ES2347884T3 - Metodo y composiciones para la prevenciã“n y tratamiento de la anemia. - Google Patents

Abstract

Un análogo de la eritropoyetina humana que comprende al menos un sitio de glucosilación adicional en cualquiera de las posiciones 52, 53, 55, 86 y 114 de la secuencia de eritropoyetina humana, en el que una cadena de carbohidratos N-ligada se añade al sitio.

Description

Campo de la Invención

La invención se refiere al aumento del hematocrito en un mamífero mediante el uso de análogos hiperglucosilados de eritropoyetina. Más particularmente, la invención se refiere a una dosificación menos frecuente de un análogo hiperglucosilado en comparación con eritropoyetina humana recombinante para aumentar y mantener el hematocrito y tratar la anemia. La invención también se refiere a la administración de cantidades más bajas de análogo hiperglucosilado en comparación con la eritropoyetina humana recombinante a una frecuencia de dosificación equivalente para aumentar y mantener el hematocrito y tratar la anemia. Los análogos hiperglucosilados nuevos de eritropoyetina también se proporcionan como se define en las reivindicaciones. Antecedentes de la Invención

La eritropoyetina (Epo) es una hormona glucoproteica necesaria para la maduración de células progenitoras eritroides a eritrocitos. Se produce en el riñón y es esencial para la regulación de los niveles de glóbulos rojos en la circulación. Las afecciones marcadas por niveles bajos de señal de oxígeno de tejido aumentaron la producción de Epo, lo que a su vez estimula la eritropoyesis. Una pérdida de la función renal como se observa en el fallo renal crónico (CRF), por ejemplo, da como resultado típicamente la producción disminuida de Epo y una reducción concomitante de glóbulos rojos.

La Epo urinaria humana se purificó por Miyake et al. (J. Biol. Chem. 252, 5558 (1977)) a partir de pacientes con anemia aplástica. Sin embargo, la cantidad de proteína Epo purificada obtenida a partir de esta fuente fue insuficiente para las aplicaciones terapéuticas. La identificación y clonaje del gen que codifica la Epo humana y la expresión de la proteína recombinante se describió en la Patente de Estados Unidos Nº 4.703.008 de Lin, la descripción de la cual se incorpora en el presente documento por referencia. Un método para la purificación de eritropoyetina humana recombinante a partir del medio celular se describe en la Patente de Estados Unidos Nº 4.667.016 de Lai et al. La producción de Epo biológicamente activa a partir de células hospedadoras de mamífero ha puesto a disposición, por primera vez, cantidades de Epo adecuadas para aplicaciones terapéuticas. Además, el conocimiento de la secuencia génica y la disponibilidad aumentada de proteína purificada ha conducido a un mejor entendimiento en modo de acción de esta proteína.

Tanto la Epo derivada urinaria humana (Miyake et al. anteriormente) como la Epo humana recombinante expresadas en células de mamífero contienen tres cadenas de oligosacáridos N-ligadas y una O-ligada que juntas comprenden aproximadamente el 40% del peso molecular de la glucoproteína. La glucosilación N-ligada se produce en restos de asparagina localizados en las posiciones 24, 38 y 83 mientras que la O-glucosilación se produce en un resto de serina localizado en la posición 126 (Lai et al. J. Bio. Chem. 261, 3116 (1986); Broudy et al. Arch. Biochem. Biophys. 265, 329 (1988)). Se ha mostrado que las cadenas de oligosacáridos se modifican con restos de ácido siálico terminales con cadenas N-ligadas que tienen típicamente hasta cuatro ácidos siálicos por cadena y cadenas O-ligadas que tienen hasta dos ácidos siálicos. Un polipéptido de Epo puede por lo tanto incorporar hasta un total de 14 ácidos siálicos.

Diversos estudios han mostrado que las alteraciones de las cadenas de carbohidratos de Epo pueden afectar la actividad biológica. En un estudio, sin embargo, la eliminación de unas cadenas de oligosacáridos N-ligadas u O-ligadas, individualmente o juntas, por mutagénesis de restos de asparagina o serina que son sitios de glucosilación reduce bruscamente la actividad in vitro de la Epo alterada que se produce en células de mamífero (Dube et. al. J. Biol. Chem. 263, 17516 (1988)). Sin embargo, DeLorme et al. (Biochemistry 31, 9871-9876 (1992)) presentaron que la eliminación de los sitios de glucosilación N-ligados en Epo redujo la actividad biológica in vivo pero no in vitro.

La relación entre el contenido de ácido siálico de Epo y la actividad biológica in vivo se describió determinando la actividad in vivo de isoformas de Epo aisladas. Se descubrió que un incremento gradual en el contenido de ácido siálico por molécula de Epo proporcionó un incremento gradual correspondiente en la actividad biológica in vivo como se midió por la capacidad de las concentraciones equimolares de isoformas de Epo aisladas para aumentar el hematocrito de ratones normales (Egrie et al. Glycoconjugate

J. 10, 263 (1993)). Aquellas isoformas Epo que tienen el contenido más alto de ácido siálico también exhibieron una semivida sérica más larga pero una afinidad disminuida por el receptor de Epo, lo que sugiere que la semivida sérica es un determinante importante de la actividad biológica in vivo.

La introducción de nuevos sitios de glucosilación en el polipéptido de Epo puede dar como resultado la producción de moléculas con cadenas de carbohidratos adicionales. Véase las Publicaciones PCT Nº WO 91/05867 y WO 94/09257. Se describen los análogos de glucosilación de Epo que tienen al menos una cadena de carbohidratos N-ligada adicional y/o que tienen al menos una cadena de carbohidratos O-ligada adicional. Se determinó que un análogo de glucosilación que tiene una cadena N-ligada adicional tenía una semivida circulante más larga en comparación con la Epo humana recombinante (rHuEpo) (isoformas 9-14) y con una isoforma purificada de rHuEpo que tiene 14 ácidos siálicos por molécula.

La administración de eritropoyetina humana recombinante (rHuEpo) es eficaz en el aumento de los niveles de glóbulos rojos en pacientes anémicos con una enfermedad renal en etapa terminal (Eschbach et al. New Eng. J. Med. 316,73-38 (1987)). Estudios posteriores han mostrado que el tratamiento con rHuEpo pueden corregir la anemia asociada con la variedad de otras afecciones. (Fischl et al. New Eng. J. Med. 322, 1488-1493 (1990); Laupacis, Lancet 1228-1232 (1993). Se han proporcionado aprobaciones reguladoras por el uso de rHuEpo en el tratamiento de la anemia asociada con CRF, anemia relacionada con la terapia con AZT (zidovudina) en pacientes infectados por VIH, anemia en pacientes con tumores no mieloides que reciben quimioterapia y anemia en pacientes que se han sometido a cirugía para reducir la necesidad de transfusiones sanguíneas alogénicas. La terapia actual para todas las indicaciones aprobadas (excepto la indicación de cirugía) implica una dosis de partida de entre 50-150 unidades/kg tres veces por semana (TIW) administrados por una inyección intravenosa (IV) o subcutánea (SC) para alcanzar un intervalo de hematocrito diana sugerido. Para la indicación de cirugía, rHuEpo se administra cada día 10 días antes de la cirugía, el día de la cirugía y cuatro días después de ella (Prospecto EPOGEN®, 12/23/96). En general, las dosis de partida recomendadas actuales para rHuEpo aumentan el hematocrito en el intervalo diana en aproximadamente de seis a ocho semanas. Una vez el intervalo de hematocrito diana se ha conseguido, se establece un régimen de dosificación de mantenimiento que variará dependiendo del paciente, pero es típicamente de tres veces por semana para pacientes anémicos con CRF. La administración de rHuEpo descrita anteriormente es un régimen eficaz y bien tolerado para el tratamiento de la anemia.

El documento EP 0267678 describe una célula epiteloide de roedor transformada con un vector de ADN recombinante incluyendo una secuencia de ADN que codifica la eritropoyetina humana, que es capaz de producir eritropoyetina humana glucosilada N-ligada y O-ligada.

Sería deseable tener una terapéutica con mayor potencia que rHuEPO. Una ventaja para esta molécula sería que podría administrarse menos frecuentemente y/o en una dosis menor. Los tratamientos actuales para pacientes que padecen anemia requieren la administración de EPOGEN® tres veces por semana y para los pacientes de cirugía la administración de una vez al día. Un régimen de dosificación menos frecuente sería más conveniente tanto para médicos como pacientes, especialmente aquellos pacientes que no hacen visitas programadas regularmente a los despachos o clínicas de los doctores o para aquellos que se inyectan a sí mismos su Epo. Otra ventaja de una molécula más potente es que se introduce menos fármaco en el paciente para un aumento comparable en el hematocrito.

Es por lo tanto un objetivo de la invención identificar moléculas más potentes para el tratamiento de la anemia que permitirán un régimen de dosificación menos frecuente. Es un objetivo adicional de la invención proporcionar moléculas que aumentarán y mantendrán el hematocrito a niveles que son al menos comparables a aquellos de Epo cuando se administra a una dosis menor. También es un objetivo de la invención que estas moléculas seleccionadas para una dosificación menos frecuente sean al menos igual de bien toleradas que la rHuEpo y potencialmente mejor toleradas en algunos pacientes. Sumario de la Invención

Se ha descubierto que un análogo de Epo hiperglucosilado denominado N47 (Asn30Thr32Val87Asn89Thr90 Epo) tiene una semivida sérica más larga que la eritropoyetina humana recombinante (rHuEpo) y una actividad in vivo mejor cuando se administra a la misma dosis y frecuencia que rHuEpo. Además, se ha mostrado que el análogo aumenta el hematocrito en ratones en una administración de una vez por semana que es comparable al aumento de hematocrito para la rHuEpo administrada tres veces por semana. La farmacocinética del análogo de Epo N47 administrado a ratones y a humanos fue similar.

Las realizaciones de la presente invención son:

1.

Un análogo de la eritropoyetina humana que comprende al menos un sitio de glucosilación adicional en cualquiera de las posiciones 52, 53, 55, 86 y 114 de la secuencia de la eritropoyetina humana, en el que una cadena de carbohidratos N-ligada se añade al sitio.

2.

El análogo de 1 que comprende al menos dos sitios de glucosilación adicionales en el que una cadena carbohidratos se une a cada uno de los sitios.

3.

El análogo de 1 que comprende al menos tres sitios de glucosilación adicionales en el que una cadena de carbohidratos se une a cada uno de los sitios.

4.

El análogo de 1 que comprende al menos cuatro sitios de glucosilación adicionales en el que la cadena de carbohidratos se une a cualquiera de los sitios.

5.

