TWI234583B

TWI234583B - Hyperglycosylated analogs of human erythropoietin and pharmaceutical composition thereof, DNA sequences encoding said analogs, and host cells comprising said sequences

Info

Publication number: TWI234583B
Application number: TW088118320A
Authority: TW
Inventors: Joan C Egrie; Steven G Elliott; Jeffrey K Browne
Original assignee: Amgen Inc
Priority date: 1998-10-23
Filing date: 1999-10-22
Publication date: 2005-06-21
Also published as: CN101703760A; KR20010075661A; SI1123313T1; ES2283139T3; PT1813624E; EP1123313B1; AU774989B2; WO2000024893A2; ES2347884T3; HUP0103920A3; CN1346369B; CY1110801T1; DE69935345T3; DE69942680D1; JP2002528465A; DE69935345T2; JP4809977B2; CN1346369A; EP1813624B1; HU228492B1

Description

1234583 A7

五、發明說明（1 ) 1明範圍 _本發明係有關使用促紅血球生成素之高糖基㈣似物提南哺乳動物血球容積之方法。更特定言之，本發明係有關以低於重組人類促紅血球生成素之投藥頻率投與高糖基化類似物即可提高及維持血球容積，並治療貧血之方法。本發明有關以低於重組人類促紅血球生成素之投藥量但同等投藥頻率投與高糖基化之類似物以便提高及維持血球容積並治療貧血之方法。亦提供促紅血球生成素之新穎高糖基化類似物。發明背景紅血球生成素（Epo)爲一種似紅血球子代細胞成熟爲紅血球所必需之一種醣蛋白激素。其在腎臟產生，且係調節循環中紅血球含量所必需者。出現組織氧氣訊號低落之病症會增加產生Epo ’進而刺激紅血球生成。例如；在慢性腎衰竭（CRF)中見到腎功能喪失，即典型地造成Ep〇減少產生，同時減少紅血球。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

Miyake等人（J· Biol· Chem· 252, 5558 (1977))已自成形不全性貧血患者純化出人類尿Epo。然而，自此來源得到之純Epo蛋白量仍不夠用於醫療用途。編碼人類Epo之基因之鑑別與選殖法及重組蛋白質之表現已揭示於林（Lin)之美國專利案No· 4,703,008，該案已以提及之方式併入本文中。自細胞培養基中純化重組人類紅血球生成素之方法揭示於莱（Lai)等人之美國專利案No. 4,667,016，該案已以提及之方式併入本文中。自哺乳動物宿主細胞中生產生物活性 -4 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1234583 A7 ----- - B7__ 五、發明說明（2 )

Epo之產量已首次達到適合醫療用途之程度。此外，對基因序列之認識及純化蛋白質之利用率提高已使人更了解此蛋白質之作用模式。衍生自人類尿之Epo(Miyake等人，如上述）及表現在哺乳動物細胞中之重組人類Ep〇二者均含有三條n -連接及一條0 -連接之寡醣鏈，其合計佔醣蛋白總分子量約40〇/〇。 N -連接之糖基化作用出現在位於第24、38及83位置之精胺酸殘基，而0 -連接之糖基化作用則出現在第126位置之絲胺酸殘基（萊（Lai)等人，J· Biol· Chem· 261, 31 16 (1986);布洛迪（Broudy)等人，Arch· Biochem. Biophys. 265, 329 (1988))。寡醣鏈已經過末端唾液酸殘基修飾，每條N -連接之鏈典型地具有至多4個唾液酸，而〇 -連接之鏈則具有至多2個唾液酸。因此Ep〇多肽共有至多1 4個唾液酸。已有多項不同研究顯示，改變Ep〇碳水化合物鏈可影響生物活性。然而在一項實驗中，經由糖基化位置之精胺酸或絲胺酸殘基之謗變作用單獨或共同脱除N -連接或〇 -連接之寡醣鏈時，大幅降低於哺乳動物細胞中生產之改變之 Epo之試管内活性（杜伯（Dube)等人，j Biol. Chem. 263, 175 16 (1988))。然而’狄洛米（DeLorme)等人（Biochemistry 9871-9876(1992))之報告指出，脱除Epo之N-連接糖基化位置會降低活體内活性而不降低試管内生物活性。

Epo中唾酸含量與活體内生物活性之間關係由測定單離之Epo同功異構型之活體内活性測得。當測定單離之Ep〇同功異構型在等莫耳濃度下提高正常小白鼠之血球容積之能 -5- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） _ ϋ ·ϋ I 1 I ϋ 一sOJ_ n ϋ ·ϋ ·ϋ I ·ϋ I (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) %

1234583 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（4 ) 每週三次（TIW)投與50至150單位/公斤之劑量，可經靜脈内（IV)或皮下（SC)注射，以達到所建議之血圍。對外科手術之病例，係於手術前丨。天，手術後4天内，每天投飯郎0(奸〇(}抓@包裝插頁（1^哪 Insert，12/23/96)。通常，目前建議之rHuEp〇起始劑量可在約6至8週内提高血球容積至目標範圍。一旦達到血球容積目標範圍，即依患者之需求建立維持之投藥計劃，但對 CRF之貧血患者主要爲每週投藥三次。投與上述汛沾㈧爲治療貧血之有效且耐受性良好之療程。需要一種效力高於rHuEpo之醫療劑。這種分子之優點應爲投藥頻率較低且/或劑量較低。目前對貧血患者之治療爲每週投與三次EPOGEN®,對手術患者則每天投藥一次。幸义低之投藥頻率對醫師及患者都更方便，尤其對不會定期回診或對彼等自行注射Epo之患者而言更方便。較強效分子之另個優點舄投與患者之藥物劑量較低即可同樣提高血球容積。因此本發明之目的爲鑑別可治療貧血之更強效分子可以降低投藥頻率。本發明另一項目的爲提供一種在較低劑量下投藥仍可提高並維持血球容積在相當於Ep〇之效力程度下之分子。本發明另一個目的爲可降低投藥頻率之此等特定分子之耐受性至少與rHuEpo相同且對某些患者而言可能更好。發明概要已發現稱N47之高糖基化Epo類似物（Asn3GThr32Val87Asn88Thr90 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格⑵0 x 297公髮） I ^1 ϋ I 一：OJI ϋ 1BB1 I (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ,ψ 項再填寫士

1234583 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（5 )

Epo)當依rHuEpo之相同劑量及頻率投藥時，具有比重組人類促紅血球生成素（rHuEpo)更長之血清半衰期，及更高之活體内活性。此外，已發現該類似物對小白鼠每週投藥一 ’人時’所提南血球容積效果相當於每週投與三次rHuEp〇時所提高血球容積效果。Epo類似物N47投與小白鼠及人類之藥物動力學相似。本發明提供一種提高及維持哺乳動物之血球容積之方法’其包括投與含在醫藥組合物中之醫療有效量之Ep〇高糖基化類似物’其中類似物之投藥頻率低於爲了達到同等血球容積目標時之等莫耳量rHuEpo投藥頻率。本發明爲了達到患者之最佳血球容積範圍時之投藥頻率低於每週三次。投藥頻率可以每週二次，每週一次，或少於每週一次，如：每隔一週一次，每月一次或每二個月一次。要維持患者之血球容積目標所需之投藥頻率爲少於每週三次。投藥頻率可爲每週二次，每週一次，或少於每週一次，如：每二週一次，每月一次，或每二個月一次。本發明亦提供提兩及維持哺乳動物之血球容積之方法，其包括投與醫療有效之Epo高糖基化類似物，其中類似物之投藥量低於rHuEpo爲了達到同等血球容積目標時之莫耳量。亦提供含Epo高糖基化類似物之醫藥組合物，其中該組合物適合依少於每週三次之頻率投藥。組合物將包含適合用於Epo高糖基化類似物之醫藥上可接受之輔劑。本發明可用於造成紅血球減少之任何病症，如：與腎功能下降或喪失（慢性腎衰竭）、骨髓抑制性療法、癌症、病 {請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁)

