも多い場合、循環中のエリスロポエチンは減少する。
【０００５】
エリスロポエチンは赤血球形成の過程に必要不可欠であるので、そのホルモンは、低いまたは不完全な赤血球産生によって特徴付けられる血液障害の診断および治療の両方に潜在的に有用な適用を有する。一般には、鎌状赤血球貧血の可能性のある治療におけるエリスロポエチンに関連する、Ｐｅｎｎａｔｈｕｒ−Ｄａｓら、Ｂｌｏｏｄ ６３（５）：１１６８−７１（１９８４）およびＨａｄｄｙ、Ａｍ．Ｊｏｕｒ．Ｐｅｄ．Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．４：１９１−１９６（１９８２）、およびエリスロポエチンが豊富な血漿の注入に対するインビボの応答に基づく、尿毒症ヒツジの治療レジメンを記載し、そして慢性腎不全に関連する型の貧血の調整策として、１５〜４０日間１日あたり１０Ｕ ＥＯＰ／ｋｇの投与量を提唱する、Ｅｓｃｈｂａｃｈら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．７４（２）：４３４−４４１（１９８４）を参照のこと。また、Ｋｒａｎｅ、Ｈｅｎｒｙ Ｆｏｒｄ Ｈｏｓｐ．Ｍｅｄ．Ｊ．３１（３）：１７７−１８１（１９８３）も参照のこと。
【０００６】
本発明者らは本明細書中で、本明細書中でＣＨＥＰＯと呼ばれる、チンパンジー由来の新規エリスロポエチンポリペプチドの同定および特徴付けを記載する。
【０００７】
（発明の要旨）
ヒトエリスロポエチンをコードする核酸と相同性を有し、本出願において「ＣＨＥＰＯ」と呼ばれる新規チンパンジーエリスロポエチンポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローンが同定された。
【０００８】
１つの実施形態では、本発明はＣＨＥＰＯポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子を提供する。
【０００９】
１つの局面では、単離された核酸分子は、（ａ）図３（配列番号（Ｓｅｑ ＩＤ Ｎｏ．）２および５）の、両端のアミノ酸を含めて約１または約２８から約１９３までのアミノ酸残基の配列を有するＣＨＥＰＯポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、または（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖に対して、少なくとも約８０％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８１％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８２％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８３％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８４％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８５％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８６％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８７％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８８％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８９％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９０％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９１％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９２％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９３％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９４％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９５％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９６％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９７％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９８％の核酸配列同一性、そしてあるいは少なくとも約９９％の核酸配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【００１０】
別の局面では、単離された核酸分子は、（ａ）図３（配列番号２および５）の、両端のアミノ酸を含めて約１または約２８から約１９３までのアミノ酸残基の配列を有するＣＨＥＰＯポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または（ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列の相補鎖を含む。
【００１１】
他の局面では、単離された核酸分子は、（ａ）図２（配列番号３）の、両端のアミノ酸を含めて約１または約８２から約５７９までのヌクレオチド配列を有するＤＮＡ分子、または（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖に対して、少なくとも約８０％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８１％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８２％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８３％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８４％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８５％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８６％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８７％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８８％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８９％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９０％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９１％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９２％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９３％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９４％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９５％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９６％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９７％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９８％の核酸配列同一性、そしてあるいは少なくとも約９９％の核酸配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【００１２】
別の局面では、単離された核酸分子は、（ａ）図２（配列番号３）の、両端のアミノ酸を含めて約１または約８２から約５７９までのヌクレオチド配列、または（ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列の相補鎖を含む。
【００１３】
別の局面では、本発明は図３（配列番号２および５）の、両端のアミノ酸を含めてアミノ酸１または約２８から約１９３までをコードする核酸配列の相補鎖にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む、下記で定義するように活性なＣＨＥＰＯポリペプチドをコードする、単離された核酸分子に関する。好ましくは、ハイブリダイゼーションはストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下で起こる。
【００１４】
さらに別の局面では、本発明は図２（配列番号３）の、両端のアミノ酸を含めて約ヌクレオチド１または約８２と約５７９との間の、核酸配列の相補鎖にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む、下記で定義するように活性なＣＨＥＰＯポリペプチドをコードする、単離された核酸分子に関する。好ましくは、ハイブリダイゼーションはストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下で起こる。
【００１５】
さらなる局面では、本発明は（ａ）図３（配列番号２および５）の、両端のアミノ酸を含めて約１または約２８から約１９３までのアミノ酸残基の配列を有するＣＨＥＰＯポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、または（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖と、ストリンジェントな条件下で試験ＤＮＡ分子をハイブリダイズさせることによって、そしてもし試験ＤＮＡ分子が（ａ）または（ｂ）に対して少なくとも約８０％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８１％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８２％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８３％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８４％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８５％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８６％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８７％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８８％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８９％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９０％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９１％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９２％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９３％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９４％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９５％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９６％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９７％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９８％の核酸配列同一性、そしてあるいは少なくとも約９９％の核酸配列同一性を有するなら、試験ＤＮＡ分子を単離することによって産生された、単離された核酸分子に関する。
【００１６】
別の局面では、本発明は（ａ）図３（配列番号２および５）の両端のアミノ酸を含めて約１または約２８から１９３までのアミノ酸残基配列と比較した場合に、少なくとも約８０％ポジティブ、あるいは少なくとも約８１％ポジティブ、あるいは少なくとも約８２％ポジティブ、あるいは少なくとも約８３％ポジティブ、あるいは少なくとも約８４％ポジティブ、あるいは少なくとも約８５％ポジティブ、あるいは少なくとも約８６％ポジティブ、あるいは少なくとも約８７％ポジティブ、あるいは少なくとも約８８％ポジティブ、あるいは少なくとも約８９％ポジティブ、あるいは少なくとも約９０％ポジティブ、あるいは少なくとも約９１％ポジティブ、あるいは少なくとも約９２％ポジティブ、あるいは少なくとも約９３％ポジティブ、あるいは少なくとも約９４％ポジティブ、あるいは少なくとも約９５％ポジティブ、あるいは少なくとも約９６％ポジティブ、あるいは少なくとも約９７％ポジティブ、あるいは少なくとも約９８％ポジティブ、そしてあるいは少なくとも約９９％ポジティブでスコア付けされるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または（ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列の相補鎖を含む、単離された核酸分子に関する。
【００１７】
特定の局面において、本発明は、Ｎ末端シグナル配列および／または開始メチオニンを欠くＣＨＥＰＯポリペプチドをコードするＤＮＡを含む単離された核酸分子、またはそのようなコードする核酸分子に相補的な、単離された核酸分子を提供する。シグナルペプチドは、図３（配列番号２および５）の配列における約アミノ酸位置１から約アミノ酸位置２７まで伸長すると仮に同定された。しかし、シグナルペプチドのＣ末端の境界は変わり得るが、本明細書中で最初に同定されたシグナルペプチドＣ末端境界のどちら側にも約５アミノ酸のみである可能性が最も高いことが記載される。ここでシグナルペプチドのＣ末端境界は、そのような型のアミノ酸配列エレメントを同定するための、当該分野で慣用的に採用される基準に従って同定され得る（例えば、Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．１０：１−６（１９９７）およびｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１４：４６８３−４６９０（１９８６））。さらに、いくつかの場合には、分泌されたポリペプチドからのシグナル配列の切断は完全には均一でなく、１つを超える分泌された種を生じることも認識される。これらのポリペプチド、およびそれらをコードするポリヌクレオチドは、本発明によって企図される。そのために、本出願の目的のために、図３（配列番号２および５）に示したＣＨＥＰＯポリペプチドのシグナルペプチドは、図３（配列番号２および５）のアミノ酸１からＸまで伸長する。ここでＸは図３（配列番号２および５）の２３から３２までの任意のアミノ酸である。従って、本発明によって含まれるＣＨＥＰＯポリペプチドの成熟形態は、図３（配列番号２および５）のアミノ酸Ｘから１９３までを含むもの、および下記で記載するようなその改変体を含む。ここでＸは図３（配列番号２および５）の２３から３２までの任意のアミノ酸である。これらのポリペプチドをコードする、単離された核酸分子もまた企図される。
【００１８】
別の実施形態は、例えばハイブリダイゼーションプローブとしての使用を見いだされ得るＣＨＥＰＯポリペプチドコード配列のフラグメント、または必要に応じて抗ＣＨＥＰＯ抗体への結合部位を含むポリペプチドをコードし得るＣＨＥＰＯポリペプチドコードフラグメントに関する。そのような核酸フラグメントは、通常長さが少なくとも約２０ヌクレオチド、あるいは長さが少なくとも約３０ヌクレオチド、あるいは長さが少なくとも約４０ヌクレオチド、あるいは長さが少なくとも約５０ヌクレオチド、あるいは長さが少なくとも約６０ヌクレオチド、あるいは長さが少なくとも約７０ヌクレオチド、あるいは長さが少なくとも約８０ヌクレオチド、あるいは長さが少なくとも約９０ヌクレオチド、あるいは長さが少なくとも約１００ヌクレオチド、あるいは長さが少なくとも約１１０ヌクレオチド、あるいは長さが少なくとも約１２０ヌクレオチド、あるいは長さが少なくとも約１３０ヌクレオチド、あるいは長さが少なくとも約１４０ヌクレオチド、あるいは長さが少なくとも約１５０ヌクレオチド、あるいは長さが少なくとも約１６０ヌクレオチド、あるいは長さが少なくとも約１７０ヌクレオチド、あるいは長さが少なくとも約１８０ヌクレオチド、あるいは長さが少なくとも約１９０ヌクレオチド、あるいは長さが少なくとも約２００ヌクレオチド、あるいは長さが少なくとも約２５０ヌクレオチド、あるいは長さが少なくとも約３００ヌクレオチド、あるいは長さが少なくとも約３５０ヌクレオチド、あるいは長さが少なくとも約４００ヌクレオチド、あるいは長さが少なくとも約４５０ヌクレオチド、あるいは長さが少なくとも約５００ヌクレオチド、あるいは長さが少なくとも約６００ヌクレオチド、あるいは長さが少なくとも約７００ヌクレオチド、あるいは長さが少なくとも約８００ヌクレオチド、あるいは長さが少なくとも約９００ヌクレオチド、そしてあるいは長さが少なくとも約１０００ヌクレオチドである。ここで、この文脈中で約という用語は、言及されたヌクレオチド配列の長さプラスまたはマイナスその言及された長さの１０％を意味する。好ましい実施形態では、ヌクレオチド配列フラグメントは、図１（配列番号１）に示したヌクレオチド配列の任意のコード領域から得られる。ＣＨＥＰＯポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の新規フラグメントは、多くの任意の周知の配列整列プログラムを用いて、ＣＨＥＰＯポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、他の公知のヌクレオチド配列とを整列させ、そしてどのＣＨＥＰＯポリペプチドをコードするヌクレオチド配列フラグメントが新規か決定することによって、慣用的な方法で決定し得ることが記載される。そのようなＣＨＥＰＯポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は全て本明細書中で企図され、そして過度の実験なしに決定し得る。これらのヌクレオチド分子フラグメントによってコードされるＣＨＥＰＯポリペプチドフラグメント、好ましくは抗ＣＨＥＰＯ抗体への結合部位を含むＣＨＥＰＯポリペプチドフラグメントも企図される。
【００１９】
別の実施形態では、本発明は、ＣＨＥＰＯをコードするヌクレオチド配列またはその改変体を含むベクターを提供する。ベクターは、本明細書中上記で同定した任意の単離された核酸分子を含み得る。
【００２０】
そのようなベクターを含む宿主細胞も提供される。例として、宿主細胞はＣＨＯ細胞、Ｅ．ｃｏｌｉ、または酵母であり得る。ＣＨＥＰＯポリペプチドを産生するためのプロセスがさらに提供され、そして宿主細胞をＣＨＥＰＯの発現に適切な条件下で培養する工程、および細胞培養物からＣＨＥＰＯを回収する工程を包含する。
【００２１】
別の実施形態では、本発明は、本明細書中上記で同定された任意の単離された核酸配列によってコードされる、単離されたＣＨＥＰＯポリペプチドを提供する。
【００２２】
特定の局面では、本発明は単離されたネイティブな配列のＣＨＥＰＯポリペプチドを提供する。それは特定の実施形態では、図３（配列番号２および５）の約１または約２８から約１９３までの残基を含むアミノ酸配列を含む。
【００２３】
別の局面では、本発明は、図３（配列番号２および５）の両端のアミノ酸を含めて約１または約２８から約１９３までのアミノ酸残基の配列に対して、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８１％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８２％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８３％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８４％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８６％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８７％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８８％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８９％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９１％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９２％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９３％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９４％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９６％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９７％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９８％のアミノ酸配列同一性、そしてあるいは少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、単離されたＣＨＥＰＯポリペプチドに関する。
【００２４】
さらなる局面では、本発明は、図３（配列番号２および５）の両端のアミノ酸を含めて約１または約２８から約１９３までのアミノ酸残基配列と比較した場合に、少なくとも約８０％ポジティブ、あるいは少なくとも約８１％ポジティブ、あるいは少なくとも約８２％ポジティブ、あるいは少なくとも約８３％ポジティブ、あるいは少なくとも約８４％ポジティブ、あるいは少なくとも約８５％ポジティブ、あるいは少なくとも約８６％ポジティブ、あるいは少なくとも約８７％ポジティブ、あるいは少なくとも約８８％ポジティブ、あるいは少なくとも約８９％ポジティブ、あるいは少なくとも約９０％ポジティブ、あるいは少なくとも約９１％ポジティブ、あるいは少なくとも約９２％ポジティブ、あるいは少なくとも約９３％ポジティブ、あるいは少なくとも約９４％ポジティブ、あるいは少なくとも約９５％ポジティブ、あるいは少なくとも約９６％ポジティブ、あるいは少なくとも約９７％ポジティブ、あるいは少なくとも約９８％ポジティブ、そしてあるいは少なくとも約９９％ポジティブでスコア付けされるアミノ酸配列を含む、単離されたＣＨＥＰＯポリペプチドに関する。
【００２５】
特定の局面では、本発明は、Ｎ末端シグナル配列および／または開始メチオニンを欠き、そして本明細書中上記で記載したようにそのようなアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列によってコードされる、単離されたＣＨＥＰＯポリペプチドを提供する。それを産生するためのプロセスも本明細書中で記載され、ここでそれらのプロセスは、適切なコードする核酸分子を含むベクターを含む宿主細胞を、ＣＨＥＰＯポリペプチドの発現に適切な条件下で培養する工程、および細胞培養物からＣＨＥＰＯポリペプチドを回収する工程を包含する。
【００２６】
さらに別の局面では、本発明は図３（配列番号２および５）の両端のアミノ酸を含めて約１または約２８から約１９３までのアミノ酸残基配列を含む、単離されたＣＨＥＰＯポリペプチド、または生物学的に活性または抗ＣＨＥＰＯ抗体の結合部位を提供するに十分なそのフラグメントに関する。ここで、生物学的活性を有するまたは抗ＣＨＥＰＯ抗体の結合部位を提供するＣＨＥＰＯポリペプチドフラグメントの同定は、当該分野において周知の技術を用いて慣用的な方法で達成され得る。好ましくは、ＣＨＥＰＯフラグメントは、ネイティブなＣＨＥＰＯポリペプチドの定性的な生物学的活性を保持している。
【００２７】
さらに別の局面では、本発明は（ｉ）試験ＤＮＡ分子をストリンジェントな条件下で、（ａ）図３（配列番号２および５）の両端のアミノ酸を含めて約１または約２８から約１９３までのアミノ酸残基配列を有するＣＨＥＰＯポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、または（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖とハイブリダイズさせること、そしてもし試験ＤＮＡ分子が（ａ）または（ｂ）に対して少なくとも約８０％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８１％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８２％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８３％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８４％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８５％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８６％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８７％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８８％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８９％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９０％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９１％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９２％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９３％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９４％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９５％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９６％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９７％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９８％の核酸配列同一性、そしてあるいは少なくとも約９９％の核酸配列同一性を有するなら、（ｉｉ）試験ＤＮＡ分子を含む宿主細胞をポリペプチドの発現に適切な条件下で培養すること、そして（ｉｉｉ）細胞培養物からポリペプチドを回収することによって産生されたポリペプチドを提供する。
【００２８】
別の実施形態では、本発明は異種ポリペプチドまたはアミノ酸配列と融合したＣＨＥＰＯポリペプチドを含むキメラ分子を提供する。ここで、ＣＨＥＰＯポリペプチドは、本明細書中上記で記載したような任意のＣＨＥＰＯポリペプチド、改変体またはそのフラグメントを含み得る。そのようなキメラ分子の例は、エピトープタグ配列または免疫グロブリンのＦｃ領域に融合したＣＨＥＰＯポリペプチドを含む。
【００２９】
別の実施形態では、本発明は、本明細書中上記で記載したようなＣＨＥＰＯポリペプチドに特異的に結合する、下記で定義するような抗体を提供する。必要に応じて、抗体はモノクローナル抗体、抗体フラグメント、または単鎖抗体である。
【００３０】
さらに別の実施形態では、本発明は下記で定義するような、ネイティブなＣＨＥＰＯポリペプチドのアゴニストおよびアンタゴニストに関する。特定の実施形態では、アゴニストまたはアンタゴニストは、抗ＣＨＥＰＯ抗体または低分子である。
【００３１】
さらなる実施形態では、本発明はＣＨＥＰＯポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストを同定する方法に関する。それは、ＣＨＥＰＯポリペプチドを候補分子と接触させる工程、およびこのＣＨＥＰＯポリペプチドによって媒介される生物学的活性をモニターする工程を包含する。好ましくは、ＣＨＥＰＯポリペプチドはネイティブなＣＨＥＰＯポリペプチドである。
【００３２】
またさらなる実施形態では、本発明はＣＨＥＰＯポリペプチド、あるいは本明細書中で記載したようなＣＨＥＰＯポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニスト、あるいは抗ＣＨＥＰＯ抗体を、キャリアと組み合わせて含む組成物に関連する。必要に応じて、キャリアは薬剤学的に受容可能なキャリアである。
【００３３】
本発明の別の実施形態は、ＣＨＥＰＯポリペプチド、本明細書中で記載したようなそのアゴニストまたはアンタゴニスト、または抗ＣＨＥＰＯ抗体に反応する状態の処置に有用な医薬品の調製のための、ＣＨＥＰＯポリペプチド、またはそのアゴニストもしくはアンタゴニスト、または抗ＣＨＥＰＯ抗体の使用に関する。
【００３４】
本発明のさらに別の実施形態は、ネイティブな配列のＣＨＥＰＯポリペプチドと比較して、１つ以上のポリペプチド領域において、好ましくは図３（配列番号２および５）に示したＣＨＥＰＯアミノ酸配列のアミノ酸位置８４を囲む、および／または含む領域において、変化したグリコシル化パターンを有するＣＨＥＰＯポリペプチドに関する。種々の実施形態で、ＣＨＥＰＯ改変体ポリペプチドは、ＣＨＥＰＯポリペプチド配列のアミノ酸位置８４に、またはその付近にＮ結合型グリコシル化部位またはＯ結合型グリコシル化部位を作製するように、周知の技術を用いて調製される。例えば、本発明によって企図されるＣＨＥＰＯポリペプチドは、（ａ）図３（配列番号２および５）に示すＣＨＥＰＯアミノ酸配列のアミノ酸８１−８４（すなわちＭｅｔ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ；配列番号６）が、アミノ酸配列Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ−Ｘ（配列番号７）またはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ−Ｘ（配列番号８）で置換され（ここでＸは、Ｐｒｏ以外の任意のアミノ酸である）；（ｂ）図３（配列番号２および５）に示すＣＨＥＰＯアミノ酸配列のアミノ酸８２−８５（すなわちＧｌｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ；配列番号９）が、アミノ酸配列Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ−Ｘ（配列番号７）またはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ−Ｘ（配列番号８）で置換され（ここでＸは、Ｐｒｏ以外の任意のアミノ酸である）；（ｃ）図３（配列番号２および５）に示すＣＨＥＰＯアミノ酸配列のアミノ酸８３−８６（すなわちＶａｌ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ；配列番号１０）が、アミノ酸配列Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ−Ｘ（配列番号７）またはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ−Ｘ（配列番号８）で置換され（ここでＸは、Ｐｒｏ以外の任意のアミノ酸である）；または（ｄ）図３（配列番号２および５）に示すＣＨＥＰＯアミノ酸配列のアミノ酸８４−８７（すなわちＡｒｇ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ａｌａ；配列番号１１）が、アミノ酸配列Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ−Ｘ（配列番号７）またはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ−Ｘ（配列番号８）で置換され（ここでＸは、Ｐｒｏ以外の任意のアミノ酸である）、それによってそれらの位置にＮ−グリコシル化部位を作製したポリペプチドを含む。これらの改変体ポリペプチドをコードする核酸も、それらの核酸を含むベクターおよび宿主細胞と同様に、本明細書中で企図される。
【００３５】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
（Ｉ．定義）
用語「ＣＨＥＰＯポリペプチド」「ＣＨＥＰＯタンパク質」、および「ＣＨＥＰＯ」は、本明細書中で使用される場合には、ネイティブな配列のＣＨＥＰＯおよびＣＨＥＰＯポリペプチド改変体（これらは本明細書中でさらに定義される）を含む。ＣＨＥＰＯポリペプチドは、種々の供給源から（例えば、ヒトの組織型から）または別の供給源から単離され得るか、あるいは組換えおよび／または合成方法によって調製され得る。
【００３６】
「ネイティブな配列のＣＨＥＰＯ」は、天然に由来するＣＨＥＰＯと同じアミノ酸配列を有しているポリペプチドを含む。このようなネイティブな配列のＣＨＥＰＯは、天然から単離され得るか、または組換えおよび／もしくは合成手段によって産生され得る。用語「ネイティブな配列のＣＨＥＰＯ」は、ＣＨＥＰＯの、天然に存在している短縮型または分泌された形態（例えば、細胞外ドメイン配列）、天然に存在している改変体の形態（例えば、選択的にスプライシングされた形態）、および天然に存在している対立遺伝子改変体を特に含む。本発明の１つの実施形態においては、ネイティブな配列のＣＨＥＰＯは、成熟のＣＨＥＰＯであるか、または図３（配列番号２および５）のアミノ酸１から１９３を含む全長のネイティブな配列のＣＨＥＰＯである。また、図３（配列番号２および５）に開示されているＣＨＥＰＯポリペプチドは、アミノ酸位置１として本明細書中で示されているメチオニン残基で開始することが示されており、図３（配列番号２および５）のアミノ酸位置１の上流または下流のいずれかに配置された別のメチオニン残基が、ＣＨＥＰＯポリペプチドの開始アミノ酸残基として使用され得ることが考えられ得、そしてそのことが可能である。
【００３７】
「ＣＨＥＰＯ改変体ポリペプチド」は、以下のアミノ酸配列と少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有している、以下に定義されているような活性なＣＨＥＰＯポリペプチドを意味する：（ａ）図３（配列番号２および５）に示されているＣＨＥＰＯポリペプチドの残基１または約２８から１９３、（ｂ）図３（配列番号２および５）に示されているＣＨＥＰＯポリペプチドのＸから１９３（ここで、Ｘは、図３（配列番号２および５）の２３から３２までの任意のアミノ酸残基である）、または（ｃ）図３（配列番号２および５）に示されているアミノ酸配列の別の特異的に誘導されたフラグメント。このようなＣＨＥＰＯ改変体ポリペプチドとしては、例えば、図３（配列番号２および５）の配列のＮ末端および／またはＣ末端、ならびに１つ以上の内部ドメイン中で、１つ以上のアミノ酸残基が付加されているか、または欠失しているＣＨＥＰＯポリペプチドが挙げられる。通常は、ＣＨＥＰＯ改変体ポリペプチドは、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、あるいは、少なくとも約８１％のアミノ酸配列同一性、あるいは、少なくとも約８２％のアミノ酸配列同一性、あるいは、少なくとも約８３％のアミノ酸配列同一性、あるいは、少なくとも約８４％のアミノ酸配列同一性、あるいは、少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、あるいは、少なくとも約８６％のアミノ酸配列同一性、あるいは、少なくとも約８７％のアミノ酸配列同一性、あるいは、少なくとも約８８％のアミノ酸配列同一性、あるいは、少なくとも約８９％のアミノ酸配列同一性、あるいは、少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、あるいは、少なくとも約９１％のアミノ酸配列同一性、あるいは、少なくとも約９２％のアミノ酸配列同一性、あるいは、少なくとも約９３％のアミノ酸配列同一性、あるいは、少なくとも約９４％のアミノ酸配列同一性、あるいは、少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性、あるいは、少なくとも約９６％のアミノ酸配列同一性、あるいは、少なくとも約９７％のアミノ酸配列同一性、あるいは、少なくとも約９８％のアミノ酸配列同一性、そしてあるいは、少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を、以下に対して有する：（ａ）図３（配列番号２および５）に示されているＣＨＥＰＯポリペプチドの残基１または約２８から１９３、（ｂ）図３（配列番号２および５）に示されているＣＨＥＰＯポリペプチドのＸから１９３（ここで、Ｘは、図３（配列番号２および５）の２３から３２までの任意のアミノ酸残基である）、または（ｃ）図３（配列番号２および５）に示されているアミノ酸配列の別の特異的に誘導されたフラグメント。ＣＨＥＰＯ改変体ポリペプチドは、天然のＣＨＥＰＯポリペプチド配列を含まない。通常は、ＣＨＥＰＯ改変体ポリペプチドは、少なくとも約１０アミノ酸の長さであり、あるいは、少なくとも約２０アミノ酸の長さであり、あるいは、少なくとも約３０アミノ酸の長さであり、あるいは、少なくとも約４０アミノ酸の長さであり、あるいは、少なくとも約５０アミノ酸の長さであり、あるいは、少なくとも約６０アミノ酸の長さであり、あるいは、少なくとも約７０アミノ酸の長さであり、あるいは、少なくとも約８０アミノ酸の長さであり、あるいは、少なくとも約９０アミノ酸の長さであり、あるいは、少なくとも約１００アミノ酸の長さであり、あるいは、少なくとも約１５０アミノ酸の長さであり、あるいは、少なくとも約２００アミノ酸の長さであり、あるいは、少なくとも約３００アミノ酸の長さ以上である。
【００３８】
本明細書中で同定されたＣＨＥＰＯポリペプチド配列に関する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、配列のアラインメント、および必要である場合には、最大のパーセント配列同一性を達成するためのギャップの導入の後での、ＣＨＥＰＯ配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基の割合として、そして配列同一性の一部としては任意の保存的置換は考慮せずに、定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ−２、またはＭｅｇａｌｉａｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような公に入手可能なコンピューターソフトウェアを使用して、当業者の範囲内である種々の方法において達成され得る。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要とされる任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメーターを決定し得る。しかし、本明細書中での目的のためには、％アミノ酸配列同一性の値は、配列比較コンピュータープログラムＡＬＩＧＡ−２を使用して以下に記載されているように得られる。ここでは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムについての完全なソースコードが、以下の表１に提供される。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータープログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．によって書かれており、そして表１に示されているソースコードは、米国商標庁（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．，２０５５９）においてユーザードキュメントとともに整理保管されている。ここでは、これは、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７の下で登録されている。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａを通じて公に入手可能であるか、または表１に提供されているソースコードからコンパイルされ得る。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、ＵＮＩＸ（登録商標）オペレーティングシステム（好ましくは、デジタルＵＮＩＸ（登録商標）Ｖ４．ＯＤ）上での使用のためにコンパイルされるはずである。全ての配列比較パラメーターが、ＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定され、そして変化しない。
【００３９】
本明細書中での目的のために、所定のアミノ酸配列Ａの、所定のアミノ酸配列ＢとのまたはＢに対する％アミノ酸配列同一性（これは、所定のアミノ酸配列ＢとまたはＢに対して特定の％アミノ酸配列同一性を有するかまたは％アミノ酸配列同一性を含む所定のアミノ酸配列Ａとして別に記載され得る）は、以下のように計算される：
割合Ｘ／Ｙの１００倍
ここでは、Ｘは、ＡおよびＢのアラインメントをプログラムしている配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ−２によって同一性適合としてスコア付けされたアミノ酸残基の数である。そしてここでは、Ｙは、Ｂ中のアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合には、Ｂに対するＡの％アミノ酸配列同一性は、Ａに対するＢの％アミノ酸配列同一性とは等しくないことが明らかである。％アミノ酸配列同一性の計算の例として、以下の表２および表３は、ＰＲＯと命名されたアミノ酸配列に対する、Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎと命名されたアミノ酸配列の％アミノ酸配列同一性を計算するための方法を示す。
【００４０】
他に特に記載されていない限りは、本明細書中で使用される全ての％アミノ酸配列同一性の値は、ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータープログラムを使用して上記のように得られる。しかし、％アミノ酸配列同一性はまた、配列比較プログラムＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２５：３３８９−３４０２（１９９７））を使用して決定され得る。ＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ−２配列比較プログラムは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖからダウンロードされ得るか、またはそうでなければ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤから得ることができる。ＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２は、いくつかの検索パラメーターを使用する。ここでは、例えば以下を含む、全てのこれらの検索パラメーターは、デフォルト値に設定される：マスクされていない＝ｙｅｓ、鎖＝全て、予想される出現＝１０、最低の複雑性の長さ＝１５／５、ｍｕｌｔｉ−ｐａｓｓ ｅ値＝０．０１、ｍｕｌｔｉ−ｐａｓｓの定数＝２５、最終的なギャップアラインメントについてのドロップオフ＝２５、およびスコアリングマトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２。
【００４１】
アミノ酸配列の比較のためにＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２が使用される状況においては、所定のアミノ酸配列Ａの、所定のアミノ酸配列ＢとのまたはＢに対する％アミノ酸配列同一性（これは、所定のアミノ酸配列ＢとまたはＢに対して特定の％アミノ酸配列同一性を有するかまたは％アミノ酸配列同一性を含む所定のアミノ酸配列Ａとして別に記載され得る）は、以下のように計算される：
割合Ｘ／Ｙの１００倍
ここでは、Ｘは、ＡおよびＢのアラインメントをプログラムしている配列アラインメントプログラムＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２によって同一性適合としてスコア付けされたアミノ酸残基の数である。そしてここでは、Ｙは、Ｂ中のアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合には、Ｂに対するＡの％アミノ酸配列同一性は、Ａに対するＢの％アミノ酸配列同一性とは等しくないことが明らかである。
【００４２】
「ＣＨＥＰＯ改変体ポリヌクレオチド」、またはＣＨＥＰＯ改変体核酸配列は、以下に定義されているような活性なＣＨＥＰＯポリペプチチドをコードし、そして以下のいずれかと少なくとも約８０％の核酸配列同一性を有している核酸分子を意味する：（ａ）図３（配列番号２および５）に示されているＣＨＥＰＯポリペプチドの残基１または約２８から１９３をコードする核酸配列、（ｂ）図３（配列番号２および５）に示されているＣＨＥＰＯポリペプチドの残基Ｘから１９３をコードする核酸配列（ここで、Ｘは、図３（配列番号２および５）の２３から３２までの任意のアミノ酸残基である）、または（ｃ）図３（配列番号２および５）に示されているアミノ酸配列の別の特異的に誘導されたフラグメントをコードする核酸配列。通常は、ＣＨＥＰＯ改変体ポリペプチドは、（ａ）図３（配列番号２および５）に示されているＣＨＥＰＯポリペプチドの残基１または約２８から１９３をコードする核酸配列、（ｂ）図３（配列番号２および５）に示されているＣＨＥＰＯポリペプチドの残基Ｘから１９３をコードする核酸配列（ここで、Ｘは、図３（配列番号２および５）の２３から３２までの任意のアミノ酸残基である）、または（ｃ）図３（配列番号２および５）に示されているアミノ酸配列の別の特異的に誘導されたフラグメントをコードする核酸配列のいずれかと、少なくとも８０％の核酸配列同一性、あるいは、少なくとも約８１％の核酸配列同一性、あるいは、少なくとも約８２％の核酸配列同一性、あるいは、少なくとも約８３％の核酸配列同一性、あるいは、少なくとも約８４％の核酸配列同一性、あるいは、少なくとも約８５％の核酸配列同一性、あるいは、少なくとも約８６％の核酸配列同一性、あるいは、少なくとも約８７％の核酸配列同一性、あるいは、少なくとも約８８％の核酸配列同一性、あるいは、少なくとも約８９％の核酸配列同一性、あるいは、少なくとも約９０％の核酸配列同一性、あるいは、少なくとも約９１％の核酸配列同一性、あるいは、少なくとも約９２％の核酸配列同一性、あるいは、少なくとも約９３％の核酸配列同一性、あるいは、少なくとも約９４％の核酸配列同一性、あるいは、少なくとも約９５％の核酸配列同一性、あるいは、少なくとも約９６％の核酸配列同一性、あるいは、少なくとも約９７％の核酸配列同一性、あるいは、少なくとも約９８％の核酸配列同一性、そしてあるいは、少なくとも約９９％の核酸配列同一性を有する。ＣＨＥＰＯポリヌクレオチド改変体は、ネイティブなＣＨＥＰＯのヌクレオチド配列を含まない。
【００４３】
通常は、ＣＨＥＰＯ改変体ポリヌクレオチドは、少なくとも約３０ヌクレオチドの長さ、あるいは、少なくとも約６０ヌクレオチドの長さ、あるいは、少なくとも約９０ヌクレオチドの長さ、あるいは、少なくとも約１２０ヌクレオチドの長さ、あるいは、少なくとも約１５０ヌクレオチドの長さ、あるいは、少なくとも約１８０ヌクレオチドの長さ、あるいは、少なくとも約２１０ヌクレオチドの長さ、あるいは、少なくとも約２４０ヌクレオチドの長さ、あるいは、少なくとも約２７０ヌクレオチドの長さ、あるいは、少なくとも約３００ヌクレオチドの長さ、あるいは、少なくとも約４５０ヌクレオチドの長さ、あるいは、少なくとも約６００ヌクレオチドの長さ、あるいは、少なくとも約９００ヌクレオチド以上の長さである。
【００４４】
本明細書中で同定されたＣＨＥＰＯポリペプチドをコードする核酸配列に関する「パーセント（％）核酸配列同一性」は、配列のアラインメント、および必要である場合には、最大のパーセント配列同一性を達成するためのギャップの導入の後での、ＣＨＥＰＯ配列をコードする核酸配列中のヌクレオチドと同一である候補配列中のヌクレオチドの割合として同定される。パーセント核酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ−２、またはＭｅｇａｌｉａｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような公に入手可能なコンピューターソフトウェアを使用して、当業者の範囲内である種々の方法において達成され得る。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要とされる任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメーターを決定し得る。しかし、本明細書中での目的のためには、％核酸配列同一性の値は、配列比較コンピュータープログラムＡＬＩＧＡ−２を使用することによって以下に記載されているように得られる。ここでは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムについての完全なソースコードが、以下の表１に提供される。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータープログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．によって書かれており、そして表１に示されているソースコードは、米国商標庁（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．，２０５５９）においてユーザードキュメントとともに整理補完されている。ここでは、これは、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７の下で登録されている。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ． Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａを通じて公に入手可能であるか、または表１に提供されているソースコードからコンパイルされ得る。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、ＵＮＩＸ（登録商標）オペレーティングシステム（好ましくは、デジタルＵＮＩＸ（登録商標） Ｖ４．ＯＤ）上での使用のためにコンパイルされるはずである。全ての配列比較パラメーターが、ＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定され、そして変化しない。
【００４５】
本明細書中での目的のために、所定の核酸配列Ｃの、所定の核酸配列ＤとのまたはＤに対する％核酸配列同一性（これは、所定の核酸配列ＤとまたはＤに対して特定の％核酸配列同一性を有するかまたは％核酸配列同一性を含む所定の核酸配列Ｃとして記載され得る）は、以下のように計算される：
割合Ｗ／Ｚの１００倍
ここでは、Ｗは、ＣおよびＤのアラインメントをプログラムしている配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ−２によって同一性適合としてスコア付けされたヌクレオチドの数である。そしてここでは、Ｚは、Ｄ中のヌクレオチドの総数である。核酸配列Ｃの長さが核酸配列Ｄの長さと等しくない場合には、Ｄに対するＣの％核酸配列同一性は、Ｃに対するＤの％核酸配列同一性とは等しくないことが明らかである。％核酸配列同一性の計算の例として、以下の表４および表５は、ＰＲＯと命名された核酸配列に対する、Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ＤＮＡと命名された核酸配列の％核酸配列同一性を計算するための方法を示す。
【００４６】
他に特に記載されていない限りは、本明細書中で使用される全ての％核酸配列同一性の値は、ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータープログラムを使用して上記のように得られる。しかし、％核酸配列同一性はまた、配列比較プログラムＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２５：３３８９−３４０２（１９９７））を使用して決定され得る。ＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ−２配列比較プログラムは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖからダウンロードされ得るか、またはそうでなければ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤから得ることができる。ＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２は、いくつかの検索パラメーターを使用する。ここでは、例えば以下を含む、全てのこれらの検索パラメーターは、デフォルト値に設定される：マスクされていない＝ｙｅｓ、鎖＝全て、予想される出現＝１０、最低の複雑性の長さ＝１５／５、ｍｕｌｔｉ−ｐａｓｓ ｅ値＝０．０１、ｐｕｌｔｉ−ｐａｓｓの定数＝２５、最終的なギャップアラインメントについてのドロップオフ＝２５、およびスコアリングマトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２。
【００４７】
配列の比較のためにＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２が使用される状況においては、所定の核酸配列Ｃの、所定の核酸配列ＤとのまたはＤに対する％核酸配列同一性（これは、所定の核酸配列ＤとまたはＤに対して特定の％核酸配列同一性を有するかまたは％核酸配列同一性を含む所定の核酸配列Ｃとして別に記載され得る）は、以下のように計算される：
割合Ｗ／Ｚの１００倍
ここでは、Ｗは、ＣおよびＤのアラインメントをプログラムしている配列アラインメントプログラムＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２によって同一性適合としてスコア付けされたヌクレオチドの数である。そしてここでは、Ｚは、Ｄ中のヌクレオチドの総数である。核酸配列Ｃの長さが核酸配列Ｄの長さと等しくない場合には、Ｄに対するＣの％核酸配列同一性は、Ｃに対するＤの％核酸配列同一性とは等しくないことが明らかである。
【００４８】
他の実施形態においては、ＣＨＥＰＯ改変体ポリヌクレオチドは、活性なＣＨＥＰＯポリペプチドをコードする核酸分子であり、そしてこれは、図３（配列番号２おおよび５）に示されている全長のＣＨＥＰＯポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に対して、（好ましくは、ストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下で）ハイブリダイズし得る。ＣＨＥＰＯ改変体ポリペプチドは、ＣＨＥＰＯ改変体ポリヌクレオチドによってコードされるものであり得る。
【００４９】
用語「ポジティブ」は、上記のように行われるアミノ酸配列の同一性の比較の状況においては、同一ではないが同様の特性を有する、比較される配列中のアミノ酸残基を含む。目的のアミノ酸残基に対してポジティブな値をスコア付けするアミノ酸残基は、目的のアミノ酸残基に対して同一であるか、または目的のアミノ酸残基の好ましく置換されたもの（以下の表６において定義されている）であるかのいずれかである。
【００５０】
本明細書中での目的のためには、所定のアミノ酸配列Ａの、所定のアミノ酸配列ＢとのまたはＢに対するポジティブの％値（これは、所定のアミノ酸配列ＢとまたはＢに対して特定の％ポジティブを有するかまたは％ポジティブを含む所定のアミノ酸配列Ａとして別に記載され得る）は、以下のように計算される：
割合Ｘ／Ｙの１００倍
ここでは、Ｘは、ＡおよびＢのアラインメントをプログラムしている配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ−２によって、上記に定義されているようなポジティブ値をスコア付けするアミノ酸残基の数である。そしてここでは、Ｙは、Ｂ中のアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合には、Ｂに対するＡの％ポジティブは、Ａに対するＢの％ポジティブとは等しくないことが明らかである。
【００５１】
本明細書中に開示されている種々のポリペプチドを記載するために使用される場合は、「単離された」は、同定されており、そしてその天然の環境の成分から分離されているおよび／または回収されているポリペプチドを意味する。好ましくは、単離されたポリペプチドは、それが天然に関連している全ての成分と関連していない。その天然の環境の混入成分は、代表的には、ポリペプチドについての診断的な使用または治療的な使用を妨害する材料であり、そしてこの成分としては、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性の溶質または非タンパク質性の溶質が挙げられ得る。好ましい実施形態においては、ポリペプチドは、（１）スピニングキャップシークエネーターの使用によってＮ末端または内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るために十分な程度まで、あるいは（２）クマシーブル（好ましくは、銀染色）を使用して非還元条件または還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる均質まで、精製される。単離されたポリペプチドとしては、は組換え細胞中でのインサイチュのポリペプチドが挙げられる。なぜなら、ＣＨＥＰＯの天然の環境の少なくとも１つの成分は存在しないからである。しかし、通常は、単離されたポリペプチドは、少なくとも１つの精製工程によって調製される。
【００５２】
ＣＨＥＰＯポリペプチドをコードする「単離された」核酸分子は、同定され、そして通常はＣＨＥＰＯをコードする核酸の天然の供給源に関連している少なくとも１つの混入核酸分子から分離されている核酸分子である。好ましくは、単離された核酸は、天然に関連している全ての成分と関連していない。単離されたＣＨＥＰＯをコードする核酸分子は、天然に見出される形態またはセッティング以外である。従って、単離された核酸分子は、天然の細胞中に存在する場合には、ＣＨＥＰＯをコードする核酸分子とは区別される。しかし、ＣＨＥＰＯポリペプチドをコードする単離された核酸分子は、通常はＣＨＥＰＯを発現する細胞中に含まれるＣＨＥＰＯをコードする核酸分子を含む。ここでは、例えば、核酸分子は、天然の細胞のものとは異なる染色体位置に存在する。
【００５３】
用語「制御配列」は、特定の宿主生物体中に作動可能に連結されたコード配列の発現のために必要なＤＮＡ配列をいう。原核生物に適切な制御配列としては、例えば、プロモーター、必要に応じて、オペレーター配列、およびリボソーム結合部位が挙げられる。真核生物細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、およびエンハンサーを利用することが公知である。
【００５４】
核酸は、別の核酸配列と機能的な関係で配置される場合には、「作動可能に連結される」。例えば、プレ配列または分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与しているプレタンパク質として発現される場合には、ポリペプチドのＤＮＡに作動可能に連結される；プロモーターまたはエンハンサーは、それが配列の転写に影響を与える場合には、コード配列に対して作動可能に連結される；あるいは、リボソーム結合部位は、それが翻訳を容易にするように配置される場合には、コード配列に対して作動可能に連結される。一般には、「作動可能に連結される」は、連結されるＤＮＡ配列が連続しており、そしてこのＤＮＡ配列が、分泌リーダーの場合には連続しておりそしてリーディングフレーム内にあることを意味する。しかし、エンハンサーは、連続している必要はない。連結は、便利な制限部位での連結によって達成される。このような部位が存在しない場合には、合成のオリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが、従来の実行に従って使用される。
【００５５】
用語「抗体」は、最も広い意味において使用され、そして例えば、単一の抗ＣＨＥＰＯモノクローナル抗体（アゴニスト、アンタゴニスト、および中和抗体を含む）、ポリペプチド特異性を有する抗ＣＨＥＰＯ抗体組成物、単鎖抗ＣＨＥＰＯ抗体、および抗ＣＨＥＰＯ抗体のフラグメントを含む（下記を参照のこと）。用語「モノクローナル抗体」は、本明細書中で使用される場合には、実質的に均質な抗体の集団から得られた抗体を言う。すなわち、微量で存在し得る可能性のある天然に存在している変異体を除く、個々の抗体を含む集団は同一である。
【００５６】
ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェンシー」は、当業者によって容易に決定可能であり、そして一般には、プローブの長さ、洗浄温度、および塩濃度に依存して、経験的に計算される。一般には、より長いプローブは、適切なアニーリングのためにより高い温度を必要とし、一方、より短いプローブは、より低い温度を必要とする。ハイブリダイゼーションは、一般には、相補鎖がそれらの融解温度未満の環境に存在する場合には、変性ＤＮＡが再アニーリングする能力に依存する。プローブとハイブリダイズが可能な配列との間でのより高い程度の相同性が所望されるほど、より高い相対的な温度が使用され得る。結果として、より高い相対的な温度が、反応条件をよりストリンジェントにする傾向にあり、一方、より低い温度はストリンジェントをより低くする傾向にあることが理解される。ハイブリダイゼーション反応のさらなる詳細およびストリンジェンシーの説明については、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，（１９９５）を参照のこと。
【００５７】
「ストリンジェントな条件」または「高ストリンジェンシーの条件」は、本明細書中で定義される場合には、以下によって同定され得る：（１）洗浄（例えば、５０℃で、０．０１５Ｍの塩化ナトリウム／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のドデシル硫酸ナトリウム）のために、低いイオン強度および高温を使用すること；（２）ハイブリダイゼーションの間に、ホルムアミドのような変性剤（例えば、４２℃で、０．１％のウシ血清アルブミンを有している５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド／０．１％のＦｉｃｏｌｌ／０．１％のポリビニルピロリドン／７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウムを有する５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５））を使用すること；（３）４２℃で、５０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ ６．８）、０．１％のピロリン酸ナトリウム、５×デンハルト溶液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０ｇ／ｍｌ）、０．１％のＳＤＳ、および１０％のデキストラン硫酸を使用し、４２℃での０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）、および５５℃での５０％のホルムアミドでの洗浄を伴い、続く５５℃でのＥＤＴＡを含有する０．１×ＳＳＣから構成される高ストリンジェンシーの洗浄を伴うこと。
【００５８】
「中程度のストリンジェントな条件」は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，１９８９に記載されているように同定され得、そしてこれは、上記のようなような低いストリンジェントの洗浄溶液およびハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、イオン強度、および％ＳＤＳ）の使用を含む。中程度のストリンジェントな条件の一例は、２０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％のデキストラン硫酸、および２０ｍｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含有する溶液中での３７℃で一晩のインキュベーション、続く約３７〜５０℃での１×ＳＳＣ中でのフィルターの洗浄である。当業者は、プローブの長さなどの因子に順応させるために必要である場合には、温度、イオン強度などを調節する方法を認識している。
【００５９】
用語「エピトープ（で）タグ化（した）」は、本明細書中で使用される場合には、「タグポリペプチド」に対して融合されたＣＨＥＰＯポリペプチドを含むキメラポリペプチドをいう。タグポリペプチドは、それに対して抗体が作製され得るが、なおそれに対して融合されるポリペプチドの活性を妨害しないように十分に短いエピトープを提供するために十分な残基を有する。タグポリペプチドはまた、好ましくは、抗体が他のエピトープと実質的に交差反応しないように、かなり特有である。適切なタグポリペプチドは、一般には、少なくとも６個のアミノ酸残基を有し、そして通常は、約８個〜５０個の間のアミノ酸残基（好ましくは、約１０個〜２０個の間のアミノ酸残基）を有する。
【００６０】
本明細書中で使用される場合には、「イムノアドヘシン（ｉｍｍｕｎｏａｄｈｅｓｉｎ）」は、免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター機能と異種タンパク質（「アドヘシン」）の結合特異性を組合せる、抗体様分子をいう。構造的には、イムノアドヘシンは、抗体の抗原認識部位および抗原結合部位以外である（すなわち、「異種」である）所望される結合特異性を有しているアミノ酸配列と、免疫グロブリンの定常ドメイン配列との融合体を含む。イムノアドヘシンの接着部分は、代表的には、レセプターまたはリガンドの少なくとも結合部位を含む連続しているアミノ酸配列である。イムノアドヘシン中の免疫グロブリン定常ドメイン配列は、任意の免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３、またはＩｇＧ−４サブタイプ、ＩｇＡ（ＩｇＡ−１およびＩｇＡ−２を含む）、ＩｇＥ、ＩｇＤ、またはＩｇＭ）から得ることができる。
【００６１】
本明細書中での目的については、「活性な」または「活性」は、ネイティブの、または天然に存在しているＣＨＥＰＯの生物学的および／または免疫学的活性を保持しているＣＨＥＰＯの形態をいう。ここでは、生物学的活性は、ネイティブのまたは天然に存在しているＣＨＥＰＯによって保有される抗原性エピトープに対する抗体の産生を誘導する能力以外の、ネイティブのまたは天然に存在しているＣＨＥＰＯによって引き起こされる生物学的機能（阻害または刺激のいずれか）をいう。そして、免疫学的活性は、ネイティブのまたは天然に存在しているＣＨＥＰＯによって保有される抗原性エピトープに対する抗体の産生を誘導する能力をいう。好ましい生物学的活性としては、例えば、赤血球の産生を調節する能力、骨髄および／または他の造血組織の方向付けられた先祖細胞の表面上のレセプターに結合する能力、ならびに／あるいは、赤血球の増殖および／または最終的な成熟を誘導する能力が挙げられる。
【００６２】
用語「アンタゴニスト」は、最も広い意味で使用され、そして本明細書中で開示されるネイティブなＣＨＥＰＯポリペプチドの生物学的活性を、部分的または完全にブロックする、阻害する、または中和する任意の分子を含む。同様の意味において、用語「アゴニスト」は、最も広い意味で使用され、そして本明細書中で開示されるネイティブなＣＨＥＰＯポリペプチドの生物学的活性を模倣する任意の分子を含む。適切なアゴニストまたはアンタゴニスト分子としては、特に、アゴニストもしくはアンタゴニスト抗体もしくは抗体フラグメント、またはネイティブなＣＨＥＰＯポリペプチドのフラグメントもしくはアミノ酸配改変体、ペプチド、低有機分子などが挙げられる。ＣＨＥＰＯポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストを同定するための方法は、ＣＨＥＰＯポリペプチドを候補のアゴニストまたはアンタゴニスト分子と接触させる工程、およびＣＨＥＰＯポリペプチドと通常は関連した１つ以上の生物学的活性の検出可能な変更を測定する工程を包含し得る。
【００６３】
「処置」は、治療的処置、および予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）または予防的（ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ）措置（ｍｅａｓｕｒｅ）の両方をいう。ここでは、目的は、標的化された病理学的状態または障害を予防することまたは遅らせる（軽減する）ことである。処置を必要としている者は、すでに障害を有している者、障害を有する傾向にある者、および障害が予防されている者を含む。
【００６４】
「慢性的な」投与は、延長された期間の最初の治療効果（活性）を最大にするように、急速な態様とは対照的に、持続的な態様での薬剤の投与をいう。断続的な投与は、中断を伴わずに連続的には行われないが、むしろ本質的には周期的である処置である。
【００６５】
処置の目的について「哺乳動物」は、哺乳動物（ヒト、飼育動物（ｄｏｍｅｓｔｉｃ ａｎｉｍａｌ）、および家畜動物を含む）、および動物園の動物、変種（ｓｐｏｒｔ）、またはペット動物（例えば、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギなど）として分類される任意の動物をいう。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
【００６６】
１つ以上のさらなる治療剤「と組合せた」投与は、同時の（並行して）および任意の順序での連続的な投与を含む。
【００６７】
「キャリア」は、本明細書中で使用される場合には、薬学的に受容可能なキャリア、賦形剤、または安定剤を含む。これらは、使用される投与量および濃度では、それに対して暴露される細胞または哺乳動物に対して非毒性である。生理学的に受容可能なキャリアは、しばしば、水性のｐＨ緩衝化された溶液である。生理学的に受容可能なキャリアの例としては、以下が挙げられる：緩衝液（例えば、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、および他の有機酸の緩衝液）；アスコルビン酸を含む抗酸化剤；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、またはリジン）；モノサッカライド、ジサッカライド、および他の炭水化物（グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む）；キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）；糖アルコール（例えば、マンニトール、またはソルビトール）；塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）；および／または非イオン性境界活性剤（例えば、ＴＷＥＥＮ、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、およびＰＬＵＲＯＮＩＣＳ）。
【００６８】
「抗体フラグメント」は、インタクトな抗体の一部、好ましくは、インタクトな抗体の抗原結合領域または可変領域を含む。抗体フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）₂、およびＦｖフラグメント；ダイアボディー（ｄｉａｂｏｄｙ）；直鎖状の抗体（Ｚａｐａｔａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．，８（１０）：１０５７−１０６２（１９９５））；単鎖抗体分子；ならびに抗体フラグメントから形成された多重特異的抗体が挙げられる。
【００６９】
抗体のパパイン消化によって、２つの同一の抗原結合フラグメント（「Ｆａｂ」フラグメントと呼ばれる）が生じる。これらのそれぞれが、単一の抗原結合部位および残りの「Ｆｃ」（これは、容易に結晶化する能力を反映する名称である）フラグメントを有する。ペプシン処理によって、２つの抗原結合部位を有し、そしてなお抗原を架橋し得るＦ（ａｂ’）₂フラグメントを生じる。
【００７０】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識部位および抗原結合部位を含む最少の抗体フラグメントである。この領域は、密接な共有結合していない、１つの重鎖可変ドメインおよび１つの軽鎖可変ドメインの二量体から構成される。この立体配置においては、それぞれの可変ドメイン中の３つのＣＤＲが、Ｖ_H−Ｖ_L二量体の表面上での抗原結合部位を定義するように相互作用する。全部で６個のＣＤＲが、抗体に対して抗原結合特異性を付与する。しかし、単一の可変ドメイン（または抗原に特異的な３個のＣＤＲのみを含むＦｖの半分）が、抗原を認識しそして結合する能力を有するが、完全な結合部位よりも親和性が低い。
【００７１】
Ｆａｂフラグメントはまた、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の最初の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む。Ｆａｂフラグメントは、抗体ヒンジ領域に由来する１つ以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端での数個の残基の付加によってＦａｂフラグメントとは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、Ｆａｂ’についての本明細書中での名称である。ここでは、定常ドメインのシステイン残基は、フリーのチオール基を保有している。Ｆ（ａｂ’）₂抗体フラグメントは、通常は、それらの間にヒンジシステインを有するＦａｂ’フラグメントの対として産生された。抗体フラグメントの他の化学的なカップリングもまた、公知である。
【００７２】
任意の脊椎動物種に由来する抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、κおよびλと呼ばれる、２つの明らかに異なる型の１つに割り当てられ得る。
【００７３】
それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、免疫グロブリンは異なるクラスに割り当てられ得る。免疫グロブリンの５個の主要なクラスが存在する：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ。そしてこれらのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、およびＩｇＡ２）にさらに分類され得る。
【００７４】
「単鎖Ｆｖ」または「ｓＦｖ」抗体フラグメントは、抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインを含む。ここでは、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖中に存在する。好ましくは、Ｆｖポリペプチドはさらに、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーを含む。これによって、ｓＦｖが抗原結合のために所望される構造を形成することが可能となる。ｓＦｖの総説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ、Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、第１１３巻、Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２６９−３１５頁（１９９４）。
【００７５】
用語「ダイアボディー（ｄｉａｂｏｄｙ）」は、２つの抗原結合部位を有する小さい抗体フラグメントをいう。これらのフラグメントは、同じポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）中で、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に対して連結された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。同じ鎖上の２つのドメイン間での対合を可能にするには短すぎるリンカーを使用することによって、ドメインが、別の鎖の相補ドメインと対合するように強制し、そして２つの抗原結合部位を作製する。ダイアボディーは、例えば、第ＥＰ ４０４，０９７号；第ＷＯ９３／１１１６１号；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：６４４４−６４４８（１９９３）により完全に記載されている。
【００７６】
「単離された」抗体は、同定され、そしてその天然の環境の成分から分離および／または回収されている抗体である。その天然の環境の混入成分は、抗体の診断的または治療的な使用を妨害する材料であり、そしてこれらの成分としては、酵素、ホルモン、および他のタンパク質様または非タンパク質様の溶質が挙げられ得る。好ましい実施形態においては、抗体は、Ｌｏｗｒｙ法によって決定されるような抗体の９５重量％以上を超えるまで、そして最も好ましくは、９９重量％を超えるまで、（２）スピニングキャップシークエネーターの使用によってＮ末端および内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るために十分な程度まで、あるいは（３）クマシーブル（好ましくは、銀染色）を使用して還元条件または非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる均質まで、精製される。単離された抗体としては、組換え細胞中でのインサイチュの抗体が挙げられる。なぜなら、抗体の天然の環境の少なくとも１つの成分は存在しないからである。しかし、通常は、単離された抗体は、少なくとも１つの精製工程によって調製される。
【００７７】
用語「標識」は、本明細書中で使用される場合には、検出可能である化合物または組成物をいう。これは、「標識された」抗体を生成するように、抗体に対して直接または間接的に結合される。標識は、それ自体によって検出可能（例えば、放射性同位元素または蛍光標識）であり得るか、あるいは酵素標識の場合においては、検出可能である基質化合物または組成物の化学的な変化を触媒し得る。
【００７８】
「固相」によって、それに対して本発明の抗体が接着し得る非水性のマトリックスが意味される。本明細書中に含まれる固相の例としては、部分的または全体が、ガラス（例えば、制御された孔ガラス）、ポリサッカライド（例えば、アガロース）、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコール、およびシリコーンから形成されるものが挙げられる。特定の実施形態においては、状況に依存して、固相は、アッセイプレートのウェルを含み得る；他のものでは、精製カラム（例えば、アフィニティー精製カラム）である。この用語はまた、離散性の粒子の不連続な固相（例えば、米国特許第４，２７５，１４９号に記載されているもの）をも含む。
【００７９】
「リポソーム」は、種々の型の脂質、リン脂質、および／または境界活性剤の、小さい小胞化合物である。これは、哺乳動物への薬物（例えば、ＣＨＥＰＯポリペプチドまたはそれに対する抗体）の送達に有用である。リポソームの成分は、生物学的な膜の脂質の組み合わせ（ａｒｒａｎｇｅ）と同様に、二重層の形成において共通して準備される。
【００８０】
低分子は、約５００ダルトン未満の分子量を有するとして、本明細書中で定義される。
【００８１】
【表１】

