KR20010075661A

KR20010075661A - 빈혈 예방 및 치료 방법과 이를 위한 조성물

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Publication number: KR20010075661A
Application number: KR1020017005047A
Authority: KR
Inventors: 에그리조안씨; 엘리엇스티븐지; 브라운제프리케이
Original assignee: 스티븐 엠. 오드레; 암젠 인코포레이티드
Priority date: 1998-10-23
Filing date: 1999-10-18
Publication date: 2001-08-09
Also published as: HUP0103920A3; AR020848A1; AU774989B2; EP1813624B1; ES2347884T3; CN101703760A; CY1107584T1; SI1813624T1; AU1124100A; HUP0103920A2; DE69935345D1; JP5558213B2; CN1346369A; IL196645A; WO2000024893A2; SI1123313T1; DE69935345T3; CN1346369B; HK1040944A1; TWI234583B

Abstract

본 발명은 에리트로포이에틴의 고글리코실화 유사체를 투여하는 포유류 헤마토크리트의 증가 및 유지 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 등몰량의 재조합 사람 에리트로포이에틴보다 더 적은 빈도로 유사체를 투여하여 비슷한 목표의 헤마토크리트를 얻고 빈혈을 치료하는 것에 관한 것이다. 선택적으로, 더 낮은 몰량의 고글리코실화 유사체를 투여하여 비슷한 목표의 헤마토크리트를 얻고 빈혈을 치료한다. 또한 본 발명은 에리트로포이에틴의 새로운 고글리코실화 유사체, 유사체의 제조방법 및 유사체를 함유하는 조성물에 관한 것이다.

Description

빈혈 예방 및 치료 방법과 이를 위한 조성물{METHODS AND COMPOSITIONS FOR THE PREVENTION AND TREATMENT OF ANEMIA}

에리트로포이에틴(Epo)은 적혈구계 선조 세포를 적혈구로 성숙시키는 데 필요한 당단백질 호르몬이다. 이는 신장에서 생성되고 순환시에 적혈구 수준을 조절하는 데 필수적이다. 저수준의 조직 산소 신호로 표지되는 조건은 차례로 적혈구 형성을 자극하는 Epo 의 생성을 증가시킨다. 예를들면, 대표적으로 만성 신부전(CRF)에서 볼 수 있는 바와 같이 신장 기능의 손실은 Epo 생성의 감소를 가져옴으로써 동시에 적혈구 감소를 가져온다.

사람 비뇨 Epo 는 Miyake 등의[J. Biol. Chem. 252, 5558(1977)]에 의하여 재생 불량성 빈혈을 갖는 환자에게서 정제되었다. 그러나, 이러한 원(source)에서 얻은 정제된 Epo 단백질의 양은 치료적으로 사용하기에는 불충분하다. 사람 Epo 를 코드하는 유전자의 동정과 클론화 및 재조합 단백질의 발현은 Lin 의 미국 특허 번호 제 4,703,008 호에 기재되어 있으며, 이의 설명은 여기에 참고적으로 혼입되어 있다. 세포 배지로부터 재조합 사람 에리트로포이에틴을 정제하는 방법은 Lai 등에 의한 미국 특허 번호 제 4,667,016 호에 기재되어 있고, 이는 여기에 참고적으로 혼입되어 있다. 포유류 숙주 세포로부터 생물학적 활성 Epo 의 생성은 처음으로 치료적 사용에 적합한 Epo 의 양으로 이용할 수 있다. 더불어, 유전자 서열 지식과 정제된 단백질의 유용성 증가는 이러한 단백질의 활동 방식을 더 잘 이해하게 한다.

사람 비뇨 유도 Epo(상기 Miyake 등)와 포유류 세포에서 발현된 재조합 사람 Epo 는 함께 전체 분자량 중 약 40 % 의 당단백질을 함유하는 세 개의 N - 결합과 하나의 O - 결합 올리고당 쇄를 함유한다. N -결합 글리코실화는 위치 24, 38 과 83 에 위치하는 아스파라긴 잔기에서 일어나는 반면에 O-결합 글리코실화는 위치 126 에 위치하는 세린 잔기에서 일어난다(Lai 등의, J. Biol. Chem. 261, 3116 (1986) ; Broudy 등의 Arch. Biochem. Biophys. 265, 329 (1988)참조]. 올리고당 쇄는 말단 시알산 잔기로 변이되는 것으로 나타났으며, 여기서 N - 결합 쇄는 대체로 쇄 당 4 개 이하의 시알산을 갖고 O - 결합쇄는 2 개 이하의 시알산을 갖는다. 그러므로, Epo 폴리펩티드는 전체 14 개 이하의 시알산을 수용할 수 있다.

여러가지 연구로, Epo 탄수화물 쇄의 교체가 생물학적 활성에 영향을 미칠 수 있음을 알 수 있다. 그러나 한 연구에서, 글리코실화 부위에 있는 아스파라긴 또는 세린 잔기의 돌연변이유발에 의하여 단독으로 또는 함께 N - 결합 또는 O - 결합 올리고당 쇄를 제거하는 것은 포유류 세포에서 생성되는 교체된 Epo 의 시험관내 활성을 급격히 감소시킨다[Dube 등의 J. Biol. Chem. 263, 17516 (1988) 참조]. 그러나, DeLorme 등은[Biochemistry, 31, 9871 - 9876 (1992)] Epo 에서 N - 결합 글리코실화 부위를 제거하면 생체내 생물학적 활성은 감소시키나 시험관내 활성은 감소시키지 않는 것으로 보고하였다.

Epo 시알산 함량과 생체내 생물학적 활성 사이의 관계는 분리된Epo 이소형의 생체내 활성을 측정하여 나타낸다. Epo 분자당 시알산 함량의 단계적 증가는 정상 마우스의 헤마토크리트를 상승시키기 위하여 분리된 Epo 이소형의 등몰 농도의 능력으로 측정된 생체내 생물학적 활성에서 해당하는 단계적 증가를 나타냄을 알았다[Egrie 등, Glycoconjugate J. 10, 263 (1993) 참조]. 또한 더 높은 시알산 함량을 갖는 이들 Epo 이소형은 더 긴 혈청 반감기를 나타내지만, Epo 수용체의 친화성은 감소되며, 이는 혈청 반감기가 생체내 생물학적 활성의 중요한 결정인자임을 나타낸다.

Epo 폴리펩티드에 새로운 글리코실화 부위의 도입은 부가적 탄수화물 쇄를 갖는 분자의 생성을 가져올 수 있다. 전체적으로 여기에 참고로 혼입되어 있는 PCT 공개 번호 제 WO 91/05867 호 및 제 WO 94/09257 호를 참조하라. 최소한 하나의 부가적 N - 결합 탄수화물을 가지며 최소한 하나의 부가적 O - 결합 탄수화물 쇄를 갖는 Epo 글리코실화 유사체는 재조합 사람 Epo(rHuEpo)(이소형 9 - 14)와 분자 당 14 시알산을 갖는 rHuEpo 의 정제된 이소형과 비교하여 더 긴 순환 반감기를 갖는 것으로 측정되었다.

재조합 사람 에리트로포이에틴(rHuEpo)의 투여는 말기 신장병을 앓는 빈혈 환자의 적혈구 수준을 상승시키는 데 효과적이다[Eschbach 등 NewEng. J. Med. 316, 73 - 38(1987) 참조]. 다음 연구에서는 rHuEpo 로 치료하면 여러가지 다른 증상과 연관되는 빈혈을 치료할 수 있음을 나타낸다[Fisch 등, New Eng. J. Med. 322, 1488 - 1493 (1990) ; Laupacis, Lancet 341, 1228 - 1232 (1993) 참조]. CRF 와 관련된 빈혈, HIV-감염 환자의 AZT(지도부딘) 요법과 관련된 빈혈, 화학요법을 받는 비-골수 악성을 갖는 환자의 빈혈과 동종 수혈의 필요를 감소시키기 위한 수술을 받는 환자의 빈혈을 치료하는 데 rHuEpo 를 사용할 수 있는 것으로 승인되었다. 모든 검정된 징후(수술 징후는 제외)의 현행 요법은 50 ∼ 150 유니트/㎏ 의 개시 용량을 주당 3 회(TIW) 정맥(IV) 또는 피하(SC) 주사로 투약하여 예상 목표 헤마토크리트 범위에 도달하게 한다. 수술 징후에 있어서는, 수술전 10 일간 매일, 수술일과 수술후 4 일간 rHuEpo 를 투여한다(EPOGEN^(R)패키지 삽입, 12/23/96). 일반적으로, 현재 권장되는 rHuEpo 의 개시 용량은 약 6 주 내지 8 주에 헤마토크리트를 목표 범위로 상승시킨다. 일단 목표 헤마토크리트 범위에 도달하면, 유지 투약량 계획은 환자에 따라 여러가지로 수립하지만, CRF 를 앓는 환자에 있어서는 일반적으로 주당 3 회이다. 상술한 rHuEpo 의 투여는 빈혈을 치료하는 데 효과적이고 잘 허용되는 양생법이다.

rHuEpo 보다 더 큰 효능이 요구된다. 이와 같은 분자에 대한 이점은 더 적은 빈도 및/또는 더 낮은 용량으로 투약하는 데 있다. 빈혈로 고통을 받는 환자에 대한 현행 치료는 주당 3 회 EPOGEN^(R)을 투여하고 수술 환자에 있어서는 매일 1 회 투여한다. 적은 빈도의 투약량 계획은 의사와 환자, 특히 병원 또는 진료소에 정기적으로 계획하여 방문하지 않는 환자 또는 Epo 를 자가 - 주사하는 환자에게 더 편리하다. 보다 유효성이 높은 분자의 다른 이점은 더 적은 양의 약물로 동등한 헤마토크리트 증가를 환자에게 도입시키는 것이다.

그러므로 본 발명의 목적은 더 적은 빈도의 투약량 계획을 허용하는 빈혈 치료에 더 효과적인 분자를 동정하는 데 있다. 다른 본 발명의 목적은 더 낮은 용량을 투여하였을 때 최소한 Epo 의 수준과 비슷한 수준으로 헤마토크리트를 증가시키고 유지하는 분자를 제공하는 데 있다. 또한 본 발명의 목적은 더 적은 빈도의 용량으로 선택한 이들 분자가 최소한 rHuEpo 와 마찬가지로 잘 허용되고 몇몇 환자에 있어서는 효능적으로 더 잘 허용되는 것에 있다.

발명의 요약

N47 로 지정된 고글리코실화 Epo 유사체(Asn³⁰Thr³²Val⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰EPO) 는 재조합 사람 에리트로포이에틴(rHuEpo) 보다 더 긴 혈청 반감기를갖고 rHuEpo 와 동일한 용량과 빈도로 투여했을 때 더 큰 생체내 활성을 갖는 것으로 나타났다. 더욱이, 유사체는 주당 1 회 마우스에 투여했을 때 주당 3 회 rHuEpo 를 투여한 헤마토크리트 상승과 비슷한 헤마토크리트 상승을 나타냈다. 마우스와 사람에 투여한 Epo 유사체 N47 의 약물동태학은 유사하였다.