Un análogo de la eritropoyetina humana seleccionado del grupo que

consiste en: Asn52Thr54Epo; Asn53 Thr55 Epo; Asn114Thr116Epo; Asn30 Thr32 Asn53 Thr55 Val87 Asn88Thr90 Epo; Asn55Thr57 Epo; Asn86 Val87 Thr88 Epo; Asn30 Thr32 Asn53 Thr55 Epo; Asn30 Thr32 Asn114 Thr116 Epo; y Asn30 Thr32 Asn53 Thr55 Val87 Asn88 Thr90 Asn114 Thr116 Epo.

6.

El análogo de 1-5 que es el producto de la expresión de una secuencia de ADN exógeno.

7.

Una secuencia de ADN que codifica el análogo de 1-5.

8.

Una célula hospedadora eucariota transfectada con la secuencia de ADN de 7 de un modo que permite a la célula hospedadora expresar el análogo.

9.

Una composición que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del análogo de 1-5, junto con un vehículo, adyuvante o diluyente

farmacéuticamente aceptable.

10.

El uso del análogo de cualquiera de 1 a 5 para la preparación de una composición farmacéutica para aumentar y mantener el hematocrito en un mamífero.

11.

El uso del análogo de 10, en el que el análogo va a administrarse menos frecuentemente que una cantidad molar equivalente de eritropoyetina humana recombinante para obtener un hematocrito diana comparable.

12.

El uso del análogo de 11, en el que la cantidad del análogo se va a administrar aproximadamente una vez por semana, aproximadamente una vez cada dos semanas o aproximadamente una vez al mes.

13.

El uso del análogo de 10, en el que el análogo va a administrarse a una cantidad molar menor que la eritropoyetina humana recombinante para obtener un hematocrito diana comparable.

14.

El uso del análogo de 12, en el que la cantidad de análogo que se va a administrar es aproximadamente de 0,025 a 1,5 g de péptido de eritropoyetina por kg por dosis tres veces por semana.

15.

El uso del análogo de 12, en el que la cantidad de análogo que se va a administrar es menor que aproximadamente 0,025 g de péptido de eritropoyetina por kg por dosis tres veces por semana.

16.

El análogo de cualquiera de 1 a 5 para su uso en el aumento y mantenimiento del hematocrito en un mamífero.

17.

Un método de producción de un análogo de la eritropoyetina humana que comprende el cultivo de la célula hospedadora de 8 en condiciones que permiten la expresión del análogo y la recuperación del análogo a partir del medio celular.

Descripción de las Figuras La Figura 1 muestra la secuencia de aminoácidos de la eritropoyetina humana. La Figura 2 muestra un análisis de transferencia de Western de rHuEpo y los análogos hiperglucosilados de Epo a partir de la expresión de células CHO en medio sin de suero. La construcción de análogos N53 y N61 se describe en el Ejemplo 1. Se indica el número de cadenas de carbohidratos N-ligadas en cada análogo. La Figura 3 compara la actividad de rHuEpo, análogos de Epo N4, N18 y N50 (que contienen cuatro cadenas de carbohidratos N-ligadas), N47 (que contiene cinco cadenas de carbohidratos N-ligadas) y N53 (que contiene seis cadenas de carbohidratos N-ligadas) en el bioensayo de ratón policitémico exhipóxico. Los procedimientos experimentales se describen en el Ejemplo 3. Cada punto representa la respuesta media de cinco animales. Los análogos N4, N18 y N47 se han descrito previamente en el documento WO 94/09257. La Figura 4 compara la semivida sérica de rHuEpo y el análogo de Epo N47 administrado a ratas normales mediante inyección intravenosa (IV). Los procedimientos experimentales se describen en el Ejemplo 4. Los resultados son la media (± SD) para cada grupo. La Figura 5 compara la semivida sérica de rHuEpo y el análogo de Epo N47 administrados a perros Beagle por inyección intravenosa (IV). Los procedimientos experimentales se describen en el Ejemplo 4. Los resultados son la media (± SD) para cada grupo. La Figura 6 muestra el aumento en el hematocrito en ratones en respuesta a dosis variables de rHuEpo o el análogo de Epo N47 administrado por inyección intraperitoneal (IP) tres veces por semana (TIW) durante seis semanas. Los procedimientos experimentales se describen en el Ejemplo 5. Los resultados mostrados son la media de grupo (± SD) del cambio en el hematocrito para cada grupo de dosis. La Figura 7 compara la potencia relativa en ratones de rHuEpo y el análogo de Epo N47 inyectados mediante las vías de administración intraperitoneal (IP) o intravenosa (IV) a una frecuencia de una vez por semana (QW) o tres veces por semana (TIW). Los procedimientos experimentales se describen en el Ejemplo 5. Cada punto representa la media (± SD) de datos de experimentos separados de la siguiente manera: N47, IP, TIW (n = 5); N47, IV, TIW (n = 1); N47, IP, QW (n = 2); N47, IV, QW (n = 3); rHuEpo, IP, TIW (n = 5); rHuEpo, IV, QW (n = 2). Cada experimento usó 7-13 ratones por dosis. La Figura 8 muestra el aumento en el hematocrito en ratones en respuesta a dosis variables de rHuEpo o el análogo de Epo N47 administrado por inyección intravenosa (IV) una vez por semana (QW) durante aproximadamente seis semanas. Los procedimientos experimentales se describen en el Ejemplo 5. Los resultados que se muestran son la media de grupo (± SD) del cambio en el hematocrito de

cada grupo de dosis.

La Figura 9 muestra el aumento en el hematocrito en ratones en

respuesta a dosis variables del análogo de Epo N47 administrado

mediante inyección intravenosa (IV) una vez por semana (QW) o una vez

cada dos semanas (EOW) durante aproximadamente seis semanas. Los

procedimientos experimentales se describen en el Ejemplo 5. Los

resultados que se muestran son la media de grupo (± SD) del cambio en

el hematocrito para cada grupo de dosis. Descripción Detallada de la Invención

La invención proporciona medios para el aumento y mantenimiento del hematocrito, en los que una cantidad terapéuticamente eficaz de un análogo hiperglucosilado de eritropoyetina se va a administrar en una composición farmacéutica. El análogo se va a administrar menos frecuentemente que una cantidad molar equivalente de rHuEpo para obtener un hematocrito diana comparable. La invención también proporciona un medio para aumentar y mantener el hematocrito en el que un análogo hiperglucosilado en cantidades molares menores que rHuEpo se va a administrar para obtener un hematocrito diana comparable. La composición se puede administrar mediante vías intravenosas, subcutáneas o intraperitoneales. Las realizaciones de la invención se definen en las reivindicaciones.

Sorprendentemente, se ha descubierto que el análogo N47, un análogo de Epo hiperglucosilado descrito en el documento WO 94/09257, podría conseguir un aumento en el hematocrito administrándose una vez por semana que fue comparable al observado para rHuEpo dado tres veces por semana. El análogo N47 tiene los siguientes cambios de aminoácidos: de ala a asn en 30; de his a thr en 32; de pro a val en 87; de trp a asn en 88 y de pro a thr en 90 lo que dio como resultado la adición de dos cadenas de carbohidratos N-ligadas en los restos de asparagina 30 y 88. El análogo se expresó en células del ovario de hámster Chino (CHO) (como se describe en el Ejemplo 1) y se purificó como se describe en el Ejemplo 2 para proporcionar isoformas de 17 a 22 ácidos siálicos. El análogo N47 mostró una semivida sérica en ratas y perros Beagle mejor que la rHuEpo cuando se inyectó por vía intravenosa (Figuras 4 y 5). Cuando se inyectó por vía intraperitoneal tres veces por semana, el N47 indujo aumentos en el hematocrito de ratones normales comparables a los de rHuEpo a concentraciones más bajas (Figura 6). La potencia de N47 se demostró que era aproximadamente de 3 a 4 veces más alta que la de rHuEpo cuando se administraba tres veces por semana (Figuras 6 y 7). Cuando se administraba una vez por semana, a dosis similares, rHuEpo mostró poca estimulación del hematocrito en ratones normales mientras que N47 proporcionó un incremento marcado (Figura 8). La potencia de N47 fue aproximadamente 14 veces más alta que la de rHuEpo para la dosificación una vez por semana (Figura 7). Significativamente, la respuesta del hematocrito para el análogo N47 administrado una vez por semana es comparable a aquella para rHuEpo administrada tres veces por semana. Incluso cuando se administra una vez cada dos semanas, N47 todavía produjo aumentos significativos en el hematocrito de ratones normales (Figura 9). En conjunto, los datos indicaron que los análogos hiperglucosilados de Epo y el análogo N47 en particular, puede usarse ventajosamente para aumentar el hematocrito usando una dosificación menos frecuente que para el tratamiento actual con rHuEpo.

También se ha mostrado que los resultados descritos anteriormente obtenidos en ratones pueden extrapolarse a humanos. Los parámetros farmacocinéticos para la administración de rHuEpo y el análogo N47 a 11 pacientes de Diálisis Peritoneal Ambulatoria Continua (DPAC) demuestran que el análogo N47 tiene una semivida sérica tres veces más larga que rHuEpo (Ejemplo 6 y Tabla 5). Estos resultados sugieren que los análogos hiperglucosilados de Epo permiten una dosificación menos frecuente que rHuEpo en seres humanos.

Como se usa en el presente documento, la expresión “análogo de Epo hiperglucosilado” se refiere a Epo que comprende al menos un sitio de glucosilación adicional con una cadena de carbohidratos adicional añadida al sitio. Los sitios de glucosilación pueden ser para cadenas de carbohidratos N-ligadas u O-ligadas. Los sitios de glucosilación N-ligados nuevos se introducen por alteraciones en la secuencia de ADN para codificar el sitio consenso para la adición de carbohidratos N-ligados (los amino ácidos Asn-X-Ser/Thr) en la cadena de polipéptidos, mientras que los sitios O-ligados nuevos se introducen por alteraciones en la secuencia de ADN para codificar un resto de serina o treonina. Los análogos se construyen por técnicas de mutagénesis para introducir las adiciones, deleciones o sustituciones de restos de aminoácido que aumentan o alteran los sitios en el polipéptido de Epo que están disponibles para la glucosilación. El ADN que codifica un análogo hiperglucosilado de Epo se transfecta en una célula hospedadora eucariota y la glicoproteína expresada se analiza respecto a la presencia de una cadena de carbohidratos adicional.

