KR100389141B1

KR100389141B1 - 인간 에리스로포이에틴을 고효율로 발현하는 재조합세포주 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR100389141B1
Application number: KR10-2000-0026805A
Authority: KR
Inventors: 나규흠; 김현일; 박장현; 이성희; 김원배; 양재명
Original assignee: 동아제약 주식회사
Priority date: 2000-05-18
Filing date: 2000-05-18
Publication date: 2003-06-25
Also published as: KR20010105066A

Abstract

본 발명은 인간 에리스로포이에틴(erythropoietin, EPO)을 고효율로 발현시키는 재조합 세포주 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 구체적으로 5',3'-비번역서열(untranslated sequence)이 삭제된 EPO 게놈 유전자, SRα 프로모터, AMV(alfalfa mosaic virus) RNA4 리더서열, DHFR(dihydrofolate reductase) 유전자, 지오신-내성 유전자(zeocin-resistant gene)를 포함하는 pSRα-gEpo 발현벡터

(expression vector)를 BHK(Baby hamster kidney) 세포와 CHO(Chinese hamster ovary) 세포에 형질감염(transfection)시킨 후 메쏘트렉세이트(methotrexate, MTX)가 포함된 배지에서 선별배양함으로써 안정화시킨 인간 에리스로포이에틴 고발현 세포주 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 인간 EPO 고발현 세포주에 의해 고역가로 대량생산된 EPO는 빈혈, 류마티스 관절염 또는 후천성 면역 결핍증 등의 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

인간 에리스로포이에틴을 고효율로 발현하는 재조합 세포주 및 이의 제조방법{Novel cell lines expressing recombinant human erythropoietin and a construction method thereof}

본 발명은 인간 에리스로포이에틴(erythropoietin, EPO)을 고효율로 발현시키는 고발현 세포주 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 구체적으로 5',3'-비번역서열(untranslated sequence)이 삭제된 EPO 게놈 유전자, SRα 프로모터, AMV(alfalfa mosaic virus) RNA4 리더서열, DHFR(dihydrofolate reductase) 유전자, 지오신-내성 유전자(zeocin-resistant gene)를 포함하는 pSRα-gEpo 발현벡터

(expression vector)를 BHK(Baby hamster kidney) 세포와 CHO(Chinese hamster ovary) 세포에 형질감염(transfection)시킨 후 메토트렉세이트(methotrexate, MTX)가 포함된 배지에서 선별배양함으로써 안정화시킨 인간 에리스로포이에틴 고발현 세포주 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

인간 에리스로포이에틴(erythropoietin, 이하 "EPO"로 약칭함)은 적혈구계의 세포에 특이적으로 작용하는 조혈 호르몬으로서 골수중의 적아구계(erythroblast) 전구 세포의 분화와 증식을 조절하여 적혈구의 생성을 자극하는 순환 당단백 호르몬이다(Carnot et al,Comp. Rend.,143:384, 1906). EPO는 165개의 아미노산으로 구성되며 3개의 N-결합 당쇄와 한개의 O-결합 당쇄를 포함하는데, 이들 당쇄 전체의 분자량은 EPO 당단백 호르몬 분자량의 40%에 해당하며 EPO의 생체내 활성에 필수적인 역할을 한다.

인간 EPO는 1906년에 적혈구 조혈(erythropoiesis)을 조절할 수 있는 체액성 인자의 존재 가능성이 보고 되면서 처음으로 알려지기 시작하였고, 1957년에 제이콥슨 등(Jacobson et al, Nature,179:633, 1957)에 의해 적혈구 생성을 촉진하는 호르몬, 즉 에리스로포이에틴(erythropoietin)으로 명명되었으며, 조혈 호르몬의 결핍이 원인인 만성 빈혈의 치료에 놀라운 잠재능을 가짐이 보고되면서(Winearles et al.,Lancet, 22:1175, 1986) EPO의 중요성이 인식되었다.

인간 EPO는 1977년에 미야케 등이 재생불량성 빈혈환자의 뇨로부터 대량으로 분리·정제하는데 최초로 성공한 이후(Miyake et al.,J. Biol. Chem., 252(15), 5558, 1977), 분자생물학과 당생물학에서 연이은 연구가 본격화되기 시작하여 야나가와 등에 의해 N-말단 30개의 아미노산 서열이 처음으로 보고되었고(Yanagawa et al.,J. Biol. Chem., 295(5), 2707, 1984), 2년 후에는 래이 등이 인간 뇨 유래 EPO로부터 전체 아미노산의 서열을 결정하여 보고하였다(Lai et al.,J. Biol. Chem., 261, 3116, 1986).

인간 EPO는 적혈구 조혈작용에 있어 전구세포의 마지막 성숙과 성장을 조절하는 역할을 하는 호르몬으로서(Goldwasser et al.,Ann. NY Acad. Sci., 149, 49, 1968) 주로 태아의 간이나 성인의 신장에서 생산되며, 혈액내 인간 EPO량은 저산소 혈중상태에서 증가하여 활발하게 조혈작용을 유도함으로써 성숙한 산소전달 적혈구 세포의 생산을 조절한다. 하지만, 이러한 EPO의 기능이상으로 조혈작용에 이상이발생하면 정상적인 조직의 기능을 위해 필요한 적정한 수준의 적혈구 수를 유지할 수 없게 된다. 따라서, 적혈구 수의 감소로 인하여 조직의 기능 장애가 발생하고 결국에는 빈혈을 일으키게 된다.

또한, 인간 EPO는 신부전증의 치료 동안 또는 이로부터 기인한 호르몬의 결핍 또는 생산 감소가 원인인 만성빈혈의 치료에 놀라운 잠재능을 나타내는 것으로 보고되었다(Winearles et al.,Lancet, 22, 1175, 1986). 특히, 말기 신부전증 환자들은 생존을 위해 신장이식이나 정기적인 신장투석이 요구되는데, 만성 신부전증 환자가 신장성 빈혈을 일으키는 가장 주된 원인은 EPO 생성의 결핍임이 이미 입증되었다(Eschbach et al.,N. Engl. J. Med., 321, 158, 1989). 따라서 인간 EPO는 빈혈, 특히 신장성 빈혈 등의 임상적 치료에 유용하게 이용되고 있으며, 이러한 치료제로서 인간 EPO를 대량으로 제조하기 위해서 유전자 재조합 기술과 세포배양 기술을 이용하는 방법은 매우 유용한 수단이 된다.

천연형 인간 EPO는 산성(acid), 단일형(monomer)의 당단백질로서 전체 분자량이 약 34,000달톤 정도이며, 당을 제외한 단백질 부분만의 분자량은 약 18,000달톤이다(Wang et al.,Endocrinology, 116, 2286, 1985). 인간 EPO에서 전체 분자량의 약 40%를 차지하는 당쇄부분은 인간 EPO의 생체내(in vivo) 활성에 필수적인 역할을 하므로, 인간 EPO내 당함량이 감소되면 인간 EPO 분자의 생물학적 반감기가 급격히 감소되어 생체내 생물학적 활성이 소실된다(Goto et al.,Biotechnology, 6, 67, 1988). 인간 EPO는 아미노산 Asn 24, Asn 38 및 Asn 83의 위치에 3개의 N-결합 당쇄와 Ser 126 위치에 하나의 뮤신형(mucin-type) O-결합 당쇄를 갖는 당단백호르몬으로서, 유전자 재조합 기술을 이용하여 이질적인 다양한 숙주세포로부터 인간 EPO를 제조하는 경우에는 인간 EPO의 당쇄구조가 매우 중요하게 작용한다.

