KR102040752B1 - 류마티스 관절염을 치료 또는 예방하는 약물 제조에서 폴리펩타이드의 응용 - Google Patents

류마티스 관절염을 치료 또는 예방하는 약물 제조에서 폴리펩타이드의 응용 Download PDF

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Abstract

본 발명은 약물분야에 관한 것으로, 구체적으로 인테그린 친화성 및 결합능력을 가진 폴리펩타이드에 관한 것이며, 류마티스 관절염을 치료 또는 예방하는 3개 폴리펩타이드를 포함한다. 상기 3개 폴리펩타이드는 구체적으로 다음과 같다.
폴리펩타이드Ⅰ：Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro(서열 중 이황화 결합이 2쌍이며, 쌍 결합방식은 1-4, 2-3임);
폴리펩타이드Ⅱ：Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp;
폴리펩타이드Ⅲ：mPEG-SC20k-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp이다.
상기 폴리펩타이드는 류마티스 관절염을 치료하는데 사용할 수 있다.

Description

류마티스 관절염을 치료 또는 예방하는 약물 제조에서 폴리펩타이드의 응용{USE OF POLYPEPTIDES IN PREPARATION OF DRUGS FOR TREATING OR PREVENTING RHEUMATOIAD ARTHRITIS}
본 발명은 약물분야에 관한 것으로, 구체적으로 류마티스 관절염을 치료 또는 예방하는 폴리펩타이드에 관한 것이다.
류마티스 관절염(rheumatoid arthritis, RA)은 임상에서 가장 흔한 염증성 관절 질환이며 주요한 불구 요인 중 하나이다. 전세계적으로 약 0.5%~1.0%이며 중국에서 RA의 발병률은 약 0.4%이다. RA는 연령과 상관없이 발생가능한 질환으로, 연령이 증가함에 따라 발병률도 증가하는 편이다. 여성의 다발 연령이 45~55세이고, 성별과 RA 발병은 밀접한 관계가 있으며 남녀 비율은 약 1:3이다. RA는 발명 원인이 밝혀지지 않은 만성 전신 염증성 질병으로, 만성, 대칭성, 다발성 활막 관절염 및 관절외 병변이 주요한 임상 증상이며 자가 면역 염증성 질환이다. 초기에는 손가락 또는 손목 부위가 아프고 부어오르며(특히 손목 배부(背部)가 부음) 증상이 완화되지 않는다. 일반적인 치료로 비록 증상을 완화시킬 수 있으나 약물을 규칙적으로 투여하지 않거나 또는 약물 투여량 부족으로 증상이 반복된다. 병세가 가중되면 현저한 조조경직(morning stiffness) 현상이 발생하는데 일반적으로 1시간 이상 지속되며 계속하여 가중됨과 동시에 일정한 관절 기능 장애가 나타난다.
류마티스 관절염의 발병 원인 및 발병 메커니즘은 아직 밝혀지지 않았으며 그 기본적인 병리특징은 혈관염 및 활막염이다. 관절내 활막 혈관이 증식하여 판누스를 형성하고 이로 인해 활막이 두꺼워지고 더 많이 스며나오며 각종 사이토카인을 분비하므로 연골을 침범하고 골질을 손상시킨다. 뿐만 아니라 그 주위의 근절강, 인대, 건초 및 근육 등 조직에도 모두 침식가능하므로 관절의 안정에 영향을 주어 관절 기형이 쉽게 발생하고 기능장애가 나타난다. 또한 혈관염은 신체의 각종 장기 조직을 침범하여 전신 질병으로 발전할 수도 있다.
현재 RA를 치료하는 약물은 증상 억제 약물 및 질병 억제 약물의 2 종류로 나눈다. 증상을 억제하는 항류마티즘 약물은 4가지 있다. 첫째, 비스테로이드성 항염증 약물(nonsteroidal antiinflammatory drug), 일반적으로 1차 약물이라고 부르는데, 이러한 약물은 종류가 다양하고 중국 국내 시장에만 수십 종류에 달한다. 둘째, 스테로이드 호르몬(steroid hormone), 호르몬은 아주 좋은 진통 항염증 약이지만 이것만 장기 사용하여서는 병세를 개선시킬 수 없을 뿐만 아니라 많은 부작용을 일으키며, 호르몬은 2차로 느리게 작용하는 약물(SAARDs, slow acting anti-rheumatic drugs)이 효과를 일으키기 전의 과도용으로 사용할 수 있으나 용량이 적어야 하며 오랜 시간 투약하는 것은 바람직하지 않다. 병세가 비교적 심할 때 관절 외 증상이 있는 환자인 경우 단기 충격 치료와 2차 약물 치료를 병행해야 한다. 셋째, SAARDs(slow acting anti-rheumatic drugs), 일반적으로 2차 약물이라 부르며 소위 말하는 느리게 작용하는 약물은 항말라리아약(antimalarial drug), 금염(gold salt), 페니실라민(penicillamine) 및 설파살라진((sulfasalazine)을 포함하며, RA 치료에 효과가 느리지만 장기적으로 사용할 경우 RA 병세를 일정하게 완화시키는 작용이 있으므로 병세를 개선하는 약으로 불리기도 한다. 넷째, 면역 억제제, 자주 사용하는 것으로 메토트렉세이트(methotrexate), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 아자티오프린(azathioprine), 뇌공등(Tripterygium wilfordii), 청풍(caulis sinomenii) 등이 있다.
RA의 병리 과정에서 혈관의 형성은 대표적인 조직학 변형의 일종으로 신생 혈관이 형성됨과 동시에 활막이 증식하고 염증 세포의 침윤이 발생한다. 이것은 RA에서 판누스(pannus)가 형성되고 관절이 파괴되는 기초이다. 원래 혈관이 존재하지 말아야 하는 관절 연골에 어떤 이상 변화로 인해 새로운 혈관이 형성되어 연골이 침식을 당하여 관절이 변형되거나 또는 통증을 유발한다. 신생 혈관은 류마티스 관절염 환자의 활막 조직의 이상 변화를 일으키고 정상인의 관절 활막 내층이 단지 1~2층의 세포로 구성되나, RA 환자의 활막 내층은 통상적으로 4~10층의 세포(어떤 경우 심지어 20층을 초과한다)가 존재한다. 이러한 세포는 수적으로 이상 증가하였을 뿐만 아니라 기능적으로도 아주 활발한 상태에 있어, 대량의 사이토카인, 신호 분자 및 프로테아제를 분비할 수 있으므로 관절 파괴의 속도를 가속화시킨다. 한편, RA 활막에 T세포, B세포 및 단핵구와 같은 대량의 염증 세포가 침윤한다.
