ES2283139T5 - Métodos y composiciones para la prevención y tratamiento de la anemia - Google Patents

Description

imagen1

imagen2

imagen3

imagen4

imagen5

imagen6

un individuo a otro, de tal forma que el juicio del médico puede ser apropiado a la hora de determinar un hematocrito diana real para cualquier paciente dado. No obstante, el determinar un hematocrito diana se encuentra dentro del grado de conocimiento en este campo.

5 Una cantidad terapéuticamente efectiva de las presentes composiciones puede ser determinada fácilmente por un experto en este campo. El Ejemplo 6 expone un protocolo clínico que tiene como uno de sus objetivos el determinar una cantidad terapéuticamente efectiva del análogo N47, tanto con una dosificación de una vez por semana como de tres veces por semana. Un rango de dosificación de administración una vez por semana es de alrededor de 0,075 a alrededor de 4,5 μg de péptido de eritropoyetina por kg por dosis. Un rango de dosificación de

10 administración de tres veces por semana es de 0,025 a 1,5 μg de péptido de eritropoyetina por kg por dosis. Este rango de dosificación puede ser utilizado con otros análogos hiperglicosilados de la Epo, siendo algo rutinario para una persona experta en este campo cualquier ajuste en el rango de dosificación.

Una ventaja significativa de la presente invención es la habilidad para correlacionar el grado de hiperglicosilación

15 tanto con una cantidad de dosificación como con un intervalo de dosificación, lo cual permitiría “adaptar” un análogo de la Epo a una dosificación o calendario de dosificación dados. Basándose en el incremento de las actividades in vivo de los análogos de la Epo que poseen una, dos o tres cadenas adicionales de carbohidratos, conforme es mostrado en la Figura 3, el médico encargado del tratamiento puede seleccionar un análogo que sea adecuado y conveniente para la dolencia anémica en tratamiento. Por ejemplo, en pacientes que muestran anemia aguda y que

20 necesitan una dosis efectiva grande, o en pacientes que requieren un tratamiento a largo plazo, puede ser preferida la administración de un análogo hiperglicosilado con tres o cuatro -o incluso más-cadenas adicionales de carbohidratos. Para otros pacientes que experimentan una anemia menos grave o que requieren de un tratamiento durante un período de tiempo relativamente corto, puede ser preferido un análogo con una o dos cadenas adicionales de carbohidratos. Los análogos de la presente invención proporcionan al médico una considerable

25 flexibilidad a la hora de prevenir y tratar la anemia que puede ser el resultado de una variedad de dolencias subyacentes.

La invención proporciona también la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de hierro, con el fin de mantener una eritropóyesis elevada durante la terapia. La cantidad a ser facilitada puede ser determinada

30 fácilmente por un experto en este campo, basándose en la terapia con rHuEpo.

La presente invención puede ser utilizada para estimular la producción de células rojas sanguíneas y para prevenir y tratar la anemia. Entre las dolencias tratables por medio de la presente invención se encuentran incluidas la anemia asociada a una disminución o pérdida de la función renal (fallo renal crónico), la anemia asociada a terapia

35 mielosupresiva, como los fármacos quimioterapéuticos o antivirales (como el AZT), la anemia asociada a la progresión de cánceres no mieloides, la anemia asociada a infecciones virales (tales como el VIH) y la anemia debida a enfermedad crónica. También son tratables las dolencias que pueden llevar a un individuo de otra manera sano a tener anemia, tales como una pérdida prevista de sangre durante cirugía. Por lo general, cualquier dolencia tratable con la rHuEpo puede ser tratada también con los análogos hiperglicosilados de la Epo de la invención.

40 Son descritas también composiciones farmacéuticas comprendiendo una cantidad terapéuticamente efectiva de un análogo hiperglicosilado de la Epo junto con un diluyente, portador, solubilizante, emulsificador, preservante y/o adyuvante farmacéuticamente aceptable. La composición será adecuada para un calendario de dosificación inferior a tres veces por semana. La composición puede encontrarse en forma líquida o liofilizada y comprende un diluyente

45 (tampones Tris, citrato, acetato o fosfato) con distintos valores de pH y fuerzas iónicas, un solubilizador como el Tween o el polisorbato, portadores como la albúmina sérica humana o la gelatina, preservantes tales como el timerosal, los parabenos, el cloruro de benzalconio o el alcohol bencílico, antioxidantes tales como el ácido ascórbico o el metabisulfito de sodio, y otros componentes tales como la lisina o la glicina. La selección de una composición determinada dependerá de un número de factores, incluyendo la dolencia a ser tratada, la ruta de

