CN106608906A - 一种具有刺激红细胞生成功能的环形多肽的制备及其应用 - Google Patents

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郑学敏
魏群超
龚珉
周植星
徐为人
汤立达
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
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Abstract

一种具有刺激红细胞生成功能的环形多肽的制备及其应用。本发明涉及一种具有长效促红细胞生成功能的促红细胞生成素环状多肽。本发明还提供了上述促红细胞生成素模拟肽衍生物的制备方法以及其在用于制备治疗以缺乏红细胞缺乏红细胞生成素或红细胞群缺少或缺陷为特征的疾病的药物中的用途。所述环形多肽如下：      SEQ ID NO：1                SEQ ID NO：2      SEQ ID NO：3 

Description

一种具有刺激红细胞生成功能的环形多肽的制备及其应用
技术领域
本发明属于生物医学领域，涉及一种能够刺激促红细胞生成素分泌的环状多肽，具体地说，本发明涉及一种能够和促红细胞生成素受体结合并激活促红细胞生成素受体或者能起促红细胞生成素激动作用的促红细胞生成素模拟肽的制备方法，本发明还涉及所述模拟肽衍生物在制备治疗以缺乏红细胞生成素或红细胞群缺少或缺陷为特征的疾病的药物中的用途。
背景技术
促红细胞生成素(EPO)是体内红细胞增殖、分化以及维持外周循环红细胞数量正常的最主要的造血生长因子，临床上主要用于：肾功能不全所致的贫血，非骨髓恶性肿瘤应用化疗引起的贫血。中国慢性肾脏病(CKD)的患者人数估计约为1.2亿，其中肾性贫血是影响CKD患者生活质量的最常见并发症，全国每年新发肿瘤病例约为312万例，约50％的化疗患者会出现贫血。
近年来，我国的CKD的患病率逐年增高，已成为影响公众健康的问题之一，根据北京大学及浙江大学调研数据：CKD的总患病率为10.8％(10.2-11.3)，因此，中国慢性肾脏病的患者人数估计约为1.195亿(1.129-1.250亿)其中肾性贫血是影响CKD患者生活质量的最常见并发症。有研究表明随着肾功能的降低(CKD期数的增加)贫血的发生率是增加的。其中CKD3期患者有接近一半(49.9％)存在贫血，血透析患者贫血发生率至少较非CKD患者高10倍。全国肿瘤登记中心发布的《2012年中国肿瘤登记年报》显示：全国每年新发肿瘤病例估计约为312万例，平均每天8550人，全国每分钟有6人被诊断为恶性肿瘤。化疗仍为目前肿瘤治疗的最重要手段，约50％的化疗患者会出现贫血。由此可以看出国内贫血市场巨大。
环状多肽相对于直线肽链而言的，具有生物活性环肽具有明确的限制构像，能够与受体很好的契合。环肽对于氨肽酶和羧肽酶的敏感性大大降低，与直链肽相比，环肽在抗真菌和杀灭肿瘤细胞等 方面都表现出天然的优势，将直线肽链形成环肽，或者在具活性的直线肽链上连接一个环肽单元，往往可使多肽的活性和稳定性都得到明显提高。Tamilarasu等通过计算机模拟构想发现，肽链在环合前后构想变化越小，对直线肽链的生物活性保持就越有利，而应用侧链成环对肽链的构想影响最小，总之，环肽独特的结构使之在多肽药物结构稳定性研究中备受关注，有广阔的开发和应用前景。
目前EPO蛋白都是通过发酵手段得到的，由于其发酵条件要求苛刻，成本极高也限制了他的应该，然而某种程度上能够作用促红细胞生成素受体的肽已经被确定和叙述。特别是确定了一组含有主要肽段的肽，这些肽可以和促红细胞生成素受体结合并能剌激促红细胞生成素细胞的分化增殖。但是能够刺激红细胞增殖分化的肽的EC50却很低，在20nM和250nM之间，因此这些肽在临床应用上受到了较大的限制。由Affymax/Takeda共同研发的聚乙二醇肽peginesatide,Omontys就是依据能够激动促红细胞生成素合成的多肽经聚乙二醇修饰得到的，Omontys是一种新红细胞生成-刺激药物(ESA)帮助红细胞形成。其作用通过刺激骨髓生成更多红细胞，通常测量血红蛋白水平，减低慢性肾病患者输血需求。Omontys是一个月注射一次给药，但是由于引发严重过敏反应,包括潜在致命过敏反应而退市，据分析可能是由于PEG的超敏反应导致的，本文的目的就是通过使用环肽修饰的方法延长主要肽段的作用时间，避免超敏反应。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种生物活性更好、生物利用度更高的促红细胞生成素环状多肽的制备方法及其应用。
一方面，本发明的目的是提供一种具有长效促红细胞生成功能的环状多肽及其制备方法。
再一方面，本发明还提供了本发明促红细胞生成素模拟肽衍生物的治疗以缺乏红细胞生成素或红细胞群缺少或缺陷为特征的疾病的药物中的用途。