신생 혈관의 생성은 정상적인 생리 조건에서는 고도의 통제를 받으며 생식, 배아 발육, 조직 재구축 및 상처 치유에서 없어서는 안될 과정이다. 혈관 생성은 각종 병리 조건에서도 발생할 수 있는데, 상기 병리 조건은 종양 성장 및 전이; 염증 장애, 예를 들면 류마티스 관절염, 건선, 골관절염, 염증성 장 질환, 크론병, 궤양성 대장염 및 기타 염증 장애를 포함한다.
인테그린은 세포 표면에 광범위하게 분포된 수용체(receptor)의 한 종류로서 세포와 세포외 기질(extracellular matrix) 그리고 세포와 세포 사이의 접착을 유도할 수 있으며 이들은 세포내 세포 골격 단백질과 세포외 기질 분자를 연결하는 상호작용에 의해 혈관 생성에 참여한다. 현재, 적어도 8종의 인테그린(α1β1, α2β1, α3β1, α6β1, α6β4, α5β1, αvβ3, αvβ5)이 혈관을 생성하는데 참여하고 있으며 그 중, αvβ3가 중요한 역할을 발휘하고 있다. αvβ 3는 리간드 분자중의 RGD(arg-gly-asp) 서열을 식별할 수 있다. αvβ 3는 다양한 종류의 세포에 발현되고 많은 세포가 활동하는 여러 과정에서의 여러 종류의 리간드와 결합하여 종양의 혈관 생성, 침입, 전이, 염증, 상처 치유 및 응혈 등 생리 및 병리 과정에 참여한다. 따라서, RGD 서열을 함유한 폴리펩타이드는 인테그린 길항제 작용이 있으며, RGD 서열은 담체의 한 종류로서, 신생 혈관의 내피(內皮)에 타겟 운반되어 신생 혈관 질병을 더욱 효과적으로 치료한다. 따라서, 혈관을 억제하는 폴리펩타이드는 혈관 생성을 억제하여 활막에 산소 및 영양물질을 공급하는 것을 방지할 뿐만 아니라 혈관의 퇴화를 직접 초래할 수 있음으로써 RA 활막이 증식하는 것을 억제할 수 있다. 신생 혈관의 생성을 억제하는 것이 이와 같은 질병을 치료하는 관건이며, 내피 세포의 증식 및 이전은 신생 혈관을 형성하는 중요한 단계이다.
연구에 의하면, 서열 Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro(Seq NO.4 참조)는 엔도스타틴(endostatin)의 제60~70번째 아미노산이고, 체외에서 신생 혈관의 형성을 억제하는 양호한 활성을 가지며, 그 활성은 심지어 엔도스타틴보다 높다. RGD-4C 서열은 인테그린의 중요한 리간드 중 하나이다. 그러므로 RGD-4C 서열을 함유하는 폴리펩타이드 Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly(Seq NO.5 참조)는 인테그린을 특이적으로 식별할 수 있다. 본 발명에 따른 폴리펩타이드는 혈관 생성을 억제하는 역학을 하는 서열 Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro의 N단에 인테그린군과 친화성 및 결합능력을 가진 RGD-4C 함유 서열 Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly을 연결시켜 인테그린과 높은 친화성 및 결합능력을 가진 폴리펩타이드, 즉 폴리펩타이드Ⅰ를 만들었다. 상기 인테그린 차단제의 폴리펩타이드 서열은 Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro이다. 이는 25개 아미노산을 포함하고 분자 중에서 RGD-4C 서열은 인테그린 친화성 및 결합능력을 가지며 연구에 의하면 그 작용 타겟은 인테그린 αvβ3이며, 상기 서열에 신생 혈관 억제 서열이 포함되어 있으므로 종양의 신생 혈관의 형성을 억제한다. 비록 선행 중국특허 ZL200510040378.5에서 상기 서열이 흑색종(melanotic tumor)에 대해 치료 효과가 있음을 공개하였으나 다른 질병에 대해서도 치료 효과가 있음은 공개하지 않았다. 발명자는 많은 실험을 거듭한 결과, 폴리펩타이드Ⅰ가 콜라겐 관절염 및 애주번트 관절염의 치료에 효과가 현저하고, 부작용이 적으며, 사용량이 적어 원가가 낮다는 것을 발견하였다. 이는, 본 발명에 따른 폴리펩타이드가 과학적이고 합리적이며 효과적이어서 류마티스 관절염을 치료하기 위한 약물의 제조에 사용가능하며 상기 인테그린 차단제의 치료계보를 크게 확장하여, 향후 약물 개발에 새로운 방향과 전망을 제시하고 현저한 사회적 가치 및 시장적 가치가 있다는 것을 설명한다.
중국특허 ZL200510040378.5는 혈관 생성을 효과적으로 억제하는 폴리펩타이드 및 그 제조방법 그리고 응용에 관한 것으로, 1종의 폴리펩타이드를 소개하고 있는데, 그 서열은 Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp(즉, 폴리펩타이드Ⅱ), 상기 서열은 인테그린 리간드 서열[Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp(Seq NO.6 참조)] 및 신생 혈관 억제 서열(Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro)을 포함하며, 그 중, 인테그린 리간드 서열에 RGD 서열(Arg-Gly-Asp)이 포함되어 상기 폴리펩타이드 서열을 인테그린 아형(亞型)에 효과적으로 결합시키며, 상기 서열에 신생 혈관 억제 서열이 포함되어 신생 혈관 형성을 억제할 수 있다. 선행 특허는 흑색종에 대해서만 연구를 진행하였고, 본 발명은 상기 서열에 대해 추가 연구를 진행한 결과, 류마티스 관절염의 치료에 효과가 있음을 발견하여 적용 대상을 확대하고 사회적 가치 및 경제적 가치를 향상시켰다.
한편, 본 발명은 폴리펩타이드Ⅱ에 대해 PEG 수식(修飾)하여 폴리펩타이드Ⅲ：mPEG-SC20k-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp를 얻었다. 중국특허 ZL201110128464.7는 폴리펩타이드Ⅲ가 신생 혈관성 눈병을 치료하는 약물 제조에서의 작용에 대해 소개하였고, 본 발명은 상기 서열에 대해 추가 연구를 진행한 결과, 류마티스 관절염에 대해 치료작용이 있음을 발견하여 적용 대상을 확대하고 사회적 가치 및 경제적 가치를 향상시켰다.
본 발명은 아래 3개 폴리펩타이드, 즉 폴리펩타이드Ⅰ: Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro(서열 중 이황화 결합이 2쌍이며, 페어링 방식은 1-4, 2-3임); 폴리펩타이드Ⅱ：Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp 및 폴리펩타이드Ⅲ：mPEG-SC20k-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp에 대해 많은 실험을 진행한 결과 류마티스 관절염에 모두 양호한 치료 및 예방 작용이 있음을 발견하였다.
