CZ281542B6 - Řetězec DNA pro použití k zajištění exprese polypeptidového produktu - Google Patents

Abstract

Řešení se týká řetězce DNA pro použití k zajištění exprese polypeptidového produktu, jehož struktura alespoň zčásti odpovídá primární struktuře erythropoetinu člověka nebo opice nebo jde o variantu nebo derivát těchto řetězců a biologickou účinností erythropoetinu, přičemž tento řetězec se volí z a) řetězců DNA z tabulky VI nebo V nebo z komplementárních řetězců pro tyto řetězce, b) z řetězců DNA, schopných hybridizace za vymezených podmínek na řetězce z odstavce a) nebo na jejich fragmenty a c) řetězců DNA, které jsou schopny hybridizace na řetězce z odstavců a) a b) z důvodů jiných než pro degeneraci genetického kodu. Řešení se rovněž týká způsobu výroby uvedených řetězců a farmakologických prostředků, které je obsahují a jsou vhodné v případě poruch s nedostatečným množstvím erythropoetinu, například při anemiích u nedostatečnosti ledvin. ŕ

Description

Sekvence DNA, hostitelská buňka, plasmid, polypeptid a způsob jeho výroby, farmaceutický prostředek a protilátka

Oblast techniky

Vynález se týká sekvence DNA pro použití k zajištění exprese polypeptidového produktu vykazujícího celou primární strukturní konformaci humánního nebo opičího erythropoetinu, jak je uvedena v tabulce VI nebo V, nebo její část nebo jakékoliv jeho varianty nebo derivátu vykazujícího biologickou účinnost spočívající ve zvyšování produkce retikulocytů a červených krvinek v kostní dřeni a zvyšování syntézy hemoglobinu nebo příjmu železa, v prokaryontních nebo eukaryontních hostitelských buňkách. Dále se vynález týká prokaryontní a eukaryontní hostitelské buňky transformované touto sekvencí DNA, plasmidu nebo vektoru obsahujícího tuto sekvenci DNA, výše charakterizovaného polypeptidu a způsobu jeho výroby, farmaceutického prostředku na bázi tohoto polypeptidu a protilátky imunoreaktivní s erythropoetinem. Pojmu sekvence DNA se používá zaměnitelně s pojmy řetězec DNA nebo sled DNA.

Dosavadní stav techniky

A. Manipulace s genetickými materiály

Genetické materiály je možno v širším významu definovat jako ty chemické struktury, které plánují a provádějí výrobu složek buněk a virů. Polymerní látky s dlouhým řetězcem, kyseliny desoxyribonukleové (DNA) nesou genetický materiál všech živých buněk a virů s výjimkou některých virů, jejichž genetický materiál nese kyselina ribonukleová (RNA). Opakujícími se jednotkami v polymerní molekule DNA jsou čtyři různé nukleotidy, z nichž každý je tvořen purinem (adenin nebo guanin) nebo pyrimidinem (thymin nebo cytosin), vázaným na desoxyribózu s navázanou fosfátovou skupinou. Vazba nukleotidů v lineární polymerní formě se uskutečňuje prostřednictvím 5’-fosfátu nukleotidu na jedné straně a prostřednictvím 3'-hydroxylové skupiny na straně druhé. Funkční DNA se vyskytuje ve formě dvojitých stálých řetězců, které vznikají z jednoduchých řetězců nukleotidů (nazývaných deoxyoligonukleotidy), řetězce jsou spojeny vodíkovou vazbou mezi purinovými a pyrimidinovými bázemi (jde tedy o komplementární spojení mezi adeninem (A) a thyminem (T) nebo guaninem (G) a cytosinem (C)). Nukleotidy jsou obvykle nazývány podle jednotlivých purinových a pyrimidinových bází a komplementární spojení nukleotidů v DNA s dvojitým řetězcem (tj. A-T a G-C) je nazýváno páry bází. Ribonukleová kyselina je polynukleotid, který obsahuje adenin, guanin, cytosin a místo thyminu uráčil (U) vázaný na ribózu a fosfátovou skupinu.

Velmi krátce uvedeno, plánovací funkce DNA je obvykle uskutečňována postupem, při němž dochází k přepisu sledu nukleotidů (genu) do poměrně nestálé mRNA. Tato mRNA slouží jako templát pro tvorbu strukturních, řídicích a katalytických bílkovin z aminokyselin. Proces translace za účinnosti mRNA v sobě zahrnuje interakce malých řetězců RNA (tRNA), které jsou klíčem pro přenos jednotlivých aminokyselin v průběhu řetězce mRNA, aby tak mohlo dojít k tvorbě polypeptidů se správným sledem aminokyselin. Toto

-1CZ 281542 B6 poselství mRNA, odvozené od DNA a zajištující interakci tRNA a orientaci kterékoliv z dvaceti aminokyselin je podkladem pro expresi na základě tripletů (kodonů), tj. sledů tří po sobě jdoucích nukleotidů. Tvorba bílkoviny je vrcholnou formou exprese plánovaného genetického poselství, které je ukryto ve sledu nukleotidů určitého genu.

Promotory jsou sledy DNA, které jsou obvykle uloženy před genem v polymeru DNA a představují místo, v němž počíná transkripce do mRNA. Řídicím sledem DNA, nacházejícím se obvykle také před genem v daném polymeru DNA zahrnuje bílkovinu, která určuje častost nebo rychlost počátku transkripce.

Systém promotor/řídicí sled nebo pouze řídicí systém je tedy sled, který je uložen před genem (nebo před geny) ve funkčním polymeru DNA a který určuje zda dojde k transkripci a popřípadě k expresi určitého genu. Sledy DNA, které jsou uloženy za genem nebo za geny v polymerní DNA znamenají signál pro ukončení transkripce do mRNA, jde tedy o terminační sledy.

Středem pozornosti mikrobiologů v posledním desetiletí bylo úsilí o průmyslovou výrobu látek, důležitých z průmyslového nebo farmaceutického hlediska při použiti organismů, které ve svém genetickém materiálu původně neměly zahrnutu informaci, týkající se požadovaného produktu nebo (v případě savčích buněk v tkáňové kultuře) u nich obvykle nedochází k expresi chromosomálního genu ve větším měřítku. V tomto případě se gen, který je specifický pro strukturu požadovaného polypeptidu buď izoluje z organismu, který tento gen obsahuje, nebo se vyrobí chemicky a potom se nastálo včlení do jiného organismu, kterým je obvykle normálním způsobem se rozmnožující jednobuněčný organismus, například bakterie, kvasinka nebo savčí buňka v tkáňové kultuře. Jakmile k tomu jednou dojde, dojde i k běžné činnosti existujícího mechanismu buňky v této transformované buňce po transfekci ke konstrukci požadovaného produktu, přičemž exogenní DNA se užívá jako templát pro transkripci mRNA s následující translací za vzniku kontinuálního sledu aminokyselinových zbytků.

V oboru je známa celá řada publikací, které se týkají metod s použitím rekombinantní DNA pro izolaci, syntézu, čištění a množení genetického materiálu pro použití k transformaci zvoleného hostitelského organismu. V US patentovém spisu č. 4 237 224 (Cohen a další) se například popisuje transformace jednobuněčného hostitele působením hybridní virové nebo cirkulární plasmidové DNA, která obsahuje zvolené sledy exogenní DNA. Při provádění způsobu, který je zahrnut v uvedeném patentovém spisu se postupuje tak, že se nejprve získá vektor pro transformaci enzymatickým rozštěpením virové nebo cirkulární plasmidové DNA za vzniku lineárních řetězců DNA. Použitím obdobných enzymů se potom připraví vybrané exogenní nebo heterologní řetězce, které obvykle obsahují kodovou oblast pro požadovaný produkt, a to také v lineární formě. Lineární virová nebo plasmidové DNA se potom inkubuje s exogenní DNA za přítomnosti enzymů pro vazbu, které umožňují opětné navázání fragmentů za vzniku hybridních vektorů, které obsahují zvolený segment exogenní DNA, který je vsunut do virové nebo cirkulární plasmidové DNA.

-2CZ 281542 B6

Transformace vhodného jednobuněčného hostitele takto získaným hybridním vektorem vede ke tvorbě mnohočetných kopií exogenní DNA v populaci hostitelských buněk. V některých případech je požadovaným výsledkem prosté pomnožení cizorodé DNA a získaným produktem je tedy samotná tato DNA. Častěji je však cílem celé transformace exprese exogenní DNA buňkami hostitele ve větším měřítku, takže je možno získat izolovatelná množství komerčně významných fragmentů bílkovin nebo polypeptidů, pro něž je kódem exogenní DNA. Podobné postupy byly popsány také v dalších patentových spisech, například v US patentových spisech č. 4 264 731, (Shine), 4 273 875 (Manis), 4 293 652 (Cohen) a v evropském patentovém spisu č. 93 619 z 9. listopadu 1983.

Vývoj specifických sledů DNA pro včlenění do vektorů DNA je možno provést nejrůznějším způsobem, které do značné míry závisí na cizorodosti dárce vzhledem k předpokládanému hostiteli a na velikosti molekuly polypeptidů, k jehož expresi má v organismu hostitele dojít. Ve velkém zjednodušení je možno uvést základní tři způsoby, a to

1) způsob, který spočívá v izolaci sledu DNA s dvojitým řetězcem z genomu dárce,

2) způsob, který spočívá v chemické výrobě sledu DNA, který je kódem pro požadovaný polypeptid a

3) syntéza DNA s dvojitým řetězcem in vitro při použití enzymu tak zvanou reversní transkripcí mRNA, která byla izolována z buněk dárce.

Způsoby, při nichž dochází ke tvorbě DNA, která je komplementární příslušné mRNA se obvykle uvádějí jako způsoby s použitím cDNA.

Výroba sledu DNA je často metodou volby v případě, že je znám celý sled zbytků aminokyselin požadovaného polypeptidů. Tento postup je popsán například v US patentové přihlášce č. 483 451 (Alton), která byla podána 15. dubna 1983 a zveřejněna 24. listopadu 1983 jako W083/04053). V této publikaci se popisují prostředky, které dovolují dosáhnout velmi dobrých výsledků, jako: možnost zavedení alternačních kodonů, které obvykle jsou v genech nacházeny, zvláště v těch, k jejichž vysoké expresi dochází v organismu hostitele (jde například o preferenční kodony pro případ použití určitého hostitele, například kvasinek nebo E. coli), dále zajištění nepřítomnosti nepřenášeného intronu, tj. uvnitř uloženého sledu, který je často a běžně přítomen v genomické DNA savců a ovšem také v příslušné mRNA a není dále zpracováván buňkou prokaryotického hostitele, dále zábrana exprese nepožadovaných vedoucích sledů polypeptidů, které jsou běžně přítomny, ale nejsou snadno odštěpovány z výsledného polypeptidů buňkami bakterií nebo kvasinek, dále zajištění dobrého včlenění DNA do vhodného vektoru pro expresi ve spojení s požadovaným systémem promotor/relulátor (řídicí sled) a se sledem pro ukončení přenosů a konečné konstrukce genů, které jsou kódem pro fragmenty polypeptidů a pro analogy požadovaných polypeptidů.

V případě, že není znám celý sled aminokyselinových zbytků v požadovaném polypeptidů, není možno vyrobit sled DNA přímo a metodou volby se potom stává izolace sledu DNA, který je kódem pro požadovaný polypeptid metodou s použitím cDNA přes potenciál-3CZ 281542 B6 ní nevýhody. Tímto způsobem je možno získat vektory pro expresi, zajišťující vysokou úroveň mikrobiální exprese tak, jak bylo uvedeno shora. Jedním ze standardních postupů pro izolaci sledu cDNA požadovaného výsledného produktu je příprava cDNA plasmidů, získané reversní transkripcí mRNA, která se ve velkém množství nachází v buňkách dárce. Jde například o celou skupinu vzorků cDNA, odvozených z buněk hypofýzy, při jejichž použití dochází k expresi poměrně značných množství růstového hormonu jako výsledného produktu. Tam, kde jsou známy podstatné části sledu aminokyselinových zbytků polypeptidů, je možno užít značených sledů DNA s jedním řetězcem, které se spojují na sledy, pravděpodobně přítomně v cílové cDNA. Tyto sledy se potom používají k hybridizačním postupům DNA/DNA, které jsou prováděny na klonovaných kopiích cDNA, denaturovaných na formu s jedním řetězcem. Tyto postupy byly popsány například v US patentovém spisu č. 4 394 443 (Weisman a další) a v celé řadě publikací, například Wallace a další, Nuc. Acids. Res. 6, str. 3543 až 3557 (1979), Reyes a další, P.N.A.S. (USA) 79, str. 3270 až 3274 (1982) a Jaye a další, Nuc. Acids Res. 11, str. 2325 až 2335 (1983). Také v US patentovém spisu č. 4 358 535 (Falkow a další) se popisuje hybridizace typu DNA/DNA při provádění diagnóz, v uveřejněné evropské patentové přihlášce č. 70685 a 70687 se popisuje způsob značení polynukleotidů s jedním řetězcem. Davis a další v A Manual for Genetic Engineering, Advanced Bacterial Genetics Cold Spring Harbor.Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. (1980) str. 55 až 58 a 174 až 176 je popsána hybridizace kolonií a plaků a v brožuře New England Nuclear (Boston, Mass.) pro membránové materiály, určené pro vyhledávání genů je možno nalézt instrukce pro přenos a hybridizaci DNA a RNA (Katalogové číslo NEF-972).

Z významnějších novinek hybridizačních postupů při rekombinantním klonování je nutno uvést například použití značených smíšených vzorků synthetických oligonukleotidů, z nichž každý je potenciálním úplným doplňkem specifického sledu DNA v hybridizačnim vzorku včetně heterogenní směsi RNA nebo DNA s jednoduchým řetězcem. Tyto postupy jsou zvláště dobře použitelné při vyhledáváni klonů cDNA, odvozených ze zdrojů, v nichž je k disposici velmi malé množství mRNA pro požadovaný polypeptid. Smysl postupu spočívá v tom, že se volí omezené hybridizační podmínky tak, aby pokud možno nedocházelo k nespecifickým vazbám při následné autoradiografické visualizaci specifického klonu cDNA při hybridizaci cílové DNA na tento jediný vzorek, který je ve směsi úplným komplematem uvedeného sledu. Tyto postupy byly popsány v publikacích, například Wallace a další, Nuc. Acids 879 až 897 (1981), Suggs a další, P.N.A.S. (USA) 78, 6617 (1981), Choo a další, Nátuře Kurachi a další, P.N.A.S. (USA) Ohkubo a další, P.N.A.S. (USA) a Kornblihtt a další, P.N.A.S. (1983). Obecně je možno uvést, vzorků tak, jak byly uvedeny v publikaci různých 9, str. 6613 až (1982), (1982),

299, str.

79, str.

80, str.

(USA) 80, že postupy s použitím smíšených

178 až 6461 až 2196 až str.

Res. str.

180

6464

2200 (1983) 3218 až 3222

Wallace a dalších (1981) byly dále rozpracovávány různými pracovníky tak, že bylo možno dosáhnout uspokojivých výsledků při izolaci klonů cDNA při použití směsi 32 řetězců o délce 16 bází s různým sledem bází spolu s jedním řetězcem o délce 11 bází k uskutečněni oboustranného potvrzeni přítomnosti požadované cDNA, jak bylo popsáno v publikaci Singer-Sam a další P.N.A.S. (USA) 80, str. 802 až 806 (1983).

-4CZ 281542 B6 endonukleázami a Blattner a další, (1977),. kde se popisuje konstrukce druhé straně bylo provedeno jen

Použití DNA izolované z genomů je společným znakem alespoň tří shora uvedených postupů pro získání sledů DNA, specifických pro použití v rekombinantních postupech. Zvláště to platí při postupech, které mají zajistit mikrobiální expresi polypeptidů savců, kde je hlavním problémem komplexnost DNA genomu savců. Existuji poměrně vhodné postupy pro fágem nesené směsi DNA genomu člověka a dalších savců, jak bylo popsáno například v Lawn a další, Cell 15, str. 1157 až 1174 (1978), kde se popisuje postup pro získání knihovny lidského genomu, nazývané Maniatis Library, Karn a další, P.N.A.S. (USA) 77, str. 5172 až 5176 (1980), publikace se vztahuje k lidské genomové knihovně založené na štěpení Science 196, str. 161 až 169 knihovny genomu skotu. Na velmi málo úspěšných pokusů s hybridizačními postupy při získáváni DNA genomu v případě, že nebyl předem dobře znám sled aminokyselin nebo sled bází příslušné DNA. Příkladem může být publikace Fiddes a další, J. Mol. and App. Genetics 1, str. 3 až 18 (1981), kde se popisuje úspěšná izolace genu, který je kódem pro podjednotku a lidského pituitárního glykoproteinu (hormonu) vzorku o cDNA pro a další, popisuje izolace klonů lidského genomu užití synthetického oligonukleotidu o 175 párech bází. Konečně Anderson a další v P.N.A.S. (USA) 80, str. 6838 až 6842 (1983) popisují izolaci klonu z genomu pro pankreatický inhibitor trypsinu skotu (BPTI) při použití jediného vzorku o délce 86 párů bází, vzorek byl konstruován podle známého sledu aminokyselin v BPTI. Autoři uvádějí nedostatečné metody pro izolaci mRNA, která by byla vhodná pro získání sbírky cDNA v důsledku zjevně příliš nízké hladiny mRNA ve slinné žláze a v plicní tkáni, které byly zdrojem této kyseliny a popisují také možnosti sledování genomu při použití směsi značených vzorků, přičemž uvádějí, že:

z Maniatis Library při použití plné délce 621 párů bází z předem izolovaného sledu podjednotku a. Dalším příkladem může být publikace Das P.N.A.S. (USA) 80, str. 1531 až 1535 (1983), kde se pro lidský HLA-DR při poo 175

80, str.

obecněji řečeno, byly použity vzorky, které obsahovaly směs sledů oligonukleotidů k izolaci bílkovinných genů s neznámým sledem ze směsi cDNA. Tyto vzorky mají obvykle formu směsi 8 až 32 oligonukleotidů o délce 14 až 17 nukleotidů, které představují nejrůznější možné kombinace kodonů pro malé sledy (5 až 6 zbytků) aminokyselin. Za omezených podmínek hybridizace, které omezují vznik vzorků s nesprávnými páry bází mohou tyto vzorky napomoci ke zjištění specifického sledu genu ve směsi klonů, která není příliš komplexní. Vzhledem ke své malé délce a ke své heterogenité však vzorek nemá specifičnost, jaké by bylo zapotřebí ke zjištění tak komplexních sledů, jakými jsou sledy v genomu savců. Tímto způsobem je tento postup nepoužitelný při izolaci bílkovinných genů savců v případě, že není možno získat odpovídající mRNA.

Je tedy zřejmé, že existuje trvalá potřeba navrhnout zlepšené metody pro uskutečnění rychlé a účinné izolace klonů cDNA v případech, kde nejsou k disposici dostatečné informace, týkající se sledu aminokyselin polypeptidů, pro nějž má gen být kódem a kde nejsou k disposici obohacené tkáně jako zdroj mRNA pro kostrukci směsi cDNA. Takto zlepšené metody by byly zvláště užitečné v případě, že by je bylo možno aplikovat na izolaci genů genomu savců, u nichž jsou k disposici pouze omezené informace,

-5CZ 281542 B6 týkající se sledu aminokyselin v polypeptidech, pro něž jsou kódem hledané geny.

B. Erythropoetin jako cílový polypeptid

Erythropoesa, tj. tvorba červených krvinek probíhá kontinuálně po celý život k náhradě buněk, které podlehly destrukci. Jde o velmi přesně řízený fysiologický pochod, který umožňuje, aby bylo k disposici dostatečné množství červených krvinek v krvi pro dobré okysličení tkání, krvinek však nesmí být tolik, aby byl omezen oběh krve. Červené krvinky se vytváří v kostní dřeni a jejich tvorba je řízena hormonem erythropoetinem.

Erythropoetin je kyselý glykoprotein s molekulou o molekulové hmotnosti přibližné 34 000 jednotek a může se vyskytovat ve třech formách: α, β a asialo. Formy a a β se od sebe poněkud liší v uhlohydrátové složce, ale mají stejnou účinnost, biologický účinek i molekulovou hmotnost. Forma asialo je forma a nebo β, z níž je odstraněna koncová uhlohydrátová skupina. Erythropoetin je přítomen v plasmě ve velmi nízkých koncentracích v případě, že tkáně za plného zdraví jsou dostatečně provzdušňovány při existujícím množství erythrocytů. Tato normální nízká koncentrace je dostatečná ke stimulaci náhrady červených krvinek, které normálně v průběhu svého stárnutí podléhají fysiologickému rozpadu.

Množství erythropoetinu v oběhu se zvyšuje při nedostatku kyslíku v případě, že je snížen přenos kyslíku červenými krvinkami krevního oběhu. Hypoxie může být způsobena ztrátou velkého množství krve krvácením, destrukcí červených krvinek při vystavení vlivu zářeni, snížením příjmu kyslíku ve velkých výškách nebo v důsledku dlouhého bezvědomí nebo v případě různých forem anemie. Jako odpověď na stress hypoxické tkáně erythropoetin zvýší produkci červených krvinek stimulací přeměny primitivních zárodečných buněk v kostní dřeni na proerythroblasty, které postupně dozrávají, synthetizují hemoglobin a jsou uvolňovány do krevního oběhu jako červené krvinky. V případě, že množství červených krvinek v oběhu je větší, než je zapotřebí pro normální požadavky tkání na kyslík, sníží se hladina erythropoetinu v oběhu.

Tyto poměry jsou popsány například v publikacích Těsta a další, Extp. Hematol., B (Supp. 8), 144 až 152 (1980), Tong a další, J. Biol. Chem. 256 (24), 12666 až 12672 (1981), Goldwasser, J. Cell. Physiol. 110 (Supp. 1) 133 až 135 (1982), Finch, Blood, 60 (6), 1241 až 1246 (1982), Sytowski a další, Expt. Hematol, 8, (Supp. 8), 52 až 64 (1980), Naughton, Ann. Clin. Lab. Sci. 13 (5), 432 až 438 (1983), Weiss a další, Am. J. Vet. Res. 44 (10), 1832 až 1835 (1983), Lappin a další, Exp. Hematol, 11 (7), 661 až 666 (1983), Baciu a další, Ann. N. Y. Acad. Sci. 414, 66 až 72 (1983), Murphy a další, Acta Haematologica Japonica 46 (7), 1380 až 1396 (1983), Dessypris a další, Brit. J. Haematol 56, 295 až 306 (1983), Emannouel a další, Am. J. Physiol 247 (lPt

2) F 168-76 (1984).

Protože erythropoetin je podstatným faktorem pro tvorbu červených krvinek, je tento hormon potenciálně užitečný pro diagnostiku i pro léčbu krevních poruch, které jsou charakterizovány nízkou nebo defektní tvorbou červených krvinek. Tyto skutečnosti byly popsány v publikacích Pennarthur-Das a další, Blood 63 (5),

-6CZ 281542 B6

1168 až 71 (1984) a Haddy, Am. J. Ped. Hernato1./Oncol. 4, 191 až 196 (1982), publikace se týkají erythropoetinu jako možného léku pro chorobu, při níž mají červené krvinky srpkovitý tvar a Esbach a další, J. Clin. Invest. 74 (2), str. 434 až 441, 1984), kde se popisuje způsob léčby u uremické ovce a vliv infusí plasmy, bohaté na erythropoetin, přičemž se navrhují dávky 10 jednotek erythropoetinu (EPO)/kg a den po dobu 15 až 40 dnů k úpravě anemie, která se vyskytuje při chronickém ledvinovém selhání. Podobný problém rozebírá také autor publikace Krane, Henry Ford Hosp. Méd. J., 31 (3), 177 až 181 (1983).