【００８２】
【表２】

【００８３】
【表３】

【００８４】
【表４】

【００８５】
【表５】

（ＩＩ．本発明の組成物および方法）
（Ａ．全長ＣＨＥＰＯポリペプチド）
本発明は、本出願でＣＨＥＰＯと称するポリペプチドをコードする新たに同定されそして単離されたヌクレオチド配列を提供する。特に、ＣＨＥＰＯポリペプチドをコードするＤＮＡは、以下の実施例でさらに詳細に開示されているように、同定しそして単離した。
【００８６】
（Ｂ．ＣＨＥＰＯ改変体）
本明細書に記載されている全長のネイティブな配列のＣＨＥＰＯポリペプチドに加えて、ＣＨＥＰＯ改変体を調製し得ることが意図されている。ＣＨＥＰＯ改変体は、ＣＨＥＰＯ ＤＮＡ中に適切なヌクレオチド変化を導入し、そして／または所望のＣＨＥＰＯポリペプチドを合成して調製し得る。当業者は、アミノ酸変化によってＣＨＥＰＯの翻訳後プロセスが変わり得る、例えば、グリコシル化部位の数もしくは位置を変えるかまたは膜アンカー形成特徴を変えられ得ることを理解する。
【００８７】
ネイティブな全長配列のＣＨＥＰＯまたは本明細書に記載されているＣＨＥＰＯの種々のドメインにおける改変は、例えば、米国特許第５，３６４，９３４号中に記載されている、例えば保存的および非保存的突然変異に関する任意の技術や指針を使用して行われ得る。改変は、ネイティブな配列のＣＨＥＰＯと比較したとき、ＣＨＥＰＯのアミノ酸配列が変化しているＣＨＥＰＯをコードする１つ以上のコドンの置換、欠失または挿入であり得る。必要に応じて、上記バリエーションは、ＣＨＥＰＯの１つ以上のドメイン中の少なくとも１個のアミノ酸を他の任意のアミノ酸で置換することによるものである。所望の活性に悪い影響を与えることなくどのアミノ酸残基を挿入し、置換し、または欠失させ得るのかを決定する際の手引きは、ＣＨＥＰＯの配列を公知の相同性タンパク質分子の配列と比較しそして高い相同性領域中でなされるアミノ酸配列変化の数を最小限にすることによって見いだされ得る。アミノ酸置換は、１つのアミノ酸を同様な構造および／または化学的特性を有する別のアミノ酸で置換すること、例えばセリンによるロイシンの置換、即ち保存的アミノ酸置換の結果であり得る。挿入または欠失は、必要に応じて、約１〜５個のアミノ酸の範囲内であり得る。可能な改変は、配列内のアミノ酸の挿入、欠失または置換を系統的に行い、そして得られた改変体を全長または成熟ネイティブな配列のが示す活性について試験することによって決定し得る。
【００８８】
ＣＨＥＰＯポリペプチドのフラグメントを本明細書中で提供する。このようなフラグメントはＮ末端またはＣ末端で短縮され得るかまたは、例えば、全長の天然タンパク質と比較したとき、内部残基を欠失し得る。特定のフラグメントは、ＣＨＥＰＯポリペプチドの所望の生物学的活性に必須でないアミノ酸残基を欠失している。
【００８９】
ＣＨＥＰＯフラグメントは多数の従来技術のうちのいずれかで調製され得る。所望のペプチドフラグメントは化学的に合成され得る。代替的なアプローチは酵素的消化によって、例えば特定のアミノ酸残基によって特定される部位のタンパク質を切断することが公知の酵素でタンパク質を処理するかまたは適切な制限酵素でＤＮＡを消化し、そして所望のフラグメントを単離することによってＣＨＥＰＯフラグメントを産生することを含む。なおもう１つの適切な技術は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、所望のポリペプチドフラグメントをコードするＤＮＡフラグメントを単離しそして増幅することを包含する。ＰＣＲにおいては、ＤＮＡフラグメントの所望の末端を規定するオリゴヌクレオチドが５’および３’プライマーに使用される。好ましくは、ＣＨＥＰＯポリペプチドフラグメントは、図３に示されている天然ＣＨＥＰＯポリペプチド（配列番号２および５）と少なくとも１つの生物学的および／または免疫学的活性を共有している。
【００９０】
特定の実施形態においては、目的の保存的置換を好ましい置換という標題で表６中に示す。このような置換によって生物学的活性が変化する場合には、表６中で例示的な置換と命名されているかまたはアミノ酸クラスに関して以下でさらに記載されている、より一層実質的な変化を導入しそして産物をスクリーニングする。
【００９１】
【表６】