유전자 재조합 기술을 이용한 당단백호르몬의 발현 및 제조에 있어서, 일반적으로 대장균, 효모, 곤충세포 또는 동물세포 등이 숙주세포로 사용될 수 있으나, 이들은 숙주세포 자체의 당화능이나 당화체계가 각기 다르기 때문에 특히, 인간 EPO와 같이 당이 호르몬의 생체내 활성에 절대적으로 중요한 역할을 하는 당단백호르몬을 제조하기 위해서는 숙주세포를 선택할 때 당화능이나 당화체계를 가장 우선적으로 고려하여야 한다.

상기의 숙주세포 중 대장균은 당화능이 전혀 없고, 효모나 곤충세포의 경우에는 당화능은 있지만 주로 고 만노즈형(high mannose type)의 당단백질을 생성하거나 인간 EPO와 같은 복합형(complex type) 당단백질을 생성시키기에는 당화능이 낮기 때문에 인간 EPO를 제조하기 위한 숙주세포로는 적절하지 못하다.

또한, 당화능이나 당화체계를 비교적 잘 갖춘 포유동물 세포라 할지라도 세포주의 특성에 따라 당화되는 정도나 형태가 다르기 때문에, 인간 EPO와 같이 치료제로 사용되는 당단백질을 제조할 때는 인체 내에서 항원성 등을 유발시키지 않고 안전하며 높은 생체내 활성을 나타낼 수 있는 당구조를 생성하는 포유동물 세포주를 숙주세포로 선택하여야 한다.

따라서, 본 발명에서는 인체내에서 고활성을 나타내는 인간 에리스로포이에틴의 고발현 세포주를 제조하기 위하여, 당화능이나 당화체계가 비교적 잘 갖추어져 있으면서 인체내에서 항원성을 유발하지 않고 안전하며 높은 생체내 활성을 나타낼 수 있는 당구조를 생성하는 포유동물 세포 중 햄스터 세포류인 차이니즈 햄스터(Chinese hamster ovary, CHO) 세포와 베이비 햄스터 신장(Baby hamster kidney, BHK) 세포를 이용하였다.

한편, 상기와 같은 동물세포에서 외래 유전자를 효율적으로 발현시키기 위해서는 전사조절인자(transcriptional control element) 및 이에 영향을 미치는 요소, 예를 들면 프로모터, 목적유전자의 염색체내 삽입위치, 유전자의 카피수(gene copy number), 번역효율 및 5',3'-비번역서열 등이 중요하다.

따라서, 본 발명은 안정적으로 인간 에리스로포이에틴을 고발현하는 세포주를 제조하기위하여, 5',3'-비번역서열이 삭제된 인간 에리스로포이에틴 게놈 유전자를 클로닝하여 포유동물 세포내에서 EPO를 고발현할 수 있도록 고안된 재조합 발현벡터 pSRα-gEpo를 제조하였으며, 상기 재조합 발현벡터를 BHK-21 및 CHO/dhfr- 세포에 형질감염시킨 후 고농도의 MTX에서 선별배양하여 EPO가 안정적으로 고발현되는 세포주를 확립함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 5',3'-비번역서열이 삭제된 EPO 게자, SRα 프로모터, AMV RNA4 리더서열, DHFR 유전자, 지오신-내성 유전자를 포함하는 발현벡터를 형질감염시킨 후 MTX 선별배양에 의해 안정화시킨 인간 에리스로포이에틴을 고효율로 발현하는 재조합 세포주를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 상기의 인간 에리스로포이에틴을 고효율로 발현하는 재조합 세포주의 제조방법을 제공하는 것이다.

도 1은 EPO 게놈 유전자(gEPO)와 비번역서열(untranslated region, UTR)이 삭제된 gEpo 발현벡터의 모식도이고,

도 2는 5',3'-비번역서열이 삭제된 EPO 게놈 유전자에 다양한 프로모터를 연결시킨 gEpo 발현벡터의 모식도이고,

도 3은 5',3'-비번역서열이 삭제된 EPO 게놈 유전자, SRα 프로모터, AMV RNA4 리더서열, DHFR 유전자, 지오신-내성 유전자를 포함하는 pSRα-gEpo 발현벡터의 모식도이고,

도 4는도 1에서 제조된 각각의 gEpo 발현벡터를 형질감염시킨 COS-7 세포에서 EPO의 발현을 측정한 결과이고,

도 5는도 1에서 제조된 각각의 gEpo 발현벡터를 형질감염시킨 COS-7 세포에서 분리한 EPO mRNA의 노던 블럿 분석(Northern blot analysis) 결과이고,

레인 1 : 대조군

레인 2 : 야생형 게놈 EPO 유전자

레인 3 : 5'-비번역서열이 삭제된 게놈 EPO 유전자

레인 4 : 3'-비번역서열이 삭제된 게놈 EPO 유전자

레인 5 : 5',3'-비번역서열이 삭제된 게놈 EPO 유전자

레인 6 : RNA 크기 표시체

도 6은도 2에서 제조된 각각의 발현벡터를 형질감염시킨 다양한 세포주들에서 EPO의 발현을 측정한 결과이고,

a : COS-7 세포주

b : BHK-21 세포주

c : CHO/dhfr- 세포주

도 7은 MTX로 선별된 BHK-21 클론에서 EPO의 발현을 측정한 웨스턴 블럿 분석(Western blot analysis) 결과이고,

레인 1 : BHK-21 세포

레인 2 : 지오신 내성 BHK-21 클론

레인 3 : 100 nM MTX에서 선별배양한 BHK-21 클론

레인 4 : 200 nM MTX에서 선별배양한 BHK-21 클론

도 8는 MTX로 선별된 BHK-21 클론에서 분리한 게놈 DNA의 서던 블럿 분석(Southern blot analysis) 결과를 나타낸 것이다.

레인 1 : BHK-21 세포

레인 2 : 지오신 내성 BHK-21 클론

레인 3 : 100 nM MTX에서 선별배양한 BHK-21 클론

레인 4 : 200 nM MTX에서 선별배양한 BHK-21 클론

상기 목적을 위하여, 본 발명은 5',3'-비번역서열이 삭제된 EPO 게놈 유전자, SRα 프로모터, AMV RNA4 리더서열, DHFR 유전자, 지오신-내성 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 발현벡터를 형질감염시킨 재조합 BHK 세포주 및 CHO 세포주를 제공한다.

아울러, 본 발명은 EPO의 재조합 발현벡터를 제조하여 동물세포에 형질감염시킨 후 MTX가 포함된 배지에서 선별배양하는 인간 에리스로포이에틴 고효율로 발현하는 재조합 동물세포주의 제조방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 재조합 발현벡터 pSRα-gEpo는 5'3'-비번역서열이 삭제된 인간 EPO 게놈 유전자, SRα 프로모터, AMV RNA4 리더서열, DHFR 유전자 및 지오신 내성 유전자를 포함하는 벡터로서 포유동물 세포에서 인간 EPO를 고효율로 발현한다.

재조합 발현벡터 pSRα-gEpo는 기존의 항생제 선별인자로써 일반적으로 사용하던 엠피실린-내성 유전자(ampiciline-resistant gene, Ampr) 또는 네오마이신-내성 유전자(neomycin-resistant gene, Neor) 대신, 대장균 뿐만 아니라 동물세포에서도 항생제 선별인자로 이용가능한 지오신-내성 유전자(zeocin-resistant gene, Zeor)를 사용하며, 종래에 흔히 이용되던 SV40 프로모터를 사용하지 않고 보다 강력한 프로모터로서 SRα 프로모터를 사용하여 목적 유전자의 고발현을 유도한다. 또한, 상기의 재조합 발현벡터 pSRα-gEpo는 형질감염체 선별표식인자로서 DHFR 유전자가 존재하여 형질감염시킨 세포주의 선별배양을 용이하게 하며, AMV RNA4 리더서열을 포함하고 있어 mRNA의 번역을 효율적으로 증가시킨다.