V poslední době bylo prokázáno, že v případě, že by byl erythropoetin k disposici v dostatečném množství, bylo by možno ročně léčit anemii 1 600 000 nemocných jen v USA, jak bylo popsáno v publikaci Morrison, Bioprocessing in Space- an overview, str. 557 až 571 v The World Biotech. Report 1984, Svazek 2, USA (Online Publications, New York, N. Y., 1984). Studie v poslední době byly základem pro odhad účinnosti erythropoetinu u různých chorobných stavů, poruch a hernatologických nepravidelností, jak bylo popsáno v publikacích Vedovato a další, Acta Haematol 71, 211 až 213 (1984) (β-thlassemie), Vichinsky a další, J. Pediatr. 105 (1), 15 až 21, 1984 (cystická fibroza), Cotes a další, Brit. J. Obstet. Gyneacol. 90 (4), 304 až 311 (1983) (těhotenství, menstruační potíže), Haga a další, Acta Pediatr. Scand. 72, 827 až 831, 1983 (časná anemie při nezralosti), Claus-Walker a další, Arch. Phys. Med. Rehabil. 65, 370 až 374, 1984 (poranění páteře), Dunn a další, Eur J. Appl. Physiol. 52, 178 až 182, 1984 (kosmické lety), Miller a další, Brit. J. Haematol. 52, 545 až 590, 1982 (akutní ztráta krve), Udupá a další, J. Lab. Clin. Med. 103 (4), 574 až 580 a 581 až 588 (1984), a Lipschitz a další, Blood, 63 (3), 502 až 509, 1983 (stárnutí) a Daniak a další, Cancer 51 (6), 1101 až 1106 (1983) a Schwartz a další, Otolaryng. 109, 269 až 272 (1983) (různá neoplastická onemocnění, spojená s abnormální erythropoesou).

Dřívější pokusy získat erythropoetin v dobrém výtěžku z plasmy nebo z moči byly poměrně neúspěšné. Je zapotřebí složitého laboratorního zařízení a i v tomto případě je obvykle možno získat pouze malá množství nečistého a nestálého extraktu, který obsahuje erythropoetin.

V US patentovém spisu č. 3 033 753 je popsán způsob pro částečné čištění erythropoetinu z krevní plasmy ovcí. Tímto způsobem je možno získat v malém výtěžku surový pevný extrakt, který obsahuje erythropoetin.

První pokusy o izolaci erythropoetinu z moči vedly k získání nestálých, biologicky neúčinných přípravků uvedeného hormonu. V US patentovém spisu č. 3 865 801 se popisuje způsob stabilizace biologické účinnosti surové látky, která obsahuje erythropoetin izolovaný z moči. Výsledný surový produkt tohoto způsobu obsahuje 90 % účinnosti erythropoetinu a je stálý.

Další způsob pro čištění lidského erythropoetinu z moči nemocných s aplastickou anemii je popsán v publikaci Miyake a další, J. Biol. Chem. Sv. 252, č. 15 (10. srpna 1977), str. 5558 až 5564. Způsob se provádí v sedmi stupních, které zahrnují chromatografii na iontoméničích, srážení ethanolem, filtraci na

-7CZ 281542 B6 gelu, adsorpční chromatografii a poskytuje čistý erythropoetin s účinností 70 400 jednotek/mg bílkoviny ve výtěžku 21 %.

V US patentovém spisu č. 4 397 840 (Takezawa a další) se popisuje způsob výroby erythropoetinového produktu z moče zdravých lidí pomocí slabé alkalických iontoměničů a popisuje se, že získané produkty s nízkou molekulovou hmotností nemají žádné inhibiční účinky na erythropoetin.

V britském patentovém spisu č. 2 085 887 (Sugimoto a další) z 6. května 1982 se popisuje způsob výroby lidských hybridních lymfoblastoidnich buněk, s jejichž použitím je možno dosáhnout produkce 3 až 420 jednotek erythropoetinu v 1 ml buněčné suspenze v kultuře po pomnožení savčích hostitelských buněk na množství *7 buněk/ml. Při nejvyšší produkci je možno rychlost tvorby erythropoetinu vyjádřit jako 40 až 4000 jednotek/10⁶ buněk/48 hodin v kultuře in vitro při přenesení z živých buněk. Odkázat v tomto smyslu je možno také na US patentový spis č. 4 377 513. Pro izolaci erythropoetinu z tkání byla navrhována řada způsobů včetně použití nádorových buněk, avšak výtěžky byly velmi malé, jak je zřejmé například z publikací Jelkman a další, Expt. Hematol. 11 (7), 581 až 588 (1983), Tambourin a další, P.N.A.S. (USA) 80, 6269 až 6273 (1983), Katsuoka a další, Gann, 74, 534 až 541 (1983), Hagiwara a další, Blood, 63 (4), 828 až 835 (1984) a Choppin a další, Blood 64 (2), 341 až 347 (1984).

Dalším možným způsobem izolace čištěného erythropoetinu jsou imunologické postupy. Postupuje se tak, že se injekcí lidského erythropoetinu zvířatům, nejlépe krysám nebo králíkům vyvolá tvorba protilátek v séru proti lidskému erythropoetinu. Lidský erythropoetin, vstřiknutý injekčné zvířeti je rozeznávám jako cizorodá látka, tj. jako antigen pro imunní systém zvířete a vyvolá tedy tvorbu protilátek proti tomuto antigenu. Různé buňky, které odpovídají na stimulaci antigenem produkují protilátky, které se od sebe poněkud liší. Při odebrání krve zůstává protilátka v krevním séru. K detekci a tvorbě komplexu s lidským erythropoetinem je možno použít jak nečištěné sérum, tak čištěné protilátky, například frakci imunoglobulinu G ze séra, avšak tyto materiály mají zásadní nevýhodu v tom, že běží o polyklonální protilátky, odvozené od různých buněk a váží se proto kromě na erythropoetin ještě na další složky surových extraktů.

Zajímavé jsou také současné pokusy vyvinout kontinnální buněčné kultury, schopné produkce stejnorodé protilátky, která reaguje specificky s jediným antigenem. Tento postup byl obecně popsán v publikaci Chisholm, High Technology Vol. 3, č. 1, str. 57 až 63 (1983). Byly také prováděny pokusy použít fůze buněk a hybridizace k získáni monoklonálních protilátek proti erythropoetinu a použit tyto protilátky k izolaci a ke kvantitativnímu stanovení lidského erythropoetinu. Jako přiklad je možno uvést úspěšný vývoj buněčných linii myšího hybridomu, které vylučují monoklonální protilátky proti lidskému erythropoetinu tak, jak byl popsán v publikaci Lee-Huang, Abstract č. 1463 v Fed. Proč. 41, 520 (1982). Dalším příkladem může být detailní popis přípravy a použití monoklonální protilátky proti lidskému erythropoetinu podle publikace Weiss a další, P.N.A.S. (USA) 79, 5465 až 5469 (1982) a také v Sasaki, Biomed. Biochim. Acta 42

-8CZ 281542 B6 (11/12), str. 202 až 206 (1983), Yanagawa a další, Blood, 64 (2), 357 až 364 (1984), Yanagawa a další, J. Biol. Chem. 259 (5), 2707 až 2710 (1984) a US patentový spis č. 4 465 624.

Zajímavé jsou také všechny zprávy, které se týkají imunologické účinnosti synthetických peptidů, které v podstatě napodobují sled aminokyselin, který existuje v přírodně se vyskytujících bílkovinách, glykoproteinech a nukleoproteinech. Je možno uvést, že bílkoviny s nižší molekulovou hmotností se účastní imunologických reakcí, u které mají podobný rozsah a trvání jako fysiologicky významných bílkovin, například virových antigenů, hormonů typu polypeptidů a podobné. Mezi imunologickými reakcemi těchto polypeptidů je nutno uvést také vyvolání tvorby specifických protilátek u zvířat, jak bylo popsáno například v publikacích Lerner a další, Cell, 23, 309 až 310, 1981, Ross a další, Nátuře 294, str. 654 až 656, 1981, Walter a další, PNAS (USA) 77, str. 5197 až 5200, 1980, Lerner a další, PNAS (USA), 78, 3403 až 3407 (1981), Walter a další, PNAS (USA) 78, 4882 až 4886, 1981, Wong a další, PNAS (USA), 78, 7412 až 7416, 1981, Green a další, Cell, 28, 477 až 487, 1982, Nígg a další, PNAS (USA) 79, 5322 až 5326 (1982), Baron a další, Cell 28, 395 až 404 (1982), Dreesman a další, Nátuře 295, 158 až 160 (1982), Lerner, Scientific Američan 248, č. 2. 66 až 74 (1983). Podobný postup je popsán také v publikaci Kaiser a další, Science 223, str. 249 až 255 (1984), kde běží zejména o biologickou a imunologickou účinnost synthetických peptidů, které mají přibližné stejné sekundární struktury s peptidovými hormony, avšak nemusí mít stejnou primární strukturu. Shora uvedené studie se ovšem vztahují většinou na aminokyselinové sledy jiných bílkovin než erythropoetinu, pro nějž ještě nebyla publikována žádná podstatná informace, týkající se sledu aminokyselin v této látce. V US patentové přihlášce č. 463 724, podané 4. února 1983 (J. Egrie), uveřejněné 22. srpna 1984 jako evropská přihláška č. 0 116 446 se popisuje buněčná linie myšího hybridomu (ATCC č. HB 8209), která produkuje vysoce specifický typ protilátky, která je současně specificky reaktivní na polypeptid, který sestává z následujícího sledu aminokyselin:

NH₂“ Ala-Pro-Pro-Arg-Leu-Ile-Cys-Asp-Ser-Arg-Val-Leu-Glu-Arg-TyrLeu-Leu-Glu-Ala-Lys-COOH.

Tento sled odpovídá sledu, který se předpokládá pro prvních dvacet aminokyselin úplného lidského erythropoetinu, izolovaného způsobem podle publikace Miyake a další, J. Biol. Chem. 252, 5558 až 5564 (1977), kde analýza sledu aminokyselin byla prováděna v plynné fázi (Applied Biosystems lne.) způsobem podle publikace Hewick M. a další, J. Biol- Chem. 256, 7990 až 7997 (1981). Podobný postup je popsán také v publikaci Sue a další, Proč. Nati. Acad, Sci. USA 80, str. 3651 až 3655 (1983), publikace se týká tvorby polyklonálních protilátek proti synthetickému sledu 26 aminokyselin a v publikaci Sytowski a další, J. Immunol. Methods 69, str. 181 až 186 (1984).

Shora popsané polyklonální a monoklonální protilátky představují vysoce užitečné materiály pro použití v imunologii k detekci a kvantitativnímu stanovení erythropoetinu a mohou být užitečné i pro afinitní čištění erythropoetinu, je však nepravděpodobné, že by tato materiály bylo možno použít k izolaci velkých

-9CZ 281542 B6 množství erythropoetinu ze savců v množství, dostatečném pro další analýzu, klinické pokusy a léčebné použití této látky například v případě chronických onemocnění ledvin, při nichž tkáň nestačí udržet dostatečnou produkci erythrocytů. V důsledku těchto skutečností je možno předpokládat, že nej lepší vyhlídky na plnou charakterizaci erythropoetinu savců a na získáni velkých množství této látky pro potenciální diagnostické a klinické použiti má úspěšná aplikace rekombinantních postupů k zajištění mikrobiální syntézy uvedeného materiálu ve velkém množství.

Byly vyvinuty velké snahy izolovat sled DNA, který je kódem pro lidský erythropoetin a pro obdobné látky u jiných savců, avšak dosud bez úspěchu. Tento neúspěch je patrně zaviněn tím, že je k disposici velmi malé množství tkání jako zdrojů této látky, zejména u člověka, jde zvláště o materiály, obohacené mRNA, které by mohly dovolit konstrukci řady cDNA, z nichž by potom bylo možno izolovat běžným způsobem sled, který je kódem pro erythropoetin. Mimoto je o kontinuálním sledu aminokyselin v erythropoetinu zatím známo tak málo, že není možno konstruovat například delší vzorky polynukleotidů, které by bylo dále možno použít při hybridizaci DNA/DNA při použití cDNA a zejména pro získání sestavy určitého genomu. Například shora uvedený sled dvaceti aminokyselin, který byl užit k získání monoklonální protilátky, produkované ATCC č. HB 8209 nedovoluje konstrukci oligonukleotidového vzorku o 60 bázích způsobem popsaným ve shora uvedené publikaci Andersona a dalších. Je pravděpodobné, že se lidský gen pro erythropoetin může vyskytovat jako jediná kopie genu v lidském genomu a v každém případě lidský materiál, který je kódem pro lidský erythropoetin tvoří méně než 0,00005 % celkové DNA lidského genomu.

I nej lepši dosud popisované výsledky, dosažené při použití rekombinantních metod za účelem získání sledů DNA, při jejichž expresi v mikroorganismu by bylo možno získat izolovatelná množství erythropoetinu savců měly daleko do skutečného úspěchu. Například v publikaci Farber a další, Exp. Hematol. 11, Suppl. 14, Abstrakt 101 (1983) se popisuje extrakce mRNA z ledvinné tkáně paviána po působení fenylhydrazinu s následnou injekcí mRNA do oocytů Xenopus laevis, přičemž bylo in vitro dosaženo přechodné tvorby směsi produktů translace, které mají mimo jiné určitou účinnost typu erythropoetinu. V publikaci Farber a další, Blood 62, č. 5, Supp. č. 1, Abstrakt 392 a na str. 122a (1983) se popisuje translace mRNA z lidské ledviny do oocytů žáby. Výsledná směs translačních produktů obsahovala 220 m jednotek translačního produktu s účinností erythropoetinu na mg mRNA. Tato úroveň translace exogenniho kódu mRNA pro erythropoetin in vitro je velmi nízká (i ve srovnání s dříve uváděnými výsledky s translací mRNA paviána), výsledky však patrně potvrzují, že lidská ledvina je místem, v němž dochází k expresi erythropoetinu, takže by mělo být možno z ledviny získat sestavu cDNA, obohacenou o požadovaný gen (Farber, Clin. Res. 31 (4), 769A (1983).

Až do podání US patentových přihlášek č. 561 024 a 582 185 byla známa pouze jediná zpráva o klonování a expresi cDNA lidského erythropoetinu v E. coli. Do plasmidů E. coli bylo včleněno větší množství klonů cDNA a produkty po fůzi s β-laktamázou byly imunoreaktivní s monoklonální protilátkou k nespecifickému epitopu lidského erythropoetinu, postup byl popsán v publikaci

-10CZ 281542 B6

Lee-Huang, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 81, str. 2708 až 2712 (1984).

Způsobem podle vynálezu je poprvé možno získat nové čištěné a izolované polypeptidové produkty, které obsahují část nebo celou primární strukturu (tj. sled zbytků aminokyselin) a mají také jednu nebo větší počet biologických vlastností (například imunologické vlastnosti a biologickou účinnost in vitro i in vivo) přírodně se vyskytujícího erythropoetinu včetně jeho alelických variant. Tyto polypeptidy jsou také produkty exprese eukaryotického nebo prokaryotického hostitele (například bakteriálních,. kvasinkových a savčích buněk v kultuře) při použití exogenních sledů DNA, získaných při klonování genomu nebo cDNA nebo syntézou genu. Produkty mikrobiální exprese v buňkách vertebrat, například savců a ptáků jsou dále prosté lidských bílkovin a dalších nečistot, které mohou doprovázet erythropoetin v jeho přirozeném prostředí v extracellulární tekutině, jako plasmatu nebo moči. Produkty typické buňky kvasinek, jako Saccharomyces cerevisiae nebo prokaryotické buňky, jako E. coli jsou prosté přítomnosti jakékoliv bílkoviny savce. V závislosti na použitém hostiteli je možno polypeptidy, získané způsobem podle vynálezu podrobit glykosylaci uhlohydráty savce nebo eukaryotického organismu nebo je ponechat v negylkosylované formě. Polypeptidy, získané způsobem podle vynálezu mohou také obsahovat v poloze 1 zbytek aminokyseliny methioninu.

Nové glykoproteiny, získané způsobem podle vynálezu včetně těch, jejichž primární struktura sleduje strukturu přírodně se vyskytujícího, například lidského erythropoetinu dostatečným způsobem k tomu, aby bylo možno dosáhnout jedné nebo většího počtu biologických vlastností při složení uhlohydrátu, které je odlišné od složení uhlohydrátů v přírodně se vyskytujícím, například lidském erythropoetinu.

Vertebrata (například COS-1 a CHO) poskytli při prováděni způsobu podle vynálezu vůbec první buňky, které je možno množit kontinuálně in vitro a které při růstu v kultuře jsou schopné produkovat do prostředí, v němž rostou více než 100 jednotek (s výhodou více než 500 jednotek, zejména 1000 až 5000 jednotek) erythropoetinu na 10⁶ buněk v průběhu 48 hodin, jak bylo stanoveno radioimunologicky.

Způsobem podle vynálezu je možno také získat synthetické polypeptidy, které zcela nebo části svou strukturou odpovídají kontinuálnímu sledu aminokyselinových zbytků erythropoetinu, která tak byla poprvé osvětlena. Tyto sledy, které mohou mít společné primární, sekundární nebo terciární strukturální vlastnosti s přírodně se vyskytujícím erythropoetinem mohou mít také biologickou účinnost a/nebo imunologické vlastnosti společné s přírodně se vyskytujícím produktem, takže je může být možno použít jako biologicky nebo imunologicky účinné náhražky erythropoetinu pro léčebné a imunologické účely. Odpovídajícím způsobem je možno získat také monoklonální a polyklonální protilátky, které jsou imunoreaktivní vzhledem ke svrchu uvedeným polypeptidům a s výhodou imunoreaktivní také k přírodně se vyskytujícímu erythropoetinu.

-11CZ 281542 B6

Příkladem látek, získaných způsobem podle vynálezu mohou být klonované sledy DNA lidského nebo opičího původu a polypeptidové sledy, získané při použití těchto materiálů, které jsou prvním potvrzením struktury erythropoetinu opic a lidí.

Způsobem podle vynálezu je také možno získat nové biologicky funkční virové a cirkulární vektory pro plasmidovou DNA, do nichž je možno včlenit sledy DNA podle vynálezu a mikrobiální (například bakteriální, kvasinkové a savčí) buňky jako hostitelské organismy, stabilně transformované nebo podrobené transfekci při použití shora uvedených vektorů. Tímto způsobem je podle vynálezu možno získat cenné polypeptidy tak, že se pěstuje v kultuře transformovaný mikrobiální hostitel za podmínek, které umožňuji nebo usnadňují expresi exogenní, do vektoru včleněné DNA ve velkém množství s následnou izolací požadovaných polypeptidů z růstového prostředí, lysátu buněk nebo frakcí buněčné membrány.

Izolaci a čištění polypeptidů, získaných mikrobiální expresí je možno provádět běžným způsobem včetně například preparativní dělicí chromatografie a imunologického dělení za použití monoklonálních a/nebo polyklonálních protilátek.

Po osvětlení sledu aminokyselinových zbytků v erythropoetinu je možno sestavit také úplný a/nebo částečný sled DNA, která je kódem pro erythropoetin včetně výhodných vlastností tohoto sledu, například včlenění kodonů, které jsou výhodné k dosažení exprese při použití hostitele odlišného od savce, začlenění míst pro štěpení restrikčními endonukleázami a přidáním počátečních terminálních nebo vmezeřených sledů DNA, které mohou usnadňovat konstrukci nebo umožnit snadnější expresi vektoru. Tímto způsobem je tedy možno získat (a specifickou mutagenezou cDNA a DNA genomu dále rozvíjet) sledy DNA, které jsou kódem pro mikrobiální expresi polypeptidových analogů nebo derivátů erythropoetinu, které se odlišují od přírodně se vyskytující formy identitou nebo umístěním jednoho nebo většího počtu aminokyselinových zbytků, jde tedy například o analogy vzniklé vynecháním méně než všech zbytků, specifických pro erythropoetin (EPO) a/nebo vzniklé substitucí, při níž jeden nebo větší počet zbytků je nahrazen jinými zbytky a/nebo vzniklé adicí, při níž se přidává jeden nebo větší počet aminokyselinových zbytků k terminální nebo mediální části polypeptidu, přičemž všechny tyto formy mohou mít část nebo všechny vlastnosti přírodně se vyskytujících forem.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je sekvence DNA pro použití k zajištění exprese polypeptidového produktu vykazujícího celou primární strukturní konformaci humánního nebo opičího erythropoetinu, jak je uvedena v tabulce VI nebo V, nebo její část nebo jakékoliv jeho varianty nebo derivátu vykazujícího biologickou účinnost spočívající ve zvyšováni produkce retikulocytů a červených krvinek v kostní dřeni a zvyšování syntézy hemoglobinu nebo příjmu železa, v prokaryontních nebo eukaryontnich hostitelských buňkách, přičemž tato sekvence DNA se volí ze souboru zahrnujícího (a) sekvence DNA uvedené v tabulce V a VI a jejich komplementární řetězce;

-12CZ 281542 B6 (b) sekvence DNA hybridizující za stringentních podmínek k sekvencím DNA definovaným v odstavci (a) nebo jejich fragmentům; a (c) sekvence DNA, které by byly hybridizovatelné k sekvencím DNA definovaným v odstavci (a) nebo (b), nebýt degenerace genetického kódu.

Specifickým představitelem sekvence (b) jsou sekvence pro lidský a opičí erythropoetin, včetně alelových variant a/nebo sekvence pro erythropoetin jiných savců. Typickou sekvencí (c) může být syntetizovaná sekvence DNA kódující EPO, jeho fragmenty nebo analogy, přičemž taková sekvence může obsahovat kodony, které usnadňují translaci mRNA do hostitele odlišného od obratlovců.

Do rozsahu vynálezu spadá i výše uvedená sekvence DNA, která je kovalentně připojena k detegovatelné značící látce, jež je s výhodou radioaktivní. Taková značená sekvence je s výhodou j ednořetězcová.

Sekvence DNA podle vynálezu může kódovat [Phe¹⁵]hEPO, [Phe⁴⁹]hEPO, [Phe¹⁴⁵]hEPO, [His⁷]hEPO, [Asn²-des-Pro² až Ile⁶]hEPO, [des-Thr¹⁶³ až Arg¹⁶⁶]hEPO nebo [delta 27-55]hEPO.

Předmětem vynálezu je dále prokaryontní nebo eukaryontní hostitelská buňka transformovaná nebo transfekovaná výše uvedenou sekvencí DNA způsobem umožňujícím této hostitelské buňce exprimovat uvedený polypeptidový produkt. Takovou buňkou, která je účelně schopna glykosylovat uvedený polypeptid, může být například savčí buňka, jako buňka COS nebo CHO.

Předmětem vynálezu je dále biologicky funkční cirkulární plasmid nebo virový DNA vektor obsahující výše definovanou sekvenci DNA, jakož i prokaryontní nebo eukaryontní hostitelská buňka stabilně transformovaná nebo transfekovaná takovým DNA vektorem.