본 발명은 치료적 유효량의 Epo 고글리코실화 유사체의 약학적 조성물을 투여하는, 포유류의 헤마토크리트를 상승시키고 유지하는 방법을 제공하며, 여기서 유사체는 등몰량의 rHuEpo 보다 더 적은 빈도로 투약하여 비슷한 목표의 헤마토크리트를 얻는다. 환자의 최적 헤마토크리트 범위에 도달하기 위한 본 발명의 투약 빈도는 주당 3 회 이하이다. 투약 빈도는 격주로 1 회, 매월 1 회 또는 2 개월마다 1 회와 같이 주당 1 회 이하, 주당 2 회 또는 주당 1 회로 할 수 있다. 환자의 목표 헤마토크리트를 유지하는 데 필요한 투약 빈도는 주당 3 회 이하이다. 투약 빈도는 2 주마다 1 회, 매월 1 회 또는 2 개월마다 1 회와 같이 주당 1 회 이하, 주당 2 회 또는 주당 1 회로 할 수 있다.

또한 본 발명은 유사체를 rHuEpo 보다 더 낮은 몰량으로 투여하여 비슷한 목표의 헤마토크리트를 얻는, 치료적 유효량의 Epo 고글리코실화 유사체를 투여함으로써 포유류의 헤마토크리트를 상승시키고 유지하는 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 주당 3 회 이하의 투약 빈도에 적합한 Epo 고글리코실화 유사체를 함유하는 약학적 조성물을 제공한다. 조성물은 Epo 고글리코실화 유사체와 함께 사용하기에 적합한 약학적으로 용인가능한 보조제를 포함한다.

본 발명은 신장 기능의 쇠퇴 또는 손실(만성 신부전), 골수억제 요법, 암, 바이러스 감염, 만성 질병과 수술 기간 동안 혈액 과대 손실과관련된 빈혈과 같은, 적혈구 감소를 가져오는 어떠한 증상에 사용할 수 있다. 한 실시형태에 있어서, 만성 신부전에서 유발되는 빈혈을 매주 1 회 투약, 또는 그 이하의 빈도로 치료한다.

또한 Epo 의 신규한 고글리코실화 유사체를 제공한다. 유사체는 최소한 하나의 N - 결합 탄수화물 쇄가 위치 52, 53, 55, 86 과 114 중 어느 것에 부가되는, rHuEpo 와 비교되는 최소한 하나의 부가적 탄수화물 쇄를 함유한다. 새로운 고글리코실화 유사체는 두 개, 세 개 또는 네 개의 부가적 탄수화물 쇄를 갖거나 또는 네 개 이상의 부가적 쇄를 가질 수 있다.

본 발명은 에리트로포이에틴의 고글리코실화된 유사체를 사용하여 포유류의 헤마토크리트를 증가시키는 것에 관한 것이다. 더욱이, 본 발명은 재조합 사람 에리트로포이에틴과 비교되는 고글리코실화된 유사체의 투약 빈도를 줄여 헤마토크리트를 증가시키고 유지하여 빈혈을 치료하는 것에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 등량의 빈도로 재조합 사람 에리트로포이에틴과 비교되는 낮은 양의 고글리코실화된 유사체를 투여하여 헤마토크리트를 증가시키고 유지하여 빈혈을 치료하는 것에 관한 것이다. 또한 에리트로포이에틴의 새로운 고글리코실화된 유사체를 제공한다.

도 1 은 사람 에리트로포이에틴의 아미노산 서열을 나타낸 것이다.

도 2 는 무혈청 배지에서 CHO 세포 발현으로 수득한 Epo 고글리코실화 유사체와 rHuEpo 의 웨스턴 블롯 분석을 나타낸 것이다. 유사체 N53 과 N61 의 구조는 실시예 1 에 기재되어 있다. 각 유사체에서 N - 결합 탄수화물 쇄의 수를 표시하였다.

도 3 은 외생 저산소 적혈구 증가성 마우스의 생물학적 검정에서, rHuEpo, Epo 유사체 N4, N18 과 N50 (4 개의 N - 결합 탄수화물 쇄 함유), N47(5 개의 N - 결합 탄수화물 쇄 함유) 및 N53(6 개의 N - 결합 탄수화물 쇄 함유)의 활성을 비교한 것이다. 실험 공정은 실시예 3 에 기재되어 있다. 각 점은 다섯 동물의 평균 반응을 나타낸 것이다. 유사체 N4, N18 과 N47 은 WO 94/09257 에 이미 기재되어 있다.

도 4 는 정맥 주사 (IV) 로 정상 랫에 투여한 rHuEpo 와 Epo 유사체 N47 의 혈청 반감기를 비교한 것이다. 실험 공정은 실시예 4 에 기재되어 있다. 결과는 각 그룹의 평균치(±SD)이다.

제 5 도는 정맥 주사(IV) 를 비글 개에 투여한 rHuEpo 와 Epo 유사체 N47 의 혈청 반감기를 비교한 것이다. 실험 공정은 실시예 4 에 기재되어 있다. 결과는 각 그룹의 평균치(±SD) 이다.

도 6 은 6 주동안 매주 3 회(TIW) 복강내 주사(IP) 로 투여하여 여러가지 투약량의 rHuEpo 또는 Epo 유사체 N47 에 대한 반응에 따른 마우스의 헤마토크리트 증가를 나타낸 것이다. 표시된 결과는 각 투약 그룹에 대한 헤마토크리트 변화의 그룹 평균치(±SD)이다.

도 7 은 주 1 회(QW) 또는 주 3 회(TIW) 의 빈도로 복강내(IP) 또는 정맥(IV) 투여 경로로 주사한 rHuEpo 와 Epo 유사체 N47 의 마우스에서 상대적인 효능을 비교한 것이다. 실험 공정은 실시예 5 에 기재되어 있다. 각 점은 다음과 같은 분리 실험에서 나온 데이타의 평균치(±SD) 를 나타낸 것이다 : N47, IP, TIW (n=5); N47, IV, TIW (n=1); N47, IP, QW (n=2); N47, IV, QW (n=3); rHuEpo, IP, TIW (n=5); rHuEpo, IV, QW (n=2). 각 실험에서 단위 투약량당 7 ∼ 13 마리의 마우스를 사용했다.

도 8 은 약 6 주동안 주당 1 회(QW) 정맥 주사(IV)하여 투여한 여러 가지 투약량의 rHuEpo 또는 Epo 유사체 N47 의 반응에 따른 마우스의 헤마토크리트 증가를 나타낸 것이다. 실험 공정은 실시예 5 에 기재되어 있다. 표시된 결과는 각 투약 그룹에 대한 헤마토크리트 변화의 그룹 평균치(±SD) 이다.

도 9 는 약 6 주동안 매주 1 회(QW) 또는 격주로 1 회(EQW) 정맥 주사하여 투여한 여러가지 투약량의 Epo 유사체 N47 의 반응에 따른 마우스의 헤마토크리트 증가를 나타낸 것이다. 실험공정은 실시예 5 에 기재되어 있다. 표시된 결과는 각 투약 그룹에 대한 헤마토크리트 변화의 그룹 평균치(±SD) 이다.

본 발명은 치료적 유효량의 에리트로포이에틴의 고글리코실화 유도체의 약학적 조성물을 투여하는, 헤마토크리트를 상승시키고 유지하는 방법을 제공한다. 유사체는 rHuEpo 의 등몰량보다 더 적은 빈도로 투여하여 비슷한 목표의 헤마토크리트를 얻는다. 또한 본 발명은 rHuEpo 보다 더 낮은 몰량의 고글리코실화 유사체를 투여하여 비슷한 목표의 헤마토크리트를 얻는, 헤마토크리트를 상승시키고 유지하는 방법을 제공한다. 조성물은 정맥, 피하 또는 복강내 경로로 투여할 수 있다.

놀랍게도, WO 94/09257, 에 기재된 유사체 N47, 고글리코실화 Epo 유사체를 주 1 회 투여함으로써 주 3 회 투여한 rHuEpo 에서 관찰된 것과 유사한 헤마토크리트 증가를 성취할 수 있음을 알았다. 유사체 N47 은다음과 같은 아미노산 변화를 갖는다: 위치 30 의 ala 가 asn 으로 ; 위치 32 의 his 가 thr 으로 ; 위치 87 의 pro 가 val 으로 ; 위치 88 의 trp 이 asn 으로 ; 및 아스파라긴 잔기 30 과 88 에서 두 개의 N - 결합 탄수화물 쇄가 부가되는 위치 90 의 pro 의 thr 으로의 치환. 유사체는 차이니스 햄스터 난소(CHO) 세포에서 발현되고(실시예 1 에 기재된 바와 같다) 실시예 2 에 기재된 바와 같이 정제되어 17 내지 22 시알산의 이소형을 나타낸다. 유사체 N47 은 정맥 주사했을 때 랫과 비글 개에서 rHuEpo 보다 더 큰 혈청 반감기를 나타낸다(도 4 및 5). N47 은 주당 3 회 복강내 주사했을 때 더 낮은 농도로 rHuEpo 와 비슷한 정상 마우스의 헤마토크리트 증가를 유도했다(도 6). N47 의 효능은 주당 3 회 투여했을 때 rHuEpo 보다 약 3 배 내지 4 배 더 높은 것으로 입증되었다(도 6 및 7). 비슷한 투약량으로 주당 1 회 투여했을 때, rHuEpo 는 정상 마우스에서 헤마토크리트의 자극을 거의 나타내지 않은 반면에 N47 은 현저한 증가를 나타냈다(도 8). N47 의 효능은 주당 1 회 투약했을 때 rHuEpo 보다 약 14 배 더 높았다(도 7). 또한 주당 1 회 투여된 유사체 N47 의 헤마토크리트 반응은 주당 3 회 투여된 rHuEpo 와 비슷했다. 격주로 1 회 투여했을 때도, N47 은 정상 마우스의 헤마토크리트에 있어 현저한 증가를 가져왔다(도 9). 수득한 데이타는, Epo 고글리코실화 유사체와 특히 유사체 N47 을 rHuEpo 로 현재 치료하는 것보다 더 적은 빈도의 투여량을 사용하여 헤마토크리트를상승시키는 데 유리하게 사용할 수 있음을 나타낸다.

또한 마우스에서 얻은 상술한 결과는 사람에게도 적용될 수 있음을 나타낸다. 11 인의 연속 보행 복막 투석(CAPD) 환자에게 rHuEpo 와 유사체 N47 을 투여하는 약물동태학적 파라미터는 유사체 N47 이 rHuEpo 보다 3 배 더 긴 혈청 반감기를 갖는 것을 입증한다. 이러한 결과는 Epo 고글리코실화 유사체가 사람에 있어 rHuEpo 보다 더 적은 빈도의 투약량을 허용함을 알 수 있다.

본원에 사용된 "고글리코실화 유사체"란 부위에 부가되는 부가적 탄수화물 쇄를 갖는 최소한 하나의 부가적 글리코실화 부위를 함유하는 Epo 를 뜻한다. 글리코실화 부위는 N - 결합 또는 O - 결합 탄수화물 쇄에 존재한다. 새로운 N - 결합 글리코실화 부위는 폴리펩티드 쇄에 N - 결합 탄수화물을 부가하기 위한 공통 부위(아미노산 Asn - X - Ser/Thr) 를 코드하는 DNA 서열의 교체에 의하여 도입되며, 반면에 새로운 O - 결합 부위는 세린 또는 트레오닌 잔기를 코드하는 DNA 서열의 교체에 의하여 도입된다. 유사체는 글리코실화를 이용할 수 있는 Epo 폴리펩티드 부위를 증가시키거나 또는 교체시키는 아미노산 잔기의 부가, 결실 또는 치환을 도입하는 돌연변이유발에 의하여 구성된다. Epo 고글리코실화 유사체를 코드하는 DNA 는 진핵 숙주 세포로 트랜스펙션되고 발현된 당단백질에는 부가적 탄수화물 쇄가 존재하는 것으로 분석된다.