상기와 같은 특징을 갖는 재조합 발현벡터 pSRα-gEpo의 제조방법과 이를 이용한 재조합 BHK 세포주 및 CHO 세포주를 제조하는 과정은 다음과 같다.

EPO 게놈 유전자 서열에 특이적인 프라이머(primer)를 사용한 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)에 의해 야생형 gEpo, 5'-비번역서열이 삭제된 gEpo, 3'-비번역서열이 삭제된 gEpo 및 5',3'-비번역서열이 삭제된 gEpo 등의 4가지 형태 EPO 게놈 유전자를 만든 후, 이들 각각을 SRα 프로모터를 함유하는 벡터에 클로닝하여 각각의 EPO 게놈 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터를 제조하였다(도 1참조). 각각의 재조합 발현벡터를 COS-7 세포에 형질감염시킨 후 효소면역측정법으로 일시적인 EPO의 발현수준을 측정한 결과, 5',3'-비번역서열이 삭제된 EPO 게놈 유전자를 이용하는 것이 가장 효율적임을 확인하였다(도 4참조).

또한, 상기의 발현벡터 각각을 형질감염시킨 세포에서의 EPO mRNA의 발현량을 분석한 결과 역시 5',3'-비번역서열이 삭제된 발현벡터에서 현저하게 증가하였는데, 이는 5',3'-비번역서열이 삭제된 EPO 게놈 유전자를 포함하는 발현벡터에서 유도된 인간 EPO의 발현증가가 mRNA 수준에서의 전사(transcription)의 증가와 연관되어 있음을 나타내준다.(도 5참조).

상기와 같이 5',3'-비번역지역이 삭제된 EPO 게놈 유전자를 이용한 발현벡터에서 EPO 발현율이 가장 높게 나타난 것을 확인한 후, 재조합 발현벡터를 제조하는데 있어 발현율을 증가시키는 가장 효율적인 프로모터를 찾기위하여 5',3'-비번역지역이 삭제된 EPO 게놈 유전자를 SV40(simian virus 40) 초기 프로모터, CMV(cytomegalo virus) 초기 프로모터, SRα 프로모터 또는 AMV RNA4 리더서열 및 SRα 프로모터와 함께 클로닝하여 4가지 형태의 발현벡터를 제조한다(도 2참조).

상기와 같이 제조된 4가지 형태의 발현벡터를 COS-7, BHK-21, 및 CHO/dhfr- 세포에 각각 형질감염시킨 후 효소면역측정법으로 EPO의 발현양을 측정한 결과, EPO의 발현은 SV40 프로모터에 의해 조절되는 발현벡터 및 SRα 및 AMV RNA4 리더서열에 의해 조절되는 발현벡터가 형질감염된 세포에서 특히 증가한다(도 6참조). 따라서, 본 발명자들은 인간 에리스로포이에틴을 고효율로 발현하는 재조합 발현벡터의 제조에 강력한 프로모터인 SRα 프로모터와 해독 효율을 높여주는 AMV RNA4 리더서열을 도입하였다. 상기한 결과들은 포유동물 세포에서 재조합 단백질의 발현이 전사조절인자(transcriptional regulatory element)와 숙주세포의 특성 모두에 영향받음을 나타낸다.

한편, 유전자 재조합 기술을 이용한 당단백호르몬의 발현 및 제조에 있어서, 일반적으로 대장균, 효모, 곤충세포 또는 동물세포 등이 숙주세포로 사용될 수 있으나, 이들은 숙주세포 자체의 당화능이나 당화체계가 각기 다르기 때문에 특히, 인간 EPO와 같이 당이 호르몬의 생체내 활성에 절대적으로 중요한 역할을 하는 당단백호르몬을 제조하기 위해서는 숙주세포를 선택할 때 당화능이나 당화체계를 가장 우선적으로 고려하여야 한다.

예를 들어, 포유동물 세포 중에서 C127세포 등과 같은 마우스 세포들은 자체의 당화체계 특성상 α-1,3-결합 갈락토오즈-β-1,4-결합 갈락토오즈-N-아세틸 글루코오즈아민(α-1,3-linked galactose-β-1,4-linked-N-acetylglucosamine)의 구조로 끝나는 글리칸(glycan)을 생성하거나(Tsuji et al.,Chem. Pharm. Bull., 38,765, 1990), α-2,3-결합과 α-2,6-결합 구조를 모두 갖는 말단 시알산 구조가 형성되는데, 이들은 인체에 정상적으로 존재하지 않는 구조물이기 때문에 적정 농도 이상이 사용되면 강한 항원성(antigenicity)을 나타낼 수 있는 N-글리코릴뉴라미닉산(N-glycolylneuraminic acid, NeuGc)의 생성률이 높은 편이다(Nigel et al.,Nature Biotechnology, 14, 975, 1996).

반면, 포유동물 세포 중 BHK(baby hamster kidney) 세포나 CHO(chinese hamster ovary) 세포와 같은 햄스터 세포들은 자체의 당화체계에 α-2,6-시알산 전이효소가 없기 때문에 α-2,3-결합 형태의 말단 시알산만이 나타나게 되며, 인간 EPO와 같은 복합형(complex type) 당단백 호르몬의 생성능이 우수하고, 또한 생성된 복합형 당말단에 형성되는 시알산 중에서도 N-글리코릴뉴라미닉산의 생성률이 낮거나 거의 생성되지 않는 특징이 있다(Hokke et al.,Eur. J. Biochem., 228, 981, 1995).

구체적으로, 베이비 햄스터 신장세포(baby hamster kidney cell)로부터 기원된 BHK 세포는 신장이 EPO를 생산하는 주기관이라는 점을 고려할 때(Jacobson et al.,Nature, 179, 633, 1957) 인간 EPO 생산을 위한 숙주세포로 적절하다. 또한, BHK 세포가 생산하는 인간 EPO에는 인체의 EPO에서는 발현되지 않는(Takeuchi et al.,J. Biol. Chem., 263, 3657, 1988) 타입-1(type-1) 사슬(Galβ1→3GlcNAcβ1-group; Tsuda 등,Biochemistry, 27, 5646, 1988)이 나타날 수 있으나, 이러한 구조는 인체 혈액형 항원(blood-type antigen)의 주요 구성 성분 중의 하나이기 때문에 타입-1 사슬 자체가 완전히 비정상적인 구조는 아니다. 따라서, BHK 세포는 인간 EPO와 같은 당단백 호르몬을 생산하기 위한 숙주세포로 유용하다.

또한, 차이니즈 햄스터 난소세포인 CHO 세포는 생체의약품(biomedicines) 생산에 가장 많이 사용되는 숙주세포로서, 디히드로폴레이트 환원효소-결손 세포주(dihydrofolate reductase-deficient mutant)를 사용한 유전자 증폭에 의해 생산성 및 당쇄 구조의 동질성을 높일 수 있는 장점을 가지고 있다. 다만, CHO 세포는 신장관(renal tubule) 등에 존재하는 인체내 EPO 생산세포에서 발견되는 구조보다 훨씬 더 반복적인 구조를 갖는 N-아세틸락토즈아민(N-acetyllactosamine)을 생산하거나(Sohuster et al.,Blood, 70, 316, 1987) 인체내 EPO에서 관찰되지 않는 3회 반복구조를 갖는 N-아세틸락토즈아민을 생산하는 것으로 알려져 있지만(Sasaki et al., In Glycoconjugates, Proceedings of the Ⅸth International Symposium, A84, 1987a), 이러한 N-아세틸락토즈아민의 3회 반복구조는 인체내 세포에 존재하는 당단백질에서도 발현되는 것으로서 인체에 해롭지 않은 것으로 보고되어 있다(Fukuda et al.,J. Biol. Chem., 259, 8260, 1984).

