ES2434494T3 - Células huésped mejoradas y métodos de cultivo - Google Patents

Abstract

Método de aumento de la producción de una glicoproteína de interés en una célula huésped aislada que se hamodificado por ingeniería genética para sobreexpresar dicha glicoproteína de interés, comprendiendo dicho métodoaumentar en dicha célula huésped la expresión de alfa 1,2-manosidasa (MAN1C1) que es nativa para dicha célulahuésped.

Description

Células huésped mejoradas y métodos de cultivo

Campo de la invención

La invención se refiere a células huésped mejoradas y a métodos de cultivo que mejoran la producción de glicoproteínas.

Antecedentes de la invención

Son altamente deseables métodos de aumento de la producción de proteína huésped recombinante en la industria farmacéutica y en el laboratorio de muchas maneras, incluyendo ahorros de costes, ahorros de tiempo y capacidad de fabricación. El tratamiento con butirato de sodio ha sido un método de aumento de la producción de proteína en cultivo celular en procedimientos biofarmacéuticos comerciales. Sin embargo, el beneficio derivado del aumento de los rendimientos de proteína algunas veces se compensa por los efectos secundarios tóxicos del butirato de sodio.

El butirato de sodio es un ácido graso de cadena corta que inhibe la enzima histona desacetilasa (HDAC) responsable del mantenimiento de la estructura de la cromatina en el núcleo de las células (Davie, J. Nutrition 133: 2485S-2493S, 2003). La pérdida de actividad da como resultado una alteración en la regulación transcripcional de genes a través del proceso de acetilación y desacetilación normal de las histonas (Prasad et al., In Vitro 12: 125-132, 1976). Se ha mostrado que el cambio en la regulación transcripcional aumenta la productividad específica de líneas celulares que producen proteínas recombinantes in vitro. Por ejemplo, se ha mostrado que el butirato de sodio aumenta la síntesis de hormona foliculoestimulante (FSH) recombinante secretada, activador del plasminógeno tisular (tPA), eritropoyetina (EPO) y trombopoyetina (TPO) en células de ovario de hámster chino (CHO) (Sung et al.,

J. Biotechnology 112: 323-335, 2004; Hendrick et al. Cytotechnology 36: 71-83, 2001; Chung et al., J. Microbiol. Biotechnol. 11, 1087-1092, 2001; Chotigeat et al., Cytotechnology 15: 217-221, 1994; Chang et al., Free Radical Research 30: 85-91, 1999). No está claro el mecanismo preciso responsable de estos aumentos. Se ha mostrado que el tratamiento con butirato de sodio aumenta transitoriamente los niveles de ARNm para proteína recombinante, dando como resultado aumentos en la biosíntesis de proteínas resultante (Yuan et al., J. Biol. Chem. 260: 37783783, 1985).

Se han estudiado previamente los cambios en la expresión génica provocados por el butirato de sodio en líneas celulares implicadas en la investigación del cáncer de colon. Los estudios demostraron que el butirato de sodio altera la expresión de múltiples genes implicados en la progresión del ciclo celular, diferenciación, señalización por citocinas y apoptosis. Sin embargo, tales estudios se limitaban a un subconjunto relativamente pequeño de genes y no determinaron si los genes estaban implicados en la biosíntesis de proteínas. (Joseph et al., Oncogene 23: 63046315, 2004; Tabuchi et al., Biochem. Biophys. Research Comm. 293: 1287-1294, 2002; Iacomino et al., Biochem. Biophys. Research Comm. 285: 1280-1289, 2001; Mariadason et al., Cancer Res. 60: 4561-4572, 2000; Della Ragione et al., FEBS Letters 499, 199-204, 2001).

La enzima alfa 1,2 manosidasa I (MAN1C1) es una enzima implicada en el procesamiento de oligosacáridos unidos en N a glicoproteínas que se ha descrito en Tremblay et al. (Glycobiology 8: 585-595, 1998) y Gonzalez et al. (J. Biol. Chem. 274: 21375-21386, 1999). La enzima cataliza la primera etapa de recorte de la manosa asociada con el procesamiento de estructuras oligosacáridas con alto contenido en manosa eliminando un azúcar manosa terminal del oligosacárido. La glicosilación N-terminal implica la adición y eliminación de diversos azúcares de monosacáridos en los compartimentos de tanto el retículo endoplasmático (RE) como el aparato de Golgi (Kornfeld et al., Ann. Rev. Biochem. 54: 631-664, 1985). En el RE, la glicosilación unida a N va acompañada por el plegamiento de las glicoproteínas nacientes para dar su estructura nativa a través de interacciones con chaperonas moleculares (Ellgaard et al., Science 286: 1882-1888, 1999; Jakob et al., J. Cell Biol. 142: 1223-1233, 1998). Este proceso se ha denominado control de calidad del RE, y si se bloquea el proceso debido a una proteína mal plegada, normalmente se produce el comienzo de la degradación asociada al RE, o ERAD, de la proteína (Ellgaard et al., Curr. Opin. Cell Biol. 13: 431-437, 2001; Sifers, Science 299: 1330-1331, 2003; Oda et al., Science 299: 1394-1397, 2003; Molinari et al., Science 299: 1397-1400, 2003; Hurtley et al., Ann. Rev. Cell Biol. 5: 277-307, 1989). Se ha mostrado que la eliminación de un azúcar manosa terminal desde Man9 hasta Man8 por la enzima alfa 1,2 manosidasa I (MAN1C1) afecta al comienzo de la respuesta de ERAD (Liu et al., J. Biol. Chem. 274: 5861-5867, 1999; Grinna et al. J. Biol. Chem. 255, 2255-2258, 1980).

En vista de la toxicidad de inductores de la producción de proteína tales como butirato de sodio, existe una necesidad de otros medios de aumento de la producción global de proteínas recombinantes en cultivo celular.

El documento WO 00/65070 A2 da a conocer un método para producir una glicoproteína en el que se cultivan células huésped que expresan dicha glicoproteína en presencia de un factor que modifica el estado de crecimiento en un cultivo celular, un catión de metal divalente o un componente plasmático. Se sugiere que las células huésped

deben expresar también enzimas que proporcionan las reacciones de modificación postraduccional apropiadas, entre otras alfa-1,2-manosidasa.

En el documento WO 2004/081201 A1, se da a conocer la expresión de una glucosidasa II mutante en combinación con alfa-1,2-manosidasa en Trichoderma reesei. La expresión de la glucosidasa II mutante aumenta la secreción de proteínas en las células. La expresión simultánea de alfa-1,2-manosidasa pretende proporcionar un perfil de glicosilación de tipo humano.

Ninguno de estos documentos da a conocer o sugiere que la sobreexpresión de alfa-1,2-manosidasa en una célula huésped aumente eficazmente la cantidad de una glicoproteína que se produce en dicha célula huésped.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a un método de aumento de la producción de una glicoproteína de interés en una célula huésped aislada que se ha modificado por ingeniería genética para sobreexpresar dicha glicoproteína de interés, comprendiendo dicho método aumentar en dicha célula huésped la expresión de alfa 1,2-manosidasa (MAN1C1) que es nativa para dicha célula huésped.

En una realización preferida de la invención, la célula huésped usada en el método de la invención se transfecta con un vector que comprende un ácido nucleico que codifica para MAN1C1 operativamente unido a una secuencia de control de la expresión heteróloga. En otra realización preferida, la célula huésped comprende una secuencia de control de la expresión heteróloga que está operativamente unida a un ácido nucleico que codifica para MAN1C1.

En una realización preferida adicional, la célula huésped se ha transfectado con un vector que comprende un ácido nucleico que codifica para dicha glicoproteína de interés operativamente unido a una secuencia de control de la expresión heteróloga. En otra realización preferida, la célula huésped comprende una secuencia de control de la expresión heteróloga operativamente unida a un ácido nucleico que codifica para dicha glicoproteína de interés.

El método de la invención puede usarse para producir cualquier glicoproteína o proteína de interés. Preferiblemente, la glicoproteína es una molécula estimulante de la eritropoyesis, tal como eritropoyetina o darbepoetina, o análogos, variantes o derivados de la misma. En una realización preferida de la invención, la glicoproteína es la eritropoyetina de SEQ ID NO:3 o la darbepoetina de SEQ ID NO:5.

En una realización preferida adicional de la invención, la célula huésped es una célula CHO, una célula humana, una célula BHK, una célula NS/0 o una célula HT-1080.

La presente invención puede usar células huésped modificadas por ingeniería genética para sobreexpresar alfa 1,2 manosidasa (MAN1C1) y una glicoproteína o proteína de interés. Tales células huésped pueden comprender una secuencia de control de la expresión heteróloga operativamente unida a un ácido nucleico que codifica para MAN1C1, y una secuencia de control de la expresión heteróloga operativamente unida a un ácido nucleico que codifica para tal glicoproteína. La células huésped pueden modificarse por ingeniería genética para sobreexpresar cualquiera de o tanto MAN1C1 como la glicoproteína de interés mediante cualquier medio conocido en la técnica, incluyendo transfección con un vector que comprende un ácido nucleico que codifica para la proteína, estando el ácido nucleico operativamente unido a una secuencia de control de la expresión heteróloga, o transfección con una secuencia de control de la expresión que regula por incremento la expresión de proteína endógena.