ＣＨＥＰＯポリペプチドの機能または免疫学的同一性の実質的な改変は、（ａ）置換領域におけるポリペプチド骨格の構造、例えば、シートまたはヘリックスコンホメーション、（ｂ）標的部位の分子の電荷または疎水性、または（ｃ）側鎖のかさ高さ（ｂｕｌｋ）の維持に対する影響が顕著に異なっている置換を選択することによって達成される。天然に存在する残基は共通の側鎖特性に基づいて次のようにグループ分けされる：
（１）疎水性：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；
（２）中性の親水性：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；
（３）酸性：ａｓｐ、ｇｌｕ；
（４）塩基性：ａｓｎ、ｇｌｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響を与える残基：ｇｌｙ、ｐｒｏ；ならびに
（６）芳香族：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ。
【００９２】
非保存的置換は、これらのクラスの１つのメンバーを別のクラスと交換することを必要とする。このような置換残基を保存的置換部位内に、または、より好ましくは、残りの（非保存）部位内に導入し得る。
【００９３】
このバリエーションは、オリゴヌクレオチド媒介性（部位特異的）変異誘発、アラニンスキャニングおよびＰＣＲ変異誘発のような当該分野で公知の方法を使用して行い得る。クローン化したＤＮＡに対して、部位特異的変異誘発［Ｃａｒｔｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：４３３１（１９８６）；Ｚｏｌｌｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１０：６４８７（１９８７）］、カセット変異誘発［Ｗｅｌｌｓら、Ｇｅｎｅ、３４：３１５（１９８５）］、制限選択変異誘発［Ｗｅｌｌｓら、Ｐｈｉｌｏｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄｏｎ ＳｅｒＡ、３１７：４１５（１９８６）］または他の公知の技術を実行して、ＣＨＥＰＯ改変体ＤＮＡを産生し得る。
【００９４】
スキャニングアミノ酸分析を使用して、連続的な配列に沿って１個以上のアミノ酸を同定し得る。好ましいスキャニングアミノ酸のなかには比較的小さな中性アミノ酸がある。このようなアミノ酸としては、アラニン、グリシン、セリンおよびシステインが挙げられる。アラニンはβ−炭素を越えた側鎖が無くそして改変体の主鎖コンホメーションを変えることはあまりない［ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４：１０８１〜１０８５（１９８９）］ので、このグループのなかでアラニンは代表的には好ましいスキャニングアミノ酸である。アラニンはまた、これが最も一般的なアミノ酸であるという理由で、代表的には好ましい。さらに、アラニンは隠れた位置と露出した位置の両方にしばしば見られる［Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．、ＮＹ）；Ｃｈｏｔｈｉａ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１５０：１（１９７６）］。アラニン置換によって適切な量の改変体が得られない場合、アイソテリック（ｉｓｏｔｅｒｉｃ）アミノ酸を使用し得る。
【００９５】
（Ｃ．ＣＨＥＰＯの改変）
ＣＨＥＰＯの共有結合改変は本発明の範囲内に含まれる。共有結合改変の１つのタイプとしては、ＣＨＥＰＯポリペプチドの標的化されたアミノ酸残基を、ＣＨＥＰＯの選択された側鎖またはＮ末端残基もしくはＣ末端残基と反応し得る有機誘導体化剤（ｏｒｇａｎｉｃ ｄｅｒｉｖａｔｉｚｉｎｇ ａｇｅｎｔ）と反応させることが挙げられる。二官能性薬剤による誘導体化は、例えば、抗ＣＨＥＰＯ抗体の精製方法で使用するためにＣＨＥＰＯを水不溶性の支持体マトリックスまたは表面と架橋させるために有用であり、そして逆の場合も同じである。通常使用される架橋剤には、例えば、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（例えば４−アジドサリチル酸とのエステル）、３，３’−ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）のようなジスクシンイミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル、ビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタンのような二官能性マレイミド、およびメチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミデートのような薬剤が挙げられる。
【００９６】
他の改変としては、グルタミニルおよびアスパラギニル残基の、それぞれ対応するグルタミルおよびアスパルチル残基への脱アミノ化、プロリンおよびリシンのヒドロキシル化、セリルまたはスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニンおよびヒスチジン側鎖の−アミノ基のメチル化［Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ： Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．、Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、７９〜８６頁（１９８３）］、Ｎ末端アミンのアセチル化ならびに任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化が挙げられる。
【００９７】
本発明の範囲内に含まれるＣＨＥＰＯポリペプチドの別のタイプの共有結合改変としては、ポリペプチドのネイティブなグリコシル化パターンの改変が挙げられる。「ネイティブなグリコシル化パターンの改変」は、本発明の目的では、ネイティブな配列のＣＨＥＰＯ中に見られる１つ以上の炭水化物部分の欠失（元となるグリコシル化部位を取り除くか、あるいは化学的および／または酵素的手段によってグリコシル化を欠失させるかのどちらかによって）および／またはネイティブな配列のＣＨＥＰＯ内には存在していない１つ以上のグリコシル化部位の付加を意味することが意図される。加えて、上記の句には、ネイティブなタンパク質のグリコシル化における定性的変化が含まれており、そしてこれは存在する種々の炭水化物部分の性質および割合の変化に係わっている。
【００９８】
ＣＨＥＰＯポリペプチドに対するグリコシル化部位の付加は、アミノ酸配列を改変することにより達成され得る。この改変は、例えば、ネイティブな配列のＣＨＥＰＯに（Ｏ結合型グリコシル化部位のための）１個以上のセリンまたはトレオニン残基を付加すること、またはこれら残基により置換することにより行われ得る。ＣＨＥＰＯアミノ酸配列はＤＮＡレベルでの変化によって、特に、所望のアミノ酸に翻訳されるコドンが産生されるように、ＣＨＥＰＯポリペプチドをコードするＤＮＡを予め選択した塩基で変異させることによって、必要に応じて改変され得る。
【００９９】
ＣＨＥＰＯポリペプチドの炭水化物部分の数を増加させるもう１つの手段はグリコシドと上記ポリペプチドの化学的または酵素的カップリングによるものである。このような方法は当該分野で、例えば、１９８７年９月１１日に公開されたＷＯ ８７／０５３３０ならびにＡｐｌｉｎおよびＷｒｉｓｔｏｎ、ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２５９〜３０６頁（１９８１）中に記載される。
【０１００】
ＣＨＥＰＯポリペプチドに存在する炭水化物部分の除去は、化学的もしくは酵素的に達成するか、またはグリコシル化用標的として利用されるアミノ酸残基をコードするコドンの変異的置換によって達成することができる。化学的脱グリコシル化技術は当該分野で公知であり、そして例えば、Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．、２５９：５２（１９８７）およびＥｄｇｅら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１１８：１３１（１９８１）によって記載されている。ポリペプチドの炭水化物部分の酵素的切断は、Ｔｈｏｔａｋｕｒａら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１３８：３５０（１９８７）によって記載されるように種々のエンドグリコシダーゼおよびエキソグリコシダーゼを使用して達成することができる。
【０１０１】
ＣＨＥＰＯの共有結合改変のもう１つの型には、ＣＨＥＰＯポリペプチドを種々の非タンパク質ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコールまたはポリオキシアルキレン）のうちの１つと、米国特許第４，６４０，８３５号；第４，４９６，６８９号；第４，３０１，１４４号；第４，６７０，４１７号；第４，７９１，１９２号または第４，１７９，３３７号中に記載されているようにして結合させることが含まれる。
【０１０２】
本発明のＣＨＥＰＯはまた、別の異種ポリペプチドまたはアミノ酸配列と融合したＣＨＥＰＯを含んでいるキメラ分子を形成するような方法で改変され得る。
【０１０３】
１つの実施形態では、このようなキメラ分子はＣＨＥＰＯと、抗タグ抗体が選択的に結合し得るエピトープを提供するタグポリペプチドとの融合体を含んでいる。上記エピトープタグは一般的にＣＨＥＰＯのアミノ末端またはカルボキシル末端に配置される。ＣＨＥＰＯのこのようなエピトープタグ化形態の存在は、このタグポリペプチドに対する抗体を使用して検出され得る。また、エピトープタグを備えることによって、このエピトープタグと結合する抗タグ抗体または別のタイプの親和性マトリックスを使用するアフィニティー精製でＣＨＥＰＯを容易に精製することができる。種々のタグポリペプチドおよびそれらのそれぞれの抗体は当該分野で周知である。これらの例にはポリ−ヒスチジン（ｐｏｌｙ−ｈｉｓ）またはポリ−ヒスチジン−グリシン（ｐｏｌｙ−ｈｉｓ−ｇｌｙ）タグ；ｆｌｕ ＨＡタグポリペプチドおよびその抗体１２ＣＡ５［Ｆｉｅｌｄら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、８：２１５９〜２１６５（１９８８）］；ｃ−ｍｙｃタグおよびこれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７および９Ｅ１０抗体［Ｅｖａｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、５：３６１０〜３６１６（１９８５）］；ならびに単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）タグおよびその抗体［Ｐａｂｏｒｓｋｙら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、３（６）：５４７〜５５３（１９９０）］が挙げられる。他のタグポリペプチドとしては、Ｆｌａｇ−ペプチド［Ｈｏｐｐら、Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、６：１２０４〜１２１０（１９８８）］；ＫＴ３エピトープペプチド［Ｍａｒｔｉｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５５：１９２〜１９４（１９９２）］；−チューブリンエピトープペプチド［Ｓｋｉｎｎｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６６：１５１６３〜１５１６６（１９９１）］；およびＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチドタグ［Ｌｕｔｚ−Ｆｒｅｙｅｒｍｕｔｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８７：６３９３〜６３９７（１９９０）］が挙げられる。
【０１０４】
代替的な実施形態では、上記キメラ分子はＣＨＥＰＯと免疫グロブリンまたは免疫グロブリンの特定領域との融合体を含み得る。上記キメラ分子の二価形態（免疫アドヘシンとも称される）では、このような融合体はＩｇＧ分子のＦｃ領域に対するものであり得る。上記Ｉｇ融合体は好ましくは、Ｉｇ分子内の少なくとも１つの可変領域の代わりにＣＨＥＰＯポリペプチドの可溶性（膜貫通ドメイン欠失または不活化）形態による置換を含んでいる。特に好ましい実施形態では、免疫グロブリン融合体はＩｇＧ１分子のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３またはヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３領域を含んでいる。免疫グロブリン融合体の調製に関しては、１９９５年６月２７日に発行された米国特許第５，４２８，１３０号も参照のこと。
【０１０５】
（Ｄ．ＣＨＥＰＯの調製）
以下の説明は主として、ＣＨＥＰＯ核酸を含むベクターで形質転換されるかまたはトランスフェクションされた細胞の培養によるＣＨＥＰＯの生成に関する。もちろん、ＣＨＥＰＯを調製するために当該分野で周知である代替的な方法を使用し得ることが意図されている。例えば、ＣＨＥＰＯ配列またはその部分は、固相技術を使用して直接的なペプチド合成で生成され得る［例えば、Ｓｔｅｗａｒｔら、Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ Ｃｏ．、Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ（１９６９）；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、８５：２１４９〜２１５４（１９６３）参照］。インビトロタンパク質合成は、手動技術を使用するかまたは自動により実施され得る。自動化合成は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用し、製造者の説明書を用いて達成され得る。ＣＨＥＰＯの種々の部分を化学的に別々に合成し得、そして化学的または酵素的方法を使用して組み合わせて、全長ＣＨＥＰＯを生成し得る。
【０１０６】
（１．ＣＨＥＰＯをコードするＤＮＡの単離）
ＣＨＥＰＯをコードするＤＮＡは、ＣＨＥＰＯ ｍＲＮＡを有し、かつそれを検出可能なレベルで発現すると考えられる組織から調製したｃＤＮＡライブラリーから得ることができる。従って、ヒトＣＨＥＰＯ ＤＮＡは好都合なことに、実施例に記載されるように、ヒト組織から調製したｃＤＮＡライブラリーから得ることができる。ＣＨＥＰＯをコードする遺伝子はまた、ゲノムライブラリーから得られ得るか、または公知の合成方法（例えば、自動化核酸合成）によって得られ得る。
【０１０７】
ライブラリーは、問題の遺伝子またはこの遺伝子によってコードされているタンパク質を同定するように設計されたプローブ（例えば、ＣＨＥＰＯに対する抗体または少なくとも約２０〜８０塩基のオリゴヌクレオチド）を使用してスクリーニングすることができる。選択したプローブによるｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーのスクリーニングは、標準的な方法、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９）中に記載されている方法を使用して実施され得る。ＣＨＥＰＯをコードする遺伝子を単離する代替的な手段は、ＰＣＲ法［Ｓａｍｂｒｏｏｋら（上述）；Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈら、ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９９５）］を使用することである。
【０１０８】
以下の実施例はｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする技術を記載している。プローブとして選択されるオリゴヌクレオチド配列は、擬似陽性を最小限にするに十分な長さで且つ十分に明白でなければならない。オリゴヌクレオチドは、好ましくは、このオリゴヌクレオチドがスクリーニングされているライブラリー中のＤＮＡび対するハイブリダイゼーションによって検出され得るように標識される。標識化方法は当該分野で周知であり、そして³²Ｐ−標識ＡＴＰのような放射性標識の使用、ビオチン付加または酵素標識化が挙げられる。中程度のストリンジェンシーおよび高いストリンジェンシーを含むハイブリダイゼーション条件は、上述のＳａｍｂｒｏｏｋら中に提供されている。
【０１０９】
このようなライブラリースクリーニング方法で同定された配列は、ＧｅｎＢａｎｋのような公的なデータベースまたは他の私的な配列データベースに寄託されそしてそこで利用可能な他の公知の配列と比較し、そしてアラインさせ得る。この分子の規定の領域内または全長配列にわたる配列同一性（アミノ酸またはヌクレオチドレベルのどちらか）は当該分野で公知であり、かつ本明細書に記載の方法を使用して決定され得る。
【０１１０】
タンパク質コード配列を有する核酸は、本明細書で初めて開示された推定アミノ酸配列を使用し、そして必要な場合、前駆体を検出するために、上述のＳａｍｂｒｏｏｋら中に記載される従来のプライマー伸長法を使用して、選択したｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーをスクリーニングし、そしてｃＤＮＡに逆転写されていないと思われるｍＲＮＡの中間体をプロセシングして得ることができる。
【０１１１】
（２．宿主細胞の選択および形質転換）
宿主細胞は、ＣＨＥＰＯ製造のために本明細書で記載した発現またはクローニングベクターでトランスフェクションするかまたは形質転換され、そしてプロモーターを誘発するか、形質転換体を選択するか、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適するように修飾した従来の栄養培地中で培養する。培地、温度、ｐＨ等のような培養条件は、過度の実験を行うことなく当業者により選択され得る。一般的に、細胞培養物の生産性を最大化するための原則、プロトコールおよび実践技術は、Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｍ．Ｂｕｔｌｅｒ編（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、１９９１）および上述のＳａｍｂｒｏｏｋら中に見ることができる。
【０１１２】
真核生物細胞のトランスフェクション方法および原核生物細胞の形質転換方法は当業者に公知である（例えば、ＣａＣｌ₂、ＣａＰＯ₄、リポソーム媒介性およびエレクトロポレーション）。使用する宿主細胞に依存して、形質転換はこのような細胞に適する標準的な技術を使用して行われる。上述のＳａｍｂｒｏｏｋら中に記載されているような塩化カルシウムを使用するカルシウム処理、またはエレクトロポレーションは一般的に原核生物に対して使用される。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓによる感染は、Ｓｈａｗら、Ｇｅｎｅ、２３：３１５（１９８３）および１９８９年６月２９日に公開されたＷＯ８９／０５８５９によって記載されているように、特定の植物細胞を形質転換するために使用される。このような細胞壁がない哺乳動物細胞では、Ｇｒａｈａｍおよびｖａｎ ｄｅｒ Ｅｂ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、５２：４５６〜４５７（１９７８）のリン酸カルシウム沈降法を使用し得る。哺乳動物細胞宿主系トランスフェクションの一般的な局面は、米国特許第４，３９９，２１６号中に記載されている。酵母内への形質転換は、代表的にはＶａｎ Ｓｏｌｉｎｇｅｎら、Ｊ．Ｂａｃｔ．、１３０：９４６（１９７７）およびＨｓｉａｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）、７６：３８２９（１９７９）の方法に従って実施される。しかし、ＤＮＡを細胞内に導入する他の方法（例えば核微量注入、エレクトロポレーション、インタクトな細胞との細菌プロトプラスト融合または多価陽イオン、例えば、ポリブレン、ポリオルニチンによる方法）を使用し得る。哺乳動物細胞を形質転換するための種々の技術については、Ｋｅｏｗｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１８５：５２７〜５３７（１９９０）およびＭａｎｓｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ、３３６：３４８〜３５２（１９８８）を参照のこと。
【０１１３】
本明細書中に記載のベクター内のＤＮＡをクローニングするかまたは発現させるための適切な宿主細胞としては、原核生物、酵母または高等真核生物細胞が挙げられる。適切な原核生物としては、真正細菌（ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、例えばグラム陰性またはグラム陽性生物、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのようなＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅが挙げられるが、これらに限定されない。種々のＥ．ｃｏｌｉ株、例えばＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２株ＭＭ２９４（ＡＴＣＣ ３１，４４６）；Ｅ．ｃｏｌｉ Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ ３１，５３７）；Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ ２７，３２５）およびＫ５ ７７２（ＡＴＣＣ ５３，６３５）が公的に入手可能である。他の適切な原核宿主細胞としては、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ（例えばＥ．ｃｏｌｉ）、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ（例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、Ｓｅｒｒａｔｉａ（例えば、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｅｃｅｓｃａｎｓ）およびＳｈｉｇｅｌｌａ）、ならびにＢａｃｉｌｌｉ（例えば、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ（例えば、１９８９年４月１２日に公開されたＤＤ ２６６，７１０に開示されているＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ４１Ｐ））、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ（例えば、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓが挙げられる。これらの例は限定ではなく、例示である。株Ｗ３１１０は組換えＤＮＡ産物発酵用の通常の宿主株であるので、これは１つの特に好ましい宿主または親宿主である。好ましくは、この宿主細胞は最小限量のタンパク質分解酵素しか分泌しない。例えば、株Ｗ３１１０は、この宿主に内在性のタンパク質をコードする遺伝子に遺伝子変異を生じさせるように改変され得、このような宿主の例としては、完全な遺伝子型ｔｏｎＡを有しているＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０株１Ａ２；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ ｐｔｒ３を有しているＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０株９Ｅ４；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ ｐｔｒ３ ｐｈｏＡ Ｅ１５（ａｒｇＦ−ｌａｃ）１６９ ｄｅｇＰ ｏｍｐＴ ｋａｒｌを有しているＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０株２７Ｃ７（ＡＴＣＣ ５５，２４４）；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ ｐｔｒ３ ｐｈｏＡ Ｅ１５（ａｒｇＦ−ｌａｃ）１６９ ｄｅｇＰ ｏｍｐＴ ｒｂｓ７ ｉｌｖＧ ｋａｒｌを有しているＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０株３７Ｄ６；Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０株４０Ｂ４（これは非カナマイシン耐性ｄｅｇＰ欠失変異を有する株３７Ｄ６である）；および１９９０年８月７日に発行された米国特許第４，９４６，７８３号中に開示されている変異ペリプラズムプロテアーゼ（ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ ｐｒｏｔｅａｓｅ）を有しているＥ．ｃｏｌｉ株が挙げられる。あるいは、クローニングのインビトロ方法、例えばＰＣＲまたは他の核酸ポリメラーゼ反応が適している。
【０１１４】
原核生物に加えて、糸状菌または酵母のような真核微生物はＣＨＥＰＯコードベクター用の適切なクローニングまたは発現用宿主である。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、一般的に使用される下等真核宿主微生物である。他のものとしては、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｂｅ（ＢｅａｃｈおよびＮｕｒｓｅ、Ｎａｔｕｒｅ、２９０：１４０［１９８１］；１９８５年５月２日に公開されたＥＰ １３９，３８３）；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ宿主（米国特許第４，９４３，５２９号；Ｆｌｅｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９：９６８〜９７５（１９９１））、例えば、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ（ＭＷ９８−８Ｃ、ＣＢＳ６８３、ＣＢＳ４５７４；Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、７３７［１９８３］）、Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ（ＡＴＣＣ １２，４２４）、Ｋ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ（ＡＴＣＣ １６，０４５）、Ｋ．ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ（ＡＴＣＣ ２４，１７８）、Ｋ．ｗａｌｔｉｉ（ＡＴＣＣ ５６，５００）、Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ（ＡＴＣＣ ３６，９０６；Ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、８：１３５（１９９０））、Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓおよびＫ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ；ｙａｒｒｏｗｉａ（ＥＰ ４０２，２２６）；Ｐｉｃｈａ ｐａｓｔｏｒｉｓ（ＥＰ １８３，０７０；Ｓｒｅｅｋｒｉｓｈｎａら、Ｊ．Ｂａｓｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２８：２６５〜２７８［１９８８］）；Ｃａｎｄｉｄａ；Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｉａ（ＥＰ ２４４，２３４）；Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ（Ｃａｓｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７６：５２５９〜５２６３［１９７９］）；Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ、例えば、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ（１９９０年１０月３１日に公開されたＥＰ ３９４，５３８）；ならびに糸状菌、例えば、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｔｐｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ（１９９１年１月１０日に公開されたＷＯ ９１／００３５７）、およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ宿主、例えばＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓ（Ｂａｌｌａｎｃｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１１２：２８４〜２８９［１９８３］；Ｔｉｌｂｕｒｎら、Ｇｅｎｅ、２６：２０５〜２２１［１９８３］；Ｙｅｌｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：１４７０〜１４７４［１９８４］）およびＡ．ｎｉｇｅｒ（ＫｅｌｌｙおよびＨｙｎｅｓ、ＥＭＢＯ Ｊ．、４：４７５〜４７９［１９８５］）が挙げられる。メチロトローフ酵母（ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｉｃ ｙｅａｓｔ）は本発明に適しており、そしてこれらとしては、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、ＴｏｒｕｌｏｐｓｉｓおよびＲｈｏｄｏｔｏｒｕｌａからなる属から選択されるメタノールで増殖可能な酵母が挙げられるが、これらに限定されない。このクラスの酵母の例示である特定の種の列挙は、Ｃ．Ａｎｔｈｏｎｙ、Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｓ、２６９（１９８２）中に見ることができる。
【０１１５】
グリコシル化したＣＨＥＰＯを発現するための適切な宿主細胞は、多細胞生物から誘導される。無脊椎動物細胞の例としては、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ Ｓｆ９のような昆虫細胞ならびに植物細胞が挙げられる。有用な哺乳動物宿主細胞株の例としては、チャイニーズ・ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞およびＣＯＳ細胞が挙げられる。さらに特定の例としては、ＳＶ４０で形質転換したサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）；ヒト胚性腎臓株（２９３細胞または懸濁培養で増殖させるためにサブクローン化した２９３細胞、Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、３６：５９（１９７７））；チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞／ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７：４２１６（１９８０））；マウス・セルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．、２３：２４３〜２５１（１９８０））；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ７５）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ ８０６５）；およびマウス乳癌（ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）が挙げられる。適切な宿主細胞の選択は当該分野の技術範囲内であると考えられる。
【０１１６】
（３．複製可能なベクターの選択および使用）
ＣＨＥＰＯをコードする核酸（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）は、クローニング（ＤＮＡの増幅）または発現のために複製可能なベクター内に挿入され得る。種々のベクターが公的に入手可能である。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子またはファージの形態であり得る。適切な核酸配列を種々の手順によりベクターへ挿入し得る。一般的に、ＤＮＡは、当該分野で公知の技術を使用して適切な制限エンドヌクレアーゼ部位内に挿入される。ベクター構成成分としては、一般的に、１つ以上のシグナル配列、複製起点、１つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーターおよび転写終結配列が挙げられるが、これらに限定されない。１つ以上のこれら構成成分を含む適切なベクターの構築には、当業者に公知の標準的な連結技術が使用される。
【０１１７】
ＣＨＥＰＯは、直接組換え的に産生されるだけでなく、成熟型タンパク質またはポリペプチドＮ末端の特定の切断部位を有しているシグナル配列または他のポリペプチドであり得る異種ポリペプチドとの融合ポリペプチドとしても組換え的に産生され得る。一般に、上記シグナル配列はベクターの構成成分であり得るかまたはベクター内に挿入されるＣＨＥＰＯコードＤＮＡの一部であり得る。このシグナル配列は、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐまたは熱安定エンテロトキシンＩＩリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列であり得る。酵母から分泌させるためには、上記シグナル配列は、例えば酵母インベルターゼリーダー、α因子リーダー（これにはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓおよびＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ α因子リーダーが挙げられ、後者は米国特許第５，０１０，１８２号中に記載されている）もしくは酸ホスファターゼリーダー、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ グルコアミラーゼリーダー（１９９０年４月４日に公開されたＥＰ ３６２，１７９）または１９９０年１１月１５日に公開されたＷＯ ９０／１３６４６中に記載されているシグナルであり得る。哺乳動物細胞発現においては、哺乳動物シグナル配列、例えば、同一種または関連種の分泌ポリペプチド由来のシグナル配列ならびにウイルス分泌リーダーを使用して、タンパク質の分泌を方向付け得る。