Los análogos hiperglucosilados de Epo han mostrado actividad in vitro que fue comparable a o incluso menor que aquella determinada para rHuEpo, lo que sugiere que la unión al receptor Epo no está aumentada y puede en algunos casos estar disminuida, por adición de cadenas de carbohidratos. Sin embargo, la hiperglucosilación puede aumentar típicamente la semivida sérica y puede llevar potencialmente a una actividad biológica in vivo aumentada. Un análogo de Epo que tenía una cadena de carbohidratos N-ligada adicional en la posición 88 exhibió afinidad disminuida por el receptor en comparación con rHuEpo (isoformas 9-14) o por una isoforma purificada de rHuEpo que tiene 14 ácidos siálicos por molécula, no obstante demostró una semivida circulante más larga y una actividad in vivo aumentada en comparación con una mezcla de las isoformas 9-14 de Epo o la isoforma 14 aislada de Epo.

Los análogos hiperglucosilados de Epo que se pueden administrar de acuerdo con la presente invención tendrán al menos una cadena de carbohidratos N-ligada u O-ligada adicional. Las realizaciones de la invención se definen en las reivindicaciones. En una realización, los análogos tendrán dos cadenas de carbohidratos N-ligados adicionales. En otras realizaciones, los análogos tendrán tres, cuatro o más cadenas de carbohidratos N-ligados adicionales. Como ejemplos, los análogos de la invención tendrán al menos una cadena N-ligada adicional en uno o más restos de aminoácidos 30, 51, 57, 69, 88, 89, 136 y 138 de la secuencia de la Epo humana. En una realización, el análogo tiene cadenas de carbohidratos N-ligados adicionales en los restos 30 y 88 de la Epo humana. La numeración de los restos de aminoácidos de la Epo humana es como se muestra en la Figura 1 y la SEC ID Nº: 1. La Figura 1 muestra un polipéptido de Epo maduro previsto de 166 aminoácidos mientras que la Epo producida de manera recombinante tiene 165 aminoácidos después de la eliminación del resto de arginina C-terminal. Se entiende que rHuEpo y los análogos de Epo hiperglucosilados pueden tener 165 ó 166 aminoácidos.

Los análogos de la invención pueden tener al menos cuatro cadenas de carbohidratos N-ligadas. De las cuatro cadenas, tres pueden estar en los sitios que se producen de manera natural en las posiciones 24, 38 y 83. Sin embargo, se contempla que algunos análogos de la invención pueden tener alteraciones de uno o más de los sitios de glucosilación que se producen de manera natural de modo que uno o más de los sitios se eliminan o se sustituyen con un sitio nuevo. Estos análogos también se proporcionan por la invención. Por ejemplo, uno cualquiera de los sitios en las posiciones 24, 38 y 83 puede eliminarse y sustituirse con un sitio en la posición 88. Opcionalmente, los análogos pueden tener un sitio O-ligado en la posición 126.

La invención proporciona nuevos análogos hiperglucosilados de Epo que tienen al menos una cadena de carbohidratos adicional. Se ha descubierto que se añade una cadena de carbohidratos N-ligada adicional en cualquiera de las posiciones 52, 53, 55, 86 y 114 que se han modificado para ser un sitio de glucosilación. Las realizaciones específicas incluyen los análogos N49 a N61 como se describe en la Tabla 1. Los nuevos análogos tendrán al menos un nuevo sitio de glucosilación N-ligado en cualquiera de las posiciones 52, 53, 55, 86 y 114 y pueden comprender adicionalmente cadenas de carbohidratos N-ligadas u O-ligadas en otros sitios. Los análogos pueden tener uno, dos, tres o cuatro cadenas de carbohidratos adicionales o más de cuatro cadenas adicionales. En una realización preferida, los análogos tendrán tres cadenas de carbohidratos N-ligadas adicionales (seis cadenas N-ligadas en total). En otra realización preferida, los análogos tendrán al menos cuatro cadenas N-ligadas adicionales (siete cadenas N-ligadas en total). Los análogos que tienen tres o cuatro o más de cuatro cadenas de carbohidratos N-ligadas adicionales pueden tener, pero no se limitan a, una cadena adicional en cualquiera de las posiciones 52, 53, 55, 86 y 114.

Sorprendentemente, se ha descubierto que un análogo hiperglucosilado con tres cadenas N-ligadas adicionales en las posiciones 30, 53 y 88 (seis cadenas N-ligadas en total) tiene una actividad in vivo mayor que el análogo N47 con dos cadenas adicionales (cinco en total). Los resultados se muestran en la Figura 3. Está claro que la actividad in vivo de los análogos depende directamente del número de cadenas de carbohidratos N-ligados. Estos resultados se pueden extrapolar al entorno terapéutico en el que los análogos que tienen más cadenas de carbohidratos N-ligadas que N47 pueden dosificarse incluso menos frecuentemente.

Los análogos se pueden preparar mediante una variedad de técnicas de mutagénesis disponibles para un experto en la materia, tales como la mutagénesis dirigida, la mutagénesis por PCR y la mutagénesis de casete (Zoller et al. Meth. Enz. 100, 468-500 (1983); Higuchi, en PCR Protocols página 177-183 (Academic Press, 1990); Wells et al. Gene 34, 315-323 (1985)). El Ejemplo 1 describe el uso de técnicas de mutagénesis por PCR para construir análogos hiperglucosilados de Epo nuevos.

Una secuencia de ADN de Epo que se ha sometido a mutagénesis se inserta en un vector de expresión usando técnicas convencionales, siendo el vector adecuado para el mantenimiento en una célula hospedadora de mamífero. El vector contendrá típicamente los siguientes elementos: promotor y otros elementos reguladores "de aguas arriba", el origen de replicación, el sitio de unión al ribosoma, el sitio de terminación de la transcripción, un sitio de clonación múltiple y marcadores seleccionables que son compatibles con el uso en una célula hospedadora de mamífero. Los vectores además pueden contener elementos que permitan la propagación y mantenimiento en células hospedadoras procariotas también.

Las líneas celulares o células adecuadas incluyen cualquiera de las fuentes de mamíferos, incluyendo las fuentes humanas. Los ejemplos incluyen COS-7 (Nº de acceso ATCC CRL 1651), humano 293, riñón de cría de hámster (BHK, Nº de acceso ATCC CCL 10), células de ovario de hámster Chino (incluyendo células deficientes en dihidrofolato reductasa (DHFR), Ur1ab et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216-4220 (1980)). Otras líneas celulares de mamífero adecuadas incluyen, pero no se limitan a, HeLa, L-929 y 3T3 de ratón. En una realización preferida, las células CHO deficientes en DHFR se usan.

Los vectores que comprenden secuencias que codifican los análogos de hiperglucosilación de Epo se introducen en células hospedadoras mediante técnicas de transfección o transformación convencionales. El cultivo, la amplificación y la exploración de células hospedadoras transfectadas o transformadas se consigue usando métodos disponibles públicamente (Gething et al. Nature 293, 620-625 (1981); Kaufman et al. Mol Cell. Biol. 5, 1750-1759 (1985); Nº de Patente de Estados Unidos 4.419.446). Las células hospedadoras que albergan secuencias de ADN que codifican análogos hiperglucosilados de Epo se cultivan en condiciones que permiten la expresión de los análogos. Los análogos se recuperan del medio celular y se purifican utilizando procedimientos esencialmente como se describe anteriormente (documento WO 94/09257) y aquellos del Ejemplo 2. Los procedimientos de purificación permiten el aislamiento de isoformas de Epo que contienen mucho ácido siálico que es el resultado de la adición de cadenas de carbohidratos adicionales.

Los análogos hiperglucosilados de Epo pueden incluir, además de nuevos sitios de glucosilación, adiciones, deleciones o sustituciones de restos de aminoácidos que no crean nuevos sitios de glucosilación y no alteran sustancialmente la actividad biológica del análogo hiperglucosilado. Estas regiones o sitios individuales de Epo que puede alterarse sin afectar la actividad biológica pueden determinarse mediante el examen de la estructura de complejo Epo-receptor de Epo como se describe en Syed et al. Nature 395, 511 (1998). El examen de la estructura del complejo Epo-receptor de Epo revela aquellos restos que interaccionan con o que están en cercana proximidad al sitio de unión del receptor de Epo y que debería evitarse cuando se producen alteraciones en la secuencia de aminoácidos de Epo. Como alternativa, se podría determinar empíricamente aquellas regiones que tolerarán sustituciones de aminoácidos mediante mutagénesis de rastreo de alanina (Cunningham et al. Science 244, 1081-1085 (1989). En este método, los restos de aminoácidos seleccionados se sustituyen individualmente con un aminoácido neutro (por ejemplo, alanina) para determinar los efectos en la actividad biológica.

Se reconoce generalmente que es menos probable que los cambios de aminoácidos conservativos perturben la estructura y/o función de un polipéptido. Por consiguiente, la invención abarca uno o más cambios de aminoácidos conservativos en un análogo hiperglucosilado de Epo. Los cambios de aminoácidos conservativos generalmente implican la sustitución de un aminoácido con otro que es similar en estructura y/o función (por ejemplo, aminoácidos con cadenas laterales similares en tamaño, carga y forma). Aquellos expertos en la materia conocen bien la naturaleza de estos cambios que se resumen en la Tabla 1 a continuación. Estas sustituciones conservativas se muestran en el apartado “Sustituciones preferidas”. También se contemplan cambios más sustanciales (“Sustituciones ejemplares”) que también se pueden introducir. Un experto en la materia apreciará que inicialmente los sitios deben modificarse por sustitución de un modo relativamente conservativo. Si estas sustituciones dan como resultado una conservación de la actividad biológica, entonces se pueden introducir más cambios sustanciales (Sustituciones Ejemplares) y/u otras adiciones/deleciones pueden hacerse y los productos resultantes pueden explorarse.

TABLA 1: Sustituciones de Aminoácidos Residuo Original Sustituciones Preferidas

Sustituciones Ejemplares Ala (A) Val Val; Leu; Ile

Arg (R) Lys Lys; Gln; Asn Asn (N) Gln Gln; His; Lys; Arg Asp (D) Glu Glu Cys (C) Ser Ser Gln (Q) Asn Asn Glu (E) Asp Asp Gly (G) Pro Pro His (H) Arg Asn; Gln; Lys; Arg Ile (I) Leu Leu; Val; Met; Ala; Phe;

norleucina Leu (L) Ile norleucina; Ile; Val; Met;

Ala; Phe Lys (K) Arg Arg; Gln; Asn Met (M) Leu Leu; Phe; Ile Phe (F) Leu Leu; Val; Ile; Ala Pro (P) Gly Gly Ser (S) Thr Thr Thr (T) Ser Ser Trp (W) Tyr Tyr Tyr (Y) Phe Trp; Phe; Thr; Ser Val (V) Leu Ile; Leu; Met; Phe; Ala;

norleucina

5 También la invención proporciona deleciones o adiciones de aminoácidos en un análogo de Epo hiperglucosilado que no afecta sustancialmente a la actividad biológica. Estas adiciones y deleciones pueden ser en el N-terminal o C-terminal del polipéptido o pueden ser internas a él. En general, es menos probable que las deleciones o adiciones relativamente

10 pequeñas afecten a la estructura y/o función de Epo o un análogo hiperglucosilado. En una realización, las deleciones o adiciones pueden ser de 5-10 restos, alternativamente de 2-5 restos de aminoácido o de 1-2 restos.