따라서, 본 발명자들은 인체내에서 고활성을 나타내는 인간 에리스로포이에틴의 고발현 세포주를 제조하기 위하여 포유동물 세포 중 햄스터 세포류인 차이니즈 햄스터(Chinese hamster ovary, CHO) 세포와 베이비 햄스터 신장(Baby hamster kidney, BHK) 세포를 이용하였다. 본 발명자들은 상기의 세포주들이 뉴클레오시드(nucleoside) 합성에 관여하는 주효소인 DHFR 유전자가 결손된 세포주들로서 뉴클레오시드를 포함하지 않는 MEM-α 최소배지에서는 생존할 수 없음을 고려하여, 형질감염체의 선별표식인자로 이용될 수 있는 쥐의 DHFR 유전자 및 대장균에서 뿐만 아니라 동물세포에서도 항생제 선별인자로 이용가능한 지오신-내성 유전자(Zeor)를 인간 에리스로포이에틴을 고효율로 발현하는 재조합 발현벡터에 도입하였다. DHFR 유전자와 지오신-내성 유전자를 포함하는 상기 발현벡터가 형질감염된 세포주들은 뉴클레오시드 합성을 저해하는 폴레이트 유사체인 MTX가 첨가된 배지에서 살아 남기 위하여, 외부에서 도입된 DHFR 유전자와 목적 유전자의 증폭을 유도함으로써 본 발명의 목적물질인 재조합 인간 EPO 당단백 호르몬의 생산이 증폭된다.

따라서, 본 발명은 EPO를 안정적으로 발현하는 세포주를 선별하기 위하여, 상기와 같이 DHFR 유전자 및 지오신-내성 유전자가 도입된 재조합 발현벡터의 특성을 이용한 방법, 즉 상기 발현벡터로 형질감염된 세포를 MTX 농도가 단계적으로 증가하는 배지에서 배양하여 선별하는 방법을 이용한다.

구체적으로, 먼저 5',3'-비번역서열이 삭제된 EPO 게놈 유전자, SRα 프로모터, AMV RNA4 리더서열, DHFR 유전자 및 지오신-내성 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터를 제조한다(도 3참조). 상기 재조합 발현벡터를 BHK-21 및 CHO/dhfr- 세포에 각각 형질감염시킨 후 지오신이 포함된 배지에서 1차 선별배양하여 EPO 발현수준이 높은 BHK-21 클론 및 CHO/dhfr- 클론을 얻는다. 상기 클론들을 MTX 농도를 점차적으로 증가시킨 10% 소 혈청함유 최소배지에서 배양하여 MTX 저항성 클론들을 선별한 후, MTX 저항성 클론들의 EPO 발현량을 측정하여 EPO의 발현량이 가장 높으며 EPO를 안정적으로 발현하는 세포주를 최종 선별한다.

상기와 같은 방법으로 최종 선별된 재조합 BHK 세포주 및 CHO 세포주를 각각BHK B6 및 CHO C135이라 명명하고 2000년 3월 23일자로 한국 세포주 연구재단에 기탁하였다(수탁번호 : KCLRF-BP-00027호 및 수탁번호 : KCLRF-BP-00028호).

상기와 같이 MTX 선별된 BHK-21 세포의 EPO 발현량은 MTX의 농도가 증가할수록 점차적으로 증가하는 양상을 보이는데, 이는 인간 EPO 고발현 재조합 발현벡터가 형질감염된 동물세포에서 MTX 선별배양에 의해 발현이 증가됨을 의미한다(도 7참조).

또한, EPO cDNA가 EPO 게놈 유전자 재조합 발현벡터로부터 BHK-21 염색체(chromosome)의 여러 부위로 삽입(integration)되며 MTX 선별배양에 의해 EPO cDNA의 상대적인 사본수(copy number)가 증폭됨음을 확인할 수 있다(도 8참조).

상기와 같이, 본 발명은 인간 EPO를 고효율로 발현시키기 위하여 EPO 게놈 유전자의 5',3'-비번역서열의 삭제와 SRα 프로모터 및 AMV RNA4 리더서열 등의 적절한 조절인자의 선택을 통해 제조된 발현벡터를 적절한 숙주세포로 형질감염시킨 후 MTX 선별배양을 통하여 안정화된 세포주를 수립함으로써 인간 에리스로포이에틴을 고효율로 발현하는 재조합 세포주를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기와 같이 재조합 인간 에리스로포이에틴을 고효율로 발현하는 재조합 동물세포주의 제조방법을 제공한다.

구체적으로, 인간 EPO를 고효율로 발현하는 재조합 동물세포주의 제조방법은 가장 높은 효율로서 재조합 EPO를 안정적으로 생산하기 위하여, 5',3'-비번역서열등이 포함 또는 삭제된 다양한 형태의 EPO 게놈 유전자의 발현이 다양한 바이러스 프로모터에 의해 조절되도록 재조합 발현벡터를 제조한 후, 상기 재조합 발현벡터를 각기 다른 동물세포에 형질감염시켜 그 중에 최적의 EPO 발현수준을 보이는 세포주를 선별하는 방법이다. 본 발명의 인간 에리스로포이에틴을 고효율로 발현하는 재조합 동물세포주 제조방법의 특징은 다음과 같다.

1) 5',3'-비번역서열이 삭제된 EPO 유전자를 클로닝한다.

2) 재조합 당단백질 게놈 유전자의 전사효율을 증가시키는 SRα 프로모터와 해독효율을 증가시키는 AMV RNA4 리더서열을 사용한다.

3) 상기 1) 및 2)를 포함하는 재조합 발현벡터로 형질감염된 세포들을 MTX 선별배양에 의해 고발현 재조합 동물세포주를 선별한다.

따라서, 본 발명의 인간 EPO를 고효율로 발현하는 동물세포주의 제조방법으로 제조된 재조합 세포주에 의해 고역가로 대량생산되는 EPO는 빈혈, 류마티스 관절염 또는 후천성 면역 결핍증 등의 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 인간 EPO 재조합 발현벡터의 제조

<1-1> 5',3'-비번역서열이 포함 또는 삭제된 인간 EPO 재조합 발현벡터의 제조

린 등(Lin et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:7580, 1985)이 발표한 EPO 게놈 유전자 서열을 참고로 하여 합성된서열번호 1로 기재되는 올리고뉴클레오티드 탐침(oligonucleotide probe)을 사용하여 인간 태아의 간 게놈 DNA 라이브러리(human fetal liver genomic DNA library, 미국 ATCC 37333)로부터 5.4 kb의 인간 EPO 게놈유전자를 클로닝하였다. 상기에서 클로닝된 인간 EPO 게놈 유전자를 주형으로 하여 야생형-gEpo DNA 절편은서열번호 2와서열번호 3으로 기재되는 프라이머에 의해, 5'-비번역서열 삭제-gEpo(△5'UTRgEpo) DNA 절편은서열번호 3과서열번호 4로 기재되는 프라이머에 의해, 3'-비번역서열 삭제-gEpo(△3'UTRgEpo) DNA 절편은서열번호 2와서열번호 5로 기재되는 프라이머에 의해, 5',3'-비번역서열 삭제-gEpo(△5'3'UTRgEpo) DNA 절편은서열번호 4와서열번호 5로 기재되는 프라이머에 의해 각각 PCR로 증폭하였다. 상기와 같이 증폭된 각각의 DNA 절편을 SRα 프로모터를 갖는 pcDSA 벡터(Lee et al., Mol. Cells, 6:552, 1996)에 삽입하여 각각의 발현벡터 pgEpo, p△5'UTRgEpo, p△3'UTRgEpo 및 p△5'3'UTRgEpo를 제조하였다(도 1).