류마티스 관절염을 치료 또는 예방하는 약물 제조에서 폴리펩타이드의 응용에 있어서, 상기 폴리펩타이드의 아미노산 서열은,
폴리펩타이드Ⅰ： Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro(AP25라 명명, Seq NO.1 참조);
폴리펩타이드Ⅱ： Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp(HM-3이라 명명, Seq NO.2 참조);
폴리펩타이드Ⅲ: mPEG-SC20k-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp(PEG-HM-3이라 명명, Seq NO.3 참조)이다.
상기 폴리펩타이드Ⅰ, 폴리펩타이드Ⅱ, 폴리펩타이드Ⅲ는 고상(固相) 합성방법 또는 발현체 재조합 방법으로 제조된다.
상기 폴리펩타이드Ⅰ, 폴리펩타이드Ⅱ, 폴리펩타이드Ⅲ는 애주번트를 공유결합으로 연결하고, 애주번트는 소혈청 알부민, 인간혈청 알부민 또는 폴리에틸렌글리콜이다.
상기 류마티스 관절염을 치료 또는 예방하는 약물에 폴리펩타이드Ⅰ, 폴리펩타이드Ⅱ, 폴리펩타이드Ⅲ가 허용가능한 유효량의 염이 포함되거나 또는 필요에 따라 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제가 포함된다.
상기 약물은 여러 가지 투약방법을 통해 류마티스 관절염을 예방 또는 치료할 수 있으며 상기 투약방법은, 피하 또는 근육 주사, 정맥 주사 또는 정맥 점적 수사, 경구 투약(예를 들면 정제, 캡슐 등), 코 스프레이 방법을 포함한다.
1. 선행연구를 통해, 폴리펩타이드Ⅰ, 폴리펩타이드Ⅱ, 폴리펩타이드Ⅲ가 항종양 효과가 비교적 우수함을 발견하였다. 본 발명은 폴리펩타이드Ⅰ, 폴리펩타이드Ⅱ, 폴리펩타이드Ⅲ에 대해 많은 연구를 거듭한 결과, 폴리펩타이드Ⅰ, 폴리펩타이드Ⅱ, 폴리펩타이드Ⅲ가 류마티스 관절염에 대해서도 양호한 치료 효과가 있음을 발견하였으며 폴리펩타이드Ⅰ, 폴리펩타이드Ⅱ, 폴리펩타이드Ⅲ가 류마티스 관절염에 대한 치료 작용과 관련하여 아직 어떠한 문헌에도 공개된 바가 없으며 특허로 출원된 것도 없다. 본 발명에서 발견한 폴리펩타이드Ⅰ, 폴리펩타이드Ⅱ, 폴리펩타이드Ⅲ가 류마티스 관절염에 대한 치료작용은 또 하나의 중대한 발견이며 발명이다. 이는 적용대상을 확대하였고 사회적 가치와 경제적 가치를 향상시켰다.
2. 작용 메커니즘에 대한 소개：
연구 결과, 서열 Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro는 신생 혈관의 생성을 억제하는 활성을 가진다. RGD-4C 서열은 인테그린의 중요한 리간드이므로 RGD-4C 서열을 함유하는 폴리펩타이드 Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly는 인테그린을 특이적으로 식별할 수 있다. 본 발명에 따른 폴리펩타이드는 혈관 생성을 억제하는 역할을 하는 서열 Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro의 N단에 인테그린군와 친화성 및 결합능력을 가진 RGD-4C 서열을 함유한 Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly를 연결시켜, 인테그린과 높은 친화성 및 결합능력을 가진 폴리펩타이드, 즉 폴리펩타이드Ⅰ를 만들었다. 상기 인테그린 차단제의 폴리펩타이드 서열은 Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro이며, 분자중에서 RGD-4C서열이 타겟성을 가지며 인테그린과 친화성 및 결합능력을 가지며, 연구에 의하면 작용 타겟은 인테그린 αvβ3이며, 상기 서열 중에 신생 혈관을 억제하는 서열이 있어, 신생 혈관의 형성을 억제한다.
Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp(즉, 폴리펩타이드Ⅱ)서열은 인테그린 리간드 서열(Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp) 및 신생 혈관을 억제하는 서열(Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro)을 포함하며, 인테그린 리간드 서열은 RGD 서열(Arg-Gly-Asp)을 포함하고, 타겟성이 있어 상기 폴리펩타이드 서열을 인테그린 아형에 효과적으로 결합시키고 상기 서열에 신생 혈관을 억제하는 서열이 포함되어 있어 신생 혈관의 형성을 억제할 수 있다. 게다가 본 발명은 폴리펩타이드Ⅱ에 대해 PEG 수식하여 폴리펩타이드Ⅲ：mPEG-SC20k-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp를 얻었고, 반감기를 연장하였을 뿐만 아니라 RGD 서열의 타겟성으로 인해, 폴리펩타이드는 RA의 관절 부위의 판누스 형성 과정의 신생 혈관 내피에 타겟팅가능하므로 신생 혈관의 형성을 억제할 수 있어 류마티스 관절염을 치료 또는 예방하는 효과에 도달할 수 있다.
발명자는 많은 실험을 거듭한 결과 폴리펩타이드Ⅰ, 폴리펩타이드Ⅱ 및 폴리펩타이드Ⅲ가 애주번트 랫 류마티스 관절염 및 DBA/1 마우스 콜라겐 류마티스 관절염의 발전을 억제할 수 있으며, 체내 실험을 통해, 류마티스 관절염의 치료에 뚜렷한 효과가 있고 부작용이 적으며 사용량이 적어 원가가 낮다는 것을 입증하였다. 이는 본 발명에 따른 폴리펩타이드가 과학적이고 합리적이며 효과적이어서 류마티스 관절염을 치료하기 위한 약물로 사용가능하며 상기 폴리펩타이드의 치료 범위를 크게 확장하여, 향후 약물 개발에 새로운 방향과 전망을 제시하고 현저한 사회적 가치 및 시장적 가치가 있다는 것을 설명한다.
도 1은 폴리펩타이드Ⅰ가 DBA/1 마우스 콜라겐 관절염 모델의 족(璃) 종창(腫脹, swelling)에 미치는 영향을 나타낸다.
도 2는 폴리펩타이드Ⅰ가 DBA/1 마우스 콜라겐 관절염 모델의 관절 종창에 미치는 영향을 나타낸다.
도 3은 폴리펩타이드Ⅰ가 DBA/1 마우스 콜라겐 관절염 모델의 사지(四肢) 관절의 임상 평점에 미치는 영향을 나타낸다.
도 4는 폴리펩타이드Ⅰ가 애주밴트 원발성 관절염 모델의 랫 좌족(左足) 종창에 미치는 영향을 나타낸다.
도 5는 폴리펩타이드Ⅰ가 애주밴트 계발성 관절염 모델의 랫 우족(右足) 종창에 미치는 영향을 나타낸다.
도 6은 폴리펩타이드Ⅰ가 랫 애주번트 관절염 모델의 사지관절의 임상 평점에 미치는 영향을 나타낸다.
