CN102205110A - 整合素阻断剂在制备治疗新生血管性眼病药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及药物领域，具体涉及具有整合素亲和性和结合能力的整合素阻断剂，该整合素阻断剂包括三个多肽，可用于新生血管性眼病的预防和治疗。所述的整合素阻断剂多肽具体是指多太I Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp；多肽II Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro以及聚乙二醇修饰的多肽III mPEG-SC20k-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp。该整合素阻断剂可用于治疗的新生血管性眼病包括角膜新生血管性眼病、虹膜新生血管性眼病、脉络膜新生血管性眼病、视网膜新生血管性眼病等。

Description

整合素阻断剂在制备治疗新生血管性眼病药物中的应用

技术领域

本发明涉及药物领域，具体涉及用于预防和治疗新生血管性眼病的整合素阻断剂多肽。

背景技术

新生血管生成，在正常生理条件下，受到高度调节，在生殖、胚胎发育、组织修复和创伤愈合中是必不可少的过程。

血管生成是响应于多种前血管生成刺激物而发生的，所述的刺激物例如生长因子、细胞因子和其它生理学分子以及其它因素例如缺氧和低pH。新血管发育的血管生成的级联需要多种分子的协作，这种作用调节必要的细胞过程，例如细胞外基质(ECM)重塑、侵袭、迁移、增殖、分化和小管形成等。前血管分子例如VEGF、PDGF以及其它分子通过刺激它们的细胞表面受体来活化内皮细胞。这些被活化的细胞经过细胞增殖过程，来提高细胞粘附分子的表达，增加蛋白水解酶的分泌，增加细胞迁移和侵袭。许多不同的分子参与了促进增殖和侵袭过程，包括用于粘附的整联蛋白、选择蛋白和免疫球蛋白基因超家族的成员以及蛋白水解酶类。最终，衍生子细胞表面受体生化信号的复杂级联与细胞外基质组分和可溶性因子相互作用，导致腔管形成并且分化成成熟的血管。

但是，血管生成在多种病理条件下也会发生，所述病理条件包括：肿瘤生长和转移；炎性障碍，例如类风湿性关节炎、银屑病、骨关节炎、炎性肠病、克隆病、溃疡性结肠类以及其它炎性障碍；眼部新血管生成，如早产儿视网膜病变、局部缺血性视网膜病变、视网膜静脉或动脉闭塞、糖尿病性视网膜病变、脉络膜新生血管形成、年龄相关性黄斑变性(AMD)、角膜新生血管形成、新生血管性青光眼或角膜移植以及多种其它眼病中的新血管生成。

抑制新生血管的形成是治疗这类疾病的关键，而内皮细胞的增殖和迁移是新生血管形成的关键步骤。血管生成抑制剂是近年在治疗新生血管性疾病中引起重视的一类药物，这方面的研究已经取得了一些进展，渴望在今后成为一类新的有希望的治疗新生血管性疾病的药物，因此阻断新生血管形成可能成为治疗由于眼中血管生成导致的患者眼病的新手段。在这些血管生成抑制剂中，尤其以血管抑素和内皮抑素最引人注目。尽管这些血管抑制剂呈现出非常诱人的前景，但其缺陷也非常明显：迄今为止的抑制血管生成药物，如内皮抑素、血管抑素等作用靶点不明确，它们对血管的专一性和选择性还不够好，效果有限，导致实验中用药量较大。因此，一个好的抗血管生成药物应该对新生血管的标记分子具有选择性，以达到对新生血管的导向性作用，从整体上提高药物对血管生成的抑制作用：做到只使用低剂量的药物，就能达到高效的抑制血管生成的效果。Avastin目前已经成功用于眼部疾病的治疗，而我国尚缺乏自主研制的此类药物。

与血管生成相关的重要血管内皮细胞标记之一是整合素家族的部分成员。整合素是多种细胞外基质成分的受体，广泛存在于细胞表面，是一个相当大的受体家族。这类受体由一条α链和一条β链组成，在与配体的结合中都起作用，不同的α链和β链的组合决定了配体的特异性。

