PT1813624E

PT1813624E - Métodos e composições para a prevenção e tratamento da anemia

Info

Publication number: PT1813624E
Application number: PT07004087T
Authority: PT
Inventors: Joan C Egrie; Jeffrey K Browne; Steven G Elliott
Original assignee: Amgen Inc
Priority date: 1998-10-23
Filing date: 1999-10-18
Publication date: 2010-10-27
Also published as: EP1813624A1; ATE477270T1; KR20010075661A; HU228492B1; SI1813624T1; CY1107584T1; HUP0103920A3; DE69935345T3; DK1813624T3; DE69935345T2; CY1110801T1; CN1346369B; EP1813624B1; AR020848A1; EP1123313B1; HK1040944B; ES2283139T3; AU774989B2; AU1124100A; EP1123313B2

Description

DESCRIÇÃO "MÉTODOS E COMPOSIÇÕES PARA A PREVENÇÃO E TRATAMENTO DA ANEMIA"

CAMPO DA INVENÇÃO A invenção refere-se ao aumento do hematócrito num mamífero, utilizando análogos hiperglicosilados da eritropoietina. Mais particularmente, a invenção refere-se a uma dosagem menos frequente de um análogo hiperglicosilado, em comparação com a eritropoietina humana recombinante, para aumentar e manter o hematócrito e tratar a anemia. A invenção refere-se também à administração de quantidades inferiores de um análogo hiperglicosilado, em comparação com a eritropoietina humana recombinante, numa frequência de dosagem equivalente, de forma a aumentar e manter o hematócrito e tratar a anemia. São, também, proporcionados novos análogos hiperglicosilados da eritropoietina como definido nas reivindicações.

Antecedentes da Invenção A eritropoietina (Epo) é uma hormona glicoproteica necessária para a maturação de células progenitoras eritróides em eritrócitos. É produzida nos rins e é essencial na regulação dos níveis dos glóbulos vermelhos na circulação. Os estados caracterizados por níveis baixos de oxigénio tecidular conduzem à produção aumentada de Epo, a qual, por sua vez, estimula a eritropoiese. Uma perda da função renal como se verifica, por 1 exemplo, na deficiência renal crónica (CRF) resulta, tipicamente, na produção reduzida de Epo e uma redução concomitante dos glóbulos vermelhos. A Epo urinária humana foi purificada por Miyake et al. {J. Biol. Chem. 252, 5558 (1977)), a partir de doentes com anemia aplástica. No entanto, a quantidade de proteína Epo purificada, obtida desta fonte era insuficiente para aplicações terapêuticas. A identificação e clonagem do gene codificante da Epo humana e a expressão da proteína recombinante foram divulgadas na Patente U.S. N° 4703008 de Lin, cuja divulgação é aqui incorporada por referência. Na Patente U. S. N° 4667016 de Lai et al. é divulgado um método para a purificação de eritropoietina humana recombinante, a partir de meio celular. A produção de Epo biologicamente activa, a partir de células hospedeiras de mamífero, tornou disponíveis, pela primeira vez, quantidades de Epo adequadas para aplicações terapêuticas. Além disso, o conhecimento da sequência génica e o aumento da disponibilidade de proteína purificada levou a uma melhor compreensão do modo de acção desta proteína.

A Epo derivada de urina humana (Miyake et al. supra) e a Epo humana recombinante, expressa em células de mamífero contêm três cadeias oligossacarídicas ligadas a N e uma ligada a O que, em conjunto, compreendem, cerca de 40% do peso molecular total da glicoproteína. A glicosilação ligada a N ocorre em resíduos de asparagina localizados nas posições 24, 38 e 83, enquanto a glicosilação ligada a O ocorre num resíduo de serina localizado na posição 126 (Lai et al. J. Biol. Chem. 261, 3116 (1986); Broudy et al. Arch. Biochem. Biophys. 265, 329 (1988)). Foi verificado que as cadeias oligossacarídicas estavam modificadas com resíduos de ácido siálico terminais, com cadeias ligadas a N 2 tendo, tipicamente, até quatro ácidos siálicos por cadeia e cadeias ligadas a 0 tendo até dois ácidos siálicos. Um polipéptido de Epo pode, consequentemente, conter até um total de 14 ácidos siálicos. Vários estudos demonstraram que as alterações das cadeias de hidratos de carbono da Epo podem afectar a actividade biológica. No entanto, num estudo, a remoção de cadeias oligossacarídicas ligadas a N ou ligadas a 0, isoladamente ou em conjunto, por mutagénese dos resíduos de asparagina ou de serina que são locais de glicosilação, reduz significativamente a actividade in vitro da Epo alterada que é produzida em células de mamífero (Dube et al. J. Biol. Chem. 263, 17516 (1988)). No entanto, DeLorme et al. (Biochemistry 31, 9871-9876 (1992)) referiram que a remoção de locais de glicosilação ligados a N na Epo reduzia a actividade biológica in vivo, mas não a in vitro. A relação entre o teor em ácido siálico da Epo e a actividade biológica in vivo foi divulgada por determinação da actividade in vivo das isoformas da Epo isoladas. Foi verificado que um aumento gradual do teor em ácido siálico por molécula de Epo, originou um aumento gradual correspondente da actividade biológica in vivo, como medida pela capacidade de concentrações equimolares de isoformas da Epo isoladas aumentarem o hematócrito de murganhos normais (Egrie et al. Glycoconjugate J. 10, 263 (1993)). As isoformas da Epo tendo um teor mais elevado em ácido siálico apresentavam, também, um tempo de semi-vida no soro mais longo, mas apresentavam afinidade reduzida para o receptor da Epo, sugerindo que a semi-vida no soro seja um factor importante para a actividade biológica in vivo. 3 A introdução de novos locais de glicosilação no polipéptido da Epo pode resultar na produção de moléculas com cadeias de hidrato de carbono adicionais. Ver as Publicações PCT N° WO91/05867 e WO94/09257. São divulgados análogos de glicosilação da Epo tendo, pelo menos, uma cadeia adicional de hidrato de carbono ligada a N e/ou tendo, pelo menos, uma cadeia adicional de hidrato de carbono ligada a 0. Um análogo de glicosilação tendo uma cadeia adicional ligada a N revelou ter uma semi-vida circulante mais longa, em comparação com a Epo humana recombinante (rHuEpo) (isoformas 9-14) e com uma isoforma da rHuEpo purificada, tendo 14 ácidos siálicos por molécula. A administração da eritropoietina humana recombinante (rHuEpo) é eficaz no aumento dos níveis dos glóbulos vermelhos em doentes anémicos com doença renal terminal (Eschbach et ai. New Eng. J. Med. 316, 73-38 (1987)). Estudos subsequentes demonstraram que o tratamento com rHuEpo pode corrigir a anemia associada a várias outros estados (Fischl et ai. New Eng. J. Med. 322, 1488-1493 (1990); Laupacis, Lancet 341, 1228-1232 (1993). Foram concedidas aprovações reguladoras para a utilização da rHuEpo no tratamento da anemia associada com CRF, anemia relacionada com terapia com AZT (zidovudina) em doentes infectados com HIV, anemia em doentes com malignidades não-mielóides recebendo quimioterapia e anemia em doentes submetidos a cirurgia, para reduzir a necessidade de transfusões alogénicas de sangue. A terapia actual para todas as indicações aprovadas (excepto para a indicação para cirurgia) envolve uma dose inicial de entre 50-150 Unidades/kg, três vezes por semana (TIW), administrada através de uma injecção intravenosa (IV) ou subcutânea (SC) , para alcançar a gama alvo do hematócrito sugerida. Para a indicação para cirurgia, a rHuEpo é administrada em intervalos de 10 dias antes da cirurgia, no dia 4 da cirurgia e ao fim de quatro dias (Folheto Informativo de EPOGEN®, 23/12/96). Em geral, as doses iniciais da rHuEpo, normalmente recomendadas, aumentam o hematócrito na gama alvo em cerca de seis a oito semanas. Logo que a gama alvo do hematócrito tenha sido alcançada, é estabelecido um programa de dosagem de manutenção, que irá variar de acordo com o doente, mas consiste, tipicamente, em três vezes por semana, em doentes anémicos com CRF. A administração da rHuEpo descrita acima é um regime eficaz e bem tolerado de tratamento da anemia. 0 documento EP 0267678 divulga uma célula epitelióide de roedor transformada com um vector de ADN recombinante incluindo uma sequência de ADN codificando a eritropoietina humana, que é capaz do produzir eritropoietina humana glicosilada ligada a N e ligada a O.

Seria desejável ter uma terapia com uma maior eficácia do que a rHuEpo. Uma vantagem dessa molécula consistiria em poder ser administrada menos frequentemente e/ou numa dose mais baixa. Os tratamentos actuais de doentes sofrendo de anemia requerem a administração de EPOGEN® três vezes por semana e, para administração a doentes de cirurgia, uma vez por dia. Um programa de dosagem menos frequente seria mais conveniente, para os médicos e para os doentes, especialmente para os doentes que não fazem visitas regularmente planeadas a consultórios médicos ou clínicas ou os que auto-injectam a sua Epo. Outra vantagem de uma molécula mais potente consiste em ser introduzido menos fármaco nos doentes, para um aumento comparável do hematócrito.

Consequentemente, é um objectivo da invenção identificar moléculas mais potentes para o tratamento da anemia que possam permitir um programa de dosagem menos frequente. É um objectivo 5 adicional da invenção proporcionar moléculas que aumentem e mantenham o hematócrito em níveis que sejam, pelo menos, comparáveis aos da Epo, quando administradas numa dose mais baixa. É, também, um objectivo da invenção que estas moléculas, seleccionadas para a dosagem menos frequente, sejam, pelo menos tão bem toleradas como a rHuEpo e, potencialmente, melhor toleradas em alguns doentes.