1234583 A7 B7 五、發明說明（7 ) 至小獵犬後之血清半衰期。實驗步驟述於實例4。結果爲各組之平均値（土 SD)。圖6出示小白鼠每週三次（TIW)經腹膜内注射（Ip)投與不同劑量rHuEpo或Epo類似物N47共6週後血球容積提高程度之變化。實驗過程述於實例5。所示結果爲各劑量組血球容積變化之組平均値（土 SD)。圖7比較小白鼠經由腹膜内（IP)或靜脈内（IV)途徑，每週投藥一次（QW)或每週投藥三次（TIW)注射rHuEp〇及Ep〇類似物N47後之相對效力。實驗過程示實例5。各點代表下列各分開實驗之數據平均値（土 SD) ·· N47，IP，TIW (n=5); N47，IV，TIW (n=l) ; N47，IP，QW (n=2) ; N47，IV，QW (n=3) ; rHuEpo，IP，TIW (n=5) ; rHuEpo，IV，QW (n=2)。各實驗中每劑量使用7至1 3隻小白鼠。圖8出示小白鼠每週一次（QW)經靜脈内（IV)注射不同劑量rHuEpo或Epo類似物N47約6週後之血球容積提高程度變化。實驗過程述於實例5中。出示之結果爲各劑量組之血球容積變化之組平均値（土 SD)。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製圖9出示小白鼠每週一次（QW)或每隔一週一次（E〇w)經靜脈内（IV)注射不同劑量EP〇類似物N47約6週後之血球容積提高程度變化。實驗過程述於實例5。所示結果爲各劑量組血球容積變化之組平均値（士 SD)。本發明之詳細説明本發明提供一種提高及維持血球容積之方法，其包括投與含在醫藥組合物中之醫療有效量之促紅血球生成素之高 10- 1234583 A7 ------_B7____ 五、發明說明（9 ) 時之效應。甚至當每隔一週投藥一次時，N47仍使正常小白氣之血球容積顯著提高（圖9 )。總言之，該等數據顯示 Epo高糖基化類似物，特定言之類似物N47採用低於目前 rHuEpo治療法之投藥頻率下，宜用於提高血球容積。其亦顯示，上述小白鼠結果可延伸用於人類。對八位連績式不队床性腹膜透析（CAPD)患者投與rHuEpo及類似物 N47時，證實類似物Νβ之血清半衰期比rHuEpo延長3倍 (實例6及表5 )。這些結果顯示，ep〇高糖基化類似物對人類之投藥頻率可以低於rHuEpo。本文中採用之’’高糖基化Ep〇類似物，，指Epo包含至少再一個糖基化位置，在此位置上再增加一條碳水化合鏈。糖基化位置可供N _連接或〇 -連接碳水化合鏈。引進新的N _連接糖基化位置之方法爲改變Dna序列，供編碼多肽鏈中用於增加N -連接之碳水化合之同義位置（胺基酸_Asn-X_ Ser/Thr)，而引進新的〇 _連接位置之方法則爲改變dNA序列供編碼絲胺酸或蘇胺酸殘基。類似物係採用謗發技術構築’以便加成、刪除或取代胺基酸殘基，在Epo多肽中增加或改變可進行糖基化之位置。將編碼Epo高糖基化類似物之DNA轉感染至興核生物宿主細胞’並分析所表現之醣蛋白質是否另含有其他碳水化合物鏈。

Epo高糖基化類似物於試管内展現之活性相當於或甚至低於rHuEpo ’此表示增加碳水化合物鏈並未加強與Ep〇受體（結合性，且有時候會降低活性。然而，高糖基化典型地延長半衰期且有潛力提高活體内生物活性。在第8 8位 -12- 本紙張尺度適财關家標準x 297公爱）_ (請先閱讀背面之注意事項Θ填寫本頁) β

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1234583

五、發明說明（1〇 ) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製另具有條N -連接之碳水化合物鏈之Ep〇類似物對受體之親和性低於rHuEp〇(同功異構型·9_14)或低於每分子有ι4 個唾液酸之rHuEpo之純化同功異構型，但仍展現較長之循锿半衰期且與Ep〇同功異構型9_14混合物或單離之Ep〇同功異構型1 4具有更加強之活體内活性。可根據本發明投藥之Ep〇高糖基化類似物可另具有至少再一條N _連接或〇 _連接之碳水化合物鏈。一項具體實施例中，該類似物可具有再二條N _連接之碳水化合物鏈。其他具體實施例中，該類似物可具有再三、四條或更多條 N-連接碳水化合物鏈。例如：本發明類似物於人類Ep〇序列之胺基酸殘基30、51、57、69、88、89、136及138中一個或多個位置具有至少再一條連接鏈。一項具體實施例中，該類似物中於人類Epo殘基3 〇及8 8處具有再一條N _ 連接之碳水化合物鏈。人類Epo之胺基酸殘基編號示於圖 1及SEQ ID ΝΟ:1。圖1出示預測之166個胺基酸之成熟Ep〇夕肤’而脱除C -末端精胺酸殘基後重組產生之Ep0具有 165個胺基酸。咸了解，rHuEp〇及高糖基化Ep〇類似物可具有165或166個胺基酸。本發明類似物具有至少四條N ·連接之碳水化合物鏈。這四條鏈中’有三條可在位置24、3 8及83之天然位置。然而’本發明有些類似物可能改變一個或多個天然糖基化位置，使得刪除一個或多個該等位置，而以位置取代。這種類似物亦由本發明提供。例如：可刪除第24、3 8及8 3位置中任一個，並以第8 8位置取代。視需要時，類似物可於 -13- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 χ 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項寫本頁)

-I 1^— ϋ I mmmmam 一-WJ_ ·ϋ 1· i^i I n I

1234583

五、發明說明（11 ) 第126位置具有一個ο -連接位置。 (請先閱讀背面之注意事項寫本頁) 本發明亦提供具有至少再一條碳水化合物鏈之新穎Ερ〇高糖基化類似物。已發現在第52、53、55、86及114位置中任一個已修飾成糖基化位置處另增加一條Ν _連接之碳水化合物鏈。明確具體實施例包括表i所述之類似物Ν49及 Ν61。該新穎類似物在第52、53、S5、86及114位置中任一位置具有至少一個新的N _連接糖基化位置，且在其他位置再含一條N_連接或〇_連接之碳水化合物鏈。該等類似物可具有再一條、二條、三條或四條碳水化合物鏈，或再四條以上之鏈。一項較佳具體實施例中，類似物可具有再二條N -連接之碳水化合物鏈（共有6條ν -連接鏈）。另一項較佳具體實施例中，類似物可具有再4條N -連接鏈（共7條 N -連接鏈）。具有再三條或四條，或超過四條其他ν -連接碳水化合物鏈之類似物可以（但不限於）在第52、53、55、 86、及114位置中任一位置再具有其他鏈。