Dalším předmětem vynálezu je polypeptid vykazující celou primární strukturní konformaci humánního nebo opičího erythropoetinu, jak je uvedena v tabulce VI nebo V, nebo její část nebo jakákoliv jeho alelová varianta nebo derivát vykazující biologickou účinnost spočívající ve zvyšování produkce retikulocytů a červených krvinek v kostní dřeni a zvyšováni syntézy hemoglobinu nebo příjmu železa, kterýžto polypeptid je produktem prokaryontní nebo eukaryontní exprese exogenní sekvence DNA. Tento polypeptid může být produktem eukaryontní exprese exogenní sekvence DNA. Touto sekvenci DNA může být sekvence cDNA nebo sekvence genomové DNA. Exogenní sekvence DNA může být připojena k autonomně se replikujícímu cirkulárnímu DNA plasmidu nebo virovému vektoru.

Pólypeptidem podle vynálezu může být glykoprotein, jehož průměrné sacharidové složení se liší od humánního erythropoetinu izolovaného z moči.

Pro speciální účely může být polypeptid podle vynálezu kovalentně připojen k detegovatelné značící látce, která je s výhodou radioaktivní.

-13CZ 281542 B6

Dalším předmětem vynálezu je způsob výroby polypeptidů vykazujícího alespoň část primární strukturní konformace erythropoietinu pro umožnění biologické účinnosti spočívající ve zvyšování produkce retikulocytů a červených krvinek v kostní dřeni a zvyšování syntézy hemoglobinu nebo přijmu železa, jehož podstata spočívá v tom, že se prokaryontní nebo eukaryontní hostitelská buňka transformovaná nebo transfekovaná výše definovanou sekvencí DNA způsobem umožňujícím hostitelské buňce exprimovat tento polypeptid kultivuje za vhodných živných podmínek a popřípadě se požadovaný polypeptidový produkt exprese této sekvence DNA izoluje.

Předmětem vynálezu je dále farmaceutický prostředek, jehož podstata spočívá v tom, že obsahuje výše uvedený polypeptid, například polypeptid připravitelný výše uvedeným způsobem a farmaceuticky vhodné ředidlo, pomocnou látku nebo nosič. Farmaceutické prostředky podle vynálezu nalézají použití všude tam, kde vzniká nedostatek erythropoetinu, například u různých typů anémií, zejména u chronického selhání ledvin.

Dalším předmětem vynálezu je protilátka vykazující imunoreaktivitu s erythropoetinem a se syntetickým polypeptidem, jehož primární strukturní konformace v podstatě kopíruje kontinuální sekvenci aminokyselinových zbytků zachovanou v erythropoetinu izolovaném z moči s výjimkou jakéhokoliv polypeptidů vykazujícího sekvenci aminokyselinových zbytků, která je úplně obsažena v sekvenci A-P-P-R-L-I-C-D-S-R-V-L-E-R-Y-L-L-E-A-K-E-A-E-N-I-T. Tato protilátka může být monoklonální nebo polyklonální.

Konečně je předmětem vynálezu také výše uvedená protilátka, která je imunoreaktivní s erythropoetinem a syntetickým polypeptidem, jehož sekvence je zvolena ze souboru zahrnujícího sekvenci V-P-D-T-K-V-N-F-Y-A-W-K-R-M-E-V-G,

K-E-A-I-S-P-P-D-A-A-S-A-A a V-Y-S-N-F-L-R-G-K-L-K-L-Y-T-G-E-A-C-R-T-G-D—R.

Polypeptidy, které jsou produktem svrchu uvedeného postupu je možno označit tak, že se na ně kovalentní vazbou naváže zjistitelný materiál. Může například jít o radioaktivní označení isotopem ¹²⁵I, čímž je možno získat reakční činidlo, které lze použít k detekci a ke kvantativnímu stanovení erythropoetinu v pevných tkáních a také ve vzorcích kapalin, například v moči nebo v krvi. DNA podle vynálezu je také možno označit, a to radioaktivně nebo například biotinem a potom použít při hybridizaci k určeni polohy erythropoetinového genu a/nebo polohy jakéhokoliv příbuzného genu u lidí, opic a dalších savců v jejich chromosomální mapě. Tímto způsobem je také možno prokázat poruchy genu pro erythropoetin na úrovni DNA nebo poruchy příbuzných genů.

Jak bude dále podrobněji uvedeno, znamená vynález podstatné zlepšení detekce specifického polynukleotidu s jedním řetězcem s neznámým sledem v heterogenním buněčném nebo virovém vzorku včetně mnohočetných polynukleotidů s jednoduchým řetězcem tak, že se

a) připraví směs značených polynukleotidových vzorků s jednoduchými řetězci s uniformně se měnícím sledem bází, přičemž každý z těchto vzorků je potenciálně specificky komplementární

-14CZ 281542 B6 ke sledu, který se vyskytuje ve vzorku a náleží polynukleotidu, který má být zjištěn,

b) vzorek se fixuje na pevný substrát,

c) substrát s fixovaným vzorkem se zpracovává tak, aby byla snížena další vzájemná možnost vazby polynukleotidů s výjimkou hybridizace na polynukleotidy uvedeného vzorku,

d) zpracovaný substrát s fixovaným vzorkem se na přechodnou dobu uvede do styku se směsí značených vzorku za podmínek, které usnadňují hybridizaci pouze mezi úplně komplementárními polynukleotidy a

e) specifický polynukleotid se zjisti zjištěním přítomnosti hybridi začni reakce .polynukleotidu s úplné komplementárním vzorkem ze směsi značených vzorku, jak je možno prokázat přítomností větší hustoty značeného materiálu na substrátu v místě přítomnosti specifického polynukleotidu ve srovnání s ostatními místy substrátu, kde došlo pouze k nespecifické vazbě značeného vzorku na substrát.

Tento způsob je zvláště účinný v situacích, kdy je zapotřebí užít 64, 128, 256, 512, 1024 nebo více vzorků polynukleotidů a délce 17 až 20 bází při hybridizaci DNA/DNA, RNA/RNA nebo DNA/RNA.

Jak již bylo uvedeno, umožnil tento postup identifikaci klonů DNA, které jsou kódem pro erythropoetin opičího původu ze skupiny sledů, připravených z mRNA buněk ledvin anemických opic. V tomto případě bylo užito 128 uniformně variabilních vzorků o délce 20 nukleotidů podle informací a sledu aminokyselin frakcí lidského erythropoetinu při hybridizaci kolonii, čímž bylo možno prokázat sedm positivních klonů cDNA z celkového počtu 200 000 kolonii. Dále bylo možno rychle izolovat tři positivní klony z 1 500 000 plaků fágu lidského genomu. I v tomto případě bylo požito směsi 128 vzorků polynukleotidů o 20 bázích spolu s druhou sestavou 128 nukleotidů o 17 bázích podle analýzy aminokyselin v jiném kontinuálním sledu lidského erythropoetinu.

Shora uvedené postupy znamenají první použiti smíšených vzorků oligonukleotidů při hybridizaci DNA/DNA za účelem izolace klonů savčího genomu, přičemž současně bylo poprvé použito směsi více než 32 vzorků oligonukleotidů při izolaci klonů cDNA.

Další výhody způsobu podle vynálezu budou zřejmé z následujícího podrobného popisu výhodných provedeni tohoto způsobu.

Způsobem podle vynálezu je možno izolovat a charakterizovat sledy DNA, které jsou kódem pro část nebo pro úplný polypeptidový sled erythropoetinu člověka a opice. Dále bylo možno podrobit DNA člověka a opice expresi v eukaryotických i prokaryotických buňkách a získat tak izolovatelná množství polypeptidů s biologickou (například imunologickou) účinností přírodně se vyskytujícího EPO jak in vivo, tak in vitro.

DNA opice byla izolována ze skupiny cDNA, která byla vytvořena pomocí mRNA z ledvinné tkáně opice s chemicky vyvolanou anemií, sérum této opice obsahovalo vysokou hladinu EPO ve srovnání se sérem normálních opic. Izolace požadovaných klonů cDNA s obsahem DNA, která je kódem pro erythropoetin byla uskutečněna použitím DNA/DNA hybridizace kolonií při použití směsi 128 radioaktiv

-15CZ 281542 B6 né značených oligonukleotidů o 20 bázích s rychlým vyhodnocením 200 000 vzniklých kolonií. Stavba oligonukleotidových vzorků byla určena podle informací o sledu aminokyselin při enzymatické fragmentaci a určení sledu v malé části lidského EPO.

DNA člověka byla izolována z lidského genomu. Izolace klonů s obsahem DNA, která je kódem pro EPO byla uskutečněna hybridižací plaků při použití shora uvedené směsi 128 oligonukleotidů o 20 bázích a druhé směsi o 128 radioaktivně značených oligonukleotidů o 17 bázích podle informací, získaných o sledu aminokyselin z jiného enzymaticky získaného fragmentu lidského EPO.

Positivní klony a plaky byly ověřeny zjištěním sledu DNA klonu při použití pomocné sestavy 16 sledů pro směs vzorků o 20 bázích a vybrané klony byly podrobeny zjištění sledu nukleotidů, jejímž výsledkem bylo odvození primární struktury polypeptidů typu EPO, pro něž byla tato DNA kódem. Takto prokázaný sled polypeptidu byl vysoce homologní s částečným sledem aminokyselin, zjištěným analýzou aminokyselin fragmentů lidského EPO.

Vybraný positivní klon cDNA opice a vybraný positivní klon cDNA člověka byly včleněny do vektoru pro přenos DNA, který byl pomnožen v E. coli a potom užit k transfekci buněk savců v kultuře. Tyto buňky potom byly dále pěstovány, přičemž v supernatantu kultury bylo možno prokázat až 3000 mjednotek EPO v 1 ml.

Vynález bude osvětlen následujícími příklady a jednotlivé příklady jsou specificky zaměřeny na postupy, které byly prováděny před identifikací klonů cDNA, které jsou kódem pro EPO opice a klonů lidského genomu, na postupy, které byly zaměřeny na identifikaci a určení sledu, na vývoj systému pro expresi a na imunologické ověření exprese EPO v těchto systémech.

Příklad 1 je zaměřen na určení sledu aminokyselin ve fragmentech lidského EPO a na konstrukci směsi radioaktivně značených vzorků na základě výsledků určení sledu.

Příklad 2 je zaměřen na postupy, vedoucí k identifikaci positivních klonů cDNA opice a poskytuje informaci pro ošetření zvířat a pro předběžnou radioimunologickou analýzu (RIA) živočišných sér.

Příklad 3 je zaměřen na přípravu směsi a sestavy cDNA, na hybridizaci kolonií, vyhledávání positivních kolonií a ověřování positivních klonů, na zjištění sledu DNA v positivním cDNA klonu a na potvrzení primární struktury EPO opice (stanovení sledu aminokyselin).

Příklad 4 je zaměřen na postupy, zahrnující identifikaci positivních klonů lidského genomu a zajišťuje informaci o zdroji genomické knihovny, hybridizaci plakú a ověřeni positivních klonů.

Příklad 5 je zaměřen na zjištěni sledu DNA v positivním klonu genomu a na získání informace o sledu aminokyselin v lidském EPO včetně jeho srovnání se sledem EPO opice.

-16CZ 281542 B6

V příkladu 6 jsou uvedeny postupy pro konstrukci vektoru se včleněnou DNA, která je kódem pro EPO, odvozeného od positivního klonu cDNA opice, použití tohoto vektoru pro transfekci buněk COS-1 a pěstování těchto buněk po transfekci.

Příklad 7 je zaměřen na konstrukci vektoru se včleněnou DNA, která je kódem pro EPO, získanou z positivního klonu lidského genomu, použití tohoto vektoru pro transfekci buněk COS-1 a pěstování těchto buněk po transfekci.

Příklad 8 se týká imunologických postupů při nichž bylo použito supernatantu z kultur buněk po transfekci podle příkladů 6 a 7.

Příklad 9 je zaměřen na sledování biologické účinnosti in vivo a in vitro pro EPO, získaný mikrobiální expresí v příkladech 6 a 7.

Příklad 10 se týká vývoje systémů pro expresi u savců pro cDNA EPO opice a pro DNA lidského genomu včetně použití ovaria čínského křečka (buňky CHO) a také imunologického a biologického sledování účinnosti produktů, získaných expresí při použití těchto systémů a vlastností těchto produktů.

Příklad 11 je zaměřen na přípravu genů které jsou kódem pro lidský EPO a jeho analogy, přičemž tyto geny mohou obsahovat řadu preferenčních kodonů, které umožňují nebo usnadňují expresi v E. coli nebo v kvasinkách. Příklad se také týká příslušných systémů pro expresi těchto genů.

Příklad 12 se vztahuje na imunologickou a biologickou účinnost produktů, získaných způsobem exprese podle příkladu 11.

Vynález bude osvětlen následujícími příklady.

Příklad 1

A. Stanovení sledu aminokyselin ve fragmentu lidského erythropoetinu

Lidský EPO byl izolován z moči a rozštěpen trypsinem, čímž vzniklo a bylo izolováno 17 oddělených fragmentů v množstvích přibližné 100 až 150 pmolů.

Tyto fragmenty byly zkusmo očíslovány a potom byly analyzovány na sled aminokyselin mikroanalýzou sledu při použití zařízení, které pracuje s plynnou fází (Biosystems Applied), čímž byla získána informace, která je uvedena v následující tabulce I. V této tabulce jsou jako kódy použita jednotlivá písmena a X znamená zbytek, který nebyl jednoznačně určen.

-17CZ 281542 B6

Tabulka I

Vzorek č.	Výsledek analýzy sledu
T4a	A-P-P-R
T4b	G-K-L-K
T9	A-L-G-A-Q-K
T13	V-L-E-R
T16	A-V-S-G-L-R
T18	L-F-R
T21	K-L-F-R
T25	Y-L-L-E-A.-K
T26a	L-I-C-D-S-R
T26b	L-Y-T-G-E-A-C-R
T27	T-I-T-A-D-T-F-R
T28	E-A-I-S-P-P-D-A-A-M-A-A-P-L-R
T30	E-A-E-X-I-T-T-G-X-A-E-H-X-S-L-N-E-X-I-T-V-P
T31	V-Y-S-N-F-L-R
T33	S-L-T-T-L-L-R
T35	V-N-F-Y-A-W-K
T38	G-Q-A-L-L-V-X-S-S-Q-P-W-E-P-L-Q-L-H-V-D-K

B. Složení a konstrukce směsi vzorků oligonukleotidů

Sledy aminokyselin, uvedené v tabulce I byly užity s ohledem na možnou degeneraci genetického kódu ke zjištění, zda by bylo možno použít postup s využitím smíšeného vzorku pro DNA/DNA hybridizaci na cDNA a/nebo na DNA z knihovny genomu. Tato analýza umožnila zjistit, že ve fragmentu č. T35 se nacházel sled sedmi zbytků aminokyselin (Val-Asn-Phe-Tyr-Ala-Trp-Lys), pro nějž by mohl být kódem jeden ze 128 možných sledů DNA s obsahem 20 párů bázi. Byl proto sestaven první souhrn 128 sledů o 20 párech bází standardním fosfoamiditovým způsobem podle publikace Beaucage a další, Tetrahedron Letters 22, str. 1859 až 1862 (1981) na pevném nosiči podle následující tabulky II.

Tabulka II

Zbytek - Val	- Asn -	Phe -	Tvr - Ala	- Trp -	Lys
3 '	CAA	TTG	AAG	ATG	CGA	AAC	TT -5
	T	A	A	A	T
	G				G
	C				C

Další analýzou bylo možno prokázat, že ve fragmentu č. T38 existuje sled šesti zbytků aminokyselin (Gln-Pro-Trp-Glu-Pro-Leu), na základě tohoto sledu bylo možno připravit směs 128 oligonukleotidů se 17 páry bází podle následující tabulky III.

-18CZ 281542 B6

Tabulka III

Zbytek	- Gin -	Pro	- Trp	- Glu -	Pro	- Leu
3 ’	GTT	GGA	ACC	CTT	GGA	GA -5
	C	T		C	T	A
		G			G
		C			C

Vzorky oligonukleotidů byly označeny na 5'-zakončení pomocí ³²P—ATP, 7500 až 8000 Ci/mol (ICN) při použití T₄-polynukleotidkinázy (NEN).

Příklad 2

A. Předběžné ošetření opic a analýza RIA

Samicím opice Macaca fascicularis o hmotnosti 2,5 až 3 kg ve stáří 1,5 až 2 roky byl podkožně podán roztok o pH 7 s obsahem

12,5 mg/kg fenylhydrazinu ve formě hydrochloridu v den 1, 3 a 5. Před každou injekcí byl kontrolován hematokrit. V den 7 nebo kdykoliv, kdy poklesla hodnota hematokritu na 25 % hodnoty původní bylo izolováno krevní sérum a ledviny po podání 25 mg/kg ketaminhydrochloridu. Materiál byl okamžitě zmrazen v kapalném dusíku a skladován při teplotě -70 C.

B. RIA pro EPO

Radioimunologické zkoušky pro kvantitativní stanovení erythropoetinu ve vzorcích byly prováděny následujícím způsobem:

Standard erythropoetinu nebo neznámý vzorek byl inkubován spolu s antisérem dvě hodiny při teplotě 37 ’C. Po dvou hodinách inkubace byly zchlazeny zkumavky se vzorky v ledu, byl přidán erythropoetin, značený ¹²⁵i a zkumavky byly inkubovány při teplotě 0 C alespoň 15 hodin. Každá ze zkumavek obsahovala 500 μΐ inkubační směsi, sestávající z 50 μΐ zředěného imunního séra, 10 000 impulsů za minutu ¹²⁵-erythropoetinu, 5 μΐ trasylolu a 0 - 250 μΐ standardu EPO nebo neznámého vzorku, zbytek objemu byl doplněn použitím PBS s obsahem 0,1 % BSA. Použité antisérum bylo z druhého pokusného odběru krve u králíků, imunizovaných 1% čistým přípravkem erythropoetinu z lidské moči. Konečné ředění antiséra bylo v průběhu pokusu upraveno tak, aby množství ¹²⁵I-EPO, vázané na protilátku bylo nejvýš 10 až 20 % možných vstupních impulsů, což je obecně konečné ředění antiséra v rozmezí 1 : 50 000 až 1 : 100 000.

Protilátka, vázaná na ¹²⁵I-erythropoetin byla vysrážena přidáním 150 μΐ Staph A. Po 40 minutách inkubace byly vzorky odstředěny a pelety byly dvakrát promyty 0,75 ml 10 mM Tris-HCl o pH

8,2 s obsahem 0,15 M chloridu sodného, 2 mM EDTA a 0,05 % Tritonu X-100. V promytých peletách byl stanoven počet impulsů ke stanovení procentuálního množství vázaného značeného erythropoetinu.

-19CZ 281542 B6

Impulsy, získané pro sérum před imunizací byly od získaných hodnot odečteny k vyloučení vlivu nespecifické precipitace. Množství erythropoetinu v neznámém vzorku bylo vypočítáno srovnáním se standardní křivkou.

Shora uvedený postup byl aplikován na sérum opic, získané v části A a na sérum zdravých opic. Normální sérum obsahovalo přibližné 36 mJ/ml, zatímco sérum opic předem ošetřených obsahovalo množství v rozmezí 1000 až 1700 mJ/ml.

Příklad 3

A. Konstrukce knihovny cDNA opice

Z ledvin normálních a anemických opic byla izolována mRNA pomocí guanidiniumthiokyanátu podle publikace Chirgwin a další, Biochemistry 18, str. 5294 (1979) a póly (A)⁺ mRNA byla čištěna dvojím průchodem sloupcem s náplní oligo(dT)-cellulózy způsobem podle publikace Maniatis a další, Molecular cloning, a laboratory manual (Cold Springs Harbor Laboratory, Cold Springs Harbor, N. Y. 1982), str. 197 až 198. Knihovna cDNA byla konstruována podle modifikace obecného postupu, popsaného v publikaci Okayama a další, Mol. and Cell. Biol. 2, str. 161 až 170 (1982). Klíčové stupně výhodného postupu jsou následující:

1) jako jediný vektor se užije pUC8, štěpený enzymem Pstl s následným navázáním oligo dT o délce 60 až 80 bází,

2) k odstranění oligo dT z jednoho zakončení vektoru se užije enzymu Hinc II,

3) syntéza prvního řetězce a navázání oligo dT bylo provedeno podle uvedené publikace,

4) štěpení BamHI bylo užito k odstraněni oligo dG z jednoho zakončení vektoru a

5) náhrada řetězce RNA řetězcem DNA byla uskutečněna za přítomnosti dvou pomocných vazných řetězců, a to

GATCTAAGACCGTCCCCCCCCC a ACGGTCTTTA ve trojnásobném molárním přebytku, vztaženo na vektor se zakončením oligo dG.

B. Hybridizace kolonii za účelem vyhledání sledu v sestavě cDNA opice

Transformovaný mikroorganismus E. coli byl nanesen při hustotě 9000 kolonií na plotny živné půdy o rozměru 10 x 10 cm s obsahem 50 mikrogramů ampicillinu. Filtry GeneScreen (New England Nuclear Catalog č. Nef-972) byly předem zvlhčeny na plotně BHI-CAM (Bacto brain heart infusion 37 g/1, Kasaminokyseliny 2 g/1 a agar 15g/l s obsahem 500 mikrogramů Chloramfenikolu) a potom byly použity k odstranění kolonií z plotny. Kolonie byly pěstovány v tomtéž prostředí 12 hodin nebo déle k získání většího počtu kopií plasmidu. Potom byly kolonie (koloniemi směrem vzhůru) zpracovávány tak, že filtry byly postupně ukládány na dvě vrstvy papíru Whatman 3 MM, nasycené následujícími roztoky:

1) 50 mM glukózy, 25 mM Tris-HCl o pH 8,0, 10 mM EDTA o pH 8,0 na pét minut,

-20CZ 281542 B6

2) 0,5 M NaOH na deset minut, a potom

3) 1,0 M Tris-HCl o pH 7,5 na tři minuty.

Potom byly filtry usušeny na vzduchu ve vakuu dvé hodiny při teplotě 80 C.

Potom byly filtry podrobeny štěpení působením Proteinázy K působením roztoku s obsahem 50 mikrogramů/ml tohoto enzymu v pufru K [0,1 M Tris-HCl o pH 8,0, 0,15 M NaCl, 10 mM EDTA o pH

8,2 a 0,2% SDS]. Na každý filtr se přidá 5 ml roztoku a štěpení se provádí 30 minut při teplotě 55 °C, potom se roztok odstraní.

K filtrům se potom přidá 4 ml předhybridizačniho pufru (5x SSPE, 0,5% SDS, 100 mikrogramů/litr SS E. coli DNA a 5x BFP). Pufr se nechá působit při teplotě 55 °C obvykle 4 hodiny nebo déle a potom se pufr odstraní.

Hybridizace se potom provádí následujícím způsobem: Ke každému filtru se přidají 3 ml hybridizačního pufru (5x SSPE, 0,5% SDS, 100 mikrogramů/litr tRNA kvasinek) s obsahem 0,025 pikomolů každého ze 128 vzorků, uvedených v tabulce II (tato směs se označuje jako EPV směs) a potom se filtry udržují 20 hodin na teplotě 48 “C.Tato teplota je o 2 ’C nižší než nejnižší vypočítaná teplota pro dissociaci (Td) pro každý z uvedených vzorků.