50 administración y los parámetros farmacocinéticos deseados. Un examen más extenso de los componentes adecuados para las composiciones farmacéuticas se puede encontrar en Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18 edic. A.R. Gennaro, ed. Mack, Easton, PA (1980). En una realización preferida, los análogos hiperglicosilados de la Epo de la invención son formulados en forma líquida en una solución isotónica tamponada con cloruro sódico/citrato sódico conteniendo albúmina humana y, opcionalmente, conteniendo alcohol bencílico como preservante. Las

55 composiciones contienen preferiblemente análogos con una, dos, tres, cuatro, o más cadenas adicionales de carbohidratos.

Las composiciones de la invención son administradas preferiblemente por medio de inyección, subcutánea o intravenosa. La ruta de administración eventualmente escogida dependerá de un número de factores y puede ser

60 determinada por un experto en este campo.

Los siguientes ejemplos son ofrecidos con el fin de ilustrar en mayor medida la invención, pero no han de ser interpretados como limitadores del ámbito de la misma.

8

EJEMPLO 1

Construcción de Análogos Hiperglicosilados de la Epo

5 Construcción de ADNcs codificando para Análogos Hiperglicosilados de la Epo

Fueron preparados análogos de la Epo por medio de mutagénesis in vitro utilizando varios métodos diferentes. Los análogos N49 y N50 fueron construidos conforme es descrito en WO95/05465. Los análogos fueron construidos también por medio de variaciones de métodos de PCR (reacción en cadena de la polimerasa) con solapamiento. El procedimiento básico incluyó dos fases sucesivas. En la primera fase fueron realizadas dos reacciones (PCR1 y PCR2) con ADN templete de la Epo, o del análogo de la Epo, utilizando un total de cuatro oligonucleótidos: un iniciador (delantero “forward”) 5’, un iniciador mutagénico reverso, un iniciador mutagénico delantero (usualmente complementario del iniciador mutagénico reverso) y un iniciador (opuesto “reverse”) 3’. Los iniciadores mutagénicos contenían los cambios nucleotídicos deseados, así como de 6 a 14 nucleótidos con coincidencia exacta en cada 15 lado de estos cambios. La PCR1 utilizó el iniciador (delantero) 5’ y el iniciador mutagénico reverso. La PCR2 utilizó el iniciador (opuesto) 3’ y el iniciador mutagénico delantero. Los fragmentos de ADN amplificados fueron separados por medio de electrofóresis en gel de agarosa. Fueron separadas del gel pequeñas porciones de agarosa conteniendo fragmentos de ADN de tamaño adecuado. Los fragmentos de ADN procedentes de la PCR1 y de la PCR2 fueron combinados entre sí y fue llevada a cabo una tercera reacción PCR utilizando únicamente los iniciadores delantero 5’ y opuesto 3’. De esta forma fue amplificado un segmento de ADN completo conteniendo las mutaciones deseadas. En algunos casos fueron combinadas dos o tres mutaciones por medio de la introducción de una nueva sustitución en el ADN que ya contenía un cambio, utilizando el mismo proceso PCR. Para construir estos análogos con múltiples sitios de glicosilación fueron utilizados análogos con un único sitio, con dos sitios o con tres sitios de glicosilación (producidos según es descrito más arriba) como un templete para PCR, y fue introducido un

25 sitio adicional de glicosilación por medio de mutagénesis dirigida a sitio con los iniciadores adecuados.

Los análogos de la Epo N51, N52 y N53 fueron construidos por medio del método 1 de PCR (reacción en cadena de la polimerasa) con solapamiento. Fue introducido en cada caso un sitio adicional de N-glicosilación. El N56 añadió un sitio de glicosilación (N114 T116) a la secuencia original de rHuEpo al utilizar Epo pDSRα2 como templete de PCR; el N51 añadió un sitio de glicosilación ligada a O (Thr125) a la Epo N47 al utilizar el templete Epo N47 Epo pDSRα2 (Asn30, Thr32, Val87, Asn88, Thr90); y el análogo N59 añadió un sitio de glicosilación (Asn53) al análogo N47 al utilizar el templete Epo N47 pDSRα2.