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製現已驚人地發現，於第3 〇、53及88位置再具有三條N-連接鏈（共6條N -連接鏈）之高糖基化類似物之活體内生物活性高於另具有二條鏈（共5條）之類似物N47。其結果示於圖3。類似物之活體内活性顯然直接依賴ν -連接碳水化合物鏈之數目。這些結果可延伸用於醫療，其中具有多條 N -連接碳水化合物鏈之類似物之投藥頻率甚至低於N47。該類似物可依相關技藝專家可採用之多種謗變技術製備，如：位置主導性謗變作用、PCR謗變作用及卡匣式謗變（cassette mutagenesis)(索勒（Zoller)等人，Meth· Εηζ· 100, -14 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1234583 A7 B7 五、發明說明（12 ) 468-500 (1983));希古奇（Higuchi)，PCR法（PCR Protocols), PP. 177-183(學院出版社（Academic Press) 1990);威爾斯 (Wells)等人，Gene 丛 315_323 (1985))。實例 1 説明 pCR謗變技術於構築新頃Ep〇高糖基化類似物上之用途。採用標準技術，使用適合在哺乳動物宿主細胞中維持之媒介體，取經過謗變之办〇 DNA序列嵌入表現媒介體中。媒介體典型地包含下列要素：發動子及其他，，上游”調節要素，複製源，核糖體結合位置，轉錄終止位置，多連接基位置’及可與哺乳動物宿主細胞相容之可選拔標記物。媒介體亦可包含可於原核生物宿主細胞中增殖並維持之要素。合適細胞或細胞株包括任何來自哺乳動物者，包括來自人類者。其實例包括：COS-7(ATCC寄存編號CRL 1651)，人類293，幼倉鼠腎（BHK，ATCC寄存編號CCL 10)，中國倉鼠卵巢細胞（包括缺乏二氫葉酸鹽還原酶（DHFR)-之細胞’鳥拉伯（Urlab)等人，Proc· Natl· Acad· Sci. Sci. USA 77 4216-4220 (1980))。其他合適之哺乳動物細胞株包括（但不限於）：HeLa，小白鼠L-929及3T3。較佳具體實施例中，採用缺乏DHFR之CHO細胞。採用標準轉形成或轉感染技術，將包含編碼Epo高糖基化類似物之序列之媒介體引入宿主細胞。轉形或轉感染之宿主細胞採用已公開之方法培養、擴增及篩選（基丁 (Gething)等人，Nature 293, 620-625 (1981);考夫曼 (Kaufman)等人，Mol· Cell. Biol· i，1750-1759 (1985);美國專案No· 4,419,446)。在可以表現類似物之條件下，培養含 -15- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項寫本頁)

-ϋ ϋ n ϋ 1 ϋ 一 δν 1 ϋ ϋ ϋ ϋ n ϋ I

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1234583 A7 B7 五、發明說明（14 ) (請先閱讀背面之注意事項^^寫本頁) 欄中。亦包括亦可引入之更大幅變化（’’例舉取代π )。相關技藝專家咸了解，該等位置應先依相對保留方式經取代作用修飾。若這種取代作用造成保留生物活性，則可再引進更大幅變化（’’例舉取代π )且/或進行其他加成/刪除，並篩選產物。表1 :胺基酸取代作用原殘基較佳取代例舉取代 Ala (A) Val Val; Leu; lie Arg (R) Lys Lys; Gin; Asn Asn (N) Gin Gin; His; Lys; Arg Asp (D) Glu Glu Cys (C) Ser Ser Gin (Q) Asn Asn Glu (E) Asp Asp Gly (G) Pro Pro His (H) Arg Asn; Gin; Lys; Arg lie (I) Leu Leu; Val; Met; Ala; Phe;正白胺酸 Leu (L) lie 正白胺酸；lie; Val; Met; Ala; Phe Lys (K) Arg Arg; Gin Asn Met (M) Leu Leu; Phe; lie Phe (F) Leu Leu; Val lie; Ala Pro (P) Gly Gly Ser (S) Thr Thr Thr(T) Ser Ser Trp (W) Tyr Try Tyr (Y) Phe Trp; Phe Thr; Ser Val (V) Leu lie; Leu; Met; Phe; Ala;正白胺酸本發明亦提供在高糖基化Epo類似物中刪除或增加胺基

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -17- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1234583 A7

五、發明說明（15 ) 酸，且貫質上不影響生物活性。這種增加與刪除可位在多肽又N -末端或C ·末端，或可在肽内。通常，相當少數之刪除或增加不容易影響Epo或高糖基化類似物之結構及/或功能。一項體實施例中，可在5至1 0個殘基，或2至5個胺基酸殘基，或1至2個殘基進行刪除或增加。 π莫耳量π —詞係指高糖基化類似物或rHuEp〇之含量，其係根據未糖基化之相應促紅血球生成素多肤之分子量計算。等量之rHuEpo及類似物係指在用於測定此等含量之方法中，考慮過其當量數變化後之含量相等。由於 rHuEpo及類似物之分子量會隨碳水化合物鏈之數目變化’因此需採用此方式決定同等量。rHuEpo之促紅血球生成素多肽分子量係根據圖1及SEQ ID N0:1所示之胺基酸殘基1-165計算。高糖基化類似物之分子量則依圖}與SEq ID N0:1中殘基1至165之胺基酸變化調整。高糖基化類似物之投藥頻率依待治療之病症及血球容積目標而異，但通常少於每週3次。投藥頻率爲約每週2 次’約每週1次。投藥頻率亦可少於每週一次，例如：約每二週一次（約每1 4天1次），每月一次，或每二個月一次。咸了解，眞正採用之投藥頻率可能與本文揭示之頻率有些差異，因爲不同個體對Epo類似物有不同反應，”約” 一詞即反映這種變化。本文採用之π醫療效量’’ 一詞係指高糖基化類似物可提高血球容積至目標値時，或至有利於患者之目標値範圍時，或可使患者保持血球容積目標値或保持在目標値範圍内時 -18- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項寫本頁) -I ϋ ϋ tl I^OJ 1 n n I ϋ -

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1234583 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（16 ) 之用量。該用量將隨每個個體而異，且將由許多因素決疋，包括患者之整個身體狀況，貧血之嚴重性及原因，及孩個別患者之最後血球容積目標。血球容積目標主要爲至少約30%，或30%至38%之範圍内，以高於38%較佳，或 40%至45%更佳。與rHuEpo之血球容積目標値範圍有關之一般原則可參見日期爲1996年1 2月2 3日之EPOGEN⑧包裝插頁’且爲30%至36%，或如其中所指示之32%至38%。咸了解’這種目標値將隨每個個體而異，因此醫師可針對任何特定患者適當地判斷，來決定正確之血球容積目標。儘管如此，血球容積目標値之決定仍在相關技藝專家之能力範圍内。本組合物之醫療有效量很容易由相關技藝專家決定。實例6出tf —種臨床方法，其目的在於每週一次及每週三次之投藥頻率下，決定醫療有效量之類似物N47。每週投藥一次I劑量範圍爲每劑量每公斤約〇〇75至約4 5微克促紅血球生成素肽。每週投藥三次之劑量範圍爲每劑量每公斤〇·〇25至1·«克促紅血球生成素肽。這種劑量範圍可用於其他Epo高糖基化類似物，相關技藝專家們可依例行方式對劑量範圍進行任何調整。本發明一項顯著優點爲使高糖基化作用程度隨投藥量或 Ί間隔變化之能力’因此可以依照指定之劑量或投藥計劃"疋做”=P〇類似物。治療之醫師可根據圖3所示另具有 :、：或三條碳水化合物鏈之Ep0類似物之活體内活性提南私度，選擇適合且方便用於所治療之貧血病症之類似 -19- 本紙張尺度適用中國國家標準格⑽χ 297公爱 (請先閱讀背面之注咅？事項再填寫本頁) 訂---------· 1234583 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製、發明說明（17 =。例如：急性貧血且需要大量有效劑量之患者，較^期治療之患者，可能最好投與另具有三或四條或2至更多條其他碳水化合物鏈之高糖基化類似物。對其他貧血較2嚴重或所需治療時間相當短之患者，則最好投與具有 !::条或二條其他碳水化合物鏈之類似物。本發明類：物馬醫師在預防及治療可能因多種潛在病因引起之提供相當大彈性。田 ^明亦提供投與醫療有效量之鐵，以便在醫療期間保、疋回夂促紅血球生成作用。其投與量可由相關技藝專家根據使用rHuEpo之療法決定。本發明可用於刺激紅血球產生及預防與治療貧血。可接，本發明治療之病症中包括與腎功能下降或喪失（慢性腎哀竭）有關之貧血，與骨髓抑制性療法如：化療法藥物（如：AZT)有關之貧血，與非骨髓性癌症之進展有關 <貧血，與病毒感染（如：HIV)有關之貧血，及慢性病之貧血。亦可處理之狀況爲可能使健康個體造成貧血時，如：在手術期間預期會失血時之狀況。通常，任何可利用 rHuEpo處理之狀況亦可採用本發明办〇高糖基化類似物處理。本發明亦提供醫藥組合物，其包含醫療有效量之Ερ〇高糖基化類似物及醫藥上可接受之稀釋劑、載體、溶解劑、乳化劑、防腐劑及/或輔劑。組合物適合少於每週三次之投藥計劃。組合物可呈液體或冷凍乾燥形式，且包含具有不同ρ Η値及離子強度之稀釋劑（Tris，擰檬酸鹽或磷酸鹽緩衝劑），/谷解劑（如：Tween或聚山梨酸酯），載體（如： — — — — — — — a — — — — — — — — <請先閱讀背面之注意事項Λ填寫本頁)