整合素家族的一部分成员(α5β1、αvβ3等)有一个共同的特征，即能够识别含有RGD(Arg-Gly-Asp)序列的配体。因此，RGD序列可以作为一种载体，靶向运输到新生血管内皮，从而对新生血管性疾病达到更高效率的治疗。本发明中三个多肽均属于含有RGD序列的整合素阻断分子，研究发现其具有高效抑制新生血管生成的活性，特别是对眼部血管异常性疾病有很好的作用。

发明内容

发明目的

本发明对以下三个多肽即多肽I  Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp；多肽II Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro以及多肽III mPEG-SC20k-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp做了大量实验研究，发现其对新生血管性眼部疾病具有很好预防和治疗作用。

技术方案

整合素阻断剂在制备治疗新生血管性眼病药物中的应用。

所述的整合素阻断剂具体是指：

多肽I：Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp

(IVRRADRAAVPGGGGRGD)；

多肽II：Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly-Ile-Val-Arg-Arg-

Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro(ACDCRGDCFCGGGGIVRRADRAAVP)；

多肽III：mPEG-SC20k-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-

Arg-Gly-Asp。

上述三种多肽由本实验室提供。

所述的多肽III是多肽I的聚乙二醇修饰产物，具体是指用20kD分子量的PEG对多肽I的N端进行修饰的产物。

所述新生血管性眼病包括虹膜新生血管性眼病、脉络膜新生血管性眼病、视网膜新生血管性眼病或角膜新生血管性眼病。

角膜新生血管性眼病是指角膜接触镜所致角膜新生血管性疾病，以及碱及其他化学物质烧伤、角膜手术、细菌感染、衣原体感染、病毒感染或原虫感染引起的角膜新生血管性眼病。

所述的病毒为单纯疱疹病毒、带状疱疹病毒、牛痘苗、腺病毒。

所述原虫为利什曼原虫、阿米巴原虫、疟原虫、弓形虫。

所述虹膜新生血管性眼病，包括新生血管性青光眼、糖尿病视网膜病变或视网膜中央静脉栓塞引起的虹膜新生血管性眼病。

所述脉络膜新生血管性眼病，包括年龄相关性黄斑变性、中心性渗出性视网膜脉络炎、眼组织胞浆菌病综合征或葡行性脉络膜病变脉络膜新生血管性眼病。

所述指视网膜新生血管性眼病，包括糖尿病、肿瘤、视网膜脱落、视网膜中央静脉阻塞、视网膜静脉周围炎、全身性红斑狼疮、Eales病或Coat病相关的视网膜新生血管性眼病。

有益结果

研究发现，本发明中的多肽序列Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro具有抑制血管生成的作用。精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)序列是整合素的一个重要配体，含有RGD序列的多肽X-Arg-Gly-Asp(X可以是1个或多个非极性氨基酸)能够特异性的识别整合素。本发明的整合素阻断剂多肽是在具有抑制血管生成作用的序列Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro的一端或另外一端连接上与整合素家族具有亲和性和结合能力的含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)的X-Arg-Gly-Asp序列，构建出了一系列与整合素有亲和性和结合能力的整合素阻断剂多肽。由于RGD序列的靶向性，多肽可以靶向到眼部病理性新生血管内皮，抑制新生血管形成，进而达到预防或治疗新生血管性眼病的效果。

实验证明多肽I、多肽II、多肽III均能够抑制人视网膜血管内皮细胞(HRCEC)的增殖，在一定范围内呈剂量依赖关系；在鸡胚尿囊绒膜(CAM)体内血管生成活性实验中三种整合素阻断剂多肽显现出了抑制鸡胚尿囊绒膜新生血管生成的活性。实验结果表明，本发明的整合素阻断剂能够抑制血管的新生，具有潜在的治疗新生血管性疾病的作用。