本发明的又一方面还提供一种药物组合物，该药物组合物包含本发明的促红细胞生成素的环状多肽衍生物。
优选地，本发明药物组合物为注射剂；更优选地，本发明药物组合物为冻干粉针或溶液注射剂。
在一个优选实施方案中，本发明药物组合物还包含药学上可接受的辅料成分。
本发明提供了一种具有体内生物活性的促红细胞生成素环状多肽衍生物及其可药用盐，其中，所述环状多肽衍生物为
SEQ ID NO:1
如上序列所示
直链1：(Ac)GGLYADHMGPIT(Nal)VKQPLR(Sar)K
直链2：HMGPIT(Nal)V
其中直链1N6的Asp侧链与链2的N末端形成酰胺键，直链1N15的Lys的侧链与链2的C末端形成酰胺键
SEQ ID NO：2
如上序列所示
直链1：(Ac)GGLYACHMGPIT(Nal)VKQPLR(Sar)K
直链2：(Ac)GGLYAC HMGPIT(Nal)V
其中直链1N6的Cys侧链巯基与链2的Cys侧链巯基形成二硫键，直链1N15的Lys的侧链与链2的C末端形成酰胺键
SEQ ID NO：3
如上序列所示
直链1：(Ac)CGLYAKHMGPIT(Nal)VKQPLR(Sar)K
直链2：(Ac)CGLYAK HMGPIT(Nal)V
其中直链1N1的Cys侧链巯基与链2的Cys侧链巯基形成二硫键，直链1N15的Lys的侧链与链2的C末端形成酰胺键。
根据SEQ ID NO:1选择氨基酸，使用Fmoc固相多肽合成法合成多肽，其中，本发明所述的Fmoc固相多肽合成方法是指以聚合物树脂作为固相反应基质，将氨基端Fmoc保护的氨基酸在偶联试剂的存在下依次缩合，从而合成多肽的合成方法。
首先合成直链1，然后片段合成直链二，通过直链1N1的Cys侧链巯基与链2的Cys侧链巯基形成二硫键，直链1N15的Lys的侧链与链2的C末端形成酰胺键来形成环肽，
优选地，所述制备方法还包括将制得的二聚体纯化，经脱盐及冷冻干燥得到多肽冻干粉的步骤；优选地，所述纯化使用HPLC C18半制备柱进行，流动相为乙腈。
与现有技术相比,本专利涉及的具有长效促红细胞生成功能的环状多肽能够明显刺激小鼠外周血网织红细胞计数的升高，说明它们刺激红细胞生成，同时还能够大大延长药物在体内的半衰期。具有 长效促红细胞生成功能的环状多肽和促红细胞生成素蛋白对成熟的红细胞、血细胞压积、血红蛋白含量没有明显的影响，对外周血白细胞计数液没有明显影响。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。
实施例 1 促红细胞生成素环状多肽的合成
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。
本发明以SEQ ID NO:1为例，其中直链的制备使用Fmoc固相多肽合成方法，使用CSBio公司生产的CS 336X型仪器进行本发明的多肽的合成。合成的方法按照生产商的仪器说明书进行。本文所述的Fmoc固相多肽合成方法是指以聚合物树脂作为固相反应基质，将氨基端Fmoc保护的氨基酸在偶联试剂的存在下依次缩合，从而合成多肽的合成方法。其具体方法参见Fmoc solid phase peptide synthesis:a practical approach,2000,Oxford University Press。并通过氧化方法形成分子间的二硫键，例如20％DMSO氧化法以及碘氧化法。肽链间的酰胺键的形成方法同肽链间的方法，不同之处就是延长时间。将制得的多肽使用HPLC C18半制备柱进行纯化，流动相为乙腈。经脱盐及冷冻干燥得到多肽冻干粉。
实施例 2. 促红细胞生成素环状多肽对小鼠的作用
采用小鼠评价并比较促红细胞生成素环状多肽及促红细胞生成素蛋白对小鼠红细胞生成的影响。
其中，EPO药品购自沈阳三生制药有限责任公司；
昆明种小鼠，购自中科院上海实验动物中心，体重25～30g，均为雌性小鼠，试验中各组动物数：10只，分为5组。
其中，3组小鼠分别皮下注射SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3，1组小鼠注射促红细胞生成素蛋白，1组小鼠为空 白对照，注射PBS缓冲液，剂量均为4.5mg/kg，连续三天，然后处死小鼠，取全血进行外周血细胞及网织红细胞计数，血细胞计数用全自动血球计数仪计数。
结果如表 1所示，发现促红细胞生成素环状多肽及促红细胞生成素蛋白均能明显刺激小鼠外周血网织红细胞计数的升高，说明它们剌激红细胞生成(见表 1)。
表 1、促红细胞生成素模拟肽衍生物对小鼠网织红细胞生成的影响
名称 剂量 网织红细胞数目
空白 PBS缓冲液 135.44±2.13
SEQ ID NO：1 4.5mg/kg 572.31±1.61
SEQ ID NO：2 4.5mg/kg 583.23±2.01
SEQ ID NO：3 4.5mg/kg 561.15±2.23
EPO 4.5mg/kg 432.11±1.93
。