Se contempla además que una célula huésped de este tipo exprese la proteína MAN1C1 a un nivel que aumenta la cantidad (pg/mg de proteína) o productividad específica (pg/célula/día) de tal glicoproteína producida. Las mejoras en tal producción de glicoproteína o productividad específica pueden ser, por ejemplo, de al menos 2 veces, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 ó 20 veces o superiores.

Otras características y ventajas de la invención resultarán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada. Sin embargo, debe entenderse que la descripción detallada y los ejemplos específicos, aunque indican realizaciones a modo de ejemplo de la invención, se facilitan a modo de ilustración sólo, porque diversos cambios y modificaciones dentro del espíritu y alcance de la invención resultarán evidentes para los expertos en la técnica a partir de esta descripción detallada.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 presenta la productividad específica de rHuBPO medida (Qp) a lo largo de un cultivo de 5 días en presencia de butirato de sodio.

La figura 2A muestra el efecto del tratamiento con ARNip de MAN1C1 sobre rHuEPO QP en presencia de butirato de sodio a lo largo de un periodo de 5 días. La figura 2B presenta el cambio en veces en los niveles de ARNm de

MAN1C1 en células HT1080 tratadas con butirato de sodio o butirato de sodio más ARNip.

La figura 3 presenta los cambios en los niveles de ARNm de rHuEPO en células HT1080 tratadas con butirato de sodio en presencia y ausencia de ARNip dirigido contra MAN1C1.

La figura 4 presenta los cambios en la productividad específica de rHuEPO tras la transfección transitoria con cantidades variables de ADN de MAN1C1.

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona métodos para aumentar la producción recombinante de una proteína de interés en células huésped. Tal como se usa en el presente documento, una “proteína de interés” es una proteína (distinta de MAN1C1) para la que se desea la producción recombinante de cantidades a granel de tal proteína.

La expresión de niveles superiores de MAN1C1 da como resultado mejoras en la productividad específica y/o producción de proteína de la proteína de interés.

La invención también contempla la mejora de la producción de proteína o el aumento de la productividad específica que implica el aumento de los niveles de actividad de MAN1C1 en células huésped a través de la introducción de inductores químicos que aumentan la producción de proteína MAN1C1, o inductores químicos que aumentan la actividad específica de la MAN1C1 expresada.

La invención contempla métodos en los que la productividad específica mejorada mide al menos 2 pg de glicoproteína/célula/día. En realizaciones a modo de ejemplo, la productividad específica mide al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 ó 100 pg de glicoproteína/célula/día. Sin embargo, se contempla una productividad específica mayor, especialmente con el uso de inductores adicionales.

La presente invención determinó que un mecanismo mediante el cual el butirato de sodio aumenta la producción de proteína es a través de la regulación por incremento de la expresión de MAN1C1, un gen implicado en la glicosilación de proteínas. Los datos descritos en el presente documento muestran que altos niveles de expresión de MAN1C1 no alteran significativamente la glicosilación de glicoproteínas sino que aumentan inesperadamente la cantidad de proteína recombinante producida. Se mostró que la expresión de ARNm de MAN1C1 aumenta drásticamente cuando se tratan las células con butirato de sodio, hasta aproximadamente 10 veces superior a lo largo de un periodo de 24 horas y más de 40 veces a lo largo de un periodo de cinco días. El tratamiento de células huésped que expresan una proteína recombinante de interés con ARNip para reducir la expresión de proteína MAN1C1 redujo en un 50% el aumento inducido por butirato de sodio. Más específicamente, la presente invención proporciona un método de aumento de la producción de una glicoproteína de interés en células huésped que se han modificado por ingeniería genética para sobreexpresar dicha glicoproteína de interés, comprendiendo dicho método aumentar en dicha célula huésped la expresión de alfa 1,2-manosidasa (MAN1C1) que es nativa para dicha célula huésped.

Producción de la proteína de interés. Además, la sobreexpresión de MAN1C1 en ausencia de butirato de sodio dio como resultado un aumento de 2-3 veces en la producción de la proteína de interés. Por tanto, el aumento de la expresión de MAN1C1 contribuye al aumento en la productividad específica de la proteína de interés.

El término “ácido nucleico aislado” se refiere a un ácido nucleico de la invención que está libre de al menos un ácido nucleico contaminante con el que está asociado de manera natural. Un “ácido nucleico” se refiere a una secuencia de ADN o ARN, que incluye opcionalmente bases artificiales o análogos de bases.

El término “identidad” (o “tanto por ciento idéntico”) es una medida del tanto por ciento de coincidencias idénticas entre la más pequeña de dos o más secuencias con alineaciones de huecos (si hay alguno) abordada mediante un programa informático o modelo matemático particular (es decir, “algoritmos”). El término “similitud” es un concepto relacionado pero, en contraposición a “identidad”, incluye tanto coincidencias idénticas como coincidencias de sustituciones conservativas. La identidad y similitud de polipéptidos y moléculas de ácido nucleico relacionadas pueden calcularse fácilmente mediante métodos conocidos. Los métodos preferidos para determinar la identidad y/o similitud están diseñados para proporcionar la coincidencia más larga entre las secuencias sometidas a prueba. Se describen métodos para determinar la identidad y similitud en programas informáticos disponibles públicamente. Los métodos de programas informáticos a modo de ejemplo para determinar la identidad y similitud entre dos secuencias incluyen, pero no se limitan a, el paquete de programas GCG, que incluye GAP (Devereux et al., Nucl. Acids. Res.

12: 387, 1984; Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.), BLASTP, BLASTN y FASTA (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990)). El programa BLASTX está disponible públicamente del National Center for Biotechnology Information (NCBI) y otras fuentes (BLAST Manual, Altschul et al. NCB/NLM/NIH Bethesda, Md. 20894; Altschul et al., citado anteriormente). También puede usarse el algoritmo de Smith-Waterman bien conocido para determinar la identidad. Los parámetros preferidos para una comparación de secuencias

polipeptídicas incluyen los siguientes: algoritmo: Needleman et al., J. Mol. Biol. 48: 443-453, 1970, matriz de comparación: BLOSUM 62 de Henikoff et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 89: 10915-10919, 1992); penalización por huecos: 12, penalización por longitud de huecos: 4, umbral de similitud: 0. El programa GAP es útil con los parámetros anteriores (junto con ausencia de penalización para huecos de extremos). Los parámetros preferidos para comparaciones de secuencias de moléculas de ácido nucleico incluyen los siguientes: algoritmo: Needleman et al., J. Mol. Biol., 48 443-453, 1970; coincidencias con la matriz de comparación=+10, apareamiento erróneo=0, penalización por huecos: 50, penalización por longitud de huecos: 3. El programa GAP también es útil con los parámetros anteriores. Los expertos en la técnica pueden usar otros algoritmos, penalizaciones por apertura de huecos, penalizaciones por extensión de huecos, matrices de comparación, umbrales de similitud, etc. a modo de ejemplo.

El término “operativamente unido” se refiere a un enlace funcional entre una secuencia de control de la expresión y una segunda secuencia de ácido nucleico, en el que la expresión de la secuencia de control dirige la transcripción del ácido nucleico correspondiente a la segundo secuencia.

La frase “condiciones de hibridación rigurosas” se refiere a condiciones en las que una sonda se hibridará con su subsecuencia diana, normalmente en una mezcla compleja de ácido nucleico, pero no otras secuencias. La rigurosidad de la hibridación está determinada principalmente por la temperatura, fuerza iónica y la concentración de agentes desnaturalizantes tales como formamida. Ejemplos de “condiciones altamente rigurosas” para hibridación y lavado son cloruro de sodio 0,015 M, citrato de sodio 0,0015 M a 65-68ºC o cloruro de sodio 0,015 M, citrato de sodio 0,0015 M y formamida al 50% a 42ºC. Véanse Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, (Cold Spring Harbor, N.Y. 1989); (1989) y Anderson et al., Nucleic acid Hybridisation: Hybridization: a practical approach, cap. 4, IRL Press Limited (Oxford, Inglaterra). Limited, Oxford, Inglaterra (1999). Ejemplos de condiciones “moderadamente rigurosas” típicas son cloruro de sodio 0,015 M, citrato de sodio 0,0015 M a 50-65ºC o cloruro de sodio 0,015 M, citrato de sodio 0,0015 M y formamida al 20% a 37-50ºC. A modo de ejemplo, una condición “moderadamente rigurosa” de 50ºC en ión sodio 0,015 M permitirá aproximadamente un 21% de apareamiento erróneo.

Los expertos en la técnica apreciarán que no hay ninguna distinción absoluta entre condiciones “altamente” y “moderadamente” rigurosas. Por ejemplo, a ión sodio 0,015 M (sin formamida), la temperatura de fusión de ADN largo perfectamente coincidente es de aproximadamente 71ºC. Con un lavado a 65ºC (a la misma fuerza iónica), esto permitiría aproximadamente un 6% de apareamiento erróneo. Para capturar secuencias relacionadas más distantemente, un experto en la técnica puede simplemente reducir la temperatura o elevar la fuerza iónica.

El término “vector” se usa para referirse a cualquier molécula (por ejemplo, ácido nucleico, plásmido o virus) usada para transferir información codificante a una célula huésped.