Sumário da Invenção

Foi verificado que um análogo hiperglicosilado da Epo designado N47 (Asn30Thr32Val87Asn88Thr90Epo) tem uma semi-vida no soro mais longa do que a eritropoietina humana recombinante (rHuEpo) e uma maior actividade in vivo quando administrado na mesma dose e frequência que a rHuEpo. Além disso, o análogo demonstrou aumentar o hematócrito em murganhos, administrado uma vez por semana, o que é comparável com o aumento do hematócrito para a rHuEpo administrada três vezes por semana. A farmacocinética do análogo N47 da Epo, administrado a murganhos e a humanos, foi semelhante. São formas de realização da presente invenção: 1. Um análogo da eritropoietina humana compreendendo, pelo menos, um local de glicosilação adicional em qualquer das posições 52, 53, 55, 86 e 114 da sequência da eritropoietina humana, em que é adicionada uma cadeia de hidrato de carbono ligada a N ao local. 6 2. 0 análogo de 1 compreendendo, pelo menos, dois locais de glicosilação adicionais, em que é ligada uma cadeia de hidrato de carbono a cada um dos locais. 3. 0 análogo de 1 compreendendo, pelo menos, três locais de glicosilação adicionais, em que é ligada uma cadeia de hidrato de carbono a cada um dos locais. 4. 0 análogo de 1 compreendendo, pelo menos, quatro locais de glicosilação adicionais, em que é ligada uma cadeia de hidrato de carbono a cada um dos locais. 5. Um análogo da eritropoietina humana seleccionado do grupo consistindo em:

Asn52 Thr54 Epo; Asn53 Thr55 Epo; Asn114 Thr116 Epo; Asn30 Thr32 Asn53 Thr55 Vai87 Asn88Thr90 Epo; Asn55 Thr57 Epo; Asn86 Vai87 Thr88 Epo; Asn30 Thr32 Asn53 Thr55 Epo; Asn30 Thr32 Asn114 Thr116 Epo; e Asn30 Thr32 Asn53 Thr55 Vai87 Asn88 Thr90 Asn114 Thr116 6. 0 análogo de 1-5 que é o produto de expressão de uma sequência de ADN exógeno. 7. Uma sequência de ADN codificando o análogo de 1-5. 7 8. Uma célula hospedeira eucariota transfectada com a sequência de ADN de 7 de uma forma permitindo à célula hospedeira expressar o análogo. 9. Uma composição compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz do análogo de 1-5 em conjunto com um diluente, adjuvante ou veiculo farmaceuticamente aceitável. 10. Utilização do análogo de qualquer de 1 a 5 para preparar uma composição farmacêutica para aumentar e manter hematócrito num mamífero. 11. Utilização do análogo de 10, em que o análogo se destina a ser administrado menos frequentemente que uma quantidade molar equivalente de eritropoietina humana recombinante para obter um hematócrito alvo comparável. 12. Utilização do análogo de 11, em que a quantidade do análogo se destina a ser administrada cerca de uma vez por semana, cerca de uma vez cada duas semanas ou cerca de uma vez por mês. 13. Utilização do análogo de 10, em que o análogo se destina a ser administrado numa quantidade molar mais baixa do que a eritropoietina humana recombinante para obter um hematócrito alvo comparável. 14. Utilização do análogo de 12, em que a quantidade do análogo que se destina a ser administrada é cerca de 0,025 a 1,5 g de péptido da eritropoietina por kg por dose três vezes por semana. 15. Utilização do análogo de 12, em que a quantidade do análogo que se destina a ser administrada é inferior a cerca de 0,025 g de péptido da eritropoietina por kg por dose, três vezes por semana. 16. O análogo de qualquer de 1 a 5 para utilização no aumento e na manutenção do hematócrito num mamífero. 17. Um método para produzir um análogo da eritropoietina humana compreendendo cultivar a célula hospedeira de 8 sob condições que permitem a expressão do análogo e a recuperação do análogo do meio celular.

Descrição das Figuras A Figura 1 mostra a sequência de aminoácidos da eritropoietina humana. A Figura 2 mostra uma análise de transferência de Western da rHuEpo e de análogos hiperglicosilados da Epo, provenientes da expressão de células CHO em meio isento de soro. A construção dos análogos N53 e N61 é descrita no Exemplo 1. É indicado o número de cadeias de hidrato de carbono ligadas a N em cada análogo. A Figura 3 compara a actividade da rHuEpo, dos análogos N4, N18 e N50 (contendo quatro cadeias de hidrato de carbono ligadas a N) , N47 (contendo cinco cadeias de hidrato de carbono ligadas a N) e N53 (contendo seis cadeias de hidrato de carbono ligadas a N) da Epo, num bioensaio com murganhos policitémicos ex-hipóxicos. Os processos 9 experimentais são descritos no Exemplo 3. Cada ponto representa a resposta média de cinco animais. Os análogos N4, N18 e N47 foram descritos, anteriormente, no documento WO94/09257. A Figura 4 compara a semi-vida no soro da rHuEpo e do análogo N47 da Epo, administrados a ratos normais, por injecção intravenosa (IV). Os processos experimentais são descritos no Exemplo 4. Os resultados sao a média (± SD) para cada grupo. A Figura 5 compara a semi-vida no soro da rHuEpo e do análogo N47 da Epo , administrados a cães Beagle, por injecção intravenosa (IV). Os processos experimentais são descritos no Exemplo 4. Os resultados sao a média (± SD) para cada grupo. A Figura 6 mostra o aumento do hematócrito em murganhos, em resposta a várias doses da rHuEpo ou do análogo N47 da Epo, administrados por injecção intraperitoneal (IP), três vezes por semana (TIW), durante seis semanas. Os processos experimentais são descritos no Exemplo 5. Os resultados apresentados são a média (± SD) da alteração do hematócrito do grupo, para cada grupo de dose. A Figura 7 compara a potência relativa da rHuEpo e do análogo N47 da Epo em murganhos, injectados pelas vias de administração intraperitoneal (IP) ou intravenosa (IV), numa frequência de uma vez por semana (QW) ou três vezes por semana (TIW). Os processos experimentais são descritos no Exemplo 5. Cada ponto representa a média (± SD) dos dados obtidos a partir de experiências distintas, como se segue: 10 Ν47, IP, TIW (n = 5); N47, IV, TIW (n = 1); N47, IP, QW (n = 2); N47, IV, QW (n = 3); rHuEpo, IP, TIW (n = 5); rHuEpo, IV, QW (n = 2) . Cada experiência utilizou 7-13 murganhos por dose. A Figura 8 mostra o aumento do hematócrito em murganhos, em resposta a várias doses da rHuEpo ou do análogo N47 da Epo, administrados por injecção intravenosa (IV), uma vez por semana (QW), durante, aproximadamente, seis semanas. Os processos experimentais são descritos no Exemplo 5. Os resultados apresentados são a média (± SD) da alteração do hematócrito do grupo, para cada grupo de dose. A Figura 9 mostra o aumento do hematócrito em murganhos, em resposta a várias doses do análogo N47 da Epo, administrado por injecção intravenosa (IV), uma vez por semana (QW) ou uma vez cada duas semanas (EOW), durante, aproximadamente, seis semanas. Os processos experimentais são descritos no Exemplo 5. Os resultados apresentados são a média (± SD) da alteração do hematócrito do grupo, para cada grupo de dose.

Descrição Detalhada da Invenção A invenção proporciona meios para aumentar e manter o hematócrito, em que uma quantidade terapeuticamente eficaz de um análogo hiperglicosilado da eritropoietina se destina a ser administrada numa composição farmacêutica. 0 análogo destina-se a ser administrado menos frequentemente do que uma quantidade equivalente molar da rHuEpo, para obter um hematócrito alvo comparável. A invenção proporciona também meios para aumentar e manter o hematócrito, em que um análogo hiperglicosilado em 11 quantidades molar mais baixas do que rHuEpo se destina a ser administrado para obter um hematócrito alvo comparável. A composição pode ser administrada pelas vias intravenosa, subcutânea ou intraperitoneal. Nas reivindicações são definidas as formas de realização da invenção.

Surpreendentemente, foi verificado que o análogo N47, um análogo hiperglicosilado da Epo, descrito no documento WO94/09257, podia permitir um aumento do hematócrito, administrado uma vez por semana, o que era comparável com o observado para a rHuEpo, administrada três vezes por semana. 0 análogo N47 tem as seguintes modificações dos aminoácidos: ala para asn em 30; his para thr em 32; pro para vai em 87; trp para asn em 88; e pro para thr em 90, as quais resultaram na adição de duas cadeias de hidrato de carbono ligadas a N nos resíduos de asparagina 30 e 88. O análogo foi expresso em células de ovário de hamster chinês (CHO) (como descrito no Exemplo 1) e foi purificado como descrito no Exemplo 2, para originar isoformas de 17 a 22 ácidos siálicos. O análogo N47 revelou uma semi-vida mais longa no soro, em ratos e cães beagle, do que a rHuEpo, quando injectado intravenosamente (Figuras 4 e 5). Quando injectado intraperitonealmente, três vezes por semana, o N47 induziu aumentos do hematócrito de murganhos normais, comparáveis aos da rHuEpo, em concentrações mais baixas (Figura 6) . A potência do N47 foi determinada como sendo, cerca de, 3 a 4 vezes mais elevada do que a rHuEpo, quando administrada três vezes por semana (Figuras 6 e 7) . Quando administrada uma vez por semana, em doses semelhantes, a rHuEpo revelou uma baixa estimulação do hematócrito em murganhos normais, enquanto que o N47 originou um aumento significativo (Figura 8). A potência do N47 foi cerca de 14 vezes mais elevada do que a da rHuEpo para a dosagem de uma vez por semana (Figura 7) . Significativamente, a 12 resposta do hematócrito para o análogo N47, administrado uma vez por semana, é comparável à da rHuEpo, administrada três vezes por semana. Mesmo quando administrado uma vez cada duas semanas, ο N47 produzia, ainda, aumentos significativos do hematócrito de murganhos normais (Figura 9) . No seu conjunto, os dados indicaram que os análogos hiperglicosilados da Epo e o análogo N47, em particular, podem ser utilizados, vantajosamente, para aumentar o hematócrito, utilizando dosagens menos frequentes do que para o tratamento actual com rHuEpo.

Foi, também, demonstrado que os resultados descritos acima obtidos em murganhos, podem ser extrapolados para humanos. Os parâmetros farmacocinéticos da administração da rHuEpo e do análogo N47 a 11 doentes em Diálise Peritoneal Contínua Ambulatória (CAPD) , demonstram que o análogo N47 tem uma semi-vida no soro três vezes mais longa do que a rHuEpo (Exemplo 6 e Tabela 5). Estes resultados sugerem que os análogos hiperglicosilados da Epo permitem uma dosagem menos frequente do que a rHuEpo, em humanos.

Como aqui utilizado, o termo "análogo hiperglicosilado da Epo" refere-se a Epo compreendendo, pelo menos, um local adicional de glicosilação, com uma cadeia adicional de hidrato de carbono adicionada ao local. Os locais de glicosilação podem ser para cadeias de hidrato de carbono ligadas a N ou ligadas a 0. São introduzidos novos locais de glicosilação ligados a N, por alterações na sequência de ADN, de forma a codificar o local de consenso para a adição de hidratos de carbono ligados a N (os aminoácidos Asn-X-Ser/Thr), na cadeia polipeptídica, enquanto que os novos locais ligados a 0 são introduzidos por alterações na sequência de ADN, de forma a codificar um resíduo serina ou treonina. Os análogos são construídos por técnicas de mutagénese 13 para introduzir adições, eliminações ou substituições de resíduos de aminoácidos que aumentam ou alteram locais no polipéptido da Epo, que se encontram disponíveis para glicosilação. 0 ADN codificando um análogo hiperglicosilado da Epo é transfectado numa célula hospedeira eucariota e a glicoproteína expressa é analisada para a presença de uma cadeia de hidrato de carbono adicional.