通过整合素阻断剂多肽对小鼠角膜新生血管和兔虹膜新生血管的作用，表明多肽I、多肽II、多肽III三种整合素阻断剂均能够抑制角膜和虹膜新生血管的生长，有潜力开发为治疗角膜新生血管性眼病和虹膜新生血管性眼病的药物。

脉络膜位于眼球后部，实验证明整合素阻断剂多肽能够改善脉络膜血流，说明用药后，通过全身循环或巩膜-葡萄膜-视神经途径，能尽快到达脉络膜，对年龄相关性黄斑变性(AMD)的脉络膜新生血管形成有抑制作用，可望用于早期AMD以及其它脉络膜新生血管性疾病的预防或治疗。同时通过整合素阻断剂多肽对大鼠脉络膜新生血管的作用，表明三种整合素阻断剂多肽能够抑制大鼠脉络膜新生血管的生成，说明三种整合素阻断剂对包括年龄相关性黄斑变性在内脉络膜新生血管性眼病具有一定的治疗作用。

对OIR小鼠模型施用多肽I、多肽II、多肽III后，三种多肽均能够改善视网膜病理性新生血管的形成，减少了视网膜中新生血管丛。说明本发明的整合素阻断剂能够抑制小鼠眼部视网膜的新生血管形成，在一定程度上能够预防或治疗视网膜新生血管性眼病。整合素阻断剂多肽对早产儿视网膜病变大鼠模型新生血管和糖尿病视网膜病变大鼠模型新生血管的作用，表明多肽I、多肽II、多肽III均能够抑制视网膜病理性新生血管的生长，从而有希望作为治疗视网膜新生血管性眼病的药物。

附图说明

附图1多肽I对人视网膜血管内皮细胞(HRCEC)增殖抑制作用；

附图2多肽II对人视网膜血管内皮细胞(HRCEC)增殖抑制作用；

附图3多肽III对人视网膜血管内皮细胞(HRCEC)增殖抑制作用；

附图4鸡胚尿囊绒膜(CAM)分析多肽I、多肽II和多肽III的体内抑制血管生成活性试验；

附图5整合素阻断剂多肽对小鼠角膜新生血管的作用MVD计数

附图6各实验组给药后不同时间CNV的发生率

附图7多肽I、多肽II和多肽III对OIR小鼠血管的影响。

附图8各实验组视网膜血管内皮细胞核计数的比较

具体实施方式

实施例1

整合素阻断剂多肽对人视网膜血管内皮细胞(HRCEC)的增殖抑制作用

采用MTT法检测整合素阻断剂多肽抑制人视网膜血管内皮细胞增殖的活性。HRCEC细胞在37℃、5％CO₂的培养箱中培养至密度90％以上时用胰蛋白酶消化收集，用培养液重悬细胞并在显微镜下计数，将细胞浓度调整为3.0×10⁴个/mL，将细胞悬液接种到96孔板中，每孔100μL，并于37℃，5％CO₂培养箱中培养过夜。将多肽I、多肽II、多肽III、Avastin用培养液稀释到各个预定浓度。待细胞完全贴壁后，将各个稀释液分别加入96孔板中，每孔100μL。以加入整合素阻断剂多肽作为给药组，Avastin作为阳性对照组，以不加任何药物的培养液作为空白对照组，在37℃，5％CO₂培养箱孵育48小时。向96孔板中每孔加入20μL 5mg/mL的MTT，继续培养4小时。吸去培养基，每孔加入100μL DMSO溶解。用酶标仪在570nm下检测，参比波长为630nm处测定吸光值，并计算生长抑制率(proliferation inhibition，PI)，公式如下：

PI(％)＝1-给药组/阴性组

表1.多肽I对人视网膜血管内皮细胞(HRCEC)增殖抑制作用

整合素阻断剂多肽对人视网膜血管内皮细胞HRCEC的体外抑制实验结果：见表1和图1，与对照相比，多肽I能够显著抑制人视网膜血管内皮细胞(HRCEC)的增殖作用，并且呈现剂量依赖关系。