Po hybridizaci se filtry třikrát promyjí na třepačce vždy 10 minut při použití 6x SSC a 0,1% SDS při teplotě místnosti, potom se promyjí ještě dvakrát až třikrát 6x SSC s 1% SDS při teplotě hybridizace 48 °C.

Autoradiografií filtrů bylo možno prokázat, že z původního počtu 200 000 kolonií je sedm kolonií positivních.

Potom byla provedena analýza sledu jednoho z klonů cDNA opice (označeného jako klon 83) modifikací postupu, uvedeného v publikaci Wallace a další, Gene 16, str. 21 až 26 (1981). Postup byl prováděn tak, že plasmidová DNA opičího klonu 83 cDNA byla linearizována působením restrikčního enzymu EcoRI a potom denaturována zahřátím ve vroucí vodní lázni. Sled desoxynukleotidů byl stanoven způsobem podle publikace Sanger a další, P.N.A.S. (USA) 74, str. 5463 až 5467 (1977). Jako primer pro tuto reakci byla užita podskupina EPV směsi, sestávající ze 16 sledů.

C. Stanovení sledu cDNA opice pro EPO

Analýza nukleotidů klonu 83 byla prováděna podle publikace Messing, Methods in Enzymology 101, str. 20 až 78 (1983). V tabulce IV je shrnuta analýza restrikčními enzymy přibližně 1600 párů bází fragmentu klonu 83, štěpeného enzymem EcoRI/Hind III. Přibližné uložení míst pro působení shora uvedených restrikčních endonukleáz bylo stanoveno tak, že byl určen počet bází od zakončení 3' k místu pro působení enzymu EcoRI v blízkosti 5'-zakončení tohoto fragmentu. Analýza sledu nukleotidů byla provedena stanovením sledu jednotlivých fragmentů po působení jednotlivých restrikčních enzymů tak, že bylo možno zjistit také fragmenty, které se překrývají. Tak bylo zjištěno například překrytí při analýze sledu nukleotidů v případě restrikčního fragmentu, označeného C113 (Sau3A při přibližné 11/SmaI při přibližně 324)

-21CZ 281542 B6 a obrácený sled v případě fragmentu, označeného jako C73 (Alul při přibližné 424/BstEII při přibližně 203).

V následující tabulce IV je uvedeno přibližné místo pro působení jednotlivých restrikčních endonukleáz.

Tabulka IV

Restrikční enzym Přibližné umístění

Místo pro působení

EcoRI	1
Sau3A	111
Smál	180
BstEII	203
Smál	324
KpnI	371
Rsal	372
Alul '	424
Pstl	426
Alul	430
Hpal	466
Alul	546
Pstl	601
PvuII	604
Alul	605
Alul	782
Alul	788
Rsal	792
Pstl	807
Alul	841
Alul	927
Ncol	946
Sau3A	1014
Alul	1072
Alul	1115
Alul	1223
Pstl	1301
Rsal	1343
Alul	1384
HindlII	1449
Alul	1450
HindlII	1585

-22CZ 281542 B6

Stanovení sledu úseku o 1342 párech bází (v oblasti od místa působení enzymu Sau3A v blízkosti 3'-zakončení do místa působení enzymu EcoRI a HindlII) a analýza směru odečítání dovolila získat informace o sledu aminokyselin a o příslušné DNA tak, jak jsou uvedeny v tabulce V. V této tabulce je počáteční aminokyselina úplného EPO (jak bylo ověřeno korelací s předem zmíněným sledem o 20 terminálních aminokyselinách) označena číslem +1. Přítomnost kodonu ATG, specifického pro tvorbu methioninu (a označeného číslem -27) směrem vzhůru od terminálního alaninového zbytku jako prvního zbytku pro úplný EPO napovídá, že k expresi EPO dochází nejprve v cytoplasmě ve formě prekursoru, který obsahuje vedoucí oblast o 27 zbytcích aminokyselin, která se odštěpuje před vstupem EPO do krevního oběhu. Potenciální místa pro glykosylaci jsou v polypeptidů označena hvězdičkami. Stanovená molekulová hmotnost přenesené oblasti byla stanovena jako 21 117 jednotek a molekulová hmotnost 165 polypeptidových zbytků, tvořících úplný EPO opice byla stanovena jako 18 236 jednotek.

-23CZ 281542 B6

Tabulka V

Translace opičí cDNA pro EPO

Sau3A

GÁŤCCCGCGCCCCCTGGACAGCCGCCCTCTCCTCCAGGCCCGTGGGGCTGGCCCTGCCC

CGCTGAACTTCCCGGGATGAGGACTCCCGGTGTGGTCACCGCGCGCCTAGGTCGCTGAG

-27 -20

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp GGACCCCGGCCAGGCGCGGAGATG GGG GTG CAC GAA TGT CCT GCC TGG

Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu Val

-10 Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro

CTG

TGG

CTT

CTC CTG

TCT

CTC

GTG

TCG

CTC

CCT

CTG

GGC

CTC

CCA

-1

>1

10

Val

Pro

Gly

Ala

Pro

Pro

Arg

Leu

Ile

Cys

Asp

Ser

Arg

Val

Leu

GTC

CCG

GGC

GCC

CCA

CCA

CGC

CTC

ATC

TGT

GAC

AGC

CGA

GTC

CTG

20

*

Glu

Arg

T yr

Leu

Leu

Glu

Ala

Lys

Glu

Ala

Glu

Asn

Val

Thr

Met

GAG

AGG

TAC

CTC

TTG

GAG

GCC

AAG

GAG

GCC

GAG

AAT

GTC

ACG

ATG

30

*

40

Gly

Cys

Ser

Glu

Ser

Cys

Ser

Leu

Asn

Glu

Asn

Ile

Thr

Val

Pro

GGC

TGT

TCC

GAA

AGC

TGC

AGC

TTG

AAT

GAG

AAT

ATC

ACC

GTC

CCA

Asp GAC

Thr ACC

Lys AAA

Val Asn Phe

T yr TAT

Ala GCC

Trp TGG

Lys Arg Met Glu

Val GTC

Gly GGG

GTT

AAC

TTC

AAG

AGG ATG

GAG

Gin

Gin

60 Ala

Val

Glu

Val

Trp

Gin

Gly

Leu

Ala

Leu

70 Leu

Ser

Glu

CAG

CAG

GCT

GTA

GAA

GTC

TGG

CAG

GGC

CTG

GCC

CTG

CTC

TCA

GAA

Ala

Val

Leu

Arg

Gly

Gin

Ala

80 Val

Leu

Ala

♦ Asn

Ser

Ser

Gin

Pro

GCT

GTC

CTG

CGG

GGC

CAG

GCC

GTG

TTG

GCC

AAC

TCT

TCC

CAG

CCT

Phe

Glu

90 Pro

Leu

Gin

Leu

His

Met

Asp

Lys

Ala

Ile

100 Ser

Gly

Leu

TTC

GAG

CCC

CTG

CAG

CTG

CAC

ATG

GAT

AAA

GCC

ATC

AGT

GGC

CTT

Arg

Ser

Ile

Thr

Thr

Leu

Leu

110 Arg

Ala

Leu

Gly

Ala

Gin

Glu

Ala

CGC

AGC

ATC

ACC

ACT

CTG

CTT

CGG

GCG

CTG

GGA

GCC

CAG

GAA

GCC

Ile

Ser

120 Leu

Pro

Asp

Ala

Ala

Ser

Ala

Ala

Pro

Leu

130 Arg

Thr

Ile

ATC

TCC

CTC

CCA

GAT

GCG

GCC

TCG

GCT

GCT

CCA

CTC

CGA

ACC

ATC

Thr

Ala

Asp

Thr

Phe

Cys

Lys

140 Leu

Phe

Arg

Val

Tyr

Ser

Asn

Phe

ACT

GCT

GAC

ACT

TTC

TGC

AAA

CTC

TTC

CGA

GTC

TAC

TCC

AAT

TTC

-24CZ 281542 B6

Tabulka V - pokračováni

150 160

Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Arg

CTC CGG GGA AAG CTG AAG CTG TAC ACG GGG GAG GCC TGC AGG AGA

165

Gly Asp Arg OP

GGG GAC AGA TGA CCAGGTGCGTCCAGCTGGGCACATCCACCACCTCCCTCACCAACA

CTGCCTGTGCCACACCCTCCCTCACCACTCCCGAACCCCATCGAGGGGCTCTCAGCTAAG

CGCCAGCCTGTCCCATGGACACTCCAGTGCCAGCAATGACATCTCAGGGGCCAGAGGAAC TGTCCAGAGCACAACTCTGAGATCTAAGGATGTCGCAGGGCCAACTTGAGGGCCCAGAGC AGGAAGCATTCAGAGAGCAGCTTTAAACTCAGGAGCAGAGACAATGCAGGGAAAACACCT GAGCTCACTCGGCCACCTGCAAAATTTGATGCAGGACACGCTTTGGAGGCAATTTACCTG TTTTTGCACCTACCATCAGGGACAGGATGACTGGAGAACTTAGGTGGCAAGCTGTGACTT CTCAAGGCCTCACGGGCACTCCCTTGGTGGCAAGAGCCCCCTTGACACTGAGAGAATATT TTGCAATCTGCAGCAGGAAAAATTACGGACAGGTTTTGGAGGTTGGAGGGTACTTGACAG GTGTGTGGGGAAGCAGGGCGGTAGGGGTGGAGCTGGGATGCGAGTGAGAACCGTGAAGAC AGGATGGGGGCTGGCCTCTGGTTCTCGTGGGGTCCAAGCTT

HindlII

-25CZ 281542 B6

Polypeptidový sled, uvedený v tabulce V, je možno snadno podrobit analýze na přítomnost vysoce hydrofilních oblastí a/nebo analýze na sekundární strukturní vlastnosti, které jsou také například potenciálními vysoce imunogenními oblastmi, například způsobem podle publikace Hopp a další, PNAS (USA) 78, str. 3824 až 3828 (1981) a podle publikace Kyte a další, J. Mol. Biol. 157, str. 105 až 132 (1982) a/nebo Chou a další, Biochem. 13, str. 222 až 245 (1974) a Advances in Enzymology 47, str. 45 až 47 (1978). Analýzu s pomocí počítače je možno zajistit při využití nabídky PEP Reference Sectio 6.7, Intelligenetics lne., 124 University Avenue, Palo AIto, California, USA (způsob podle Hoppeho a dalších).

Příklad 4

A. Sestava lidského genomu

Byla získána sestava genomu lidských fetálních jater, nesená fágem Ch4A způsobem, popsaným v publikaci Lawn a další, Cell 18, str. 533 až 543 (1979), sestava potom byla udržována pro použití při hybridizaci plaků.

B. Hybridizace plaků jako metoda pro vyhledávání sledů v sestavě lidského genomu

Částice fágu byly rozrušeny a DNA byla fixována na filtry v množství 50 000 plaků na filtr způsobem, popsaným v publikaci Woo, Methods in Enzymology 68, str. 389 až 395 (1979) s tím rozdílem, že bylo užito filtrů GeneScreen Plus (New England Nuclear Catalog č. NEF-976) a ploten NZYAM (NaCl 5 g, MgCl₂ . 6 H₂0 2 g, NZ-Amin A 10 g, extrakt z kvasnic 5 g, Kasaminokyseliny 2 g, maltóza 2 g a agar 15 g na litr).

Filtry, usušené na vzduchu byly zahřívány 1 hodinu na teplotu 80 “C a potom byly štěpeny Proteinázou K způsobem podle příkladu 3, část B. Předběžná hybridizace byla prováděna při použití 1 M NaCl, 1% SDS pufru 4 hodiny při teplotě 55 °C nebo o něco déle, potom byl pufr odstraněn. Hybridizace a zpracování po hybridizaci bylo prováděno obdobným způsobem jako v příkladu 3, část B. Byla užita jak směs 128 vzorků o 20 párech bází, označená EPV, tak směs 128 vzorků o 17 párech bází z tabulky III, označená jako směs EPQ. Hybridizace byla prováděna při použití směsi EPV při teplotě 48 °C a při použití směsi EPQ při teplotě 46 ’C, tj. 4 stupně pod nejnižší vypočítanou hodnotou Td pro složky směsi. Odstranění hybridizovaného vzorku pro rehybridizaci bylo prováděno varem s lx SSC, 0,1% SDS na dvě minuty. Autoradiografie filtrů prokázala přítomnost tří positivních klonů (které reagovaly s oběma vzorky) ze skupiny původních 1 500 000 fágů. Potom byla ověřena skutečnost, že tyto positivní klony jsou kódem pro EPO stanovením sledu DNA a v elektronovém mikroskopu, kde je možno prokázat strukturu cDNA opice z příkladu 3. Tímto postupem bylo také možno prokázat přítomnost intronů ve sledu DNA genomu.

-26CZ 281542 B6

Příklad 5

Byla provedena analýza sledu nukleotidů v jednom z positivních klonů (označeném lambdahEl). Výsledky jsou uvedeny v následující tabulce VI.

Tabulka VI

AAGCTTCTGGGCTTCCAGACCCAGCTACTTTGCGGAACTCAGCAACCCAGGCATCTCTGAGTCTCCGCCCA

AGACCGGGATGCCCCCCAGGGGAGGTGTCCGGGAGCCCAGCCTTTCCCAGATAGCACGCTCCGCCAGTCCC AAGGGTGCGCAACCGGCTGCACTCCCCTCCCGCGACCCAGGGCCCGGGAGCAGCCCCCATGACCCACACGC ACGTCTGCAGCAGCCCCGCTCACGCCCCGGCGAGCCTCAACCCAGGCGTCCTGCCCCTGCTCTGACCCCGG GTGGCCCCTACCCCTGGCGACCCCTCACGCACACAGCCTCTCCCCCACCCCCACCCGCGCACGCACACATG CAGATAACAGCCCCGACCCCCGGCCAGAGCCGXAGAGTCCCTGGGCCACCCCGGCCGCTCGCCTGCCGCTG CGCCGCACCGCGCTGTCCTCCCGGAGCCGGACCGGGGCCACCGCGCCCXGCTCTGCTCCGACACCGCGCCC CTTGGACAGCCGCCCTCTCCTCTAGGCCCGTGGGGCTGGCCCTGCACCGCCGAGCTTCCCGGGATGAGGXX

-27 -24

Met Gly Val His

CCCGGTGACCGGCGCGCCCCAAGTCGCTGAGGGACCCCGGCCAAGCGCGGAG ATG GGG GTG CAC G

GTGAGTACTCGCGGGCTGGGCGCTCCCGGCGGCCGGGTTCCTGTTTGAGCGGGGATTTAGCGCCCCGGCT

-27CZ 281542 B6

Tabulka VI - pokračování

ATTGGCCAAGAGGTGGCTGGGTTCAAGGACCGGCGACTTGTCAAGGACCCCGGAAGGGGGAGGGGGGTGGG GCAGCCTCCACGTGCCGCGGGGACTTGGGGGAGTTCTTGGGGATGGCAAAAACCTGGCCTGTTGAGGGGCA CAGTTTGGGGTTGGGGAGGAGGTTTGGGGTTCTGCTGTGCAGTTGTGTCGTTGTCAGTGTCTCG[i.S.] TTGCACACGCACAGATCAATAAGCCAGAGGCAGCACCTGAGTGCTTGCATGGTTGGGACAGGAAGGACGAG

CTGGGGCAGAGACGTGGGGATGAAGGAAGCTGTCCTTCCACAGCCACCCTTCTCCCCCCCCGCCTGACTCT

CAGCCTGGCTATCTGTTCTAG

-23 Glu Cys Pro

-20 Ala GCC

Trp Leu

Trp Leu Leu

Leu CTG

Ser TCC

Leu CTG

AA

TGT

CCT

TGG

CTG

TGG CTT

CTC

-10

-1

+ 1

Leu

Ser

Leu

Pro

Leu

Gly

Leu

Pro

Val

Leu

Gly

Ala

Pro

Pro

Arg

Leu

Ile

Cys

CTG

TCG

CTC

CCT

CTG

GGC

CTC

CCA

GTC

CTG

GGC

GCC

CCA

CCA

CGC

CTC

ATC

TGT

10

20

♦

Asp

Ser

Arg

Val

Leu

Glu

Arg

Tyr

Leu

Leu

Glu

Ala

Lys

Glu

Ala

Glu

Asn

Ile

GAC

AGC

CGA

GTC

CTG

GAG

AGG

TAC

CTC

TTG

GAG

GCC

AAG

GAG

GCC

GAG

AAT

ATC

Thr

ACG GTGAGACCCCTTCCCCAGCACATTCCACAGAACTCACGCTCAGGGCTTCAGGGAACTCCTCCCAGAT

CCAGGAACCTGGCACTTGGTTTGGGGTGGAGTTGGGAAGCTAGACACTGCCCCCCTACATAAGAATAAGTC

TGGTGGCCCCAAACCATACCTGAAACTAGGCAAGGAGCAAAGCCAGCAGATCCTACGCCTGTGGGCCAGGG

30

Thr Gly Cys Ala Glu CCAGAGCCTTCAGGGACCCTTGACTCCCCGGGCTGTGTGCATTTCAG ACG GGC TGT GCT GAA * 40

His

Cys

Ser

Leu

Asn

Glu

Asn

Ile

Thr

Val

Pro

Asp

Thr

Lys

Val

Asn

Phe

Tyr

CAC

TGC

AGC

TTG

AAT

GAG

AAT

ATC

ACT

GTC

CCA

GAC

ACC

AAA

GTT

AAT

TTC

TAT

50

55

Ala

Trp

Lys

Arg

Met

Glu

GCC

TGG

AAG

AGG

ATG

GAG

GTGAGTTCCTTTTTTTTTTTTTTTCCTTTCTTTTGGAGAATCTCATT

TGCGAGCCTGATTTTGGATGAAAGGGAGAATGATCGGGGGAAAGGTAAAATGGAGCAGCAGAGATGAGGCT

GCCTGGGCGCAGAGGCTCACGTCTATAATCCCAGGCTGAGATGGCCGAGATGGGAGAATTGCTTGAGCCCT GGAGTTTCAGACCAACCTAGGCAGCATAGTGAGATCCCCCATCTCTACAAACATTTAAAAAAATTAGTCAG GTGAAGTGGTGCATGGTGGTAGTCCCAGATATTTGGAAGGCTGAGGCGGGAGGATCGCTTGAGCCCAGGAA TTTGAGGCTGCAGTGAGCTGTGATCACACCACTGCACTCCAGCCTCAGTGACAGAGTGAGGCCCTGTCTCA

-28CZ 281542 B6

Tabulka VI - pokračování

AAAAAGAAAAGAAAAAAGAAAAATAATGAGGGCTGTATGGAATACATTCATTATTCATTCACTCACTCACT

CACTCATTCATTCATTCATTCATTCAACAAGTCTTATTGCATACCTTCTGTTTGCTCAGCTTGGTGCTTGG

GGCTGCTGAGGGGCAGGAGGGAGAGGGTGACATGGGTCAGCTCGACTCCCAGAGTCCACTCCCTGTAG

56

60

70

Val

Gly

Gin

Gin

Ala

Val

Glu

Val

Trp

Gin

Gly

Leu

Ala

Leu

Leu

Ser

Glu

Ala

GTC

GGG

CAG

CAG

GCC

GTA

GAA

GTC

TGG

CAG

GGC

CTG

GCC

CTG

CTG

TCG

GAA

GCT

~~*

80

«

90

Val

Leu

Arg

Gly

Gin

Ala

Leu

Leu

Val

Asn

Ser

Ser

Gin

Pro

Trp

Glu

Pro

Leu

GTC

CTG

CGG

GGC

CAG

GCC

CTG

TTG

GTC

AAC

TCT

TCC

CAG

CCG

TGG

GAG

CCC

CTG

100

Gin

Leu

His

Val

Asp

Lys

Ala

Val

Ser

Gly

Leu

Arg

Ser

Leu

Thr

Thr

Leu

Leu

CAG

CTG

CAT

GTG

GAT

AAA

GCC

GTC

AGT

GGC

CTT

CGC

AGC

CTC

ACC

ACT

CTG

CTT

110 115

Arg Ala Leu Gly Ala Gin

CGG GCT CTG GGA GCC CAG GTGAGTAGGAGCGGACACTTCTGCTTGCCCTTTCTGTAAGAAGGGGA

GAAGGGTCTTGCTAAGGAGTACAGGAACTGTCCGTATTCCTTCCCTTTCTGTGGCACTGCAGCGACCTCCT

116

120

Lys

Glu

Ala

Ile

Ser

Pro

Pro

Asp

Ala

Ala

Ser

Ala

Ala

GTTTTCTCCTTGGCAG

AAG

GAA

GCC

ATC

TCC

CCT

CCA

GAT

GCG

GCC

TCA

GCT

GCT

130

140

Pro

Leu

Arg

Thr

Ile

Thr

Ala

Asp

Thr

Phe

Arg

Lys

Leu

Phe

Arg

Val

Tyr

Ser

CCA

CTC

CGA

ACA

ATC

ACT

GCT

GAC

ACT

TTC

CGC

AAA

CTC

TTC

CGA

GTC

TAC

TCC

150

160

Asn

Phe

Leu

Arg

Gly

Lys

Leu

Lys

Leu

Tyr

Thr

Gly

Glu

Ala

Cys

Arg

Thr

Gly

AAT

TTC

CTC

CGG

GGA

AAG

CTG

AAG

CTG

TAC

ACA

GGG

GAG

GCC

TGC

AGG

ACA

GGG

166

Asp Arg OP

GAC AGA TGA CCAGGTGTGTCCACCTGGGCATATCCACCACCTCCCTCACCAACATTGCTTGTGCCACA

CCCTCCCCCGCCACTCCTGAACCCCGTCGAGGGGCTCTCAGCTCAGCGCCAGCCTGTCCCATGGACACTCC AGTGCCAGCAATGACATCTCAGGGGCCAGAGGAACTGTCCAGAGAGCAACTCTGAGATCTAAGGATGTCAC AGGGCCAACTTGAAGGGCCCAGAGCAGGAAGCATTCAGAGAGCAGCTTTAAACTCAGGGACAGAGCCATGC TGGGAAGACGCCTGAGCTCACTCGGCACCCTGCAAAATTTGATGCCAGGACACGCTTTGGAGGCGATTTAC CTGTTTTCGCACCTACCATCAGGGACAGGATGACCTGGAGAACTTAGGTGGCAAGCTGTGACTTCTCCAGG TCTCACGGGCATGGGCACTCCCTTGGTGGCAAGAGCCCCCTTGACACCGGGGTGGTGGGAACCATGAAGAC AXGATXGGGGCTGGCCTCTGGCTCTCATGGGGTCCAAGTTTTGTGTATTCTCAACCTATTGACAGACTGAA

ACACAATATGAC

-29CZ 281542 B6

V tabulce VI je počátečním kontinuálním sledem DNA horní sled o 620 bázích, který je zřejmě nepřeneseným sledem, bezprostředně předcházejícím přenesené části genu pro lidský EPO. Sled zřejmě obsahuje 5’-zakončeni genu a potom přenesenou oblast DNA, která je kódem pro první čtyři aminokyseliny (-27 až -24) vedoucího nebo předběžného sledu. Čtyři páry bází ve sledu před sledem, který je kódem pro začátek vedoucího sledu nebyly jednoznačně stanoveny a jsou proto označeny jako X. Potom následuje intron o 639 párech bází (439 párů bází z tohoto sledu bylo prokázáno, zbývajících 200 je označeno I.S.) a potom kodon pro glutamin, který byl označen polohou -23 v přeneseném polypeptidů. Sled exonu, který bezprostředně následuje je kódem pro zbytky aminokyselin od alaninového zbytku (označeného jako zbytek +1 sledu aminokyselin úplného lidského EPO) do kodonu pro theonin v poloze +26, potom následuje druhý intron, sestávající z 256 bází, jak je označeno. Za tímto intronem následuje exon pro zbytky aminokyselin v poloze 27 až 55 a potom třetí intron o 612 párech bází. Následující exon je kódem pro zbytky 56 až 115 lidského EPO a potom následuje čtvrtý intron o 134 bázích, jak je uvedeno. Za ním následuje exon, který je kódem pro zbytky 116 až 166 a stop kodon (TGA). V tabulce VI je uveden sled 568 párů bází, v němž se zřejmě nachází nepřenesená 3'-oblast lidského EPO-genu a dva páry bází v tomto genu (X) ještě nebyly plně identifikovány.