Las reacciones en cadena de la polimerasa para el método 1 fueron realizadas utilizando un protocolo adaptado de

35 Cheng et al., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 5695 (1994)). El iniciador (opuesto) 3’ contenía secuencias que introdujeron un codón terminador seguido de un sitio de restricción Xba I:

ATCTAGAAGTTGCTCTCTGGACAGTTCCT (SEC. ID. Nº 2).

El iniciador de reacción delantero 5’:

GAAGCTTGCGCCACCATGGGGGTGCACGAATG (SEC. ID. Nº 3) tenía un sitio de restricción Hind III seguido de una secuencia Kozak aguas arriba del codón iniciador (ATG) de la Epo. La mezcla de reacción usual de PCR contenía: 4 μl de cada uno de los iniciadores, delantero y opuesto (5 pmol/μl), 1 μl de templete (25 ng), 10 μl de 45 tampón LP 5X (100 mM de Tricina pH 8,7/25% glicerol/425 mM de KOAc), 10 μl de dNTP stock (1 mM de cada uno de ellos: dATP, dTTP, dCTP, dGTP), 0,8 μl de rTth polimerasa (Perkin Elmer; 2,5 U/μl), y 2 μl de Vent polimerasa (NEB; 0,01 U/μl después de dilución fresca 1:100 en tampón LP 1X). Fue añadido H2O para que el volumen final fuera de 50 μl. Todos los componentes fueron añadidos juntos en el orden mostrado y fue comenzada la PCR cuando la temperatura durante el primer ciclo se encontraba por encima de los 60ºC, al añadir 1 μl de 50 mM de MgOAc. Las condiciones usuales de la reacción fueron: 2 ciclos de 94ºC, 10 seg/ 50ºC, 1 min/ 68ºC, 5 min, seguido de 25 ciclos de 94ºC, 10 seg/ 55ºC, 1 min/ 68ºC, 5 min. Los fragmentos amplificados fueron separados por medio de electrofóresis en gel de agarosa y el fragmento de ADN de tamaño correcto fue purificado utilizando un kit Geneclean™ y los procedimientos facilitados por el fabricante (Bio 101, Inc.). El ADN purificado fue digerido con Hind III y Xba I, a continuación fue purificado de nuevo utilizando el kit Geneclean™. Después, el fragmento fue

55 ligado al vector pDSRα2 cortado con Hind III y Xba I. El ADN ligado fue precipitado con 2 volúmenes de etanol en 0,3M de NaOAc, pH 5.2, en presencia de ARNt portador, y fue transformado en E. Coli. Los análogos de la Epo fueron sometidos a escrutinio por medio de digesto de restricción en preparados de ADN mini. Fueron preparados a continuación plásmidos procedentes de clones positivos y el inserto fue secuenciado para confirmar la presencia de las mutaciones deseadas y para asegurar que no fueran introducidos cambios aminoacídicos adicionales.

Los análogos N54 y N61 fueron construidos utilizando el método 2 de estrategia de PCR con solapamiento. El iniciador (opuesto) 3’ contenía secuencias que introdujeron un codón terminador seguido de un sitio de restricción Xba I:

65 GATCCTCTAGAGTTGCTCTCTGGACAG (SEC. ID. Nº 4).

9

imagen7

imagen8

imagen9

imagen10

aLos resultados son presentados como el promedio del grupo + SD para cinco ratas en el grupo del N47 y para seis ratas en el grupo de la rHuEpo.

En los estudios con perros, perros Beagle normales pesando entre 7,8 y 9,5 kg recibieron una inyección intravenosa

5 en bolo de ~29μCi de rHuEpo 125I o de N47 125I (~0,1μg del péptido/kg) dentro de la vena cefálica. En distintos momentos, a lo largo de 24 horas después de la administración, fueron recogidos aproximadamente de 1 a 2 mL de sangre y fue preparado el suero. Fue determinada la concentración de la rHuEpo 125I y del N47 125I en 0,1 mL de suero, y fueron calculados los parámetros farmacocinéticos conforme es descrito más arriba. La concentración de suero contra las curvas farmacocinéticas en el tiempo para los estudios del perro son mostradas en la Figura 5. Los puntos de tiempo son las medias por grupo de dos animales en cada grupo. Los parámetros farmacocinéticos son resumidos en la Tabla 4.