La expresión “cantidad molar” se refiere a una cantidad de un análogo hiperglucosilado o rHuEpo que está basada en el peso molecular del polipéptido de eritropoyetina correspondiente sin glucosilación. Las cantidades equivalentes de rHuEpo y análogo se refieren a cantidades que son iguales cuando se tienen en cuenta variaciones normales en el procedimiento usadas para determinar dichas cantidades. Es necesario determinar cantidades equivalentes de este modo puesto que el peso molecular de rHuEpo y análogos variará dependiendo del número de cadenas de carbohidratos. Para rHuEpo, el peso molecular del polipéptido de eritropoyetina se calcula basándose en los restos de aminoácidos 1-165 como se muestra en la Figura 1 y SEC ID Nº: 1. Para los análogos hiperglucosilados, los pesos moleculares se ajustan dependiendo de los cambios de aminoácidos en los restos 1-165 de la Figura 1 y SEC ID Nº: 1.

La frecuencia de dosificación para un análogo hiperglucosilado variará dependiendo de la afección a tratar y el hematocrito diana, pero en general será menos de tres veces por semana. La frecuencia de dosificación será aproximadamente dos veces por semana, aproximadamente una vez por semana. La frecuencia de dosificación puede ser también menor de una vez por semana, por ejemplo aproximadamente una vez cada dos semanas (aproximadamente una vez cada 14 días), una vez al mes o una vez cada dos meses. Se entiende que las frecuencias de dosificación actualmente usadas pueden variar algo de las frecuencias descritas en el presente documento debido a variaciones en las respuestas de individuos diferentes a los análogos de Epo; el término “aproximadamente” pretende reflejar dichas variaciones.

Como se usa en el presente documento, la expresión “cantidad terapéuticamente eficaz” se refiere a una cantidad de un análogo hiperglucosilado que proporciona un aumento del hematocrito hasta un hematocrito diana o a un intervalo de hematocrito diana que proporciona beneficio a un paciente o, como alternativa, mantiene a un paciente a un hematocrito diana o dentro de un intervalo de hematocrito diana. La cantidad variará de un individuo a otro y dependerá de varios factores, incluyendo la condición física total del paciente, la gravedad y la causa subyacente de anemia y el hematocrito diana final para el paciente individual. Un hematocrito diana es típicamente al menos aproximadamente del 30% o está en un intervalo del 30%-38%, preferiblemente sobre 38% y más preferiblemente 40%45%. Las directrices generales que se relacionan con intervalos de hematocrito diana para rHuEpo también se encuentran en el EPOGEN® prospecto de fecha 12/23/96 y son 30%-36% o alternativamente 32%-38% como se indica en el. Se entiende que dichas dianas variarán de un individuo a otro de modo que el criterio del médico puede ser apropiado en la determinación de un hematocrito diana actual para cualquier paciente dado. No obstante, la determinación de un hematocrito diana está bastante dentro del nivel de conocimiento en la técnica.

Un experto en la materia puede determinar fácilmente una cantidad terapéuticamente eficaz de las presentes composiciones. El Ejemplo 6 expone un protocolo clínico que tiene como un objetivo determinar una cantidad terapéuticamente eficaz del análogo N47 tanto en la dosificación una vez por semana como en la de tres veces por semana. Un intervalo de dosis para la administración una vez por semana es de aproximadamente 0,075 a aproximadamente 4,5 μg de péptido de eritropoyetina por kg por dosis. Un intervalo de dosis para la administración tres veces por semana es de 0,025 a 1,5 μg de péptido de eritropoyetina por kg por dosis. Este intervalo de dosis puede emplearse con otros análogos hiperglucosilado de Epo, con cualquier ajuste en el intervalo de dosificación siendo una rutina para un experto en la materia.

Una ventaja significativa para la presente invención es la habilidad de correlacionar el grado de hiperglucosilación con una cantidad de dosis o con un intervalo de dosificación que permitiría a uno “diseñar” un análogo de Epo frente a un régimen de dosificación o una dosis dada. Basándose en las actividades in vivo que aumentan de los análogos de Epo que tienen una, dos o tres cadenas de carbohidratos adicionales como se muestra en la Figura 3, el médico correspondiente puede seleccionar un análogo que sea apropiado y conveniente para la afección anémica a tratar. Por ejemplo, en pacientes que son anémicos agudos y que necesitan una dosis efectiva grande o en pacientes que requieren un tratamiento más duradero, puede preferirse la administración de un análogo hiperglucosilado con tres o cuatro incluso más cadenas de carbohidratos adicionales. Para otros pacientes que experimentan anemia menos grave o requieren un tratamiento por un tiempo relativamente corto, puede preferirse un análogo con una o dos cadenas de carbohidratos adicionales. Los análogos de la presente invención proporcionan al médico una flexibilidad considerable en la prevención y tratamiento de anemia que puede ser el resultado de una gran variedad de condiciones subyacentes.

La invención también proporciona la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de hierro para mantener la eritropoyesis aumentada durante la terapia. La cantidad a proporcionar puede determinarse fácilmente mediante un experto en la materia basándose en la terapia con rHuEpo.

La presente invención se puede usar para estimular la producción de glóbulos rojos y prevenir y tratar la anemia. Entre las afecciones tratables por la presente invención se incluye la anemia asociada con una disminución o pérdida de la función renal (fallo renal crónico), anemia asociada con terapia mielosupresiva, tal como fármacos quimioterapéuticos o antivirales (tal como la AZT), anemia asociada con la progresión de cánceres no mieloides, anemia asociada con infecciones virales (tales como el VIH) y anemia de enfermedad crónica. También son tratables las afecciones que pueden conducir a anemia de un individuo sano por el contrario, tal como una pérdida prevista de sangre durante una cirugía. En general, cualquier condición tratable con rHuEpo puede también tratarse con análogos hiperglucosilados de Epo de la invención.

La invención también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de un análogo hiperglucosilado de Epo junto con un adyuvante, conservante, emulsificante, solubilizador, vehículo y/o diluyente farmacéuticamente aceptable. La composición será útil para un régimen de dosificación de menos de tres veces por semana. La composición puede ser en una forma líquida o liofilizada y comprende un diluyente (tampones Tris, citrato, acetato o fosfato) que tiene varios valores de pH y fuerzas iónicas, solubilizadores tal como el Tween o Polisorbato, vehículos tales como la gelatina o albúmina sérica humana, conservantes tales como el timerosal, los parabenos, cloruro de benzilalconio o bencil alcohol, antioxidantes tales como el ácido ascórbico o metabisulfito sódico y otros componentes tales como lisina o glicina. La selección de una composición particular dependerá de varios factores, incluyendo la condición a tratar, la vía de administración y los parámetros farmacocinéticos deseados. Un reconocimiento más extensivo de los componentes adecuados para las composiciones farmacéuticas se encuentra en Remington’s Pharmaceutical Sciences, ed. 18ª. A.R. Gennaro, ed. Mack, Easton, PA (1980). En una realización preferida, los análogos de glucosilación de Epo de la invención se formulan de forma líquida en una solución tamponada de citrato sódico/cloruro sódico isotónica que contiene albúmina humana y que opcionalmente contiene bencil alcohol como un conservante. Las composiciones preferiblemente contienen análogos teniendo uno, dos, tres, cuatro o más cadenas de carbohidratos adicionales.

Las composiciones de la invención se administran preferiblemente por inyección, subcutánea o intravenosa. La vía de administración elegida eventualmente dependerá de varios factores y puede determinarse mediante un experto en la materia.

Los siguientes ejemplos se ofrecen para ilustrar más completamente la invención, pero no deben interpretarse como limitantes del alcance de la misma. EJEMPLO 1 Construcción de Análogos de Epo Hiperglucosilados Construcción de ADNc que codifican Análogos de Epo Hiperglucosilados

Los análogos de Epo se produjeron mediante mutagénesis in vitro usando varios métodos distintos. Los análogos N49 y N50 se construyeron como se describe en el documento WO 94/09257. También se construyeron los análogos mediante variaciones de métodos de PCR de solapamiento (reacción en cadena de la polimerasa). El procedimiento básico incluyó dos etapas sucesivas. En la primera etapa, dos reacciones (PCR1 y PCR2) se realizaron en ADN de análogo de Epo o Epo usando un total de cuatro oligonucleótidos: un cebador 5' (directo), un cebador mutagénico inverso, un cebador mutagénico directo (normalmente complementario al cebador mutagénico inverso) y un cebador 3' (inverso). Los cebadores mutagénicos contenían los cambios de nucleótidos deseados así como 6-14 nucleótidos que coincidían de manera exacta a cada lado de estos cambios. La PCR1 usó el cebador directo 5' y el cebador mutagénico inverso .La PCR2 usó el cebador 3' (inverso) y el cebador mutagénico directo. Los fragmentos de ADN amplificados se separaron por electroforesis en gel de agarosa. Las piezas pequeñas de agarosa que contenían fragmentos de ADN del tamaño exacto se escindieron del gel. Los fragmentos de ADN de PCR1 y PCR2 se combinaron juntos y se realizó una tercera reacción de PCR usando sólo los cebadores directos 5' e inversos 3'. Por tanto, se amplificó un segmento de ADN de longitud completa que contenía las mutaciones deseadas. En varios casos, se combinaron dos o tres mutaciones mediante la introducción de una nueva sustitución en el ADN que ya contenía un cambio, usando el mismo proceso de PCR. Para construir estos análogos de sitios de glucosilación múltiples, los análogos de sitio único, doble o triple (producidos como se describe anteriormente) se usaron como molde de PCR y un sitio de glucosilación adicional se introdujo mediante mutagénesis dirigida con los cebadores apropiados.

Los análogos de Epo N51, N52 y N53 se construyeron mediante métodos de PCR de solapamiento 1 (reacción en cadena de la polimerasa). Un sitio de N-glucosilación adicional se introdujo en cada caso. N56 añadió un sitio de glucosilación (N114T116) a la secuencia nativa de HuEpo usando Epo pDSRα2 como molde de PCR, N51 añadió un sitio de glucosilación O-ligado (Thr125) a Epo N47 usando un molde N47 de Epo pDSRα2 (Asn30, Thr32, Va187, Asn88, Thr90) y el análogo N59 añadió un sitio de glucosilación (Asn53) al análogo N47 usando un molde N47 de Epo pDSRα2.