表2.多肽II对人视网膜血管内皮细胞(HRCEC)增殖抑制作用

结果：见表2和图2，与对照相比，多肽II能够抑制HRCEC的增殖作用，在中高剂量下，多肽II对细胞增殖的抑制率与阴性对照相比有显著性的差异。

表3.多肽III对人视网膜血管内皮细胞(HRCEC)增殖抑制作用

结果：见表3和图3，与对照相比，多肽III能够抑制HUVEC的增殖作用，在1-64μg/mL范围内呈现一定的剂量依赖性。

实施例2

鸡胚尿囊绒膜(CAM)分析多肽的体内抑制血管生成活性

本研究采用CAM试验探讨整合素阻断剂多肽体内抑制血管生成的活性。研究表明在鸡胚发育的第8天到第11天，胶原蛋白的生物合成速率达到最大，此时正是血管生成的最旺盛阶段，而机体免疫系统尚未完全建立，因此选择发育到第8天的鸡胚开始给药。考虑到载药纸片上的多肽会在鸡胚尿囊膜上有一定的弥散范围限制，因此试验中只计数距离纸片边缘5mm半径的范围内新生血管数量。采用如下操作步骤：

(1)将第6天的白来杭鸡胚在60％-70％湿度的37℃培养箱培养两天。

(2)在鸡胚气室上方钻1.0cm×1.0cm的窗口，用镊子将内膜撕去，暴露出尿囊膜。以直径为5mm的擦镜纸片为加样载体，放入鸡胚气室尿囊绒膜上。滤纸片加PBS为空白组，给药组分别加不同剂量的多肽，阳性对照为Avastin。

(3)将鸡胚气室用无菌透明胶带封上，于37℃培养72小时后，打开鸡胚气室，加入固定液(甲醛∶丙酮＝1∶1)固定15min。取出粘附有擦镜纸片的尿囊膜，观察其新生血管分布状况，对新生血管进行计数并拍照。每组剂量设5个重复，试验结果进行统计分析。

鸡胚尿囊绒膜(CAM)分析多肽的体内抑制血管生成活性结果：阴性对照采用PBS处理，阳性对照Avastin的剂量为10μg，多肽I、多肽II、多肽III设置三个剂量处理鸡胚，分别是5.0μg、10μg、20μg，结果见图4，多肽I、多肽II、多肽III都显现出了一定的抑制鸡胚尿囊绒膜的活性，CAM上的新生血管密度和数量显著下降，其中以多肽II的抑制率最高；在5.0μg、10μg、20μg三个剂量下，抑制活性呈一定的剂量依赖性。

实施例3

整合素阻断剂多肽对小鼠角膜新生血管的作用

(1)BALB/c小鼠碱烧伤诱导角膜新生血管模型的制备：

健康BALB/c小鼠20只，雄性，体重20-25g，裂隙灯显微镜下检查双眼眼前段及附属器，排除眼部病变。碱烧伤模型制备前1d予0.3％氧氟沙星眼药水点眼，每日2次。小鼠经腹腔注射1.8％Avertin麻醉后，用镊子夹住直径为2mm的单层滤纸片，浸于1mol/L氢氧化钠溶液中，使其达饱和状态，去除多余液体，将滤纸片置于BALB/c小鼠角膜中央40S，弃掉滤纸，立即用15ml的PBS充分冲洗烧伤区及结膜囊1min。棉签拭去过多水分，于手术显微镜下以角膜刮铲平行于角膜缘的方式旋转刮除角膜上皮，注意勿伤及上皮下基质层及角膜缘，术毕结膜囊内涂红霉素眼膏预防感染。