Os análogos hiperglicosilados da Epo demonstraram actividade in vitro, a qual era comparável ou mesmo inferior à determinada para a rHuEpo, sugerindo que a ligação ao receptor da Epo não seja intensificada e podendo, em alguns casos, ser diminuída, pela adição de cadeias de hidrato de carbono. No entanto, tipicamente, a hiperglicosilação pode aumentar a semi-vida no soro e, potencialmente, originar actividade biológica in vivo aumentada. Um análogo da Epo tendo uma cadeia de hidrato de carbono ligada a N adicional, na posição 88, apresentava afinidade reduzida para o receptor, em comparação com a rHuEpo (isoformas 9-14) ou com uma isoforma da rHuEpo purificada tendo 14 ácidos siálicos por molécula, demonstrando, no entanto, uma semi-vida circulante mais longa e uma actividade in vivo intensificada, em comparação com uma mistura das isoformas 9-14 da Epo ou com a isoforma 14 da Epo isolada.

Os análogos hiperglicosilados da Epo, os quais podem ser administrados de acordo com a presente invenção, irão ter, pelo menos, uma cadeia de hidrato de carbono adicional ligada a N ou ligada a 0. Nas reivindicações são definidas formas de realização da invenção. Numa forma de realização, os análogos irão ter duas cadeias de hidrato de carbono adicionais ligadas a N. Noutras formas de realização, os análogos irão ter três, quatro ou mais cadeias de hidrato de carbono adicionais ligadas 14 a N. Como exemplos, os análogos da invenção irão ter, pelo menos, uma cadeia adicional ligada a N em um ou mais dos resíduos de aminoácido 30, 51, 57, 69, 88, 89, 136 e 138 da sequência da Epo humana. Numa forma de realização, o análogo tem cadeias de hidrato de carbono adicionais ligadas a N nos resíduos 30 e 88 da Epo humana. A numeração dos resíduos de aminoácido da Epo humana é como apresentada na Figura 1 e na SEQ ID N°: 1. A Figura 1 mostra um polipéptido da Epo maduro previsto com 166 aminoácidos, enquanto que a Epo produzida de modo recombinante, tem 165 aminoácidos após a remoção do resíduo de arginina C-terminal. É entendido que a rHuEpo e os análogos hiperglicosilados da Epo podem ter 165 ou 166 aminoácidos.

Os análogos da invenção podem ter, pelo menos, quatro cadeias de hidrato de carbono ligadas a N. Das quatro cadeias, três podem estar nos locais de ocorrência natural nas posições 24, 38 e 83. No entanto, é tido em consideração que alguns análogos da invenção podem ter alterações de um ou mais dos locais de glicosilação de ocorrência natural, tais como um ou mais dos locais serem eliminados e substituídos por um novo local. Esses análogos são, também, proporcionados pela invenção. Por exemplo, qualquer um dos locais nas posições 24, 38 e 83 pode ser eliminado e substituído por um local na posição 88. Opcionalmente, os análogos podem ter um local ligado a O, na posição 126. A invenção proporciona novos análogos hiperglicosilados da Epo tendo, pelo menos, uma cadeia de hidrato de carbono adicional. Foi verificado que é adicionada uma cadeia de hidrato de carbono adicional ligada a N em qualquer das posições 52, 53, 55, 86 e 114, as quais foram modificadas para serem um local de glicosilação. As formas de realização específicas incluem os 15 análogos N49 até N61, como descrito na Tabela 1. Os novos análogos irão ter, pelo menos, um novo local de glicosilação ligado a N, em qualguer das posições 52, 53, 55, 86 e 114 e podem, ainda, compreender cadeias de hidrato de carbono adicionais, ligadas a N ou ligadas a 0, em outros locais. Os análogos podem ter uma, duas, três ou quatro cadeias de hidrato de carbono adicionais ou mais de quatro cadeias adicionais. Numa forma de realização preferida, os análogos irão ter três cadeias de hidrato de carbono adicionais ligadas a N (um total de seis cadeias ligadas a N) . Em outra forma de realização preferida, os análogos irão ter quatro cadeias adicionais ligadas a N (um total de sete cadeias ligadas a N) . Os análogos tendo três, quatro ou mais de quatro cadeias de hidrato de carbono adicionais ligadas a N podem ter, mas não estão limitadas a uma cadeia adicional em qualquer das posições 52, 53, 55, 86 e 114.

Surpreendentemente, foi verificado que um análogo hiperglicosilado com três cadeias adicionais ligadas a N, nas posições 30, 53 e 88 (um total de seis cadeias ligadas a N) tem uma actividade in vivo superior à do análogo N47 com duas cadeias adicionais (um total de cinco). Os resultados são apresentados na Figura 3. É evidente que a actividade in vivo dos análogos está directamente dependente do número de cadeias de hidrato de carbono ligadas a N. Estes resultados podem ser extrapolados para o contexto terapêutico, em que os análogos que têm mais cadeias de hidrato de carbono ligadas a N do que N47 podem ser doseados ainda menos frequentemente.

Os análogos podem ser preparados por várias técnicas de mutagénese disponíveis para um especialista na técnica, tais como mutagénese dirigida para um local, mutagénese por PCR e mutagénese por cassete (Zoller et ai. Meth. Enz. 100, 468-500 16 (1983); Higuchi, em PCR Protocols pp. 177-183 (Academic Press, 1990); Wells et al. Gene 34, 315-323 (1985)). O exemplo 1 descreve a utilização de técnicas de mutagénese por PCR, para construir novos análogos hiperglicosilados da Epo.

Uma seguência de ADN da Epo gue sofreu mutagénese é inserida num vector de expressão, utilizando técnicas padrão, sendo o vector adequado para a manutenção numa célula hospedeira de mamífero. O vector irá conter, tipicamente, os seguintes elementos: promotor e outros elementos reguladores "a montante", origem da replicação, locais de ligação de ribossomas, local de terminação da transcrição, local de clonagem múltipla e marcador de selecção que são compatíveis com a utilização numa célula hospedeira de mamífero. Os vectores podem, também, conter elementos que permitem, igualmente, a propagação e a manutenção em células hospedeiras procariotas.

As células ou as linhas celulares adequadas incluem qualquer uma com origem em mamíferos, incluindo origem humana. Os exemplos incluem COS-7 (N° de acesso da ATCC CRL 1651), 293 humana, rim de hamster bebé (BHK, N° de acesso da ATCC CCL 10), células de ovário de hamster chinês (incluindo células deficientes em redutase do di-hidrofolato (DHFR), Urlab et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77, 4216-4220 (1980)) Outras linhas celulares de mamífero adequadas incluem, mas não estão limitadas a HeLa, L-929 e 3T3 de murganho. Numa forma de realização preferida, são utilizadas células CHO deficientes em DHFR. São introduzidos vectores compreendendo sequências codificando os análogos de hiperglicosilação da Epo, em células hospedeiras, por técnicas de transformação ou de transfecção padrão. A cultura, amplificação e rastreio de células 17 hospedeiras transformadas ou transfectadas são realizados utilizando métodos publicamente disponíveis (Gething et al. Nature 293, 620-625 (1981); Kaufman et al. Mol. Cell. Biol. 5, 1750-1759 (1985); Patente U.S. N° 4419446). As células hospedeiras contendo sequências de ADN codificando análogos hiperglicosilados da Epo são cultivadas sob condições que permitem a expressão dos análogos. Os análogos são recuperados a partir dos meios celulares e purificados utilizando processos, essencialmente como descritos anteriormente (documento WO94/09257) e os do Exemplo 2. Os processos de purificação permitem o isolamento de ácido siálico superior, contendo isoformas da Epo resultantes da adição de cadeias de hidrato de carbono adicionais.

Os análogos hiperglicosilados da Epo podem incluir, além de novos locais de glicosilação, adições, eliminações ou substituições dos resíduos de aminoácido que não criam novos locais de glicosilação e não alteram substancialmente a actividade biológica do análogo hiperglicosilado. Esses locais ou regiões individuais da Epo que podem ser alterados sem afectar a actividade biológica, podem ser determinados pelo exame da estrutura do complexo do receptor Epo-Epo, como descrito em Syed et al. Nature 395, 511 (1998) . O exame da estrutura do complexo do receptor Epo-Epo revela os resíduos que interagem ou que estão em estreita proximidade com o local de ligação receptor da Epo e que devem ser evitados quando são realizadas alterações na sequência de aminoácidos da Epo. Alternativamente, as regiões que podem tolerar substituições de aminoácidos, podem ser determinadas empiricamente por rastreio de mutagénese de alanina (Cunningham et al. Science 244, 1081-1085 (1989). Neste método, os resíduos de aminoácido seleccionados são substituídos, individualmente, com um 18 aminoácido neutro (e. g., alanina), para determinar os efeitos sobre a actividade biológica. E geralmente reconhecido que as modificações de aminoácidos conservadoras apresentam uma menor probabilidade de perturbar a estrutura e/ou a função de um polipéptido. Consequentemente, a invenção abrange uma ou mais modificações de aminoácido conservadoras, dentro de um análogo hiperglicosilado da Epo. As modificações de aminoácidos conservadoras envolvem, geralmente, a substituição de um aminoácido por outro que seja semelhante em estrutura e/ou de função (e. g., aminoácidos com cadeias laterais semelhantes em tamanho, carga e forma). A natureza destas modificações é bem conhecida de um especialista na técnica e está resumida na Tabela 1 abaixo. Essas substituições conservadoras são apresentadas sob o titulo "Substituições Preferidas". São também contempladas modificações mais substanciais ("Substituições Exemplificativas") , as quais podem, também, ser introduzidas. Um especialista na técnica irá ter em consideração que, inicialmente, os locais deverão ser modificados por substituição, de uma forma relativamente conservadora. Se essas substituições resultarem numa retenção da actividade biológica, então, poderão ser introduzidas modificações mais substanciais (Substituições Exemplificativas) e/ou podem ser realizadas outras adições/eliminações e os produtos resultantes podem ser submetidos a rastreio. 19 TABELA 1: Substituições de Aminoácidos

Resíduo Original Substituições Substituições

Preferidas Exemplificativas

Ala (A) Vai Vai; Leu; Ile Arg (R) Lys Lys; Gin; Asn Asn (N) Gin Gin; His; Lys; Arg Asp (D) Glu Glu Cys (C) Ser Ser Gin (Q) Asn Asn Glu (E) Asp Asp Gly (G) Pro Pro His (H) Arg Asn; Gin; Lys; Arg lie (I) Leu Leu; Vai; Met; Ala; Phe; norl eucina Leu (L) Ile norleucina; Ile; Vai; Met; Ala; Phe Lys (K) Arg Arg; Gin; Asn Met (M) Leu Leu; Phe; Ile Phe (F) Leu Leu; Vai; Ile; Ala Pro (P) Gly Gly Ser (S) Thr Thr Thr (T) Ser Ser Trp (W) Tyr Tyr 20

Resíduo Original Tyr (Y)

Vai (V) (continuação)