【０１１８】
発現ベクターとクローニングベクターは共に、１つ以上の選択された宿主細胞内でそのベクターを複製させ得る核酸配列を含む。このような配列は種々の細菌、酵母およびウイルスについて周知である。プラスミドｐＢＲ３２２由来の複製起点は大部分のグラム陰性菌に適しており、２プラスミド起点は酵母に適しており、そして種々のウイルス起点（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶまたはＢＰＶ）は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。
【０１１９】
発現ベクターおよびクローニングベクターは代表的には、選択マーカーとも称される選択遺伝子を含む。代表的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質または他のトキシン、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートまたはテトラサイクリンに対して耐性を付与するタンパク質か、（ｂ）栄養要求性欠乏を補足するタンパク質かまたは複雑な培地から入手できない重要な栄養を供給するタンパク質をコードする（例えばＢａｃｉｌｌｕｓのＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子）。
【０１２０】
哺乳動物細胞用の適切な選択マーカーの例は、ＣＨＥＰＯコード核酸を取り込む能力のある細胞の同定を可能にする選択マーカー（例えば、ＤＨＦＲまたはチミジンキナーゼ）である。野生型ＤＨＦＲを使用する場合に適する宿主細胞は、Ｕｒｌａｕｂら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７：４２１６（１９８０）によって記載されているようにして調製されそして増殖されたＤＨＦＲ活性を欠失しているＣＨＯ細胞株である。酵母で使用される適切な選択遺伝子は酵母プラスミドＹＲｐ７中に存在するｔｒｐ１遺伝子である［Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂら、Ｎａｔｕｒｅ、２８２：３９（１９７９）；Ｋｉｎｇｓｍａｎら、Ｇｅｎｅ、７：１４１（１９７９）；Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒら、Ｇｅｎｅ、１０：１５７（１９８０）］。ｔｒｐ１遺伝子は、トリプトファン中で増殖する能力を欠いている酵母の変異株、例えば、ＡＴＣＣ番号４４０７６またはＰＥＰ４−１［Ｊｏｎｅｓ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．８５：１２（１９７７）］の選択マーカーを提供する。
【０１２１】
発現ベクターおよびクローニングベクターは通常、ｍＲＮＡ合成を指令するためにＣＨＥＰＯコード核酸配列と作動可能に連結したプロモーターを含む。種々の潜在的宿主細胞によって認識されるプロモーターは周知である。原核宿主で使用するために適しているプロモーターとしては、−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系［Ｃｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ、２７５：６１５（１９７８）；Ｇｏｅｄｄｅｌら、Ｎａｔｕｒｅ、２８１：５４４（１９７９）］、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系［Ｇｏｅｄｄｅｌ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、８：４０５７（１９８０）；ＥＰ ３６，７７６］ならびにｔａｃプロモーターのようなハイブリッドプロモーター［ｄｅＢｏｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８０：２１〜２５（１９８３）］が挙げられる。細菌系で使用するためのプロモーターはまた、ＣＨＥＰＯをコードするＤＮＡと作動可能に連結したシャイン・ダルガーノ（Ｓ．Ｄ．）配列を含む。
【０１２２】
酵母宿主で使用される適切なプロモーター配列（ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）の例としては、３−ホスホグリセレートキナーゼ［Ｈｉｔｚｍａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５５：２０７３（１９８０）］または他の解糖酵素［Ｈｅｓｓら、Ｊ．Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｑ．、７：１４９（１９６８）；Ｈｏｌｌａｎｄ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１７：４９００（１９７８）］、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼおよびグルコキナーゼのプロモーターが挙げられる。
【０１２３】
増殖条件によって転写が制御されるというさらなる利点を有する誘導性プロモーターである他の酵母プロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロームＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝に関係のある分解酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼならびにマルトースおよびガラクトース利用にを担う酵素のプロモーター領域である。酵母発現で使用される適切なベクターおよびプロモーターはＥＰ ７３，６５７中でさらに記載されている。
【０１２４】
哺乳動物宿主細胞内におけるベクターからＣＨＥＰＯの転写は、例えば、ウイルスのゲノムから得られるプロモーター、例えばポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス（１９８９年７月５日に公開されたＵＫ ２，２１１，５０４）、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス２）、ウシ乳頭腫ウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよびシミアン・ウイルス４０（ＳＶ４０）から得られるプロモーター、異種哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーターから得られるプロモーター、ならびに熱ショックプロモーターから得られるプロモーターによって制御されるが、但し、このようなプロモーターは宿主細胞株と適合性である。
【０１２５】
高等真核生物によるＣＨＥＰＯをコードするＤＮＡの転写は、ベクター内にエンハンサー配列を挿入することによって増大され得る。エンハンサーは、プロモーターに作用してその転写を増大させる、通常、約１０から３００ｂｐまでのＤＮＡのシス作用性エレメントである。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在公知である（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、−フェトプロテインおよびインスリン）。しかし、当業者は、代表的には、真核生物細胞ウイルス由来のエンハンサーを使用する。これらの例としては、複製起点の後側（ｂｐ １００〜２７０）のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後側のポリオーマエンハンサーおよびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。上記エンハンサーはベクター内のＣＨＥＰＯコード配列の５’または３’位にスプライシングされ得るが、好ましくは上記プロモーターの５’位に位置させる。
【０１２６】
真核宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒトまたは他の多細胞生物由来の有核細胞）内で使用される発現ベクターはまた、転写終結およびｍＲＮＡ安定化に必要な配列を含む。このような配列は通常、真核生物またはウイルスのＤＮＡまたはｃＤＮＡの５’非翻訳領域から、そしてときには３’非翻訳領域から得られる。これらの領域は、ＣＨＥＰＯをコードするｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化フラグメントとして転写されるヌクレオチドフラグメントを含む。
【０１２７】
組換え脊椎動物細胞培養におけるＣＨＥＰＯの合成に適合させることに適しているさらに他の方法、ベクターおよび宿主細胞はＧｅｔｈｉｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ、２９３：６２０〜６２５（１９８１）；Ｍａｎｔｅｉら、Ｎａｔｕｒｅ、２８１：４０〜４６（１９７９）；ＥＰ １１７，０６０；およびＥＰ １１７，０５８中に記載されている。
【０１２８】
（４．遺伝子増幅／発現の検出）
遺伝子増幅および／または発現は、本明細書で提供した配列に基づいて、適切な標識プローブを使用して、試料中で直接、例えば従来のサザンブロット法、ｍＲＮＡの転写を定量するノーザンブロット法［Ｔｈｏｍａｓ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７：５２０１〜５２０５（１９８０）］、ドットブロット法（ＤＮＡ分析）またはインサイチュハイブリダイゼーションで測定され得る。あるいは、ＤＮＡ二重鎖、ＲＮＡ二重鎖およびＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二重鎖またはＤＮＡ−タンパク質二重鎖を含む特定の二重鎖を認識し得る抗体を使用し得る。これらの抗体は順次標識し得、そしてアッセイを実施し得、そのアッセイにおいて、二重鎖が表面に結合され、その結果、表面に二重鎖が形成されると、この二重鎖に結合した抗体の存在を検出し得る。
【０１２９】
あるいは、遺伝子発現を免疫学的方法、例えば、細胞または組織切片の免疫組織化学的染色および細胞培養物または体液のアッセイによって測定して、遺伝子産物の発現を直接定量し得る。免疫組織化学的染色および／またはサンプル液体のアッセイに有用な抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体のいずれかであり得、そして任意の哺乳動物において調製され得る。好都合には、これら抗体はネイティブな配列のＣＨＥＰＯポリペプチドに対してか、または本明細書中で提供されるＤＮＡ配列に基づく合成ペプチドに対してか、またはＣＨＥＰＯ ＤＮＡと融合しそして特定の抗体エピトープをコードする外来配列に対して調製され得る。
【０１３０】
（５．ポリペプチドの精製）
ＣＨＥＰＯの形態物は、培養培地または宿主細胞溶解物から回収され得る。膜と結合している場合、これは適切な境界活性剤溶液（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００）を使用するかまたは酵素的切断によって膜から遊離され得る。ＣＨＥＰＯの発現に使用された細胞は、種々の物理的または化学的手段、例えば凍結−融解反復、超音波処理、機械的破壊または細胞溶解剤によって破壊され得る。
【０１３１】
組換え細胞タンパク質またはポリペプチドからＣＨＥＰＯを精製することは望ましい。以下の手順は適切な精製手順の例である：イオン交換カラムでの分画；エタノール沈澱；逆相ＨＰＬＣ；シリカまたはＤＥＡＥのような陽イオン交換樹脂によるクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈降；例えば、セファデックスＧ−７５を用いるゲルろ過；ＩｇＧのような夾雑物を除去するプロテインＡセファロースカラム；およびＣＨＥＰＯのエピトープ−タグ化形態と結合する金属キレート化カラム。種々のタンパク質精製方法が使用され得、そしてこのような方法は当該分野で公知であり、そして例えば、Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１８２（１９９０）；Ｓｃｏｐｅｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８２）中に記載される。選択される精製工程は、例えば、使用される製造方法および生成される特定のＣＨＥＰＯの性質に依存する。
【０１３２】
（Ｅ．ＣＨＥＰＯの使用）
ＣＨＥＰＯをコードするヌクレオチド配列（またはそれらの相補鎖）は、ハイブリダイゼーションプローブとしての使用を含む分子生物学分野、染色体および遺伝子マッピングならびにアンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡの産生における種々の適用を有する。ＣＨＥＰＯ核酸はまた、本明細書中で記載した組換え技術によるＣＨＥＰＯポリペプチドの調製に有用である。
【０１３３】
全長のネイティブな配列のＣＨＥＰＯ ｃＤＮＡ（配列番号３）またはその部分は、全長ＣＨＥＰＯ ｃＤＮＡを単離するかまたは図２に開示されているＣＨＥＰＯ配列（配列番号３）と所望の配列同一性を有するさらに他のｃＤＮＡ（例えば、天然に存在するＣＨＥＰＯ改変体または他の種から得られるＣＨＥＰＯをコードするもの）を単離するために、ｃＤＮＡライブラリーのハイブリダイゼーションプローブとして使用され得る。必要に応じて、これらプローブの長さは約２０〜約５０塩基である。上記ハイブリダイゼーションプローブは、配列番号３のヌクレオチド配列の少なくとも部分的に新規な領域から（ここで、その領域は、過度の実験を行うことなく決定され得る）か、またはネイティブな配列のＣＨＥＰＯのプロモーター、エンハンサーエレメントおよびイントロンを含むゲノム配列から誘導され得る。一例として、スクリーニング方法は、公知のＤＮＡ配列を使用して約４０塩基の選択されたプローブを合成してＣＨＥＰＯ遺伝子のコード領域を単離することを含んでいる。ハイブリダイゼーションプローブは、³²Ｐもしくは³⁶Ｓのような放射性ヌクレオチドまたは酵素標識、例えばアビジン／ビオチンカップリング系を介してプローブとカップリングしているアルカリホスファターゼを含む種々の標識により標識され得る。本発明のＣＨＥＰＯ遺伝子の配列と相補的な配列を有している標識プローブを使用してヒトｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡのライブラリーをスクリーニングして、上記プローブがこのようなライブラリーのうちのどのメンバーとハイブリダイズするのかを決定し得る。ハイブリダイゼーション技術は以下の実施例でさらに詳細に記載される。
【０１３４】
本出願で開示されているＥＳＴ配列はいずれも、本明細書で開示した方法を使用して、プローブとして同様に使用され得る。
【０１３５】
ＣＨＥＰＯ核酸の他の有用なフラグメントとしては、標的ＣＨＥＰＯ ｍＲＮＡ（センス）またはＣＨＥＰＯ ＤＮＡ（アンチセンス）配列と結合し得る一本鎖核酸配列（ＲＮＡかまたはＤＮＡのどちらか）を含んでいるアンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドが挙げられる。本発明によれば、アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドはＣＨＥＰＯ ＤＮＡのコード領域のフラグメントを含む。このようなフラグメントは一般的に、少なくとも約１４のヌクレオチド、好ましくは約１４から３０までのヌクレオチドを含んでいる。所定のタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列に基づいてアンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドを誘導する能力は、例えば、ＳｔｅｉｎおよびＣｏｈｅｎ（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４８：２６５９、１９８８）およびｖａｎ ｄｅｒ Ｋｒｏｌら（Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：９５８、１９８８）中に記載される。
【０１３６】
アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドが標的核酸配列と結合すると、二重鎖の分解増強、転写もしくは翻訳の成熟前終結（ｐｒｅｍａｔｕｒｅ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ）を含む幾つかの手段のうちの１つまたは他の手段によって上記標的配列の転写または翻訳をブロックする二重鎖の形成を生じる。従って、上記アンチセンスオリゴヌクレオチドを使用してＣＨＥＰＯタンパク質の発現をブロックし得る。アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドはさらに、改変された糖−ホスホジエステル骨格（または他の糖結合、例えばＷＯ９１／０６６２９中に記載されているもの）を有するオリゴヌクレオチドを含み、そしてその際このような糖結合は内因性ヌクレアーゼに抵抗性である。抵抗性の糖結合を有するこのようなオリゴヌクレオチドはインビボで安定である（即ち、酵素的分解に抵抗し得る）が、標的ヌクレオチド配列と結合し得る配列特異性は保持している。
【０１３７】
センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドの他の例としては、有機部分（例えばＷＯ ９０／１００４８中に記載されているもの）および標的核酸配列に対するオリゴヌクレオチドの親和性を高める他の部分（例えば、ポリ−（Ｌ−リシン））と共有結合しているオリゴヌクレオチドが挙げられる。さらになお、エリプチシンのようなインターカレート剤およびアルキル化剤または金属錯体をセンスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドと結合させて、標的ヌクレオチド配列に対するアンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドの結合特異性を改変し得る。
【０１３８】
アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、ＣａＰＯ₄媒介性ＤＮＡトランスフェクション、エレクトロポレーションを含む任意の遺伝子導入方法によって、またはエプスタイン・バーウイルスのような遺伝子導入ベクターを使用することによって、標的核酸配列を含む細胞内に導入され得る。好ましい方法では、アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドは適切なレトロウイルスベクター内に挿入される。標的核酸配列を含んでいる細胞は、インビボかまたはエクスビボのどちらかで組換えレトロウイルスベクターと接触される。適切なレトロウイルスベクターとしては、マウスレトロウイルスＭ−ＭｕＬＶから誘導されるもの、すなわち、Ｎ２（Ｍ−ＭｕＬＶから誘導されたレトロウイルス）またはＤＣＴ５Ａ、ＤＣＴ５ＢおよびＤＣＴ５Ｃと称されるダブルコピーベクター（ＷＯ ９０／１３６４１参照）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３９】
センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、ＷＯ ９１／０４７５３中に記載されているように、リガンド結合分子と結合体を形成することによって標的ヌクレオチド配列を含んでいる細胞内に導入され得る。適切なリガンド結合分子としては、細胞表面レセプター、増殖因子、他のサイトカインまたは細胞表面レセプターと結合する他のリガンドが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、上記リガンド結合分子の結合体化は、このリガンド結合分子がその対応する分子またはレセプターと結合する能力、あるいはセンスもしくはアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその結合体化バージョンの細胞内への侵入をブロックする能力には実質的に干渉しない。
【０１４０】
あるいは、センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＷＯ ９０／１０４４８中に記載されているように、オリゴヌクレオチド−脂質複合体を形成することによって標的核酸配列を含む細胞内に導入され得る。このセンスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチド−脂質複合体は、好ましくは、内因性リパーゼによって細胞内で解離される。
【０１４１】
密接に関連したＣＨＥＰＯコード配列を同定するための配列プールを作製するために、上記プローブをＰＣＲ技術で使用し得る。
【０１４２】
ＣＨＥＰＯをコードするヌクレオチド配列を使用して、このＣＨＥＰＯをコードする遺伝子をマッピングするためおよび遺伝子疾患を有する個体の遺伝子分析のためにハイブリダイゼーションプローブを構築し得る。本明細書中で提供されるヌクレオチド配列は、公知の技術（例えば、インサイチュハイブリダイゼーション、公知の染色体マーカーに対する連鎖分析およびライブラリーとのハイブリダイゼーションスクリーニング）を使用して染色体および染色体の特定の領域にマッピングされ得る。
【０１４３】
ＣＨＥＰＯのコード配列が、別のタンパク質に結合するタンパク質をコードする場合（例えば、ＣＨＥＰＯがレセプターである場合）は、ＣＨＥＰＯは、結合相互作用に関与する他のタンパク質または分子を同定するためのアッセイにおいて使用され得る。このような方法によって、レセプター／リガンド結合相互作用のインヒビターが同定され得る。このような結合相互作用に関与するタンパク質はまた、結合相互作用のペプチドまたは低分子インヒビターまたはアゴニストをスクリーニングするために使用され得る。また、レセプターＣＨＥＰＯは、関連するリガンド（ｃｏｒｒｅｌａｔｉｖｅ ｌｉｇａｎｄ）を単離するために使用され得る。スクリーニングアッセイは、ネイティブなＣＨＥＰＯまたはＣＨＥＰＯのレセプターの生物学的活性を模倣するリード化合物を見出すために設計され得る。このようなスクリーニングアッセイは、化学的なライブラリーの高スループットスクリーニングに敏感に反応するアッセイを含み、これは、それらを低分子薬物候補を同定するために特に適切にする。意図される低分子としては、合成の有機化合物、または無機化合物が挙げられる。アッセイは、タンパク質−タンパク質結合アッセイ、生化学的なスクリーニングアッセイ、イムノアッセイ、および細胞に基づくアッセイを含む種々の形式で行われ得、これらは当該分野で十分に特徴付けられている。
【０１４４】
ＣＨＥＰＯまたはその改変された形態をコードする核酸もまた、トランスジェニック動物または「ノックアウト」動物のいずれかを作製するために使用され得、次いでこれらは、治療的に有用な試薬の開発およびスクリーニングにおいて有用である。トランスジェニック動物（例えば、マウスまたはラット）は、トランスジーンを含む細胞を有する動物である。このトランスジーンは、胎児期に（例えば、胚段階で）動物または動物の先祖に導入された。トランスジーンは、トランスジェニック動物が発生する細胞のゲノム中に組み込まれるＤＮＡである。１つの実施形態においては、ＣＨＥＰＯをコードするｃＤＮＡが、確立された技術に従ってＣＨＥＰＯをコードするゲノムＤＮＡをクローン化するために使用され得、そしてゲノム配列が、ＣＨＥＰＯをコードするＤＮＡを発現する細胞を含むトランスジェニック動物を作製するために使用され得る。トランスジェニック動物（特に、マウスまたはラットのような動物）を作製するための方法は、当該分野で従来技術となっており、そして例えば、米国特許第４，７３６，８６６号および同第４，８７０，００９号に記載されている。代表的には、特定の細胞は、組織特異的エンハンサートを伴うＣＨＥＰＯトランスジーンの取りこみのために標的化される。胚段階で動物の生殖系に導入されたＣＨＥＰＯをコードするトランスジーンのコピーを含むトランスジェニック動物が、ＣＨＥＰＯをコードするＤＮＡの増大された発現の影響を試験するために使用され得る。このような動物は、例えば、その過剰な発現に関連する病理学的状態からの防御を付与すると考えられる試薬についてのテスター動物として使用され得る。本発明のこの局面に従うと、動物が試薬で処置され、そしてトランスジーンを保有していない未処置の動物と比較した病理学的状態の減少した指標は、病理学的状態についての可能性のある治療介入を示す。
【０１４５】
あるいは、ＣＨＥＰＯの非ヒトホモログが、ＣＨＥＰＯ「ノックアウト」動物を構築するために使用され得る。この動物は、ＣＨＥＰＯをコードする内因性の遺伝子と、動物の胚性幹細胞中に導入されたＣＨＥＰＯをコードする改変されたゲノムＤＮＡとの間での相同組換えの結果として、ＣＨＥＰＯをコードする遺伝子を欠損しているか、またはＣＨＥＰＯをコードする遺伝子が改変されている。例えば、ＣＨＥＰＯをコードするｃＤＮＡは、確立された技術に従って、ＣＨＥＰＯをコードするゲノムＤＮＡをクローン化するために使用され得る。ＣＨＥＰＯをコードするゲノムＤＮＡの部分が欠失され得るか、またはそれが、組込みをモニターするために使用され得る選択可能なマーカーをコードする遺伝子のような別の遺伝子で置きかえられ得る。代表的には、数キロベースの改変されていない隣接しているＤＮＡ（５’および３’末端の両方）が、ベクター中に含まれる（例えば、相同組換えベクターの記載については、ＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｃｃｈｉ，Ｃｅｌｌ，５１：５０３（１９８７）を参照のこと）。ベクターが、胚性幹細胞株中に導入され（例えば、エレクトロポレーションによって）、そして導入されたＤＮＡが内因性のＤＮＡと相同組換えされた細胞が、選択される（例えば、Ｌｉら、Ｃｅｌｌ，６９：９１５（１９９２）を参照のこと）。選択された細胞は、次いで、凝集キメラを形成するように動物（例えば、マウスまたはラット）の胎盤胞に注入される（例えば、Ｂｒａｄｌｅｙ、Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編（ＩＲＬ，Ｏｘｆｏｒｄ、１９８７）、１１３−１５２頁を参照のこと）。キメラの胚は、次いで、適切な偽妊娠させた雌性の里親動物に移植され、そして胚は、「ノックアウト」動物を作製する期間を過ごす。相同組換えされたＤＮＡをそれらの生殖細胞中に保有している子孫は、標準的な技術によって同定され得、そしてその動物の全ての細胞が相同組換えされたＤＮＡを含む動物を交配するために使用され得る。ノックアウト動物は、例えば、特定の病理学的状態に対して防御するそれらの能力について、およびＣＨＥＰＯポリペプチドの非存在に起因する病理学的状態のそれらの発症について特徴付けられ得る。
【０１４６】
ＣＨＥＰＯポリペプチドをコードする核酸はまた、遺伝子治療において使用され得る。遺伝子治療適用においては、遺伝子は、治療的に有効な遺伝子産物のインビボでの合成を達成するために、例えば、欠損遺伝子の置換のために、細胞中に導入される。「遺伝子治療」は、従来の遺伝子治療（ここでは、永続的な効果が単一の処置によって達成される）および遺伝子治療剤の投与（これは、治療的に有効なＤＮＡまたはｍＲＮＡの１回または反復投与を含む）の両方を含む。アンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡは、インビボで特定の遺伝子の発現をブロックするための治療剤として使用され得る。短いアンチセンスオリゴヌクレオチドは、それらの低い細胞内濃度が細胞膜によるそれらの制限された取りこみによって生じるにもかかわらず、インヒビターとして作用し得る細胞中に輸送され得る。（Ｚａｍｅｃｎｉｋら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３，４１４３−４１４６（１９８６））。オリゴヌクレオチドは、例えば、それらの負に荷電したホスホジエステル基を荷電していない基で置換することによって、それらの取りこみを増強するように改変され得る。
【０１４７】
生存可能な細胞中に核酸を導入するために利用可能な種々の技術が存在する。これらの技術は、核酸が、意図される宿主の細胞のインビトロでまたはインビボで培養された細胞中に導入されるかどうかに依存して、変化する。インビトロでの哺乳動物細胞への核酸の導入に適切な技術としては、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ−デキストラン、リン酸カルシウム沈殿方法などの使用が挙げられる。現在好ましいインビボでの遺伝子導入技術としては、ウイルス（代表的には、レトロウイルス）ベクターでのトランスフェクションおよびウイルスコートタンパク質−リポソーム媒介性トランスフェクションが挙げられる（Ｄｚａｕら、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １１，２０５−２１０（１９９３））。いくつかの状況においては、核酸の供給源に標的細胞を標的化する薬剤（例えば、細胞表面の膜タンパク質または標的細胞に対して特異的な抗体、標的細胞上のレセプターに対するリガンドなど）を提供することが所望される。リポソームが使用される場合は、エンドサイトーシスに関連する細胞表面の膜タンパク質に結合するタンパク質が、例えば、特定の細胞型について向性である、キャプシドタンパク質またはそのフラグメント、循環している際にインターナライズを受けるタンパク質に対する抗体、細胞内局在化を標的化しそして細胞内半減期を増大するタンパク質中の取りこみを標的化および／または促進するために、使用され得る。レセプターによって媒介されるエンドサイトーシスの技術は、例えば、Ｗｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２，４４２９−４４３２（１９８７）；およびＷａｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７，３４１０−３４１４（１９９０）によって記載されている。遺伝子作製および遺伝子治療プロトコールの概要については、Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６、８０８−８１３（１９９２）を参照のこと。
【０１４８】
本明細書中に記載されているＣＨＥＰＯポリペプチドはまた、タンパク質の電気泳動の目的のための分子量マーカーとしても使用され得る。
【０１４９】
本明細書中に記載されているＣＨＥＰＯポリペプチドまたはそのフラグメントをコードする核酸分子は、染色体の同定に有用である。これに関しては、新規の染色体マーカーを同定する必要性が現在存在している。なぜなら、実際の配列データに基づく比較的小数の染色体マーキング試薬だけが現在利用可能であるからである。本発明のそれぞれのＣＨＥＰＯ核酸分子が、染色体マーカーとして使用され得る。
【０１５０】
本発明のＣＨＥＰＯポリペプチドおよび核酸分子はまた、組織のタイピングに使用され得る。ここでは、本発明のＣＨＥＰＯポリペプチドは、別のものと比較した場合には、１つの組織中で差次的に発現され得る。ＣＨＥＰＯ核酸分子は、ＰＣＲ、ノーザン分析、サザン分析、およびウェスタン分析のためのプローブを作製するための使用を見出される。
【０１５１】
本明細書中に記載されるＣＨＥＰＯポリペプチドはまた、治療剤としても使用され得る。本発明のＣＨＥＰＯポリペプチドは、薬学的に有用な組成物を調製するために公知の方法に従って処方され得る。それにより、そのＣＨＥＰＯ生成物は、薬学的に受容可能なキャリアビヒクルとの混合物中で混合される。治療処方物は、所望の程度の純度を有している有効成分を、最適な生理学的に受容可能なキャリア、賦形剤、または安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、第１６版、Ｏｓｏｌ，Ａ．編（１９８０））と混合することによって、凍結乾燥した形態または水性の溶液の形態で、保存のために調製される。受容可能なキャリア、賦形剤、または安定剤は、使用される投与量および濃度では、レシピエントに対しては非毒性であり、そしてこれらとして以下のものが挙げられる：緩衝液（例えば、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、および他の有機酸の緩衝液）；アスコルビン酸を含む抗酸化剤；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド、タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、またはリジン）；モノサッカライド、ジサッカライド、および他の炭水化物（グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む）；キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）；糖アルコール（例えば、マンニトール、またはソルビトール）；塩形成対イオン（例えば、ナトリウムおよび／または非イオン性境界活性剤（例えば、ＴＷＥＥＮ（登録商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）、またはＰＥＧ）。
【０１５２】
インビボでの投与に使用される処方物は、滅菌でなければならない。これは、凍結乾燥および再構成の前または後の、滅菌の濾過膜を通した濾過によって容易に達成される。
【０１５３】
本明細書中の治療組成物は、一般には、滅菌の通路口を有している容器（例えば、静脈内溶液バッグ、または皮下注射用の注射針によって穴を空けられ得るストッパーを有しているバイアル）中に配置される。
【０１５４】
投与の経路は、例えば、静脈内、腹膜内、大脳内、筋肉内、眼球内、動脈内、または病変内経路による注射または注入、局所的投与、あるいは徐放システムによるような、公知の方法に従う。
【０１５５】
本発明の薬学的組成物の投与量および所望される薬物濃度は、想定される特定の使用されるに依存して変化し得る。投与の適切な投与量または経路の決定は、十分に当業者の技術範囲内である。動物実験は、ヒトの治療に有効な用量の決定のための信頼できる指針を提供する。有効用量の種間のスケーリングが、Ｍｏｒｄｅｎｔｉ，Ｊ．およびＣｈａｐｐｅｌｌ，Ｗ．、「Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｉｎｔｅｒｓｐｅｃｉｅｓ ｓｃａｌｉｎｇ ｉｎ ｔｏｘｉｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ」 Ｔｏｘｉｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｎｅｗ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｙａｃｏｂｉら編、Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９８９、４２−９６頁によって主張された原理に従って行われ得る。