(2)实验动物分组及标本获取

20只小鼠按随机分组，标记为多肽I实验组、多肽II实验组、多肽III实验组和对照组，每组5只，自碱烧伤后分别给予50μg多肽I、50μg多肽II、50μg多肽III和生理盐水玻璃体腔注射，每日1次，持续1周，碱烧伤后1d、7d、14d于裂隙灯显微镜下观察各组角膜的炎症反应及新生血管情况。碱烧伤后第14d于带眼前段照相的裂隙灯显微镜下拍照记录各组角膜新生血管形成情况，随即以颈椎脱臼法处死所有小鼠并摘除眼球，生理盐水冲洗血迹，4％多聚甲醛固定1.5h，含30％蔗糖的PBS中脱水过夜，OCT冰冻切片包埋剂包埋，-80℃冰箱中保存，8μm冰冻切片，免疫组织化学法检测CD31的表达。

(3)角膜组织微血管密度定量测定

微血管密度(Microvessel density，MVD)是评价血管形成的指标。我们采用抗CD31抗体免疫组织化学法标记血管内皮细胞，计数单位面积中的微血管数目，由此来衡量新生血管生成的程度。统计微血管的标准：显微镜下观察角膜组织中与邻近组织分界清楚，并被染成棕黄色或褐色的内皮细胞或细胞团均计入新生血管。在10×20镜下计数整张切片新生血管数目，角膜组织片照相后以图像处理软件Image J计算出整个角膜组织片面积，求出该例整张切片的新生血管密度。

表4：整合素阻断剂多肽对小鼠角膜新生血管的作用MVD计数

结果：CD31作为微血管标记物，主要表达于血管内皮细胞胞质中，染色阳性细胞为血管内皮细胞染成棕黄色或褐色，无背景染色。多肽I、多肽II、多肽III实验组CD31阳性新生血管与对照组相比显著减少。多肽I实验组切片MVD值为28.57±5.428，多肽II实验组MVD值为23.60±4.920，多肽III实验组MVD值为35.18±6.285，与对照组50.48±8.456比较有显著性差异。实验结果表明多肽I、多肽II、多肽III三种整合素阻断剂均能够抑制角膜新生血管的生长，能够作为治疗角膜新生血管性眼病的药物。

实施例4

整合素阻断剂多肽对家兔虹膜新生血管的作用

采用577nm氩离子激光凝阻家兔视网膜主分支静脉，经眼底荧光素血管造影(FFA)证实静脉阻塞成功。5-12天后眼虹膜荧光素血管造影(IFA)显示虹膜血管与正常对照组对比荧光素渗漏明显，证实虹膜新生血管化的动物模型(NVI)形成。

取造模成功的12只眼，随机分成4组，每组3只。分别标记为阴性对照组、多肽I治疗组、多肽II治疗组、多肽III治疗组，分别以生理盐水、200μg多肽I、200μg多肽II、200μg多肽III玻璃体腔注射给药，每日1次，持续2周。第3周用光学及电子显微镜观察。

结果：光学显微镜下可观察到虹膜前表面是主要由纤维组织组成的纤维血管膜残迹，仅有极少的开放血管腔。在虹膜基质内可看到血管残存物，为坏死细胞及细胞碎片。而光镜下的对照眼的虹膜表面为有分枝的和潜在管腔的纤维血管膜。

治疗组虹膜的超微结构为一系列的退行性改变。虹膜基质中部的大血管的内皮细胞有正常的细胞核、细胞质和细胞连接。虹膜基质中及虹膜前表面有毛细血管残迹，周围有细胞碎片和巨噬细胞浸润。无潜在管腔的毛细血管及退变的壁细胞，表明新生血管消退。