Epo 고글리코실화 유사체는 rHuEpo 에서 측정된 것과 비슷하거나 이보다 더 적은 시험관내 활성을 나타내며, 이로써 Epo 수용체에 대한 결합은 탄수화물 쇄의 부가에 의하여 강화되지 않고, 몇몇 경우에는 감소됨을 예상할 수 있다. 그러나, 고글리코실화는 일반적으로 혈청 반감기를 증가시킬 수 있고, 증가된 생체내 생물학적 활성을 강력하게 유도할 수 있다. 위치 88 에서 부가적 N - 결합 탄수화물 쇄를 갖는 하나의 Epo 유사체는 rHuEpo(이소형 9 - 14) 또는 분자당 14 개의 시알산을 갖는 rHuEpo 의 정제된 이소형과 비교하여 수용체의 친화력 감소를 나타내며 더 긴 순환 반감기가 입증되고, Epo 이소형 9 - 14 의 혼합물 또는 분리된 Epo 이소형 14 와 비교하여 생체내 활성이 강화된다.

본 발명에 따라서 투여되는 Epo 고글리코실화 유사체는 최소한 하나의 부가적 N - 결합 또는 O - 결합 탄수화물 쇄를 갖는다. 한 실시형태에 있어서, 유사체는 두 개의 부가적 N - 결합 탄수화물 쇄를 갖는다. 다른 실시형태에 있어서, 유사체는 세 개, 네 개 또는 그 이상의 부가적 N - 결합 탄수화물 쇄를 갖는다. 예로서, 본 발명의 유사체는 사람 Epo 서열의 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기 30, 51, 57, 69, 88, 89, 136 및 138 에서 최소한 하나의 부가적 N - 결합 쇄를 갖는다. 한 실시형태로, 유사체는 사람 Epo 의 잔기 30 과 88 에서 부가적 N - 결합 탄수화물 쇄를 갖는다. 사람 Epo 의 아미노산 잔기 번호는 도 1 과 SEQ ID NO : 1 에 표시된 바와 같다. 도 1 은 166 아미노산의 예상된 성숙 Epo 폴리펩티드를 나타내므로 재조합 생성 Epo 는 C - 말단 아르기닌 잔기의 결실 후 165 아미노산을 갖는다. 이로써 rHuEpo 와 고글리코실화 Epo 유사체는 165 또는 166 아미노산을 갖는 것을 알 수 있다.

본 발명의 유사체는 최소한 네 개의 N - 결합 탄수화물 쇄를 갖는다. 네 개의 쇄 중 세 개는 위치 24, 38 및 83 에서 자연 발생 부위에 있다. 그러나, 본 발명의 몇몇 유사체는 하나 또는 그 이상의 부위가 결실되어 새로운 부위로 치환되는 하나 또는 그 이상의 자연 발생 글리코실화 부위로 교체되는 것을 알 수 있다. 이러한 유사체도 본 발명에 의하여 제공된다. 예를들면, 위치 24, 38 및 83 에서 부위 중 어느 하나가 결실되어 위치 88 에서 한 부위로 치환된다. 임의적으로, 유사체는 위치 126 에서 0 - 결합 부위를 갖는다.

또한, 본 발명은 최소한 하나의 부가적 탄수화물 쇄를 갖는 새로운 Epo 고글리코실화 유사체를 제공한다. 부가적 N - 결합 탄수화물 쇄는 글리코실화 부위로 변이되는 위치 52, 53, 55, 86 및 114 중 어느 것에 부가됨을 알 수 있다. 특정 실시형태는 표 1 에서 설명한 바와 같이 유사체 N49 내지 N61 을 포함한다. 새로운 유사체는 위치 52, 53, 55, 68 및 114 중 어느 것에서 최소한 하나의 새로운 N - 결합 글리코실화 부위를 가지며 다른 부위에서 부가적 N - 결합 또는 0 - 결합 탄수화물 쇄를 더 함유한다. 유사체는 한 개, 두 개, 세 개 또는 네 개의 부가적 탄수화물 쇄 또는 네 개 이상의 부가적 쇄를 갖는다. 바람직한 한 실시형태는, 유사체가 세 개의 부가적 N - 결합 탄수화물 쇄(전체 6 개의 N - 결합 쇄)를 갖는 것이다. 다른 바람직한 실시형태로는, 유사체가 네 개의 부가적 N - 결합 쇄(전체 7 개의 N - 결합 쇄)를 갖는 것이다. 세 개나 네 개 또는 네 개 이상의 부가적 N - 결합 탄수화물 쇄를 갖는 유사체는 한정되어 있는 것은 아니나, 위치 52, 53, 55, 86 및 114 중 한 위치에 부가적 쇄를 갖는다.

놀랍게도, 위치 30, 53 및 88 에서 세 개의 부가적 N -결합 쇄(전체 6 개의 N - 결합 쇄)를 갖는 고글리코실화 유사체가 두 개의 부가적 쇄(전체 5 개)를 갖는 유사체 N47 보다 더 큰 생체내 활성을 갖는 것을 알았다. 결과는 표 3 에 나타나 있다. 유사체의 생체내 활성은 N - 결합 탄수화물 쇄의 수와 직접적으로 관계가 있는 것이 분명하다. 이러한 결과는 N47 보다 더 많은 N - 결합 탄수화물 쇄를 갖는 유사체는 더 적은 빈도로 투약할 수 있는 치료 환경을 추정하게 한다.

유사체는 부위 - 특이 돌연변이유발, PCR 돌연변이유발 및 카세트 돌연변이유발과 같은 본 분야의 숙련자가 이용할 수 있는 여러가지 돌연변이유발에 의해 제조할 수 있다[Zoller 등의, Meth. Enz. 100, 468 - 500 (1983); Higuchi,PCR Protocolspp. 177 - 183(Academic Press, 1990); Wells 등의 Gene 34, 315 - 323 (1985) 참조]. 실시예 1 에서는 PCR 돌연변이 유발을 이용하여 새로운 Epo 고글리코실화 유사체를 구성하는 것을 기술하고 있다.

포유류 숙주 세포에서 보존하기에 적합한 벡터를 이용한 표준 방법을 사용하여, 돌연변이를 일으킬 Epo DNA 서열을 발현 벡터 내로 삽입한다. 벡터는 일반적으로 다음 요소를 함유한다 : 촉진인자와 다른 "상류" 조절 요소, 복제 개시점, 리보솜 결합 부위, 전사 종결 부위, 다링커 부위와 포유류 숙주 세포의 사용과 화합할 수 있는 선택 표지. 또한 벡터는 원핵 숙주 세포의 증식과 유지를 허용하는 요소를 함유한다.

적당한 세포 또는 세포주는 사람 원을 포함하여, 포유류 원을 포함한다. 예를들면, COS-7(ATCC 기탁 번호 제 CRL 1651 호), 사람 293, 유아 햄스터 신장(BHK, ATCC 기탁 번호 제 CCL 10 호), 차이니스 햄스터 난소 세포[디히드로엽산 환원 효소(DHFR) - 결핍 세포 포함, Urlab 등의 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216 - 4220 (1980)] 가 있다. 다른 적당한포유류 세포주는 한정되어 있는 것은 아니다. HeLa, 마우스 L-929 와 3T3 가 있다. 바람직한 실시형태는, DHFR-결핍 CHO 세포를 사용하는 것이다.

Epo 고글리코실화 유사체를 코드하는 서열을 함유하는 벡터는 표준 형질전환 또는 트랜스펙션 방법에 의하여 숙주 세포에 도입된다. 형질전환 또는 트랜스펙션된 숙주 세포를 배양, 증폭 및 선별하는 것은 통상적으로 이용할 수 있는 방법으로 성취할 수 있다[Gething 등의 Nature 293, 620 - 625 (1985) ; Kaufman 등의 Mol. Cell. Biol. 5, 1750 - 1759 (1985); 미국 특허 번호 제 4,419,446 호 참조]. Epo 고글리코실화 유사체를 코드하는 DNA 서열을 함유하는 숙주 세포는 유사체의 발현을 허용하는 조건하에서 배양된다. 유사체는 세포 배지에서 회수하여 전술한 WO 94/09257 과 실시예 2 에서와 같은 공정을 사용하여 정제한다. 정제 공정은 부가적 탄수화물 쇄를 부가하여 수득한, 보다 많은 수의 시알산을 함유하는 Epo 이소형을 분리하도록 하는 것이다.

Epo 고글리코실화 유사체는 새로운 글리코실화 부위를 창출하지 않고 고글리코실화 유사체의 생물학적 활성을 실질적으로 변화시키지 않는 아미노산 잔기의 부가, 결실 또는 치환을, 새로운 글리코실화 부위와 더불어 포함한다. 생물학적 활성에 영향을 미치지 않고 교체될 수 있는Epo 의 이들 개개 부위 또는 영역은 Syed 등의 Nature 395, 511(1998) 에 기술되어 있는 Epo-Epo 수용체 복합체의 구조를 검사하여 결정할 수 있다. Epo-Epo 수용체 복합체 구조를 검사하여 Epo 의 수용체 결합 부위와 상호작용을 하거나 가깝게 인접한 잔기 및 Epo 아미노산 서열의 교체가 이루어질 때 피해야만 되는 잔기를 밝혔다. 또한, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발에 의하여 아미노산 치환을 허용하는 이들 영역을 실험적으로 결정할 수 있다[Cunningham 등의 Science 244, 1081-1085 (1989) 참조]. 이 방법에서, 선택된 아미노산 잔기는 중성 아미노산(예를들어, 알라닌)으로 개별적으로 치환하여 생물학적 활성에 관한 효과를 측정한다.

보존적 아미노산 치환은 폴리펩티드의 구조 및/또는 기능을 최소한 불안정하게 하는 것으로 일반적으로 인식되어 있다. 따라서, 본 발명은 Epo 고글리코실화 유사체 내에 하나 또는 그 이상의 보존적 아미노산 치환을 포함한다. 일반적으로 보존적 아미노산 치환은 구조 및/또는 기능이 유사한 다른 것(예를들어, 크기, 전하와 형태가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산)으로 한 아미노산을 치환하는 것이다. 이러한 치환의 성질은 본 분야의 숙련자들에게 잘 알려져 있으며 하기 표에 요약하였다. 이와 같은 보존적 치환은 "바람직한 치환" 이라는 제목으로 표시하였다. 또한, 도입할 수 있는 다른 실질적인 치환("전형적인 치환")도 예상된다. 본 분야의 숙련자는 처음에는 비교적 보존적인방법으로 치환하여 부위를 변이시켜야 함을 인지할 수 있을 것이며, 이러한 치환으로 생물학적 활성도가 유지된다면, 그 이상의 실질적인 치환(전형적인 치환)을 도입하고/하거나 다른 부가/결실을 실시한 후에 생성물을 스크리닝한다.