Claims (6)

1.一种促红细胞生成素多肽由环状构型组成。
2.如权利要求1所述多肽的结构为：
如上序列所示
直链1：(Ac)GGLYADHMGPIT(Nal)VKQPLR(Sar)K
直链2：HMGPIT(Nal)V
其中直链1N6的Asp侧链与链2的N末端形成酰胺键，直链1N15的Lys的侧链与链2的C末端形成酰胺键。
3.如权利要求1所述多肽的结构为：
如上序列所示
直链1：(Ac)GGLYACHMGPIT(Nal)VKQPLR(Sar)K
直链2：(Ac)GGLYAC HMGPIT(Nal)V
其中直链1N6的Cys侧链巯基与链2的Cys侧链巯基形成二硫键，直链1N15的Lys的侧链与链2的C末端形成酰胺键。
4.如权利要求1所述多肽的结构为：
如上序列所示
直链1：(Ac)CGLYAKHMGPIT(Nal)VKQPLR(Sar)K
直链2：(Ac)CGLYAK HMGPIT(Nal)V
其中直链1N1的Cys侧链巯基与链2的Cys侧链巯基形成二硫键，直链1N15的Lys的侧链与链2的C末端形成酰胺键。
5.促红细胞生成素环状多肽可药用在制备用于治疗以缺乏红细胞生成素或红细胞群缺少或缺陷为特征的疾病的药物中的应用。
6.优选地，所述以缺乏红细胞生成素或红细胞群缺少或缺陷为特征的疾病选自末期肾功能衰竭或透析；AIDS相关性贫血，自身免疫性疾病，或恶性肿瘤；囊性纤维变性；早期早熟性贫血；与慢性炎性疾病相关的贫血；脊髓损伤；急性失血；衰老和伴有异常红细胞产生的肿瘤疾病。
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