El término “vector de expresión” se refiere a un vector que es adecuado para su uso en una célula huésped y contiene secuencias de ácido nucleico que dirigen y/o controlan la expresión de secuencias de ácido nucleico deseadas (“secuencias de control de la expresión”). Las secuencias de control de la expresión adecuadas incluyen promotores constitutivos o inducibles o regulables, potenciadores o una serie de sitios de unión a factores de transcripción. “Expresión” incluye, pero no se limita a, procesos que conducen a la producción de proteína tal como transcripción, traducción y corte y empalme del ARN, si están presentes intrones.

Una secuencia de control de la expresión “heteróloga” operativamente unida a un ácido nucleico se refiere a una secuencia de control de la expresión que está operativamente unida a un ácido nucleico (incluyendo un gen) que es diferente del gen al que la secuencia de control de la expresión está operativamente unida normalmente en su estado nativo.

El término “célula huésped” se usa para referirse a una célula que se ha transformado, o que puede transformarse con una secuencia de ácido nucleico y luego expresar un gen de interés seleccionado. El término incluye la progenie de la célula original, ya sea la progenie idéntica o no en morfología o en constitución genética al antecesor original, siempre que esté presente el gen seleccionado.

Tal como se usa en el presente documento, una célula huésped “modificada por ingeniería genética para sobreexpresar” una proteína (o un ácido nucleico que codifica para tal proteína) es una célula huésped, incluyendo un descendiente de la misma, que se ha alterado de una forma tal que se expresan niveles superiores a los normales de tal proteína, en comparación con la célula huésped no alterada. Por tanto, se incluye dentro de esta categoría la expresión de proteínas foráneas para la célula huésped, proteínas que no se expresan de manera natural por la célula huésped o proteínas expresadas de manera natural por la célula huésped a niveles relativamente bajos que aumentan tras la alteración de la célula huésped.

Los encabezamientos de secciones se usan en el presente documento para fines de organización sólo, y no debe interpretarse que limitan de ningún modo la materia descrita.

Aumento de la actividad alfa 1,2-manosidasa (MAN1C1)

La invención contempla que puede lograrse el aumento de los niveles de actividad alfa 1,2-manosidasa (MAN1C1) en células huésped durante la producción de una proteína de interés a través de cualquier medio conocido en la técnica, incluyendo la adición de un inductor químico o a través de sobreexpresión de la enzima MAN1C1. La enzima MAN1C1 que la célula huésped sobreexpresa puede tener la misma secuencia que o una secuencia similar a MAN1C1 que es endógena, o nativa, para la célula huésped. Por tanto, puede sobreexpresarse MAN1C1 humana en células huésped humanas, puede sobreexpresarse MAN1C1 de CHO en células huésped CHO, y de manera similar puede sobreexpresarse enzima nativa que porta la función MAN1C1 en otras células huésped. Sin embargo, puede usarse cualquier enzima MAN1C1 que funcione del mismo modo en la célula huésped deseada, incluyendo un ortólogo, o un fragmento, variante, análogo o derivado biológicamente activo.

Tal como se usa en el presente documento, “análogo” se refiere a una secuencia de aminoácidos o nucleótidos que tiene inserciones, deleciones o sustituciones en relación con la secuencia original, aunque todavía mantiene sustancialmente la actividad biológica de la secuencia original, tal como se determina usando ensayos biológicos conocidos por un experto en la técnica. “Variantes” incluyen variantes alélicas que se producen de manera natural, variantes de corte y empalme o formas polimórficas de la secuencia original. Los “derivados” de polipéptidos variantes o análogos que se producen de manera natural incluyen los que se han modificado químicamente, por ejemplo, para unirse a polímeros solubles en agua (por ejemplo, polietilenglicol), radionúclidos u otros restos terapéuticos o de direccionamiento o de diagnóstico, cualquiera de los cuales puede unirse directa o indirectamente a través de ligadores.

“Biológicamente activo” con respecto a un polipéptido de MAN1C1 significa que el fragmento, variante, derivado o análogo del mismo conserva una actividad similar en la mejora de la productividad específica, por ejemplo tal como se mide como la cantidad de proteína de interés producida por célula al día, o conserva una actividad enzimática similar en la eliminación de manosa de un sustrato que contiene manosa adecuado. “Biológicamente activo” con respecto a un ácido nucleico de MAN1C1 significa que el ácido nucleico codifica para un polipéptido de MAN1C1 biológicamente activo de este tipo.

Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de una MAN1C1 humana a modo de ejemplo se exponen en SEQ ID NO: 1 y 2, respectivamente. Los nucleótidos 331 a 2223 del polinucleótido de SEQ ID NO: 1 codifican para el polipéptido de MAN1C1 de SEQ ID NO: 2. Las secuencias de nucleótidos y polipeptídicas para MAN1C1 humana (SEQ ID NO: 1 y 2, respectivamente, se identificaron por Tremblay et al. (J. Biol. Chem. 275: 31655-31660, 2000) y se proporcionan en el n.º de registro de Genbank: AF261655. Se identifican secuencias polinucleotídicas y polipeptídicas a modo de ejemplo de otros ortólogos y variantes de MAN1C1 en los n.os de registro de Genbank AB209275 (SEQ ID NO: 12 y 13) y DV567987 (SEQ ID NO: 14).

El término “MAN1C1” tal como se usa en el presente documento se refiere a MAN1C1 humana (el polipéptido de SEQ ID NO: 2 codificado por el polinucleótido de SEQ. ID NO: 1), ortólogos de la misma, o un fragmento, variante, análogo o derivado biológicamente activo de la enzima humana u ortólogos. Los análogos a modo de ejemplo conservan el 65% o una identidad de aminoácidos superior con la secuencia original, o el 70%, el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 91%, el 92%, el 93%, el 94%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98% o el 99% o una identidad superior. Los fragmentos a modo de ejemplo incluyen fragmentos de al menos 25, 50, 75, 100 o más residuos de aminoácido de un polipéptido de MAN1C1. Otros fragmentos, variantes, análogos o derivados de MAN1C1 a modo de ejemplo incluyen los codificados por ácidos nucleicos que se hibridarían en condiciones alta o moderadamente rigurosas con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 o cualquier otro ortólogo de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1

Tal como se usa en el presente documento, el término “ácido nucleico de MANIC1” o “polinucleótido de MANIC1” se refiere a un ácido nucleico que codifica para cualquiera de los polipéptidos anteriores, incluyendo una secuencia de nucleótidos tal como se expone en SEQ ID NO: 1, o ácidos nucleicos que comprenden secuencias de nucleótidos que son al menos aproximadamente el 65%, el 70%, el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98%, el 99% o el 100% idénticas a la misma, o ácidos nucleicos que se hibridan en condiciones moderada o altamente rigurosas tal como se define en el presente documento con el complemento de SEQ ID NO: 1 o cualquier otro ortólogo de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1.

También se entiende que los ácidos nucleicos de MAN1C1 incluyen variantes alélicas o de corte y empalme de un ácido nucleico de MAN1C1 de SEQ ID NO: 1 o cualquier otro ortólogo, e incluyen secuencias de nucleótidos que son complementarias a cualquiera de las secuencias de nucleótidos anteriores.

Cuando se ha identificado un gen que codifica para un polipéptido de MAN1C1 de una especie, puede usarse todo o una parte de ese gen como sonda o cebador para identificar genes correspondientes de otra especie (ortólogos, u “homólogos de especie”) o genes relacionados de la misma especie (homólogos). Las sondas o los cebadores pueden usarse para el examen por hibridación o la amplificación por PCR de bibliotecas de ADN genómico o ADNc de diversas fuentes de tejido que se cree que expresan el gen de MAN1C1. Un experto habitual en la técnica puede

determinar las condiciones apropiadas de rigurosidad de la hibridación. También pueden usarse técnicas bioinformáticas para identificar ortólogos, en las que se examinan colecciones de secuencias de diversas especies de mamíferos u otras para detectar secuencias de nucleótidos o polipeptídicas que presentan homología significativa con secuencias de MAN1C1 conocidas. También pueden identificarse ácidos nucleicos que codifican para polipéptidos de MAN1C1 mediante clonación de expresión que emplea la detección de clones positivos basándose en una propiedad de la proteína expresada. Normalmente, se examinan bibliotecas de ácido nucleico mediante la unión de un anticuerpo u otra pareja de unión (por ejemplo, receptor o ligando) a proteínas clonadas que se expresan y se presentan sobre la superficie de una célula huésped. El anticuerpo o pareja de unión se modifica con un marcador detectable para identificar las células que expresan el clon deseado.

Aunque la invención contempla principalmente que se sobreexpresará MAN1C1, es decir, se expresará en la célula huésped alterada a un nivel mayor que el normal en la célula huésped no alterada, la invención también contempla métodos para disminuir o inhibir la expresión de MAN1C1 en células, por ejemplo a través de la administración de ARNip o compuestos antisentido.