본 발명은 실질적으로 생물학적 활성에 영향을 미치지 않는 고글리코실화 Epo 유사체의 아미노산 결실 또는 부가를 제공한다. 이러한부가 및 결실은 폴리펩티드의 N - 말단 또는 C - 말단에서 이루어지거나 이의 내부에서 이루어진다. 일반적으로, 비교적 소규모의 결실 또는 부가는 고글리코실화 유사체의 구조 및/또는 기능에 보다 적게 영향을 미칠 것이다. 한 실시형태에 있어서, 5 ∼ 10 잔기, 선택적으로 2 ∼ 5 아미노산 잔기 또는 1 ∼ 2 잔기를 결실 또는 부가할 수 있다.

"몰량" 이란 용어는 글리코실화 없이 해당 에리트로포이에틴 폴리펩티드의 분자량을 기준으로 한 고글리코실화 유사체 또는 rHuEpo 의 양을 뜻한다. rHuEpo 와 유사체의 등량이란 이러한 양을 측정하는 데 사용된 공정에서 정상 변이를 계산할 때 동일한 양을 뜻한다. rHuEpo 와 유사체의 분자량은 탄수화물 쇄의 수에 따라서 변하기 때문에 이러한 방법으로 등량을 측정하는 것이 필요하다. rHuEpo 에 있어서, 에리트로포이에틴 폴리펩티드의 분자량은 도 1 과 SEQ ID NO : 1 에 표시된 아미노산 잔기 1 - 165 를 기준으로 하여 계산한다. 고글리코실화 유사체에 있어서, 분자량은 도 1 과 SEQ ID NO : 1 의 잔기 1 - 165 에서 아미노산 치환에 따라 조정된다.

고글리코실화 유사체의 투약 빈도는 치료되는 조건과 목표 헤마토크리트에 따라 변하지만, 일반적으로 주당 3 회 이하이다. 투약 빈도는 주당 약 2 회 또는 주당 약 1 회이다. 또한, 투약 빈도는주당 약 1 회이하, 예를들어 2 주마다 약 1 회(14 일당 약 1 회), 매월 1 회 또는 2 개월 마다 1 회일 수 있다. 실제 사용되는 투약 빈도는 Epo 유사체에 대한 다른 개개인의 반응에 따라 달라지므로 본원에 기재된 빈도가 어느 정도 달라질 수 있음을 이해할 것이며 ; "약" 이란 용어는 이러한 변화를 반영하는 것이다.

본원에 사용된 바와 같이, "치료적 유효량"이란 용어는 목표 헤마토크리트까지, 또는 환자에게 유익하거나 선택적으로, 환자를 목표 헤마토크리트에서 또는 목표 헤마토크리트 범위내에서 유지하는 목표 헤마토크리트 범위까지 헤마토크리트를 증가시키는 고글리코실화 유사체의 양을 뜻한다. 양은 개체에 따라 다양하고 환자의 전체 신체 조건, 병의 심도와 빈혈의 근본 원인 및 개개 환자의 최종 목표 헤마토크리트를 포함한, 여러가지 인자에 따라 달라진다. 목표 헤마토크리트는 일반적으로 최소한 약 30 %, 또는 30 % ∼ 38 %, 바람직하게는 38 % 이상, 더 바람직하게는 40 % ∼ 45 % 이다. 또한, rHuEpo 의 목표 헤마토크리트 범위에 관한 일반적 가이드라인은 1996년 12월 23일자 EPOGEN^(R)패키지 삽입물에서 알 수 있고, 본원에 설명된 바와 같이 30 % ∼ 36 %, 또는 선택적으로 32 % ∼ 38 % 이다. 이러한 목표는 개체에 따라 다양하므로 주어진 환자의 실제 목표 헤마토크리트를 측정하는 데 있어 의사가 판단할 수 있을 것으로 인지된다. 그렇지만, 목표 헤마토크리트를 측정하는 것은 본 분야의 숙련자 수준 내에서 잘 알려져 있다.

본 조성물의 치료적 유효량은 본 분야의 숙련자가 쉽게 확인할 수 있다. 실시예 6 에는 주당 1 회 및 주당 3 회 투약하는 데 있어 유사체 N47 의 치료적 유효량을 측정하기 위한 하나의 목적을 갖는 임상안이 기재되어 있다. 주당 1 회 투여하기 위한 투약량 범위는 약 0.075 내지 약 4.5 ㎍ 의 에리트로포이에틴 펩티드/kg/투약량이다. 주당 3 회 투여하기 위한 투약량 범위는 0.025 내지 1.5 ㎍ 의 에리트로포이에틴 펩티드/kg/투약량이다. 이 투약 범위는 다른 Epo 고글리코실화 유사체에 사용할 수 있고, 투약 범위의 조정은 본 분야의 숙련자에게 잘 알려져 있다.

본 발명의 우수한 장점은 주어진 투약량 또는 투약 계획에 요구되는 대로 Epo 유사체를 알맞게 제조할 수 있는, 투약량 또는 투약 간격과 고글리코실화의 정도를 부합시키는 능력에 있다. 도 3 에 표시된 하나, 둘 또는 셋의 부가적 탄수화물 쇄를 갖는 Epo 유사체의 생체내 활성 증가를 근거로 하여, 담당 의사는 치료할 빈혈 증상에 적당하고 편리한 유사체를 선택할 수 있다. 예를들면, 급성 빈혈이 있고 유효 투약량을 대량으로 필요로 하는 환자에게 또는 보다 긴 지속적 치료가 요구되는 환자에게는 세 개, 네 개 또는 그 이상의 부가적 탄수화물 쇄를 갖는 고글리코실화 유사체가 바람직하며, 심하지 않은 빈혈을 경험하거나 비교적 짧은 시간의 치료를 요구하는 다른 환자들에게는 하나 또는 둘의 부가적 탄수화물 쇄를 갖는 유사체가 바람직하다. 본 발명의 유사체는 광범위한 근원적 증상에서 나오는 빈혈을 예방 및 치료하는 데 상당한 융통성을 의사에게 제공한다.

또한, 본 발명은 치료적 유효량의 철을 투여하여 치료하는 동안 증가된 적혈구 형성을 유지하는 것을 제공한다. 투여량은 rHuEpo 치료를 근거로 본 분야의 숙련자가 쉽게 측정할 수 있다.

본 발명은 적혈구 생성을 자극하여 빈혈을 예방하고 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명에 의하여 치료할 수 있는 증상 중에는 신장 기능의 쇠퇴 또는 손실(만성 신부전)과 관련된 빈혈, 화학요법 또는 항 - 바이러스 약제(예, AZT)와 같은, 골수억제 요법과 관련된 빈혈, 비-골수 암의 진행과 관련된 빈혈, 바이러스 감염(예, HIV)과 관련된 빈혈과 만성 질병의 빈혈이 있다. 또한 수술하는 동안 예상되는 혈액의 손실과 같은, 또 다른 건강한 개인에게 빈혈을 가져올 수 있는 증상도 치료할 수 있다. 일반적으로, rHuEpo 로 치료할 수 있는 증상은 본 발명의 Epo 고글리코실화 유사체로도 치료할 수 있다.

또한 본 발명은 약학적으로 수용할 수 있는 희석제, 담체, 가용화제, 유화제, 방부제 및/또는 보조제와 함께 치료적 유효량의 Epo 고글리코실화 유사체를 함유하는 약학적 조성물을 제공한다. 조성물은 주당 3 회 이하의 투약 계획에 적합하다. 조성물은 액체 또는 동결건조 형태로 할 수 있고 여러가지 pH 값과 이온세기를 갖는 희석제(트리스, 시트르산염, 초산염 또는 인산염 완충액), 트윈 또는 폴리소르베이트와 같은 가용화제, 티메로살, 파라벤, 염화벤질알코늄, 또는 벤질알콜 같은 방부제, 메타아황산 수소 나트륨 또는 아스코르브산과 같은 산화방지제와, 기타 리신 또는 글리신과 같은 성분을 함유한다. 특별한 조성물의 선택은 치료될 증상, 투여 방법과 원하는 약물동태학적 파라미터를 포함하는 여러가지 인자에 따른다. 약학적 조성물에 적합한 성분을 더 광범위하게 조사하면 Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed. A. R. Gennaro, ed. Mack, Easton, PA (1980) 에서 볼 수 있다. 바람직한 실시형태에 있어서, 본 발명의 Epo 글리코실화 유사체를 사람 알부민을 함유하는 등장성 염화나트륨/시트르산나트륨 완충액과 임의로 방부제로서 벤질알콜을 함유하는 액체 형태로 제조한다. 조성물은 하나, 둘, 셋세, 넷 또는 그 이상의 부가적 탄수화물 쇄를 함유하는 것이 바람직하다.

본 발명의 조성물은 피하 또는 정맥 주사로 투여하는 것이 바람직하다. 최종적으로 선택되는 투여 방법은 여러가지 인자에 따라 달라짐을 본 분야의 숙련자들은 인지할 수 있다.

다음 실시예들은 본 발명을 보다 상세히 예시하기 위하여 제공한 것으로, 본 발명의 범위를 한정하고자 하는 것은 아니다.

실시예 1

고글리코실화 Epo 유사체의 구조

고글리코실화 Epo 유사체를 코드하는 cDNA 의 구조

Epo 유사체는 몇 가지 다른 방법을 사용하여 시험관내 돌연변이유발에 의해 제조한다. 유사체 N49 와 N50 은 WO 94/09257 에 기재된 바와 같이 구성된다. 또한 중첩 PCR(중합효소 연쇄 반응) 방법의 변이에 의하여 유사체를 구성한다. 기본 공정에는 두 연속 단계가 포함된다. 제 1 단계에서는, 전체 네 개의 올리고뉴클레오티드 : 5'(전진) 프라이머, 역방향 돌연변이유발 프라이머, 전진 돌연변이유발 프라이머(통상적으로 역방향 돌연변이유발 프라이머에 대하여 상보적임)와 3' (역방향) 프라이머를 사용하여 Epo 또는 Epo 유사체 주형 DNA 에 대해 두 반응(PCR1 및 PCR2)을 수행한다. 돌연변이유발 프라이머는 원하는 뉴클레오티드 치환은 물론 이들 치환체의 양 끝에 6 - 14 의 정확히 부합되는 뉴클레오티드를 함유한다. PCR1 은 5'(전진) 프라이머와 역방향 돌연변이유발 프라이머를 사용한다. PCR2 는 3'(역방향) 프라이머와 전진 돌연변이유발 프라이머를 사용한다. 증폭된 DNA 단편은 아가로스 겔 전기영동으로 분리한다. 정확한 크기의 DNA 단편을 함유하는 아가로스 소편은 겔로부터 취한다. PCR1 과 PCR2 에서 수득한 DNA 단편을 함께 조합하고, 5' 전진 및 3' 역방향 프라이머만을 사용하여 제 3 PCR 반응을 행한다. 원하는 돌연변이체를 갖는 전장 DNA 세그멘트가 증폭된다. 몇몇 경우에, 두 개 또는 세 개의 돌연변이체는 동일한 PCR 방법을 사용하여, 이미 치환을 내포하는 DNA 에 새로운 치환을 도입하여 조합한다. 이들 다수의 글리코실화 부위 유사체를 구성하기 위하여, 단일, 이중 또는 삼중 부위 유사체(상술한 바와 같이 제조)를 PCR 주형으로 사용하고, 적당한 프라이머에 부위 특이 돌연변이유발에 의하여 부가적 글리코실화를 도입한다.