【０１５６】
ＣＨＥＰＯポリペプチドまたはそのアゴニストもしくはアンタゴニストのインビボでの投与が使用される場合は、通常の投与量は、投与の経路に依存して、１日当たり約１０ｎｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇの哺乳動物の体重まで、またはそれ以上で、好ましくは、約１ｇ／ｋｇ／日から１０ｍｇ／ｋｇ／日で変化し得る。送達の特定の投与量および方法についての指針は、以下の文献に提供される。例えば、米国特許第４，６５７，７６０号；同第５，２０６，３４４号；または同第５，２２５，２１２号を参照のこと。種々の処方物が、種々の処置化合物および種々の障害について有効であると予想される。例えば、１つの器官または組織を標的化する投与は、別の器官または組織を標的化する様式とは異なる様式での送達を必然的に伴い得る。
【０１５７】
ＣＨＥＰＯポリペプチドの徐放投与がＣＨＥＰＯポリペプチドの投与を必要としている任意の疾患または障害の処置に適切である放出特性を有する処方物において処方されることが所望される場合は、ＣＨＥＰＯポリペプチドのマイクロカプセル化が意図される。徐放のための組換えタンパク質のマイクロカプセル化は、ヒトの成長ホルモン（ｒｈＧＨ）、インターフェロン（ｒｈＩＦＮ）、インターロイキン−２、およびＭＮｒｇｐ１２０を用いて良好に行われている。Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，２：７９５−７９９（１９９６）；Ｙａｓｕｄａ，Ｂｉｏｍｅｄ．Ｔｈｅｒ．，２７：１２２１−１２２３（１９９３）；Ｈｏｒａら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８：７５５−７５８（１９９０）；Ｃｌｅｌａｎｄ、「Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｉｎｇｌｅ Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｕｓｉｎｇ Ｐｏｌｙｌａｃｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｇｌｙｃｏｌｉｄｅ Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ」、Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ：Ｔｈｅ Ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｐｏｗｅｌｌ ａｎｄ Ｎｅｗｍａｎ編（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９５）、４３９−４６２頁；第ＷＯ９７／０３６９２号、第ＷＯ９６／４００７２号、第ＷＯ９６／０７３９９号；および米国特許第５，６５４，０１０号。
【０１５８】
これらのタンパク質の徐放処方物は、その生体適合性および広範な生体分解特性に起因して、ポリ乳酸−ポリコグリコール酸（ＰＬＧＡ）ポリマーを使用して開発された。ＰＬＧＡ、乳酸、およびグリコール酸の崩壊産物は、ヒトの体から迅速にクリアランスされる。さらに、このポリマーの分解性は、その分子量および組成に依存して、数ヶ月から数年間までで調節され得る。Ｌｅｗｉｓ、「Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ ｂｉｏａｃｔｉｖｅ ａｇｅｎｔｓ ｆｒｏｍ ｌａｃｔｉｄｅ／ｇｌｙｃｏｌｉｄｅ ｐｏｌｙｍｅｒ」、Ｍ．Ｃｈａｓｉｎ ａｎｄ Ｒ．Ｌａｎｇｅｒ（編）、Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ａｓ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９０）、１〜４１頁。
【０１５９】
本発明は、ＣＨＥＰＯポリペプチドを模倣する化合物（アゴニスト）、またはＣＨＥＰＯポリペプチドの影響を妨げる化合物（アンタゴニスト）を同定するための、スクリーニング化合物によるスクリーニング方法を含む。アンタゴニスト薬物の候補についてのスクリーニングアッセイが、本明細書中で同定された遺伝子によってコードされるＣＨＥＰＯポリペプチドに結合するか、またはそれと複合体を形成する化合物、あるいはそうでなければ、他の細胞性タンパク質とコードされるポリペプチドとの相互作用を妨害する化合物を同定するために設計される。このようなスクリーニングアッセイとしては、化学的なライブラリーの高スループットスクリーニングに敏感に反応するアッセイが挙げられる。これによって、それらは、低分子である薬物候補を同定するために特に適切にされる。
【０１６０】
アッセイは、タンパク質−タンパク質結合アッセイ、生化学的なスクリーニングアッセイ、イムノアッセイ、および細胞に基づくアッセイ（これらは、当該分野で十分に特徴付けられている）を含む種々の形式で行われ得る。アンタゴニストについての全てのアッセイは、これらが、薬物候補を本明細書中で同定された核酸分子によってコードされるＣＨＥＰＯポリペプチドと、これらの２つの成分が相互作用させるために十分な条件下でそして十分な時間、接触させることを必要とする点で、共通している。
【０１６１】
結合アッセイにおいては、相互作用は結合であり、そして形成された複合体が反応混合物中で単離され得るかまたは検出され得る。特定の実施形態においては、本明細書中で同定された遺伝子によってコードされるＣＨＥＰＯポリペプチドまたは薬物候補が、固相上（例えばマイクロタイタープレート上）に、共有結合または非共有結合によって固定される。非共有結合は一般には、ＣＨＥＰＯポリペプチドの溶液で固体の表面をコーティングすること、および乾燥させることによって達成される。あるいは、固定化されるＣＨＥＰＯポリペプチドに対して特異的である固定化された抗体（例えば、モノクローナル抗体）が、固体の表面にそれをアンカーする（ａｎｃｈｏｒ）ために使用され得る。このアッセイは、固定化していない成分を添加することによって行われ得る。この成分は、固定化された成分（例えば、アンカーされた成分を含むコーティングされた表面）に対する検出可能な標識によって標識され得る。反応が完了すると、反応していない成分が、例えば、洗浄によって除去され、そして固体の表面上にアンカーされた複合体が検出される。もともと固定化されていない成分が検出可能な標識を保有している場合は、表面上に固定化された標識の検出は、複合体化が生じたことを示す。もともと固定化されていない成分が標識を保有していない場合は、複合体化は、例えば、固定化された複合体に特異的に結合する標識された抗体を使用することによって、検出され得る。
【０１６２】
候補の化合物が、本明細書中で同定される遺伝子によってコードされる特定のＣＨＥＰＯポリペプチドトと相互作用するがそれに結合しない場合は、ＣＨＥＰＯポリペプチドとのその相互作用は、タンパク質−タンパク質相互作用を検出するための周知の方法によってアッセイされ得る。このようなアッセイとしては、伝統的なアプローチ（例えば、架橋、同時免疫沈降、および勾配またはクロマトグラフィーカラムを通じる同時精製）が挙げられる。さらに、タンパク質−タンパク質相互作用は、ＣｈｅｖｒａｙおよびＮａｔｈａｎｓ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：５７８９−５７９３（１９９１）によって開示されているような、Ｆｉｅｌｄｓおよび共同研究者ら（ＦｉｅｌｄｓおよびＳｏｎｇ，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ），３４０：２４５−２４６（１９８９）；Ｃｈｉｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：９５７８−９５８２（１９９１））によって記載されている酵母に基づく遺伝子システムを使用することによってモニターされ得る。多くの転写活性化因子（例えば、酵母のＧＡＬ４）は、以下のような２つの物理的に異なるモジュラードメインから構成される。１つは、ＤＮＡ結合ドメインとして作用し、他方は、転写活性化ドメインとして作用する。上記の刊行物に記載されている酵母の発現システム（一般には、「ツーハイブリッドシステム」と呼ばれる）は、その特性を利用し、そして以下のような２つのハイブリッドタンパク質を使用する。そのうちの１つには、標的タンパク質がＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインに融合され、そして他方は、その中で候補の活性化タンパク質が活性化ドメインに対して融合されている。ＧＡＬ４活性化プロモーターの制御下にあるＧＡＬ１／ｌａｃＺレポーター遺伝子の発現は、タンパク質−タンパク質相互作用を通じるＧＡＬ−４活性の再構成に依存する。相互作用するポリペプチドを含むコロニーが、−ガラクトシダーゼの色素生成性基質を用いて検出される。ツーハイブリッド技術を使用して２つの特異的なタンパク質間でのタンパク質−タンパク質相互作用を同定するための完全なキット（ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ^TM）が、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから市販される。このシステムはまた、特異的なタンパク質の相互作用に関与しているタンパク質ドメインをマップするために、ならびにこれらの相互作用に重要なアミノ酸残基を正確に指摘するためにも拡大され得る。
【０１６３】
本明細書中で同定されたＣＨＥＰＯポリペプチドをコードする遺伝子の、他の細胞内または細胞外成分との相互作用を妨害する化合物が、以下のように試験され得る：通常は、２つの生成物の相互作用および結合を可能にする条件下でそして可能にする時間で、遺伝子産物と細胞内または細胞外成分とを含有する反応混合物が調製される。候補化合物が結合を阻害する能力を試験するために、反応は、試験化合物の非存在下および存在下で行われる。さらに、プラセボが、ポジティブコントロールとして作用するように、第３の反応混合物に添加され得る。試験化合物と、混合物中に存在する細胞内または細胞外成分との間での結合（複合体の形成）は、本明細書中で上記のようにモニターされる。コントロール反応物中での複合体の形成（しかし、試験化合物を含有する反応混合物中には存在しない）は、試験化合物が、試験化合物とその反応パートナーとの相互作用を妨害することを示す。
【０１６４】
アンタゴニストについてのアッセイのために、ＣＨＥＰＯポリペプチドがＣＨＥＰＯポリペプチドの存在下で目的の活性を阻害する（このことは、化合物がＣＨＥＰＯポリペプチドのアンタゴニストであることを示す）化合物の特定の活性および能力をスクリーニングするために、化合物とともに細胞に添加され得る。あるいは、アンタゴニストは、競合阻害アッセイに適切な条件下で、膜に結合したＣＨＥＰＯポリペプチドレセプターまたは組換えのレセプターと、ＣＨＥＰＯポリペプチドおよび可能性のあるアンタゴニストとを混合することによって、検出され得る。ＣＨＥＰＯポリペプチドは、例えば、放射活性によって標識され得、その結果、レセプターに結合したＣＨＥＰＯポリペプチド分子の数が、可能性のあるアンタゴニストの有効性を決定するために使用され得る。レセプターをコードする遺伝子は、当業者に公知の多数の方法（例えば、リガンドパンニングおよびＦＡＣＳソーティング）によって同定され得る。Ｃｏｌｉｇａｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎ．，１（２）：Ｃｈａｐｔｅｒ ５（１９９１）。好ましくは、発現クローニングが使用される。ここでは、ポリアデニル化されたＲＮＡが、ＣＨＥＰＯポリペプチドに応答する細胞から調製され、そしてこのＲＮＡから作製されたｃＤＮＡライブラリーがプールに分けられ、そしてＣＯＳ細胞またはＣＨＥＰＯポリペプチドに応答しない他の細胞をトランスフェクトするために使用される。ガラススライド上で増殖させられたトランスフェクトされた細胞は、標識されたＣＨＥＰＯポリペプチドに対して暴露される。ＣＨＥＰＯポリペプチドは、部位特異的タンパク質キナーゼの認識部位のヨウ素化または封入を含む種々の手段によって標識され得る。固定およびインキュベーション後、スライドは、オートラジオグラム分析に供される。ポジティブなプールが同定され、そしてサブプールが調製され、そして相互作用するサブプールを使用して再度トランスフェクトされ、そして再度スクリーニングされ、最終的に推定のレセプターをコードする単一のクローンが得られる。
【０１６５】
レセプターの同定のための別のアプローチとして、標識されたＣＨＥＰＯポリペプチドは、レセプター分子を発現する細胞膜または抽出調製物と光親和的に架橋され得る。架橋された材料は、ＰＡＧＥによって解析され、そしてＸ線フィルムに曝される。レセプターを含む標識された複合体が切り出され得、ペプチドフラグメントに分割され得、そしてタンパク質の微小配列決定に供され得る。微小配列決定によって得られたアミノ酸配列を使用して、縮重オリゴヌクレオチドプローブのセットを設計し、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングして、推定のレセプターをコードする遺伝子を同定する。
【０１６６】
アンタゴニストについての別のアッセイにおいては、レセプターを発現する哺乳動物細胞または膜調製物が、候補化合物の存在下で、標識されたＣＨＥＰＯポリペプチドとともにインキュベートされる。次いで、化合物がこの相互作用を増強するかまたはブロックする能力が、測定され得る。
【０１６７】
可能性のあるアンタゴニストのより特異的な例としては、ＣＨＥＰＯポリペプチドとの免疫グロブリンの融合体に結合するオリゴヌクレオチド、そして詳細には、抗体（限定的ではないが、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、ならびに抗体フラグメント、単鎖抗体、抗イディオタイプ抗体、ならびにそのような抗体またはフラグメントのキメラまたはヒト化バージョン、ならびにヒトの抗体および抗体フラグメントを含む）が挙げられる。あるいは、可能性のあるアンタゴニストは、密接に関連するタンパク質（例えば、レセプターを認識するが、影響は与えない、ＣＨＥＰＯポリペプチドの変異した形態）であり得、それによってＣＨＥＰＯポリペプチドの作用を競合的に阻害し得る。
【０１６８】
別の可能性のあるＣＨＥＰＯポリペプチドアンタゴニストは、アンチセンス技術を使用して調製されたアンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡ構築物である。ここでは、例えば、アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡ分子は、標的化されたｍＲＮＡに対してハイブリダイズすること、およびタンパク質の翻訳を妨げることによって、ｍＲＮＡの翻訳を直接ブロックするように作用する。アンチセンス技術は、３重へリックスの形成、またはアンチセンスＤＮＡもしくはＲＮＡを通じて遺伝子発現を制御するために使用され得る。これらの方法の両方ともが、ＤＮＡまたはＲＮＡに対するポリペプチドの結合に基づく。例えば、本明細書中の成熟ＣＨＥＰＯポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の５’コード部分が、約１０から４０塩基対の長さのアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計するために使用される。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に関与している遺伝子の領域に対して相補的であるように設計され（３重へリックス−Ｌｅｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，６：３０７３（１９７９）；Ｃｏｏｎｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４１：４５６（１９８８）；Ｄｅｒｖａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１：１３６０（１９９１））、それによってＣＨＥＰＯポリペプチドの転写および産生を妨げる。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡに対してインビボでハイブリダイズし、そしてＣＨＥＰＯポリペプチドへのｍＲＮＡ分子の翻訳をブロックする（アンチセンス−Ｏｋａｎｏ，Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，５６：５６０（１９９１）；Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ：Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，１９８８）。上記のオリゴヌクレオチドは、細胞に送達され得、その結果、アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡが、ＣＨＥＰポリペプチドの産生を阻害するようにインビボで発現され得る。アンチセンスＤＮＡが使用される場合は、翻訳開始部位に由来するオリゴデオキシヌクレオチド（例えば、標的遺伝子ヌクレオチド配列の約−１０位と＋１０位の間）が、好ましい。
【０１６９】
可能性のあるアンタゴニストとしては、活性化部位、レセプター結合部位、または増殖因子、あるいはＣＨＥＰＯポリペプチドの他の関連する結合部位に結合し、それによってＣＨＥＰＯポリペプチドの正常な生物学的活性をブロックする低分子が挙げられる。低分子の例としては、小さいペプチドまたはペプチド様分子（好ましくは、可溶性のペプチド、および合成の非ペプチジル有機化合物または無機化合物）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７０】
リボザイムは、ＲＮＡの特異的な切断を触媒し得る酵素性のＲＮＡ分子である。リボザイムは、相補性の標的ＲＮＡに対する配列特異的なハイブリダイゼーション、続く内部核酸溶解性の切断によって作用する。可能性のあるＲＮＡ標的中の特異的なリボザイム切断部位は、公知の技術によって同定され得る。さらなる詳細については、Ｒｏｓｓｉ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４：４６９−４７１（１９９４）、およびＰＣＴ国際公開番号第ＷＯ９７／３３５５１号（１９９７年９月１８日に公開された）を参照のこと。
【０１７１】
転写を阻害するために使用される三重へリックス形成における核酸分子は、一本鎖であり、そしてデオキシヌクレオチドから構成されるはずである。これらのオリゴヌクレオチドの塩基の組成は、それがＨｏｏｇｓｔｅｅｎ塩基対合の法則を通じて三重ヘリックスの形成を促進するように設計される。これらは、一般には、二本鎖の一方の鎖上のプリンまたはピリミジンのかなり大きいストレッチを必要とする。さらなる詳細については、例えば、ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９７／３３５５１号（前出）を参照のこと。
【０１７２】
これらの低分子は、本明細書中で上記に議論されている任意の１つ以上のスクリーニングアッセイ、および／または当業者に周知の任意の他のスクリーニング技術によって同定され得る。
【０１７３】
（Ｆ．抗ＣＨＥＰＯ抗体）
本発明はさらに、抗ＣＨＥＰＯ抗体を提供する。例示的な抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、二重特異的抗体、および異種結合体抗体が挙げられる。
【０１７４】
（１．ポリクローナル抗体）
抗ＣＨＥＰＯ抗体は、ポリクローナル抗体を含み得る。ポリクローナル抗体を調製する方法は、当業者に公知である。ポリクローナル抗体は、哺乳動物中で、例えば、免疫薬剤および所望される場合には、アジュバントの１回以上の注射によって惹起され得る。代表的には、免疫薬剤および／またはアジュバントは、複数回の皮下または腹腔内注射によって哺乳動物に注射される。免疫薬剤は、ＣＨＥＰＯポリペプチドまたはその融合タンパク質を含み得る。免疫される哺乳動物中で免疫原性であることが公知のタンパク質に対して免疫薬剤を結合させることが有用であり得る。このような免疫原性タンパク質の例としては、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、およびダイズトリプシンインヒビターが挙げられるが、これらに限定されない。使用され得るアジュバントの例としては、フロイトの完全なアジュバント、およびＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（モノホスホリル脂質Ａ、合成のトレハロースジコリノミコレート（ｄｉｃｏｒｙｎｏｍｙｃｏｌａｔｅ））が挙げられる。免疫プロトコールは、過度の実験を行うことなく、当業者によって選択され得る。
【０１７５】
（２．モノクローナル抗体）
抗ＣＨＥＰＯ抗体は、あるいは、モノクローナル抗体であり得る。モノクローナル抗体は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）によって記載されているような、ハイブリドーマ方法を使用して調製され得る。ハイブリドーマ方法においては、マウス、ハムスター、または他の適切な宿主動物が、代表的には、抗体を産生するかまたは抗体を産生し得るリンパ球を誘発する免疫薬剤で免疫される。これらは、免疫薬剤に対して特異的に結合する。あるいは、リンパ球は、インビトロで免疫され得る。
【０１７６】
免疫薬剤は、代表的には、ＣＨＥＰＯポリペプチドまたはその融合タンパク質を含む。一般には、末梢血リンパ球（「ＰＢＬ」）が、ヒト起源の細胞が所望される場合には使用されるか、または脾臓細胞もしくはリンパ節細胞が、非ヒト哺乳動物供給源が所望される場合には使用されるかのいずれかである。次いで、リンパ球は、適切な融合剤（例えば、ハイブリドーマ細胞を形成するためのポリエチレングリコール）を使用して、不死化細胞株と融合される（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）、５９−１０３頁）。不死化細胞株は、通常は、形質転換された哺乳動物細胞であり、特に、げっ歯類、ウシ、およびヒト起源の骨髄腫細胞である。通常は、ラットまたはマウスの骨髄腫細胞株が使用される。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは、融合されていない不死化細胞の増殖または生存を阻害する１つ以上の物質を含有する、適切な培養培地中で培養され得る。例えば、親細胞が、酵素であるヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠失している場合は、ハイブリドーマのための培養培地は、代表的には、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含む（「ＨＡＴ培地」）。これらの物質は、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を妨げる。
【０１７７】
好ましい不死化細胞株は、効率よく融合し、選択された抗体を産生する細胞による抗体の安定な高レベルの発現を支持する細胞株であり、そしてこれらは、ＨＡＴ培地のような培地に対して敏感である。より好ましい不死化細胞株は、マウスの骨髄腫株である。これらは、例えば、Ｓａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ およびアメリカンタイプカルチャーコレクション、Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａから入手することができる。ヒトの骨髄腫およびマウス−ヒトのヘテロ骨髄腫細胞株もまた、ヒトのモノクローナル抗体の産生について記載されている（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９８７）、５１−６３頁）。
【０１７８】
ハイブリドーマ細胞が培養される培養培地は、次いで、ＣＨＥＰＯに対して指向されたモノクローナル抗体の存在についてアッセイされ得る。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生されたモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降によって、またはインビトロでの結合アッセイ（例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）もしくは酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって決定される。このような技術およびアッセイは、当該分野で公知である。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、ＭｕｎｓｏｎおよびＰｏｌｌａｒｄ，Ａｎａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０７：２２０（１９８０）のＳｃａｔｃｈａｒｄ分析によって決定され得る。
【０１７９】
所望されるハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンは、限界稀釈手順によってサブクローン化され得、そして標準的な方法によって増殖させられ得る（Ｇｏｄｉｎｇ、前出）。この目的についての適切な培養培地としては、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地およびＲＰＭＩ−１６４０培地が挙げられる。あるいは、ハイブリドーマ細胞は、哺乳動物中で腹水としてインビボで増殖され得る。
【０１８０】
サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、培養培地から単離または精製され得るか、あるいは例えば、プロテインＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ，ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーのような、従来の免疫グロブリン精製手順によって腹水液から単離または精製され得る。
【０１８１】
モノクローナル抗体はまた、米国特許第４，８１６，５６７号に記載されているような組換えＤＮＡ方法によって作製され得る。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来手順を使用して容易に単離されそして配列決定され得る（例えば、マウスの抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に対して特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）。本発明のハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源として作用する。一旦単離されると、ＤＮＡは、発現ベクター中に配置され得、これは次いで、サルのＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞（これらはそうでなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しない）のような宿主細胞中に、組換え宿主細胞中でモノクローナル抗体の合成を得るために、トランスフェクトされる。ＤＮＡはまた、例えば、相同なマウスの配列の代わりに、ヒトの重鎖および軽鎖の定常ドメインのコード配列で置きかえることによって（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、前出）、あるいは、非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全てまたは一部を、免疫グロブリンのコード配列に対して共有的に連結することによって、改変され得る。このような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインで置換され得るか、またはキメラの二価抗体を作製するために、本発明の抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインで置換され得る。
【０１８２】
抗体は、一価の抗体であり得る。一価の抗体を調製するための方法は、当該分野で周知である。例えば、１つの方法としては、免疫グロブリン軽鎖および改変された重鎖の組換え発現が挙げられる。重鎖は、一般には、重鎖の架橋を防ぐために、Ｆｃ領域中の任意の点で短縮される。あるいは、関連するシステイン残基が、別のアミノ酸残基で置換されるか、または架橋を防ぐように欠失させられる。
【０１８３】
インビトロでの方法もまた、一価の抗体を調製するために適切である。そのフラグメント（特に、Ｆａｂフラグメント）を産生するための抗体の設計は、当該分野で公知の慣用的な技術を使用して達成され得る。
【０１８４】
（３．ヒト抗体およびヒト化抗体）
本発明の抗ＣＨＥＰＯ抗体はさらに、ヒト化抗体またはヒト抗体を含み得る。非ヒト（例えば、マウス）抗体のヒト化形態は、キメラの免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、またはそれらのフラグメント（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）₂、または抗体の他の抗原結合サブ配列）である。これらは、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小の配列を含む。ヒト化抗体としては、ヒトの免疫グロブリン（レシピエント抗体）（その中で残基が、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）を形成する）が、所望される特異性、親和性、および能力を有している非ヒト種（例えば、マウス、ラット、またはウサギ）のＣＤＲ（ドナー抗体）に由来する残基で置換される。いくつかの例においては、ヒトの免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置き換えられる。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体、および導入されたＣＤＲまたはフレームワーク配列中のいずれにも見出されない残基を含み得る。一般には、ヒト化抗体は、少なくとも１つの、そして代表的には２つの可変ドメインを実質的に全て含む。ここでは、非ヒト免疫グロブリンのものに対応する全てのまたは実質的に全てのＣＤＲ領域、およびＦＲ領域の全てまたは実質的に全てが、ヒト免疫グロブリンのコンセンサス配列のものである。ヒト化抗体はまた、最適には、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、代表的には、ヒト免疫グロブリンの少なくとも一部を含む（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２９（１９８８）；およびＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：５９３−５９６（１９９２））。
【０１８５】
非ヒト抗体をヒト化するための方法は、当該分野で周知である。一般には、ヒト化抗体は、非ヒト供給源に由来するそれに導入された１つ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、「輸入」残基と呼ばれる。これらは代表的には、「輸入」可変ドメインから得られる。ヒト化は、本質的には、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者らの方法に従って、ヒト抗体の対応する配列でげっ歯類のＣＤＲ配列を置換することによって、行われ得る（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６（１９８８））。従って、このような「ヒト化」抗体は、キメラ抗体である（米国特許第４，８１６，５６７号）。ここでは、実質的に完全ではないヒトの可変ドメインが、非ヒト種に由来する対応する配列によって置換されている。実際、ヒト化抗体は、代表的には、その中のいくつかのＣＤＲ残基および可能性のあるいくつかのＦＲ残基が、げっ歯類の抗体中の同様の部位に由来する残基によって置換されているヒト抗体である。
【０１８６】
ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリーを含む、当該分野で公知の種々の技術を使用して産生され得る（ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍおよびＷｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１（１９９１））。ＣｏｌｅらおよびＢｏｅｒｎｅｒらの技術もまた、ヒトのモノクローナル抗体の調製のために利用可能である（Ｃｏｌｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ、７７頁（１９８５）およびＢｏｅｒｎｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７（１）：８６−９５（１９９１））。同様に、ヒト抗体は、トランスジェニック動物（例えば、内因性の免疫グロブリン遺伝子が部分的または完全に不活化されているマウス）にヒトの免疫グロブリン遺伝子座を導入することによって、作製され得る。チャレンジの際には、ヒト抗体の産生が観察され、これは、遺伝子の再配置、アセンブリ、および抗体のレパートリーを含む全ての点においてヒトで見られるものに非常に類似している。このアプローチは、例えば、米国特許第５，５４５，８０７号；同第５，５４５，８０６号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，６６１，０１６号、および以下の科学文献に記載されている：Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０，７７９−７８３（１９９２）；Ｌｏｎｂｅｒｇら、Ｎａｔｕｒｅ ３６８、８５６−８５９（１９９４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ ３６８，８１２−８１３（１９９４）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４，８４５−５１（１９９６）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４，８２６（１９９６）；ＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３（１９９５）。