Inductores de la producción de proteína

La invención también contempla el uso de otros inductores conocidos de la producción de proteína en combinación con las células huésped que sobreexpresan MAN1C1 y otra proteína de interés, para aumentar adicionalmente la producción global de la proteína de interés. Los inductores conocidos incluyen, pero no se limitan a, los siguientes compuestos: N-acetil-L-cisteína, actinomicina D, 7-amino-, Bafilomicina A1, Streptomyces griseus, calfostina C, Cladosporium cladosporioides, camptotecina, Camptotheca acuminata, CAPE, 2-cloro-2’-desoxiadenosina, 5’trifosfato de 2-cloro-2’-desoxiadenosina, sal de tetralitio, cicloheximida, ciclofosfamida monohidrata, ciclosporina, Trichoderma polisporum, daunorubicia, clorhidrato, dexametasona, doxorubicina, clorhidrato, (-)-galato de epigalocatequina, etopósido, fosfato de etopósido, ET-18-OCH3, 5-fluorouracilo, H-7, diclorhidrato, genisteína, 4hidroxinonenal, 4-hidroxifenilretinamida, hidroxiurea, inhibidor de IL-1β, (6)-S-nitroso-N-acetilpenicilamina, Snitrosoglutatión, 12-miristato-13-acetato de forbol, puromicina, diclorhidrato, ácido 1-pirrolidincarboditioico, sal de amonio, quercetina, dihidratada, rapamicina, butirato de sodio, 4-fenilbutirato de sodio, D-eritro-esfingosina, N-acetil-, D-eritro-esfingosina, N-octanoil-, estaurosporina, Streptomyces sp., sulindaco, tapsigargina, TRAIL, E. coli, tricostatina A, Streptomyces sp., (6)-verapamilo, clorhidrato, veratridina, vitamina D3, 1α, 25-dihidroxi- y succinato de vitamina E (VWR y Calbiochem).

La invención contempla además la identificación de otros productos químicos que mejoran la producción de proteína a través del aumento de la actividad de MAN1C1, por ejemplo mediante el aumento de la expresión de MAN1C1. Pueden determinarse aumentos en la actividad de MAN1C1 tal como se describe por Tremblay et al. (2000, citado anteriormente).

Pueden determinarse aumentos en la expresión de MAN1C1 midiendo cantidades relativas de ARNm de MAN1C1 producido tal como se describe en el ejemplo 4 (usando el chip Affymetrix) o el ejemplo 5 (PCR cuantitativa), o proteína MAN1C1 producida mediante ELISA, HPLC o otros métodos conocidos en la técnica tal como se describe por Tremblay et al. (2000, citado anteriormente).

Proteínas de interés para producción recombinante

La proteína de interés recombinante que la célula huésped sobreexpresa puede ser cualquier polipéptido, o bien endógeno (nativo) o bien exógeno para la célula. Proteínas de interés a modo de ejemplo son glicoproteínas, incluyendo glicoproteínas secretadas. En realizaciones a modo de ejemplo, la glicoproteína de interés es una molécula estimulante de la eritropoyesis, descrita a continuación.

La cantidad de proteína de interés recombinante producida puede medirse como “productividad específica”, que es la cantidad de proteína de interés producida por célula al día. La cantidad de proteína de interés recombinante producida también puede medirse mediante la cantidad de proteína de interés producida por cantidad de proteína celular. Se conocen bien en la técnica métodos de medición de la productividad específica o producción de proteína.

Las proteínas de interés recombinantes para las que puede aumentarse la expresión usando los materiales y métodos de la invención pueden ser cualquier polipéptido, o bien endógeno o bien exógeno para la célula. Proteínas de interés recombinantes a modo de ejemplo son glicoproteínas, especialmente glicoproteínas N-glicosiladas. Las glicoproteínas de interés a modo de ejemplo incluyen glicoproteínas secretadas tales como moléculas estimulantes de la eritropoyesis.

Los términos “polipéptido” y “proteína” se usan de manera intercambiable en el presente documento.

El término “moléculas estimulantes de la eritropoyesis” tal como se usa en el presente documento incluye eritropoyetina humana (SEQ. ID NO.: 3) o una variante, derivado o análogo biológicamente activo de la misma,

incluyendo un derivado modificado químicamente de tal proteína o análogo. Los aminoácidos 1 a 165 de SEQ ID NO: 3 constituyen la proteína madura. Otra molécula estimulante de la eritropoyesis a modo de ejemplo es la darbepoetina (SEQ ID NO: 5). Los aminoácidos 1 a 165 de SEQ. ID NO: 5 constituyen la proteína madura. También se contemplan análogos de eritropoyetina (SEQ ID NO.: 3) o darbepoetina (SEQ. ID NO: 5), con el 65%, el 70%, el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 91%, el 92%, el 93%, el 94%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98% o el 99% de identidad con SEQ. ID NO: 3 o SEQ. ID NO: 5, respectivamente, y que conservan todavía actividad eritropoyética.

Se describen secuencias a modo de ejemplo, la fabricación, purificación y el uso de eritropoyetina humana recombinante en varias publicaciones de patente, incluyendo pero sin limitarse a la patente estadounidense

4.703.008 concedida a Lin y Lai et al. patente estadounidense 4.667.016, cada una de las cuales se incorpora en el presente documento como referencia en su totalidad. La darbepoetina es un análogo de eritropoyetina hiperglicosilado que tiene cinco cambios en la secuencia de aminoácidos de rHuEPO que proporcionan dos cadenas de hidrato de carbono adicionales. Más específicamente, la darbepoetina contiene dos cadenas de hidrato de carbono unidas en N adicionales en los residuos de aminoácido 30 y 88 de SEQ ID NO: 5. Se describen secuencias a modo de ejemplo, la fabricación, purificación y el uso de darbepoetina y otros análogos de eritropoyetina en varias publicaciones de patente, incluyendo Strickland et al., 91/05867, Elliott et al., documento WO 95/05465, Egrie et al., documento WO 00/24893 y Egrie et al. documento WO 01/81405, cada uno de los cuales se incorpora en el presente documento como referencia en su totalidad. Los derivados de polipéptidos análogos o que se producen de manera natural incluyen los que se han modificado químicamente, por ejemplo, para unir polímeros solubles en agua (por ejemplo, pegilado), radionúclicos u otros restos terapéuticos o de direccionamiento o de diagnóstico.

El término “actividad eritropoyética” significa la actividad para estimular la eritropoyesis tal como se demuestra en un ensayo in vivo, por ejemplo, el ensayo de ratón policitémico exhipóxico. Véase, por ejemplo, Cotes y Bangham, Nature 191:1065 (1961).

Otros polipéptidos de interés para los que puede aumentarse la producción recombinante usando los materiales y métodos de la invención incluyen citocinas, proteínas de tipo inmunoglobulina, anticuerpos y pepticuerpos, y análogos, variantes o derivados de cualquiera de estas proteínas.

Las proteínas de interés a modo de ejemplo incluyen factor estimulante de las colonias de granulocitos (GCSF), factor de células madre, leptina, hormonas, citocinas, factores hematopoyéticos, factores de crecimiento, factores antiobesidad, factores tróficos, factores antiinflamatorios, receptores o receptores solubles, tales como un fragmento soluble de p80 TNF-R, enzimas y fusiones de Fc de cualquiera de los anteriores. Otros ejemplos incluyen insulina, gastrina, prolactina, hormona adrenocorticotropa (ACTH), hormona estimulante del tiroides (TSH), hormona luteinizante (LH), hormona foliculoestimulante (FSH), gonadotropina coriónica humana (HCG), motilina, interferones (alfa, beta, gamma), interleucinas (IL-1 a IL-12), factor de necrosis tumoral (TNF), proteína de unión a factor de necrosis tumoral (TNF-bp) o receptor de TNF I o II, factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), factor neurotrófico derivado de la glía (GDNF), factor neurotrófico 3 (NT3), factores de crecimiento de fibroblastos (FGF), factor de crecimiento neurotrófico (NGF), factores de crecimiento óseos tales como osteoprotegerina (OPG), factores de crecimiento similares a la insulina (IGF), factor estimulante de las colonias de macrófagos (MCSF), factor estimulante de las colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), factor de crecimiento derivado de megacariocitos (MGDF), factor de crecimiento de queratinocitos (KGF), trombopoyetina, factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PGDF), factores de crecimiento estimulantes de colonias (CSF), proteína morfogenética ósea (BMP), superóxido dismutasa (SOD), activador del plasminógeno tisular (TPA), urocinasa, estreptocinasa o calicreína, receptores o receptores solubles, enzimas, variantes, derivados o análogos incluyendo fusiones de Fc de cualquiera de estas proteínas.

Tal como se usa en el presente documento, el término “anticuerpo” incluye anticuerpos completamente ensamblados, anticuerpos monoclonales (incluyendo anticuerpos humanos, humanizados o quiméricos), anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos), maxicuerpo y fragmentos de anticuerpos que pueden unirse a antígeno (por ejemplo, Fab’, F’(ab)2, Fv, anticuerpos de cadena sencilla, diacuerpos), que comprenden regiones determinantes de complementariedad (CDR) de los anteriores siempre que presenten la actividad biológica deseada.