通过虹膜新生血管化的动物模型实验，证明了多肽I、多肽II和多肽III能够抑制新生血管形成并使已形成的血管退化。

实施例5

整合素阻断剂多肽对兔眼脉络膜血流的影响

取体重为2.5-3.0公斤的新西兰白兔，随机分为4组，分别标记为对照组、多肽I实验组、多肽II实验组、多肽III实验组。每组的白兔用35mg/kg甲苯噻嗪混合后肌注麻醉，之后每小时用起始量的一半肌注维持麻醉。升高左眼眼压至40mmHg，该压力下可使眼血流降至正常值的1/3。经右颈动脉插管至左心室，用于注射微球(计算眼血流量)，股动脉插管用于采血。各组分别进行玻璃体腔注射生理盐水、200μg多肽I、200μg多肽II、200μg多肽III，给药后于0、30、60和120分钟用彩色微球技术测定高眼压兔眼的眼血流量。在每个时间点，注入0.2mL(约200万)微球，微球注入后立即经股动脉采血60秒整，并置于肝素化抗凝管，记录采血量。最后一次采血后，用100mg/kg的苯巴比妥静注处死动物，摘取眼球，分离视网膜、脉络膜、虹膜和睫状体，记录组织重量。

每个时间点组织血流的计算用以下公式：Qm＝(Cm×Qr)/Cr。其中Qm代表组织血流，单位μL/min/mg；Cm是每毫克组织微球数；Qr是血流量，单位μL/min；Cr是作为参照的血液微球数。

表5.多肽I对白兔眼脉络膜血流的影响

表6.多肽II对白兔眼脉络膜血流的影响

表7.多肽III对白兔眼脉络膜血流的影响

多肽对兔眼脉络膜血流的影响结果：见表5、表6和表7，与阴性对照组相比，在所有观察时间点(30、60、120分钟)，多肽I、多肽II和多肽III的治疗组脉络膜血流量都显著增加。

实施例6

整合素阻断剂多肽对大鼠脉络膜新生血管的作用

用846复合麻醉剂0.5ml/Kg腹腔注射充分麻醉6-8周雄性BN大鼠，激光光凝前5min用复方托品酰胺眼液滴眼一次，充分散大双眼瞳孔。固定动物，在-53.00D角膜接触镜辅助下，围绕视盘并在距视盘2PD位置等距离行氪离子激光光凝，共计8个光凝斑，激光波长为647.1nm，功率为350mW，光凝斑直径和时间分别为50μm及0.05s。光凝后立刻进行眼底照相。于光凝后3、7、14、21、28分别进行FFA、组织病理及透射电镜检查。

通过眼底照相及FFA检查证实，光凝后第21天光凝斑荧光素渗漏达到高峰。同时进行病理组织学检查，光凝后21天，光镜下显示CNV呈现显著的纤维血管增殖，其中可见大量新生血管，管腔内可见红细胞；镜下显示脉络膜黑色素细胞间有毛细血管呈凝聚性改变，内皮细胞凝聚。表明21天后大鼠脉络膜新生血管模型形成。

将造模成功的20只大鼠，随机分成4组，每组5只大鼠。分别标记为空白对照组、多肽I治疗组、多肽II治疗组、多肽III治疗组，分别以生理盐水、多肽I(100μg)、多肽II(100μg)、多肽III(100μg)玻璃体腔注射，每日1次，持续1周。给药后3天、7天、14天及28天均进行FFA检查。

表8：各实验组给药后不同时间CNV发生率

结果：见表8和图6，各实验组给药后不同时间CNV发生率(发生渗漏的光斑数/总光斑数)。FFA检测，给药后3天，多肽I、多肽II、多肽III三组治疗组荧光素渗漏与用药前相比无明显变化；给药后7、14天，治疗组荧光素渗漏比用药前逐渐减轻；给药后28天，荧光素渗漏相比用药后14天更少。说明三种整合素阻断剂多肽能够治疗大鼠脉络膜新生血管，有可能开发成为治疗脉络膜新生血管性眼病的药物。