Las reacciones en cadena de la polimerasa para el método 1 se realizaron un protocolo adaptado de Cheng et. al., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 5695 (1994)). El cebador 3' (inverso) contenía secuencias que introdujeron un codón de terminación seguido de un sitio de restricción de Xba I:

ATCTAGAAGTTGCTCTCTGGACAGTTCCT (SEC ID Nº: 2).

El cebador de reacción directo 5':

GAAGCTTGCGCCACCATGGGGGTGCACGAATG (SEC ID Nº: 3) tuvo un sitio de restricción Hind lll de una secuencia Kozak aguas arriba del codón de iniciación de Epo (ATG). La mezcla típica de reacción de PCR contenía: 4 μl de cada cebador directo e inverso (5 pmol/μl), 1 μl de molde (25 ng), 10 μl de tampón LP 5X (Tricina 100 nM pH 8,7/glicerol al 25%/KOAc 425 mM), 10 μl de solución madre de dNTP (1 mM de cada dATP, dTTP, dCTP, dGTP), 0,8 μl de polimerasa rtTh (Perkin Elmer; 2,5 U/μl) y 2 μl de polimerasa Vent (NEB; 0,01 U/μl después una dilución fresca 1:100 en tampón LP 1X). Se añadió H2O para llegar al volumen final de 50 μl. Todos los componentes se añadieron juntos en el orden mostrado y se comenzó la PCR con la temperatura durante el primer ciclo fue mayor de 60ºC añadiendo 1 μl de MgOAc 50 mM. Las condiciones típicas de reacción fueron: 2 ciclos de 94ºC, 10 s/50ºC, 1 min./68ºC, 5 min. seguidos de 25 ciclos de 94ºC, 10 s/55ºC, 1 min./68ºC, 5 min. Los fragmentos amplificados se separaron mediante electroforesis en gel de agarosa y el fragmento de ADN de tamaño correcto se purificó utilizando un kit Geneclean™ y procedimientos suministrados por el fabricante (Bio 101, Inc.). El ADN purificado se digirió con Hind lll y Xba l, cuando se purificó de nuevo usando el kit Geneclean™. El fragmento después se liga en el corte de Hind lll y Xba l del vector pDSRα2. El ADN ligado se precipitó con 2 volúmenes de etanol en NaOAc 0,3 M pH 5,2 en presencia de ARNt vehículo y transformado en E. coli. Los análogos de Epo se exploraron mediante digestión de restricción en mini preparaciones de ADN. Los plásmidos de clones positivos se prepararon después y el inserto se secuenció para confirmar la presencia de las mutaciones deseadas y para asegurar que no se introducían cambios de aminoácidos adicionales.

Los análogos N54 a N61 se construyeron utilizando el método 2 de estrategia de PCR de solapamiento. El cebador 3' (inverso) contenía secuencias que introdujeron un codón de terminación seguido de un sitio de restricción Xbal:

GATCCTCTAGAGTTGCTCTCTGGACAG (SEC ID Nº: 4).

El cebador de reacción directo 5':

CAACAAGCTTGCGCCGCCATGGGGG (SEC ID Nº: 5) tuvo un sitio de restricción Hindlll seguido de una secuencia Kozak aguas arriba del codón de iniciación de Epo (ATG). Una estrategia de PCR de fidelidad alta se realizó utilizando la polimerasa de ADN de Perkin Elmer UITma y reactivos acompañantes; 10 μl de tampón de PCR 10X, 3 μl de dNTP 1mM, 5 pmol de cada cebador y agua en un volumen final de 100μl. Se añadieron 0,5 unidades de polimerasa UITma después de que la mezcla de PCR alcanzara 94ºC. Las reacciones de PCR se realizaron durante 5 ciclos durante 30 segundos a 94ºC, 30 segundos a 50ºC y 90 segundos a 72ºC. Se realizaron 25 ciclos subsiguientes durante 30 segundos a 94ºC y 90 segundos a 72ºC. Las bandas del producto de los tamaños correctos se escindieron de un gel de agarosa después de la electroforesis.

Los productos de PCR resultantes para cada análogo se limpiaron utilizando el kit de extracción de gel Qiagen. El ADN purificado se digirió en una digestión de restricción de 100 μl con las enzimas de restricción Hindlll y Xbal (Boehringer Mannheim) a 37ºC durante 1 hora. Los extractos se purificaron de nuevo mediante un gel y el fragmento digerido se ligó en el vector pDSRα2 digerido por Hindlll y Xbal.

El ADN ligado se precipitó con 2 volúmenes de etanol en NaOAc 0,3 M pH 5,2 en presencia de ARNt vehículo y se transformaron en E. coli. Los análogos de Epo se exploraron inicialmente mediante PCR de colonias para identificar clones que contenían el inserto de ADN con el tamaño y el tipo

5 correcto. Con ese procedimiento, las células que contenían plásmidos se localizaron en tubos de PCR en presencia de los cebadores de Epo directos e inversos. La mezcla después se sometió a PCR usando las condiciones de reacción descritas anteriormente. Los plásmidos de clones positivos se prepararon después y el inserto análogo de Epo se secuenció para confirmar la

10 presencia de las mutaciones deseadas y para asegurar que no se introducían cambios adicionales de aminoácidos. TABLA 1 ANÁLOGOS DE ERITROPOYETINA QUE TIENE SITIOS PARA CADENAS DE CARBOHIDRATOS N-LIGADAS Análogo Sustitución de Cambios de Secuencia Aminoácido

N49 Lys, Met → Asn52, Thr54 N50 Arg, Clu → Asn53, Thr55 N51 Ala, His, Pro, Trp, Pro, Ala → N30, T32, V87, N88, T90 T125 N52 Ala, Lys → Asn114, Thr116

N53 Ala, His, Arg, Glu Pro, Trp, Pro → N30, T32, N53, T55, V87,

N88, T90 N54 Glu, Gly → Asn55, Thr57 N55 Gln, Pro, Trp → Asn86, Val87, Thr88 N56 Pro, Trp, Pro → Ala87, ,Asn88, Thr90

AAG, ATG → AAT, ACC

AGG, GAG → AAT, ACG

GCT, CAC, CCG, TGG, CCC, GCC → AAT, ACG, GTG, AAT, ACC, ACC GCC, AAG → AAC, ACG

GCT, CAC, AGG, GAG, CCG, TGG, CCC → AAT, ACG, AAT, ACG, GTG, AAT, ACC

GAG, GGG → AAT, ACT

CAG, CCG, TGG → ACC, GTG, ACG CCG, TGG, CCC → GCG, AAT, ACC

ANÁLOGOS DE ERITROPOYETINA QUE TIENE SITIOS PARA CADENAS DE CARBOHIDRATOS N-LIGADAS Análogo Sustitución de Cambios de Secuencia Aminoácido

N57 Pro, Trp, Pro → CCG, TGG, CCC → GTG, AAT, Va187, Asn88, Ser90 ACG N58 Pro, Trp, Glu, Pro→ CCG, TGG, GAG, CCC → GTG, Val87, Asn88, Gly89, AAT, CGC, ACC Thr90 N59 Ala, His, Arg, Glu → GCT, CAC, AGG, GAG → AAT, Asn30, Thr32, Asn53, ACG, AAT, ACG Asn55 Ala, His, Ala, Ly6 →

N60 GCT, CAC, GCC, AAG → AAT,Asn30, Thr32,

ACG, AAC, ACG

Asn114, Thr116 A, H, R, E, P, W, P, GCT, CAC, ACG, GAG, CCG, TGG,

N61 A, K → 10, T32, N53, CCC, GCC, AAG → AAT, ACG, T55, V87, N88, T90, AAT, ACG, GTG, AAT, ACC, AAC, N114, T115 ACG Análisis de la adición de carbohidratos Las construcciones para los análogos de Epo hiperglucosilados que se insertaron en el vector de expresión pDSRα2 se transfectaron en células COS. Los sobrenadantes de las células COS transfectadas se analizaron mediante 5 transferencia de western para determinar si el análogo de Epo expresado y secretado contenía carbohidratos adicionales. Se cargaron las muestras directamente en pocillos de geles SDS-PAGE, después se analizaron mediante inmunotransferencia utilizando el anticuerpo monoclonal, 9G8A (Elliott et al. (1996) Blood 87:p2714). Las movilidades de las muestras análogas se 10 compararon con aquellas de las muestras que contenían rHuEpo. La Figura 1 muestra movilidad disminuida de los análogos N53 y N61 en comparación con los análogos N4 (cuatro cadenas de carbohidratos) y N47 (cinco cadenas de carbohidratos). La movilidad concuerda con la presencia de seis cadenas de carbohidratos para el análogo N53 y siete cadenas de carbohidratos para el 15 análogo N61. Los datos para todos los análogos hiperglucosilados se muestran en la Tabla 2. Bioensayos in vitro

Los medios acondicionados mediante células COS o CHO que expresaban rHuEpo o análogos se ensayaron para la estimulación del consumo de 3H-timidina mediante células UT7-Epo (Komatsu et al., Blood 82,456). Las células UT7-Epo son responsables de Epo y expresan los

5 receptores de Epo humanos en su superficie celular. Las células UT7-Epo se cultivaron en medio de crecimiento (Medio de Dulbecco Modificado por Iscove 1X con L-glutamina, tampón HEPES 25 mM y 3024 mg/l de bicarbonato sódico, pero sin alfa-tioglicerol o betamercaptoetanol (GIBCO) / Suero Bobino Fetal al 10% en v/v / solución de L-glutamina-Penicilina-Estreptomicina al 1% en v/v

10 (Irvine Scientific) / 1 unidad/ml de rHuEpo) hasta aproximadamente 3x105 células/ml. Las células se recogieron mediante centrifugación (aproximadamente 500xG), se lavaron dos veces con solución salina tamponada con fosfato y se resuspendieron a 5x104 células/ml en medio de ensayo (Medio RPMI 1640 1x sin L-glutamina (Gibco) / L-glutamina al 1% /

15 suero bovino fetal al 4%). Las muestras de ensayo o patrón de Epo (rHuEpo), 100 μl diluidas en medio de ensayo al menos 5 veces, se añadieron a las células en placa de microtitulación de 96 pocillos. Después se añadieron 50 μl de células suspendidas (5000 células/pocillo) y las placas se incubaron en una incubadora humidificada a 37ºC y CO2 al 5%. Después de 72 horas, se

20 añadieron 50 μl de metil-3H-Timidina (1 mCi/ml; 20 Ci/mMol) diluida 1:100 en medio de ensayo. Las células se incubaron durante 4 horas adicionales a 37ºC y CO2 al 5%. Las células marcadas se recogieron en tiras de filtro de fibra de vidrio, se lavaron con agua desionizada seguida de 2-propanol, se secaron y contaron. Se determinó la actividad comparando la respuesta determinada por