Anticuerpos a modo de ejemplo son Herceptin® (trastuzumab), un anticuerpo monoclonal humanizado derivado de ADN recombinante que se une selectivamente al dominio extracelular del receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano (Her2); y Rituxan® (rituximab), un anticuerpo monoclonal murino/humano quimérico diseñado por ingeniería genética dirigido contra el antígeno CD20 que se encuentra en la superficie de linfocitos B normales y malignos. Otros anticuerpos a modo de ejemplo incluyen Avastin® (bevacizumab), Bexxar® (tositumomab), Campath® (alemtuzumab), Erbitux® (cetuximab), Humira® (adalimumab), Raptiva® (efalizumab), Remicade® (infliximab), ReoPro® (abciximab), Simulect® (basiliximab), Synagis® (palivizumab), Xolair® (omalizumab), Zenapax® (caclizumab), Zevalin® (ibritumomab tiuxetan) o Milotarg® (gemtuzumab ozogamicina), receptores o receptores solubles, enzimas, variantes, derivados o análogos de cualquiera de estos anticuerpos.

Se describen en general pepticuerpos, moléculas que comprenden un dominio Fc de anticuerpo unido a al menos un

péptido de unión a antígeno, en la publicación PCT WO 00/24782, publicada el 4 de mayo de 2000. Las proteínas de tipo inmunoglobulina, miembros de la superfamilia de inmunoglobulinas, contienen uno o más dominios de tipo inmunoglobulina que se pliegan en estructuras similares a partes de la región variable de anticuerpos.

Modificación por ingeniería genética de células huésped para sobreexpresar proteína

Pueden modificarse por ingeniería genética células huésped para sobreexpresar una proteína de una variedad de modos conocidos en la técnica, incluyendo pero sin limitarse a inserción de ácido nucleico exógeno que codifica para la proteína deseada, opcionalmente como parte de un vector de expresión, inserción de una secuencia de control de la expresión exógena de manera que provoca un aumento de la expresión del gen endógeno de la célula huésped que codifica para la proteína deseada, o activación de la(s) secuencia(s) de control de la expresión endógena(s) de la célula huésped para aumentar la expresión de un gen endógeno que codifica para la proteína deseada.

Pueden prepararse cultivos de células huésped según cualquier método conocido en la técnica, y se conocen en la técnica métodos de crecimiento de tales células huésped y recuperación de proteína recombinante producida por las células, ya sea a partir de las células o del medio de cultivo. Tales métodos de cultivo pueden implicar la adición de inductores químicos de la producción de proteína al medio de cultivo. Se describen a continuación células huésped y procedimientos a modo de ejemplo.

Puede insertarse un ácido nucleico que codifica para un polipéptido de MAN1C1 en un vector de expresión apropiado usando técnicas de ligamiento convencionales. Los vectores de expresión pueden incluir opcionalmente un promotor, una o más secuencias potenciadoras, un origen de replicación, una secuencia de terminación de la transcripción, una secuencia de intrón completa que contiene un sitio de corte y empalme donador y aceptor, una secuencia que codifica para una secuencia señal o líder para la secreción del polipéptido, un sitio de unión a ribosomas, una secuencia de poliadenilación, una región de poliligador para insertar el ácido nucleico que codifica para el polipéptido que va a expresarse y/o un elemento de marcador seleccionable. Cada una de estas secuencias se comenta a continuación.

Opcionalmente, el vector puede contener una secuencia que codifica para una “etiqueta”, es decir, una secuencia oligonucleotídica ubicada en el extremo 5’ o 3’ de la secuencia que codifica para el polipéptido de MAN1C1, la molécula de oligonucleótido codifica para poliHis (tal como hexaHis), u otra “etiqueta” tal como FLAG, HA (hemaglutinina del virus influenza) o myc para las que existen anticuerpos disponibles comercialmente. Esta etiqueta se fusiona normalmente con el polipéptido tras la expresión del polipéptido, y puede servir como medio para la detección o purificación por afinidad del polipéptido de MAN1C1 de la célula huésped.

Los vectores adecuados incluyen, pero no se limitan a, cósmidos, plásmidos o virus modificados, pero se apreciará que el sistema de vector debe ser compatible con la célula huésped seleccionada. Puede transferirse ácido nucleico a células huésped mediante cualquier medio conocido en la técnica, por ejemplo a través de transferencia mediada por liposomas, transferencia mediada por receptores (complejo de ligando-ADN), electroporación, microinyección de ADN, fusión celular, DEAE-dextrano, cloruro de calcio, precipitación con fosfato de calcio, bombardeo de micropartículas, infección con vectores virales, lipofección, transfección o recombinación homóloga.

La invención también contempla el uso de recombinación homóloga u otros métodos de producción recombinantes utilizando elementos de control introducidos en células que ya contienen ADN que codifica para polipéptidos de MAN1C1. Por ejemplo, pueden usarse métodos de recombinación homóloga para modificar una célula que contiene un gen de MAN1C1 normalmente silencioso transcripcionalmente, o un gen subexpresado, y de ese modo producir una célula que expresa cantidades terapéuticamente eficaces de polipéptidos MAN1C1. La recombinación homóloga es una técnica originalmente desarrollada para seleccionar como diana genes para inducir o corregir mutaciones en genes transcripcionalmente activos (Kucherlapati, Prog. Nucl. Acid Res. & Mol. Biol. 36: 301, 1989). La técnica básica se desarrolló como un método para introducir mutaciones específicas en regiones específicas del genoma de mamíferos (Thomas et al., Cell 44: 419-428, 1986; Thomas et al., Cell 51:503-512, 1987; Doetschman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 8583-8587, 1988) o para corregir mutaciones específicas dentro de genes defectuosos (Doetschman et al., Nature 330: 576-578, 1987). Se describen técnicas de recombinación homóloga a modo de ejemplo en la patente estadounidense n.º 5.272.071 (documento EP 9193051, publicación EP n.º 505500; documento PCT/US90/07642, publicación internacional No. WO 91/09955).

A través de recombinación homóloga, la secuencia de ADN que va a insertarse en el genoma puede dirigirse a una región específica del gen de interés uniéndola a ADN de direccionamiento. El ADN de direccionamiento es una secuencia de nucleótidos que es complementaria (homóloga) a una región del ADN genómico. Pequeños trozos de ADN de direccionamiento que son complementarios a una región específica del genoma se ponen en contacto con la hebra original durante el proceso de replicación del ADN. Es una propiedad general del ADN que se ha insertado en una célula que se hibride, y por tanto, se recombine con otros trozos de ADN endógeno a través de regiones homólogas compartidas. Si esta hebra complementaria se une a un oligonucleótido que contiene una mutación o una secuencia diferente o un nucleótido adicional, también se incorpora en la hebra recién sintetizada como

resultado de la recombinación. Como resultado de la función de corrección de lectura, es posible que la nueva secuencia de ADN sirva como molde. Por tanto, el ADN transferido se incorpora en el genoma.

Unidas a estos trozos de ADN de direccionamiento hay regiones de ADN que pueden interaccionar con o controlar la expresión de un polipéptido de MAN1C1, por ejemplo, secuencias flanqueantes. Por ejemplo, se inserta un promotor y/o elemento potenciador, o un elemento modulador de la transcripción exógeno, que incluye opcionalmente un intrón, en el genoma de la célula huésped prevista en proximidad y orientación suficientes para influir en la transcripción de ADN que codifica para el polipéptido de MAN1C1 deseado. El elemento de control controla una parte del ADN presente en el genoma de la célula huésped. Por tanto, la expresión de polipéptido de MAN1C1 puede lograrse no sólo mediante transfección de ADN que codifica para el propio gen de MAN1C1, sino en su lugar mediante el uso de ADN de direccionamiento (que contiene regiones de homología con el gen de interés endógeno) acoplado con segmentos reguladores de ADN que proporcionan a la secuencia génica endógena señales reconocibles para la transcripción de un polipéptido de MAN1C1.

En una realización a modo de ejemplo, se introduce ADN que incluye al menos una secuencia reguladora, un exón y un sitio donador de corte y empalme en el ADN cromosómica de una manera tal que se produce una nueva unidad de transcripción (en la que la secuencia reguladora, el exón y el sitio donador de corte y empalme presentes en el constructo de ADN están operativamente unidos al gen endógeno).

La sobreexpresión, tal como se describe en el presente documento, abarca la activación de un gen (o provocar que se exprese) que normalmente es silencioso (no se expresa) en la célula tal como se obtiene, así como el aumento de la expresión de un gen que no se expresa a niveles fisiológicamente significativos en la célula tal como se obtiene.

Se conocen en la técnica sistemas de recombinación específicos de sitio tales como Cre/loxP, FLP/FRT (Sauer, Curr. Opin. Biotechnol. 521-527, 1994; Sauer, Met Enzymol. 225: 890-900, 1993).

Un enfoque adicional para aumentar, o provocar, la expresión de polipéptido de MAN1C1 a partir del gen de MAN1C1 endógeno de una célula implica aumentar la expresión de factores de transcripción que regulan por incremento la expresión del gen y/o disminuir la expresión de represores transcripcionales que regulan por disminución la expresión del gen, de una manera que da como resultado la producción de polipéptido de MAN1C1 aumentada o de novo a partir del gen de MAN1C1 endógeno de la célula.