-20 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1234583

五、發明說明（伯） PCR2) : 5’（前向）引子，逆向謗變引子，前向謗變引子（通常與逆向誘變引子互補）及3，（逆向）引子。誘變引子包含所需之核甞酸變化及此等變化之每側上6至14個正確相^ 否之核甘。P C R1使用5 ’（前向）引子及逆向謗變引子。 PCR2使用3 ’（逆向）引子及前向謗變引子。擴增之DNA片段係利用瓊脂糖凝膠電泳法分離。自凝膠上切下含正確大小之DNA片段之小塊瓊脂糖。合併來自PcR^PCR2之DNA 片段，並僅使用5，前向及3，逆向引子進行第三個PCR反應。因此擴增含有所需突變之全長度DNA節段。有數種情況下，採用相同PCR過程，將一處新的取代引進已含有變化之DNA中，合併成二處或三處突變。要構築此等多重糖基化位置類似物時，使用單一個雙重或三重位置類似物 (依上述產生）作爲PCR模板，並使用適當引子，利用位置主導性謗變作用，再引進另一個糖基化位置。

Epo類似物N51，N52及N53係利用重疊PCR(聚合酶鏈反應）方法1構築成。分別在其中另引進一個N -糖基化位置。採用pDSRa2 Epo作爲PCR模板，在天然序列HuEpo中增加一個糖基化位置（N114 T116)，形成N56 ;採用pDSRa2 Epo N47 模板（Asn30，Thr32，Val87，Asn88，Thr90)，在 N47 Epo上增加一個〇 -連接之糖基化位置（Thr 125)，形成 N51 ;及採用pDSR汉2 Epo N47模板，在類似物N47上增加一個糖基化位置（Asn53)，形成類似物N59。方法1之聚合酶鏈反應係擷用陳（Cheng)等人，（Pore. Natl. Acad. Sci· USA £1，5695 (1994))之方法進行。3,（逆向）引 -22- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）

A7 1234583 B7_ 五、發明說明（2〇 ) 子所含之序列中，在Xba I限制酶切割位置之前引進一個停止字碼子： ATCTAGAAGTTGCTCTCTGGACAGTTCCT (SEQ ID N0:2) 5’前向反應引子： GAAGCTTGCGCCACCATGGGGGTGCACGAATG (SEQ ID N0:3) 具有一個Hind III限制酶切割位置，隨後爲Epo起始字碼子 (ATG)上游之Kozak序列。典型之PCR反應混合物包含：各 4微升之前向及逆向引子（5微微莫耳/微升），1微升模板 (25 毫微克），1 0 微升 5X LP緩衝液（100 mM Tricine pH 8.7/25%甘油/425 mM KOAc)，10微升 dNTP保存液（各 1 mM dATP，dTTP，dCTP，dGTP)，0.8微升 rtTH 聚合酶（柏金艾瑪公司（Perkin Elmer ; 2·5單位/微升），及2微升Vent聚合酶 (NEB ;於IX LP緩衝液中新鮮稀釋1 : 100後爲0.01單位/微升）。加水至經體積5 0微升。所有成份均依指定順序添加，當第一個循環期間之溫度高於60°C時，添加1微升50 mM MgOAc，起動PCR。典型反應條件爲：94°C，1 0秒/ 50°C，1 分鐘/68°C，5分鐘循環2次後，94°C，10秒/55°C，1分鐘 / 68°C，5分鐘循環2 5次。擴增之片段利用瓊脂糖凝膠電泳法分離，採用電廠商（Bio 101公司）提供之GenecleanTM套組及程序，純化正確大小之DNA片段。純化之DNA經Hind III及Xba I分解，然後再使用組純化。該片段黏接至Hind III及Xba I切割之pDSRa2媒介體中，黏接後之DNA於載體tRNA之存在下，在2倍體積之0.3 M NaOAc 乙醇溶液，pH 5·2中沈澱，轉形至大腸桿菌中。於最少量 DNA標本上利用限制酶分解，篩選出Epo類似物。然後由 -23- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公1 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) --------訂---------^^^^1 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 1234583 ___B7___ 五、發明說明（21 ) 陽性純系製造質體，分析嵌段之序列，證實仍含有所需突變，並確認其中未引入其他胺基酸變化。採用重疊PCR方法2構築類似物N54至N61。含V(逆向）引子之序列在Xbal限制酶切割位置之前引進一個停止字碼子： GATCCTCTAGAGTTGCTCTCTGGACAG (SEQ ID N0:4) 5*前向反應引子： CAACAAGCTTGCGCCGCCATGGGGG (SEQ ID N0:5) 具有一個Hind III限制酶切割位置，隨後爲Epo起始字碼子 (ATG)上游之Kozak序列。採用柏金艾瑪UlTma DNA聚合酶及下列試劑進行高眞度之PCR法：10微升10XPCR緩衝液3 微升1 mM dNTPs，各5微微莫耳各引子，及水，加至終體積100微升。當PCR混合物達94°C後，添加0.5單位UlTma聚合酶。然後進行PCR反應，於94°C下30秒，50°C下30秒，及72°C下90秒，循環5次。隨後於94°C下30秒，及72°C下 9 0秒，循環2 5次。電泳後，自瓊脂糖凝膠上切下正確大小之產物條帶。各類似物所得PCR產物採用Qiagen凝膠萃取套組清洗。純化之DNA於100微升限制酶分解液中，使用Hind III及 Xbal 限制酶（百靈藥廒（Boehringer Mannheim))，於 37°C 下分解1小時。分解物再經凝膠純化，分解之片段再黏接至 Hind III及Xbal分解之pDSra2媒介體中0 黏接後之NDA於載體tRNA之存在下，經2倍體積之0.3M NaOAc乙醇溶液，pH 5.2沈澱，並轉形至大腸桿菌中。先使用群落PCR篩選Epo類似物，以鑑別含有正確大小與型態之DNA嵌段之純系。依此方法，將含有質體之細胞置入 -24- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注音？事項㈣填寫本頁) 訂---------

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1234583 A7 B7 五、發明說明（22 ) 含有Epo前向及逆向引子之PCR試管中。再依上述反應條件，使混合物進行PCR。然後自陽性純系製備質體，分析