Substituições

Preferidas

Phe

Leu

Substituições Exemplificativas Trp; Phe; Thr; Ser

Ile; Leu; Met; Phe; Ala; norleucina São, também, proporcionadas pela invenção, eliminações ou adições de aminoácidos num análogo hiperglicosilado da Epo, as quais não afectam, substancialmente, a actividade biológica. Essas adições e eliminações podem situar-se no N-terminal ou no C-terminal do polipéptido ou podem ser internas a este. Em geral, as eliminações ou as adições relativamente pequenas irão afectar com uma menor probabilidade a estrutura e/ou a função da Epo ou de um análogo hiperglicosilado. Numa forma de realização, as eliminações ou as adições podem ser de 5-10 resíduos, alternativamente, de 2-5 resíduos de aminoácido ou de 1-2 resíduos. O termo "quantidade molar" refere-se a uma quantidade de um análogo hiperglicosilado ou de rHuEpo que é baseada no peso molecular do polipéptido da eritropoietina correspondente sem glicosilação. As quantidades equivalentes da rHuEpo e do análogo referem-se a quantidades que são iguais, tendo em consideração as variações normais dos processos utilizados para determinar essas quantidades. É necessário determinar as quantidades equivalentes desta forma, uma vez que o peso molecular da rHuEpo e dos análogos irão variar, dependendo do número de cadeias de hidrato de carbono. Para a rHuEpo, o peso molecular do 21 polipéptido da eritropoietina é calculado com base nos resíduos de aminoácido 1-165, como apresentado na Figura 1 e na SEQ ID N°: 1. Para análogos hiperglicosilados, os pesos moleculares são ajustados dependendo das modificações de aminoácidos nos resíduos 1-165 da Figura 1 e da SEQ ID N°: 1. A frequência de dosagem para um análogo hiperglicosilado irá variar, dependendo do estado a ser tratado e do hematócrito alvo, mas, em geral, será inferior a três vezes por semana. A frequência de dosagem será de, cerca de, duas vezes por semana, cerca de, uma vez por semana. A frequência de dosagem pode ser, também, inferior a uma vez por semana, por exemplo, cerca de, uma vez cada duas semanas (cerca de uma vez cada 14 dias) , uma vez por mês ou uma vez cada dois meses. É entendido que as frequências de dosagem efectivamente utilizadas podem variar um pouco em relação às frequências aqui divulgadas, devido a variações nas respostas aos análogos Epo, por parte de indivíduos diferentes; o termo "cerca de" pretende reflectir essas variações.

Como aqui utilizado, o termo "quantidade terapeuticamente eficaz" refere-se a uma quantidade de um análogo hiperglicosilado que origina um aumento do hematócrito para um hematócrito alvo ou para uma gama de hematócrito alvo que proporciona um benefício a um doente ou, alternativamente, mantém um doente num hematócrito alvo ou dentro de uma gama de hematócrito alvo. A quantidade irá variar entre indivíduos e irá depender de vários factores, incluindo a condição física global do doente, gravidade e a causa subjacente da anemia e essencialmente do hematócrito alvo para o doente individual. Um hematócrito alvo é, tipicamente, pelo menos, cerca de 30% ou numa gama de 30%-38%, de um modo preferido, acima de 38% e, de 22 um modo mais preferido, 40%-45%. As orientações gerais referentes às gamas de hematócrito alvo da rHuEpo são, também, encontradas no folheto informativo do EPOGEN® datado de 23/12/96 e são 30%-36% ou, alternativamente, 32%-38%, como agui referido. É entendido que esses alvos irão variar entre indivíduos, para que seja necessário o critério médico na determinação de um hematócrito alvo real para qualquer doente determinado. No entanto, a determinação de um hematócrito alvo encontra-se completamente dentro das capacidades do especialista na técnica.

Uma quantidade terapeuticamente eficaz das presentes composições pode ser facilmente determinada por um especialista na técnica. 0 Exemplo 6 estabelece um protocolo clínico que tem como objectivo a determinação de uma quantidade terapeuticamente eficaz do análogo N47 numa dosagem de uma vez por semana e três vezes por semana. Uma gama de dose para uma administração uma vez por semana é de cerca de 0,075 a cerca de 4,5 pg de péptido de eritropoiet ina por kg por dose. Uma gama de dose para uma administração três vezes por semana é de 0,025 a 1,5 pg de péptido de eritropoietina por kg por dose. Esta gama de dose pode ser empregue com outros análogos hiperglicosilados da Epo, sendo que quaisquer correcções na gama de dosagem constituem rotina para um especialista na técnica.

Uma vantagem significativa da presente invenção é a capacidade de correlacionar a extensão da hiperglicosilação, com uma quantidade de dose ou com um intervalo de dosagem que poderá permitir "adaptar" um análogo da Epo a uma determinada dose ou programa de dosagem. Com base nas actividades in vivo aumentadas dos análogos da Epo, tendo uma, duas ou três cadeias de hidrato de carbono adicionais, como apresentado na Figura 3, o médico assistente pode seleccionar um análogo que seja apropriado e 23 conveniente para o estado anémico que está a ser tratado. Por exemplo, em doentes que são anémicos de forma aguda e com necessidade de uma grande dose eficaz ou em doentes que necessitam de um tratamento de mais longa duração, pode ser preferida a administração de um análogo hiperglicosilado, com três, quatro ou mesmo mais cadeias de hidrato de carbono adicionais. Para outros doentes que sofram de anemia menos grave ou necessitem do tratamento durante um tempo relativamente curto, pode ser preferido um análogo com uma ou duas cadeias de hidrato de carbono adicionais. Os análogos da presente invenção proporcionam ao médico uma flexibilidade significativa, na prevenção e tratamento de anemia, que pode resultar de uma ampla gama de estados subjacentes. A invenção proporciona, também, a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de ferro para manter uma eritropoiese aumentada durante a terapia. A quantidade a ser administrada pode ser facilmente determinada por um especialista na técnica com base na terapia com rHuEpo. A presente invenção pode ser utilizada para estimular a produção de glóbulos vermelho e prevenir e tratar a anemia. Entre os estados tratáveis pela presente invenção, incluem-se a anemia associada ao declínio ou perda da função renal (deficiência renal crónica), anemia associada à terapia mielossuppressora, tais como quimioterapia ou fármacos anti-virais (tal como AZT), anemia associada à progressão de cancros não-mielóides, anemia associada a infecções virais (tal como HIV) e anemia de doença crónica. Os estados que podem levar à anemia num indivíduo de outra forma saudável, tal como uma perda previsível de sangue durante a cirurgia são, também, tratáveis. Em geral, qualquer estado tratável com rHuEpo pode 24 ser, também, tratado com os análogos hiperglicosilados da Epo da invenção. A invenção proporciona, também, composições farmacêuticas compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um análogo hiperglicosilado da Epo, em conjunto, com um diluente, veículo, solubilizante, emulsionante, conservante e/ou adjuvante farmaceuticamente aceitável. A composição será adequada para um programa de dosagem de menos de três vezes por semana. A composição pode estar sob uma forma liquida ou liofilizada e compreende um diluente (tampões Tris, citrato, acetato ou fosfato), tendo vários valores de pH e forças iónicas, solubilizantes, tais como Tween ou Polissorbato, veículos, tais como albumina do soro humano ou gelatina, conservantes, tais como timerosal, parabenos, cloreto de benzilalcónio ou álcool benzílico, antioxidantes, tais como ácido ascórbico ou metabissulfito de sódio, e outros componentes, tais como lisina ou glicina. A selecção de uma composição particular irá depender de vários factores, incluindo o estado a ser tratado, a via de administração e os parâmetros farmacocinéticos pretendidos. Um levantamento mais extenso de componentes adequados para composições farmacêuticas encontra-se em Remington's

Pharmaceutical Sciences, 18a ed. A. R. Gennaro, ed. Mack,

Easton, PA (1980). Numa forma de realização preferida, os análogos de glicosilação da Epo da invenção são formulados sob a forma líquida numa solução tamponada com cloreto de sódio/citrato de sódio isotónica, contendo albumina humana e contendo, opcionalmente, álcool benzílico como conservante. De um modo preferido, as composições contêm análogos que têm uma, duas, três, quatro ou mais cadeias de hidrato de carbono adicionais. 25

As composições da invenção são, de um modo preferido, administradas por injecção subcutânea ou intravenosa. A via de administração consequentemente escolhida irá depender de vários factores e pode ser determinada por um especialista na técnica.

Os exemplos seguintes são proporcionados para ilustrar a invenção de um modo mais completo, mas não devem ser interpretados como uma limitação ao seu âmbito. EXEMPLO 1

Construção de Análogos Hiperglicosilados da Epo

Construção_de_ADNc_codif icantes_de_Análogos

Hiperglicosilados da Epo

Os análogos da Epo foram realizados por mutagénese in vitrOf utilizando vários métodos diferentes. Os análogos N49 e N50 foram construídos como descrito no documento WO94/09257. Foram também construídos análogos, por variações de métodos de PCR (reacção em cadeia da polimerase) por sobreposição. 0 processo básico incluiu dois passos sucessivos. No primeiro passo, foram realizadas duas reacções (PCR1 e PCR2) sobre o ADN molde da Epo ou do análogo da Epo, utilizando um total de quatro oligonucleótidos: um iniciador 5' (directo), um iniciador mutagénico inverso, um iniciador mutagénico directo (normalmente complementar ao iniciador mutagénico inverso) e um iniciador 3' (inverso). Os iniciadores mutagénicos continham as modificações nucleotídicas pretendidas, assim como 6-14 nucleótidos de correspondência exacta em cada lado destas modificações. A PCR1 utilizou o iniciador 5' (directo) e o iniciador mutagénico 26 inverso. A PCR2 utilizou o iniciador 3' (inverso) e o iniciador mutagénico directo. Os fragmentos de ADN amplificados foram separados por electroforese em gel de agarose. Foram excisados do gel pequenos pedaços de agarose contendo fragmentos de ADN com o tamanho correcto. Os fragmentos de ADN das PCR1 e PCR2 foram combinados em conjunto e foi realizada uma terceira reacção de PCR utilizando apenas os iniciadores 5' directo e 3' inverso. Deste modo, foi amplificado um segmento de ADN completo contendo as mutações pretendidas. Em vários casos, foram combinadas duas ou três mutações, pela introdução de uma nova substituição no ADN que já continha uma modificação, utilizando o mesmo processo de PCR. Para construir estes análogos com múltiplos locais de glicosilação, foram utilizados análogos com locais únicos, duplos ou triplos (produzidos como descrito acima), como molde de PCR e foi introduzido um local de glicosilação adicional por mutagénese dirigida para um local, com os iniciadores apropriados.

Os análogos da Epo N51, N52 e N53 foram construídos pelo método 1 de PCR por sobreposição (reacção em cadeia da polimerase). Foi introduzido um local de N-glicosilação adicional em cada caso. 0 N56 adicionou um local de glicosilação (N114 T116) à sequência nativa da HuEpo, pela utilização de Epo pDSRa2 como molde de PCR, ο N51 adicionou um local de glicosilação ligado a 0 (Thrl25) à Epo N47, utilizando o molde pDSRa2 Epo N47 (Asn30, Thr32, Val87, Asn88, Thr90) e o análogo N59 adicionou um local de glicosilação (Asn53) ao análogo N47, utilizando o molde pDSRa2 Epo N47.