<1-2> 형질감염(Transfection) 및 세포배양

실시예 <1-1>에서 제조된 각각의 재조합 발현벡터를 햄스터 세포류인 차이니즈 햄스터(Chinese hamster ovary) COS-7 세포에 형질감염시켰다. 구체적으로, 전배양한 COS-7 세포를 2 × 10⁵cells/㎖ 농도로 60 mm 조직배양 플레이트에 접종한 후 18시간 동안 배양하였다. 실시예 <1-1>에서 제조된 각각의 재조합 발현벡터로부터 분리한 DNA 2 ug과 7 ㎕ 리포펙틴(LipofectinTM, Gibco BRL) 시약을 혈청을 함유하지 않은 DMEM 배지 100 ㎕에 각각 첨가하여 상온에서 10분 동안 반응시킨 후, 두 용액을 서로 혼합하여 다시 상온에서 30분 동안 반응시켜 리포펙틴-DNA 복합체를 형성하였다. 상기 리포펙틴-DNA 복합체에 혈청을 함유하지 않은 DMEM을 첨가한 후 이것을 COS-7 세포위에 살며시 얹어 37℃, 5% CO₂배양기에서 5시간 동안 배양하여 형질감염시켰다. 각각의 발현벡터가 형질감염된 COS-7 세포는 10% 소 태아혈청(fetal bovine serum, JRH), 50 ㎍/㎖ 페니실린, 50 ㎍/㎖ 스트렙토마이신이 함유된 DMEM 배지를 이용하여 37℃, 5% CO₂조건하에서 48 시간 동안 배양하였다.

<1-3> 각각의 발현벡터로 형질감염된 세포의 효소면역측정법에 의한 EPO 발현수준 측정

상기와 같이 각각의 재조합 발현벡터가 형질감염된 세포들의 일시적인 EPO 발현수준을 효소면역측정법에 의하여 조사하였다. 구체적으로, 효소면역측정 키트(QuantikineTM IVDTM ELISA, RD Systems) 내 항체 흡착 플레이트의 지정된 각 웰에 희석액 100 ㎕씩을 첨가한 후, 상기 희석액으로 적절히 희석한 표준액, 국제표준액 및 상기 형질감염체들의 배양액 시료를 100 ㎕씩 첨가하여 잘 혼합한 후 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 이때, 국제표준액은 인간 EPO 국제표준품(86 IU/앰플, NIBSC) 앰플 한개를 인간 혈청 알부민이 첨가된 제형완충액[3% D-만니톨, 34.2 mM 염화나트륨, 12.5 mM 무수인산이수소나트륨(pH 7.0), 인간 혈청 알부민(1.0 ㎎/㎖)] 1㎖에 용해시킨 후 바이알 당 10 ㎕씩 분주하여 -70℃에 보관하고, 사용할 때마다 바이알 한개(10㎕)를 꺼내어 녹인 후 희석액으로 희석하여 사용하였다.

반응 후 각 웰의 잔여 반응액을 제거하고 세척용액으로 250 ㎕씩 3회 세척한 후 각 웰에 200 ㎕씩의 효소항체 접합체액을 첨가하여 다시 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응 후 반응액을 제거하고 세척용액으로 200 ㎕씩 3회 세척하여 잔여액을 모두 제거한 후 용시조제한 기질-발색용액 200 ㎕씩을 가하여 실온에서 20분 동안 반응시켰다. 각 웰에 반응정지액 100㎕ 씩을 가하여 반응을 정지시킨 후 450 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.

표준액의 역가(log mIU/㎖)를 횡축, 흡광도(A450nm)를 종축으로 하여 표준곡선을 작성하고 이 표준곡선으로부터 국제표준액과 형질감염체들의 배양액 시료 각각의 흡광도에 따른 인간 EPO 역가(mIU/㎖) 수치를 구하였다. 상기 수치에 각각의 희석비를 곱하여 얻은 3가지 희석액 역가 수치의 평균값을 계산하여 국제표준품과 시료의 측정치를 구한 후, 국제표준품의 측정치를 86 IU/㎖로 보정하여 보정비를 구하고 시료의 측정치에 보정비를 곱하여 형질감염체들의 배양액 시료내 EPO의 최종 역가를 계산하였다.

상기와 같이, 효소면역측정법으로 각각의 형질감염체들의 일시적인 EPO 발현수준을 측정한 결과, 야생형 pgEpo가 형질감염된 세포에 비해 △3'UTRgEpo가 형질감염된 세포에서는 EPO 발현이 40% 감소한 반면, △5'UTRgEpo 및 △5'3'UTRgEpo 각각이 형질감염된 세포에서는 각각 1.4배 및 2.6배씩 EPO 발현이 증가하였다(도4). 따라서,도 4에서 나타난 바와 같이 발현벡터를 제조하는데 있어 야생형 EPO 게놈 유전자보다 5',3'-비번역서열이 삭제된 EPO 게놈 유전자를 이용하는 것이 재조합 단백질의 발현을 효과적으로 증가시킴을 알 수 있다.

<1-4> 각각의 발현벡터로 형질감염된 세포의 노던 블럿 분석

실시예 <1-1>에서 제조된 각각의 발현벡터로 형질감염된 세포에서 발현되는 EPO mRNA의 양을 노던 블럿 분석(Northern blot analysis)으로 측정하였다. 구체적으로, 형질감염시키고 48시간 후에 각각의 발현벡터가 형질감염된 COS-7 세포로부터 세포내 총 RNA를 추출하였다. 각 시료의 RNA 농도를 260 nm에서 흡광도로 측정한 후, 0.7% 포름알데히드 아가로즈 겔(formaldehyde agarose gel)에 각 시료당 10 ㎍씩의 RNA를 로딩(loading)하고 전기영동으로 전개하였다. 전기영동이 끝난 후, 아가로즈 겔 상의 DNA를 모세관 이동법(capillary transfer)에 의해 나일론 여지(nylon membrane, Amersham Pharmacia)로 이동시켰다. 상기 나일론 여지를 혼성화 용액(hybridization solution)(5X SSPE, 2X Denhardt's solution, 0.1% SDS, 50% formamide, 50 ㎍/㎖ salmon sperm DNA)에 넣고 42℃에서 3시간 동안 전혼성화(prehybridization)시킨 후, DNA 탐침이 포함된 혼성화 용액에 넣고 42℃에서 20시간 동안 반응을 실시하였다. DNA 탐침은 인간 EPO 게놈 유전자내 엑손 2로부터 제한효소를 처리하여 얻은 XbaI-KpnI 절편을 DNA 라벨링 키트(High PrimeDNA labeling kit, BM)를 사용하여 [α-³²P]dGTP로 표지하였다. 혼성화가 끝나면 나일론 여지를 0.5% SDS가 포함된 2X SSC 용액으로 65℃에서 15분 동안 2회 세척한 후 0.5% SDS가 포함된 1X SSC 용액과 0.1X SSC 용액으로 각각 15분 동안 2회씩 세척하였다. 영상분석장치(Image analyzer, Vilber Lourmat)를 이용하여 로딩된 전체 RNA에 대한 상대적인 mRNA의 양을 측정하여 그 결과를도 5에 나타내었다.