Epo類似物嵌段之序列，證實其中含有所需突變，並確認其中未引進其他胺基酸變化。表1 具有N -連接碳水化合物鏈之位置之促紅血球生成素類似物

類似物胺基酸取代序列變化 N49 Lys, Met->Asn52, Thr54 AAG, ATG^AAT, ACC N50 Arg, Glu->Asn53, Thr55 AGG, GAG->AAT, ACG N51 Ala, HiS, Pro, Trp, Pro, Ala^N30, T32, V87, N88, T90T125 GCT, CAC CCG TGG CCC GCC->AAT，ACG，GTG, AAT，ACC， ACC N52 Ala, Lys->Asnl 14, Thrl 16 GCC, AAG->AAC, ACG N53 Aal, His, Arg, Glu Pro, Trp, Pro-> N30, T32, N53, T55, V87, N88, T90 GCT, CAC, AGG, GAG, CCG, TGG, CCC^AAT, ACG, AAT, ACG, GTG, AAT，ACC N54 Glu, Gly^Asn55, Thr57 GAG, GGG^AAT, ACT N55 Gin, Pro, Trp->Asn86, Val87, Thr88 CAG, CCG, TGG^ACC, GTG, ACG N56 Pro, Trp, Pro->Ala87, Asn88, Thr90 CCG，TGG，CCC—GCG，AAT，ACC N57 Pro, Trp, Pro->Val87, Asn88, Ser90 CCG, TGG CCC->GTG, AAT, ACG N58 Pro, Trp, Glu, Pro-> Val87, Asn88, Gly89, Thr90 CCG, TGG, GAG, CCC-> GTG，AAT, GGG，ACC N59 Ala, His, Arg, Glu~> Asn30, Thr32, Asn53, Asn55 GCT, CAC，AGG，GAG-> AAT, ACG, AAT, ACG N60 Ala, His, Ala, Lys^ Asn30, Thr32, Asnl 14, Thrl 16 GCT, CAC, GCC, AAG-> AAT, ACG, AAC, ACG N61 A, H, R, E, P, W, P5 A, K 80, T32, N53, T55, V87, N88, T90, N114,T115 GCT, CAC, ACG, GAG, CCG, TGG, CCC, GCC, AAG->AAT, ACG, AAT, ACG, GTG, AAT, ACC, AAC, ACG -25- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項^填寫本頁)

-^1 a^i mmmmm -1 ·_1 I I ϋ_ι tmme I— i^i —amt I

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1234583 A7 B7 五、發明說明（23 ) 碳水化合物加成作用之分析取嵌入表現媒介體pDSRa2中之高糖基化Epo類似物之構築體轉感染至COS細胞中。取轉感染之COS細胞上澄液，利用西方墨點分析，測定是否表現及分泌含有其他碳水化合物之Epo類似物。取樣本直接加至SDS-PAGE凝膠之孔中，利用兔疫吸墨法，採用單株抗體9G8A分析（艾略特 (Elliott)等人（1996) Blood 87:p2714)。比較類似物樣本與含 rHuEpo樣本之移動性。圖1示出類似物N53及N61之移動性比類似物N4(四條碳水化合物鏈）及N47(五條碳水化合物鏈）低。此移動性亦與類似物N53(六條碳水化合物鏈）及類似物N61(七條碳水化合物鏈）之移動性一致。所有高糖基化類似物之數據示於表2。試管内生物分析法分析經過表現rHuEpo或類似物之COS或CHO細胞調適之 (conditioned)之培養基刺激UT7-Epo細胞吸收3H-胸甞之作用（Komatsu等人，Blood 拉，456)。UT7-Ep〇細胞會因應 Epo 而反應’在其細胞表面上表現人類Ep〇受體。取uT7-Epo 細胞於生長培養基中生長（IX艾氏改良杜氏培養基（Isc〇ve，s

Modified Dulbecco's Medium) ’ 含l_ 麩醯胺，25 mM HEPES 缓衝液’ *3〇24毫克/升碳酸氫钟，但不含硫代#油或經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A -氮f基乙醇/GIBC〇)/1()% V/V胎牛血清/1% ν/ν 醯胺-青黴素-鏈黴素溶液（伊文科舉,. (Irvine Scientific)/1單位 / 毫升rHuEpo)，至約3 x 105個細腧/古，笔升。離心（約500xG)收集細胞，以磷酸緩衝食鹽水洗滌〇 ^ * 2次，依5 X 1〇4個細胞/毫

升再懸浮於分析培養基中（1 X κρΜΐ培養基164〇，不含L-麩醯胺（Gibco)/1% L-麩醯胺/4% a + /〇月台牛血清）。取試驗樣本 26、本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297 1234583 A7 B7 五、發明說明（24 ) 或EP〇標準物（rHuEp0)i〇〇微升於分析培養基中稀釋至少5 倍，加至9 6孔微滴定板之9 6孔中。添加5 0微升懸浮細胞 ( 5000個細胞/孔），板子於37。〇及5% c〇2潮濕培養箱中培養7 2小時後，添加於分析培養基中稀釋^ : ^⑼之$ 〇微升甲基-3H-胸：y：(i毫居禮/毫升；2〇居孔/毫莫耳）。細胞於37°C及5% CO,下再培養4小時。於玻璃纖維濾墊上收集已標識之細胞，以去離子水及2_丙醇依序洗滌，乾燥及計數。比較各類似物所測得之效應之rHuEp〇標準物測得之效應，、決定活性。然後由試管内活性除以免疫分析法測得各類似物 < 濃度，得到比生物活性（艾略特等人（1996)， Blood 87:p2714)。其結果示於下表2。 ’

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製類似物 rHuEpo N49 N50 N51 N52 N53 N54 N55 N56 N57 N58 N59 N60 N61 * 含1至2條〇 -連接鏈 * *試管内活性係與rHuEpo活性比較 +++ 等於rHuEpo之善性 + + 爲rHuEpo之2 5至75%活性 NT 未測試 3-4 6 4 4 4 3- 4 4 5 4- 5 6-7

試管内活性5 +++ +++ +++ +++ +++ ++ NT +++ +++ +++ +++ ++ +++ NT -27- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1234583

五、發明說明（％ ) 取澄清之DFM加至Q-Sepharose Fast Flow管柱中（法馬公司（Pharmacia)，6公分x 1 8公分，管柱預先於i 〇 bis Tds丙烷（BTP)，PH 7.0中平衡），以2倍管柱體積1〇 mM BTP落離所有未結合之物質。依高糖基化類似物含有四、五或7T條N -連接碳水化合物鏈而定，決定採用下列梯度落離。此階段使用之所有緩衝液均含1 mM甘胺酸，2 0// Μ CuS〇4，6 Μ尿素，5微克/毫升抗纖維蛋白溶酶肽及丨微克 /耄升胃蛋白酶抑制素。溶離具四條N ·連接碳水化合物鏈之類似物之梯度爲10 mM乙酸，〇·1 mM NaCl至500 mM乙酸，5 mM NaCH，共4 9倍管柱體積，其中有2倍管柱體積保持高鹽度條件。溶離具五條N -連接碳水化合物鏈之類似物之梯度爲0·7 Μ乙酸，7 mM NaCl至1.0 Μ乙酸，12 mM NaCl，共3 0倍管柱體積，其中2倍管柱積保持高鹽度條件。溶離具六條N-連接碳水化合物鏈之類似物之梯度爲1 .〇 Μ 乙酸，1〇 mM NaCl 至 1.5 Μ 乙酸，20 mM NaCl，共 5 0 倍管柱體積，其中2倍管柱體積保持高鹽度條件。梯度溶離後，以2倍管柱體積之10 mM BTP，pH 7.0洗滌管柱，以 0.6 M NaCl，100 mM BTP，pH 7.0溶離高度同功異構型部份。逆相層析法（C 4 ) 取自Q-Sepharose管柱（1Q)之鬲鹽度溶離份加至Vydac C4 逆相管柱中（3 0微米粒子，4公分X 1 8公分，先於20%乙醇，10 mM BTP，pH 7.0中平衡），以3 0倍管柱體積之達 94%乙醇（於10 mM BTP，pH 7.0中緩衝）梯度溶離。收集以 -29- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公t )