25 cada análogo respecto a aquella del patrón rHuEpo. La actividad biológica específica se determinó después dividiendo la actividad in vitro por la concentración de cada análogo como se determina por el inmunoensayo (Elliott et al. (1996) Blood 87:p2714). Los resultados se muestran en la Tabla 2. TABLA 2 ANÁLOGO Número de Cadenas de Actividad In Vitro** Carbohidratos N-ligadas rHuEpo 3 +++ N49 4 +++ N50 4 +++ N51 5* +++

ANÁLOGO Número de Cadenas de Actividad In Vitro** Carbohidratos N-ligadas N52 3 -4 +++ N536 ++ N544 NT N55 4 +++ N56 4 +++ N57 3 -4 +++ N58 4 +++ N595 ++ N60 4 -5 +++ N61 6 -7 NT

contiene 1-2 cadenas O-ligadas ** actividad in vitro es relativa a la actividad rHuEpo +++ actividad equivalente a rHuEpo ++ actividad es 25-75% de rHuEpo NT No Ensayado EJEMPLO 2 Preparación de Eritropoyetina Humana Recombinante y Análogos de Eritropoyetina Hiperglucosilados

La eritropoyetina humana recombinante (rHuEpo) que se usó para los

5 experimentos descritos en el presente documento se expresó mediante las células de ovario de hámster Chinos (CHO) transfectadas con un plásmido recombinante que portaba el gen de la eritropoyetina humana. El producto recombinante se recuperó a partir del medio acondicionado y se purificó esencialmente como describen Lai et al. anteriormente. La preparación de

10 rHuEpo resultante tiene predominantemente las isoformas de 9 a 14 ácidos siálicos como se determina mediante isoelectroenfoque.

Los análogos de eritropoyetina hiperglucosilados recombinantes se expresaron en células CHO transfectadas con un plásmido recombinante que portaba el gen análogo de Epo como se describe en los documentos

15 WO91/05867 y WO94/09257 incorporado por referencia en el presente documento. Los análogos hiperglucosilados se purificaron a partir de sobrenadantes de cultivo como se describe posteriormente. Concentración y diafiltración del medio acondicionado

El medio acondicionado (libre de suero) de tres recogidas sucesivas (de 5-8 días cada una) de la línea celular CHO transfectada se recogió, se filtró a través de un filtro de 0,45 μm, se concentró aproximadamente treinta veces y se diafiltró en Tris 10 mM, CuSO4 20 μM, pH 7,0 usando un sistema de ultrafiltración de flujo tangencial (Millipore) con una membrana de límite del peso molecular de 10.000. El medio diafiltrado (DFM) se filtró (0,45 μm) una segunda vez y se almacenó a -20ºC hasta que se uso para la purificación. Purificación

Todos los procedimientos se realizaron de 2 a 8ºC. Cromatografía de Intercambio Aniónico (10)

El DFM purificado se aplicó a una columna de Q-Sepharosa de Flujo Rápido (Pharmacia, 6 cm x 18 cm) equilibrada en bis Tris propano 10 mM (BTP), pH 7,0 y se lavó con dos volúmenes de columna de BTP 10 mM para eluir todas las especies no unidas. Los siguientes gradientes se aplicaron dependiendo de si el análogo hiperglucosilado tenía cuatro, cinco o seis cadenas de carbohidratos N-ligados. Todos los tampones usados en esta fase contenían glicina 1 mM, CuSO4 20 μM, urea 6 M, 5 μg/ml leupeptina y 1 μg/ml pepstatina. Para los análogos con cuatro cadenas de carbohidratos N-ligadas, el gradiente fue ácido acético 10 mM, de NaCl 0,1 mM a ácido acético 500 mM, NaCl 5 mM sobre 49 volúmenes de columna con una retención de volumen de dos columnas en condiciones de alta salinidad. Para los análogos con cinco cadenas de carbohidratos N-ligados, el gradiente fue ácido acético 0,7 M, de NaCl 7 mM a ácido acético 1,0 M, NaCl 12 mM sobre 30 volúmenes de columna con una retención de volumen de dos columnas en condiciones de alta salinidad. Para los análogos con seis cadenas de carbohidratos N-ligados el gradiente fue ácido acético 1,0 M, de NaCl 10 mM a ácido acético 1,5 M, NaCl 20 mM sobre 50 volúmenes de columna con una retención de volumen de dos columnas en condiciones de alta salinidad. Después del gradiente, la columna se lavó con dos volúmenes de columna de BTP 10 mM, pH 7,0 y la fracción de isoforma alta se eluyó con NaCl 0,6 M, BTP 100 mM, pH 7,0. Cromatografía de Fase Inversa (C4)

La parte de alta salinidad de la columna de Q-Sepharosa (1Q) se aplicó a una columna de fase inversa Vydac C4 (partículas de 30 μ, 4 cm x 18cm) se equilibró en etanol al 20%, BTP 10 mM, pH 7,0 y se eluyó de la columna con un gradiente de volumen de 30 columnas hasta etanol al 94% tamponado en BTP 10 mM, pH 7,0. El máximo de producto agrupado, eluyendo en aproximadamente etanol al 60%, se diluyó con cuatro volúmenes de BTP 10 mM, pH 7,0 para minimizar la posibilidad de agregación en presencia de etanol. Cromatografía de Intercambio Aniónico (20)

El eluato diluido de la columna de fase inversa se aplicó a una segunda columna de Q-Sepharosa de Flujo Rápido (Pharmacia, 3 cm x 9 cm) equilibrada con BTP 10 mM, pH 7,0. La columna se lavó con tampón de equilibrado y el análogo de Epo hiperglucosilado se eluyó con cloruro sódico 0,6 M, citrato sódico 20 mM, pH 6,0.

La proteína purificada se intercambió en un NaPO4 20 mM, pH 6,0, NaCl 140 mM mediante centricon (límite de peso molecular 10.000), seguido por el paso a través de un filtro de 0,2 μm y almacenamiento a 2-8ºC. EJEMPLO 3 Bioactividad In Vivo de Análogos de rHuEpo y rHuEpo que Contenían cuatro, cinco y seis Cadenas de Carbohidratos N-ligadas

La actividad in vivo de los análogos de Epo que contenían cuatro, cinco y seis cadenas de carbohidratos N-ligadas se comparó con aquella de rHuEpo en el bioensayo de ratón policitémico exhipóxico. Este ensayo cuantifica la incorporación de 59Fe en glóbulos rojos sintetizados recientemente como una medida del aumento de la eritropoyesis en ratones en respuesta a una muestra de ensayo administrada exógenamente. El ensayo, realizado como se describe posteriormente, es una modificación del método de Cotes y Bangham (Nature 191, 1065 (1961)).

En este ensayo ratones hembras BDF1 se preacondicionan primero mediante exposición a condiciones bajas de oxígeno en una cámara hipobárica (4,1-5,1 KPa (0,4-0,5 atm.)) durante aproximadamente 18 horas al día durante 14 días. Para compensar las bajas condiciones de oxígeno los ratones responden mediante la estimulación de la eritropoyesis para aguantar el número de glóbulos rojos y por lo tanto la capacidad relativa de portar oxígeno. Después de la finalización de la exposición hipobárica final, se permite a los ratones que permanezcan a presión ambiente durante aproximadamente 72 horas antes de la administración de las muestras de ensayo mediante inyección intraperitoneal. A presión ambiente los ratones son relativamente policitémicos y responden mediante la disminución de la producción de eritropoyetina endógena y la tasa de eritropoyesis. Cinco días después de la administración de la muestra, 0,2-0,3 μCi de FeCl3 en 0,2 ml se inyecta por vía intravenosa en la vena de la cola. Cuarenta y ocho horas más tarde, se sacrifican los animales y el incremento de la eritropoyesis producido por las muestras de ensayo se determina midiendo la cantidad de 59Fe incorporado en una muestra de 0,5 ml de sangre total.

Un ejemplo de los resultados obtenidos cuando la rHuEpo y cinco análogos diferentes de Epo, que contenían cuatro, cinco o seis cadenas de carbohidratos N-ligadas, se ensayaron en este ensayo se muestra en la Figura

3. Cada muestra se ensayó a seis o siete diluciones diferentes dentro de un intervalo de concentración adecuado. Todas las muestras se eluyeron en solución salina tamponada con fosfato que contenía albúmina sérica bovina al 0,5% y se administraron 0,4 ml de cada dilución a cinco ratones preacondicionados. Cuarenta y ocho horas después de la administración de 59Fe, la cantidad incorporada en 0,5 ml de sangre se midió mediante el recuento gamma. Los resultados para cada una de las muestras se representan como el porcentaje de 59Fe incorporado frente al logaritmo de la dosis administrada.

Como se muestra en la Figura 3, los cinco análogos de Epo hiperglucosilados ensayados en este ensayo fueron más potentes que rHuEpo. Además, la potencia de cada análogo fue directamente dependiente del número de cadenas de carbohidratos N-ligadas, teniendo dichos análogos un número incrementado de cadenas de carbohidratos que tenían mayor actividad. Por tanto, el análogo N53, que contenía seis cadenas de carbohidratos N-ligadas fue el análogo más potente. El análogo N47, que contenía cinco cadenas de carbohidratos N-ligados, fue a su vez, más potente que aquellos análogos que contenían cuatro cadenas N-ligadas. Las potencias de los tres análogos que contenían cuatro cadenas de carbohidratos N-ligadas (N4, N18 y N50) fueron aproximadamente iguales entre ellas y mayores que aquellas de rHuEpo.

En este experimento, las dosis de rHuEpo y los análogos que contenían cuatro, cinco o seis cadenas de carbohidratos N-ligadas requerían producir el 40% de la incorporación de 59Fe fueron 10.700 ng, 640 ng, 140 ng y 38 ng, respectivamente. Basándose en la cantidad de material requerido para producir ese nivel de eritropoyesis. Los análogos de Epo que contenían cuatro, cinco o seis cadenas de carbohidratos N-ligadas son 17 veces, 77 veces y 280 veces más potentes que rHuEpo. EJEMPLO 4 Farmacocinética lV de rHuEpo y el análogo de Epo N47 en Ratas y Perros Beagle

5 Dos estudios separados en ratas y perros se realizaron para comparar los parámetros farmacocinéticos de análogo de Epo N47 y rHuEpo.