【０１８７】
（４．二重特異的抗体）
二重特異的抗体は、モノクローナル抗体（好ましくは、ヒト抗体またはヒト化抗体）である。これは、少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有する。この場合においては、１つの結合特異性は、ＣＨＥＰＯに対してであり、他方は、任意の他の抗原に対して、そして好ましくは、細胞表面タンパク質またはレセプターまたはレセプターサブユニットに対してである。
【０１８８】
二重特異的抗体を作製するための方法は、当該分野で公知である。伝統的には、二重特異的抗体の組換え産生は、２つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の同時発現に基づく。ここでは、２つの重鎖は異なる特異性を有する（ＭｉｌｓｔｅｉｎおよびＣｕｅｌｌｏ、Ｎａｔｕｒｅ，３０５：５３７−５３９（１９８３））。免疫グロブリン重鎖および軽鎖のランダムな組合せに起因して、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は、１０個の異なる抗体分子の可能性のある混合物を生じる。これらのうちの１つだけが、正確な二重特異的構造を有する。正確な分子の精製は、通常は、アフィニティークロマトグラフィー工程によって達成される。同様の手順が、１９９３年５月１３日に公開された第ＷＯ９３／０８８２９号、およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら、ＥＭＢＯ Ｊ．，１０：３６５５−３６５９（１９９１）に開示されている。
【０１８９】
所望される結合特異性を有する抗体の可変ドメイン（抗体−抗原結合部位）は、免疫グロブリンの定常ドメイン配列に対して融合され得る。融合体は、好ましくは、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３領域の少なくとも一部を含む、免疫グロブリン重鎖の定常ドメインを有する。融合体の少なくとも１つの中に存在している軽鎖の結合に必要な部位を含む第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）を有することが、好ましい。免疫グロブリン重鎖融合体（および、所望される場合には、免疫グロブリン軽鎖）をコードするＤＮＡは、別の発現ベクター中に挿入され、そして適切な宿主生物体中に同時トランスフェクトされる。二重特異的抗体の生成のさらなる詳細については、例えば、Ｓｕｒｅｓｈら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１２１：２１０（１９８６）を参照のこと。
【０１９０】
第ＷＯ９６／２７０１１号に記載されている別のアプローチに従うと、抗体分子の対の間の境界は、組換え細胞培養物から回収されるヘテロ二量体の割合を最大にするように操作され得る。好ましい境界は、抗体の定常ドメインのＣＨ３領域の少なくとも一部を含む。この方法においては、第１の抗体分子の境界に由来する１つ以上の小さいアミノ酸側鎖が、より大きな側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）で置換される。大きな側鎖と同一であるかまたはそれと同様の大きさを補う孔が、より小さい側鎖（例えば、アラニンまたはスレオニン）でより大きなアミノ酸側鎖を置換することによって、第２の抗体分子の境界上に作製される。これによって、ホモ二量体のような、他の所望されない最終生成物を上回るヘテロニ量体の収量を増大させるための機構を提供する。
【０１９１】
二重特異的抗体は、全長の抗体または抗体フラグメント（例えば、Ｆ（ａｂ）₂二重特異的抗体）として調製され得る。抗体フラグメントから二重特異的抗体を生成するための技術は、文献に記載されている。例えば、二重特異的抗体は、化学的な連結を使用して調製され得る。Ｂｒｅｎｎａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：８１（１９８５）は、インタクトな抗体がタンパク質分解によって切断されてＦ（ａｂ）₂フラグメントを生じる手順を記載する。これらのフラグメントは、近隣のジチオールを安定化させ、そして分子内ジスルフィド形成を防ぐために、ジチオールを複合体化する薬剤である亜ヒ酸ナトリウムの存在化で還元される。生成されたＦａｂフラグメントは、次いで、チオニトロベンゾエート（ＴＮＢ）誘導体に転換される。Ｆａｂ−ＴＮＢ誘導体の１つが、次いで、メルカプトエチルアミンでの還元によってＦａｂ−チオールに再転換され、そして二重特異的抗体を形成するように等量の他のＦａｂ−ＴＮＢ誘導体と混合される。産生された二重特異的抗体は、酵素の選択的な固定化のための薬剤として使用され得る。
【０１９２】
Ｆａｂフラグメントは、Ｅ．ｃｏｌｉから直接回収され得、そして二重特異的抗体を形成するように化学的にカップリングされ得る。Ｓｈａｌａｂｙら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５：２１７−２２５（１９９２）は、完全にヒト化された二重特異的抗体Ｆ（ａｂ）₂分子の産生を記載している。それぞれのＦａｂフラグメントは、Ｅ．ｃｏｌｉから別々に分泌され、そして二重特異的抗体を形成するようにインビトロでの直接的な化学的なカップリングに供される。このように形成された二重特異的抗体は、ＥｒｂＢ２レセプターを過剰に発現する細胞および正常なヒトのＴ細胞に対して結合し得、そしてヒトの乳房腫瘍細胞標的に対してヒトの細胞傷害性のリンパ球の溶解活性を誘発する。
【０１９３】
組換え細胞培養物から直接二重特異的抗体フラグメントを作製しそして単離するための種々の技術もまた、記載されている。例えば、二重特異的抗体は、ロイシンジッパーを使用して産生されている。Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８（５）：１５４７−１５５３（１９９２）。ＦｏｓおよびＪｕｎタンパク質に由来するロイシンジッパーペプチドは、遺伝子融合によって、２つの異なる抗体のＦａｂ部分に対して連結された。抗体のホモ二量体は、ヒンジ領域で還元されて単量体を形成し、そして次いで、抗体のヘテロニ量体を形成するように再度酸化された。この方法はまた、抗体ホモ二量体の産生のためにも利用され得る。Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４−６４４８（１９９３）によって記載されているダイアボディー技術は、二重特異的抗体フラグメントを作製するための別の機構を提供する。フラグメントは、同じ鎖上の２つのドメイン間での対合を可能にするには短すぎるリンカーによって軽鎖可変ドメイン（Ｖ_L）に連結された重鎖可変ドメイン（Ｖ_H）を含む。従って、１つのフラグメントのＶ_HおよびＶ_Lドメインが、別のフラグメントの相補的なＶ_LおよびＶ_Hドメインと対合し、それによって２つの抗原結合部位を形成するするように仕向けられる。単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体の使用により二重特異的抗体を作製するための別のストラテジーもまた、報告されている。Ｇｒｕｂｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５３６８（１９９４）。
【０１９４】
２つを超える結合価を有する抗体が意図される。例えば、三重特異的抗体が調製され得る。Ｔｕｔｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）。
【０１９５】
例示的な二重特異的抗体は、本明細書中の所定のＣＨＥＰＯポリペプチド上の２つの異なるエピトープに結合し得る。あるいは、抗ＣＨＥＰＯポリペプチドアームが、Ｔ細胞レセプター分子（例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ２８、またはＢ７）、またはＩｇＧのＦｃレセプター（Ｆｃ Ｒ）（例えば、ＦｃＲＩ（ＣＤ６４）、Ｆｃ ＲＩＩ（ＣＤ３２）、およびＦｃ ＲＩＩＩ（ＣＤ１６）のような、白血球上の分子を誘発するように結合するアームと結合され得る。その結果、細胞は、特定のＣＨＥＰＯポリペプチドを発現する細胞に対する細胞性の防御機構に対して集中されられる。二重特異的抗体はまた、特定のＣＨＥＰＯポリペプチドを発現する細胞に対して細胞傷害性薬剤を局在化させるために使用され得る。これらの抗体は、ＣＨＥＰＯ結合アーム、およびＥＯＴＵＢＥ、ＤＰＴＡ、ＤＯＴＡ、またはＴＥＴＡのような細胞傷害性薬剤または放射性核種キレーターに結合するアームを保有する。目的の別の二重特異的的抗体は、ＣＨＥＰＯポリペプチドに結合し、そしてさらに組織因子（ＴＦ）に結合する。
【０１９６】
（５．ヘテロ結合体抗体）
ヘテロ結合体抗体もまた、本発明の範囲内である。ヘテロ結合体抗体は、２つの共有的に連結された抗体から構成される。このような抗体は、例えば、所望されない細胞に対して免疫システムの細胞を標的化するため（米国特許第４，６７６，９８０号）、そしてＨＩＶ感染の処置のため（第ＷＯ９１／００３６０号；同第ＷＯ９２／２００３７３号；第ＥＰ ０３０８９号）に提案されている。抗体が、架橋剤を含む方法を含む、合成タンパク質化学における公知の方法を使用してインビトロで調製され得ることが意図される。例えば、免疫毒素は、ジスルフィド交換反応を使用して、またはチオエーテル結合を形成することによって、構築され得る。この目的のための適切な試薬の例としては、イミノチオレートおよびメチル−４−メルカプトブチルイミデート、ならびに、例えば、米国特許第４，６７６，９８０号に開示されている試薬が挙げられる。
【０１９７】
（６．エフェクター機能の操作）
例えば、ガンの処置における抗体の有効性を増強するために、エフェクター機能に関して本発明の抗体を改変することが所望され得る。例えば、システイン残基が、Ｆｃ領域に導入され得、それによってこの領域中での鎖間ジスルフィド結合形成を可能にする。このように生成されたホモ二量体抗体は、改善されたインターナライゼーション能力、ならびに／または増大させられた補体によって媒介された細胞殺傷、および抗体依存性の細胞性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を有し得る。Ｃａｒｏｎら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：１１９１−１１９５（１９９２）およびＳｈｏｐｅｓ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：２９１８−２９２２（１９９５２）を参照のこと。増強された抗腫瘍活性を有するホモ二量体抗体もまた、Ｗｏｌｆｆら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５３：２５６０−２５６５（１９９３）に記載されているようなヘテロ二官能性の架橋リンカーを使用して調製され得る。あるいは、二重のＦｃ領域を有し、そしてそれによって増強された補体溶解およびＡＤＣＣ能力を有し得る抗体が、操作され得る。Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎら、Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ，３：２１９−２３０（１９８９）を参照のこと。
【０１９８】
（７．免疫結合体）
本発明はまた、化学療法剤、毒素（例えば、酵素的に活性である、細菌、真菌、植物、または動物起源の毒素、あるいはそれらのフラグメント）あるいは放射活性な同位元素（例えば、放射活性結合体）のような細胞傷害性の薬剤に対して結合体化した抗体を含む、免疫結合体に関する。
【０１９９】
このような免疫結合体の生成に有用な化学療法剤が、上記に記載されている。使用され得る酵素的に活性な毒素およびそれらのフラグメントとしては、以下が挙げられる：ジフテリアのＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性フラグメント、エキソトキシンＡ鎖（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシン（ｍｏｄｅｃｉｎ）Ａ鎖、α−サリシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉタンパク質、ジアンチン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａインヒビター、カルシン（ｃａｒｃｉｎ）、クロチン（ｃｒｏｔｉｎ）、ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓインヒビター、ゲロニン、ミトギリン（ｍｉｔｏｇｅｌｉｎ）、レストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）、エノマイシン（ｅｎｏｍｙｃｉｎ）、およびトリコセシン（ｔｒｉｃｏｔｈｅｃｅｎｅ）。種々の放射性核種が、放射活性を結合された抗体の産生に利用可能である。例としては²¹²Ｂｉ、¹³¹Ｉ、¹³¹Ｉｎ、⁹⁰Ｙ、および¹⁸⁶Ｒｅが挙げられる。
【０２００】
抗体と細胞傷害性薬剤との結合体は、種々の二官能性タンパク質カップリング剤（例えば、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えば、ジメチルアジピミデート（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｄｉｐｉｍｉｄａｔｅ）（ＨＣＬ））、活性なエステル（例えば、ジスクリンイミジルスベレート）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ビス−アジド化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トルエン２，６−ジイソシアネート）、およびビス活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン））を使用して作製される。例えば、リシン免疫毒素は、Ｖｉｔｅｔｔａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３８：１０９８（１９８７）に記載されているように調製され得る。炭素−１４−標識１−イソチオシアネートベンジル−３−メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）が、抗体に対する放射性核種の結合のための例示的なキレート剤である。第ＷＯ９４／１１０２６号を参照のこと。
【０２０１】
別の実施形態においては、抗体は、腫瘍の予備標的化における利用のための「レセプター」（例えば、ストレプトアビジン）に対して結合され得る。ここでは、抗体−レセプター結合体が患者に対して投与され、続いて、キレート剤を使用して循環から結合していない結合体が除去され、次いで、細胞傷害性薬剤（例えば、放射性核種）に対して結合させられた「リガンド」（例えば、アビジン）の投与が行われる。
【０２０２】
（８．免疫リポソーム）
本明細書中に開示されている抗体はまた、免疫リポソームとして処方され得る。抗体を含有するリポソームが、Ｅｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：３６８８（１９８５）；Ｈｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４０３０（１０９８）；ならびに米国特許第４，４８５，０４５号、および同第４，５４４，５４５号に記載されているように、当該分野で公知の方法によって調製される。循環時間が増強されたリポソームが、米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。
【０２０３】
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール、およびＰＥＧで誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含有する脂質組成物を用いて、逆相蒸発方法によって生成され得る。リポソームは、所望される直径を有するリポソームを得るために、規定された孔の大きさのフィルターを通じて押し出される。本発明の抗体のＦａｂ’フラグメントは、Ｍａｒｔｉｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５７：２８６−２８８（１９８２）に記載されているように、ジスルフィド鎖間反応を通じてリポソームに対して結合体化され得る。化学療法剤（例えば、ドキソルビシン）が、必要に応じて、リポソーム中に含まれる。Ｇａｂｉｚｏｎら、Ｊ．Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．，８１（１９）：１４８４（１９８９）を参照のこと。
【０２０４】
（９．抗体の薬学的組成物）
本明細書中で同定されたＣＨＥＰＯポリペプチドに特異的に結合する抗体、ならびに本明細書中で上記で開示されるスクリーニングアッセイによって同定された他の分子が、薬学的組成物の形態で種々の障害の処置のために投与され得る。
【０２０５】
ＣＨＥＰＯポリペプチドが細胞内にあり、そして抗体全体がインヒビターとして使用される場合は、インターナライズ抗体は好ましい。しかし、リポフェクションまたはリポソームもまた、細胞中に抗体または抗体フラグメントを送達するために使用され得る。抗体フラグメントが使用される場合は、標的タンパク質の結合ドメインに特異的に結合する最も小さい阻害性フラグメントが好ましい。例えば、抗体の可変領域の配列に基づいて、標的タンパク質配列に結合する能力を保持しているペプチド分子が設計され得る。このようなペプチドは、化学的に合成され得、および／または組換えＤＮＡ技術によって産生され得る。例えば、Ｍａｒａｓｃｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：７８８９−７８９３（１９９３）を参照のこと。本明細書中の処方物もまた、処置される特定の指標に必要である場合、１つを超える活性な化合物（好ましくは、互いに有害な影響を与えない相補活性を有する化合物）を含み得る。あるいは、またはさらに、組成物は、その機能を増強する薬剤（例えば、細胞傷害性薬剤、サイトカイン、化学療法剤、または増殖阻害因子）を含み得る。このような分子は、意図される目的のために有効である量で組合せられて、適切に存在する。
【０２０６】
有効成分はまた、例えば、コアセルベーション技術によって、または境界の重合（例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロース、またはゼラチンマイクロカプセル、およびポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル）によって調製されたマイクロカプセル中に、コロイド状薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセル）中に、またはマイクロエマルジョン中に捕捉され得る。このような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、前出に開示されている。
【０２０７】
インビボでの投与に使用される処方物は、滅菌でなければならない。これは、滅菌の濾過膜を通じた濾過によって容易に達成される。
【０２０８】
徐放調製物が調製され得る。徐放調製物の適切な例としては、抗体を含む固体の疎水性ポリマーの半透性のマトリックスが挙げられる。このマトリクスは、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルのような、成形された物の形態である。徐放マトリックスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸およびエチル−Ｌ−グルタミン酸のコポリマー、非分解性のエチレンビニルアセテート、分解性の乳酸−グリコール酸コポリマー（例えば、ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴ（登録商標））（乳酸−グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプロリドから構成される注射可能なマイクロスフェア）、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。エチレン−ビニルアセテートおよび乳酸−グリコール酸のようなポリマーは、１００日を越えて分子を放出することが可能であるが、特定のヒドロゲルは、より短い期間の間タンパク質を放出する。カプセル化された抗体が長期間の間体内に留まる場合は、これらは、３７℃で水分に対する暴露の結果として、変性し得るかまたは凝集し得、それによって生物学的活性の欠失および免疫原性における可能性のある変化を生じる。合理的なスラテジーが、関与する機構に依存して安定化のために考案され得る。凝集機構が例えば、チオ−ジスルフィド交換を通じた分子内Ｓ−Ｓ結合の形成であると発見される場合は、安定化は、スルフヒドリル残基を改変すること、酸性の溶液から凍結乾燥させること、水分含有量を制御すること、適切な添加剤を使用すること、および特異的なポリマーマトリックス組成物を開発することによって達成され得る。
【０２０９】
（Ｇ．抗ＣＨＥＰＯ抗体の使用）
本発明の抗ＣＨＥＰＯ抗体は、種々の有用性を有する。例えば、抗ＣＨＥＰＯ抗体は、ＣＨＥＰＯの診断アッセイ（例えば、特定の細胞、組織、または血清中でのその発現を検出すること）において使用され得る。当該分野で公知の種々の診断アッセイ技術（例えば、競合結合アッセイ、直接または間接的なサンドイッチアッセイ、および不均質な相または均質な相のいずれかの中で行われる免疫沈降アッセイ）が使用され得る。（Ｚｏｌａ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（１９８７）、１４７−１５８頁）。診断アッセイにおいて使用される抗体は、検出可能な部分を用いて標識され得る。検出可能な部分は、直接または間接的に、検出可能なシグナルを産生し得るはずである。例えば、検出可能な部分は、放射性同位体（例えば、³Ｈ、¹⁴Ｃ、³²Ｐ、³⁵Ｓ、または¹²⁵Ｉ）、蛍光、または化学発光化合物（例えば、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、またはルシフェリン）、あるいは酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、または西洋ワサビペルオキシダーゼ）であり得る。検出可能な部分に対して抗体を結合体化するための当該分野で公知の任意の方法が使用され得る。これらとしては、Ｈｕｎｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，１４４：９４５（１９６２）；Ｄａｖｉｄら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１３：１０１４（１９７４）；Ｐａｉｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，４０：２１９（１９８１）；およびＮｙｇｒｅｎ，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．ａｎｄ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．，３０：４０７（１９８２）によって記載されている方法が挙げられる。
【０２１０】
抗ＣＨＥＰＯ抗体はまた、組換え細胞培養物または天然の供給源からのＣＨＥＰＯのアフィニティー精製のために有用である。このプロセスにおいては、ＣＨＥＰＯに対する抗体は、適切な支持体（例えば、Ｓｅｐｈａｓｅｘ樹脂または濾紙）上に、当該分野で周知の方法を使用して固定化される。次いで、固定化された抗体は、精製されるＣＨＥＰＯを含むサンプルと接触させられ、その後、支持体が、固定された抗体に結合させられていＣＨＥＰＯを除く、サンプル中の実質的に全ての材料を除去する適切な溶媒で洗浄される。最後に、支持体が、抗体からＣＨＥＰＯを解離させる別の適切な溶媒で洗浄される。
【０２１１】
以下の実施例は、説明の目的のみのために与えられ、そしていかなる方法においても本発明の範囲を限定することは意図されない。
【０２１２】
本明細書中に引用されている全ての特許および参考文献は、それらの全体において参考として本明細書中で援用されている。
【０２１３】
（実施例）
本実施例において言及する市販の試薬は、特に記載していない場合を除き、製造業者の使用説明書に従って使用した。以下の実施例中および本明細書中全体を通してＡＴＣＣ受託番号により示す細胞の供給源は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）である。
【０２１４】
（実施例１：ＣＨＥＰＯをコードする核酸の単離）
製造業者の使用説明書に推奨されるように、Ｑｉａｇｅｎキット（ｃａｔ＃１０２６２）を用いて、２種のチンパンジーの細胞株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６０９およびＣＲＬ １８５７）よりゲノムＤＮＡを単離した。次いで、チンパンジーＥｐｏ遺伝子を、鋳型として１ｇのゲノムＤＮＡおよび以下のプライマー対を用いたＰＣＲによって、３つの異なるフラグメント上で得た。
ＥＰＯ．Ｆ： ５'−ＡＣＣＧＣＧＣＣＣＣＣＴＧＧＡＣＡＧ−３'（配列番号１２）
ＥＰＯ．ＩＮＴ１．Ｒ： ５'−ＣＡＴＣＣＡＣＴＴＣＴＣＣＧＧＣＣＡＡＡＣＴＴＣＡ−３'（配列番号１３）
ＥＰＯ．ＩＮＴ１Ｆ： ５'−ＴＴＴＧＧＣＣＧＧＡＧＡＡＧＴＧＧＡＴＧＣ−３'（配列番号１４）
ＥＰＯ．ＩＮＴ４Ｒ：５’−ＴＣＡＣＴＣＡＣＴＣＡＣＴＣＡＴＴＣＡＴＴＣＡＴＴＣＡＴＴＣＡ−３’（配列番号１５）
ＥＰＯ．ＩＮＴ４Ｆ：５’−ＧＴＴＧＡＡＴＧＡＡＴＧＡＴＴＧＡＡＴＧＡＡＴＧＡＧＴＧＡ−３’（配列番号１６）
ＥＰＯ．Ｒ：５’−ＧＣＡＣＴＧＧＡＧＴＧＴＣＣＡＴＧＧＧＡＣＡＧ−３’（配列番号１７）
各ＰＣＲの反応系を、１０×ＰＣＲ緩衝液（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を５ｌ、ｄＮＴＰ（２０ｍＭ）を１ｌ、ゲノムＤＮＡを１ｇ、各プライマー対を１ｌ、Ｔａｑポリメラーゼ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を１ｌ含み、Ｈ₂Ｏで全体積を５０ｌにした。反応はまず９４℃で４分変性させた後、９４℃で１分、６５℃もしくは６６℃で１分、７２℃で１分の伸長を４０回繰り返して増幅した。最後に７２℃で５分の伸長工程を行った。次いで、反応物をアガロースゲルを用いて分析した。それぞれ５００ｂｐ、１２００ｂｐ、および７５０ｂｐのＰＣＲ産物が観察された。次いで、ＰＣＲ反応物を、Ｗｉｚａｒｄ ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ ｃａｔ＃ Ａ７１７０）を用いて精製した後、直接配列決定を行った。ＰＣＲ産物のＤＮＡ配列決定は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３７７ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（ＰＥ／Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて行った。用いた化学反応は、ｄＲｈｏｄａｍｉｎｅおよびＢＩＧ ＤＹＥターミネーター（ＰＥ／Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いる色素ターミネーターサイクル配列決定法（ＤＹＥ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）であった。配列アセンブリおよび編集はＳｅｑｕｅｎｃｈｅｒ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）で行った。
【０２１５】
ヒトエリスロポエチンの配列との相同性によって５つのエキソンコードを同定し、推定全長ｃＤＮＡへと組み立てた。ＣＨＥＰＯ ｃＤＮＡのコード領域は５７９ｂｐヌクレオチド長（図１）で１９３アミノ酸の推定タンパク質をコードする（図３）。また２２、２４、２７番目のアミノ酸残基の後ろに予測される３つの推定シグナル切断部位がある。ヒトＥｐｏのＮ末端配列と一致すると、おそらく、最後のものがチンパンジーＥｐｏの切断部位に対応する。疎水性の２７アミノ酸のシグナルペプチドの後ろに３つの推定Ｎグリコシル化部位を含む１６６アミノ酸長の成熟タンパクを有する。ＣＲＬ１６０９から得た推定配列中には１ヌクレオチド多型が存在しており、これは１４２位のアミノ酸をＱからＫへとタンパク質配列を変更する。チンパンジーＥｐｏタンパクとヒトＥｐｏの配列とを整列させると８４番目のアミノ酸がただ１つ異なっていることを示す（図３）。
【０２１６】
（実施例２：ハイブリダイゼーション用プローブとしてのＣＨＥＰＯ ｃＤＮＡの使用）
以下の方法はハイブリダイゼーション用プローブとしてのＣＨＥＰＯをコードするヌクレオチド配列の使用を記載する。
【０２１７】
ヒト組織ｃＤＮＡライブラリー中もしくはヒト組織ゲノムライブラリー中における相同なＤＮＡ（ＣＨＥＰＯの天然の改変体をコードするもの）のスクリーニング用プローブとして、全長もしくは成熟ＣＨＥＰＯ（図２の配列番号３に示す）のコード配列を含むＤＮＡを利用する。
【０２１８】
いずれかのＤＮＡライブラリーを含むフィルターのハイブリダイゼーションおよび洗浄は以下の高ストリンジェンシー条件下で行う。放射性標識したＣＨＥＰＯ由来のプローブのフィルターへのハイブリダイゼーションは５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、０．１％ ピロリン酸ナトリウム、５０ｍＭ リン酸ナトリウム、ｐＨ６．８、２×デンハルト溶液そして１０％ 硫酸デキストラン中、４２℃で２０時間行う。フィルターの洗浄を、０．１×ＳＳＣおよび０．１％ ＳＤＳを含む水溶液中、４２℃で行う。
【０２１９】
次いで、ネイティブなＣＨＥＰＯ全長配列をコードするＤＮＡと所望の配列同一性を有するＤＮＡは、当該分野で公知の標準的な技術を用いて同定できる。
【０２２０】
（実施例３：Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＣＨＥＰＯの発現）
本実施例では、Ｅ．ｃｏｌｉにおける組み換え発現による非グリコシル化型ＣＨＥＰＯの調製について示す。
【０２２１】
まず、選択したＰＣＲプライマーを用いてＣＨＥＰＯをコードするＤＮＡ配列（図３）を増幅する。プライマーは選択した発現ベクター上の制限酵素部位に対応する制限酵素部位を含むべきである。種々の発現ベクターが使用可能である。適したベクターの例は、アンピシリンおよびテトラサイクリン耐性遺伝子を含むｐＢＲ３２２（Ｅ．ｃｏｌｉ由来：Ｂａｌｉｖａｒら，Ｇｅｎｅ，２：９５（１９７７）参照）である。ベクターを制限酵素で消化し、脱リン酸化する。次いで、ＰＣＲ増幅した配列をベクター中に連結する。好ましくは、ベクターは抗生物質耐性遺伝子をコードする配列、ｔｒｐプロモーター、ポリＨｉｓリーダー（最初の６個のＳＴＩＩコドン、ポリＨｉｓ配列、エンテロキナーゼ切断部位を含む）、ＣＨＥＰＯコード領域、λ転写ターミネーター、そしてａｒｇＵ遺伝子を含む。
【０２２２】
次いで、連結混合物を、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）に示されている方法を用いて、選択したＥ．ｃｏｌｉを形質転換するために使用する。形質転換体を、ＬＢプレート上での生育能により同定し、次いで抗生物質耐性コロニーを選択する。プラスミドＤＮＡを単離し得、そして制限酵素処理およびＤＮＡ配列決定によって同定し得る。
【０２２３】
選択したクローンを、抗生物質を含むＬＢブロスなどの液体培養培地中で一晩増殖し得る。一晩増殖した培養物を、続いてより大きなスケールの培養へと接種するために使用する。次いで、細胞を所望の光学密度まで増殖させ、この間に発現プロモータースイッチが入る。
【０２２４】
細胞をさらに数時間培養した後、遠心分離により細胞を回収する。遠心分離により得られたペレットを当該分野で公知の種々の試薬を用いて可溶化し、次いで、可溶化したＣＨＥＰＯタンパク質を、タンパク質が強く結合する条件で金属キレートカラムを用いて精製し得る。
【０２２５】
ＣＨＥＰＯは以下に示す手法を用いてポリＨｉｓタグ化形態でＥ．ｃｏｌｉで発現させ得る。まず、選択したＰＣＲプライマーを用いてＣＨＥＰＯをコードするＤＮＡを増幅する。プライマーは選択した発現ベクター上にある制限酵素部位に対応する制限酵素部位を有しており、また、効率的かつ信頼性の高い翻訳開始、金属キレートカラムによる迅速な精製およびエンテロキナーゼによるタンパク質分解除去を提供する有用な他の配列を含む。次いで、ポリＨｉｓタグ化したＰＣＲ増幅した配列を、発現ベクターに連結し、５２株（Ｗ３１１０ ｆｕｈＡ（ｔｏｎＡ） ｌｏｎ ｇａｌＥ ｒｐｏＨｔｓ（ｈｔｐＲｔｓ）ｃｌｐＰ（ｌａｃｌｑ））に基づいたＥ．ｃｏｌｉ宿主を形質転換するために用いる。まず、形質転換体を、５０ｍｇ／ｍｌのカルベニシリンを含むＬＢ培地中において３０℃でＯ．Ｄ．６００が３〜５になるまで振盪培養する。次いで、培養物をＣＲＡＰ培地（３．５７ｇ （ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、０．７１ｇ クエン酸ナトリウム２Ｈ₂Ｏ、１．０７ｇ ＫＣｌ、５．３６ｇ Ｄｉｆｃｏ酵母抽出物、５．３６ｇ Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ ｈｙｃａｓｅ ＳＦを５００ｍＬの水に、１１０ ｍＭのＭＰＯＳ、ｐＨ７．３、０．５５％（ｗ／ｖ）のグルコースおよび７ｍＭの硫酸マグネシウムを混合することによって調製する）中で５０〜１００倍に希釈し、３０℃で約２０〜３０時間振盪培養する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで発現を確認するために、サンプルを取り出し、バルク培養物を遠心分離し、細胞をペレットにする。細胞のペレットは、精製およびリフォールディングを行うまで凍結保存する。
【０２２６】