Tabulka VI tedy slouží k identifikaci primární struktury (sledu aminokyselin) úplného lidského EPO včetně 166 plně specifikovaných aminokyselinových zbytků (stanovená molekulová hmotnost 18 399). Jak je v tabulce uvedeno, je sled DNA kódem pro signální sled o 27 zbytcích spolu s 5'- a 3'- DNA sledy, které mohou být významné pro funkci promotor/operátor operonu lidského genu. Místa pro potenciální glykosylaci úplného lidského EPO polypeptidů jsou v tabulce označena hvězdičkami. Je nutno uvést, že specifický sled aminokyselin, uvedený v tabulce VI pravděpodobně představuje sled přírodně se vyskytující alelové formy lidského erythropoetinu. Podporu pro toto tvrzení je možno nalézt ve výsledcích soustavných výzkumů sledů lidského erythropoetinu, izolovaného z moči, jimiž bylo prokázáno, že podstatné množství molekul erythropoetinu obsahuje methionin v poloze 126 na rozdíl od šeřinu, který je uveden v tabulce.

V tabulce VII je uveden rozsah homologie sledu mezi lidským a opičím erythropoetinem. V horní kontinuální linii tabulky je užito jednotlivých písmen k označení sledu lidského polypeptidů po translaci, začíná se polohou -27, spodní kontinuální linie uvádí sled pro opičí erythropoetin, začíná se opět místem, označeným polohou -27. K osvětleni homologie jednotlivých sledů je užito hvězdiček. Je nutno se zmínit o tom, že sledy lidského a opičího EPO prokazují přídatný lysinový (K) zbytek v poloze 116 lidského erythropoetinu. Při srovnání s tabulkou VI je zřejmé, že tento zbytek leží na hranici spojeni ve sledu genomu (mRNA). Přítomnost lysinového zbytku ve sledu lidského polypeptidu byla dále ověřena zjištěním sledu lidské cDNA v klonu, získaném pomocí mRNA, izolované z buněk COS-1, transformovaných pomocí DNA lidského genomu tak, jak je uvedena v příkladu 7, který bude dále uveden.

-30CZ 281542 B6

Tabulka VII

Srovnání lidského a opičího EPO

-20 -10 *1 10 20 3040

Lidsky MGVHECPAWLWLLLSLLSLPLGLPVLGAPPRLICOSRVLERYLLEAKEAENITTGCAEHCSLNENITVPDTK «««««*«««««««·«« «««««««« *«««·««*««***«**«««·«««*« · «* * «··«··«**«·««

Opicí MGVHECPAWLWLLLSLVSLPLGLPVPGAPPRLICOSRVLERYLLEAKEAENVTMGCSESCSLNENITVPOTK

60 70 80 90 100110

Lidský VNFYAWKRMEVGQQAVEVWQGLALLSEAVLRGQALLVNSSQPWEPLQLHVOKAVSGLRSLTTLLRALGAQKE *««««*«**««««**««*«*«***««***««*** * ·«·«« «««««« ««* **·«* «·*««·**«« «

Opičí VNFYAWKRMEVGQQAVEVWQGLALLSEAVLRGQAVLANSSqPFEPLQLHMOKAISGLRSITTLLRALGAQ-E ,, 120 130 140 150160

Lidsky AISPPOAASAAPLRTitaotfrklfrvysnflrgklklytgeacrtgor ·«« «··«««··*«««««««* «*«·««·«««··««««·«««««· «««

Opičí AISLPDAASAAPLRTITADTFCKLFRVYSNFLRGKLKLYTGEACRRGOR

-31~

Příklad 6

Systém pro expresi, který byl zvolen pro počáteční pokusy uskutečnit mikrobiální syntézu izolovatelných množství erythropoetinu, pro nějž je kódem opičí příslušná cDNA a který je uveden v příkladu 3 byl systém, při němž bylo užito jako hostitele savčích buněk (tj. buněk COS-1, ATCC č. CRL-1650). Tyto buňky byly podrobeny transfekci vektorem, který umožňoval i autonomní replikaci v E. coli jako hostiteli (vzhledem k přítomnosti DNA, odvozené od plasmidu pBR322) i replikaci v buňkách savců (vzhledem k přítomnosti DNA, odvozené od viru SV40).

kilobází pomocí enzymů HindlII a Sall. L Laboratories) byl působením enzymů EcoRI fragment o velikosti přibližně 30 párů obsahoval postupně zakončení po štěpení potom následovala místa pro štěpení Smál, BamHI a Xbal a zakončení schopné opětné vazby. Všechny tři čímž byl kilobází,

DNA pro erythropoetin byla na míst pro působení různých restenzymů. Plasmid pERS byl potom štěpen enzymy HindlII čímž byla získána DNA pro EPO a vazný řetězec EcoRI až o 1,4 párech bází byl navázán na fragkilobázích po štěpení enzymy BamHI řetězec, získaný štěpením M13mpl0 RF přibližně 30 párech bází. Tento druhý na jednom zakončení místo po působení opětné vazby, toto místo bylo následorestrikčních enzymů Pstl, Sall, Xbal

Podrobněji uvedeno, vektor pro expresi byl konstruován následujícím způsobem. Klon 83 plasmidu, v příkladu 3 byl podroben amplifikaci v E. coli s DNA o přibližně 1,4 kilobází, která je kódem pro opičí erythropoetin byla izolována pomocí štěpení enzymy EcoRI a HindlII. Odděleně byl izolován fragment z pBR322 o velikosti přibližné 4,0 Z DNA M13mpl0 RF (P a a Sall získán vazný bází. Tento fragment EcoRI, schopné opětné vazby, enzymy Sstl, Smál, BamHI a Xbal a zakončení po štěpení enzymem Sall, schopné opětné vazby. Všechny tři shora uvedené fragmenty byly navázány, čímž byl jako meziprodukt získán plasmid (pERS) o přibližně 5,4 kilobází, v němž jedné straně ohraničena skupinou rikčních a Sall, i Sall (M13mpl0). Fragment ment plasmidu pBR322 o 4,0 a Sall enzymy vazný enzymu váno místy pro působení a potom následovalo zakončení po štěpení enzymem BamHI s možností opětné vazby. Produktem vazby byl opět užitečný plasmid (pBR-EPO), který obsahoval DNA pro erythropoetin, který byl na obou stranách ohraničen řetězci s celou řadou míst pro působení různých restrikčních enzymů.

a na další vazný HindlII a BamHI o řetězec z M13 měl HindlII s možností

Vektor, který byl užit pro expresi DNA pro erythropoetin v buňkách COS-1 (pDSVLl) byl konstruován tak, aby dovoloval selekci a autonomní replikaci v E. coli. Tyto vlastnosti uvedeného vektoru jsou zajišťovány počátkem replikace a sledem DNA, který je kódem pro odolnost proti ampicillinu, který je uložen mezi nukleotidy 2448 a 4362 ve sledu plasmidu pBR322. Tento sled byl strukturně modifikován přidáním pomocného vazného řetězce tak, aby vzniklo místo pro působení restrikčního enzymu HindlII bezprostředné v sousedství nukleotidu 2448 před včleněním do vektoru. Z užitečných vlastností zvoleného vektoru je zapotřebí uvést zejména schopnost autonomní replikace v buňkách COS-1 a přítomnost sledu promotoru viru, funkčního v buňkách savců. Tyto vlastnosti jsou zajišťovány sledem DNA pro počátek replikace a sledem virového promotoru, jehož délka je 342 párů bází a zasahuje od polohy 5171 sledu do polohy 270 genomu SV40. Ve vektoru se nachází jediné místo pro působení restrikčního enzymu (BamHI) a v těs

-32CZ 281542 B6 né blízkosti virového promotoru je navázán běžně dodávaný vazný sled (Collaborative Research). Ve vektoru je včleněn také sled o 237 párech bází (poloha nukleotidů 2553 až 2770 SV40) s obsahem mRNA virového polyadenylačního signálu (obvykle uváděný jako terminátor transkripce). Tento fragment byl do vektoru uložen ve správné orientaci vzhledem k virovému promotoru pomocí jediného místa pro působení restrikčního enzymu BamHI. Ve vektoru je také přítomen další gen savce v poloze, která není rozhodující pro potenciální transkripci genu, včleněného v jediném místě působení BamHI, mezi virovým promotorem a terminačním sledem (tímto genem byl gen o přibližně 2500 párech bází pro myší dihydrofolátreduktázu (DHRF), izolovaný z plasmidu pMG-1 způsobem, popsaným v publikaci Gasser a další, PNAS (USA) 79, str. 6522 až 6526 (1982)). Hlavní operativní složky plasmidu pDSVLl jsou v nukleotidech 2448 až 4362 plasmidu pBR322 spolu s nukleotidy 5171 až 270 (342 párů bází) a 2553 až 2770 (237 párů bází) DNA SV40.

Podle shora uvedených postupů, popsaných například v uvedené publikaci Maniatise a dalších byla izolována DNA, která je kódem pro erythropoetin z plasmidu pBR-EPO jako fragment po štěpení enzymem BamHI a potom byla včleněna do plasmidu pDSVLl po jeho rozštěpení enzymem BamHI. Analýza restrikčními enzymy byla použita k potvrzení včlenění genu pro erythropoetin ve správné orientaci ve dvou z výsledných klonovaných vektorů (vektory H a L). Tyto skutečnosti jsou zřejmé i z obr. 2, kde je znázorněn plasmid pDSVL-MkE. Vektory s geny EPO v nesprávné orientaci byly uchovány jako negativní kontroly pro pokusy s transfekcí, při nichž běží o stanovení úrovně exprese EPO v hostiteli, transformovaném vektory, které obsahují DNA pro erythropoetin ve správné orientaci.

Přiklad 7

A. Počáteční systém pro expresi EPO, buňky COS-1

Systém, který byl zvolen pro počáteční pokusy s mikrobiální syntézou izolovatelných množství lidského erythropoetinu, pro nějž je kódem DNA lidského genomu také zahrnoval expresi v buňkách savců jako v hostitelských buňkách (tj. v buňkách COS-1, ATCC č. CRL-1650). Gen pro lidský EPO byl nejprve podroben počátečnímu klonování ve vektoru, který je schopen autonomní replikace v obou hostitelích E. coli (vzhledem k přítomnosti DNA z plasmidu pBR322) i v buněčné linii savců COS-1 (vzhledem k přítomnosti DNA, odvozené od viru SV40). Tento vektor s obsahem genu pro erythropoetin byl potom vnesen do buněk COS-1. Polypeptidový materiál typu EPO byl potom buňkami po provedené transfekcí produkován a vylučován do prostředí, v němž byly buňky pěstovány.

Vektor pro expresi byl tedy zkonstruován následujícím způsobem: DNA, izolovaná z lambda klonu XhEl s obsahem genu pro EPO lidského genomu byl rozštěpen působením restrikčních enzymů BamHI a HindlII a byl izolován fragment o 5,6 kbází, o němž bylo známo, že obsahuje úplný gen pro erythropoetin. Tento fragment byl navázán na bakteriální plasmid pUC8 (Bethesda Research Laboratories lne.), který byl rozštěpen obdobným způsobem, čímž vznikl intermediární plasmid (pUC8-HuE, který se tak stal vhodným zdrojem uvedeného restrikčního fragmentu.

Vektor, který byl zvolen pro expresi DNA pro EPO v buňkách COS-1 (pSV4SEt) byl zkonstruován již dříve. Jde o plasmid, který obsahuje sled DNA, dovolující selekci a autonomní replikaci v buňkách E. coli. Tyto vlastnosti jsou zajišťovány sledy DNA pro počátek replikace a pro odolnost proti ampicillinu, které jsou přítomny v oblasti, která zasahuje od nukleotidu v poloze 2448 do nukleotidu v poloze 4362 bakteriálního plasmidu pBR322, tento sled byl potom strukturně modifikován přidáním vazného řetězce s místem pro působení restrikčního enzymu HindlII bezprostředně v blízkosti polohy 2448. Plasmid pSV4SEt je také schopen autonomní replikace v buňkách COS-1. Tato vlastnost je zajišťována fragmentem o 342 párech bází s obsahem počátku pro replikaci z viru SV40 (nukleotidy v -polohách 5171 až 270). Tento fragment byl potom modifikován přidáním vazného řetězce s místem pro působení restrikčního enzymu EcoRI v bezprostřední blízkosti nukleotidu 270 a vazného řetězce s místem pro působení Sáli v bezprostřední blízkosti nukleotidu 5171. V tomto vektoru je včleněn také fragment o 1061 párech bází z viru SV40 (nukleotidy 1711 až 2772 s vazným řetězcem s místem pro působení enzymu Sáli v bezprostřední blízkosti nukleotidu 2772). V tomto fragmentu se nachází jediné místo pro působení restrikčního enzymu BamHI. Celkové je možno uvést, že plasmid pSV4SEt obsahuje jediné místo pro působení BamHI a HindlII a dovoluje tak včlenění genu pro lidský erythropoetin, sledů, dovolujících replikaci a selekci v E. coli a sledy, dovolující replikaci v buňkách COS-1.

včlenit gen pro lidský erythropoetin do plasplasmid pUC8-HuE rozštěpen působením enzymů izolován fragment o 5,6 kbází s DNA pro Plasmid pSV4SEt byl také rozštěpen enzymy a byl izolován hlavní fragment o 2513 párech obsahoval všechny nutné funkce. Tyto fragmenty byly vzájemně navázány, čímž vznikl výsledný vektor tak, jak je znázorněn na obr. 3. Tento vektor byl E. coli a byla izolována DNA tohoto vektoru. Potom

Aby bylo možno midu pSV4SEt, byl BamHI a HindlII a byl lidský erythropoetin. BamHI a HindlII bází, který smíseny a pSVgHuEPO propagován v bylo užito analýzy pomocí restrikčnich enzymů k potvrzení včlenění genu pro EPO.

Plasmid pSVgHuEPO byl užit pro expresi lidského EPO v buňkách COS-1. DNA tohoto plasmidu byla kombinována s nosnou DNA a byla provedena transfekce vždy v trojnásobném opakování na plotnách s buňkami COS-1 o rozměrech 60 mm. Jako kontroly bylo užito nosné DNA, u níž byla také provedena transfekce do buněk COS-1. Prostředí kultur bylo odebíráno po pěti a po sedmi dnech a bylo zkoumáno na přítomnost polypeptidů s vlastnostmi přírodně se vyskytujícího lidského EPO, zejména pokud jde o vlastnosti imunologické.

B. Druhý systém pro expresi EPO při použití buněk COS-1

Byl konstruován ještě další systém pro zlepšenou produkci lidského erythropoetinu, pro nějž je kódem DNA pro EPO lidského genomu v buňkách COS-1 (ATCC č. CRL-1650).

V předchozím systému bylo dosaženo exprese EPO v buňkách COS-1 při použití jeho vlastního promotoru, nacházejícího se v oblasti restrikčního fragmentu po působení enzymu BamHI a HindlII s velikostí 5,6 kbází. Při následující konstrukci byl

-34CZ 281542 B6 gen pro EPO pozměněn tak, že k jeho expresi dochází použitím promotoru viru SV40.

Klonovaný restrikční fragment EPO lidského genomu o 5,6 kbázích po štěpení enzymy BamHI až HindlII byl modifikován následujícím způsobem. Plasmid pUC8-HuE, popsaný shora byl rozštěpen enzymem BamHI a BstEII. Restrikční enzym BstEII štěpí fragment EPO o 5,6 kbázích v poloze, která se nachází 44 párů bází 5' k počátku ATG kódu pro předběžný peptid a přibližně 680 párů bázi 3' k místu pro štěpení restrikčním enzymem HindlII. Byl izolován fragment o přibližně 4900 párech bází. Byl také synthetizován a čištěn vazný fragment se zakončeními, schopnými vazby v místech po štěpení enzymy Sall a BstEII s místem pro štěpení enzymem BamHI uvnitř fragmentu. Oba fragmenty byly smíseny a vázány na plasmid pBR322, který byl rozštěpen restrikčními enzymy Sall a BamHI za vzniku intermediárního plasmidu pBRgHE. Gen pro EPO lidského genomu byl potom izolován jako fragment o 4900 párech bází po štěpení enzymem BamHI, fragment obsahoval úplný strukturální gen s jediným ATG v místě 44 párů bází 3’ od místa působeni enzymu BamHI v blízkosti zakončení kódové oblasti s aminoskupinou na konci.

Tento fragment byl izolován a včleněn jako fragment schopný vazby po štěpení enzymem BamHI do plasmidu pDSVLl, popsaného v příkladu 6 jako do vektoru pro expresi, rozštěpeném enzymem BamHI. Výsledný plasmid pSVLgHuEPO, který je znázorněn na obr. 4 byl užit k expresi polypeptidového materiálu typu EPO v buňkách COS-1 způsobem podle příkladů 6 a 7A.

Příklad 8

Živné prostředí, v němž byly pěstovány buňky COS-1 (šest kultur po transfekci podle příkladu 6) bylo analyzováno radioimunologicky způsobem podle příkladu 2, část B. Jednotlivé vzorky obsahovaly 250, 125, 50 a 25 μΐ uvedeného prostředí. Supernatanty kultur, které obsahovaly vektory s nesprávnou orientací genu EPO byly jednoznačně negativní. Pro vzorky dvou supernatantů z kultur buněk COS-1 po transfekci vektory (H a L), které obsahovaly DNA pro EPO ve správné orientaci se pohybovalo procento inhibice ¹²⁵I-EPO vázaného na protilátku v rozmezí 72 až 88 %, všechny hodnoty se tedy pohybovaly na vrcholu standardní křivky. Přesná koncentrace EPO v kultuře nemohla být snadno přesně stanovena. Ze vzorku s obsahem 250 μΐ supernatantu bylo odhadnuto, že obsah EPO je minimálně 300 mjednotek/ml.

Supernatant, získaný z kultury podle příkladu 6 a z pět a sedm dní staré kultury podle příkladu 7A byly zkoumány RIA, aby bylo možno srovnat účinnost rekombinantního opičího a lidského EPO a přírodně se vyskytujícího EPO jako standardu, výsledky jsou uvedeny v grafické formě na obr. 1. Jak bylo možno očekávat, došlo ke kompetici rekombinantního opičího EPO vzhledem k protilátce proti lidskému EPO, přestože inhibice nebyla za podmínek pokusu úplná. Maximální hodnoty inhibice v procentech pro rekombinantní lidský EPO se však blížily hodnotám pro standardní lidský EPO. Protože křivky pro dávku a odpověď mají paralelní průběh, je

-35CZ 281542 B6 možno soudit na imunologickou identitu sledů (epitopů). Původní výsledky pro opičí EPO byly znovu vyhodnoceny a byly získány hodnoty v rozmezí 2,91 až 3,12 jednotek/ml. Zjištěné množství lidského EPO byly ve vzorku po pětidenním pěstování 392 m jednotek v ml a 567 m jednotek/ml ve vzorku, který byl pěstován 7 dní. Stanovená množství opičího EPO podle příkladu 7B byla stejného řádu nebo o něco vyšší.

Příklad 9

Živné prostředí z kultur připravených podle příkladu 6 a 7 bylo podrobeno zkouškám in vitro na účinnost EPO způsobem, popsaným v publikaci Goldwasser a další, Endocrinology 97, č. 2, str. 315 až 323 (1975). Stanovené hodnoty pro opičí EPO v živném prostředí zkoumaných kultur bylo v rozmezí 3,2 až 4,3 jednotek/ml. Živné prostředí kultur s obsahem lidského EPO bylo také při tomto sledování účinné a mimoto účinnost těchto prostředí mohla být neutralizována protilátkou proti EPO. Živné prostředí z rekombinantních kultur opičího EPO podle příkladu 6 bylo také zkoumáno na biologickou účinnost in vivo způsobem, popsaným v publikaci Cotes a další, Nátuře, 191, str. 1065 až 1067 (1961) a podle publikace Hammond a další, Ann. N. Y. Acad, Sci. 149, str. 516 až 527 (1968) a byla zjištěna účinnost 0,94 až 1,24 jednotek/ml.

Příklad 10

V předchozích příkladech byl rekombinantní lidský nebo opičí materiál typu EPO získán pomocí vektorů, užitých k transfekci buněk COS-1. Dochází přitom k replikaci těchto vektorů v buňkách COS-1 vzhledem k přítomnosti T-antigenu SV40 v buňce a počátku replikace SV40 ve vektoru. Přestože je možno při použití těchto vektorů získat použitelná množství EPO z buněk COS-1, je tato exprese pouze přechodná (7 až 14 dní), protože po čase dochází ke ztrátě vektoru. Mimoto pouze malé procentuální množství COS-1 je po transfekci schopno produkovat příslušný materiál. Dále bude popsán systém pro expresi s použitím ovariálních buněk [CHO] DHFR“ čínského křečka a selekce schopného označení, DHFR. Popis příbuzných systémů pro expresi je uveden v U. S. Letters Patent č. 4 399 216 a v evropských patentových spisech č. 117 057, 117 059 a 117 060, uveřejněných 29. srpna 1984.

Buňky CHO DHFR“ [buňky (DuX-Bll) CHO Kl] byly popsány v publikaci Urlaub a další, Proč. Nat. Acad. Sci. USA, sv. 77, 4461 (1980), tyto buňky postrádají enzym dihydrofolátreduktázu (DHFR) vzhledem k mutacím strukturálního genu a proto vyžadují přítomnost glycinu, hypoxanthinu a thymidinu v živném prostředí. Plasmidy pDSVL-MkE (přiklad 6) nebo pDSVL-gHuEPO (příklad 7B)_ byly podrobeny transfekci spolu s nosnou DNA do buněk CHO DHFR“ rostoucích v prostředí s obsahem hypoxanthinu, thymidinu a glycinu na plotnách o rozměrech 60 mm. Plasmid pSVgHuEPO (příklad 7A) byl smísen s plasmidem pMG2 s obsahem genu pro myší dihydrofolátreduktázu, klonovaného v bakteriálním plasmidu pBR322 jako vektoru (podle shora uvedené publikace Gassera a dalších). Směs plasmidu a nosné DNA byla přenesena do buněk CHO DHFR“ (buňky s obsahem

-36CZ 281542 B6 tohoto plasmidu obvykle obsahuj i i druhý plasmid). Po třech dnech byly buňky dispergovány působením trypsinu na několik ploten o rozměru 100 mm v prostředí bez obsahu hypoxanthinu a thymidinu. Pouze ty buňky, které byly nastálo transformovány genem DHFR, a tím i genem EPO na tomto prostředí přežívají. Po 7 až 21 dnech je možno pozorovat kolonie přežívajících buněk. Tyto kolonie transformantů je možno po dispersi trypsinizací kontinuálně pěstovat na prostředích bez hypoxanthinu a thymidinu, čímž se získají nové buněčné kmeny (například CHO pDSVL-MkEPO, CHO pSVgHuEPO, CHO—pDSVL-gHuEPO).