En los estudios de ratas, 1 μCi (∼ 0,1 μg de péptido/kg) de análogo de Epo N47 marcado con 125I o eritropoyetina humana recombinante marcada con 125I (Amersham) se inyectó por vía intravenosa en una cánula carótida

10 implantada quirúrgicamente en ratas macho normales Sprague-Dawley que pesaban entre 314-363 g. A distintos puntos de tiempo después de la administración, se recogieron 0,3 ml de sangre y se preparó el suero mediante centrifugación. El nivel de 125I-rHuEpo o análogo de Epo N47 marcado con 125I de cada muestra de suero se determinó después de una incubación durante

15 una noche a 4ºC con etanol al 90%. La proteína precipitada por etanol se recogió en cada muestra de suero mediante centrifugación y se midió la radiactividad en un contador gamma. La concentración sérica resultante frente a las curvas farmacocinéticas de tiempo se muestran en la Figura 4. Cada punto representa una media de grupo de cinco ratas en el grupo de análogo

20 N47 y seis ratas en el grupo de rHuEpo. Los parámetros farmacocinéticos se determinaron para cada rata usando el análisis de regresión no lineal PCNONLIN 4.0 (Statistical Consultants, 1992) y se hizo la media de los resultados para cada grupo. Los resultados se muestran en la Tabla 3. TABLA 3 Comparación de los Parámetros Farmacocinéticos IV de N47 y r-HuEpo en Ratas Semivida

Ensayo de

α (horas) β (horas) V4 (ml/kg) Aclaramiento

Muestra

Sérico (ml/kg-h)

N47 (n

= 5 0,57 ± 0,49 6,9 ± 0,3 33 ± 5 4,8 ± 1,2

ratas)

r-HuEpo, (n =

0,18 ± 0,03 2,5 ± 0,2 36 ± 6 17,7 ± 3,4

6 ratas)

a Los resultados se presentan como la media del grupo ± SD para cinco ratas en el grupo de N47 y seis ratas en el grupo de r-HuEpo

En estudios en perros, los perros normales Beagle que pesaban entre 7,8-9,5 kg recibieron una inyección en embolada intravenosa de ~ 29 μCi de 125I-rHuEpo o 125I-N47(~ 0,1 μg péptidos/kg) en la vena cefálica. A distintos puntos de tiempo durante 24 horas después de la administración, se recogió

5 aproximadamente de 1 a 2 ml de sangre y se preparó el suero. La concentración de 125I-rHuEpo y 125I-N47 en 0,1 ml de suero se determinó y los parámetros farmacocinéticos se calcularon como se describe anteriormente. La concentración sérica frente a las curvas farmacocinéticas de tiempo para los estudios en perros se muestran en la Figura 5. Los puntos de tiempo son las

10 medias de grupo de dos animales en cada grupo. Los parámetros farmacocinéticos se resumen en la Tabla 4.

TABLA 4 Comparación de los Parámetros Farmacocinéticos IV de N47 y r-HuEpo en Perros

Semivida Ensayo de α (horas) β (horas) V4 (ml/kg) Aclaramiento

Muestra Sérico (ml/kg-h) N47 0,34 25,0 55,9 2,4 r-HuEpo 0,40 7,2 60,8 8,4 a Los resultados presentados son los parámetros medios para los dos perros en cada grupo

Tanto en los estudios de ratas como de perros, rHuEpo y el análogo de Epo N47 exhibieron aclaramiento sérico bifásico. El aclaramiento en ratas fue 15 aproximadamente 3,7 veces más rápido para rHuEpo que para el análogo de Epo N47 y la semivida β fue aproximadamente 2,8 veces más larga para el análogo de Epo N47 que para rHuEpo. Los parámetros farmacocinéticos en los estudios de perros concordaron generalmente con aquellos observados en ratas. En perros, el aclaramiento de rHuEpo fue 3,5 veces más rápido que para

20 el análogo de Epo N47 y la semivida β fue 3,5 veces más larga para el análogo de Epo N47 en comparación con aquél para rHuEpo. EJEMPLO 5 Respuesta de dosis de hematocrito después de administración de rHuEpo y el análogo de Epo N47.

25 Estudios de Respuesta de Dosis de Hematocrito tres veces por semana (TIW)

Los efectos biológicos in vivo de rHuEpo y el análogo de Epo N47 en ratones normales se compararon después de la administración de un intervalo de dosis mediante inyección intraperitoneal o intravenosa tres veces por semana durante hasta seis semanas. Las determinaciones de hematocrito se realizaron dos veces por semana mediante sangrado retroorbital.

Los ratones normales CD1 que pesaban aproximadamente 30g (10-13 ratones por grupo) se inyectaron por vía intraperitoneal tres veces por semana durante un total de seis semanas con rHuEpo (sobre el intervalo de dosis de 0,625-10 μg péptidos/kg/dosis), análogo de Epo N47 (sobre el intervalo de dosis de 0,156-1,25 μg péptido/kg/dosis) o vehículo control. El vehículo control y el diluyente para las diversas preparaciones de dosificación de rHuEpo y análogo de Epo N47 fue solución salina tamponada con fosfato (PBS), que contenía el 0,025% de albúmina sérica de ratón. Los hematocritos de todos los ratones se determinaron en el inicio y dos veces por semana a partir de entonces mediante sangrados retroorbitales. Al finalizar el experimento, el suero de todos los animales se recogió y se ensayó respecto a los anticuerpos en el producto inyectado mediante un ensayo de radioinmunoprecipitación de solución. Los datos de hematocrito de animales que se juzgó que eran negativos para los anticuerpos neutralizantes se usaron para el análisis subsiguiente.

Como se muestra en la Figura 6 tanto rHuEpo como el análogo de Epo N47 producen un aumento dependiente de la dosis en el hematocrito en el estudio de seis semanas, sin embargo el análogo N47 promueve un mayor incremento en el hematocrito en comparación con rHuEpo a una concentración dada. En este experimento el análogo de Epo N47 es aproximadamente de 3 a 4 veces más potente cuando se dosifica tres veces por semana mediante inyección intraperitoneal.

Los estudios de respuesta a dosis de rHuEpo y el análogo N47 se realizaron mediante inyección intravenosa tres veces por semana usando procedimientos similares a aquellos para la inyección intraperitoneal. Los resultados obtenidos fueron similares a aquellos para la administración intraperitoneal y, en particular, los estudios confirmaron adicionalmente que el análogo de Epo N47 tuvo una potencia mayor que rHuEpo cuando se administró tres veces por semana.

Para comparar y cuantificar mejor la actividad biológica de rHuEpo y el análogo de Epo N47 en el aumento del hematocrito de ratones normales, los resultados de los experimento se analizaron también mediante los diagramas de potencia relativa. Para cada experimento, se determinó la actividad de rHuEpo o el análogo N47 a cada dosis sumando el incremento en el hematocrito durante los primeros 38 días del estudio mediante suma trapezoidal para obtener el área bajo la curva (AUC). Después se representó esto frente a la dosis logarítmica en μg péptido/kg/semana. La diferencia de potencia entre los compuestos administrados por la misma a diferentes vías de administración o frecuencias de dosificación se pueden determinar midiendo la distancia entre las líneas de respuesta de las dosis logarítmicas relevantes. La Figura 7 resume los datos de potencia relativa para todos los experimentos realizados comparando la actividad de rHuEpo y el análogo de Epo N47 administrados por dos vías diferentes (intraperitoneal e intravenosa) y dos regímenes de dosificación diferentes.

Como se muestra en la Figura 7 cuando se administra tres veces por semana, el análogo de Epo N47 tiene la misma potencia cuando se inyecta por la vía intravenosa o intraperitoneal y fue 3,6 veces más potente que rHuEpo inyectada por vía intraperitoneal tres veces por semana. Estudios de Respuesta de Dosis Hematocrito una vez por semana (OW)

Las comparaciones de rHuEpo y el análogo de Epo N47 a un hematocrito que aumenta en ratones normales se llevaron a cabo con la dosificación de una vez por semana mediante vías de administración intraperitoneales o intravenosas durante seis semanas.

Los ratones normales CD1 que pesaban aproximadamente 30 g (8-10 ratones por grupo) se inyectaron una vez por semana durante un total de seis semanas con concentraciones variables de rHuEpo o análogo de Epo N47 preparados en PBS que contenía albúmina sérica de ratón al 0,025% o con control de vehículo (PBS con albúmina sérica de ratón al 0,025%). La dosis de análogo varió de 6,25-25 μg de péptido/kg/dosis y la dosis de rHuEpo varió de 25-200 μg/kg/dosis. Los hematocritos de todos los ratones se determinaron al inicio y dos veces por semana después mediante sangrados retroorbitales. Al finalizar el experimento, el suero de todos los animales se recogió y se ensayó para los anticuerpos frente al producto inyectado mediante una radioinmunoprecipitación de solución. Los datos de animales que se juzgó que eran negativos para anticuerpos neutralizantes se usaron para análisis posteriores.

Como se muestra en la Figura 8, mientras que tanto rHuEpo como el análogo N47 pueden aumentar el hematocrito de ratones normales cuando se dosifican una vez por semana, la dosis de rHuEpo necesaria para producir una respuesta fue significativamente mayor que aquella para el análogo N47. Por ejemplo, en este experimento 25 μg péptido/kg/semana de N47 aumentaron el hematocrito de ratones en 41,2 puntos en seis semanas, mientras que la misma dosis de rHuEpo produjo sólo un aumento de hematocrito de 12,5 puntos.

Los estudios de respuesta a dosis de rHuEpo y del análogo N47 se realizaron mediante inyección intraperitoneal una vez por semana usando procedimientos similares a aquellos descritos anteriormente. Los resultados obtenidos fueron coherentes con los resultados para la administración intravenosa y confirmaron adicionalmente la mayor potencia del análogo N47 en comparación con rHuEpo cuando se administraron una vez por semana.

Para cuantificar la diferencia a actividad entre rHuEpo y el análogo de N47 cuando cada uno se dosifica una vez por semana, los diagramas de potencias relativas se generaron a partir de los experimentos relevantes como se describe anteriormente. Como se muestra en la Figura 7, cuando se administra una vez por semana, el análogo N47 tiene la misma potencia cuando se inyecta mediante la vía intravenosa o intraperitoneal. El análogo N47 es aproximadamente 14 veces más potente que rHuEpo cuando cada uno se administra una vez por semana.