０．５〜１Ｌの培養物からのＥ．ｃｏｌｉペースト（６〜１０ｇのペレット）を１０容量（ｗ／ｖ）の７Ｍ グアニジンを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８）中に再懸濁する。固体の亜硫酸ナトリウムおよびテトラチオン酸（ｔｅｔｒａｔｈｉｏｎａｔｅ）ナトリウムをそれぞれ終濃度０．１Ｍおよび０．０２Ｍとなるように添加し、溶液を４℃で一晩攪拌する。この工程により全てのシステイン残基を亜硫酸化（ｓｕｌｆｉｔｏｌｉｚａｔｉｏｎ）によって保護された変性タンパクが生じる。この溶液をＢｅｃｋｍａｎ Ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅを用いて４０，０００ｒｐｍで３０分遠心分離する。上清を３〜５容量の金属キレートカラム用緩衝液（６Ｍ グアニジン、２０ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ７．４））で希釈し、０．２２ミクロンのフィルターを用いて濾過し、清澄化する。清澄化した抽出物を、金属キレートカラム用緩衝液で平衡化した５ｍｌのＱｉａｇｅｎ Ｎｉ−ＮＴＡ金属キレートカラムに供する。カラムを５０ｍＭイミダゾール（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｕｔｒｏｌ ｇｒａｄｅ），ｐＨ ７．４を含むさらなる緩衝液で洗浄する。２５０ｍＭ イミダゾールを含む緩衝液を用いてタンパクを溶出させる。所望のタンパク質を含む画分をプールし、４℃で保存する。タンパク質濃度はそのアミノ酸配列に基づいて計算された吸光係数を用いて２８０ｎｍの吸光度より算出する。
【０２２７】
タンパク質のリフォールディングは、新たに調製した２０ｍＭ トリス、ｐＨ８．６、０．３Ｍ ＮａＣｌ、２．５Ｍ 尿素、５ｍＭ システイン、２０ｍＭ グリシンおよび１ｍＭ ＥＤＴＡを含むリフォールディング緩衝液中にサンプルをゆっくり希釈して行う。リフォールディング体積はタンパク質の終濃度が５０〜１００μｇ／ｍｌになるように選択する。リフォールディング溶液は４℃で１２〜３６時間緩やかに攪拌する。リフォールディング反応は終濃度０．４％になるようＴＦＡ（ｐＨは約３）を添加して止める。さらなるタンパク質精製の前に、溶液を０．２２ミクロンのフィルターで濾過し、終濃度２〜１０％のアセトニトリルを添加する。リフォールディングされたタンパク質はＰｏｒｏｓ Ｒ１／Ｈ 逆相カラムで、移動緩衝液は０．１％ ＴＦＡを用い、アセトニトリル１０〜８０％のグラジエントにより溶出させるクロマトグラフィーにかける。Ａ２８０の吸光を示す画分のアリコートをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにより分析し、均一にリフォールディングされたタンパクはまとめる。一般に正しくリフォールディングされた種のタンパク質のほとんどは、疎水性内部が逆相カラム担体との相互作用から保護されている最もコンパクトな状態にあるため、最も低いアセトニトリル濃度で溶出する。凝集した種は通常、高アセトニトリル濃度で溶出する。ミスフォールドされたタンパク質を所望の形態から分離することに加えて、逆相工程はまた、エンドトキシンをサンプルから除去する。
【０２２８】
望ましくフォールドされたＣＨＥＰＯポリペプチドを含む画分をまとめ、溶液に緩やかに窒素ガスを注入してアセトニトリルを除去する。タンパク質を０．１４Ｍ 塩化ナトリウムおよび４％ マンニトールを含む２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ，ｐＨ６．８緩衝液で透析するか、もしくはこの緩衝液で平衡化されたＧ ２５ Ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）樹脂を用いたゲル濾過カラムにより処方し、滅菌濾過する。
【０２２９】
（実施例４：哺乳動物細胞内におけるＣＨＥＰＯの発現）
本実施例では、哺乳動物細胞内での組み換え発現によって潜在的にグリコシル化型のＣＨＥＰＯの調製について示す。
【０２３０】
発現ベクターとしてベクターｐＲＫ５（ＥＰ ３０７，２４７参照。１９８９年３月１５日公開）を採用する。必要に応じて、ＣＨＥＰＯ ＤＮＡは選択した制限酵素部位でＳａｍｂｒｏｏｋら（前出）に記載されている連結方法を用いてｐＲＫ５中に連結してＣＨＥＰＯ ＤＮＡの挿入を可能にする。得られたベクターはｐＲＫ５−ＣＨＥＰＯと称する。
【０２３１】
一つの実施形態において、選択した宿主細胞は２９３細胞であり得る。ヒト２９３細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １５７３）は、ウシ胎仔血清、場合により栄養成分および／もしくは抗生物質を含む培地（例えば、ＤＭＥＭ）で組織培養プレート中でコンフルエントになるまで増殖させる。約１０ｇのｐＲＫ５−ＣＨＥＰＯ ＤＮＡは、約１ｇのＶＡ ＲＮＡ遺伝子をコードするＤＮＡ［Ｔｈｉｍｍａｐｐａｙａら，Ｃｅｌｌ，３１：５４３（１９８２）］と混ぜ、５００ｌの１ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２２７Ｍ ＣａＣｌ溶液中に溶解する。この混合物に５００ｌの５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、２８０ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍＭ ＮａＰＯ₄溶液を滴下し、２５℃で１０分間沈殿を形成させる。沈殿物を懸濁した後、２９３細胞に添加し、３７℃で約４時間沈澱させる。培養培地を吸引して除去し、２ｍｌの２０％グリセロールＰＢＳ溶液を３０秒間で添加する。次いで、２９３細胞を無血清培地で洗浄し、新たな培地を添加して細胞を約５日間培養する。
【０２３２】
トランスフェクションして約２４時間、培養培地を除去し、培養培地単独または２００Ｃｉ／ｍｌ ³⁵Ｓ−システインおよび２００Ｃｉ／ｍｌ ³⁵Ｓ−メチオニンを含む培養培地に置き換える。１２時間培養した後、馴化培地を集めてスピンフィルターにより濃縮し、１５％ ＳＤＳゲルに供する。処理したゲルを乾燥し、ＣＨＥＰＯポリペプチドの存在を調べるため、ある決められた時間フィルムに感光させ得る。トランスフェクションした細胞を含む培養物をさらに（無血清培地中で）培養し、培地を決められたバイオアッセイにより調べる。
【０２３３】
別の手法としては、ＣＨＥＰＯをＳｏｍｐａｒｙｒａｃら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１２：７５７５（１９８１））に記載の硫酸デキストラン法を用いて一過性に２９３細胞に導入し得る。２９３細胞をスピナーフラスコ中で最大濃度まで培養させ、７００ｇのｐＲＫ５−ＣＨＥＰＯ ＤＮＡを添加する。細胞をまず遠心分離して、スピナーフラスコから濃縮し、ＰＢＳで洗浄する。ＤＮＡ−デキストラン沈殿物を菌体ペレット上で４時間インキュベートする。細胞を２０％グリセロールで９０秒間処理し、組織培養培地で洗浄し、組織培養培地、５ｇ／ｍｌ ウシインスリンおよび０．１ｇ／ｍｌウシトランスフェリンの入ったスピナーフラスコ中に再び導入する。およそ４日後、馴化培地を遠心分離し、濾過により細胞、細胞片を除く。次いで、発現したＣＨＥＰＯを含むサンプルは透析および／もしくはカラムクロマトグラフィーのような任意の選択した手法を用いて濃縮および精製する。
【０２３４】
別の実施形態では、ＣＨＥＰＯをＣＨＯ細胞中で発現させ得る。ｐＲＫ５−ＣＨＥＰＯはＣａＰＯ₄またはＤＥＡＥ−デキストランのような公知の試薬を用いてＣＨＯ細胞中にトランスフェクトし得る。上記のように、細胞培養物をインキュベートし、培地を培養培地（単独）または例えば、放射性標識した³⁵Ｓ−メチオニンを含む培地で置き換え得る。ＣＨＥＰＯポリペプチドの存在を確認した後、培養培地を無血清培地に交換し得る。好ましくは、この培養物を、約６日間インキュベートし、次いで、馴化培地を回収する。次いで、発現したＣＨＥＰＯを含む培地を、任意の選択した手法により濃縮、精製する。
【０２３５】
また、エピトープタグ化ＣＨＥＰＯを宿主ＣＨＯ細胞中で発現し得る。ＣＨＥＰＯはｐＲＫ５ベクターからサブクローニングし得る。サブクローニングした挿入物を、ＰＣＲによってポリＨｉｓタグのような選択したエピトータグと共にバキュウロウイルス発現ベクターにインフレームで融合させ得る。次いで、ポリＨｉｓタグ化ＣＨＥＰＯ挿入物を、ＤＨＦＲなどの選択マーカーを含むＳＶ４０由来のベクター中に安定したクローンを選択するためにサブクローニングし得る。最後に、ＣＨＯ細胞を（前述のように）ＳＶ４０由来ベクターとトランスフェクションし得る。前述のように発現を確認するために標識してもよい。次いで、発現させたポリＨｉｓタグ化ＣＨＥＰＯを含む培養培地を、Ｎｉ²⁺キレートアフィニティークロマトグラフィーのような種々の選択した手法を用いて濃縮および精製し得る。
【０２３６】
また、ＣＨＥＰＯは一過性の発現手法によってＣＨＯ細胞および／もしくはＣＯＳ細胞中、また別の安定な発現手法によってＣＨＯ細胞中で発現させ得る。
【０２３７】
次に示す手法によりＣＨＯ細胞中で安定な発現を行う。タンパク質をＩｇＧ構築物（イムノアドヘシン）として発現し（ここで、各タンパク質の可溶性形態のためのコード配列（例えば、細胞外ドメイン）は、ヒンジ領域、ＣＨ２およびＣＨ２ドメインを有するＩｇＧ１の定常領域配列と融合している）、および／またはこの発現は、ポリＨｉｓタグ化型である。
【０２３８】
ＰＣＲによる増幅に続き、それぞれのＤＮＡフラグメントを、標準的な技術（Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｕｎｉｔ ３．１６，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９９７）を参照のこと）を用いてＣＨＯ発現ベクター中にサブクローニングする。ＣＨＯ発現ベクターを、ｃＤＮＡのシャトル（ｓｈａｔｌｌｉｎｇ）に便利になるよう、目的のＤＮＡの５’位および３’位の制限部位への適合性を有するように構築する。ＣＨＯ細胞中での発現に使用したベクターはＬｕｃａｓら（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，２４：９（１７７４−１７７９（１９９６））に記載のものであり、目的のｃＤＮＡおよびジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ） の発現を駆動するためのＳＶ４０の初期プロモーター／エンハンサーを使用する。ＤＨＦＲの発現によって、トランスフェクションの後のプラスミドの安定な維持に関する選択が可能となる。
【０２３９】
１２μｇの所望のプラスミドＤＮＡを、市販のトランスフェクション試薬であるＳｕｐｅｒｆｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎ）、ＤｏｓｐｅｒもしくはＦｕｇｅｎｅ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いて約１０００万個のＣＨＯ細胞中に導入する。細胞はＬｕｃａｓら（前述）によって示されているように増殖させる。約３×１０⁷の細胞を、以下に示すさらなる増殖および生成のためにアンプル中で冷凍する。
【０２４０】
プラスミドＤＮＡを含むアンプルを、水浴に入れて解凍し、ボルテックスにより混合する。内容物をピペットで１０ｍｌの培地の入った遠心管に移し１０００ｒｐｍで５分の間、遠心分離する。上清を吸引して除いた後、細胞を、１０ｍｌの選択培地（０．２μｍのフィルターで濾過したウシ胎仔血清を５％含む０．２μｍのフィルターで濾過したＰＳ２０）中に再懸濁する。次いで、細胞を９０ｍｌの選択培地の入った１００ ｍｌスピナーにアリコートに分ける。１〜２日後、選択増殖培地を１５０ｍＬ含む２５０ｍＬスピナーフラスコ中に細胞を移し、３７℃でインキュベートする。さらに２〜３日後、２５０ｍｌ、５００ｍｌおよび２０００ｍｌのスピナーフラスコ中に３×１０⁵細胞／ｍＬを播種する。細胞培地を、遠心分離および生成培地への再懸濁により新たな培地に交換する。任意の適切なＣＨＯ培地が使用可能であるが、米国特許第５，１２２，４６９号（１９９２年６月１８日発行）に記載されているものを実際には使用する。３Ｌの産生スピナー中に１．２×１０⁶細胞／ｍＬで播種する。０日目に、菌体数、ｐＨを測定する。１日目、スピナーからサンプリングを行い、フィルター濾過した空気の散布を始める。２日目、スピナーからサンプリングを行う。温度を３３℃にし、５００ｇ／Ｌのグルコース３０ｍＬと０．６ｍＬの１０％ 消泡剤（例えば、３５％ ポリジメチルシロキサンエマルジョン（Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ ３６５ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｇｒａｄｅ Ｅｍｕｌｓｉｏｎ））を添加する、生産期間全体を通じて、ｐＨは、必要に応じて約７．２に維持するように調整する。１０日後、もしくは生存率が７０％未満に低下した後、細胞培養物を遠心分離して集菌し、０．２２μｍのフィルターで濾過する。濾液を、各々４℃で保存するかすぐに精製カラムに供するかのいずれかである。
【０２４１】
ポリＨｉｓタグ化構築物に関しては、Ｎｉ−ＮＴＡカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてタンパク質を精製する。精製前に、５ｍＭの濃度になるまでイミダゾールを馴化培地に添加する。馴化培地を、ポンプを用いて０．３Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ イミダゾールを含む２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化した６ ｍｌのＮｉ−ＮＴＡカラムに４℃、流速４．５ ｍｌ／分で導入する。導入した後、さらに平衡化緩衝液でカラムを洗浄し、０．２５Ｍ イミダゾールを含む平衡化緩衝液を用いてタンパク質を溶出させる。続いて、高度に精製したタンパク質を、２５ｍｌ Ｇ２５ Ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ） カラムを用いて、１０ ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、０．１４Ｍ ＮａＣｌ、および４％ マンニトールを含む保存緩衝液（ｐＨ６．８）に脱塩し、−８０℃で保存する。
【０２４２】
イムノアドヘシン（Ｆｃ含有）構築物を、馴化培地から以下に示す方法で精製する。馴化培地はポンプを用いて２０ ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ６．８）で平衡化した５ ｍｌ のプロテインＡ カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に供する。ロードした後、ｐＨ３．５の１００ｍＭ クエン酸で溶出する前に、平衡化緩衝液を用いてカラムを徹底的に洗浄する。溶出したタンパク質は、２７５Ｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ９）を含むチューブ中に１ｍｌの画分を回収して直ちに中和する。続いて、ポリＨｉｓタグ化したタンパク質について上に記載したようにして、高度に精製したタンパク質を保存緩衝液中に脱塩する。均一性をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルおよびエドマン分解を用いたＮ末端アミノ酸配列決定によって評価する。
【０２４３】
（実施例５：酵母内におけるＣＨＥＰＯの発現）
以下の方法は、酵母内におけるＣＨＥＰＯの組み換え発現について示す。
【０２４４】
まず、酵母内発現ベクターは、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーターによるＣＨＥＰＯの細胞内産生、もしくは分泌を目的として設計する。ＣＨＥＰＯをコードするＤＮＡおよびプロモーターは、ＣＨＥＰＯの細胞内発現を行わせるために選択したプラスミド中の適切な制限酵素部位に挿入する。分泌に関しては、ＣＨＥＰＯをコードするＤＮＡを、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーターをコードするＤＮＡとともに、ネイティブなＣＨＥＰＯのシグナルペプチドもしくは他の哺乳動物のシグナルペプチドもしくは、例えば、酵母のα因子もしくはインベルターゼ分泌シグナル／リーダー配列、そして（必要であれば）ＣＨＥＰＯの発現のためのリンカー配列を選択したプラスミド中にクローニングし得る。
【０２４５】
次いで、酵母細胞、例えば酵母液ＡＢ１１０を、上記の発現用プラスミドを用いて形質転換し得、また選択発酵培地中で培養し得る。形質転換された酵母の上清は、１０％ トリクロロ酢酸を用いた沈殿によって分析でき、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥの後、クーマシーブルー染色でゲルを染色することによって分離できる。
【０２４６】
続いて、組み換えＣＨＥＰＯを遠心分離により発酵培地から酵母細胞を除去し、次いで、選択したカートリッジフィルターを用いて培地を濃縮することで分離および精製し得る。ＣＨＥＰＯを含む濃縮液を、選択したカラムクロマトグラフィー樹脂を用いてさらに精製し得る。
【０２４７】
（実施例６：バキュウロウイルスを感染させた昆虫細胞内におけるＣＨＥＰＯの発現）
以下の方法は、バキュウロウイルスを感染させた昆虫細胞内におけるＣＨＥＰＯの組み換え発現について示す。
【０２４８】
ＣＨＥＰＯをコードする配列を、バキュウロウイルス発現ベクターに含まれる、エピトープタグの上流に融合する。このようなエピトープタグはポリＨｉｓタグおよび（ＩｇＧのＦｃ領域のような）免疫グロブリンタグを含む。ｐＶＬ １３９３（Ｎｏｖａｇｅｎ）などの市販品のプラスミド由来のプラスミドを含む種々のプラスミドが使用可能である。簡単に述べると、ＣＨＥＰＯをコードする配列もしくはその望ましい部分、例えば膜貫通タンパク質の細胞外ドメインをコードする配列またはタンパク質が細胞外のものであればその成熟タンパク質をコードする配列を、５’領域および３’領域と相補的なプライマーを用いるＰＣＲにより増幅する。５’プライマーは隣接した（選択した）制限酵素部位を含む。次いで、産物をそれらの選択した制限酵素で消化し、発現ベクターにサブクローニングする。
【０２４９】
組み換えバキュウロウイルスは上記のプラスミドおよびＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ^TMウイルスＤＮＡ（Ｐｈａｍｉｎｇｅｎ）をリポフェクチン（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬより市販）を用いてＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（「Ｓｆ９」）細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １７１１）に対して同時トランスフェクションすることで作製する。２８℃で４〜５日インキュベートした後、放出したウイルスを回収し、さらに増幅するために使用する。ウイルスの感染およびタンパク質の発現はＯ'Ｒｅｉｌｌｅｙら（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｏｘｆｏｒｄ： Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９４））に記載されるように行う。
【０２５０】
次いで、発現させたポリＨｉｓタグを有するＣＨＥＰＯを、例えばＮｉ²⁺キレートアフィニティークロマトグラフィーによって以下のように精製し得る。抽出物を、組み換えウイルスを感染させたＳｆ９細胞からＲｕｐｅｒｔら（Ｎａｔｕｒｅ．３６２：１７５−１７９（１９９３））に記載されるように調製する。簡単に述べると、Ｓｆ９細胞を洗浄し、超音波破砕用緩衝液（２５ｍＬ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．９；１２．５ｍＭ ＭｇＣｌ₂；０．１ｍＭ ＥＤＴＡ；１０％ グリセロール；０．１％ ＮＰ−４０；０．４Ｍ ＫＣｌ）中に再懸濁し、氷上で２０秒間の超音波破砕を２度繰り返す。破砕液を遠心分離し、上清をローディング緩衝液（５０ｍＭ リン酸、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１０％ グリセロール、ｐＨ７．８）で５０倍に希釈し、０．４５μｍフィルターを用いて濾過する。総ベッド体積５ｍＬでのＮｉ²⁺−ＮＴＡ−アガロースカラム（Ｑｉａｇｅｎより市販）を調製し、２５ｍＬの水で洗浄し、２５ｍＬのローディング緩衝液で平衡化する。濾過した細胞抽出液は０．５ｍＬ／分でカラムに供する。ローディング緩衝液を用いてＡ₂₈₀ベースラインまでカラムを洗浄し、この時点で画分の回収を開始する。次にカラムを非特異吸着タンパク質を溶出させる二次洗浄緩衝液（５０ｍＭ リン酸；３００ｍＭ ＮａＣｌ、１０％ グリセロール、ｐＨ６．０）で洗浄する。再度Ａ₂₈₀ベースラインまで達した後、カラムを二次洗浄緩衝液中０〜５００ｍＭ イミダゾール勾配で展開する。１ｍＬの画分を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの後、銀染色もしくはＮｉ²⁺−ＮＴＡアルカリフォスファターゼ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いたウエスタンブロッティングによって分析する。Ｈｉｓ₁₀タグが結合したＣＨＥＰＯを含む画分をプールし、ローディング緩衝液で透析する。
【０２５１】
あるいは、ＩｇＧタグ（もしくはＦｃタグ）のついたＣＨＥＰＯの精製を、公知のクロマトグラフィー技術（例えばプロテインＡもしくはプロテインＧカラムのクロマトグラフィーを含む）を用いて行い得る。
【０２５２】
（実施例７：ＣＨＥＰＯと結合する抗体の調製）
本実施例は、特異的にＣＨＥＰＯと結合し得るモノクローナル抗体の調製法について示す。
【０２５３】
モノクローナル抗体を生成する技術は当該分野で公知であり、例えばＧｏｄｉｎｇ（前出）に示されている。使用し得る免疫原は精製したＣＨＥＰＯ、ＣＨＥＰＯを含む融合タンパク質および細胞表面で組換えＣＨＥＰＯを発現する細胞を含む。免疫原の選択は、当業者によって過度な実験を行うことなく行われ得る。
【０２５４】
マウス（Ｂａｌｂ／ｃなど）はフロイント完全アジュバント中で乳化したＣＨＥＰＯ免疫原を皮下もしくは腹腔に１〜１００μｇの量注射することによって免疫する。あるいは、免疫原をＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＭＴ）内で乳化して動物の後肢肉球に注射する。次いで、免疫したマウスを、１０〜１２日後に、選択したアジュバント内で乳化した免疫原を用いて追加免疫する。次いで、数週間後、またマウスにさらに免疫注射を行い、追加免疫を行ってもよい。ＥＬＩＳＡアッセイで試験するため、抗ＣＨＥＰＯ抗体を検出するために眼窩後部採血によって血清サンプルを定期的にマウスから採取する。
【０２５５】
適切な抗体力価が検出された後、抗体「陽性」の動物は最終的なＣＨＥＰＯの静脈中注射を受け得る。３〜４日後、マウスを屠殺し、その脾細胞を収集する。次いで、脾細胞を（３５％ ポリエチレングリコールを用いて）選択したマウス骨髄腫細胞株（例えばＰ３Ｘ６３ＡｇＵ．１（ＡＴＣＣより入手可能（Ｎｏ．ＣＲＬ １５９７）））と融合させる。融合物からハイブリドーマ細胞が生じ、次いで、それらを非融合細胞、骨髄腫ハイブリッド細胞および脾ハイブリッド細胞の増殖を阻害するために、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン）培地を含む９６ウェル組織培養プレート上に撒く。
【０２５６】
ハイブリドーマ細胞はＣＨＥＰＯに対する反応性についてＥＬＩＳＡによって選抜する。ＣＨＥＰＯに対して所望のモノクローナル抗体を分泌する「陽性」なハイブリドーマ細胞を決定することは、当業者の技術範囲内である。
【０２５７】
陽性のハイブリドーマ細胞は抗ＣＨＥＰＯモノクローナル抗体を含む腹水を生成する同系Ｂａｌｂ／ｃマウス腹腔内に注射され得る。あるいは、ハイブリドーマ細胞を、細胞培養用フラスコもしくは回転ビン中で生育させ得る。腹水中で生成されたモノクローナル抗体の精製は、硫酸アンモニウム沈殿、続いてサイズ排除ゲル濾過クロマトグラフィーを用いて達成し得る。あるいは、プロテインＡもしくはプロテインＧへの抗体の結合性を利用したアフィニティクロマトグラフィーも使用し得る。
【０２５８】
（実施例８：特異的抗体を用いたＣＨＥＰＯポリペプチドの精製）
ネイティブもしくは組み換えＣＨＥＰＯポリペプチドは、当該分野で標準的な種々のタンパク質精製技術により精製され得る。例えば、プロＣＨＥＰＯポリペプチド、成熟ＣＨＥＰＯポリペプチド、もしくはプレＣＨＥＰＯポリペプチドは、目的のＣＨＥＰＯポリペプチドに特異的な抗体を用いたイムノアフィニティークロマトグラフィーにより精製する。一般に、イムノアフィニティーカラムは抗ＣＨＥＰＯポリペプチド抗体を活性化したクロマトグラフィー樹脂に共有結合させることにより構築される。
【０２５９】
ポリクローナル免疫グロブリンは硫酸アンモニウム沈澱または固定化したプロテインＡ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）での精製のいずれかにより免疫性の血清より調製される。同様にモノクローナル抗体は、マウスの腹水から硫酸アンモニウム沈澱または固定化したプロテインＡのクロマトグラフィーによって調製される。部分精製された免疫グロブリンはＣｎＢｒで活性化されたＳＥＰＨＡＲＯＳＥ^TM（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）のようなクロマトグラフィー樹脂に対して共有結合させる。抗体は樹脂と結合し、樹脂はブロックされ、誘導体化した樹脂を製造業者の取扱説明書に基づいて洗浄する。
【０２６０】
このようなイムノアフィニティーカラムは、ＣＨＥＰＯポリペプチドを可溶化形態で含む細胞から画分を調製することによりＣＨＥＰＯポリペプチドの精製を行う際に用いられる。この調製物は全細胞もしくは界面活性剤の添加または他の当該分野で周知の手法により差次的な遠心分離から得られる亜細胞画分を、可溶化して調製する。あるいは、シグナル配列を有する可溶性のＣＨＥＰＯポリペプチドは細胞が培養された培地中に有用な量分泌され得る。
【０２６１】
可溶性のＣＨＥＰＯポリペプチド含有調製物をイムノアフィニティーカラムを通過させて、カラムをＣＨＥＰＯポリペプチドの優先的な吸光がみられる条件下（例えば、界面活性剤の存在下でイオン強度の高い緩衝液を用いる）で洗浄する。次いで、抗体／ＣＨＥＰＯポリペプチド結合を破壊するような条件下（例えば、約ｐＨ２〜３のような低ｐＨ緩衝液、もしくは高濃度のカオトロピック塩（例えば、尿素もしくはチオシアネートイオン）を用いる）でカラムからの溶出を行い、ＣＨＥＰＯポリペプチドを収集する。
【０２６２】
（実施例９：薬物スクリーニング）
本発明は任意の種々の薬物スクリーニング技術においてＣＨＥＰＯポリペプチドもしくはその結合フラグメントを用いて化合物のスクリーニングを行う場合に特に有用である。このような試験に用いるＣＨＥＰＯポリペプチドもしくはそのフラグメントは溶液中に遊離しているか、固体支持体に担持されているか、細胞表面に生じているか、または細胞内に存在しているかのいずれかであり得る。薬物スクリーニングの一つの手法は、ＣＨＥＰＯポリペプチドもしくはフラグメントを発現するための組み換え核酸で安定に形質転換されている真核生物もしくは原核生物宿主細胞を利用する。競合的な結合アッセイで形質転換した細胞に対する薬剤のスクリーニングを行う。生細胞であろうが固定化細胞であろうが、このような細胞を標準的な結合アッセイに用い得る。例えば、ＣＨＥＰＯポリペプチドもしくはフラグメントと試験薬剤との複合体の形成を測定し得る。あるいは、試験薬剤によって引き起こされるＣＨＥＰＯポリペプチドと標的細胞もしくは標的レセプターとの複合体形成の減少を調べ得る。
【０２６３】
それ故に、本発明は、ＣＨＥＰＯポリペプチドの関連する疾患または障害に影響を及ぼし得る薬物または任意の薬剤のスクリーニング手法を提示するものである。これらの手法は、ＣＨＥＰＯポリペプチドもしくはそのフラグメントをこのような薬剤と接触させること、および（ｉ）薬剤とＣＨＥＰＯポリペプチドもしくはそのフラグメントの複合体の存在、もしくは（ｉｉ） ＣＨＥＰＯポリペプチドもしくはそのフラグメントと細胞の複合体の存在を当該分野で周知の手法を用いてアッセイすることを含む。このような競合的な結合アッセイにおいて、ＣＨＥＰＯポリペプチドもしくはそのフラグメントは、代表的には標識される。適切なインキュベーションの後、結合状態にあるＣＨＥＰＯポリペプチドもしくはそのフラグメントを分離し、そして遊離もしくは非複合体の状態にある標識の量は、特定の薬剤がＣＨＥＰＯポリペプチドへ結合する能力またはＣＨＥＰＯポリペプチド／細胞複合体を妨害する能力の尺度である。
【０２６４】
別の薬物スクリーニング技術はポリペプチドに対して適切な結合親和性を有する化合物のハイスループットスクリーニング技術を提供し、詳細はＷ０ ８４／０３５６４（ １９８４年９月１３日公開）に示されている。簡単に述べると、多数の異なる小サイズのペプチド試験用化合物をプラスティックピンもしくはいくつかの他の表面のような固体基板上で合成する技術である。ＣＨＥＰＯポリペプチドに適用する場合、このペプチド試験用化合物をＣＨＥＰＯポリペプチドと反応させて、洗浄する。結合したＣＨＥＰＯポリペプチドを当該分野で周知の手法により検出する。また、精製したＣＨＥＰＯポリペプチドは前述の薬物スクリーニング技術に使用するプレート上に直接コーティングし得る。加えて、固体担体上でペプチドを捕捉し、固定化する場合に非中和状態の抗体を使用し得る。
【０２６５】
また、本発明はＣＨＥＰＯポリペプチドと特異的に結合し得る中和抗体が、ＣＨＥＰＯポリペプチドもしくはそのフラグメントへの結合に関して試験化合物と競合する場合における競合的な薬物スクリーニングアッセイの利用を意図する。このように、抗体を、ＣＨＥＰＯポリペプチドに対して１つ以上の抗原性決定因子を共有する任意のペプチドの存在の検出にも利用し得る。
【０２６６】
（実施例１０：合理的な薬物設計）
合理的な薬物設計の最終目的は、目的の生理活性ポリペプチド（すなわち、ＣＨＥＰＯポリペプチド）の構造的アナログもしくはそれと相互作用する低分子物質（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、またはインヒビター）を生成することである。これらの例は、いずれもＣＨＥＰＯポリペプチドのより活性または安定性の高い形としての薬剤、もしくはＣＨＥＰＯポリペプチドのインビボにおける機能（Ｈｏｄｇｓｏｎ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：１９−２１（１９９１）を参照のこと）を増強もしくは阻害する薬剤を作るために利用される。
【０２６７】
アプローチの一例は、ＣＨＥＰＯポリペプチド、もしくはＣＨＥＰＯポリペプチド−インヒビター複合体の三次元構造をＸ線結晶解析、コンピューターモデリング、最も代表的には、この二種類の手法の組み合わせによって決定することである。分子の構造を解明し、活性部位を決定するためにはＣＨＥＰＯポリペプチドの形態および電荷の両方を確かめなければならない。また、それほど必要ではないかもしれないが、相同なタンパク質の構造に基づいたモデル化を行うことでＣＨＥＰＯポリペプチドの構造に関する有用な情報を得ることもできる。どちらの場合でも適切な構造の情報はＣＨＥＰＯポリペプチド様の分子アナログをデザインしたり、または効果的なインヒビターを同定するために利用する。合理的な薬物設計の有用な例としては活性や安定性を増加させた分子（ＢｒｅｘｔｏｎおよびＷｅｌｌｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３１；７７９６−７８０１（１９９２））またはネイティブなペプチドのインヒビター、アゴニスト、またはアンタゴニストとして機能する分子（Ａｔｈａｕｄａら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１３；７４２−７４６（１９９３））が挙げられる。
【０２６８】
上記のような機能解析を用いて選択された標的特異的な抗体を単離し、次いでその結晶構造を解明することも可能である。このようなアプローチによって、原則的には、引き続き行う薬物設計の基礎となるファーマコア（ｐｈａｒｍａｃｏｒｅ）が得られる。機能的、薬理学的に活性な抗体に対して抗イディオタイプ抗体（ａｎｔｉ−ｉｄ）を生成することによってタンパク質結晶学全体を考える必要がなくなることも可能である。鏡像体の鏡像として、ａｎｔｉ−ｉｄの結合部位はもともとのレセプターアナログと考えられる。次いで、ａｎｔｉ−ｉｄは化学的もしくは生物学的に生成したペプチドバンクよりペプチドを特定し、単離するために使うことができる。次いで、この単離したペプチドはファーマコアとして作用する。
【０２６９】
本発明によりＸ線結晶解析などの分析的な研究を行うに十分量のＣＨＥＰＯペプチドの生成が可能である。さらに、本明細書中に記載したＣＨＥＰＯペプチドのアミノ酸配列に関する知識はＸ線結晶解析に代わって、もしくは加えてコンピューターモデル化技術を採用する指針を提供し得る。
【０２７０】
上記の明細書は、当業者が本願発明を実施し得るに十分なものであると考えられる。本明細書中に示し、述べている事象に加えて、本発明の種々の改変は、上記の説明から当業者に明らかであり、またこれらは、本発明の範囲内にある。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】 図１Ａ〜Ｃは、ネイティブな配列のＣＨＥＰＯをコードする、ヌクレオチド配列（ヌクレオチド１３４−１４６、６６７−８１２、１０７１−１１５７、１７６０−１８３９、および２０７４−２２２６、他を除く）を含む、単離されたゲノムＤＮＡ分子のヌクレオチド配列（配列番号１）を示す。ゲノム配列において、開始コドン、エキソンおよびイントロンの位置、ならびに配列番号１のコード配列によってコードされるアミノ酸配列（配列番号２）も示される。
【図１Ｂ】 図１Ａ〜Ｃは、ネイティブな配列のＣＨＥＰＯをコードする、ヌクレオチド配列（ヌクレオチド１３４−１４６、６６７−８１２、１０７１−１１５７、１７６０−１８３９、および２０７４−２２２６、他を除く）を含む、単離されたゲノムＤＮＡ分子のヌクレオチド配列（配列番号１）を示す。ゲノム配列において、開始コドン、エキソンおよびイントロンの位置、ならびに配列番号１のコード配列によってコードされるアミノ酸配列（配列番号２）も示される。
【図１Ｃ】 図１Ａ〜Ｃは、ネイティブな配列のＣＨＥＰＯをコードする、ヌクレオチド配列（ヌクレオチド１３４−１４６、６６７−８１２、１０７１−１１５７、１７６０−１８３９、および２０７４−２２２６、他を除く）を含む、単離されたゲノムＤＮＡ分子のヌクレオチド配列（配列番号１）を示す。ゲノム配列において、開始コドン、エキソンおよびイントロンの位置、ならびに配列番号１のコード配列によってコードされるアミノ酸配列（配列番号２）も示される。
【図２】 図２は、ＣＨＥＰＯ分子のｃＤＮＡ配列（配列番号３）およびそれによってコードされるアミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【図３】 図３は、ヒトエリスロポエチンアミノ酸配列（ヒト）（配列番号４）および本明細書中で記載したチンパンジーエリスロポエチン（ｃｈｅｐｏ）の比較を示す。ここでＣＨＥＰＯ配列のアミノ酸位置１４２でＸと示されるアミノ酸は、グルタミン（配列番号２）またはリシン（配列番号５）のいずれかである。