Kapalný materiál z pěstování shora uvedených kmenů buněk byl zkoušen RIA na přítomnost rekombinantniho opičího nebo lidského EPO. Prostředí pro kmen CHO pDSVL-MkEPO obsahovalo EPO s imunologickými vlastnostmi obdobnými materiálu, který byl získán z buněk COS-1 po transfekci plasmidem pDSVL-MkEPO. Kapalný materiál, odebraný z kultury po pěstování 65 hodin obsahoval EPO opice v koncentraci 0,60 jednotek/ml.

Kapalný materiál z CHO pSVgHuEPO a CHO pDSVL-gHuEPO obsahoval lidský EPO s imunologickými vlastnostmi obdobnými materiálu, který byl získán při použití buněk COS-1 po transfekci plasmidem pSVgHuEPO nebo pDSVL-gHuEPO. Kapalný podíl 3 dny staré kultury CHO pSVgHuEPO obsahoval 2,99 jednotek/ml lidského EPO a 5,5 dní pěstovaný vzorek CHO pDSVL-gHuEPO obsahoval 18,2 jednotek/ml lidského EPO, měřeno RIA.

Množství EPO, produkované shora uvedenými buněčnými kmeny je možno zvětšit amplifikací genu za vzniku nového buněčného kmene s vyšší produktivitou. Enzym dihydrofolátreduktáza (DHFR), který je produktem, pro néjž je kódem gen DHFR může být inhibována methotrexátem (MTX). Buňky, pěstované v prostředí bez hypoxanthinu a thymidinu je tedy možno zbrzdit v růstu až usmrtit MTX. Za vhodných podmínek (například minimální koncentrace MTX) se mohou buňky stát odolnými a schopnými růstu v přítomnosti MTX. Odolnost těchto buněk proti MTX je způsobena amplifikací počtu jejich genů DHFR, a tím i vyšší produkcí enzymu DHFR. Přežívající buňky je potom možno zpracovávat působením stoupajícího množství MTX, čímž je možno získat buněčné kmeny, které obsahují větší počet genů DHFR. Gen, nesený” vektorem pro expresi (například gen pro EPO) současně s genem DHFR nebo transformovaný genem DHFR obvykle také zvýší počet svých kopií.

Jako praktický přiklad této amplifikace je možno uvést případ, při němž byl buněčný kmen CHO pDSVL-MkE podroben vlivu stoupající koncentrace MTX (0 nM, 30 nM a 100 nM). Po 65 hodinách působení jednotlivých koncentrací byly kultury sledovány RIA a bylo možno prokázat, že kapalný materiál obsahuje 0,60, 2,45 a 6,10 jednotek v ml. Buněčný kmen CHO pDSVL-gHuEPO byl potom podroben působení stoupajících koncentrací MTX 30 nM, 50 nM, 100 nM, 200 nM, 1 μΜ, 5 μΜ MTX. Po třech dnech pěstování obsahoval kapalný materiál z kultury, na niž bylo působeno 100 nM MTX lidský EPO v koncentraci 3089 ± 129 jednotek/ml podle stanovení RIA. 48 hodin pěstované vzorky po působení 100 nM a 1 μΜ MTX obsahovaly lidský EPO v množství 466 a 1352 jednotek/ml podle stanoveni RIA (průměr ze tří stanoveni). Při provádění těchto postupů byla užita koncentrace 1 x 10⁶ buněk v 5 ml prostředí při použití plo

-37CZ 281542 B6 ten o průměru 60 mm. Po 24 hodinách bylo prostředí odstraněno a nahrazeno 5 ml prostředí bez séra (DMEM s vysokou koncentrací glukózy s 0,1 mM neesenciálních aminokyselin a L-glutaminu). Po 48 hodinách bylo sledováno nahromadění EPO v prostředí bez séra. Prostředí bylo odebráno pro analýzu RIA a buňky byly podrobeny působení trypsinu a počítány. Průměrné hodnoty RIA byly 467 jednotek/ml a 1352 jednotek/ml, pro buňky, pěstované při koncentraci 100 nM a 1 μΜ MTX byly hodnoty 2335 jednotek/plotna a 6750 jednotek/plotna. Průměrný počet buněk na plotně byl 1,94 χ 10⁶ a 3,12 χ 10⁶. Účinnost produkce tedy byla 1264 a 2167 jednotek/10⁶ buněk za 48 hodin.

Buňky, obsažené ve shora uvedených kulturách jsou geneticky heterogenní populace. Byly použity standardní postupy k izolaci geneticky homogenních klonů s nejvyšší produkční kapacitou. Tyto postupy jsou uvedeny v Points to Consider in the Characterization of Cell Lineš ušed to Produce Biologics, Oddíl A, část 2, 1. června 1984, Office of Biologics Research Review, Center for Drugs and Biologics, U. S. Food and Drug Administration.

Produktivita buněčných linií EPO produkujících buněk CHO může být zlepšena příslušným zásahem do pěstování kultur. Pěstování savčích buněk v kultuře obvykle vyžaduje přítomnost séra v živném prostředí. Způsob produkce buněk savců v kultuře obvykle vyžaduje přítomnost séra v růstovém prostředí. Způsob produkce erythropoetinu z buněk CHO v prostředí, které sérum neobsahuje podstatně usnadní izolaci erythropoetinu z živného prostředí. Tento způsob tedy zaručuje hospodárné získávání erythropoetinu v prostředích, která neobsahují sérum ve velkých množstvích.

Buňky kmene CHO pDSVL-gHuEPO, pěstované za standardních podmínek se užijí k naočkování baněk, vhodných k přímému odstředění v prostředí, které sestává ze směsi 50 : 50 z prostředí DMEM s vysokým množstvím glukózy a z prostředí Hamova F12, doplněného 5 % fetálního séra, L-glutaminem a také Penicillinem, streptomycinem, 0,05 mM neesenciálních aminokyselin a příslušnou koncentrací methotrexátu. Pěstování buněk v suspenzi dovoluje využít velkého objemu buněk CHO, produkujících EPO. Buňky CHO, pěstované v suspenzi se potom užijí k naočkování větších baněk o objemu 850 ml s obsahem 200 ml prostředí. Buňky se ponechají růst až do vzniku souvislé vrstvy jako ke stěně lnoucí vrstva po dobu tří dnů. Prostředí, použité v této fázi je totéž jako prostředí, užité k růstu buněk v suspenzi. Na konci třídenního období růstu se prostředí obsahující sérum odstraní a nahradí se 100 ml prostředí, které je séra prosté. Jde o směs 50 : 50 prostředí DMEM s vysokým obsahem glukózy a Hamova prostředí F12, doplněného 0,05 nM neesenciálních aminokyselin a glutaminu. Baňky se opět vrátí do inkubačního zařízeni na 1 až 3 hodiny, prostředí se znovu odstraní a nahradí se 100 ml čerstvého prostředí, prostého séra. Inkubace s prostředím prostým séra na dobu 1 až 3 hodiny sníží koncentraci kontaminujících sérových bílkovin. Potom se baňky znovu vrátí do inkubátoru na dobu sedm dní, tuto dobu se hromadí erythropoetin v živném prostředí, prostém séra. Na konci sedmidenního období se prostředí odstraní a nahradí se čerstvým prostředím, prostým séra pro druhý produkční cyklus. Po sedmi dnech může obsahovat takto získaný vzorek například 3892 ± 409 jednotek/ml lidského erythropoetinu podle údajů RIA. Vzhledem

-38CZ 281542 B6 k stanovené hustotě buněk 0,9 až 1,8 χ 10⁵ buněk v ml obsahuje každá baňka 0,75 až 1,5 χ 10θ buněk a produkce EPO ve 100 ml kultury tedy byla 750 až 1470 jednotek/10⁶ buněk za 48 hodin.

Živné prostředí z pěstování buněčného kmene CHO pDSVL-MkEPO za přítomnosti 10 nM MTX bylo podrobeno RIA in vitro a byla sledována také účinnost in vivo. Vzorek prostředí obsahoval 41,2 ±

1,4 jednotek/ml MkEPO při měření RIA, 41,2 ± 0,064 jednotek/ml při měření účinnosti in vitro a 42,5 ± 5 jednotek/ml při měření biologické účinnosti in vivo. Sledování polypeptidového řetězce produktů prokázalo přítomnost látek typu EPO, šlo o látky s obsahem tří zbytků signálního sledu za aminoterminálním zbytkem alaninu. Prozatím není jasné, zda běží o nesprávnou výrobu polypeptidu v membráně buněk CHO nebo o odraz různosti struktury aminoterminálního zakončení opičího a lidského EPO.

Prostředí z pěstování kmene CHO pDSVL-gHuEPO bylo podrobeno třem typům zkoušek. Vzorek po pěstování 5,5 dní obsahoval rekombinantní lidský EPO v prostředí v koncentraci 18,2 jednotek/ml při stanovení RIA, 15,8 ± 4,6 jednotek/ml při stanovení in vitro a 16,8 ± 3,0 jednotek/ml při stanovení in vivo.

Prostředí z pěstování buněk CHO pDSVL-gHuEPO s aplifikovaným genem po použití 100 nM MTX bylo také podrobeno všem třem zkouškám. Po pěstování 3 dny vzorek obsahoval rekombinantní lidský EPO v koncentraci 3089 ± 129 jednotek/ml při stanoveni RIA, 2589 ±

71,5 jednotek/ml při stanovení in vitro a 2040 ± 160 jednotek/ml při stanovení in vivo. Při stanovení sledu aminokyselin bylo možno prokázat aminoterminálni zakončení, znázorněné v tabulce VI.

Prostředí z pěstováni buněk CHO po transfekci plasmidem pDSVL-MkE za přítomnosti 10 nM MTX bylo slito a MTX byl dialyzován několik dní, čímž bylo získáno prostředí s koncentrací EPO 221 ± 5,1 jednotek/ml (EPO/CCM), aby bylo možno stanovit účinnost EPO/CCM in vivo na úroveň hematokritu u normálních myši Balc/C byl proveden následující pokus: Prostředí z pěstování buněk CHO (CCM) a EPO-CCM bylo upraveno přidáním PBS. CCM byl užit pro kontrolní skupinu tří myší a pro experimentální skupiny (2 myši ve skupině) byly užity dvě koncentrace, a to 4 jednotky a 44 jednotek v jedné dávce. V průběhu 5 týdnů byla tato dávka podávána myším 3x týdně intraperitoneálně. Po osmé injekci byla průměrná hodnota hematokritu pro kontrolní skupinu 50,4 %, pro skupinu s podáváním 4 jednotek 55,1 % a pro skupinu s podáváním 44 jednotek 67,9 %.

Produkty exprese buněk savců je možno snadno izolovat ve v podstatě čisté formě z živného prostředí při použití vysokotlaké kapalinové chromatografie (C₄) a ethanolového gradientu, s výhodou při pH 7.

Byly provedeny předběžné pokusy pro stanovení vlastností rekombinantních glykoproteinových produktů z upraveného prostředí po expresi buňkami COS-1 a CHO lidského genu pro EPO ve srovnání s izoláty lidského EPO z moči při použití různých typů analýzy (SDS-PAGE). Tyto studie ukazují, že EPO, produkovaný buňkami CHO má poněkud vyšší molekulovou hmotnost než produkt exprese buňkami COS-1, který měl molekulu poněkud větší než produkt, získaný

-39CZ 281542 B6 z moči. Všechny produkty byly poněkud heterogenní. Po působení enzymu neuraminidázy k odstranění kyseliny sialové byly získány rekombinantni produkty exprese buňkami COS-1 a CHO s přibližně stejnou molekulovou hmotností, které však měly větší molekulovou hmotnost než asialoprodukt z lidské moči. Působením Endoglykosidázy F (EC 3.2.1) na rekombinantni produkt z buněk CHO a na produkt z moči (k úplnému odstranění uhlohydrátů z obou produktů) byl získán v podstatě homogenní produkt v obou případech s identickou molekulovou hmotností.

Čištěný produkt z lidské moči a rekombinantni produkt z buněk CHO, získaný způsobem podle vynálezu byly podrobeny analýze uhlohydrátů způsobem podle publikace Ledeen a další, Methods in Enzymology, 83 (část D) 139-191 (1982) po modifikaci použitím hydrolýzy podle publikace Nesser a další, Anal. Biochem. 142, 58 až 67 (1984). Experimentálně stanovené hodnoty, vyjádřené jako molárni poměr uhlohydrátů v produktu pro látku izolovanou z moči byly následující: hexózy 1,73, N-acetylglukosamin 1, kyselina N-acetylneuraminová 0,93, fukóza 0, N-acetylgalaktosamin 0. Odpovídající hodnoty pro rekombinantni produkt (z buněk CHO pDSVL-gHuEPO po třídenním pěstování za přítomnosti 100 nM MTX) byly následující: hexózy 15,09, N-acetylglukosamin 1, kyselina acetylneuraminová 0,998, fukóza 0 a N-acetylgalaktosamin 0. Tyto hodnoty jsou v souladu s analytickými údaji.

Je tedy zřejmé, že produkty, vyrobené způsobem podle vynálezu odpovídají svou strukturou přírodně se vyskytujícímu erythropoetinu a mají také jednu nebo větší počet jeho biologických vlastností při složení uhlohydrátů které je od přírodně se vyskytujícího se erythropoetinu poněkud odlišné.

Příklad 11

Byly prováděny pokusy s úplnou konstrukcí nukleotidových bází dvou strukturálních genů, které, jak je zřejmé z tabulky VI, jsou kódem pro lidský EPO za současného včlenění výhodných kodonů pro expresi v E. coli a pro expresi v kvasinkách S. cerevisiae. Na základě těchto stanovení je možno zkonstruovat geny, které jsou kódy pro analogy lidského EPO. Provedení odpovídalo způsobu, popsanému Altonem a dalšími (WO 83/04053). Geny byly sestaveny jako mnohočetné dvojice, které bylo možno rozdělit do tří skupin. Tyto skupiny byly určeny k amplifikaci a bylo z nich možno sestavit mnohonásobnou vazbou fragmentů vhodný vektor pro expresi.

V následujících tabulkách VIII až XIV jsou znázorněny konstrukce takto získaného genu, který je kódem pro lidský EPO jako pro produkt translace bez signálního nebo předběžného sledu, avšak s počátečním methioninovým zbytkem v poloze -1. Mimoto jsou do genu včleněny z podstatné části kodony, které jsou preferenční pro E. coli, proto byl tento gen nazván ECEPO.

-40CZ 281542 B6

Tabulka VIII

Oligonukleotidy ECEPO úsek 1

1.	AATTCTAGAAACCATGAGGGTAATAAAATA
2.	CCATTATTTTATTACCCTCATGGTTTCTAG
3.	ATGGCTCCGCCGCGTCTGATCTGCGAC
4.	CTCGAGTCGCAGATCAGACGCGGCGGAG
5.	TCGAGAGTTCTGGAACGTTACCTGCTG
6.	CTTCCAGCAGGTAACGTTCCAGAACT
7.	GAAGCTAAAGAAGCTGAAAACATC
8.	GTGGTGATGTTTTCAGCTTCTTTAG
9.	ACCACTGGTTGTGCTGAACACTGTTC
10.	CAAAGAACAGTGTTCAGCACAACCA
11.	TTTGAACGAAAACATTACGGTACCG
12.	GATCCGGTACCGTAATGTTTTCGTT

Tabulka IX

ECEPO úsek 1

Xbal

EcoRI 1 , 3

AATTCTAG AAACCATGA^ GGTAATAAAA TAjftTGGCTCC GCCGCGTCTG GATC TTTGGTACTC CCATTATTTT ATTAČ3GAGG CGGCGCAGAC 2 4

ATCTGCGAclr CGAGAGTTCT GGAACGTTAC

TAGACGCTGA GCTCjTCAAGA CCTTGCAATG

CTGCTGfcAAG CTAAAGAAGC GACGACCTŤČ] GATTTCTTCG

TGAAAACÁŤC IftCCACTGGTT ACTTTTGTAG TGGTG[lCCAA

GTGCTGAACA CACGACTTGT 10 ctgttc(tttg GACAAGAAAC]

AACGAAAACA TTGCTTTTGT

KpnI BamHI TTACGGTACC G AATGCCATGG CCTAG 12

-41CZ 281542 B6

Tabulka X

Oligonukleotidy ECEPO úsek 2

1. AATTCGGTACCAGACACCAAGGT

2. GTTAACCTTGGTGTCTGGTACCG

3. TAACTTCTACGCTTGGAAACGTAT

4. TTCCATACGTTTCCAAGCGTAGAA

5. GGAAGTTGGTCAACAAGCAGTTGAAGT

6. CCAAACT.TCAACTGCTTGTTGACCAAC

7. TTGGCAGGGTCTGGCACTGCTGAGCG

8. GCCTCGCTCAGCAGTGCCAGACCCTG

9. AGGCTGTACTGCGTGGCCAGGCA

10. GCAGTGCCTGGCCACGCAGTACA

11. CTGCTGGTAAACTCCTCTCAGCCGT

12. TTCCCACGGCTGAGAGGAGTTTACCA

13. GGGAACCGCTGCAGCTGCATGTTGAC

14. GCTTTGTCAACATGCAGCTGCAGCGG

15. AAAGCAGTATCTGGCCTGAGATCTG

16. GATCCAGATCTCAGGCCAGATACT

-42CZ 281542 B6

Tabulka XI

ECEPO úsek 2

EcoRI KpnI A ATTCGGTACC GCCATGG

AGACACCAAG TCTGTGGTTC gtIfaacttct caatTg|aaga acgcTtggaa TGCGAACCTT acgtatIjgaa

TGCATACČYT|

GTTGGTCAAC AAGCAGTTGA CAACCAGTTG TTCGTCAACT agtIttggcag TCAWqGTC

GGTCTGGCAC CCAGACCGTG

TGCTGAGCGh ACGACTCGCT

GGCTGTACTG

ČČGflCATGAC cgTggccagg GCACCGGTCC caIetgctggt gtgáčgIacca

AAACTCCTCT TTTGAGGAGA

CAGCCGTbGG GTCGGCACČ?

AACCGCTGCA TŤfcGCGACGT ¹ 14

GCTGCATGTT CGACGTACAA gacKaagcag

CTGTtTCG|TC

BqlII BamHI

TATCTGGCCT GAGATCTG ATAGACCGGA CTCTAGACCTAC

-43CZ 281542 B6

Tabulka XII

ECEPO úsek 3

1.	GATCCAGATCTCTGACTACTCTGC
2.	ACGCAGCAGAGTAGTCAGAGATCTG
3.	TGCGTGCTCTGGGTGCACAGAAAGAGG
4.	GATAGCCTCTTTCTGTGCACCCAGAGC
5.	CTATCTCTCCGCCGGATGCTGCATCT
6.	CAGCAGATGCAGCATCCGGCGGAGA
7.	GCTGCACCGCTGCGTACCATCACTG
8.	ATCAGCAGTGATGGTACGCAGCGGTG
9.	CTGATACCTTCCGCAAACTGTTTCG
10.	ATACACGAAACAGTTTGCGGAAGGT
11.	TGTATACTCTAACTTCCTGCGTGGTA
12.	CAGTTTACCACGCAGGAAGTTAGAGT
13.	AACTGAAACTGTATACTGGCGAAGC
14.	GGCATGCTTCGCCAGTATACAGTTT
15.	ATGCCGTACTGGTGACCGCTAATAG
16.	TCGACTATTAGCGGTCACCAGTAC

-44CZ 281542 B6

Tabulka XIII

ECEPO úsek 3

BamHI BqlII

GA TCCAGATCTCŤG GTCTAGAGAC

ACTACTCTGC IrGCGTGCTCT

TGATGAGACG ACGCAjSGAGA

GGGTGCACAG

CCCACGTGTC aaagagg|:ta TCTCTCCGCC TTTCTCCGAt ÁG|AGAGGCGG ggatgctgca CCTACGACGT 6

TCTÍCTGCAC agac£áč|gtg

CGCTGCGTAC GCGACGCATG catcactgít gataccttcc GTAGTGACGA CT^TGGAAGG

GCAAACTGTT CGTTTGACAA 10

TATACTGGCG ATATGACCGC 14

U .12

TCGlTGTATAC TCTAACTTCC TGCGTGGTAF ACTGAAACTG AGCACATA|TG AGATTGAAGG ACGCACCATT TGACfTTTGAC 12

Sáli

AAGC^TGCCG TACTGGTGAC CGCTAATAG ttcgTOSSc atgaccactg gcgattatc AGCT

-45CZ 281542 B6

Tabulka XIV

Gen ECEPO

-1 1

Xbal MetAla cTIg aaaccatgag ggtaataaaa taatggctcc gccgcgtctg

ATCTGCGACT TAGACGCTGA	TTTGGTACTC CCATTATTTT ATTACCGAGG CGGCGCAGAC CGAGAGTTCT GGAACGTTAC CTGCTGGAAG CTAAAGAAGC GCTCTCAAGA CCTTGCAATG GACGACCTTC GATTTCTTCG
TGAAAACATC ACTTTTGTAG	ACCACTÍGGTT GTGCTGAACA CTGTTCTTTG AACGAAAACA TGGTGACCAA CACGACTTGT GACAAGAAAC TTGCTTTTGT
TTACGGTACC AATGCCATGG	AGACACCAAG GTTAACTTCT ACGCTTGGAA ACGTATGGAA TCTGTGGTTC CAATTGAAGA TGCGAACCTT TGCATACCTT
GTTGGTCAAC CAACCAGTTG	AAGCAGTTGA AGTTTGGCAG GGTCTGGCAC TGCTGAGCGA TTCGTCAACT TCAAACCGTC CCAGACCGTG ACGACTCGCT
GGCTGTACTG CCGACATGAC	CGTGGCCAGG CACTGCTGGT AAACTCCTCT CAGCCGTGGG GCACCGGTCC GTGACGACCA TTTGAGGAGA GTCGGCACCC
AACCGCTGCA TTGGCGACGT	GCTGCATGTT GACAAAGCAG TATCTGGCCT GAGATCTCTG CGACGTACAA CTGTTTCGTC ATAGACCGGA CTCTAGAGAC
ACTACTCTGC TGATGAGACG	TGCGTGCTCT GGGTGCACAG AAAGAGGCTA TCTCTCCGCC ACGCACGAGA CCCACGTGTC TTTCTCCGAT AGAGAGGCGG
GGATGCTGCA CCTACGACGT	TCTGCTGCAC CGCTGCGTAC CATCACTGCT GATACCTTCC AGACGACGTG GCGACGCATG GTAGTGACGA CTATGGAAGG
GCAAACTGTT CGTTTGACAA	TCGTGTATAC TCTAACTTCC TGCGTGGTAA ACTGAAACTG AGCACATATG AGATTGAAGG ACGCACCATT TGACTTTGAC
TATACTGGCG ATATGACCGC	Sáli AAGCATGCCG TACTGGTGAC CGCTAATAG TTCGTACGGC ATGACCACTG GCGATTATCA GCT

-46CZ 281542 B6

V tabulce VIII jsou znázorněny oligonukleotidy, užité k výstavbě úseku 1 genů ECEPO, jde o kód aminoterminálních zbytků lidského polypeptidů. Oligonukleotidy byly sestaveny jako dvojice, tzn. 1 a 2, 3 a 4, atd. a tyto dvojice potom byly navázány za vzniku úseku 1 genu ECEPO, jak je zřejmé z tabulky IX. Je nutno upozornit na to, že tento úsek obsahuje místa po štěpení enzymy EcoRI a BamHI, potom směrem dolů od zakončení po působení EcoRI se nachází místo po působení enzymu Xbal a směrem nahoru od místa pro působení enzymu BamHI se nachází místa pro působení enzymu KpnI. Úsek I je možno snadno podrobit amplifikaci při použití fágu M13 jako vektoru pro ověření sledu. Některé obtíže byly spojeny s izolací tohoto úseku jako fragmentu po působení enzymů”XBaI/KpnI z DNA, vzniklé v E. coli, příčinou byla patrně methylace místa po působení enzymu KpnI v hostiteli. Z tohoto důvodu byla izolována DNA fágu s jednoduchým řetězcem a byla potom in vitro změněna na DNA s dvojitým řetězcem, potom byl izolován požadovaný fragment s dvojitým řetězcem.