As reacções em cadeia da polimerase para o método 1 foram realizadas utilizando um protocolo adaptado de Cheng et al., (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91, 5695 (1994)). 0 iniciador 3' 27 (inverso) continha sequências que introduziram um codão de terminação seguido por um local de restrição Xba I: ATCTAGAAGTTGCTCTCTGGACAGTTCCT (SEQ ID N°: 2). 0 iniciador 5' da reacção directa: GAAGCTTGCGCCACCATGGGGGTGCACGAATG (SEQ ID N°: 3) tinha um local de restrição Hind III seguido por uma sequência de Kozak a montante do codão de iniciação da Epo (ATG). A mistura de reacção de PCR típica continha: 4 pL de cada um dos iniciadores directos e inversos (5 pmol/pL),

1 pL de molde (25 ng) , 10 pL de tampão LP 5X (Tricina 100 mM pH 8,7/glicerol a 25%/KOAc 425 mM) , 10 pL de armazenamento de dNTP (dATP, dTTP, dCTP, dGTP, cada um 1 mM) , 0,8 pL de polimerase rtTh (Perkin Elmer; 2,5 U/ pL) e 2 pL de polimerase Vent (NEB; 0,01 U/pL após diluição fresca 1:100 em tampão LP IX) . Foi adicionada H20 para levar o volume final a 50 pL. Todos os componentes foram adicionados em conjunto, na ordem apresentada e a PCR foi iniciada quando a temperatura durante o primeiro ciclo se encontrava acima de 60 °C, pela adição de 1 pL de MgOAc 50 mM. As condições de reacção típicas foram: 2 ciclos a 94 °C, 10 seg./50 °C, 1 min./68 °C, 5 min. seguidos por 25 ciclos a 94 °C, 10 segundos/55 °C, 1 min./68 °C, 5 min. Os fragmentos

amplificados foram separados por electroforese em gel de agarose e o fragmento de ADN com o tamanho correcto foi purificado utilizando o kit Geneclean™ e processos fornecidos pelo fabricante (Bio 101, Inc.) . O ADN

purificado foi digerido com Hind III e Xba I, seguidamente, foi purificado, novamente, utilizando o kit Geneclean™. O 28 fragmento foi então ligado no vector pDSRa2 cortado com Hind III e Xba I. 0 ADN ligado foi precipitado com 2 volumes de etanol em NaOAc 0,3 M pH 5,2, na presença de ARNt de transferência e foi transformado em E. coli. Os análogos da Epo foram rastreados por digestão de restrição de mini-preparações de ADN. Os plasmídeos obtidos a partir de clones positivos foram, então, preparados e a inserção foi sequenciada, para confirmar a presença das mutações pretendidas e assegurar que não foi introduzida qualquer modificação de aminoácidos adicional.

Os análogos N54 a N61 foram construídos utilizando a estratégia do método 2 de PCR por sobreposição. O iniciador 3' (inverso) continha sequências que introduziram um codão de terminação, seguido por um local de restrição Xbal: GATCCTCTAGAGTTGCTCTCTGGACAG (SEQ ID N°: 4). O iniciador 5' da reacção directa: CAACAAGCTTGCGCCGCCATGGGGG (SEQ ID N°: 5) tinha um local de restrição HindIII, seguido por uma sequência de Kozak, a montante do codão de iniciação da Epo (ATG). Foi realizada uma estratégia de PCR de elevada fidelidade, utilizando Polimerase de ADN UITma de Perkin Elmer e os reagentes que a acompanham; 10 pL de tampão de PCR 10X, 3 pL de dNTPs 1 mM, 5 pmol de cada iniciador e água, num volume final de 100 pL. Foram adicionadas 0,5 unidades de polimerase UITma, após a mistura de PCR ter atingido 94 °C. As reacções de PCR foram, então, realizadas em 5 ciclos a 94 °C, durante 30 segundos, a 50 °C durante 29 30 segundos e a 72 °C durante 90 segundos. Foram realizados 25 ciclos subsequentes a 94 °C, durante 30 segundos e a 72 °C, durante 90 segundos. Após a electroforese, as bandas de produtos com os tamanhos correctos foram excisadas a partir do gel de agarose.

Os produtos de PCR resultantes para cada análogo foram limpos, utilizando o kit Qiagen de extracção de gel. O ADN purificado foi digerido numa digestão de restrição de 100 pL com as enzimas de restrição HindIII e Xbal (Boehringer Mannheim) , a 37 °C, durante 1 hora. As digestões foram, novamente, purificadas em gel e o fragmento digerido foi, então, ligado no vector pDSRa2 digerido com HindIII e Xbal. O ADN ligado foi precipitado com 2 volumes de etanol em NaOAc 0,3 M a pH 5,2, na presença de ARNt de transferência e transformado em E. coli. Os análogos da Epo foram inicialmente rastreados por PCR de colónia, para identificar clones contendo a inserção de ADN com o tamanho e tipo correcto. Através deste processo, as células contendo plasmídeos foram colocadas em tubos de PCR, na presença de iniciadores directos e inversos para a Epo. A mistura foi, então, submetida a PCR, utilizando as condições de reacção descritas acima. Os plasmídeos provenientes de clones positivos foram, então, preparados e a inserção do análogo da Epo foi sequenciada para confirmar a presença das mutações pretendidas e assegurar que não foram introduzidas quaisquer modificações de aminoácidos adicionais. 30 TABELA 1

ANÁLOGOS DA ERITROPOIETINA TENDO LOCAIS PARA CADEIAS DE HIDRATO DE CARBONO LIGADAS A N

Análogo Substituição de Aminoácidos Modificações na Sequência

N49 LYS, Met -► Asn52, Thr54 AAG, ATG - AAT, ACC N50 Arg, Glu -* Asn53, Thr55 AGG, GAG - AAT, ACG N51 Ai U , His, Pro, Trp , Pro, Ala GCT, CAC, CCG, TGG, CCC, - N30 , T32, V8 7, N88, T90 GCC - - AAT , ACG, GTG, AAT, T125 ACC, ACC N52 Ala, Lys -► Asnll4, Thrllô GCC, AAG - AAC, ACG N53 Ala, His, Arg, Glu Pro, Trp, GCT, CAC, AGG, GAG, CCG Pro -> N30, T32, N53, T55, TGG, CCC - AAT, ACG, AAT V8 7, N88, T90 ACG, GTG, AAT, ACC N54 Glu, Gly ->· Asn55, Thr5 7 GAG, GGG -> AAT, ACT N55 Gin, Pro, Trp -► Asn86, CAG, CCG, TGG - ACC, GTG Val8 7 , Thr8 8 ACG N56 Pro, Trp, Pro -► Ala87, CCG, TGG, CCC -> GCG, AAT Asn88 , Thr9 0 ACC N57 Pro, Trp, Pro -* Val87, CCG, TGG, CCC -> GTG, AAT Asn8 8 , Ser90 ACG N58 Pro, Trp, Glu, Pro -* Val87, CCG, TGG, GAG, CCC -> GTG Asn8 8 , Gly89, Thr90 AAT, GGG, ACC N59 Ala, His, Arg, Glu -> GCT, CAC AGG GAG - AAT, Asn30, Thr32, Asn53, Asn55 ACG, AAT, ACG N60 Ala, His, Ala, Lys ->· GCT, CAC, GCC, AAG -> AAT Asn3 0 , Thr32, Asnll4, Thrllô ACG, AAC, ACG N61 A, H, R, E, P, W, P, A, K ^ GCT, CAC, ACG, GAG, CCG 10, T32, N53, T55, V87, N88, TGG, CCC, GCC, AAG -> AAT T90, NI14, T115 ACG, AAT, ACG, GTG, AAT ACC, AAC, ACG 31

Análise da adição de hidratos de carbono

As construções para os análogos hiperglicosilados da Epo que foram inseridas no vector de expressão pDSRa2 foram transfectadas em células COS. Os sobrenadantes das células COS transfectadas foram analisados por transferência de Western, para determinar se o análogo da Epo expresso e segregado continha hidratos de carbono adicionais. As amostras foram aplicadas directamente em poços de géis de SDS-PAGE e, seguidamente, foram analisadas por imunotransferência, utilizando o anticorpo monoclonal 9G8A (Elliott et al. (1996)

Blood 87: p2714). Foram comparadas as mobilidades de amostras análogas com as de amostras contendo rHuEpo. A Figura 1 mostra a mobilidade diminuída dos análogos N53 e N61, em comparação com os análogos N4 (quatro cadeias de hidrato de carbono) e N47 (cinco cadeias de hidrato de carbono). A mobilidade é consistente com a presença de seis cadeias de hidrato de carbono, para o análogo N53 e de sete cadeias de hidrato de carbono, para o análogo N61. Os dados da totalidade dos análogos hiperglicosilados são apresentados na Tabela 2.

Bioensaios in vitro

Foram ensaiados meios condicionados por células COS ou CHO expressando a rHuEpo ou análogos, para o estímulo da incorporação de 3H-timidina por células UT7-Epo (Komatsu et ai., Blood 82, 456). As células UT7-Epo respondem à Epo e expressam receptores para a Epo humana na sua superfície celular. As células UT7-Epo foram cultivadas em meio de Crescimento (Meio de Dulbecco Modificado de Iscove 1 X com L-glutamina, tampão HEPES 25 mM e 3024 mg/L de bicarbonato de sódio, mas sem 32 alfa-tioglicerol ou beta-mercaptoetanol (GIBCO)/Soro Bovino Fetal a 10% v/v/solução de L-glutamina-Penicilina-Estreptomicina a 1% v/v (Irvine Scientific)/rHuEpo a 1 Unidade/mL), até, aproximadamente, 3 x 105 células/mL. As células foram recolhidas por centrifugação (aprox. 500 x G) , lavadas duas vezes com tampão fosfato salino e ressuspensas em 5 x 104 células/mL no meio de Ensaio (Meio RPMI 1640 1 x sem L-glutamina (Gibco)/L-glutamina a 1%/soro bovino fetal a 4%). As amostras de teste ou o padrão Epo (rHuEpo) , 100 pL diluídos em meio de ensaio a, pelo menos, 5 vezes, foram adicionados a poços numa placa de microtitulação de 96 poços. Foram, então, adicionados 50 pL de células suspensas (5000 células/poço) e as placas foram incubadas numa incubadora humidificada a 37 °C e com CO2 a 5%. Após 72 horas, foram adicionados 50 pL de metil-3H-Timidina (1 mCi/mL; 20 Ci/mMole) diluída 1:100 no meio de ensaio. As células foram incubadas, durante mais 4 horas, a 37 °C e com CO2 a 5%. As células marcadas foram recolhidas por filtro de fibra de vidro, lavadas com água desionizada seguida por 2-propanol, secas e contadas. A actividade foi determinada por comparação da resposta determinada para cada análogo com a do padrão de rHuEpo. A actividade biológica específica foi, então, determinada por divisão da actividade in vitro pela concentração de cada análogo, como determinada por imunoensaio (Elliott et al. (1996) Blood 87: p2714). Os resultados são apresentados na Tabela 2. 33 TABELA 2 ANÁLOGO Número de Cadeias de Hidrato de Carbono Ligadas a N Actividade In Vitro* * rHuEpo 3 + + + N49 4 + + + N50 4 + + + N51 5* + + + N52 3-4 + + + N53 6 + + N54 4 NT N55 4 + + + N56 4 + + + N57 3-4 + + + N58 4 + + + N59 5 + + N60 4-5 + + + N61 6-7 NT * contém 1-2 cadeias ligada a 0 ** a actividade in vitro é relativa à actividade da rHuEpo +++ actividade equivalente à rHuEpo ++ a actividade é 25-75% da rHuEpo NT Não Testado 34 EXEMPLO 2