도 7은 폴리펩타이드Ⅱ가 DBA/1 마우스 콜라겐 관절염 모델의 족 종창에 미치는 영향을 나타낸다.
도 8은 폴리펩타이드Ⅱ가 DBA/1 마우스 콜라겐 관절염 모델의 관절 종창에 미치는 영향을 나타낸다.
도 9는 폴리펩타이드Ⅱ가 DBA/1 마우스 콜라겐 관절염 모델의 사지관절의 임상 평점에 미치는 영향을 나타낸다.
도 10은 폴리펩타이드Ⅱ가 애주밴트 원발성 관절염 모델의 랫 좌족 종창에 미치는 영향을 나타낸다.
도 11은 폴리펩타이드Ⅱ가 애주밴트 계발성 관절염 모델의 랫 우족 종창에 미치는 영향을 나타낸다.
도 12는 폴리펩타이드Ⅱ가 랫 애주번트 관절염 모델의 사지관절의 임상 평점에 미치는 영향을 나타낸다.
도 13은 폴리펩타이드Ⅲ가 DBA/1 마우스 콜라겐 관절염 모델의 족 종창에 미치는 영향을 나타낸다.
도 14는 폴리펩타이드Ⅲ가 DBA/1 마우스 콜라겐 관절염 모델의 관절 종창에 미치는 영향을 나타낸다.
도 15는 폴리펩타이드Ⅲ가 DBA/1 마우스 콜라겐 관절염 모델의 사지관절의 임상 평점에 미치는 영향을 나타낸다.
도 16은 폴리펩타이드Ⅲ가 애주밴트 원발성 관절염 모델의 랫 좌족 종창에 미치는 영향을 나타낸다.
도 17은 폴리펩타이드Ⅲ가 애주밴트 계발성 관절염 모델의 랫 우족 종창에 미치는 영향을 나타낸다.
도 18은 폴리펩타이드Ⅲ가 랫 애주번트 관절염 모델의 사지관절의 임상 평점에 미치는 영향을 나타낸다.
실시예 1
폴리펩타이드Ⅰ, 폴리펩타이드Ⅱ 및 폴리펩타이드Ⅲ는 모두 고상 합성방법으로 합성되고, 고성능 액체크로마토그래피를 통해 정화하고, RP-HPLC로 폴리펩타이드의 순도를 측정했다. 합성방법은 중국특허 ZL 201110194918.0와 키 201110370529.9를 참조하기 바란다.
결과：합성된 폴리펩타이드에 대해 역으로 액체크로마토그래피 분석을 거쳐 순도를 측정한 결과: 폴리펩타이드Ⅰ, 폴리펩타이드Ⅱ 및 폴리펩타이드Ⅲ의 순도가 각각 96.94%, 99.30%, 96.34%로서 모두 95%보다 높으므로 개발요구에 부합한다.
실시예 2
폴리펩타이드Ⅰ가 콜라겐 유도 마우스 관절염 동물 모델에서의 체내 면역 보호 작용
콜라겐 마우스 관절염 동물 모델을 만들고 폴리펩타이드가 마우스 콜라겐 유도 관절염(collagen induced arthritis, CIA)에 대한 치료작용을 연구한다. 마우스(mouse)를 실험대상 동물로 하고 SPF급 DBA/1 마우스 90마리(Sino-British SIPPR Lab. Animal Ltd에서 제공하고, 동물생산 허가증 코드：SCXK(호)2008-0016), 수컷, 7-8주령(周齡), 몸무게가 18~22g이고, 랜덤으로 9군으로 나누는데, 각각 정상대조군, 모델대조군, 폴리펩타이드Ⅰ 저, 중, 고의 3개 투여량군(0.2, 0.4, 0.8 mg/kg) 및 양성약물 대조군(메토트렉세이트 1mg/kg)이다. 정상군 외에, 제0일째 각 실험군은 마우스 CIA 모델을 만드는데, 그 방법은, 닭연골(Chicken Cartilage)Ⅱ형 콜라겐(cⅡ)용 0.1mol/l의 초산을 4mg/ml의 용액으로 용해하여 4℃의 냉장고에서 밤 내내 보관한다. 실험당일, Ⅱ형 콜라겐과 4mg/ml의 Myeobaeterium tuberculosis strain H37Rv의 완전프로인트항원보강제(CFA)을 동일 체적으로 충분히 유화시켜 DBA/1 마우스가 마취된 후 꼬리 부위 피부에 마리당 50μl의 유화제를 주사하여 면역시키고, 21일이 지난 후 4mg/ml의 Ⅱ형 콜라겐(cⅡ)과 불완전 프로인트항원애주번트(IFA)를 동일 체적으로 충분히 유화시켜 같은 량의 유화제로 꼬리 부위에 다시 면역시킨다. 모델링 제30일째부터 피하주사방식으로 약물을 투여한다. 폴리펩타이드Ⅰ의 3개 투여량군(0.2, 0.4, 0.8mg/kg)：매일 2회, 연속 10일; 양성약물 대조군(메토트렉세이트 1mg/kg)：5일마다 1회, 3회 연속; 정상대조군과 모델대조군(생리식염수)：연속 10일. 모델링 후의 제21일 내지 제70일 사이에 3일마다 몸무게를 측정하고 관절에 대해 평점을 하고 후측 좌우 양족(兩足)의 복사뼈 직경을 각각 측정하여 약물이 마우스 콜라겐 관절염에 미치는 영향을 관찰하였다. 제70일째 마우스를 탈구시켜 죽인다.
관절염 평가 지표는 다음과 같다.
1) 관절에 대한 평점
사지: 0~4의 5등급으로 평점을 하되, 0 = 무홍반 또는 무홍종(紅腫)); 1 = 경미한 홍반 또는 홍종, 그 중 하나의 전/후측 족(足)에 홍반 또는 종창(swelling, 腫脹)이 발생; 2 = 2이상의 족에 홍반 또는 종창이 발생; 3 = 복사뼈 또는 발목 관절 아래의 족에 종창이 발생; 4 = 발목 관절을 포함한 모든 족에 종창이 발생. 마우스의 네족에 대해 각각 평점을 하고 최고 평점으로 16점을 준다.
모델링 후의 제21일 내지 제70일 사이에 3일마다 관절에 대해 평점하여 결과를 기록한다.
2) 복사뼈 직경을 측정하다
모델링 전과 모델링 후의 제21일 내지 제70일 사이에 3일에 한번씩 버니어 캘리퍼(vernier caliper)로 마우스의 왼쪽, 오른쪽 복사뼈 내측에서 외측까지 직경 및 복사뼈의 두께를 측정하여 결과를 기록한다.
시험결과의 측정 데이터는 평균값±표준편차(mean ± SD)로 표시하고 SPSS 11.0 소프트웨어 프로그램으로 각각의 투약군과 대조군 사이의 t검사를 진행하며, *는 p< 0.05를 나타내며, **는 p< 0.01을 나타낸다.