Geny ECEPO, úseky 2 a 3 tak, jak jsou znázorněny v tabulkách XI a XIII, byly konstruovány obdobným způsobem z oligonukleotidů, uvedených v tabulkách X a XII. Každá sekce byla podrobena amplifikaci ve vektoru M13 pro ověření sledu a potom byla izolována z DNA-fágu. Jak je zřejmé z tabulky XI, úsek 2 ECEPO byl konstruován s místy po působení enzymů EcoRI a BamHI s možností opětné vazby a mohl být izolován jako fragment po působení KpnI/BglII. Obdobně úsek 3 ECEPO byl připraven s místy po působení BamHI a Sáli, schopnými opětné vazby na konci a mohl být izolován z DNA fágu jako fragment BglII/SalI. Takto získané 3 úseky je možno snadno spojit na kontinuální sled DNA tak, jak je znázorněn v tabulce XIV, který je kódem pro celý lidský polypeptid EPO s aminoterminálním kodonem pro methionin (ATG) pro počátek translace v E. coli. Je nutno také upozornit na to, že směrem nahoru od počátečního kodonu ATG se nachází skupina párů bází, která v podstatě opakuje sled pro vazbu ribosomu při expresi genu OMP-f E. coli.

Jako nosný vektor pro ECEPO je možno užít jakýkoliv vhodný vektor pro dosažení exprese. Vektorem, zvoleným pro tento účel byl na teplotu citlivý plasmid pCFM536, což je derivát plasmidu pCFM414 (ATCC 40076), který byl popsán v US patentové přihlášce č. 636 727, podané 6. srpna 1984 (Charles F. Morris). Gen pCFM536 byl potom rozštěpen enzymy Xbal a HindlII. Velký fragment byl izolován a použit k vazbě s genem ECEPO. Úseky 1 (Xbal/KpnI), 2 (KpnI/BglII) a 3 (BglII/SalI) byly předem zařazeny ve správném pořadí v Ml3 a gen pro EPO byl potom izolován jako jediný fragment (Xbal/HindlII). Tento fragment obsahoval část vazného řetězce z fágu M13 mp9 mezi místy pro působení enzymů Sáli až HindlII. Při ověřeni exprese výsledného plasmidu p536 bylo použito promotoru lambda P^, který sám může být podřízeným represorického genu Cj₈₅₇ tak, jak se nachází v kmenu E. coli K12AHtrp.

Shora získaný gen pro ECEPO je potom možno různým způsobem modifikovat, čímž se získají kódy pro analogy erythropoetinu, například [Asn², des-Pro² až Ile⁶]hEPO a [His⁷]hEPO, jak již bylo uvedeno.

-47CZ 281542 B6

A. [Asn², des-Pro² až Ile⁶]hEPO

Plasmid 536, který nese zkonstruovaný gen ECEPO z tabulky XIV jako včleněný úsek, zakončený místy pro působení Xbal a HindlII byl rozštěpen enzymy HindlII a Xhol. Druhá z uvedených endonukleáz štěpí uvedený gen v místě, které se nachází 6 párů bází od kodonu, který je kódem pro Asp⁸ až Arg¹⁰. Potom byl produkován vazný řetězec Xbal/Xhola následujícím sledem:

	+1	2	7	8	9
Xbal	Met	Ala	Asn	Cys	Asp	Xhol
5’-CTAG	ATG	GCT	AAT	TGC	GAC-3	t
3 ' -	TAC	CGA	TTA	ACG	CTG	AGCT-5'

Vazný řetězec Xbal/Xhol a fragment se sledem genu ECEPO Xhol/HindlII se včlení do velkého fragmentu, který vznikne tak, že se pomocí enzymů Xbal a HindlII rozštěpí plasmid pCFM526, což je derivát plasmidu pCFM414 (ATCC 40076) tak, jak byl popsán v US patentové přihlášce č. 636 727, podané 6. srpna 1984 (Charles F. Morris), čímž se získá sled DNA, který je kódem pro Met^-1 formu požadovaného analogu při expresi v E. coli.

B. [His⁷]hEPO

Plasmid 536 byl rozštěpen enzymy HindlII a Xhol jako v odst.

A. Vazný	řetězec	Xbal/Xhol	byl	zkonstruován	s následujícím
sledem:
		+1	2	3	4	5	6	7	8 9
Xbal	Met	Ala	Pro	Pro	Arg	Leu	Ile	His	Asp Xhol
5'-CTAG -	ATG	GCT	CCG	CCA	CGT	CTG	ATC	CAT	GAC-3'
3 '-	TAC	CGA	GGC	GGT	GCA	GAC	TAG	GTA	CTG AGCT-5'

Vazný řetězec a fragment ECEPO (Xhol/HindlII byl potom včleněn do plasmidu pCFM526, čímž byl získán sled DNA, nesený plasmidem, který je kódem pro Met“¹ formu požadovaného analogu při expresi v E. coli.

Konstrukce genu SCEPO, který má v sobě včleněné kodony, usnadňující expresi v kvasinkách, je popsána v následujících tabulkách XV až XXI. Stejně jako v případě genu ECEPO, zahrnuje v sobě celá konstrukce tvorbu tří skupin oligonukleotidů tak, jak jsou uvedeny v následujících tabulkách XV, XVII a XIX, jde o dvojice bází, které jsou potom uspořádány do úseků, které jsou znázorněny na tabulkách XVI, XVIII a XX, je nutno uvést, že syntézu je možno částečně usnadnit tak, že se použijí některé suboptimálni kodony při konstrukci SCEPO i ECEPO, tj. v případě obou genů jsou identické oligonukleotidy 7 až 12 v úseku 1 a také v úseku 2 jsou totožné v obou genech oligonukleotidy 1 až 6.

-48CZ 281542 B6

Tabulka XV

Oligonukleotidy SCEPO úsek 1

1.	AATTCAAGCTTGGATAAAAGAGCT
2.	GTGGAGCTCTTTTATCCAAGCTTG
3.	CCACCAAGATTGATCTGTGACTC
4.	TCTCGAGTCACAGATCAATCTTG
5.	GAGAGTTTTGGAAAGATACTTGTTG
6.	CTTCCAACAAGTATCTTTCCAAAAC
7.	GAAGCTAAAGAAGCTGAAAACATC
8.	GTGGTGATGTTTTCAGCTTCTTTAG
9.	ACCACTGGTTGTGCTGAACACTGTTC
10.	CAAAGAACAGTGTTCAGCACAACCA
11.	TTTGAACGAAAACATTACGGTACCG
12.	GATCCGGTACCGTAATGTTTTCGTT

Tabulka XVI

SCEPO úsek 1

EcoRI HindlII 1 AATTCA AGCTTGGATA

GT TCGAACCTAT

AAAGAGCTbc ACCAAGATTG ATCTGTGACT cfcAGAGTTTT

TTTCTCGAGG TG^TTCTAAC TAGACACTGA GCTÚŤjCAAAA

GGAAAGATAC TTGTTGpAAG CTAAAGÁAGC TGAAAACATC faCCACTGGTT CCTTTCTATG AACAACCTTČ] GATTTCTTCG ACTTTTGTAG TGČfí^CCAA 6 8

11 KpnI BamHI

GTGCTGAACA CTGTTCiTTTG. AACGAAAACA TTACGGTACC G CACGACTTGT GACAAGAÁÁČl TTGCTTTTGT AATGCCATGG CCTAG ! 12

-49CZ 281542 B6

Tabulka XVII

Oligonukleotidy SCEPO úsek 2

1. AATTCGGTACCAGACACCAAGGT

2. GTTAACCTTGGTGTCTGGTACCG

3. TAACTTCTACGCTTGGAAACGTAT

4. TTCCATACGTTTCCAAGCGTAGAA

5. GGAAGTTGGTCAACAAGCAGTTGAAGT

6. CCAAACTTCAACTGCTTGTTGACCAAC

7. TTGGCAAGGTTTGGCCTTGTTATCTG

8. GCTTCAGATAACAAGGCCAAACCTTG

9. AAGCTGTTTTGAGAGGTCAAGCCT

10. AACAAGGCTTGACCTCTCAAAACA

11. TGTTGGTTAACTCTTCTCAACCATGGG

12. TGGTTCCCATGGTTGAGAAGAGTTAACC

13. AACCATTGCAATTGCACGTCGAT

14. CTTTATCGACGTGCAATTGCAA

15. AAAGCCGTCTCTGGTTTGAGATCTG

16. GATCCAGATCTCAAACCAGAGACGG

-50CZ 281542 B6

Tabulka XVIII

SCEPO úsek 2

KpnI

EcoRI 1

TFffTTCGGT^CC AGACACCAAG

GCCATGG TCTGTGGTTC

GTlrAACTTCT ACGCTTGGAA ACGTATbGAA GTTGGTČAAC

CAATTŠJ1AGA TGCGAACCTT TGCATACCŤŤf CAACCAGTTG

AAGCTGTTGA TTCGACAACT 6

AGTlTTGGCAA

TCAAÁČČ^TT

GGTTTGGCCT CCAAACCGGA

TGTTATCTGk AGCTGTTTTG

ACAATAGACT TCG|ACAAAAC agaggtcaag TCTCCAGTTC 10 cct|tgttggt

GGAAČ^ZCA

TAACTCTTCT ATTGAGAAGA

CAACCATGGG GTTGGTACCC

ACCATTGCA

WTJaacgt

ATTGCACGTC TAACGTGCAG

GAThAAGCCG ctatTťčJsgc

TCTCTGGTTT AGAGACCAAA

BglII BamHI GAGATCTG CTCTAGACCTA G

-51CZ 281542 B6

Tabulka

XIX

Oligonukleotidy SCEPO úsek 3

1.	GATCCAGATCTTTGACTACTTTGTT

2. TCTCAACAAAGTAGTCAAAGATCTG

3. GAGAGCTTTGGGTGCTCAAAAGGAAG

4.	ATGGCTTCCTTTTGAGCACCCAAAGC
5.	CCATTTCCCCACCAGACGCTGCTT
6.	GCAGAAGCAGCGTCTGGTGGGGAA

7. CTGCCGCTCCATTGAGAACCATC

8.	CAGTGATGGTTCTCAATGGAGCG
9.	ACTGCTGATACCTTCAGAAAGTT
10.	GAATAACTTTCTGAAGGTATCAG
11.	ATTCAGAGTTTACTCCAACTTCT
12.	CTCAAGAAGTTGGAGTAAACTCT
13.	TGAGAGGTAAATTGAAGTTGTACAC
14.	ACCGGTGTACAACTTCAATTTACCT
15.	CGGTGAAGCCTGTAGAACTGGT

16. CTGTCACCAGTTCTACAGGCTTC

17. GACAGATAAGCCCGACTGATAA

18.	GTTGTTATCAGTCGGGCTTAT
19.	CAACAGTGTAGATGTAACAAAG
20.	TCGACTTTGTTACATCTACACT

Tabulka XX

SCEPO úsek 3

BamHI Balil 1.

GATC CAGATCTTTG ACTACTTTGT TpAGAGCTTT GTCTAGAAAC TGATGAAACA ACTČTfGAAA 2

GGGTGCTCAA AAGGAAGfcCA TTTCCCČACC AGACGCTGCT

CCCACGAGTT TTCCTTCGGÍ A^AGGGGTGG TCTGCGACGA

CATTGAGAAC CATCllCTGCT GATACCTTCA GAAAGTT^TT

GTAACTCTTG GTAGTGAČfcA CTATGGAAGT CTTTCAATÁA ‘ 10

TCCAACTTCT frGAGAGGTAA ATTGAAGTTG TACACfcGGTG AGGTTGAAGA ΑδΓψΟΟΑΤΤ TAACTTCAAC ATGTGGČČ^C

TCTGCCGCTC AEEČČGCGAG

CAGAGTTTAC GfrCTCAAATG

AAGCCTGTAG TTCGGACATC 16

19

AACTGGTfcAC AGATAAGCCC GACTGATAA^ AACAGTGTAG ttgaccacT^TCJtattcggg CTGACTATTG ÍTGJTCACATC

Sáli ATGTAACAAA G TACATTGTTT CAGCT 20

-53CZ 281542 B6

Tabulka XXI

Gen SCEPO

HindlII ISčTtggata ACCTAT	-1 +1 ArgAla AAAGAGCTCC ACCAAGATTG ATCTGTGACT CGAGAGTTTT TTTCTCGAGG TGGTTCTAAC TAGACACTGA GCTCTCAAAA
GGAAAGATAC CCTTTCTATG	TTGTTGGAAG CTAAAGAAGC TGAAAACATC ACCACTGGTT AACAACCTTC GATTTCTTCG ACTTTTGTAG TGGTGACCAA
GTGCTGAACA CACGACTTGT	CTGTTCTTTG AACGAAAACA TTACGGTACC AGACACCAAG GACAAGAAAC TTGCTTTTGT AATGCCATGG TCTGTGGTTC
GTTAACTTCT CAATTGAAGA	ACGCTTGGAA ACGTATGGAA GTTGGTCAAC AAGCTGTTGA TGCGAACCTT TGCATACCTT CAACCAGTTG TTCGACAACT
AGTTTGGCAA TCAAACCGTT	GGTTTGGCCT TGTTATCTGA AGCTGTTTTG AGAGGTCAAG CCAAACCGGA ACAATAGACT TCGACAAAAC TCTCCAGTTC
CCTTGTTGGT GGAACAACCA	TAACTCTTCT CAACCATGGG AACCATTGCA ATTGCACGTC ATTGAGAAGA GTTGGTACCC TTGGTAACGT TAACGTGCAG
GATAAAGCCG CTATTTCGGC	TCTCTGGTTT GAGATCTTTG ACTACTTTGT TGAGAGCTTT AGAGACCAAA CTCTAGAAAC TGATGAAACA ACTCTCGAAA
GGGTGCTCAA CCCACGAGTT	AAGGAAGCCA TTTCCCCACC AGACGCTGCT TCTGCCGCTC TTCCTTCGGT AAAGGGGTGG TCTGCGACGA AGACGGCGAG
CATTGAGAAC GTAACTCTTG	CATCACTGCT GATACCTTCA GAAAGTTATT CAGAGTTTAC GTAGTGACGA CTATGGAAGT CTTTCAATAA GTCTCAAATG
TCCAACTTCT AGGTTGAAGA	TGAGAGGTAA ATTGAAGTTG TACACCGGTG AAGCCTGTAG ACTCTCCATT TAACTTCAAC ATGTGGCCAC TTCGGACATC
AACTGGTGAC TTGACCACTG	AGATAAGCCC GACTGATAAC AACAGTGTAG TCTATTCGGG CTGACTATTG TTGTCACATC
ATGTAACAAA TACATTGTTT	Sáli G CAGCT

-54CZ 281542 B6

Celý úsek SCEPO byl podroben expresi v M13 a úseky 1, 2 a 3 byly izolovatelné z fágu jako fragmenty HindlII/KpnI, KpnI/BglII a BglII/SalI.

Systém pro expresi genu SCEPO, který je za současné doby pokládán za výhodný, je založen na sekreci α-faktoru S. cerevisiae tak, jak to bylo popsáno v U. S. patentové přihlášce č. 487 753, podané 22. dubna 1983 (Grant A. Bitter), a uveřejněné

31. října 1984 jako evropská patentová přihláška č. 0 123 294. Tento systém zahrnuje konstrukce, v nichž DNA, která je kódem pro vedoucí sled genu pro α-faktor kvasinek se uloží do polohy těsně 5'za kódovou oblast exogenního genu, k jehož expresi má dojít. V důsledku toho produkt po translaci obsahuje vedoucí nebo signální sled, který je odstraněn endogenním enzymem kvasinek v průběhu sekrece zbytku produktu. Protože se při konstrukci užívá kodonu ATG, který je kodonem pro počátek translace a-faktoru, není zapotřebí zařadit tento kodon do polohy -1 genu SCEPO. Jak je zřejmé z tabulky XXI, nachází se před kódem pro alanin (+1) vazný řetězec, který dovoluje přímé včleněni do plasmidu včetně DNA pro prvních 80 zbytků signálního sledu pro α-faktor s následujícím promotorem pro α-faktor. Specifická konstrukce pro expresi genu SCEPO v sobě zahrnuje čtyřstupňovou vazbu včetně shora uvedených fragmentů a velkého fragmentu po štěpení plasmidu paC3 enzymy HindlII/SalI. Z výsledného plasmidu paC3/SCEPO je možno izolovat promotor pro α-faktor, signální sled a gen SCEPO štěpením enzymem BamHI a vazbou do plasmidu pYE po štěpení enzymem BamHI, čímž vzniká plasmid pYE/SCEPO.

Příklad 12

Exprese rekombinantních produktů při použití konstruovaných genů ECEPO a SCEPO systémem pro expresi z příkladu 11 je možno dosáhnout následujícím způsobem:

Plasmid p536 z příkladu 11 se transformuje do buněk AM7 E. coli, které již byly transformovány vhodným plasmidem pMWl s genem C_I857. Kultury buněk v prostředí LB (Ampicilin 50 μg/ml a KANAMYCIN 5μg/ml, s výhodou s 10 mM síranu hořečnatého) se udržuje na teplotě 28 ’C a buňky se pěstují do hustoty 0,1 (optická hustota), exprese EPO se vyvolá zvýšením teploty na 42 ’C. Dochází k produkci EPO v množství přibližně 5 mg/litr.

Buňky se izolují, rozruší a potom se na ně působí lysozymem a smáčedlem NP-40. Peleta po odstředění (24 000 g) se potom solubilizuje guanidinhydrochloridem a dále se čistí vysokotlakou kapalinovou chromatografii v reversní fázi (C₄ - Vydac), 0 až 80 % ethanolu, 50 mM octanu amonného, pH 4,5. Při stanovení sledu bílkoviny je možno prokázat, že čistota produktu je vyšší než 95 % a získaný produkt má 2 možná zakončení na aminoterminálním konci, a to A-P-P-R nebo P-P-R v poměrném množství 3:1. Toto pozorování produktů, které odpovídají lidskému hEPO a témuž produktu bez alaninu v poloze 1 ukazuje na zpracování hostitelskými buňkami, které odstraňuje terminální methionin a v některých případech také počáteční alanin. Radioimunologická účinnost isolátů byla 150 000 až 160 000 jednotek/mg, účinnost in vitro

-55CZ 281542 B6

000 až 62 000 jednotek/mg a účinnost in vivo 120 až 720 jednotek/mg. (Srovnání bylo prováděno s materiálem, izolovaným z lidské moči s účinností 70 000 jednotek/mg). Křivka závislosti účinku na dávce pro rekombinantní produkt in vivo se podstatně lišila od téže křivky pro EPO z lidské moči.

Plasmidy pro analogy EPO, vytvořené v částech A a B v příkladu 11 byly jednotlivé transformovány do buněk AM7 E. coli, které již byly transformovány pMWl a buňky byly pěstovány shora uvedeným způsobem. Čištěné izoláty byly zkoumány RIA in vitro. Obě hodnoty pro produkty exprese [Asn², des-Pro² až Ile⁶]hEPO byly přibližné 11 000 jednotek/mg a 6000 jednotek/mg bílkoviny, zatímco stejné hodnoty pro [His⁷]hEPO byly 41 000 jednotek/mg a 14 000 jednotek/mg bílkoviny, což ukazuje na to, že analogické produkty měly účinnost 1/4 až 1/10 než úplné produkty exprese.

V systému pro expresi, určeném pro použití v hostitelských buňkách S. cervisiae, byl plasmid pYE/SCEPO transformován do dvou různých kmenů, a to YSDP4 (genotyp a pep4-3 trpí) a RK81 (genotyp αα pep4-3 trpí). Transformované hostitelské buňky YSDP4 byly pěstovány v prostředí SD (Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y., p. 62 (1983)), doplněné aminokyselinami kaseinu v koncentraci 0,5 %, pH 6,5 při 30 ’C. Prostředí bylo odděleno při optické hustotě buněk 36 a obsahovalo EPO v koncentraci 244 jednotek/ml (97 μg/litr podle RIA). Transformované buňky RK81 byly pěstovány do optické hustoty

6,5 nebo 60, koncentrace EPO byla 80 až 90 jednotek/ml (34 μg/litr podle RIA). Předběžná analýza prokázala heterogenitu produktů, patrné na základě různé glykosilace bílkovin a poměrně vysoký obsah manózy.

Plasmidy PaC3 a pYE v HB101 E. coli byly uloženy 27. září 1984 do Američan Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland pod čísly ATCC 39881 a ATCC 39882. Plasmidy pCFM526 vAM7, pCFM536 v buňkách JMI03 a pMWl v buňkách JMI03 byly také uloženy 21. listopadu 1984 pod čísly ATCC 33932, 33934 a 33933. Saccharomyces cerevisiae kmene YSPD4 a RK81 byly uloženy 21. listopadu 1984 pod čísly ATCC 20734 a 20733.

Je zřejmé, že způsobem podle vynálezu je možno získat četné výjimečně cenné produkty.

Polypeptidy, získané způsobem podle vynálezu, jsou užitečné materiály, ať již běží o produkty mikrobiální exprese, nebo o syntetické produkty, primární, sekundární a terciální struktura těchto produktů byla poprvé poznána prováděním způsobu podle vynálezu.