Preparaçao de Eritropoietina humana recombinante e de Análogos hiperglicosilados da eritropoietina A eritropoietina humana recombinante (rHuEpo) utilizada nas experiências aqui descritas foi expressa por células de ovário de hamster chinês (CHO) transfectadas com um plasmídeo recombinante contendo o gene da eritropoietina humana. 0 produto recombinante foi recuperado do meio condicionado e purificado, essencialmente como descrito por Lai et al., supra. A preparação de rHuEpo resultante possui, predominantemente, isoformas dos ácidos siálicos 9 a 14, como determinado por focagem isoeléctrica.

Os análogos hiperglicosilados da eritropoietina recombinantes foram expressos em células CHO transfectadas com um plasmideo recombinante contendo o gene análogo da Epo como descrito nos documentos WO91/05867 e WO94/09257 aqui incorporados por referência. Os análogos hiperglicosilados foram purificados a partir de sobrenadantes de cultura, como descrito abaixo.

Concentração e diafiltração de meios condicionados 0 meio condicionado (isento de soro) de três recolhas sucessivas (5-8 dias cada) da linha celular CHO transfectada, foi recolhido, filtrado através de um filtro de 0,45 pm, concentrado, cerca de trinta vezes e diafiltrado em Tris 10 mM, CuS04 20 μΜ, pH 7,0, utilizando um sistema de ultrafiltração de fluxo tangencial (Millipore) com uma membrana com uma 35 selectividade de peso molecular 10000. Os meios dialfiltrados (DFM) foram filtrados uma segunda vez (0,45 pm) e armazenados a -20 °C até serem utilizados na purificação.

Purificação A totalidade dos processos foi realizada a 2 a 8 °C.

Cromatografia de Permuta aniónica (10) O DFM clarificado foi aplicado a uma coluna de Q-Sepharose Fast Flow (Pharmacia, 6 cm x 18 cm) equilibrada em bis Tris propano (BTP) 10 mM, pH 7,0 e foi lavada com dois volumes de coluna de BTP 10 mM para eluir todas as formas não ligadas. Foram aplicados os seguintes gradientes dependendo de se o análogo hiperglicosilado tinha quatro, cinco ou seis cadeias de hidrato de carbono ligadas a N. Todos os tampões utilizados nesta etapa contêm glicina 1 mM, CUS04 20 μΜ, ureia 6 M, leupeptina 5 pg/mL e pepstatina 1 pg/mL. Para análogos com quatro cadeias de hidrato de carbono ligadas a N, o gradiente foi de ácido acético 10 mM, NaCl 0,1 mM, até ácido acético 500 mM, NaCl 5 mM, ao longo de 49 volumes de coluna com uma manutenção de dois volumes de coluna sob condições de sal elevado. Para análogos com cinco cadeias de hidrato de carbono ligadas a N, o gradiente foi de ácido acético a 0,7 M, NaCl 7 mM, até ácido acético 1,0 M, NaCl 12 mM, ao longo de 30 volumes de coluna com uma manutenção de dois volumes de coluna sob condições de sal elevado. Para análogos com seis cadeias de hidrato de carbono ligadas a N, o gradiente foi de ácido acético 1,0 M, NaCl 10 mM a ácido acético 1,5 M, NaCl 20 mM, ao longo de 36 50 volumes de coluna com uma manutenção de dois volumes de coluna sob condições de sal elevado. Após o gradiente, a coluna foi lavada com dois volumes de coluna de BTP 10 mM, pH 7,0 e a fracção de isoforma elevada foi eluída com NaCl 0,6 M, BTP 100 mM, pH 7,0.

Cromatografia de Fase Reversa (C4) A banda de sal elevado da coluna (1Q) de Q-Sepharose foi aplicada a uma coluna de fase reversa Vydac C4 (partículas de 30 μ, 4 cm x 18 cm) equilibrada em etanol a 20%, BTP 10 mM, pH 7,0 e eluída a partir da coluna, com um gradiente de trinta volumes de coluna, até etanol a 94% tamponado em BTP 10 mM, pH 7,0. O pico de produto combinado, eluindo em etanol a, aproximadamente, 60%, foi diluído com quatro volumes de BTP 10 mM, pH 7,0, para minimizar a possibilidade da agregação na presença de etanol.

Cromatografia de Permuta Aniónica (20) O eluído diluído da coluna de fase reversa foi aplicado numa segunda coluna Q-Sepharose Fast Flow (Pharmacia, 3 cm x 9 cm), equilibrada com BTP 10 mM, pH 7,0. A coluna foi lavada com tampão de equilíbrio e o análogo hiperglicosilado da Epo foi eluído com cloreto de sódio 0,6 M, citrato de sódio 20 mM, pH 6,0. A proteína purificada foi permutada em NaP04 20 mM, pH 6,0, NaCl 140 mM, através de um centricon (selectividade de peso 37 molecular 10000), seguida de passagem através de um filtro de 0,2 pm e armazenamento a 2-8 °C. EXEMPLO 3

Bioactividade In vivo da rHuEpo e de Análogos da rHuEpo, Contendo quatro, cinco e seis Cadeias de Hidrato de Carbono ligadas a N A actividade in vivo de análogos da Epo contendo quatro, cinco e seis cadeias de hidrato de carbono ligadas a N, foi comparada com a da rHuEpo num bioensaio com murganhos policitémicos ex-hipóxicos. Este ensaio quantifica a incorporação de 59Fe em glóbulos vermelhos recentemente sintetizados, como uma medida do aumento da eritropoiese em murganhos, em resposta a uma amostra de teste administrada exogenamente. O ensaio, realizado como descrito abaixo, é uma modificação do método de Cotes e Bangham (Nature 191, 1065 (1961)) .

Neste ensaio, os murganhos BDF fêmea são inicialmente pré-condicionados por exposição a baixas condições de oxigénio, numa câmara hipobárica (0,4-0,5 atm.), durante, aproximadamente, 18 horas por dia, durante 14 dias. Para compensar as baixas condições de oxigénio os murganhos respondem estimulando a eritropoiese, para aumentar o número de glóbulos vermelhos e, deste modo, a capacidade relativa de transporte de oxigénio. Após a finalização da exposição hipobárica, é permitido que os murganhos permaneçam à pressão ambiente, durante, aproximadamente, 72 horas antes da administração de amostras de teste por injecção intraperitoneal. À pressão ambiente, os 38 murganhos são relativamente policitémicos e respondem reduzindo a produção de eritropoietina endógena e a taxa de eritropoiese. Cinco dias após a administração da amostra, são injectados 0,2 -0,3 pCi de 59FeCl3, em 0,2 mL, intravenosamente, na veia da cauda. Ao fim de quarenta e oito horas, os animais são sacrificados e o aumento da eritropoiese produzido pelas amostras de teste é determinado, pela medição da quantidade de 59Fe incorporado numa amostra de 0,5 mL de sangue completo.

Na Figura 3 é apresentado um exemplo dos resultados obtidos quando a rHuEpo e cinco análogos da Epo diferentes, contendo quatro, cinco ou seis cadeias de hidrato de carbono ligadas a N, foram testadas neste ensaio. Cada amostra foi ensaiada em seis ou sete diluições diferentes dentro de uma gama de concentração apropriada. Todas as amostras foram diluídas em tampão fosfato salino contendo albumina de soro bovino a 0,5% e foram administrados 0,4 mL de cada diluição a cinco murganhos pré-condicionados. A quantidade incorporada em 0,5 mL de sangue foi medida, quarenta e oito horas após a administração de 59Fe, por contagem gama. Os resultados para cada uma das amostras são representados como a percentagem de 59Fe incorporado versus o logaritmo da dose administrada.

Como apresentado na Figura 3, todos os cinco análogos hiperglicosilados da Epo testados neste ensaio foram mais potentes do que a rHuEpo. Além disso, a potência de cada análogo era directamente dependente do número de cadeias de hidrato de carbono ligadas a N, tendo os análogos com um número aumentado de cadeias de hidrato de carbono, uma maior actividade. Deste modo, o análogo N53, que contém seis cadeias de hidrato de carbono ligadas a N, foi o análogo mais potente. O análogo N47, que contém cinco cadeias de hidrato de carbono ligadas a N, foi, 39 por sua vez, mais potente do que os análogos contendo quatro cadeias ligadas a N. As potências dos três análogos contendo quatro cadeias de hidrato de carbono ligadas a N (N4, N18 e N50) foram, aproximadamente, iguais entre si e maiores do que a da rHuEpo.

Nesta experiência, as doses da rHuEpo e dos análogos contendo quatro, cinco ou seis cadeias de hidrato de carbono ligadas a N, necessárias para produzir uma incorporação de 40% de 59Fe foram, respectivamente, de 10700 ng, 640 ng, 140 ng e 38 ng. Com base na quantidade de material necessário para produzir este nível de eritropoiese, os análogos da Epo contendo quatro, cinco ou seis cadeias de hidrato de carbono ligadas a N são 17 vezes, 77 vezes e 280 vezes mais potentes do que a rHuEpo. EXEMPLO 4

Farmacocinét ica IV da rHuEpo e do análogo N47 da Epo em Ratos e Cães Beagle

Foram realizados dois estudos distintos em ratos e cães, para comparar os parâmetros farmacocinéticos do análogo N47 da Epo e da rHuEpo.