결과：모델링 후의 마우스와 정상 마우스를 비교할 때, 마우스 꼬리 부위의 피내(皮內)에 불활성화 결핵균을 함유한 완전프로인트항원보강제와 콜라겐을 등일 체적으로 혼합한 유화제를 주사하고, 21일이 지난 후 꼬리 부위의 피내에 불완전프로인트항원보강제과 콜라겐을 동일 체적으로 혼합한 유화제를 주사하여 면역시킨 후, 제27일째에 CIA 마우스의 족에 홍종이 발생하고, 관절염 지수 평점이 높아지고 모델군은 제45-60일째가 종창 피크시기이며 모델군은 제35일째부터 몸무게가 거의 증가하지 않으나 후기(後期)에 약간 낮아진다. 폴리펩타이드가 콜라겐 유도 마우스 관절염 동물 모델의 체내에서의 면역 보호 작용은 표 1을 참조하기 바란다. 표 1로부터 알 수 있듯이, 폴리펩타이드Ⅰ가 콜라겐 유도 마우스 관절염 동물 모델에 대해 모두 체내 면역 보호 작용을 발휘할 수 있으며 구체적인 결과는 다음과 같다.
폴리펩타이드Ⅰ가 마우스 콜라겐 관절염 모델의 족 종창에 미치는 영향은 도 1를 참조하기 바란다. 양성대조군, 폴리펩타이드Ⅰ의 고, 중, 저투여량군의 족 종창과 모델군을 비교할 때, 모두 매우 현저한 차이를 나타냈으며(p<0.01), 이와 같은 실험결과는 통계학적 의미를 지닌다. 폴리펩타이드Ⅰ가 마우스 콜라겐 관절염 모델의 관절 종창에 미치는 영향은 도 2를 참조하기 바란다. 양성대조군, 폴리펩타이드Ⅰ의 고, 중, 저 투여량군의 관절 종창과 모델군을 비교할 때, 모두 매우 현저한 차이를 나타냈으며(p<0.01), 이와 같은 실험결과는 통계학적 의미를 지닌다. 폴리펩타이드Ⅰ가 콜라겐 관절염 마우스의 임상 평점에 미치는 영향은 도 3을 참조하기 바란다. 폴리펩타이드Ⅰ의 저, 중, 고투여량군의 사지 평점은 모델대조군보다 현저하게 낮으며(p<0.01), 모델대조군과 비교시 매우 현저한 차이를 나타냈으며 이와 같은 실험결과는 통계학적 의미를 지닌다.
<폴리펩타이드Ⅰ가 콜라겐 마우스 관절염 동물 모델에 대한 체내 면역 보호 작용>
군별 마리수 (n) 투여량 ( mg / kg ) 좌우족종창도 ( mm ) 관절종창도 ( mm ) 임상평점
정상대조군 10 -- 0.18±0.05** 0.19±0.04** 0.00±0.00**
모델대조군 10 -- 1.94±0.37 1.93±0.40 15.5±2.3
양성대조군 10 1 0.95±0.19** 0.76±0.17** 8.1±1.2**
폴리펩타이드Ⅰ고 10 0.8 1.29±0.26** 1.05±0.31** 10.4±1.6**
폴리펩타이드Ⅰ중 10 0.4 0.92±0.18** 0.76±0.17** 9.1±1.4**
폴리펩타이드Ⅰ저 10 0.2 1.10±0.22** 0.93±0.23** 9.7±1.5**
*는 p< 0.05를 나타내고, **는 p< 0.01을 나타낸다.
결론：폴리펩타이드Ⅰ가 마우스 콜라겐 관절염에 대해 치료작용이 있다.
실시예 3
폴리펩타이드Ⅰ가 애주번트 랫(rat) 관절염 동물 모델에 대한 체내 면역 보호 작용
랫 애주번트 관절염 동물 모델을 만들고, 폴리펩타이드가 애주번트 관절염(Adjuvant arthritis, AA)의 랫에 대한 치료작용을 연구한다. 랫을 실험대상 동물로 하고, SPF급 SD 랫 90마리(Sino-British SIPPR Lab. Animal Ltd에서 제공하고, 동물생산 허가증 코드：SCXK(호)2008-0016), 수컷, 몸무게가 140g~160g이고, 랜덤으로 9군으로 나누는데, 각각 정상대조군, 모델대조군, 폴리펩타이드Ⅰ 저, 중, 고의 3개 투여량군(0.1, 0.2, 0.4mg/kg) 및 양성약물 대조군(메토트렉세이트1 mg/kg)이다. 정상군 외에, 제0일째 각 실험군은 랫 AA 모델을 만드는데, 그 방법은, 랫의 후측 왼쪽 후족에 불활성화 결핵균(H37RA, 10mg/ml)을 함유한 완전프로인트항원보강제를 0.08ml 주사하여 랫 애주번트 관절염 모델을 만든다. 모델링 제10일째부터 피하주사로 투약한다. 폴리펩타이드Ⅰ의 3개 투여량군(0.1, 0.2, 0.4mg/kg)：1일 2회, 연속 10일; 양성약물 대조군(메토트렉세이트 1mg/kg)：5일마다 1회, 연속 3회; 정상대조군 및 모델대조군(생리식염수)： 연속 10일. 각각 모델링 후의 제8, 11, 14, 17, 20, 23 및 26일에 관절에 대해 평점하고 후측 좌우 복사뼈 직경을 각각 측정하여 약물이 랫 애주번트 관절염에 미치는 영향을 관찰하였다.
관절염 평가 지표는 다음과 같다.
1) 관절에 대한 평점
사지: 0~4의 5등급으로 평점을 하되, 0 = 무홍반 또는 무홍종(紅腫); 1 = 경미한 홍반 또는 홍종, 그 중 하나의 전/후 족 관절에 홍반 또는 홍종이 발생; 2 = 2이상의 족에 홍반 또는 종창(腫脹)이 발생; 3 = 복사뼈 또는 발목 관절 아래의 족에 종창이 발생; 4 = 복사뼈 관절을 포함한 모든 족에 종창이 발생. 랫의 4개 족에 대해 각각 평점을 하고 최고 평점으로 16점을 준다.
모델링 후의 제8, 11, 14, 17, 20, 23 및 26일에 관절에 대해 평점을 주고 결과를 기록한다.
2) 복사뼈 직경을 측정하다
모델링 전과 모델링 후의 제8, 11, 14, 17, 20, 23 및 26일에 버니어 캘리퍼(vernier caliper)로 랫의 좌우 복사뼈 내측에서 외측까지의 직경 및 복사뼈의 두께를 측정하여 결과를 기록한다.
시험결과의 측정 데이터는 평균값±표준편차(mean±SD)로 표시하고, SPSS 11.0 소프트웨어 프로그램으로 각각의 투약군과 대조군 사이의 t검사를 진행하며 *는 p< 0.05를 나타내며, **는 p< 0.01을 나타낸다.