Por tanto, la invención contempla células huésped en las que se ha insertado ácido nucleico que codifica para MAN1C1, de manera opcional operativamente unido a una secuencia de control de la expresión, y opcionalmente como parte de un vector de expresión. La invención también contempla células huésped en las que se ha insertado una secuencia de control de la expresión heteróloga de una manera tal que se aumenta la expresión de MAN1C1, incluyendo células huésped en las que el gen de MAN1C1 nativo está operativamente unido a una secuencia de control de la expresión heteróloga.

Puede usarse cualquier célula huésped o huéspedes conocidos en la técnica para la producción de proteína recombinante, incluyendo células de levaduras, células vegetales, plantas, células de insectos y células de mamíferos, y animales transgénicos. Las células de levaduras a modo de ejemplo incluyen Pichia, por ejemplo P. pastoris, y Saccharomyces por ejemplo S. cerevisiae, así como Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces, K. Zactis, K. fragilis, K bulgaricus, K. wickeramii, K. waltii, K. drosophilarum, K. thernotolerans y K. marxianus; K. yarrowia; Trichoderma reesia, Neurospora crassa, Schwanniomyces, Schwanniomyces occidentalis, Neurospora, Penicillium, Totypocladium, Aspergillus, A. nidulans, A niger, Hansenula, Candida, Kloeckera, Torulopsis y Rhodotorula. Las células de insectos a modo de ejemplo incluyen Autographa californica y Spodoptera frugiperda, y Drosophila. Las células de mamíferos a modo de ejemplo incluyen variedades de células CHO, BHK, HEK-293, NS0, YB2/3, SP2/0 y humanas tales como PER-C6 o HT1080, así como VERO, HeLa, COS, MDCK, NIH3T3, Jurkat, Saos, PC-12, HCT 116, L929, Ltk-, WI38, CV1, TM4, W138, Hep G2, MMT, una línea celular leucémica, célula madre embrionaria u óvulo fertilizado.

Métodos de cultivo y producción de polipéptido

La invención también proporciona métodos para cultivar, es decir, hacer crecer, células huésped en condiciones que aumentan la expresión de proteína MAN1C1 y dan como resultado un aumento de la productividad específica o producción de proteína de cualquiera de las proteínas de interés recombinantes descritas en el presente documento. Tales métodos pueden incluir además la etapa de recuperar la proteína de interés recombinante producida de las células huésped o el medio de cultivo.

Cuando la proteína de interés recombinante se secreta al medio, puede recogerse el medio periódicamente, de modo que pueden usarse las mismas células huésped a través de varios ciclos de recogida. En realizaciones a modo de ejemplo, se incuban células huésped que producen moléculas estimulantes de la eritropoyesis en tres

ciclos de recogida discontinuos diferenciados. Para cada ciclo, se recoge el medio y se reemplaza por medio nuevo que reemplaza al medio recogido. El primer ciclo puede ser, por ejemplo, de 8 días; el segundo ciclo, por ejemplo, de 7 días; y el tercer ciclo, por ejemplo, de 5 días de duración.

Se conocen en la técnica una variedad de sistemas de cultivo, incluyendo frascos T, frascos centrifugadores y agitadores, botellas rotatorias y biorreactores de tanque con agitación. El cultivo en botellas rotatorias se lleva a cabo generalmente sembrando células en botellas rotatorias que están parcialmente llenas (por ejemplo, hasta el 10-30% de su capacidad) con medio y haciéndolas rotar lentamente, permitiendo que las células se adhieran a los lados de las botellas y crezcan hasta la confluencia. Se recoge el medio celular decantando el sobrenadante, que se reemplaza por medio nuevo. También pueden cultivarse células dependientes de anclaje sobre un microportador, por ejemplo esferas poliméricas, que se mantienen en suspensión en biorreactores de tanque con agitación. Alternativamente, las células pueden hacerse crecer en una suspensión de células individuales.

Puede añadirse medio de cultivo en un procedimiento discontinuo, por ejemplo en el que se añade medio de cultivo una vez a las células en un único lote, o en un procedimiento de alimentación discontinua en el que se añaden periódicamente pequeños lotes de medio de cultivo. Puede recogerse el medio al final del cultivo o varias veces durante el cultivo. También se conocen en la técnica procedimientos de producción perfundidos de manera continua, e implican la alimentación continua de medio nuevo al cultivo, al mismo tiempo que se retira de manera continua el mismo volumen del reactor. Los cultivos perfundidos logran generalmente densidades celulares superiores que los cultivos discontinuos y pueden mantenerse durante semanas o meses con recogidas repetidas.

Las células huésped de la invención pueden cultivarse usando medios convencionales bien conocidos por el experto en la técnica. Los medios contendrán habitualmente todos los nutrientes necesarios para el crecimiento y la supervivencia de las células. Medios adecuados para cultivar células eucariotas son medio Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640), medio esencial mínimo (MEM) y/o medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), todos los cuales pueden complementarse con suero y/o factores de crecimiento tal como se indica por la línea celular particular que está cultivándose. Un medio adecuado para cultivos de insectos es el medio de Grace complementado con extracto de levaduras, hidrolizado de lactalbumina y/o suero de ternera fetal según sea necesario.

Normalmente, se añade un anticuerpo u otro compuesto útil para el crecimiento selectivo de células transformadas como complemento para el medio. El compuesto que va a usarse estará dictado por el elemento de marcador seleccionable presente sobre el plásmido con el que se transformó la célula huésped. Por ejemplo, cuando el elemento de marcador seleccionable es resistencia a kanamicina, el compuesto añadido al medio de cultivo será kanamicina. Otros compuestos para el crecimiento selectivo incluyen ampicilina, tetraciclina, geneticina y neomicina.

La cantidad de un polipéptido de MAN1C1 y la cantidad de proteína de interés recombinante deseada producida por una célula huésped pueden evaluarse usando métodos convencionales conocidos en la técnica. Tales métodos incluyen, sin limitación, análisis de inmunotransferencia de tipo Western, electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida, electroforesis en gel no desnaturalizante, separación por cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC), inmunoprecipitación y/o ensayos de actividad tales como ensayos de desplazamiento en gel de la unión a ADN. La invención también contempla que la productividad específica (expresada como pg/célula/día) de proteína de interés puede evaluarse usando métodos convencionales tal como se conoce en la técnica y tal como se describe en el presente documento.

Ejemplos

La presente invención se describe en más detalle con referencia a los siguientes ejemplos no limitativos, que se ofrecen para ilustrar más completamente la invención, pero no debe interpretarse que limitan el alcance de la misma. Los ejemplos ilustran diversos métodos usados en la invención, tales como métodos de cultivo celular; cuantificación de HuEPO recombinante mediante RP-HPLC; análisis de la expresión génica usando chips Affymetrix; PCR en tiempo real cuantitativa de genes seleccionados; el uso de ARNip de MAN1C1; y clonación y expresión de MAN1C1. Los ejemplos también ilustran el efecto del butirato de sodio sobre la productividad específica de rHuEPO y la progresión del ciclo celular; el efecto del butirato de sodio sobre la expresión de MAN1C1; el efecto de ARN de interferencia pequeño (ARNip) de MAN1C1 sobre la productividad específica de rHuEPO; y el efecto de la sobreexpresión de MAN1C1 sobre la productividad específica de rHuEPO.

Las técnicas descritas en estos ejemplos representan técnicas descritas por los inventores que funcionan bien en la puesta en práctica de la invención, y como tales constituyen modos a modo de ejemplo para la puesta en práctica de la misma. Pueden hacerse muchos cambios en los métodos específicos que se dan a conocer y obtener todavía un resultado parecido o similar sin apartarse del espíritu y alcance de la invención. Tales variaciones están previstas como aspectos de la invención.

Ejemplo 1

Métodos de cultivo celular

Se usó una línea celular de fibrosarcoma de riñón humano, HT1080 (Rasheed et al., Cancer 33. 1027-1033, 1974), transfectada con un plásmido para cDNA de EPO humana a lo largo de todos los experimentos descritos en los ejemplos expuestos a continuación. Se mantuvo una presión selectiva para la retención del plásmido transfectado con el antibiótico geneticina (Gibco). Se hicieron crecer las células como monocapas adheridas en frascos T ventilados (75 cm2) (Corning) a una densidad de inoculación de 2,1 x 104 células/cm2 en un incubador humidificado con un 12% de CO2 a 37ºC. Se hicieron crecer las células durante 4-5 días en medio DMEM que contenía un 10% de suero complementado con 1X aminoácidos no esenciales, geneticina 5 mg/l y bicarbonato de sodio 1 5 g/l (todos de Gibco). Después de que las células alcanzaran la confluencia, se lavaron con PBS para eliminar el suero y se cambiaron a medio DMEM/F-12 1:1 libre de suero complementado con 1X aminoácidos no esenciales (Gibco), bicarbonato de sodio 1,5 g/l y glucosa 2 g/l durante un periodo de 5 a 7 días. Se trataron los cultivos experimentales con butirato de sodio 2 mM (Sigma) el mismo día que la adición de medio libre de suero.