도 5에 나타난 바와 같이, 실시예 <1-1>의 pgEpo, p△5'UTRgEpo, p△3'UTRgEpo 및 △5'3'UTRgEpo 발현벡터로 형질감염된 세포에서 발현된 mRNA는 각각의 예상되는 크기의 위치(각각 1,470 nt, 1,260 nt, 860 nt, 630 nt)에서 검출되었다. 또한, 발현된 mRNA의 상대적인 양을 비교한 결과, 야생형인 pgEpo가 형질감염된 세포에 비해 p△5'UTRgEpo가 형질감염된 세포에서 mRNA 발현량이 1.3배 증가하였고 p△3'UTRgEpo 및 p△5'3'UTRgEpo 각각이 형질감염된 세포에서는 mRNA 발현량이 각각 2배 및 3배씩 증가하였다. 이러한 결과는 5',3'-비번역서열이 삭제된 발현벡터에서의 EPO 발현증가가 mRNA 수준에서의 전사(transcription) 증가와 연관되어 있음을 나타낸다.

<실시예 2> 인간 EPO를 고효율로 발현하는 재조합 발현벡터의 제조

<2-1> 다양한 프로모터에 의해 조절되는 인간 EPO 재조합 발현벡터의 제조

인간 에리스로포이에틴의 발현율을 증가시키는데 가장 효율적인 프로모터와 세포주를 찾기 위하여, 다양한 형태의 프로모터에 의해 발현이 조절되는 인간 EPO재조합 발현벡터를 제조하였다.

구체적으로, 상기 실시예 1에서 인간 EPO의 발현을 위해 효과적이라고 밝혀진 5',3'-비번역서열이 삭제된 gEpo DNA를 SRα 프로모터를 갖는 pcDSA 벡터의 멀티클로닝 부위내 PstI-XhoI 제한효소 부위에 삽입하여 재조합 발현벡터 pcDSAI-gEpo를 제조하였다(도 2). 재조합 발현벡터 pcDSAI-gEpo에서는 SRα 프로모터에 의해 EPO의 발현이 조절된다.

서열번호 1로 기재되는 프라이머를 사용한 중합효소연쇄반응에 의하여 해독 개시코돈(translation start codon) 앞에 AMV RNA4 리더서열(leader sequences)을 포함하는 5',3'-비번역서열이 삭제된 gEpo DNA 절편을 증폭시킨 후, 상기 절편을 pcDSA 벡터에 클로닝하여 재조합 발현벡터 pcDSAII-gEpo를 제조하였다(도 2). 재조합 발현벡터 pcDSAII-gEpo에서는 EPO의 발현이 전사효율(transcriptional efficiency)을 증가시키는 SRα 프로모터와 번역효율(translational efficiency)을 증가시키는 AMV RNA4 리더서열에 의해 조절된다.

또 다른 재조합 발현벡터를 제조하기 위하여, 5',3'-비번역서열이 삭제된 gEpo DNA 절편을 pcDNA3.1 벡터(In vitrogen) 및 pZeoSV2 벡터(In vitrogen)의 멀티클로닝 부위내 EcoRI-XhoI 제한효소 부위에 클로닝하여 각각 재조합 발현벡터 pcDNA3.1-gEpo 및 pZeoSV2-gEpo를 제조하였다(도 2). 재조합 발현벡터 pcDNA3.1-gEpo에서는 싸이토메갈로 바이러스(cytomegalo virus, CMV)의 초기 프로모터가 EPO의 발현을 조절하며, 재조합 발현벡터 pZeoSV2-gEpo에서는 시미안 바이러스 40(simian virus 40, SV40)의 초기 프로모터가 EPO의 발현을 조절한다.

<2-2> 형질감염(Transfection) 및 세포배양

실시예 <2-1>에서 제조된 각각의 재조합 발현벡터를 COS-7, BHK-21 및 CHO/dhfr- 세포에 실시예 <1-2>와 동일한 방법으로 형질감염시켰다. 각각의 발현벡터가 형질감염된 BHK-21 세포와 COS-7 세포는 10% 소 태아혈청, 50 ㎍/㎖ 페니실린, 50 ㎍/㎖ 스트렙토마이신이 함유된 DMEM 배지에서 배양하고, CHO/dhfr- 세포는 10% 소 태아혈청, HT(0.1 mM sodium hypoxanthine, 0.016 mM thymidine), 50 ㎍/㎖ 페니실린, 50 ㎍/㎖ 스트렙토마이신이 함유된 IMDM 배지에서 배양하였다. 세포배양은 37℃, 5% CO₂조건하에서 실시하였다.

<2-3> 각각의 발현벡터로 형질감염된 세포의 효소면역측정법에 의한 EPO 발현수준 측정

실시예 <1-3>의 효소면역측정법과 동일한 방법으로 각각의 재조합 발현벡터가 형질감염된 COS-7, BHK-21 및 CHO/dhfr- 세포의 EPO 발현수준을 측정한 결과, CMV의 초기 프로모터에 의해 EPO의 발현이 조절되는 재조합 발현벡터 pcDNA3.1-gEpo 및 SRα 프로모터와 AMV RNA4 리더서열에 의해 EPO의 발현이 조절되는 재조합 발현벡터 pcDSAII-gEpo로 형질감염된 모든 세포의 경우에서 EPO의 발현이 증가하였다(도 6). 이러한 결과는 포유동물 세포에서 재조합 단백질의 발현이 재조합 발현벡터 내 전사조절인자(transcriptional regulatory element) 및 숙주세포의 특성모두에 영향받음을 나타낸다.

<실시예 3> 인간 EPO를 고효율로 발현하는 고발현 세포주의 제조

<3-1> 인간 EPO를 고효율로 발현하는 재조합 발현벡터 pSRα-gEpo의 제조

상기 실시예 1 및 실시예 2를 통하여 인간 EPO를 고효율로 발현하는 재조합 발현벡터를 제조하기 위해서는, 야생형 EPO 게놈 유전자보다 5',3'-비번역지역이 삭제된 EPO 게놈 유전자와 전사조절인자로서 SRα 프로모터 및 AMV RNA4 리더서열을 포함하는 것이 효율적임을 확인하였다. 따라서, 상기의 결과를 바탕으로 본 발명자들은 효율적이고 안정적으로 EPO를 고효율로 발현하는 세포주를 수립하기 위하여, SRα 프로모터와 AMV RNA4 리더서열의 조절하에서 EPO를 발현하는 재조합 발현벡터 pSRα-gEpo를 제조하였다(도 3).