TABLA 4

15 Comparación de IV Parámetros Farmacocinéticos del N47 y de la rHuEpo en Perros

Muestra de la

Vida media Va (mL/kg) Desaparición en suero (mL/kg-hora)

Prueba

α (horas) β (horas)

N47

0,34 25,0 55,9 2,4

rHuEpo

0,40 7,2 60,8 8,4

aLos resultados presentados son los parámetros promedio para los dos perros de cada grupo.

En ambos estudios, el de la rata y el del perro, la rHuEpo y el análogo de la Epo N47 exhibieron una desaparición en suero bifásica. La desaparición en las ratas fue alrededor de 3,7 veces más rápida para la rHuEpo que para el análogo de la Epo N47, y la vida media β fue alrededor de 2,8 veces más larga para el análogo de la Epo N47 que para la rHuEpo. Los parámetros farmacocinéticos en los estudios con perro fueron consistentes por lo general con

25 los observados en rata. En los perros la desaparición de la rHuEpo fue 3,5 veces más rápida que la del análogo de la Epo N47, y la vida media β fue 3,5 veces más larga para el análogo de la Epo N47 comparada con la de la rHuEpo.

EJEMPLO 5

Respuesta a dosis del hematocrito después de la administración

de la rHuEpo y del análogo de la Epo N47

Estudios de Respuesta a dosis del Hematocrito tres veces por semana (TIW)

35 Fueron comparados los efectos biológicos in vivo de la rHuEpo y del análogo de la Epo N47 en ratones normales después de la administración de un rango de dosis, intraperitonealmente o por medio de inyección intravenosa, tres veces por semana a lo largo de hasta seis semanas. Las determinaciones del hematocrito fueron realizadas dos veces por semana por medio de sangrado retrorbital.

Ratones normales CD1 pesando aproximadamente 30 g (10-13 ratones por grupo) fueron inyectados intraperitonealmente tres veces por semana durante un total de seis semanas con rHuEpo (sobre el rango de dosificación de 0,625-10μg de péptido/kg/dosis), con análogo de la Epo N47 (sobre el rango de dosificación de 0,156-1,25μg de péptido/kg/dosis) o con vehículo de control. El vehículo de control y diluyente para los distintos

45 preparados de dosificación de la rHuEpo y del análogo de la Epo N47 fue solución salina tamponada con fosfato (PBS), conteniendo 0,025% de albúmina sérica de ratón. Fueron determinados como base los hematocritos de todos los ratones y, dos veces por semana después de esto, por medio de sangrados retrorbitales. Al finalizar el experimento fue recolectado el suero procedente de todos los animales y fue sometido a análisis para determinar los anticuerpos al producto inyectado por medio de un ensayo de radioinmunoprecipitación de solución. Los datos del hematocrito procedentes de animales a los que se juzgó negativos para neutralizar anticuerpos fueron utilizados para análisis subsiguiente.

Conforme es mostrado en la Figura 6 tanto la rHuEpo como el análogo de la Epo N47 producen un incremento en el hematocrito dependiendo de la dosis en el estudio de seis semanas, aunque el análogo N47 promueve un

55 incremento mayor en el hematocrito si se compara con la rHuEpo en una concentración dada. En este experimento el análogo de la Epo N47 es alrededor de 3 a 4 veces más potente cuando es dosificado tres veces por semana por medio de inyección intraperitoneal.

Los estudios de respuesta a dosis de la rHuEpo y del análogo N47 fueron llevados a cabo por medio de inyección intravenosa tres veces por semana, utilizando procedimientos similares a los de la inyección intraperitoneal. Los resultados obtenidos fueron similares a los de la administración intraperitoneal y, en particular, los estudios

14

imagen11

inyectados intravenosamente una vez por semana, o una vez cada dos semanas, durante un total de aproximadamente seis semanas, con concentraciones variables del análogo de la Epo N47 preparado en PBS conteniendo 0,025% de albúmina sérica de ratón. El análogo N47 fue administrado en cantidades de 200, 100 o 25 μg/kg/dosis una vez cada dos semanas, o con una cantidad de 12,5 μg/kg/dosis una vez por semana. Fueron

5 determinados como base los hematocritos de todos los ratones y, dos veces por semana después de ello, por medio de sangrados retrorbitales.