Nos estudos com ratos, foi injectado 1 pCi (~0,1 pg de péptido/kg) , quer de 125I-análogo N47 da Epo, quer de 125I-eritropoietina humana recombinante (Amersham), intravenosamente, numa cânula de carótida implantada cirurgicamente em ratos Sprague-Dawley macho normais, pesando entre 314-363 g. Em vários pontos temporais após a 40 administraçao, foram recolhidos 0,3 mL de sangue e o soro foi preparado por centrifugação. O nível de 125I-rHuEpo ou de Ί o c I-analogo N47 da Epo, em 0,1 mL de cada amostra de soro foi, então, determinado após uma incubação com etanol a 90%, de um dia para o outro, a 4 °C. A proteína precipitada com etanol em cada amostra de soro foi recolhida por centrifugação e a radioactividade foi contada num contador gama. As curvas farmacocinéticas de concentração de soro vs. tempo, resultantes, são apresentadas na Figura 4. Cada ponto representa uma média de um grupo de cinco ratos do grupo do análogo N47 e de seis ratos do grupo da rHuEpo. Os parâmetros farmacocinéticos foram determinados para cada rato, utilizando análise de regressão não linear PCNONLIN 4.0 (Statistical Consultants, 1992) e foi calculada a média dos resultados de cada grupo. Os resultados são apresentados na Tabela 3. TABELA 3

Comparação dos Parâmetros Farmacocinéticos IV do N47 e da r-HuEpo em Ratos

Semi-vida

Amostra de Teste α (horas) β (horas Vd (mL/kg) Eliminação do Soro (mL/kg-h) N47 (n = 5 ratos) 0,57 ± 0,49 6,9 ± 0,3 33 ± 5 4,8 ± 1,2 r-HuEpo (n = 6 ratos) 0,18 ± 0,03 2,5 ± 0,2 36 + 6 17, 7 + 3,4 a Os resultados são apresentados como a média do grupo ± SD, para cinco ratos do grupo N47 e seis ratos do grupo r-HuEpo.

Nos estudos com cães, os cães Beagle normais, pesando entre 7,8 - 9,5 kg, receberam, por injecção intravenosa, um bólus de ~29 pCi, guer de 125I-rHuEpo, guer de 125I-N47 41 (—0,1 pg péptido/kg), na veia cefálica. Em vários pontos temporais, ao longo de 24 horas após a administração, foram recolhidos, aproximadamente, 1 a 2 mL de sangue e o soro foi preparado. Foi determinada a concentração de 125I-rHuEPo e 125I-N47 em 0,1 mL de soro e os parâmetros f armacocinét icos foram calculados como descrito acima. A concentração no soro vs. as curvas farmacocinéticas do tempo, para os estudos em cães, é apresentada na Figura 5. Os pontos temporais são as médias de um grupo de dois animais em cada grupo. Os parâmetros farmacocinéticos estão resumidos na Tabela 4. TABELA 4

Comparação dos Parâmetros Farmacocinéticos IV do N47 e da r-HuEpo em Cães

Semi- vida Amostra de Teste α (horas) β (horas Vd Eliminação do Soro (mL/kg) (mL/kg-h) N47 0,34 25, 0 55,9 2,4 r-HuEpo 0,40 7,2 60,8 8,4 a Os resultados apresentados são os parâmetros médios para os dois cães em cada grupo Em ambos os estudos com ratos e cães, a rHuEpo e o análogo N47 da Epo apresentavam uma eliminação de soro bifásica. A eliminação em ratos foi, cerca de, 3,7 vezes mais rápida para a rHuEpo do gue para o análogo N47 da Epo e a semi-vida β foi cerca de 2,8 vezes mais longa para o análogo N47 da Epo do que para a rHuEpo Os parâmetros farmacocinéticos nos estudos com cães foram, geralmente, consistentes com os observados nos ratos. Em cães , a eliminação da . rHuEpo foi 3, 5 vezes mais rápida 42 do que para o análogo N47 da Epo e a semi-vida β foi 3,5 vezes mais longa para o análogo N47 da Epo, em comparação com a da rHuEpo. EXEMPLO 5

Resposta à dose do hematócrito, após administração da rHuEpo e do análogo N47 Epo.

Estudos de Resposta à Dose do Hematócrito, a três vezes por semana (TIW)

Os efeitos biológicos in vivo da rHuEpo e do análogo N47 da Epo em murganhos normais foram comparados, após a administração de uma gama de doses por injecção intraperitoneal ou intravenosa, três vezes por semana, durante até seis semanas. As determinações do hematócrito foram realizadas duas vezes por semana por recolha de sangue retro-orbital.

Foram injectados murganhos CD1 normais, pesando, aproximadamente, 30 g (10-13 murganhos por grupo), intraperitonealmente, três vezes por semana, num total de seis semanas com rHuEpo (na gama de dose de 0,625-10 pg de péptido/kg/dose) ou com análogo N47 da Epo (na gama de dose de 0,156-1,25 pg de péptido/kg/dose) ou veículo de controlo. O veículo de controlo e diluente para as várias preparações de dosagem da rHuEpo e do análogo N47 da Epo foi tampão de fosfatos salino (PBS), contendo albumina de soro de murganho a 0,025%. Os hematócritos da totalidade dos murganhos foram determinados na linha de base e duas vezes por semana daí em diante, por recolha 43 de sangue retro-orbital. Na conclusão da experiência, foi recolhido o soro da totalidade dos animais e foi ensaiado para anticorpos contra o produto injectado, através de um ensaio de solução de radioimunoprecipitação. Na análise subsequente foram utilizados dados do hematócrito de animais considerados negativos para anticorpos neutralizantes.

Como apresentado na Figura 6, a rHuEpo e o análogo N47 da Epo, produzem um aumento do hematócrito dependente da dose no estudo de seis semanas, embora o análogo N47 promova um maior aumento do hematócrito, em comparação com a rHuEpo, para uma determinada concentração. Nesta experiência o análogo N47 da Epo é, cerca de, 3 a 4 vezes mais potente quando doseado três vezes por semana, por injecção intraperitoneal.

Os estudos de resposta à dose da rHuEpo e do análogo N47 foram realizados por injecção intravenosa, três vezes por semana, utilizando processos semelhantes aos da injecção intraperitoneal. Os resultados obtidos foram semelhantes aos da administração intraperitoneal e, em particular, os estudos confirmaram, adicionalmente, que o análogo N47 da Epo apresentava uma maior potência do que a rHuEpo, quando administrado três vezes por semana.

Para melhor comparar e quantificar a actividade biológica da rHuEpo e do análogo N47 da Epo, no aumento do hematócrito de murganhos normais, os resultados das experiências foram, também, analisados por representações de potência relativa. Para cada experiência, a actividade da rHuEpo ou do análogo N47 em cada dose, foi determinada, por adição do aumento do hematócrito ao longo dos 38 primeiros dias do estudo por adição trapezoidal, para obter a área sob a curva (AUC) . Isto foi, então, 44 representado versus o logaritmo da dose em pg péptido/kg/semana. A diferença de potência entre compostos administrados pelas mesmas ou diferentes vias de administração ou frequências de dosagem pode ser determinada, por medição da distância entre as linhas de resposta do logaritmo da dose relevantes. A Figura 7 resume os dados da potência relativa de todas as experiências realizadas, comparando a actividade da rHuEpo e do análogo N47 da Epo administrados por duas vias diferentes (intraperitoneal e intravenosa) e em dois programas de dosagem diferentes.

Como apresentado na Figura 7 quando administrado três vezes por semana, o análogo N47 da Epo tem a mesma potência quando injectado por via intravenosa ou intraperitoneal e foi 3,6 vezes mais potente do que a rHuEpo injectada intraperitonealmente três vezes semanalmente.

Estudos de Resposta à Dose do Hematócrito em uma vez por semana (OW)

Foram realizadas comparações entre a rHuEpo e o análogo N47 da Epo no aumento do hematócrito em murganhos normais, com uma dosagem de uma vez semanalmente, pelas vias de administração intraperitoneal ou intravenosa, durante seis semanas.

Foram injectados murganhos CD1 normais pesando, aproximadamente, 30 g (8-10 murganhos por grupo), intravenosamente, uma vez semanalmente, num total de seis semanas, com concentrações variáveis de rHuEpo ou de análogo N47 da Epo, preparadas em PBS contendo albumina de soro de murganho a 0,025% ou com veiculo de controlo (PBS com albumina de soro de murganho a 0,025%). A dose do análogo variou de 6,25 - 25 pg de 45 péptido/kg/dose e a dose da rHuEpo variou de 25 - 200 pg/kg/dose. Os hematócritos da totalidade dos murganhos foram determinados na linha de base e duas vezes semanalmente daí em diante, por recolha de sangue retro-orbital. Na conclusão da experiência, foi recolhido o soro da totalidade dos animais e foi ensaiado para anticorpos contra o produto injectado, através de uma solução de radioimunoprecipitação. Na análise subsequente foram utilizados dados de animais considerados negativos para anticorpos neutralizantes.

Como apresentado na Figura 8, enquanto que tanto a rHuEpo como o análogo N47 podem aumentar o hematócrito de murganhos normais quando doseados uma vez semanalmente, a dose da rHuEpo necessária para produzir uma resposta foi significativamente superior do que a do análogo N47. Nesta experiência, por exemplo, 25 pg de péptido/kg/semana de N47 aumentaram o hematócrito de murganhos em 41,2 pontos, em seis semanas, enquanto que a mesma dose da rHuEpo produziu, apenas, uma subida de 12,5 pontos do hematócrito.

Os estudos de resposta à dose da rHuEpo e do análogo N47 foram realizados por injecção intraperitoneal, uma vez semanalmente, utilizando processos semelhantes aos descritos acima. Os resultados obtidos foram consistentes com os resultados da administração intravenosa e confirmaram, ainda, a maior potência do análogo N47, em comparação com a rHuEpo, quando administrado uma vez por semana.

Para quantificar a diferença de actividade entre a rHuEpo e o análogo N47 quando cada um é doseado uma vez semanalmente, foram produzidas representações de potência relativa a partir de todas as experiências relevantes, como descrito acima. Como 46 apresentado na Figura 7, quando administrado uma vez por semana, o análogo N47 tem a mesma potência quando injectado por via intravenosa e intraperitoneal. 0 análogo N47 é, aproximadamente, 14 vezes mais potente do que a rHuEpo, quando cada um é administrado uma vez semanalmente.

Além disso, as representações da resposta do logaritmo da dose na Figura 6 ilustram, também, o seguinte: (1) Uma determinada dose do análogo N47 administrada uma vez semanalmente (QW) é, aproximadamente, tão eficaz como a mesma dose total semanal da rHuEpo, administrada sob a forma de três doses divididas (TIW); (2) Uma determinada dose da rHuEpo administrada uma vez semanalmente (QW) é apenas, aproximadamente, 2% tão eficaz como a mesma dose total semanal do análogo N47, administrado sob a forma de três doses divididas (TIW); (3) 0 análogo N47 é, aproximadamente, 4 vezes mais potente em murganhos quando administrado TIW, em comparação com QW.

Estudos de Resposta à Dose do Hematócrito em cada duas semanas (EOW)

Foram também realizadas experiências para avaliar a capacidade do análogo N47 para aumentar o hematócrito de murganhos, quando injectados uma vez cada duas semanas. Foram injectados murganhos CD-I normais (10 murganhos por grupo), intravenosamente uma vez semanalmente ou uma vez cada duas semanas, para um total de, aproximadamente, seis semanas com concentrações variáveis de análogo N47 da Epo, preparado em PBS contendo albumina de soro de murganho a 0,025%. O análogo N47 foi administrado em 200, 100 ou 25 pg/kg/dose, cada duas semanas 47 ou em 12,5 pg/kg/dose, uma vez semanalmente. Os hematócritos da totalidade dos murganhos foram determinados na linha de base e duas vezes semanalmente, dai em diante, por recolha de sangue retro-orbital.