결과： 모델링 후의 랫과 정상 랫을 비교할 때, 랫의 좌우 후족에 불활성화 결핵균을 함유한 완전프로인트항원보강제를 주사한 후, 후측 좌족(左足)에 원발성 관절염이 빠르게 발생하여 현저한 종창이 나타남과 동시에 곪는다. 후측 우족(右足)은 약 10일 후에 계발성 관절염이 나타나기 시작하며 평가 점수가 점차 증가하게 되며 동시에 귀 부위 혈관이 현저하게 증식하고, 홍종이 뚜렷해 지고 꼬리 부위 관절에 종창이 발생한다. 폴리펩타이드가 콜라겐 유도 랫 관절염 동물 모델에서의 체내 면역 보호 작용의 결과는 표 2에 표시한 바와 같다. 표로부터 알 수 있듯이, 폴리펩타이드Ⅰ는 콜라겐 유도 랫 관절염 동물 모델에 대해 모두 체내 면역 보호 작용을 발휘할 수 있다. 구체적인 결과는 다음과 같다.
폴리펩타이드Ⅰ가 랫 원발성 관절염 좌족의 종창에 미치는 영향은 도 4를 참조기 바란다. 랫 양성대조군, 폴리펩타이드Ⅰ의 중 투여량군의 후측 왼쪽 복사뼈의 직경과 모델군을 비교하면, 매우 현저한 차이(p<0.01)가 있으며; 인테그린 차단제 폴리펩타이드Ⅰ의 저, 고투여량군의 후측 왼쪽 복사뼈 직경과 모델군을 비교하면 모두 현저한 차이(p<0.05)가 있으며 이와 같은 실험결과는 통계학적 의미를 가진다. 폴리펩타이드Ⅰ가 랫 계발성 관절염의 우족의 종창에 미치는 영향은 도 5를 참조하기 바란다. 랫 양성대조군, 폴리펩타이드Ⅰ의 저, 중, 고투여량군의 후측 오른쪽 복사뼈의 직경과 모델군을 비교하면 현저한 차이(p<0.05)가 있다. 폴리펩타이드Ⅰ가 애주번트 관절염의 랫 임상 평점에 미치는 영향은 도 6을 참조하기 바라며, 폴리펩타이드Ⅰ의 저, 중, 고투여량군의 사지(四肢) 평점은 모델대조군보다 현저하게 낮으며(p<0.05), 모델대조군과의 차이는 모두 통계학적 의미가 있다.
<폴리펩타이드Ⅰ가 랫 애주번트 관절염 동물 모델에 대한 체내 면역 보호 작용>
군별 마리수 (n) 투여량 ( mg / kg ) 좌족종창도 ( mm ) 우족종창도 ( mm ) 임상평점
정상대조군 10 -- 0.90±0.18** 0.40±0.08** 0.0±0.0**
모델대조군 10 -- 7.01±1.4 3.29±0.94 13.1±2.6
양성대조군 10 1 3.60±0.72** 0.68±0.19** 5.0±1.0*
폴리펩타이드Ⅰ고 10 0.4 4.77±0.95* 1.25±0.30* 6.0±1.2*
폴리펩타이드Ⅰ중 10 0.2 3.81±0.76** 0.79±0.18* 5.3±1.0*
폴리펩타이드Ⅰ저 10 0.1 4.27±0.85* 1.18±0.31* 5.7±1.1*
*는 p< 0.05이며, **는 p< 0.01이다.
결론：폴리펩타이드Ⅰ가 AA 랫 관절염에 대해 치료 작용이 있다.
실시예 4
폴리펩타이드Ⅱ가 콜라겐 유도 마우스 관절염 동물 모델에서의 체내 면역 보호 작용
구체적인 실시방식은 실시예 2를 참조하기 바란다. 폴리펩타이드Ⅱ의 투약방법은 폴리펩타이드Ⅱ의 3개 투여량군(0.8, 1.6, 3.2mg/kg)：매일마다 2회, 연속하여 10일을 투약한다.
결과：모델링 후의 마우스와 정상 마우스를 비교하면, 마우스 꼬리 부위 피내에 불활성화 결핵균을 함유한 완전프로인트항원보강제와 콜라겐을 동일 체적으로 혼합한 유화제를 주사하고, 21일 후에는 꼬리 부위의 피내에 불완전프로인트항원보강제와 콜라겐을 동일 체적으로 혼합한 유화제를 주사하고, 면역시킨 후 제27일에 CIA 마우스의 족에 홍종이 발생하고 관절염 지수 평점이 높아지고, 모델군은 제45~60일째가 종창 피크이며 모델군은 제35일째부터 몸무게가 거의 증가하지 않으나, 후기에 약간 낮아진다. 폴리펩타이드가 콜라겐 유도 마우스 관절염 동물 모델에서의 체내 면역 보호 작용은 표 3을 참조하기 바란다. 표로부터 알 수 있듯이, 폴리펩타이드Ⅱ가 콜라겐 유도 마우스 관절염 동물 모델에 대해 체내 면역 보호 작용을 모두 발휘할 수 있다. 구체적인 결과는 다음과 같다.
폴리펩타이드Ⅱ가 마우스 콜라겐 관절염의 족 종창에 미치는 영향은 도 7을 참조하기 바란다. 양성대조군, 저투여량군의 복사뼈의 직경과 모델군을 비교하면 모두 매우 현저한 차이(p<0.01)가 있으며, 이와 같은 실험결과는 통계학적 의미가 있다. 폴리펩타이드Ⅱ가 마우스 콜라겐 관절염의 관절 종창에 미치는 영향은 도 8을 참조하기 바란다. 양성대조군, 폴리펩타이드Ⅱ의 고, 저투여량군의 관절 종창과 모델군을 비교하면, 모두 현저한 차이(p<0.05)가 있으며, 이와 같은 실험결과는 통계학적 의미를 가진다. 폴리펩타이드Ⅱ가 콜라겐 관절염 마우스의 임상 평점에 미치는 영향은 도 9를 참조하기 바란다. 폴리펩타이드Ⅱ의 저, 고투여량군의 사지 평점도 모델대조군보다 현저하게 낮으며(p<0.05), 모델대조군과 현저한 차이가 있는 실험결과는 통계학적 의미를 가진다.
<폴리펩타이드Ⅱ가 콜라겐 마우스 관절염 동물 모델에 대한 체내 면역 보호 작용>
군별 마리수 (n) 투여량 ( mg / kg ) 좌우족종창도 ( mm ) 관절종창도 ( mm ) 임상평점
정상대조군 10 -- 0.04±0.07** -0.22±0.12** 0.00±0.00**
모델대조군 10 -- 0.52±0.46 0.32±0.60 7.40±3.85
양성대조군 10 1 0.21±0.45 -0.19±0.43* 2.33±2.73*
폴리펩타이드Ⅱ고 10 3.2 0.23±0.35 -0.18±0.49* 2.67±2.34*
폴리펩타이드Ⅱ중 10 1.6 0.45±0.41 0.35±0.80 5.83±2.93
폴리펩타이드Ⅱ저 10 0.8 0.13±0.28** -0.19±0.28* 2.33±3.14*
*는 p< 0.05를 나타내고, **는 p< 0.01을 나타낸다.