Ejemplo 2

Cuantificación de HuEPO recombinante mediante RP-HPLC

Para determinar la cantidad de eritropoyetina humana recombinante (rHuEPO) producida en medio de cultivo celular, se analizaron 200 μl de medio mediante HPLC de fase inversa. Se separaron las muestras sobre una columna de HPLC de estireno/divinilbenceno equipada con una precolumna (Polymer Labs) usando un gradiente lineal de desde el 30-65% de CH3CN en TFA al 0,1% a lo largo de 17 minutos (Sigma). El tiempo de retención para rHuEPO expresada en cultivo celular era de aproximadamente 15,5 minutos y se correspondía con un patrón de rHuEPO purificada (Amgen Inc). Se cuantificaron las áreas de picos integradas de muestras desconocidas mediante comparación con una curva patrón de rHuEPO purificada.

Ejemplo 3

Análisis de la expresión génica usando el chip Affymetrix

Se estudió la expresión de genes en células HT1080 a lo largo de un periodo de 24 horas en presencia y ausencia de butirato de sodio usando microalineamientos de oligonucleótidos y el chip HU133A Affymetrix (Affymetrix). Se llevaron a cabo todos los experimentos según los protocolos de Affymetrix. Se analizaron un total de 24 chips, 12 de células tratadas con butirato de sodio y 12 controles. Se importaron en primer lugar los datos de expresión génica del software Affymetrix a GeneSpring® versión 6.0 y se normalizaron usando el procedimiento de normalización global del software. Los valores por debajo de 0,01 se fijaron a 0,01 y se dividió cada medición entre el percentil 50 de todas las mediciones para esa muestra. Entonces se dividió cada gen entre la mediana de sus mediciones en todas las muestras, y si la mediana de los valores sin procesar estaba por debajo de 10, entonces se dividió cada medición para ese gen entre 10. Entonces se agruparon los datos de muestras para cada chip por tipo de tratamiento (control o butirato de sodio) y por tiempo (3, 6, 12 y 24 horas). Se compararon los resultados de los datos de expresión con la lista de genes disponible públicamente de la alineamiento de ADNc del Consorcio para Glicómica funcional (chip génico GLYCOv2) para determinar genes presentes en cuatro categorías: degradación de glicanos, glicano transferasa, transporte de glicanos y nucleótidos de azúcar, tal como se define por la lista de genes del Consorcio.

Ejemplo 4

PCR en tiempo real cuantitativa de genes seleccionados

Se usó PCR en tiempo real cuantitativa (qRT-PCR) con transcripción inversa TaqMan (Applied Biosystems Inc.) para verificar los cambios en la expresión de ARNm observados usando el chip Affymetrix. Se generaron sondas para MAN1C1 y rHuEPO usando el software Primer Express (Applied Biosystems Incorporated). MAN1C1: directo-GGA GCC CCA GAG CCA AGT (SEQ ID NO: 6); inverso-GCC AAG CAA ACT GCA TCA TCT (SEQ ID NO: 7); TaqMan-ECG AGC CCA GCG GGA GAA AAT CAX (E = 6-FAM; X = Tamra) (SEQ ID NO: 8). rHuEPO: directo-GTT AAT TTC TAT GCC TGG AAG AGG AT (SEQ ID NO: 9); inverso-CCA GGC CCT GCC AGA CTT (SEQ ID NO: 10); TaqMan-EAG GTC GGG CAG CAG GCC GTX (E = 6-FAM; X= Tamra) (SEQ ID NO: 11). Se usó un instrumento ABI 7000 o 7900 (Applied Biosystems Inc.) para cada análisis con los siguientes parámetros de ciclación térmica; 1 ciclo a 50ºC durante 30 min.; 1 ciclo a 95ºC durante 10 min.; 40 ciclos a 94ºC durante 15 s y 60ºC durante 60 s. Se sometieron a ensayo muestras de ARN de al menos tres cultivos celulares independientes por triplicado para células tanto control como tratadas con butirato de sodio. Se normalizaron los valores de ciclo umbral (Ct) para todos los genes sometidos a prueba con respecto al gen de mantenimiento, GAPDH (Applied Biosystems Inc., parte n.º 4310884E), para corregir los errores en las concentraciones de ARN. Se notificaron los datos como o bien “cambio en veces” o bien “cambio en tanto por ciento” en los niveles de Ct para muestras tratadas con butirato de sodio en comparación con muestras control.

Ejemplo 5

ARNip de MAN1C1

Se hicieron crecer células HT1080 en matraces T ventilados de 75 cm2 durante 4 días en medio DMEM que contenía un 10% de suero complementado con 1X aminoácidos no esenciales y bicarbonato de sodio 1,5 g/l (todos de Gibco). Después de que las células hubiesen alcanzado la confluencia, se lavaron 1X con PBS y entonces se trataron con o sin 50 μl de agente de transfección de amina siPORT™ más 60 μM de ARN inhibidor pequeño (ARNip) (Ambion) en 15 ml de medio DMEM que contenía un 10% de suero durante un periodo de 48 horas. Entonces se lavaron los cultivos con PBS para eliminar el suero y se cambiaron a 15 ml de medio DMEM:F12 libre de suero con o sin 50 μl de amina siPORT™ y ARNip 60 uM. Entonces se hicieron crecer los cultivos durante un periodo de 5 días en presencia y ausencia de butirato de sodio 2 mM. Se recogieron muestras de medios y se sometieron a ensayo los niveles de rHuEPO y ARNm en los días 1, 3 y 5 tras el cambio libre de suero.

Ejemplo 6

Clonación y expresión de MAN1C1

Se usó un vector de entrada pENTR™221 que contenía la secuencia de ADNc de MAN1C1 (SEQ ID NO: 1) y sitios de recombinación attL flanqueantes (Invitrogen – ID de clon: IOH42767). Siguiendo el procedimiento de tecnología Gateway, se realizó la recombinación, usando LR Clonase™, de los dos sitios attL del clon de entrada con los dos attR del vector pcDNA3.1/nV5-DEST™ de destino, y se verificó mediante transformación de células competentes DH5α bajo selección con ampicilina. (El vector de destino contiene el gen ccdB que permite la selección negativa en la reacción de recombinación). La digestión con enzimas de restricción del vector de destino tras la recombinación y transformación con BamHI confirmó la reacción de recombinación apropiada (datos no mostrados). Se obtuvo una preparación de plásmido de ADN (∼3 mg) usando el protocolo del fabricante par el kit de ADN de plásmido Giga Prep (Qiagen).

Se realizó la transfección de células HT1080 tal como sigue: Se inocularon frascos T (75 cm2) a 1,6 x 106 células y se dejaron crecer durante de 4 a 5 días antes de la transfección. Se añadieron o bien 16, 32 o bien 64 μg de ADN de plásmido a 2 ml de medio DMEM:F12. Además, se añadieron 59 μl de Lipofectamine 2000 (Invitrogen) a 2 ml separados de medio DMEM:F12 y se incubaron durante 5 minutos. Se combinaron entonces las dos mezclas de ADN y Lipofectamine y se dejaron incubar durante 20 minutos a temperatura ambiente. Tras un lavado con 1X PBS de los frascos T, se añadió toda la mezcla (∼4 ml) y se dejó incubar durante 2 horas en un incubador a 37ºC/12% de CO2. Se añadieron 11 ml adicionales de medio DMEM:F12 nuevo a cada matraz T, y se comenzó la toma de muestras 24 horas después.

Ejemplo 7

El butirato de sodio aumenta la productividad específica de rHuEPO y bloquea la progresión del ciclo celular

Se examinó el efecto que tiene el tratamiento con butirato de sodio sobre el ciclo celular de HT1080 y la productividad específica de rHuEPO. Las células tratadas con butirato de sodio (2 mM) aumentaron la productividad específica de eritropoyetina humana recombinante (rHuEPO) aproximadamente cuatro veces en comparación con cultivos control (figura 1). Sin embargo, en lugar de que el butirato de sodio desplazase las células a la fase G0/G1, en la que otros investigadores han notificado que se maximiza la síntesis de proteínas (Kim et al., Biotech. Bioeng.

71: 184, 2001), la población de células en las fases G0/G1, S y G2/M permaneció relativamente constante a lo largo de todos los 5 días de cultivo en comparación con cultivos control. Estas diferencias pueden deberse a los métodos de cultivos expuestos anteriormente, que permitieron que las células alcanzaran la confluencia antes de la adición del butirato de sodio, mientras que informes previos observaron los efectos en el ciclo celular sobre células en crecimiento exponencial en el momento de la adición del butirato de sodio. Por tanto, los datos del ciclo celular solos no pueden ser responsables de los aumentos en la productividad específica de que se midieron.

Ejemplo 8

El butirato de sodio aumenta la expresión de MAN1C1

Se usó HuEPO recombinante, producida en cultivos de HT1080, como glicoproteína modelo para estudiar los efectos del butirato de sodio sobre genes implicados en la glicosilación de proteínas. El tratamiento de células HT1080 con butirato de sodio 2 mM en cultivo dio como resultado numerosos cambios fenotípicos con respecto a conjuntos de nucleótidos de azúcar y las estructuras de oligosacáridos presentes sobre rHuEPO.

Para determinar si estos cambios fenotípicos estaban asociados con cambios genéticos, se estudió la expresión de

genes en células HT1080 a lo largo de un periodo de 24 horas en presencia y ausencia de butirato de sodio usando microalineamientos de oligonucleótidos y el chip HU133A Affymetrix (Affymetrix).

Se identificó una posible enzima limitativa de la velocidad, la enzima alfa 1,2 manosidasa I (MAN1C1), implicada en el procesamiento de oligosacáridos unidos en N a glicoproteínas. El cambio relativo en el ARNm de MAN1C1 inducido por el butirato de sodio se expone a continuación en la tabla 1. Este gen aumentó su expresión aproximadamente 10 veces a lo largo del transcurso de veinticuatro horas cuando se trataron las células con butirato de sodio (tabla 1). La validación posterior de la expresión de MAN1C1 mediante qRT-PCR para células HT1080 tratadas con butirato de sodio a lo largo de un periodo de cinco días mostró aumentos > 40 veces en comparación con cultivos control (tabla 1).

Tabla 1: Resumen de los datos de qRT-PCR para el cambio en veces del ARNm de MAN1C1 de HT1080

Punto de tiempo (h)A Cambio en vecesB Desviación estándar

3 8,7 ± 21 6 38,7 ± 9,5 12 36,0 ± 4,6 24 53,3 ± 144 72 42,2 ± 3,8 120 7,8 ± 3,6

A -Tiempo tras añadirse butirato de sodio al cultivo B – Cambio en veces en comparación con células HT1080 no tratadas

Ejemplo 9

ARNde interferencia pequeño (ARNip) de MAN1C1 reduce la productividad específica de rHuEPO

Para determinar si existe un vínculo entre el efecto del butirato de sodio sobre los aumentos en la expresión de MAN1C1 y los aumentos en la productividad específica de rHuEPO, se trataron las células con ARN de interferencia pequeño (ARNip) contra MAN1C1 en presencia y ausencia de butirato de sodio. El tratamiento con ARNip no tuvo ningún impacto sobre la Qp de rHuEPO en condiciones control, pero disminuyó hasta un 50% de Qp de rHuEPO cuando se trataron las células con tanto butirato de sodio como el ARNip en comparación con butirato de sodio solo (figura 2A). Tal como se mostró anteriormente, el tratamiento con butirato de sodio aumenta los niveles de ARNm de MAN1C1 en comparación con cultivos control (figura 2B), sin embargo, células tratadas con tanto butirato de sodio como ARNip tenían una disminución de ∼30% en los niveles de ARNm de MAN1C1 en comparación con células tratadas con butirato de sodio solo (figura 2B). Debe indicarse que los niveles de ARNm de MAN1C1 eran todavía superiores en las células tratadas con butirato de sodio y ARNip en comparación con los controles (figura 2B). Esto se correlacionaba con una Qp de rHuEPO que permanecía superior al control en tanto células tratadas con butirato de sodio solo como células tratadas con butirato de sodio y ARNip, aunque los niveles absolutos de Qp se redujeron (figura 2A).

Para garantizar que los cambios en las mediciones de productividad específica no estaban provocados por una disminución en los niveles de ARNm de rHuEPO debido a efectos inespecíficos del tratamiento con ARNip, se midieron los niveles de ARNm de rHuEPO a lo largo del mismo periodo de cinco días. Tal como se muestra en la figura 3, los niveles de ARNm de rHuEPO eran constantes en el día 1 y el día 5 en células tratadas con butirato de sodio (+/-) ARNip, y eran ligeramente superiores en el día 5 en comparación con cultivos control. Estos datos confirman que el tratamiento con ARNip para MAN1C1 no alteraban los niveles de expresión de rHuEPO reduciendo la abundancia de ARNm de rHuEPO.

Ejemplo 10

La sobreexpresión de MAN1C1 aumenta la productividad específica de rHuEPO

Para confirmar que MAN1C1 puede explicar el aumento en QP de rHuEPO QP, independientemente del tratamiento con butirato de sodio, se tranfectaron células para que sobreexpresaran MAN1C1 en condiciones control. Tal como se observa en la tabla 2 (expuesta a continuación), cuando se transfectaron 16-64 μg de ADN de plásmido de MAN1C1 en las células, se midió un gran aumento (>1000 veces) en los niveles de ARNm de MAN1C1 en comparación con células no transfectadas (control).

La expresión transitoria de MAN1C1 en condiciones control (por ejemplo sin adición de butirato de sodio) dio como resultado un aumento de 2-3 veces en la productividad específica de rHuEPO dependiendo de la cantidad de ADN de plásmido transfectada (figura 4). Aunque el nivel de productividad de rHuEPO es inferior cuando se usa butirato de sodio solo, los datos confirman que el butirato de sodio aumenta la expresión de MAN1C1, que a su vez contribuye al aumento en la productividad específica de rHuEPO.

Tabla 2: Resumen del % de aumento en el ARNm de MAN1C1 tras la transfección en comparación con células no transfectadas. % de aumento de ARNm de MAN1C1 (n=2)A

Muestra

Día 1 Día 3 Día 5

16 ug de ADN

1683% 1817% 2020%

32 ug de ADN

1776% 1828% 2149%

64 ug de ADN

1650% 1774% 2463%

A – Se calculó el % de aumento mediante la diferencia en el ciclo a la que se produce la cuantificación absoluta (Ct –ciclo umbral) entre células no transfectadas frente a transfectadas.

Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patentes citadas en esta memoria descriptiva se incorporan en el presente documento como referencia en su totalidad, incluyendo pero sin limitarse a, el material relevante por el motivo citado, como si se indicase específica e individualmente que cada publicación o solicitud de patente individual se incorpora como referencia. Aunque la invención anterior se ha descrito en algo de detalle a modo de ilustración y ejemplo para fines de claridad de comprensión, resultará fácilmente evidente para los expertos habituales en la técnica en vista de las enseñanzas de esta invención que pueden hacerse determinados cambios y modificaciones a la misma sin apartarse del espíritu o alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Lista de secuencias

<110> Crowell, Christopher K.

<120> Células huésped mejoradas y métodos de cultivo

<130> 01017/41657A

<150> Documento US 60/749.076

<151>

<160> 14

<170> Patent In versión 3.3

<210> 1

<211> 2912

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 1

<210> 2

<211> 630

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

<210> 3

<211> 193 5 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> mat_peptide

<222> (28)..(192) 10 <400> 3

<210> 4

<211> 1725

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 4

<210> 5

<211> 193

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> mat_peptide

<222> (28)..(192)

<400> 5

<210> 6

<211> 18

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador sintético

<400> 6 ggagccccag agccaagt 18

<210> 7

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador sintético

<400> 7 tctactacgt caaacgaacc g 21

<210> 8

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador sintético

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> El nucleótido en la posición 1 está unido a 6-Fam.

<220>

<221> misc_feature

<222> (22)..(22)

<223> El nucleótido en la posición 22 está unido a Tamra.

<400> 8 cgagcccagc gggagaaaat ca 22

<210> 9

<211> 26

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador sintético

<400> 9 gttaatttct atgcctggaa gaggat 26

<210> 10

<211> 18

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador sintético

<400> 10 ttcagaccgt cccggacc 18

<210> 11

<211> 19

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador sintético

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> El nucleótido en la posición 1 está unido a 6-Fam.

<220>

<221> misc_feature

<222> (22)..(22)

<223> El nucleótido en la posición 22 está unido a Tamra.

<400> 11 aggtcgggca gcaggccgt 19

<210> 12

<211> 3815

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 12

<210> 13

<211> 482

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 13

<210> 14

<211> 735

<212> ADN

<213> Platichtys flesus

<400> 14

Claims (11)

1. REIVINDICACIONES

   1. Método de aumento de la producción de una glicoproteína de interés en una célula huésped aislada que se ha modificado por ingeniería genética para sobreexpresar dicha glicoproteína de interés, comprendiendo dicho método aumentar en dicha célula huésped la expresión de alfa 1,2-manosidasa (MAN1C1) que es nativa para dicha célula

   5 huésped.
2. 2. Método según la reivindicación 1, en el que dicha célula huésped se transfecta con un vector que comprende un ácido nucleico que codifica para MAN1C1 operativamente unido a una secuencia de control de la expresión heteróloga.
3. 3. Método según la reivindicación 1, en el que dicha célula huésped comprende una secuencia de control de la 10 expresión heteróloga operativamente unida a un ácido nucleico que codifica para MAN1C1.

4. 4.

   Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que dicha célula huésped se ha transfectado con un vector que comprende un ácido nucleico que codifica para dicha glicoproteína de interés operativamente unida a una secuencia de control de la expresión heteróloga.

5. 5.

   Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que dicha célula huésped comprende una secuencia

   15 de control de la expresión heteróloga operativamente unida a un ácido nucleico que codifica para dicha glicoproteína de interés.

6. 6.

   Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que la glicoproteína de interés es una molécula estimulante de la eritropoyesis.

7. 7.

   Método según la reivindicación 6, en el que la glicoproteína de interés es eritropoyetina de SEQ ID NO: 3.

   20 8. Método según la reivindicación 6, en el que la glicoproteína de interés es darbepoetina de SEQ ID NO: 5.

8. 9.

   Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que dicha célula huésped es una célula CHO.

9. 10.

   Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que dicha célula huésped es una célula humana.

10. 11.

    Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que dicha célula huésped es una célula BHK.

11. 12. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que dicha célula huésped es una célula NS/0. 25 13. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que dicha célula huésped es una célula HT-1080.