Epo 유사체 N51, N52 및 N53 은 중첩 PCR(중합효소 연쇄 반응) 방법 1 에 의하여 구성한다. 각 부가적 N - 글리코실화 부위를 각 경우에 도입한다. N56 은 PCR 주형으로 PDSRα2 Epo 를 사용하여 글리코실화 부위(N114 T116)를 미변성 서열 HuEpo 에 부가시키고, N51 은 pDSRα2 Epo N47 주형(Asn30, Thr32, Val87, Asn88, Thr90)을 사용하여 O - 결합 글리코실화 부위(Thr125)를 N47 Epo 에 부가시키고, 유사체 N59 는 글리코실화 부위(Asn53)를 pDSRα2 Epo N47 주형을 사용하여 글리코실화 부위를 부가시킨다.

방법 1 의 중합효소 연쇄 반응은 Cheng 등의[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 5695 (1994)]에서 나온 원안을 사용하여 행한다. 3'(역방향) 프라이머는 Xba I 제한 부위 다음에 종지 코돈을 도입한 서열을 함유한다 :

5' 전진 반응 프라이머 :

는 Epo 개시 코돈(ATG)의 코자크 서열 상류 다음에 Hind III 제한 부위를 갖는다. 일반적으로 PCR 반응 혼합물은 각 4 ㎕ 의 전진 및 역방향 프라이머(5 pmol/㎕), 1㎕ 주형(25 ng), 10 ㎕ 의 5 X LP 완충액(100 mM 트리신 pH 8.7/25 % 글리세롤/425 mM KOAc), 10 ㎕ dNTP 주(각 1 mM 의 dATP, dTTP, dCTP, dGTP), 0.8 ㎕ rtTh 중합효소(퍼킨 엘머 ; 2.5 U/㎕)와 2 ㎕ 의 벤트 중합효소(NEB ; 1 X LP 완충액으로 1 : 100 으로 새롭게 희석한 후 0.01 U/㎕) 를 함유한다. H₂O 를 첨가하여 최종 부피가 50 ㎕ 가 되게 한다. 모든 성분을 표시된 순서로 함께 첨가하고 1 ㎕ 의 50 mM MgOAc 를 가하여 첫번째 순환하는 동안 온도가 60 ℃ 이상될 때 PCR 을시작한다. 대표적 반응 조건은 94 ℃ 에서 10 초, 50 ℃ 에서 1 분, 68 ℃ 에서 5 분씩 2 주기 후에 94 ℃ 에서 10 초, 55 ℃ 에서 1 분, 68 ℃ 에서 5 분씩 25 주기이다. 증폭된 단편은 아가로스 겔 전기영동에 의하여 분리하고 정확한 크기의 DNA 단편을 제조자(바이오 101, 인코포레이티드) 에 의하여 공급된 Geneclean^(R)키트와 공정을 사용하여 정제한다. 정제된 DNA 를 Hind III 과 Xba I 로 절단한 다음, 이를 Geneclean^(R)키트를 사용하여 다시 정제한다. 단편을 Hind III 및 XbaI 으로 절단한 pDSRα2 벡터에 결찰시킨다. 결찰된 DNA 를 운반체 tRNA 의 존재하에여 0.3 NaOAc pH 5.2 에서 2 부피의 에탄올에 침전시키고 E. coli 내로 형질전환시킨다. Epo 유사체를 DNA 미니프렙에서 제한 절단에 의하여 선별한다. 양성 클론에서 수득한 플라스미드를 제조한 다음 삽입물을 배열하여 원하는 돌연변이의 존재를 확인하고 부가적 아미노산 치환이 도입되지 않았음을 확인하였다.

pDSRα2 는 다음 세 가지를 변형시킨 플라스미드 pCD(Okayama & Berg, Mol. Cell Biol. 3 : 280 - 289, 1983 참조)의 유도체이다 : (i) SV40 폴리아데닐화 시그널을 소 난포자극호르몬의 α- 소단위체, α- 소단위체, α- bFSH(Goodwin 등의, Nucleic Acids Res. 11 : 6873 - 6882, 1983 참조)로부터의 시그널과 대체하였다 ; (ii) 마우스의 디히드로엽산 환원 효소미니유전자(Minigene)(Gasser 등의, Proc. Natl. Acad. Sci. 79 : 6522 - 6526, 1982 참조)를 발현 카세트 하류에 삽입하여 형질전환체가 선택되고 증폭되도록 하였다 ; (iii) 인체 T-세포 백혈병 바이러스 제 I 형(HTLV-I) 의 긴 말단 반복체(LTR) 의 "U5" 서열의 부분 및 "R-요소"를 함유하는 267 bp 단편을 클로닝하고 SV40 프로모터와 Takebe 등의, Mol. Cell Biol. 8 : 466 - 472, 1988 에 기술된 접합 시그널 사이에 삽입하였다.

상기 플라스미드 pCD 는 Okayama & Berg, Mol. Cell Biol. 3 : 280 - 289, 1983 문헌에 기술되어 있는 바와 같이 다음 세 단편을 T4 DNA 리가제와 함께 결합시킴으로써 제조할 수 있다 : pBR322 ori 및 Amp^R을 함유하는, pCDV1(미국 위스콘신 53205 매킨리 애비뉴 1037 에 소재하는 피-엘 바이오케미컬스 인코포레이티드에서 수득)으로부터의 HindIII-BamHI 거대 단편, SV40 시발 부위 프로모터 및 후기 부위 인트론을 함유하는, pL1(미국 위스콘신 53205 매킨리 애비뉴 1037 에 소재하는 피-엘 바이오 케미컬스 인코포레이티드에서 수득)으로부터의 HindIII-Pst I 단편 및 전체 DHFR 단백질 암호화 서열(dhfr cDNA)을 함유하는 Pst I-BglII 단편이나 아니면 전체 길이의 α-글로빈 cDNA 분절을 함유하는 PstI - BamHI 단편.

중첩 PCR 방법 2 를 사용하여 유사체 N54 내지 N61 을 구성한다. 3' (역방향) 프라이머는 XbaI 제한 부위 다음에 종지 코돈을 도입한 서열을 함유한다:

.

5' 전진 반응 프라이머 :

는 Epo 개시 코돈(ATG)의 코자크 서열 상류 다음에 Hind III 제한 부위를 갖는다. 퍼킨 엘머 UlTma DNA 중합 효소와 동반 시약 ; 10 ㎕ 10 X PCR 완충액, 3 ㎕ 1 mM dNTPs, 5 pmol 의 각 프라이머와 100 ㎕ 최종 부피의 물을 이용하여 높은 적합도의 PCR 을 행한다. PCR 혼합물이 94 ℃ 에 도달한 후 0.5 유니트의 UlTma 중합효소를 가한다. PCR 반응을 30 초 동안 94 ℃, 30 초 동안 50 ℃, 90 초 동안 72 ℃ 에서 5 주기 행한 다음, 30 초 동안 94 ℃, 90 초 동안 72 ℃ 에서 다음의 25 주기를 행한다. 전기영동 후에 정확한 크기의 생성물 밴드를 아가로스 겔에서 절개하였다.

각 유사체에서 대한 PCR 생성물을 Qiagen 겔 추출 키트를 사용하여 세척한다. 1 시간 동안 37 ℃ 에서, Hind III 와 XbaI 제한 효소(뵈링거 맨하임에서 입수)를 이용한 100 ㎕ 제한 절단으로 정제된 DNA 를 절단한다. 절단물을 다시 겔 정제시키고 절단된 단편을 Hind III 및 XbaI 절단 pDSRα2 벡터 내로 결찰시켰다.

결찰된 DNA 를 운반체 tRNA 의 존재하에 0.3 M NaOAc pH 5.2 로 2 부피의 에탄올에 침전시키고 E. coli 내로 형질전환시킨다. 처음에는 콜로니 PCR 에 의해 Epo 유사체를 선별하여 정확한 크기의 DNA 삽입물 형을 함유하는 클론을 동정한다. 이러한 공정으로, 플라스미드를 함유하는 세포를 Epo 전진 및 역방향 프라이머의 존재하에 PCR 관에 놓는다. 상술한 반응 조건을 사용하여 혼합물에 대한 PCR 을 실시한다. 양성 클론에서 수득한 플라스미드를 제조한 다음 Epo 유사체 삽입물을 배열하여 원하는 돌연변이의 존재를 확인하고 부가적 아미노산 치환이 도입되지 않았음을 확인한다.

탄수화물 부가의 분석

발현 벡터에 삽입된 고글리코실화 Epo 유사체 구조물을 COS 세포내로 트랜스펙션한다. 트랜스펙션된 COS 세포(ATCC 제 CRL-1561 호)에서 나온 상청액을 웨스턴 블롯으로 분석하여 발현되고 분비된 Epo 유사체가 부가적 탄수화물을 함유하는지 여부를 측정한다. 시료를 SDS - PAGE겔의 웰에 직접 넣은 다음 단클론 항체, PG8A(Elliott 등의 (1996) Blood 87 : p2714) 를 사용하여 임뮤노블로트에 의하여 분석한다. 유사체 시료의 이동도를 rHuEpo를 함유하는 시료의 이동도와 비교한다. 도 1 은 유사체 N4(4 개의 탄수화물 쇄)와 N47(5 개의 탄수화물 쇄)과 비교한 유사체 N53 과 N61 의 이동도 감소를 나타낸다. 이동도는 유사체 N53 의 6 개의 탄수화물 쇄와 유사체 N61 의 7 개의 탄수화물 쇄의 존재와 일치한다. 모든 고글리코실화 유사체의 데이타는 표 2 에 표시했다.

시험관내 생물학적 검정

rHuEpo 또는 유사체를 발현시키는 COS 또는 CHO 세포에 의하여 조정된 배지는 UT7-Epo 세포에 의하여 3H - 티미딘 흡수를 자극하여 검정한다.(Komatsu 등, Blood 82, 456). UT7 - Epo 세포는 Epo 에 반응하고 그들의 세포 표면에서 사람 Epo 수용체를 발현시킨다. UT7-Epo 세포는 약 3 X 10⁵세포/ml로 성장 배지 (L-글루타민, 25 mM HEPES 완충액 및 3024 mg/l 의 중탄산 나트륨은 함유하지만, 알파-티오글리세롤 또는 베타 - 머캅토에탄올(GIBCO)/10 % v/v 우태아 혈청/1 % v/v L-글루타민-페니실린-스트렙토마이신 용액(이르빈 사이언티픽)/1 유니트/ml rHuEpo 는 함유하지 않는 1 X 이스코브 변형 둘베코 배지)에서 성장된다. 세포를원심분리(약 500 x G)하여 수집하고 인산완충식염수로 2 회 세척한 후, 검정 배지(L - 글루타민 (Gibco)/1 % L - 글루타민/4 % 우태아 혈청을 함유하지 않는 1 X RPMI 배지 1640)에 5 X 10⁴세포/ml 로 재현탁시킨다. 최소한 5 - 배로 검정 배지로 희석시킨 100 ㎕ 의 시험 시료 또는 Epo 표준(rHuEpo)를 96 웰 마이크로 플레이트의 웰에 첨가한다. 50 ㎕ 의 현탁된 세포를 가한 다음(5000 세포/웰) 플레이트를 37 ℃ 및 5 % CO₂하에 가습 배양기에서 배양한다. 72 시간후, 검정 배지로 1 : 100 희석된 50 ㎕ 메틸 -³H-티미딘(1 mCi/ml ; 20 Ci/mMole) 을 가한다. 세포를 37 ℃ 및 5 % CO₂에서 4 시간 더 배양한다. 표지된 세포를 유리섬유 필터매트에 수확하고, 탈염수로 세척한 다음 2 - 프로판올로 세척하고, 건조한 후 측정한다. 활성도는 각 유사체에 대하여 측정한 반응과 표준 rHuEpo 의 반응을 비교하여 측정한다. 생물학적 비활성도는 시험관내 활성도를 면역 검정에 의하여 측정된 각 유사체의 농도로 나눔으로써 결정된다[Elliot 등의 (1996) Blood 87 : p2714]. 그 결과는 하기 표 2 에 표시했다.

실시예 2

재조합 사람 에리트로포이에틴과

고글리코실화 에리트로포이에틴 유사체의 제조

본원에 기재된 실험에 사용하는 재조합 사람 에리트로포이에틴 (rHuEpo)을 사람 에리트로포이에틴 유전자를 운반하는 재조합 플라스미드로 트랜스펙션된 차이니스 햄스터 난소(CHO) 세포(ATCC 제 CCL - 61 호)로 발현시킨다. 재조합 생성물을 조정 배지에서 회수하고 상기 Lai 등에 의하여 기술된 바와 같이 정제한다. 생성된 rHuEpo 제제는 등전점 전기영동에 의하여 측정된 9 ∼ 14 시알산의 이소형을 주로 갖는다.

본원에 참고적으로 혼입되어 있는 WO 91/05867 과 WO 94/09257 에 기재되어 있는 Epo 유사체 유전자를 운반하는 재조합 플라스미드로 트랜스펙션 된 CHO 세포에서 재조합 고글리코실화 에리트로포이에틴 유사체를 발현시킨다. 고글리코실화 유사체는 하기한 바와 같이 배양 상청액으로 정제된다.

조정된 배지의 농도와 완전여과

트랜스펙션된 CHO 세포주의 세 가지 연속 수확물(각 5 ∼ 8 일)에서 나온 조정 배지(무혈청)를 수집하고, 0.45 ㎛ 필터로 여과하여 약 30 배로 농축한 후 10000 분자량 차단막을 갖는 접선-유동 한외거름 장치(밀리포어)를 사용하여 10 mM 트리스, 20 μM CuSO₄, pH 7.0 으로 완전여과한다. 완전여과된 배지(DFM)를 2 회 여과하고(0.45 ㎛) 정제에 사용할 때까지 -20 ℃ 에서 저장한다.

정제

모든 공정은 2 ∼ 8 ℃ 에서 행한다.

음이온 - 교환 크로마토그래피(1 Q)

청정화된 DFM 을 10 mM 비스 트리스 프로판(BTP) pH 7.0 으로 평형화된 Q - 세파로스 고속 유동 컬럼(파마시아, 6 cm X 18 cm) 에 가하고 2 컬럼 부피의 10 mM BTP 로 세척하여 모든 비 - 결합 종을 용리한다. 고글리코실화 유사체가 넷, 다섯 또는 여섯 개의 N - 결합 탄수화물 쇄를 갖는지 여부에 따라 다음 구배를 조작한다. 이 단계에 사용된 모든 완충액은 1 mM 글리신, 20 μM CuSO₄, 6 M 요소, 5 ㎍/ml 류펩틴과 1 ㎍/ml 펩스타틴을 함유한다. 4 개의 N - 결합 탄수화물 쇄를 갖는 유사체에 있어서, 구배는 2 컬럼 부피가 높은 염 조건에서 유지되는 49 이상의 컬럼 부피로 10 mM 초산, 0.1 mM NaCl 내지 500 mM 초산, 5 mM NaCl 로 행한다. 5 개의 N - 결합 탄수화물 쇄를 갖는 유사체에 있어서, 구배는 2 컬럼 부피가 높은 열 조건에서 유지되는 30 이상의 컬럼 부피로 0.7 M 초산, 7 mM NaCl 내지 1.0 M 초산, 12 mM NaCl 로 행한다. 6 개의 N-결합 탄수화물 쇄를 갖는 유사체에 있어서, 구배는 2 컬럼 부피가 높은 염 조건에서 유지되는 50 이상의 컬럼 부피로 1.0 M 초산, 10 mM NaCl 내지 1.5 M 초산, 20 mM NaCl 로 행한다. 구배한 다음, 컬럼을 2 컬럼 부피의 10 mM BTP, pH 7.0 으로 세척하고 높은 이소형 분획을 0.6 M NaCl, 100 mM BTP, pH 7.0 으로 용리한다.

역상 크로마토크래피(C4)

Q - 세파로스 컬럼(1Q) 에서 나온 높은 염 스트립을 20 % 에탄올.10 mM BTP, pH 7.0 으로 평형화된 바이닥 C4 역상 컬럼(30 μ 입자 4 cm X 18 cm)에 사용하고 10 mM BTP, pH 7.0 으로 완충된 44 % 에탄올로 30 컬럼 부피를 갖는 컬럼에서 용리한다. 약 60 % 에탄올로 용리한, 푸울된 최고 생성물을 4 부피의 10 mM BTP, pH 7.0 으로 희석하여 에탄올 존재하에서 응집 가능성을 최소화한다.

음이온 - 교환 크로마토그래피(2Q)

역상 컬럼에서 나온 희석된 용리액을 10 mM BTP, pH 7.0 으로 평형화된 제 2 Q - 세파로스 고속 유동 컬럼(파마시아, 3 cm X 9 cm) 에 사용한다. 컬럼을 평형화 완충액으로 세척하고, 고글리코실화 Epo 유사체를 0.6 M 염화나트륨, 20 mM 시트르산나트륨, pH 6.0 으로 용리한다.

정제된 단백질을 센트리콘 (10,000 분자량 차단)을 통하여 20 mM NaPO₄, pH 6.0, 140 mM NaCl 로 교환한 다음 0.2 ㎛ 필터로 통과시키고 2 - 8 ℃ 에서 저장한다.

실시예 3

네 개, 다섯 개, 여섯 개의 N - 결합 탄수화물 쇄를 함유하는 rHuEpo 와 rHuEpo 유사체의 생체내 생물학적 활성도

네 개, 다섯 개, 여섯 개의 N - 결합 탄수화물 쇄를 함유하는 Epo 유사체의 생체내 활성도를 외생 저산소 적혈구 증가증의 마우스 생물학적 검정에서 rHuEpo 의 활성도와 비교한다. 이러한 검정은 외인성 - 투여 시험 시료의 반응에 따라 마우스의 적혈구 형성 증가를 측정하여 새로이 합성된 적혈구에⁵⁹Fe 의 혼합량을 나타낸다. 하기 서술한 바와 같이 실행하는 검정은 Cotes 및 Bangham 의[Nature 191, 1065 (1961)]의 방법을 변형한 것이다.

이 검정에서, 암컷 BDF 마우스를 먼저 14 일간 일일 약 18 시간 동안 저기압실(0.4 - 0.5 atm.) 의 저산소 상태에 노출시켜서 미리 조절한다. 저산소 상태를 보충하기 위하여 마우스를 적혈구 형성 자극으로 반응시켜서 적혈구의 수를 증가시키므로써 상대적인 산소 - 운반 용량을 증가시킨다. 최종 저기압 노출을 완료한 후, 복강내 주사에 의한 시험 시료를 투여하기 전에 마우스를 약 72 시간 동안 주변 압력하에 둔다. 주변 압력에서 마우스는 상대적으로 적혈구증가를 나타내었고, 내인성 에리트로포이에틴 생성과 적혈구 형성 속도가 감소하는 반응을 나타낸다. 시료 투여 후 5 일째에, 0.2 - 0.3 μCi 의⁵⁹FeCl₃0.2 ml 를 꼬리 정맥에 주사한다. 48 시간 후, 동물을 희생시켜 시험 시료에 의해 일어나는 적혈구형성의 증가는 전체 혈액 중 0.5 ml 시료에 혼합되는⁵⁹Fe 의 양을 계산하여 측정한다.

네 개, 다섯 개 또는 여섯 개의 N - 결합 탄수화물 쇄를 함유하는, rHuEpo 와 다섯 개의 다른 Epo 유사체를 이러한 검정으로 시험할 때 얻은 결과의 예는 도 3 에 표시했다. 각 시료를 적당한 농도 범위내의 여섯 또는 일곱 가지 다른 희석물에서 검정한다. 모든 시료를 0.5 % 소 혈청 알부민을 함유하는 인산완충식염수로 희석하고, 0.4 ml 의 각 희석물을 다섯 마리의 미리 조정된 마우스에 투여한다.⁵⁹Fe 투여 48 시간 후, 감마 카운팅에 의하여 0.5 ml 의 혈액에 혼합된 양을 측정한다. 각 시료의 결과는 혼합된⁵⁹Fe 퍼센트 대 투여된 투약량의 로그로 표시한다.

도 3 에 표시된 바와 같이, 이 검정에서 시험한 다섯 가지 고글리코실화 Epo 유사체 모두는 rHuEpo 보다 더 우수했다. 더불어, 각 유사체의 효능은 N - 결합 탄수화물 쇄의 수에 직접 따르고, 증가된 수의 탄수화물 쇄를 갖는 유사체는 더 큰 활성을 갖는다. 따라서, 여섯 개의 N - 결합 탄수화물 쇄를 함유하는 유사체 N53 은 가장 큰 효능을 갖는 유사체이다. 다섯 개의 N - 결합 탄수화물 쇄를 함유하는 유사체 N47 은 다음으로 4 개의 N - 결합 쇄를 함유하는 유사체보다 더 큰 효능을 갖는다. 4 개의 N - 결합 탄수화물 쇄를 함유하는 세 유사체(N4, N18 과 N50) 의 효능은 서로 거의 동일하거나 rHuEpo 보다 더 크다.

이 실험에서 40 %⁵⁹Fe 혼합을 이루는 데 필요한 네 개, 다섯 개 또는 여섯 개의 N - 결합 탄수화물 쇄를 함유하는 유사체와 rHuEpo 의 투약량은 각각 10,700 ng, 640 ng, 140 ng 및 38 ng 이다. 이러한 적혈구형성 수준을 만드는 데 필요한 물질의 양을 기초로 할 때, 네 개, 다 섯 개 또는 여섯 개의 N - 결합 탄수화물 쇄를 함유하는 유사체는 rHuEpo 보다 17 - 배, 77-배 및 280 - 배 더 큰 효능을 갖는다.

실시예 4

랫과 비글 개에서 rHuEpo 및 Epo 유사체 N47 의 IV 약물동태학

랫과 개를 두가지 분리 연구를 실행하여 Epo N47 유사체와 rHuEpo 의 약물동태학적 파라미터를 비교한다.

랫의 연구에 있어, 1 μCi(∼ 0.1 ㎍ 의 펩티드/kg)의¹²⁵I-Epo N47유사체 또는¹²⁵I - 재조합 사람 에리트로포이에틴(아머샴)을 314 ∼ 363 g 의 체중을 갖는 숫컷 정상 스프래그 - 돌레이 랫에 외과적으로 이식한 경동맥 캐뉼라에 정맥 주사한다. 투여 후 여러가지 시간점에서, 0.3 ml 의 혈액을 수집하고 혈청을 원심분리하여 제조한다. 0.1 ml 의 각 혈청 시료에서¹²⁵I-rHuEpo 또는¹²⁵I Epo N47 유사체의 수준을 90 % 에탄올로 하룻밤 4 ℃ 에서 배양한 다음 측정한다. 각 혈청 시료의 에탄올 -침전 단백질을 원심분리하여 수집하고 감마 카운터로 방사능을 측정한다. 수득한 혈청 농도 대 시간의 약물동태학적 곡선은 도 4 에 표시했다. 각 점은 N47 유사체 그룹의 다섯 마리 랫과 rHuEpo 그룹의 여섯 마리 랫의 그룹 평균을 나타낸다. 약물동태학적 파라미터는 PCNONL1N 4.0 비선형 회귀 분석(Statistical Consulants, 1992)을 사용하여 각 마우스 대하여 측정하고 각 그룹의 결과를 평균을 낸다. 그 결과는 표 3 에 표시했다.

개의 연구에서, 7.8 - 9.5 kg 의 체중을 갖는 비글 개의 두부 정맥에 ∼ 29 μCi 의¹²⁵I-rHuEpo 또는¹²⁵I-N47(∼0.1 ㎍ 펩티드/kg) 을 농축괴 정맥 주사한다. 24 시간 투여 후 여러 시간점에서, 약 1 ∼ 2 ml 의 혈액을 수집하여 혈청을 제조한다. 0.1 ml 의 혈청에서¹²⁵I-rHuEpo 와¹²⁵I-N47 의 농도를 측정하고 상술한 바와 같이 약물동태학적 파라미터를 계산한다. 개에 대한 혈청 농도 대 시간 약물동태학적 곡선은 도 5 에 표시했다. 시간점은 각 그룹에서 두 동물의 그룹 평균이다. 약물동태학적 파라미터는 표 4 에 요약했다.

두 랫과 개의 연구에서 rHuEpo 및 Epo N47 유사체는 이상 혈청 청소율을 나타낸다. 랫의 청소율은 Epo N47 유사체에서보다 rHuEpo 에서 약 3.7 - 배 더 빨랐고 β-반감기는 rHuEpo 에서보다 Epo N47 유사체에서 약 2.8 배 더 길었다. 개 연구에서 약물동태학적 파라미터는 일반적으로 랫에서 관찰된 것과 일치했다. 개에서, rHuEpo 의 청소율은 Epo N47 유사체에서보다 3.5 - 배 더 빨랐고 β - 반감기는 rHuEpo 와 비교하여 Epo N47 유사체가 3.5 - 배 더 길었다.

실시예 5

rHuEpo 와 Epo 유사체 N47 의 투여 후 헤마토크리트의 투약 반응

주당 3 회(TIW)에서 헤마토크리트 투약 반응 연구

정상 마우스에 6 주 이하 동안 주당 3 회 복강내 또는 정맥내 주사하여 투약 범위를 정한 후 rHuEpo 와 Epo 유사체 N47 의 생체내 생물학적 효과를 비교한다. 헤마토크리트 결정은 레트로-궤도 출혈에 의하여 주 2 회 행한다.

약 30 g 의 체중을 갖는 정상 CD1 마우스(그룹당 10 ∼ 13 마우스)에 rHuEpo(0.625 ∼ 10 ㎍ 펩티드/kg/투약량의 투약 범위 이상), Epo N47 유사체(0.156 - 1.25 ㎍ 펩티드/kg/ 투약량의 투약 범위 이상) 또는 부형제 대조를 전체 6 주동안 주당 3 회 복강내 주사한다. 여러가지 rHuEpo 와 Epo N47 유사체 투약 제제용 부형제 대조와 희석제는 0.025 % 마우스 혈청 알부민을 함유하는, 인산완충식염수(PBS) 이다. 모든 마우스의 헤마토크리트는 기준선에서 레트로-궤도 출혈 후 주 2 회 측정한다. 실험 종료시에, 모든 동물에서 나온 혈청을 수집하여 방사면역 침전 검정법에 의하여 주사한 생성물에 대한 항체를 검정한다. 중화 항체에 대하여 음성으로 판단되는 동물에서 나온 헤마토크리트 데이타는 다음 분석에 사용한다.

도 6 에 표시된 바와 같이 N47 유사체가 주어진 농도에서 rHuEpo 와 비교하여 더 큰헤마토크리트의 증가를 촉진하지만, 두 rHuEpo 와 Epo N47 유사체는 6 주 연구에서 투약-의존형 헤마토크리트 증가를 나타낸다.이 실험에서, Epo N47 유사체는 복강내 주사에 의하여 주당 3 회 투약했을 때 약 3 ∼ 4 배 이상의 효능을 갖는다.

rHuEpo 와 유사체 N47 의 투약 반응 연구는 복강내 주사에서와 유사한 공정을 사용하여 주당 3 회 정맥 주사하여 행한다. 수득한 결과는 복강내 투여시와 유사했으며, 특히 이 연구에서 주당 3 회 투여했을 때 rHuEpo 보다 더 큰 효능을 가짐을 확인했다.

정상 마우스의 헤마토크리트를 상승시키는 rHuEpo 와 Epo N47 유사체의 생물학적 활성을 더 잘 비교하고 정량하기 위하여, 실험 결과를 상대 효능 플로트로 분석한다. 각 실험에 있어, 각 투약량에서 rHuEpo 또는 N47 유사체의 활성도는 사다리꼴 집적에 의한 첫번째 연구 38 일 이상에서 헤마토크리트 증가를 합계하여 측정하여서 곡선하면적(AUC)을 얻는다. 이것은 ㎍ 펩티드/kg/주의 로그 투약량에 대비하여 계획된 것이다. 동일한 또는 다른 투약 방법이나 투약 빈도에 의하여 투여되는 화합물 사이의 효능 차이는 관련된 로그 - 투약 반응선 사이의 거리를 측정하여 결정할 수 있다. 도 7 은 상이한 두 방법(복강내와 정맥내)및 상이한 두 투약 계획으로 투여하여 rHuEpo 와 Epo N47 유사체의 활성도를 비교하여 실행한 모든 실험의 상대 효능 데이타를 요약한 것이다.

도 7 에 표시된 바와 같이, Epo N47 유사체를 주당 3 회 투여하면, 정맥내 또는 복강내 경로로 주사했을 때 동일한 효능을 가지고 주 3 회 복강내 주사한 rHuEpo 보다 3.6 - 배 이상의 효능을 갖는다.

주당 일회(QW) 에서의 헤마토크리트 투약 반응 연구

정상 마우스에서 헤마토크리트 증가에 있어 rHuEpo 와 Epo 유사체 N47 의 비교는 6 주동안 복강내 또는 정맥내 투여 방법으로 매주 일회 투여하여 행한다.

0.025 % 마우스 혈청 알부민을 함유하는 PBS 에서 제조된 여러가지 농도의 rHuEpo 또는 Epo N47 유사체 또는 부형제 대조(0.025 % 마우스 혈청 알부민을 갖는 PBS)를 전체 6 주동안 매주 한번 약 30 g 의 체중을 갖는 정상 CD1 마우스에 정맥 주사한다. 유사체 투약량은 6.25 ∼ 25 ㎍ 의 펩티드/kg/투약량의 범위를 갖고 rHuEpo 의 투약량은 25 ∼ 200 ㎍/kg/ 투약량의 범위를 갖는다. 모든 마우스의 헤마토크리트는 레트로-궤도 출혈 후 주 2 회 기준선에서 측정한다. 실험 종료시에 모든 동물에서 수득한 혈청을 수집하여 용액 방사면역 침전에 의하여 주사된 생성물에 대한 항체를 검정한다. 중화 항체에 대하여 음성으로 판단되는 동물에서 수득한 데이타는 다음 분석에 사용한다.

도 8 에 표시된 바와 같이, 두 rHuEpo 와 유사체 N47 은 주 1 회 투여했을 때 정상 마우스의 헤마토크리트를 증가시킬 수 있는 반면에, 반응을 나타내는 데 필요한 rHuEpo 의 투약량은 유사체 N47 에서보다도 현저하게 더 크다. 예를들면, 이 실험에서 25 ㎍ 펩티드/kg/주의 N47 은 6 주에 41.2 포인트까지 마우스의 헤마토크리트를 증가시킨 반면에, 동일한 투약량의 rHuEpo 는 단지 12.5 포인트의 헤마토크리트 상승만을 나타냈다.

상술한 것과 유사한 공정을 사용하여, 매주 1 회 복강내 주사하여 rHuEpo 와 유사체 N47 의 투약 반응 연구를 행한다. 얻은 결과는 정맥 투여한 결과와 일치했고 주당 1 회 투여했을 때의 rHuEpo 와 비교했을 때 유사체 N47 이 더 큰 효능을 갖는 것을 더 확인했다.

rHuEpo 와 N47 유사체 사이의 활성도 차이를 측정하기 위하여, 각각을 매주 1 회 투약했을 때 상대 효능 플로트는 상술한 바와 같이 모든 관련된 실험에서 나왔다. 도 7 에 표시된 바와 같이, 유사체 N47 을 주당 1 회 투여하면, 정맥내 및 복강내 경로로 주사했을 때와 동일한 효능을 갖는다. 유사체 N47 은 각각 매주 1 회 투여했을때 rHuEpo 보다 약 14 - 배 더 많은 효능이 있다.

더불어, 도 6 에서 로그 - 투약 반응 플로트를 다음과 같이 예시한다 : (1) 매주 일회(QW) 투여되는 유사체 N47 의 주어진 투약량은 3 회 분할한 투약량(TIW)으로 주어진 rHuEpo 의 동일한 전체 주 투약량과 거의 같은 효과를 갖는다 ; (2) 매주 일회(QW) 투여되는 rHuEpo 의 주어진 투약량은 3 회 분할한 투약량(TIW) 으로서 주어진 유사체 N47 의 동일한 전체 주 투약량으로 단지 약 2 % 효과 뿐이다 ; (3) 유사체 N47 은 QW 와 비교되는 TIW 로 투여했을 때 마우스에서 약 4 -배 이상의 효능을 나타낸다.

격주(EQW)에서의 헤마토크리트 투약 반응 연구

실험을 행하여 격주로 1 회 투여했을 때 마우스의 헤마토크리트가 증가하는 유사체 N47 의 능력을 평가한다. 0.025 % 마우스 혈청 알부민을 함유하는 PBS 로 제조한 여러가지 농도의 Epo N47 유사체를 전체 약 6 주동안 매주 1 회 또는 격주로 1 회 정상 CD-1 마우스(그룹당 10 마우스)에 정맥 주사한다. 200, 100 또는 25 ㎍/kg/투약량을 격주로 또는 12.5 ㎍/kg/투약량을 매주 1 회씩 유사체 N47 을 투여한다. 모든 마우스의 헤마토크리트는 기준선에서 테트로 - 궤도 출혈 후 주 2 회 측정한다.

도 9 에 표시된 바와 같이, 유사체 N47 을 2 개월마다 투여했을 때도 투약 - 의존형의 정상 마우스의 헤마토크리트를 증가시킬 수 있다.더 적은 빈도로 투약했을 때 예상되는 바와 같이 헤마토크리트를 증가시키는 데 더 큰 양의 N47 유사체를 필요로 한다. 격주로 투여한 200 ㎍/kg 의 N47 유사체 투약량은 6 주동안 12.5 ㎍/kg 을 매주 투약했을 때와 거의 동일한 정도까지 헤마토크리트를 증가시킨다.

실시예 6

연속 보행 복막 투석(CAPD) 환자에서의

Epo N47 유사체와 rHuEpo 의 IV 약물동태학

랫과 비글 개에서 rHuEpo 와 비교하여, Epo N47 유사체의 혈청 반감기가 현저하게 증가하는 것을 볼 때, 증가가 사람에게서 관찰될 수 있는지 여부를 측정하는 것이 유익하다. 11 인의 안정한 CAPD 환자(남성 7, 여성 4, 나이 27 - 75 세) 의 이중 - 맹검, 무작위 교차 계획 연구를 행한다. 한 환자 그룹에 100 U/kg 의 rHuEpo(0.5 ㎍ 의 펩티드/kg 과 등가)를 투여하고 제 2 환자 그룹에 0.5 ㎍ 펩티드/kg 의 Epo N47 유사체를 투여하고, 둘 모두 단일 농축괴 정맥 주사로 투여한다. 정맥 혈액 시료(3 ml) 를 내포하는 캐뉼라를 통하여 흡입하여 농축괴 정맥 주사 후 5, 10, 15, 30 분과 1, 2, 5, 8, 12, 16, 24, 30, 36, 48, 60, 72 와 96 시간에 사전 - 투약을 취한다. 28 일의 세척 기간 후, 제 1 환자 그룹에 단일 정맥내 투약량의 Epo 유사체 N47 을 투여하고 제 2 그룹에 단일정맥내 투여량의 rHuEpo 를 투여한다. 혈액 시료를 제 1 치료 주기에서와 같이 취한다. 기준선 내인성 Epo 수준을 공제한 후 EL1SA 에 의하여 혈청에서 rHuEpo 와 Epo N47 유사체의 수준을 측정한다. 교차 계획 효과를 조정한 후 평가된 약물동태학적 파라미터(평균 ± SE) 를 표 5 에 표시했다. 선형 사다리꼴 집적을 사용하여 혈청 농도 AUC 를 계산한다. t1/2_Z는 다음과 같이 정의된다 : log(2)/K_z, 여기서 K_Z는 In(혈청 농도) 시간 곡선의 말단 부분의 경사로 계산된다. 청소율(C1)은 다음과 같이 정의한다 : 투약량/AUC, 분포의 부피(V_a)는 다음과 같이 정의한다: Cl/K.

Epo N47 유사체의 평균 혈청 반감기(25.3 시간)는 rHuEpo 에서보다 3 배 더 길고(8.5 시간), 청소율은 유사체 N47 에서보다 rHuEpo 에서 2.5 배 더 빨랐다.

실시예 7

Epo N47 유사체의 제 II 단계 투약 소견과 투약 계획 연구

다중심, 무작위, 연속 투약량 - 점증 연구를 시작하여 투석을 받는 CRF 환자에게 피하 또는 정맥 주사로 투여했을 때의 유사체 N47 의 최적 투약량과 투약 계획을 연구하는 것이다.

투약 계획은 다음과 같다 :

주당 1 회 투약: 0.075, 0.225, 0.45, 0.75, 1.5 및 4.5 ㎍ 의

펩티드/kg/투약량.

주당 3 회 투약: 0.025, 0.075, 0.015, 0.25, 0.5 및 1.5 ㎍ 의 펩티드/kg/투약량.

연구를 두 부분으로 행한다. 첫째 부분은 4 주 이상 동안 최적의 속도로 헤모글로빈이 증가하는 주당 1 회 또는 3 회로 주어진 유사체 N47 의 투약량(1 g/dL) 이거나 그 이상으로, 3 g/dL 이하이다)을 평가하기 위하여 계획된 투약량 - 점증 연구이다. 각 연구의 둘째 부분은 치료적 목표로 헤마토크리트를 유지하는 데 요구되는 투약량(정맥 또는 피하 투여 방법으로 매주 1 회 또는 3 회 투여했을 때)을 측정하기 위하여 계획된 것이다.

예비 결과는 빈혈 CRF 환자의 헤마토크리트를 증가시켜서 유지하는 데 유사체 N47 을 매주 1 회 투약량으로 사용할 수 있음을 나타낸다. 최초 결과는 두 투여 방법에 있어 주 3 회 투약 계획으로 치료를 시작하는데 바람직한 투약량은 0.15 및 0.25 ㎍ 펩티드/kg/투약량이고, 주당 1 회 투약 계획으로 하는 투약량은 0.45 및 0.75 ㎍ 펩티드/kg/투약량임을 예상하게 한다.

본 발명을 바람직한 실시형태로 기술하였으나 기재된 실시형태로 한정되는 것은 아니며, 첨부된 청구의 범위와 그것의 범주내에 포함되는 여러가지 수정과 동등물을 포함시킬 수 있으며 이 범위는 가장 광범위하게 해석하여 이와 같은 모든 수정과 동등물이 포함되도록 한다.

Claims

등몰량의 재조합 사람 에리트로포이에틴보다 더 적은 빈도로 유사체를 투여하여 유사한 목표 헤마토크리트를 얻기 위하여, 치료적 유효량의 에리트로포이에틴의 고글리코실화 유사체를 약학적 조성물로 투여하는 포유류 헤마토크리트의 증가 및 유지 방법.
제 1 항에 있어서, 에리트로포이에틴의 고글리코실화 유사체의 양을 주당 약 2 회 투여함을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 에리트로포이에틴의 고글리코실화 유사체의 양을 주당 약 1 회 투여함을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 에리트로포이에틴의 고글리코실화 유사체의 양을 격주로 약 1 회 투여함을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 에리트로포이에틴의 고글리코실화 유사체의 양을 매월 약 1 회 투여함을 특징으로 하는 방법.
제 3 항에 있어서, 투여되는 에리트로포이에틴의 고글리코실화 유사체의 양이 약 0.075 ∼ 4.5 ㎍ 에리트로포이에틴 펩티드/kg/투약량을 특징으로 하는 방법.
재조합 사람 에리트로포이에틴보다 더 낮은 몰량으로 유사체를 투여하여 유사한 목표 헤마토크리트를 얻기 위하여, 치료적 유효량의 에리트로포이에틴의 고글리코실화 유사체를 약학적 조성물로 투여하는 포유류 헤마토크리트의 증가 및 유지 방법.
제 7 항에 있어서, 투여되는 에리트로포이에틴의 고글리코실화 유사체의 양이 주당 3 회 투약으로 약 0.025 ∼ 1.5 ㎍ 에리트로포이에틴 펩티드/㎏/투약량임을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 또는 제 7 항에 있어서, 하나의 탄수화물 쇄가 글리코실화 부위에 부가되는 사람 에리트로포이에틴에 비하여 에리트로포이에틴의 고글리코실화 유사체는 하나 이상의 부가적인 글리코실화 부위를 함유함을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 또는 제 7 항에 있어서, 목표 헤마토크리트가 최소한 약 30 % 임을 특징으로 하는 방법.
탄수화물 쇄가 사람 에리트로포이에틴 서열의 위치 30, 51, 57, 69, 88, 89, 136, 138 중 하나 또는 그 이상에 있는 N - 결합 탄수화물 쇄임을 특징으로 하는 제 9 항의 유사체.
사람 에리트로포이에틴 서열의 위치 30 및 88 에서 부가적 N - 결합 탄수화물 쇄를 갖는 제 9 항의 유사체.
제 12 항에 있어서, Asn³⁰Thr³²Val⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰Epo 임을 특징으로 하는 유사체.
제 1 항 또는 제 7 항에 있어서, 약학적 조성물이 약학적으로 용인가능한 희석제, 담체, 가용화제, 유화제, 방부제 및/또는 보조제를 함유함을 특징으로 하는 방법.
제 14 항에 있어서, 희석제가 시트르산나트륨 또는 인산나트륨의 완충액임을 특징으로 하는 조성물.
제 14 항에 있어서, 담체가 사람 혈청 알부민임을 특징으로 하는 조성물.
제 14 항에 있어서, 방부제가 벤질 알콜임을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항 또는 제 7 항에 있어서, 포유류가 신장 기능의 쇠퇴 또는 손실과 관련된 빈혈로 고통받음을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 또는 제 7 항에 있어서, 포유류가 골수억제 요법과 관련된 빈혈로 고통받음을 특징으로 하는 방법.
제 19 항에 있어서, 골수억제 요법은 화학요법적 또는 항-바이러스 약물을 포함함을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 또는 제 7 항에 있어서, 포유류가 과대 혈액 손실과 관련된 빈혈로 고통받음을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 또는 제 7 항에 있어서, 치료적 유효량의 철을 더 투여함을 특징으로 하는 방법.
사람 에리트로포이에틴 서열의 위치 52, 53, 55, 86 과 114 중 어느 위치에, 최소한 하나의 N- 결합 탄수화물 쇄가 부가되는 부가적 글리코실화부위를 함유하는 사람 에리트로포리에틴의 유사체.
제 22 항에 있어서, 탄수화물 쇄가 각 부위에 부착되는, 최소한 두 개의 부가적 글리코실화 부위를 함유함을 특징으로 하는 유사체.
제 22 항에 있어서, 탄수화물 쇄가 각 부위에 부착되는 최소한 세 개의 부가적 글리코실화 부위를 함유함을 특징으로 하는 유사체.
제 22 항에 있어서, 탄수화물 쇄가 각 부위에 부착되는 최소한 네 개의 부가적 글리코실화 부위를 함유함을 특징으로 하는 유사체.
다음 군에서 선택한 사람 에리트로포이에틴의 유사체 :
제 23 항 내지 제 27 항에 있어서, 외인성 DNA 서열의 발현 생성물임을 특징으로 하는 유사체.
제 23 항 내지 제 27 항의 유사체를 코드하는 DNA 서열.
숙주 세포가 유사체를 발현시킬 수 있도록 제 29 항의 DNA 서열로 트랜스펙션시킨 진핵 숙주 세포.
약학적으로 용인가능한 희석제, 보조제 또는 담체와 함께 치료적 유효량의 제 23 항 내지 제 27 항의 유사체를 함유하는 조성물.
치료적 유효량의 제 23 항 내지 27 항의 유사체를 약학적 조성물로 투여하는 포유류 헤마토크리트 증가 및 유지 방법.
제 32 항에 있어서, 비슷한 목표 헤마토크리트를 얻기 위하여 등몰량의 재조합 사람 에리트로포이에틴보다 더 적은 빈도로 유사체를 투여함을 특징으로 하는방법.
제 33 항에 있어서, 유사체의 양을 매주 약 1 회, 격주로 약 1 회또는 매월 약 1 회 투여함을 특징으로 하는 방법.
제 32 항에 있어서, 비슷한 목표 헤마토크리트를 얻기 위하여 재조합 사람 에리트로포이에틴보다 더 낮은 몰량으로 유사체를 투여함을 특징으로하는 방법.
제 34 항에 있어서, 투여되는 유사체의 양은 주당 3 회 투약으로 약 0.025 ∼ 1.5 ㎍ 에리트로포이에틴 펩티드/kg/투약량임을 특징으로 하는 방법.
제 34 항에 있어서, 투여되는 유사체의 양이 주당 3 회 투약으로 약 0.025 ㎍ 에리트로포이에틴 펩티드/kg/투약량 미만임을 특징으로 하는 방법.