实施例7

整合素阻断剂多肽在OIR小鼠中对视网膜血管的影响

OIR模型的建立：在C57/B16小鼠出生后第7天至第12天将小鼠幼畜及其母鼠暴露置于75％高氧环境中，可致其中央视网膜中毛细管迅速消失。在第12天返回到室内空气中，暴露与高氧中的视网膜血管迅速消失，这会引起广泛的异常新生血管形成，视网膜的中央部分长期在很大程度上保持无血管状态。在血管消失完全之后，于第13天向玻璃体内注射多肽(给药组，多肽I、多肽II和多肽III剂量均为50μg)或生理盐水(阴性组)，在第17天对视网膜血管进行评价。(为标记未闭合的血管，将50mL德克萨斯红标记的番茄凝集素注射入左心室并循环5分钟。)

整合素阻断剂多肽在OIR小鼠中对视网膜血管的影响结果：对OIR小鼠施用多肽I、多肽II和多肽III后，能够改善病理性新生血管形成。如图7，与阴性对照相比，用多肽I、多肽II、多肽III处理的OIR小鼠视网膜中新生血管丛明显减少，所占的面积分别减少了62.24％、65.31％、30.10％。

实施例8

整合素阻断剂多肽对早产儿视网膜病变大鼠模型新生血管的作用

采取波动氧诱导动物模型，将同一天自然分娩的新生鼠(12h内)随机分成3组：给氧模型组和给氧治疗组、正常对照组。给氧模型再分成三个亚组模型组和治疗组均置于有机玻璃制作的半封闭氧舱中，舱内接入医用氧气，测氧仪调整浓度至80％±2％，24h后往氧气舱内通入氮气，迅速气将氧浓度调整至10％±2％，并维持24h。如此反复，保持氧气舱内的氧气浓度每隔24h在80％和10％之间交替，持续7d后再转入空气中饲养。每天监测氧浓度8次，控制舱内环境温度在23℃±2℃，更换垫料、加食、换水、替换母鼠1次。正常对照组、置于动物房饲养环境中。模型组与对照组比较，若视网膜铺片ADP酶染色示血管改变明显，突破视网膜内界膜长入玻璃体的血管内皮细胞核计数增多，差异有统计学意义，则造模成功。

给氧治疗组分成三个亚组，于造模第7天，玻璃体腔注射给药，分别给予多肽I、多肽II、多肽III，剂量均为100μg；给氧模型组和对照组只给予生理盐水，连续给药1周。

第14天时，乙醚麻醉处死后，摘除眼球，于40g/L多聚甲醛溶液中固定24h。梯度酒精脱水、二甲苯透明。浸蜡后连续切片，厚度4μm，尽量避开视盘周围。切片平行于角膜至视盘的矢状位平面。每只眼球随机取10张切片行苏木精伊红染色，计数突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核数目(仅计数与内界膜有紧密联系的血管内皮细胞核)，统计平均每只眼球每张切片细胞数。

结果：对照组中未发现或仅极少数切片中偶有突破视网膜内界膜长入玻璃体的血管内皮细胞核。模型组可见较多突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核，有些单独出现，有些成簇出现，同时在一些切片上还可见这些血管内皮细胞核邻近深层视网膜血管，证实他们来源于视网膜而非玻璃体或眼部其他组织。治疗组切片中仅可见少数突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核。

表9：各组视网膜血管内皮细胞核计数

结果：见表9和图8，多肽I治疗组视网膜血管内皮细胞核计数为6.672±1.907，多肽II治疗组5.368±1.534，多肽III治疗组8.540±2.085，与给氧组29.450±4.543相比，血管内皮细胞核数都显著减少，证明多肽I、多肽II、多肽III一定程度上都能够抑制氧诱导新生鼠视网膜病变模型新生血管的形成。