1234583

五、發明說明（π )

約60%乙醇溶離出之產物高輋，以4倍體積i()mMBTp，pH 7.0稀釋，儘可能避免在乙醇存在下出現凝集。法（2 〇 ) 取來自逆相管柱之稀釋之溶出液加至第二支Q_Seph臟e Fast F丨ow(法馬公司，3公分χ 9公分）管柱中（已先經⑺ 福btp，pH7.0平衡）。以平衡缓衝液洗滌管柱，以〇6m 氣化鈉，20 mM擰檬酸鈉，ρΗ 6·〇溶離高糖基化Ep〇類似純化气蛋白質經由centric〇n(分子量截斷直1〇,〇〇〇)交換至 20 mM NaP04 ’ pH 6.0，140 mM NaCl 中，然後通過〇 2微米濾紙，保存在2至8 °C中。實例3 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製含四、五及六條N-連接碳水化合物鏈之rHuEp〇及 rHuEpo類似物之活體内生物活性於外因性缺氧化紅血球增多症小白鼠生物分析法中，比較含四、五及7T條N -連接之碳水化合物鏈之Ep0類似物與 rHuEpo之活體内活性。此分析法定量進入新合成之紅血球細胞中之59Fe量，作爲測定小白鼠因投與外來試驗樣本而產生提高紅血球生成作用反應之測定値。依下文説明進行之分析法係改良柯迪斯（Cotes)與班格漢（Bangham)之方法 (Nature 191，1065 (1961)) 〇此分析法中，雌性BDF!小白鼠先於低壓室中（〇·4至0.5大氣壓）低氧條件下每天約1 8小時，共1 4天。爲了補償低氧條件，小白鼠會刺激紅血球生成，以增加紅血球細胞數， 30· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1234583

五、發明說明（28 ) 藉以提高相對攜氧能力。最後低壓曝露過程結束後，使小 1鼠先留在常壓下72小時，然後經腹膜内注射投與試驗 7本。小白鼠在常壓下相對地出現紅血球增多症，因此其 5應爲降低内因性促紅血球生成素生產及紅血球生成速率。投與樣本5天後，經靜脈内注射含於0.2亳升中之0.2至〇·3微居禮59FeC13至尾部靜脈中。48小時後，殺死動物，測疋0.5亳升皿樣中”以吸收量，決定試驗樣本中紅血球生成作用之提高量。例如·當本分析法中測試rHuEpo及5種不同Epo類似物 (占四五或六條N ·連接之碳水化合物鍵）等，所得結果不於圖3。各樣本在適當濃度範圍内6個或7個不同稀釋度下分析。所有樣本均於含〇·5%胎牛血清白蛋白之磷酸鹽緩衝食鹽水中稀釋，對五隻經過預先調適之小白鼠投與0.4 愛升各稀釋皮。投與59Fe 48小時後，利用r -計數器測定〇·5毫升血樣中之吸收量。各樣本之結果依”以吸收百分比對投與劑量對數値作圖。如圖3所示，本分析法中測試之所有五種高糖基化Ep〇類似物均比rHuEpo強效。此外，各類似之效力分別直接與 N -連接之碳水化合物鏈數目相關，碳水化合物鏈數目愈多之類似物，其活性愈高。因此，含有六條N -連接之碳水化合物鏈之類似物N53爲效力最強之類似物。而含有五條N -連接之碳水化合物鏈之類似物N47則比含四條N -連接鏈之類似物強效。含四條N -連接之碳水化合物鏈之三種類似物（N4，N18及N50)之效力純互相相等，且比rHuEpo強效。本實驗中，要達到吸收40% 59Fe程度時所需之rHuEpo及 -31 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂---------

經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣 1234583 A7 B7 五、發明說明（29 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製含四、五或六條N -連接之碳水化合物鏈之類似物之劑量分別爲10,700毫微克，640毫微克，140毫微克，及3 8毫微克。根據爲了達到這個紅血球生成作用所需之物質用量計算’含四、五或六條N-連接之碳水化合物鏈之Epo類似物之效力分別爲rHuEpo之1 7倍、7 7倍及280倍。實例4 rHuEpo及Epo類似物N47於老鼠及小獵犬體内之I V藥物動力學以老鼠及小獵犬分開進行二次實驗，比較Ep〇 N47類似物及rHuEpo之藥物動力學參數。狗實驗中，由體重7.8至9.5公斤之正f小獵犬經靜脈内大丸劑注射約2 9微居禮⑴卜出仙㈧或,4+47(約〇.丨微克肽 /公斤）至頭靜脈中。投藥後24小時内，在不同時間點收集約1至2耄升血樣，製備血清。測定〇1毫升血清中^工·臟p。及⑴，依上述方法計算藥物動力學參數。狗實驗之血«度對時間之藥物動力學曲線示於圖 5。時間點爲各組中二隻動物之相单妨广人一 '主又力物〈、、且千均値。藥物動力學參數、%；合7F於表4。表4 N47與r-HuEP〇於狗體内之Iv藥物半衰期勒力學參數比較血清排空率試驗樣本請先閱讀背面之注意事項

imL 頁I I I 訂

β (毫升/公斤-小時） 2.4 8.4 (小時） 0.34 0.40 (2】;時）（毫升4斤) 79 55·9 山- 60.8 a出不之結果爲各組中二隻狗之平均參數 N47 rHuEp

本紙張尺度適i中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 32 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1234583

五、發明說明（3〇 ) 老氣與狗二項實驗中，rHuEpo及Epo N47類似物具有雙相血清排空率。老鼠體内rHuEpo之排空率比Epo N47快約 3.7倍，且Epo N47類似物之θ -半衰期比rHuEpo長約2.8 倍。狗實驗之藥物動力學參數一般而言與老鼠的觀察一致。狗體内rHuEpo之排空率比Epo N47類似物快3.5倍，而 Epo N47之y?-半衰期則比rHuEpo長3.5倍。實例5 投與rHuEpo及Epo類似物N47 後血球容積隨劑量之效應變化普週投藥二次（TIW)之血球血球容積劑量效應實驗對小白鼠經腹膜内或靜脈内注射一定劑量範圍内之 rHuEpo及Epo類似物N47，每週三次，達6週後，比較活體内生物效果。每週二次自眼眶後抽血，測定血球容積。取體重約3 0克之正常小白鼠（每組丨〇至丨3隻），經腹膜内每週注射三次rHuEpo(劑量範圍0.625至1 0微克肽/公斤/ 劑量），Epo N47類似物（劑量範圍〇· 156至1.25微克肽/公斤 /劑量）或載劑控制組，共6週。各種不同rHuEpo及Epo N47類似物投藥製劑之載劑對照組及稀釋劑爲含〇〇25%小白鼠血清白蛋白之磷酸鹽緩衝食鹽水（PBS)。所有小白氣均在底線時及投藥後每週二次，自眼眶後抽血測定血球容積。實驗結果時，收集所有動物之血清，利用溶液放射性免疫沈殿分析法分析對注射產物產生之抗體。對中和抗體呈陰性反應之動物之血球容積數據繼續用於分析。如圖6所示，rHuEpo及Epo N47類似物在6週實驗期間， -33- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）