구체적으로, 실시예 <2-1>에서 해독 개시코돈 앞에 AMV RNA4 리더서열을 포함하는 5',3'-비번역서열이 삭제된 gEpo DNA 절편을 클로닝하여 제조된 재조합 발현벡터 pcDSAII-gEpo에 제한효소 EcoRⅠ 및 XhoⅠ을 처리하여 AMV RNA4 리더서열을 포함하는 △5'3'UTRgEpo DNA 절편을 얻었다. 상기 DNA 절편을 동일한 제한효소 EcoRⅠ-XhoⅠ이 처리된 pBluescript 벡터(Stratagene)에 삽입시켜 pgEpo를 제조하였다. 한편, 형질감염체 선별을 위한 DHFR 유전자와 지오신-내성 유전자를 재조합 발현벡터에 도입하기 위하여, pSV2-dhfr 벡터(Berg et al.,Mol. Cell. Biol., 1 : 854, 1981)에 제한효소 HindIII 및 BamHI을 처리하여 약 1.5 kb 크기의 DHFR 유전자를 분리한 후, 지오신-내성 유전자(zeocin-resistant gene)를 포함하는pZeoSV2(+) 벡터(Invitrogen)를 동일한 제한효소 Hind III 및 BamH I으로 절단하여 상기 DHFR 유전자를 T4 DNA 라이게이즈(T4 ligase)를 이용하여 삽입하여 5 kb 크기의 벡터 pZeoSV2-dhfr을 제조하였다. 상기 벡터 pZeoSV2-dhfr에 제한효소 EcoRⅠ 및 XhoⅠ을 처리하여 지오신 내성 유전자와 dhfr 유전자를 분리한 후 이를 벡터 pgEpo의 EcoRI-XhoI 제한효소 부위에 삽입하여 재조합 발현벡터 pSRα-gEpo를 제조하였다(도 3).

<3-2> 재조합 발현벡터 pSRα-gEpo가 형질감염된 세포주의 지오신 선별(zeocin selection)

상기와 같이 제조된 SRα 프로모터, AMV RNA4 리더서열, 지오신-내성 유전자 및 DHFR 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터 pSRα-gEpo를 BHK-21 및 CHO/dhfr- 세포에 실시예 <1-2>와 동일한 방법으로 형질감염시킨 후 지오신이 포함된 배지에서 배양하면서 선별하였다.

구체적으로, 상기 재조합 발현벡터가 형질감염되지 않은 세포를 제거하기 위한 최소의 지오신 농도를 결정하기 위하여, 세포들을 6 웰-플레이트(6 well plate, Falcon)에 접종한 후 다양한 농도의 지오신을 함유한 DMEM 배지에서 배양하였다. 선택배지를 3 내지 4일마다 교환해주면서 대부분의 세포가 사멸하는 지오신의 농도를 결정하였다.

지오신-내성 세포(zeocin-resistant cells)는 모간과 달링(Morgan Darling, BIOS scientific publisher., p79-84, 1993)의 방법에 따라 클론화하였다. 즉, 96 웰 조직배양 플레이트에 지오신이 함유된 DMEM 배지를 첨가한 후 형질감염시킨지 48시간이 경과된 상기 세포들을 10⁵cells/well의 농도로 상기 웰 플레이트에 접종하였다. 형질감염된 BHK-21 세포는 10% 투석된 소 태아혈청, 비필수아미노산 및 20 ㎍/㎖ 지오신이 함유된 DMEM 배지로 교체하여 배양함으로써 형질감염된 세포를 선별하였고, 형질감염된 CHO/dhfr- 세포는 10% 투석된 소 태아혈청 및 10 ㎍/㎖ 지오신은 함유하지만 디옥시리보뉴클레오시드(deoxyribonucleoside) 및 리보뉴클레오시드(ribonucleoside)는 결핍된 MEM-α 최소배지로 교체하여 배양함으로써 형질감염된 세포를 선별하였다. 상기의 지오신 선별을 통해 EPO를 0.4 내지 100 IU/㎖ 생산하는 BHK-21 클론들(그 중 대표클론으로 B6를 선별함)과 0.1 내지 12 IU/㎖ 생산하는 CHO/dhfr- 클론들(그 중 대표클론으로 C135을 선별함)을 얻었다.

<3-3> 재조합 발현벡터 pSRα-gEpo가 형질감염된 세포주의 MTX 선별(Methotrexate selection)

상기 실시예 <3-2>의 지오신 선별을 통해 확보한 형질감염 세포주 BHK-21 클론들과 CHO/dhfr- 클론들을 MTX 농도를 점차 증가시킨 배지에서 배양하여 2차 선별하였다. 1차 선별된 BHK-21 지오신-내성 세포는 10% 투석된 소 태아혈청, 비필수아미노산 및 100 nM MTX를 함유한 DMEM 배지에서 배양하면서, 500 nM까지 단계적으로 MTX 농도를 증가시켰다. 1차 선별된 CHO/dhfr- 지오신-내성 세포를 10% 투석된소 태아혈청 및 10 nM MTX는 함유하지만 디옥시리보뉴클레오시드 및 리보뉴클레오시드는 결핍된 MEM-α 최소배지에서 배양하며 20 nM까지 단계적으로 MTX 농도를 증가시켰다. 상기 세포들을 각각의 MTX 농도에서 적어도 한달간 적응시키면서 EPO를 안정적으로 발현하는 세포주를 선별하였다.

상기와 같은 방법으로 최종 선별된 재조합 BHK 세포주와 CHO 세포주를 각각 BHK B6 및 CHO C135이라 명명하고 2000 년 3 월 23 일자로 한국 세포주 연구재단에 기탁하였다(수탁번호 : KCLRF-BP-00027호 및 수탁번호 : KCLRF-BP-00028호).

<3-4> 인간 EPO 고발현 세포주 BHK 및 CHO에서의 EPO 발현 측정

상기의 MTX 선별에서 최종 선별된 BHK-21 및 CHO 세포의 EPO 발현능을 웨스턴 블럿 분석(Western blot analysis)으로 측정하였다. 구체적으로, 상기 세포들을 소 태아혈청이 결핍된 DMEM 또는 MEM-α 최소배지에서 배양한 후 원심분리하여 균체와 배양상등액을 분리하였다. 상기 배양상등액 시료에 5X 샘플완충용액(125 mM Tris-HCl, 5% SDS, 50% glycerol, β-mercaptoethanol, 1 ㎎/㎖ bromophenol blue)을 1 : 4의 비율로 혼합하고 95℃에서 7분 동안 전처리 한 후 분자량 표준품과 함께 12% 폴리아크릴아미드 겔(polyacrylamide gel)의 웰에 25 ㎕씩 로딩하여 전개하였다. 전기영동이 끝난 후, 전개된 단백질을 반-건조 전기블럿터(semi-dry electroblotter, Owl)를 이용하여 나이트로셀룰로우스 여지(nitrocellulose membrane, Schleicher Schuell)로 이동시켰다. 상기 나이트로셀룰로오스 여지를 반응정지액(5% 탈지유 및 0.1% Tween 20을 함유하는 TBS 용액)에 넣어 상온에서 1시간 동안 교반시킨 후 세척액으로 10분 동안 3회 세척하였다. 세척이 끝난 나이트로셀룰로오스 여지를 인간 EPO 1차 항체인 항인간-EPO 토끼 다클론 항체(anti-human EPO antibody, Genzyme)와 상온에서 1시간 동안 반응시키고 세척액(0.1% Tween20을 포함하는 TBS 용액)으로 세척한 후 2차 항체인 알칼라인 포스파타제 결합 항토끼 염소 항체(goat anti-rabbit IgG antibody conjugated alkaline phosphatase, PIERCE)와 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후 세척액으로 3회 세척한 후 니트로-블루-테트라졸리움(nitro-blue tetrazolium)과 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 인산염( 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate)을 첨가하여 인간 EPO 양성 밴드가 육안으로 확인될 때까지 흔들어 준 다음 발색이 확인되면 나이트로셀룰로우스 여지를 인산염 완충용액으로 세척하여 반응을 종결시킨 후 건조시켜 판독하였다.