实施例9

整合素阻断剂多肽对糖尿病视网膜病变大鼠模型新生血管的作用

将STZ溶于0.1mol/L，pH4.5的柠檬酸缓冲液中配制成2％的溶液。所有实验Wistar大鼠注射前禁食12h，每只大鼠按65mg/kg剂量腹腔注射2％STZ溶液。注射后单笼饲养，48h检测尿糖和血糖。尿糖在+++以上，血糖高于16.7mmol/L为成模标准。通过血糖、尿糖、尿量检测以及视网膜VEGF免疫组化检测，糖尿病视网膜病变模型建模成功。

取成模大鼠20只，随机分为四组，标记为对照组、多肽I治疗组、多肽II治疗组、多肽III治疗组。玻璃体腔给药，对照组注射生理盐水(0.1mL)，多肽治疗组多肽I、多肽II、多肽III均给药100μg(0.1mL)，每日1次，给药2周，第4周、第8周、第12周天观察。

表10：各组大鼠视网膜神经节细胞数目(mm^-2)

结果：光学显微镜下检测，每只眼球计数10张后极部视网膜神经节细胞数目，每只眼球测量10张后极部视网膜厚度。实验组大鼠视网膜组织较对照组大鼠视网膜组织各层厚度增加。实验组大鼠视网膜神经节细胞数目与对照组比较如表10，治疗组视细胞数目和对照组视细胞数目对比增加，差异具有显著意义。

实验结果表明：多肽I、多肽II、多肽III在100μg剂量下均能够对糖尿病视网膜病变产生一定的治疗作用。

Claims (10)

1.整合素阻断剂在制备治疗新生血管性眼病药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的整合素阻断剂在制备治疗新生血管性眼病药物中的应用，其特征在于所述的整合素阻断剂具体是指：

多肽I：Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp；

多肽II：Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro；

多肽III：mPEG-SC20k-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp。

3.根据权利要求2所述的整合素阻断剂在制备治疗新生血管性眼病药物中的应用，其特征在于所述的多肽III是多肽I的聚乙二醇修饰产物，具体是指用20kD分子量的PEG对多肽I的N端进行修饰的产物。

4.根据权利要求1所述的整合素阻断剂在制备治疗新生血管性眼病药物中的应用，其特征在于所述新生血管性眼病包括虹膜新生血管性眼病、脉络膜新生血管性眼病、视网膜新生血管性眼病或角膜新生血管性眼病。

5.根据权利要求4所述的整合素阻断剂在制备治疗新生血管性眼病药物中的应用，其特征在于角膜新生血管性眼病为角膜接触镜所致角膜新生血管性疾病，以及碱及其他化学物质烧伤、角膜手术、细菌感染、衣原体感染、病毒感染或原虫感染引起的角膜新生血管性眼病。

6.根据权利要求5所述的整合素阻断剂在制备治疗新生血管性眼病药物中的应用，其特征在于所述的病毒为单纯疱疹病毒、带状疱疹病毒、牛痘苗、腺病毒。

7.根据权利要求5所述的整合素阻断剂在制备治疗新生血管性眼病药物中的应用，其特征在于所述原虫为利什曼原虫、阿米巴原虫、疟原虫、弓形虫。

8.根据权利要求4所述的整合素阻断剂在制备治疗新生血管性眼病药物中的应用，其特征在于所述虹膜新生血管性眼病，包括新生血管性青光眼、糖尿病视网膜病变或视网膜中央静脉栓塞引起的虹膜新生血管性眼病。

9.根据权利要求4所述的整合素阻断剂在制备治疗新生血管性眼病药物中的应用，其特征在于所述脉络膜新生血管性眼病，包括年龄相关性黄斑变性、中心性渗出性视网膜脉络炎、眼组织胞浆菌病综合征或葡行性脉络膜病变脉络膜新生血管性眼病。

10.根据权利要求4所述的整合素阻断剂在制备治疗新生血管性眼病药物中的应用，其特征在于所述指视网膜新生血管性眼病，包括糖尿病、肿瘤、视网膜脱落、视网膜中央静脉阻塞、视网膜静脉周围炎、全身性红斑狼疮、Eales病或Coat病相关的视网膜新生血管性眼病。

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