Jak již bylo uvedeno, rekombinantní produkty a syntetické produkty mají v různém stupni společnou biologickou účinnost in vitro jak pro izoláty EPO z přírodních zdrojů, tak pro produkty exprese a mohou tedy být užity jako náhražky pro izoláty EPO v živném prostředí pro krevní buňky. V určité míře mají polypeptidy, vyrobené způsobem podle vynálezu také účinnost in vivo, podobnou přírodním izolátům EPO a je tedy možné je užít pro léčbu erythropoetinem u savců včetně lidí, například tam, kde je zapotřebí dosáhnout stimulace retikulocytů, vznik ferrokinetických

-56CZ 281542 B6 účinků, například výměny železa mezi plasmou a kostní dření, tam kde je zapotřebí dosáhnout změny počtu erythrocytů, stimulace vzniku hemoglobinu C (Eschbach a další, shora) a zvýšení hodnoty hematokritu, u savců, jak bylo uvedeno v příkladu 10. Jde tedy o nemocné, kteří obvykle vyžadují krevní transfuzi, například při úrazech, v případě chirurgických nemocí, u nemocí ledvin včetně použití umělé ledviny, a u nemocných s různými typy poruch ve složení krve, jako jsou hemofilie, poruchy tvaru krvinek, fyziologické anemie, srpkovitá anemie a podobně. Tímto způsobem je možno snížit nutnost transfuzí, a tím využít EPO ke snížení materiálů, jimiž se mohou přenášet infekční choroby. Produkty podle vynálezu vzhledem k výrobě rekombinantními způsoby jsou prosté pyrogenů, přírodních inhibičních látek a podobně, a jsou tedy velmi účinné ve srovnání s přírodními produkty. Je možné je užit také tam, kde je nutno zlepšit přenos kyslíku, například při pobytu v prostředí s jeho sníženým množstvím a v případě oběhových onemocnění.

Výhodným způsobem podání těchto polypeptidů je parenterální podání, látky se obvykle podávají s přijatelnými ředidly, nosiči a/nebo pomocnými látkami. Předběžné farmakokinetické studie prokazují delší poločas in vivo pro opičí EPO při nitrosvalovém podání než při nitrožilním podání. Účinné dávky se podstatně liší od sebe navzájem podle onemocnění, pohybují se však v rozmezí 0,1 až 100 μg/kg, tj. přibližně 7 až 7000 jednotek/kg. Lze užít běžná ředidla, například lidský sérový albumin a standardní nosiče, například fyziologický roztok chloridu sodného.

V prostředcích je možno užít i další pomocné látky, například testosterony, stimulátory zárodečných buněk, růstové faktory podobné insulinu, prostaglandinu, serotoninu, cyklickému AMP, prolaktinu a trijodthyroninu, použít při léčbě aplastických anemií, drolon (1981) , (1984) , 283 až (1982) ) . o nichž asialo-EPO, androgeny nebo BPA Concepts England, (1982), Kalmanti, serotoninu, je možno také látky užívané stanozol a nan248 444 8) , 108

243 až 437 až (Supp.

105 až (Resegotti a další, McGonigle a další, Pavlovic-Kantera a další, 291 (1980) a Kurtz, FEBS

Jako pomocné látky je je známo, že zvyšují například adrenergní f in Erythropoiesis, 1983), Weiland a další, Blut, 44 Kidney Int., 22, 383 až 391 až 80 (1973), (1977), Urabe a další, J· . neu., a Billat a další, Expt. Hematol., 10 sloučeniny, které jsou označovány jako jaterní faktory pro tvorbu krve, jak bylo popsáno v publikacích Naughton a další, Acta Haemat., 69, 171 až 179 (1983) a erythrotropiny, popsané v publikacích Congote a další v Abstract 364, Proceedings 7th International Congress of Endocrinology (Quebec City, Quebec, červenec 1 - 7, 1984), Congote, Biochem.

Biophys. Res. Comm, 115 (2), 447 až 483 (1983) a Congote, Anal.

Biochem., 140, 428 až 433 (1984) a erythrogeniny, popsané v publikaci Rothman a další, J. Surg. Oncol, 20, 105 až 108 (1982). Předběžné sledováni ukazuje na hypoxických polycythemických myších, předem ošetřených 5-a-dihydrotestosteronem nebo

New.	Eng.	J. Med.,	289, 72
ids,	30	(6), 833	až 845
149,	1314	až 1325	(1979)
(1) ,	133	až 140 (1982) a

jako methenolen, Panminerva Medica 23, Kidney Int. 25 (2),

Expt. Hernato1. 8 Letters, 14a (1), možno užít také sloučeniny, účinek erythropoetinu nebo látky, hormony štítné žlázy, jak bylo popsáno v publikacích Dunn, Current

John Wiley and Sons (Chichester, další, Blut, 44 (3), 173 až 175

22, 383 až 391 (1982), Shahidi,

Fischer a další, Sterodalší, J. Exp. Med

-57CZ 281542 B6 nandrolonem a potom erythropoetinem slibné výsledky.

Diagnostické použití polypeptidů, vynálezu, je i neznačených forem RIA, ELISA a podobné, stejné jako celou a in vivo. Tyto postupy jsou Expt. Hematol., logy, 16, 155 až 156 (1984) až 660 (1983), Saito a (1984), Nathan a další, (1983) a také v různých článcích, cích odkazy. Polypeptidy podle vynálezu včetně syntetických peptidů se sledy nebo Zbytky EPO jsou také vysoce užitečnými čistými látkami pro polyklonální protilátky a bankami monoklonálních protilátek, specifických k rozeznávání kontinuálních a diskontinuálních epitopů EPO. Příkladem může být předběžná analýza sledu aminokyselin z tabulky VI podle publikace Hopp a další, PNAS (USA), 78, strany 3824 až 3828 (1981) a analýza sekundární struktury podle publikace Chou a další, Ann. Rev. Biochem, 47, str. 251 (1978) prokázala, že syntetické peptidy, jejichž struktura odpovídá kontinuálním sledům přírodních peptidů v oblastech 41 až 57, 116 až 118 a 144 až 166 vždy včetně jsou schopny vyvolat vysoce antigenní odpověď, a tím i vznik monoklonálních a polyklonálních protilátek, které reagují se syntetickým peptidem i s celou bílkovinou. Tyto protilátky by mohly být užitečné k detekci a čištění EPO a příbuzných produktů.

vyrobených způsobem podle také velmi široké a zahrnuje použití značených v různých imunologických zkouškách včetně řadu zkoušek in vitro popsány v publikacích Dunn a další, 11 (7), 590 až 600 (1983), Gibson a další, Patho, krystal, Expt. Hematol, 11 (7), 649 další, Jap. J. Med., 23 (1), 16 až 21

New Eng. J. Med., 308 (9), 520 až 522 na něž jsou v těchto publikaByly připraveny následující tři syntetické peptidy:

1) hEPO 41-57, V-P-D-T-K-V-N-F-Y-A-W-K-R-M-E-V-G,

2) hEPO 116-128, K-E-A-I-S-P-P-D-A-A-S-A-A,

3) hEPO 144-166, V-Y-S-N-F-L-R-G-K-L-K-L-Y-T-G-E-A-C-R-T-G-D-R.

Předběžná studia, týkající se imunizace, s použitím uvedených polypeptidu ukázaly poměrné slabou positivní odpověď pro hEPO 41 až 57, téměř žádnou odpověď pro hEPO 116 až 128 a silnou positivní odpověď na hEPO 144 až 166, měřeno schopnosti protilátek králičího séra srážek izolátu EPO z lidské moči, značené ¹²⁵I. Předběžné studie in vivo všech tří peptidů neprokázaly téměř žádnou účinnost jednotlivě ani ve směsi.

Sled aminokyselinových zbytků EPO savců, tak, jak byl prokázán v příkladech, definuje primární strukturu úplného EPO, avšak specifický sled 165 aminokyselin opičího EPO v Tabulce V a 166 zbytků lidského EPO v Tabulce VI neomezuje rozsah použitelných polypeptidů podle vynálezu. Způsobem podle vynálezu je možno získat různé alelové formy EPO, které podle výsledků dřívějších výzkumů existují, například lidský gama-interferon, jak je možno srovnat s údaji, které hovoří o argeninovém zbytku v poloze č. 140 EPO nebo glutaminovém zbytku v poloze 140 v publikaci Gray a další, Nátuře, 295, strany 503 až 508 (1982). Vždy však běží o úplný sled lidského gama-interferonu. Alelové formy úplného EPO se mohou lišit od sebe navzájem a od sledů v tabulkách V a VI délkou sledu nebo tím, že některé zbytky jsou vynechány,

-58CZ 281542 B6 nahrazeny, členěny nebo přidány s následnými změnami účinku a změnami glykosilace. Jak již bylo uvedeno, jedna alelová forma lidského EPO patrně obsahuje zbytek methioninu v poloze 126. Je možno očekávat, že patrně existují ještě DNA genomu a sledy cDNA, které jsou kódem pro alelové polypeptidy nebo prostě obsahují odlišné kodony k označení téhož polypeptidu.

Kromě přírodně se vyskytujících alelových forem úplného EPO zahrnuje vynález také další EPO-produkty, například polypeptidové analogy EPO a jeho fragmenty. Způsobem podle přihlášek Altona a dalších navrhnout a zkonstruovat geny dů, jejichž struktura se liší zbytků, a to jejich uveřejněných (například WO/83/04053/) je možno pro mikrobiální expresi polypeptiod úplného EPO v jednom nebo ve větším počtu zbytků, a to jejich substitucí, přidáním uprostřed nebo na konci nebo vynecháním. Je také možno uskutečnit modifikace genů mutogenesou a tak získat analogy a deriváty EPO. Tyto produkty mohou mít některé biologické vlastnosti, avšak liší se v dalších vlastnostech EPO. Některé produkty vynechávají aminokyseliny [Asn², des-Pro² až Ile⁶JhEPO, [des-Thr¹⁶³ až Arg¹⁶⁶JhEPO a delta27-55hEPO, přičemž poslední látka má vypuštěný celý exon. Některé deriváty jsou stálejší proti hydrolýze a tím mají delší účinek, nebo je vypuštěno jedno nebo větší počet míst pro glykosylaci, což může vést k větší účinnosti v případě produkce kvasinkami, nebo může být zbytek cysteinu nahrazen například hystidinem nebo serinem, jako v analogu [His JhEPO a je možno je snáze izolovat nebo mají tyrosin nahrazený fenylalaninem, jako [Phe¹⁵JhEPO, [Phe⁴⁹JhEPO a [Phe¹⁴⁵JhEPO snáze vázat na receptory v cílových o fragmenty obsahující pouze část sledu účinnosti této látky, například vazbu erythropoetickou účinnost. Zvláště významné jsou fragmenty sledu DNA lidského genomu z tabulky VI, které jsou zvláštními doménami biologické účinnosti. Je nutno uvést, že neúčinnost in vivo nemusí znamenat léčebný nezdar nebo nedostatek antagonismu. Tento antagonismus může být užitečný v léčbě polycythemií při přebytku EPO, jak bylo son, Hosp. Practice, 18 (12), 49 ší, Clin. Lab. Haemat., 5, 335 až a mohou se hůře nebo buňkách. Může také jít úplného EPO a jen část na receptory a nikoliv potenciální které popsáno v publikacích Adamaž 57 (1983), a Hellmann a dal342 (1983).

Podle dalšího způsobu podle vynálezu je možno získat klonované sledy DNA, které jsou kódem pro lidský a opičí EPO a které jsou cenné vzhledem k informacím, které podávají o sledu aminokyselin erythropoetinu savců, které předtím nebylo možno získat navzdory desetiletím analytických výzkumů přírodně se vyskytujících produktů. Sledy DNA je možno užít také pro syntézu erythropoetinu rekombinantním způsobem. Mimoto je možno je užít ke konstrukci virových a cirkulárních plasmidů, hostitelských buněk, a to prokaryotických i eukaryotických po transfekci nebo transformaci a buněk kvasinek i savců v kultuře, takže běží o nové a cenné metody pro pěstování uvedených buněk, které jsou schopné produkovat EPO a EPO-produkty. Sledy DNA jsou také použitelné jako značené vzorky při izolaci EPO a DNA genomu, včetně cDNA, která je kódem pro tyto produkty. Prozatím není možno odhadnout, v jakém rozsahu je možno použít sledy DNA podle vynálezu v syntéze bílkovin, například u hmyzu. Tyto sledy mohou dát vznik různým typům buněk savců, které potom mohou být eukarytickými hostiteli

-59CZ 281542 B6 pro výrobu erythropoetinu a podobných produktů, jak bylo popsáno v publikaci Palmiter a další, Science, 222 (4625), 809 až 814 (1983).

Je tedy zřejmé, že příklady, uvedené v příkladové části přihlášky, nemají sloužit k omezení rozsahu vynálezu, protože je zásadně možná řada modifikací a variací, vzhledem k tomu, že sledy DNA zahrnují cDNA a sledy DNA genomu. Mohou tedy být kódem pro EPO, jako v příkladu 12, i pro jeho fragmenty a analogy, tj. EPO-produkty, které mohou mít totožné některé biologické vlastnosti s přírodním produktem, jiné však nikoliv.

Je tedy zřejmé, že DNA sledy podle vynálezu zahrnují všechny sledy, dovolující expresi v prokaryotických nebo eukaryotických hostitelských buňkách, přičemž produktem této exprese je polypeptid, který má alespoň část primární struktury EPO a jednu nebo větší počet jeho vlastností, může tedy jít o:

a) sledy DNA z tabulek V a VI,

b) sledy DNA, které hybridizují se sledy v odstavci a) nebo jejich fragmenty a

c) sledy DNA, které hybridizují se sledy z odstavce a) a b) z jiných důvodů než vzhledem k degeneraci genetického kódu.

Je nutno se zmínit o tom, že existující alelové opičí a lidské sledy genu pro EPO pravděpodobné hybridizují se sledy z tabulek V a VI nebo s jejich fragmenty. Mimoto geny SCEPO a ECEPO a sledy cDNA nebo DNA genomu, které jsou kódem pro různé fragmenty a analogy EPO, mohou také hybridizovat se shora uvedenými sledy DNA. Tuto hybridizaci je možno provést za podmínek, které byly shora popsány, včetně omezujících podmínek.

Shora uvedené příklady osvětlují mikrobiální expresi EPO a expresi v buňkách savců, přičemž DNA je včleněna do hybridního vektoru bakteriálního plasmidu a viru, bylo by však možno užít širokou škálu podobných systémů. Mohlo by jít například o vektory homogenního původu, vnesené do celé řady buněk bakterií, kvasinek a savců v kultuře nebo o systémy, v nichž se nepoužívá vektorů, například při použití fosforečnanu vápenatého. Je zřejmé, že exprese například DNA opičího původu se provádí v kultuře buněk opice nebo člověka a i když v tom případě běží o expresi exogenní DNA, je možno dosáhnout vysoké úrovně exprese, přestože neběží o DNA, která má svůj původ v genomu hostitele. Systémy exprese podle vynálezu dále uvažují o tvorbě EPO a podobných produktů v cytoplasmě nebo membráně s následným nahromaděním, popřípadě i v periplasmatickém prostoru bakterií nebo v supernatantu živného prostředí shora uvedených kultur nebo v méně běžných systémech, například těch, které využívají P.aeruginosa podle publikace Gray a další, Biotechnology, 2, strany 161 až 165 (1984).

Zlepšené metody hybridizace podle vynálezu byly aplikovány na DNA/DNA, je možno je aplikovat ovšem také na RNA/RNA a RNA/DNA. Směsné vzorky mohou umožnit velké zlepšení hybridizace s rychlejší izolací polynukleotidu. Může jít například o zlepšený přenos kolonií, o použiti filtrů, podložených nylonem, například GeneScreen a GeneScreen Plus, které dovolují opakované použití, použití nových proteáz podle publikace Taub a další, Anal. Biochem, 126, str. 222 až 230 (1982), použití velmi nízkých

-60CZ 281542 B6 koncentrací řádu 0,025 pikomolů například s obsahem více než hybridizace a dalšího zpracování s výhodou 2 'C Tato zlepšení očekávat. Je tedy zřejmé vynálezu, je které obsahuj í čtyřnásobný s tím, co bylo k izolaci

500 000 plaků fágu. Tohoto výsledku bylo dosaženo v podstatě souběžné uvedeném a neproveditelný pro izolaci genu že celé řady směsných vzorků, odlišných sledů a provádění za omezujících podmínek, tj. 4, od nejnižší vypočítané teploty pro každý vzorek, mohou zajistit , že velmi podstatné výsledky, které nebylo možno dříve zlepšení, dosažené způsobem podle vzhledem k tomu, že směsné vzorky, počet různých sledů, ve srovnání až dosud provedeno, bylo možno s úspěchem užít jediného sledu genu ze směsi, která obsahovala s publikovaným názorem Andersona a dalších ve svrchu článku, totiž že ... tento způsob je nepraktický pro bílkoviny savců v případě, není k dispozici odpovídající RNA.

Claims (37)

1. Sekvence DNA pro použití k zajištěni exprese polypeptidového produktu vykazujícího celou primární strukturní konformaci humánního nebo opičího erythropoetinu, jak je uvedena v tabulce VI nebo V, nebo její část nebo jakékoliv jeho varianty nebo derivátu vykazujícího biologickou účinnost spočívající ve zvyšování produkce retikulocytů a červených krvinek v kostní dřeni a zvyšování syntézy hemoglobinu nebo příjmu železa, v prokaryontních nebo eukaryontních hostitelských buňkách, přičemž tato sekvence DNA se volí ze souboru zahrnujícího (a) (b) (c) sekvence DNA uvedené v tabulce V a VI a jejich komplementární řetězce;

sekvence DNA hybridizující k sekvencím DNA definovaným fragmentům; a sekvence DNA, které by byly DNA definovaným v odstavci genetického kódu.

za stringentnich podmínek v odstavci (a) nebo jejich hybridizovatelné k sekvencím (a) nebo (b), nebýt degenerace

2. Sekvence DNA podle nároku 1 kódující humánní erythropoetin.

3. Sekvence DNA podle nároku 1 nebo 2, jíž je sekvence cDNA.

4. Sekvence DNA podle nároku 3 kódující opičí erythropoetin.

5. Sekvence DNA podle nároku 4 obsahující oblast kódující protein uvedenou v tabulce V.

6. Sekvence DNA podle nároku 1 nebo 2, jíž je sekvence genomové DNA.

7. Sekvence DNA podle nároku 6 kódující humánní erythropoetin.

8. Sekvence DNA podle nároku 7 obsahující oblast kódující protein uvedenou v tabulce VI.

-61CZ 281542 B6

9. Sekvence DNA podle nároku 1 nebo 2, která je kovalentně připojena k detegovatelné značící látce.

10.Sekvence DNA podle nároku 9, kde detegovatelná značící látka je radioaktivní.

11.Sekvence DNA podle nároku 9 nebo 10, která je jednořetězcová.

12.Sekvence DNA podle nároku 1 kódující [Phe¹⁵]hEPO, [Phe⁴⁹]hEPO, [Phe¹⁴⁵]hEPO, [His⁷]hEPO, [Asn²-des-Pro² až Ile⁶]hEPO, [des-Thr¹⁶³ až Arg¹⁶⁶]hEPO nebo [delta 27-55]hEPO.

13.Prokaryontní nebo eukaryontní hostitelská buňka transformovaná nebo transfekovaná sekvenci DNA podle některého z nároků 1, 2,3,6,7a 8 způsobem umožňujícím této hostitelské buňce exprimovat uvedený polypeptidový produkt.

14.Prokaryontní nebo eukaryontní hostitelská buňka podle nároku 13, která je schopna glykosylovat uvedený polypeptid.

15. Prokaryontní nebo eukaryontní 14, kterou je savčí buňka.

16. Prokaryontní nebo eukaryontní 14, kterou je buňka COS.

17. Prokaryontní nebo eukaryontní 14, kterou je buňka CHO.

18. Biologicky funkční cirkulární obsahující sekvenci DNA podle 7, 8 nebo 12.

hostitelská buňka podle nároku hostitelská buňka podle nároku hostitelská buňka podle nároku plasmid nebo virový DNA vektor některého z nároků 1, 2, 3, 6,

19.Prokaryontní nebo eukaryontní hostitelská formovaná nebo transfekovaná DNA vektorem buňka stabilně transpodle nároku 18.

20. Polypeptid vykazující celou primární strukturní konformaci humánního nebo opičího erythropoetinu, jak je uvedena v tabulce VI nebo V, nebo její část nebo jakákoliv jeho alelová varianta nebo derivát vykazující biologickou účinnost spočívající ve zvyšování produkce retikulocytů a červených krvinek v kostní dřeni a zvyšování syntézy hemoglobinu nebo příjmu železa, kterýžto polypeptid je produktem prokaryontní nebo eukaryontní exprese exogenní sekvence DNA.

21. Polypeptid podle nároku 20, který je produktem eukaryontní exprese exogenní sekvence DNA.

22. Polypeptid podle nároku 20, kterým je glykoprotein, jehož průměrné sacharidové složení se liší od humánního erythropoetinu izolovaného z moči.

23.Polypeptid podle nároku 20, 21 nebo 22, kde exogenní sekvencí DNA je sekvence cDNA.

-62CZ 281542 B6

24. Polypeptid podle nároku 20, 21 nebo 22, kde exogenní sekvencí DNA je sekvence genomové DNA.

25. Polypeptid podle nároku 20, 21 nebo 22, kde exogenní sekvence DNA je připojena k autonomně se replikujícímu cirkulárnímu DNA plasmidu nebo virovému vektoru.

26. Polypeptid podle některého z nároků 20 až 25, který je koválentně připojen k detegovatelné značící látce.

27. Polypeptid podle nároku 26, kde detegovatelné značící látka je radioaktivní.

28. Polypeptidový produkt připravitelný expresí sekvence DNA podle nároku 1 nebo 2 v prokaryontní nebo eukaryontní hostitelské buňce.

29. Způsob výroby polypeptidů vykazujícího alespoň část primární strukturní konformace erythropoetinu pro umožnění biologické účinnosti spočívající ve zvyšování produkce retikulocytů a červených krvinek v kostní dřeni a zvyšování syntézy hemoglobinu nebo příjmu železa, vyznačující se tím, že se prokaryontní nebo eukaryontní hostitelská buňka transformovaná nebo transfekovaná sekvencí DNA podle nároku 1 nebo 2 způsobem umožňujícím hostitelské buňce exprimovat tento polypeptid kultivuje za vhodných živných podmínek a popřípadě se požadovaný polypeptidový produkt exprese této sekvence DNA izoluje.

30. Způsob podle nároku 29, vyznačující se tím, že se kultivuje hostitelská buňka podle některého z nároků 13 až 17.

31. Způšob podle nároku 29 nebo 30 pro výrobu polypeptidů podle některého z nároků 20 až 28, vyznačující se tím, že se postupuje za podmínek vedoucích k těmto polypeptidům.

32. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje polypeptid připravitelný způsobem podle nároku 29 nebo 30 a farmaceuticky vhodné ředidlo, pomocnou látku nebo nosič.

33. Farmaceutický prostředek podle nároku 32, vyznačující se tím, že obsahuje polypeptid podle některého z nároků 20 až 28.

34. Protilátka vykazující imunoreaktivitu s erythropoetinem a se syntetickým polypeptidem, jehož primární strukturní konformace v podstatě kopíruje kontinuální sekvenci aminokyselinových zbytků zachovanou v erythropoetinu izolovaném z moči s výjimkou jakéhokoliv polypeptidů vykazujícího sekvenci aminokyselinových zbytků, která je úplně obsažena v sekvenci

A-P-P-R-L-I-C-D-S-R-V-L-E-R-Y-L-L-E-A-K-E-A-E-N-I-T.

35. Protilátka podle nároku 34, kterou je monoklonální protilátka.

-63CZ 281542 B6

36. Protilátka podle nároku 34, kterou je polyklonální protilátka.

37. Protilátka podle nároku 34, která je imunoreaktivní s erythropoetinem a syntetickým polypeptidem, jehož sekvence je zvolena ze souboru zahrnujícího sekvenci