Conforme es mostrado en la Figura 9, el análogo N47 puede elevar el hematocrito de ratones normales de un modo que depende de la dosificación, aún cuando es administrado dos veces al mes. Como sería de esperar, cuando es dosificado con una frecuencia menor se requiere una cantidad mayor del análogo N47 para elevar el hematocrito. Una dosis de 200 μg/kg del análogo N47 administrado una vez cada dos semanas elevó el hematocrito hasta aproximadamente el mismo nivel en seis semanas que el conseguido por 12,5 μg/kg cuando es dosificado semanalmente.

15 EJEMPLO 6

IV Farmacocinéticas del análogo de la Epo N47 y de la rHuEpo en pacientes en Diálisis Peritoneal Ambulatoria Continua (CAPD)

A la vista del marcado incremento en la vida media en suero del análogo de la Epo N47 en comparación con la rHuEpo en rata y perro beagle, fue de interés el determinar si podría ser observado también un incremento en humanos.

25 Fue llevado a cabo un estudio de diseño aleatorizado, cruzado, a doble ciego de once pacientes CAPD estables (7 hombres, 4 mujeres, de 25 a 75 años de edad). Un grupo de pacientes recibió 100 U/kg de rHuEpo (equivalente a 0,5 μg de péptido/kg) mientras que un segundo grupo de pacientes recibió 0,5 μg de péptido/kg del análogo de la Epo N47, ambos administrados como una única inyección intravenosa en bolo. Fueron sacadas muestras de sangre venosa (3 mL) a través de una cánula fijada internamente y fueron tomadas antes de la dosificación y a los 5, 10, 15, 30 minutos y a 1, 2, 5, 8, 12, 16, 24, 30, 36, 48, 60, 72 y 96 horas después del bolo intravenoso. Después de un período de 28 días de eliminación, el primer grupo de pacientes recibió una única dosis intravenosa del análogo de la Epo N47 mientras que el segundo grupo recibió una única dosis intravenosa de la rHuEpo. Fueron tomadas muestras sanguíneas de la misma forma que en el primer ciclo de tratamiento. Fueron determinados los niveles en suero de la rHuEpo y del análogo de la Epo N47 por medio de ELISA después de restar los niveles base de la Epo

35 endógena. Los parámetros farmacocinéticos (media + SE) estimados después del ajuste para los efectos de diseño cruzado son mostrados en la Tabla 5. La concentración en suero AUC fue calculada utilizando la suma trapezoidal lineal. t1/2z es definido como: log(2)/Kz, donde Kz es calculado como la ladera de la parte final de la curva de tiempo 1n (concentración de suero). La desaparición (Cl) es definida como: dosis/AUC. El volumen de distribución (Vd) es definido como:Cl/K.

TABLA 5

Grupo de Dosificación

AUC (ng.h/mL) t1/2z (h) Cl (mL/h/kg) Vd (mL/kg)

N47

291,0+7,6 25,3+2,2 1,6+0,3 52,4+2,0

rHuEpo

131,9+8,3 8,5+2,4 4,0+0,3 48,7+2,1

El promedio de vida media en suero para el análogo de la Epo N47 (25,3 h) fue tres veces más largo que el de la 45 rHuEpo (8,5 h) y la desaparición fue 2,5 veces más rápida para la rHuEpo que para el análogo N47.

EJEMPLO 7

Una Fase II del Estudio para Determinar la Dosis y el Calendario de Dosificación del Análogo de la Epo N47

Fueron iniciados estudios de escalado de dosis secuenciales, aleatorios, multicéntricos con el fin de investigar la dosis y el calendario de dosificación óptimos para el análogo N47 cuando es administrado por medio de inyección subcutánea o intravenosa, en pacientes con CRF recibiendo diálisis.

55 El calendario de dosificación es el siguiente:

Dosificación de una vez por semana: 0,075, 0,225, 0,45, 0,75, 1,5 y 4,5 μg de péptido/kg/dosis.

Dosificación de tres veces por semana: 0,025, 0,075, 0,15, 0,25, 0,5 y 1,5 μg de péptido/kg/dosis.

Los estudios son llevados a cabo en dos partes: la primera parte es un estudio de escalado de dosis diseñado para evaluar la dosis del análogo N47, facilitado una vez o tres veces por semana, la cual incrementa la hemoglobina

16

Claims (1)

1. imagen1