Claims (6)

1. 免疫グロブリンのＦｃ領域に融合されている、以下のＣＨＥＰＯポリペプチドを含むキメラ分子：
   （ａ）図２（配列番号２）のアミノ酸残基１〜１９３またはアミノ酸残基２８〜１９３；または
   （ｂ）図２（配列番号３）のヌクレオチド１〜５７９またはヌクレオチド８２〜５７９によりコードされるポリペプチド配列；または
   （ｃ）以下：
   

   

   

   に示されるアミノ酸配列（１）〜（１４）のうちのいずれか１つ；または
   （ｄ）以下：
   

   

   

   に示されるアミノ酸配列（１）〜（１６）のうちのいずれか１つ。
2. 請求項１に記載のキメラ分子であって、前記ＣＨＥＰＯポリペプチドが、前記免疫グロブリン内の少なくとも１つの可変領域に代わって置換されている、キメラ分子。
3. 二量体である、請求項２に記載のキメラ分子。
4. 前記免疫グロブリンがＩｇＧ分子である、請求項２に記載のキメラ分 子。
5. 前記免疫グロブリンのＦｃ領域が、ＩｇＧ１分子のヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３領域を含む、請求項２に記載のキメラ分子。
6. 前記免疫グロブリンのＦｃ領域が、ＩｇＧ１分子のヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３領域を含む、請求項２に記載のキメラ分子。

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