결론：폴리펩타이드Ⅱ가 마우스 콜라겐 관절염에 대해 치료작용이 있다.
실시예 5
폴리펩타이드Ⅱ가 애주번트 랫 관절염 동물 모델에 대한 체내 면역 보호 작용
구체적인 실시방식은 실시예 3을 참조하기 바란다. 폴리펩타이드Ⅱ의 투약방식은 폴리펩타이드Ⅱ의 3개 투여량군(0.4, 0.8, 1.6 mg/kg )：매일 3회, 연속 10일 투약한다.
결과： 모델링 후의 랫과 정상 랫을 비교하면, 랫의 후측 왼쪽 후족에 불활성화 결핵균을 함유한 완전프로인트항원보강제를 주사한 후, 후측 좌족은 원발성 관절염이 빠르게 발생하여, 현저한 종창이 나타나고 곪는다. 후측 우족은 약 10일후에 계발성 관절염이 나타나기 시작하고, 평가 점수도 점차 증가하며 귀부위 혈관의 증식도 현저하고 홍종이 현저하며 꼬리 부위의 관절에 종창이 나타난다. 폴리펩타이드가 콜라겐 유도 랫 관절염 동물 모델에서의 체내 면역 보호 작용의 결과는 표 4를 참조하기 바란다. 표 4로부터 알 수 있듯이, 폴리펩타이드Ⅱ가 콜라겐 유도 랫 관절염 동물 모델에서 체내 면역 보호 작용을 모두 발휘할 수 있다. 구체적인 결과는 다음과 같다.
폴리펩타이드Ⅱ가 랫 원발성 관절염의 좌족 종창에 미치는 영향은 도 10을 참조하기 바란다. 랫 양성대조군의 후측 왼쪽 복사뼈의 직경과 모델군을 비교하면, 매우 현저한 차이(p<0.01)가 있다. 인테그린 차단제 폴리펩타이드Ⅱ의 중투여량군의 후측 왼쪽 복사뼈의 직경과 모델군을 비교하면, 현저한 차이(p<0.05)가 있으며, 이와 같은 실험결과는 통계학적 의미가 있다. 폴리펩타이드Ⅱ가 랫 계발성 관절염 우족 종창에 미치는 영향은 도 11을 참조하기 바란다. 랫 양성대조군, 폴리펩타이드Ⅱ의 저투여량군의 후측 오른쪽 복사뼈의 직경과 모델군을 비교하면, 현저한 차이(p<0.05)가 있다. 폴리펩타이드Ⅱ가 애주번트 관절염의 랫의 임상 평점에 미치는 영향은 도 12를 참조하기 바란다. 폴리펩타이드Ⅱ의 중, 고투여량군의 사지평점은 모델대조군보다 현저하게 낮으며(p ＜0.05) 모델대조군과의 차이는 모두 통계학적 의미가 있다.
<폴리펩타이드Ⅱ가 애주번트 랫 관절염 동물 모델에 대한 체내 면역 보호 작용>
군별 마리수 (n) 투여량 ( mg / kg ) 좌족종창도 ( mm ) 우족종창도 ( mm ) 임상평점
정상대조군 10 -- 1.00±0.47** 0.25±0.28** 0.00±0.00**
모델대조군 10 -- 6.59±0.88 2.87±1.27 10.43±3.87
양성대조군 10 1 3.23±1.20** 0.13±0.33** 4.00±0.00**
폴리펩타이드Ⅱ고 10 1.6 4.98±1.97 1.97±1.56 7.29±3.40*
폴리펩타이드Ⅱ중 10 0.8 4.50±1.95* 1.63±1.57 6.57±4.24*
폴리펩타이드Ⅱ저 10 0.4 5.03±1.99 1.56±1.66* 8.29±4.86
*는 p< 0.05를 나타내고, **는 p< 0.01을 나타낸다.
결론：폴리펩타이드Ⅱ가 AA 랫 관절염에 대해 치료작용이 있으며 비교한 바에 따르면 폴리펩타이드Ⅱ군의 효과가 폴리펩타이드Ⅰ보다 높다.
실시예 6
폴리펩타이드Ⅲ가 콜라겐 유도 마우스 관절염 동물 모델에서의 체내 면역 보호 작용
구체적인 실시방식은 실시예 2를 참조하기 바란다. 폴리펩타이드Ⅲ의 투약방식은 폴리펩타이드Ⅲ의 3개 투여량군(10, 20, 40mg/kg )：2일에 1회, 연속 5회 투약한다.
결과: 모델링 후의 마우스와 정상 마우스를 비교하면, 마우스의 꼬리 부위의 피내에 불활성화 결핵균을 함유한 완전프로인트항원보강제와 콜라겐을 동일 체적으로 혼합한 유화제를 주사하고, 21일이 지난 후에 꼬리 부위의 피내에 불완전프로인트항원보강제와 콜라겐을 동일 체적으로 혼합한 유화제를 주사하고 면역시킨 후, 제27일째에 CIA 마우스의 족에 홍종이 발생하고, 관절염 지수의 평점이 높아지고, 모델군의 제45~60일째가 종창 피크이며, 모델군은 제35일째부터 몸무게가 거의 증가하지 않으나 후기에는 약간 낮아진다. 폴리펩타이드가 콜라겐 유도 마우스 관절염 동물 모델에서의 체내 면역 보호 작용은 표 5를 참조하기 바란다. 표 5로부터 알 수 있듯이, 폴리펩타이드Ⅲ가 콜라겐 유도 마우스 관절염 동물 모델에서 체내 면역 보호 작용을 모두 발휘할 수 있다. 구체적인 결과는 다음과 같다.
폴리펩타이드Ⅲ가 마우스 콜라겐 관절염의 족 종창에 미치는 영향은 도 13을 참조하기 바란다. 양성대조군, 폴리펩타이드Ⅲ의 고투여량군의 복사뼈의 직경과 모델군을 비교하면, 모두 현저한 차이 (p<0.05)가 있으며 이와 같은 실혐결과는 통계학적 의미가 있다. 폴리펩타이드Ⅲ가 마우스 콜라겐 관절염의 관절 종창에 미치는 영향은 도 14를 참조하기 바란다. 양성대조군, 폴리펩타이드Ⅲ의 고투여량군의 관절 종창과 모델군을 비교하면, 모두 현저한 차이(p<0.05)가 있으며, 이와 같은 실험결과는 통계학적 의미를 가진다. 폴리펩타이드Ⅲ가 콜라겐 관절염의 마우스의 임상 평점에 미치는 영향은 도 15를 참조하기 바란다. 폴리펩타이드Ⅲ의 고투여량군의 사지평점은 모델대조군보다 현저하게 낮으며(p ＜0.05), 모델대조군과의 현저한 차이가 있는 실험결과는 통계학적 의미를 가진다.