1234583 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（31 ) 血球容積均隨劑量增加，但指定濃度下，N47類似物提高血球容積之程度高於rHuEpo。本實驗中，當經腹膜内每週注射三次Epo N47類似物時，其效力高約3至4倍。 rHuEpo及類似物N47之劑量效應實驗係採用類似腹膜内注射法之方式，每週經靜脈内注射三次。所得結果類似腹膜:内投藥結果’特定T之，該等實驗進一步證實，當每週投藥三次時，Epo N47類似物之效力大於rHuEpo。爲了更進一步比較及定量rHuEpo與Epo N47類似物對提高正常小白鼠之血球容積之生物活性，亦利用相對效力圖分析實驗結果。各項實驗中，利用梯形合計法，合計前 3 8天實驗期之血球容積增加量，得到曲線下面積（auc)，測得rHuEpo或N47類似物於各劑量下之活性。然後由此數據對劑量對數値（微克/公斤/週）作圖。測定相關之劑量對數値效應直線之間距離，可決定經由相同或相異投藥途徑或投藥頻率投與之藥物之間之效力差異。圖7综合説明所有比較經由二種不同途徑（腹膜内及靜脈内）及二種不同投藥頻率投與之rHuEpo及N47類似物活性之實驗之相對效力數據。由圖7可見，當每週投藥三次時，Epo N47類似物當經靜脈内或腹膜内途徑注射時，其效力比每週經腹膜内注射三次之rHuEpo強3.6倍。毐週投藥一次（QW)之血球容積劑量效應實驗經由腹膜内或靜脈内投藥途徑每週投藥一次共6個月，比較rHuEpo及Epo類似物N47對增加正常小白鼠之血球容積 -34- 表紙張尺度適用巾關家標準(CNS)A4規格（210 X 297公i ) t mmtm ϋ I 1 «ϋ I n I (請先閱讀背面之注音？事項#l填寫本頁) 項再填寫太

A7 1234583 ——_______B7__ 五、發明說明（32 ) 效應。取體重約3 0克之正常CD 1小白鼠（每組8至1 〇隻），每週 —次經靜脈内注射不同濃度之rHuEpo或Epo N47類似物製劑（於含0.025%小白鼠血清白蛋白之PBS中製備）或載劑對照組（含0.025%小白鼠血清白蛋白之PBS)，共6週。類似物劑量變化爲6.25至25微克肽/公斤/劑量，且rHuEp〇劑量變化爲2 5至200微克/公斤/劑量。所有小白鼠之血球容積均於底線時及投藥後每週三次，自眼眶後抽血測定。實驗結束時’收集所有動物之血清’利用溶液放射性免疫沈殿法分析對注射產物產生之抗體。取對中和抗體呈陰性反應之動物之數據繼續用於分析。 a 由圖8可見，rHuEpo及類似物N47二者當每週投藥一次時，均可提高正常小白鼠之血球容積，但爲了產生效應所需之rHuEpo劑量則顯著高於類似物N47。例如：本實驗中， 25微克N47肽/公斤/週在6週内提高小白鼠血球容積41.2 克，而相同劑量下之rHuEpo則僅使血球容積提高12.5點。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製類似上述方式，經腹膜内每週投藥一次，進行rHuEp〇與類似物N47之劑量效應實驗。所得結果與靜脈内投藥之結果一致，且進一步證實，當每週投藥一次時，類似物N47 之效力高於rHuEpo。爲了定量每週分別投藥一次之rHuEpo與N47類似物之間之活性差異，由上述所有相關實驗產生相對效力圖。由圖 7可見，當每週投藥一次時，經靜脈内投藥途徑與經腹膜内投藥途徑投與之類似物N47均具有相同效力。當分別每 -35· >紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1234583 A7 B7 五、發明說明（33 ) 週投藥一次時，類似物N47之效力比rHuEpo高約1 4倍。此外，圖6之劑量對數値效應圖示説明下列幾點：（1)每週投與一次（QW)指定劑量之類似物N47之效果與每週總劑量相同但分三次投藥（TIW)之rHuEpo之效果大略相同；（2) 每週投與一次（QW)指定劑量之rHuEpo之效果僅爲每週總劑量相同但分三次投藥（TIW)之類似物N47之效果之約 2% ; (3)當類似物N47依TIW對小白鼠投藥時，其效力爲 Q W之約4倍。：iJIAiE〇w)投藥之血球容積劑量效應實驗亦實驗分析類似物N47當每隔週投藥一次時，提高小白鼠血球容積之能力。對正常CD· 1小白鼠（每組1 0隻）每週一次或每隔週一次經靜脈内注射不同濃度Epo N47類似物 (於含0.025%小白鼠血清白蛋白之PBS中製備）共約6週。類似物N47每隔週之投藥劑量爲200，100或25微克/公斤/劑量，或每週投藥劑量爲12.5微克/公斤/劑量。所有小白鼠均於底線時及投藥後每週二次，自眼眶後抽血測量血球容積。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製如圖9所示，類似物N4 7甚至當每二週投藥一次時，仍可隨劑量增加而提高正常小白鼠之血球容積。如所預期者，當投藥頻率減少時，需要更多量N47類似物來提高血球容積。每隔週投與200微克/公斤N47類似物之劑量在6週内提高之血球容積程度與每週投與12,5微克/公斤時大略相同。實例6 連續式不臥床腹膜透析（CAPD)患者之Epo類似物N47與 -36- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1234583 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

五、發明說明（34 ) rHuEpo之I V藥動力學由於老鼠與小獵犬實驗中，Epo N47類似物之血清半衰期比rHuEpo長’因此値仔測定這種延長結果是否亦出現在人體。進行一種爲八位穩定之CAPD患者（7位男性，4位女性， 27至75歲）設計·^項雙盲隨機父叉試驗。一組患者接受 100單位/公斤rHuEpo(相當於0.5微克肽/公斤），第二組患者則接受0.5微克肽/公斤Epo N47類似物，這二組均以單一大丸劑經靜脈内注射扳投藥。在投藥前及經靜脈内投與大丸劑後 5、10、15、30 分鐘及 1、2、5、8、12、16、24、 30、36、48、72及96小時，自内導管抽取靜脈血樣（3亳升）。經過2 8天清洗期後，第一組患者接受單一靜脈内劑量Epo類似物N47，而第二組患者接受單一靜脈内劑量之 rHuEpo。依第一個循環處理取血樣。利用ELISA測定血清中rHuEpo及Epo N47類似物濃度，並扣除内因性Epo底線濃度。交叉設計效果經過調整後估計之藥物動力學參數 (平均値土 SE)示於表5。採用線性梯形合計法計算血清濃度AUC。tl/2〆定義爲：l〇g(2)/Kz，其中&計算爲ln(血清濃度）時間曲線之末端部份斜率。排空率（CL)之定義：劑量/AUC。分析體積（Vd)之定義爲：Cl/Κ。表5 AUC 劑量組 N47 rHuEpo tl/2,

Cl (毫微克·小時/毫升）（小時）（毫升寺/公斤）（毫升/公斤） 291 ±7.6 253+2.2 1.6 + 0.3 52.4±2.〇131.9 士 8.3 8.5 + 2.4 4.〇±〇.3 48.7 + 2.1 •37- 太紙張尺廑適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 2Q7公蝥）

1234583 A7 __^_____B7 _ 五、發明說明（35 )

Epo N47類似物之平均血清半衣期（25·3小時）比rHuEpo 長3倍（8.5小時），出沾0〇之排空率比類似物^47快2.5倍。實例7

Epo N47類似物之11期劑量探討及投藥計劃研究進行多中心隨機之連續劑量階梯式實驗，探討類似物N47 當經皮下或靜脈内注射接受透析之CRF患者時之最佳劑量及投藥計劃：投藥計劃如下：每週投藥一次：0.075，0.225，0.45，0.75，1.5及4.5微克月太/公斤/劑量。每週投藥三次：0.025，0·075，0·15，0.25，〇·5及 1·5微克肽/公斤/劑量。本實驗分二部份進行：第一個部份爲劑量。階梯式實驗，其設計在於評估每週投藥一次或三次共4週内可使血球容積提高最適當比例（超過1克/公合，但小於3克/公合）時之劑量。各實驗之第二個部份係決定爲了維持血球容積在醫療目標内時所需劑量（經靜脈内或皮下投藥進徑每週投藥一次或三次）。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製初步實驗結果顯示，類似物N47每週投藥一次時，可同時提高並維持貧血之CRF患者之血球容積。最初結果顯示，最初依二種投藥途徑，每週三次之投藥計劃進行療法之較佳劑量爲〇.15及0.25微克/肽/公斤/劑量，每週一次之投藥計劃爲0.45及0.75微克/肽/公斤/劑量。 -38 -本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1234583