그 결과, EPO의 발현은 MTX의 농도가 높은 배지에서 배양된 세포의 배양상등액일수록 그 발현량이 점차적으로 증가하는 양상을 보였다(도 7). 대표적으로 BHK B6 클론에서는 EPO의 발현이 MTX 농도가 0에서 500 nM로 증가함에 따라 80 IU/㎖에서 491 IU/㎖로 증가하였고, CHO C135 클론에서는 EPO의 발현이 지오신을 포함한 배지에서는 10 IU/㎖ 이었다가 20 nM MTX를 포함한 배지에서는 45 IU/㎖로 증가하였다. 이러한 결과는 재조합 발현벡터 pSRα-gEpo로 형질감염시킨 후 MTX 선별배양에 의해 최종선별된 재조합 BHK 및 CHO 세포주에서 재조합 인간 에리스로포이에틴 단백질의 발현이 증가하였음을 나타낸다.

<3-5> 인간 EPO 고발현 세포주 BHK 및 CHO에서의 서던 블럿 분석

상기의 인간 EPO 고발현 세포주 중 대표적 클론인 BHK B6 클론의 DNA를 분리하여 서던 블럿 분석(Southern blot analysis)을 수행하였다. 구체적으로, 상기 세포를 최소배지에서 배양한 후 SDS를 처리하여 세포를 용해(lysis)시키고 단백질 분해효소 K(proteinase K, Sigma)를 처리한 후 페놀추출법(phenol extraction)에 의해 순수한 DNA를 분리하였다. 상기 DNA를 제한효소 EcoRI으로 절단한 후 7ug DNA를 0.7% 아가로즈 겔에 로딩하여 전기영동으로 전개한 후 모세관이동법(capillary transfer method)을 이용하여 나일론 여지로 이동시켰다. 이때, 전기영동이 끝난 아가로즈 겔을 에티디움 브로마이드(ethidium bromide)로 염색하여 얻은 형광패턴을 관찰하여 각 레인에 동량의 DNA가 로딩되었을 확인하였다. 상기 나일론 여지를 혼성화 용액(6X SSPE, 5X Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, 100 ㎍/㎖ salmon sperm DNA)에 넣고 42℃에서 3시간 동안 전혼성화시킨 후, DNA 탐침이 포함된 혼성화 용액에 넣어 42℃에서 20시간 동안 더 반응시켰다. 이때, DNA 탐침은 DNA 라벨링 키트(High Prime DNA labeling kit, BM)를 사용하여 인간 EPO 유전자내 엑손 2의 XbaI-KpnI 절편에 [α-32P]dCTP로 표지하여 사용하였다. 혼성화가 끝난 나일론 여지를 0.5% SDS가 포함된 2X SSC 용액으로 65℃에서 15분 동안 2회 세척한 후 0.5% SDS가 포함된 1X SSC 용액과 0.1X SSC 용액으로 15분 동안 2회씩 세척하였다.

서던 블럿 분석 결과, 음성대조군(negative control, 레인 1)에서는 검출되지 않은 3개의 밴드(band)가 200 ㎍/㎖ 지오신(레인 2), 100 nM MTX(레인 3), 200nM MTX(레인 4), 500 nM MTX(레인 5)가 첨가된 배지에서 배양한 세포에서 검출되어 MTX 내성 BHK B6 클론에서 EPO cDNA가 증폭되었음을 확인할 수 있다(도 8). 이러한 결과는 EPO 게놈 유전자내 EcoRI 부위가 전혀 없음을 고려할 때, 재조합 발현벡터의 EPO cDNA가 BHK-21 염색체(chromosome)의 여러 부위로 삽입(integration)되었음을 나타낸다. 또한, 배지내 MTX의 농도가 증가함에 따라 검출되는 밴드의 강도가 함께 증가한다는 사실은 EPO cDNA의 상대적인 사본수(copy number)가 MTX 선별배양에 의해 BHK-21 염색체내에서 증폭되었음을 암시한다.

본 발명은 5',3'-비번역서열이 삭제된 EPO 게놈 유전자, SRα 프로모터 및 AMV RNA4 리더서열 등의 적절한 조절인자, DHFR 유전자 및 지오신 내성유전자 등의 선별인자를 포함하는 인간 EPO를 고효율로 발현하는 재조합 발현벡터를 제조하고 이를 BHK 세포와 CHO 세포에 형질감염시킨 후 MTX 선별배양에 의해 안정화시킨 재조합 인간 에리스로포이에틴 고발현 세포주 및 이의 제조방법을 제공한다. 따라서, 본 발명의 인간 EPO 고발현 세포주의 제조방법에 의해 제조된 재조합 동물세포주에서 고역가로 대량생산된 EPO는 빈혈, 류마티스 관절염 또는 후천성 면역 결핍증 등의 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.

Claims

5',3'-비번역서열(untranslated sequence; UTR)이 삭제된 EPO 게놈 유전자, SRα프로모터, AMV(alfalfa mosaic virus) RNA4 리더 서열(leader sequences), 형질감염체 선별표식인자 및 항생제 선별인자를 포함하는 재조합 발현벡터로 형질전환된, 인간 에리스로포이에틴(erythropoietin; EPO)을 고효율로 발현시키는 재조합 세포주.
제 1항에 있어서, 재조합 세포주는 BHK B6(수탁번호 : KCLRF-BP-00027호) 또는 CHO C135(수탁번호 : KCLRF-BP-00028호)인 것을 특징으로 하는 재조합 세포주.
ⅰ) 5',3'-비번역서열이 삭제된 EPO 게놈 유전자, SRα프로모터, AMV RNA4 리더 서열, 형질감염체 선별표식인자 및 항생제 선별인자를 포함하는 재조합 발현벡터를 제조하는 단계;

ⅱ) 상기 재조합 발현벡터를 동물세포주에 형질감염시키는 단계;

ⅲ) 형질감염된 동물세포주를 선별하는 단계; 및

ⅳ) 선별된 재조합 동물세포주로부터 안정적으로 인간 EPO를 생산하는 동물세포주를 선별하는 단계를 포함하는, 인간 EPO를 고효율로 발현시키는 재조합 세포주의 제조방법.
삭제
제 3항에 있어서, 상기 단계 i)의 재조합 발현벡터의 형질감염체 선별표식인자는 및 항생제 선별인자는 각각 DHFR 유전자 및 지오신 내성유전자인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 3항에 있어서, 상기 단계 i)의 재조합 발현벡터는도 3으로 표시되는 pSRα-gEpo인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 3항에 있어서, 상기 단계 ⅱ)의 동물세포주는 BHK(Baby hamster kidney)유래 세포주 또는 CHO(Chinese hamster ovary)유래 세포주인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
제 3항에 있어서, 상기 단계 ⅲ)에서 형질감염된 동물세포주를 지오신(zeocin) 및 MTX(methotrexate)가 첨가된 배지에서 단계적으로 배양하여 선별하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 3항에 있어서, 상기 단계 ⅳ)의 재조합 동물세포주는 BHK 세포주 BHK B6(수탁번호 : KCLRF-BP-00027호) 또는 CHO 세포주 CHO C135(수탁번호 : KCLRF-BP-00028호)인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 1항에 있어서, 재조합 발현벡터의 형질감염체 선별표식인자는 DHFR(dihydrofolate reductase) 유전자인 것을 특징으로 하는 재조합 세포주.
제 1항에 있어서, 재조합 발현벡터의 항생제 선별인자는 지오신 내성유전자 (zeocin-resistant gene)인 것을 특징으로 하는 재조합 세포주.
5',3'-비번역서열(untranslated sequence; UTR)이 삭제된 EPO 게놈 유전자, SRα프로모터, AMV(alfalfa mosaic virus) RNA4 리더 서열(leader sequences), 형질감염체 선별표식인자 및 항생제 선별인자를 포함하는 재조합 발현벡터.
제 12항에 있어서, 도 3으로 표시되는 pSRα-gEpo 재조합 발현벡터.