<폴리펩타이드Ⅲ가 콜라겐 마우스 관절염 동물 모델에 대한 체내 면역 보호 작용>
군별 마리수 (n) 투여량 ( mg / kg ) 좌우족종창도 ( mm ) 관절종창도 ( mm ) 임상평점
정상대조군 10 -- 0.04±0.07** -0.22±0.12** 0.00±0.00**
모델대조군 10 -- 0.52±0.46 0.32±0.60 7.40±3.85
양성대조군 10 1 0.21±0.45* -0.19±0.43* 2.33±2.73*
폴리펩타이드Ⅲ고 10 40 0.14±0.42* 0.07±0.08* 2.00±2.37*
폴리펩타이드Ⅲ중 10 20 0.34±0.42 0.12±0.55 6.33±4.23
폴리펩타이드Ⅲ저 10 10 0.37±0.35 0.23±0.43 4.83±2.99
*는p< 0.05를 나타내고, **는 p< 0.01을 나타낸다.
결론：폴리펩타이드Ⅲ는 마우스 콜라겐 관절염에 치료작용이 있다.
실시예 7
폴리펩타이드Ⅲ가 애주번트 랫 관절염 동물 모델에 대한 체내 면역 보호 작용
구체적인 실시방식은 실시예 3을 참조하기 바란다. 폴리펩타이드Ⅲ의 투약 방식은 폴리펩타이드Ⅲ의 3개 투여량군(10, 20, 40mg/kg)：2일 1회, 연속 5회 투약한다.
결과：모델링 후의 랫과 정상 랫을 비교하면, 랫의 후측 왼쪽 후족 부위에 불활성화 결핵균을 함유한 완전프로인트항원보강제를 주사한 후, 후측 좌족에 원발성 관절염이 빠르게 발생하여 현저한 종창이 나타나고 곪는다. 후측 우족은 약 10일 후부터 계발성 관절염이 나타나기 시작하고, 평가 점수는 점차 높아지고 동시에 귀부위의 혈관이 현저하게 증식하고 홍종이 현저하며, 꼬리 부위의 관절에 종창이 나타난다. 폴리펩타이드가 콜라겐 유도 랫 관절염 동물 모델에서의 체내 면역 보호 작용에 대한 결과는 표 6을 참조하기 바란다. 표 6으로부터 알 수 있듯이, 폴리펩타이드Ⅲ가 콜라겐 유도 랫 관절염 동물 모델에 대해 체내 면적 보호 작용을 모두 발휘할 수 있다. 구체적인 결과는 다음과 같다.
폴리펩타이드Ⅲ가 랫 원발성 관절염의 족 종창에 미치는 영향은 도 16을 참조하기 바란다. 랫 양성대조군, 폴리펩타이드Ⅲ의 저투여량군의 후측 왼쪽 복사뼈의 직경과 모델군을 비교하면, 매우 현저한 차이(p<0.01)가 있으며; 인테그린 차단제의 폴리펩타이드Ⅲ의 중, 고투여량군의 후측 왼쪽 복사뼈의 직경과 모델군을 비교하면, 모두 현저한 차이(p<0.05)가 있으며 이 실험결과는 통계학적 의미를 가진다. 폴리펩타이드Ⅲ가 랫 계발성 관절염의 족 종창에 미치는 영향은 도 17을 참조하기 바란다. 랫 양성대조군, 폴리펩타이드Ⅲ의 저투여량군의 후측 오른쪽 복사뼈의 직경과 모델군을 비교하면, 매우 현저한 차이(p<0.01)가 있으며, 폴리펩타이드Ⅲ의 중, 고투여량군의 후측 오른쪽 복사뼈의 직경과 모델군을 비교하면, 현저한 차이(p<0.05)가 있다. 폴리펩타이드Ⅲ가 애주번트 관절염 랫 임상 평점에 미치는 영향은 도 18을 참조하기 바란다. 폴리펩타이드Ⅲ의 저, 중, 고투여량군의 사지 평점은 모델대조군(p ＜0.01)보다 현저하게 낮으며 모델대조군과의 비교 차이는 모두 통계학적 의미를 가진다.
<폴리펩타이드Ⅲ가 애주번트 랫 관절염 동물 모델에 대한 체내 면역 보호 작용>
군별 마리수 (n) 투여량 ( mg / kg ) 좌족종창도 ( mm ) 우족종창도 ( mm ) 임상평점
정상대조군 10 -- 1.00±0.47** 0.25±0.28** 0.00±0.00**
모델대조군 10 -- 6.59±0.88 2.87±0.27 10.43±3.87
양성대조군 10 1 3.23±1.20** 0.13±0.33** 4.00±0.00**
폴리펩타이드Ⅲ고 10 40 4.40±0.91* 1.05±1.31* 5.29±3.90**
폴리펩타이드Ⅲ중 10 20 4.48±1.72* 1.28±1.27* 5.71±2.36**
폴리펩타이드Ⅲ저 10 10 4.40±.091** 0.76±1.21** 5.43±2.15**
*는 p< 0.05를 나타내고, **는 p< 0.01을 나타낸다.
결론：폴리펩타이드Ⅲ가 AA 랫 관절염에 대해 치료 작용이 있으며 비교한 바에 따르면 폴리펩타이드Ⅲ군의 효과가 폴리펩타이드Ⅰ보다 높다.
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Claims (5)

  1. 하기 아미노산 서열의 폴리펩타이드를 포함하는, 류마티스 관절염의 치료 또는 예방용 조성물:
    폴리펩타이드Ⅲ: mPEG-SC20k-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 폴리펩타이드Ⅲ은 합성 방법 또는 폴리펩타이드Ⅱ의 재조합 방법으로 제조된, 조성물:
    폴리펩타이드Ⅱ: Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 폴리펩타이드Ⅱ는 애주번트(adjurvant)를 공유결합으로 연결할 수 있고, 상기 애주번트는 소혈청 알부민(bovine serum albumin), 인간혈청 알부민(human serum albumin) 또는 폴리에틸렌글리콜(PEG)인, 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 조성물이 상기 폴리펩타이드Ⅲ의 허용가능한 유효량의 염(salts), 또는 약학적으로 허용가능한 전달 담체 또는 부형제(excipients)를 포함하는, 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 여러 가지 투약방법을 통해 투여될 수 있으며 상기 투약방법은, 피하 주사, 근육 주사, 정맥 주사 또는 정맥 점적 주사, 경구 투약, 또는 코 스프레이(nasal spray) 로 투여되는, 조성물.
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