、發明說明（36 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製、雖然本發明已説明其較佳具體實施例〈具體實施例限制，反之，本笋-、纟又此揭示範圍乏m „ 尚函盍附錄之申請專利係招姑甘，口人軏圍所包括之各種修正及同等事物，該範圍 '、艮據，、廣義定義，因此可涵括所有此等修正及同等事物0 -39- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）

Claims

I234S&3i 18320號專利申請案中文申請專利範圍替換本(94年3月） A8 B8 C8 六、申請專利範圍修正補充公告本 •Γ種提高及維持哺乳動物血球容積之醫藥組合物，並投樂頻率低於為了得到同等血球容積目標之等莫耳量重組人類促紅血球生成素之投藥頻率，其包括醫療有效量之促、、、X血球生成素之高糖基化類似物。 2·根據申請專利範園第1項之醫藥組合物，其中投藥頻率係約每週投藥2次。根據申請專利範圍第！項之醫藥組合物，其中投藥頻率係約每週投藥1次。其中投藥頻率其中投藥頻率 •根據申請專利範圍第丨項之醫藥組合物係約每隔週投藥1次。 •根據申請專利範圍第1項之醫藥組合物係約每個月投藥i次。 6·，據申請專利範圍第3項之醫藥組合物，係提供每劑量每公斤每個促紅血球生成素肽約〇.〇75至4·5微克。 7 . 一種提高並維持哺乳動物之血球容積之醫藥組合物，其投藥量低於重組人類促紅血球生成素為了達到同等血球谷積目標時之莫耳量，其包括醫療有效量促紅血球生成素之高糖基化類似物。 8 ·根據申請專利範圍第7項之醫藥組合物，係提供為每週二次投與每劑量每公斤約〇〇25至1.5微克促紅血球生成素肽。 9 ·根據申請專利範圍第1或7項之醫藥組合物，其中促紅血球生成素之高糖基化類似物包含比人類促紅血球生成素至少多一個糖基化位置，其中碳水化合物鏈係加在本紙張尺度相巾g國家標準(CNS) Μ規格(21GX297公褒) A BCD 1234583 六、申請專利範圍此位置上。 10·根據申請專利範圍第1或7項之醫藥組合物，其中血球容積目標為至少約30%。 11 ·根據申请專利範圍第9項之醫藥組合物，其中碳水化合物鏈為位在人類促紅血球生成素序列中第3〇、5丨、57、 69、88、89、136及138位置中一處或多處之N-連接碳水化合物鍵。 12. 根據申請專利範圍第9項之醫藥組合物，其在人類促紅血球生成素序列中第3 〇及8 8個位置另具有其他N -連接碳水化合物鏈。 13. 根據申請專利範圍第1 2項之醫藥組合物，其係 Asn30Thr32Val87Asn88Thr90Epo。 14·根據申請專利範圍第1或7項之醫藥組合物，其包含醫藥上可接受之稀釋劑、載體、溶解劑、乳化劑、防腐劑及/ 或辅劑。 15·根據申請專利範圍第1 4項之醫藥組合物，其中稀釋劑為擰檬酸鈉或磷酸鈉之緩衝溶液。 16.根據申請專利範圍第1 4項之醫藥組合物，其中載體為人類血清白蛋白。 Π·根據申請專利範圍第1 4項之醫藥組合物，其中防腐劑為苄醇。 18.根據申請專利範圍第1或7項之醫藥組合物，其中哺乳動物罹患與腎功能下降或喪失有關之貧血。 19·根據申請專利範圍第1或7項之醫藥組合物，其中哺乳動 -2- 1234583 A8 B8 C8

申請專利範園物罹患與骨髓抑制性療法有關之貧血。 •根據申印專利範圍第1 9項之醫藥組合物，其中骨髓抑制性療法包括化療法或抗病毒藥物。 21·根據申請專利範圍第1或7項之醫藥組合物，其中哺乳動物罹患與失血過多有關之貧血。 22·根據申請專利範圍第1或7項之醫藥組合物，其尚包括投與醫療有效量之鐵。種人類促紅血球生成素之局糖基化類似物，其在人類促紅血球生成素序列中第52、53、55、86及114位置中任一處另含至少一個糖基化位置’其中N -連接之碳水化合物鏈即附加在此位置上。 24·根據申請專利範圍第23項之類似物，其另包含至少再二個糖基化位置，其中該位置之一者係為人類促紅血球生成素序列中第52、53、55、86及114位置中任一處，且其中N -連接之碳水化合物鏈分別附加在此等位置上。 25根據申請專利範圍第23項之類似物，其另包含至少再三個糖基化位置，其中該位置之一者係為人類促紅血球生成素序列中第52、53、55、86及114位置中任一處，且其中N -連接之碳水化合物鏈分別附加在此等位置上。 26·根據申請專利範圍第2 3項之類似物，其另包含至少再四個糖基化位置，其中該位置之一者係為人類促紅血球生成素序列中第52、53、55、86及114位置中任一處，且其中N-連接之碳水化合物鏈分別附加在此等位置上。 27· —種人類促紅血球生成素之高糖基化類似物，其係選自

1234583 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍下列所組成之群·· Asn52 Thr54 Epo ； Asn53 Thr55 Epo ； Asn30 Thr32 Val87 Asn88 Thr90 Thr125 Epo ； Asn114 Thr116 Epo ； Asn30 Thr32 Asn53 Thr55 Val87 Asn 88 Thr90 Epo ； Asn55 Thr57 Epo ； Asn86 Val87 Thr88 Epo ； Ala87 Asn88 Thr90 Epo ； Val87 Asn88 Ser90 Epo ； Val87 Asn88 Gly89 Thr90 Epo ； Asn30 Thr32 Asn53 Thr55 Epo ； Asn30 Thr32 Asn114 Thr116 Epo ;與 Asn30 Thr32 Asn53 Thr55 Val87 Asn88 Thr90 Asn114 Thr116 Epo o 28.根據中請專利範圍第23至27項任一項之類似物，其係外因性DNA序列之表現產物。 29· —種DNA序列，其編碼根據申請專利範圍第^至”項任一項之類似物。 30. —種真核生物宿主細胞，其經根據申請專利範圍第“項之DNA序列轉感染，使得宿主έ 于伯、、、田胞可以表現該類似物。 31. -種提高及維持哺乳動物之血球容積之醫藥組合物，其包括醫療有效量之根據申請專利範圍第门項至a項之任 -4. 1234583 A8 B8 C8 D8 、申請專利範園一項類似物。 32·根據申請專利範圍第3〗項之醫於重組人類促紅血球生成素為了達二’其投藥頻率低時之等莫耳量之投藥頻率。達到问寺血球容積目標 33.2=專利範圍第32項之醫藥組合物，其中類似物之技柒I為約每週一次，約每隔週—次，或約每月一次。 34.根據申請專利範圍第31項之醫藥組合物，其投藥量低於重組人類促紅血球生成素為了得到同等血球之莫耳量。裝 35·，據申請專利範圍第33項之醫藥組合物，其係提供投藥量為每週二次投與每劑量每公斤約〇 · 〇 2 5至i · 5微克促紅血球生成素肽。 36·根據申請專利範圍第3 3項之醫藥組合物，其係提供投藥量低於每週三次每劑量每公斤約〇 · 〇 2 5微克促紅血球生成素肽。 -5-本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐)