JPH0984582A - 糖転移酵素活性を強化した動物細胞、糖鎖改変糖蛋白質ならびにその製造方法 - Google Patents
糖転移酵素活性を強化した動物細胞、糖鎖改変糖蛋白質ならびにその製造方法Info
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- JPH0984582A JPH0984582A JP7266138A JP26613895A JPH0984582A JP H0984582 A JPH0984582 A JP H0984582A JP 7266138 A JP7266138 A JP 7266138A JP 26613895 A JP26613895 A JP 26613895A JP H0984582 A JPH0984582 A JP H0984582A
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- gene
- transglycosylase
- sugar chain
- cell
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- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【解決手段】 糖転移酵素遺伝子を導入することによ
り、当該糖転移酵素活性を強化した動物細胞、当該細胞
より得られる糖鎖の構造が改変された糖蛋白質ならびに
その製造方法。 【効果】 本発明によれば、糖転移酵素（Ｎーアセチル
グルコサミニルトランスフェラーゼ Ｖ）遺伝子を動物
細胞に導入することにより該酵素活性を高レベルに維持
する動物細胞が得られ、また該細胞を培養することによ
り、治療上または産業上有用な種々の糖鎖改変蛋白質を
得ることができる。
り、当該糖転移酵素活性を強化した動物細胞、当該細胞
より得られる糖鎖の構造が改変された糖蛋白質ならびに
その製造方法。 【効果】 本発明によれば、糖転移酵素（Ｎーアセチル
グルコサミニルトランスフェラーゼ Ｖ）遺伝子を動物
細胞に導入することにより該酵素活性を高レベルに維持
する動物細胞が得られ、また該細胞を培養することによ
り、治療上または産業上有用な種々の糖鎖改変蛋白質を
得ることができる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、糖転移酵素遺伝子
を導入することにより、当該糖転移酵素活性を強化した
動物細胞、当該細胞より得られる糖鎖の構造が改変され
た糖蛋白質ならびにその製造方法に関する。
を導入することにより、当該糖転移酵素活性を強化した
動物細胞、当該細胞より得られる糖鎖の構造が改変され
た糖蛋白質ならびにその製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】近年、遺伝子工学を応用した有用組み換
え蛋白質の生産においては、蛋白質に付加する糖鎖の役
割の重要性が強く認識されている。組み換え蛋白質を生
産するにあたり、宿主として大腸菌などの原核生物を用
いた場合は、通常、蛋白質に糖鎖が付加することはな
い。また、酵母などの下等真核生物を宿主とした場合
は、蛋白質に付加する糖鎖が動物細胞のものとは大きく
異なることが知られている。そのため、ヒト由来のサイ
トカイン類など少量で高付加価値のある組み換え蛋白質
の生産では、動物細胞を宿主とする方法に注目が集まっ
ている。
え蛋白質の生産においては、蛋白質に付加する糖鎖の役
割の重要性が強く認識されている。組み換え蛋白質を生
産するにあたり、宿主として大腸菌などの原核生物を用
いた場合は、通常、蛋白質に糖鎖が付加することはな
い。また、酵母などの下等真核生物を宿主とした場合
は、蛋白質に付加する糖鎖が動物細胞のものとは大きく
異なることが知られている。そのため、ヒト由来のサイ
トカイン類など少量で高付加価値のある組み換え蛋白質
の生産では、動物細胞を宿主とする方法に注目が集まっ
ている。
【０００３】蛋白質への糖鎖の付加は、動物細胞の小胞
体、ゴルジ装置に局在する数多くの糖転移酵素の寄与に
よる複雑な機構で行われており、現在、動物細胞由来の
各種糖転移酵素の精製と遺伝子クローニング、クローン
化された遺伝子の大腸菌や動物細胞での発現、糖鎖合成
に関する変異株の作出などの研究が盛んになってきてい
る。これまで報告されている例としては、α−１，３フ
コシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子をクロー
ニングし、動物細胞で発現させた例（Natsuka,S. et a
l., J.Biol. Chem.;269, 16789-16794, 1994）、シアリ
ルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ配列を真核細
胞中でシアリル化される糖蛋白質をコードするＤＮＡ配
列と共に発現させ、高度にシアリル化された糖蛋白質を
得た例（特開平6-105692）、モノクローナル抗体を産生
するハイブリドーマをレクチン存在下で培養して、レク
チン耐性株を得ることにより、糖鎖合成能が変化したハ
イブリドーマを作出した例（特開平6-90782）等があ
る。
体、ゴルジ装置に局在する数多くの糖転移酵素の寄与に
よる複雑な機構で行われており、現在、動物細胞由来の
各種糖転移酵素の精製と遺伝子クローニング、クローン
化された遺伝子の大腸菌や動物細胞での発現、糖鎖合成
に関する変異株の作出などの研究が盛んになってきてい
る。これまで報告されている例としては、α−１，３フ
コシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子をクロー
ニングし、動物細胞で発現させた例（Natsuka,S. et a
l., J.Biol. Chem.;269, 16789-16794, 1994）、シアリ
ルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ配列を真核細
胞中でシアリル化される糖蛋白質をコードするＤＮＡ配
列と共に発現させ、高度にシアリル化された糖蛋白質を
得た例（特開平6-105692）、モノクローナル抗体を産生
するハイブリドーマをレクチン存在下で培養して、レク
チン耐性株を得ることにより、糖鎖合成能が変化したハ
イブリドーマを作出した例（特開平6-90782）等があ
る。
【０００４】動物細胞で生産される蛋白質の糖鎖構造に
ついて、人為的な制御あるいは改変を加えることは、個
々の蛋白質分子に付加した糖鎖の型をすべて同一とする
ことにより組み換え蛋白質としての均一性を向上させた
り、糖鎖の分岐構造を増やすことにより血中クリアラン
ス時間の延長が期待できるなど、産業上高い有用性があ
る。
ついて、人為的な制御あるいは改変を加えることは、個
々の蛋白質分子に付加した糖鎖の型をすべて同一とする
ことにより組み換え蛋白質としての均一性を向上させた
り、糖鎖の分岐構造を増やすことにより血中クリアラン
ス時間の延長が期待できるなど、産業上高い有用性があ
る。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、糖転
移酵素活性を遺伝子工学的に制御した動物細胞を得、該
細胞から糖鎖の構造が改変された糖蛋白質を得ることに
ある。
移酵素活性を遺伝子工学的に制御した動物細胞を得、該
細胞から糖鎖の構造が改変された糖蛋白質を得ることに
ある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、糖転移酵素である
Ｎーアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ Ｖの
遺伝子を動物細胞に導入することにより、該細胞から糖
鎖の分岐構造が増大した糖蛋白質が得られることを見い
出し、本発明を完成した。
を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、糖転移酵素である
Ｎーアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ Ｖの
遺伝子を動物細胞に導入することにより、該細胞から糖
鎖の分岐構造が増大した糖蛋白質が得られることを見い
出し、本発明を完成した。
【０００７】即ち、本発明は、糖転移酵素の遺伝子を導
入することにより、当該酵素活性を強化した動物細胞で
ある。本発明はまた、糖転移酵素の遺伝子を動物細胞に
導入し、該細胞を培地に培養し、培養物より糖鎖の構造
が改変された糖蛋白質を得ることを特徴とする糖鎖改変
糖蛋白質の製造方法である。
入することにより、当該酵素活性を強化した動物細胞で
ある。本発明はまた、糖転移酵素の遺伝子を動物細胞に
導入し、該細胞を培地に培養し、培養物より糖鎖の構造
が改変された糖蛋白質を得ることを特徴とする糖鎖改変
糖蛋白質の製造方法である。
【０００８】さらに、本発明は、上記方法により得られ
る糖鎖の構造が改変された糖蛋白質である。本発明にお
いては、糖転移酵素として、具体的にはＮーアセチルグ
ルコサミニルトランスフェラーゼ Ｖ（以下、ＧｎＴ−
Ｖと略す）を用いる。ＧｎＴ−Ｖは、２本鎖構造のＮ−
結合糖鎖にＮ−アセチルグルコサミニル基を転移するこ
とにより、３本鎖構造を生じさせる（図１）。ＧｎＴ−
Ｖの遺伝子は、１９９３年にジョージア大学のマイケ
ル．ピアスらによりラットから（Shoreibah et al., J.
Biol. Chem. 268, 15381-15385, 1993, 特表平6-51091
4）、１９９４年に大阪大学医学部の谷口らによりヒト
から（Saito et al., Biochem. Biophys. Res. Commun.
198, 318-327, 1994）、そのｃＤＮＡがそれぞれクロ
ーニングされている。
る糖鎖の構造が改変された糖蛋白質である。本発明にお
いては、糖転移酵素として、具体的にはＮーアセチルグ
ルコサミニルトランスフェラーゼ Ｖ（以下、ＧｎＴ−
Ｖと略す）を用いる。ＧｎＴ−Ｖは、２本鎖構造のＮ−
結合糖鎖にＮ−アセチルグルコサミニル基を転移するこ
とにより、３本鎖構造を生じさせる（図１）。ＧｎＴ−
Ｖの遺伝子は、１９９３年にジョージア大学のマイケ
ル．ピアスらによりラットから（Shoreibah et al., J.
Biol. Chem. 268, 15381-15385, 1993, 特表平6-51091
4）、１９９４年に大阪大学医学部の谷口らによりヒト
から（Saito et al., Biochem. Biophys. Res. Commun.
198, 318-327, 1994）、そのｃＤＮＡがそれぞれクロ
ーニングされている。
【０００９】上記遺伝子を動物細胞に導入し、発現させ
るためのベクターとして動物細胞用発現ベクターを用い
る。動物細胞用発現ベクターには、動物ウイルスが利用
され、具体的にはＳＶ４０、ＢＰＶ（ウシパピローマウ
イルス）、アデノウイルス、レトロウイルス系が挙げら
れる。動物ウイルスは、一般に宿主細胞で働くプロモー
ター、ＲＮＡスプライシングシグナルとポリＡ付加シグ
ナル、さらにプロモーターの活性を増大させるエンハン
サーなど遺伝子発現に必要なシグナルに加えて自己複製
能を有するもつため、遺伝子が細胞内で増殖し、遺伝子
発現量を増加させることができる。ウイルスによって増
殖可能な宿主細胞が限られており、宿主細胞によってベ
クターとして用いるウイルスを選ぶ必要がある。
るためのベクターとして動物細胞用発現ベクターを用い
る。動物細胞用発現ベクターには、動物ウイルスが利用
され、具体的にはＳＶ４０、ＢＰＶ（ウシパピローマウ
イルス）、アデノウイルス、レトロウイルス系が挙げら
れる。動物ウイルスは、一般に宿主細胞で働くプロモー
ター、ＲＮＡスプライシングシグナルとポリＡ付加シグ
ナル、さらにプロモーターの活性を増大させるエンハン
サーなど遺伝子発現に必要なシグナルに加えて自己複製
能を有するもつため、遺伝子が細胞内で増殖し、遺伝子
発現量を増加させることができる。ウイルスによって増
殖可能な宿主細胞が限られており、宿主細胞によってベ
クターとして用いるウイルスを選ぶ必要がある。
【００１０】プロモーターやエンハンサーとしては、Ｌ
ＴＲ（レトロウイルスのlong terminal repeat) 、ＳＶ
４０、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）、ＭＴ（メタロ
チオネイン）、アクチンなどのプロモーターや、ＬＴ
Ｒ、ＳＶ４０、ＣＭＶなどのエンハンサー配列がよく用
いられている。動物細胞用発現ベクターとしては、大別
すると、その一つは宿主ＤＮＡ内に組み込まれて発現す
るタイプ、もう一つは宿主ＤＮＡに組み込まれることな
く細胞内でエピソームとして増殖するタイプがある。こ
れらは、宿主細胞の遺伝子欠失を相補したり、代替する
遺伝子、例えばジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝
子、Ecogpt遺伝子、Neo 遺伝子等を選択マーカーとして
利用している。
ＴＲ（レトロウイルスのlong terminal repeat) 、ＳＶ
４０、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）、ＭＴ（メタロ
チオネイン）、アクチンなどのプロモーターや、ＬＴ
Ｒ、ＳＶ４０、ＣＭＶなどのエンハンサー配列がよく用
いられている。動物細胞用発現ベクターとしては、大別
すると、その一つは宿主ＤＮＡ内に組み込まれて発現す
るタイプ、もう一つは宿主ＤＮＡに組み込まれることな
く細胞内でエピソームとして増殖するタイプがある。こ
れらは、宿主細胞の遺伝子欠失を相補したり、代替する
遺伝子、例えばジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝
子、Ecogpt遺伝子、Neo 遺伝子等を選択マーカーとして
利用している。
【００１１】本発明において使用する動物細胞用発現ベ
クターは、具体的にはニワトリのβ−アクチン遺伝子プ
ロモーターの一部の塩基配列をウサギのβ−グロビン由
来の遺伝子に置き換えることにより外来遺伝子の高発現
を可能にするベクターである、ｐＣＡＧＧＳ（Niwa et
al., Gene, 108, 193-200 (1991)、特開平03-168087)が
挙げられるが、その他動物細胞用発現ベクターであれば
特に限定されない。
クターは、具体的にはニワトリのβ−アクチン遺伝子プ
ロモーターの一部の塩基配列をウサギのβ−グロビン由
来の遺伝子に置き換えることにより外来遺伝子の高発現
を可能にするベクターである、ｐＣＡＧＧＳ（Niwa et
al., Gene, 108, 193-200 (1991)、特開平03-168087)が
挙げられるが、その他動物細胞用発現ベクターであれば
特に限定されない。
【００１２】本発明において、遺伝子を導入する動物細
胞としては、糖蛋白質性の有用物質の生産に利用されて
いる細胞、あるいは利用可能性のある細胞であればよ
く、具体的には、ＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター
卵巣細胞）、サルＶｅｒｏ細胞、マウスＬ細胞、ＢＨ
Ｋ、φ２（ＮＩＨ３Ｔ３）、マウスＣ１２７細胞、サル
ＣＯＳ細胞、Ｈｅｌａ細胞、マウスミエローマ等が挙げ
られる。
胞としては、糖蛋白質性の有用物質の生産に利用されて
いる細胞、あるいは利用可能性のある細胞であればよ
く、具体的には、ＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター
卵巣細胞）、サルＶｅｒｏ細胞、マウスＬ細胞、ＢＨ
Ｋ、φ２（ＮＩＨ３Ｔ３）、マウスＣ１２７細胞、サル
ＣＯＳ細胞、Ｈｅｌａ細胞、マウスミエローマ等が挙げ
られる。
【００１３】本発明において、糖鎖の構造が改変されう
る糖蛋白質としては、治療目的として有用な、ヒト・エ
リスロポエチン、ヒト・スロンボポエチン、インターフ
ェロン群、インターロイキン群、レクチン、インターロ
イキン１レセプター、インターロイキン４レセプター、
インターロイキン７レセプター、腫瘍壊死因子レセプタ
ー、ＣＤ４およびそれらの改変体が挙げられる。
る糖蛋白質としては、治療目的として有用な、ヒト・エ
リスロポエチン、ヒト・スロンボポエチン、インターフ
ェロン群、インターロイキン群、レクチン、インターロ
イキン１レセプター、インターロイキン４レセプター、
インターロイキン７レセプター、腫瘍壊死因子レセプタ
ー、ＣＤ４およびそれらの改変体が挙げられる。
【００１４】糖鎖の構造の改変とは、具体的には、糖鎖
の分岐構造の増大をいう。このように糖鎖の分岐構造の
増大した糖蛋白は、生体内での活性の増大、血液中での
クリアランス時間の延長という点において優れている
(Takeuchi et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 7
819-7822, 1989) 。動物細胞への遺伝子導入の方法とし
ては、最も一般的なリン酸カルシウム法のほか、マイク
ロインジェクション法、プロトプラスト融合法、リポソ
ーム融合法、赤血球ゴースト融合法、エレクトロポレー
ション法等が用いられる。
の分岐構造の増大をいう。このように糖鎖の分岐構造の
増大した糖蛋白は、生体内での活性の増大、血液中での
クリアランス時間の延長という点において優れている
(Takeuchi et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 7
819-7822, 1989) 。動物細胞への遺伝子導入の方法とし
ては、最も一般的なリン酸カルシウム法のほか、マイク
ロインジェクション法、プロトプラスト融合法、リポソ
ーム融合法、赤血球ゴースト融合法、エレクトロポレー
ション法等が用いられる。
【００１５】酵素ＧｎＴ−Ｖ活性の測定は、西河らの方
法（Nishikawa et al., Biochim. Biophys. Acta, 103
5, 313-318, 1990）に従う。即ち、2-アミノピリジンに
より還元末端を蛍光ラベルしたアシアロ・アガラクト２
本鎖糖鎖、及びUDP-N-アセチルグルコサミンを緩衝液中
にて細胞抽出液と反応させた後、反応生成物を高速液体
クロマトグラフィーにより同定・定量することにより行
いうる。
法（Nishikawa et al., Biochim. Biophys. Acta, 103
5, 313-318, 1990）に従う。即ち、2-アミノピリジンに
より還元末端を蛍光ラベルしたアシアロ・アガラクト２
本鎖糖鎖、及びUDP-N-アセチルグルコサミンを緩衝液中
にて細胞抽出液と反応させた後、反応生成物を高速液体
クロマトグラフィーにより同定・定量することにより行
いうる。
【００１６】
【実施例】以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説
明するが、これらの実施例は本発明の範囲を何等限定す
るものではない。 〔実施例１〕 糖転移酵素遺伝子を導入した動物細胞の
調製 (1) ヒトＧｎＴ−ＶｃＤＮＡの取得（クローニング） ヒトＧｎＴ−ＶｃＤＮＡの取得法については、既に報告
されている（Saito etal., Biochem. Biophys. Res. Co
mmun. 198, 318-327, 1994)。具体的には、ヒト肺癌由
来ＱＧ細胞の培養液上清から得られたＧｎＴ−Ｖ（特開
平6-197756号公報) の部分アミノ酸配列からオリゴヌク
レオチドプローブを作成し、ヒト肺癌細胞のｃＤＮＡ、
ヒト胎児肝臓のｃＤＮＡライブラリー、ヒト神経芽細胞
腫由来の細胞株であるＧＯＴＯ細胞のＲＮＡに対して、
ＰＣＲ又はプラークハイブリダイゼーションを行うこと
によりヒトＧｎＴ−ＶｃＤＮＡの全長を得た（図２〜
３）。
明するが、これらの実施例は本発明の範囲を何等限定す
るものではない。 〔実施例１〕 糖転移酵素遺伝子を導入した動物細胞の
調製 (1) ヒトＧｎＴ−ＶｃＤＮＡの取得（クローニング） ヒトＧｎＴ−ＶｃＤＮＡの取得法については、既に報告
されている（Saito etal., Biochem. Biophys. Res. Co
mmun. 198, 318-327, 1994)。具体的には、ヒト肺癌由
来ＱＧ細胞の培養液上清から得られたＧｎＴ−Ｖ（特開
平6-197756号公報) の部分アミノ酸配列からオリゴヌク
レオチドプローブを作成し、ヒト肺癌細胞のｃＤＮＡ、
ヒト胎児肝臓のｃＤＮＡライブラリー、ヒト神経芽細胞
腫由来の細胞株であるＧＯＴＯ細胞のＲＮＡに対して、
ＰＣＲ又はプラークハイブリダイゼーションを行うこと
によりヒトＧｎＴ−ＶｃＤＮＡの全長を得た（図２〜
３）。
【００１７】(2) 糖転移酵素遺伝子の動物細胞への導
入 (1)で得られたヒトＧｎＴ−ＶｃＤＮＡを、動物細胞用
発現ベクターｐＣＡＧＧＳ（Niwa et al., Gene, 108,
193-200(1991)）に組み込み、ネオマイシン耐性ベクタ
ーｐＳＴｎｅｏＢ（Katoh et al., Cell Structure and
Function, 12,575-580, 1987）と共に燐酸カルシウム
法を用いて、組み換えヒト・エリスロポエチン（ＥＰ
Ｏ）を生産するＣＨＯ細胞であるＣＨＯ−Ｋ１の亜株
[Lin et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 82, 7580-
7584 (1985), 理化学研究所 開発銀行 細胞カタログ
No. 7, p. 73, 1994]に対して遺伝子導入を行った。Ｇ
４１８耐性で選抜した遺伝子導入株約５０株について西
河らの方法（Nishikawa et al., Biochim. Biophys. Ac
ta, 1035, 313-318, 1990）に従い、2-アミノピリジン
により還元末端を蛍光ラベルしたアシアロ・アガラクト
２本鎖糖鎖（図１中、Asn を2-アミノピリジンに置換し
たもの) 、及びUDP-N-アセチルグルコサミンを緩衝液中
にて細胞抽出液と反応させた後、反応生成物を高速液体
クロマトグラフィーにより同定・定量することにより、
細胞のＧｎＴ−Ｖ活性を測定し、高活性の維持されるも
のを２株選抜した。
入 (1)で得られたヒトＧｎＴ−ＶｃＤＮＡを、動物細胞用
発現ベクターｐＣＡＧＧＳ（Niwa et al., Gene, 108,
193-200(1991)）に組み込み、ネオマイシン耐性ベクタ
ーｐＳＴｎｅｏＢ（Katoh et al., Cell Structure and
Function, 12,575-580, 1987）と共に燐酸カルシウム
法を用いて、組み換えヒト・エリスロポエチン（ＥＰ
Ｏ）を生産するＣＨＯ細胞であるＣＨＯ−Ｋ１の亜株
[Lin et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 82, 7580-
7584 (1985), 理化学研究所 開発銀行 細胞カタログ
No. 7, p. 73, 1994]に対して遺伝子導入を行った。Ｇ
４１８耐性で選抜した遺伝子導入株約５０株について西
河らの方法（Nishikawa et al., Biochim. Biophys. Ac
ta, 1035, 313-318, 1990）に従い、2-アミノピリジン
により還元末端を蛍光ラベルしたアシアロ・アガラクト
２本鎖糖鎖（図１中、Asn を2-アミノピリジンに置換し
たもの) 、及びUDP-N-アセチルグルコサミンを緩衝液中
にて細胞抽出液と反応させた後、反応生成物を高速液体
クロマトグラフィーにより同定・定量することにより、
細胞のＧｎＴ−Ｖ活性を測定し、高活性の維持されるも
のを２株選抜した。
【００１８】上述の２株（♯２、♯３２）及びに対照株
（遺伝子導入なし）について、細胞破砕抽出物のＧｎＴ
−III, IV, V活性を測定した。結果を表１に示す。ま
た、高速液体クロマトグラフを用いたGnT-III,IV,V活性
測定の一例を図４に示す。
（遺伝子導入なし）について、細胞破砕抽出物のＧｎＴ
−III, IV, V活性を測定した。結果を表１に示す。ま
た、高速液体クロマトグラフを用いたGnT-III,IV,V活性
測定の一例を図４に示す。
【００１９】
【表１】 GnT-V遺伝子導入CHO細胞のGnT-III,IV,V活性 ─────────────────────────── 細 胞 GnT活性（pmol/hour/mg protein） GnT-III GnT-IV GnT-V ─────────────────────────── ♯２ n.d. 34 2765 ♯３２ n.d. 39 2363 対照１ n.d. 41 835 対照２ n.d 34 1137 ─────────────────────────── 基質濃度：800 μM n.d.: 検出できず
【００２０】遺伝子導入株♯２、♯３２株においては、
ネオマイシン耐性遺伝子のみを導入したコントロール株
に対して２〜３倍の単位蛋白質量あたりの活性が観察さ
れた。また、同時に測定可能であるＧｎＴ−III 、Ｇｎ
Ｔ−ＩＶ活性については対照株との間に差は観察され
ず、酵素活性の増大がＧｎＴ−Ｖ遺伝子の導入に起因す
るものであることが強く示唆された。
ネオマイシン耐性遺伝子のみを導入したコントロール株
に対して２〜３倍の単位蛋白質量あたりの活性が観察さ
れた。また、同時に測定可能であるＧｎＴ−III 、Ｇｎ
Ｔ−ＩＶ活性については対照株との間に差は観察され
ず、酵素活性の増大がＧｎＴ−Ｖ遺伝子の導入に起因す
るものであることが強く示唆された。
【００２１】細胞から総ＲＮＡを抽出し、ヒトＧｎＴ−
Ｖ構造遺伝子のＥｃｏＲＩ−ＳｍａＩ断片をプローブと
して常法によりノーザンブロットを行った結果、♯２、
♯３２株においては図５に示すごとく明瞭なバンドが観
察され、導入した遺伝子の転写が行われていることが明
らかであった。
Ｖ構造遺伝子のＥｃｏＲＩ−ＳｍａＩ断片をプローブと
して常法によりノーザンブロットを行った結果、♯２、
♯３２株においては図５に示すごとく明瞭なバンドが観
察され、導入した遺伝子の転写が行われていることが明
らかであった。
【００２２】〔実施例２〕 組み換えタンパク質（ＥＰ
Ｏ）の生産 ♯２株、♯３２株をそれぞれＤ−ＭＥＭ／Ｆ−１２培地
（７５ｎＭのメトトレキセート、１ｍｇ／ｍｌのＧ４１
８、１０％の非動化仔牛血清を含む）５０ｍｌを加えた
１７５ｃｍ2 フラスコにて３７℃、５％ＣＯ2 の条件で
ほぼフラスコ底面いっぱいに培養した後、非動化仔牛血
清を含まない上記培地に交換した後、３７℃、５％ＣＯ
2 下に１１日間保持した。培養液上清を回収後、遠心分
離により細胞その他固形物を沈澱させ、得られた上清を
膜を用いて２００倍に濃縮の後、逆相カラム（Ｖｙｄａ
ｃ Ｃ４）を用いてＥＰＯ蛋白質を精製した。精製した
エリスロポエチンの脱塩を行ない、等電点電気泳動の試
料とした。ゲルは、5.0 gの尿素と780 ulのPharmalyte
2.5-5 (Pharmacia)を含む10.5mlの水溶液で膨潤したCle
anGel IEF(Pharmacia) を用いた。この操作により、シ
アル酸の付加数に応じてＥＰＯを幾つかのisoform に分
離することができる。泳動後、タンパク質をゲルからPV
DF膜に転写し、抗ＥＰＯ抗体を用いた方法でエリスロポ
エチンを検出した。結果を図６に示した。その結果、Ｇ
ｎＴ−Ｖ高活性株である♯２、♯３２によって生産され
たＥＰＯでは、シアル酸の付加が９個であるバンドが消
失していた。シアル酸は分岐した糖鎖の各末端部分に１
分子ずつ結合していることが知られている。ＥＰＯでは
１分子中に３本のＮ−リンク糖鎖と１本のＯ−リンク糖
鎖が存在し、Ｎ−リンク糖鎖がすべて４本鎖構造を取っ
た場合、１分子中のシアル酸の合計は１４個となる。従
ってシアル酸の付加数の少ない分子種の割合が低下して
いるということは、糖鎖の分岐構造の増大を示唆するも
のである。
Ｏ）の生産 ♯２株、♯３２株をそれぞれＤ−ＭＥＭ／Ｆ−１２培地
（７５ｎＭのメトトレキセート、１ｍｇ／ｍｌのＧ４１
８、１０％の非動化仔牛血清を含む）５０ｍｌを加えた
１７５ｃｍ2 フラスコにて３７℃、５％ＣＯ2 の条件で
ほぼフラスコ底面いっぱいに培養した後、非動化仔牛血
清を含まない上記培地に交換した後、３７℃、５％ＣＯ
2 下に１１日間保持した。培養液上清を回収後、遠心分
離により細胞その他固形物を沈澱させ、得られた上清を
膜を用いて２００倍に濃縮の後、逆相カラム（Ｖｙｄａ
ｃ Ｃ４）を用いてＥＰＯ蛋白質を精製した。精製した
エリスロポエチンの脱塩を行ない、等電点電気泳動の試
料とした。ゲルは、5.0 gの尿素と780 ulのPharmalyte
2.5-5 (Pharmacia)を含む10.5mlの水溶液で膨潤したCle
anGel IEF(Pharmacia) を用いた。この操作により、シ
アル酸の付加数に応じてＥＰＯを幾つかのisoform に分
離することができる。泳動後、タンパク質をゲルからPV
DF膜に転写し、抗ＥＰＯ抗体を用いた方法でエリスロポ
エチンを検出した。結果を図６に示した。その結果、Ｇ
ｎＴ−Ｖ高活性株である♯２、♯３２によって生産され
たＥＰＯでは、シアル酸の付加が９個であるバンドが消
失していた。シアル酸は分岐した糖鎖の各末端部分に１
分子ずつ結合していることが知られている。ＥＰＯでは
１分子中に３本のＮ−リンク糖鎖と１本のＯ−リンク糖
鎖が存在し、Ｎ−リンク糖鎖がすべて４本鎖構造を取っ
た場合、１分子中のシアル酸の合計は１４個となる。従
ってシアル酸の付加数の少ない分子種の割合が低下して
いるということは、糖鎖の分岐構造の増大を示唆するも
のである。
【００２３】
【発明の効果】本発明によれば、糖転移酵素（Ｎーアセ
チルグルコサミニルトランスフェラーゼ Ｖ）遺伝子を
動物細胞に導入することにより該酵素活性を高レベルに
維持する動物細胞が得られ、また該細胞を培養すること
により、治療上または産業上有用な種々の糖鎖改変蛋白
質を得ることできる。
チルグルコサミニルトランスフェラーゼ Ｖ）遺伝子を
動物細胞に導入することにより該酵素活性を高レベルに
維持する動物細胞が得られ、また該細胞を培養すること
により、治療上または産業上有用な種々の糖鎖改変蛋白
質を得ることできる。
【図１】ＧｎＴ−Ｖの触媒する化学反応を示す。
【図２】ヒトＧｎＴ−ＶｃＤＮＡの全長配列を示す。
【図３】ヒトＧｎＴ−ＶｃＤＮＡの全長配列（続き）を
示す。
示す。
【図４】高速液体クロマトグラフを用いたGnT-III,IV,V
活性測定の一例を示す。
活性測定の一例を示す。
【図５】ノーザンブロットによる遺伝子の発現を示す電
気泳動写真である。
気泳動写真である。
【図６】等電点電気泳動による、ＥＰＯのisoform分布
を示す電気泳動写真である。
を示す電気泳動写真である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/09 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (Ｃ１２Ｎ 5/10 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 谷口 直之 大阪府豊中市上野東２−19−32−201
Claims (8)
- 【請求項１】 糖転移酵素遺伝子を導入することによ
り、当該酵素活性を強化した動物細胞。 - 【請求項２】 糖転移酵素が、Ｎーアセチルグルコサミ
ニルトランスフェラーゼ Ｖである請求項１記載の動物
細胞。 - 【請求項３】 細胞株が、ＣＨＯ−Ｋ１株に由来するも
のである請求項１記載の動物細胞。 - 【請求項４】 糖転移酵素の遺伝子を動物細胞に導入
し、該細胞を培地に培養し、培養物より糖鎖の構造が改
変された糖蛋白質を得ることを特徴とする糖鎖改変糖蛋
白質の製造方法。 - 【請求項５】 糖転移酵素が、Ｎーアセチルグルコサミ
ニルトランスフェラーゼ Ｖである請求項４記載の方
法。 - 【請求項６】 細胞株が、ＣＨＯ−Ｋ１株に由来するも
のである請求項４記載の方法。 - 【請求項７】 請求項４〜６のいずれかに記載の方法に
より得ることのできる糖鎖改変糖蛋白質。 - 【請求項８】 糖蛋白質がエリスロポエチン（ＥＰＯ）
である、請求項７記載の糖鎖改変糖蛋白質。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7266138A JPH0984582A (ja) | 1995-09-21 | 1995-09-21 | 糖転移酵素活性を強化した動物細胞、糖鎖改変糖蛋白質ならびにその製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7266138A JPH0984582A (ja) | 1995-09-21 | 1995-09-21 | 糖転移酵素活性を強化した動物細胞、糖鎖改変糖蛋白質ならびにその製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0984582A true JPH0984582A (ja) | 1997-03-31 |
Family
ID=17426849
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7266138A Pending JPH0984582A (ja) | 1995-09-21 | 1995-09-21 | 糖転移酵素活性を強化した動物細胞、糖鎖改変糖蛋白質ならびにその製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0984582A (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002002793A1 (fr) * | 2000-07-05 | 2002-01-10 | Japan As Represented By Secretary Of Osaka University | Processus de production de glycoproteine |
| WO2003060131A1 (fr) * | 2002-01-09 | 2003-07-24 | Suntory Limited | Transferase gn-t de sucre presentant un effet angiogenique |
| JP2016053077A (ja) * | 2008-09-23 | 2016-04-14 | エフ.ホフマン−ラ ロシュ アーゲーF. Hoffmann−La Roche Aktiengesellschaft | エリスロポエチンの精製 |
| US9574218B2 (en) | 2001-01-19 | 2017-02-21 | Phyton Holdings, Llc | Method of co-expressing galactosyltransferase and a glycoprotein in a transgenic plant cell and sialylating the glycoprotein for production of glycoprotein having human-type sugar chain |
| US9745594B2 (en) | 2007-04-17 | 2017-08-29 | Stichting Dienst Landbouwkundig Onderzoek | Mammalian-type glycosylation in plants by expression of a zebrafish glycosyltransferase |
-
1995
- 1995-09-21 JP JP7266138A patent/JPH0984582A/ja active Pending
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002002793A1 (fr) * | 2000-07-05 | 2002-01-10 | Japan As Represented By Secretary Of Osaka University | Processus de production de glycoproteine |
| US9574218B2 (en) | 2001-01-19 | 2017-02-21 | Phyton Holdings, Llc | Method of co-expressing galactosyltransferase and a glycoprotein in a transgenic plant cell and sialylating the glycoprotein for production of glycoprotein having human-type sugar chain |
| WO2003060131A1 (fr) * | 2002-01-09 | 2003-07-24 | Suntory Limited | Transferase gn-t de sucre presentant un effet angiogenique |
| US7662769B2 (en) | 2002-01-09 | 2010-02-16 | Suntory Holdings Limited | Glycosyltransferase GnT-V having neovascularization action |
| US9745594B2 (en) | 2007-04-17 | 2017-08-29 | Stichting Dienst Landbouwkundig Onderzoek | Mammalian-type glycosylation in plants by expression of a zebrafish glycosyltransferase |
| JP2016053077A (ja) * | 2008-09-23 | 2016-04-14 | エフ.ホフマン−ラ ロシュ アーゲーF. Hoffmann−La Roche Aktiengesellschaft | エリスロポエチンの精製 |
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