Como apresentado na Figura 9, o análogo N47 pode aumentar o hematócrito de murganhos normais de um modo dependente da dose, mesmo quando administrado duas vezes por mês. Como esperado quando doseado menos frequentemente, é necessária uma maior quantidade do análogo N47 para aumentar o hematócrito. Uma dose de 200 pg/kg do análogo N47, administrada cada duas semanas, em seis semanas, aumentou o hematócrito, aproximadamente, na mesma medida que 12,5 pg/kg, quando doseados semanalmente. EXEMPLO 6

Farmacocinét ica IV do análogo N47 da Epo e da rHuEpo em doentes em Diálise Peritoneal Contínua Ambulatória (CAPD)

Tendo em perspectiva o aumento significativo da semi-vida no soro do análogo N47 da Epo em comparação com arHuEpo, em ratos e cães beagle, interessou determinar se poderia ser, também, observado um aumento em humanos.

Foi realizado um estudo de planeamento cruzado aleatório com dupla ocultação de onze doentes com CAPD estáveis (7 do sexo masculino, 4 do sexo feminino, 27-75 anos de idade). Um grupo de doentes recebeu 100 U/kg de rHuEpo (equivalente a 0,5 pg de péptido/kg), enquanto que um segundo grupo de doentes recebeu 0,5 pg péptido/kg de análogo N47 da Epo, sendo ambos administrados sob a forma de um único bólus por injecção 48 intravenosa. Foram recolhidas amostras de sangue venoso (3 mL), através de uma cânula endovenosa, recolhidas pré-dose e aos 5, 10, 15, 30 minutos e às 1, 2, 5, 8, 12, 16, 24, 30, 36, 48, 60, 72 e 96 horas após o bólus intravenoso. Após um período de desgaste de 2 8 dias, o primeiro grupo de doentes recebeu uma dose intravenosa única do análogo N47 da Epo, enquanto que o segundo grupo recebeu uma dose intravenosa única da rHuEpo. As amostras de sangue foram recolhidas como no primeiro ciclo de tratamento. Os níveis da rHuEpo e do análogo N47 da Epo foram determinados no soro, por ELISA, após a subtracção dos níveis de linha de base da Epo endógena. Na Tabela 5 são apresentados os parâmetros farmacocinéticos (média ± SE), estimados após o ajustamento para os efeitos da concepção entrecruzada. A AUC da concentração no soro foi calculada utilizando a adição trapezoidal linear. tl/2z, é definido como: log(2)/Kz, em que Kz é calculado como o declive da porção terminal do ln (concentração no soro) curva de tempo. A eliminação (Cl) é definida como: dose/AUC. 0 volume da distribuição (Vd) é definido como: Cl/K. TABELA 5

Grupo de AUC (ng. ti/2z (h) Cl Vd (mL/kg)

Dose h/mL) (mL/h/kg) N47 291,0 ± 7,6 25,3 ± 2,2 1,6 ± 0,3 52,4 ± 2,0 RHuEpo 131,9 ± 8,3 8,5 ± 2,4 4,0 ± 0,3 48,7 ± 2,1 A semi-vida média no soro para o análogo N47 da Epo (25,3 h) foi três vezes mais longa do que para a rHuEpo (8,5 h) e a eliminação foi e 2,5 vezes mais rápida para a rHuEpo do que para o análogo N47 . 49 EXEMPLO 7

Um Estudo de Fase II de Determinação de Dose e Programa de Dose do análogo N47 da Epo São iniciados estudos de aumento de dose sequencial, multicentro, aleatórios, para investigar a dose e o programa de dose óptimos para o análogo N47, quando administrado por injecção subcutânea ou intravenosa em doentes com CRF recebendo diálise. 0 programa de dosagem é como se segue:

Dosagem de uma vez por semana: 0,075, 0,225, 0,45, 0, 75, 1,5 e 4,5 pg de péptido/kg/dose.

Dosagem de três vezes por semana: 0,025, 0,075, 0,15, 0,25, 0,5 e 1,5 pg de péptido/kg/dose.

Os estudos são realizados em duas partes: a primeira parte consiste num estudo de aumento de dose, concebido para avaliar a dose do análogo N47, administrado, uma ou três vezes por semana, que aumenta a hemoglobina numa taxa óptima ao longo de quatro semanas (maior do que ou igual a 1 g/dL mas inferior a 3 g/dL). A segunda parte de cada estudo é concebida para determinar as doses necessárias (quando administradas uma ou três vezes por semana, pelas vias de administração intravenosas ou subcutâneas) para manter o hematócrito no alvo terapêutico.

Os resultados preliminares indicam que pode ser utilizada a dosagem uma vez semanalmente com o análogo N47 para aumentar e para manter o hematócrito de doentes anémicos com CRF. Os 50 resultados iniciais sugerem que as doses preferidas para iniciar terapia, num programa de dosagem de três vezes por semana sejam 0,15 e 0,25 pg/péptido/kg/dose e num programa de dosagem de uma vez por semana sejam 0,45 e 0,75 pg/péptido/kg/dose, para ambas as vias de administração.

Embora a invenção tenha sido descrita no que é considerado como sendo as suas formas de realização preferidas, esta não pretende ficar limitada às formas de realização divulgadas, mas é pretendido abranger várias modificações e equivalentes incluídos dentro do âmbito das reivindicações em anexo.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Egrie C., Joan Elliott G., Steven Browne K., Jeffrey <120> Métodos e Composições Para a Prevenção e Tratamento da Anemia <130> A-460 <140> 09/178292 <141> 1998-10-23 <160> 5 <170> Patentln Ver. 2.0 <210> 1 <211> 193 <212> PRT <213> Humano 51 <220> <221> SINAL <222> (D ..(27) <223> a sequência sinal é o resíduo 1-27 <400> 1

Met Gly Vai His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu 15 10 15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Vai Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu 20 25 30

Ile Cys Asp Ser Arg Vai Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu 35 40 45

Ala Glu Asn lie Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu 50 55 60

Asn Ile Thr Vai Pro Asp Thr Lys Vai Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg 65 70 75 80

Met:. Glu Vai Gly Gin Gin Ala Vai Glu Vai Trp Gin Gly Leu Ala Leu 85 90 95

Leu Ser Glu Ala Vai Leu Arg Gly Gin Ala Leu Leu Vai Asn Ser Ser 100 105 110

Gin Pro Trp Gl.u Pro Leu Gin Leu His Vai Asp Lys Ala Vai Ser Gly 115 120 125

Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gin Lys Glu 130 135 140

Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile 145 150 155 160

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Vai Tyr Ser Asn Phe Leu 165 170 175

Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp 180 185 190

Arg 52 <210> 2 <211> 29 <212> ADN <213> Humano <400> 2 atctagaagt tgctctctgg acagttcct 29 <210> 3 <211> 32 <212> ADN <213> Humano <40 0> 3 gaagcttgcg ccaccatggg ggtgcacgaa tg 32 <210> 4 <211> 27 <212> ADN <213> Humano <400> 4 gatcctctag agttgctctc tggacag 27 <210> 5 <211> 25 <212> ADN <213> Humano <400> 5 caacaagctt gcgccgccat ggggg 25

Lisboa, 20 de Outubro de 2010 53

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Análogo da eritropoietina humana compreendendo, pelo menos, um local de glicosilação adicional em qualquer das posições 52, 53, 55, 86 e 114 da sequência da eritropoietina humana, em que é adicionada uma cadeia de hidrato de carbono ligada a N ao local.
2. Análogo da Reivindicação 1 compreendendo, pelo menos, dois locais de glicosilação adicionais, em que é ligada uma cadeia de hidrato de carbono a cada um dos locais.
3. Análogo da Reivindicação 1 compreendendo, pelo menos, três locais de glicosilação adicionais, em que é ligada uma cadeia de hidrato de carbono a cada um dos locais.
4. Análogo da Reivindicação 1 compreendendo, pelo menos,quatro locais de glicosilação adicionais, em que é liqada uma cadeia de hidrato de carbono a cada um dos locais.
5. Análogo da eritropoietina humana seleccionado do grupo consistindo em: Asn52 Thr64 Epo; Asn53 Thr55 Epo; Asn114 Thr118 Epo; Asn30 Thr32 Asn53 Thr5 Vai87 Asn88 Thr90 Asn55 Thr57 Epo; Asn88 Vai87 Thr88 Epo; Asn30 Thr32 Asn53 Thr55 Epo; Asn30 Thr32 Asn114 Thr116 Epo; e 1 Asn30 Thr32 Asn53 Thr55 Vai87 Asn88 Thr90 Asn114 Thr116 Epo.
6. Análogo das reivindicações 1-5 que é o produto de expressão de uma sequência de ADN exógeno.
7. Sequência de ADN codificando o análogo das reivindicações 1-5.
8. Célula hospedeira eucariota transfectada com a sequência de ADN da Reivindicação 7 de uma forma permitindo à célula hospedeira expressar o análogo.
9. Composição compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz do análogo das reivindicações 1-5 em conjunto com um diluente, adjuvante ou veiculo farmaceuticamente aceitável.
10. Utilização do análogo de qualquer das reivindicações 1 a 5 para preparar uma composição farmacêutica para aumentar e manter o hematócrito num mamífero.
11. Utilização do análogo da Reivindicação 10, em que o análogo se destina a ser administrado menos frequentemente do que uma quantidade molar equivalente de eritropoietina humana recombinante para obter um hematócrito alvo comparável.
12. Utilização do análogo da Reivindicação 11, em que a quantidade de análogo se destina a ser administrada cerca de uma vez por semana, cerca de uma vez cada duas semanas ou cerca de uma vez por mês.
13. Utilização do análogo da Reivindicação 10, em que o análogo se destina a ser administrado numa quantidade molar mais 2 baixa do que a eritropoietina humana recombinante para obter um hematócrito alvo comparável.
14. Utilização do análogo da Reivindicação 12, em que a quantidade de análogo que se destina a ser administrada é cerca de 0,025 a 1,5 g de péptido da eritropoietina por kg por dose, três vezes por semana.
15. Utilização do análogo da Reivindicação 12, em que a quantidade de análogo que se destina a ser administrada é inferior a cerca de 0,025 g de péptido da eritropoietina por kg por dose, três vezes por semana.
16. Análogo de qualquer das reivindicações 1 a 5 para utilização no aumento e na manutenção do hematócrito num mamífero.
17. Método de produção de um análogo da eritropoietina humana compreendendo cultivar a célula hospedeira da Reivindicação 8 sob condições que permitem a expressão do análogo e a recuperação do análogo dos meios celulares. Lisboa, 20 de Outubro de 2010 3