Además, los diagramas de respuesta de dosis logarítmica en la Figura 6 también ilustran lo siguiente: (1) una dosis dada de análogo N47 administrado una vez por semana (QW) es aproximadamente tan eficaz como la misma dosis semanal total de rHuEpo dada como tres dosis divididas (TIW); (2) una dosis dada de rHuEpo administradas una vez por semana (QW) sólo tiene aproximadamente el 2% de eficacia de la misma dosis total semanal del análogo N47 dado en tres dosis divididas (TIW); (3) el análogo N47 es aproximadamente cuatro veces más potente en ratones cuando se administra TIW en comparación con QW. Estudios de Respuesta a Dosis de Hematocrito Cada Dos Semanas (EOW)

Los experimentos también se llevaron a cabo para evaluar la capacidad del análogo N47 de aumentar el hematocrito de ratones cuando se inyecta una vez cada dos semanas. Se inyectó por vía intravenosa a ratones normales CD1 (10 ratones por grupo) una vez por semana o una vez cada dos semanas durante un total de aproximadamente seis semanas con concentraciones variables de análogo de Epo N47 preparadas en PBS que contenía albúmina sérica de ratón al 0,025%. El análogo N47 se administró a 200, 100 ó 25 μg/kg/dosis cada dos semanas o a 12,5 μg/kg/dosis una vez por semana. Los hematocritos de todos los ratones se determinaron al inicio y después dos veces por semana mediante sangrados retroorbitales.

Como se muestra en la Figura 9, el análogo N47 puede aumentar el hematocrito de ratones normales de un modo dependiente de dosis, incluso cuando se administra bimensualmente. Como se espera cuando se dosifica menos frecuentemente, una cantidad mayor de análogo N47 se requiere para aumentar el hematocrito. Una dosis de 200 μg/kg de análogo N47 administrado cada dos semanas aumentó el hematocrito hasta aproximadamente el mismo grado en seis semanas como lo hicieron 12,5 μg/kg cuando se dosificaron semanalmente. EJEMPLO 6 Farmacocinética IV del análogo de Epo N47 y rHuEpo en pacientes de Diálisis Peritoneal Ambulatoria Continua (CAPD)

A la vista del incremento marcado en la semivida sérica del análogo de Epo N47 en comparación con rHuEpo en ratas y perros Beagle, fue de interés determinar si podría observarse también un incremento en humanos.

Un estudio de diseño cruzado aleatorizado, de doble ciego, de once pacientes estables de CAPD (7 hombres, 4 mujeres, de edad 27-75 años) se llevó a cabo. Un grupo de pacientes recibió 100 U/kg de rHuEpo (equivalente a 0,5 μg de péptido/kg) mientras que un segundo grupo de pacientes recibió 0,5 μg péptido/kg del análogo de Epo N47, ambos administrados como una única inyección en embolado intravenosa. Las muestras sanguíneas venosas (3 ml) se extrajeron mediante una cánula interna y se tomaron antes de la dosis y a 5, 10, 15, 30 minutos y 1, 2, 5, 8, 12, 16, 24, 30, 36, 48, 60, 72 y 96 horas después de bolo intravenoso. Después de un período de descanso de fármaco de 28 días, el primer grupo de pacientes recibió una única dosis intravenosa de análogo de Epo N47 mientras que el segundo grupo recibió una única dosis

intravenosa de rHuEpo. Las muestras sanguíneas se tomaron como en el

primer ciclo de tratamiento. Los niveles de rHuEpo y del análogo de Epo N47

se determinaron en el suero mediante ELISA después de la sustracción de los

niveles de Epo endógenos iniciales. Los parámetros farmacocinéticos (media ±

5 SE) estimados después del ajuste de los efectos de diseño cruzado se

muestran en la Tabla 5. La AUC de concentración de suero se calculó usando

la suma trapezoidal lineal. El t1/2z se define como: log (2)/Kz, donde Kz se

calcula como la pendiente de la porción terminal de la curva de tiempo In

(concentración de suero). El aclaramiento (CL) se define como: dosis/AUC. El 10 volumen de distribución (Vd) se define como: Cl/K. TABLA 5

Grupo de Dosis

AUC (ng.h/ml) T1/2z (h) CL (ml/h/kg) Vd (ml/kg)

N47

291,0 ± 7,6 25,3 ± 2,2 1,6 ± 0,3 52,4 ± 2,0

rHuEpo

131,9 ± 8,3 8,5 ± 2,4 4,0 ± 0,3 48,7 ± 2,1

La semivida sérica media para el análogo de Epo N47 (25,3 h) fue tres veces más larga que para rHuEpo (8,5 h) y el aclaramiento fue 2,5 veces más

15 rápido para rHuEpo que para el análogo N47. EJEMPLO 7 Un Hallazgo de Dosis de Fase II y Estudio de Régimen de Dosificación del Análogo de Epo N47

Se inician estudios de escalado de dosis secuenciales, aleatorizados,

20 multicéntricos para investigar la dosis y el régimen de dosificación óptimos para el análogo N47 cuando se administra mediante inyección subcutánea o intravenosa en pacientes con CRF que recibían diálisis.

El régimen de dosificación es de la siguiente manera: Dosificación una vez por semana: 0,075, 0,225, 0,45, 0,75, 1,5 y 4,5 μg de

25 péptido/kg/dosis. Dosificación tres veces por semana: 0,025, 0,075, 0,15, 0,25, 0,5 y 1,5 μg de péptido/kg/dosis.

Los estudios se realizan en dos partes: la primera parte es un estudio de escalado de dosis diseñado para evaluar la dosis del análogo N47 30 proporcionado una o tres veces por semana que aumenta la hemoglobina a una tasa óptima durante cuatro semanas (mayor de o igual a 1 g/dl, pero menor

de 3 g/dl). La segunda parte de cada estudio se diseña para determinar las dosis requeridas (cuando se administra una o tres veces por semana mediante vías de administración intravenosas o subcutáneas) para mantener el hematocrito en la diana terapéutica.

Los resultados preliminares indican que las dosificación una vez por semana con el análogo N47 se puede usar tanto para aumentar como para mantener el hematocrito de pacientes con CRF anémicos. Los resultados iniciales sugieren que las dosis preferidas para iniciar la terapia en un régimen de dosificación de tres veces por semana son 0,15 y 0,25 μg/péptido/kg/dosis y en el régimen de dosificación de una vez por semana son 0,45 y 0,75 μg/péptido/kg/dosis para ambas vías de administración.

Mientras que la invención se ha descrito en lo que se considera que son sus realizaciones preferidas, no debe limitarse a las realizaciones descritas, pero pretende cubrir distintas modificaciones y equivalentes incluidas dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

LISTA DE SECUENCIAS

<110> Egrie C., Joan Elliott G. Steven Browne K. Jeffrey

<120> Métodos y Composiciones para la Prevención y Tratamiento de la Anemia

<130> A-460

<140> 09/178.292

<141> 1998-10-23

<160> 5

<170> Patentln Ver 2.0

<210> 1

<211> 193

<212> PRT

<213> Humano

5 <220>

<221> SEÑAL

<222> (1) .. (27)

<223> la secuencia de señal es el residuo 1-27

10 <400> 1

imagen1

<210> 2

<211> 29 15 <212> ADN

<213> Humano <400> 2 atctagaagt tgctctctgg acagttcct 29

<210> 3

<211> 32

<212> ADN

<213> Humano

<400> 3 gaagcttgcg ccaccatggg ggtgcacgaa tg 32

<210> 4

<211> 27

<212> ADN

<213> Humano

<400> 4 gatcctctag agttgctctc tggacag 27

<210> 5

<211> 25

<212> ADN

<213> Humano

<400> 5 caacaagctt gcgccgccat ggggg 25

Claims (18)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Un análogo de la eritropoyetina humana que comprende al menos un sitio de glucosilación adicional en cualquiera de las posiciones 52, 53, 55, 86 y 114 de la secuencia de eritropoyetina humana, en el que una cadena de carbohidratos N-ligada se añade al sitio.

2. 2.

   El análogo de la reivindicación 1 que comprende al menos dos sitios de glucosilación adicionales en el que una cadena de carbohidratos se une a cada uno de los sitios.

3. 3.

   El análogo de la reivindicación 1 que comprende al menos tres sitios de glucosilación adicionales en el que la cadena de carbohidratos se une a cada uno de los sitios.

4. 4.

   El análogo de la reivindicación 1 que comprende al menos cuatro sitios de glucosilación adicionales en el que la cadena de carbohidratos se une a cada uno de los sitios.

5. 5.

   Un análogo de la eritropoyetina humana que se selecciona del grupo que

   consiste en: Asn52 Thr64 Epo; Asn53 Thr55 Epo; Asn114 Thr118 Epo; Asn30 Thr32 Asn53 Thr5 Val87 Asn88 Thr90 Epo; Asn55 Thr57 Epo; Asn88 Val87 Thr88 Epo; Asn30 Thr32 Asn53 Thr55 Epo; Asn30 Thr32 Asn114 Thr116 Epo, y Asn30 Thr32 Asn53 Thr55 Val87 Asn88 Thr90 Asn114 Thr116 Epo.

6. 6.

   El análogo de las reivindicaciones 1-5 que es el producto de la expresión de una secuencia de ADN exógena.

7. 7.

   Una secuencia de ADN que codifica el análogo de las reivindicaciones 1

8. 5.

9. 8.

   Una célula hospedadora eucariota transfectada con la secuencia de ADN de la reivindicación 7 de un modo que permite a la célula hospedadora expresar el análogo.

10. 9.

    Una composición que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del análogo de las reivindicaciones 1-5 junto con un vehículo, adyuvante o diluyente farmacéuticamente aceptable.

11. 10.

    Uso del análogo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para la preparación de una composición farmacéutica para el aumento y mantenimiento del hematocrito en un mamífero.

12. 11.

    Uso del análogo de la reivindicación 10, en el que el análogo se va a administrar menos frecuentemente que una cantidad molar equivalente de eritropoyetina humana recombinante para obtener un hematocrito diana comparable.

13. 12.

    Uso del análogo de la reivindicación 11, en el que la cantidad de análogo se va a administrar aproximadamente una vez por semana, aproximadamente una vez cada dos semanas o aproximadamente una vez al mes.

14. 13.

    Uso del análogo de la reivindicación 10, en el que el análogo se va a administrar a una cantidad molar menor que una eritropoyetina humana recombinante para obtener un hematocrito diana comparable.

15. 14.

    Uso del análogo de la reivindicación 12, en el que la cantidad del análogo que se va a administrar es aproximadamente de 0,025 a 1,5 g de péptido de eritropoyetina por kg por dosis tres veces por semana.

16. 15.

    Uso del análogo de la reivindicación 12, en el que la cantidad de análogo que se va a administrar es menor aproximadamente de 0,025 g de péptido de eritropoyetina por kg por dosis tres veces por semana.

17. 16.

    El análogo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para su uso en el aumento y mantenimiento del hematocrito en un mamífero.

18. 17.

    Un método para la producción de un análogo de eritropoyetina humana que comprende el cultivo de la célula hospedadora de la reivindicación 8 en condiciones que permitan la expresión del análogo y la recuperación del análogo del medio celular.